TW554043B - Process for preparing O-acetylserine, L-cysteine and L-cysteine-related products - Google Patents
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Description
554043 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明(1 ) 發明背景: 本發明乃關於一項製備0 -乙醯絲胺酸、L -半胱胺酸, 及隨著而衍生出來的含硫化合物等的方法。 L -半胱胺酸及其衍生^常被用於藥劑類(治療支氣管 疾病),被用於化粧品類(作為洗髮精及永久波形髮油的成 分),及被用於食品類(作為抗氧化劑、作為調味素,和製 造發酵麵團所用的,佐助劑)。L-半胱胺酸到現在為止都是 從含有角蛋白材料中抽取出來,例如:毛髮、鬣毛、獸角 、獸蹄、和羽毛等。或者自前驅物經酶的轉變而得來。一 種藉由徼生物的方法高量生産L -半胱胺酸的需求乃極為殷 切,因為如圖1、圖2、圖3所顯示,L-半胱胺酸不僅是 具有經濟價值的化合物,並且更是在合成麩胱甘肽、甲硫 胺酸、和生物素等的一種重要的中介材料。 在所有生物有機體中,L -半胱胺酸於硫的新陳代謝作 用裡佔有關鍵地位,並且用於合成蛋白質、麩胱甘肽、生 物素、甲硫胺酸、和另外一些含硫的新陳代謝産品。更甚 者,在輔酶A的生物合成中,L -半胱胺酸成為其前驅産物 ;除此之外,L -半胱胺酸會極易被氧化成胱胺酸。在L -半 胱i酸和其它例如L -絲胺酸、甘胺酸和L -甲硫胺酸等胺基 酸之間的生物合成時,存在一種密切關僳。 L -半胱胺酸的合成(如圖4)曾於原核生物中做過詳細 的研究,持別是在細菌之中(生物化學期刊1 9 6 6年第2 4 1期 ,4955至4965頁,作者克里狄區、湯肯斯;半胱胺酸之生 物合成,1987年,作者克里狄區,刊於華盛頓美國微生物 -3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 554043 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(2 ) 學會期刊第一期,419至428頁,大腸桿菌及鼠傷寒沙門氏 桿菌:細胞與分子生物,编者尼德哈爾待,英格拉罕,馬 格珊尼克、羅烏、帥赫特、安巴格等),其主要反應包括 從一種乙醯基族轉移為絲疲酸以産生0 -乙醯絲胺酸,此其 一。接著由硫氫族取代乙醯基族而導致合成為L-半胱胺酸 ,此其二。 1) L -絲胺酸 '乙醯輔酶A — 0 -乙醯絲胺酸 +輔酶A 2) 0 -乙醯絲胺酸 +硫化氫 L -半胱胺酸 +乙酸 在徼生物和植物中,以0 -乙醯絲胺酸,而不是絲胺酸 ,作為L -半胱胺酸中碩原子架構即前的前驅産物(生物化 學期刊1966年第241期,4955至4965頁,作者克里狄區、 湯肯斯)。為了製造活化形式的L -絲胺酸而先令乙醯族轉 移的反應是藉由絲胺酸乙醯轉移酶的催化而生(EC 2.3. 1. 30),此絲胺酸乙醯轉移酶是藉由编碼於CysE基因而得, 它並且又受其終端産品L -半胱胺酸的嚴格控制。用於絲胺 酸乙轉移酶的基因是已經本體繁殖過,導自該脱氧核糖 核酸序列的該胺基酸序列乃是已知(徹生物總論期刊1987 年第133期:515至525頁,作者為鄧克與博克)。 L -半胱胺酸本身是藉兩個0-乙醯絲胺酸硫化氫解酶的 同工酶催化而成(EC 4.2.99.8),它們乃各编碼於cysK基 因(0 -乙醯絲胺酸硫化氫解酶A)和cysM的基因(0 -乙醯絲 胺酸硫化氫解酶B)産生,這一種反應中0 -乙醯絲胺酸的功 能作為/3 -丙胺醯基供體以及硫化氫作為/3 -丙胺酸基受體 (生物化學期刊1966年第241期,4955至4965頁,作者克里 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 554043 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明(3 ) 狄區與湯肯斯),並以0 -乙醯絲胺酸硫化氫解酶A對於半胱 胺酸的合成作出最重要貢獻。除此之外,〇 -乙醯絲胺酸硫 化氫解酶B (编碼CysM)能夠利用硫代硫酸鹽作為硫磺的來 源(徼生物總論期刊1987年、第133期:2719至2725頁,作者 席爾科小組)。該0 -乙醯絲胺酸硫化氫解酶B催化0 -乙醯絲 胺酸與硫代硫酸鹽之間的反應,以造成S -磺酸半胱胺酸, 它然後又會轉變成、半胱胺酸(細菌學期刊1983年第156期, 656至662頁,作者中村小組)。 L-半胱胺酸所産生對於野生型絲胺酸乙醯轉移酶的終 端産品抑制作用在半胱胺酸生物合成動態調節中是一種生 理上的重要因素(生物化學期刊1971年第2 46期,3 47 4至 3484頁,作者克里狄區;生物化學期刊1966年第241期, 49 5 5至49 6 5頁,作者克里狄區與湯肯斯)。絲胺酸乙醯轉 移酶在野生型的活性被半胱胺酸所抑制。這種抑制作用曾 經做過動態的研究,發現它具有一種競爭的特徽。於含有 0 · 1 m Μ的乙醯輔酶A及1 Μ的L -絲胺酸溶液中,測定出這 値抑制常數值Ki = 1.1 X 1〇_6 Μ (生物化學期刊1 9 6 6年第 241期,49 5 5至49 6 5頁,作者克里狄區與湯肯斯)。 自文獻中得知一項可以分離一種半胱胺酸原質營養生 物的反突變體的實例,此反突變體所具有的絲胺酸乙醯轉 移酶之活性,對於L -半胱胺酸所生終端産品抑制作用僅作 徹弱的反應。這是由於藉用化學的方式以乙基甲烷磺酸將 一種缺少半胱胺酸營養症的菌株加以誘變,造成於编碼區 域中産生胺基酸的替換(微生物總論期刊1 9 8 7年第1 3 3期,
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X297公釐) L (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) • J1 m —i · 訂 554043 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明(4 ) 515至525頁,作者鄧克與博克)。根據此文獻的參考資料 所指,此突變體的回饋阻抗提高了 10倍。因此,在與野生 型的形式下作比較時,此突變體的Ki值約為0 . 0 1 mM。 發明的詳細説明: 本發明乃闋於對抑制劑L -半胱胺酸具有敏感性的絲胺 酸乙醯轉移酶。與野生型酶素比較,它會減少那種抑制作 用。它的蛋白質序列比野生型的序列顯示了至少一項突變 或切除。其中突變是在第97序位的胺基酸至包括第273序 位的胺基酸之間的次序範圍之内,或者其切除是在自第227 序位的胺基酸開始向上的羧基末端的序列區域。圖5所示 偽以起點甲硫胺酸為第1序位(序列識別碼:1 )以及其蛋 白質次序在第256序位所有的Met突變為lie被除外。 意外地發現到此新穎的絲胺酸乙醯轉移酶内胺基酸的 替代及/或羧基末端胺基酸的切除乃可導致半胱胺酸敏感 度降低,而同時又能容許適度的酶素活性保存下來。 該新穎的絲胺酸乙醯轉移酶最好在含有1 mM的L -半胱 胺酸和(KlmM的乙醯輔酶A時其抑制常數Ki約為0.005至2.3 mM之間。其中該擁有至少一個突變的絲胺酸乙醯轉移酶最 好在含有InrM的L-絲胺酸和O.lmM的乙醯輔酶A時其抑制 常數約為0.015至2. 3mM之間,而擁有至少一個羧基末端切 除的絲胺酸乙醯轉移酶最好在含有lmM L-絲胺酸和O.linM 的乙醯輔酶A時其抑制常數Κί約為0.005至0.03mM之間。 在含有1 πιΜ的L -絲胺酸和O.lmM的乙醯輔酶A的成份下 ,特別愛用的酶素突變體感受L -半胱胺酸的抑制常數(q ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公t ) 554043 A7 B7 五、發明説明( 間 之 物 生 徹 於 合 適 Mi 種 1 出 示 展 酶 移 轉 醯 。乙 酸 胺 3m絲 2 颖 至新 02有 ο 具 為 約 序 順 的 質 白 蛋 其 〇在 者好 素最 酶酶 該移 有轉 含醯 乃乙 物酸 生胺 徹絲 此的 ,穎 性新 ϋ-ΓΤ MHI1 活種 的一 長 生 體 變 突 的 E S y C 的 範 規 所 中 b 者 或 a 1X ο 表換 在替 個的 一 酸 少基 至胺 含其 包為 ,作 中 , 表 阻 饋 回 的 化 變 酸 基 胺 値 多 或 個 一 ο 有因 擁基 中偶 域對 BSE 碼cy 编的 於抗 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210 X 297公釐) 554043 A7 B7 五、發明説明( 0ΔΤ·0 οεο·· Ο 20·0 cn曰XU-H日/χο 曰 Wtisnl 卜 ττ·ο 9ιητ·009τ·0rnsz.o ιη5·0 9艺·0 < 5 οτ οτ 00卜 sοεοτ OHοτ s命εΜφε?< 丨ιη寸CNSHO Δ9τβτν<*Δ9τΜιιΕΗ 卜 9τβτν<·^9τ】ΜΑ9ιηεφτι< 丨νοιηειφκΔεζΤ^ΛΛΤ卜 εεβτν VDLnCN®TI< 丨 9scnu0)h 8rn<NsCQ<l8ez:>tTD 9sCNa)r-»I<—volr)CN4Ja}H 8εϊφΒ<-8εεΛΤ;0ΔεετβΛΑ-Δεϊ^τν 8εεϊε?<-8εζ:ΛΤ;0 ζ.εετβΛ<-ζ-εί^τν Ln9H04mv<1ln9T>1l;o 8ε2:ϊ^<-8εεΛΤο 0^0 tl— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i (066) m6) 066) srne) S6) 56) 56) m卜) S6} l<I,v<-DHV oDV<-as <.LV<0,LVoDV<-as ^HOAIHUa aDV<-CJDO xxo<-ehud soaihs UDV< 丨us Λ3Β>1ο ΛΙΗβΛϋ IIIWmAO ΙΙΜΒΛϋ ία 8
S6) J-LO<-HaD urn6) 066) HHOAtBO ViV< iDEHv
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(SS6) SD δ^ΑΙΗαϋ DDD<-00·< IXWBAOxamAO ΙΙΙΛΕΟ ιιληοοιλο iawqao 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) 554043 A7 B7 五、發明説明( β曰 x UJS/XOUU/ ετε·ο εϊ·ο ZS0.0 S80.0 οε 000ΗΛ os οοτ οοεοα cornCN“®cn<-8roCN>1To LseAtLrnCNeHv Δ9τβτν<-ζ-9τ 占 ι. 卜 93«<<-Δ9τ“ΜΗ 99τ&ν<-59τ^0osCN>1IO<loLnCNdal< 9SNdoucn< 丨 9lnCNJJa)s 卜VOTBIHVA 丨卜 9HJq£-»L9zn®q<-L9CNoqd 卜 9iq<did 8eCNsCQ<-8rnc4>1r-fD L6STO<-t6m>1q (这逛)¥颂 0 ^ 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) • J— I J— 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 δοτ} {^εσ>}aoVAIaOD HHLn) WO八 (^¾) tisn 0^0 豳瓛获aB>13 iixwcdad
Hs{9S56) 56) (686+886) Hs usi (rns aDV<-000 J-LD<-HUD ooD<-sv SD<-SV •LVDA—ioD OVH<-ow HDD<-EHva DVH<-DHV 000<-sv ojihaiehjjil iuDA-Iio ιιιχ^βλο ΛΙΧΗΒΑϋ ΙΙΛΧΕΟ
IIIXXWalAO 0. 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210Χ 297公釐) 554043 五、發明説明(8 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 1 b :擁有消除 羧基末端 回饋阻抗 的c y s E對 偶基因 cyseE突變體 被消除的 末 端 Ki 比活性 胺基酸 胺基酸 (/iM) /naol/min x mg* cysB-Del259 14 His259 7.5 0.328 cysE-Del258 15 Gln258 5 0-256 cysE-Del257 IS Asp257 7.5 0.394 cysE-Del256 17 Met256 12.5 0.366 cysE-Del255 18 Asp255 30 0 . S24 cysS-Del250 23 Asp250 20 0.405 cysE-Del249 24 Ser249 15 0.420 cysS-De!248 25 Asp248 12.5 0-270 舉例言之,新穎的不敏感半胱胺酸的絲胺酸乙醯轉移 酶可從演變一種编碼該新穎的絲胺酸乙醯轉移酶的脫氯核 糖核酸(D N A )序列而獲得。 由這些DNA序列编碼而得的酶素變體各展示對抑制劑 L -半胱胺酸一種不同的敏感度,然而在每一種狀況中,用 這些已發現的絲胺酸乙醯轉移酶都比野生型多出5倍對抑 制劑L -半胱胺酸的阻抗力。 本發明進一步關聯到编碼出新的絲胺酸乙醯轉移酶的 脫氣核糖核酸序列。 這些脱氯核糖核酸(DNA)序列的持徵在於實際上於各 自的cysE基因的DNA编碼區域中,自bp510至bpl040間,至 -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
A 554043 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(9 ) 少有一次突變。以圖6中的b P 1為第1鹹基(序列識別號碼 :2),並將990序位鳥嚷11令(guanine)至腺嚼D# (adenine) 的突變排除在外。 新穎的脫氧核糖核酸次序隨著上述的待歡,也就被稱 之為回饋阻抗的半胱胺酸E對偶基因。 舉例而言,者種脫氧核糖核酸的次序可藉非指定或藉 定位誘變等方法,_依照下面所述的起始材料開始予以製備。 例如,在該脫氧核糖核酸的區域内,可以藉由一些化 學藥劑(例如亞硝基胍、乙基甲烷磺酸之類)來産生一些非 指定的突變,及/或藉由物理方法來産生這些突變(分子 遣傳學的實驗:113至185頁,作者米勒,美國冷泉港實驗 室,1 9 7 2年),及/或藉由在某種特性條件下實施結合酶 連鎖反應(P C R )來産生(分析化學期刊1 9 9 0年第6 2期,1 2 0 2 至1214頁,作者吉布斯)。 將突變引入脱氯核耱核酸Η段之中的指定位置的方法 已是大家所知,並且在例如下述的著作中已有説明:生物 科技1 9 9 0年第8期,4 0 4至4 0 7頁,作者沙卡爾,松黙爾。 描述使用PCR作指定位置的突變;分子生物學當前的意見 交流1987年,8.0.1至8.3.6頁,格林出販公司,作者奧蘇 貝爾小組,描述使用Μ13噬菌體作指定位置突變的方法。 另一種對半胱胺酸Ε對偶基因産生回饋阻抗的方法為 包括結合不同點的突變,它們可以導致回饋的阻力,從而 引起具有新穎性質的多個突變體。 脱氯核糖核酸具屬於野生型的cysE基因者,或者其屬 -1 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
554043 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明(1 0 ) 於被突變造成不活躍的cysE基因者,或者其屬於已經突變 並已编碼成回饋阻抗的絲胺酸乙醯轉移酶的cysE基因者, 用於誘發突變作用作為起始材料較為合意。 有待突變的cysE基因可以编碼在染色體上或者编碼在 染色體外。 例如,起始的脱氣核糖核酸包括野生型cysE基因的片 段可使用已知的標_準技術重組於載體上,以製成重組DNA 。藉由使用前面所提的誘變方法,在DNA序列中改變一値 或多個核苷酸,致使此刻才被基因编碼造成胺基酸序列呈 現出至少一個突變在第97序位直到包括第273序位的胺基 酸序列區域之中,或者在自第227序位胺基酸為起點的羧 基末端次序區域中,發生至少一次的切除。其中第一序位 是圖5中的起始甲硫胺酸(序列識別號碼:1),以及其中第 256序位Met成為lie的突變被除外。 應用以上所說明的技術,可以在任何c y s E基因的該D N A 突變區域内,引入一痼或多値的突變作用,使被编碼的絲 胺酸乙醯轉移酶,因而具有一種胺基酸序列,它可導致對 半胱胺酸的不敏感性。 隨著這種突變作用,譬如實施以上所説明者,選擇了 具有所欲的表現型的突變體,然後藉由例如鋪蓋在無半胱 胺酸的培養基上,接著測定突變過的絲胺酸乙醯轉移酶對 於半胱胺酸敏感性的程度。 本發明亦關於含有回饋阻抗的cysE的對偶基因的微生 物。 ~ 12 - · 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X29*7公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
554043 A7 B7 五、發明説明(11 ) 其有 代徹,物 擇菌 為個 陳的知生 選桿 徽一 新有熟徹。當腸 特少 的所已有來適大 其至 酸在都所出的是 ,被 胺徑也於植株其 株上 C 胱途術用培菌尤 菌際用半這技應♦上穎 , 的實作於,的可物新菌 的偶 新用書株 選 酸對 的。科® 的 胺SE同知教的 宜 胱CY相已準新 適 半的 沿是標創 別 的抗 是說於以 恃 有阻 用可可所 是 具饋 作物如, 更 所回 謝生例上 。 , 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 胺 中簡: C ,的高 抗選面 胱 程此了品品品、 阻揀下 半 過因括産産産酸 饋。如 L-α成,包係的類羧 回株例 自物合制別關酸這二 。該菌用 者生物控特的胺 。)-等,主使 或微生的這酸胱物 U 肽素宿 , ,的得成,胺半合 4 甘酶為株 備穎使合物胱L-化),胱酶變菌 製新因物合半自硫,s麩移轉的 的養基生化L-生含 U 和轉法質 酸培偶其的和衍的-2,醯方性 胺於對棄量,有備烷素乙的酶13 胱助酸放大酸所製唑物酸慣移 I 半藉胺前産胺是來噻生胺習轉 L-,胱之生胱品酸E-、絲用醯 於備半點游半産胺 酸的使乙 關製的制下L'偽胱,胺變可酸 物,節由行株又生植細 有的抗控點、關半S)硫改因胺 生用調,進菌且微培性 亦品阻的制酸的L-R,甲現基絲 微作了上徑穎並何是陰 明産饋要控胺酸要2(、表偶過 種謝除則途新,任菌蘭 發的回重個絲胺須:酸 了對變 這代解原謝備得從細革 本生該個這醯胱是有胺為SE改 陳因 代製査以 。 衍 一在乙半就子胱cy有 新基 陳以中可 擇 酸 在化o-L-也例半 的具 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) 554043 A7 B7 五、發明説明() 所述的方法極為有效。 為了測定該已改變議株對半胱胺酸不敏感的程度,首 先要以半定量的方法,所謂交饋試驗來測量菌株分泌出來 的半胱胺酸。為了這個目標,該被測試的菌株被放進無半 胱胺酸的最低營養要求培養基中,並加入一種缺欠半胱胺 酸營養的指示菌株。該指示鐘株環繞著特別的接種條紋( 光輪)的生長帶即被作為分泌半胱胺酸的一種半定量測量 。全部有半徑大於2公厘光輪的菌株在交饋試驗中都被指 定為”交饋試驗的正結果”。一種酶素活性試驗於選取出 的菌株中加以實施,其目的為測定改變過的絲胺酸乙醯轉 移酶對半胱胺酸容受性的程度。 任何於含有半胱胺酸中能測定絲胺酸乙醯轉移酶活性 的方法均能用來測定此酶素對於半胱胺酸的敏感度。舉例 而言,絲胺酸乙醯轉移酶用克里狄區和湯肯斯在生物化學 期刊241期(1966年)4955至4965頁中所描述的方法來測定 其活性。在該試驗中,該酶素的測試混合試樣中包含基底 、L -絲胺酸,和輔因子乙醯輔酶A 。該反應從加入酶素後 即刻開始,使用一具分光光度計監視,觀察在232徼米處 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
裂 醯羧有胺 鏈 乙過含絲 酯 酸飾在同 硫 胺修用不 的 絲種作種 内 何一制各 A 任有抑。 酶 量具的試 輔 測括性測 醯於包活中 乙 用,酶液 在合度移合 於適感轉混 由驗敏醯應 是 試的乙反 長。素酸酸的 波長酶胺胺酸 該波的胱絲胺 ,的述半。胱 收光描對素半 吸的所素酶L-低出上酶的度 減引以酶端濃 漸而 移末同 逐開 轉基不 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 554043 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(l3 ) 酸乙醯轉移酶催化活性也在含有和不含有L -半胱胺酸的情 形下測試,而抑制常數K可從這裡測知(生物化學期刊2 41 期,1 9 6 6年,4 9 5 5至49 6 5頁,作者克里狄區與湯肯斯)。 在大多數情形下,最好是有一種半胱胺酸敏感性已消 失而酶素性仍活躍的絲胺酸乙醯轉移酶。為了其它的目的 ,一種在終端産品敏感度及催化作用都相伴降低者則可能 受歡迎。 _ 原則上,一種終端産品阻抗的絲胺酸乙醯轉移酶大量 地過度表現是並非所想要的,因為〇 -乙醯絲胺酸或者L -半 胱胺酸,或者說從那裡引致的新陳代謝作用,在過度演化 情形之下會造成過分的程度,在細胞内堆積起來以致毒害 細胞,並且也可能引出一些選擇出能減少絲胺酸乙醯轉移 酶活性的突變體。基於這個理由,該具回饋阻抗的cysE對 偶基因最好是整合於基因組内,使用習用的方法整合為單 獨的合販。 將單獨基因用適當的載體整合於染色體内的方法為習 知的技藝(例如:細_學期刊1 9 8 5年第1 6 1期,1 2 1 9至1 2 2 1 頁,作者溫南及同仁;細菌學期刊1 9 8 8年第1 7 0期,3 2 9 4 至3296頁,作者雪維爾及同仁;細菌學期刊1991年第173 期,2633至2638頁,作者庫拉寇士卡及同仁)。 同樣地,最好於低合販數的質粒表現回饋阻抗的絲胺 酸乙醯轉移酶。 正如已為熟知者,表現載體除了有回饋阻抗的cysE對 偶基因之外,最好也有一些其它的元素,以下將說明這些 -15- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) 554043 A7 __B7 五、發明説明(14 ) 元素。 載體上所有的编碼次序連接調節元件乃十分有用,這 些元件在表現编碼次序至所欲程度是必須有的。 這類調節元件的例子有啓動基因,核糖體結合部位, 和末端序列等。在多數情形下,其天然的調節半胱胺酸序 列也用於表現創新的突變體。然而,任何其它的調節序列 也可拿來使用。 _ 將選定的標幟及/或回報基因编碼的順序也常被喜歡 在表現載體上及調節元件之上。這種選定標幟基因的表示 便於轉移體的識別。適當選擇的標織基因是编碼於阻抗例 如氨苄氡徽素、四環素、坎那徽素、氨黴素或其它抗生素 的基因。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如果新穎的突變髏要以染色體外的方式複製時,最好 在質粒載體中包括複製物的一個原物。使用載體而將複製 物的原物移走以整合基因於染色體中的策略是一種習知的 技藝(細菌學期刊1985年第161期,1219至1221頁,作者溫 南及同仁;細菌學期刊1988年第170期,3294至3296頁, 作者雪維爾及同仁;細菌學期刊1991年第173期,2633至 2633頁,作者庫拉寇斯卡及同仁)。 於大腸桿菌中能自主性地複製的載體可於下述文獻中 找到實例:袍威爾、恩格佛克、布拉黙爾三人合著,無性 繁殖的載體,1985年,愛爾斯雒爾,阿姆斯特丹。 此類載髏的例子有: - 高合販數的質粒,例如PBR322及PUC18。 -16 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 554043 A7 B7 五、發明説明(IS ) - 中至低合販數的質粒,例如PACYC184及PACYC177,和 PSC101 〇 - 噬菌體載體,例如M13載體。 較為適合和喜用的載髏是那些具有低合販數的;適合 的載體且又是特受愛用者為具有 P15A複製子者,例如 PACTC184UTCC37033)或者 pACTC177(ATCC37031)。 在該文獻關於其它的細菌中,也敘述了許多的載體( 袍威爾、恩格佛克、布拉黙爾三人合著,無性繁殖的載體 ,1985年,愛爾斯維爾,阿姆斯特丹)。使用這種載體時, 亦可能現出他種細_的新穎突變體。 使用製備重組脱氧核糖核酸的標準技術可以産生適當 的重組載體。這類技術在標準教科書中均有詳細說明。 一値適當的宿主菌株可以隨一値演變載體來轉變,該 載體為含有能编碼成不敏感於半胱胺酸的絲胺酸乙醯轉移 酶的轉錄單元。 含有半胱胺酸敏感性的蛋白質的菌株,例如原核生物 或者酵母,是用來作為宿主菌株。 最好利用野生型的大腸桿菌菌株,或者其中的内源的 cysE基因為不活躍的菌株,並且這菌株又被新穎的cysE基 因所補充。此類細胞条统乃最適宜於用在大量生産L -半胱 胺酸或自其中衍生的新陳代謝作用。 當包含有至少一値回饋阻抗的cysE的對偶基因的一些 菌株被培養時,發現這些菌株在含有ΙπιΜ的L -絲胺酸和0.1 ιηΜ乙醯輔酶A 的培養液中,其内存的回饋阻抗cysE的對偶 -17 - 本纸張尺度適用中國國家標導(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
554043 A7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 B7五、發明説明(16 ) 基因在具有q值為0.015至2. 3mM之間,會分泌出較為多量 的半胱胺酸。 新穎的絲胺酸乙醯轉移酶也能夠使用抗感性核糖核酸 來製造,那是在一種用抗感性核糖核酸所諝反轉基因的特 別方法來阻礙或修飾基因活性的習用技藝的一部份。(基 因期刊1988年第72期、25至34頁,作者井上),反感性核 糖核酸是脱氣核糖核酸分股的轉錄産品,這DNA分股乃補 充在分股编碼於蛋白質上。藉由演變載體的方法來製造反 感性核糖核酸時也可能大量降低絲胺酸乙醯轉移酶的半胱 胺酸敏感性,這些核糖核酸補償到天然的或移轉的半胱胺 酸E基因中3’编碼分股的一値介定區域之内。於此狀況之 下,該反感性核耱核酸會刻意地退火至cysE-mRNA的目標 序列中,並從而引出新穎的絲胺酸乙醯轉移酶的酶素,此 酶素在其羧基末端被切除,並且相似於例3中的消除突變 體一般,會顯示減褪L -半胱胺酸抑制劑的敏感性。 另外的一個目的是提供硫磺來源,它確使藉用新穎的 徹生物作順利的半胱胺酸高量生産能適當進行。 曽經意外地發現到,0 -乙醯絲胺酸在細胞内的過量生 産會導致細胞内的半胱胺酸濃度明顯地上升,這種過量生 産是由使用新穎的絲胺酸乙醯轉移酶與適當的營養介質結 合所引發的。據此,新穎的絲胺酸乙醯轉移酶乃適合用於 過量生産半胱胺酸。 為了要達成這些目的,在生産介質中,必須要提供一 種新穎的微生物,並且也要供應一種適當數量的硫磺供體。 -18 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 554043 A7 B7 五、發明説明(l7 ) 所有的有機硫磺化合物都可為達致過量生産半胱胺酸 當作硫磺供體之用。一些既適合又偏愛使用的化合物為硫 酸鹽、亞硫酸鹽、硫化物、連二亞硫酸、和硫化硫酸鹽等 。硫化硫酸鹽為達到順利的半胱胺酸生産是十分適宜且特 別偏愛使用的。 進一步的增加半胱胺酸産量可以用額外地過度演變能 降低硫酸鹽的酶素(藉编碼於cysD、C、 H、 G、 I和J基因) 和産生硫氫酸鹽的酶素(以半胱胺酸K及半胱胺酸Μ的基 因來编碼)來達成。 更進一步增加半胱胺酸的生産率尚有以下的可能: a) 藉肋於將在基因層次調節作用蛋白質cysB解除制約, 其目的在於獲得組成的演變,該c y s B蛋白質所具備的功能 是作為跨越大腸桿菌中制約半胱胺酸的生物合成的控制作 用(半胱胺酸的生物合成1987年,作者克里狄區,載於細 胞的與分子的生物學第一集,大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏桿 菌,419至428頁,美國徹生物學會,華盛頓,编輯者奈德 哈特、英格拉罕、馬格沙尼克、羅、帥赫特、烏姆巴格)。 b) 藉助於混合Ser-A基因與新穎的cys-E基因。該Ser-A基 因是選自野生型的SerA族基因以及编碼一個磷酸甘油酸脱 氫酶的SerA基因,此酶素已失去對絲胺酸的敏感性。 c) 藉由自外面供應絲胺酸 最好是將本能具有半胱胺酸敏感性的絲胺酸乙醯轉移 酶的基因在宿主菌株中予以非活性化,從而保證僅有半胱 胺酸不敏惑性的絲胺酸乙醯轉移酶被合成在内,此不敏感 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 554043 A7 B7 五、發明説明(19 ) 圖6顯示大腸桿菌中的cysE基因的DNA序列、和由此 序列引生的絲胱胺酸乙醯轉移酶中胺基酸的序列; 圖7顯示例1中質粒pPl的限制圖。該例中質粒包含 一個用來繁殖的回饋阻抗cysE的對偶基因,自2.25kb的 pvul[片段進入pUC19; 圔8顯示例2中、質粒PUC43,在質粒中含有cysE野生 型基因,於pBlueseript之中其具有1.15kb大小的EcoRI/ BamHI的片段; 圖9顯示例3的PACYC184-LH的質粒圖,例中質粒含 有具羧基末端切除的回饋阻抗的cysE的對偶基因。例4中 的質粒含有具變更鹹基替換的回饋阻抗的cysE的對偶基因。 以下各實施例作為進一步澄清本發明之用: 實施例1 分離含有對半胱胺酸不敏感性之絲胺酸乙醯轉移酶的大腸 桿菌突變體 藉由逆反營養缺陷症的大腸桿菌菌株可以生産制約的 突變體。具備這些想要的性質(絲胺酸乙醯轉移酶對半胱 胺酸的不敏感性)的突變體要從缺少半胱胺酸營養的cysE 的大腸桿菌菌株的反突變體之中再尋求。 為了要分離這些反突變體,須使用缺少半胱胺酸營養 的大腸桿菌 JM15菌株(CGSC #5042: cysE50, tf「-8)和 JM 39菌株(CGSC »5043: cysE51, tfr-8)。這些菌株乃存放 於設在德國布隆士威格的德國微生物收藏館中,其寄存號 碼為DSM10173。為了要産生半胱胺酸原質營養生物性的反 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
554043 A7 B7 五、發明説明(20 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
突 變 體 9 使 用 亞 硝 胍 突 變 劑 來 處 理 這 Μ 株 如 密 勒 在 其 著 作 中 所 描 述 的 方 法 (分 子 遣 傳 學 1 9 7 2 年 9 125 至 1 29 頁 t 冷 泉 港 出 販 社 f 冷 泉 港 研 究 所 ) 〇 半 胱 胺 酸 原 質 營 養 生 物 性 的 反 突 變 體 在 無 半 胱 胺 酸 的 最 低 營 養 要 求 培 養 基 中 被 尋 獲 〇 約 有 1 , 000 個 被 尋 獲 的 反 突 變 體 開 頭 用 交 饋 試 驗 來 測 試 其 半 胱 胺 酸 分 泌 0 為 此 之 故 被 試 驗 的 反 突 變 體 即 被 置 於 4rrr Μ 半 胱 胺 酸 的 最 μ 營 養 要 求 培 養 基 平 板 上 ( 12 g /L K2 ΗΡ〇4 > 3 g /L kh2 P〇4, 5 g / L (NH4 )2 so 4 » 0 · 3 g/ L Mg SO 4X 7 Η 2 0 > 0 • 0 15 g /L C aC 12 X 2 η2 0 , 0 . 002 g / L FeSO 4 x 7 Η 2 0 9 1 g /L Na C it r a t X 2 h2 0 , 0 . 1 δ / L Na Cl » 15 g /L B a c to ~ A g a r , 以及] • in 1 /L 痕 量 元 素 溶 液 > 其 中 包 含 0 .1 5 g / L Na 2m 〇0 4 x 2 Η 2 0 2 .5 g /L Η 3 B 03 > 0 . 7 g / L Co Cl 2 x 6 h2 〇 9 0 .25 g / L C u S 〇4 X 5 Η 2〇 i . 6 g / L Μη C 1 2 X 4 h2 0 f 以 及 0 . 3 g / L Ζ η S 04 X 7 Η2 0 ( 溶 液 中 再 補 充 1¾的 葡 萄 糖 ) 並 在 每 毫 升 溶 液 中 接 種 缺 少 半 胱 胺 酸 營 養 的 JM39 標 示 菌 株 5 X 1 06 痼 細 胞 在 37 的 保 溫 箱 培 育 48小 時 〇 環 繞 測 試 菌 落 (光輪) 的 餵 食 耳 部 的 半 徑 被 用 以 作 為 白 測 試 菌 株 分 泌 半 胱 胺 酸 的 一 種 半 定 量 的 衡 量 > 所 有 反 突 變 體 其 生 長 帶 顯 示 出 大 於 2 公 厘 者 被 分 類 為 揚 而 予 以 分 離 1 經 過 數 次 剷 線 培 養 純 化 之 後 就 加 以 保 存 起 來 0 為 了 要 分 析 反 突 變 體 所 具 有 分 泌 半 胱 胺 酸 的 生 物 化 學 基 本 性 質 該 絲 胺 酸 乙 醯 轉 移 酶 的 活 性 是 在 體 外 測 定 的 0 並 且 也 測 量 半 胱 胺 酸 抑 制 酶 素 的 能 力 〇 此 測 量 要 使 用 選 定 的 反 突 變 體 起 始 菌 株 和 大 腸 桿 菌 比 較 菌 株 W 3 11 0 (A T T C -11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) 554043 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(23 ) 液是在4 °C 的溫度中以30,000克的離心力作20分鐘取得的 。為了要確切認清個別c y s E導致終端産品抵抗性的對偶基 因中結構基因的變化,這些對偶基因的脱氧核糖核酸使用 c y s E特定基因的低核《酸為序列,並且將找到的核苷序列 與c y s E野生型基因的序列相比較。這痼核苷酸序列的比較 中,在野生型DNA序列和胺基酸序列的對比都得到一些差 異 。這些資 料摘錄於 下列表 2 中(參考圖5及圖6 )0 表 2 :自化 學突變劑 獲致的 回 饋阻抗的c y s E基因 cysS 核荅酸 胺基酸 突變體 替換(號碼) 替換(號碼) (μΗ) cysS工工 GGC->AGC (934) Gly238->Ser238 10 cysE工工工 GGT->GAT (71S) GlylS5->Aspl65 10 cysHVII GCT->GTT (932) Ala237->Val237 10 cysSX ACG->GCG (721) ThrlS7->Alalo7 50 cysEXI GGT->AGT (955) Gly245->Ser245 700 ACG->GCG (721) ThrlS7->Alal67 cysSX工工 AAA->GAA (511) Lys97->Gln97 40 GGC->AGC (934) Gly238->Ser238 TTT->TTG (1023) Phe2S7->Leu2S7 cysSXI工工 GTT->GCT (713) VallS4->Alalo4 30 TTT-TTG (1023) Phe2S7->Leu267 cysEXVI GAT_〉GGT (971) Asp250->Gly250 50 AAG->TAG (973) Lys251->Stop251 實 驗例2 : 藉 由在cysE的結構基 因中以 特 定鹼基替換的方法 來産生 终 端産品不 敏感性的 絲胺酸 乙 醯轉移酶 -25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
554043 A7 B7 五、發明説明(24 ) 於例1中,以總共8痼不同的cysE對偶基因來說明, 由於鹼基的替換和相伴而生的胺基酸改變,它們展示了絲 胺酸乙醯轉移酶對於L -半胱胺酸的抑制作用有實質程度的 非敏感化。這些改變過的酶素不單只是在導致抗力的胺基 酸替換的序位有所差異,並且在某種情形之下,也對抑制 體L -半胱胺酸的敏感性程度不同。具有终端産品阻抗的絲 胺酸乙醯轉移酶這種新特性的酶素,以指定位置突變作用 而構成,並且這些酶素中的胺基酸替換如例1中所說明的 為互相結合一起。為此目的所要求的突變按照酶學方法期 干U 1987年第154期:367至332頁中,孔克爾及同仁所説明 的方法為習用技藝來實施。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一種c y s E質粒p P C 4 3 (寄存於德國布隆斯威格德國微生 物收藏館,其寄存號碼為DSM10171)繪示於圖8中,被用 作突變的起始質粒,此質粒在呑噬體質粒載體pBluescript I SK+ (取自海德堡史待拉塔金)的EcoRI-BamHI位置上含 有1.15 kb大小野生型的cysE基因。此野生型的cysE基因 是從野生型大腸捍菌株y3110(ATTC27325)的DNA基因組藉 用結合酶連鎖反應(P C R )方法(科學期刊1 9 8 8年第2 3 9期, 487至491頁,作者賽奇及同仁)予以放大,使用低核苷酸 cysE-fwl(序列識別號碼:3)(有意義引子)和cysE-revl( 序列識別號碼:4 )(反意義引子)。這些引子的核苷酸序列 如以下組成:c y s E - f w 1 (序列識別號碼:3 ) 5 , -GCCTGGATCCTGCAGTCGACCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3 , -26 - 本紙張尺度適用中國國家標隼(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) 554043 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(25 ) 粗寫的部份為相對應於圖6中c y s E的D N A序列自9至3 0 的鹼基;下方劃線者為協同BamHI的位置。 c y s E - r e v 1 (序列識別號碼:4 ) 5 , -GTAGGAGCTCTGCAGAATTCGGGTATCCGGGAGCGGTATTG- 3 · · 粗寫的部份為相對應於圖6中c y s E的D N A序列自1 1 0 6 至1126的鹼基;下_方劏線者為協同EcoRI的位置。 結合酶連鎖反應試驗是在一台溫度循環器(基因ATAQ 控制儀,取自藥房)實施30週期,並加入200um的三磷酸 脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP),每一種情形下加 入各對應的低核苷酸lwffl, l〇〇ng的W3110 DNA,反應缓衝 劑(ΙΟιηΜ Tris-HCl pH8 . 3 , 5 0 in M KC 1 , 1 . 5mM M g C 13 , 0.01 %明膠)和5單位的熱穩定的Vent DNA結合酶(取自生物試 驗室)以及如下的條件:96^0,1.5分鐘;62t!, 1分鐘; 72°C, 3分鐘。該放大後的産品以BamHI及EcoRI加以限制, 使用聚半乳糖膠予以純化並作本體繁殖,形成一個1.15kb 大小的DNA片段,置於已用BamHI及EcoRI線條化的呑噬體 質粒載Bluescript2SK +之中,結果成為cysE質粒pPC43( 見圖8 )。 用以下的程序可做出想要的多重突變體: 1) 製備cysEIV的對偶基因:雙突變體Val237 + Ser233 用野生型的cysE質粒pPC43開始,並應用特定位置的 突變法,起先用低核苷酸c y s E - M u t - 1 (序列識別號碼:5 ) (見表3 )突變作用將一個絲胺酸引入取代第2 3 8序位的甘 -27 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公缝) 554043 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(26 ) 胺酸,於此得到的 c y s E突變體p P C 3 4中,再用低核苷酸 CysE-Mut-3(序列識別號碼:6)(見表3)的突變作用引入 一個纈胺酸以取代第237序位的丙胺酸。結果成為cysE IV 的對偶基因。 ' 2) 製備cysEUI的對偶基因:雙突變體Val237 + Ile25S 用野生型的cysE質粒PPC43開始,並應用特定位置的 突變法,使用低核苔酸c y s E - M u t - 6 (序列識別號碼:7 )(見 表3 )的突變作用引入一個異亮胺酸以取代第256序位的甲 硫胺酸,而得到c y s E I的對偶基因。再用低核苷酸c y s E -Mut-3(序列識別號碼:6)(見表3)的突變作用於後者對偶 基因中引入一値纈胺酸以取代第2 3 7序位的丙胺酸。如此 即造成c y s E VI的對偶基因。 3) 製備cysEVI的對偶基因··雙突變體Ser238 + ne 25 6 使用低序列識別號碼:5)(見表3) 的突變作用將一個絲胺酸引進上述的cysE I 的對偶基因 (突變體工le25S )中,以取代第2 3 8序位的甘胺酸,從而獲 致c y s E VI的對偶基因。 4) 製備cysEV的對偶基因:三突變體Val237 + Ser238 + Ile256 於上述cysE W的對偶基因(雙突變Val237 + Sei:233 ) 中第256序位的甲硫胺酸被一個異亮胺酸所取代,使用的 突變方法為低核荅酸cySE-Mut-6(序列識別號碼:7)(見表 3)。如此即造成cysEV的對偶基因。 5) 製備cysE XIV的對偶基因··雙突變體 Ala1S7 + Stop251 -2 8 * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 554043 A7 B7 五、發明説明(27) 從cysE-Del 255的對偶基因開始(參閲例3),使用低 核苷酸CySE-Mut-10(序列識別號碼:8)(見表3)的突變作 用,引入一個丙胺酸以取代第167序位的蘇胺酸,由此獲 致cysE XI V的對偶基因。、 6) 製備<^3£乂711的對偶基因:雙突變體义39^5七八131,7 從cysEI的對偶基因開始(突變體 Aspiss ,參閲例1 ) ,使用低核苷酸cysE-Mut-10(序列識別號碼:8)(見表3) 引入一個丙胺酸以故代第167序位的蘇胺酸胺基酸,此即 造成c y s E X V I I的對偶基因。 7) 製備cysEXVIII的對偶基因:三突變體Ala1S7 + Val237 + Ser233 使用低核苷酸c y s E - M u t - 1 Ο (序列識別號碼:8 )(見表 3)的突變作用,在cysE IV的對偶基因(雙突變體Val237 + Seir233 )中引入一個丙胺酸於第1 6 7序位以取代其蘇胺酸, 從而獲致c y s E X X I I I的對偶基因。 對於某種特殊突變體的整個結構成基因的DNA序列分 析是被用以核對所引入的突變作用是否正確完成,在表4 中所交待者為cysE多重突變體的總覽表。 經濟部中央標傘局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如酶素的活性及抑制常數 Ki-類的生物化學參數均 用類似於例1所描述的方法來測定。 表3 :用於指定位置突變作用以産生新穎的回饋阻抗的 cysE對偶基因的低核苷酸 -29 - 本纸張尺度適用中國國家標率(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 554043 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 五、發明説明(28) Δ93ν<-Δ9τ^ιΗ ΑΒ79sCNI9rHI<-9s2 ① S8ε298<-8εεΑτο 0 « 0 1 ^ s &-9 _
<ΝεΔ-60Δ /7 .ΙΙΛίοΗοοαοουϋιννοΗΟοΕΗJbus I ,Ln 666 丨 9L6fn丨 XVODVUUVDSVSODHYVCJHVUU- ,Lnεε6 — ετ6 /rn丨 xisasuvoovEHvasooov ,Ln In寸 6I8CN6 ,ε 丨ΗυαοοοΙηΙοοϋ<;ιχοοοαο 丨 i S
9 丨JJns-wmAo Γη丨4Jns-WB>1o 1H丨JJnslwmAo 麄:ίπ逛裝 iti 4it<«K 8 L 9In 19騌菡 0 ^ ^ 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
554043 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(29 ) 表4 :藉由指定位置的目標式突變方法産生的回饋阻抗 cysE對偶基因 cysE 突變體 核荅酸 替換(號碼 ), 胺基酸 替換(號碼) Ki (μΜ) cysEIV GCT->CTT (932) Ala237->Val237 40 GGC->AGC (934) Gly238->Ser238 cysEV GCT->GTT (932) Ala237->Val237 10 GGC->AGC (934) Gly238->Ser238 ATG->ATA (990) Met25S->Ile25S cysSVI GGC->AGC (934) Gly233->Ser233 10 ATG- >ATA (990) Met25S->Ile25S cysSV工工工 GCT->GTT (932) Aia237->Val237 30 ATG->ATA (990) Met25S_>Ile25S ACG->GCG (721) Thrl57->AlalS7 >1000 ATG->TAG (338+989) Met25o->stop2 5 o cysEXV工工 GGT->GAT (71S) Gly165->AsplS 5 100 ACG-〉GCG (721) Thrl67->AlalS7 cysEXX工工工 ACG->GCG (721) ThrlS7->Alal67 2300 GCT->GTT (932) Ala237->Val237 GGC->AGC (934) Gly238->Ser238 實施例3 藉使用結合酶連鎖反應法於控制情況下截斷酶素的羧基末 端以産生不敏惑於终端産品的絲胺酸乙SI轉移酶 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
554043 A7 B7 五、發明説明(3〇 ) 藉由結合酶連鎖反應技術使用適當的突變引體以變更 蛋白質中特定的一値或多値胺基酸是習用的技藝,並且在 D N A層次上可以很容易實施的(科學期刊1 9 8 8年第2 3 9期: 487至491頁,作者賽奇及同仁)。將獲致的結合酶連鎖反 應産品作本體繁殖作成質粒/宿主的条統以達到使該改變 過的蛋白質能夠被演變的目的。 具有羧基末端以不同長度被切除的各種cysE突變體乃 用表5所列述的各種低核苷酸引體自大腸桿菌的野生型菌 株W3110UTTC27325)的基因體DNA來製備的,這些長度不 同的突變體統列於表6中。 該結合酶連鎖反應試驗在一台熱循環器(基因ATA Q控 制器,得自藥房)中加上2 0 0 w m的三磷酸脱氧核苷酸(d A Τ Ρ 、dCTP、dGTP及dTTP),實施30次循環。在每一種情況下 也加人1 y m的有意義引體c y s E - L H f w 1 (序列識別號碼:9 )的 低核苷酸以及相對應的反意義引體(序列識別號碼:1 0 - 2 3 (見表5), 100ng的W3110 DNA,反應缓衝劑(1〇1^1>丨3- HC1 PH8.3,50roM KC1, 1·5ιαΜ MgCl2, 0.01¾ 明膠),以及 5單位的一種熱穩定Vent DNA結合酶(取自生物試驗室), 在下列的條件下蓮作:96t, 1.5分鐘;62t, 1分鐘;72 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) t , 3分鐘。 c y s E - L H f w 1 (序列識別號碼:9 ) 57-TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3 7 粗寫部份乃相對應圖6所示c y s E序列9至3 0的鹼基, -32 - 本纸張尺度適用中國國家標隼(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 554043 A7 B7 五、發明説明(31 ) 下面劃線部份是協同的B s t X I / S a c I位置。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經過放大之後獲得的産品以酶素SacI及Nsil加以限制 ,然後透過一種聚半乳糖膠予以純化,以及將各種情況下 分離開的cysEDHA片段結合、於載體pACYC184-LH/DSM(10172) (參考圖9),此載體已用SacI及Nsil線性化。每一種結合 混合體都被轉變成缺少半胱胺酸營養症的cysEit株JM15( CGSG#5042)並且在無半胱胺酸但含有四環素(20毫克/升) 的最低營養培養基¥揀選。 自這裡本體繁殖所穫得的質粒被稱為pACYC184/cysE-Del以符合它們被切除的程度(該質粒圖可參閲圖9)。對 於酶素活性抑制常數Ki的測定,以及交饋試驗都可以用類 似於例1所描述的方法實施。DHA序列分析則用來證實該 切除已被正確引進。 這些研究的結果於表6中予以條列。 表5 :製備具有切除羧基末端的cysE對偶基因所用的反意 義低核苷酸 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 554043 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 \)/ 2 3 /—\ 明説 明發五 _这s &-9匿 S6 ·卜卜8 6ΓΟ6 ·ετ6 卜56 -ΤΓΟ6 996 -56 696 i6 CNr-6 —9 寸 6 Δ86 丨Τ96 066'S6 ΓΟ66 —996 966 丨ΟΔ6 666 ·ε卜6 ττοτ丨S86 9(Ν0τ-000τ CNstH-90s / € -ooVHWXiDS.LVBHaHW\ruHuVHVuuuVHHV.IooV.LHVuO.LVOoJ:VJ丨 :丨 νγ9υΒυανΗννϋο3ΗνΕΗοΗνγνοΗονΗΗν.103<;ΕΗΗνοοΗνο3ΕΗο丨 ro-CJHVHYDuiDDJo£>HWVOXXS3VHVWHHVHSV.LHVoDHVSILu丨 Γη丨 xiuaDHYDixYDuHVHVuuHOOJbDHYVHXVHoovEHEHvooEHvouE-lu. ε 丨aHvxiaooEHVDiiYDaHVEHvaaJboHuVB.LV.L8V.LEHvooEHvooJb 丨 ε 丨 ϋΗϋϋϋΗνχΛυοοΗνοϋνϋϋΗνΗνοϋΗϋν,ΙΙ,ν,ΙΟυνΕΗΕΗνυαΕΗνουΗυ 丨 ε 丨CJHCDHuDuEHvEHHuDoHVDEHHVuuHVHVuVHEHV.L0av,LEHvac!)H<oaEHu丨 ε 丨 §ΗυΗΟΗυαυΗνϋυ§ΗναχχγουΗνγΕΗΕΗνΕΗοανΗΗνοϋΗνοο.Ιυ丨 ε 丨 SVHWDYDuuVXJ-LDDHoHDHoDoHYV,I.LV,LSVEHHVooEHv8EHu 丨 ε 丨oSYDuviwovDuuVHJ^ODHuHoHuDVHEHvsoVHHVoDEHvouEHu丨 ε 丨 οουοονουνΗγνονοοονχχχοοΗυΗΘνΗΗνΗΟυν,ΙΗνοΟΗνοοΗο丨 ε 丨 doyduduyyddoudyduvehwdyduowhhv,idcjν,ΙΙ,νοο,Ινοοδ丨 ε 丨§aoDuuHVHDaHaauDDuDVuaDuwv&HEHV.LOov,LHVuDEHVDoHu-, s Ln ε -ϋυΕΗγνοοϋυϋΗυυννοουνουγοανυνΕΗΗνδονΗΕΗναο,ΙνϋαΗυ— / s >CNCNTa)aiws>1u 6εοίτα)αιΗα}>1ϋ 5 寸CNTa)a — wm>1u 8 寸ζτα)αιΗΒ>1ϋ 6 寸 ετα)α 丨 wmAq oLnCNIHa)a 丨 ws>1o sLnCNrHa)a 丨 wQ>1a 9sCNTa)a-3CQ>1D z.sCNHa)a — ws>1D 8lnCNHa}alwOQ>1D 6ιηετα)α-ΕΙΒΛϋ rn9CNPHa)a 丨 wmAu 89csT^a-WBt or-CNTa)a 丨 wcdao ε<Ν CSCN HCN OCN 61 lh9τ SH 寸Hετ CNTττοτ ^ 0 0 H ^ ^ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2!0Χ 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 554043 A7 B7 五、發明説明(33) 粗體字部份對應於圖6中序列内各相對的基底;底下 劃線部份為N s i I位置。 表6 :經由切除羧基末端産生的回饋阻抗cysE對偶基因 cysS突變體 被切除胺 末端胺基酸 又:㈣ 基酸數量 cysE-Del271 2 Asp271 0 cysH-De!27 0 3 Gly270 0 cys3-De!2 5 3 、 5 Glu2 S 8 0 cysS-Dei2 53 10 工le2S3 0 cysE-Dei2 5 9 14 His259 7.5 cysH-DeI253 15 Gln253 5 cysE-Del257 15 Asp257 7.5 cysS-De!25o 17 Met25o 12.5 cysS-De!253 13 Asp25 5 30 cy3E-Del250 23 Asp2 5 0 20 cys2-Del249 24 Ser249 15 cysE-De!24 8 25 Asp243 12.5 cysE-De!245 28 GIy245 0 cysE-Del23 9 34 Val239 0 cysS-DeI227 45 Leu2 27 0 實施例4 : 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用變更過的絲胺酸乙醯轉移酶以轉變大腸桿宿宿主菌株其 目的為在震動水瓶内邋量生産L-半胱胺酸或者L-半胱胺酸 的相關産品 載體PACYC184-LH ,其特微為低販本數量乃被用於該 生産。為此目的,例1與例2中的質粒上的cysE基因被用 -3 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 554043 A7 _B7_ ____ 五、發明説明(34 ) 結合酶連鎖反應法放大。 該結合酶連鎖反應實驗於熱循環器(基因ATAQ控制器, 取自麵房)中實施30次循琛,並加入200/zm的三礎酸脱氧 核苷酸(dATP、dCTP、dGTP及dTTP),每一菌株例中各加入 1/z a的有意義cysE-LHfv/l(序列識別號碼:9)引體的低核# 酸和相對應的反意義cysE-LHrevl(序列識別號碼:24)引 髏,10ng的各相應DNA質粒,反應緩衝劑(1〇»Μ的Tris-HCl PH8.3, 50iaM KC1, 1·5·Μ MgCl2, 〇·〇1Χ 明膠),以及 5 單位 的熱穩定Vent DNA結合酶(取自生物試驗室),並在以ΤΚί 操作條件:96t;, 1.5分鐘;62Ϊ:, 1分鐘;72C,3分鐘。 c y s Ε - L H f w 1 (序列識別號碼:9 ) 5, -TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3 7 底下劃線的齡基為對應於協同的BstXI和SacI限制裂 開位置;其餘的粗寫鹼基乃對應於圖6中cysE序列的第3 至9 0序位。 cysE-LHrevl(序列識別號碼:24) 5, -CTCGATGCATTACGTAGGGGTATCCGGGAGCGGTATTG-3 . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 底下割線的鹼基乃對應於協同的N S ί I限制裂開位置; 其餘粗寫部份的鹸基乃對應於園6中cysE序列中第1106至 11 2 7序位。 經過放大之後獲得的産品被限制於SacI和Nsil的酶素 中,並隨後透過聚半乳糖膠予以純化·,於各種倩況下分離 -36 - 本纸張尺度適用中國國家標準((:犯)八4規格(210、犬297公釐), 554043 A7 B7 五、發明説明(35 ) 出來的cysE DNA片段然後連結於載體PACYC184-LH/ (DSM 10172)中,此載體已先用SacI及Hsil予以線條化。 每一連結混合髏均轉變成缺乏半胱胺酸營養症的cysE 菌株JM15(CGSG#5042)並在含有無半胱胺酸四環素(20毫克 /升)的最低營養要求培養基中進行揀選。自此繁殖而獲得 的回饋阻抗cysE質粒被命名為pACYC184/cysE(參閲圖9 )。 每一種繁殖均被提供相對應的eysE對偶基因的號碼。 酶素活性及抑制常數1^的測定和交饋試驗等都可用類 似於例1所描述的方法實施。 為了澜定在液態培養基中的生産能量,在20毫升的標 準培養液中接種一單菌落,並在30C和17〇Γριη下培養48小 時。該營養基中包含15 g/L的葡:g糖、0.08 g/L的細菌胰 蛋白、0.04 g/L的酵素抽取液、5 Big/L的維生素Bl、3 g/ L KH2P〇4 , 12 g/L K2 HP〇4 , 0 . 3 g/L MgS〇4 x 7 H2 0 , 0 . 1 g/L HaC 1 , 5 g/L (HH4 )2 S 04 , 14.7 a g / L CaC 12 x 2 H 2 〇 » 2 nig/L F e S x 2 H 2 〇 . 1 g/L H a3 C i t r a t x 2 H 2 〇 ,5 g/L Na2 S2 03 x 5 H2 0 , 1通1 / L的痕量元素溶液,和 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0.025毫克/升的四環素。該痕量元素溶液的組成為0.15 g /L Na2Mo〇4 X 2 Η20, 2.5 g/L H3B〇3, 0.7 g/L CoCl2 X 6 H2 0 , 0.2 5 g/L CuS〇4 x 5 H2 0 , 1.6 g/L MnCl2 x 4 H20及0.3 g/L ZnS〇4x 7 H20。在每一種案例中經過24小 時及48小時之後各取出一次試樣(10ul)並將其適當地稀 釋;用熱量測計的方式來測定該無細胞上淸液中的産品濃 度,使用蓋通德在生物化學期刊1 9 6 7年第1 0 4期,6 2 7至 -37 - 木纸張尺度適用中國國家標隼(CNS ) Λ4規格(210X297公釐) 554043 A7 B7 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 i、發明説明(36) 633頁所描述的方法。為了轉變不同的cysE突變體以産生 J Μ 1 5薗株,測得半胱胺酸的濃度介於5 〇至3 0 0毫克/升之間。 實施例5 使用一種再結合的人-原嗤、菌體造成以染色體方式编碼的 回饋阻抗cysE對偶基因,以及在1公升的發酵素内産生L_ 半胱胺酸和L-半胱胺酸的衍生産物。 將cysE對偶基因的cysE IV、cysE X和cysE XI繁殖在 i>RS551質粒中(基*因期刊1987年第53期:85至96頁,作者 西門氏及同仁),以達到將其結合於染色體附著位置(att λ)之中。為此之故,每一個cysE對偶基因都從對應的cys E質粒藉由結合酶連鎖反應予以放大。所使用的低核;酸, 也就是cysE-fwl及cysE-revl,是在例1中討論過。放大 的蓮作亦如例3所討論的實施。所獲致的片段是以Ec〇R1/ BaniHl來***,又透過聚半乳糖膠予以純化,並連結於以 被EcoRl及BainHl***的載髏PRS551之中。如此可得到以載 體PRS551作基礎的再結合質粒pRScysE IV、X和XI。 一種異質的蘭布達(lambda)溶菌産物,它含有λ RS45 噬菌髏之外,也含有帶再結合cysE對偶基因的λ RS45的衍 生物。它是在應用XRS45噬菌體(基因期刊1987年第53期 :85至96頁,作者西門氏及同仁)製造一種在帶有PRScysE 的recA+的菌株(例如YMC9、ATCC3397)之上的溶菌片時· 於體内作同源異髏的重組而産生。 被異質的蘭布達溶菌産物感染而接著放置在帶有坎那 徽素(25毫克/升)LB平板上的cysE菌株JM15是被用以在内 -38 - 本纸張尺度適用中國國家標举(CNSM4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 554043 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(37 ) 中尋找重組的RS 45衍生物。所得到的溶素源抗坎那徽素繁 殖體跟著被試驗在沒有半胱胺酸的最低營養要求培養基上 的生長能力。S每一例原質營養的半胱胺酸中遘取一株繁 殖體將其用以製造同種異株的cysEX溶菌産物(藉由紫外 線感應。基因期刊1987年第53期:85至96頁,作者西門氏 及同仁)。 該JM15菌株被取自每一例中的那些同種異株cysEA溶 菌産物所感染。所造成的JM15attA::cysE菌株被如例6 所描述加以培養。在每種情況下各自的培養液都含有每公 升25毫克的坎那徽素代替四環素作為選用的培養基。 各情況下的半胱胺酸産量為:於cysEIV例中0.5克/升 ,於cysE X例中1.8克/升和於cysE XI例中2.1克/升(參閲 表7 ) 〇 實施例6 使用主髏菌株JM15在1公升的發酵素内生産L-半胱胺酸及 L -半胱胺酸衍生産品受不同的以質粒编碼的cysE對偶基因 所生的影鬱 將20毫升的LB培養基(1¾胰蛋白_、0.5¾酵素抽取液, 0.5!«氛化鈉)裝進100毫升的厄菌邁耳瓶中,接種一株生産 所得菌株JM15(CGSC#5042)的單菌落。該菌落為已被以對 應的cysE質粒所轉變。 在細菌搖動器中(30Ό, 15〇rpn)培養7小時之後,各 自的初期培養物轉移到100毫升的SM1培養基。該SM1培養 基含有5 g/LS萄糖、5 mg/L的維生素Bl、 3 g/L KH2P〇4, 一 39 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) 554043 經濟部中央標準局員工消費合作讧印製 A7 B7五、發明説明(38 ) 12 g/L Κ2ΗΡ〇4,0 . 3 g/L M g S 〇4 x 7 H2〇, 0 . 1 g/L NaC 1 ,5 g/L (HH4)2S〇4, 14.7 ag/L CaCl2 x 2 H2〇, 2 mg/L FeS〇4 x 2 Η〗。,1 g/L Na3 Citrat x 2 Η2〇, 1 ffll/L 的 痕量元素溶液,以及25毫克/升的四環素。該痕量元素溶 液由 0.15 g/L Na2 Mo04 x 2 H20, 2 . 5 g/L Η 3 B 03 , 0 . 7 g /L CoC12 x 6 H2 0, 0.2 5 g/L CuS〇4 x 5 H2〇, 1 . 6 g/L MnCl2 x 4 H20 及 0.3 g/L ZnS04 x 7 H2〇 所組成。該培 養物在1公升容量的細菌搖動器中於301C及150γή下振動 1 7小時。經過如此培育之後,其0 D 6()(3數值介於4與5之間。 其後的發酵是在布勞恩-邁耳松根的拜耳斯泰持Μ研究用 .發酵器中實施。使用一種總容積為2公升的培育瓶。 該發酵素培養基包含15g/L葡萄糖、5 g/L NaCl, 0.3 g/L MgS〇4 x 7 H20 , 15 mg/L CaCl2 x 2 H2〇, 75 ag/L F e S 0 4 x 7 H 2 〇 » 1 g/L M a 3 Citrat x 2 H2 〇, 1 .5 g/L KH2PO4, 1毫升的痕量元素液(Difco)以及25nig/L四環素。 在發酵器中的葡萄糖濃縮液開始先加入一種700克/升 (滅菌過的)¾萄糖溶液以譌整至濃度為15克/升,再加入 25¾的氫氣化氛溶液以調整其pH值至7,0。在達到006()(3為 10之後,以每小時300毫克的速度供應一種滅過菌濃度為 100克/升的硫代硫酸鹽貯存溶液。將100毫升的原始培育物 加入發酵器容器中以接種。開始時的體積約為1公升。起 先以400rpni來攪動培育物,再以的壓縮空氣予以充 氣。此空氣以通過滅菌過濾器來滅菌。發酵在30P的溫度 下進行。 -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) • —«Mu 1^11- 0 訂 554043 A7 B7 該酸驗度 pH值為〇 · 7。 降至20¾以下 中的葡萄糖含 小時測量一次 YS I的葡萄糖 種化合物以調 培養基中 生物化學期刊 計來测定試樣 該發酵試 生半胱胺酸量 表7 :以不同 半胱胺 五、發明説明(39 傜以25%氫氯化氨用自動校正的方式維持在 在發酵進行中氧氣的飽和度不得在任何時間 •,攪動的速度乃用以保證這一點。營養溶液 量、光密度和半胱胺酸含童都每間隔2至3 。葡萄耱含量是以酶素方式測定,使用取自 分析儀。《萄糖的濃度以繼續不斷地加入這 整到1 0至2 0克/升之間。 的半胱胺酸含量乃使用蓋通德的方式,載於 1967年第104期,627至633頁,以熱量测量 中的無細胞上清液。 驗經過44至50小時後停止。在48小時之後産 以克/升表示摘錄於表7中。 的cysE對偶基因轉變來生産JM15菌株所得的 酸産率 半胱按酸産率[g/L】[48小時 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 cysS對偶基因 ?ACYC184/cysHIV pACYC134/cysEY -1 • 3 pACYC18 4/cys EVI i ,4 pACYC184/cysEX 3 4 pACYC184/cysSXI 3 4 pACYCl8 4/cys EX工工 1 2 pACYC18 4/cys 3XIV 2 3 p ACYC18 4 / cy s EXV 3 0 pACYCl8 4/ cy s EXV工 2 2 pACYC18 4/cys SXX工工工 2 · ,7 pACYCl34/cysEDe!2 5 5 3 · ,9 41 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210/ 297公釐) 554043 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明(40 ) 實施例7 : 使用棒狀桿菌生産L-半胱胺酸或L-半胱胺酸衍生産物 具有回饋阻抗的cysE對偶基因,包括cysE IV、cysE X、cys XI和cysE XIV (參'閲例1的表2)等,用限制酶素 BaniHl和EcoRl (取自波林格孟漢)將各自對應的質粒裂開出 來,以及各自1.15 kb大小的DNA片段都透過一種聚半乳糖 膠予以純化和分離,各自的DNAH段都用大腸捍SIDNA結合 酶1(取自波林格孟漢)的克林諾片段做成鈍端。載體ptfSTl 以限制酶素Saal(取自波林格孟漢)加以限制並使用T4 DNA 連結酶將其連結於成為鈍端的DNA片段。該載髏pWSTI是一 種大腸桿菌/棒狀捍薗穿梭傳媒體,它並且既可在大腸桿 菌中複製,又可在棒狀桿菌中複製。此載髏的棒狀桿菌複 製品乃源自棒狀桿菌麩胺醛胺菌株ATTC 1 92 2 3。傳媒體 pWSTI的製備在美國專利US-A-4965197號案中已有說明。 該連結混合物被用以轉變缺少半胱胺酸的突變體JM15。此 類互補的質粒被命名為 P W S T 1 - c y s E IV , p W S T 1 - c y s E X , pliST卜cysEXl和pWSTl-cysEXIV以符合它們所介人的cysE 對偶基因。 該pWSTl-cysE質粒被用以轉變棒狀捍菌麩胺醯胺ATCC 21851菌株。該轉變乃使用一種由利泊爾及同仁在1989年 發表於FEMS微生物通訊第65, 299至304頁中所說明的電氣 合成法實施的。該重組繁殖體以它們對坎那徽素的编碼質 粒阻抗為基準於含有25毫克/升康徽素的半乳糖皿中選取 的。 -42 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 554043 ⑴ 一般資料 (i )申請人: (A) 名稱:電化:t業聯合公司 (B) 地址:德國慕尼黑市斯勒史達持街二十號 (C) 城市:慕尼黑 (D )聯邦州:巴伐利亞 (E )國家:德國 (F) 郵遞區號:81379 (G) 電話·· 089/748440 (H) 傳真·· 089/74844350 (i)電傳:5215553 cons d
(ii )發明名稱··製備0 -乙醒絲胺酸、L -半胱胺酸及L 半胱胺酸相關産品的方法 (ώ )序列數目:2 5 (iv )電腦可讀形式: (A)媒體形式:軟磁碟 (B )電腦:I B Μ相容個人電腦
(C) 蓮作条統:PC-DOS/ MS-DOS (D) 軟髏:Patentln RElease #1·0,
Version ttl.30(EPA) 554043 ⑵ 序列識別號碼:1的資料 (i )序列特徵: (A)長度:42對基元 (B )型式:核苷酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀' (ii)分子型式:雜式的核酸 (A )説明:/ d e s c = ”低核苷酸 (m )序列表示:序列識別號碼:1 :
GCTTCGGCGT
GCCTGGATCC TGCAGTCGAC CTGGCGCATC ⑵ 序列識別號碼:2的資料 (i )序列特徵: (A )長度·· 4 1對基元 (B )型式:核苷酸 (C)股數:單股 (D )形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核苷酸 (νϋ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-revl (X i )序列表示··序列識別號碼:2 :
GTAGGAGCTC TGCAGAATTC GGGTATCCGG GAGCGGTATT 554043 (2) 序列識別號碼:3的資料 (i )序列特激: (A)長度:18對基元 (B )型式:核苷酸 (C)股數:單股 (D )形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核苷酸 (vii )瞬間來源: (A) 圖書館:合成的 (B) 繁殖體:cysE-Mut-1 (X i )序列表示:序列識別號碼:3 :
GCCGCTAGCG TTCCGGCT ⑵ 序列識別號碼:4的資料 (i )序列特激: (A )長度:1 8對基元 (B )型式:核苷酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A )説明:/ d e s c = ”低核苷酸 (νΰ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β )繁殖體:c y s Ε - M ii t - 2 (x i )序列表示:序列識別號碼:4 :
CGTCGTTGAT GAACGGCG 554043 ⑵ 序列識別號碼:5的資料 (i )序列特徽: (A)長度:21對基元 (B )型式··核苷酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A)説明:/desc = ”低核苷酸 (νΰ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖髏:cysE-Mut-3 (X i )序列表示:序列識別號碼:5 :
CCGCCGCATA CCACCGCCGT T ⑵ 序列識別號碼:6的資料 (i )序列特徵: (A)長度:24對基元 (B )型式:核苔酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A)說明:/desc = ”低核苷酸 (νϋ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-Mut-6 (X i )序列表示:序列識別號碼:6 :
CC ATCAATGG ATATAGACCA GCAT 554043 ⑵ 序列識別號碼:7的資料 (i )序列特徽: (A)長度:24對基元 (B )型式:核苷酸 (C )股數:單股 (D)形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A)説明:/desc = ”低核苷酸” (νΰ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-Mut-10 (X i )序列表示:序列識別號碼:7 :
GTCGTTGGTG AAGCGGCGGT GATT ⑵ 序列識別號碼:8的資料 (i )序列恃徵: (A)長度:38對基元 (B )型式:核苷酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核¥酸” (νϋ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-LHfwl (X i )序列表示:序列識別號碼:8 :
CGGCGTTG
TGGACCAGAG CTCTGGCTGG CGCATCGCTT 554043 ⑵ 序列識別號碼:9的資料 (i )序列待徽: (A)長度:26對基元 (B )型式:核苷酸 (C)股數:單股 (D )形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A )説明:/ d e s c = ”低核苷酸” (νϋ )瞬間來源: (A) 圖書館:合成的 (B) 繁殖體·· cysE-Del 270 (X i )序列表示:序列識別號碼:9 :
AATACC
CTCGATGCAT TACGTATTAC CCATACTCA A ATCTATGGTT ⑵ 序列識別號碼:1 0的資料 (i )序列特徵: (A)長度:46對基元 (B )型式:核苷酸 (C)股數:單股 (D )形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核苷酸” (νϋ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-De 1 268 (X i )序列表示:序列識別號碼:1 0 :
CTCGATGCAT TACGTATTAC TCAAATGTAT GGTTAATACC GTTGAA 554043 ⑵ 序列識別號碼:1 1的資料 (i )序列特徽: (A) 長度:46對基元 (B) 型式:核苷酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀 (U)分子型式:雜式的核酸 (A)說明·· /desc = ”低核¥酸” (νϋ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-De 1 263 (X i )序列表示:序列識別號碼:11 :
CATATC
CTCGATGCAT TACGTATAAA ATACCGTTGA AATGCTGGTC ⑵ 序列識別號碼:1 2的資料 (i )序列待徵: (A)長度:46對基元 (B )型式:核苷酸 (C )股數:單股 (D)形狀:線條狀 U)分子型式:雜式的核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核苷酸” (νϋ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-De1 259 (X i )序列表示:序列識別號碼:1 2 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA TGCTGGTCCA TATCCATTGA TGGCTT 554043 ⑵ 序列識別號碼:1 3的資料 (i )序列特激: (A)長度:46對基元 (Εί)型式:核苷酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀 U)分子型式:雜式均核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核苷酸” (νΰ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-De 1 258 (X i )序列表示:序列識別號碼:1 3 :
CTTATC
CTCGATGCAT TACGTATTAC TGGTCCATAT CCATTGATGG ⑵ 序列識別號碼:1 4的資料 (i )序列特徵: (A)長度:47對基元 (B )型式:核苷酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀 (11)分子型式:雜式的核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核苷酸” (vfi )瞬間來源: (A) 圖書館:合成的 (B) 繁殖髏:cySE-De 1 2 5 7 . (x i )序列表示:序列識別號碼·· 1 4 :
CTCGATGCAT TACGTATTAG TCCATATCCA TTGATGGCTT ATCGCTG 554043 ⑵ 序列識別號碼:1 5的資料 (i )序列特徵 (A)長度 46對基元 (B)型式 核苷酸 (C)股數 單股 (D)形狀 線條狀 (ii )分子型式 :雜式的核酸 (A)說明 :/desc = ”低核苔酸” (νΰ )瞬間來源 (A )圖書館:合成的 (B)繁殖體:cysE-Del 256 (X i )序列表示:序列識別號碼:1 5 :
CTCGATGCAT TACGTATTAC ATATCCATTG ATGGCTTATC GCTGTC ⑵ 序列識別號碼 :1 6的資料 (i )序列特徵 : (A)長度 46對基元 (B)型式 核苷酸 (C)股數 單股 (D)形狀 線條狀 (ii )分子型式 :雜式的核酸 (A)説明 :/ d e s c = ”低核苷酸” (νΰ )瞬間來源 (A) 圖書館:合成的 (B) 繁殖體:cysE-De1 255 (X i )序列表示:序列識別號碼:1 6 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA TCCATTGATG GCTTATCGCT GTCTGG 554043 ⑵ 序列識別號碼:1 7的資料 (i )序列特徽 : (A)長度: 46對基元 (B )型式: 核苷酸 (C)股數: 單股 (D)形狀: 線條狀 (ii )分子型式 :雜式的核酸 (A)說明 ·· / d e s c = ”低核苷酸” (νΰ )瞬間來源 (A) 圖書館:合成的 (B) 繁殖體:cysE-De 1 250 (X i )序列表示:序列識別號碼:1 7 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA TCGCTGTCTG GTTTACCGAC AATACG ⑵ 序列識別號碼 :1 8的資料 (i )序列特徽 : (A)長度: 46對基元 (B)型式: 核苷酸 (C)股數: 單股 (D)形狀: 線條狀 (ii )分子型式 :雜式的核酸 (A)說明 :/ d e s c = ” 低核 ¥ 酸” (νϋ )瞬間來源: (A) 圖書館:合成的 (B) 繁殖體:cysE-De 1 249 (X i )序列表示:序列識別號碼:1 8 : %
CTCGATGCAT TACGTATTAG CTGTCTGGTT TACCGACAAT ACGAGC 554043 ⑵ 序列識別號碼:1 9的資料 (i )序列待徽: (A)長度:46對基元 (B )型式:核苷酸 (C) 股數:單股 (D) 形狀:線條狀 U)分子型式:雜式@核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核苷酸” (vii )瞬間來源: (A) 鼠書館:合成的 (B) 繁殖體:cysE-De 1 248 (X i )序列表示:序列識別號碼:1 9 :
AGCCGG
CTCGATGCAT TACGTATTAG TCTGGTTTAC CGAC AATACG ⑵ 序列識別號碼:2 0的資料 (i )序列特徴: (A)長度:46對基元 (B )型式:核苷酸 (C)股數:單股 (D )形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核®酸” (νΰ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-De 1 245 (X i )序列表示:序列識別號碼:2 0 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA CCGACAATAC GAGCCGGAAC GCCAGC 554043 ⑵ 序列識別號碼:2 1的資料 (i )序列特徽 * (A)長度: 46對基元 (B)型式: 核苷酸 (C )股數: 單股 (D)形狀: 線條狀 (ii )分子型式 :雜式的核酸 (A)說明 ·· / d e s c = ”低核苷酸” (vii )瞬間來源: (A )圖書館··合成的 (B)繁殖體:cysE-De 1 239 (X i )序列表示:序列識別號碼:2 1 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA ACGCCAGCGG CGGTGGTATC CGGCGG ⑵ 序列識別號碼 :2 2的資料 (i )序列持徵 : (A)長度: 46對基元 (B )型式: 核¥酸 (C)股數: 單股 (D )形狀: 線條狀 (ii )分子型式 :雜式的核酸 (A )說明 :/ d e s c = ”低核苷酸” (νϋ )瞬間來源: (A) 圖書館:合成的 (B) 繁殖體:cysE-De 1 227 (X i )序列表示:序列識別號碼:2 2 :
CTCGATGCAT TACGTATTAC AGCACCACGG AACCTGCGCC AATCTT 554043 ⑵ 序列識別號碼:2 3的資料 (i )序列特徽: (A)長度:46對基元 (B )型式:核苷酸 (C)股數:單股 (D )形狀:線條狀 (ii)分子型式:雜式的核酸 (A)說明:/desc = ”低核苷酸 (νώ )瞬間來源: (Α)圖書館:合成的 (Β)繁殖體:cysE-LHrevl (X i )序列表示:序列識別號碼:2 3 :
CGGTATTG
CTCGATGCAT TACGTAGGGG TATCCGGGAG ⑵ 序列識別號碼:2 4的資料 (i )序列特徵: (A)長度:27 3値胺基酸 (B )型式:胺基酸 (C) 股數: (D) 形狀:線條狀 (ii)分子型式:蛋白質 (A) 說明:/desc = ”低核苷酸 (vi )原始來源: (A )有機髏:大腸桿菌 (B) 菌株:W3110 (X i )序列表示:序列識別號碼:2 4 : -13 - 554043
Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu lie 1 5 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu 20 Ala Tiir Leu Leu Lys His Glu Asn 35 ' 40 Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro 50 55 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala 65 70 Ala Ala Cys Asp lie Gin Ala Val 35 Lys Tyr Ser Tiir Pro Lau Leu Tyr 100 Ala Tyr Arg lie Glv His Trp Leu 115 120 Ala lie Phe Leu Gin Asn Gin Val 130 135 His Pro Ala Ala Lys lis Gly Arg 145 150 Glv lie Val Val Gly Glu Thr Ala 165
Val Trp Asn Asn 工le Lys Ala Glu 10 15
Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr Kis 25 30
Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 45 工le Met Pro Ala 工le Ala lie Arg 60
Ala Asp Pro Glu Met lie Ala Ser 75 30
Arg Ίίι: Arg Asp ?rc Ala Val Asp 90 95 L^u Lys Gly Phe His Ala Leu Gin 105 110
Trp Asn Gin Gl:/ A:g Arg Ala Leu 125
Ser Val Tiir Pile Gin Val Asp ne 140
Gly lie Met Leu Asp His Ala Thr ΙΞ5 ISO
Val lie Glu Asn Asp Val Ser lie 170 175· 14 554043
Leu Gin Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 19〇
His Pro Lys 工le Arg Glu Gly Val Met lie Gly Ala Gly Ala Lys lie 195 200 205
Leu Gly Asn lie Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys lie Gly Ala Gly Ser 210 215 220
Val Val Leu Gin Pro Val Pro Pro His Tiir Tiir Ala Ala Gly Val Pro-225 230 235 240
Ala Arg lie Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met 245 250 255
Asp Gin His Phe Asia Gly lie Asn His Tiir Phe Glu Tyr Gly Asp Gly 260 265 270
He ⑵ 序列識別號碼·· 2 5的資料 (i )序列待擻: (A) 長度:1135對基元 (B) 型式:核苷酸 (C )股數··雙股 (D)形狀:線條狀 (ii)分子型式:基因組的脱氧核糖核酸 (A )說明:/ d e s c = ”低核苷酸” (vi )原始來源: (A) 有機髏:大腸桿菌 (B) 菌株:W3110 (νϋ )瞬間來源: (Β)繁殖體:PPC43 (X i )序列表示:序列識別號碼:2 5 : -15 -
TCCGCGAACT GGCGCATCGC TTCGGCGTTG AAATGCCAAT AACCGAGGAA ATTTATCAAG
CGTGCACGCA ACCCGGCCCG TGAAGAACTG TGAGCCAATG TGCACTGAGC CCGTGAAGTG TGATATTCAG ATACCTGAAG TATTCACCCG CGTTGGTGAA CGGTACGGGT CGCGGGCGCG
TATTATATTG CGGAAAAAAC GCGCGCGAGG CAGCATTGAC TTTACTAGGT AGOACGAGCG CAGCAGCCAC TAACGCCAGG GAACCTTTGT TACCGCTATG CGCAGAACGG GCCGGTCATT ATCTCATCGT GTGGAGTAAG CAATGTCGTG GAAATTGTCT GGAACAATAT TAAAGCCGAA GCCAGAACGC TGGCGGACTG CTGGCCAGTT TTTACCACGC GACGCTACTC AAGCACGAAA ACCTTGGCAG TACATGCTGG CGAACAAGCT GTCATCGCCA ATTATGCCTG CTATTGCTAT GTGGAAGAAG CCTACGCCGC TGACCCGGAA ATGATCGCCT CTGCGGCCTG GCGCTGCGTA CCCGCGACCC GGCAGTCGAT AAATACTCAA CCCCGTTGTT GGTTTTCATG CCTTGCAGGC CTATCGCATC GGTCACTGGT TGTGGAATCA GC\CTGGCAA TCTTTCTGCA AAACCAGGTT TCTGTGACGT TCCAGGTCGA GCAGCAAAAA TTGGTCGCGG TATCATGCTT GACCACGCGA C\GGCATCGT ACGGCGGTGA TTGAAAACGA C3TATCGATT CTGCAATCTG TGACGCTTGG AAATCTGGTG GTGACCGTCA CCCGAAAATT CGTGAAGGTG TGATGATTGG -16 -
Claims (1)
- 554043 绶濟部智慧財產局員工消費合作社印制A A8 BS CS D8 六、申請專利範圍 Ala lie ?he 'Leu Gin Asn Gin Val Ser Vai Thr Phe Gin Val Asp lie 130 135 140 His Pro Ala Ala Lys lie Gly Arg Gly lie Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 Gly lie Val Val Gly Glu Thr Ala Val lie Glu Asn Asp Val Ser lie 165 170 175 Leu Gin Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 130 185 190 His Pro Lys lie Arg Glu Gly Val Met lie Gly Ala Gly Ala Lys lie 195 200 205 Leu Gly Asn lie Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys lie Gly Ala Gly Ser 210 215 220 Val Val Leu Gin Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 Ala Arg lie Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met 245 250 255 Asp Gin His phe Asn Gly lie Asn His Thr Pile Glu Tyr Gly Asp Gly 260 265 270 lie 中之起始甲硫胺酸,但於序位256曱硫胺酸突變 成異亮胺酸除外,其中絲氨酸乙醯轉移酶具有一 抑制常數Ki,在ImM L -絲氨酸及〇 . 1 mM乙醯 辅酶A存在之情況下,為〇·〇2至2.3 πιΜ。 _____ - 45 - _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂---------線一 554043 AS B8 C3 D8 六、申請專利範圍 2 . 一種重組體絲氨酸乙醯轉移酶,該轉移酶所展現對抑 制L-半胱氨酸之敏感度,比野生型酶低,而且與野生型序 列比,其蛋白質序列展現至少一突變或缺失, 其中突變係在胺基酸之序列97-100,164-169, 237 , 239-240 , 245-255 , 25-259 及 267_269,缺失係在胺基酸之羧基末端序列範圍 237-240 , 245-255 , 257-259 及 267-269 , 序位1為 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu 工le.Val Trp Asn Asri lie Lys A1三 Glu 1 5 10 15 Ala Αχ-g Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 Ala Th.2: Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro lie Met Pro Ala lie Ala lie Arg 50 55 60 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met 工le Ala Ser 65 70 75 80 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Ala Ala Cys Asp lie Gin Ala* Val Arg Thr* Airg Asp Pro Ala Val Asp S5 90 95 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Lau Lys Gly Phe Kis Ala Leu Gin 100 105 110 Ala* Tyr Arg lie Gly His Trp Heu Trp Asn Gin Gly Arg A:rg Ala* Leu 115 120 125 -46 - 本紙張尺度適用辛國國家標準(CNS)A4規格(210 x 297公釐) 554043 AS BScs DS 申請專利範圍 Ala lie Phe Lau Gin Asn Gin V"al 130 135 Val Tlir· Phe Gin Val Asp lie 140 145 Ala Ala Lvs lie Gly Aire Gly He Met Leu Asp Hi.s Ala Thr 150 155 1^0 Gly lie Vail Val Gly Glu Till: Ala V三 1 Ils 165 · 170 Val Ser lie 175 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Leu Gin Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 130 185 190 His Pro Lys 工le Arg Glu Gly Val Met lie Gly Ala Gly Ala Lys lie 195 200 205 Leu Gly Asn lie Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys lie Gly Ala Gly Ser 210 215 220 Val Val Leu Gin Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 Ala Arg lie Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met 245 250 255 Asp Gin His Phe Asn Gly lie Asn His Tiir Phe Glu Tyr Gly Asp Gly 260 265 270 He 之起始甲硫胺酸。 3· 一種重組體DNA序列,該序列編碼申請專利範圍第1 項之絲氨酸乙醯轉移酶。 4· 一種重組體DNA序列,該序列編碼申請專利範圍第2 項之絲氨酸乙醯轉移酶。 47 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再 i 本頁 訂---------線- |--- j k, Ϊ :丨 1 '八j 公告本 申請曰期 灯、ί〇、4 案 號 85113019 類 別 (以上各攔由本局填註) A4 C4 554043 新I. 專利説明書 中文 發明 新型 名稱 製備α乙醢絲胺酸、l-半胱胺酸及L·半胱胺酸相關產品 的方法 英 文 Process for preparing O-acetylserine, L-cysteine and L一cysteine-related product! 姓 名 國 籍 發明 創作 人 住、居所 瓦勒符萊德•藍恩菲德爾博士 彼特·漢瑞希博士德國 德國德國慕尼黑市包頓西奈德路五號 德國陶德頓外施-山德市卡排倫路十一號 裝 訂 姓 名 (名稱) 德商•電化工業聯合公司 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 申請人 國 籍 住、居所 (事務所) 代表人 姓 名 德國 德國慕尼黑市斯勒史達特街二十號 符藍克•谬勒博士 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐)554043 五、發明説明(18) (讀背面之注意事項再填寫本頁) 的轉移酶是經由移轉引介入特殊的菌株之中。將大腸稈菌 中的天然基因加以非活性化的討論文獻有很多(细菌學期 刊1989年第171期、4617至4622頁,作者漢米爾敦及同仁 ;细菌學期刊1989年第171期,2609至2613頁,作者羅索 耳及同仁;遺傳學1986年第112期,441至457頁,作者沉 與黃;细菌學期刊1984年第159期,783至786頁,作者師 默耳及潔生)。 將一個編碼一變更的絲胺酸乙醯轉移酶的基因的合販 整合於宿主基因體內也是受歡迎的。 敘述這類技術和參考都可Μ自下述的出版物中找到: 细菌學期刊1988年第170期.3294至3296頁,作者帥維爾 及同仁;细菌學期刊1991年第173期,2633至2638頁,作 者庫拉寇斯卡及同仁。 最好不同Ki值的cysE的對偁基因被繁殖至一種低販數 的載體,並且轉變成合逋的菌株產品。 圖式簡單說明: 圖1顯示一種自高絲胺酸開始到產生L-甲磙胺酸的生 物合成逢程; 圖2顧示一種自麩胺酸開始到產生麩胱甘肽的生物合 成過程; 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖3顯示一種自脫硫生物素開始到產生生物素的生物 合成過程ί 圖4顯示一種自葡萄糖開始到產生大腸桿菌中的L-半 胱胺酸的生物合成過程; 圖5顯示大腸稈菌中絲胺酸乙醒[轉移酶的胺基酸序列; -20 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) 554043五、發明說明(η 27325)等的S30抽取液(將細胞勻漿在4〇c# 3〇〇〇〇克離心 力處理20分鐘)。仍然發現許多反突變體含有的絲胺酸乙 醢轉移酶的活性在各種不同濃度的抑制劑L_半胱胺酸一 起反應的時候,展現出相當嚴重的殘餘活性(Ki值介於5 至50公尺之間)。 為了要藉由定量測量半胱胺酸以測試在一種液體培養 基中分泌半胱胺酸的能力,將5〇個選定的cysE反突變體 放入20毫升的標準生產培養基在3〇〇c的溫度下培養,以 每分鐘170轉的轉速持續48小時。該標準生產培養基含有 15 g/L的葡萄糖、〇·〇8 g/L細菌联蛋白,0 04 g/L酵母抽 取物,5 mg/L 維他命 Bl,3 g/L ΚΗ2Ρ04,12 g/L K2hP04, 0·3 g/L MgS04 x 7 H20,〇·ΐ g/L NaC卜 5 g/L (NH4) 2S04, 14·7 mg/L CaCl2 x 2 H20,2 mg/L FeS04 x 2 H20,lg/L Na3 Citrat x 2 H20,5 g/L Na2S203 x 5 H20 及 1 ml/L 的痕量 元素溶液(參考前文)。每一種菌株例中經過24小時及48 小時後各取出10毫升試樣並加以稀釋。用熱量測定的方式 來測定該無細胞的上清液中半胱胺酸的濃度。使用蓋通德 在生物化學期刊1967年第104期627至633頁所提出的 方法。這些突變艘分泌半胱胺陵的程度自5至60 mg/L的 半胱胺酸在培養基的上清液内。另一方面作為一種比較, 在大腸桿菌的野生型菌株中,是不可能偵測到半胱胺酸的 分泌,在此次篩選中,有8個反突變體的半胱胺酸分泌是 介於40至60 mg/1之間的被選擇出來。 為了要精確地分析這8個突變體的絲胺酸乙醢轉移酶 23 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I MM ΜΗ I ΙΒΜ MM MM I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 554043 ;修正| 犧I ir補充丨 年月 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明(22) 終端產品抗阻基因的本性。將這8個突變體的半胱胺睃結 構基因作本體繁殖,然後測定這些基因的DNA次序。 由於cysE的野生型基因所有的DNA次序,以及在大 腸桿菌中半胱胺酸側翼區域的染色體限制圖都已被揭示 (微生物總論期刊1987年第133期,515至525頁,作者 鄧克與博克),因而得知cysE結構的基因是位於一種 2.25kb大小的pvuIIDNA片段上。 為了將cysE作本體繁殖再編碼成半胱胺酸不敏感性 的絲胺酸乙醯轉移酶,把選出的反突變體的染色體DNA 完全切割於ρνιιΠ之中,該DNA水解物放在預製的聚半乳 糖膠上分級分離,並將大小範圍為2-3kb的分離出來。分 離開的ρνιιΠ水解物用T4 DNA連結酶將其連結於線條化 的Smal和被脫磷酸的鹼性磷酸酶質粒載體puci9(可自 波林格曼漢公司取得)。 缺少半胱胺酸營養的cysE菌株JM15(CGS#5042)以相 對應的連結混合液予以移轉,並且在無半胱胺酸但含有氨 苄菁黴素(50 mg/丨)的最低營養培養液中進行揀選。這些被 選出的質粒(參考圖7),它們同時也和宿主菌株的缺少半胱 胺酸互補,在其限制形狀中,展現出一種為cysE基因所被 要求的裂開形狀(微生物學總論1987年第133期,515至 525 ’作者鄧克與博克)。這些被選出的形質轉換菌同時也 在交饋實驗中產生健壯成長的標示菌株JM35(光輪>4公 厘),測量這些cysE突變體的細胞抽取液中絲胺酸乙醢轉移 的活性展現出一種對L-半胱胺酸敏感性的降低,這些抽取 -J------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2455404? 气 **%/** b·** 一ΐ A7 B7 五、發明說明(41 發酵作用以類似於例6所描述的條件下實施,除了用 濃度為50毫克/升的坎那黴素作為選用的抗生素以取代四 環素。 從這個發酵作用中發現帶有cysEXl對偶基因在質粒 上的菌株獲得最高的半胱胺酸產率。 使用棒狀桿菌半胱胺酸產率[g/l】[48h】如次: cysEIV cysEX cysEXl cysEXIV 0.9 2.1 2.5 1.5 Ί,------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 43 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(21〇 X 297公釐)
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