TW554170B - High throughput screening method for the identification of leads from a library of compounds and method of identification of active compounds from a library of compounds - Google Patents

High throughput screening method for the identification of leads from a library of compounds and method of identification of active compounds from a library of compounds Download PDF

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Description

554170 案號87115977 今c?年丨丨月 曰 修正 五、發明說明（1) 本發明係關於由存庫選擇前置者或活性化合物之方法。 特別，本發明提供選擇對預定目標具有活性及選擇性之前 置者或化合物之方法。本發明例如可用於藥物發現方法。 目前藥物發現方法需要篩選大量天然來源或經由組合化 學方法獲得之化合物。
於單 < 藥物發現計畫常測試數萬種或數十萬種化合物存 庫（圖1)。入選化合物亦即入選者數目極大。平均入選率 為0 . 1 %。如此，篩選1 0 0，0 0 0種化合物存庫可能產生1 0 0個 入選者。由入選者至藥物候選者是一段漫長過程，需要多 次合成及筛選焦點化合物存庫週期。此種前置化合物之最 佳化過程極為耗時，且需大量、預算。 確實，待追蹤的入選者常係基於其對被筛檢目標之強度 選擇。各次前置最佳化週期須產生活性更高之化合物。當 少數入選者具有預期強度時，通常係經過數次最佳化週期 後，其變成前置者，然後測試其對大量生物目標之選擇性 (π前置者側錄（lead prof iling)n )。藥物候選者係基於其 對選定目標之親和力，及其對目標之特異性而被保留（亦 即不可對該計畫之病理項目無關的目標具有活性）。選定 前置者證實非特異性，因而可能引起非期望之副作用並非 罕見。隨後需要由強度較低之入選者重新開始整個過程。 本發明係關於由存庫識別前置者或活性化合物之改良方 法。本發明亦係關於高通量（t h r 〇 u gh p u t )側錄方法，其允 許由大量多樣化組合中筛選出選擇性化合物。本發明也提 供包含多種具有結構多樣化但具有共通功能性質之化合物 之新穎焦點存庫。
O:\55\55113.ptc 第5頁 554170 案號 87115977
五、發明說明（2) __ 本發明方法特別係關於於藥物發現過程之 人選者特異性（"側錄"）。此等新穎方法允許識定 =質(亦即合併對指定目標之強度及選擇性標準以良 者選擇性用於前置者最適化過程而識別具有 測度及較低成本之藥物候選者（drug candidates)軚网預 因=i本發明之目的係提供一種由化合 者之方+法，該方法包含下列步驟： 則置 潠(^ ) ·篩選一化合物存庫對預定目標之活性而獲得強力入 (2 )j則錄步驟（a)之強力入選者獲得強力選擇性前置者。
μ ί二ί f明，先前藥物發現、方法或前置者選擇方法包括 ===3物存庫有關對預定目標之活性，如此所得 最佳化週期而產生前置者。但= 即基於“可庫對預定目標之活性’亦 比去白人Γ 興^疋目標交互作用之化合物，但先前方法 “提2 方法。本發明之高通量筛選方 指定目；^六種存庫之側錄步驟，因此獲得合併強度（可與 “或：：)互之作雙用重能/i)及f擇性(與其它目標交互作用'程 本發明ίΛ 標準之前置者。 化合物之古ί 一的係提供一種由一化合物存庫識別活性 Π ) t、s Β /該方法包含： G、^篁碑選包含下列步驟： < 入選者a;師選一化合物存庫對預定目標之活性而獲得強力 (b)側錄步驟（a)之強力入選者獲得強力選擇性前置
554170 案號 87115977 崎丨丨月 曰 修正 五、發明說明（3) 者； (c )製備結構上相關步驟（b)前置者之化合物之焦點 存庫； (i i )使用步驟（c )之焦點存庫選擇性重複步驟（i ) 一次或 數次而產生進一步焦點存庫，及 (i i i)對該目標篩選步驟（i )或（i i)之焦點存庫而獲得活 性化合物。
此種方法示例說明於圖2 之循序步驟及前置者最佳化 為求清晰起見，π入選者π 示於主存庫經一次筛檢步驟 者為第一階段選擇所得化合 有最低強度。π前置者’'為最 經過證實，更佳使用不同選 置者為至少兩次篩檢步驟後 步最佳化步驟之起始物料， 點存庫，選擇活性化合物， 將產生藥物候選者。 ，及包含前述前置者識別方法 步驟而產生活性化合物。 一詞於本發明之定義範圍内表 後、入選之化合物。因此，入選 物，其對預定目標而言至少具 佳化之入選者，亦即活性已經 擇試驗證實之入選者。因此前 所得化合物。前置者表示進一 進一步最佳化步驟包含設計焦 其化學改質，功能測試等，而 本發明方法中，一存庫篩選其對指定目標之活性。概略 而言，目標可為於醫藥或農用化學品領域之任一種分子例 如受體，蛋白質，部分受體，抗體，配合基，傳染性顆粒 例如病毒、細菌、真菌或核酸等。更佳目標為涉及生物或__ 病理路徑之分子，例如受體，酶，核酸區，離子通道等。 特定類型目標例如為受體如表I引述者，及酶如表I I引述 者0
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a 月 修正 如前述，本案申技 對指定目標之活性％專利方法之步雜（a)包含篩選一存庫 有關選擇可與該。φ篩選對指定目楳之活性之一般方式係 於本發明範圍内，交互作用之存庫中之任一種化合物。 用。更佳本方法 父互作用’，一詞表系物理或功能交互作 之化合物包含篩=步驟（a)中，篩選對預定目標具有活性 修改酶活性或調 >(或選擇）可結合奚顇定目標之化合物， 本發明之4# ‘ :基因表現。 之化合物。更佳^體例中，步驟U)包含篩選結合至目標 係由該化合物抑；；例，，化合物結m目標之能力 測量。舉例士之忝加標記之參考分子、，，σ σ目標之能力 化合物抑制；加樟以結合至指定力係藉瓛 制吾。@ ^ 士知圮之受體配合基結合至目私叉體之能力f 夕i^人A处人’ 6帛選包含對各種化合物測定抑制添加標記 之配合基結合至目標之百分比。 、本發明之另一特定具體例中，步驟（a)包含篩選可修改 活性之化合物。此等修改包括刺激或抑制酶活性，或改變 特異性或調節酶活性（舉例）。 化合物對目標之活性可根據業界已知之多種方法檢定分 析’例如酶學（特別免疫酶學）方法，基於螢光之檢測方法 或放射性檢定分析（舉例）^至於基於螢光之檢測技術之特 別適合例值得一提者為螢光偏振法，螢光校正光譜術 (Eigen et al·， PNAS 91 (1994) 5740)及時間解析螢光 (舉例）°此等技術之較佳例包括例如PSA (Baum et al.，
Anal. Biochem· 237 (1996) 129 ) ，HTRF (Mathis G·， Clin· Chem· 39 (1993) .1 953)。至於放射性免疫檢定分
O:\55\55113.ptc 第8頁 554170 修正 案號87115977 4〇年|丨月 曰 五、發明說明（5) 析之例例如可方便使用EL I SA或I R A於本發明之範圍。 如實驗乙節所述，該等方法可於試管試驗系統或於基於 細胞之檢定分析進行。特別，此等檢定分析通常係於容器 如平板（微孔板），其裝載適當反應劑（目標，缓衝液，試 驗化合物）進行。適當板包括9 6孔板，以及具有較多孔 數，特別384，864，1536或以上之板。此等板由市面可購 得。
為了使篩選方法更為準確，進一步較佳證實化合物相對 於目標之活性。證實可藉例如單純重複前述篩選方法，但 使用分離或純化形式之化合物而非含於全存庫之化合物進 行。 、 依據起始存庫大小而定，證實入選者數目可為5至500， 通常為5至100種。 此外，較佳具體例中，步驟（a)之篩選進一步包含化合 物結合預定目標之親和力，俾選擇具有最佳親和力之化合 物作為強力入選者。為了測定親和力，經過證實之入選者 通常再度合成及純化。然後藉業界已知方法如實例揭示之 π史格查（S c a t c h a r d )π分析測定。又於此步驟中，由於化 合物之化學結構式故可進一步拋棄化合物。 根據步（a )篩選之化合物通常為5至5 0種，隨後接受步驟 (b )。側錄步驟（b )概略而言，包含檢定分析強力入選者對 各種預定目標之活性，並選出對預定目標具特異性之化合 物。因此，此步驟可保有對目標具有預期強度及良好選擇 性側錄之前置者。步驟（b)通常包含決定被選上之入選者 與多種目標交互作用，較.佳結合至多種目標之能力。
O:\55\55113.ptc 第9頁 554170 案號 87115977 曰 修正 五、發明說明（6) 本發明之一特定具體例中，步驟（b )包含強力入選者對 超過2 5種目標進行檢定分析。更為特定具體例中，側錄步 驟（b)包含於超過50種目標檢定分析強力入選者。最佳具 體例中，側錄步驟（b )包含於超過6 0種目標檢定分析強力 入選者。可於步驟（b)檢定分析之目標之說明例列舉於下 表I。本發明之較佳具體例中，側錄步驟（b )包含對下列目 標篩選被選定之入選者，此等目標至少包含： -非肽G -偶合受體，包含腺苷受體，腎上腺激性受體， 多巴胺受體，組織胺受體，褪黑激素受體，簟毒鹼受體， 及σ -受體； -肽類G -偶合受體，包含血管緊張肽素受體，bombesin 受體，缓動激素受體，膽囊收縮激素受體，化學激素受 體，内皮肽素受體，虱肽素受體，神經激素受體，神經肽 Y受體及後葉加壓素受體； -離子通路偶合受體包含血清素受體；及 -離子通路’包含4弓通路及钟通路。 又更佳接受檢定分析之目標進一步包含： -酶，包括磷酸二酯酶及酪胺酸激酶及選擇性蛋白質激 酶及蛋白解酶。 另一較佳具體例中，側錄步驟進一步包括一種或數種基 於細胞之檢定分析選自： -細胞激素分泌檢定分析如用於人類單核細胞之TNF-a分βΡ 泌檢定分析； -自由基檢定分析，例如用於人類顆粒球（如HL 6 0 )之02 分泌檢定分析；·
O:\55\55113.ptc 第10頁 554170 修正 案號87115977 今0年丨丨月 曰 五、發明說明（7) -黏著檢定分析，特別人類單核細胞（如U 9 3 7細胞與人類 内皮細胞間之黏合）； -細胞毒性檢定分析，例如對人類單核細胞之毒性。 典型示例說明之本發明之特定具體例中，側錄步驟（b ) 包含篩選化合物對表I I I列舉之各種及每種目標之活性。 本發明之另一典型示例說明特例中，側錄步驟（b)包含 篩選化合物對表I列舉之各種及每種目標之活性。 4Ρ 化合物與此等目標交互作用或結合能力可遵照步驟（a) 之相同方法於試管試驗或於基於細胞之系統測定。本發明 之主要方面為側錄大量化合物（強力入選者），俾產生比先 前技術方法更為改良之前置者。就此方面為言，為了加速 側錄步驟（b )，申請人發展出一種高通量側錄（"ΗΤΡΠ )構 想，其允許於如上揭示之大量目標於試管試驗中快速測試 無數化合物（例如一百至兩百種範圍）。特別，此種Η Τ Ρ包 括機械人系統，其每曰可處理高達20個方案（每個目標一 個方案）。此種方法之進一步細節揭示於實例。基本上， 於本發明之特定具體例中，ΗΤΡ係使用包括下列元件之裝 置進行： -工作站包括： <» •數個培育器，較佳為2或3個 •一或多個過濾站 •試劑配送器 -容器較佳為平板，及 -移動容器之各個工作站至裝置。 特別試劑配送器可配送.1 0 - 2 0個目標，及多於1 0 0種測試
O:\55\55113.ptc 第11頁 554170 修正 案號 87115977 五、發明說明（8) 化合物。試驗配送器之活動可以人工或自動化進行。 如前述，HTP步驟使用之平板可為96-，384-，864-或 1536孔平板。較佳含有96，384或864孔。
於此步驟（b)後保有之化合物為可與預定目標交互作 用，而不會與任何其它目標或僅與少數目標交互作用或與 其它目標極少交互作用者。選擇要求可隨目標而異，可由 業界人士調整配合。特別依化合物之期望用途而定，只要 化合物與其它不相關目標（例如組織胺受體）不具交互作 用，則可忍受與若干相關目標（例如若干血清素激性受體） 之交互作用。本發明之步驟（b )極為要緊，步驟（b )可決定 藥物發現過程所尋求之選擇性程度。 最佳具體例中，本發明方法進一步包含恰於HTP步驟（b ) 之前或之後，一個高通量前置者開發步驟。此種高通量前 置者開發（n HTLD")步驟包含篩選入選者之藥理性質。特別 HTLD包含篩選入選者之下列性質： -毒性 -代謝，及/或 -藥力學。 毒性較佳經由化合物接觸報告者細胞如人類單核細胞， 及經由根據已知方法測量加標記報告者化合物（亦即C r)之 釋放測定。 代謝就預測該化合物於活體内將如何表現相當重要。化( 合物代謝之測定可經由化合物接觸胞色素P 4 5 0，及測定所 得代謝產物性質而於試管試驗或於基於細胞之檢定分析進 行0
O:\55\55113.ptc 第12頁 554170 皇墓^1115977 年 I 發明說明（9) 華力 產六杜 定分析。 於腸腔細胞杈式，特別Caco-2或MDCK細胞檢 本^月之特定變化方法中， (a)篩選仆入心丄 /邱U)包含： 入選者广及5物存庫有關對預定目標之活性而獲得強力 (b )側錄步驟〔 擇；；ί理性質而獲得強力i擇對預定目標之選 預 τ丁心選擇性及於試管試驗人 $ β開k 對 5 =，步驟（b)包含側錄步驟（a)之二=人類細胞毒性。又 !標之選擇性，於試管試驗對人Γf者有關逐一對 可穿越腸腔模式。特佳且體例f ^類細胞不具毒性，及 P4 5 0存在下之代謝作用二此種方法=測ί化合物於胞色素1 。 古之不意代表圖示於圖3 如此所得前置者可直接用於 =步驟(c)作為模版供設計及合候二選擇計畫，或用 點存庫。焦點存庫可根據後文揭示成及。構關聯之化合物 5，、可含數千種化合物。"結構關聯"f業，已知技術產 计成其化合物含有也存在於前置v =，不此等存庫設 別如實例之揭示，此等存庫含 :構或要素》例如特 塊。特別，焦點存庫者之特定單體或區 徵化前置者，俾決於第-步，，分子特 t括；集具有共通結構特徵之ί置：擇第-步驟也丨 …、點存庫。由第一分析，最常俾口成有限數目之 五 曰 修正
模式化步冑，俾產生焦點.存庫。；ί j其類似物用於分子 早類&物之選擇
554170 案號 87115Q77 /π年丨丨月 曰 修正 五、發明說明（10) 已知類比策略進行，包括類比單體或類比整個結構。此種 類比例如可使用適當軟體藉虛擬篩選存庫進行。然後根據 下述已知組合化學方法產生存庫。 由焦點存庫，重複步驟（a)至（C )而獲得進一步焦點存庫 (步驟（i i ))。依據尋求之選擇性或強度而定，此週期可重 複0至1 0次，較佳1至5次。
最終對此等存庫篩選指定目標（步驟（i i i ))獲得活性化 合物。步驟（i i i )之篩選可根據業界已知方法進行。較佳 步驟（i i i )之篩選係以類似前述步驟（a )及（b )之篩選及側 錄方式進行。此種篩選也可含有額外步驟，例如實例所述 基因毒性檢定分析或功能檢定分析。 前述方法可應用於多種化合物存庫，包括天然來源或經 由眾所周知之組合化學方法獲得之化合物存庫。此等組合 化學方法包括始於單體或區塊，使用例如固體撐體-或液 體合成、平行合成、微珠粒、分割偶合重組或任何其它業 界已知方法合成隨機或焦點系統化合物（N · K · T e r r e t · Μ. Gardner, D. W. Gordon, R. J. Kobylecki, J. Steele." 組合合成。化合物存庫之設計及其應用於藥物發現"。四 面體第51卷，第30期（1995年）8135 - 8173頁）。因而化合物 可為核酸，肽類，其它化學品或其組合。存庫例如包含 5 0 0 0至5 0 0，0 0 0種化合物，例如1 0，0 0 0至2 0，0 0 0種化合 物。 本發明方法可有效用於識別各型活性化合物如藥物候選 者，受體配合基。此等方法之優點為可產生強力且對目標 具選擇性之候選者，因而避免追蹤不佳之前置者。
O:\55\55113.ptc 第14頁 554170 案號 87115977 月 曰 修正 五、發明說明（11) 就此方面而言，本發 包含筛選大量化合物有 作用的能力。更佳試驗 1 0 0，例如5至5 0種。檢 更佳高於5 0種。特佳使 標之不例說明表列示於 育各化合物與各目標， 行。此種篩選例如可於 限時間内進行多次篩選 機械人系統，允許快速 化配送化合物於平板， 目標之能力。為了進行 於其表面及加標記之配 相當短時間内測定多種 本發明也提供改良化 數化合物之焦點存庫， 係衍生自可選擇性結合 然先前技術之焦點存庫 合物，但本發明提供更 不僅有能力結合至目標 者。如此，此等存庫^ 作藥物發現計畫之化合 根據業界已知方法藉由 得。 9 下列實例將揭示本發
明亦係關於一種高通量側錄方法， 關其與大量目標中之指定目標交互 化合物數目為5至500，又更佳5至 定分析之目標數目較佳高於25種， 用高於60如62或73種目標。此等目 表I。化合物之篩選通常係經由培 接者決疋父互作用（例如結合）進 微力價平板進行’因而僅可能於有 。就此方面而言’本發明描述一種 進行筛選’此種機械人系統可自動 接著測、定化合物抑制配合基社人 此種方法，平板通常包含目i i布 合基。如實例所述，此種方法可於 化合物對多種目標（73種）之作用。 合物存庫。特別本發明提供包含複 其中該等化合物具有結構多樣性且 二-個共通預定目標之化合物。雖 主要包含衍生自可結人 為明確界定之存庫，I勺it之化 同時也對該g標具有G^ =生1 較先前存庫之焦點入選 物來源。本文中，"v生用 組合化學方法基於入選者結;】i: 明之進-步細冑’但此等實例僅供
554170 案號 87115977 ^ 曰 五、發明說明（12) 舉例說明之用而非限制本發明之μ 圖說 靶圍 傳統藥物發現方法。 本發明之藥物發現方法。 本發明之藥物發現方法。 經選定之乂選者對大氣 參考化合物：DAG0。 圖5 圖6 修正 圖1 圖2 圖3 圖4 β受體之I C 5 〇之測定^ 12種前置者之結構式。 選3之入選者對人類“受體之親和力。 選疋之入選者之Ητρ資料。由親和力研究.里φ 合物對多重目標進行試驗。目庐 :九選出之化效果係以灰色強度表示，白ί述ΪΪ1。各例中 果。圖底報告表I V所得資料，亦=為最大效 親和力值。 ’亦即化合物對雅片劑受體之 f8 :功能檢定分析：天竺鼠迴腸收縮受選定之前置者 之抑制之測定。 直有 實例 實例1 :對鴉片劑#受體之入選者之選擇 心使用傳統結合檢定分析系統於得自大鼠來源之鴻片劑# 叉體模式中設計、合成及篩選i 0，0 0 0種化合物存庫。特 別，化合物係於溶液以1〇-5Μ濃度於[3H] DAMG0作為放射性k 配合基存在下對大鼠腦皮質均化物進行試驗。藉液體閃 法於與拿洛松（naloxone)競爭下決定特異性結合作用。 初步篩選獲得無數入選者（圖4) : 1 8 〇種化合物抑制放射 性配合基特異性結合至//.受體大於5 〇 %。n丨種抑制大於 圖7
O:\55\55113.ptc 第16頁 554170 五、發明說明
±Ll 月 曰 修正 6 0 %，及4 2種大於7 0 %。為了獲得具有高強度活性化合物， 最末42種化合物用於進一步步驟。 4 2種化合物之結構式經過分析。 4 2種化合物中，2 4種由於化學結構式（亦即與產業應用 不相配）而被捨棄及1 8種被保留進行進一步分析。 其中一種化合物（CER680827)於大鼠/z檢定分析證實不 具有活性。其餘1 7種化合物再根據業界已知方法合成，純 化，及於人類#，（5及/c受體結合檢定分析測量親和力。 如表I I所示，證實5種化合物無活性（C E R 6 8 0 4 3 5， CER728422 ，CER728428 ，CER829741 ，CER838941)可能原
因為初步篩選所見效果可能來自於副產物（初步篩選係以 未純化化合物進行）或因此等化合物之物種選擇性（初步f帛 選係使用大鼠受體進行，而親和力係使用人受體測定）。 但12種入選者對//受體具有預期親和力，其中僅有一種 (CER 7 98 9 6 7 )對（5受體比對#受體之活性更高。此12種化 合物之結構式顯示於圖5。資料摘述於圖6及表I V。 然後此1 2種化合物於Η T P系統試驗，亦即其選擇性側錄 係如表I所述使用6 2種受體測定。用於該用途，1 〇 # μ各 化合物係於表I所示先前塗布以目標之微力價平板於對各 該目標具有特異性之加標記之參考配合基存在下培育。各 化合物重複進行試驗。 所得結果摘述於圖7。ΗΤΡ獲得寶責的資訊，原因為其允4 許顯示已經基於對鴉片劑受體之相對親和力選擇之化合物 中若干者證實對多種不相關目標具有活性。因此，此等化 合物由於非特異性故被拋棄。
〇-\55\55113-910527.ptc 第17頁 554170 k年丨丨月 曰 修正 案號 87115977 五、發明說明（14) 組合強度（入選者對#受體及其它雅片劑受體之親和力） 及選擇性標準選出4種化合物（前置者）作為前置者最佳化 過程之後續追蹤之候選者。此等化合物為CER7〇4252， CER704261 ，CER704889 及CER701830 。 好ί二i:ΐ Γ i艮據本發明所得前置化合物之功能，各 該化&物试驗其抑制天竺鼠迴腸收縮能力如 貫驗程序· ，，段係得自體重3 0 0-3 50克之雄鄧肯哈特利天竺鼠。 組織懸掛於兩根不鏽鋼鉤間置於含氧 之器官浴中，於此處聯結至力—位移氧轉°換%預進皿行熱生理鹽水 測量。藉多通道穩定電流刺激、器介於二鉑 ^力 電磁極（單一脈衝，1毫秒時間大广:上运電場J_ 搐收縮。組織被拉張至最佳靜止張力，《後任赫:平)：：抽’ 30分鐘，其間重複洗滌。抽搐收；：$ V 搐收縮幅度。 干观j丹現該抽 促效劑活性試驗： 組織最初曝露於有效濃度參考促效劑“1^(；〇而證 具有反應性。於洗滌及另一次平衡時間後，組織暾:、、l
種更高濃度試驗化合物或相同促效劑。不同濃“ ：J 加’且保持接觸組織至獲得穩定反應為止。當獲得黑二： 效劑反應（抑制抽搐收縮）時，隨後加入參考拮抗劑=促 松，並於此反應檢視牽涉#受體之最高濃度铷 作用。 观％ σ物之 圖8所示結果證實選用之前置者可抑制天竺 縮，其進一步驗證本發明方法之可信度。 腸收
O:\55\55113.ptc 第18頁 554170 案號 87115977 曰 修正 五、發明說明（15) 此第一週期前置者最適化步驟耗時6週（合成，初步篩 選，確證，對雅片劑受體親和力及ΗΤ Ρ )而可縮短為3週， 亦即藉由縮短ΗΤΡ之週轉時間可縮短為3週。如此導致更快 速更可靠地發現前置者，換言之可避免後續追蹤不佳的前 置候選者。
O:\55\55113.ptc 第19頁 卻扒雙正I 補亦J案號87115977 Λ_日 修正 五、發明說明（16) 表I : ΗΤΡ系統包括之檢定分析表 高通量側錄（ΗΤΡ) 非肽類 腺苷 Α1⑻ A2a(h) A3(h) 腎上腺激性 αΐ α2 βΐ⑻ P2(h) NE攝取 苯并二氮雜革 BZDc BZDp
Cannabinoid CBl(h) CB2⑻ 多巴胺 D1⑻ D2(h) D3(h) D4⑻ D5⑻ 攝取 其他：
GABA 組織胺
HI H2 褪黑激素ML1 蕈毒驗 Ml(h) M2(h) M3(h) M4(h) M5⑻ 鴉片劑 δ κ μ
Phencyclidine 類***素 TXA2(h) PGI2(h) 嘌吟激性 P2X P2Y σ
Orphamn ORL1 血清素激性 5-HTlA(h) 5-HT1B 5-HT2A(h) 5-HT2C(h) 5-HT3 5-HT5a(h) 5-HT6(h) 5-HT7(h) 肽類
血管緊張肚素-II AT-l(h) AT-2(h) Bombesin 緩動激素 CGRP 膽囊激素 CCK-A(h) CCK-B(h) 内皮肽素 ET-A(h) ET-B(h) 鼠激素
PACAP 生長因子 PDGF IL-l(h) TFN 神經激素 NK1⑻ NK2(h) NK3(h) 神經肽Y Y1⑻ Y2⑻ 神經緊張肽素 生長靜止素 VIP 後葉加壓素 Vla(h) V2 離子通道 鈣通道(L) 鉀通道 伏特-dpdt 約-dpdt 鈉通道 位置1 位置2 氯離子基團 化學激素 CCR1
0 \55\55ll3-910527.ptc 第20頁 554170 修正 _案號 87115977 五、發明說明（17) 表II :含括於HTP系統之酶清單 族 名稱 磷酸二酯酶類 PDEII (h) PDEIV ⑻ 蛋白質激酶類 MAP激酶(h) PKc 酪胺酸激酶類 EGF-tyr激酶⑻ p56-tyr 激酶 蛋白解酶類 血管緊張肽素轉化酶(ACE)(h) 組織蛋白酶B(h) 彈力蛋白酶⑻
(h)表示該檢定分析係使用人類來源之酶進行
O:\55\55113.ptc 第21頁 554170 修正 案號87115977 q G年丨丨月 曰 五、發明說明（18)
表III : HTP系統之典型檢定分析表 受體偶合蛋白質G 受體非肽類 腺苷 场） 腎上腺激性 αι α2 βι β2 多巴胺 D/h) D2⑻ 組織胺 褪黑激素 Hi MLi 蕈毒驗 M/h) M3⑻ 雅片劑 μ⑻ 血清素 5-HT1A(h) 5-HT1D 5-HT2C(h) 5-HT6(h) σ σΐ 受體肽類 血管緊張肽素 ATl(h) Bombesine BB 缓動激素 b2 CGRP CGRP ⑻ 膽囊激素 CCKA(h)
4P 痛離
Bill O:\55\55113.ptc 第22頁 554170 _案號 87115977 五、發明說明（19) 十年丨（月 曰 修正 化學激素及細胞激素LL-L β CCR2 ⑻ 内皮肽素 BTA(h) 虱激素 風激素(h) 肝糖類肽 GLP-1 ⑻ 神經激素 肌⑻ 神經肽Υ Yi(h) 後葉加壓素 ，V1A〇i) 受體偶合離子通道 本并二氣雜章中心 BZDC 血清素 5-HT3 運輸者 新腎上腺素 NE攝取(h) 多巴胺 DA攝取(h) 血清素 5-HT攝取 離子通道 轉通道 Ca(verapmil) 鉀通道 K(ATP依賴型) 納通道 Na(位置2) 氣通道 Cl離子基團 酶 磷酸二酯酶類. PDE 11(h) PDE IV(h)
11·1 O:\55\55113.ptc 第23頁 554170 _案號 87115977 五、發明說明（20) 曰 修正 蛋白質激酶類 酪胺酸激酶類 蛋白解酶類 基於細胞之檢定分析 細胞激素 自由基 黏著 細胞毒性 (h ··試驗係對人類蛋白質進 MAP激酶(h)
PKC EGF-tyr 激酶(h) p56-tyr 激酶 血管緊張肽素轉化酶(ACE)(h) 組織蛋白酶B⑻ 彈力蛋白酶(li) 人類單核細胞之TNF-α之分泌 人類顆粒細胞(HL-60)之〇2之分泌 人類單核細胞(U937)對人類内皮細胞 人類單核細胞
11111 O:\55\55113.ptc 第24頁 554170 修正 案號87115977 年U月 曰 五、發明說明（21) 表IV :入選者對雅片受體之親和力 化合物 μ δ Κ 化合物 μ δ κ CER680435 - - - CER710830 328 7300 - CER680827 - - - CER728422 - - - CER703950 1300 3300 3600 CER728428 - - - CER704252 632 - - CER812221 2500 4800 4700 CER704261 257 - - CER829741 - 8400 - CER704478 364 2400 - CER838941 - - CER704889 53 1700 - CER833240 1200 3600 - CER709929 626 2500 10000 CER703696 ,512 1400 744 CER710110 1100 歸 _ CER798967 640 400 1500
化合物之親和力係以η Μ表示。符號π - π指示於試驗濃度範 圍（0.1至10,000 ηΜ)不存在有效果。 «·
O:\55\55113.ptc 第25頁 554170 案號 87115977 年11月 曰 修正 圖式簡單說明 I1IH1 第26頁 O:\55\55113.ptc

Claims (1)

  1. 554170 案號 87115977 Λ2 年/月 TO 六、申請專利範圍 1. 一種高通量篩選方法，其係用於由一化合物存庫識別 前置者（1 eads)，該方法包含下列步驟： (a)篩選一化合物存庫有關其可結合預定目標或調節 預定目標（tar get):其中該篩選係由分別於一容器中混合 該化合物及該目標及利用酵素性方法進行，螢光為基底之 方法或放射性分析偵測該目標之結合或其活性，該目標係 選自受體、蛋白質、受體之一部份、抗體、配位基、傳染 性顆粒、黴菌及核酸，以得到可結合至目標或調節目標活 性之強力入選者；及 (b )偵測步驟（a )中可結合至超過2 5個目標或調節超過 2 5個目標活性之能力之所有強力入選者，該目標係選自至 少： 一非肽類G偶合受體，
    —狀類G偶合受體， 一離子通路偶合受體； 一離子通路， 及 其係藉由於一容器中混合該化合物及該目標及利 用酵素性方法進行，螢光為基底之方法或放射性分析偵測 該目標之結合或其活性，及 (c )選擇步驟（b )中具有可結合或調節步驟（a )之所欲 目標之能力且不與步驟（b)中任何其他目標或僅與其中少 數交互作用或與其他目標極少交互作用之強力入選者。 2. —種由一化合物存庫識別活性化合物之方法，該方法 包含：
    O:\55\55113-920728.ptc 第27頁 554170 _案號 87115977 六、申請專利範圍 7月 0_ (i )高通量篩選包含下列步驟： (a )篩選一化合物存庫中可與預定目標互相作用 者，其中該篩選係由分別於一容器中混合該化合物及該目 標及利用酵素性方法進行，螢光為基底之方法或放射性分 析偵測該目標之結合或其活性，該目標係選自受體、蛋白 質、受體之一部份、抗體、配位基、傳染性顆粒、黴菌及 核酸，以得到可結合至目標或調節目標活性之強力入選 者；及
    (b )偵測步驟（a )中所有強力入選者結合至超過2 5個目 標或調節超過2 5個目標活性之能力，該目標係選自至少： -非狀類G偶合受體， -月太類G偶合受體， -離子通路偶合受體；及 -離子通路， 其係藉由於一容器中混合該化合物及該目標及利 用酵孝性方法進行，螢光為基底之方法或放射性分析偵測 該目標之結合或其活性，及
    (c )製備結構上與步驟（b )前置者相關之化合物之 焦點存庫，其係藉將前置者分子特徵化，以決定其組成區 塊，叢集具有共通結構特徵之前置者及利用最常見區塊及 其類似物進行分子模式化； (i i )使用步驟（c)之焦點存庫重複步驟（i ) 一次或數次 而產生進一步焦點存庫，及 (i i i )篩選及側錄步驟（i i )之焦點存庫而獲得可對抗
    O:\55\55113-920728.ptc 第28頁 554170 修正 案號87115977 01年公月 日 / 六、申請專利範圍 該目標活性之特定化合物。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該步驟（a)之篩選 進一步包含測量可結合至預定目標之化合物之親和力，俾 選擇具有最佳親和力之化合物作為強力入選者。 4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該側錄步驟 (b)包含檢定分析強力入選者對多種目標之作用及選擇對 預定目標具特異性之化合物。 5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該侧錄步驟（b)包 含檢定分析強力入選者對於超過5 0種目標之作用。
    6. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該侧錄步驟（b)包 含檢定分析強力入選者對於超過70種目標之作用。 7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於步驟（b)中侧錄 5至500種強力入選者。 8. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該化合物存庫 包含5, 000至500, 000種化合物。 其中該化合物存庫包 ，其中該活性化合物為 ，其中該活性化合物為 9 .如申請專利範圍第6項之方法， 含10, 000至20, 000種化合物。 1 0 .如申請專利範圍第2項之方法 藥物候選者。 1 1 .如申請專利範圍第2項之方法 受體配合基。 1 2 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該步驟（a ) 之篩選包括選擇可結合至受體之化合物，其係藉由測量其 抑制該受體之特異標籤化配位基之結合。
    O:\55\55113-920728.ptc 第29頁 554170 _案號 87115977 六、申請專利範圍 Ά 曰 修正 13.根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該步驟（a) 之篩選包括選擇可結合至受體之化合物，其係藉由測量其 修飾酵素活性之能力。 1 4 .如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該步驟（b )包 括偵測步驟（a)中所有強力入選者結合至受體之能力，該 受體選自至少： -非肽類G偶合受體，包括腺受體，腎上腺激性受體、 多巴胺受體、組織胺受體、褪黑激素受體、蕈毒鹼受體及 σ受體；
    -肽類G偶合受體，包括血管緊張肽素受體、蛙皮素受 體、緩動激素受體、膽囊激素受體、化學激素受體、内皮 肽素受體、虱激素受體、神經激素受體、神經肽Υ受體及 後葉加壓素受體； -離子通道偶合受體，包括血清激素受體；及 -離子通道，包括4弓通道及卸通道。 1 5 .根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該步驟（b ) 包括至少偵測步驟（a)中所有強力入選者結合至如下所列 目標或調節如下所列目標之活性：
    高通量側錄（HTP) 非肽類 GABA 血清素激性 生長因子 腺苷 組織胺 5-HTlA(h) PDGF A1⑻ H1 5-HT1B IL-l(h) A2a(h) H2 5-HT2A ⑻ TFN A3⑻ 褪黑激素ML1 5-HT2C(h) 神經激素 腎上腺激性 蕈毒鹼 5-HT3 NKl(h) αΐ Ml⑻ 5-HT5a(h) NK2⑻ 〇2 M2(h) 5-HT6(h) ΝΤΟ⑻ βΐ⑻ M3(h) 5-HT7(h) 神經肽Υ
    O:\55\55113-920728.ptc 第30頁 554170 _案號 87115977 六、申請專利範圍 Ά 曰 修正 M4(h) 肽類 Y1⑻ M5(h) 血管緊張肽素-II Y2(h) 鴉片劑 ΑΤ-1 ⑻ 神經緊張S太素 δ AT-2(h) 生長靜止素 κ Bombesin VIP μ 缓動激素 後葉加壓素 Phencyclidine CGRP Via⑻ V2 類***素 膽囊激素 離子通道 TXA2 ⑻ CCK-A ⑻ |弓通道(L) PGI2(h) CCK-B(h) If通道 ϋ票吟激性 内皮肽素 伏特-dpdt > Ρ2Χ ET-A(h) 姜弓-dpdt Ρ2Υ ET-B(h) 納通道 σ 乱激素 位置1 位置2 氣離子基團
    β2⑻ ΝΕ攝取 苯并二氮雜萆 BZDc BZDp Cannabinoid CBl(h) CB2⑻ 多巴胺 D1⑻ D2(h) D3(h) D4⑻ D5⑻ 攝取 其他： amp Orphanin ORL1 PACAP 化學激素 CCR1
    1 6.根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該容器為
    O:\55\55113-920728.ptc 第31頁 554170 _案號 87115977 六、申請專利範圍 曰 修正 平板。 1 7.根據申請專利範圍第1 6項之方法，其中該平板係為 微滴孔平板。 1 8.根據申請專利範圍第1 7項之方法，其中該微滴孔平 板為9 6孔平板，以及具有較高孔數之平板。 1 9.根據申請專利範圍第1 8項之方法，其中之孔數係為 3 84、864、1536 或更多。
    O:\55\55113-920728.ptc 第32頁
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