PL186403B1 - Acetylotransferaza serynowa, sekwencja DNA, mikroorganizmy - Google Patents
Acetylotransferaza serynowa, sekwencja DNA, mikroorganizmyInfo
- Publication number
- PL186403B1 PL186403B1 PL96327187A PL32718796A PL186403B1 PL 186403 B1 PL186403 B1 PL 186403B1 PL 96327187 A PL96327187 A PL 96327187A PL 32718796 A PL32718796 A PL 32718796A PL 186403 B1 PL186403 B1 PL 186403B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cyse
- cysteine
- mutation
- sequence
- amino acid
- Prior art date
Links
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 154
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 108091022908 Serine O-acetyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims abstract description 44
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 13
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 claims description 70
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 65
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 62
- 101100498063 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cysB gene Proteins 0.000 claims description 53
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 28
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 20
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 18
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N O-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 101150029709 cysM gene Proteins 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 5
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 4
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L thiosulfate(2-) Chemical compound [O-]S([S-])(=O)=O DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710170569 Cysteine synthase B Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 101000865057 Thermococcus litoralis DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- -1 β-alanyl Chemical group 0.000 description 3
- ZNAIHAPCDVUWRX-DUCUPYJCSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;4-amino-n-(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)benzenesulfonamide;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-t Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1.C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O ZNAIHAPCDVUWRX-DUCUPYJCSA-N 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 2
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 2
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 101150058227 cysB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150094831 cysK gene Proteins 0.000 description 2
- 101150112941 cysK1 gene Proteins 0.000 description 2
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 2
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100533230 Caenorhabditis elegans ser-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 101710170530 Cysteine synthase A Proteins 0.000 description 1
- 101710109085 Cysteine synthase, chloroplastic/chromoplastic Proteins 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N L-cysteine sulfonic acid Natural products OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710138316 O-acetylserine sulfhydrylase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- NOKPBJYHPHHWAN-REOHCLBHSA-N S-sulfo-L-cysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSS(O)(=O)=O NOKPBJYHPHHWAN-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 101150052442 cysD gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019264 food flavour enhancer Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 239000008266 hair spray Substances 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 210000003284 horn Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003464 sulfur compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000004764 thiosulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
1. Acetylotransferaza serynowa, która w po- równaniu do enzymu typu dzikiego wykazuje zredukowana wrazliwosc na inhibitor L-cysteine i której sekwencja bialkowa wykazuje w porów- naniu z sekwencja typu dzikiego co najmniej jedna mutacje lub delecje, znam ienna tym, ze mutacja znajduje sie w obszarze sekwencji od aminokwa- su w pozycji 97 do aminokwasu w pozycji 227 wlacznie, albo delecja lezy w C-koncowym ob- szarze sekwencji rozpoczynajacym sie od amino- kwasu w pozycji 227, przy czym pozycja 1 jest startowa metionina z fig. 5 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1) i w której wykluczona jest muta- cja Met na Ile w pozycji 256. Fig: 5 1 MSCEELEIVW NNIKAEARTL ADCEPMLASF YHATLLKHEN LGSALSYHLA 5 1 NRLSSPIMPA IAIRETWEEA YAADPEHIAS AACDIQAVRT RDPAVDKYST 1 0 1 PLLYLKGFHA LQAYRIGHWL WNQGRRALAI FLQNQVSVTF QVDIHPAAKI 1 5 1 GRGIMLDHAT G IW G E TA V I ENDVSILQSV TLGGTGKSGG DRHPKIREGV 2 0 1 KIGAGAKILG NIEVGRGAKI GAGSW LQPV PPHTTAAGVP ARIVGKPDSD 2 5 1 KPSMDMDQHF NGINHTFEYG DGI PL PL PL
Description
Przedmiotami wynalazku są acetylotranssferaza serynowa, sekwencja DNA i mikroorganizmy.
L-cysteinę i jej pochodne stosuje się w farmacji (do leczenia chorób oskrzeli), kosmetyce (jako składnik szamponów do włosów i lakierów do włosów) i przemyśle spożywczym (jako przeciwutleniacz, wzmacniacz smaku i jako dodatek przy obróbce ciasta). L-cysteina była dotychczas uzyskiwana przez ekstrakcję z materiałów zawierających keratynę, takich jak: włosy, szczecina, rogi, kopyta i pierze lub przez enzymatyczne przemiany prekursorów. Nadprodukcja L-cysteiny przez mikroorganizmy jest bardzo pożądana, ponieważ L-cysteina jest nie tylko związkiem interesującym przemysł, ale także dlatego, że jak to wynika z fig. 1-3, stanowi ona ważny związek pośredni w syntezie glutationu, metioniny i biotyny.
L-cysteina zajmuje kluczową pozycję w metabolizmie siarki u wszystkich organizmów i jest stosowana w syntezie białek, glutationu, biotyny, metioniny i innych, zawierających siarkę metabolitów. Ponadto L-cysteina służy jako prekursor w biosyntezie koenzymu A, poza tym L-cysteina może zostać łatwo utleniona do cystyny. Między biosyntezą L-cysteiny i innych aminokwasów jak L-seryna, glicyna i L-metionina istnieje ścisły związek. Synteza L-cysteiny (fig. 4) została wnikliwie zbadana u prokariotów, szczególnie u bakterii (Kredich, N. M. i G. M. Tomkins 1966, J.Biol.Chem. 241: 4955 - 4965; Kredich, N. M., 1987, Biosynteza cysteiny, w: Neidhardt F. C., Ingraham, J.L., Magasanik, B., Low. K. B., Schaester, M., Umberger, H. E. (wyd.) Escherichia coli i Salmonella typhimurium: biologia komórki i molekularna, Vol. 1. American society for Microbiology, Washington D.C., 419-428). Kluczowa
186 403 reakcja polega na przeniesieniu grupy acetylowej na serynę dając O-acetyloserynę 1), następnie wymianie grupy acetylowej na grupę SH, dzięki czemu jest syntetyzowana L-cysteina 2).
1) L-seryna + acetylokoenzym A -> O-acetyloseryna + koenzym A
2) O-acetyloseryna + H2S -> L-cysteina + octan
U mikroorgmńzmów i roślin O-acetyloseryna, zastępuje serynę służąc jako bezpośredni prekursor szkieletu węglowego dla L-cysteiny (Kreidich, N.M; i G.M. Tomkns 1966, J.Biol. Chem. 241: 4955 - 4965). Reakcja przeniesienia grupy acetylowej w celu utworzenia aktywowanej formy L-seryny jest katalizowana przez acetylotransferazę serynową(EC 2.3.1.30) kodowaną przez gen cysE i podlega ścisłej kontroli przez produkt końcowy L-cysteinę. Gen acetylotransferazy serynowej został już sklonowany i jest znana wynikająca z sekwencji DNA sekwencja aminokwasowa (Denk, D. i Bock, A. 1987, J. Gen. Microbiol. 133: 515 - 525).
Samo tworzenie L-cysteiny jest katalizowane przez dwa izoenzymy sulfhydrylazy Oacetyloserynowej (EC 4.2.99.8) kodowane przez geny: cysK (O-acetyloseryno-sulfhydrylaza
A) i cysM (O-acetyloseryno-sulfhydrylaza B) w reakcji, w której O-acetyloseryna spełnia funkcję donora β-alanylu a H2S akceptora β-alanylu (Kredich, N. M. i G. M. Tomkins 1966,
J. Biol. Chem. 241: 4955 - 4965), przy czym główny udział w syntezie cysteiny ma O-acetyloseryno-sulfhydrylaza A. Dodatkowo O-acetyloseryno-sulfhydrylaza B (cysM) jest zdolna do wykorzystywania tiosiarczanu jako źródła siarki (Sirko, A. i wsp. , 1987, J. Gen. Microbiol. 133: 2719-2725). O-acetyloseryno-sulfhydrylaza B katalizuje reakcję między O-acetyloseryną i tiosiarczanem dając S-sulfocysteinę, która może być następnie konwertowana do cysteiny (Nakamura, T., i wsp, 1983, J. Bacteriol. 156,656-662).
Hamowanie przez produkt końcowy formy typu dzikiego acetylotransferazy serynowej przez L-cysteinę jest znaczącym fizjologicznie czynnikiem w kinetycznej regulacji biosyntezy cysteiny (Kredich, N. M. 1971, J. Biol. Chem. 246, 3474 - 3484; Kredich, N. M. i G. M. Tomkins 1966, J. Biol. Chem. 241: 4955 - 4965). Aktywność formy typu dzikiego acetylotransferazy serynowej jest hamowana przez cysteinę. Została zbadana kinetyka tego hamowania, które okazało się mieć charakter kompetycyjny. Oznaczona została stała hamowania Ki = 1,1 x 1 06Mw obecności 0,1 mM acetylokoenzymu A i 1 mM L-seryny ( Kredich, N. M. i G. M. Tomkins 1966, J. Biol. Chem. 241: 4955 - 4965).
Z literatury wiadomo, że poprzez chemiczną mutagenezę przy użyciu estru etylowego kwasu matanosulfonowego ze szczepów auksotroficznych względem cysteiny mogą zostać wyizolowane prototroficzne względem cysteiny rewertanty, których aktywność acetylotransferazy serynowej z powodu zamiany aminokwasów w obszarze kodującym wykazuje słabe hamowanie przez produkt końcowy (Denk, D. i Bock, A. 1987, J. Gen. Microbiol. 133: 515 - 525). Oporność na sprzężenie zwrotne tych mutantów jest zgodnie z wymienioną pozycją literaturową 10-krotnie podwyższona. Ki tych mutantów wynosi zatem około 0,01 mM w przeciwieństwie do formy typu dzikiego.
Wynalazek dotyczy acetylotransferazy serynowej, która w porównaniu z enzymem typu dzikiego wykazuje zredukowaną wrażliwość na inhibitor iL-cysteinę i której sekwencja białkowa wykazuje w porównaniu z sekwencją typu dzikiego co najmniej jedną mutację lub delecję, charakteryzującej się tym, że mutacja znajduje się w obszarze sekwencji od aminokwasu w pozycji 97 do aminokwasu w pozycji 227 włącznie, albo delecja leży w C-końcowym obszarze sekwencji rozpoczynającym się od aminokwasu w pozycji 227, przy czym pozycją 1 jest startowa metionina z fig. 5 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1) i w której w sekwencji białkowej jest wykluczona mutacja Met na Ile w pozycji 256.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że zgodne z wynalazkiem zamiany aminokwasów i/lub delecje aminokwasów na C-końcu acetylotransferazy serynowej prowadzą do obniżenia wrażliwości na cysteinę przy jednoczesnym utrzymaniu wystarczającej aktywności enzymatycznej.
Acetylotransferaza serynowa według wynalazku posiada korzystnie stalą hamowania Ki od 0,005 do 2,3 mM w obecności 1 mM L-seryny i 0,1 mM acetylo-CoA, przy czym acetylo transferaza serynowa z co najmniej jedną mutacją wykazują korzystnie stałą hamowania Ki 0,005 do 2,3 mM w obecności 1 mM L-seryny i 0,1 mM acetylo-CoA, podczas gdy acet
186 403 transferaza serynowa z co najmniej jedną C-końcową delecją wykazuje korzystnie stałą hamowania Ki od 0,005 do 0,03 mM w obecności 1 mM L-seryny i 0,1 mM acetylo-CoA.
Stałe hamowania (Ki) odnośnie L-cysteiny szczególnie pożądanych mutan^iów enzymatycznych leżą między 0,02 i 2,3 mM w obecności 1 mM L-seryny i 0,1 mM acetylo-CoA.
Acetylotransferaza serynowa według wynalazku, wykazuje aktywność wystarczającą dla wzrostu zawierających ją mikroorganizmów.
Szczególnie kocystnie sekwencja białkowa acetylotransferazy serynowej według wynalazku obejmuje zmiany aminokwasowe co najmniej jednego z cys E mutantów wymienionych w tab. la albo lb.
Tabela la
Oporne na sprzężenie zwrotne allelele cysE z pojedynczymi lub kilkoma zmianami aminokwasowymi w obszarze kodującym
| Mutanty cysE | Zmiana nukleotydów (Nr) | Zmiana aminokwasów (Nr) | Ki (uM) | Alk. właść . pmol/min x mg |
| cysEII | GGC->AGC (934) | Gly238->Ser238 | 10 | 0,068 |
| cysEIII | GGT->GAT (716) | Gly165->Aspl65 | 10 | 0,030 |
| cysEIV | GCT->GTT (932) GGC->AGC (934) | Ala237->Val237 Gly238->Ser238 | 40 | 0,170 |
| cysEV | GCT->GTT (932) GGC->AGC (934) ATG->ATA (990) | Ala237->Val237 Gly238->Ser238 Met256->Ile256 | 10 | 0,246 |
| cysEVI | GGC->AGC (934) ATG->ATA (990) | Gly238->Ser238 Met256->Ile256 | 10 | 0,075 |
| cysEVII | GCT->GTT (932) | Ala237->Val237 | 10 | 0,253 |
| cysEVIII | ATG->ATA (990) GCT->GTT (932) | Met256->Ile256 Ala237->Val237 | 30 | 0,160 |
| cysEX | ACG->GCG (721) | Thrl67->Alal67 | 50 | 0,156 |
| cysEXI | ACG->GCG (721) GGT->AGT (955) | Thr167->Ala167 Gly245->Ser245 | 700 | 0,117 |
| cysEKII | AAA->CAA (511) GGC->AGC (934) TTT->TTG (1023) | Lys97->Gln97 Gly238->Ser238 Phe267->Leu267 | 40 | 0,254 |
| cysEXIII | GTT->GCT (713) TTT->TTG (1023) | Vall64->Alal64 Phe267->Leu267 | 30 | 0,213 |
| cysEXIV | ACG->GCG (721) ATG->TAG (988+989) | Thr167->Alal67 Met256->Stop251 | >1000 | 0,453 |
| cysEXVI | GAT->GGT (971) AAG->TAG (973) | Asp250->Gly250 Lys251->Stop251 | 50 | 0,554 |
| cysEXVII | GGT->GAT (716) ACG->GCG (721) | Glyl65->Aspl65 Thr167->Alal67 | 100 | 0,052 |
| cysEXXIII | ACG->GCG GCT->GTT GGC->AGC | Thr167->Alal67 Ala237->Val237 Gly238->Ser238 | 2300 | 0,085 |
186 403
Tabela lb:
Oporne na sprzężenie zwrotne cysE-allele z delecjami.
| cysE-mutant | Usunięte aminokwasy | Ostatni aminokwas | Ki (pM) | Akt. właść. [pmol/min x mg |
| cysE-Del259 | 14 | His259 | 7,5 | 0,328 |
| cysE-Del258 | 15 | Gln258 | 5 | 0,256 |
| cysE-Del257 | 16 | Asp257 | 7,5 | 0,394 |
| cysE-Del256 | 17 | Met256 | 12,5 | 0,366 |
| cysE-Del255 | 18 | Asp255 | 30 | 0,624 |
| cysE-Del250 | 23 | Asp250 | 20 | 0,405 |
| cysE-Del249 | 24 | Ser249 | 15 | 0,420 |
| cysE-De1248 | 25 | Asp248 | 12,5 | 0,270 |
Niewrażliwą na cysteinę acetylotransferazę serynową według wynalazku można przykładowo otrzymać poprzez ekspresję sekwencji DNA, która koduje acetylotransferazę serynową według wynalazku.
Kodowane przez te sekwencje DNA warianty enzymów wykazują za każdym razem różną wrażliwość na inhibitor L-cysteinę, przy czym we wszystkich przypadkach obserwowano co najmniej pięciokrotnie wyższą w porównaniu z typem dzikim oporność acetylotransferazy serynowej na inhibitor L-cysteinę.
Wynalazek dotyczy także sekwencji DNA, która koduje acetylotransferazę serynową która w porównaniu z enzymem typu dzikiego wykazuje zredukowaną wrażliwość na inhibitor L-cysteinę i charakteryzuje się tym, że wykazuje co najmniej jedną mutację od pary zasad 510 do pary zasad 1040, przy czym parą zasad 1 jest pierwsza zasada z fig. 6 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2) i wykluczona jest mutacja guaniny na adeninę w pozycji 990.
Sekwencja DNA według wynalazku będzie też dalej określana jako odporna na sprzężenie zwrotne cysE-allele.
Tę sekwencję DNA można otrzymać przykładowo metodami niespecyficznej lub ukierunkowanej mutagenezy z opisanych dalej materiałów wyjściowych.
Mutacje niespecyficzne w obrębie wspomnianych regionów DNA można uzyskać czynnikami chemicznymi (np. nitrozoguanidyną kwasem etylometanosulfonowym i.in.) i/lub metodami fizycznymi (Miller, J. H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, USA: 113-185) i/lub przez przeprowadzaną w określonych warunkach reakcję PCR (Gibbs, R. A. 1990, Anal. Chem. 1202-1214).
Metody wprowadzania mutacji w specyficznych pozycjach w obrębie fragmentów DNA są znane i opisane przykładowo w następujących publikacjach: Sarkar, G., Sommer, S. S., 1990, BioTechniques 8: 404-407, opisującej ukierunkowaną mutagenezę za pomocą PCR; Ausubel, F. M. i wsp., 1987, S. 8.01-8.3.6 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, opisującej metodę ukierunkowanej mutagenezy za pomocą fagów M13.
Dalsze sposoby otrzymywania odpornych na sprzężenie zwrotne alleli cysE obejmują rózne kombinacje, prowadzące do odporności na sprzężenie zwrotne mutacji punktowych w mutantach wielokrotnych o nowych właściwościach.
Jako materiał wyjściowy dla mutagenezy służy korzystnie DNA genów cysE typu dzikiego lub inaktywowany przez mutację gen cysE lub zmutowany i kodujący już odporną na sprzężenie zwrotne acetylotransferazę serynową gen cysE.
Poddawany mutacji gen cysE może być kodowany chromosomalnie lub pozachromosomalnie.
Wyjściowy fragment DNA, przykładowo obejmujący gen cysE typu dzikiego, został zrekombinowany z wektorem znanymi standartowymi technikami otrzymywania rekombinowanego DNA. Dzięki zastosowaniu poprzednio wymienionych metod mutagenezy zmieniono jeden lub więcej nukleotydów w sekwencji DNA w taki sposób, że kodowana przez gen sekwencja aminokwasowa wykazywała co najmniej jedną mutację w obszarze sekwencji od aminokwasu w pozycji 97 do aminokwasu w pozycji 227 włącznie, lub co najmniej jedną
186 403 delecję obecną w C-końcowym obszarze sekwencji rozpoczynającym się od aminokwasu w pozycji 227, przy czym pozycją 1 jest metionina startowa z fig. 5 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1) i w której mutacja Met na Ile w pozycji 256 jest wykluczona.
Opisane techniki pozwalają wprowadzić w dowolnym genie cysE jedną lub więcej mutacji we wspomnianym obszarze DNA, które sprawiają, że kodowana acetylotransferaza serynowa posiada sekwencję aminokwasowąprowadzącą do niewrażliwości na cysteinę.
W połączeniu z opisaną przykładowo mutagenezą stosuje się selekcję mutantów z pożądanym fenotypem przykładowo przez posiew na płytki z nie zawierającym cysteiny podłożem, a następnie określa się stopień wrażliwości na cysteinę zmutowanej acetylótransferazy serynowej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku są mikroorganizmy, które posiadają co najmniej jedną sekwencję DNA kodującą acetylotransferazę serynową regulującą metabolizm cysteiny, wykazującą w porównaniu z enzymem typu dzikiego zredukowaną wrażliwość na inhibitor L-cysteinę i wykazującą co najmniej jedną mutację od pary zasad 510 do pary zasad 1040, przy czym para zasad 1 jest pierwsza zasada z fig. 6 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2) i wykluczona jest mutacja guaniny na adeninę w pozycji 990.
Takie szczepy mikroorganizmów charakteryzują się tym, że posiadają co najmniej jedną sekwencję DNA według zastrz. 1 albo zastrz. 4 regulującą ich metabolizm cysteiny.
Ponieważ u wszystkich mikroorganizmów metabolizm cysteiny przebiega właściwie tą samą, znaną ścieżką przemiany materii, a techniki zastosowane do otrzymywania szczepów według wynalazku, np. znane ogólnie ze standartowych podręczników, nadają się do stosowania w odniesieniu do wszystkich mikroorganizmów, szczepy według wynalazku powstały z dowolnie wybranych mikroorganizmów.
Korzystnie nadaj ącymi się do otrzymywania szczepów według wynalazku są bakterie.
Szczególnie korzystnie nadają się bakterie gram-ujemne, jeszcze korzystniej E.coli.
Odporne na sprzężenie zwrotne allele cysE umożliwiają zniesienie kontroli ważnego punktu regulacji ścieżki biosyntezy, dzięki czemu ulega wzmocnieniu produkcja licznych związków leżących za tym punktem. Zaliczają się do nich przede wszystkim O-acetyloseryna, L-cysteina i produkty spokrewnione z L-cysteiną. Spokrewnionymi z L-cysteiną produktami są wszystkie produkty pochodzące od L-cysteiny, tj. związki zawierające siarkę, do których otrzymania wymagana jest L-cysteina. Przykładami takich produktów są kwas 2(R,S)-metylotiazolidyno-2(R,S),4(R)-dwukarboksylowy, homocysteina, metionina, biotyna i glutation.
Odporne na sprzężenie zwrotne allele cysE zostały za pomocą znanych sposobów poddane transformacji w szczepach żywicieli w celu uzyskania ekspresji zmienionego enzymu acetylótransferazy serynowej. Wyselekcjonowanie szczepów z acetylotransferazą serynową o zmienionych właściwościach uzyskano przykładowo przy pomocy opisanych dalej metod.
W celu określenia poziomu niewrażliwości na cysteinę zmienionych enzymów mierzono wydzielanie cysteiny przez szczepy za pomocą pseudoilościowego testu hodowli krzyżowych. W tym celu wywoływano wzrost indukowanego szczepu auksohoficznego względem cysteiny, który posiewano wraz z testowanym szczepem na podłożu minimalnym. Każdorazowo strefa wzrostu szczepu indukowanego wokół linii posiewu (halo) służyła jako pseudoilościowa miara wydzielania cysteiny. Wszystkie szczepy, które wywoływały w teście posiewów krzyżowych halo o promieniu > 2 mm, były uznawane jako „pozytywne w teście posiewów krzyżowych”. Testowano aktywność zmienionych acetylotransferazy serynowej z wyselekcjonowanych szczepów w celu określenia stopnia tolerancji na cysteinę.
Do określenia wrażliwości acetylotransferazy serynowej na cysteinę może zostać użyta każda metoda, która pozwala określić aktywność tego enzymu w obecności cysteiny. Przykładowo oznaczenie aktywności acetylótransferazy serynowej może zostać przeprowadzone metodą opisaną przez Kredich, N. M. i G. M. Tomkins 1966, J. Biol . Chem. 241: 4955 - 4965. Podczas tego testu mieszanina testująca enzym zawiera substrat L-serynę i kofaktor acetylokoenzym A. Reakcję rozpoczyna się przez dodanie enzymu i obserwuje przez pomiar spadku absorpcji przy 232 nm, który jest wywoływany przez rozkład wiązania tioestrowego w acetylokoenzymie A.
186 403
Opisany test enzymatyczny nadaje się do oznaczania wrażliwości na cysteinę każdego enzymu acetylotransferazy serynowej, łącznie z enzymami modyfikowanymi na C-końcu. Hamowanie aktywności acetylotransferazy serynowej testowano w obecności różnych stężeń L-cysteiny. Katalityczna aktywność różnych enzymów acetylotransferazy serynowej została oznaczona w obecności i nieobecności L-cysteiny i ustalano z tych pomiarów stałą hamowania Ki (Kredich, N. M. i G. M. Tomkins 1966, J. Biol. Chem. 241: 4955 - 4965).
W większości przypadków korzystnie enzymatycznie aktywna acetylotransferaza serynowa posiadała obniżoną wrażliwość na cysteinę. W innych zamierzeniach może być pożądane jednoczesne zmniejszenie wrażliwości na produkt końcowy i aktywności katalitycznej.
W zasadzie silna nadekspresja opornej na produkt końcowy acetylotransferazy serynowej nie jest pożądana, ponieważ tworzące się przy tym w zbytnim nadmiarze O-acetyloseryna, L-cysteina lub pochodzące od nich metabolity gromadzą się w komórkach, ulegają toksyfikacji i mogą wywołać selekcję mutantów ze zredukowaną aktywnością acetylotrasferazy serynowej. Dlatego odporne na sprzężenie zwrotne allele cysE korzystnie wbudowano znanymi sposobami do genomu jako pojedyncze kopie.
Metody wbudowywania pojedynczych genów do chromosomu za pomocą odpowiednich wektorów należą do stanu techniki (np. Winans i wsp., 1985; J. Bacteriol. 161: 1219 - 1221; Shevell i wsp., 1988; J. Bacteriol. 170: 3294 - 3296; Kulakauskas i wsp. 1991, J. Bacteriol. 173:2633-2638).
Równie korzystne jest wyrażanie genów acetylotransferazy serynowej opornych na sprzężenie zwrotne za pomocą plazmidów o niskiej ilości kopii.
Jak wiadomo wektor ekspresyjny obok odpornych na sprzężenie zwrotne alleli cysE posiada korzystnie jeszcze inne, opisane elementy.
Znajdujące się na wektorze sekwencje kodujące są korzystnie połączone z elementami regulatorowymi, które są potrzebne do uzyskania pożądanego poziomu ekspresji sekwencji kodujących.
Przykładami tych elementów regulatorowych są promotory, miejsca przyłączania rybosomów i sekwencje terminacji. W większości przypadków w ekspresji mutantów według wynalazku stosuje się natywne, regulatorowe sekwencje cysE. Mogą być jednak zastosowane też inne dowolne sekwencje regulatorowe.
Obok elementów regulatorowych korzystnie wektor ekspresyjny zawiera także sekwencje, które kodują markery selekcyjne i/lub geny reporterowe. Ekspresja takich markerów selekcyjnych ułatwia identyfikację transformantów. Genami nadającymi się do spełniania roli markerów selekcyjnych są geny kodujące oporność na np.: ampicylinę, tetracyklinę, kanamycynę, chloramfenikol lub inne antybiotyki.
Aby mutanty według wynalazku mogły podlegać pozachromosomalnej replikacji, wektory plazmidowe powinny korzystnie zawierać miejsce inicjacji replikacji. Strategie służące integracji genów z chromosomem za pomocą wektorów, które nie posiadają miejsca inicjacji replikacji, należą do stanu techniki (Winans i wsp., 1985; J. Bacteriol. 161: 1219 - 1221; Shevell i wsp., 1988; J. Bacteriol. 170: 3294 - 3296; Kulakauskas i wsp. 1991, J. Bacterio. 173: 2633 -2638).
Przykłady wektorów zdolnych do samodzielnej replikacji u E.coli podaje Pouwels, P.H., Enger-Valk, B.E., Brammer, WJ. 1985, Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam.
Takimi wektorami są przykładowo:
- plazmidy o wysokiej liczbie kopii jak np.: pBR322, pUC18
- plazmidy o średniej do niskiej liczbie kopii jak np.: pACYC184, pACYC177 i pSC101
- wektory fagowe jak np.: wektory M13.
Korzystnie polecane są wektory o średniej do niskiej liczbie kopii; szczególnie korzystne są wektory z replikonem pl5A, takie jak pACYC184 (ATCC37033) lub pACYC177 (ATCC37031).
Duża ilość wektorów dla innych bakterii opisana jest w literaturze (Pouwels, P.H., Enger-Valk, B.E., Brammer, W. J. 1985, Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam). Przy pomocy tych wektorów możliwa jest ekspresja mutantów według wynalazku w innych bakteriach.
186 403
Odpowiednie wektory rekombinowane można uzyskać przy pomocy standardowych technik otrzymywania rekombinowanego DNA. Techniki te są w sposób wystarczający przedstawione w standartowych podręcznikach.
Odpowiedni szczep gospodarza poddano transformacji wektorem ekspresyjnym, który zawierał jednostki transkrypcyjne kodujące niewrażliwą na cysteinę acetylotransferazę serynową.
Jako szczepy gospodarzy użyto szczepów, które zawierały wrażliwe na cysteinę białka, jak np. prokarioty lub drożdże.
Korzystnie stosuje się dzikie szczepy E.coli lub szczepy, u których endogenny gen cysE jest nieaktywny i ulega komplementacji przez gen cysE według wynalazku. Tego rodzaju systemy komórkowe nadają się do nadprodukcji L-cysteiny i pochodzących od niej metabolitów.
Podczas hodowli fermentacyjnej szczepów, które posiadały co najmniej jeden odporny na sprzężenie zwrotne allel cysE, okazało się, że szczepy wykazujące wartość Ki między 0,015 i 2,3 mM w obecności 1 mM L-seryny i 0,1 mM acetylo-CoA wydzielały znacząco większą ilość cysteiny.
Acetylotransferazę se^nową według wynalazku można również otrzymać stosując antysensowne RNA. Stosując należącą do stanu techniki, tak zwaną genetykę odwrotną można przy pomocy a^^^^^^<^'wnego RNA blokować lub modyfikować określoną aktywność genową (Inouye, 1988, Gene 72: 25-34). Antysensowne RNA jest produktem transkrypcji takiej nici DNA, która jest komplementarna do nici kodującej białko. Jest możliwe, zredukowanie in vivo wrażliwości na cysteinę acetylotransferazy serynowej, poprzez produkcję przy pomocy wektorów ekspresyjnych antysensownego RNA, który jest kompetytywny do określonego obszaru 3'-kodującej nici natywnego lub transformowanego genu cysE. Antysensowne RNA przyłącza się przy tym specyficznie do docelowej sekwencji cysE-mRNA powodując syntezę acetylotransferazy serynowej według wynalazku, która posiada skrócony C-koniec i analogicznie do mutantów delecyjnych z przykładu 3 wykazują obniżoną wrażliwość na inhibitor L-cysteinę.
Dodatkowym zadaniem było przedstawienie źródła siarki nadającego się do optymalnej produkcji cysteiny za pomocą mikroorganizmów według wynalazku.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że wewnątrzkomórkowa nadprodukcja O-acetyloseryny, wyzwalana przez zastosowanie mutantów acetylotransferazy serynowej według wynalazku w połączeniu z odpowiednią pożywką, prowadzi do wyraźnego wzrostu pozakomórkowego stężenia cysteiny. W związku z tym mutanty acetylotrasferazy serynowej według wynalazku nadają się do osiągania nadprodukcji cysteiny.
Aby to osiągnąć mikroorganizmy według wynalazku muszą otrzymać w pożywce produkcyjnej wystarczającą ilość donorów siarki.
Odpowiednimi donorami siarki w nadprodukcji cysteiny są wszystkie nieorganiczne związki siarki. Korzystne są siarczany, siarczyny, siarczki, ditioniany i tiosiarczany. Szczególnie korzystny w optymalnej produkcji cysteiny jest tiosiarczan.
Dalszy wzrost wydajności cysteiny może być osiągany przez dodatkową nadekspresję enzymów redukujących siarczany (kodowanych przez geny cysD, C, H, G, I, J) i enzymów sulfhydrylujących (kodowanych przez geny cysK i cysM).
Dalszy wzrost wydajności cysteiny jest możliwy:
a) przez kontrolę białka regulatorowego cysB na poziomie genowym rozumianym jako ekspresja konstytutywna. Białko cysB funkcjonuje jako nadrzędne białko regulatorowe w biosyntezie cysteiny u E. coli ( Kredich, N.M., 1987, Biosynteza cysteiny. W: Neihhardt F.C., Ingraham, J.L., Magasanik, B., Low. K.B., Schaechter, M., Umbarger, H. E. (wyd.) Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Vol. 1. American society for Microbiology, Washington D.C., 419 - 428).
b) przez kombinację genów ser-A, wybranych z grupy serA typu dzikiego i genów serA kodujących dehydrogenazę fosfoglicerolu o obniżonej wrażliwości z genami cysE według wynalazku.
c) przez podawanie nadmiaru seryny w pożywce.
186 403
Korzystnie inaktywowano natywny gen wrażliwej na cysteinę acetylótransferazy seryiowej, dzięki czemu jedynej możliwej syntezy dokonano stosując wprowadzoną przez-transformację niewrażliwą na cysteinę acetylotransferazę serynową. Istnieje wiele publikacji podających techniki inaktywacji natywnych genów u E.coli (Hamilton i wsp., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622; Russel i wsp., 1989, J. Bacteriol. 171: 2609 -2613; Shen i Huang, 1986, Genetics 112: 441 - 457; Jasin i Schimmel, 1984, J. Bacteriol. 159: 783 - 786).
Ponadto korzystne jest wbudowanie do genomu gospodarza pojedynczej kopii dowolnego genu, który koduje zmienioną seryno-acetylotransferazę .
Opisy i odsyłacze dotyczące tych technik znajdują się w następujących publikacjach: Shevell i wsp., 1988, J. Bacteriol. 170: 3294 - 3296; Kulakauskas i wsp., 1991, J. Bacteriol. 173:2633 -2638.
Korzystnie klonowano allele cysE z różnymi Ki w wektor o niskiej liczbie kopii i tranformowano nim odpowiedni szczep produkcyjny.
Figura 1 przedstawia biosyntezę L-metioniny, gdy związkiem wyjściowym jest homoseryna.
Figura 2 przedstawia biosyntezę glutationu, gdy związkiem wyjściowym jest glutaminian.
Figura 3 przedstawia biosyntezę biotyny, gdy związkiem wyjściowym jest detiobiotyna.
Figura. 4 przedstawia biosyntezę L-cysteiny u E.coli, gdy związkiem wyjściowym jest glukoza.
Figura 5 przedstawia sekwencję aminokwasową acetylótransferazy serynowej z E.coli.
Figura 6 przedstawia sekwencję DNA genu cysE z E.coli i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową acetylótransferazy serynowej.
Figura 7 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pP1 z przykładu 1 posiadającego oporny na sprzężenie zwrotne allel cysE, wklonowany do pUC19 jako 2,25 kb fragment PVuII.
Figura 8 przedstawia plazmid pPC43 z przykładu 2 obejmujący gen cysE typu dzikiego jako fragment EcoRI/BamHI wielkości 1,15 kb w pBluescript.
Figura 9 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pACYC184-LH z przykładu 3 posiadającego oporny na sprzężenie zwrotne allel cysE z delecją na C-końcu, i z przykładu 4 posiadającego oporny na sprzężenie zwrotne allel cysE z różnymi wymianami zasad.
Poniższe przykłady służą dalszemu objaśnieniu wynalazku.
Przykład 1
Izolacja mutantów E.coli z niewrażliwym na cysteinę enzymem acetylótransferazy' serynowej
Poprzez rewersję auksotroficznych szczepów E.coli możliwe jest uzyskanie mutantów regulacyjnych. Mutanty o pożądanych właściwościach (niewrażliwość na cysteinę acetylotransferazy serynowej) zostały znalezione wśród rewertantów szczepów auksotroficznych cysteinozależnych szczepów cysE-E.coli.
Do izolacji rewertantów zostały użyte szczepy cysteinozależnych auksotrofów E.coli JM 15(CGSC # 5042: cvsE50. tfr-8). oraz JM39 (CGSC # 5043: cvsE51. trf-8), złożone w Deutschen Samlung ftir Mikroorganismen in Braunschweig pod numerami dMS 10173. W celu uzyskania prototroficznych względem cysteiny rewertantów traktowano te szczepy mutagenem: nitrozoguanidyną zgodnie z Miller, J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Press: 125-125, Cold Spring Harbor Laboratory. Rewertanty prototroficzne ze względu na cysteinę izolowano w podłożu minimalnym nie posiadającym cysteiny. Około 1000 otrzymanych rewertantów następnie testowano na wydzielanie cysteiny w eksperymencie hodowli krzyżowych. W tym celu wysiewano testowane rewertanty na podłoże minimalne bez cysteiny (12 g/l K2HPO,„ 3 g/I KH2PO4, 5 g/l (NH^SO^ 0,3 g/l MgSO4 x 7 H20, 1 g/l Na^ytrynian x 2 H20, 0,1 g/l NaCl, 15 g/l Bacto-Agar, 1 ml/L roztworu pierwiastków śladowych, składającego się z 0,15 g/l Na2MoO4 x 2 H2O, 2,5 g/l H3B03, 0,7 g/l uzupełniano 1% glukozą i zaszczepiono 5x106 komórek cysteinozależnych auksotrofów szczepu JM39 /ml, i inkubowano przez 48 godzin w 37°C. Promień strefy wzrostu wokół koloni testowych (halo) przyjęto jako miarę wydzielania cysteiny przez testowane szczepy.
186 403
Wszystkie rewertanty, które wykazywały strefę wzrostu większą niż 2 mm, uznawano za pozytywne i po kilku etapach oczyszczania izolowano i konserwowano.
W celu zbadania biochemicznych podstaw wydzielania cysteiny przez rewertanty określano aktywność in vitro acetylotransferazy serynowej, oraz mierzono jej hamowanie przez cysyteinę. Do oznaczeń użyto ekstrakty S30 (rozbijane komórki odwirowywane przez 20 minut przy 30000 g w 4°C) wybranych rewertantów, szczepów wyjściowych oraz szczepu porównawczego E.coli W3110 (ATTC 27325). Znaleziono grupę rewertantów, których aktywność acetylotraasferazowy serynowej w obecności różnych stężeń inhibitora L-cysteiny wykazywała znaczną resztkową aktywność (wartość Ki między 5 i 50 pM).
Aby okr^^lić zdolność do wydzielania cysteiny w płynnej pożywce inkubowano 50 wybranych rewertantów cysE w 20 ml podłoża standartowego przez 48 godzin przy 30°C i 170 Upm. Podłoże standartowe składało się z 15 g/l glukozy, 0,08 g/l Bactotrypton-u, 0,04 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 mg/l witaminy B1, 3 g/l KH2PO4, 12 g/l KJHO4, 0,3 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0,1 g/l NaCl, 5 g/l (NH4)2SO4, 14,7 mg/l CaC^ x 2 H20, 2 mg/l FeSO4 x 2 H2O, 1 g/l Na^ cytrynian x 2 H2O, 5 g/l Na.2S2O3 x 5 H2O, 1 ml/l roztworu pieiwijsstków śladowych (patrz wyżej). Po 24 i 48 godzinach pobierano każdorazowo próby (10 ml), zagęszczano, i pozakomórkowy nadmiar stężenia cysteiny określano kalorymetrycznie wg. Gaitonde,M.K. (1967), Biochem. J. 104: 627-633. Stopień wydzielania cysteiny przez te mutanty oscylował od 5 do 60 mg/l cysteiny w płynie hodowlanym. Dla porównania u szczepów dzikich E.coli nie stwierdzono żadnego wydzielania cysteiny. Tą metodą izolacji wybrano 8 rewertantów, u których wydzielanie cysteiny wynosiło od 40 do 60 mg/l.
W celu dokładnej analizy genetycznych podstaw odporności na produkt końcowy acetylotransfera:zy serynowej tych 8 mutaitów sklonowano geny strukturalne cysE i określono ich sekwencje.
Ponieważ sekwencja DNA dzikiego genu cysE oraz mapa restrykcyjna regionów flankujących gen cysE z E.coli są znane (Denk i Bock, 1987, J.Gen.Microbiol. 133:515-525), wiadomo, że gen strukturalny cysE leży na fragmencie PvuII-DNA o wielkości 2,25 kb.
W celu sklonowania genu cysE kodującego niewrażliwą na cysteinę acetylotransferazę serynową, DNA chromosomalne wyselekcjonowanych rewertantów hydrolizowano zupełnie Pvu II, hydrolizat DNA rozdzielano preparatyce na żelu agarozowym i izolowano fragmenty o wielkości należącej do przedziału 2-3 kb. Wyizolowany hydrolizat PvuII ligowano przy pomocy DNA ligazy T4 ze zlinearyzowanym Smal i defosforylowanym fosfatazą alkaliczną wektorem plazmidowym pUC 19 (pochodzącym z firmy Boehringer Mannheim).
Auksotroficzny względem cysteiny szczep JM 15 (CGSC#5042) transformowano każdorazowo mieszaniną ligacyjną i poddawano selekcji na nieposiadającym cysteiny, zawierającym ampicylinę (50 mg/I) podłożu minimalnym. Wyselekcjonowane i komplementujące auksotrofię względem cysteiny szczepów gospodarza, plazmidy wykazywały w układzie fragmentów ^^^Itr/l^iccyjn^ych układ restrykcyjny odpowiadający genowi cysE (Denk i Bock, 1987,
J. Gen. Microbiol. 133:515-525). Także w teście hodowli krzyżowych wyselekcjonowane transformanty powodowały intensywny wzrost indukowanego szczepu JM35 (halo > 4 mm). Próby aktywności acetylotransferazy serynowej ekstraktów komórkowych z tych mutantów cysE, które były otrzymywane przez 20 minutowe odwirowywanie przy 30 000 g w temperaturze 4°C, dawały wyniki w postaci zredukowanej wrażliwości na L-cysteinę. W celu dokładnej identyfikacji zmian w genie strukturalnym pojedynczych alleli cysE* prowadzących do niewrażliwości na produkt końcowy sekwencjonowano ich DNA stosując specyficzne dla genu cysE oligonukleotydy i porównywano uzyskiwane sekwencje nukleotydowe z sekwencją genu cysE typu dzikiego. Będące owocem tych porównań sekwencji nukleotydowych różnice z sekwencją DNA i aminokwasową typu dzikiego, zostały podsumowane w tabeli 2 (porównaj fig. 5 i 6).
186 403
Tabela 2
Nie wrażliwe na sprzężenie zwrotne allele cysE, powstałe w wyniku mutagenezy chemicznej
| Mutanty cysE | Zmiana nukleotydowa, (Nr) | Zmiana aminokwasowa (Nr) | Ki [pM] |
| cysEII | GGC->AGC (934) | Gly238->Ser238 | 10 |
| cysEIU | GGT->GAT (716) | Gly165->Asp165 | 10 |
| cysEVII | GCT-xGTT (932) | Ala237->Val237 | 10 |
| cysEX | ACG->GCG (721) | Thrl67->Alal67 | 50 |
| cysEXI | GGT->AGT (955) ACG->GCG (721) | Gly245->Ser245 Thr167->Alal67 | 700 |
| cysEX II | AAA->CAA (511) GGC->AGC (934) TTT->TTG (1023) | Lys97->Gln97 Gly238->Ser238 Phe267->Leu267 | 40 |
| cysEXHI | GTT->GCT (713) TTT->TTG (1023) | Vall64->Ala164 Phe267->Leu267 | 30 |
| cysEXVI | GAT->GGT (971) AAG->TAG (973) | Asp250->Gly250 Lys251->Stop251 | 50 |
Przykład 2
Otrzymywanie acetylotransferazy serynowej niewrażliwej na produkt końcowy poprzez ukierunkowaną wymianę zasad w genie strukturalnym cysE
W przykładzie 1 opisano łącznie 8 różnych alleli cysE, które z powodu wymiany zasad i wynikającej z niej zmiany aminokwasu wykazują znaczne uniewrażliwienie acetylotransferazy serynowej na inhibitor L-cysteinę. Te zmienione enzymy różnią się nie tylko pozycjami zmian aminokwasowych prowadzących do oporności, lecz także częściowo stopniem wrażliwości na inhibitor L-cysteinę. Poprzez ukierunkowaną mutagenezę zostały skonstruowane odporne na działanie produktu końcowego enzymy acetylotransferazy serynowej o nowych właściwościach, które otrzymano w wyniku wzajemnej kombinacji opisanych w przykładzie 1 zamian aminokwasowych. Potrzebne do tego mutagenezy zostały przeprowadzone zgodnie z metodami opisanymi w stanie techniki przez Kunkel i wsp. (1987), Meth.Enzymol. 154: 367-382.
Jako plazmid wyjściowy dla mutagenezy zastosowano przedstawiony na fig. 8 cysE-plazmid pPC43 (zdeponowany w DSM, Braunschweig pod numerem DSM 10171), który posiada dziki gen cysE o wielkości 1,15 kb w miejscu EcoRI-BamHI fagemidowego wektora pBluescriptll SK+ (Stratagene, Heidelberg). Ten gen cysE-WT został amplifikowany metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PGR) (Saiki i wsp. 1988, Science 239: 487-491) z genomowego DNA szczepu dzikiego E.coli W3110 (ATTC 27325). Zastosowano oligonukleotydy cysE-fwl (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3) („starter sensowny”) oraz cysE-revl (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4) („starter antysensowny”). Sekwencja nukleotydowa tego startera przedstawia się następująco:
cysE-fwl: (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3)
5,-GCCTGGATC£TGCAGTCGACCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3'
Zaznaczona wytłuszczonym drukiem część odpowiada zasadom 9-30 z sekwencji DNA cysE z fig. 6, wbudowane miejsce BamHI zostało podkreślone.
cysE-revl : (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4)
5,-GTAGGtAGCTCTGCAGAATTCGGGTATCCGGGAGCGGTATTG-3,
Zaznaczona wytłuszczonym drukiem część odpowiada zasadom 1106-1126 z sekwencji DNA cysE z fig. 6, wbudowane miejsce EcoRI zostało podkreślone.
Eksperymenty PCR zostały przeprowadzone w 30 cyklach w obecności 200 μΜ trifosforanów dezoksynukleotydów' (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), po 1 μΜ odpowiednich oligo12
186 403 nukleotydów, 100 ng W3110-DNA, buforu reakcyjnego (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCL2, 0,01% żelatyny) i 5 jednostek termostabilnej DNA-polimerazy Vent (Biolabs) w aparacie do PGR (Gene-ATAQ-Controler, Pharamacia) w następujących warunkach: 96°C, 1,5 min; 62°C, 1 min; 72°C, 3 min. Produkt amplifikacji hydrolizowano BamHI i EcoRI, oczyszczano w żelu agarozowym i klonowano jako fragmenty DNA wielkości 1,15 kb w wektor fagemidowy BluescriptII SK+, w wyniku czego powstał cysE-plazmid pPC43 (fig. 8).
Pożądane mutanty wielokrotne otrzymano następującym sposobem:
1) Otrzymywanie alleli cysE-IV: podwójny mutant Val2j7 + Sey^
Wychodząc z dzikiego plazmidu cysE, pPC43 wprowadzono poprzez ukierunkowaną, mutagenezę z zastosowaniem oligonukleotydów mutacyjnych cysE-Mut-1 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5) (tab. 3) najpierw w pozycji 238 serynę w miejsce glicyny osiągając cysE-mutant pPC34, w którym stosując oligonukleotydy mutacyjne cysE-Mut-3 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6) (tab. 3) wprowadzono zamiast alaniny w pozycji 237 walinę, w wyniku czego powstał allel cysE-IV.
2) Otrzymywanie alleli cysE-VTII: podwójny mutant Val237 + Ile256
Wychodząc z dzikiego plazmidu cysE pPC43 wprowadzono poprzez ukierunkowaną mutagenezę z zastosowaniem oligonukleotydów mutacyjnych cysE-Mut-6 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7) (tab. 3) w pozycji 256 izoleucynę w miejsce metioniny, osiągając allel cysE-I. W nim stosując oligonukleotydy mutacyjne cysE-Mut-3 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6) (tab.3) wprowadzono zamiast alaniny w pozycji 237 walinę, w wyniku czego powstał allel cysE-VIII.
3) Otrzymywanie alleli cysE-VI: podwójny mutant Ser238 + Ile256
W allelu cysE-I (mutant Ile256) został wprowadzony przy pomocy oligonukleotydów mutacyjnych cysE-Mut-1 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5) (tab. 3) w pozycji 238 serynę w miejsce glicyny, w wyniku czego powstał allel cysE-VI.
4) Otrzymywanie alleli cysE-V: potrójny mutant Val237 + Ser238 + Ile256
W allelu cysE-IV (podwójny mutant Val27 + Ser238) został wprowadzony przy pomocy oligonukleotydów mutacyjnych cysE-Mut-6 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7) (tab. 3) w pozycji 256 izoleucynę w miejsce metioniny. W wyniku tego powstał allel cysE-V.
5) Otrzymywanie alleli cys.E-VI: podwójny mutant Ala, 17 + Stop25,
Wychodząc z allelu cysE-Del255 ( przykład 3 ) został wprowadzony przy pomocy oligonukleotydów mutacyjnych cysE-Mut-10 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8) (tab. 3) w pozycji 167 alaninę w miejsce treoniny, w wyniku czego powstał allel cysE-XTV.
6) Otrzymywanie alleli cysE-XVII: podwójny mutant Asp,^ + Ala,^
Wychodząc z allelu cysE-IH (mutant Aspm, przykład 1) został wprowadzony przy pomocy oligonukleotydów mutacyjnych cysE-Mut-10 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8) (tab.
3) w pozycji 167 alaninę w miejsce treoniny. Przez to powstał allel cysE-XVII.
7) Otrzymywanie alleli cysE-XXIII: potrójny mutant AlaU)7+ ya^ + Sety^
W allelu cysE-IV (podwójny mutant Va^7 + Se^8) został wprowadzony przy pomocy oligonukleotydów mutacyjnych cysE-Mut-10 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8) (tab.3) w pozycji 167 alaninę w miejsce treoniny, przez co powstał allel cysE-XXIII.
Poprawność wprowadzonych mutacji sprawdzono przez analizę sekwencji całego genu strukturalnego każdorazowego mutanta. Przegląd cysE*-mutantów wielokrotnych znajduje się w tabeli 4.
W celu określenia parametrów biochemicznych takich jak aktywność enzymatyczna i stała hamowania Ki postępowano analogicznie do opisu w przykładzie 1.
186 403
Tabela 3
Oligonukleotydy, stosowane w mutacji kierunkowej w celu osiągnięcia nowych odpornych na sprzężenie zwrotne alleli cysE
| Oligonukleotyd mutacyjny | Sekwencja nukleotydowa | Pozycja na fig.6 | Zmiana aminokwasowa | |
| 5 | cysE-Mut-1 | 5' -GCCGCTAGCGTTCCGGCT-3 ' | 928-945 | Gly238->Ser238 |
| 6 | cysE-Mut-3 | 5'-CCGCCGCATACCACCGCCGTT-3 ' | 913-933 | Ala237->Val237 |
| 7 | cysE-Mut-6 | 5'CCATCAATGGATATAGACCAGCAT-3' | 976-999 | Met256->Ile256 |
| 8 | cysE-Mut-10 | 5'-GTCGTTGGTGAAGCGGCGGTGATT-3 ' | 709-732 | Thrl67->Alal67 |
Tabela 4
Allele cysE odporne na sprzężenie zwrotne, powstałe poprzez celową ukierunkowaną mutagenezę
| Mutanty cysE | Zmiana nukleotydów (Nr) | Zmiana aminokwasów (Nr) | Ki (HM) |
| cysEIV | GCT->GTT (932) GGC->AGC (934) | Ala237->Val237 Gly238->Ser238 | 40 |
| cys EV | GCT->GTT (932) GGC->AGC (934) ATG->ATA (990) | Ala237->Val 237 Gly238->Ser238 Met256->Ile256 | 10 |
| cysEVI | GGC->AGC (934) ATG->ATA (990) | Gly238->Ser238 Met256->Ile256 | 10 |
| cysEYIII | GCT->GTT (932) ATG->ATA (990) | Ala237->Val237 Met256->Ile256 | 30 |
| cysEXTV | ACG->GCG (721) ATG>TAG (988+989) | Thr167->Alal67 Met256->Stop256 | >1000 |
| cysEXVII | GGT->GAT (716) ACG->GCG (721) | Glyl65->Aspl65 Thr167->Ala167 | 100 |
| cysEXXIII | ACG->GCG GCT->GTT GGC->AGC | Thr167->Ala167 Ala237->Val237 Gly238->Ser238 | 2300 |
Przykład 3
Otrzymywanie acetylotransferazy serynowej niewrażliwej na produkt końcowy poprzez kontrolowane skracanie C-końca enzymu stosując PCR
Celowe zmiany pojedynczego lub kilku aminokwasów w obrębie białek należą do stanu techniki i mogą zostać przeprowadzone na poziomie DNA przy pomocy techniki PGR (Saiki i in., 1988, Science 239: 487-491) przez zastosowanie odpowiednich starterów mutacyjnych. Zeby wyrazić zmienione białka otrzymywane produkty PCR klonuje się w systemie odpowiednich plazmidów i stosując odpowiedniego gospodarza.
Przy zastosowaniu przedstawionych w tabeli 5 starterów oligonukleotydowych uzyskano na bazie genomowego DNA dzikiego szczepu E.coli W3110 (ATTC 27325) różnej długości mutanty cysE z delecjami na C-końcu, które zestawiono w tabeli 6.
Eksperymenty PGR zostały przeprowadzone w 30 cyklach w obecności 200 pM tri fosforanów dezoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , po 1 pM oligonukleotydu
186 403 „sensownego startera” cysE-LHfw1 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9) i odpowiedniego „antysensownego startera” (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10-23) (tab.5), 100 ng W3110DNA, buforu reakcyjnego (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCL2, 0,01% żelatyny) i 5 jednostek termostabilnej DNA-polimerazy Vent (firma Biolabs) w aparacie do PCR (Gene-ATAO-Controler, firma Pharamacia) w następujących warunkach: 96°C, 1,5 min; 62°C, 1 min; 72°C, 3 min.
cysE-L (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9)
5'-TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3'
Część zaznaczona wytłuszczonym drukiem odpowiada zasadom 9-30 sekwencji cysE z fig. 6, podkreślone zostało wbudowane miejsce BstXI/SacI.
Produkt amplifikacji hydrolizowano enzymami SacI i NsiI, oczyszczano w żelu agarozowym i ligowano każdorazowo te izolowane fragmenty cysE-DNA ze zlinearyzowanym przy pomocy SacI i NsiI wektorem pACYC184-LH (DMS 10172) (fig. 9). Każdorazowo produktem ligacji transformowano auksotroficzny względem cysteiny cysE-szczep JM 15 (CGSC#5042) i przeprowadzano selekcję na niezawierającym cysteiny, zawierającym tetracyklinę (20 mg/l) podłożu minimalnym.
Pochodzące z tego klonowania plazmidy zostały odpowiednio do rozmiaru delecji oznaczone jako pACYC184-LH/cysE-Del (na fig. 9 mapa plazmidu). Oznaczanie aktywności enzymatycznej i stałej hamowania Ki oraz: testy hodowli krzyżowych przeprowadzono analogicznie do przykładu 1. Poprawność wprowadzonych delecji potwierdzono analizą sekwencji DNA.
Wyniki tych badań zestawiono w tabeli 6.
186 403
Antysensowne oligonukleotydy do otrzymywania alleli cysE posiadających delecje na C- końcu
| poz. na fig.6 | 1006-1032 | 1000-1026 | 985-1011 | 973-999 | 970-996 | m (Tl cn 1 to to σι | 964-990 | 961-987 | 946-972 | 943-969 | 940-966 | 931-957 | 913-939 | 877-903 |
| sekwencja nukleotydową | 5 ’-CTCGATGCATTACGTATTACCCATACTCAA ATCTATGGTTA AT ACC-3 ’ | 5 ’-CTCGATGCATTACGTATTACTCAAATGTATGGTTAATACCGTTGAA-3 ’ | 5 ’-CTCGATGCATTACGTATTAAATACCGTTGAAATGCTGGTCCATATC-3 ’ | 5 ’-CTCGATGCATTACGTATTAATGCTGGTCCATATCCATTGATGGCTT-3 ’ | 5 ’-CTCGATGCATTACGTATTACTGGTCCATATCCATTGATGGCTTATC-3 ’ | cn 1 o U O U H ϋ O 0? O u u U u H O £ H O U < £ o 5 o u H U 1 UO | 5’-CTCGATGCATTACGTATTACATATCCATTGATGGCTTATCGCTGTC-3’ | 5 -CTCGATGCATTACGTATTAATCCATTGATGGCTTATCGCTGTCTGG-3 ’ | 5 -CTCGATGCATTACGTATTAATCGCTGTCTGGTTTACCGACAATACG-3 ’ | 1 5 -CTCGATGCATTACGTATTAGCTGTCTGGTTTACCGACAATACGAGC-3 ’ | 5 -CTCGATGCATTACGTATTAGTCTGGTTTACCGACAATACGAGCCGG-3 ’ | 1 5 ’ -CTCGATGCATTACGTATTAACCGACAATACGAGCCGGAACGCCAGC-3 ’ | 5 -CTCGATGCATTACGTATTAAACGCCAGCGGCGGTGGTATCCGGCGG-3 ’ | 5 ’-CTCGATGCATTACGTATTACAGCACCACGGAACCTGCGCCAATCTT-3 ’ |
| oligo-nukleotyd mutacyjny | cysE-Del270 | co Ό CM i—1 tU Q 1 W tn o | to CM i—1 O) Q 1 W tn S o | σι tn CM i—1 0) Q 1 ω tn >1 o | 00 tn CM i—1 <u Q I W tn u | r- tn CM i—1 (U Q 1 W tn >1 u | to tn CM i—1 (U Q 1 w tn >1 o | tn tn CM r—1 0) Q 1 w tn O | o tn CM i—I tu Q l ω tn o | <n NT CM i—t (U Q l ω tn υ | co CM r-1 (U Q 1 W cn >, o | cysE-Del245 | cysE-Del239 | > CM CM i—1 (U Ci l W tn υ |
| O t~ł | 1“1 iH | CM Γł | CO rH | sj* rH | ID i—ł | vo Γ—ł | r- H | 00 r—ł | (Ti tH | O CM | rH CM | CM CM | m CM |
186 403
Części oznaczone tłustym drukiem odpowiadają każdorazowo zasadom z sekwencji na fig. 6, podkreślono miejsce Nsil.
Tabela 6
Odporne na sprzężenie zwrotne allele-cysE, powstałe przez delecję na C-końcu
| Mutanty cysE | Liczba usuniętych aminokwasów | Ostatni aminokwas | Ki (pM) |
| cysE-Del 271 | 2 | Asp271 | 0 |
| cysE-Del 270 | 3 | Gly270 | 0 |
| cysE-Del 268 | 5 | Glu268 | 0 |
| cysE-Del 263 | 10 | Ile263 | 0 |
| cysE-Del 259 | 14 | His259 | 7,5 |
| cysE-Del 258 | 15 | Gln258 | 5 |
| cysE-Del 257 | 16 | Asp257 | 7,5 |
| cysE-Del 256 | 17 | Met256 | 12,5 |
| cysE-Del 255 | 18 | Asp255 | 30 |
| cysE-Del 250 | 23 | Asp250 | 20 |
| cysE-Del 249 | 24 | Ser249 | 15 |
| cysE-Del 248 | 25 | Asp248 | 12,5 |
| cysE-Del 245 | 28 | Gly245 | 0 |
| cysE-Del 239 | 34 | Val239 | 0 |
| cysE-Del 227 | 46 | Leu227 | 0 |
Przykład 4
Transformacja szczepów gospodarzy E.coli zmienioną acetylotransferazą serynową w celu uzyskania nadprodukcji L-cysteiny względnie pokrewnych z L-cysteiną produktów w wytrząsanych hodowlach kolbowych
W produkcji wykorzystano cechujący się niską ilością kopii wektor pACYC184-LH. W tym celu amplifikowano stosując PGR geny cysE z plazmidów z przykładów 1 i 2.
Eksperymenty PGR zostały przeprowadzone w 30 cyklach w obecności 200 pM trifosf oranów dezoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), po 1 pM oligonukleotydu „sensownego startera” cysE-LHfwl (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9) i odpowiedniego „antysensownego startera” cysE-LHrev1 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 24), każdorazowo 10 ng plazmidowego DNA, buforu reakcyjnego (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCL2, 0,01% żelatyny) i 5 jednostek termostabilnej DNA-polimerazy Vent (Biolabs) w aparacie do PCR (Gene-ATAQ-Ćontrolep Pharamacia) w następujących warunkach: 96°C, 1,5 min; 62°C, 1 min; 72°C, 3 min.
cysE-LHfwl (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9)
5,-TGGACCAGAGCTĆTGGćTGGĆGĆATĆGĆTTĆGGĆGTTG-3'
Podkreślone zasady odpowiadają wbudowanym miejscom restrykcyjnym dla BstXI i SacI, pozostałe, zaznaczone wytłuszczonym drukiem zasady odpowiadają zasadom w pozycjach 9-30 sekwencji cysE z fig. 6.
cysE-LHrevl (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 24), l-ĆTCGATGćATTAĆGTAGGGGTATĆĆGGGAGĆGGTATTG-3'
186 403
Podkreślone zasady odpowiadają wbudowanemu miejscu restrykcyjnemu dla NsiI, pozostałe, zaznaczone wytłuszczonym drukiem zasady odpowiadają zasadom w pozycjach 1106-1127 sekwencji cysE z fig. 6.
Produkt amplifikacji hydrolizowano enzymami SacI i NsiI, oczyszczano w żelu agarozowym i ligowano każdorazowo te izolowane fragmenty cysE-DNA ze zlinearyzowanym przy pomocy SacI i Nsil wektorem pACYC184-LH (DMS 10172). Każdorazowo produktem ligacji transformowano auksotroficzny względem cysteiny cysE szczep JM 15 (CGSC#5042) i przeprowadzano selekcję na niezawierającym cysteiny, zawierającym tetracyklinę (20 mg/l) podłożu minimalnym. Pochodzące z tego klonowania plazmidy z opornymi na sprzężenie zwrotne cysE zostały oznaczone jako pACYC184/cysE (fig. 9), przy czy każdy klon został opatrzony odpowiednim numerem allelu.
Oznaczanie aktywności enzymatycznej i stałej hamowania Ki oraz testy hodowli krzyżowych przeprowadzono analogicznie do opisu z przykładu 1.
Aby określić zdolność produkcyjną w podłożu płynnym zaszczepiano pojedynczymi koloniami 20 ml standartowej pożywki produkcyjnej i inkubowano przez 48 godzin przy 30°C i 170 Upm. Pożywka produkcyjna składała się z 15 g/l glukozy, 0,08 g/l Bactotryptonu, 0,04 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 mg/l witaminy BI, 3 g/l KH2P(04, 12 g/l K2HPO4, 0,3 g/l MgSC^ x 7 H20, 0,1 g/l NaCl, 5 g/l (NH4)2S04 14,7 mg/l CaCl, x 2 H2O, 2 mg/l FeSO4 x 2 H2O, 1 g/l Ną^ytrynian x 2 HZO, 5 g/l Na2S2O3 x 5 H20, 1 ml/L roztworu pierwiastków śladowych, 0,025 mg/l tetracykliny. Roztwór pierwiastków śladowych składał się z 0,15 g/l Na^MoO4 x 2 H2O, 2,5 g/l H3BO3, 0,7 g/l CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/l CUSO4 x 5 H2O, 1,6 g/l MnCl2 x 4 H2O, 0,3 g/l ZnSO4 x 7 H2O. Po 24 i 48 godzinach pobierano każdorazowo próby (10 ml), odpowiednio zagęszczano, i pozakomórkowy nadmiar stężenia cysteiny określano kalorymetrycznie wg. Gaitonde,M.K. (1967), Biochem. J. 104: 627-633. Dla szczepów produkcyjnych JM15 transformowanych różnymi mutantami cysE mierzone stężenia cysteiny wynosiły od 50 do 300 mg/l.
Przykład 5
Konstruowanie chromosomalnych, odpornych na sprzężenie zwrotne alleli cysE za pomocą rekombinowanych profagów 1 oraz produkcja L-cysteiny lub wywodzących się od L-cysteiny produktów w 1 litrowym fermentorze
W celu włączenia do chromosomu w „miejscu włączania” (attl) wklonowaio cysE-allele cysEIV, cysEX i cysEXI do plazmidu pRS551 (Simons i wsp., 1987, Gene 53: 85-96). Amplifikowano stosując PCR odpowiednie allele cysE z odpowiednich plazmidów cysE. Zastosowane oligonukleotydy cysE-fwl i cysE-revl są opisane w przykładzie 1. Amplifikacja przebiegała tak jak opisano w przykładzie 3. Otrzymane fragmenty trawiono EcoRI/BamHI, oczyszczano w żelu agarozowym i ligowano z trawionym EcoRI/BamHI wektorem pRS551. W ten sposób powstały bazujące na pRS551 rekombinowane plazmidy pRScysEIV, X i XI.
Poprzez otrzymywanie lizatów płytkowych po działaniu fagami 1RS45' na szczepy recA+ (np. YMC9, ATCC 3397) posiadające pRScysE uzyskano poprzez homologiczną rekombinację in vivo heterogenny lizat fagowy, który obok fagów 1S45 zawierał również rekombinowane, zawierające allele cysE pochodne 1RS45 (Simons i wsp., 1987, Gene 53: 85-96).
Do selekcji rekombinowanych RS45-pochodnych zastosowano cysE szczep JM 15, który infekowano heterogennym lizatem fagowym i wysiewano na płytki z podłożem LB zawierającym kanamycynę (25 mg/l). Uzyskiwane lizogenne, oporne na kanamycynę klony testowano na ich zdolność do wzrostu na płytkach z podłożem minimalnym bez cysteiny. Każdorazowo wybierano prototroficzne względem cysteiny klony i stosowano je do otrzymywania (za pomocą indukcji UV, Simons i wsp., 1987, Gene 53: 85-96) homogennych lizatów cysE-1.
Tak otrzymywanymi homogennymi lizatami cysE-1 infekowano szczep JM 15. Otrzymane w ten sposób szczepy JM15attl::cysE hodowano zgodnie z opisem z przykładu 6. Każdorazowo zamiast tetracykliny pożywka zawierała jako czynnik selekcjonujący 25 mg/l kanamycyny.
186 403
Uzyskiwane wydajności cysteiny wynosiły odpowiednio dla cysEIV 0,5, dla cysEX 1,8 oraz dla cysEXI 2,1 g/l (tab. 7).
Przykład 6
Wpływ różnych, plazmidowych alleli cysE na produkcję L-cysteiny lub pochodzących od L-cysteiny produktów w 1 litrowym fermentorze przy zastosowaniu jako gospodarza szczepu JM 15 ml pożywki LB (1% Trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl) znajdujące się w 100 ml kolbach Erlenmayera zaszczepiano każdorazowo pojedynczymi koloniami transformowanych plazmidami cysE szczepów produkcyjnych JM15 (CGSC#5042).
Po 7 godzinnej inkubacji na wytrząsarce (150 rpm, 30C) przenoszono odpowiednie hodowle wstępne do 100 ml pożywki SM1. Pożywka SM1 składała się z 5 g/l glukozy, 5 mg/I witaminy B1, 3 gl/KH2PO4, 12 g/l K2HPO4, 0,3 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0,1 g/l Na Cl, 5 g/l (NH4)2SO4, 14,7 mg/l CaCL x 2 H2O, 2 mg/l FeSO4 x 2 H20,1 g/l Nącytrynian x 2 H2O, 1 ml/L roztworu pierwiastków śladowych, 25 mg/l tetracykliny. Roztwór pierwiastków śladowych składał się z 0,15 g/l NaJMoO,, x 2 H2O, 2,5 g/l H3BO3, 0,7 g/l CoC^ x 6 H2O, 0,25 g/l CuSO4 x 5 H2O, 1,6 g/l MnCl2 x H2O oraz 0,3 g/l ZnSO4 x 7 H2O. Hodowle wytrząsano przy 30°C przez 17 h przy 150 rpm. Po tej inkubacji ODg^, wynosiło między 4 a 5. Dalsza fermentację prowadzono w fermentorze badawczym BIOSTAT M z firmy Braun-Melsungen. Użyto pojemnika hodowlanego o całkowitej pojemności 2 L.
Pożywka fermentacyjna zawierała 15 g/l glukozy, 5 g/l NaCl, 0,3 g/l MgSO4 x 7 H2O, 15 mg/l CaCl2 x 2 H2O, 75 mg/l FeSO4 x 7 H2O, 1 g/l Na^cytrynian x 2 H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 ml/L rozzworu pienwiatków śladowych (patrz wyżej), 5 mg/l witaminy BI, 2,5 g/l ekstraktu drożdżowego (Difco), 2,5 g/l Trypton (Difco) i 25 mg/l tetracykliny.
Stężenie glukozy w fermentorze od początku utrzymywano poprzez dopompowywanie 700 g/l (w/v) roztworu glukozy (sterylizowanego) na poziomie 15 g/l, a wartość pH przez dopompowywanie 25% roztworu NH4OH utrzymywana na poziomie 7,0. Po osiągnięciu wartości OD600 wynoszącej 10 było doprowadzane 300 mg na sekundę sterylnego roztworu podstawowego tiosiarczanu 100 g/l (w/v). 100 ml kultury wstępnie pompowano jako zaszczep do naczynia fermentora. Początkowa objętość wynosiła ok. 1 1. Hodowle były następnie wzruszane przy 400 rpm i nagazowywane sprężonym powietrzem sterylizowanym przez filtrowanie. Fermentację prowadzono w temperaturze 30°C.
Wartość pH utrzymywano na poziomie 7,0 dzięki automatycznej korekcie 25% NH4OH. Wysycenie tlenem w brzeczce fermentacyjnej nie powinno spaść podczas fermentacji poniżej 20%, co było kontrolowane przez prędkość mieszania. W odstępach 2 do 3 godzinnych śledzono zawartość glukozy w pożywce, gęstość optyczną i zawartość cysteiny. Oznaczanie zawartości glukozy następowało enzymatycznie przy pomocy analizatora glukozy z firmy YSI. Stężenie glukozy było utrzymywane przez ciągłe uzupełnianie między 10 a 20 g/l.
Zawartość produktu w pożywce określano kalorymetrycznie w próbkach pozakomórkowego płynu hodowlanego zgodnie z Gatoide, M.K. (1967), Biochem. J. 104, 627 - 633.
Po 44-50 h przerywano fermentację. Wyprodukowane ilości cysteiny w g/l po 48 h zostały zestawione w tabeli 7.
186 403
Tabela 7
Wydajności uzyskanej cysteiny ze szczepów produkcyjnych JM 15 transformowanych różnymi cysE-allelami (11 fermentor)
| cysE-allel | Wydajność cysteiny [g/l] [48 h] |
| pACYC184/cysEIV | 1,6 |
| pACYC 184/cysEV | 1,3 |
| pACYC184/cysEVI | 1,4 |
| pACYC184/cysEX | 3,4 |
| pACYC184/cysEXI | 3,4 |
| pACYC184/cysEXII | 1,2 |
| pACYC184/cysEXIV | 2,3 |
| pACYC184/cysEXV | 3,0 |
| pACYC184/cysEXVI | 2,2 |
| pACYC184/cysEEXXm | 2,7 |
| pACYC184/cysEDe255 | 3,9 |
Przykład 7
Wytwarzanie przez Corynebacterie L-cysteiny lub produktów pochodzących od Lcysteiny
Odporne na sprzężenie zwrotne allele cysE, cysEIV, cysEX, cysEXI i cysEXIV (tab. 2 w przykładzie 1) zostały wycięte z odpowiednich plazmidów enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI (Boehringer Mannheim) i każdorazowo fragmenty DNA wielkości 1,15 kb oczyszczano w żelu agarozowym i izolowano. Poszczególne fragmenty DNA zostały wypełnione do tępych końców przy pomocy fragmentu Klenowa DNA polimerazy I z E.coli (Boehringer Mannheim). Wektor pWST1 hydrolizowano enzymem restrykcyjnym Smal (Boehringer Mannheim) i łączono za pomocą T4 DNA-ligazy z posiadającymi tępe końce fragmentami DNA. Wektor pWST1 jest wektorem wahadłowym E.coli/Conynebacterium może ulegać replikacji zarówno w E.coli jak i w Corynebacterium. Replikon specyficzny dla Corynebacteria tego wektora pochodzi ze szczepu Corynebacterium glutamicum ATCC 19223. Otrzymywanie wektora pWSTl jest opisane w US-A-4,965,197. Produkt ligacji używano do transformacji cysteino-auksotrofowych mutantów JM15. Komplementujące plazmidy zostały nazwane odpowiednio do zawartych w nich cysE-alleli: pWSTl-cysEIV, pWSTl-cysEX, pWSTlcysEXI oraz pWSTl-cysEXTV.
Plazmidy pWST1-cysE zostały użyte do transformacji Corynebacterium glutamicum ATCC21851. Transformacja następowała poprzez szczegółowo opisaną przez Liebl, W. i wsp., 1989, FEMS Microbiol. Letters, 65, 299-304 technikę elektroporacji. Selekcja rekombinowanych klonów następowała na płytkach agarowych z 25 mg/l kanamycyny dzięki kodowanej na plazmidzie oporności na kanamycynę.
Fermentacja następowała w warunkach analogicznych do opisanych w przykładzie 6 z tym wyjątkiem, ze zamiast tetracykliny jako czynnika selekcyjnego użyto kanamycynę w stężeniu 50 mg/l. Podczas fermentacji okazało się, że szczep, który posiadał plazmidowy allel cysEXI, osiągał najwyższą wydajność cysteinową.
Claims (6)
1. Acetylotransferaza serynowa, która w porównaniu do enzymu typu dzikiego wykazuje zredukowaną wrażliwość na inhibitor L-cysteinę i której sekwencja białkowa wykazuje w porównaniu z sekwencją typu dzikiego co najmniej jedną mutację lub delecję, znamienna tym, że mutacja znajduje się w obszarze sekwencji od aminokwasu w pozycji 97 do aminokwasu w pozycji 227 włącznie, albo delecja leży w C-końcowym obszarze sekwencji rozpoczynającym się od aminokwasu w pozycji 227, przy czym pozycją 1 jest startowa metionina z fig. 5 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1) i w której wykluczona jest mutacja Met na Ile w pozycji 256.
2 . Acetylotransferaza serynowa według zastrz. 1, znamienna tym, że posiada stałą hamowania Ki od 0,005 do 2,3 mM w obecności lmM L-seryny i 0,1 mM acetylo-CoA.
3. Acetylotransferaza serynowa według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jej sekwencja białkowa obejmuje zmiany aminokwasowe co najmniej jednego z mutantów cysE wymienionych w tab. la albo lb.
4. Sekwencja DNA, która koduje acetylotransferazę serynową, która w porównaniu z enzymem typu dzikiego wykazuje zredukowaną wrażliwość na inhibitor L-cysteinę, znamienna tym, że wykazuje co najmniej jedną mutację od pary zasad 510 do pary zasad 1040, przy czym parą zasad 1 jest pierwsza zasada z fig. 6 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2) i wykluczona jest mutacja guaniny na adeninę w pozycji 990.
5. Mikroorganizmy, znamienne tym, że posiadają co najmniej jedną sekwencję DNA kodującą acetylotransferazę serynową regulującą metabolizm cysteiny, wykazującą w porównaniu z enzymem typu dzikiego zredukowaną wrażliwość na inhibitor L-cysteinę, i wykazującą co najmniej jedną mutację od pary zasad 510 do pary zasad 1040, przy czym parą zasad 1 jest pierwsza zasada z fig.
6 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2) i wykluczona jest mutacja guaniny na adeninę w pozycji 990.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19539952A DE19539952A1 (de) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
| PCT/EP1996/004613 WO1997015673A1 (de) | 1995-10-26 | 1996-10-24 | Verfahren zur herstellung von o-acetylserin, l-cystein und l-cystein-verwandten produkten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL327187A1 PL327187A1 (en) | 1998-11-23 |
| PL186403B1 true PL186403B1 (pl) | 2004-01-30 |
Family
ID=7775886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96327187A PL186403B1 (pl) | 1995-10-26 | 1996-10-24 | Acetylotransferaza serynowa, sekwencja DNA, mikroorganizmy |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6218168B1 (pl) |
| EP (1) | EP0858510B1 (pl) |
| JP (1) | JP3329825B2 (pl) |
| KR (1) | KR100275287B1 (pl) |
| CN (1) | CN1155711C (pl) |
| AT (1) | ATE211175T1 (pl) |
| BR (1) | BR9610910A (pl) |
| CA (1) | CA2235752C (pl) |
| CZ (1) | CZ294539B6 (pl) |
| DE (2) | DE19539952A1 (pl) |
| DK (1) | DK0858510T3 (pl) |
| ES (1) | ES2169269T3 (pl) |
| HU (1) | HU224097B1 (pl) |
| MX (1) | MX9803317A (pl) |
| PL (1) | PL186403B1 (pl) |
| TW (1) | TW554043B (pl) |
| WO (1) | WO1997015673A1 (pl) |
Families Citing this family (92)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19726083A1 (de) * | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
| FR2787466B1 (fr) * | 1998-12-17 | 2001-02-16 | Rhone Poulenc Agrochimie | Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
| DE19949579C1 (de) * | 1999-10-14 | 2000-11-16 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten |
| DE10136986A1 (de) * | 2000-09-03 | 2002-03-21 | Degussa | Für Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen |
| US6822085B2 (en) | 2000-09-03 | 2004-11-23 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the cysD, cysN, cysK, cysE and cysH genes |
| DE10046934A1 (de) * | 2000-09-21 | 2002-04-18 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
| DE10104722A1 (de) * | 2001-02-02 | 2002-08-14 | Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cystein, Cystin und Glutathion |
| DE10104721B4 (de) * | 2001-02-02 | 2006-02-09 | IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen |
| JP4622111B2 (ja) * | 2001-02-09 | 2011-02-02 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| DE10107002A1 (de) * | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von O-Acetyl-L-Serin |
| ES2313555T3 (es) * | 2001-07-11 | 2009-03-01 | Evonik Degussa Gmbh | Proceso para la preparacion de l-treonina que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas. |
| EP1645623B1 (en) * | 2001-09-28 | 2009-01-07 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine producing bacterium and method for producing L-cysteine |
| US7348037B2 (en) * | 2002-08-16 | 2008-03-25 | Evonik Degussa Gmbh | Sulfur-containing animal-feed additives |
| JP2006517796A (ja) | 2003-02-18 | 2006-08-03 | メタボリック エクスプローラー | 代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物の生産方法 |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| US7312058B2 (en) * | 2003-07-16 | 2007-12-25 | Ajinomoto Co., Ltd. | Mutant serine acetyltransferase |
| RU2275425C2 (ru) * | 2003-11-03 | 2006-04-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина |
| JP4479283B2 (ja) | 2004-03-04 | 2010-06-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2055771A3 (en) | 2006-03-23 | 2009-07-08 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA |
| EP2007873B1 (en) | 2006-04-18 | 2015-11-18 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE |
| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2021458A1 (en) | 2006-05-23 | 2009-02-11 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
| JP5297804B2 (ja) | 2006-07-25 | 2013-09-25 | 協和発酵バイオ株式会社 | アミノ酸の製造法 |
| RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| ES2631360T3 (es) | 2007-01-22 | 2017-08-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido |
| DE102007007333A1 (de) * | 2007-02-14 | 2008-08-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur Reinigung von L-Cystein |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2143786B1 (en) | 2007-04-06 | 2014-12-10 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Method for producing dipeptide |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| JP5476545B2 (ja) * | 2008-02-21 | 2014-04-23 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| US8383372B2 (en) * | 2008-03-06 | 2013-02-26 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| JP5332237B2 (ja) | 2008-03-06 | 2013-11-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| WO2009116566A1 (ja) | 2008-03-18 | 2009-09-24 | 協和発酵キリン株式会社 | 工業的に有用な微生物 |
| EP2330184B1 (en) | 2008-09-01 | 2020-11-25 | Shinshu University | Process for producing a useful substance in coryneform bacteria |
| BRPI0918299B1 (pt) | 2008-09-08 | 2018-08-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para produzir um l-aminoácido |
| WO2010084995A2 (en) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid |
| EP2397545B1 (en) | 2009-02-10 | 2015-07-29 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Method for producing amino acid |
| JP5521347B2 (ja) * | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2010095642A1 (ja) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | 国立大学法人信州大学 | 有用物質の製造方法 |
| JP5463528B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP5359409B2 (ja) * | 2009-03-12 | 2013-12-04 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| RU2009136544A (ru) | 2009-10-05 | 2011-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae |
| CN102639691B (zh) | 2009-11-30 | 2014-04-16 | 味之素株式会社 | 生产l-半胱氨酸的细菌以及生产l-半胱氨酸的方法 |
| RU2460793C2 (ru) | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| JP2013074795A (ja) | 2010-02-08 | 2013-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法 |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| RU2482188C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |
| RU2501858C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-12-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae |
| WO2012036151A1 (ja) | 2010-09-14 | 2012-03-22 | 味の素株式会社 | 含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法 |
| WO2012053794A2 (en) * | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| ES2790661T3 (es) | 2011-02-09 | 2020-10-28 | Kyowa Hakko Bio Co Ltd | Método para producir una sustancia diana mediante un procedimiento de fermentación |
| JP2014087259A (ja) | 2011-02-22 | 2014-05-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP6020443B2 (ja) | 2011-04-01 | 2016-11-02 | 味の素株式会社 | Ｌ−システインの製造法 |
| US9234223B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-01-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-cysteine |
| JP2014131487A (ja) | 2011-04-18 | 2014-07-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システインの製造法 |
| DE102011075656A1 (de) | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
| DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| JPWO2013154182A1 (ja) | 2012-04-13 | 2015-12-21 | 協和発酵バイオ株式会社 | アミノ酸の製造法 |
| DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| DE102012016716A1 (de) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-Inhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die Herstellung von Aminosäuren und Nukleotiden |
| DE102012216527A1 (de) | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| US9611461B2 (en) | 2013-03-19 | 2017-04-04 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | Enterobacteriaceae bacteria exhibiting increased L-cysteine producing ability |
| RU2013118637A (ru) | 2013-04-23 | 2014-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK |
| DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| RU2013140115A (ru) | 2013-08-30 | 2015-03-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
| JP6459962B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-01-30 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2014105547A (ru) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Адзиномото Ко., Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL |
| US10172380B2 (en) | 2014-03-31 | 2019-01-08 | Impossible Foods Inc. | Ground meat replicas |
| RU2015120052A (ru) | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
| BR112018017227A2 (pt) | 2016-02-25 | 2019-02-05 | Ajinomoto Kk | método para produzir um l-aminoácido |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN109517748A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-26 | 吉林大学 | 黑色食物小分子肽在修复肝损伤中的医用用途 |
| BR112021014194A2 (pt) | 2019-02-22 | 2021-12-28 | Ajinomoto Kk | Método para a produção de um l-aminoácido |
| WO2020204179A1 (en) | 2019-04-05 | 2020-10-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing l-amino acids |
| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
| EP4103729B1 (de) | 2020-04-03 | 2023-10-18 | Wacker Chemie AG | Biokatalysator als kernkomponente eines enzymkatalysierten redoxsystems zur biokatalytischen reduktion von cystin |
| CN116018400A (zh) | 2020-06-26 | 2023-04-25 | 瓦克化学股份公司 | 改进的产生半胱氨酸的菌株 |
| EP4208560A1 (de) | 2021-07-05 | 2023-07-12 | Wacker Chemie AG | Verfahren zur enzymatischen oxidation von sulfinsäuren zu sulfonsäuren |
| CN114214341B (zh) * | 2021-12-30 | 2023-12-26 | 山西大学 | 番茄SlSERAT1;1基因或其片段在植物发育过程中的应用 |
| WO2023165684A1 (de) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Wacker Chemie Ag | Verbesserte cystein produzierende stämme |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4965197A (en) | 1987-06-12 | 1990-10-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Coryneform expression and secretion system |
-
1995
- 1995-10-26 DE DE19539952A patent/DE19539952A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-10-24 CN CNB961978945A patent/CN1155711C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 EP EP96937217A patent/EP0858510B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 DE DE59608521T patent/DE59608521D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 KR KR1019980703063A patent/KR100275287B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 DK DK96937217T patent/DK0858510T3/da active
- 1996-10-24 BR BR9610910A patent/BR9610910A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 WO PCT/EP1996/004613 patent/WO1997015673A1/de active IP Right Grant
- 1996-10-24 TW TW085113019A patent/TW554043B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 CA CA002235752A patent/CA2235752C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 JP JP51628297A patent/JP3329825B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 HU HU9900078A patent/HU224097B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 PL PL96327187A patent/PL186403B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 AT AT96937217T patent/ATE211175T1/de active
- 1996-10-24 ES ES96937217T patent/ES2169269T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 CZ CZ19981269A patent/CZ294539B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 US US09/065,104 patent/US6218168B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-04-27 MX MX9803317A patent/MX9803317A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1200764A (zh) | 1998-12-02 |
| JP2000504926A (ja) | 2000-04-25 |
| CZ294539B6 (cs) | 2005-01-12 |
| KR100275287B1 (ko) | 2001-02-01 |
| CA2235752C (en) | 2002-04-16 |
| EP0858510B1 (de) | 2001-12-19 |
| WO1997015673A1 (de) | 1997-05-01 |
| US6218168B1 (en) | 2001-04-17 |
| HUP9900078A2 (hu) | 1999-04-28 |
| CZ126998A3 (cs) | 1998-07-15 |
| ES2169269T3 (es) | 2002-07-01 |
| HUP9900078A3 (en) | 2001-08-28 |
| BR9610910A (pt) | 1999-07-13 |
| ATE211175T1 (de) | 2002-01-15 |
| PL327187A1 (en) | 1998-11-23 |
| DK0858510T3 (da) | 2002-03-25 |
| TW554043B (en) | 2003-09-21 |
| CA2235752A1 (en) | 1997-05-01 |
| HU224097B1 (hu) | 2005-05-30 |
| JP3329825B2 (ja) | 2002-09-30 |
| DE19539952A1 (de) | 1997-04-30 |
| DE59608521D1 (de) | 2002-01-31 |
| MX9803317A (es) | 1998-09-30 |
| EP0858510A1 (de) | 1998-08-19 |
| KR19990067120A (ko) | 1999-08-16 |
| CN1155711C (zh) | 2004-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL186403B1 (pl) | Acetylotransferaza serynowa, sekwencja DNA, mikroorganizmy | |
| CA2386539C (en) | Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation | |
| JP5164566B2 (ja) | フィードバック感受性が変化した組み換え酵素 | |
| RU2346038C2 (ru) | Способ ферментативного получения аминокислот и производных аминокислот из семейства фосфоглицератов | |
| US9493801B2 (en) | Compositions and methods of producing methionine | |
| KR101586098B1 (ko) | 메티오닌 수득량의 증가법 | |
| CN102002473A (zh) | 产生o-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o-乙酰高丝氨酸的方法 | |
| ES2268504T3 (es) | Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-metionina. | |
| US7195897B2 (en) | Feedback-resistant homoserine transsuccinylases having a modified c-terminus | |
| US20190264245A1 (en) | N-acetyl homoserine | |
| US7371551B1 (en) | Feedback-resistant homoserine transsuccinylases | |
| Gunji et al. | Characterization of the L-lysine biosynthetic pathway in the obligate methylotroph Methylophilus methylotrophus | |
| Wada et al. | Purification and characterization of O-acetylserine sulfhydrylase of Corynebacterium glutamicum | |
| Yeom et al. | Regulation of enzymes involved in methionine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20071024 |