TW202313977A

TW202313977A - 作為新穎基因靜默技術的短雙股ｄｎａ及其應用

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Publication number: TW202313977A
Application number: TW111122093A
Authority: TW
Inventors: 李嘉強; 憲高孫; 查爾斯李
Original assignee: 大陸商北京強新生物科技有限公司
Priority date: 2021-05-29
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2023-04-01
Also published as: AU2022286925A1; EP4347828A1; CA3221923A1; KR20240014533A; CN118369428A; WO2022256354A1; JP2024520556A

Abstract

本發明公開了一種用於調節細胞、組織、生物體和動物中的標靶核酸和/或蛋白質的新穎基因靜默技術。新技術提供了用於基因靜默應用的組合物，包括預防和治療人類疾病。該組合物包含短鏈的、雙股DNA分子，其中有義股在長度上至少與反義股相等。雙股DNA分子進一步包括至少一個核糖核苷酸單體間隔片段。本發明進一步提供了使用該組合物調節標靶基因的表達或功能，或用於治療或預防疾病以及用於其它醫學或生物學應用的方法。

Description

作為新穎基因靜默技術的短雙股DNA及其應用

相關申請的交叉引用

本申請要求2021年5月29日遞交的申請號為63/195,010的美國臨時專利申請的優先權並要求享有該申請的權益，該臨時專利申請的全部內容併入本申請當中作為參考。

本發明涉及作為基因靜默技術的短雙股DNA，及其相關的組合物和方法，可用於生物或醫學研究、疾病的治療和預防、以及在其它生物領域中的基因靜默應用。

現代醫學療法依賴於兩項基本的技術，即小分子化學成分和蛋白質/抗體技術。然而，僅有約10%的被基因組學研究和生物醫學研究所確定的靶點可以通過上述兩項基礎技術解決。寡核苷酸有望解決眾多的靶點，包括通過小分子化學成分和蛋白質/抗體技術無法成藥的靶點。經過40多年的研究創造了反義寡核苷酸（ASO，Antisense oligonucleotide）和小干擾RNA（siRNA，small interfering RNA）技術（ Cy A. Stein et al., 2017）。然而，儘管經過40多年的研究，除少數臨床孤兒適應症外，顯著的成藥性問題阻礙了ASO和siRNA技術成為主流治療平臺的發展。這些成藥性問題包括，除其他外：低靜默效率，脫靶效應，刺激非預期免疫反應，組織滲透性挑戰和體內遞送等。因此，在各種生物和醫學應用中，創造新技術以靶向感興趣的基因存在著顯著尚未被滿足的需求。

ASO是一種基因靜默技術，其基於最初於1978年提出的概念（ Zamecnik P.C. et al., 1978）。一般來說，ASO技術背後的原理是將反義寡核苷酸與標靶核酸雜交，調節基因表現的活性或功能，例如轉錄/轉錄後或轉譯。其機制大體上分為：（1）僅佔位而不促進RNA的降解，其中ASO的結合導致轉譯停滯（translational arrest）、剪接抑制或誘導可變剪接變體，或者（2）占位誘導的不穩定化（occupancy-induced destabilization），其中ASO的結合促進通過內源性酶降解RNA，例如核糖核酸酶H1（RNase H1）；和（3）轉譯調節：ASO可阻斷在5’UTR區域的上游開放閱讀框（uORFs）或者其它抑制性或調控性元件，提高或調節轉譯效率（ Stanley T. Crooke et al., 2008 ； C. Frank Bennett, 2010 ； Richard G. Lee, 2013 ； Stanley T. Crooke, 2017）。ASO是單股去氧核糖核苷酸序列的結構，可以通過鹼基配對與標靶RNA結合。經過40年的研究，通過各種對單股寡核苷酸的化學修飾使得ASO技術得到了改進，例如硫代磷酸酯取代或其它經修飾的核苷酸（參見 Iwamoto N et al 2017, Crooke ST, 2017 ； Crooke ST et al., 2018；U.S. Pat. Nos. 7919472 和 9045754）。

短雙股RNA通過RNAi機制觸發同源序列RNA丟失(loss)，這種機制首次在植物中觀察到，並在線蟲（秀麗隱桿線蟲）中得到證實（ A. Fire et al, 1998）。該機制涉及長鏈dsRNA降解為短鏈干擾雙股體RNA（siRNA），siRNA與多蛋白RNA誘導靜默複合物（RICS，RNA-Induced Silencing Complex）相互作用；在RISC中，siRNA是解旋的，其中的有義股丟棄，反義股或者引導股與RISC核酸內切酶AGO2結合，隨後AGO2裂解標靶RNA（ de Fougerolles et al., 2007 ； Ryszard Kole, 2016）。在哺乳動物細胞中，合成的siRNA或非對稱短干擾RNAs（aiRNA或非對稱siRNA）可以通過依賴RISC的機制用於誘導基因靜默（參見 Elbashir SM et al., 2001 ； Sun X et al., 2008； U.S. Pat. Nos. 7056704 和9328345）。

已研究幾十年的寡核苷酸，其被認為很有望成為一類全新的療法。然而其有限的靜默效率，遞送上的挑戰和劑量依賴性副作用（包括雜交依賴性毒性和雜交非依賴性毒性）一直限制著這些新穎療法的發展（ C. Frank Bennett, 2010 ； C. Frank Bennett, 2019 ； Roberts TC et al., 2020 ； Crooke ST et al., 2018 ；和 Setten RL et al., 2020）。一般來說，雖然ASO化合物在誘導基因靜默中的效能不及基於siRNA的化合物，但是ASO化合物與siRNA化合物相比，其具有一些製藥上的優勢。目前，ASO和siRNA仍然是設計基因靜默治療療法的兩種同等重要的平臺技術（ Crooke ST et al 2018 ； Roberts TC et al 2020）。寡核苷酸的雜交依賴性毒性主要歸於其與非標靶基因的雜交（「脫靶效應」）（ Jackson et al., 2003 ； Lin X et al., 2005）。寡核苷酸的非雜交依賴性毒性是通過其與蛋白質的相互作用發生：這些作用包括增加凝血時間，促發炎作用和啟動補體途徑。這些作用傾向於發生在較高劑量的寡核苷酸中，並且是劑量依賴性的。例如，在較高濃度下，ASO可導致腎小管病變和血小板減少（ Geary, RS. et al., 2007 ； Kwoh J T, 2008）。臨床上，第一代PS反義寡去氧核苷酸和第二代經2’-MOE修飾的反義寡核苷酸的主要耐受性和安全性問題已被證明是非雜交依賴的作用，如延長活化部分凝血活酶的時間、注射部位反應和諸如發熱、發冷和頭痛的全身症狀（C . Frank Bennett, 2010 ； Henry S P, 2008 ； Kwoh J T, 2008）。即使是最優化的ASO通常也仍然遠不及siRNA有效，而且其被證明具有劑量依賴性的典型毒性（ Kendall S. Frazier, 2015）。在過去的40年裡，為減輕寡核苷酸的劑量依賴性毒性，人們一直努力通過各種化學修飾來克服ASO有限的效能問題和相關的安全性問題（ Iwamoto N et al 2017, Crooke ST et al., 2018 ；和 Roberts TC et al., 2020）。

與ASO相比，雙股siRNA的脫靶效應被認為是由有義股介導的靜默，與內源性miRNA通路的競爭，以及與TLR或其它蛋白質的相互作用所介導的（ Setten RL et al 2019）。另外，典型的21nt/19bp雙股 siRNA在細胞和組織滲透力方面效率不高，也需要廣泛的化學修飾以增強siRNA的穩定性和其它藥物性質。

總之，經過40多年的ASO技術創新和20多年的基於RNAi技術研究後，雖成功開發針對近90%與人類疾病相關的靶點的基因靶向療法，但仍然具有挑戰性。此外，針對現在已批准的寡核苷酸藥物，每位患者每年的花費超過50萬美元，因此無法解決影響普通大眾的疾病。因此，迫切需要新的技術來克服這些挑戰。

本文引用的參考文獻不等同承認其為所請求保護的本發明的現有技術。

本發明基於由短雙股去氧核糖核苷酸（sdDNA，short duplex deoxyribonucleotides）觸發的有效的基因靜默的出人意料的發現。這種新穎基因靜默技術由sdDNA實現，sdDNA採用了一種由連接著的核苷酸單體組成的短的雙股分子，並具有一個或更多個的核糖核苷酸單體間隔片段（ISR，interspersed segment of ribonucleotide monomer(s)），其中每個核苷酸單體選自下組：天然存在的核苷酸、其類似物（analog）和經修飾的核苷酸（以下統稱為「核苷酸單體」）。換句話說，本發明的一個實施方案中使用的核苷酸單體包含「去氧核糖核苷酸單體」，其中「去氧核糖核苷酸單體」選自下組：天然存在的去氧核糖核苷酸、其類似物和經修飾的去氧核糖核苷酸。進一步的，通過摻入一個或幾個間隔的核糖核苷酸單體，可以顯著實現或增強sdDNA的基因靜默功能。「核糖核苷酸單體」可選自下組：天然存在的核糖核苷酸、其類似物和經修飾的核糖核苷酸。

在本發明中，短雙股DNA（sdDNA）分子進一步地被一個或幾個核糖核苷酸單體間隔開，形成至少一個核糖核苷酸單體間隔片段（ISR）。

在一個實施例中，本公開所包含的基於sdDNA的新穎平臺技術的強大基因靜默效應是通過寡核苷酸單體有義股和寡核苷酸單體反義股實現的，其中寡核苷酸單體反義股與標靶核糖核苷酸序列基本上互補。我們的數據顯示本申請的sdDNA分子因其獨特、新穎的組成，可以在皮莫耳濃度(pico molar)下引起基因靜默，且比ASO、siRNA以及其它現存的基因靜默技術更強，因此可以減少劑量依賴性毒性。本申請的sdDNA分子還有望具有優於現有基因靜默技術的至少一個以下優勢，包括更好的組織滲透力；相比於基於siRNA的基因靜默僅發生在細胞質中，sdDNA可以在細胞核、粒線體等中實現基因靜默；減少脫靶效應；更好的穩定性；消除或減少與siRNAs相關的內源性microRNA途徑之間不期望發生的競爭；低合成成本以及改進的藥學性質。因此，本發明的sdDNA分子對解決現有技術面臨的各種挑戰方面具有巨大的潛能。本發明的sdDNA分子可以用於當前寡核苷酸所正在應用或預期使用的全部領域，包括研究、診斷、疾病預防和治療以及生物領域的其它應用，還包括農藥和獸藥領域。

第一方面，本發明提供一種組合物，其包含具有第一股和第二股的短雙股DNA（sdDNA）分子。sdDNA分子第二股的長度至少與第一股的長度相等，更具體地，sdDNA分子第二股的長度比第一股的長度長或者與第一股的長度相等。由於第一股通過至少一個靶向區與標靶RNA的標靶片段基本上互補，因此第一股可以被認為是反義股或者反義寡核苷酸。進一步地，第二股與第一股基本上互補，與第一股形成至少一個雙股區，第二股也可以被視為是有義股或者有義寡核苷酸。sdDNA分子包含至少一個核糖核苷酸單體間隔片段（ISR）。在一個特徵中，sdDNA分子中的ISR包含至少一個核糖核苷酸單體，其中ISR可以存在於任一股中或者在兩股中均存在。

本發明提供的組合物用於調節真核細胞中的基因表現或功能，其中sdDNA與細胞接觸或者向受試者施用。

在一些實施方案中，sdDNA分子包含至少一個或至少兩個核糖核苷酸單體間隔片段（ISR）。在一個特徵中，本發明sdDNA分子的第一股包含至少一個ISR或sdDNA分子的第二股可包含至少一個ISR。在一個實施方案中，第一股包含至少一個ISR並且第二股也包含至少一個ISR。在一個特徵中，每個ISR彼此獨立地由1個核糖核苷酸單體組成，或包含至少2、3、4、5或6個連續的核糖核苷酸單體。在另一個特徵中，ISR包含至少2個核糖核苷酸單體，其中該核糖核苷酸單體是連續的或其被至少一個（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多）不同種類的單體摻入而隔開。在另一個特徵中，第一股中包含的ISR的核糖核苷酸單體總數至少為2。

在一個特徵中，至少一個ISR分佈在第一股（反義股）的至少一個靶向區中。在另一個特徵中，至少一個ISR分佈在第二股（有義股）的至少一個雙股區中。在另一個特徵中，至少一個ISR分佈在第一股的至少一個靶向區中且至少一個ISR分佈在第二股（有義股）的至少一個雙股區中。在一些實施方案中，至少一個ISR可以分佈在第一股的任意位點。在一些實施方案中，至少一個ISR位於第一股的5’端或者靠近第一股的5’端（從所述股末端起數的7個核鹼基以內，或者從所述股末端起數的核鹼基總數的33%個以內，例如：長度約為21個核鹼基的股，從所述末端起數的第1、2、3、4、5、6或7個核鹼基位置）；和/或至少一個ISR位於第一股的3’端或者靠近第一股的3’端（從所述股末端起數的7個核鹼基以內，或者從所述股末端起數的核鹼基總數的33%個以內）；和/或至少一個ISR位於第一股的更中心位點。在一些實施方案中，第一股中分佈的至少一個ISR僅位於第一股的突出區域。在一些實施方案中，第一股中分佈的至少一個ISR位於第一股的突出區域和雙股區。在一些實施方案中，第一股中的ISR包含至少一個位於第一股5’端或第一股3’端的核糖核苷酸單體。在一些實施方案中，至少一個ISR位於第二股的5’端或者靠近第二股的5’端（從所述股末端起數的7個核鹼基以內，或者從所述股末端起數的核鹼基總數的33%個以內）；和/或至少一個ISR位於第二股的3’端或者靠近第二股的3’端（從所述股末端起數的7個核鹼基以內，或者從所述股末端起數的核鹼基總數的33%個以內）；和/或至少一個ISR位於第二股的更中心位點。

在一個特徵中，第一股或反義股包含多個連接著的核苷酸單體以形成核鹼基序列，並且第一股或反義股至少70%、80%、85%、90%、95%或者完全地與標靶基因的RNA的標靶片段互補。在某些實施方案中，標靶RNA選自mRNA或非編碼的RNA，其中RNA或者編碼與疾病有關的蛋白質或者調控與疾病有關的生物學通路的部分，例如哺乳動物疾病。術語「標靶（target）」和「靶向（targeted）」在本公開中可互換地使用並具有相同的含義。

在各種實施方案中，第一股（反義股）具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連接著的核苷酸單體的主鏈長度，或其等值長度，或由上述任意兩數值括起來的長度範圍（範圍的兩個端點值均包括在其中）。例如，第一股的一些長度範圍包括：（a）8-36個核苷酸單體，（b）8-33個核苷酸單體，（c）10-30個核苷酸單體，（d）10-29個核苷酸單體，（e）12-29個核苷酸單體，（f）12-28個核苷酸單體，（g）12-26個核苷酸單體，（h）12-25個核苷酸單體，（i）13-25個核苷酸單體，（j）13-24個核苷酸單體，（k）13-23個核苷酸單體，（l）14-24個核苷酸單體，（m）15-23個核苷酸單體，和（n）8-50個核苷酸單體，（o）16-23個核苷酸單體，（p）10-36個核苷酸單體，和（q）至少8個核苷酸單體。

在一個特徵中，第二股或有義股包含多個連接著的核苷酸單體以形成核鹼基序列，並且第二股或有義股至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或者完全地與第一股或反義股的連接著的區域互補。因此，第一股與第二股形成包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個鹼基對的雙股區。在一些實施方案中，有義股完全地與第一股/反義股的至少一個連接著的區域互補，且形成至少一個沒有任何錯配的雙股區。在一些實施方案中，有義股與第一股/反義股的至少一個連接著的區域互補，且形成至少一個具有1、2、3或者更多個錯配的雙股區。在一個特徵中，有義股中的錯配單體具有的核鹼基選自由A、G、C和T組成的群組或選自經修飾的核鹼基。

在一個特徵中，第二股或有義股具有的主鏈長度與第一股或反義股的長度相等。在一個實施方案中，sdDNA分子的兩股形成對稱雙股，沒有任何突出端(overhang)。在另一個實施方案中，sdDNA分子的第一股和第二股均有3’突出端或5’突出端。在某些實施方案中，sdDNA分子的兩股的3’突出端和5’突出端具有至少1、2、3、4或5個核苷酸單體的同等長度。

在一個特徵中，第二股或有義股具有的主鏈長度比第一股或反義股的長至少以下數量個的核苷酸單體：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些實施方案中，第二股的3’突出端具有的長度為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸單體，或由上述任意兩數值括起來的範圍（範圍的兩個端點值均包括在其中）。在某些實施方案中，第二股的5’突出端具有的長度為：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸單體，或由上述任意兩數值括起來的範圍（範圍的兩個端點值均包括在其中）。在本發明的一個實施方案中，第二股具有1-5個核苷酸單體的3’突出端和1-5個核苷酸單體的5’突出端（範圍的兩個端點值均包括在其中）。在另一個實施方案中，第二股具有1-8個核苷酸單體的3’突出端（範圍的兩個端點值均包括在其中）和5’平末端(blunt end)。在另一個實施方案中，第二股具有1-8個核苷酸單體的5’突出端（範圍的兩個端點值均包括在其中）和3’平末端。在另一個實施方案中，第二股具有1-10個核苷酸單體的3’突出端（範圍的兩個端點值均包括在其中）和5’凹陷端(recessed end)，或者第二股具有1-10個核苷酸單體的5’突出端（範圍的兩個端點值均包括在其中）和3’凹陷端。

在各種實施方案中，第二股或有義股具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連接著的核苷酸單體的主鏈長度，或其等值長度，或由上述任意兩數值括起來的長度範圍（範圍的兩個端點值均包括在其中）。在某些實施方案中，例如，第二股的一些長度範圍包括：（a）8-36個核苷酸單體，（b）8-33個核苷酸單體，（c）10-30個核苷酸單體，（d）10-29個核苷酸單體，（e）12-29個核苷酸單體，（f）12-28個核苷酸單體，（g）12-26個核苷酸單體，（h）12-25個核苷酸單體，（i）12-24個核苷酸單體，（j）13-25個核苷酸單體，（k）13-24個核苷酸單體，（l）13-23個核苷酸單體，（m）14-24個核苷酸單體，（n）15-23個核苷酸單體，（o）8-50個核苷酸單體，（p）16-23個核苷酸單體，（q）10-36個核苷酸單體，和（r）至少8個核苷酸單體。

在本發明sdDNA分子的一個特徵中，第一股和/或第二股中至少一個核苷酸單體是經修飾的核苷酸或核苷酸類似物，例如，經糖修飾的，主鏈經修飾的，和/或經鹼基修飾的核苷酸。在一個實施方案中，主鏈經修飾的核苷酸至少在核苷間鍵(internucleotide linkage)中具有修飾，例如包括氮雜原子或硫雜原子中的至少一個。在某些實施方案中，經修飾的核苷間鍵是或包含：硫代磷酸酯基（P=S）、磷酸三酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯(phosphoramidite)。

在某些實施方案中，第一股和/或第二股包含至少一個經修飾的核苷間鍵，其中經修飾的核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施方案中，第二股去氧核糖核苷酸單體間的至少一個核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施方案中，第一股和/或第二股的每個核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。在各種實施方案中，第一股和/或第二股的核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵與磷酸二酯鍵的混合。

在一個特徵中，本發明分子的第一股和/或第二股包括至少一個的經修飾的核苷酸或核苷酸類似物，其中經修飾的核苷酸或核苷酸類似物包含經修飾的糖基團（moiety）。在某個實施方案中，經修飾的糖基團的2’位置被選自由下列的基所取代：OR、R、鹵基、SH、SR、NH ₂、NHR、NR ₂或CN，其中每個R獨立地是C ₁-C ₆烷基、烯基或炔基，鹵基是F、Cl、Br或I。在一些實施方案中，經修飾的糖基團的2’位置被選由下列的基取代：烯丙基、氨基、疊氮基、硫代、O-烯丙基、O-C ₁-C ₁₀烷基、OCF ₃、OCH ₂F、O(CH ₂) ₂SCH ₃、O(CH ₂) ₂-O-N(R _m)(R _n)、O-CH ₂-C(=O)-N(R _m)(R _n)、或O-CH ₂-C(=O)-N(R ₁)-(CH ₂) ₂-N(R _m)(R _n)，其中每個R ₁，R _m和R _n獨立地是H或取代或未取代的C ₁-C ₁₀烷基。在一些實施方案中，經修飾的糖基團具有選自下組的取代基：5’-乙烯基、5’甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH ₃、2’-OCH ₂CH ₃、2’-OCH ₂CH ₂F、2'-O-氨基丙基化（2’-AP）和2’-O(CH2) ₂OCH ₃。在一些實施方案中，經修飾的糖基團被選自由下組的雙環糖取代：4’-(CH ₂)—O-2’(LNA)、4’-(CH ₂)—S-2’、4’-(CH ₂)2—O-2’(ENA)、4’-CH(CH ₃)—O-2’ (cEt)和4’-CH(CH ₂OCH ₃)—O-2’、4’-C(CH ₃)(CH ₃)—O-2’、4’-CH ₂—N(OCH ₃)-2’、4’-CH ₂—O—N(CH ₃)-2’、4’-CH ₂—N(R)—O-2’（其中R是H，C ₁-C ₁₂烷基或保護基）、4’-CH ₂—C(H)(CH ₃)-2’、和4’-CH ₂—C—(═CH ₂)-2’。在一些實施方案中，經修飾的糖基團選自下組：2’-O-甲氧基乙基經修飾的糖（MOE）、4’-(CH ₂)—O-2’雙環糖（LNA）、2’-去氧-2’-氟***糖（2’-F***糖，FANA）和甲基（亞甲氧基）(4’-CH(CH ₃)—O-2雙環糖（cEt）。

在本發明sdDNA分子的一個特徵中，去氧核糖核苷酸單體的糖基團是天然存在的去氧核糖核苷酸的糖基團(2-H)或2'-去氧-2'-氟***糖(FA)。

在本發明sdDNA分子的一個特徵中，核糖核苷酸單體的糖基團選自：天然存在的核糖核苷酸(2-OH)、2’-F修飾的糖、2’-OMe修飾的糖、2’-O-甲氧基乙基修飾的糖（MOE）、4’-(CH ₂)—O-2’雙環糖（LNA）和甲基（亞甲氧基）(4’-CH(CH ₃)—O-2雙環糖（cEt）。

在一個特徵中，本發明分子的第一股和/或第二股包括至少一個核苷酸單體，其中核苷酸單體包含經修飾的核鹼基。在一些實施方案中，經修飾的核鹼基選自下組：5-甲基胞嘧啶（5-Me-C）；次黃嘌呤核苷鹼基；三苯甲基化鹼基；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶；5-鹵代尿嘧啶以及胞嘧啶；5-丙炔基（-C≡C-CH ₃）尿嘧啶以及胞嘧啶以及嘧啶鹼基的其它炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶；5-尿嘧啶（假尿嘧啶）；4-硫尿嘧啶；1-甲基-假尿嘧啶；8-鹵基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基以及其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-鹵代（特別是5-溴代）、5-三氟甲基、5-甲基尿苷以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-氨基腺嘌呤；8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤；7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤；以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。在特定實施方案中，經修飾的核鹼基是5-甲基胞嘧啶。在一個實施方案中，本發明分子的每個胞嘧啶鹼基是5-甲基胞嘧啶。在一個實施方案中，本發明sdDNA分子的ISR中每個尿苷鹼基是5-甲基尿苷。

在一個特徵中，現發明的sdDNA可能包含至少一個CpG基序（motif），其中CpG基序可以被例如Toll樣受體的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）所識別。

在一個特徵中，本發明分子的第一股和/或第二股與配體或基團相綴合（conjugated）。在某個實施方案中，配體或基團選自下組：多肽/蛋白質、抗體、多聚物、多糖、脂質、疏水基團或分子、陽離子基團或分子、親脂性化合物或基團、寡核苷酸、膽固醇、GalNAc和核酸適體（aptamer）。

在本發明的一個特徵中，sdDNA分子用於調節細胞（例如真核細胞，如哺乳動物細胞）中的基因表現或功能。

在某些實施方案中，標靶RNA，根據本發明原理決定了sdDNA分子的至少部分核苷酸單體序列，選自mRNA或非編碼RNA，其中這些RNA或者編碼與疾病有關的蛋白質或者調控與疾病有關的部分生物學通路。在各種實施方案中，這種標靶RNA可選自：與人類或動物的疾病或病症有關的基因的mRNA；致病微生物的基因的mRNA；病毒RNA、和與選自由自身免疫性疾病、發炎性疾病、退行性疾病、傳染性疾病、增殖性疾病、代謝性疾病、免疫介導的紊亂、過敏性疾病、皮膚病、惡性病、胃腸道疾病、呼吸系統疾病、心血管疾病、腎臟疾病、類風濕性疾病、神經系統疾病、內分泌紊亂、和衰老相關疾病或紊亂組成的群組的疾病或紊亂有關的RNA。

在一個實施方案中，本發明提供一種短雙股DNA（sdDNA）分子，其包含第一股和第二股，每股包含連接著的核苷酸單體，其中核苷酸單體選自下組：核苷酸、其類似物和經修飾的核苷酸，其中：（a）第一股與第二股的長度相等，或第一股比第二股的長度短選自由以下數量個單體組成的單體：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；（b）第一股通過至少一個靶向區與標靶RNA的標靶片段基本上互補，其中第一股由8-36個（範圍的兩個端點均包括在其中）通過鍵連接著的核苷酸單體組成，其中鍵選自由相鄰單體間的硫代磷酸酯鍵、磷酸二酯鍵、和硫代磷酸酯鍵與磷酸二酯鍵的混合組成的群組；（c）第二股與第一股基本上互補，與第一股形成至少一個雙股區，其中第二股由10-36個（範圍的兩個端點均包括在其中）通過鍵連接著的核苷酸單體組成，其中鍵選自由相鄰單體間的硫代磷酸酯鍵、磷酸二酯鍵、和硫代磷酸酯鍵與磷酸二酯鍵的混合組成的群組；（d）sdDNA分子包含至少一個核糖核苷酸單體間隔片段（ISR）與至少一個去氧核糖核苷酸單體相連，其中去氧核糖核苷酸單體選自由去氧核糖核苷酸、其類似物和經修飾的去氧核糖核苷酸組成的群組；（e）sdDNA分子的ISR包含至少一個核糖核苷酸單體，其中核糖核苷酸單體選自由核糖核苷酸、其類似物和經修飾的核糖核苷酸組成的群組。在一個特徵中，sdDNA分子用於調節細胞（例如真核細胞，如哺乳動物細胞）中的標靶基因表現或功能。在另一個特徵中，sdDNA分子在細胞中使標靶基因表現的靜默作用比相應的ASO更強或更有效。

第二方面，本發明提供了一種藥物組合物，包含作為活性劑的第一方面的組合物，和其藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。此類載體的實例包括，但不限於：藥物載體、正電荷載體、脂質體、脂質奈米顆粒、蛋白質載體、疏水基團或分子、陽離子基團或分子、GalNAc、多糖聚合物、奈米顆粒、奈米乳劑、膽固醇、脂質、親脂性化合物或基團、以及類脂(lipoid)。

第三方面，本發明提供了一種使用第一方面的組合物或第二方面的藥物組合物以治療或預防疾病或病症的方法，通過施用治療有效量的本發明的sdDNA分子或包含該sdDNA分子的藥物組合物。施用方法選自以下途徑：靜脈注射（iv）、皮下注射（sc）、口服（po）、肌肉注射（im）、經口施用、吸入、局部、鞘內和其它部位的施用方式。

在一個特徵中，被預防性或治療性治療的疾病或病症選自下組：癌症、自身免疫性疾病、發炎性疾病、退行性疾病、傳染性疾病、增殖性疾病、代謝性疾病、免疫介導的紊亂、過敏性疾病、皮膚病、惡性病、胃腸道疾病、肝臟疾病、呼吸系統疾病、心血管疾病、皮膚病、腎臟疾病、類風濕疾病、神經系統疾病、精神疾病、內分泌紊亂和與衰老相關疾病或紊亂。

第四方面，本發明提供了一種使用第一方面的組合物或第二方面的藥物組合物以調控或調節真核細胞中的基因表現或基因功能的方法。該方法包括以下步驟：使細胞與有效量的本發明的任一sdDNA分子或包含該sdDNA分子的藥物組合物接觸。

在一個實施方案中，所述接觸步驟包括以下步驟：將包含所述sdDNA分子的組合物引入可以發生選擇性基因靜默的培養中的標靶細胞或生物體中。在進一步的實施方案中，引入步驟是選自由以下組成的群組：簡單混合、轉染、脂質轉染、電穿孔、感染、注射、經口施用、靜脈注射（iv）、皮下注射（sc）、口服（po）、肌肉內（im）注射、吸入、局部、鞘內和和其它部位的施用方式。在另一個實施方案中，引入步驟包含使用藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑，其中藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑選自下組：包括藥物載體、脂質奈米顆粒、正電荷載體、脂質體、蛋白質載體、疏水基團或分子、陽離子基團或分子、GalNAc、多糖聚合物、奈米顆粒、奈米乳劑、膽固醇、脂質、親脂性化合物或基團、以及類脂。

在某些實施方案中，標靶基因是mRNA。在某些實施方案中，標靶基因是例如microRNA和IncRNA的非編碼RNA。

在一個實施方案中，標靶基因與哺乳動物的疾病、病理狀況或不良狀況相關。在進一步的實施方案中，標靶基因是病原微生物的基因。在更進一步的實施方案中，標靶基因是病毒基因。在另一個實施方案中，標靶基因是腫瘤相關基因。在又一個實施方案中，標靶基因是與選自在第三方面列出的疾病群組相關的基因。

在另一方面，本發明提供的一種寡聚雙股包含（a）一個或多個去氧核糖核苷、其類似物或經修飾的去氧核糖核苷，和（b）一個或多個ISR連接到至少8個核鹼基長度的反義序列中，其中ISR包含核糖核苷，其類似物或經修飾的核糖核苷。反義序列至少70%與標靶序列互補。

根據本文提供的附加描述（包括不同的實施例），本發明的其它特徵和優點是顯而易見的。所提供的實施例示出了在實施本發明時有用的不同組分和方法。實施例不限制所要求保護的發明。根據本公開的內容，本領域的技術人員可以確認和採用對實施本發明有用的其它組分和方法。儘管已經顯示和描述了幾個實施方案，但是在不脫離本發明的精神和範圍的情況下可以進行任何修改。

發明詳述

本發明涉及短雙股DNA的基因或RNA調節/靜默技術。這項新技術通過使用短雙股DNA（sdDNA）組合物用於在體外和體內調節基因表現或功能。本發明還提供了使用該組合物調節標靶基因的表現或功能，或用於治療或預防疾病以及用於其它醫學和生物學應用的方法。這些組合物和方法在調控基因表現或基因功能方面提供了高效力，而且還降低了劑量依賴性毒性。 1．定義

如本文所使用的，除非上下文另有明確規定，單數形式的「一」、「一個」、「該」包括其複數形式。例如：術語「一個細胞」包含多個細胞，包括它們的混合物。

當術語「約」與數值範圍結合使用時，它通過擴展這些數值的上下邊界來限定該範圍。一般而言，術語「約」在本文中用於以高於和低於設定值20%、10%、5%或1%的變化幅度來限定該數值。在一些實施方案中，術語「約」用於以高於和低於設定值10%的變化幅度來限定該數值。在一些實施方案中，術語「約」用於以高於和低於設定值5%的變化幅度來限定該數值。在一些實施方案中，術語「約」用於以高於和低於設定值1%的變化幅度來限定該數值。

如本文所使用的，術語「類似（analog）」或「類似物（analogue）」可互換地表示功能上或結構上等效。例如，幾十年來核苷和核苷酸類似物一直用於癌症和病毒感染的臨床治療，且研究人員和製藥行業在不斷合成和評估新化合物，參見，例如Jordheim L.P. et al., Nat Rev Drug Discov12, 447-464 (2013)。

如本文所使用的，術語「去氧核糖核苷單體」是指包括天然存在的去氧核糖核苷、其類似物和經修飾的去氧核糖核苷的核苷單體。術語「去氧核糖核苷酸單體」是指包括天然存在的去氧核糖核苷酸、其類似物和經修飾的去氧核糖核苷酸的核苷酸單體。

如本文所使用的，術語「核糖核苷單體」是指包括天然存在的核糖核苷、其類似物和經修飾的核糖核苷的核苷單體。術語「核糖核苷酸單體」是指包括天然存在的核糖核苷酸、其類似物和經修飾的核糖核苷酸的核苷酸單體。

如本文所使用的，術語「核苷」是指包含核鹼基基團和糖基團的化合物。核苷單體包括，但不限於天然存在的核苷（例如，分別在DNA和RNA中發現的去氧核糖核苷和核糖核苷）、其類似物和經修飾的核苷。核苷單體可以是去氧核糖核苷單體或核糖核苷單體。例如，核苷單體可以與磷酸基團相連接以形成核苷酸單體。

如本文所使用的，術語「核苷酸」是指核苷進一步包含磷酸連接基。核苷酸單體包括，但不限於天然存在的核苷酸（例如，分別在DNA和RNA中發現的去氧核糖核苷酸和核糖核苷酸）、其類似物和經修飾的核苷酸。核苷酸單體可以是去氧核糖核苷酸單體或核糖核苷酸單體。經修飾的核苷酸可以在以下中的一處或多處被修飾：含氮核鹼基基團、五碳糖基團和導致核苷間鍵變化的磷酸連接基。

如本文所使用的，術語「寡核苷酸（縮寫為oligo）」或「寡核苷酸（oligonucleotide）」是指包含多個連接著的核苷單體的化合物。在某些實施方案中，一個或多個核苷單體被修飾，或一個或多個核苷間鍵被修飾。

術語「去氧核苷」和「去氧核糖核苷」在本文中可互換地使用。術語「去氧核苷酸」和「去氧核糖核苷酸」在本文中也可互換地使用。如本文所使用的，「去氧核苷」或「去氧核苷酸」分別是含有去氧的糖基團的核苷或核苷酸。

如本文所使用的，在「短雙股DNA（sdDNA）」中的術語「雙股DNA」是指由兩條核苷酸單體股組成的分子，他們相互雜交形成雙股寡核苷酸，並與細胞接觸或施用於受試者，其中關鍵的RNA靶向的基序中的大多數，即50%或更多的，相連的核苷酸單體是去氧核糖核苷酸單體，包含經修飾的去氧核糖核苷酸。

如本文所用，術語「基序（motif）」是諸如在反義股或有義股中的化學上不同的區域的模式。

如本文所使用的，術語「緊鄰」是指在兩個元件之間，例如在區域、片段、核苷酸和/或核苷之間不存在介入的元件。

如本文所使用的，術語「經修飾的核苷酸」是指具有至少一個經修飾的糖基團、經修飾的核苷間鍵和/或經修飾的核鹼基的核苷酸。

如本文所使用的，術語「經修飾的核苷」是指具有至少一個經修飾的糖基團和/或經修飾的核鹼基的核苷。

如本文所使用的，術語「經修飾的寡核苷酸」是指包含至少一個經修飾的核苷酸的寡核苷酸。

如本文所使用的，術語「天然存在的核苷間鍵」是指3’至 5’的磷酸二酯鍵。

如本文所使用的，術語「經修飾的核苷間鍵」是指來自天然存在的核苷間鍵的取代或任何變化。例如，硫代磷酸酯鍵是一種經修飾的核苷間鍵。

如本文所使用的，術語「天然的糖基團」是指天然存在於DNA(2-H)或RNA(2-OH)中的糖。

如本文所使用的，術語「經修飾的糖」是指來自天然的糖基團的取代或變化。例如，經2'-O-甲氧基乙基修飾的糖是一種經修飾的糖基團。

如本文所使用的，術語「雙環糖」是指通過橋接兩個非雙環原子而修飾的呋喃糖基（furosyl）環。雙環糖是一種經修飾的糖。

如本文所使用的，術語「雙環核酸」、「BNA」、「雙環核苷」或「雙環核苷酸」是指核苷或核苷酸的呋喃糖基團包括連接呋喃糖環上的兩個碳原子的橋連基從而形成雙環糖系統的核苷或核苷酸。

如本文所使用的，術語「2'-O-甲氧基乙基」（也稱為2'-MOE、2'-O(CH ₂) ₂—OCH ₃和2'-O-(2-甲氧基乙基)）是指呋喃糖基環的2'位置被O-甲氧基乙基修飾。經2'-O-甲氧基乙基修飾的糖是一種經修飾的糖。如本文所使用的，術語「2'-O甲氧基乙基核苷酸」（也稱為2'-MOE RNA）是指一種包含經2'-O甲氧基乙基修飾的糖基團的修飾的核苷酸。

如本文所使用的，術語「經修飾的核鹼基」是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之外的任何核鹼基。例如，5-甲基胞嘧啶是一種經修飾的核鹼基。相反地，如本文中所使用的「未經修飾的核鹼基」是指嘌呤鹼基的腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G），以及嘧啶鹼基的胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。

如本文所使用的，術語「5-甲基胞嘧啶」是指連接於5'位置的甲基基團修飾的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是一種經修飾的核鹼基。

如本文所使用的，「RNA樣核苷酸」是指一種在摻入寡核苷酸時採用Northern構型並且功能類似RNA的經修飾的核苷酸。RNA樣核苷酸包括，但不限於：2'-內呋喃糖核苷酸、橋接核酸（BNA）、LNA、cEt、2'-O-甲基化核酸、2'-O-甲氧基乙基化（2'-MOE）核酸酸、2'-氟化核酸、2'-O-氨丙基化（2'-AP）核酸，己糖醇核酸（HNA）、環己烷核酸（CeNA）、肽核酸（PNA）、乙二醇核酸（GNA）、蘇糖核酸（TNA）、嗎啉代核酸、三環DNA（tcDNA）和RNA替代物。

如本文所使用的，「DNA樣核苷酸」是指一種在摻入寡核苷酸時功能類似於DNA的修飾核苷酸。DNA樣核苷酸包括，但不限於2'-去氧-2'-氟***糖（FANA）核苷酸和DNA替代物。

如本文所使用的，「非編碼RNA」是指不轉譯成蛋白質的RNA分子。非編碼RNA的例子包括轉運RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA），以及小非編碼RNA和長ncRNA（lncRNA）。如本文所使用的，「小非編碼RNA」的例子包括，但不限於：microRNA（miRNA）、asRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA和任何前述模擬物（mimic）。如本文所使用的，「lncRNA」、「長非編碼RNA」是一種包含超過200個不編碼蛋白質的核苷酸的轉錄的RNA分子。LncRNA還可以進行常見的轉錄後修飾，包括5’-加帽（5’-capping）、3’-多聚腺苷酸化（3’-adenylation）和剪接。一般來說，IncRNA是一類多樣化的分子，在調控基因和基因組的功能中發揮著各種作用。例如，眾所周知lncRNAs調控基因轉錄、轉譯和表觀遺傳調控。IncRNA的實例包括，但不限於：Kcnqlotl、Xlsirt、Xist、ANRIL、NEAT1、NRON、DANCR、OIP5-AS1、TUG1、CasC7、HOTAIR和MALAT1。如本文所使用的，「剪接」是指去除不必要的RNA區域並改造RNA的自然過程。通過寡核苷酸，包括其雙股，調節RNA靶功能的一個例子是對非編碼RNA功能的調節。在一些實施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸雙股是為靶向前述的小非編碼RNA之一設計的。在一些實施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸雙股是為靶向miRNA設計的。在一些實施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸雙股是為靶向pre-miRNA設計的。在一些實施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸雙股是為靶向lncRNA設計的。在一些實施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸雙股是為靶向剪接體設計的。

如本文所使用的，術語「分離的」或「純化的」是指材料基本上不含在其天然狀態下通常伴隨它的組分。純度和均一性通常使用分析化學技術來確定，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳法或高效液相色譜法。

如本文所使用的，術語「間隔（的）」是指在相鄰空間具有不同種類的基團，例如，不同種類的核苷酸或核苷酸類似物、相同種類的核苷酸或核苷酸類似物的不同修飾。在本發明的各種實施方案中，「核糖核苷酸單體間隔片段（ISR）」是指在寡核苷酸股中的一段核糖核苷酸，其具有一個或多個核糖核苷酸，並與至少一個與所述核糖核苷酸不同種類的基團連接著。例如：如果所述核糖核苷酸是未修飾的，則不同種類的基團可以是去氧核苷酸或其類似物、經修飾的去氧核苷酸、經修飾的核糖核苷酸或核糖核苷酸類似物。如果所述核糖核苷酸是經修飾的，則不同種類的基團可以是去氧核苷酸或其類似物、經修飾的去氧核苷酸、未經修飾的核糖核苷酸、經不同修飾的核糖核苷酸或不同種類的核糖核苷酸類似物。

如本文所使用的，「調節」、「調控」及其語法上的等同物指的是增加或減少（例如靜默），換句話說，上調或下調。如本文所使用的，「基因靜默」是指基因表現的減少，並且可以指標靶基因的基因表現減少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。

如本文所使用的，當用於生物活性的語境中時，術語「抑制」、「以抑制」及其語法上的等同物是指生物活性的下調，可能降低或消除標靶功能（例如蛋白質的產生，或分子磷酸化）。在特定實施方案中，抑制可指標靶活性降低約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。當用於紊亂或疾病的語境中使用時，該術語指成功預防症狀的發作、減輕症狀或消除疾病、狀況（疾病）或紊亂。

如本文所使用的，術語「基本上互補的」或「互補的」是指在具有連接著的核苷的兩股之間的鹼基配對在雙股區中的互補性，而不是任何單股區（例如末端的突出端或兩個雙股區域之間的間隙區）。互補性是不需要完全的；例如，在兩條具有連接著的核苷的股之間可能存在任意數量的鹼基對錯配。然而，如果錯配的數目眾多以至於即使在最不嚴格的雜交條件下也不會發生雜交，則該序列不是基本上互補的序列。具體而言，當在本文中的兩個序列被稱為「基本上互補」時，是指這些序列彼此充分互補，可在選擇的反應條件下雜交。足以實現特異性的核酸互補性和雜交嚴格性的關係是本領域熟知的。兩條基本上互補的股可以是例如，完全互補的，或可以包含1個到多個錯配，只要雜交條件足以允許，例如區分配對序列和非配對序列。因此，基本上互補的序列可以指在雙股區中具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%、或介於上述任意兩數位之間任何數位的鹼基對互補性序列。

如本文所使用的，「完全互補」或「100％互補」是指具有連接著的核苷的第一股的核苷鹼基序列中的每個核苷鹼基在具有連接著的核苷的第二股的第二核苷鹼基序列中具有互補的核苷鹼基。在某些實施方案中，具有連接著的核苷的第一股是反義化合物，具有連接著的核苷的第二股是標靶核酸。在某個實施方案中，具有連接著的核苷的第一股是有義化合物，具有連接著的核苷的第二股是反義化合物，反之亦然。

如本文所使用的，術語「靶向區」是指寡核苷酸股中與另一條寡核苷酸股基本上或完全互補的區域，使得在合適的條件下，兩條股在該靶向區處彼此雜交或黏合。例如，反義股可以包括靶向區域，通過該靶向區域其可以與標靶mRNA雜交。

術語「施用」（「administer」、「administering」、「administration」）在本文中以其最寬泛的含義使用。這些術語是指給受試者引入本文所述的化合物或藥用組合物的任何方法，可以包括，例如，全身地、局部地或原位地將所述化合物引入給受試者。因此，本文公開的化合物由組合物（無論組合物是否包括該化合物）在受試者體內產生的包含在這些術語中。當這些術語與「全身的」或「全身地」結合使用時，它們通常指化合物或組合物在體內全身的吸收或蓄積在血液中，隨後在全身分佈。

如本文中所使用的，術語「有效量」和「治療有效量」是指足以影響預期結果的本文所述的化合物或藥物組合物的量，所述預期結果包括但不限於疾病治療，如下所示。在一些實施方案中，「治療有效量」是指能夠對以下的有效的量：可檢測到的殺死或抑制癌細胞的生長或擴散、腫瘤的大小或數量、和/或癌症的程度、階段、進展和/或嚴重程度的其他測量。在一些實施方案中，「治療有效量」是指全身，局部或原位施用的量（例如，在受試者中原位產生的化合物的量）。治療有效量可以根據預期應用（體外或體內）或所治療的受試者和疾病狀況而變化（例如受試者的體重和年齡、疾病狀況的嚴重程度、施用方式等等），這些可以由本領域的普通技術人員容易地確定。該術語也適用於在標靶細胞中誘導特定反應的劑量，例如，減少細胞遷移。具體劑量可以根據以下而變化：例如，特定的藥物組合物、受試者及其年齡和現有的健康狀況或健康狀況的風險、要遵循的劑量方案、疾病的嚴重程度、是否與其它藥劑聯合施用、施用時間、施用的組織以及載有它的物理遞送系統。

在受試者中，術語「癌症」是指存在具有致癌細胞典型特徵的細胞，例如不受控制的增殖、永生性、轉移潛能、快速生長和增殖率以及某些形態特徵。通常，癌細胞會以腫瘤或腫塊的形式存在，但癌細胞也可能單獨存在於受試者體內，或者可能作為獨立的細胞在血流中循環，例如白血病或淋巴瘤細胞。如本文所用的癌症的實例包括，但不限於：肺癌、胰腺癌、骨癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚黑色素瘤或眼內黑色素瘤、乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、腹膜癌、結腸癌、直腸癌、結直腸腺癌、肛門區域癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、胃腸癌、胃腺癌、腎上腺皮質癌（adrenocorticoid carcinoma）、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、***癌、外陰癌、霍奇金病、食道癌、胃食管結合部癌、胃食道腺癌、軟骨肉瘤、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尤文氏肉瘤、尿道癌、陰莖癌、***癌、膀胱癌、睾丸癌、輸尿管癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、腎癌、腎細胞癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、中樞神經系統（CNS）腫瘤、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤、包括上述任何癌症的難治情形、或上述癌症中的一種或多種的組合。一些示例的癌症包括在一般術語中並且包括在本術語中。例如，一般術語泌尿系統癌症包括膀胱癌、***癌、腎癌、睾丸癌等；而另一個一般術語肝膽系統癌症包括肝癌（其本身是包括肝細胞癌或膽管癌在內的一般術語）、膽囊癌、膽管癌或胰腺癌。本公開的內容涵蓋泌尿系統癌症和肝膽系統癌症，並包括在術語「癌症」中。

術語「藥物組合物」是含有諸如本文所公開的分子或組合物作為活性成分的製劑，通常與其它物質（例如藥物載體，如無菌水）混合以形成適合施用於受試者的形式。在一個實施方案中，藥物組合物是散裝形式或單位劑型。單位劑型是多種形式中的任一種，包括，例如：膠囊、IV袋、片劑、氣溶膠吸入器上的單泵、或小瓶。組合物的單位劑量中活性成分的量是一種有效量並且根據所涉及的具體治療而變化。本領域技術人員將理解有時需要根據患者的年齡和狀況對劑量進行常規調整。劑量還將取決於施用途徑。多種途徑被考慮，包括口服、肺部、直腸、腸胃外、透皮、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、鼻內等。本發明的sdDNA的局部或透皮施用的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳膏劑、乳液、凝膠、溶液劑、貼劑和吸入劑。

術語「藥劑」是指當施用於個體時可提供治療獲益的物質。

術語「藥學上可接受的載體」是指不干擾化合物結構的介質或稀釋劑。某些這樣的載體能夠使藥物組合物配製成例如片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體製劑、凝膠、糖漿劑、漿液、懸浮液和***錠以便由受試者口服攝入。某些這樣的載體能夠使藥物組合物配製用於注射、輸注或局部施用。例如，藥學上可接受的載體可以是無菌水溶液。

術語「藥學上可接受的衍生物」包括本文所述化合物的衍生物，例如溶劑化物、水合物、酯、前藥、多晶型化合物（polymorphs）、異構物、同位素標記的變體、藥學上可接受的鹽和本領域已知的其它衍生物。

術語「藥學上可接受的鹽」是指化合物在生理學和藥學上可接受的鹽，即保留母化合物所需的生物活性且不會賦予其不需要的毒理學作用的鹽。術語「藥學上可接受的鹽」或「鹽」包括由母化合物與藥學上可接受的無毒的酸或鹼（包括無機或有機的酸和鹼）反應製備的鹽。本文所述的化合物的藥學上可接受的鹽可以通過本領域熟知的方法製備。關於藥學上可接受的鹽的綜述，參見Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use（Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002）。藥學上可接受的鹽包括，但不限於：包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽和酒石酸鹽的酸加成鹽；如Na、K、Li的鹼金屬陽離子鹽，如Mg或Ca的鹼土金屬鹽，或有機胺鹽。特別地，寡核苷酸的鈉鹽已被證明是可用的並且被普遍接受用於治療性施用於人類。因此，在一個實施方案中，本文所述的化合物是鈉鹽形式。

如本文所使用的，術語「受試者」是指任何動物（例如哺乳動物），包括，但不限於人類、非人類靈長類動物、齧齒類動物等，受試者是特定治療的接受者。通常，就人類受試者而言，術語「受試者」和「患者」在本文可互換地使用。

如本文所使用的，術語如「治療（treating）」、「治療（treatment）」、「以治療（to treat）」、「減輕（alleviating）」或「以減輕（to alleviate）」是指（1）診斷的病理病症或紊亂的治癒、減緩、症狀減輕和/或進展停止的治療措施，和（2）預防或減緩標靶病理狀況（condition ）或紊亂（disorder ）的預防性（prophylactic）或防預性（preventative）措施。因此那些需要治療的人，包括那些已經患有這種紊亂的人；那些容易發生紊亂的人；以及那些需要預防紊亂的人。如果受試者表現出以下一項或多項，則表示根據本發明的方法成功地「治療」了該受試者：癌細胞的數量減少或完全不存在；腫瘤大小減小；癌細胞浸潤到外周器官（包括癌症擴散到軟組織和骨骼中）的抑制或不存在；腫瘤轉移的抑制或不存在；腫瘤生長的抑制或不存在；與特定癌症相關的一種或多種症狀的緩解；發病率和死亡率的降低；和生活品質的提高。

如本文所使用的，術語「載體」是指藥學上可接受的材料、組合物或載體，例如，參與或能夠將主體藥物化合物由一種器官或身體部分攜帶或運輸至另一器官或身體部分的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。就與製劑中的其它成分相容且對患者無害這一意義上而言，各載體必須是「可接受的」。藥學上可接受的賦形劑、載體和/或稀釋劑的非限制性實例包括：例如乳糖、葡萄糖和蔗糖的糖類；例如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉的澱粉；如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素的纖維素及其衍生物；粉狀黃蓍膠；麥芽（malt）；明膠；滑石粉；例如可哥脂和栓劑蠟的賦形劑；例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油的油類；例如丙二醇的二醇類；例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇的多元醇；例如油酸乙酯和月桂酸乙酯的酯類；瓊脂；例如氫氧化鎂和氫氧化鋁的緩衝劑；海藻酸；無熱原水；等張鹽水；Ringer's溶液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；和其它用於藥物製劑的無毒相容物質。潤濕劑、乳化劑和潤滑劑（例如月桂基硫酸鈉、硬脂酸鎂和聚環氧乙烷-聚環氧丙烷共聚物）、以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑和香料劑、防腐劑和抗氧化劑也可存在於組合物中。 2．某些實施方案—sdDNA結構骨架

本發明的某些實施方案提供了一種雙股組合物，其中反義股和有義股均由連接著的核苷單體組成。在關鍵RNA靶向基序中，50%或更多的核苷單體是去氧核糖核苷單體，或者50%或更多的核鹼基對在sdDNA分子雙股區的一股中包含去氧核糖核苷單體，其中包含的一些去氧核糖核苷單體和/或核苷間鍵可以是修飾的，即對源自天然DNA中的那些結構的修飾。本發明的雙股DNA進一步的包含一個或多個在核糖核苷酸單體間隔片段（ISR）中的核糖核苷單體。一個或多個ISR可能存在於反義股或有義股，或兩者中均存在。在一些實施方案中，每個ISR獨立地由1個核糖核苷酸單體組成，或由2、3、4、5或6個連續的核糖核苷酸單體組成。在一些實施方案中，ISR具有至少兩個連續的且連接著的核糖核苷酸單體。

本發明的短雙股DNA（sdDNA）的反義股和有義股都相對短，其中有義股的長度至少與反義股的長度相等，因此稱作「短雙股DNA（sdDNA）」。進一步地，在某些實施方案中，由於兩股的長度相同，本發明的雙股分子可更具體地稱為「對稱短雙股DNA」。

圖 1A 、 2A 、 4A 、 5A 、 6A 和 7A顯示了本發明的雙股分子的示例性結構和序列，其中ISR在兩股中均存在或僅存在於反義股中。

在一些實施方案中，相同長度的反義股和有義股形成沒有任何突出端的對稱結構。

本發明的組合物可用於以至少三種方式調節真核細胞中的基因表現或功能：（i）使一種sdDNA分子與細胞接觸或施用於受試者；（ii）使不同種類的sdDNA分子在不同時間與細胞接觸或不同時間分別地施用於受試者；（iii）使不同種類的sdDNA分子同時與細胞接觸或施用於受試者。

在某些實施方案中，反義寡核苷酸股包括被稱為「靶向區」的核鹼基序列區，其至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90 %、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%與所靶向的標靶基因的標靶片段互補，其中標靶基因包括mRNA和非編碼RNA。在某些實施方案中，反義寡核苷酸股具有的核鹼基序列包含與靶向的標靶基因的標靶片段完全互補的序列。在某些實施方案中，反義寡核苷酸股具有的核鹼基序列，當其與靶向的標靶RNA的標靶片段雜交時，包含不超過1、2或3個的錯配。在某些實施方案中，標靶基因選自與哺乳動物疾病有關的mRNA或非編碼RNA。在某些實施方案中，至少一個ISR分佈在反義股的靶向區。在某些實施方案中，ISR位於或者靠近（即在該股長度的三分之一以內，例如，對於大約21個核鹼基長的股，從末端起數的7個核鹼基以內）反義股的5’端。可選的，ISR位於或者靠近（即在該股長度的三分之一以內，例如，對於大約21個核鹼基長的股，從末端起數的7個核鹼基以內）反義股的3’端。在一些實施方案中，ISR或至少ISR的一部分也位於反義股的更中心的部分，即在反義股長的中間三分之一長度處，例如，對於約21個核鹼基長的反義股，距反義股兩端都超過7個核鹼基的位點。

在各種實施方案中，第一股或反義股具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連接著的核苷酸單體的主鏈長度，或其等值長度，或由上述任意兩數值括起來的長度範圍（範圍的兩個端點值均包括在其中）。例如，第一股或反義股的一些長度範圍包括：8-50個核苷酸單體；8-36個核苷酸單體；8-33個核苷酸單體；10-36個核苷酸單體；10-30個核苷酸單體；10-29個核苷酸單體；12-36個核苷酸單體；12-29個核苷酸單體；12-28個核苷酸單體；12-26個核苷酸單體；12-25個核苷酸單體；13-25個核苷酸單體；13-24個核苷酸單體；13-23個核苷酸單體；14-24個核苷酸單體；15-23個核苷酸單體；和16-23個核苷酸單體；和至少8核苷酸單體。

在某些實施方案中，反義寡核苷酸股的長度為10到36個（範圍的兩個端點值均包括在其中）核苷酸單體。換句話說，反義股是10到36個（範圍的兩個端點值均包括在其中）連接著的核鹼基單體。在其它實施方案中，反義股包含經修飾的寡核苷酸，其由8至100、10至80、12至50、14至30、15至23、16至22、16至21或20個（範圍的兩個端點值均包括在其中）連接著的核鹼基組成。

在某些實施方案中，反義寡核苷酸股由14-23個（範圍的兩個端點值均包括在其中）連接著的核苷單體組成。在某些實施方案中，反義寡核苷酸股由20個連接著的核苷單體組成。在某些實施方案中，反義寡核苷酸股由16個連接著的核苷單體組成。

在某些實施方案中，有義股包含與反義股基本上互補的核鹼基序列，並且其核鹼基序列至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%（以有義股的全部核鹼基序列為計）與反義寡核苷酸連接著的區域的序列互補。這些來自兩股的基本上互補的序列形成一個或多個雙股區。在某些實施方案中，有義股具有包含與反義股連接著的區域的序列完全互補的核鹼基序列。因此，兩股形成包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個鹼基對的雙股區。在一些實施方案中，至少一個ISR分佈於有義股的雙股區。

在某些實施方案中，ISR位於或者靠近（從所述末端起數的核鹼基總數33%內）有義股的5’端，或ISR位於或者靠近（從所述末端起數的核鹼基總數33%內）有義股的3’端。在一些實施方案中，ISR或ISR的至少一部分也位於有義股的更中心部分，即距有義股兩端都超過核鹼基總數33%的位點。在一些實施例中，ISR分佈在有義股中不是必需的。

在一個特徵中，有義寡核苷酸股的長度與反義寡核苷酸股的長度相等或比反義寡核苷酸股的長度長。在某些實施方案中，有義股具有從反義股的全長個數到比反義股長16個連接著的核鹼基的長度。在某些實施方案中，有義股的長度為6至66個（範圍的兩個端點值均包括在其中）核苷酸單體。換句話說，有義股是6至66個（範圍的兩個端點值均包括在其中）連接著的核鹼基單體。在其它實施方案中，有義股包含由20至21、8至36、10至30、12至25、14至24或16至23個（範圍的兩個端點值均包括在其中）連接著的核鹼基組成的寡核苷酸。在某實施方案中，有義股包含寡核苷酸，其中寡核苷酸的長度由以下的連接著的核鹼基組成：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66個，或由上述任意兩數值定義的範圍（範圍的兩個端點值均包括在其中）。在一些實施方案中，有義股是有義寡核苷酸。

在一個特徵中，第二股或有義股的長度與第一股或反義股的相等。在某些實施方案中，雙股的兩末端均為平末端。在另一個特徵中，第二股或有義股具有的主鏈長度比第一股或反義股的長至少以下數量個核苷酸單體：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。在各種實施方案中，第二股或有義股具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66個連接著的核苷酸單體的主鏈長度，或其等值長度，或由上述任意兩數值括起來的長度範圍（範圍的兩個端點值均包括在其中）。例如，在某些實施方案中，第二股（有義股）的一些長度範圍包括：6-66個核苷酸單體，8-50個核苷酸單體，8-40個核苷酸單體，8-36個核苷酸單體，8-33個核苷酸單體，10-36個核苷酸單體，10-30個核苷酸單體，10-29個核苷酸單體，12-29個核苷酸單體，12-28個核苷酸單體，12-26個核苷酸單體，12-25個核苷酸單體，12-24個核苷酸單體，13-25個核苷酸單體，13-24個核苷酸單體，13-23個核苷酸單體，14-24個核苷酸單體，15-23個核苷酸單體，16-23個核苷酸單體，和至少8個核苷酸單體。

在某些實施方案中，有義股比反義股長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個核苷酸單體。在某些實施方案中，有義股由8-36個（範圍的兩個端點值均包括在其中）連接著的核苷單體組成。在某些實施方案中，有義股由13個連接著的核苷單體組。在某些實施方案中，有義股由14個連接著的核苷單體組成。

在本發明的某些實施方案中，sdDNA分子的兩股形成對稱雙股，沒有任何突出端。在各種另外地實施方案中，第一股（反義股）的兩個末端是以下配置中的一種：3’突出端和5’平末端，5’突出端和3’平末端，3’突出端和5’凹陷端，3’凹陷端和5’突出端，或3’凹陷端和5’凹陷端。

在某些實施方案中，有義股的3’突出端具有的長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸單體。在各種實施方案中，有義股的3’突出端具有的長度為1-8、1-5、1-3、或1-2個核苷酸單體（範圍的兩個端點值均包括在其中）。

在某些實施方案中，有義股的5’突出端具有的長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸單體。在各種實施方案中，有義股的5’突出端具有的長度為1-8、1-5、1-3、或1-2個核苷酸單體（範圍的兩個端點值均包括在其中）。

在本發明sdDNA分子中，第一股和/或第二股中至少一個核苷酸單體可以是經修飾的核苷酸或核苷酸類似物，例如經糖修飾的，主鏈經修飾的，和/或經鹼基修飾的核苷酸。在一個實施方案中，主鏈經修飾的核苷酸在核苷間鍵中具有至少一個修飾，例如包括氮雜原子或硫雜原子中的至少一個。在一些實施方案中，經修飾的核苷間鍵是或包含：硫代磷酸酯基（P=S）、磷酸三酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。

在某些實施方案中，反義股和/或有義股包含至少一個經修飾的核苷間鍵。這種經修飾的核苷間鍵可以在兩個去氧核糖核苷單體、兩個核糖核苷單體，或一個去氧核糖核苷單體和一個核糖核苷單體之間。可選地，至少一個末端的核苷單體上的磷酸基可被修飾。在某些實施方案中，核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。在某些實施方案中，核苷間鍵是硫代氨基磷酸酯核苷間鍵。在某些實施方案中，寡核苷酸股的每個核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。在某些實施方案中，股（反義股或有義股或兩者）中的所有核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵、或硫代磷酸酯鍵與磷酸二酯鍵的混合。

在某些實施方案中，反義股和/或有義股包含至少一個具有經修飾的糖基團的核苷單體。這樣的核苷單體可以是去氧核糖核苷單體或核糖核苷單體。

在某個實施方案中，經修飾的糖基團的2’位置被選自下列的基所取代：OR、R、鹵素、SH、SR、NH ₂、NHR、NR ₂或CN，其中每個R獨立地是C ₁-C ₆烷基、烯基或炔基，鹵素是F、Cl、Br或I。在一些實施方案中，經修飾的糖基團的2’位置被選下列的基所取代：烯丙基、氨基、疊氮基、硫代、O-烯丙基、O-C ₁-C ₁₀烷基、OCF ₃、OCH ₂F、O(CH ₂) ₂SCH ₃、O(CH ₂) ₂-O-N(R _m)(R _n)、O-CH ₂-C(=O)-N(R _m)(R _n)、或O-CH ₂-C(=O)-N(R ₁)-(CH ₂) ₂-N(R _m)(R _n)，其中每個R ₁，R _m和R _n獨立地是H，或取代或未取代的C ₁-C ₁₀烷基。在一些實施方案中，經修飾的糖基團具有選自下組的取代基：5’-乙烯基、5’甲基（R或S）、4’-S、2’-F、2’-OCH ₃、2’-OCH ₂CH ₃、2’-OCH ₂CH ₂F、和2’-O(CH2) ₂OCH ₃。在一些實施方案中，經修飾的糖基團被選自下組的雙環糖所取代：4’-(CH ₂)—O-2’(LNA)、4’-(CH ₂)—S-2’、4’-(CH ₂) ₂—O-2’(ENA)、4’-CH(CH ₃)—O-2’ (cEt)和4’-CH(CH ₂OCH ₃)—O-2’、4’-C(CH ₃)(CH ₃)—O-2’、4’-CH ₂—N(OCH ₃)-2’、4’-CH ₂—O—N(CH ₃)-2’、4’-CH ₂—N(R)—O-2’（其中R是H、C ₁-C ₁₂烷基或保護基）、4’-CH ₂—C(H)(CH ₃)-2’、和4’-CH ₂—C—(═CH ₂)-2’。

一些實施方案中，經修飾的糖基團選自下組：經2’-O-甲氧基乙基修飾的糖（MOE）、4’-(CH ₂)—O-2’雙環糖（LNA）、2’-去氧-2’-氟***糖（FANA）和甲基(亞甲氧基)(4’-CH(CH ₃)—O-2雙環糖（cEt）。

[000118] 在一些實施方案中，本發明分子的反義股和/或有義股包含至少一個具有經修飾的核鹼基的核苷酸單體。這樣的核苷單體可以是去氧核糖核苷單體或核糖核苷單體。

在一些實施方案中，經修飾的核鹼基選自下組：5-甲基胞嘧啶（5-Me-C）；次黃嘌呤核苷鹼基；三苯甲基化鹼基；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶；5-鹵代尿嘧啶以及胞嘧啶；5-丙炔基（-C≡C-CH3）尿嘧啶以及胞嘧啶以及嘧啶鹼基的其它炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶；5-尿嘧啶（假尿嘧啶）；4-硫尿嘧啶；8-鹵基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基以及其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-鹵代（特別是5-溴）、5-三氟甲基以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-氨基腺嘌呤；8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤；7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤；以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。

在特定實施方案中，本發明分子中經修飾的核鹼基是5-甲基胞嘧啶。在一個實施方案中，本發明分子的每個胞嘧啶鹼基是5-甲基胞嘧啶。在某些實施方案中，經修飾的核鹼基是5-甲基尿嘧啶。在某些實施方案中，每個尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶。

在某些實施方案中，本發明分子的反義股或有義股或兩股均包含連接著的去氧核苷單體。在某些實施方案中，整個有義股僅由連接著的去氧核苷單體組成。在一個特徵中，除了連接著的去氧核苷單體之外，反義股、或者反義股與有義股兩股，還包括由一個或多個連接著的核糖核苷單體組成的ISR。此外，可能還有更多的ISR片段。ISR可以位於任一股中的任何位點。在一些實施方案中，一個或多個ISR包括末端的核苷單體或末端的倒數第二個核苷單體。在某些實施方案中，每個ISR獨立地由1個核糖核苷單體，或由2、3、4或5個連接著的核糖核苷單體組成。

在某些實施方案中，雙股區的至少一股中的至少一半核鹼基是去氧核糖核苷酸單體。

在某些實施方案中，在第一股的雙股區的RNA靶向部分中的至少50%的核苷酸是去氧核糖核苷酸單體。

在某些實施方案中，sdDNA分子中核糖核苷酸單體的總數不超過同一sdDNA分子中去氧核糖核苷酸單體的總數。

在某些實施方案中，ISR的至少一個或每個連接著的核糖核苷單體是經修飾的核糖核苷酸或核糖核苷酸類似物。核糖核苷酸可以被如下相同或相似的方式修飾：具有經修飾的核苷間鍵、經修飾的糖基團和/或經修飾的核鹼基。

在一些實施方案中，去氧核糖核苷酸單體的糖基團是天然存在的去氧核糖核苷酸的糖基團(2-H)或2'-去氧-2'-氟***糖（FANA）。

在一些實施方案中，核糖核苷酸單體的糖基團選自由以下組成的群組：天然存在的核糖核苷酸(2-OH)、經2'-F修飾的糖、經2’-OMe修飾的糖、經2’-O-甲氧基乙基修飾的糖（MOE）、4’-(CH ₂)—O-2’雙環糖（LNA）和甲基（亞甲氧基）(4’-CH(CH ₃)—O-2雙環糖（cEt）。

在某些實施方案中，在反義股、有義股或兩股中，每個ISR中的至少一個或每個核糖核苷單體具有經修飾的糖基團，其中經修飾的糖基團選自下組：經2’-O-甲氧基乙基修飾的糖（MOE）、4’-(CH ₂)—O-2’雙環糖（LNA）和甲基（亞甲氧基）(4’-CH(CH ₃)—O-2雙環糖（cEt）。在某些實施方案中，在反義股、有義股或兩股中，至少一個去氧核糖核苷單體具有經2'-去氧-2'-氟***糖（FANA）修飾的糖基團。在某些實施方案中，每個ISR的每個核糖核苷單體具有2'-O甲氧基乙基修飾糖、4'-(CH ₂)—O-2'雙環糖或甲基(亞甲氧基)(4'-CH(CH ₃)—O-2)雙環糖(cEt)，其中每個胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，其中每個尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶或甲基-假尿嘧啶，並且其中每個核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。

在某些實施方案中，本發明的分子具有由去氧核苷單體組成的反義股或有義股，其中每個核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。在某些實施方案中，本發明的分子具有由去氧核苷單體組成的反義股或有義股，其中每個核苷間鍵是沒有經硫代磷酸酯修飾的天然磷酸鍵。

在某些實施方案中，本發明的分子包含有義股，其中有義股的每個核苷酸單體包含與反義股的互補核苷酸單體相同的修飾。

圖 1A 、 2A 、 4A 、 5A 、 6A 和 7A展示了本發明具有反義寡核苷酸股和有義寡核苷酸股的示例性分子的示例性結構和示例性序列。

在某些實施方案中，短DNA雙股和在其雙股分子的反義股中的至少一個ISR能夠實現強大的基因靜默。以下所有實施例中顯示的數據表明，基於本發明的新平臺技術，即具有反義寡去氧核糖核苷酸和在其反義寡去氧核糖核苷酸中的至少一個ISR的雙股，可實現極其強大的基因靜默。對sdDNA的SAR（結構-活性關係）特徵進行了進一步研究，包括各種ISR基序、各種長度、互補和錯配、各種修飾等，其有助於確定可能影響基因靜默活性的各種結構因素或骨架特徵。這些SAR因素和設計特徵對於設計優化的基因靜默子，以靶向典型的哺乳動物細胞中超過100,000種不同mRNA以及更多非編碼RNA的各種序列和結構，非常重要。我們關於sdDNA的基因靜默活性和SAR的數據表明，sdDNA的基因靜默特徵與siRNA和ASO有很大不同，這說明基因靜默機制的一種新穎而獨特的機制尚待被確定。

在某些實施方案中，本發明的分子可以通過至少一種化學修飾或二級結構來穩定以防止降解。有義寡核苷酸股和反義寡核苷酸股可以具有不配對或不完美地配對的核苷酸單體。有義寡核苷酸股和/或反義寡核苷酸股可以具有一個或多個切口（核酸主鏈中的切口）、間隙（具有一個或多個缺失核苷酸的片段股）和經修飾的核苷酸或核苷酸類似物。不僅有義寡核苷酸股和反義寡核苷酸股中的任何或所有核苷酸單體可以被化學修飾，而且每股可以綴合到一個或多個基團或配體以增強其功能性，例如，具有選自以下的基團或配體：多肽、抗體、抗體片段、多聚物、多糖、脂質、疏水基團或分子、陽離子基團或分子，親脂性化合物或基團、寡核苷酸、膽固醇、GalNAc和核酸適體。

在某些實施方案中，本發明的雙股分子的雙股區不包含任何錯配或凸起(bulge)，並且兩股在雙股區中彼此完全互補。在另一個實施方案中，雙股的雙股包含錯配和/或凸起。

在某些實施方案中，標靶是與哺乳動物疾病相關的mRNA或非編碼RNA。在某些實施方案中，標靶是mRNA。在某些實施方案中，標靶是非編碼RNA，例如microRNA和lncRNA。只要反義股與標靶序列基本上互補，反義股通過與標靶序列雜交而佔位標靶，使標靶基因失活。 3．不配對或錯配的區域

本發明的反義股和有義股之間的互補區可以具有至少一個不配對或不完美地配對的區域，例如，一個或多個錯配。在一些實施方案中，本發明提供的sdDNA的有義股可以耐受三個或更多個（至少靶向區的15%）錯配，而對sdDNA的基因靜默活性沒有任何影響。有時需要有義股中的錯配來減少脫靶效應或實現sdDNA的其它功能。

正如本領域技術人員所熟知的，可以在不消除活性的情況下引入錯配鹼基。類似地，本發明的sdDNA的反義寡核苷酸股可以包括不配對或錯配的區域。在一些實施方案中，本發明的sdDNA的反義寡核苷酸股可以耐受至少三個（至少靶向區的15%）錯配，同時保持sdDNA的基因靜默活性。有時需要反義股中的錯配來減少脫靶效應或實現sdDNA的其它功能。 4．修飾

苷單體是一種鹼基-糖組合物。核苷單體的核鹼基（也稱為鹼基）基團通常是雜環鹼基基團。核苷酸單體是進一步包括與核苷的糖基團共價連接的磷酸基的核苷單體。對於那些包含戊呋喃糖基糖的核苷單體，磷酸基可以連接到糖的2’、3’或 5’羥基基團。寡核苷酸是通過相鄰核苷單體彼此共價連接形成的，以形成線性的聚合的寡核苷酸。在寡核苷酸結構內，磷酸基通常被稱為形成寡核苷酸的核苷間鍵。

對本發明的sdDNA分子、反義股和/或有義股的修飾包括對核苷間鍵、糖基團或核鹼基的取代或改變。經修飾的sdDNA、反義股和/或有義股在某些情況下由於理想的特性比其天然形式更為優選，例如增加的抑制活性，增強的細胞攝取，增加的股親和力、溶解度，減少非特異性相互作用，和對RNase降解的抗性或增強的穩定性。因此，通常可以得到與具有這些化學修飾的核苷單體的短反義股類似的結果。本發明的反義股和有義股中的一個或多個天然的核苷酸可以被經修飾的核苷酸或核苷酸類似物所取代。取代可以發生在反義股和有義股的任何位點。

已經研究了寡核苷酸分子的修飾可以提高各種寡核苷酸分子（包括反義寡核苷酸、核酶、核酸適體和RNA）的穩定性（ Chiu and Rana, 2003 ； Czauderna et al., 2003 ； de Fougerolles et al., 2007; Kim and Rossi, 2007 ； Mack, 2007 ； Zhang et al., 2006 ； Schrnidt, 2007 ； Setten RL et al., 2020 ； Crooke ST et al., 2018 ；和 Roberts TC et al., 2020）。

本領域技術人員已知的任何穩定化修飾都可用於提高寡核苷酸分子的穩定性。在寡核苷酸分子內，可以將化學修飾引入磷酸主鏈（例如硫代磷酸酯鍵）、糖（例如鎖核酸、甘油核酸、cEt、2’-MOE、2’-氟尿苷、2’-O-甲基)，和/或鹼基（例如2’-氟嘧啶）中。

以下部分總結了此類化學修飾的幾個實例。

在各種實施方案中，經修飾的核苷酸或核苷酸類似物是經糖修飾、主鏈經修飾和/或經鹼基修飾的核苷酸。 4.1 經修飾的核苷間鍵或主鏈經修飾的核苷酸

RNA和DNA中天然存在的核苷間鍵是3’到5’磷酸二酯鍵。相比於僅具有天然存在的核苷間鍵的相應分子而言，在一股中或在兩股中皆具有一個或多個經修飾的核苷間鍵（即非天然存在的核苷間鍵）的本發明sdDNA分子有時會因具有理想的特性（例如細胞攝取的增強、對標靶核酸親和力的增強以及在核酸酶存在下穩定性的增加）而被選擇。

具有經修飾的核苷間鍵的寡核苷酸股包括保留磷原子的核苷間鍵以及不具有磷原子的核苷間鍵。在一個實施方案中，可以將磷酸二酯核苷間鍵修飾以包含氮雜原子或硫雜原子中的至少一個。代表性的含磷核苷間鍵包括，但不限於：磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代亞磷醯胺和硫代磷酸酯。製備含磷和不含磷的鍵的方法是眾所周知的。

在一個實施方案中，經修飾的核苷酸或核苷酸類似物是主鏈經修飾的核苷酸。主鏈經修飾的核苷酸可能具有在磷酸二酯核苷間鍵上的修飾。在另一個實施方案中，主鏈經修飾的核苷酸是硫代磷酸酯核苷間鍵。在某些實施方案中，每個核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。 4.2 經修飾的糖基團

本發明的反義股和/或有義股可任選地含有糖基團經修飾的一個或多個核苷單體。這些糖修飾的核苷單體可賦予所述反義股和/或有義股增強的核酸酶穩定性、增高的結合親和力或一些其它有利的生物學性質。在某些實施方案中，核苷單體包含經化學修飾的呋喃核糖環基團。經化學修飾的呋喃核糖環的實例包括，但不限於：取代基的添加；包括5’和2’取代基，非偕位（non-geminal）環原子橋連以形成雙環核酸（BNA），用S、N(R)或C(R ₁)(R ₂)（R、R ₁和R ₂各自獨立地是H，C ₁-C ₁₂烷基或保護基）置換核糖基環氧原子，和其組合。經化學修飾的糖的實例包括2’-F-5’-甲基取代的核苷（關於其它公開的5’,2’-雙取代的核苷，參見2008年8月21日公開的PCT國際申請WO2008/101157）、或用S置換核糖基環氧原子且在2’-位置上具有進一步取代（參見，於2005年6月16日公開的美國專利申請US2005-0130923）或者對BNA可選的5’-取代（參見於2007年11月22日公開的PCT國際申請WO2007/134181，其中LNA被例如5’-甲基或5’-乙烯基取代）。

具有經修飾的糖基團的核苷單體的實例包括而不限於：包含5’-乙烯基、5’-甲基（R或S）、4’-S、2’-F、2’-OCH ₃、2’-OCH ₂CH ₃、2’-OCH ₂CH ₂F和2’-O(CH ₂) ₂OCH ₃取代基的核苷。2’位置上的取代基還可以選自烯丙基、氨基、疊氮基、硫代、O-烯丙基、O-C ₁-C ₁₀烷基、OCF ₃、OCH ₂F、O(CH ₂) ₂SCH ₃、O(CH ₂) ₂-O-N(Rm)(Rn)、O-CH ₂-C(=O)-N(Rm)(Rn)和O-CH ₂-C(=O)-N(R1)-(CH ₂) ₂-N(Rm)(Rn)，其中各Rl、Rm和Rn獨立地為H、或經取代的或未經取代的C ₁-C ₁₀烷基。

雙環核苷是具有雙環糖基團的經修飾的核苷。雙環核酸（BNA）的實例包括而不限於在4'和2'核糖基環原子之間包含橋連基的核苷。在某些實施方案中，本文中所提供的sdDNA、反義股和/或有義股包括一個或多個BNA核苷，BNA核苷中的橋連基包含以下各式之一：4’-(CH ₂)—O-2’(LNA)、4’-(CH ₂)—S-2、4’-(CH ₂) ₂—O-2’(ENA)、4’-CH(CH ₃)—O-2’和4’-CH(CH ₂OCH ₃)—O-2’（和其類似物，參見於2008年7月15日授權的美國專利7,399,845）；4’-C(CH ₃)(CH ₃)—O-2’（和其類似物，參見於2009年1月8日公開為WO/2009/006478的PCT/US2008/068922）；4’-CH ₂—N(OCH ₃)-2’（和其類似物，參見2008年12月11日公開為WO/2008/150729的PCT/US2008/064591）；4’-CH ₂—O—N(CH ₃)-2’（參見於2004年9月2日公開的美國專利申請US2004-0171570）；4’-CH ₂—N(R)—O-2’，其中R是H、C ₁-C ₁₂烷基或保護基（參見於2008年9月23日授權的美國專利7,427,672）；4’-CH ₂—C(H)(CH ₃)-2’（參見，Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134）；和4’-CH ₂—C—(═CH ₂)-2’（和其類似物，參見於2008年12月8日公開的公開為W2008/154401的PCT/US2008/066154）。

在某些實施方案中，雙環核苷包括，但不限於：（A）α-L-亞甲氧基(4’-CH ₂—O-2)BNA、(B) β-D-亞甲氧基(4’-CH ₂—O-2)BNA、（C）乙烯氧基(4’-(CH ₂) ₂—O-2’)BNA、（D）氨氧基(4’-CH ₂—O—N(R)-2’)BNA、（E）氧氨基(4’-CH ₂—N(R)—O-2)BNA、（F）甲基（亞甲氧基）(4’-CH(CH ₃)—O-2)BNA（也稱為約束乙基（constrained ethyl）或cEt）、（G）亞甲基硫基(4’-CH ₂—S-2’)BNA,、（H）亞甲基氨基(4’-CH ₂—N(R)-2’)BNA、（I）甲基碳環(4’-CH ₂—CH(CH ₃)-2)BNA、（J）丙烯碳環(4’-(CH ₂) ₃-2’)BNA和（K）乙烯基BNA。

在某些實施方案中，經修飾的核苷酸或核苷酸類似物是經糖修飾的核糖核苷酸，其中2'-OH基被選自以下的基所取代：H、OR、R、鹵素、SH、SR、NH ₂、NHR、NR ₂和CN，其中各R獨立地選自由以下組成的群組：C ₁-C ₆烷基、烯基或炔基，和選自下組：F，Cl，Br或I的鹵素。在某些實施方案中，經糖修飾的核糖核苷酸選自下組：經2'-OMe修飾的核苷酸、經2'-F修飾的核苷酸、經2’-O-甲氧基乙基（2’MOE）修飾的核苷酸、經LNA（鎖核酸(locked nucleic acid)）修飾的核苷酸，經GNA（甘油核酸(glycerol nucleic acid)）修飾的核苷酸和經cEt（約束乙基）修飾的核苷酸。

採用在核糖2'位置的化學修飾可以穩定本發明的分子，例如2’-O-甲基嘌呤和2'-氟嘧啶可增加其對血清中核酸內切酶活性的抵抗。應仔細選擇引入修飾的位點，以避免顯著降低分子靜默/調控的能力。在某些實施方案中，與反義股的5'-末端核苷酸單體相鄰的第一個核苷酸單體是2’-氟核糖核苷酸。 4.3 經修飾的核鹼基

sdDNA分子中的反義股和/或有義股也可以具有修飾或取代的核鹼基（或鹼基）。核鹼基（或鹼基）修飾或取代雖然在結構上與天然存在的或合成的未經修飾的核鹼基不同，但在功能上可與之互換。天然的和經修飾的核鹼基都能夠參與氫鍵結合。所述核鹼基修飾可賦予sdDNA分子核酸酶穩定性、結合親和力或一些其它有利的生物學性質。經修飾的核鹼基包括合成的和天然的核鹼基，諸如，例如，5-甲基胞嘧啶（5-Me-C）。某些核鹼基取代，包括5-甲基胞嘧啶取代，對於提高反義股和有義股的結合親和力特別有用。例如，已證明5-甲基胞嘧啶取代使核酸雙股穩定性提高0.6-1.2°C（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）。

其它經修飾的核鹼基包括，但不限於：5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，1-甲基假尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基（-C≡C-CH ₃）尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶鹼基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代（特別是5-溴代）、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。

雜環鹼基基團可以包括其中嘌呤或嘧啶鹼基被其它雜環取代的那些，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。對於增加反義股和有義股的結合親和力特別有用的核鹼基包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。

在某些實施方案中，經修飾的核苷酸或核苷酸類似物是經鹼基修飾的核苷酸。在一個實施方案中，經修飾的核苷酸或核苷酸類似物具有稀有鹼基或經修飾的鹼基。在某些實施方案中，經修飾的鹼基是5-甲基胞嘧啶（5’-Me-C）。在某些實施方案中，每個胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在某些實施方案中，經修飾的鹼基是5-甲基尿嘧啶（5'-Me-U）。在某些實施方案中，每個尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶。

可以在不脫離本發明的精神和範圍的情況下製備任何可能有利於穩定性或親和力的修飾核苷酸或類似物。這種化學修飾的幾個實例與上面總結的相同。 5．藥物組合物

在一些實施方案中，本發明還提供藥物製劑，其包含本發明的sdDNA或其藥學上可接受的衍生物和至少一種藥學上可接受的賦形劑或載體。如本文所用，「藥學上可接受的賦形劑」或「藥學上可接受的載體」旨在包括與藥物施用相容的任何的和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等。合適的載體在「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Twentieth Edition," Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA」中進行了描述，該文獻通過引用併入本文。此類載體或稀釋劑的實例包括，但不限於：水、鹽水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂質體和非水載體，例如也可使用不揮發油。本領域眾所周知，此類介質和試劑可用於藥物活性物質中。除非任何常規介質或試劑與sdDNA分子不相容，否則考慮將其用於組合物中。

可與本發明的分子一起使用的藥學上可接受的載體的實例包括，但不限於：藥用載體、正電荷載體、脂質體、脂質奈米顆粒、蛋白質載體、疏水基團或分子、陽離子基團或分子、GalNAc、多糖聚合物、奈米顆粒、奈米乳劑、膽固醇、脂質、親脂性化合物或基團、和類脂。

在某個實施方案中，本發明提供了一種治療方法，包括向有需要的受試者施用治療有效量的藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物通過選自以下的途徑施用：靜脈內注射（iv）、皮下注射（sc）、口服（po）、肌肉（im）注射、經口施用、吸入、局部、鞘內和其它部位的施用方式。在另一個實施方案中，治療有效量為每天1 ng至1 g、每天100 ng至1 g、或每天1 μg至1000 mg。

在PCT國際申請PCT/US02/24262 （WO03/011224）、美國專利申請公開號2003/0091639和美國專利申請公開號2004/0071775中公開了製劑方法，均通過引用併入本文。

本發明的sdDNA分子以合適的劑型施用，該劑型通過根據常規步驟（即生產本發明的藥物組合物）將治療有效量（例如，通過抑制腫瘤生長、殺死腫瘤細胞、治療或預防細胞增殖性疾病等，足以達到所需治療效果的有效量）的本發明的sdDNA分子（作為活性成分）與標準藥用載體或稀釋劑組合以製備。

這些步驟可能涉及適當地混合、製粒和壓縮或溶解所述成分，以獲得所需的製劑。在另一個實施方案中，治療有效量的sdDNA分子以沒有標準藥用載體或稀釋劑的合適劑型施用。在一些實施方案中，治療有效量的本發明雙股分子以合適的劑型施用。藥學上可接受的載體包括固體載體，例如乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、***膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等。示例性的液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、水等。類似地，載體或稀釋劑可包括本領域已知的時間延遲材料，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，可單獨使用或與蠟、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基丙烯酸甲酯等一起使用。其它填充劑、賦形劑、調味劑和其它如本領域已知的添加劑也可以包含在根據本發明的藥物組合物中。

本發明的藥物組合物可以以眾所周知的方式製備，例如，通過常規的混合、溶解、製粒、包糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或凍乾工藝。可以使用一種或多種生理上可接受的載體以常規方式配製藥物組合物，所述載體包括可促進有義寡核苷酸和反義寡核苷酸加工成可藥用製劑的賦形劑和/或助劑。當然，合適的製劑取決於所選擇的施用途徑。

本發明的組合物、化合物、組合或藥物組合物可以以目前用於化療治療的許多眾所周知的方法施用於受試者。例如，為了治療癌症，本發明的sdDNA分子可以直接注射到腫瘤中，注射到血流或體腔中，或者採用口服或通過皮膚貼片施用。對於乾癬病症（psoriatic conditions）的治療，全身施用（例如經口施用）或給受影響的皮膚區域局部施用都是優選的施用途徑。選擇的劑量應該足以構成有效的治療，但不能高到引起不可接受的副作用。在治療期間和治療後的一段合理時間內，應密切監測疾病狀況（例如癌症、乾癬（psoriasis）等）和患者的健康狀況。 6．使用 6.1 使用方法

本發明提供了一種調節細胞或生物體中基因表現或功能的方法。該細胞可以是真核細胞，例如哺乳動物細胞。該方法包括以下步驟：在可以發生選擇性基因靜默的條件下，使所述細胞或生物體與本文公開的sdDNA分子接觸，並對具有與asdDNA分子的反義股基本上互補的序列部分的標靶核酸介導由asdDNA分子產生的選擇性的基因靜默。標靶核酸可以是RNA，例如mRNA或非編碼RNA，這些RNA或者編碼與疾病有關的蛋白質，或者調控與疾病有關的部分生物學通路。

在一個實施方案中，接觸步驟包括將sdDNA分子引入可以發生選擇性基因靜默的培養中的標靶細胞或生物體中。在進一步的實施方案中，引入步驟包括混合、轉染、脂質轉染、感染、電穿孔或其它遞送技術。在另一個實施方案中，引入步驟包括使用藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑通過靜脈內、皮下、鞘內、口服、吸入、局部或其它臨床上可接受的施用方法施用，其中藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑選自藥用載體、正電荷載體、脂質體、脂質奈米顆粒、蛋白質載體、聚合物、奈米顆粒、奈米乳劑、脂質、N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）、親脂性化合物或基團、和類脂。

在一個實施方案中，靜默方法用於確定在細胞或生物體中的基因功能或效用。

在一個實施方案中，本發明的組合物靶向的基因或RNA與疾病（例如人類疾病或動物疾病）、病理狀況或不良狀況相關。在進一步的實施方案中，標靶基因或標靶RNA是病原微生物的基因或RNA。在更進一步的實施方案中，標靶基因或標靶RNA是病毒來源的基因或RNA。在另一個實施方案中，標靶基因或標靶RNA是腫瘤相關的基因或RNA。

在一個可選地實施方案中，本發明的組合物靶向的基因或RNA是與下列疾病相關的基因或RNA：癌症、自身免疫性疾病、發炎性疾病、退行性疾病、傳染性疾病、增殖性疾病、代謝性疾病，免疫介導的紊亂、過敏性疾病、皮膚病、惡性病、胃腸道疾病、肝臟疾病、呼吸系統障礙、心血管障礙、皮膚病、腎病、類風濕疾病、神經系統障礙、精神障礙、內分泌紊亂、或與衰老相關疾病或紊亂。 6.2 治療方法

本發明還提供治療或預防各種疾病或病症的方法，其中各種疾病或病症包括ASO和siRNA總結的可治療或預防的那些( Czech, 2006; de Fougerolles et al., 2007; Dykxhoorn et al., 2003; Kim and Rossi, 2007; Mack, 2007; Crooke ST et al., 2018; Setten RL et al., 2019; Roberts TC et al., 2020)。該方法包括在可發生所需的基因抑制（上述6.1部分所述的）的條件下，將有效量的sdDNA分子施用於有需要的受試者。

在一個示例性實施方案中，向有需要的受試者施用治療有效量的藥物組合物以治療或預防疾病或不良狀況，其中該藥物組合物具有sdDNA分子和藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。

在一些實施方案中，本發明可用於癌症治療或預防癌症。sdDNA組合物可用於靜默或敲落（knock down）與細胞增殖紊亂或惡性病有關的基因。這些基因的實例是k-Ras、β-catenin、Stat3。這些癌基因在大量人類癌症中活躍且與之相關。

本發明的新穎組合物還可用於治療或預防眼部疾病（例如年齡相關性黃斑變性（AMD）和糖尿病性視網膜病變（DR））；傳染病（例如HIV/AIDS、B型肝炎病毒（HBV）、C型肝炎病毒（HCV）、人類乳突病毒（HPV）、單純皰疹病毒（HSV）、RCV、巨細胞病毒（CMV）、登革熱、西尼羅病毒）；呼吸道疾病（例如呼吸道融合病毒（RSC）、哮喘、囊腫性纖維化）；神經系統疾病（例如亨丁頓氏病（HD）、肌萎縮側索硬化症（ALS）、脊髓損傷、帕金森病、阿茲海默病、疼痛）；心血管疾病；代謝紊亂（例如高脂血症、高膽固醇血症和糖尿病）；遺傳疾病；和發炎病症（例如發炎性腸2道疾病（IBD）、關節炎、類風濕病、自身免疫性疾病）、皮膚病。

在另一個實施方案中，施用方法選自下列途徑：靜脈內注射（iv）、皮下注射（sc）、口服（po）、鞘內、吸入、局部和區域施用。 實施例

下面提供的實施例以進一步闡述本發明的不同特徵。實施例還闡述了實施本發明的有用的方法。這些示例不限制所要求保護的發明。 方法和材料 細胞培養

HepaRG細胞在添加了10% FBS、10mg/ml氫化可體松（hydrcortisone），和4 mg/ml人類重組胰島素的William培養基中生長。 sdDNA 轉染 HepaRG 細胞

轉染前24小時，將HepaRG細胞接種到6孔培養盤中（1x10 ⁵個細胞/2 mL/盤孔）。按照製備方法所描述的，通過Lipofectamine® RNAiMAX（Thermo Fisher，USA）將終濃度為100 pM sdDNA進行轉染，簡而言之，sdDNA和RNAiMAX在無血清OPTI-MEM（Thermo Fisher）中培養20分鐘，然後將其加入到含有培養基的細胞中。定量 PCR

用指定的sdDNA轉染細胞48小時後收穫轉染的細胞。用TRIZOL分離RNA，並使用TaqMan一步法RT-PCR試劑進行qRT-PCR，APOCIII試驗用於APOCIII mRNA檢測，和基因GAPDH mRNA量用作內部對照。

標靶序列

為了證明本發明公開的sdDNA的基因靜默效應，設計並製造的靶向APOCIII基因(APOCIII mRNA)的sdDNA用於下列實施例中。標靶序列是登記號為NM_000040（Accession # NM_000040）的序列片段，標靶序列可與sdDNA的反義股或對應的單股反義寡核苷酸結合。 實施例 1 ：不同 ISR 基序的 sdDNA 的基因靜默活性

圖1A顯示了本發明提供的具有不同ISR基序的sdNDA（sdDNA1-3）實施方案的結構，其中ISR位於AS（反義股）和SS（有義股）中或僅位於AS中，以及靶向APOCIII基因設計的sdDNA（sdDNA1-3）的序列。與sdDNA（sdDNA1-3）的反義股具有相同結構和序列的單股反義寡核苷酸，也被用作對應的單股AS寡核苷酸（對應的ASO）以進行比較。所使用的對應ASO（SEQ ID No.: 1）是ISIS304801，其是採用最先進的ASO技術優化獲得的典型ASO產品。在HepaRG細胞中檢測sdDNA1-3和對應ASO靶向APOCIII基因的靜默活性（結果如圖 1B所示)。

在圖1A中，所示結構中的所有字母「D」代表DNA殘基或者去氧核糖核苷酸單體；所示結構中的所有字母「R」代表RNA殘基或者核糖核苷酸單體；序列中的所有小寫字母「 a 、 c 、 g 、 t」代表DNA殘基；序列中的所有大寫字母「 A 、 C 、 G 、 U」代表經2’-MOE修飾的RNA殘基，其中所有「 U」是5-甲基尿苷2’-MOE RNA殘基；其中序列中所有「 C」和「 c」是5-Me-C；所示結構中所有「*」代表PS（硫代磷酸酯核苷間鍵）。

結果表明所有設計的sdDNA在非常低的濃度（皮莫耳濃度）下對APOCIII基因具有高效的靜默活性，並且比對應的單股反義寡核苷酸 (ASO)更強和更有效。 實施例 2 ：不同長度的 sdDNA

圖2A顯示了sdDNA的一些實施方案。在這些sdDNA中，AS和SS的長度是對稱的。設計了各種長度（8至36 bp）的sdDNA雙股（靶向APOCIII基因的sdDNA_1-10的結構和序列，如圖2A所示）。也設計了與sdDNA_1-10的反義股具有相同結構和序列的單股反義寡核苷酸，作為每個sdDNA的對應單股AS。在HepaRG細胞中檢測sdDNA_1-10和各個對應ASO靶向APOCIII基因的靜默活性（sdDNA結果如圖2B所示，對應單股AS的結果如圖2C所示）。

在圖2A中，所示序列中小寫字母「 a 、 c 、 g 、 t」，大寫字母「 A 、 C 、 G 、 U」和「*」與圖1A中所表示的含義相同。

結果表明，10 bp的對稱平末端sdDNA在非常低的濃度（皮莫耳濃度）下具有高效的基因靜默活性，並且比對應單股ASO更強和更有效。雖然對應單股ASO在皮莫耳濃度顯示了普遍低的活性，但它們可以在奈莫耳濃度（約10 nM-30 nM）顯示基因靜默活性，該結果與通過眾所周知的當前最先進的ASO技術下開發的已知寡核苷酸一致。同樣令人驚訝的是，發現具有比典型的ASO（一般具有16nt到20nt的長度）更長許多的單股AS寡核苷酸比典型的ASO顯示出更強的基因靜默活性。然而，本發明的sdDNA與對應單股AS寡核苷酸相比，包括通過最先進的ASO技術優化的已知典型ASO（例如SEQ ID No.：1），總是顯示相對更好的基因靜默活性。 實施例 3 ：不同長度的對稱 sdDNA

圖3A顯示了sdDNA實施方案的不同結構設計。在這些sdDNA中，AS和SS的長度是對稱的。此外，設計和製造了具有各種長度（8至14bp）的AS和SS雙股（圖3A顯示了，靶向APOCIII基因的sdDNA的sdDNA_1-3結構和序列）。在HepaRG細胞中檢測sdDNA_1-3靶向APOCIII基因的靜默活性（sdDNA結果如圖3B所示）。

在圖3A中，所示序列中的所有小寫字母「 a 、 c 、 g 、 t」和「*」與圖1A中所表示的含義相同，所示序列的所有底線的大寫字母「 A 、 C 、 G 、 U 」代表經LNA修飾的RNA殘基，其中所有「 U 」是5-甲基尿苷LNA RNA殘基，所有「 C 」是5-Me-C LNA RNA殘基。

結果表明所有設計的sdDNA在非常低的濃度下（皮莫爾濃度）都具有高效的基因靜默活性。 實施例 4 ：具有不同修飾基序的 SS 的 sdDNA

圖4A顯示具有不同PS修飾基序的SS的sdDNA實施方案的不同結構設計。具體地，在這些sdDNA中，AS保持不變，SS中除了核苷間鍵外，其它也保持不變。具體地，sdDNA_SS:PS為整條SS的每個核苷間鍵都是經PS修飾的， sdDNA_SS:PO為整條SS的每個核苷間鍵都是天然的PO核苷間鍵，sdDNA_SS:PS/PO為混合的SS，連接著的去氧核糖核苷單體的核苷間鍵的僅一部分而非全部是經PS修飾的核苷間鍵的。與sdDNA（sdDNA1-3）的反義股具有相同結構和序列的單股反義寡核苷酸，也被用作對應的單股AS寡核苷酸（對應的ASO）以進行比較。所使用對應的ASO（SEQ ID No.: 1）是ISIS304801，其是採用最先進的ASO技術優化獲得的典型的ASO產品。在HepaRG細胞中檢測sdDNA（PS，PO，PS/PO）和設計的對應ASO靶向APOCIII基因的靜默活性（結果如圖4B所示）。

在圖4A中，所示序列中所有小寫字母「 a 、 c 、 g 、 t」，大寫字母「 A 、 C 、 G 、 U」和「*」與圖1A中所表示的含義相同。

所有設計的具有不同PS修飾基序的SS的sdDNA顯示了，在非常低的濃度（皮莫耳濃度）下對APOCIII的高效基因靜默活性，並且比對應的ASO更強和更有效。換句話說，至少與傳統ASO技術相比，在連接著的去氧核糖核苷單體/DNA殘基的核苷間鍵中的各種修飾基序，可保持通過本發明提供的基於sdDNA的基因靜默技術的基因靜默活性顯著提高的優勢。具有部分或全部用PS核苷間鍵修飾的SS的sdDNA顯示出至少與具有完全天然的PO核苷酸間鍵的sdDNA一樣好的有效基因靜默活性。到目前為止，本領域眾所周知對於體內應用PS修飾是被需要的。

這些結果還表明，SS是通過典型的DNase以外的未知機制從sdDNA雙股中移除或降解的，因為具有完全經PS修飾的SS的sdDNA比未經修飾SS的sdDNA更有效或至少同等有效。此外，還可預期在SS的連接的去氧核糖核苷單體/DNA殘基中使用至少一種修飾（例如經PS修飾的核苷間鍵），可能有助於為體內應用設計具有改善的藥學特性的sdDNA，包括更好的穩定性和組織分佈。 實施例 5 ：具有分佈在 AS 的不同位置的各種 ISR 基序的 sdDNA

圖5A顯示了另外一系列sdDNA的不同結構設計。在這些sdDNA中，保持有義股不變，同時改變AS中ISR的核糖核苷酸單體的位置和總數（ISR_0-5，其結構和序列顯示在圖5A中）。圖5A中反義股的各種ISR基序顯示，每個ISR具有低至1個或2個數量的核糖核苷酸單體，且每個ISR被至少一個其間的去氧核糖核苷酸單體間隔開。在圖5A中，所示序列中的所有小寫字母「 a 、 c 、 g 、 t」，大寫字母「 A 、 C 、 G 、 U」和「*」與圖1A中所表示的含義相同。在HepaRG細胞中檢測ISR_0-5靶向APOCIII的基因靜默活性（結果如圖5B所示)。

所有設計的sdDNA在非常低的濃度下（皮莫耳濃度）都具有高效的基因靜默活性。這些結果進一步表明在AS中的至少一個ISR（ISR具有不同數量的核糖核苷酸單體，分佈在AS中的各種位點）可增強或實現本發明提供的sdDNA的高效基因靜默活性。 實施例 6 ： AS 中具有錯配的 sdDNA

圖6A顯示了另外一系列sdDNA的不同結構設計。在這些sdDNA中，設計的反義股與標靶RNA雜交時包含至少一個錯配（Mis1-2，其結構和序列顯示在圖6A中），且設計了在反義股中沒有錯配的（Mis0）作為對照。在圖6A中，所示序列中的所有小寫字母「 a 、 c 、 g 、 t」，大寫字母「 A 、 C 、 G 、 U」和「*」與圖1A中所表示的含義相同。在HepaRG細胞中檢測Mis0-2靶向APOCIII的基因靜默活性（結果如圖6B所示)。

所有設計的sdDNA在非常低的濃度下（皮莫耳濃度）都具有高效的基因靜默活性。結果進一步的表明本發明提供的sdDNA的反義股可以容忍至少2個（至少靶向區的10%）的錯配而同時保持本發明提供的sdDNA的基因靜默活性。在AS中某些位點的一些錯配或者多個錯配可能會降低sdDNA的基因靜默活性。 實施例 7 ：具有 SS 比 AS 長的 sdDNA

圖7A顯示了具有比AS長的SS的另一系列sdDNA的不同結構設計。在這些sdDNA中，反義股保持不變的同時改變有義股的長度（sdDNA_1-2，其結構和序列顯示在圖7A中）。在圖7A中，所示序列中的所有小寫字母「 a 、 c 、 g 、 t」，大寫字母「 A 、 C 、 G 、 U」和「*」與圖1A中所表示的含義相同。與sdDNA（sdDNA_1-2）的反義股具有相同結構和序列的單股反義寡核苷酸，也被用作對應的單股AS寡核苷酸（對應的ASO）以進行比較。在HepaRG細胞中檢測sdDNA_1-2和對應的ASO靶向APOCIII基因的靜默活性（結果如圖7B所示）。

所有設計的sdDNA在非常低的濃度（皮莫耳濃度）下具有高效的基因靜默活性，並且比對應的ASO更強和更有效。該結果表明sdDNA的有義股可比其反義股長。如實施例所示，SS可以比AS長至少16個單體。 等效物

代表性實施例旨在幫助說明本發明，並不旨在也不應解釋為限制本發明的範圍。實際上，除了本文所展示的和描述的之外，對於本領域技術人員而言，從本文檔的全部內容，包括實施例和本文所包含的科學文獻和專利文獻的引用，本發明的各種修改及其許多進一步實施例是顯而易見的。實施例包含重要的附加資訊、示例和指導，可適用於實施本發明的各種實施例及其等效物中。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同含義。儘管與本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料也可以用於實施或測試本公開，但是現在描述的是優選方法和材料。除了公開的特定順序之外，本文所述的方法可以以邏輯上可能的任何循序執行。 通過引用合併

在本公開中已經對其它檔進行了參考和引用，例如專利、專利申請、專利出版物、期刊、書籍、論文、網路內容。出於所有目的，所有此類文檔均通過引用整體併入本文。通過引用併入本文的任何材料或其部分，但與現有定義、聲明或本文明確闡述的其它公開材料相衝突的，僅在該併入的材料是與本公開材料之間不發生衝突的範圍內被併入。在發生衝突的情況下，將支援本公開的材料或其部分作為優選的公開，以解決衝突。 參考文獻1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8. doi: 10.1038/35078107. PMID: 11373684. 2. Sun Xiangao, Rogoff Harry A, Li Chiang J. Asymmetric RNA duplexes mediate RNA interference in mammalian cells. Nat Biotechnol. 2008 Dec;26(12):1379-82. doi: 10.1038/nbt.1512. Epub 2008 Nov 23. Erratum in: Nat Biotechnol. 2009 Feb;27(2):205. PMID: 19029911. 3. C. Frank Bennett and Eric E. Swayze, RNA Targeting Therapeutics: Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides as a Therapeutic Platform. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2010. 50:259–93. 4. C. Frank Bennett. Therapeutic Antisense Oligonucleotides Are Coming of Age. Annu Rev Med. 2019 Jan 27;70:307-321. doi: 10.1146/annurev-med-041217-010829. PMID: 30691367. 5. Setten RL, Rossi JJ, Han SP. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2019 Jun;18(6):421-446. doi: 10.1038/s41573-019-0017-4. Erratum in: Nat Rev Drug Discov. 2019 Mar 18;: Erratum in: Nat Rev Drug Discov. 2019 Apr 24;: PMID: 30846871. 6. Sibley CR, Seow Y, Wood MJ. Novel RNA-based strategies for therapeutic gene silencing. Mol Ther. 2010 Mar;18(3):466-76. doi: 10.1038/mt.2009.306. Epub 2010 Jan 19. PMID: 20087319; PMCID: PMC2839433.7. Grimm D. Asymmetry in siRNA design. Gene Ther. 2009 Jul;16(7):827-9. doi: 10.1038/gt.2009.45. Epub 2009 Apr 30. PMID: 19404320. 8. Crooke ST, Witztum JL, Bennett CF, Baker BF. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metab. 2018 Apr 3;27(4):714-739. doi: 10.1016/j.cmet.2018.03.004. Erratum in: Cell Metab. 2019 Feb 5;29(2):501. PMID: 29617640.9. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020 Oct;19(10):673-694. doi: 10.1038/s41573-020-0075-7. Epub 2020 Aug 11. PMID: 32782413; PMCID: PMC7419031. 10. Ryszard Kole, Adrian R. Krainer, Sidney Altman, RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotids. Nat Rev Drug Discov. 2016. 11(2): 125-140. 11. Cy A. Stein, Daniela Castanotto, FDA-Approved Oligonucleotide Therapies in 2017. Molecular Therapy. 2017. Vol. 25 No 5 May 2017 12. Richard G. Lee, Jeff Crosby, Brenda F. Baker, Mark J. Graham, Rosanne M. Crooke, Antisense Technology: An Emerging Platform for Cardiovascular Disease Therapeutics. J. of Cardiovasc. Trans. Res.2013. DOI 10.1007/s12265-013-9495-7 13. Zamecnik, P. C., & Stephenson, M. L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75, 1978. 280–284. 14. Stanley T. Crooke, Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. NUCLEIC ACID THERAPEUTICS. Volume 27, Number 2, 2017 Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/nat.2016.0656 15. Antisense Drug Technologies: Principles, Strategies, and Applications. 2. Crooke, ST., editor. CRC Press; Boca Raton, Florida: 2008 16. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998. 391, 806–811 17. de Fougerolles A, Vornlocher HP, Maraganore J, Lieberman J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nature Rev Drug Discov. 2007; 6:443–453. [PubMed: 17541417] 18. Jackson AL, Bartz SR, Schelter JM, Kobayashi SV, Burchard J, et al. 2003. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat. Biotechnol.21:635–37 19. Lin X, Ruan X, Anderson MG, McDowell JA, Kroeger P, et al. 2005. siRNA-mediated off-target gene silencing triggered by a 7nt complementation. Nucleic Acids Res.33:4527–35 20. Kwoh JT. 2008. An overview of the clinical safety experience of first- and second-generation antisense oligonucleotides. See Ref. 9, pp. 365–99 21. Henry SP, Kim T-W, Kramer-Strickland K, Zanardi TA, Fey RA, Levin AA. 2008. Toxicological properties of 2’-O-methoxyethyl chimeric antisense inhibitors in animals and man. See Ref. 9, pp. 327–63 22. Geary, RS.; Yu, RZ.; Levin, AA. Antisense Drug Technologies: Principles, Strategies, and Applications. See Ref. 9, pp. 183-217 23. Iwamoto N, Butler D, Syrzikapa N, Mohapatra S., Verdine GL. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotidesNat Biotechnol 35(9):845-851, 2017 doi: 10.1038/nbt.3948. Epub 2017 Aug 21.

無

圖1A示出了根據本發明原理的短雙股DNA(sdDNA)的一些實施方案的示例性結構，至少一個核糖核苷酸間隔片段（ISR）在sdDNA的反義股（第一股，AS）（和有義股（第二股，SS））中，和具有所設計的結構的用於靶向APOCIII基因的sdDNA的示例性序列。本文所描述的每個雙股中，有義股都列在反義股的上方。圖1B顯示了圖1A中所示的sdDNA和其對應的ASO（ASO具有與圖1A中的sdDNA的單股AS相同的結構和序列，作為對比）的基因靜默效力。100 pM的sdDNA和對應ASO轉染HepaRG細胞後，分析APOCIII基因的相對mRNA量。

圖2A顯示了各種長度的對稱sdDNA的一些實施方案的示例性結構和序列。圖2B顯示了圖2A所示的sdDNA靶向APOCIII基因的基因靜默效力。圖2C顯示了與圖2A所示的每個sdDNA的反義股具有相同序列的對應的單股AS寡核苷酸靶向APOCIII基因的基因靜默效力。100 pM的sdDNA和對應的單股AS寡核苷酸轉染HepaRG細胞後，檢測APOCIII基因的相對mRNA量。

圖3A顯示了各種長度的對稱sdDNA的一些實施方案的示例性結構和序列。圖3B顯示了通過圖3A所示的sdDNA靶向APOCIII基因的基因靜默效力。100 pM的sdDNA轉染HepaRG細胞後，檢測APOCIII基因的相對mRNA量。

圖4A顯示了在SS中具有不同PS修飾基序的sdDNA的一些實施方案的示例性結構和序列。圖4B顯示了通過圖4A中所示的sdDNA和其對應的ASO（ASO具有與圖4A中sdDNA的單股AS相同的結構和序列，作為對比）的基因靜默效力。100 pM的sdDNA和對應ASO轉染HepaRG細胞後，檢測APOCIII基因的相對mRNA量。

圖5A顯示了在反義股中具有各種ISR基序的sdDNA的一些實施方案的示例性結構和序列。圖5B顯示了通過圖5A所示的sdDNA靶向APOCIII基因的基因靜默效力。100 pM的sdDNA轉染HepaRG細胞後，檢測APOCIII基因的相對mRNA量。

圖6A顯示了sdDNA的一些實施方案的示例性結構和序列，與標靶RNA結合時，sdDNA的反義股中具有至少一個錯配。圖6B顯示了通過圖6A所示的sdDNA靶向APOCIII基因的基因靜默效力。100 pM的sdDNA轉染HepaRG細胞後，檢測APOCIII基因的相對mRNA量。

圖7A顯示了SS比AS長的sdDNA的一些實施方案的示例性結構和序列。圖7B顯示了通過圖7A中所示的sdDNA和其對應的ASO（ASO具有與圖7A中sdDNA的單股AS相同的結構和序列，作為對比）的基因靜默效力。100 pM的sdDNA和其對應的ASO轉染HepaRG細胞後，檢測APOCIII基因的相對mRNA量。

無

                         序列表
          <![CDATA[<110>  北京強新生物科技有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  作為新穎基因靜默技術的短雙股DNA及其應用]]>
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          aaagctggac aagaag                                                       16
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          cuucttgtcc agcuuu                                                       16
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          ataaagctgg acaagaagct                                                   20
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          gcagcutctt gtccagctuu auug                                              24
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          caataaagct ggacaagaag ctgc                                              24
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          uagcagcttc ttgtccagct tuauuggg                                          28
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          cccaataaag ctggacaaga agctgcta                                          28
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          cauagcagct tcttgtccag ctttauuggg ag                                     32
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          ctcccaataa agctggacaa gaagctgcta tg                                     32
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          ucauagcagc ttcttgtcca gctttauugg gaggcc                                 36
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> ]]> 人工合成寡核苷酸序列
          <![CDATA[<400>  23]]>
          ggcctcccaa taaagctgga caagaagctg ctatga                                 36
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  24]]>
          ataaagctgg acaagaagct                                                   20
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          uucttgtcca gcuu                                                         14
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          agcttcttgt ccagcttuau                                                   20
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          agctucttgt ccagcutuau                                                   20
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          agcuucttgt ccagctutau                                                   20
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核?酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          agcuucutgt ccagctutau                                                   20
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  30]]>
          agcttcttgt ccagctttau                                                   20
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  31]]>
          agcuucttct ccagcuuuau                                                   20
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          agcuugttgt ccagcuauau                                                   20
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          000
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工合成寡核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          cttgtccagc                                                              10

Claims

一種短雙股DNA（sdDNA）分子包含第一股和第二股，其中所述第一股和所述第二股都包含連接著的核苷酸單體，其中所述第一股與標靶RNA的標靶片段基本上互補；其中所述第二股與所述第一股基本上互補，並與所述第一股形成至少一個雙股區；其中所述第二股的長度與所述第一股的長度相等或更長；和其中所述sdDNA分子包含至少一個核糖核苷酸單體間隔片段（ISR），其ISR包含至少一個核糖核苷酸單體。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第一股包含至少一個ISR。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第二股包含至少一個ISR。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第一股包含至少一個ISR，且所述第二股也包含至少一個ISR。
如請求項2或4所述的sdDNA分子，其中所述至少一個ISR分佈在所述第一股的至少一個靶向區中。
如請求項5所述的sdDNA分子，其中所述第一股中所有的ISR的核糖核苷酸單體的總數至少為2。
如請求項3或4所述的sdDNA分子，其中所述至少一個ISR分佈在所述第二股的至少一個雙股區中。
如請求項1-7任一項所述的sdDNA分子，其中所述sdDNA分子包含至少兩個或更多個ISR，其中每個ISR彼此獨立地由1個核糖核苷酸單體組成，或包含至少2、3、4或5個連續的核糖核苷酸單體。
如請求項1-7任一項所述的sdDNA分子，其中所述至少一個ISR包含至少2、3、4、5或6個連續的核糖核苷酸單體。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第一股至少70%、80%、85%、90%、95%或者完全地與所述標靶RNA的標靶片段互補。
如請求項1-10任一項所述的sdDNA分子，其中所述第一股與所述標靶RNA雜交時包含不超過1、2或3個錯配。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第二股至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或者完全地與所述第一股互補。
如請求項12所述的sdDNA分子，其中所述第二股與所述第一股的至少一個區域形成互補雙股時包含1、2、3或更多個錯配。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第一股具有的長度選自由以下組成的群組：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50個核苷酸單體。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第一股具有的長度選自由以下組成的群組： a) 6-50個核苷酸單體 b) 8-36個核苷酸單體， c) 8-33個核苷酸單體， d) 8-36個核苷酸單體， e) 10-30個核苷酸單體，和 f) 8-29個核苷酸單體。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第二股的長度與第一股的長度相等。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第二股比所述第一股長至少選自由以下數量個組成的群組的核苷酸單體：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20個。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第二股具有的長度選自由以下組成的群組：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50個核苷酸單體。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第二股具有的長度選自由以下組成的群組： a) 6-50個核苷酸單體， b) 8-36個核苷酸單體， c) 8-33個核苷酸單體， d) 8-36個核苷酸單體， e) 8-32個核苷酸單體， f) 8-30個核苷酸單體， g) 8-29個核苷酸單體，和 h) 8-25個核苷酸單體。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述雙股區由選自由以下數量個組成的群組的鹼基對組成：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個鹼基對。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述雙股的兩末端均為平末端。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述第一股和所述第二股均具有3’突出端，或者所述第一股和所述第二股均具有5’突出端。
如請求項17所述的sdDNA分子，其中所述第二股具有以下配置中的一種：3’突出端和5’突出端、3’突出端和5’平末端、3’平末端和5’突出端、3’突出端和5’凹陷端或5’突出端和3’凹陷端。
如請求項16或17所述的sdDNA分子，其中所述第一股具有以下配置中的一種：3’突出端和5’平末端、3’平末端和5’突出端、3’突出端和5’凹陷端、5’突出端和3’凹陷端、3’平末端和5’平末端、或3’凹陷端和5’凹陷端。
如請求項23或24所述的sdDNA分子，其所述3’突出端或所述5’突出端具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個的核苷酸單體。
如請求項1-25任一項所述的sdDNA分子，其中至少一個核苷酸單體是經修飾的核苷酸或核苷酸類似物。
如請求項26所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的核苷酸或核苷酸類似物是經糖修飾，主鏈經修飾，和/或經鹼基修飾的核苷酸。
如請求項27所述的sdDNA分子，其中所述主鏈經修飾的核苷酸在核苷間鍵上具有修飾。
如請求項28所述的sdDNA分子，其中所述核苷間鍵被修飾以包含氮雜原子或硫雜原子中的至少一個。
如請求項29所述的sdDNA分子，其中經修飾的所述核苷間鍵選自由以下組成的群組：硫代磷酸酯基（P=S）、磷酸三酯、甲基膦酸酯和氨基磷酸酯。
如請求項26所述的sdDNA分子，其中所述第一股和/或所述第二股包含至少一個經修飾的核苷間鍵，其中所述經修飾的核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。
如請求項26所述的sdDNA分子，其中所述第二股包含在連接著的去氧核糖核苷酸單體區域的至少一個經修飾的核苷間鍵，其中所述經修飾的核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。
如請求項31所述的sdDNA分子，其中所述第一股的每個核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。
如請求項31所述的sdDNA分子，其中所述第二股的每個核苷間鍵是硫代磷酸酯核苷間鍵。
如請求項26所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的核苷酸或核苷酸類似物包含經修飾的糖基團。
如請求項35所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的糖基團的2’位置被選自由以下組成的群組的基所取代：OR、R、鹵素、SH、SR、NH ₂、NHR、NR ₂和CN，其中每個R獨立地是C ₁-C ₆烷基、烯基或炔基，鹵素是F、Cl、Br或I。
如請求項35所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的糖基團的2’位置被選自由以下組成的群組的基所取代：烯丙基、氨基、疊氮基、硫代、O-烯丙基、O-C ₁-C ₁₀烷基、OCF ₃、OCH ₂F、O(CH ₂) ₂SCH ₃、O(CH ₂) ₂-O-N(R _m)(R _n)、O-CH ₂-C(=O)-N(R _m)(R _n)和O-CH ₂-C(=O)-N(R ₁)-(CH ₂) ₂-N(R _m)(R _n)，其中每個R ₁，R _m和R _n獨立地是H、或取代的或未取代的C ₁-C ₁₀烷基。
如請求項35所述的sdDNA分子，所述經修飾的糖基團選自由以下組成的群組：5’-乙烯基、5’甲基（R或S）、4’-S, 2’-F, 2’-OCH ₃、2’-OCH ₂CH ₃, 2’-OCH ₂CH ₂F和2’-O(CH ₂) ₂OCH ₃取代基。
如請求項35所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的糖基團被選自由以下組成的群組的雙環糖所取代：4’-(CH ₂)—O-2’(LNA)、4’-(CH ₂)—S-2’、4’-(CH ₂) ₂—O-2’(ENA)、4’-CH(CH ₃)—O-2’(cEt)和4’-CH(CH ₂OCH ₃)—O-2’、4’-C(CH ₃)(CH ₃)—O-2’、4’-CH ₂—N(OCH ₃)-2’、4’-CH ₂—O—N(CH ₃)-2’、4’-CH ₂—N(R)—O-2’（其中R是H，C ₁-C ₁₂烷基或保護基）、4’-CH ₂—C(H)(CH ₃)-2’和4’-CH ₂—C—(═CH ₂)-2’。
如請求項35所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的糖基團選自由以下組成的群組：經2’-O-甲氧基乙基修飾的糖（MOE）、4’-(CH ₂)—O-2’雙環糖（LNA）、2’-去氧-2’-氟***糖（FANA）和甲基（亞甲氧基）(4’-CH(CH ₃)-O-2)雙環糖（cEt）。
如請求項26所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的核苷酸或核苷酸類似物包含經修飾的核鹼基。
如請求項41所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的核鹼基選自由以下組成的群組：5-甲基胞嘧啶（5-Me-C）；次黃嘌呤核苷鹼基；三苯甲基化鹼基；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶以及2-巰胞嘧啶；1-甲基-假尿嘧啶；5-鹵代尿嘧啶以及胞嘧啶；5-丙炔基（-C≡C-CH ₃）尿嘧啶以及胞嘧啶以及嘧啶鹼基的其它炔基衍生物； 6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶；5-尿嘧啶（假尿嘧啶）；4-硫尿嘧啶；8-鹵基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基以及其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-鹵代（特別是5-溴代）、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-氨基腺嘌呤；8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤；7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤；以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。
如請求項37所述的sdDNA分子，其中所述經修飾的核鹼基是5-甲基胞嘧啶。
如請求項41所述的sdDNA分子，其中每個胞嘧啶鹼基是5-甲基胞嘧啶。
如請求項1-44任一項所述的sdDNA分子，其中所述sdDNA具有調節細胞中基因表現或功能的能力。
如請求項1-45任一項所述的sdDNA分子，其中所述sdDNA分子比其對應的單股反義寡核苷酸在靜默標靶RNA上更強或更有效。
如請求項1-46任一項所述的sdDNA分子用於調節細胞中基因表現或功能。
如請求項47所述的sdDNA分子，其中所述細胞是真核細胞。
如請求項48所述的sdDNA分子，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述標靶RNA是mRNA或非編碼RNA，這些RNA或者編碼與疾病或病症有關的蛋白質、或者調控與疾病或病症有關的部分生物學通路。
如請求項1所述的sdDNA分子，其中所述標靶RNA選自由以下組成的群組： a)與人類或動物的疾病或紊亂有關的基因的mRNA， b)致病微生物的基因的mRNA， c)病毒RNA，和 d)與選自由自身免疫性疾病、炎症性疾病、退行性疾病、傳染性疾病、增殖性疾病、代謝性疾病、免疫介導的紊亂、過敏性疾病、皮膚病、惡性病、胃腸道疾病、呼吸系統障礙、心血管障礙、腎病、類風濕疾病、神經系統障礙、內分泌紊亂，和與衰老相關疾病組成的群組的疾病有關的RNA。
如請求項1-51任一項所述的sdDNA分子，其中所述第一股和/或所述第二股與配體或基團相綴合。
如請求項52所述的sdDNA分子，其中所述配體或基團選自由以下組成的群組：多肽、抗體、多聚物、多糖、脂質、疏水基團或分子、陽離子基團或分子、親脂性化合物或基團、寡核苷酸、膽固醇、GalNAc和核酸適體。
一種藥物組合物，包含作為活性劑的如請求項1-53任一項所述的sdDNA分子及藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
根據權利要求54所述的藥物組合物，其中所述載體選自由以下組成的群組：藥物載體、正電荷載體、脂質納米顆粒、脂質體、蛋白質載體、疏水部分或分子、陽離子部分或分子、GalNAc、多糖聚合物、奈米顆粒、奈米乳劑、膽固醇、脂質、親脂性化合物或部分、以及類脂。
一種治療或預防疾病或病症的方法，其中所述方法包含向有需要的受試者施用治療有效劑量的如請求項1-53任一項所述的sdDNA分子或如請求項54或55所述的藥物組合物。
如請求項50的方法，其中所述疾病或病症選自由以下組成的群組：癌症、自身免疫性疾病、發炎性疾病、退行性疾病、傳染病、增殖性疾病、代謝性疾病、免疫介導的紊亂、過敏性疾病、皮膚病、惡性病、胃腸道疾病、肝臟疾病、呼吸系統障礙、心血管障礙、皮膚病、腎病、類風濕疾病、神經系統障礙、精神障礙、內分泌紊亂和與衰老相關紊亂或疾病。
如請求項57所述的方法，其中所述sdDNA分子或藥物組合物通過選自由以下組成的群組的途徑施用：靜脈注射（iv）、皮下注射（sc）、口服（po）、肌肉注射（im）、經口施用、吸入、局部、鞘內和其它部位的施用。
一種調節真核細胞中基因表現或功能的方法，其中所述方法包括細胞與有效量的如請求項1-53任一項所述的sdDNA分子或如請求項54或55所述的藥物組合物接觸。
一種短雙股體DNA（sdDNA）分子包含第一股和第二股，其中所述第一股和所述第二股都包含連接著的核苷酸單體，其中所述核苷酸單體選自由核苷酸、其類似物和經修飾的核苷酸組成的群組，其中，所述第一股的長度與所述第二股的長度相等或比所述第二股的長度長，且所述第一股選自由以下數量個組成的群組的單體：1、2、3、4、5、6、7和8個單體，其中所述第一股通過至少一個靶向區與標靶RNA的標靶片段基本上互補，其中所述第一股由8-36個（範圍的兩個端點值均包括在其中）通過鍵連接的核苷酸單體組成，其中所述鍵選自由相鄰單體間的硫代磷酸酯鍵，磷酸二酯鍵、或硫代磷酸酯鍵與磷酸二酯鍵的混合組成的群組，其中所述第二股與所述第一股基本上互補，且與所述第一股形成至少一個雙股區，其中所述第二股由10-36個（範圍的兩個端點值均包括在其中）通過鍵連接的核苷單體組成，其中所述鍵選自由相鄰單體間的硫代磷酸酯鍵、磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯與磷酸二酯鍵的混合組成的群組，其中所述sdDNA分子包含至少一個核糖核苷酸單體間隔片段（ISR）與至少一個去氧核糖核苷酸單體相連，其中去氧核糖核苷酸單體選自由去氧核糖核苷酸、其類似物和經修飾的去氧核糖核苷酸組成的群組，其中所述sdDNA分子中的所述ISR包含至少一個核糖核苷酸單體，其中核糖核苷酸單體選自由核糖核苷酸、其類似物和經修飾的核糖核苷酸組成的群組，其中所述sdDNA分子用於調節細胞中的基因表現和功能，和其中所述sdDNA分子在細胞中，靜默標靶基因表現上，比其對應的ASO更強或更有效。