TW202317652A

TW202317652A - 一種生物惰性材料及其應用在防止金屬表面沾黏生物分子的方法

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Publication number: TW202317652A
Application number: TW110138636A
Authority: TW
Inventors: 張雍; 唐碩禧; 陳登信
Original assignee: 中原大學
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2023-05-01
Also published as: TWI800039B

Abstract

本發明揭示一種共聚物及其應用在防止金屬表面沾黏生物分子的方法。該共聚物之結構包含第一鏈段和第二鏈段，該第一鏈段包含複數個磷酸基，該第二鏈段包含複數個吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼，以及上述之第一鏈段和第二鏈段藉由共價鍵連結形成所述之共聚物。特別地，該共聚物的磷酸基在該金屬表面形成配位共價鍵結藉此錨定在該金屬表面，並藉由該吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼防止其沾黏生物分子。

Description

一種共聚物及其應用在防止金屬表面沾黏生物分子的方法

本發明揭示一種共聚物及其應用在防止金屬表面沾黏生物分子的方法。特別地，該共聚物之結構包含複數個磷酸基和複數個吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼。

市場上廣泛應用於治療心血管疾病的支架醫材包含裸金屬支架(Bare Metal Stent,BMS)，其是單純的金屬支架，作用是撐開血管狹窄處，但有導致日後血管再狹窄化的缺點。另一種是塗藥型支架(Drug Eluting Stent,DES)，其為在金屬支架表面塗佈一層含抑制細胞增生藥物的生物降解高分子，藉由緩慢的生物降解來逐漸釋放藥物，使得血管內皮細胞生長被抑制，雖然可避免血管再狹窄化，但卻使得凝血反應不斷發生，必須終生服用抗凝血藥物，且支架上的含藥數僅能維持5到10年，此為一大缺點，以上的支架材料都存在不同的缺點需要克服，以降低其在植入生物體後產生的副作用。

根據前述，為了克服目前支架材料和植入生物體產生交互副作用的缺失，研究開發一結構穩定性佳又兼具生物惰性的材料實為現今生醫材料產業亟須投入研究開發的課題。

根據前述的發明背景和產業需求，本發明的技術手段和功效係揭示一具新穎結構的共聚物，該共聚物結構包含一能夠和基材起錨定/固定作用的磷酸基，和一耐裂解的具生物惰性的吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼官能基。特別地，本發明以上述之共聚物結構製造設計相關生物惰性材料並應用在防止金屬材料表面的生物分子沾黏。

本發明第一目的在於提供一種新穎的共聚物，該共聚物之結構包含第一鏈段和第二鏈段，該第一鏈段包含複數個磷酸基，該第二鏈段包含複數個吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼，以及上述之第一鏈段和第二鏈段藉由共價鍵連結形成所述之共聚物。

具體地，該共聚物是使用乙烯基磷酸(Vinylphosphonic acid，VPA)與無酯類官能基的4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼(4-vinylpyridine propylsulfobetaine，4VPPS)以自由基聚合製成的乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物。

具體地，該乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物能和金屬材料的表面形成配位共價鍵結，藉此錨定在該金屬材料的表面。

具體地，上述之共聚物同時具有生物相容性、抗生物分子沾黏、易於錨定在基材表面和自身分子結構安定的技術效果，能廣泛應用在製備生物惰性材料。

本發明第二目的在於提供一種生物惰性材料，其包含一膜層和一基材，該膜層是由包含第一目的所述之共聚物的組成所構成，並以配位共價鍵結或化學接枝錨定在該基材的表面，藉此形成所述的生物惰性材料。

特別地，該膜層還包含一互穿聚合物網絡結構。

具體地，該共聚物之結構包含第一鏈段和第二鏈段，該第一鏈段包含複數個磷酸基，該第二鏈段包含複數個吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼，以及上述之第一鏈段和第二鏈段藉由共價鍵連結形成所述之共聚物。

具體地，上述之生物惰性材料同時具有生物相容性、抗生物分子沾黏和材料結構安定的技術效果，能廣泛應用在生醫材料領域。

本發明第三目的在於提供一種防止金屬表面沾黏生物分子的方法，其包含使本發明第一目的所述的共聚物配位共價鍵結在該金屬表面或以化學接枝形成互穿聚合物網絡結構，藉此防止該金屬表面沾黏生物分子。

具體地，該配位共價鍵結係由該磷酸基和該金屬表面所含的鉻所形成。

綜上所述，本發明的技術特徵和效果包含：(1)提供一具有磷酸基和吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼結構的共聚物，其中該磷酸基和材料表面形成配位共價鍵結或互穿聚合物網絡結構，藉此錨定在該材料上以形成穩定的共聚物膜層結構；和上述之吡啶磺酸基甜菜鹼或或吡啶羧酸基甜菜鹼使該共聚物膜層達到抗生物分子沾黏等生物惰性的效果；(2)提供一新穎的生物惰性材料，特別是以金屬作為基材的生物惰性材料，該生物惰性材料包含以具有磷酸基和吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼結構的共聚物所構成的膜層，同時具有生物相容性、抗生物分子沾黏和材料結構安定的技術效果；(3)提供一種防止金屬材料表面沾黏生物分子的方法，藉由配位共價鍵結或以化學接枝形成互穿聚合物網絡結構使上述之具有磷酸基和吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼結構的共聚物錨定在該金屬材料的表面，藉此達到防止該金屬材料表面沾黏生物分子之目的，能廣泛應用於金屬製醫材領域。

〔圖1〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)的FTIR圖譜；對照組是Poly(VPA-r-SBMA)共聚物。

〔圖2〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)的水接觸角長條圖。

〔圖3〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)的水合含量長條圖。

〔圖4〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)的顯微鏡影像圖和人類纖維母細胞相對貼附量長條圖；對照組是SBMA水膠。

〔圖5〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)的凝血時間長條圖。

〔圖6〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)的溶血測試百分比長條圖。

〔圖7〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)的細胞毒性分析顯微鏡影像圖和分級。

〔圖8〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)的熱重損失分析(TGA)圖譜；對照組是Poly(VPA-r-SBMA)共聚物。

〔圖9〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物poly(VPA-r-4VPPS)在滅菌前後的人類全血顯微鏡影像圖和人類全血相對貼附量長條圖；對照組是SBMA水膠。

〔圖10〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物PPA70及其共聚物互穿網絡(PPA70-PVA)膜層的人類纖維母細胞相對貼附量長條圖；對照組是SBMA水膠。

〔圖11〕係本發明乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物PPA70及其共聚物互穿網絡(PPA70-PVA)膜層的綠色螢光蛋白大腸桿菌相對貼附量長條圖；對照組是SBMA水膠。

以上雖以特定範例說明本發明，但並不因此限定本發明之範圍，只要不脫離本發明之要旨，熟悉本技藝者瞭解在不脫離本發明的意圖及範圍下可進行各種變形或變更。此外，摘要部分和標題僅是用來輔助專利文件搜尋之用，並非用來限制本發明之權利範圍。

依據前述發明內容，本發明第一實施例在於提供一種共聚物，其結構包含第一鏈段和第二鏈段，該第一鏈段包含複數個磷酸基，該第二鏈段包含複數個吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼，以及上述之第一鏈段和第二鏈段藉由共價鍵連結形成所述之共聚物。

於一實施例，該共聚物具有如下結構通式，其中m是5~500的整數，n是5~500的整數；R是帶有羧酸根(Carboxylic acid)或磺酸根(sulfonic acid)的官能基；k是1~3重複的碳鏈。

式(1)

於一具體實施例，該共聚物是乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物，其化學結構如式(2)所示，其中m是20~400的整數，n是30~300的整數。

式(2)

於一具體實施例，該乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物的重量平均分子量是小於120kDa，較佳的，其範圍是50~120kDa。

於一具體實施例，該乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物是由乙烯基磷酸和4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼進行自由基聚合反應所製成，該乙烯基磷酸和4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼的反應莫耳比例範圍是約9：1到1：9。較佳的，是7：3到3：7。

本發明第二實施例在於提供一種生物惰性材料，其包含一膜層和一基材，該膜層包含如本發明第一實施例所提供之共聚物，和該膜層藉由配位共價鍵結或化學接枝錨定在該基材的表面，藉此形成所述的生物惰性材料。

於一具體實施例，該共聚物是乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物，其重量平均分子量是約50~120kDa。

於一具體實施例，該乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物是由乙烯基磷酸和4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼進行自由基聚合反應所製成，該乙烯基磷酸和4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼的反應莫耳比例範圍是約7：3到3：7。

於一具體實施例，該膜層的水接觸角約是小於60度，較佳的，是30~50度。

於另一具體實施例，該膜層還包含一如式(3)所示的聚乙烯醇和乙烯基磷酸所形成的互穿聚合物網絡結構，其中X是5~500的整數，較佳的，是20~400的整數，Y是5~7000的整數，較佳的，Y是30~1500的整數。

式(3)

於另一具體實施例，該基材包含不鏽鋼、鈦合金、玻璃、矽晶圓、陶瓷、聚對苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚二甲基矽氧烷、聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯。

於另一具體實施例，所述之生物惰性材料，係應用於製備心導管、血管支架、內視鏡或手術器械。

本發明第三實施例在於提供一種防止金屬表面沾黏生物分子的方法，包含使本發明第一實施例所述的共聚物配位共價鍵結在該金屬表面或以化學接枝形成互穿聚合物網絡結構，藉此防止該金屬表面沾黏生物分子，該配位共價鍵結係由磷酸基和該金屬表面所含的鉻所形成。

特別地，上述實施例提及之技術特徵和功效能夠解決裸金屬支架與塗藥型支架現今存在的問題。利用本發明之共聚物材料在金屬支架創造一層抗生物分子沾黏的膜層或進行其表面改質，使其具有生物相容性，能夠抵抗細胞的黏附，但又不會抑制細胞生長；另一方面本發明的共聚物和其構成的膜層還能抑制血液細胞的貼附，避免凝血、溶血等反應發生，進一步降低抗凝血藥物的服用。據此，本發明之共聚物、生物惰性材料和應用方法在生醫產業，尤其是侵入式醫材產業著實具有習知技術無法預期的功效。

以下範例和實驗例係依據上述之發明內容和實施例所述之內容所進行的實驗，並據此做為本發明的效果驗證和說明。

範例一：乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共 聚物(poly(VPA-r-4VPPS))合成

利用自由基聚合(Free Radical Polymerization)方式合成poly(VPA-r-4VPPS)，並控制乙烯基磷酸(VPA)：4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼(4VPPS)之莫耳比例，如表1所示，並控制理論分子量約在50kDa，實際分子量是由凝膠滲透層析儀(Gel Permeation Chromatography，GPC)所測定。共聚高分子合成的反應如段落[0036]所示，將VPA與4VPPS單體放入聚丙烯(PP)反應瓶中，以1M NaCl水溶液作為溶劑溶解單體，加入過硫酸銨(Ammonium persulphate,APS)作為起始劑並溶解後，以氬氣通氣15分鐘，去除溶液中的氧氣與水氣，隨後密封瓶口，並置於70℃油浴鍋中攪拌反應48小時。反應完成的產物浸泡於冰浴中終止反應，並以丙酮為非溶劑析出高分子，將析出完之共聚高分子放入真空乾燥設備移除殘留的溶劑，即完成共聚高分子的合成。本發明的對照組是以乙烯基磷酸(VPA)和磺酸基甜菜鹼甲基丙烯酸酯單體(SBMA)合成之Poly(VPA-r-SBMA)共聚物。

表1

反應方程式

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(poly(VPA-r-4VPPS))FT-IR分析

應用FT-IR檢測共聚物結構中的鍵結與官能基，在Poly(VPA-r-4VPPS)共聚物中，能檢測到特徵官能基，分析圖譜如圖1所示。吡啶(Pyridine)的波數為1571~1423cm^-1；Poly(VPA-r-SBMA)共聚物檢測到波數1725cm^-1 C=O特徵官能基；此外，在各比例的共聚物中，都檢測到波數為1641~1643cm^-1的C-N⁺鍵結、1201~1043cm^-1的SO₃鍵結與983~925cm^-1的P-O鍵結，據此證明範例一使用磷酸基的單體與雙離子單體的自由基聚合方法成功製成本發明的Poly(VPA-r-4VPPS)共聚物。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(poly(VPA-r-4VPPS))改質材料表面的水接觸角分析

本實驗以不鏽鋼作為要表面改質的材料，以賦予其具有生物惰性，改質前後的不鏽鋼表面進行水接觸角分析，藉此證明本發明共聚物在材料表面能形成穩定結構的技術功效。具體地，以1M NaCl為溶劑，將Poly(VPA-r-4VPPS)共聚高分子以40mg/mL的比例配置成高分子溶液，在24孔多孔盤中，每一格置入1片不鏽鋼錠，並加入1mL的高分子溶液，將多孔盤以鐵氟龍止瀉帶包覆後，置入60℃烘箱反應48小時，當反應完成後，以1M NaCl溶液反覆清洗，將未接枝上的高分子清除，再以去離子水清洗，將殘留的NaCl洗去，之後將水分吸乾，即完成不鏽鋼的表面改質。本實驗中的水接觸角檢測方法為將4μL的去離子水水滴於室溫環境下，滴至不鏽鋼樣品的表面，並等待其平衡3分鐘後，量測其水接觸角，實驗結果如圖2所示。其中Poly(VPA-r-4VPPS)共聚物改質的不鏽鋼相比未改質的不鏽鋼，接觸角大幅降低約60°，較佳的條件為PPA70的36.8°，證實使疏水的不鏽鋼表面已經改質轉變成親水表面。但是PPA100為單純的VPA均聚高分子，兩個-OH官能基會與不鏽鋼表面的氧化鉻(Cr₂O₃)鍵結，結構上只剩一個親水的P=O官能基，因此水接觸角下降的趨勢明顯比本發明的共聚物要小。P4VPPS則為4VPPS的均聚物，在缺乏磷酸基單體(VPA)的條件下，無法與不鏽鋼表面形成穩定的鍵結，在改質完後的清洗純化程序被沖洗，導致水接觸角無法有效降低，所以沒有磷酸基的共聚物是無法和材料表面形成的穩定結構，達到材料表面改質後具有良好親水性之目的。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(poly(VPA-r-4VPPS))改質材料表面的水合能力分析

水合能力是用來評估材料表面的生物惰性的一項指標，水合能力越高表示材料表面的抗生物分子沾黏的效果越好，能在生物環境中捕捉更多水分子，在其表面形成水合層，有效降低生物分子與材料表面之間的分子間作用力，進而增加材料表面的抗生物分子沾黏特性。本發明具體之實驗結果如圖3所示，在經過poly(VPA-r-4VPPS)改質的不鏽鋼表面，相對於未改質的表面，顯著提升該不鏽鋼表面的水合能力，最佳的條件為PPA70，相對於未改質的不鏽鋼提升高達約200%的水合能力，具體的，由PPA70所改質的不鏽鋼，水合能力平均為0.097mg/cm²。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(poly(VPA-r-4VPPS))生物惰性效能分析之一

本實驗所使用的細胞為人類纖維母細胞(HT1080)。將培養至9成滿細胞的75T Flask以1mL的胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)與細胞外基質反應6分鐘使細胞懸浮，並加入9mL的細胞培養液終止胰蛋白酶的反應，將細胞懸浮液在15mL離心管中以290rcf離心5分鐘後，將上清液移除後，再以10mL的細胞培養液將細胞沖散。以細胞計數盤在顯微鏡底下計算細胞數量，並以培養液將細胞數量稀釋至50,000cells/mL。將樣品放置於24well plate中以PBS膨潤12小時，並以UV燈殺菌30分鐘後放入生物安全櫃中，移除well plate中的 PBS，並以1mL的PBS清洗樣品2次後，下入1mL稀釋完的細胞液，並放入恆濕恆溫培養箱中以37℃，5% CO₂培養24小時。將培養後的樣品以PBS清洗3次，加入戊二醛作為細胞固定劑，待反應1小時後，以PBS清洗1次，並以螢光顯微鏡觀測細胞在材料表面的貼附量，使用電腦軟體做定量的分析。實驗結果如圖4所示，係為HT1080貼附在材料表面的分析圖以及螢光顯微鏡下的畫面，顯示PPA70為其中之一較佳的抗細胞貼附條件，在經過PPA70所改質的不鏽鋼表面，相較於未改質不鏽鋼的細胞貼附量，平均每平方公分大幅降低15,000顆細胞數，形成有效的抗細胞沾黏表面。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(poly(VPA-r-4VPPS))生物惰性效能分析之二

本凝血分析實驗係將不鏽鋼錠浸泡在1mL乏血小板血漿(Platelet poor plasma,PPP)中，並於37℃水浴平衡1小時，將平衡完的PPP吸取至樣品管中，並使用凝血時間分析儀(CA-600 series)，設定檢測項目為凝血酶原時間(Prothrombin Time,PT)及活化部分凝血活酶時間(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)，儀器將會自動注入檢測試劑與PPP混合，並以波長660nm，進行光散射強度的檢測。比較浸泡完樣品的PPP與單純PPP正常值反應時間的差異。依據ISO 10993的生物相容性規範，接觸血液的醫療器材必須進行凝血分析。本研究檢測了不鏽鋼的凝血酶原時間(Prothrombin Time,PT)與活化部分凝血活酶時間(Activated Partial Thromb oplastin Time,APTT)，分別是檢測外源性凝血與內源性凝血，PT的正常值為12~16秒，APTT的正常值為24~36秒；將浸泡不鏽鋼的PPP與單純的PPP所測出來的值做比較，由圖5所示，經由共聚高分子改質的不鏽鋼表面並不會造成凝血的反應。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(poly(VPA-r-4VPPS))生物惰性效能分析之三

將全血先以PBS稀釋成總體積為800μL不同濃度的稀釋液，並取200μL加入3.33mL的PBS，取其中200μL檢測波長542nm的吸光值，並找出OD₅₄₂=0.7~0.8的濃度值。使用適當的濃度，配置全血稀釋液，將稀釋液取200μL加入內含3.33mL PBS與不鏽鋼樣品的15mL離心管中，並準備PBS與DI water作為凝血的控制條件。將離心管置於37℃水浴槽中恆溫1小時，恆溫過後的離心管以180rcf的轉速離心10分鐘，取離心完的上清液200μL去檢測波長542nm的吸光值，以PBS與DI water所檢測的OD值設定為0%與100%，當溶血程度低於5%時，視為樣品不會造成溶血，利用下列公式計算不同條件的溶血程度。

Hemolysis=(OD_SUS-OD_PBS)/(OD_DI-OD_PBS)×100%

OD_SUS：各條件之不鏽鋼經溶血實驗所測得之OD 值；OD_PBS：負控制組PBS所測得之OD值；OD_DI正控制組DIWater所測得之OD值。

在上述溶血分析中，以PBS為不會溶血的負控制組，去離子水為會造成溶血的正控制組，將本發明共聚物材料浸泡在血液中，並使用UV-VIS觀測血球是否因該共聚物材料造成溶血導致血紅素溶解至稀釋血液的PBS中，並以公式計算各條件的不鏽鋼所造成的溶血程度。由圖7所示，以本發明共聚物改質的不鏽鋼不會造成溶血反應。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(poly(VPA-r-4VPPS))生物惰性效能分析之四

本發明提供之共聚物之細胞毒性是依據法規ISO 10993-5規定的標準流程進行檢測，使用的細胞為小鼠纖維母細胞(L929)進行實驗，總共分為3天的時長進行，並分為顯微鏡定性觀測與XTT試劑定量檢測。第一天分為細胞培養與樣品毒性萃取。細胞培養：將培養在細胞培養箱中的L929細胞取出，以PBS沖洗2次；加入1mL的胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)反應6分鐘使細胞於Flask上脫附；使用顯微鏡觀測細胞已完全脫附，加入9mL的細胞培養液終止胰蛋白酶的反應；將脫附的細胞移至15mL的離心管，以290rcf的轉速離心5分鐘；將離心完的上清液移除，再以10mL的細胞培養液沖散離心管底部的細胞；將細胞使用細胞計數盤計算細胞數，並以細胞培養液稀釋細胞；欲用顯微鏡觀測之樣品的細胞濃度為150,000 cells/mL，於12孔多孔盤各加入1mL的細胞稀釋液至並放入細胞培養箱培養24小時；欲以XTT試劑檢測之細胞濃度為100,000cells/mL，並於96孔多孔盤各加入0.1mL至並放入細胞培養箱培養24小時。樣品毒性萃取：將樣品以UV燈將樣品殺菌30分鐘，並將L929細胞培養液將不鏽鋼以6cm²/mL的比例進行萃取，同時，以0.2g/mL的比例進行HDPE的萃取，作為細胞毒性的正控制組，並以0.1g/mL的比例進行ZDEC的萃取，作為細胞毒性的負控制組，以37℃、150rpm的條件進行萃取。第二天將第1天的將培養細胞的培養液，置換成萃取樣品的萃取液，12孔盤各加入1mL、96孔盤各加入0.1mL，並繼續放入細胞培養箱培養24小時。第三天分為定性及定量，定性：將12孔盤的細胞以細胞培養液清洗2次，並在顯微鏡下觀測細胞生長的情況。定量：將XTT試劑與XTT Activity Solution以50：1的比例混和，並將96孔盤每格加入51μL混和好的XTT試劑，並放入37℃細胞培養相中反應3小時；將反應完成的96孔盤以UV-VIS讀取450nm的吸收光。實驗結果如圖6所示，各條件的不鏽鋼在毒性檢測的顯微鏡定性分析及XTT試劑所換算出來的毒性級數，HDPE與ZDEC為正、負控制組，以培養液培養的控制組Blank定義為100%，健康的細胞在顯微鏡下型態為健康的紡錘狀，並且佈滿在well plate中，而負控制組的ZDEC會造成細胞死亡，細胞型態將會由紡錘狀轉變為圓球狀，並且懸浮在溶液中。由顯微鏡定性分析以及XTT試劑定量分析可得知，各改質條件在顯微鏡下有良好的細胞型態，並且在XTT試劑的定量下，細胞存活率均大於80%，細胞毒性為0級，說明經過高分子改質後的不鏽鋼均不具有細胞毒性。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物的熱穩定性分析

本實驗例比較分別含有4VPPS與SBMA的共聚高分子的熱裂解溫度，將PPA30與SBMA70，秤重5mg，使用熱失重分析儀(Thermogravimetric analysis,TGA)來測定材料的熱穩定性質，檢測程序為在120℃維持15分鐘，除去共聚高分子中的水分，除水完成後以10℃/min的升溫速率升溫至800℃，以除水完成的重量作為100%的重量比，當升溫時重量損失10%時的溫度，即為材料的熱裂解溫度。熱裂解溫度由熱失重分析儀所測量，並以10%的重量損失時的溫度定義為共聚高分子的熱裂解溫度，實驗結果如圖8所示，本發明之不含酯類官能基的PPA30的熱裂解溫度在332℃，相較於對照組含酯類官能基的SBMA70的283℃高了約50℃，證明本發明之共聚物結構設計能提升熱穩定性。更重要的是當熱裂解溫度大於300℃時，更有利於各式材料的加工，特別是金屬材料的表面改質。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物的抗生物惰性效能衰變之分析

本實驗例使用濕熱滅菌程序測試比較本發明之共聚物具有的抗生物惰性效能衰變的技術效果，具體的方式和結果如下所述。

使用以PPA30、SBMA70進行改質的不鏽鋼和SBMA的水凝膠進行溼熱滅菌，並以全血(Human Whole Blood)貼附量來比較含酯類官能基的共聚物與無酯類官能基共聚物之間的熱穩定性質的差異。將改質完的不鏽鋼與水膠對照組浸泡於PBS中，在121℃的溫度下進行20分鐘的濕熱滅菌。將未滅菌的樣品與滅菌後的樣品置於24孔多孔盤中，以PBS在37℃烘箱中膨潤12小時；將膨潤的PBS移除，並以PBS清洗1次；在24孔盤中每格加入1mL的全血，並以37℃，120rpm的搖晃烘箱進行血液的貼附；貼附完的樣品以PBS清洗3次，將樣品移至新的24孔盤，再以PBS清洗3次後，以戊二醛在37℃烘箱中進行1小時的血球細胞的固定，並以SYTO-9染劑對血液進行染色；以PBS清洗1次，使用雷射共軛聚焦掃描式顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)進行血球細胞的拍攝，並以電腦軟體進行定量的分析。結果如圖9所示，以未改質的不鏽鋼表面定義為100%的貼附量，明顯地，滅菌後的SBMA水膠之血液貼附量比滅菌前的增加1,633%；SBMA70改質的不鏽鋼表面在滅菌後的血液貼附量相對滅菌前的血液貼附量大幅增加947%。表示在濕熱滅菌後其喪失了抗沾黏的效用。但是本發明的PPA30所改質的不鏽鋼表面，結構中不含有酯類官能基，血液貼附量在滅菌前後沒有明顯變化，表示其結構在滅菌過後仍然保有其抗沾黏的功效。據此證明本發明之共聚物和所構成的膜層具有抗生物惰性效能衰變的技術功效。

乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物形成之互穿聚合物網絡結構的生物惰性效能之分析

本發明之乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(PPA70)的磷酸基團和聚乙烯醇(PVA)的氫氧基可藉由反應形成共價鍵結，製成互穿聚合物網絡結構，如式(3)所示，其中X是20~400的整數，Y是30~1500整數。

式(3)

具有上述共聚物以及該共聚物和PVA製成的互穿聚合物網絡結構膜層的薄膜或基材進行生物惰性效能測試，實驗結果如圖10和圖11所示，本發明之乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物(PPA70)塗布在金屬和陶瓷材料上的膜層對於大腸桿菌的貼附量都小於2%。且經上述如式(2)所示之互穿聚合物網絡結構改質的聚對苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯薄膜的細胞貼附量幾乎是0，都比沒有改質的薄膜低，此表示具有如式(2)所示之互穿聚合物網絡結構改質的塑膠薄膜具有非常好的抗細胞沾黏特性。特別地，具有如式(2)所示之互穿聚合物網絡結構改質的聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯薄膜對於大腸桿菌表現出非常良好的抗沾粘效果，其貼附量也接近於0。據此，具有本發明共聚物製成之互穿聚合物網絡結構的膜層或材料都表現出良好的抗生物分子沾黏效果，是一創新的生物惰性材料。

Claims

一種共聚物，該共聚物之結構包含第一鏈段和第二鏈段，該第一鏈段包含複數個磷酸基，該第二鏈段包含複數個吡啶磺酸基甜菜鹼或吡啶羧酸基甜菜鹼，以及上述之第一鏈段和第二鏈段藉由共價鍵連結形成所述之共聚物。
如請求項1所述之共聚物，該共聚物的化學結構如式(1)所示：

其中，R是帶有羧酸根(Carboxylic acid)或磺酸根(sulfonic acid)的官能基k是1~3重複的碳鏈；m是5~500的整數，n是5~500的整數。
如請求項2所述之共聚物，該共聚物是乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物，和其重量平均分子量是小於120kDa。
如請求項3所述之共聚物，該乙烯基磷酸-4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼共聚物是由乙烯基磷酸和4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼進行自由基聚合反應所製成，該乙烯基磷酸和4-乙烯基吡啶磺酸基甜菜鹼的反應莫耳比例範圍是約9：1到1：9。
一種生物惰性材料，包含一膜層和一基材，該膜層是由包含如請求項1~4所述之共聚物的組成所構成，並以配位共價鍵結或化學接枝錨定在該基材的表面，藉此形成所述的生物惰性材料。
如請求項5所述生物惰性之材料，該膜層的水接觸角是約小於60度。
如請求項5所述之生物惰性材料，該膜層還包含一如式(2)所示的聚乙烯醇和乙烯基磷酸所形成的互穿聚合物網絡結構：

其中X是5~500的整數，Y是5~7000的整數。
如請求項5所述之生物惰性材料，該基材包含不鏽鋼、鈦合金、玻璃、矽晶圓、陶瓷、聚對苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚二甲基矽氧烷、聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯。
如請求項5所述之生物惰性材料，係應用於製備心導管、血管支架、內視鏡或手術器械。
一種防止金屬表面沾黏生物分子的方法，其步驟包含使請求項1~4所述的共聚物配位共價鍵結在該金屬表面或以化學接枝形成互穿聚合物網絡結構，藉此防止該金屬表面沾黏生物分子，該配位共價鍵結係由磷酸基和該金屬表面所含的鉻所形成。