ES2236949T3 - Procedimiento de identificacion de compuestos cabeza de serie o compuestos activos. - Google Patents
Procedimiento de identificacion de compuestos cabeza de serie o compuestos activos.Info
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Abstract
Procedimiento de rastreo de alta capacidad de procesamiento para la identificación de compuestos cabeza de serie a partir de una biblioteca de compuestos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: (a) rastrear una biblioteca de compuestos respecto a su actividad contra una diana deseada, para obtener aciertos potenciales; (b) perfilar los aciertos potenciales de la etapa (a) sobre más de 25 dianas que comprenden por lo menos: - receptores no peptídicos acoplados a G - receptores peptídicos acoplados a G - un receptor acoplado a un canal iónico, y - canales iónicos, para obtener aciertos potenciales con un perfil seleccionado.
Description
Procedimiento de identificación de compuestos
cabeza de serie o compuestos activos.
La invención se refiere a procedimientos de
selección de compuestos cabeza de serie o compuestos activos a
partir de bibliotecas. Más específicamente, la invención
proporciona procedimientos de selección de compuestos cabeza de
serie o compuestos que son activos y selectivos respecto a una
diana deseada. La invención inmediata puede utilizarse, por
ejemplo, en procedimientos de hallazgo de medicamentos.
Las metodologías habituales en el hallazgo de
medicamentos implican el rastreo de grandes cantidades de
compuestos de origen natural u obtenidos mediante procedimientos de
química combinatoria. Dichas metodologías se describen, por
ejemplo, en el "Journal of Immunological Methods" (1996, 193,
2, 189-197) y en "Molecular diversity" (1996,
1, 4, 233-240).
Bibliotecas de varias decenas o cientos de miles
de compuestos se ensayan habitualmente en un único programa para el
hallazgo de un medicamento (figura 1). Los compuestos
seleccionados, principalmente los aciertos, pueden ser muy
numerosos. Se considera que la tasa promedio de aciertos es del
0,1%. Así, es probable que el rastreo de una biblioteca de 100.000
compuestos genere 100 aciertos. Desde el acierto hasta el candidato
a medicamento existe un largo procedimiento que implica ciclos
múltiples de síntesis y el rastreo de bibliotecas químicas
focalizadas. Este procedimiento de optimización de los compuestos
cabeza de serie requiere mucho tiempo y necesita grandes
presupuestos.
De hecho, los aciertos, de los cuales se va a
hacer el seguimiento, son seleccionados basándose habitualmente en
la potencia de su actividad sobre la diana que se ha rastreado.
Cada ciclo de optimización de un compuesto cabeza de serie
permitirá generar compuestos más activos. Cuando algunos aciertos
exhiben la potencia esperada, habitualmente después de varios
ciclos de optimización, se convierten en compuestos cabeza de serie
que se ensayan entonces respecto a su selectividad respecto a un
gran número de dianas biológicas ("perfilado de compuestos cabeza
de serie"). Los candidatos a medicamento se conservan basándose
en su afinidad respecto a la diana seleccionada y a su especificidad
para esta diana (es decir, no serán activos en dianas que no estén
relacionadas con el objetivo patológico del programa). No es raro
que los compuestos cabeza de serie seleccionados demuestren que no
son específicas, siendo probable de esta forma que provoquen
efectos no deseados. Resulta entonces necesario iniciar el
procedimiento a partir de un acierto menos potente.
La presente invención se refiere a procedimientos
mejorados de identificación de compuestos cabeza de serie o de
compuestos activos a partir de las bibliotecas. La invención se
refiere asimismo a un procedimiento para perfilar una alta
capacidad de procesamiento, que permite el rastreo de compuestos
selectivos a partir de composiciones voluminosas y diversas. La
invención proporciona asimismo nuevas bibliotecas focalizadas que
comprenden una pluralidad de compuestos con diversidad estructural,
pero con propiedades funcionales comunes.
Los procedimientos de la presente invención
implican más específicamente la determinación de la especificidad de
los aciertos ("perfilado") en un estadio muy temprano en el
proceso de hallazgo del medicamento. Estos nuevos procedimientos
permiten la identificación de compuestos cabeza de serie con
propiedades que han mejorado (es decir, combinando los criterios de
potencia y selectividad respecto a una diana dada) que pueden
utilizarse, opcionalmente, en procedimientos de optimización de
compuestos cabeza de serie para identificar candidatos a
medicamento altamente previsibles y a precios más bajos.
Es por lo tanto un objetivo de la presente
invención proporcionar un procedimiento para la identificación de
compuestos cabeza de serie a partir de una biblioteca de
compuestos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
siguientes:
- (a)
- rastrear una biblioteca de compuestos respecto a su actividad respecto a una diana deseada, para obtener aciertos potenciales; y
- (b)
- perfilar los aciertos potenciales de la etapa (a) para obtener compuestos cabeza de serie eficaces y selectivos.
Tal como se ha explicado anteriormente, los
procedimientos previos de hallazgo de medicamentos o de la
selección de compuestos cabeza de serie implican un rastreo de una
biblioteca de compuestos respecto a su actividad respecto a una
diana deseada, y los aciertos obtenidos con ello son procesados a
continuación a través de un ciclo de optimización de los compuestos
cabeza de serie para conseguir éstos. Sin embargo, estas etapas
están sólo basadas en el rastreo de bibliotecas o de bibliotecas
focalizadas en una diana deseada, es decir, en la selección de
compuestos que tengan la capacidad de interaccionar con una diana
dada. Sin embargo, ninguno de los procedimientos anteriores, implica
una etapa de perfilado según la presente invención. El
procedimiento de rastreo de una alta capacidad de procesamiento de
la presente invención proporciona dicha etapa de perfilado de la
biblioteca, de manera que los compuestos cabeza de serie obtenidos
combinan ambos criterios de potencia (capacidad para interaccionar
con una diana dada) y selectividad (disminución o falta de
interacción con otras dianas).
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la identificación de compuestos
activos a partir de una biblioteca de compuestos, comprendiendo
dicho procedimiento:
- (i)
- un rastreo de alta capacidad de procesamiento que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- rastrear una biblioteca de compuestos respecto a su actividad contra una diana deseada, para obtener aciertos potenciales;
- (b)
- perfilar los aciertos potenciales de la etapa (a) para obtener compuestos cabeza de serie eficaces y selectivos; y
- (c)
- preparar una biblioteca o bibliotecas focalizadas de compuestos relacionados estructuralmente con los compuestos cabeza de serie de la etapa (b);
- (ii)
- repetir opcionalmente, una o varias veces, la etapa (i), utilizando la biblioteca o bibliotecas focalizadas de la etapa (c) para generar otras bibliotecas focalizadas, y
- (iii)
- rastrear, y preferentemente perfilar, las bibliotecas focalizadas de la etapa (i) o (ii) para dicha diana, para obtener compuestos activos y preferentemente selectivos.
Este procedimiento se muestra en la Figura 2 y
comprende tanto las etapas secuenciales del procedimiento de
identificación de los compuestos cabeza de serie, tal como se ha
dado a conocer anteriormente, como las etapas de optimización de
los compuestos cabeza de serie, que dan lugar a compuestos
activos.
En aras de la claridad, el término "acierto"
designa, en el sentido de la presente invención, cualquier
compuesto seleccionado después de una etapa de rastreo de una
biblioteca primaria. Un acierto es por lo tanto un compuesto
obtenido después del primer nivel de selección, que posee de esta
manera, por lo menos, la potencia mínima respecto a una diana
deseada. Un "compuesto cabeza de serie" es un acierto
optimizado, es decir, un acierto cuya actividad ha sido confirmada,
utilizando más preferentemente, un ensayo distinto de selección. Los
compuestos cabeza de serie son por tanto compuestos obtenidos
después de por lo menos 2 etapas de rastreo. Los compuestos cabeza
de serie representan material de iniciación para etapas ulteriores
de optimización que comprenden el diseño de las bibliotecas
focalizadas, la selección de compuestos activos, la modificación
química suya, el ensayo funcional, etc., que darán lugar a un
candidato o a los candidatos al medicamento.
En los procedimientos de la presente invención,
se rastrea una biblioteca respecto a la actividad respecto a una
diana seleccionada. En términos generales, la diana puede ser
cualquier molécula tal como por ejemplo un receptor, una proteína,
una parte de un receptor, un anticuerpo, un ligando, una partícula
infecciosa tal como un virus, una bacteria, un hongo o un ácido
nucleico, etc., bien en el ámbito farmacéutico o en el agroquímico.
Más preferentemente, la diana es una molécula implicada en una vía
biológica o patológica, tal como un receptor, una enzima, una
región de un ácido nucleico, un canal iónico, etc. Tipos
particulares de dianas son, por ejemplo, receptores, tales como los
que se enumeran en la Tabla I, y enzimas, tales como los que se
enumeran en la tabla II.
Tal como se indicó anteriormente, la etapa (a) de
los procedimientos que se reivindican comprende el rastreo de una
biblioteca respecto a la actividad respecto una diana dada. El
rastreo respecto a la actividad respecto una diana dada se refiere,
generalmente, a la selección de cualesquiera compuestos de la
biblioteca que tengan la capacidad de interaccionar con dicha diana.
En el contexto de la invención inmediata, el término
"interacción" significa cualquier interacción física o
funcional. Más preferentemente, en la etapa (a) del procedimiento,
el rastreo para los compuestos que tienen actividad respecto a una
diana deseada comprende el rastreo (o selección) de compuestos
capaces de unirse a la diana deseada, modificando la actividad de
una enzima, o regulando la expresión de un
gen.
gen.
En una forma de realización particular de la
invención, la etapa (a) comprende el rastreo para los compuestos
que se unen a una diana. En una forma de realización más preferida,
la capacidad de un compuesto para unirse a una diana dada se mide
por la capacidad de dicho compuesto de inhibir la unión, a dicha
diana, de una molécula marcada de referencia. Como ejemplo, la
capacidad de un compuesto para unirse a un receptor diana dado
puede medirse por la capacidad de dicho compuesto de inhibir la
unión, a dicho receptor diana, de un ligando marcado de dicho
receptor. En este caso particular, el rastreo comprende por tanto,
para cada compuesto, la determinación del porcentaje de inhibición
de la unión a la diana de un ligando marcado. La capacidad de un
compuesto para unirse a una diana dada puede medirse asimismo en un
ensayo basado celularmente. En particular, la unión puede ensayarse
midiendo, con marcadores apropiados, la actividad inducida por
dicho compuesto en el interior celular.
En otra forma de realización particular de la
invención, la etapa (a) comprende el rastreo de compuestos capaces
de modificar la actividad de una enzima. Dicha modificación incluye
la estimulación o inhibición de la actividad de dicha enzima, o la
alteración de la especificidad o de la regulación de la actividad
de dicha enzima, por ejemplo.
La actividad del compuesto con respecto a la
diana puede ensayarse según diversos procedimientos conocidos en la
técnica, tales como procedimientos enzimáticos (en particular
inmunoenzimáticos), procedimientos de detección basados en la
fluorescencia, o ensayos radioactivos, por ejemplo. Como ejemplos
particulares apropiados de técnicas de detección basadas en la
fluorescencia, se puede mencionar la polarización de fluorescencia,
la espectroscopia de correlación de fluorescencia (Eigen et
al., PNAS 91 (1994) 5740) y la fluorescencia resuelta en el
tiempo, por ejemplo. Ejemplos preferidos de dichas técnicas
incluyen por ejemplo PSA (Baum et al., Anal. Biochem. 237
(1996) 129), HTRF (Mathis G., Clin. Chem. 39 (1993) 1953). Como
ejemplos apropiados de radio/inmunoensayos, es conveniente
utilizar, en el contexto de la presente invención, ELISA o IRA, por
ejemplo.
Dichos procedimientos pueden llevarse a cabo en
sistemas in vitro o en ensayos basados celularmente, tal
como se describe en la sección experimental. En particular, estos
ensayos se realizan generalmente en contenedores tales como placas
(placas de micropocillos), que se cargan con los reactivos
apropiados (diana, tampón, compuesto del ensayo). Las placas
apropiadas incluyen placas de 96 pocillos, así como placas que
tienen un número superior de pocillos, en particular 384, 864, 1536
o más. Dichas placas están disponibles comercialmente.
Para que este procedimiento de rastreo sea más
seguro, se prefiere además que se confirme la actividad de los
compuestos respecto a la diana. La confirmación puede obtenerse,
por ejemplo, repitiendo simplemente el procedimiento de rastreo
anterior, pero utilizando el compuesto más bien en forma aislada o
purificada que el contenido en el conjunto de la biblioteca.
Dependiendo del tamaño de la biblioteca de
partida, el número de aciertos confirmados puede variar entre 5 y
500, habitualmente entre 5 y 100.
Además, en una forma de realización preferida, el
rastreo de la etapa (a) comprende además medir la afinidad de los
compuestos capaces de unirse a dicha diana deseada, para
seleccionar, como aciertos potenciales, los compuestos que
presentan la mejor afinidad. Para determinar ésta, los aciertos
confirmados se vuelven habitualmente a sintetizar, purificándose.
La afinidad se determina entonces mediante procedimientos conocidos
en la técnica, tales como mediante el análisis "Scatchard",
tal como se da a conocer en los ejemplos. Asimismo, durante esta
etapa, los compuestos pueden descartarse además a causa de su
estructura química.
Los compuestos obtenidos mediante el rastreo
según la etapa (a), generalmente entre 5 y 500, se someten entonces
a la etapa (b). La etapa de perfilado (b) comprende en términos
generales el ensayo de los aciertos potenciales sobre varias dianas
y la selección de los compuestos que son específicos para la diana
deseada. Esta etapa permite por tanto conservar los compuestos
cabeza de serie que exhiben tanto la potencia esperada para la
diana como un buen perfil de selectividad. La etapa (b) comprende
habitualmente la determinación de la capacidad de los aciertos
potenciales seleccionados para interaccionar, preferentemente para
unirse a varias dianas.
En una forma de realización particular de la
invención, la etapa (b) comprende el ensayo de los aciertos
potenciales en más de 25 dianas. En una forma de realización más
particular, dicha etapa de perfilado (b) comprende ensayar los
aciertos potenciales sobre más de 50 dianas. En una forma de
realización muy preferida, la etapa (b) de perfilado comprende el
ensayo de los aciertos potenciales en más de 60 dianas. Ejemplos
que ilustran dianas que pueden ensayarse en la etapa (b) se
enumeran en la Tabla 1 a continuación. En una forma de realización
preferida de la invención, la etapa de perfilado (b) comprende el
rastreo de los aciertos seleccionados sobre las dianas siguientes,
por lo
menos:
menos:
- -
- receptores no peptídicos acoplados a G, que comprenden un receptor de adenosina, un receptor adrenérgico, un receptor de dopamina, un receptor de histamina, un receptor de melatonina, un receptor muscarínico, y un receptor sigma;
- -
- receptores peptídicos acoplados a G, que comprenden un receptor de angiotensina, un receptor de bombesina, un receptor de bradiquinina, un receptor de colecistoquinina, un receptor de quemoquina, un receptor de endotelina, un receptor de galanina, un receptor de neuroquinina, un receptor del neuropéptido Y y un receptor de vasopresina;
- -
- un receptor acoplado a un canal iónico, que comprende un receptor de serotonina;
- y
- -
- canales iónicos, que comprende un canal de calcio y un canal de potasio.
Más preferentemente incluso, las dianas ensayadas
comprenden además:
- -
- enzimas, que incluyen una fosfodiesterasa y una tirosina quinasa, y, opcionalmente, una proteína quinasa y una proteasa.
En otra forma de realización, la etapa de
perfilado comprende además uno o varios ensayos basados
celularmente, seleccionados a partir de:
- -
- un ensayo de secreción de citoquinas, tal como un ensayo de la secreción de TNF-\alpha en los monocitos humanos;
- -
- un ensayo de radicales libres, tal como un ensayo de secreción de O_{2} en los granulocitos humanos (por ejemplo, HL60);
- -
- un ensayo de adhesión, en particular entre los monocitos humanos (por ejemplo, células U937) y células endoteliales humanas;
- -
- un ensayo de citotoxicidad, en los monocitos humanos, por ejemplo.
En una forma de realización típica específica que
ilustra la invención, la etapa de perfilado (b) comprende el
rastreo de los compuestos sobre todas las dianas que se enumeran en
la tabla III.
En otra forma de realización típica específica
que ilustra la invención, la etapa de perfilado (b) comprende el
rastreo de los compuestos sobre todas las dianas que se enumeran en
la tabla I.
La capacidad de los compuestos para interaccionar
con, o unirse a estas dianas, puede determinarse siguiendo la misma
metodología que se describe en la etapa (a), en sistemas in
vitro o basados celularmente. Un aspecto importante de la
invención es la capacidad para perfilar grandes cantidades de
compuestos (acertados eficaces) para obtener compuestos cabeza de
serie mejorados respecto a los procedimientos de la técnica
anterior. A este respecto, para facilitar esta etapa de perfilado
(b), el solicitante ha desarrollado un concepto de Alta Capacidad
de Procesamiento ("HTP") que permite ensayar rápidamente in
vitro numerosos compuestos (por ejemplo, del orden de cien a
doscientos) en un gran número de dianas, tal como se expone
anteriormente. Más específicamente, este HTP implica un sistema
robótico que es capaz de procesar hasta 20 protocolos (un protocolo
por diana) al día. Este procedimiento se da a conocer más
detalladamente en los ejemplos. Básicamente, en una forma de
realización particular de la invención, el HTP se lleva a cabo
utilizando un dispositivo que comprende los elementos
siguientes:
- -
- centrales de trabajo, que incluyen:
- \bullet
- varios incubadores, más preferentemente 2 ó 3
- \bullet
- una o más estaciones de filtración
- \bullet
- dispensadores de reactivos
- -
- contenedores, preferentemente placas, y
- -
- medios para desplazar los contenedores a las diversas centrales de trabajo.
Más específicamente, los dispensadores de
reactivos permiten el suministro de 10 a 20 dianas y más de 100
compuestos de prueba. La actividad de los dispensadores de
reactivos puede ser manual o automatizada.
Tal como se consideró anteriormente, las placas
utilizadas en la etapa HTP pueden ser placas con 96, 384, 864 ó
1536 pocillos. Preferentemente, contienen 96, 384 ó 864
pocillos.
Los compuestos que se conservan después de esta
etapa (b) son aquéllos que interaccionan con la diana deseada y que
no interaccionan con ninguna otra diana o que sólo interaccionan
con algunos de ellos o escasamente con otras dianas. Los
requerimientos de selectividad pueden variar de una diana a otra y
pueden ser adaptados por el experto en la técnica. En particular,
dependiendo de la utilización anticipada de los compuestos, la
interacción con varias dianas relacionadas (por ejemplo, varios
receptores serotoninérgicos) puede ser tolerada, mientras el
compuesto no exhiba interacción con otras dianas no relacionadas
(tales como receptores de histamina, por ejemplo). La etapa (b) del
presente procedimiento es muy importante porque determina el nivel
de selectividad que se busca en el procedimiento de hallazgo del
medicamento.
En la forma de realización más preferida, el
procedimiento según la presente invención comprende además una
etapa de desarrollo de compuestos cabeza de serie de alta capacidad
de procesamiento, directamente antes o después de la etapa (b). A
este respecto, en una forma de realización preferida de la presente
invención, el término perfilado comprende la evaluación de la
especificidad, así como la evaluación de propiedades farmacológicas
(es decir, la etapa de desarrollo de los compuestos cabeza de
serie). Esta etapa de desarrollo de los compuestos cabeza de serie,
de alta capacidad de procesamiento, ("HTLD"), comprende
preferentemente el rastreo de los aciertos con respecto a sus
propiedades farmacológicas. Más particularmente, HTLD comprende el
rastreo de los aciertos respecto a las propiedades siguientes:
- toxicidad
- metabolismo, y/o
- farmacocinética.
La toxicidad se determina preferentemente
poniendo en contacto los compuestos con células informadoras, tal
como, por ejemplo, monocitos humanos, y midiendo la liberación de
un compuesto informador marcado (es decir, Cr), según
procedimientos conocidos.
El metabolismo es importante en términos de
predecir cómo el compuesto se comportará in vivo. La
determinación del metabolismo de los compuestos puede llevarse a
cabo in vitro o en ensayos basados celularmente, poniendo en
contacto el compuesto con el citocromo o citocromos P450 y
determinando las propiedades de los metabolitos resultantes.
La farmacocinética se ensaya preferentemente en
un modelo celular de la luz intestinal, en particular en las
células Caco-2 o MDCK.
En una variante particular del procedimiento de
la invención, la etapa (i) comprende por lo tanto:
- (a)
- rastrear una biblioteca de compuestos respecto a la actividad contra una diana deseada, para obtener aciertos potenciales; y
- (b)
- perfilar los aciertos potenciales de la etapa (a) para la selectividad respecto a la diana deseada y las propiedades farmacológicas, para obtener compuestos cabeza de serie eficaces y selectivos.
Más preferentemente, la etapa (b) comprende el
perfilado de los aciertos potenciales de la etapa (a) para la
selectividad respecto a la diana deseada y para la ausencia de
toxicidad sobre las células humanas in vitro. Más
preferentemente incluso, la etapa (b) comprende el perfilado de los
aciertos potenciales de la etapa (a) para la selectividad respecto
a la diana deseada, la falta de toxicidad sobre las células humanas
in vitro y la capacidad para atravesar un modelo de luz
intestinal. En una forma de realización particularmente ventajosa,
los compuestos se ensayan asimismo respecto a su metabolismo en
presencia del citocromo o citocromos P450. Una representación
esquemática de dicho procedimiento se proporciona en la Figura
3.
Los compuestos cabeza de serie de este modo
pueden utilizarse, bien directamente en un programa de selección de
candidatos a medicamentos, o en la etapa (c) del procedimiento, como
matrices para diseñar y sintetizar bibliotecas focalizadas de
compuestos estructuralmente relacionados. Estas bibliotecas
focalizadas pueden obtenerse según las técnicas que se dan a
conocer a continuación y que se conocen en la técnica, y pueden
contener varios miles de compuestos. El término "estructuralmente
relacionados" indica que estas bibliotecas se diseñan de forma
que sus compuestos contengan estructuras o motivos que se encuentran
también en los compuestos cabeza de serie. Por ejemplo, estas
bibliotecas pueden contener monómeros específicos o bloques que se
identifican en los compuestos cabeza de serie, tal como se da a
conocer en los ejemplos. En particular, la construcción de las
bibliotecas focalizadas implica generalmente, en una primera etapa,
la caracterización molecular de los compuestos cabeza de serie, para
determinar sus bloques constitutivos. Opcionalmente, esta etapa
inicial puede también implicar la agrupación de los compuestos
cabeza de serie que tengan características estructurales comunes,
para sintetizar un número limitado de bibliotecas focalizadas. A
partir de este primer análisis, los bloques más comunes y sus
análogos se utilizan en una etapa de modelado molecular, para crear
la biblioteca focalizada. La selección de los análogos puede
realizarse según varias estrategias conocidas de analogización, que
incluyen la de monómeros o la de la estructura entera. Esta
analogización puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el
rastreo virtual de bibliotecas con softwares apropiados. Las
bibliotecas se obtienen entonces según los procedimientos conocidos
de la química combinatoria, tal como se da a conocer a
continuación.
A partir de estas bibliotecas focalizadas, las
etapas (a) a (c) pueden repetirse para obtener otras bibliotecas
focalizadas (etapa (ii)). Dependiendo de la selectividad o potencia
que se busque, este ciclo puede repetirse entre 0 y 10 veces,
preferentemente entre 1 y 5 veces.
Estas bibliotecas se rastrean finalmente respecto
a la diana dada (etapa (iii)), para obtener compuestos activos. El
rastreo de la etapa (iii) puede llevarse a cabo según
procedimientos que se conocen en la técnica. Preferentemente, el
rastreo de la etapa (iii) se lleva a cabo de una forma similar a la
del rastreo y perfilado de las etapas (a) y (b) anteriores. Esta
rastreo puede también contener etapas adicionales tales como un
ensayo de genotoxicidad o un ensayo funcional, tal como se describe
en los ejemplos.
Los procedimientos que se han dado a conocer
anteriormente pueden aplicarse a varias bibliotecas de compuestos,
que incluyen bibliotecas de compuestos de origen natural u
obtenidas mediante procedimientos de química combinatoria bien
conocidos. Estos procedimientos de química combinatoria implican la
síntesis de series focalizadas o al azar de compuestos que se
inician a partir de monómeros o bloques, utilizando por ejemplo la
síntesis en soportes sólidos o líquidos, síntesis en paralelo,
microperlas, la división, el acoplamiento, o la recombinación o
cualquier otro procedimiento conocido en la técnica (N.K. Terret, M.
Gardner, D.W. Gordon, R.J. Kobylecki, J. Steele. "Combinatorial
synthesis. The design of compound libraries and their application to
drug discovery". Tetrahedron, Vol 51, nº 30, (1995) pág
8135-8173). Los compuestos pueden por tanto ser
ácidos nucleicos, péptidos, otras sustancias químicas o una
combinación de ellos. Estas bibliotecas pueden comprender, por
ejemplo, entre 5.000 y 500.000 compuestos, por ejemplo entre 10.000
y 20.000 compuestos.
Los procedimientos de la invención pueden
utilizarse eficientemente para identificar varios tipos de
compuestos activos tales como candidatos a medicamentos, ligandos
de receptores. Las ventajas de estos procedimientos son la
posibilidad de producir compuestos cabeza de serie que son tanto
eficaces como selectivos para una diana, evitando por lo tanto el
seguimiento de los compuestos cabeza de serie empobrecidos.
A este respecto, la invención se refiere asimismo
a un procedimiento de Perfilado de Alta Capacidad de Procesamiento
que comprende el rastreo de un gran número de compuestos con
respecto a su capacidad para interaccionar con una diana dada,
entre un gran número de ellas. Más preferentemente, el número de
compuestos que se ensayan está comprendido entre 5 y 500, más
específicamente entre 5 y 100, tal como por ejemplo, entre 5 y 50.
El número de dianas ensayadas es preferentemente superior a 25, más
preferentemente superior a 50. Se prefiere particularmente utilizar
un número de dianas superior a 60, tal como por ejemplo 62 ó 73.
Una lista que ilustra dichas dianas se provee en la Tabla I.
En una forma de realización particular, el
procedimiento HTP de la presente invención comprende por lo tanto
el rastreo de por lo menos 50 compuestos respecto a su capacidad
para interaccionar con una diana dada entre, por lo menos, 50
dianas distintas.
En otra forma de realización preferida, el
procedimiento HTP de la presente invención comprende el rastreo de
por lo menos 50 compuestos respecto a su capacidad para
interaccionar con una diana dada entre por lo menos 50 dianas
diferentes y con respecto a sus propiedades farmacológicas.
El rastreo de los compuestos se lleva a cabo
habitualmente incubando cada compuesto con cada diana, seguido por
la determinación de una interacción (por ejemplo, una unión). Dicho
rastreo puede llevarse a cabo, por ejemplo, en placas de
microtitulación, de forma que se realicen tantos rastreos como sea
posible en un período de tiempo limitado. La invención da a conocer
a este respecto un sistema robótico que permite que este rastreo se
lleve a cabo rápidamente, proporcionando dicho sistema robótico una
distribución automatizada de los compuestos en las placas, seguido
por una determinación de la capacidad del compuesto para inhibir la
unión del ligando a la diana. Para llevar a cabo este
procedimiento, las placas comprenden habitualmente las dianas
revestidas hasta su superficie, así como un ligando marcado. Tal
como se muestra en los Ejemplos, este procedimiento permite la
determinación, en un período de tiempo relativamente corto, de
varios compuestos sobre numerosas dianas (73).
La presente invención proporciona asimismo
bibliotecas mejoradas de compuestos. En particular, la invención
proporciona bibliotecas focalizadas que comprenden una pluralidad
de compuestos, en las que dichos compuestos tienen diversidad
estructural y derivan de compuestos que poseen la capacidad de
unirse selectivamente a una diana deseada común. Mientras que las
bibliotecas focalizadas de la técnica anterior comprenden
esencialmente compuestos que se derivan de que tienen la capacidad
de unirse a una diana, la invención proporciona ahora bibliotecas
más definidas, que comprenden compuestos que se derivan de aciertos
que no sólo tienen la capacidad de unirse a una diana, sino que son
también específicos para dicha diana. Estas bibliotecas están, pues,
más focalizadas que las previas y pueden utilizarse como una fuente
de compuestos en un programa de hallazgo de medicamentos. El
término "que se derivan" en este contexto significa obtenido
mediante procedimientos de química combinatoria basados en la
estructura de dichos aciertos potenciales, según procedimientos
conocidos en la técnica.
La presente invención se expondrá con mayor
detalle en los ejemplos siguientes, que deben considerarse a modo
de ilustración y en ningún caso limitan el alcance de la presente
invención.
Figura 1: Procedimiento clásico de hallazgo de
medicamentos
Figura 2: Procedimiento de hallazgo de
medicamentos de la invención
Figura 3: Procedimiento de hallazgo de
medicamentos de la invención
Figura 4: Determinación del IC50 de los aciertos
seleccionados para el receptor mu de la rata. Compuesto de
referencia: DAGO.
Figura 5: Estructura de 12 compuestos cabeza de
serie
Figura 6: Determinación de la afinidad de los
aciertos seleccionados para el receptor mu humano.
Figura 7: Datos HTP para aciertos seleccionados.
Los compuestos seleccionados a partir del estudio de afinidad, se
ensayaron sobre múltiples dianas. La identidad de las dianas es tal
como se describe en la tabla I. El efecto se indica por la
intensidad del gris en cada caso, siendo inactivo el blanco y
correspondiendo el efecto máximo al negro. En la parte inferior de
la figura, se informa de datos de la tabla IV, principalmente
valores de afinidad de los compuestos para los receptores
opiáceos.
Figura 8: Ensayo funcional: Determinación de la
inhibición de la contracción del íleo del cobaya mediante los
compuestos cabeza de serie seleccionados.
Se diseñó, sintetizó y rastreó una biblioteca de
10000 compuestos en un modelo de receptores mu de opiáceos a partir
de un origen murino, utilizando un sistema clásico de ensayo de la
unión. Más específicamente, se ensayaron los compuestos en
solución, a una concentración de 10^{-5}M, en presencia de
[_{3}H] DAMGO como ligando radioactivo, sobre un homogenado de
córtex de rata. Se determinó la unión específica compitiendo con
naloxona mediante centelleo líquido.
Este rastreo primario dio lugar a numerosos
aciertos (Figura 4): 180 compuestos inhibieron más del 50% la unión
del ligando radioactivo específico para el receptor mu. 111
inhibieron más del 60% de dicha unión y 42 más del 70%. Para
obtener compuestos activos con una alta potencia, estos últimos 42
compuestos se han utilizado para las etapas posteriores.
Se analizó la estructura química de estos 42
compuestos.
Entre estos 42 compuestos, 24 se descartaron
debido a su estructura química, (es decir, incompatibilidad con las
aplicaciones industriales) y 18 se guardaron para un análisis
posterior.
Uno de estos compuestos (CER680827) no confirmó
su actividad en el ensayo mu de la rata. Los 17 compuestos
restantes se volvieron a sintetizar según los procedimientos
conocidos en la técnica, se purificaron y se midió su afinidad en
ensayos de unión de los receptores kappa, delta y mu humanos.
Tal como se muestra en la Tabla II, cinco
compuestos demostraron ser inactivos (CER680435, CER728422,
CER728428, CER829741, CER838941), debido, bien a que el efecto
observado en el rastreo primario se debió a un producto secundario
(el rastreo primario se lleva a cabo con compuestos no
purificados), o debido a la selectividad típica de estos compuestos
(el rastreo primario se llevó a cabo utilizando el receptor de la
rata y la afinidad se determinó utilizando el receptor humano).
Sin embargo, 12 aciertos mostraron la afinidad
esperada respecto al receptor mu y sólo uno de ellos (CER798967) se
encontró que era más activo sobre los receptores delta que sobre
los receptores mu. La estructura de estos 12 compuestos se
representa en la Figura 5. Los datos se sumarizan en la Figura 6 y
en la Tabla IV.
Estos 12 compuestos se ensayaron entonces en el
sistema HTP, es decir, su perfil de selectividad se determinó
utilizando 62 receptores tal como se describe en la Tabla I. Para
esto, 10 \muM de cada compuesto se incubaron en placas de
microtitulación revestidas previamente con las dianas que se
muestran en la Tabla I, en presencia de un ligando de referencia
marcado, específico para cada una de dichas dianas. Cada compuesto
se ensayó por duplicado.
Los resultados obtenidos se sumarizan en la
Figura 7. El HTP proporcionó una información preciosa, pues
permitió mostrar que alguno de los compuestos que podrían haber
sido seleccionados basándose en su afinidad relativa respecto a los
receptores opiáceos, mostraron ser activos sobre muchas dianas que
no estaban relacionadas. Estos compuestos se han descartado, por lo
tanto, a causa de su inespecificidad.
La combinación de los criterios de potencia
(afinidad de los aciertos respecto a los receptores mu y a otros
receptores opiáceos) y selectividad permitió seleccionar 4
compuestos (compuestos cabeza de serie) como candidatos para seguir
el procedimiento de optimización de los compuestos cabeza de serie.
Estos compuestos son CER704252, CER704261, CER704889 y
CER710830.
Además, para confirmar la funcionalidad de los
compuestos de los compuestos cabeza de serie obtenidos según el
procedimiento inmediato, cada uno de estos compuestos se ensayó
respecto a su capacidad para inhibir la contracción del íleo del
cobaya, de la siguiente forma:
Se obtuvieron segmentos de íleo a partir de
cobayas machos Dunkin Hartley que pesaban de 300 a 350 g. Los
tejidos se suspendieron entre dos garfios de acero inoxidable en
baños de órganos que contenían una solución salina fisiológica
oxigenada y pre-calentada, en los que estaban
conectados a transductores de desplazamiento-fuerza
para el registro de la tensión isométrica. Se provocaron
contracciones nerviosas mediante la estimulación de campos
eléctricos (impulsos únicos, de duración de 1 ms, intensidad máxima
de 0,1 Hz), estimulación que se aplicó a través de dos electrodos
de platino mediante un estimulador multicanal de corriente
constante. Los tejidos se estiraron hasta una tensión óptima de
reposo y entonces se dejó que se equilibraran durante por lo menos
30 minutos, lavándose repetidamente durante dicho tiempo. Los
medicamentos se añadieron después de que la amplitud de la
contracción nerviosa fuera reproducible.
Los tejidos se expusieron inicialmente a una
concentración efectiva del agonista de referencia DAMGO, para
comprobar la reactividad de los tejidos. Después del lavado y de
otro período de equilibración, los tejidos se expusieron a varias
concentraciones crecientes de los compuestos del ensayo, o el mismo
agonista. Las distintas concentraciones se añadieron
acumulativamente, permaneciendo el canal de calcio en contacto con
los tejidos, hasta que se obtuvo una respuesta estable. Cuando se
obtuvieron respuestas de tipo agonista (inhibición de las
contracciones nerviosas), se añadió el antagonista naloxona de
referencia después de que actuase la concentración más alta de los
compuestos de ensayo, para evaluar la implicación de los receptores
\mu en esta respuesta.
Los resultados que se presentan en la Figura 8
confirman que los compuestos cabeza de serie seleccionados tienen
todos la misma capacidad para inhibir la concentración del íleo del
cobaya, lo que demuestra además la fiabilidad del procedimiento de
la invención.
En conjunto, este primer ciclo de optimización de
los compuestos cabeza de serie duró 6 semanas (síntesis, rastreo
primario, confirmación, afinidad para los receptores opiáceos, y
HTP) y podría reducirse hasta 3 semanas, principalmente
disminuyendo el tiempo de cambio completo de HTP. Esto hará que el
hallazgo de los compuestos cabeza de serie sea rápido y seguro, en
el sentido de que evitará el seguimiento de candidatos con pocas
posibilidades de convertirse en compuestos cabeza de serie.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista típica de ensayos para el
sistema HTP Receptores Unidos A Proteínas
G
| Receptores no peptídicos | |
| Adenosina | A_{1} (h) |
| Adrenérgicos | \alpha1 |
| \alpha2 | |
| \beta1 | |
| \beta2 | |
| Dopamina | D_{1} (h) |
| D_{2} (h) | |
| Histamina | H_{1} |
| Melatonina | ML1 |
| Muscarínicos | M_{1}(h) |
| M_{3}(h) | |
| Opiáceos | mu (h) |
| Serotonina | 5-HT_{1A}(h) |
| 5-HT_{1D} | |
| 5-HT_{2c}(h) | |
| 5-HT_{6}(h) | |
| Sigma | \sigma1 |
| Receptores peptídicos | |
| Angiotensina | AT_{1} (h) |
| Bombesina | BB |
| Bradiquinina | B_{2} |
| CGRP | CGRP (h) |
| Colescitoquinina | CCK_{A} (h) |
| Quemoquina y citoquina | IL-1\beta |
| CCR_{2} (h) |
| Receptores peptídicos | |
| Endotelina | ETA (h) |
| Galanin | Galanina (h) |
| Péptido de tipo glucagón | GLP-1 (h) |
| Neuroquinina | NK_{1} (h) |
| Neuropéptido Y | Y_{1} (h) |
| Vasopresina | V_{1A} (h) |
| Receptores Unidos A Canales Iónicos | |
| Benzodiacepinas centrales | BZDc |
| Serotonina | 5-HT3 |
| Vehículos | |
| Norepinefrina | Absorción de NE (h) |
| Dopamina | Absorción de DA (h) |
| Serotonina | Absorción de 5-HT |
| Canales Iónicos | |
| Canal de calcio | Ca (verapamil) |
| Canal de potasio | K (dependiente de ATP) |
| Canal de sodio | Na (sitio 2) |
| Canal de cloruro | Ionóforo Cl |
| Enzimas | |
| Fosfodiesterasas | PDE II (h) |
| PDE IV (h) | |
| Proteínquinasas | MAP quinasa (h) |
| PKc | |
| Tirosinquinasas | EGF-tyr quinasa (h) |
| p56-tyr quinasa | |
| Proteasas | Enzima conversora de angiotensina (ACE) (h) |
| Catepsina B (h) | |
| Elastasa (h) | |
| Ensayos Basados En Células | |
| Citoquina | Secreción de TNF-\alpha por los monocitos humanos. |
| Radicales libres | Secreción de O_{2} por los granulocitos humanos (HL60). |
| Adhesión | \begin{minipage}[t]{83mm} De los monocitos humanos (U937) sobre las células endoteliales humanas.\end{minipage} |
| Citotoxicidad | De los monocitos humanos. |
| (h= ensayo llevado a cabo sobre proteínas humanas). |
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}{145mm} Las afinidades de los compuestos se
dan en nM. El signo - indica la ausencia de efectos en el intervalo
de concentración ensayado (0,1 a 10.000
nM).\end{minipage} \cr}
Claims (13)
1. Procedimiento de rastreo de alta capacidad de
procesamiento para la identificación de compuestos cabeza de serie a
partir de una biblioteca de compuestos, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas siguientes:
- (a)
- rastrear una biblioteca de compuestos respecto a su actividad contra una diana deseada, para obtener aciertos potenciales;
- (b)
- perfilar los aciertos potenciales de la etapa (a) sobre más de 25 dianas que comprenden por lo menos:
- -
- receptores no peptídicos acoplados a G
- -
- receptores peptídicos acoplados a G
- -
- un receptor acoplado a un canal iónico, y
- -
- canales iónicos,
- para obtener aciertos potenciales con un perfil seleccionado.
2. Procedimiento de identificación de compuestos
activos a partir de una biblioteca de compuestos, comprendiendo
dicho procedimiento:
- (i)
- un rastreo de alta capacidad de procesamiento que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- rastrear una biblioteca de compuestos respecto a su actividad contra una diana deseada, para obtener aciertos potenciales;
- (b)
- perfilar los aciertos potenciales de la etapa (a) para obtener compuestos cabeza de serie eficaces y selectivos;
- (c)
- preparar una biblioteca o bibliotecas focalizada(s) de compuestos relacionados estructuralmente con los compuestos cabeza de serie de la etapa (b);
- (ii)
- repetir, una o varias veces, la etapa (i), utilizando la biblioteca o las bibliotecas focalizada(s) de la etapa (c) para generar otras bibliotecas focalizadas, y
- (iii)
- rastrear y perfilar las bibliotecas focalizadas de la etapa (i) o (ii) respecto a la actividad contra dicha diana, para obtener compuestos activos y específicos.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho rastreo de la etapa (a) comprende la selección de
compuestos capaces de interaccionar con una diana deseada.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que dicho rastreo de la etapa (a) comprende además la medición de
la afinidad de los compuestos capaces de unirse a dicha diana
deseada, para seleccionar, como aciertos potenciales, los
compuestos que tienen la mejor afinidad.
5. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicha etapa (b) de perfilado comprende ensayar los
aciertos potenciales sobre dichas dianas y seleccionar los
compuestos que son específicos para la diana deseada.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que dicha etapa (b) de perfilado comprende ensayar los aciertos
potenciales sobre más de 50 dianas.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que dicha etapa (b) de perfilado comprende ensayar los aciertos
potenciales sobre más de 70 dianas.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (i) comprende:
- (a)
- rastrear una biblioteca de compuestos respecto a la actividad contra una diana deseada, para obtener aciertos potenciales; y
- (b)
- perfilar los aciertos potenciales de la etapa (a) para la selectividad respecto a la diana deseada y a las propiedades farmacológicas, para obtener compuestos cabeza de serie selectivos y eficaces.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que, en la etapa (b), se perfilan entre 5 y 500 aciertos
potenciales.
\newpage
10. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicha biblioteca de compuestos comprende entre 5.000 y
500.000 compuestos.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha biblioteca de compuestos comprende entre 10.000 y
20.000 compuestos.
12. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dichos compuestos activos son candidatos a medicamentos.
13. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dichos compuestos activos son ligandos de receptores.
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