DE69829299T2 - Verfahren zur identifizierung von leitstrukturen oder aktiven verbindungen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren für die Auswahl von Führungssubstanzen oder aktiven Verbindungen aus Banken. Insbesondere stellt die Erfindung Verfahren für die Auswahl von Führungssubstanzen oder Verbindungen bereit, die gegenüber einer erwünschten Zielstruktur aktiv und selektiv sind. Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise in Verfahren der Wirkstoffauffindung verwendet werden.
  • Die gängigen Methoden in der Wirkstoffauffindung beinhalten die Durchmusterung großer Mengen von Verbindungen natürlichen Ursprungs oder von Verbindungen, die durch Verfahren der kombinatorischen Chemie gewonnen wurden. Solche Verfahren sind z.B. in „The Journal of Immunological Methods" (1996, 193, 2, 189–197) und in „Molecular diversity" (1996, 1, 4, 233–240) beschrieben.
  • Üblicherweise werden in einem einzigen Durchgang der Wirkstoffauffindung Banken mit mehreren Dutzend oder Hunderttausenden von Verbindungen getestet (1). Die ausgewählten Verbindungen, Treffer genannt, können sehr zahlreich sein. Die durchschnittliche Trefferrate wird auf 0,1% geschätzt. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Durchmusterung einer Bank mit 100.000 Verbindungen 100 Treffer erzeugt. Vom Treffer bis zum Kandidatenwirkstoff ist es ein langer Prozess, der mehrere Syntheserunden und die Durchmusterung fokussierter chemischer Banken beinhaltet. Dieser Prozess der Führungssubstanzoptimierung ist sehr zeitaufwändig und erfordert ein großes Budget.
  • In der Tat werden Treffer, die weiter untersucht werden sollen, üblicherweise auf der Basis ihrer Aktivitätsstärke gegenüber der Zielsubstanz, auf die sie durchmustert wurden, ausgewählt. Jede Runde der Führungssubstanzoptimierung sollte die Herstellung wirkungsvollerer Verbindungen erlauben. Wenn wenige Treffer die erwartete Wirkung aufweisen, üblicherweise nach mehreren Optimierungsrunden, werden sie zu Führungssubstanzen, die anschließend auf ihre Selektivität gegen eine große Anzahl biologischer Zielstrukturen getestet werden („Profilbestimmung der Führungssubstanz"). Die Wirkstoffkandidaten werden auf Basis ihrer Affinität für die ausgewählte Zielstruktur und ihre Spezifität für diese Zielstruktur ermittelt (d.h. sie sollten keine Wirkung gegenüber Zielstrukturen zeigen, die mit der im Mittelpunkt des Programms stehenden Erkrankung in keiner Beziehung stehen). Es ist nicht selten, dass sich die ausgewählten Führungssubstanzen als unspezifisch erweisen, so dass sie höchstwahrscheinlich unerwünschte Wirkungen verursachen. In diesem Fall ist es notwendig, das Verfahren von einem weniger wirkungsvoller Treffer ausgehend wieder zu beginnen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren für die Identifizierung von Führungssubstanzen oder wirksamen Verbindungen aus Banken. Die Erfindung betrifft auch ein Hochdurchsatz-Profilbestimmungsverfahren, das die Durchmusterung selektiver Verbindungen aus großen und unterschiedlichen Zusammensetzungen erlaubt. Die Erfindung stellt auch neuartige fokussierte Banken bereit, die eine Vielzahl von Verbindungen mit strukturell vielfältigen, jedoch funktional gemeinsamen Eigenschaften umfassen.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung betreffen insbesondere die Bestimmung der Trefferspezifität („Profilbestimmung") in einer sehr frühen Phase des Wirkstoffauffindungsprozesses. Diese neuen Verfahren erlauben die Identifizierung von Führungssubstanzen mit verbesserten Eigenschaften (d.h. das Verbinden der Kriterien Stärke und Selektivität gegenüber einer gegebenen Zielstruktur), die gegebenenfalls in Führungssubstanzoptimierungsprozessen verwendet werden können, um Wirkstoffkandidaten vorhersagbarer und mit geringeren Kosten zu identifizieren.
  • Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Identifizierung von Führungssubstanzen aus einer Verbindungsbank bereitzustellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegen eine erwünschte Zielstruktur, um wirkungsvolle Treffer zu erlangen;
    • (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a), um so wirkungsvolle und selektive Führungssubstanzen zu erhalten.
  • Wie oben erklärt, beinhalten die bestehenden Verfahren der Wirkstoffauffindung oder Führungssubstanzauswahl eine Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegenüber einer erwünschten Führungssubstanz, und die so erhaltenen Treffer werden anschließend in einer Führungssubstanzoptimierungsrunde weiter prozessiert, so dass die Führungssubstanzen hergestellt werden. Allerdings basieren diese Schritte nur auf der Durchmusterung von Banken oder fokussierten Banken auf eine erwünschte Zielstruktur hin, d.h. auf die Auswahl von Verbindungen mit der Fähigkeit, mit einer gegebenen Zielstruktur zu interagieren. Keines der bestehenden Verfahren beinhaltet allerdings einen Profilbestimmungsschritt gemäß der vorliegenden Erfindung. Das erfindungsgemäße Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahren stellt einen solchen Profilbestimmungsschritt der Bank bereit, so dass die erhaltenen Führungssubstanzen sowohl das Kriterium der Wirksamkeit (Fähigkeit, mit einer gegebenen Zielsubstanz zu interagieren) als auch Selektivität (geringe oder Fehlen von Interaktion mit anderen Zielstrukturen) in sich vereinen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Identifizierung aktiver Verbindungen aus einer Verbindungsbank bereitzustellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (i) eine Hochdurchsatz-Durchmusterung, umfassend die Schritte:
    • (a) Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegen eine erwünschte Zielstruktur, um so wirkungsvolle Treffer zu erhalten;
    • (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a), um so wirkungsvolle und selektive Führungssubstanzen zu erhalten;
    • (c) Herstellung (einer) fokussierter(n) Bank(en) von Verbindungen, die strukturell mit den Führungssubstanzen aus Schritt (b) verwandt sind;
    • (ii) ein- oder mehrmalige Wiederholung von Schritt (i) unter Verwendung der fokussierten Bank(en) aus Schritt (c), um so weiter fokussierte Banken herzustellen, und
    • (iii) Durchmusterung und Profilbestimmung der fokussierten Banken aus Schritt (i) oder (ii) auf Aktivität gegen die Zielstruktur, um so aktive und spezifische Verbindungen zu erhalten.
  • Dieses Verfahren ist in 2 dargestellt und umfasst sowohl die sequentiellen Schritte des Führungssubstanz-Identifizierungsverfahrens wie oben offenbart als auch die Führungssubstanz-Optimierungsschritte, welche die aktiven Verbindungen herstellen.
  • Um der Klarheit willen bezeichnet der Ausdruck „Treffer" im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede beliebige Verbindung, die nach einem Durchmusterungsschritt einer primären Bank ausgewählt wurde. Ein Treffer ist daher eine Verbindung, die nach der ersten Stufe der Selektion gewonnen wurde, und die daher wenigstens die minimale Wirksamkeit gegenüber einer erwünschten Zielstruktur besitzt. Eine „Führungssubstanz" ist ein optimierter Treffer, d.h. ein Treffer, dessen Wirksamkeit bestätigt wurde, wobei vorzugsweise ein unterschiedlicher Auswahltest verwendet wurde. Führungssubstanzen sind daher Verbindungen, die nach wenigstens 2 Durchmusterungsschritten gewonnen wurden. Führungssubstanzen stellen das Ausgangsmaterial für weitere Optimierungsschritte dar, welche die Ausgestaltung fokussierter Banken, Auswahl wirkungsvoller Verbindungen, deren chemische Modifikation, funktionale Überprüfung, etc. umfassen, und welche Wirkstoffkandidaten erzeugen.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Bank auf Aktivität gegenüber einer ausgewählten Zielstruktur durchmustert. Im Allgemeinen kann die Zielstruktur jedes beliebige Molekül sein, beispielsweise ein Rezeptor, ein Protein, ein Teil eines Rezeptors, ein Antikörper, ein Ligand; ein infektiöses Partikel, wie ein Virus, ein Bakterium, ein Pilz oder eine Nukleinsäure, etc., entweder auf dem Gebiet der Pharmazeutik oder der Agrochemie. Vorzugsweise ist die Zielstruktur ein Molekül, das in biologischen oder pathologischen Reaktionswegen beteiligt ist, beispielsweise ein Rezeptor, ein Enzym, ein Nukleinsäurebereich, ein Ionenkanal, etc. Besondere Arten von Zielstrukturen sind beispielsweise Rezeptoren, wie diejenigen, die in der Tabelle I aufgeführt sind, und Enzyme, wie sie in Tabelle II aufgeführt sind.
  • Wie oben angegeben, umfasst Schritt (a) der beanspruchten Verfahren die Durchmusterung einer Bank auf Aktivität gegenüber einer gegebenen Zielstruktur. Die Durchmusterung auf Aktivität gegenüber einer gegebenen Zielstruktur betrifft im Allgemeinen die Auswahl beliebiger Verbindungen der Bank mit der Fähigkeit, mit der Zielstruktur zu interagieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „Interaktion" entweder physikalische oder funktionale Interaktion. Vorzugsweise umfasst in Schritt (a) des Verfahrens das Durchmustern nach Verbindungen mit Aktivität gegenüber einer erwünschten Zielstruktur die Durchmusterung (oder Auswahl) von Verbindungen, die in der Lage sind, an die erwünschte Zielstruktur zu binden, die Aktivität eines Enzyms zu modifizieren oder die Expression eines Gens zu regulieren.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst Schritt (a) das Durchmustern nach Verbindungen, die an eine Zielstruktur binden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fähigkeit einer Verbindung, an eine gegebene Zielstruktur zu binden, durch die Fähigkeit der Verbindung gemessen, die Bindung eines Referenzstoffs, ein markiertes Molekül, an die Zielstruktur zu inhibieren. Beispielsweise kann die Fähigkeit einer Verbindung, an einen gegebenen Zielrezeptor zu binden, anhand der Fähigkeit der Verbindung gemessen werden, die Bindung eines markierten Liganden des Rezeptors an den Zielrezeptor zu inhibieren. Für diesen besonderen Fall umfasst die Durchmusterung daher für jede Verbindung die Bestimmung der Prozent Inhibition der Bindung eines markierten Liganden an die Zielstruktur. Die Fähigkeit einer Verbindung, an eine gegebene Zielstruktur zu binden, kann auch in einem Zell-basierten Assay gemessen werden. Insbesondere kann die Bindung durch Messung der Wirkung, die durch die Verbindung innerhalb der Zelle induziert wird, mit geeigneten Markern ermittelt werden.
  • In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst Schritt (a) die Durchmusterung nach Verbindungen, die in der Lage sind, die Aktivität eines Enzyms zu modifizieren. Diese Modifikation beinhaltet beispielsweise die Stimulierung oder Inhibition der Aktivität des Enzyms oder die Veränderung der Spezifität oder der Regulation der Aktivität des Enzyms.
  • Die Aktivität der Verbindung im Hinblick auf die Zielstruktur kann mit verschiedenen, dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden, beispielsweise enzymatische (insbesondere immunoenzymatische) Verfahren, Fluoreszenz-basierte Nachweisverfahren oder Radioassays. Als besonders geeignete Beispiele für Fluoreszenz-basierte Nachweistechniken kann Fluoreszenzpolarisierung, die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (Eigen et al., PNAS 91 (1994) 5740) und die zeitaufgelöste Fluoreszenz als Beispiele genannt werden. Bevorzugte Beispiele solcher Techniken beinhalten beispielsweise PSA (Baum et al., Anal. Biochem. 237 (1996) 129), HTRF (Mathis G., Clin. Chem. 39 (1993) 1953). Im Hinblick auf geeignete Beispiele für Radio-/Immunoassays ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, beispielsweise ELISA oder IRA zu verwenden.
  • Diese Verfahren können in in vitro-Systemen oder in Zell-basierten Assays, wie im Experimentalteil beschrieben, ausgeführt werden. Insbesondere werden diese Assays im Allgemeinen in Behältern wie Platten (Mikrowell-Platten) ausgeführt, die mit den geeigneten Reagenzien beladen sind (Zielstruktur, Puffer, Versuchsverbindung). Geeignete Platten umfassen 96-well-Platten und Platten mit einer höheren Anzahl von wells (Vertiefungen), insbesondere 384, 864, 1536 oder mehr. Solche Platten sind kommerziell erhältlich.
  • Damit das Durchmusterungsverfahren genauer wird, wird man vorzugsweise die Aktivität der Verbindungen im Hinblick auf die Zielstruktur bestätigen. Eine Bestätigung kann beispielsweise erreicht werden, indem einfach das oben genannte Durchmusterungsverfahren wiederholt wird, wobei jedoch die Verbindung in einer isolierten oder aufgereinigten Form verwendet wird und nicht als Bestandteil der gesamten Bank. In Abhängigkeit von der Größe der Ausgangsbank kann die Anzahl der bestätigten Treffer zwischen 5 und 500 schwanken, üblicherweise zwischen 5 und 100.
  • Ferner umfasst die Durchmusterung in Schritt (a) in einer bevorzugten Ausführungsform die Messung der Affinität der Verbindungen, die in der Lage sind, an die erwünschte Zielstruktur zu binden, um als wirkungsvolle Treffer die Verbindungen auszuwählen, welche die beste Affinität besitzen. Um die Affinität zu bestimmen, werden die bestätigten Treffer üblicherweise resynthetisiert und aufgereinigt. Die Affinität wird anschließend mit dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt, beispielsweise mit der „Scatchard"-Analyse, wie sie in den Beispielen offenbart ist. Ebenso können während dieses Schrittes Verbindungen weiterhin verworfen werden auf Grund ihrer chemischen Struktur.
  • Verbindungen, die durch die Durchmusterung gemäß Schritt (a) gewonnen wurden, im Allgemeinen zwischen 5 und 500, werden anschließend Schritt (b) unterworfen. Der Profilbestimmungsschritt (b) umfasst allgemein gesagt das Austesten der wirkungsvollen Treffer auf verschiedenen Zielstrukturen und die Auswahl der Verbindungen, die für die erwünschte Zielstruktur spezifisch sind. Dieser Schritt ermöglicht daher die Führungssubstanzen zurückzubehalten, welche die erwartete Wirkung gegenüber der Zielstruktur und ein gutes Selektivitätsprofil aufweisen. Schritt (b) umfasst üblicherweise die Bestimmung der Fähigkeit der ausgewählten Treffer, mit verschiedenen Zielstrukturen zu interagieren, vorzugsweise an sie zu binden.
  • In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung umfasst Schritt (b) das Testen der wirkungsvollen Treffer an mehr als 25 Zielstrukturen. In einer besonderen Ausführungsform umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) das Testen der wirkungsvollen Treffer an mehr als 50 Zielstrukturen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) das Testen der wirkungsvollen Treffer an mehr als 60 Zielstrukturen. Erläuternde Beispiele von Zielstrukturen, die in Schritt (b) getestet werden können, sind in Tabelle I unten aufgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) das Durchmustern der ausgewählten Treffer an den folgenden Zielstrukturen, wenigstens:
    • – nicht-peptidische G-gekoppelte Rezeptoren, umfassend einen Adenosinrezeptor, einen adrenergen Rezeptor, einen Dopaminrezeptor, einen Histaminrezeptor, einen Melatoninrezeptor, einen muscarinischen Rezeptor und einen Sigma-Rezeptor;
    • – peptidische G-gekoppelte Rezeptoren, umfassend einen Angiotensinrezeptor, einen Bombesinrezeptor, einen Bradykininrezeptor, einen Cholecystokininrezeptor, einen Chemokinrezeptor, einen Endothelinrezeptor, einen Galaninrezeptor, einen Neurochininrezeptor, einen Neuropeptid-Y-Rezeptor und einen Vasopressinrezeptor;
    • – einen Ionenkanal-gekoppelten Rezeptor, umfassend einen Serotoninrezeptor; und
    • – Ionenkanäle, umfassend einen Calciumkanal und einen Kaliumkanal.
  • Sogar noch bevorzugter umfassen die getesteten Zielstrukturen weiterhin:
    • – Enzyme, einschließlich einer Phosphodiesterase und einer Tyrosinkinase, und gegebenenfalls eine Proteinkinase und eine Protease.
  • In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform umfasst der Profilbestimmungsschritt ferner einen oder mehrere Zell-basierte Assays, ausgewählt aus:
    • – einem Cytokin-Sekretionsassay, wie einem TNF-α-Sekretionsassay auf humanen Monozyten;
    • – einem freie Radikale-Assay, wie einem O2-Sekretionsassay auf humanen Granulozyten (z.B. HL60);
    • – einem Adhäsionsassay, insbesondere zwischen humanen Monozyten (z.B. U937-Zellen) und humanen endothelialen Zellen;
    • – einem Cytotoxizitätsassay, beispielsweise auf humane Monozyten.
  • In einer typischen erläuternden spezifischen Ausführungsform der Erfindung umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) die Durchmusterung der Verbindungen gegen jede einzelne Zielstruktur, die in Tabelle III aufgelistet ist.
  • In einer weiteren typischen erläuternden spezifischen Ausführungsform der Erfindung umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) die Durchmusterung der Verbindung gegenüber jeder einzelnen Zielstruktur, die in Tabelle I aufgelistet ist.
  • Die Fähigkeit dieser Verbindungen, mit diesen Zielstrukturen zu interagieren oder an sie zu binden, kann in vitro oder in Zell-basierten Systemen gemäß derselben Methodik bestimmt werden, wie sie in Schritt (a) beschrieben ist. Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Fähigkeit, für eine große Anzahl von Verbindungen (wirkungsvollen Treffern) eine Profilbestimmung auszuführen, um im Hinblick auf Verfahren des Stands der Technik verbesserte Führungssubstanzen herzustellen. Diesbezüglich, um den Profilbestimmungsschritt (b) zu erleichtern, hat der Anmelder ein Konzept der Hochdurchsatz-Profilbestimmung (High Throughput Profiling „HTP") entwickelt, die es erlaubt, zahlreiche Verbindungen (beispielsweise im Bereich von einem bis zweihundert) schnell in vitro gegenüber einer großen Anzahl von Zielstrukturen, wie sie oben offenbart sind, zu testen. Insbesondere umfasst dieses HTP ein Robotersystem, das in der Lage ist, bis zu 20 Protokolle (ein Protokoll pro Zielstruktur) pro Tag auszuführen. Dieses Verfahren ist in den Beispielen detaillierter offenbart. Grundsätzlich wird, in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, die HTP ausgeführt, indem eine Vorrichtung verwendet wird, welche die folgenden Elemente umfasst:
    • – Arbeitsstationen, umfassend:
    • • mehrere Inkubatoren, vorzugsweise 2 oder 3
    • • eine oder mehr Filtrierstationen
    • • Reagenzien-Spender
    • – Behälter, vorzugsweise Platten und
    • – Mittel, um die Behälter zu den verschiedenen Arbeitsstationen zu bewegen.
  • Insbesondere erlauben die Reagenzien-Spender die Verteilung von 10–20 Zielstrukturen und über 100 Testverbindungen. Der Reagenzien-Spender kann manuell oder automatisiert bedient werden.
  • Wie oben dargelegt, können die die in der HTP verwendeten Platten 96-, 384-, 864- oder 1536-well-Platten sein. Vorzugsweise enthalten sie 86, 384 oder 864 wells (Vertiefungen).
  • Die Verbindungen, die nach dem Schritt (b) zurückbehalten werden, sind diejenigen, die mit der erwünschten Zielstruktur interagieren und die mit keiner anderen Zielstruktur interagieren oder nur mit wenigen von ihnen oder schwach mit anderen Zielstrukturen interagieren. Die Anforderungen an die Selektivität können von einer Zielstruktur zur nächsten variieren und können vom Durchschnittsfachmann angepasst werden. Insbesondere, in Abhängigkeit von der erwarteten Verwendung der Verbindungen, kann eine Interaktion mit mehreren verwandten Zielstrukturen (beispielsweise mehreren Serotoninrezeptoren) toleriert werden, solange die Verbindung keine Interaktion mit anderen nicht-verwandten Zielstrukturen aufweist (beispielsweise einem Histaminrezeptor). Schritt (b) des vorliegenden Verfahrens ist sehr wichtig hinsichtlich der Tatsache, dass er den Grad an Selektivität bestimmt, die im Wirkstoff-Auffindungsprozess gesucht wird.
  • In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin einen Hochdurchsatzschritt zur Führungssubstanzentwicklung, direkt vor oder nach Schritt (b). Diesbezüglich umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Ausdruck Profilbestimmung die Bestimmung der Spezifität genauso wie die Bestimmung der pharmakologischen Eigenschaften (d.h. den Führungssubstanz-Entwicklungsschritt). Dieser Hochdurchsatz-Führungssubstanz-Entwicklungsschritt („HTLD") umfasst vorzugsweise die Durchmusterung der Treffer auf ihre pharmakologischen Eigenschaften. Insbesondere umfasst HTLD die Durchmusterung der Treffer auf die folgenden Eigenschaften:
    • – Toxizität,
    • – Metabolismus und/oder
    • – Pharmakokinetik.
  • Die Toxizität wird vorzugsweise bestimmt, indem die Verbindungen mit Reporterzellen kontaktiert werden, beispielsweise humane Monozyten, und indem die Freisetzung einer markierten Reporterverbindung (z.B. Cr) gemäß bekannter Verfahren gemessen wird.
  • Der Metabolismus ist im Rahmen einer Voraussage wichtig, wie sich die Verbindung in vivo verhalten würde. Die Bestimmung des Metabolismus der Verbindungen kann in vitro oder mit Zell-basierten Assays ausgeführt werden, indem die Verbindung mit Cytochrom(en) P450 kontaktiert wird und die Eigenschaften der resultierenden Metaboliten bestimmt werden.
  • Die Pharmakokinetik wird vorzugsweise in einem Zellmodell des intestinalen Lumens, insbesondere mit Caco-2- oder MDCK-Zellen, getestet.
  • In einer besonderen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst Schritt (i) deshalb:
    • (a) Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegen eine erwünschte Zielstruktur, um wirkungsvolle Treffer zu erlangen; und
    • (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a) auf Selektivität für die erwünschte Zielstruktur und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, um so wirkungsvolle und selektive Führungssubstanzen zu erhalten.
  • Noch mehr bevorzugt umfasst Schritt (b) die Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a) auf Selektivität für die erwünschte Zielstruktur und Fehlen von Toxizität für humane Zellen in vitro. Sogar noch bevorzugter umfasst Schritt (b) die Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a) auf Selektivität für die erwünschte Zielstruktur, das Fehlen von Toxizität für humane Zellen in vitro und die Fähigkeit, ein Modell basierend auf intestinalem Lumen zu durchqueren. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden die Verbindungen auch auf ihren Metabolismus in Gegenwart von Cytochrom(en) P450 getestet. Eine schematische Darstellung solcher Verfahren ist in 3 dargestellt.
  • Die dadurch erhaltenen Führungssubstanzen können entweder direkt in einem Wirkstoffkandidaten-Auswahlprogramm oder im Schritt (c) des Verfahrens verwendet werden, um als Vorlagen zu dienen, um fokussierte Verbindungsbanken zu entwickeln und zu synthetisieren, die strukturell mit ihnen verwandt sind. Diese fokussierten Banken können gemäß den unten offenbarten Techniken hergestellt werden und sind dem Durchschnittsfachmann bekannt, und sie können mehrere tausend Verbindungen enthalten. Der Ausdruck „strukturell verwandt" zeigt an, dass diese Banken entwickelt worden sind, so dass ihre Verbindungen Strukturen oder Motive enthalten, die auch in den Führungssubstanzen vorliegen. Z.B. können diese Banken spezifische Monomere oder Blöcke, die in den Führungssubstanzen identifiziert wurden, enthalten, wie es in den Beispielen offenbart ist. Insbesondere beinhaltet die Konstruktion fokussierter Banken in einem ersten Schritt die molekulare Charakterisierung der Führungssubstanzen, um ihre konstitutiven Blöcke zu bestimmen. Gegebenenfalls kann dieser anfängliche Schritt auch das Zusammenfassen von Führungssubstanzen beinhalten, die gemeinsame strukturelle Charakteristiken besitzen, um eine begrenzte Anzahl fokussierter Banken zu synthetisieren. Ausgehend von dieser ersten Analyse werden die üblichsten Blöcke und ihre Analogen in einem molekularen Modellierungsschritt verwendet, um die fokussierte Bank herzustellen. Die Wahl der Analogen kann gemäß verschiedener, bekannter Analogisierungsstrategien ausgeführt werden, einschließlich der Analogisierung von Monomeren oder dem Analogisieren der gesamten Struktur. Dieses Analogisieren kann z.B. mit geeigneter Software mittels einer virtuellen Durchmusterung von Banken durchgeführt werden. Die Banken werden anschließend gemäß bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie, wie sie unten offenbart sind, hergestellt.
  • Ausgehend von diesen fokussierten Banken können die Schritte (a) bis (c) wiederholt werden, so dass weitere fokussierte Banken gewonnen werden (Schritt (ii)). In Abhängigkeit von der Selektivität oder Wirksamkeit, die gesucht wird, kann diese Runde 0 bis 10 Mal wiederholt werden, vorzugsweise 1 bis 5 Mal.
  • Diese Banken werden letztendlich auf die gegebene Zielstruktur hin durchmustert (Schritt (iii)), so dass aktive Verbindungen gewonnen werden. Die Durchmusterung gemäß Schritt (iii) kann gemäß Verfahren ausgeführt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Vorzugsweise wird die Durchmusterung gemäß Schritt (iii) auf eine ähnliche Weise ausgeführt, wie die Durchmusterung und Profilbestimmung der oben angegebenen Schritte (a) und (b). Diese Durchmusterung kann auch zusätzliche Schritte wie einen Genotoxizitätsassay oder einen funktionalen Assay, wie in den Beispielen beschrieben, enthalten.
  • Die oben offenbarten Verfahren können auf verschiedene Verbindungsbanken angewendet werden, einschließlich Verbindungsbanken natürlichen Ursprungs, oder auf Banken, die mittels wohlbekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie gewonnen wurden. Diese Verfahren der kombinatorischen Chemie beinhalten die Synthese einer zufälligen oder fokussierten Reihe von Verbindungen, beginnend von Monomeren oder Blöcken, indem beispielsweise Festphasen- oder Flüssigsynthese-, Parallelsynthese-, Mikrobeads-, Spaltpartnerrekombinations- oder jedes andere beliebige Verfahren, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, verwendet wird (N. K. Terret, M. Gardner, D. W. Gordon, R. J. Kobylecki, J. Steele. „Combinatorial synthesis. The design of compound libraries and their application to drug discovery". Tetrahedron, Bd. 51, Nr. 30, (1995), S. 8135–8173). Die Verbindungen können daher Nukleinsäuren, Peptide, andere Chemikalien oder eine Kombination daraus sein. Diese Banken können beispielsweise zwischen 5.000 und 500.000 Verbindungen, beispielsweise zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen, umfassen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können effizient verwendet werden, um verschiedene Typen aktiver Verbindungen zu identifizieren, wie Wirkstoffkandidaten, Rezeptorliganden. Die Vorteile dieser Verfahren liegen in der Möglichkeit, Führungssubstanzen herzustellen, die sowohl wirkungsvoll als auch selektiv für eine Zielstruktur sind, wobei auf diese Weise die Weiterbehandlung schlechter Führungssubstanzen verhindert wird.
  • In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung auch ein Verfahren der Hochdurchsatz-Profilbestimmung, das die Durchmusterung einer großen Anzahl von Verbindungen auf ihre Fähigkeit umfasst, unter einer großen Anzahl von Zielstrukturen mit einer gegebenen Zielstruktur zu interagieren. Vorzugsweise umfasst die Anzahl der getesteten Verbindungen zwischen 5 und 500, insbesondere zwischen 5 und 100, beispielsweise zwischen 5 und 50 Verbindungen. Die Anzahl der untersuchten Zielstrukturen liegt vorzugsweise über 25, noch bevorzugter über 50. Es wird insbesondere bevorzugt, eine Anzahl von Zielstrukturen zu verwenden, die über 60 liegt, beispielsweise 62 oder 73. Eine erläuternde Auflistung solcher Zielstrukturen wird in Tabelle I bereitgestellt.
  • In einer besonderen Ausführungsform umfasst das HTP-Verfahren dieser Erfindung daher die Durchmusterung von wenigstens 50 Verbindungen auf ihre Fähigkeit, unter wenigstens 50 unterschiedlichen Zielstrukturen mit einer gegebenen Zielstruktur zu interagieren.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das HTP-Verfahren dieser Erfindung die Durchmusterung von wenigstens 50 Verbindungen auf ihre Fähigkeit, unter wenigstens 50 unterschiedlichen Zielstrukturen mit einer gegebenen Zielstruktur zu interagieren und auf ihre pharmakologischen Eigenschaften.
  • Die Durchmusterung der Verbindungen wird üblicherweise ausgeführt, indem jede Verbindung mit jeder Zielstruktur inkubiert wird, gefolgt von der Bestimmung einer Interaktion (z.B. einer Bindung). Eine solche Durchmusterung kann beispielsweise in Mikrotiterplatten ausgeführt werden, um so viele Durchmusterungen wie möglich in einem begrenzten Zeitraum auszuführen. In dieser Hinsicht offenbart die Erfindung ein Robotersystem, das es erlaubt, diese Durchmusterung schnell auszuführen, wobei solch ein Robotersystem für eine automatisierte Verteilung der Verbindungen in die Platten sorgt, gefolgt von einer Bestimmung der Fähigkeit der Verbindung, die Bindung eines Liganden an die Zielstruktur zu inhibieren. Um dieses Verfahren auszuführen, umfassen die Platten üblicherweise die Zielstruktur in einer an deren Oberfläche geknüpfte Struktur sowie einen markierten Liganden. Wie in den Beispielen gezeigt ist, erlaubt dieses Verfahren die Bestimmung verschiedener Verbindungen auf zahlreichen Zielstrukturen (73) in einem verhältnismäßig kurzen Zeitraum.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch verbesserte Verbindungsbanken bereit. Insbesondere stellt die Erfindung fokussierte Banken bereit, die eine Vielzahl von Verbindungen umfassen, wobei die Verbindungen eine strukturelle Diversität besitzen und von Verbindungen abstammen, welche die Fähigkeit haben, selektiv an eine gemeinsame, erwünschte Zielstruktur zu binden. Während die fokussierten Banken des Stands der Technik im Wesentlichen Verbindungen umfassen, die von Treffern stammen, welche die Fähigkeit haben, an eine Zielstruktur zu binden, stellt die Erfindung jetzt definiertere Banken bereit, die Verbindungen umfassen, die von Treffern stammen, die nicht nur die Fähigkeit haben, an eine Zielstruktur zu binden, sondern die auch für die besagte Zielstruktur spezifisch sind. Diese Banken sind daher fokussierter als die vorhergehenden und können als eine Verbindungsquelle in einem Wirkstoff-Auffindungsprogramm verwendet werden. Der Ausdruck „stammen" bedeutet in diesem Rahmen, gewonnen durch Verfahren der kombinatorischen Chemie, die auf der Struktur solcher Treffer basieren, gemäß Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die nur erläuternd sind und in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken, detaillierter offenbart.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: Klassisches Wirkstoff-Auffindungsverfahren
  • 2: Wirkstoff-Auffindungsverfahren der Erfindung
  • 3: Wirkstoff-Auffindungsverfahren der Erfindung
  • 4: Bestimmung der IC50 ausgewählter Treffer für den mu-Rezeptor der Ratte.
  • Vergleichsverbindung: DAGO.
  • 5: Struktur von 12 Führungssubstanzen.
  • 6: Bestimmung der Affinität der ausgewählten Treffer für den humanen mu-Rezeptor.
  • 7: HTP-Daten für ausgewählte Treffer. Die Verbindungen, die aus der Affinitätsuntersuchung ausgewählt wurden, wurden auf vielen Zielstrukturen getestet. Die Identität der Verbindungen ist in Tabelle I beschrieben. Für jeden Fall wird die Wirkung durch die Intensität des Grautons angegeben, wobei weiß inaktiv und schwarz die maximale Wirkung bedeutet. Am unteren Rand der Figuren sind die Daten aus Tabelle IV angegeben, nämlich die Affinitätswerte der Verbindungen für die Opioidrezeptoren.
  • 8: Funktionalitätsassay: Bestimmung der Inhibition der Ileum-Kontraktion von Meerschweinchen durch die ausgewählten Führungssubstanzen.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Trefferauswahl für den Opioid-mu-Rezeptor
  • Es wurde eine Bank von 10.000 Verbindungen entwickelt, synthetisiert und in einem Modellsystem für Opioid-mu-Rezeptoren aus der Ratte durchmustert, wobei ein klassisches Bindungsassay-System verwendet wurde. Insbesondere wurden Verbindungen in Lösung getestet, bei einer Konzentration von 10–5 M, in Gegenwart von [3H] DAMGO als ein Radioligand, auf einem Homogenat von Ratten-Cortex. Eine spezifische Bindung wurde durch Flüssigszintillation unter Kompetition mit Naloxon bestimmt.
  • Diese primäre Durchmusterung ergab zahlreiche Treffer (4): 180 Verbindungen inhibierten um mehr als 50% die Bindung des Radioliganden, der für den mu-Rezeptor spezifisch ist. 111 inhibierten um mehr als 60% dieser Bindung und 42 um mehr als 70%. Um aktive Verbindungen mit einer hohen Wirksamkeit zu gewinnen, wurden die letzteren 42 Verbindungen für die weiteren Schritte verwendet.
  • Die chemische Struktur dieser 42 Verbindungen wurde analysiert.
  • Von diesen 42 Verbindungen wurden 24 wegen ihrer chemischen Struktur verworfen (d.h. Inkompatibilität mit gewerblicher Anwendbarkeit) und 18 wurden für die weitere Analyse behalten.
  • Eine dieser Verbindungen (CER680827) wurde im Ratten-mu-Assay nicht als aktiv bestätigt. Die 17 verbleibenden Verbindungen wurden gemäß bekannter Verfahren re-synthetisiert, aufgereinigt, und ihre Affinität wurde in humanen mu-, delta- und kappa-Rezeptorbindungsassays gemessen.
  • Wie in Tabelle II gezeigt ist, wurden fünf Verbindungen als inaktiv nachgewiesen (CER680435, CER728422, CER728428, CER829741, CER838941), entweder aus dem Grund, weil der beobachtete Effekt in der primären Durchmusterung auf einem Nebenprodukt beruhte (die primäre Durchmusterung wird mit nicht-aufgereinigten Verbindungen ausgeführt) oder wegen einer Spezies-Selektivität dieser Verbindungen (die primäre Durchmusterung wurde unter Verwendung des Rattenrezeptors ausgeführt und die Affinität wurde unter Verwendung des humanen Rezeptors bestimmt).
  • Allerdings wiesen 12 Treffer die erwartete Affinität für den mu-Rezeptor auf und nur für einen von diesen (CER798967) wurde gefunden, dass er aktiver auf dem delta-Rezeptor ist als auf dem mu-Rezeptor. Die Struktur dieser 12 Verbindungen ist in 5 dargestellt. Die Daten sind in 6 und in Tabelle IV zusammengefasst.
  • Diese 12 Verbindungen wurden anschließend im HTP-System getestet, d.h. ihr Selektivitätsprofil wurde unter Verwendung von 62 Rezeptoren, wie sie in Tabelle I beschrieben sind, bestimmt. Zu diesem Zweck wurden 10 μM von jeder Verbindung in Mikrotiterplatten inkubiert, die zuvor mit den in Tabelle I gezeigten Zielstrukturen beschichtet wurden, wobei die Inkubation in Gegenwart eines markierten Referenzliganden erfolgte, der für jede dieser Zielstrukturen spezifisch ist. Jede Verbindung wurde in einem Doppelversuch getestet.
  • Die erhaltenen Resultate sind in 7 zusammengefasst. Die HTP ergab wertvolle Informationen, da sie es erlaubte, zu zeigen, dass einige der Verbindungen, die auf Basis ihrer relativen Affinität für Opioidrezeptoren hätten ausgewählt werden können, sich auf vielen unverwandten Zielstrukturen als aktiv zu erweisen. Diese Verbindungen wurden auf Grund ihrer Unspezifität daher verworfen.
  • Die Kombination der Kriterien der Wirksamkeit (Affinität der Treffer gegenüber den mu- und anderen Opioidrezeptoren) und der Selektivität erlaubte 4 Verbindungen (Führungssubstanzen) als Kandidaten für die Weiterführung des Führungssubstanz-Optimierungsprozesses auszuwählen. Diese Verbindungen sind CER704252, CER704261, CER704889 und CER710830.
  • Um die Funktionalität der gemäß des vorliegenden Verfahrens gewonnenen Führungsverbindungen zu bestätigen, wurde jede dieser Verbindungen wie folgt auf ihre Fähigkeit hin getestet, die Ileum-Kontraktion von Meerschweinchen zu inhibieren:
  • Experimentelle Verfahren:
  • Ileum-Segmente wurden von 300–350 g schweren männlichen Dunkin-Hartley-Meerschweinchen gewonnen. Die Gewebe wurden zwischen zwei rostfreien Stahlhaken in Organbädern mit Sauerstoff angereicherter und vorgewärmter physiologischer Kochsalzlösung aufgehängt, wo sie zur Ermittlung der isometrischen Dehnung mit Kraftaufnehmern verbunden wurden. Zuckungskontraktionen wurden durch eine elektrische Feldstimulation (Einzelimpulse, 1 ms Länge, maximale Intensität, 0,1 Hz) durch zwei Platinelektroden mit einem Mehrkanal-Gleichstromstimulator erzeugt. Die Gewebe wurden bis zu einer optimalen verbleibenden Spannung gedehnt und anschließend wenigstens 30 min. äquilibriert, währenddessen sie wiederholt gewaschen wurden. Wirkstoffe wurden hinzu gegeben, nachdem die Zuckungskontraktionsamplitude reproduzierbar war.
  • Test auf Agonistenaktivität:
  • Die Gewebe wurden anfänglich einer effektiven Konzentration des Referenzagonisten DAMGO ausgesetzt, um die Reaktionsfähigkeit des Gewebes zu verifizieren. Nach dem Auswaschen und einem weiteren Äquilibrierungszeitraum wurden die Gewebe mehreren ansteigenden Konzentrationen der Testverbindungen oder demselben Agonisten ausgesetzt. Die unterschiedlichen Konzentrationen wurden kumulativ hinzugefügt und jede verbleibt in Kontakt mit den Geweben, bis eine stabile Reaktion erreicht wird. Wenn eine Agonisten-ähnliche Reaktion erreicht wird (Inhibition der Zuckungskontraktionen), wird nach der Wirkung der höchsten Konzentration der Testverbindungen der Referenzantagonist Naloxon hinzugefügt, um die Beteiligung der μ-Rezeptoren in dieser Reaktion zu überprüfen.
  • Die in 8 dargestellten Resultate bestätigen, dass die ausgewählten Führungssubstanzen alle die Fähigkeit besitzen, Ileum-Kontraktionen von Meerschweinchen zu inhibieren, was ferner die Verlässlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.
  • Alles zusammen genommen dauerte diese erste Runde der Führungssubstanzoptimierung 6 Wochen (Synthese, primäre Durchmusterung, Bestätigung, Affinität zu Opioidrezeptoren und HTP) und könnte auf 3 Wochen reduziert werden, hauptsächlich indem die Rundengeschwindigkeit der HTP verringert wird. Dies wird die Auffindung von Führungssubstanzen sowohl schnell als auch sicher machen, und zwar in dem Sinne, dass dies die Weiterverfolgung schlechter Führungssubstanzkandidaten verhindern wird. Tabelle I: Liste der Assays, die das HTP-System beinhaltet Hochdurchsatz-Profilbestimmung (HTP)
    Figure 00150001
    Tabelle II: Liste der Enzyme, die das HTP-System beinhaltet
    Figure 00160001
    • (h) zeigt an, dass der Assay mit einem Enzym humanen Ursprungs ausgeführt wurde
    Tabelle III: Typische Liste von Assays für das HTP-System G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN Nicht-peptidische Rezeptoren
    Adenosin A1
    Adrenergika α1 α2 β1 β2
    Dopamin D1 D2
    Histamin H1
    Melatonin ML1
    Muscarinergika M1 M3
    Opiate mu (h)
    Serotonin 5-HT1A 5-HT1D 5-HT2C 5-HT6
    Sigma σ1
    Peptidische Rezeptoren
    Angiotensin AT1
    Bombesin BB
    Bradykinin B2
    CGRP CGRP
    Cholecystokinin CCKA
    Chemokin und Cytokin IL-1β CCR2
    Endothelin ETA
    Galanin Galanin
    Glucagon-ähnliches Peptid GLP-1
    Neurokinin NK1
    Neuropeptid Y Y1
    Vasopressin V1A
    IONENKANAL-GEKOPPELTE REZEPTOREN
    Benzodiazepin zentral BZDc
    Serotonin 5-HT3
    TRÄGER
    Norepinephrin NE-Aufnahme
    Dopamin DA-Aufnahme
    Serotonin 5-HT-Aufnahme
    IONENKANÄLE
    Calciumkanal Ca (Verapamil)
    Kaliumkanal K (ATP-abhängig)
    Natriumkanal Na (Stelle 2)
    Chloridkanal Cl-Ionophor
    ENZYME
    Phosphodiesterasen PDE II PDE IV
    Proteinkinasen MAP-Kinase Pkc
    Tyrosinkinasen EGF-tyr-Kinase p56-tyr-Kinase
    Proteasen Angiotensin-konvertierendes Enzym (ACE) Cathepsin B Elastase
    ZELL-BASIERTE ASSAYS
    Cytokin TNF-α-Sekretion durch humane Monozyten
    Freie Radikal O2-Sekretion durch humane Granulozyten (HL60)
    Adhäsion von humanen Monozyten (U937) auf humanen endothelialen Zellen
    Cytotoxizität für humane Monozyten
  • Tabelle IV: Affinität der Treffer für Opioidrezeptoren
    Figure 00190001
  • Die Affinitäten der Verbindungen sind in nM angegeben. Das Zeichen - zeigt das Fehlen der Wirksamkeit im getesteten Konzentrationsbereich an (0,1 bis 10.000 nM).

Claims (13)

  1. Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung von Führungssubstanzen aus einer Verbindungsbank, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegen eine erwünschte Zielstruktur, um wirkungsvolle Treffer zu erlangen; (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a) an mehr als 25 Zielstrukturen, wenigstens umfassend: – nicht-peptidische G-gekoppelte Rezeptoren, – peptidische G-gekoppelte Rezeptoren, – einen Ionenkanal-gekoppelten Rezeptor, und – Ionenkanäle, um so wirkungsvolle Treffer mit einem ausgewählten Profil zu erhalten.
  2. Verfahren für die Identifizierung aktiver Verbindungen aus einer Verbindungsbank, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) eine Hochdurchsatz-Durchmusterung, umfassend die Schritte: (a) Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegen eine erwünschte Zielstruktur, um so wirkungsvolle Treffer zu erhalten; (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a), um so wirkungsvolle und selektive Führungssubstanzen zu erhalten; (c) Herstellung (einer) fokussierter(n) Bank(en) von Verbindungen, die strukturell mit den Führungssubstanzen aus Schritt (b) verwandt sind; (ii) ein- oder mehrmalige Wiederholung von Schritt (i) unter Verwendung der fokussierten Bank(en) aus Schritt (c), um so weiter fokussierte Banken herzustellen, und (iii) Durchmusterung und Profilbestimmung der fokussierten Banken aus Schritt (i) oder (ii) auf Aktivität gegen die Zielstruktur, um so aktive und spezifische Verbindungen zu erhalten.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Durchmusterung aus Schritt (a) die Auswahl von Verbindungen umfasst, die in der Lage sind, mit einer erwünschten Zielstruktur zu interagieren.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Durchmusterung aus Schritt (a) weiterhin die Affinitätsmessung der Verbindungen umfasst, die in der Lage sind, an die erwünschte Zielstruktur zu binden, um so die Verbindungen mit der besten Affinität als wirkungsvolle Treffer auszuwählen.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Profilbestimmung aus Schritt (b) die Untersuchung der wirkungsvollen Treffer an den Zielstrukturen und die Auswahl der Verbindungen umfasst, die spezifisch für die erwünschte Zielstruktur sind.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Profilbestimmung aus Schritt (b) die Untersuchung der wirkungsvollen Treffer an mehr als 50 Zielstrukturen umfasst.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Profilbestimmung aus Schritt (b) die Untersuchung der wirkungsvollen Treffer an mehr als 70 Zielstrukturen umfasst.
  8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt (i) umfasst: (a) Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegen eine erwünschte Zielstruktur, um wirkungsvolle Treffer zu erlangen; und (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a) auf Selektivität für die erwünschte Zielstruktur und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, um so wirkungsvolle und selektive Führungssubstanzen zu erhalten.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in Schritt (b) für zwischen 5 bis 500 wirkungsvolle Treffer das Profil bestimmt wird.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindungsbank zwischen 5.000 und 500.000 Verbindungen umfasst.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Verbindungsbank zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen umfasst.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die aktiven Verbindungen Kandidaten für Arzneimittel sind.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die aktiven Verbindungen Rezeptorliganden sind.
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