KR20240014533A - 신규한 유전자 침묵 기술로서의 짧은 듀플렉스 dna 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 유전자 침묵 기술로서의 짧은 듀플렉스 dna 및 이의 용도 Download PDF

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시안가오 순
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Abstract

본 발명은 세포, 조직, 유기체 및 동물에서 표적 핵산 및/또는 단백질을 조정하기 위한 새로운 유형의 유전자 침묵 기술을 개시한다. 새로운 기술은 인간 질환의 예방 및 치료를 포함하여 유전자 침묵 적용에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 센스 가닥의 길이가 안티센스 가닥과 적어도 동일한 짧은 듀플렉스 DNA 분자를 포함한다. 듀플렉스 DNA 분자는 적어도 하나의 산재된 리보뉴클레오티드 단량체를 추가로 포함한다. 본 발명은 표적 유전자의 발현 또는 기능을 조정하거나 질환을 치료 또는 예방할 뿐만 아니라 다른 의학적 또는 생물학적 적용을 위해 조성물을 사용하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

신규한 유전자 침묵 기술로서의 짧은 듀플렉스 DNA 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 5월 29일에 출원된 공동 계류 중인 미국 가특허 출원 일련 번호 63/195,010에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 이 출원은 전체가 참조로 본원 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 유전자 침묵 기술로 사용되는 짧은 듀플렉스 DNA 및 생물학적 또는 의학적 연구, 질환의 치료 및 예방, 다른 생물학적 분야의 유전자 침묵 적용에 사용될 수 있는 관련 조성물 및 방법에 관한 것이다.
현대 의학 치료제는 2가지의 기본 기술, 즉 소분자 화학 및 단백질/항체 기술에 의존한다. 그러나, 게놈 및 생물의학 연구를 통해 확인된 표적 중 약 10%만이 앞서 언급된 2가지의 초석 기술로 해결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 소분자 화학 및 항체/단백질 기술을 통해 약물로 치료할 수 있지 않은 표적을 포함하여 수많은 표적을 다루기 위한 가능성을 가지고 있다. 40년이 넘는 연구를 통해 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 및 작은 간섭 RNA(siRNA) 기술이 탄생하였다(Cy A. Stein et al., 2017). 그러나, 40년이 넘는 연구에도 불구하고 소수의 임상적 희귀 적응증을 제외하고는 상당한 약물 기량성 문제로 인해 ASO 및 siRNA 기술의 개발이 주류 치료 플랫폼이 되는 것이 차단되었다. 이러한 약물 기량성 문제는 특히 낮은 침묵 효율, 표적외 효과, 의도하지 않은 면역 반응의 자극, 조직 침투 문제, 및 생체내 전달 등을 포함한다. 따라서, 다양한 생물학적 및 의학적 적용에서 관심 유전자를 표적화하는 새로운 기술을 개발해야 하는 충족되지 않은 요구가 상당하다.
ASO는 1978년에 처음 제안된 개념에 기초한 유전자 침묵 기술이다(Zamecnik P.C. et al., 1978). 일반적으로, ASO 기술의 원리는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산에 혼성화하여 전사/전사 후 또는 번역과 같은 유전자 발현 활성 또는 기능을 조정한다는 것이다. 메커니즘은 하기와 같이 광범위하게 분류될 수 있다: (1) RNA 분해를 촉진하지 않고 단지 점유: ASO의 결합은 번역 정지, 스플라이싱 억제 또는 대체 스플라이싱 변이체의 유도로 이어짐, 또는 (2) 점유 유발된 불안정화: ASO의 결합은 리보뉴클레아제 H1(RNase H1)과 같은 내인성 효소를 통해 RNA의 분해를 증진시킴; 및 (3) 번역 조정: ASO는 5'UTR에서 업스트림 오픈 리딩 프레임(uORF) 또는 다른 억제 또는 조절 요소를 차단하여 번역 효율을 높이거나 조정할 수 있음(Stanley T. Crooke et al., 2008; C. Frank Bennett, 2010; Richard G. Lee, 2013; Stanley T. Crooke, 2017). ASO 구조는 염기 짝지음을 통해 표적 RNA에 결합할 수 있는 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오티드 서열이다. 40년간의 연구 끝에 ASO 기술은 포스포로티오에이트 치환 또는 다른 변형된 뉴클레오티드와 같은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 다양한 화학적 변형을 통해 개선되었다(Iwamoto N et al 2017, Crooke ST, 2017; Crooke ST et al., 2018; U.S. Pat. Nos. 7919472 and 9045754).
RNAi는 짧은 이중 가닥 RNA가 상동 서열의 RNA 손실을 촉발시키는 메커니즘으로 식물에서 처음 관찰되었으며 선충(카에노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans))에서 입증되었다(A. Fire et al, 1998). 메커니즘은 긴 dsRNA의 짧은 간섭 듀플렉스 RNA(siRNA)로의 분해 및 siRNA와 다중 단백질 RNA 유도된 침묵 컴플렉스(RISC)의 상호작용을 포함하며; RISC 내에서, siRNA는 풀리고 센스 가닥은 버려지고 안티센스 또는 가이드 가닥은 RISC 엔도뉴클레아제 AGO2에 결합한 다음 표적 RNA를 절단한다(de Fougerolles et al., 2007; Ryszard Kole, 2016). 포유동물 세포에서, 합성 siRNA 또는 비대칭의 짧은 간섭 RNA(aiRNA 또는 비대칭적 siRNA)를 사용하여 RISC 의존적 메커니즘을 통해 유전자 침묵을 유도할 수 있다(Elbashir SM et al., 2001; Sun X et al., 2008; U.S. Pat. Nos. 7056704 and 9328345).
올리고뉴클레오티드는 수십 년 동안 연구되어 왔으며 완전히 새로운 부류의 치료제가 될 가능성이 상당한 것으로 간주된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 제한된 침묵 효율, 전달 과제 및 혼성화 의존적 독성 및 혼성화 비의존적 독성을 포함한 용량 의존적 역효과는 이러한 새로운 부류의 치료제 개발을 계속해서 제한하고 있다(C. Frank Bennett, 2010; C. Frank Bennett, 2019; Roberts TC et al., 2020; Crooke ST et al., 2018; and Setten RL et al., 2020). 일반적으로, ASO 화합물은 유전자 침묵을 유도하는 데 있어서 siRNA 기반 화합물보다 덜 강력하지만 ASO 화합물은 siRNA 화합물보다 몇 가지 약학적 이점을 가지고 있다. 현재, ASO 및 siRNA는 유전자 침묵 치료제를 설계하기 위한 2가지 동등하게 중요한 플랫폼 기술로 남아 있다(Crooke ST et al 2018; Roberts TC et al 2020). 올리고뉴클레오티드의 혼성화 의존적 독성은 주로 비-표적 유전자에 대한 혼성화("표적외 효과")에 기인한다(Jackson et al., 2003; Lin X et al., 2005). 올리고뉴클레오티드와 단백질의 상호작용을 통해 혼성화 독립적 독성이 발생하였으며; 그 효과는 증가된 응고 시간, 전염증 효과 및 보체 경로 활성화를 포함한다. 이러한 효과는 더 높은 용량의 올리고뉴클레오티드에서 발생하는 경향이 있으며 용량 의존적이다. 예컨대, 더 높은 농도에서 ASO는 세뇨관 변화 및 혈소판감소증을 유발한다(Geary, RS. et al., 2007; Kwoh J T, 2008). 임상적으로, 1세대 PS 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 및 2세대 2'-MOE 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 주요 내약성 및 안전성 문제는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간의 연장, 주사 부위 반응, 및 발열, 오한 및 두통과 같은 전신 증상과 같은 혼성화 독립적 효과인 것으로 입증되었다(C. Frank Bennett, 2010; Henry S P, 2008; Kwoh J T, 2008). 가장 최적화된 ASO라도 일반적으로 siRNA보다 훨씬 덜 강력하며 용량 의존적인 전형적 독성을 갖는 것으로 입증되었다(Kendall S. Frazier, 2015). 올리고뉴클레오티드의 용량 의존적 독성을 완화하기 위해, 지난 40년 동안 다양한 화학적 변형을 통해 제한된 효능 문제 및 관련된 안전성 문제를 극복하려는 노력이 이루어져 왔다(Iwamoto N et al 2017; Crooke ST et al., 2018; and Roberts TC et al., 2020).
ASO와 비교하여, siRNA 듀플렉스의 표적외 효과는 센스 가닥 매개된 침묵, 내인성 miRNA 경로와의 경쟁 및 TLR 또는 다른 단백질과의 상호작용에 의해 매개되는 것으로 여겨진다(Setten RL et al 2019). 또한, 21 nt/19 bp의 전형적인 siRNA 듀플렉스는 세포 및 조직 침투에 효율적이지 않으며, 또한 안정성 및 다른 약학적 특성을 향상시키기 위해 광범위한 화학적 변형이 필요하다.
요약하면, ASO 기술의 40년 이상의 혁신 및 RNAi 기반 기술의 20년 이상의 연구 후에도 인간 질환애 연루된 거의 90%의 표적에 대한 유전자 표적화된 요법의 성공적인 개발은 여전히 어려운 과제로 남아 있다. 또한, 현재 승인된 올리고뉴클레오티드 약물은 환자당 연간 50만 USD가 넘으므로 일반 인구에 영향을 미치는 질환을 해결하는 것이 불가능하다. 따라서, 이러한 과제를 극복하기 위한 새로운 기술이 시급히 필요하다.
본원에 인용된 참조문헌은 청구된 발명에 대한 선행 기술로 인정되지 않는다.
본 발명은 짧은 듀플렉스 데옥시리보뉴클레오티드(sdDNA)에 의해 촉발되는 강력한 유전자 침묵의 놀라운 발견에 기초한다. 하나 이상의 리보뉴클레오티드 단량체(들)의 산재된 세그먼트("ISR")를 갖는 sdDNA를 통해 가능해진 이 새로운 유형의 유전자 침묵 기술은 자연 발생 뉴클레오티드, 이의 유사체 및 변형된 뉴클레오티드(이하 통칭 "뉴클레오티드 단량체"라고 함)의 군으로부터 각각 선택되는 연결된 뉴클레오티드 단량체로 이루어진 짧은 듀플렉스 분자를 사용한다. 다시 말해, 본 발명의 일 실시양태에 사용되는 뉴클레오티드 단량체는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오티드, 이의 유사체 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드의 군으로부터 선택되는 "데옥시리보뉴클레오티드 단량체"를 포함한다. 또한, sdDNA의 유전자 침묵 기능은 하나 또는 몇 개의 산재된 리보뉴클레오티드 단량체를 통합함으로써 극적으로 가능하게 되거나 향상될 수 있다. "리보뉴클레오티드 단량체"는 자연 발생 리보뉴클레오티드, 이의 유사체 및 변형된 리보뉴클레오티드의 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서, 짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA) 분자는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체(들)의 산재된 세그먼트("ISR")를 형성하는 하나 또는 몇 개의 리보뉴클레오티드 단량체로 추가로 산재된다.
본 개시내용에 함유된 sdDNA 기반 새로운 플랫폼 기술의 뛰어난 유전자 침묵 효과는 일 실시양태에서 올리고뉴클레오티드 단량체의 센스 가닥 및 표적화된 리보뉴클레오티드 서열에 대해 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 단량체의 안티센스 가닥을 통해 달성된다. 본 발명자들의 데이터는 독특하고 새로운 조성을 갖는 본 발명의 sdDNA 분자가 피코 몰 농도에서 ASO, siRNA 및 다른 기존 유전자 침묵 기술보다 더 강력한 유전자 침묵을 촉발할 수 있으므로 용량 의존적 독성을 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 본 발명의 sdDNA 분자는 또한 기존 유전자 침묵 기술에 비해 더 나은 조직 침투; siRNA 기반 유전자 침묵은 세포질에서만 발생하는 것과 대조적으로 핵, 미토콘드리아 등에서 유전자 침묵을 가능하게 함; 감소된 표적외 효과; 더 나은 안정성; siRNA와 관련된 내인성 microRNA 경로와의 바람직하지 않은 경쟁의 제거 또는 감소; 낮은 합성 비용 및 다른 개선된 약학적 특성을 포함한 이점 중 적어도 하나를 가질 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 sdDNA 분자는 기존 유전자 침묵 기술이 직면한 다양한 과제를 해결할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있다. 본 발명의 sdDNA 분자는 연구, 진단, 질환 예방 및 치료 뿐만 아니라 농업 및 수의학을 포함한 생물학적 분야의 다른 적용을 포함하여 현재 올리고뉴클레오티드가 적용되거나 사용이 고려되는 모든 영역에서 사용될 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥을 갖는 짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA) 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 제2 가닥의 길이는 제1 가닥의 길이와 적어도 동일하고, 보다 구체적으로 제2 가닥은 길이가 제1 가닥보다 길거나 이와 동일하다. 제1 가닥은 적어도 하나의 표적화 영역을 통해 표적화된 RNA의 표적화된 세그먼트에 대해 실질적으로 상보적이므로 안티센스 가닥 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 간주될 수 있다. 또한, 센스 가닥 또는 센스 올리고뉴클레오티드로 간주될 수 있는 제2 가닥은 제1 가닥에 대해 실질적으로 상보적이며, 제1 가닥과 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 형성한다. sdDNA 분자는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체(들)의 산재된 세그먼트(ISR)를 포함한다. 한 특색에서, sdDNA 분자 내의 ISR은 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체(들)를 포함하고, 이는 하나의 가닥 또는 두 가닥 모두에 있을 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 조성물은 진핵 세포에서 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 데 사용되며, sdDNA는 세포와 접촉하게 되거나 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, sdDNA 분자는 적어도 1개 또는 적어도 2개의 리보뉴클레오티드 단량체(들)의 산재된 세그먼트(ISR)를 포함한다. 본 발명의 sdDNA 분자의 한 특색에서, 분자의 제1 가닥은 적어도 하나의 ISR을 포함하거나 분자의 제2 가닥은 적어도 하나의 ISR을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 가닥은 적어도 하나의 ISR을 포함하고, 제2 가닥도 적어도 하나의 ISR을 포함한다. 한 특색에서, 각각의 ISR은 서로 독립적으로 1개의 리보뉴클레오티드 단량체로 이루어지거나 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 근접한 리보뉴클레오티드 단량체를 포함한다. 또 다른 특색에서, ISR은 상이한 종류의 적어도 1개(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)의 개재하는 단량체와 근접하거나 이격되어 있는지 여부에 관계없이 적어도 2개의 리보뉴클레오티드 단량체를 포함한다. 또 다른 특색에서, 제1 가닥에 포함된 모든 ISR(들)의 리보뉴클레오티드 단량체의 총 수는 적어도 2이다.
한 특색에서, 적어도 하나의 ISR은 제1 (안티센스) 가닥의 적어도 하나의 표적화 영역에 배치된다. 또 다른 특색에서, 적어도 하나의 ISR은 제2 (센스) 가닥의 적어도 하나의 이중 가닥 영역에 배치된다. 또 다른 특색에서, 적어도 하나의 ISR은 제1 가닥의 적어도 하나의 표적화 영역에 배치되고 적어도 하나의 ISR은 제2 (센스) 가닥의 적어도 하나의 이중 가닥 영역에 배치된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ISR은 제1 가닥의 임의의 위치에 놓여질 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ISR은 제1 가닥의 5' 말단에 또는 근처에(7개의 핵염기 이내 또는 상기 말단을 카운팅하여 말단으로부터 상기 가닥 내 핵염기의 총 수의 33% 이내, 예컨대 말단으로부터 시작하여 약 21개의 핵염기 길이인 가닥에 대해 위치 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7); 및/또는 제1 가닥의 3' 말단에 또는 근처에(7개의 핵염기 이내 또는 상기 말단을 카운팅하여 말단으로부터 상기 가닥 내 핵염기의 총 수의 33% 이내); 및/또는 제1 가닥의 더 중앙 부분에 위치된다. 일부 실시양태에서, 제1 가닥에 배치된 적어도 하나의 ISR은 제1 가닥의 돌출부 영역에만 위치된다. 일부 실시양태에서, 제1 가닥에 배치된 적어도 하나의 ISR은 제1 가닥의 돌출부 영역 및 이중 가닥 영역 둘 다에 위치된다. 일부 실시양태에서, 제1 가닥 내 ISR(들)은 제1 가닥의 5' 말단 또는 제1 가닥의 3' 말단에 위치되는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ISR은 제2 가닥의 5' 말단에 또는 근처에(7개의 핵염기 이내 또는 상기 말단을 카운팅하여 말단으로부터 상기 가닥 내 핵염기의 총 수의 33% 이내); 및/또는 제2 가닥의 3' 말단에 또는 근처에(7개의 핵염기 이내 또는 상기 말단을 카운팅하여 말단으로부터 상기 가닥 내 핵염기의 총 수의 33% 이내); 및/또는 제2 가닥의 더 중앙 부분에 위치된다.
한 특색에서, 제1 가닥 또는 안티센스 가닥은 핵염기 서열을 형성하는 다중 연결된 뉴클레오티드 단량체를 포함하고, 표적화된 유전자의 RNA의 표적화된 세그먼트에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 상보적이거나 완전히 상보적이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 RNA는 mRNA 또는 비-코딩 RNA로부터 선택되며, RNA는 단백질을 코딩하거나 질환, 예컨대 포유동물 질환에 연루된 생물학적 경로의 일부를 조절한다. 용어 "표적" 및 "표적화된"은 본 개시내용에서 상호교환적으로 사용되며 동일한 의미를 공유한다.
다양한 실시양태에서, 제1 가닥(안티센스 가닥)은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 연결된 뉴클레오티드 단량체, 또는 이의 등가물, 또는 상기 값 중 임의의 2개로 묶인 범위(범위 끝점 모두 포함)의 주쇄 길이를 갖는다. 예컨대, 제1 가닥의 길이 범위 중 일부는 하기를 포함한다: (a) 8-36개의 뉴클레오티드 단량체; (b) 8-33개의 뉴클레오티드 단량체; (c) 10-30개의 뉴클레오티드 단량체; (d) 10-29개의 뉴클레오티드 단량체; (e) 12-29개의 뉴클레오티드 단량체; (f) 12-28개의 뉴클레오티드 단량체; (g) 12-26개의 뉴클레오티드 단량체; (h) 12-25개의 뉴클레오티드 단량체; (i) 13-25개의 뉴클레오티드 단량체; (j) 13-24개의 뉴클레오티드 단량체; (k) 13-23개의 뉴클레오티드 단량체; (l) 14-24개의 뉴클레오티드 단량체; (m) 15-23개의 뉴클레오티드 단량체; 및 (n) 8-50개의 뉴클레오티드 단량체; (o) 16-23개의 뉴클레오티드 단량체; (p) 10-36개의 뉴클레오티드 단량체; 및 (p) 적어도 8개의 뉴클레오티드 단량체.
한 특색에서, 제2 가닥 또는 센스 가닥은 핵염기 서열을 형성하는 다중 연결된 뉴클레오티드 단량체를 포함하고, 제1 가닥 또는 안티센스 가닥의 연결된 영역에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 상보적이거나 완전히 상보적이다. 그 결과, 2개의 가닥은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 염기쌍을 포함하는 이중 가닥 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 제1/안티센스 가닥의 적어도 하나의 연결된 영역에 대해 완전히 상보적이고, 어떠한 미스매치(mismatch)도 없이 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 제1/안티센스 가닥의 적어도 하나의 연결된 영역에 대해 상보적이며, 1, 2, 3개 또는 그 초과의 미스매치를 갖는 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 형성한다. 한 특색에서, 센스 가닥 내의 미스매치 단량체(들)는 A, G, C 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵염기 또는 변형된 핵염기를 갖는다.
한 특색에서, 제2 가닥 또는 센스 가닥은 제1 가닥 또는 안티센스 가닥과 동일한 주쇄 길이를 갖는다. 한 실시양태에서, sdDNA 분자의 2개의 가닥은 어떠한 돌출부도 없이 대칭적 듀플렉스를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 가닥 및 제2 가닥 모두는 3'-돌출부 또는 5'-돌출부를 갖는다. 특정 실시양태에서, 2개의 가닥의 3'-돌출부 및 5'-돌출부는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 단량체의 동일한 길이를 갖는다.
다른 특색에서, 제2 가닥 또는 센스 가닥은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20과 같은 뉴클레오티드 단량체의 수 만큼 제1 가닥 또는 안티센스 가닥보다 긴 주쇄 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 제2 가닥의 3'-돌출부는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 단량체, 또는 상기 값 중 임의의 2개로 묶인 범위(범위 끝점 모두 포함)의 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 제2 가닥의 5'-돌출부는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 단량체, 또는 상기 값 중 임의의 2개로 묶인 범위(범위 끝점 모두 포함)의 길이를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제2 가닥은 1-5개의 뉴클레오티드 단량체의 3'-돌출부 및 1-5개의 뉴클레오티드 단량체의 5'-돌출부(범위 끝점 모두 포함)를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 제2 가닥은 1-8개의 뉴클레오티드 단량체의 3'-돌출부(범위 끝점 모두 포함) 및 5'-평활 말단을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 제2 가닥은 1-8개의 뉴클레오티드 단량체의 5'-돌출부(범위 끝점 모두 포함) 및 3'-평활 말단을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 제2 가닥은 1-10개의 뉴클레오티드 단량체의 3'-돌출부(범위 끝점 모두 포함) 및 5'-함몰 말단 또는 1-10개의 뉴클레오티드 단량체의 5'-돌출부(범위 끝점 모두 포함) 및 3'-함몰 말단을 갖는다.
다양한 실시양태에서, 제2 또는 센스 가닥은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 연결된 뉴클레오티드 단량체, 또는 이의 등가물, 또는 상기 값 중 임의의 2개로 묶인 범위(범위 끝점 모두 포함)의 주쇄 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 예컨대 제2 센스 가닥의 길이의 범위 중 일부는 (a) 8-36개의 뉴클레오티드 단량체; (b) 8-33개의 뉴클레오티드 단량체; (c) 10-30개의 뉴클레오티드 단량체; (d) 10-29개의 뉴클레오티드 단량체; (e) 12-29개의 뉴클레오티드 단량체; (f) 12-28개의 뉴클레오티드 단량체; (g) 12-26개의 뉴클레오티드 단량체; (h) 12-25개의 뉴클레오티드 단량체; (i) 12-24개의 뉴클레오티드 단량체; (j) 13-25개의 뉴클레오티드 단량체; (k) 13-24개의 뉴클레오티드 단량체; (l) 13-23개의 뉴클레오티드 단량체; (m) 14-24개의 뉴클레오티드 단량체; (n) 15-23개의 뉴클레오티드 단량체; (o) 8-50개의 뉴클레오티드 단량체; (p) 16-23개의 뉴클레오티드 단량체; (q) 10-36개의 뉴클레오티드 단량체; 및 (r) 적어도 8개의 뉴클레오티드 단량체를 포함한다.
본 발명의 sdDNA 분자의 한 특색에서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 내 적어도 하나의 뉴클레오티드 단량체는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 당, 주쇄, 및/또는 염기 변형된 뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 이러한 주쇄 변형된 뉴클레오티드는, 예컨대 질소 또는 황 헤테로원자 중 적어도 하나를 포함하도록 뉴클레오시드간 연결에 적어도 하나의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트(P=S) 기, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 또는 포스포르아미데이트이거나 이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하며, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 실시양태에서, 제2 가닥의 데옥시리보뉴클레오티드 단량체 사이의 적어도 하나의 뉴클레오시드 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 실시양태에서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 다양한 실시양태에서, 뉴클레오시드간 연결은 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 포스포로티오에이트와 포스포디에스테르 연결의 혼합이다.
한 특색에서, 본 발명의 분자의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 변형된 당 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 당 모이어티의 2' 위치는 OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2, 또는 CN으로부터 선택되는 군으로 대체되며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티의 2' 위치는 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), 또는 O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)로부터 선택되는 군으로 대체되고, 여기서 각각의 Rl, Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬이다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F, 2'-O-아미노프로필화(2'-AP) 및 2'-O(CH2)2OCH3의 군으로부터 선택되는 치환기(들)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2'(cEt) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 4'-C(CH3)(CH3)-O-2', 4'-CH2-N(OCH3)-2', 4'-CH2-O-N(CH3)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2'(여기서, R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임), 4'-CH2-C(H)(CH3)-2', 및 4'-CH2-C-(=CH2)-2'의 군으로부터 선택되는 이환식 당으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당(MOE), 4'-(CH2)-O-2' 이환식 당(LNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노스(2'-F-아라비노, FANA), 및 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2) 이환식 당(cEt)의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 sdDNA 분자의 한 특색에서, 데옥시리보뉴클레오티드 단량체의 당 모이어티는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오티드(2-H) 또는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노스(FA)의 당 모이어티이다.
본 발명의 sdDNA 분자의 한 특색에서, 리보뉴클레오티드 단량체의 당 모이어티는 자연 발생 리보뉴클레오티드(2-OH), 2'-F 변형된 당, 2'-OMe 변형된 당, 2'-O-메톡시에틸 변형된 당(MOE), 4'-(CH2)-O-2' 이환식 당(LNA) 및 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2) 이환식 당(cEt)으로부터 선택된다.
또 다른 특색에서, 본 발명의 분자의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 변형된 핵염기를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 단량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 핵염기는 5-메틸시토신(5-Me-C), 이노신 염기, 트리틸화 염기, 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 히포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 1-메틸-슈도-우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 5-메틸 우리딘 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 및 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌의 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 5-메틸시토신이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 분자 내 각각의 시토신 염기는 5-메틸시토신이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 sdDNA 분자의 ISR 내의 각각의 우리딘 염기는 5-메틸우리딘이다.
한 특색에서, 본 발명의 sdDNA 분자는 패턴 인식 수용체(PRR), 예컨대 Toll 유사 수용체에 의해 인식될 수 있는 적어도 하나의 CpG 모티프를 포함할 수 있다.
한 특색에서, 본 발명의 분자의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 리간드 또는 모이어티에 접합된다. 특정 실시양태에서, 리간드 또는 모이어티는 펩티드/단백질, 항체, 중합체, 다당류, 지질, 소수성 모이어티 또는 분자, 양이온성 모이어티 또는 분자, 친유성 화합물 또는 모이어티 올리고뉴클레오티드, 콜레스테롤, GalNAc 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 특색에서, sdDNA 분자는 세포, 예컨대 포유동물 세포와 같은 진핵 세포에서 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 데 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 원리에 따른 sdDNA 분자의 뉴클레오티드 단량체 서열의 적어도 일부를 지시하는 표적화된 RNA는 mRNA 또는 비-코딩 RNA로부터 선택되며, 이러한 RNA는 단백질을 코딩하거나 질환에 연루된 생물학적 경로의 일부를 조절한다. 다양한 실시양태에서, 이러한 표적 RNA는 인간 또는 동물의 질환 또는 병태에 연루된 유전자의 mRNA; 병원성 미생물의 유전자의 mRNA; 바이러스 RNA, 및 자가면역 질환, 염증성 질환, 퇴행성 질환, 감염성 질환, 증식성 질환, 대사 질환, 면역 매개 장애, 알러지 질환, 피부 질환, 악성 질환, 위장 장애, 호흡기 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 류마티스 장애, 신경계 장애, 내분비 장애, 및 노화 관련 장애 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애에 연루된 RNA로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각 뉴클레오티드, 이의 유사체, 및 변형된 뉴클레오티드의 군으로부터 선택되는 연결된 뉴클레오티드 단량체를 포함하는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA) 분자를 제공하며, (a) 제1 가닥은 길이가 제2 가닥과 동일하거나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단량체의 수 만큼 제2 가닥보다 짧고; (b) 제1 가닥은 적어도 하나의 표적화 영역을 통해 표적화된 RNA의 표적화된 세그먼트에 대해 실질적으로 상보적이고, 제1 가닥은 인접한 단량체 사이의 포스포로티오에이트 연결, 포스포디에스테르 연결, 및 포스포로티오에이트와 포스포디에스테르 연결의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결을 통해 연결된 8-36개(범위 끝점 모두 포함)의 뉴클레오티드 단량체로 이루어지고; (c) 제2 가닥은 제1 가닥에 대해 실질적으로 상보적이고, 제1 가닥과 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 형성하고, 제2 가닥은 인접한 단량체 사이의 포스포로티오에이트 연결, 포스포디에스테르 연결, 및 포스포로티오에이트와 포스포디에스테르 연결의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결을 통해 연결된 10-36개(범위 끝점 모두 포함)의 뉴클레오티드 단량체로 이루어지고; (d) sdDNA 분자는 데옥시리보뉴클레오티드, 이의 유사체, 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 단량체에 연결된 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체의 산재된 세그먼트(ISR)를 포함하고; (e) sdDNA 분자 내의 ISR은 리보뉴클레오티드, 이의 유사체, 및 변형된 리보뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체를 포함한다. 한 특색에서, sdDNA 분자는 세포, 예컨대 포유동물 세포와 같은 진핵 세포에서 표적 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 데 사용된다. 추가 특색에서, sdDNA 분자는 세포에서 상응하는 ASO보다 표적 유전자의 발현을 침묵시키는 데 더 강력하거나 더 효과적이다.
제2 측면에서, 본 발명은 활성제로서의 제1 측면의 조성물, 및 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 담체의 예는 약학적 담체, 양전하 담체, 리포솜, 지질 나노입자, 단백질 담체, 소수성 모이어티 또는 분자, 양이온성 모이어티 또는 분자, GalNAc, 다당류, 중합체, 나노입자, 나노에멀젼, 콜레스테롤, 지질, 친유성 화합물 또는 모이어티, 및 유지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
제3 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 sdDNA 분자 또는 이러한 분자를 함유하는 약학 조성물을 투여함으로써 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 제1 측면의 조성물 또는 제2 측면의 약학 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 투여 방법은 정맥내 주사(iv), 피하 주사(sc), 경구(po), 근육내(im) 주사, 경구 투여, 흡입, 국소, 척수강내, 및 다른 영역 투여의 군으로부터 선택되는 경로이다.
한 특색에서, 예방적으로 또는 치료적으로 치료되는 질환 또는 병태는 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 퇴행성 질환, 감염성 질환, 증식성 질환, 대사 질환, 면역 매개 장애, 알러지 질환, 피부 질환, 악성 질환, 위장 장애, 간 장애, 호흡기 장애, 심혈관 장애, 피부 장애, 신장 장애, 류마티스 장애, 신경계 장애, 정신 장애, 내분비 장애, 및 노화 관련 장애 또는 질환의 군으로부터 선택된다.
제4 측면에서, 본 발명은 진핵 세포에서 유전자 발현 또는 유전자 기능을 조절하거나 조정하기 위해 제1 측면의 조성물 또는 제2 측면의 약학 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 유효량의 본 발명의 임의의 sdDNA 분자 또는 이러한 분자를 함유하는 약학 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 접촉 단계는 상기 sdDNA 분자를 포함하는 조성물을 배양물 내 표적 세포 또는 선택적 유전자 침묵이 일어날 수 있는 유기체에 도입하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 도입 단계는 단순 혼합, 형질감염, 리포펙션, 전기천공, 감염, 주사, 경구 투여, 정맥내 주사(iv), 피하 주사(sc), 경구(po), 근육내(im) 주사, 흡입, 국소, 척수강내, 및 다른 영역 투여로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 도입 단계는 약학적 담체, 지질 나노입자, 양전하 담체, 리포솜, 단백질 담체, 소수성 모이어티 또는 분자, 양이온성 모이어티 또는 분자, GalNAc, 다당류, 중합체, 나노입자, 나노에멀젼, 콜레스테롤, 지질, 친유성 화합물 또는 모이어티, 및 유지질을 포함하는 군으로부터 선택되는 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 사용하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표적 유전자는 mRNA이다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자는 microRNA 및 lncRNA와 같은 비-코딩 RNA이다.
한 실시양태에서, 표적 유전자는 포유동물의 질환, 병리학적 상태, 또는 바람직하지 않은 상태와 관련되어 있다. 추가 실시양태에서, 표적 유전자는 병원성 미생물의 유전자이다. 추가의 실시양태에서, 표적 유전자는 바이러스 유전자이다. 또 다른 실시양태에서, 표적 유전자는 종양 관련된 유전자이다. 또 다른 실시양태에서, 표적 유전자는 제3 측면과 관련하여 나열된 군으로부터 선택되는 질환과 관련된 유전자이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오시드, 이의 유사체 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오시드, 및 (b) 적어도 8개의 핵염기 길이의 안티센스 서열에 연결된 리보뉴클레오시드, 이의 유사체 또는 변형된 리보뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 ISR을 포함하는 올리고머 듀플렉스를 제공한다. 안티센스 서열은 표적 서열에 대해 적어도 70% 상보적이다.
본 발명의 다른 특색 및 이점은 상이한 실시예를 포함하여 본원 제공된 추가 설명으로부터 명백해진다. 제공된 실시예는 본 발명을 실시하는 데 유용한 상이한 요소 및 방법론을 예시한다. 실시예는 청구된 발명을 제한하지 않는다. 본 개시내용에 기초하여, 숙련된 기술자는 본 발명을 실시하는 데 유용한 다른 성분 및 방법론을 확인하고 사용할 수 있다. 여러 실시양태가 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 임의의 변형이 이루어질 수 있다.
도 1a는 안티센스 가닥(제1 가닥, AS) (및 센스 가닥(제2 가닥, SS)) 내에 적어도 하나의 리보뉴클레오티드의 산재된 세그먼트(ISR)를 갖는 본 발명의 원리에 따른 짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA)의 일부 실시양태의 예시적인 구조 및 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 설계된 구조를 갖는 sdDNA의 예시적인 서열을 도시한다. 여기에 묘사된 각각의 듀플렉스에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥 위에 나열된다. 도 1b는 도 1a에 나타낸 sdDNA 및 이의 상응하는 ASO(도 1a의 sdDNA의 단일 가닥 AS와 동일한 구조 및 서열을 가짐)의 유전자 침묵 효능을 비교하여 나타낸다. APOCIII 유전자의 상대적인 mRNA 수준은 HepaRG 세포를 100 pM의 이러한 sdDNA 및 상응하는 ASO로 형질감염시킨 후 분석되었다.
도 2a는 다양한 길이의 대칭적 sdDNA의 일부 실시양태의 예시적인 구조 및 서열을 나타낸다. 도 2b는 도 2a에 나타낸 sdDNA로 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 유전자 침묵 효능을 나타낸다. 도 2c는 도 2a에 나타낸 각각의 sdDNA의 안티센스 가닥과 동일한 서열을 갖는 상응하는 단일 가닥 AS 올리고뉴클레오티드로 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 유전자 침묵 효능을 나타낸다. APOCIII 유전자의 상대적인 mRNA 수준은 HepaRG 세포를 100 pM의 sdDNA 및 상응하는 단일 가닥 AS 올리고뉴클레오티드로 형질감염시킨 후 검출되었다.
도 3a는 다양한 길이의 대칭적 sdDNA의 일부 실시양태의 예시적인 구조 및 서열을 나타낸다. 도 3b는 도 3a에 나타낸 sdDNA로 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 유전자 침묵 효능을 나타낸다. APOCIII 유전자의 상대적인 mRNA 수준은 HepaRG 세포를 100 pM의 sdDNA로 형질감염시킨 후 검출되었다.
도 4a는 SS 내에 상이한 PS 변형 모티프를 갖는 sdDNA의 일부 실시양태의 예시적인 구조 및 서열을 나타낸다. 도 4b는 도 4a에 나타낸 sdDNA 및 이의 상응하는 ASO(도 4a의 sdDNA의 단일 가닥 AS와 동일한 구조 및 서열을 가짐)로 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 유전자 침묵 효능을 비교하여 나타낸다. APOCIII 유전자의 상대적인 mRNA 수준은 HepaRG 세포를 100 pM의 sdDNA 및 상응하는 ASO로 형질감염시킨 후 검출되었다.
도 5a는 안티센스 가닥 내에 다양한 ISR 모티프를 갖는 sdDNA의 일부 실시양태의 예시적인 구조 및 서열을 나타낸다. 도 5b는 도 5a에 나타낸 sdDNA로 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 유전자 침묵 효능을 나타낸다. APOCIII 유전자의 상대적인 mRNA 수준은 HepaRG 세포를 100 pM의 sdDNA로 형질감염시킨 후 검출되었다.
도 6a는 표적 RNA에 결합 시 안티센스 가닥 내에 적어도 하나의 미스매치를 갖는 sdDNA의 일부 실시양태의 예시적인 구조 및 서열을 나타낸다. 도 6b는 도 6a에 나타낸 sdDNA로 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 유전자 침묵 효능을 나타낸다. APOCIII 유전자의 상대적인 mRNA 수준은 HepaRG 세포를 100 pM의 sdDNA로 형질감염시킨 후 검출되었다.
도 7a는 AS보다 긴 SS를 갖는 sdDNA의 일부 실시양태의 예시적인 구조 및 서열을 나타낸다. 도 7b는 도 7a에 나타낸 sdDNA 및 이의 상응하는 ASO(도 7a의 sdDNA의 단일 가닥 AS와 동일한 구조 및 서열을 가짐)로 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 유전자 침묵 효능을 비교하여 나타낸다. APOCIII 유전자의 상대적인 mRNA 수준은 HepaRG 세포를 100 pM의 sdDNA 및 상응하는 ASO로 형질감염시킨 후 검출되었다.
본 발명은 짧은 듀플렉스 DNA를 사용한 유전자 또는 RNA 조절/침묵 기술에 관한 것이다. 이 새로운 기술은 짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA) 조성물을 사용하여 시험관내 및 생체내에서 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 데 사용된다. 본 발명은 또한 표적 유전자의 발현 또는 기능의 조정, 또는 질환의 치료 또는 예방 뿐만 아니라 다른 의학적 및 생물학적 적용을 위해 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물 및 방법은 유전자 발현 또는 유전자 기능 조절에 있어 높은 효능을 제공할 뿐만 아니라 용량 의존적 독성도 감소시킨다.
1. 정의
본원 사용된 단수형은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예컨대, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 포함한 복수의 세포를 포함한다.
용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 해당 수치 값 위 및 아래의 경계를 확장함으로써 해당 범위를 변형한다. 일반적으로, 용어 "약"은 20%, 10%, 5% 또는 1%의 변화로 명시된 값 위 및 아래의 수치 값을 변형하기 위해 본원에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "약"은 10%의 변화로 명시된 값 위 및 아래의 수치 값을 변형하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "약"은 5%의 변화로 명시된 값 위 및 아래의 수치 값을 변형하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "약"은 1%의 변화로 명시된 값 위 및 아래의 수치 값을 변형하는 데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "유사체(analog)" 또는 "유사체(analogue)"는 상호교환적으로 기능적 또는 구조적 등가물을 의미한다. 예컨대, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체는 수십 년 동안 암 및 바이러스 감염의 임상 치료에 사용되어 왔으며 새로운 화합물은 연구자들 및 제약업에 의해 지속적으로 합성되고 평가되고 있다(예컨대, 문헌(Jordheim L.P. et al., Nat Rev Drug Discov 12, 447-464 (2013)) 참조).
본원에 사용된 용어 "데옥시리보뉴클레오시드 단량체"는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오시드, 이의 유사체 및 변형된 데옥시리보뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오시드 단량체를 의미한다. 용어 "데옥시리보뉴클레오티드 단량체"는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오티드, 이의 유사체 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 단량체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "리보뉴클레오시드 단량체"는 자연 발생 리보뉴클레오시드, 이의 유사체 및 변형된 리보뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오시드 단량체를 의미한다. 용어 "리보뉴클레오티드 단량체"는 자연 발생 리보뉴클레오티드, 이의 유사체 및 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 단량체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오시드"는 핵염기 모이어티 및 당 모이어티를 포함하는 화합물을 의미한다. 뉴클레오시드 단량체는 자연 발생 뉴클레오시드(예컨대 각각 DNA 및 RNA에서 발견되는 데옥시리보뉴클레오시드 및 리보뉴클레오시드), 이의 유사체 및 변형된 뉴클레오시드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오시드 단량체는 데옥시리보뉴클레오시드 단량체 또는 리보뉴클레오시드 단량체일 수 있다. 뉴클레오시드 단량체는 포스페이트 모이어티에 연결되어, 예컨대 뉴클레오티드 단량체가 될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 포스페이트 연결기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 뉴클레오티드 단량체는 자연 발생 뉴클레오티드(예컨대 각각 DNA 및 RNA에서 발견되는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드), 이의 유사체 및 변형된 뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드 단량체는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체 또는 리보뉴클레오티드 단량체일 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 하기 중 하나 이상에서 변형될 수 있다: 질소 함유 핵염기 모이어티, 5탄당 당 모이어티, 및 뉴클레오시드간 연결에 변화를 초래하는 포스페이트 연결기.
본원에 사용된 용어 "올리고" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 복수의 연결된 뉴클레오시드 단량체를 포함하는 화합물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오시드 단량체 또는 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결이 변형된다.
용어 "데옥시뉴클레오시드" 및 "데옥시리보뉴클레오시드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "데옥시뉴클레오티드" 및 "데옥시리보뉴클레오티드"는 또한 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 "데옥시뉴클레오시드" 또는 "데옥시뉴클레오티드"는 각각 데옥시 당 모이어티를 함유하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 바와 같이, "짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA)"에서와 같은 용어 "듀플렉스 DNA"는 듀플렉스 올리고뉴클레오티드를 형성하도록 서로 혼성화하고 세포와 접촉하게 되거나 대상체에게 투여되는 뉴클레오티드 단량체의 2개의 가닥 또는 쇄로 구성된 분자를 의미하며, 주요 RNA 표적화 모티프의 연결된 뉴클레오티드 단량체의 대부분, 즉 50% 이상이 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체이다.
본원에 사용된 용어 "모티프"는, 예컨대 안티센스 가닥 또는 센스 가닥에서 화학적으로 구별되는 영역의 패턴을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "바로 인접한"은 2개의 요소 사이, 예컨대 영역, 세그먼트, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드 사이에 개재하는 요소가 없음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 적어도 하나의 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 연결 및/또는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 적어도 하나의 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "자연 발생 뉴클레오시드간 연결"은 3'에서 5'로의 포스포디에스테르 연결을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결"은 자연 발생 뉴클레오시드간 결합으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 지칭한다. 예컨대, 포스포로티오에이트 연결은 변형된 뉴클레오시드간 연결이다.
본원에 사용된 용어 "천연 당 모이어티"는 DNA (2-H) 또는 RNA (2-OH)에서 자연적으로 발견되는 당을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "변형된 당"은 천연 당으로부터의 치환 또는 변화를 지칭한다. 예컨대, 2'-O-메톡시에틸 변형된 당은 하나의 변형된 당이다.
본원에 사용된 용어 "이환식 당"는 2개의 비-제미날(geminal) 고리 원자의 브릿징에 의해 변형된 푸로실 고리를 의미한다. 이환식 당은 변형된 당이다.
본원에 사용된 용어 "이환식 핵산", "BNA", "이환식 뉴클레오시드" 또는 "이환식 뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 푸라노스 부분이 푸라노스 고리 상의 2개의 탄소 원자를 연결하는 브릿지를 포함함으로써 이환식 고리 시스템을 형성하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "2'-O-메톡시에틸"(또한 2'-MOE, 2'-O(CH2)2―OCH3 및 2'-O-(2-메톡시에틸))은 푸로실 고리의 2' 위치의 O-메톡시-에틸 변형을 지칭한다. 2'-O-메톡시에틸 변형된 당은 하나의 변형된 당이다. 본원에 사용된 용어 "2'-O-메톡시에틸 뉴클레오티드"(또한 2'-MOE RNA)는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "변형된 핵염기"는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘 또는 우라실 이외의 임의의 핵염기를 지칭한다. 예컨대, 5-메틸시토신은 변형된 핵염기이다. 대조적으로, 본원에서 사용된 "변형되지 않은 핵염기"는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신(C), 및 우라실(U)을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "5-메틸시토신"은 5 위치에 부착된 메틸기로 변형된 시토신을 의미한다. 5-메틸시토신은 변형된 핵염기이다.
본원에 사용된 "RNA 유사 뉴클레오티드"는 노던 구성을 채택하고 올리고뉴클레오티드에 통합될 때 RNA와 같은 기능을 하는 변형된 뉴클레오티드를 의미한다. RNA 유사 뉴클레오티드는 2'-엔도 푸라노실 뉴클레오티드, 브릿징된 핵산(BNA), LNA, cEt, 2'-O-메틸화 핵산, 2'-O-메톡시에틸화(2'-MOE) 핵산, 2'-플루오르화 핵산, 2'-O-아미노프로필화(2'-AP) 핵산, 헥시톨 핵산(HNA), 사이클로헥산 핵산(CeNA), 펩티드 핵산(PNA), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 모르폴리노 핵산, 트리사이클로-DNA(tcDNA) 및 RNA 대용물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "DNA 유사 뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드에 통합될 때 DNA와 같이 기능하는 변형된 뉴클레오티드를 의미한다. DNA 유사 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노스(FANA) 뉴클레오티드 및 DNA 대용물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "비-코딩 RNA"는 단백질로 번역되지 않는 RNA 분자를 의미한다. 비-코딩 RNA의 예는 전달 RNA(tRNA) 및 리보솜 RNA(rRNA) 뿐만 아니라 작은 비-코딩 RNA 및 긴 ncRNA(lncRNA)를 포함한다. 본원에 사용된 "작은 비-코딩 RNA"의 예는 microRNA(miRNA), asRNA, pre-miRNA, pri-miRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA 및 전술한 것 중 임의의 것의 모방체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 "lncRNA", "긴 비-코딩 RNA"는 단백질을 코딩하지 않는 200개 초과의 뉴클레오티드를 함유하는 전사된 RNA 분자이다. LncRNA는 5'-캡핑, 3'-폴리아데닐화, 스플라이싱을 포함한 일반적인 전사 후 변형을 겪을 수도 있다. 일반적으로, IncRNA는 유전자 및 게놈 기능의 조정에서 다양한 역할을 하는 다양한 부류의 분자이다. 예컨대, lncRNA는 유전자 전사, 번역 및 후생적 조절을 조절하는 것으로 알려져 있다. IncRNA의 예는 Kcnqlotl, Xlsirt, Xist, ANRIL, NEAT1, NRON, DANCR, OIP5-AS1, TUG1, CasC7, HOTAIR 및 MALAT1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원 사용된 "스플라이스" 또는 "스플라이싱"은 RNA의 불필요한 영역을 제거하고 RNA를 재형성하는 천연 과정을 지칭한다. 듀플렉스를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 의한 RNA 표적 기능의 조정의 예는 비-코딩 RNA 기능의 조정이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스는 전술한 작은 비-코딩 RNA 중 하나를 표적화하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스는 miRNA를 표적화하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스는 pre-miRNA를 표적화하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스는 pri-miRNA를 표적화하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스는 lncRNA를 표적화하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스는 스플라이스를 표적화하도록 설계된다.
본원에 사용된 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 천연 상태에서 일반적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 순도 및 균질성은 전형적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 이용하여 결정된다.
본원에 사용된 용어 "산재된(interspersed)"은, 예컨대 상이한 종류의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 동일한 종류의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 상이한 변형에 의해 인접한 공간에 상이한 종류의 모이어티를 갖는 것을 지칭한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, "리보뉴클레오티드 단량체(들)의 산재된 세그먼트(ISR)"는 하나 또는 다수의 리보뉴클레오티드(들)가 이(이들)와 상이한 종류인 적어도 하나의 모이어티에 연결된 올리고뉴클레오티드 가닥의 섹션을 지칭한다. 예컨대, 상기 리보뉴클레오티드(들)가 변형되지 않은 경우, 상이한 종류의 모이어티는 데옥시뉴클레오티드 또는 이의 유사체, 변형된 데옥시뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 상기 리보뉴클레오티드(들)가 변형된 경우, 상이한 종류의 모이어티는 데옥시뉴클레오티드 또는 이의 유사체, 변형된 데옥시뉴클레오티드, 변형되지 않은 리보뉴클레오티드, 상이하게 변형된 리보뉴클레오티드, 또는 상이한 종류의 리보뉴클레오티드 유사체일 수 있다.
본원에 사용된 "조정하는", "조절하는" 및 이의 문법적 동등어는 증가 또는 감소(예컨대, 침묵), 달리 말해서 상향 조절 또는 하향 조절을 지칭한다. 본원에 사용된 "유전자 침묵"는 유전자 발현의 감소를 지칭하며, 표적화된 유전자의 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 유전자 발현의 감소를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "억제하는", "억제하다" 및 이들의 문법적 동등어는 생물활성과 관련하여 사용될 때 표적화된 기능, 예컨대 단백질의 생성 또는 분자의 포스포릴화를 감소시키거나 제거할 수 있는 생물 활성의 하향 조절을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 억제는 표적화된 활성의 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 감소를 지칭할 수 있다. 장애 또는 질환의 맥락과 관련하여 사용될 때, 이 용어는 증상의 발병을 방지하거나, 증상을 완화하거나, 질환, 병태 또는 장애를 제거하는 데 성공하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 상보적인" 또는 "상보적인"은 말단 돌출부 또는 2개의 이중 가닥 영역 사이의 갭 영역과 같은 임의의 단일 가닥 영역이 아닌 연결된 뉴클레오시드의 2개의 쇄 사이의 염기 짝지은 이중 가닥 영역에서의 상보성을 지칭한다. 상보성은 완벽할 필요는 없으며; 예컨대, 연결된 뉴클레오시드의 2개의 쇄 사이에는 임의의 수의 염기쌍 미스매치가 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 수가 너무 많아서 최소한의 엄격한 혼성화 조건에서도 혼성화가 일어날 수 없는 경우, 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. 구체적으로, 본원에서 두 서열이 "실질적으로 상보적"이라고 언급되는 경우, 이는 선택된 반응 조건 하에서 혼성화하도록 서열이 서로 충분히 상보적임을 의미한다. 특이성을 달성하기에 충분한 핵산 상보성과 혼성화의 엄격함의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 2개의 실질적으로 상보적인 가닥은, 예컨대 완벽하게 상보적일 수 있거나, 혼성화 조건이, 예컨대 쌍을 이루는 서열과 쌍을 이루지 않는 서열 사이의 구별을 허용하기에 충분하다면 1개 내지 많은 미스매치를 함유할 수 있다. 따라서, 실질적으로 상보적인 서열은 이중 가닥 영역에서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 또는 이 사이의 임의의 숫자의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 "완전히 상보적인" 또는 "100% 상보적인"은 연결된 뉴클레오시드의 제1 가닥의 핵염기 서열의 각각의 핵염기가 연결된 뉴클레오시드의 제2 가닥의 제2 핵염기 서열에 상보적인 핵염기를 갖는다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 연결된 뉴클레오시드의 제1 가닥은 안티센스 화합물이고, 연결된 뉴클레오시드의 제2 가닥은 표적 핵산이다. 특정 실시양태에서, 연결된 뉴클레오시드의 제1 가닥은 센스 화합물이고, 연결된 뉴클레오시드의 제2 가닥은 안티센스 화합물이거나 그 반대이다.
본원에 사용된 용어 "표적화 영역"은 올바른 조건 하에서 2개의 가닥이 이러한 표적화 영역에서 서로 혼성화하거나 어닐링하도록 또 다른 올리고뉴클레오티드 가닥에 대해 실질적으로 또는 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드 가닥 내의 영역을 지칭한다. 예컨대, 안티센스 가닥은 표적화된 mRNA와 혼성화할 수 있는 표적화 영역을 포함할 수 있다.
용어 "투여하다", "투여하는" 또는 "투여"는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 본원에 기재된 화합물 또는 약학 조성물을 대상체에게 도입하는 임의의 방법을 지칭하며, 예컨대 대상체에게 전신적으로, 국소적으로 또는 제자리에서 화합물을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, (화합물을 포함하는지 여부에 관계없이) 조성물로부터 대상체에서 생성되는 본 개시내용의 화합물은 이러한 용어에 포괄된다. 이러한 용어가 용어 "전신적" 또는 "전신적으로"와 관련하여 사용되는 경우, 이는 일반적으로 혈류 내 화합물 또는 조성물의 생체내 전신 흡수 또는 축적 후 전신에 걸쳐 분포되는 것을 지칭한다.
용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 하기에서 설명되는 바와 같이 질환 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 의도된 결과에 영향을 미치기에 충분한, 본원에 기재된 화합물 또는 약학 조성물의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "치료학적 유효량"은 암세포의 성장 또는 확산의 검출 가능한 사멸 또는 억제, 종양의 크기 또는 수, 및/또는 암의 수준, 병기, 진행 및/또는 중증도의 다른 척도에 효과적인 양이다. 일부 실시양태에서, "치료학적 유효량"은 전신, 국소 또는 제자리에서 투여되는 양(예컨대, 대상체에서 제자리에서 생성되는 화합물의 양)을 지칭한다. 치료학적 유효량은 의도된 적용(시험관내 또는 생체내), 또는 치료되는 대상 및 질환 상태, 예컨대 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 이 용어는 또한 표적 세포에서 특정 반응, 예컨대 세포 이동 감소를 유도할 용량에도 적용된다. 특정 용량은, 예컨대 특정 약학 조성물, 대상체 및 이들의 연령 및 기존 건강 상태 또는 건강 상태에 대한 위험, 따라야 할 투여 요법, 질환의 중증도, 다른 작용제와 조합하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여되는 조직, 및 운반되는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 수 있다.
대상체에서 용어 "암"은 제어되지 않는 증식, 불멸성, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식 속도, 특정 형태학적 특색과 같은 암 유발 세포의 전형적인 특징을 보유하는 세포의 존재를 지칭한다. 종종 암세포는 종양 또는 덩어리의 형태로 존재하지만, 이러한 세포는 대상체 내에서 단독으로 존재할 수 있거나, 백혈병 또는 림프종 세포와 같은 독립적인 세포로서 혈류에서 순환할 수 있다. 본원 사용된 암의 예는 폐암, 췌장암, 골암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 유방암, 자궁암, 난소암, 복막암, 결장암, 직장암, 결장직장 선암종, 항문 영역의 암, 위암(stomach cancer), 위암(gastric cancer), 위장암, 위 선암종, 부신피질호르몬 암종, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 질환, 식도암, 위식도 접합부 암, 위식도 선암종, 연골육종, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종 조직, 유잉 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 고환암, 요관암, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담도암, 신장암, 신세포암종, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척수 축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 수막종, 편평 세포 암종, 뇌하수체 선종, 상기 암 중 임의의 것의 난치성 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시된 암 중 일부는 일반적인 용어에 포함되어 이 용어에 포함된다. 예컨대, 일반적인 용어인 비뇨기과암은 방광암, 전립선암, 신장암, 고환암 등을 포함하고; 또 다른 일반적인 용어인 간담도암은 간암(그 자체는 간세포 암종 또는 담관암종을 포함하는 일반적인 용어), 담낭암, 담도암 또는 췌장암을 포함한다. 비뇨기과암 및 간담도암 모두 본 개시내용에 의해 고려되며 용어 "암"에 포함된다.
용어 "약학 조성물"은 활성 성분, 예컨대 본원에 개시된 분자 또는 조성물을 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로, 종종 다른 물질, 예컨대 약학적 담체, 예컨대 멸균 수용액과 혼합하여 함유하는 제형이다. 한 실시양태에서, 약학 조성물은 벌크 또는 단위 투여 형태이다. 단위 투여 형태는, 예컨대 캡슐, IV 백, 정제, 에어로졸 흡입기 상의 단일 펌프, 또는 바이알을 포함하는 다양한 형태 중 임의의 것이다. 단위 용량의 조성물 중의 활성 성분의 양은 효과의 양이며 관련된 특정 치료에 따라 달라진다. 당업자는 환자의 연령 및 상태에 따라 용량을 일상적으로 변경하는 것이 때때로 필요하다는 것을 이해할 것이다. 용량은 또한 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 경구, 폐, 직장, 비경구, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내 등을 포함하는 다양한 경로가 고려된다. 본 발명의 sdDNA의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다.
용어 "약제"는 개체에게 투여될 때 치료적 이익을 제공하는 물질을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 화합물의 구조를 방해하지 않는 매질 또는 희석제를 의미한다. 이러한 담체 중 일부는 약학 조성물이, 예컨대 대상체에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 및 로젠지로서 제형화될 수 있게 한다. 이러한 담체 중 일부는 약학 조성물이 주사, 주입 또는 국소 투여용으로 제형화될 수 있게 한다. 예컨대, 약학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액일 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는 유도체"는 용매화물, 수화물, 에스테르, 전구약물, 다형체, 이성질체, 동위원소 표지된 변이체, 약학적으로 허용되는 염 및 당업계에 공지된 다른 유도체와 같은 본원에 기재된 화합물의 유도체를 포괄한다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 화합물의 생리학적 및 약학적으로 허용되는 염, 즉 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 이에 원하지 않는 독성 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다. 용어 "약학적으로 허용되는 염" 또는 "염"은 모 화합물을 무기 또는 유기 산 및 염기를 포함한 약학적으로 허용되는 비-독성 산 또는 염기와 반응시켜 제조된 염을 포함한다. 본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염에 대한 검토는 문헌(Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002))을 참조한다. 약학적으로 허용되는 염은 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트, 수소 술페이트, 알킬술포네이트, 아릴술포네이트, 아세테이트, 벤조에이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 락테이트, 및 타르트레이트를 포함하는 산부가염; Na, K, Li와 같은 알칼리 금속 양이온, Mg 또는 Ca와 같은 알칼리 토금속 염, 또는 유기 아민 염을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 특히, 올리고뉴클레오티드의 나트륨 염이 유용한 것으로 입증되었으며 인간에 대한 치료 투여용으로 잘 받아들여지고 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물은 나트륨 염의 형태이다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 특정한 치료의 수용자인 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 동물(예컨대, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료할" 또는 "완화하는" 또는 "완화할"과 같은 용어는 (1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애의 증상을 치유, 지연, 감소 및/또는 또는 이의 진행을 중단시키는 치료적 조치 및 (2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 방지거나 늦추는 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 대상체는 이미 장애가 있는 대상체; 장애를 갖기 쉬운 대상체; 및 장애를 방지해야 하는 대상체를 포함한다. 대상체가 하기 중 하나 이상을 나타내는 경우, 대상체는 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료"된 것이다: 암세포의 수의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기 감소; 연조직 및 골로의 암 확산을 포함하여 말초 기관으로의 암세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 완화; 이환률 및 사망률 감소; 및 삶의 질의 개선.
본원에 사용된 용어 "담체"는 약학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 본 약학적 화합물을 신체의 하나의 기관 또는 일부로부터 신체의 또 다른 기관 또는 일부로 운반 또는 수송하는 데 관련되는 또는 할 수 있는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 양립 가능하고 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 약학적으로 허용되는 담체, 담체 및/또는 희석제의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 이의 유도체; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충 용액; 및 약학적 제형에 사용되는 다른 비-독성의 양립 가능한 물질. 나트륨 라우릴 술페이트, 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드 공중합체와 같은 습윤제, 유화제 및 윤활제 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 향료, 보존제 및 항산화제도 조성물에 존재할 수 있다.
2. 특정 실시양태-sdDNA 구조 스캐폴드
본 발명의 특정 실시양태는 안티센스 가닥 및 센스 가닥이 모두 연결된 뉴클레오시드 단량체로 이루어진 듀플렉스 조성물을 제공한다. 주요 RNA 표적화 모티프에 있는 뉴클레오시드 단량체의 50% 이상은 데옥시리보뉴클레오시드 단량체이거나, sdDNA 분자의 이중 가닥 영역의 한 가닥에 있는 50% 이상의 핵염기는 데옥시리보뉴클레오시드 단량체, 및 그 안에 함유된 데옥시리보뉴클레오시드 단량체 중 일부를 포함하고/하거나 뉴클레오시드간 연결(들)은 천연 DNA에서 발견되는 것으로부터 변형될 수 있다. 본 발명의 듀플렉스 DNA 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 단량체(들)의 산재된 세그먼트("ISR")에 리보뉴클레오시드 단량체를 추가로 포함한다. 하나 이상의 ISR은 안티센스나 센스 가닥, 또는 둘 다에서 발견될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 ISR은 독립적으로 1개의 리보뉴클레오티드 단량체, 또는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 근접한 리보뉴클레오티드 단량체로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ISR은 적어도 2개의 근접하고 연결된 리보뉴클레오티드 단량체를 갖는다.
본 발명의 짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA)의 안티센스 및 센스 가닥 둘 다는 상대적으로 짧고, 센스 가닥의 길이는 적어도 안티센스 가닥의 길이와 동일하므로 "짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA)"가 된다. 또한, 특정 실시양태에서, 2개의 가닥 사이의 길이가 동일한 경우, 본 발명의 듀플렉스 분자는 보다 구체적으로 "대칭의 짧은 듀플렉스 DNA"로 불릴 수 있다.
본 발명의 듀플렉스 분자의 예시적인 구조 및 서열이 도 1a, 2a, 4a, 5a, 6a 및 7a에 나타나 있으며, ISR은 두 가닥 모두에서 또는 안티센스 가닥에서만 발견된다.
일부 실시양태에서, 동일한 길이의 안티센스 및 센스 가닥은 어떠한 돌출부도 없이 대칭적 구조를 형성한다.
본 발명의 조성물은 적어도 3가지 방식으로 진핵 세포에서 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 데 사용된다: (i) 한 종류의 sdDNA 분자가 세포와 접촉하게 되거나 대상체에게 투여되고; (ii) 상이한 종류의 sdDNA 분자가 세포와 접촉하게 되거나 상이한 시기에 별도로 대상체에게 투여되고; (ii) 상이한 종류의 sdDNA 분자가 세포와 접촉하게 되거나 대상체에게 동시에 투여된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥은 mRNA 및 비-코딩 RNA를 포함하여 표적화되는 표적 유전자의 표적 세그먼트에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보적인 "표적화 영역"으로 불리는 핵염기 서열 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적화되는 표적 RNA의 표적 세그먼트의 완전히 상보적인 서열을 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적화되는 표적 RNA의 표적 세그먼트에 혼성화될 때 1, 2 또는 3개 이하의 미스매치(들)를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자는 포유동물 질환에 연루된 mRNA 또는 비-코딩 RNA로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ISR은 안티센스 가닥의 표적화 영역에 배치된다. 특정 실시양태에서, ISR은 안티센스 가닥의 5' 말단에 또는 근처에(즉, 가닥 길이의 1/3 이내, 이는 예컨대 약 21개의 핵염기 길이인 가닥에 대해, 말단을 카운팅하여 7개의 핵염기 이내를 의미함)에 위치된다. 대안적으로, ISR은 안티센스 가닥의 3' 말단에 또는 근처에(즉, 가닥 길이의 1/3 이내, 이는 예컨대 약 21개의 핵염기 길이인 가닥에 대해, 말단을 카운팅하여 7개의 핵염기 이내를 의미함)에 있다. 일부 실시양태에서, ISR 또는 ISR의 적어도 일부는 또한 안티센스 가닥의 더 중앙 부분, 즉 길이의 중간 1/3에 위치되며, 이는 예컨대 약 21개의 핵염기 길이인 가닥에 대해, 안티센스 가닥의 양 말단으로부터 7개 초과의 핵염기가 떨어져 있는 것을 의미한다.
다양한 실시양태에서, 제1 또는 안티센스 가닥은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 연결된 뉴클레오티드 단량체, 또는 이의 등가물, 또는 상기 값 중 임의의 2개로 묶인 범위(범위 끝점 모두 포함)의 주쇄 길이를 갖는다. 예컨대, 제1 안티센스 가닥의 길이의 범위의 일부는 8-50개의 뉴클레오티드 단량체; 8-36개의 뉴클레오티드 단량체; 8-33개의 뉴클레오티드 단량체; 10-36개의 뉴클레오티드 단량체; 10-30개의 뉴클레오티드 단량체; 10-29개의 뉴클레오티드 단량체; 12-36개의 뉴클레오티드 단량체; 12-29개의 뉴클레오티드 단량체; 12-28개의 뉴클레오티드 단량체; 12-26개의 뉴클레오티드 단량체; 12-25개의 뉴클레오티드 단량체; 13-25개의 뉴클레오티드 단량체; 13-24개의 뉴클레오티드 단량체; 13-23개의 뉴클레오티드 단량체; 14-24개의 뉴클레오티드 단량체; 15-23개의 뉴클레오티드 단량체; 및 16-23개의 뉴클레오티드 단량체; 및 적어도 8개의 뉴클레오티드 단량체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥은 10 내지 36개(범위 끝점 모두 포함)의 뉴클레오티드 단량체 길이이다. 다시 말해, 안티센스 가닥은 10 내지 36개(범위 끝점 모두 포함)의 연결된 핵염기 단량체이다. 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥은 8 내지 100개, 10 내지 80개, 12 내지 50개, 14 내지 30개, 15 내지 23개, 16 내지 22개, 16 내지 21개, 또는 20개(범위 끝점 모두 포함)의 연결된 핵염기로 이루어진 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 14-23개(범위 끝점 모두 포함)의 연결된 뉴클레오시드 단량체로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20개의 연결된 뉴클레오시드 단량체로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 16개의 연결된 뉴클레오시드 단량체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 실질적으로 상보적이고, 안티센스 가닥의 전체 핵염기 서열과 비교하여 측정 시, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 연결된 영역의 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보적인 핵염기 서열을 포함한다. 두 가닥 모두로부터의 이러한 실질적으로 상보적인 서열은 하나 이상의 이중 가닥 영역을 형성한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 연결된 영역의 완전히 상보적인 서열을 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 그 결과, 2개의 가닥은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 염기쌍을 포함하는 이중 가닥 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ISR은 센스 가닥의 이중 가닥 영역에 배치된다.
특정 실시양태에서, ISR은 센스 가닥의 5' 말단에 또는 근처에(상기 말단을 카운팅하여 말단으로부터 핵염기의 총 수의 33% 이내), 또는 센스 가닥의 3' 말단에 또는 근처에(상기 말단을 카운팅하여 말단으로부터 핵염기의 총 수의 33% 이내) 위치된다. 일부 실시양태에서, ISR 또는 ISR의 적어도 일부는 또한 센스 가닥의 보다 중앙 부분에, 즉 센스 가닥의 양 말단으로부터 핵염기의 총 수의 33% 초과가 떨어져 위치된다. 일부 실시양태에서, ISR은 센스 가닥에 놓여질 필요가 없다.
한 특색에서, 센스 올리고뉴클레오티드 가닥은 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥과 동일한 길이를 갖거나 이보다 긴 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 전체 길이에서 안티센스 가닥보다 16개의 연결된 핵염기 길이가 긴 길이까지의 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 6 내지 66개(범위 끝점 모두 포함)의 뉴클레오티드 단량체 길이이다. 다시 말해, 이러한 센스 가닥은 6 내지 66개(범위 끝점 모두 포함)의 연결된 핵염기이다. 다른 실시양태에서, 센스 가닥은 20 내지 21개, 8 내지 36개, 10 내지 30개, 12 내지 25개, 14 내지 24개 또는 16 내지 23개(범위 끝점 모두 포함)의 연결된 핵염기로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66개의 연결된 핵염기 길이, 또는 상기 값의 임의의 2개에 의해 정의되는 범위(범위 끝점 모두 포함)로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 센스 올리고뉴클레오티드이다.
한 특색에서, 제2 센스 가닥의 길이는 제1 안티센스 가닥의 길이와 동일하다. 특정 실시양태에서, 듀플렉스의 양 말단은 평활 말단이다. 다른 특색에서, 제2 또는 센스 가닥은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 및 20과 같은 뉴클레오티드 단량체의 수 만큼 제1 가닥 또는 안티센스 가닥보다 긴 주쇄 길이를 갖는다. 다양한 실시양태에서, 제2 또는 센스 가닥은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66개의 연결된 뉴클레오티드 단량체, 또는 이의 등가물, 또는 상기 값 중 임의의 2개로 묶인 범위(범위 끝점 모두 포함)의 주쇄 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 예컨대, 제2 센스 가닥의 범위 중 일부는 6-66개의 뉴클레오티드 단량체; 8-50개의 뉴클레오티드 단량체; 8-40개의 뉴클레오티드 단량체; 8-36개의 뉴클레오티드 단량체; 8-33개의 뉴클레오티드 단량체; 10-36개의 뉴클레오티드 단량체; 10-30개의 뉴클레오티드 단량체; 10-29개의 뉴클레오티드 단량체; 12-29개의 뉴클레오티드 단량체; 12-28개의 뉴클레오티드 단량체; 12-26개의 뉴클레오티드 단량체; 12-25개의 뉴클레오티드 단량체; 12-24개의 뉴클레오티드 단량체; 13-25개의 뉴클레오티드 단량체; 13-24개의 뉴클레오티드 단량체; 13-23개의 뉴클레오티드 단량체; 14-24개의 뉴클레오티드 단량체; 15-23개의 뉴클레오티드 단량체; 16-23개의 뉴클레오티드 단량체; 및 적어도 8개의 뉴클레오티드 단량체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개의 뉴클레오티드 단량체가 길다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 8-36개(범위 끝점 모두 포함)의 연결된 뉴클레오시드 단량체로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 13개의 연결된 뉴클레오시드 단량체로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 14개의 연결된 뉴클레오시드 단량체로 이루어진다.
본 발명의 특정 실시양태에서, sdDNA 분자의 2개의 가닥은 어떠한 돌출부도 없이 대칭적 듀플렉스를 형성한다. 다양한 일부 다른 실시양태에서, 제1 가닥(안티센스 가닥)의 2개의 말단은 하기 구성 중 하나이다: 3'-돌출부 및 5'-평활 말단; 5'-돌출부 및 3'-평활 말단; 3'-돌출부 및 5'-함몰 말단; 3'-함몰 말단 및 5'-돌출부; 또는 3'-함몰 말단 및 5'-함몰 말단.
특정 실시양태에서, 센스 가닥의 3'-돌출부는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 단량체의 길이를 갖는다. 다양한 실시양태에서, 센스 가닥의 3'-돌출부는 1-8개, 1-5개, 1-3개, 또는 1-2개의 뉴클레오티드 단량체(범위 끝점 모두 포함)의 길이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥의 5'-돌출부는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 단량체의 길이를 갖는다. 다양한 실시양태에서, 센스 가닥의 3'-돌출부는 1-8개, 1-5개, 1-3개, 또는 1-2개의 뉴클레오티드 단량체(범위 끝점 모두 포함)의 길이를 갖는다.
본 발명의 sdDNA 분자에서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 내의 적어도 하나의 뉴클레오티드 단량체는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 당, 주쇄, 및/또는 염기 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 주쇄 변형된 뉴클레오티드는, 예컨대 질소 또는 황 헤테로원자 중 적어도 하나를 포함하도록 뉴클레오시드간 연결에서 적어도 하나의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트(P=S) 기, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 또는 포스포르아미데이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 이러한 변형된 뉴클레오시드간 연결은 2개의 데옥시리보뉴클레오시드 단량체, 2개의 리보뉴클레오시드 단량체, 또는 1개의 데옥시리보뉴클레오시드 단량체 및 1개의 리보뉴클레오시드 단량체 사이에 있을 수 있다. 대안적으로, 말단 뉴클레오시드 단량체 중 적어도 하나 상의 포스페이트 기는 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드간 연결은 티오-포스포르아미데이트 뉴클레오시드간 연결이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 가닥의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 특정 실시양태에서, 가닥, 안티센스 또는 센스 또는 둘 모두 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 또는 포스포로티오에이트와 포스포디에스테르 연결의 혼합이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 변형된 당 모이어티를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오시드 단량체를 포함한다. 이러한 뉴클레오시드 단량체는 데옥시리보뉴클레오시드 단량체 또는 리보뉴클레오시드 단량체일 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 당 모이어티의 2' 위치는 OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2, 또는 CN으로부터 선택되는 군으로 대체되며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티의 2' 위치는 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), 또는 O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)로부터 선택되는 군으로 대체되고, 여기서 각각의 Rl, Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬이다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2'(cEt) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 4'-C(CH3)(CH3)-O-2', 4'-CH2-N(OCH3)-2', 4'-CH2-O-N(CH3)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2'(여기서, R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임), 4'-CH2-C(H)(CH3)-2', 및 4'-CH2-C-(=CH2)-2'의 군으로부터 선택되는 이환식 당으로 치환된다.
일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당(MOE), 4'-(CH2)-O-2' 이환식 당(LNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노스(FANA), 및 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2) 이환식 당(cEt)의 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 분자의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 변형된 핵염기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드 단량체를 포함한다. 이러한 뉴클레오시드 단량체는 데옥시리보뉴클레오시드 단량체 또는 리보뉴클레오시드 단량체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 핵염기는 5-메틸시토신(5-Me-C), 이노신 염기, 트리틸화 염기, 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 히포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 및 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌의 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 분자 내의 변형된 핵염기는 5-메틸시토신이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 분자 내의 각각의 시토신 염기는 5-메틸시토신이다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 5-메틸우라실이다. 특정 실시양태에서, 각각의 우라실은 5-메틸우라실이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 분자의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 또는 둘 다는 연결된 데옥시뉴클레오시드 단량체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전체 센스 가닥은 연결된 데옥시뉴클레오시드 단량체로만 이루어진다. 한 특색에서, 안티센스 가닥 또는 안티센스 및 센스 가닥 둘 다는 연결된 데옥시뉴클레오시드 단량체 외에 하나 이상의 연결된 리보뉴클레오시드 단량체로 이루어진 ISR을 추가로 포함한다. 또한, 더 많은 ISR 세그먼트가 있을 수 있다. ISR은 어느 가닥의 어느 곳에나 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 ISR은 말단 뉴클레오시드 단량체, 또는 끝에서 제2 말단 뉴클레오시드 단량체를 포함한다. 특정 실시양태에서, ISR 각각은 독립적으로 1개의 리보뉴클레오시드 단량체, 2, 3, 4 또는 5개의 연결된 리보뉴클레오시드 단량체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 영역의 적어도 하나의 가닥 내의 핵염기의 적어도 절반은 데옥시리보뉴클레오티드 단량체이다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 영역의 RNA 표적화 부분의 제1 가닥 내의 뉴클레오티드의 적어도 50%는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체이다.
특정 실시양태에서, sdDNA 분자 내의 리보뉴클레오티드 단량체(들)의 총 수는 동일한 sdDNA 분자 내의 데옥시리보뉴클레오티드 단량체의 총 수 이하이다.
특정 실시양태에서, ISR의 연결된 리보뉴클레오시드 단량체 중 적어도 하나 또는 각각은 변형된 리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 유사체이다. 리보뉴클레오티드는 하기와 동일하거나 유사한 방식으로 변형될 수 있다: 변형된 뉴클레오시드간 연결, 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 핵염기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레오티드 단량체의 당 모이어티는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오티드(2-H) 또는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노스(FANA)의 당 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 리보뉴클레오티드 단량체의 당 모이어티는 자연 발생 리보뉴클레오티드(2-OH), 2'-F 변형된 당, 2'-OMe 변형된 당, 2'-O-메톡시에틸 변형된 당(MOE), 4'-(CH2)-O-2' 이환식 당(LNA) 및 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2) 이환식 당(cEt)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥, 센스 가닥 또는 두 가닥 모두에서, 내부의 각각의 ISR의 적어도 하나 또는 각각의 리보뉴클레오시드 단량체는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당(MOE), 4'-(CH2)-O-2' 이환식 당(LNA), 및 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2) 이환식 당(cEt)의 군으로부터 선택되는 변형된 당 모이어티를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥, 센스 가닥 또는 두 가닥 모두에서, 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오시드 단량체는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노스(FANA)의 변형된 당 모이어티를 갖는다. 특정 실시양태에서, 각각의 ISR의 각각의 리보뉴클레오시드 단량체는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당, 4'-(CH2)-O-2' 이환식 당, 또는 메틸(메틸렌옥시)(4'-CH(CH3)-O-2) 이환식 당(cEt)를 갖고, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이고, 각각의 우라실은 5-메틸우라실 또는 메틸-슈도우라실이고, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 분자는 데옥시뉴클레오시드 단량체로 이루어진 안티센스 가닥 또는 센스 가닥을 가지며, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 분자는 데옥시뉴클레오시드 단량체로 이루어진 안티센스 가닥 또는 센스 가닥을 가지며, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 변형이 없는 천연 포스페이트 연결이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 분자는 센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드 단량체는 안티센스 가닥의 상보적인 뉴클레오티드 단량체와 동일한 변형을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥 및 센스 올리고뉴클레오티드 가닥을 갖는 본 발명의 예시적인 분자의 예시적인 구조 및 예시적인 서열이 도 1a, 2a, 4a, 5a, 6a 및 7a에 나타나 있다.
특정 실시양태에서, 짧은 DNA 듀플렉스 및 듀플렉스 분자의 안티센스 가닥 내의 적어도 하나의 ISR은 강력한 유전자 침묵을 가능하게 한다. 하기의 모든 실시예에 제시된 데이터는 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 및 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 내의 적어도 하나의 ISR을 갖는 듀플렉스에 기초한 새로운 플랫폼 기술이 매우 강력한 유전자 침묵을 가능하게 했음을 시사한다. 다양한 ISR 모티프, 다양한 길이, 상보성 및 미스매치, 다양한 변형 등을 포함한 sdDNA의 SAR(구조-활성 관계) 특색에 대한 추가 연구가 수행되었으며, 이는 유전자 침묵 활성에 영향을 미칠 수 있는 다양한 구조적 요인 또는 스캐폴드 특색을 정의하는 데 도움이 된다. 이러한 SAR 인자 및 설계 특색은 전형적인 포유동물 세포에서 100,000개 초과의 상이한 mRNA 뿐만 아니라 훨씬 더 많은 비-코딩 RNA의 다양한 서열 및 구조를 표적화하는 최적화된 유전자 사일런서를 설계하는 데 중요하다. sdDNA의 유전자 침묵 활성 및 SAR에 대한 본 발명자들의 데이터는 sdDNA의 유전자 침묵 특색이 siRNA 및 ASO와 크게 상이하며, 이는 아직 확인되지 않은 새롭고 독특한 유전자 침묵 메커니즘을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 분자는 적어도 하나의 화학적 변형 또는 2차 구조를 통해 분해에 대해 안정화될 수 있다. 센스 올리고뉴클레오티드 가닥 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥은 매치되지 않거나 불완전하게 매치된 뉴클레오티드 단량체를 가질 수 있다. 센스 올리고뉴클레오티드 가닥 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥은 하나 이상의 닉(핵산 주쇄의 절단부), 갭(하나 이상의 빠진 뉴클레오티드를 갖는 단편화된 가닥) 및 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 가질 수 있다. 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥 내의 임의의 또는 모든 뉴클레오티드 단량체가 화학적으로 변형될 수 있을 뿐만 아니라, 각각의 가닥은, 예컨대 모이어티 또는 리간드는 펩티드, 항체, 항체 단편, 중합체, 다당류, 지질, 소수성 모이어티 또는 분자, 양이온성 모이어티 또는 분자, 친유성 화합물 또는 모이어티, 올리고뉴클레오티드, 콜레스테롤, GalNAc 및 압타머로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티 또는 리간드에 접합되어 이의 기능성을 향상시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 듀플렉스 분자의 이중 가닥 영역은 임의의 미스매치 또는 돌출을 함유하지 않으며, 2개의 가닥은 이중 가닥 영역에서 서로 완벽하게 상보적이다. 또 다른 실시양태에서, 듀플렉스의 이중 가닥 영역은 미스매치 및/또는 돌출을 함유한다.
특정 실시양태에서, 표적은 포유동물 질환에 연루된 mRNA 또는 비-코딩 RNA이다. 특정 실시양태에서, 표적은 mRNA이다. 특정 실시양태에서, 표적은 microRNA 및 lncRNA와 같은 비-코딩 RNA이다. 안티센스 가닥은 서로 실질적으로 상보적이고 표적 유전자를 불활성화시키는 한 표적 서열에 혼성화함으로써 표적을 점유할 수 있다.
3. 매치되지 않거나 미스매치된 영역
본 발명의 안티센스 가닥과 센스 가닥 사이의 상보적인 영역은, 예컨대 하나 이상의 미스매치를 함유하는 적어도 하나의 매치되지 않거나 불완전하게 매치된 영역을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 제공된 sdDNA의 센스 가닥은 sdDNA의 유전자 침묵 활성에 어떠한 영향도 주지 않고 3개 이상(표적화 영역의 적어도 15%)의 미스매치를 함유할 수 있다. 센스 가닥 내의 미스매치는 때때로 표적외 효과를 줄이거나 sdDNA에 다른 특색을 가능하게 하기 위해 필요하다.
당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 활성을 제거하지 않고 미스매치 염기를 도입하는 것이 가능하다. 유사하게, 본 발명의 sdDNA의 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥은 매치되지 않거나 미스매치된 영역(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 sdDNA의 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥은 유전자 침묵 활성을 유지하면서 적어도 3개(표적화 영역의 적어도 15%)의 미스매치를 견딜 수 있다. 안티센스 가닥 내의 미스매치는 때때로 표적외 효과를 줄이거나 sdDNA에 다른 특색을 가능하게 하기 위해 필요하다.
4. 변형
뉴클레오시드 단량체는 염기-당 조성이다. 뉴클레오시드 단량체의 핵염기(염기로도 알려짐) 부분은 일반적으로 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다. 뉴클레오티드 단량체는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드 단량체이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드 단량체의 경우, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 인접한 뉴클레오시드 단량체가 서로 공유적 연결을 통해 형성되어 선형의 중합체성 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트 기는 일반적으로 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 연결을 형성하는 것으로 지칭된다.
본 발명의 sdDNA 분자, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥에 대한 변형은 뉴클레오시드간 연결, 당 모이어티 또는 핵염기에 대한 치환 또는 변화를 포괄한다. 변형된 sdDNA, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 일부 경우에서, 예컨대 증가된 억제 활성, 향상된 세포 흡수, 향상된 가닥 친화성, 용해도, 감소된 비-특이적 상호작용 및 RNase 분해에 대한 내성 또는 달리 향상된 안정성과 같은 바람직한 특성 때문에 천연 형태에 비해 선호된다. 결과적으로, 이러한 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 단량체를 갖는 더 짧은 안티센스 가닥을 사용하여 유사한 결과를 종종 얻을 수 있다. 본 발명의 안티센스 및 센스 가닥 내의 천연 뉴클레오티드 중 하나 이상은 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로 치환될 수 있다. 치환은 안티센스 가닥 및 센스 가닥 어디에서나 일어날 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 압타머 및 RNAi를 포함하는 다양한 올리고뉴클레오티드 분자의 안정성을 개선하기 위해 올리고뉴클레오티드 분자의 변형이 조사되었다(Chiu and Rana, 2003; Czauderna et al., 2003; de Fougerolles et al., 2007; Kim and Rossi, 2007; Mack, 2007; Zhang et al., 2006; Schrnidt, 2007; Setten RL et al., 2020; Crooke ST et al., 2018; and Roberts TC et al., 2020).
당업자에게 공지된 임의의 안정화 변형을 이용하여 올리고뉴클레오티드 분자의 안정성을 향상시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드 분자 내에서 화학적 변형은 포스페이트 주쇄(예컨대, 포스포로티오에이트 연결), 당(예컨대, 잠긴 핵산, 글리세롤 핵산, cEt, 2'-MOE, 2'-플루오로우리딘, 2'-O-메틸), 및/또는 염기(예컨대, 2'-플루오로피리미딘)에 도입될 수 있다.
이러한 화학적 변형의 여러 예가 하기 섹션에 요약되어 있다.
다양한 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 당, 주쇄, 및/또는 염기 변형된 뉴클레오티드이다.
4.1 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 주쇄 변형된 뉴클레오티드
RNA 및 DNA의 자연 발생 뉴클레오시드간 연결은 3'에서 5'로의 포스포디에스테르 연결이다. 가닥 중 하나 또는 둘 다에 하나 이상의 변형된, 즉 비-자연 발생 뉴클레오시드간 결합을 갖는 본 발명의 sdDNA 분자는 때때로, 예컨대 향상된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 향상된 친화성, 및 뉴클레아제의 존재 시 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성 때문에 단지 자연 발생 뉴클레오시드간 연결을 갖는 상응하는 분자에 우선하여 선택된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드 가닥은 인 원자를 보유하는 뉴클레오시드간 연결 뿐만 아니라 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 한 실시양태에서, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결은 적어도 질소 및/또는 황 헤테로원자를 포함하도록 변형된다. 대표적인 인 함유 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 티오-포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인 함유 및 비-인 함유 연결의 제조 방법은 잘 알려져 있다.
한 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 주쇄 변형된 뉴클레오티드이다. 주쇄 변형된 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결에 변형을 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, 주쇄 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 특정 실시양태에서, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
4.2 변형된 당 모이어티
본 발명의 안티센스 및/또는 센스 가닥은 임의적으로 당 기가 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드 단량체를 함유할 수 있다. 이러한 당 변형된 뉴클레오시드 단량체는 향상된 뉴클레아제 안정성, 증가된 결합 친화성 또는 일부 다른 유익한 생물학적 특성을 가닥에 부여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 단량체는 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리의 예는 제한 없이 치환기의 추가(5' 및 2' 치환기 포함, 비-제미날 고리 원자를 브릿징하여 이환식 핵산(BNA) 형성, 리보실 고리 산소 원자를 S, N(R), 또는 C(R1)(R2)로 대체(R, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 보호기임) 및 이들의 조합을 포함한다. 화학적으로 변형된 당의 예는 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오시드(다른 개시된 5',2'-비스 치환된 뉴클레오시드에 대해서는 2008년 8월 21일에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2008/101157 참조) 또는 2' 위치에 추가의 치환과 함께 리보실 고리 산소 원자의 S로의 대체(2005년 6월 16일에 공개된 미국 특허 출원 US2005-0130923 참조) 또는 대안적으로 BNA의 5' 치환(2007년 11월 22일에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2007/134181 참조, 여기서 LNA는, 예컨대 5'-메틸 또는 5'-비닐 기로 치환됨)을 포함한다.
변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드 단량체의 예는 제한 없이 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 뉴클레오시드를 포함한다. 2' 위치의 치환체는 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각각의 R1, Rm 및 Rn은 독립적으로 독립적으로, H 또는 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬이다.
이환식 뉴클레오시드는 이환식 당 모이어티를 갖는 변형된 뉴클레오시드이다. 이환식 핵산(BNA)의 예는 제한 없이 4'와 2' 리보실 고리 원자 사이에 브릿지를 포함하는 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 sdDNA, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 하나 이상의 BNA 뉴클레오시드를 포함하며, 여기서 브릿지는 화학식: 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA);4'-CH(CH3)-O-2' 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (및 이의 유사체, 2008년 7월 15일 허여된 미국 특허 번호 7,399,845 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (및 이의 유사체, 2009년 1월 8일에 WO/2009/006478로 공개된 PCT/US2008/068922 참조); 4'-CH2-N(OCH3)-2'(및 이의 유사체, 2008년 12월 11일에 WO/2008/150729로 공개된 PCT/US2008/064591 참조); 4'-CH2-O-N(CH3)-2'(2004년 9월 2일에 공개된 미국 특허 출원 US2004-0171570 참조); 4'-CH2-N(R)-O-2'(여기서, R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임) (2008년 9월 23일에 허여된 미국 특허 번호 7,427,672 참조); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); 및 4'-CH2-C-(=CH2)-2' (및 이의 유사체, 2008년 12월 8일에 WO 2008/154401로 공개된 PCT/US2008/066154 참조) 중 하나를 포함한다.
특정 실시양태에서, 이환식 뉴클레오시드는 (A) α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2)BNA (B) β-D-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2) BNA (C) 에틸렌옥시(4'-(CH2)2-O-2') BNA,(D) 아미노옥시(4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노(4'-CH2-N(R)-O-2) BNA, (F) 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2) BNA (또한 제한된 에틸 또는 cEt로도 지칭됨), (G) 메틸렌-티오(4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노(4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸카르보사이클릭(4'-CH2-CH(CH3)-2) BNA, (J) 프로필렌 카르보사이클릭(4'-(CH2)3-2') BNA, 및 (K) 비닐 BNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 당 변형된 리보뉴클레오티드이며, 여기서 2'-OH 기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2, 및 CN으로부터 선택되는 군으로 대체되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 C1-C6 알킬, 알케닐 및 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 할로는 F, Cl, Br 및 I의 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 당 변형된 리보뉴클레오티드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드, 2'-F 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸(2'MOE) 변형된 뉴클레오티드, LNA(잠긴 핵산) 변형된 뉴클레오티드, GNA(글리세롤 핵산) 변형된 뉴클레오티드, 및 cEt(제한된 에틸) 변형된 뉴클레오티드의 군으로부터 선택된다.
혈청 내 엔도뉴클레아제 활성에 대한 내성을 증가시키는 2'-O-메틸퓨린 및 2'-플루오로피리미딘과 같은 리보스의 2' 위치에서의 화학적 변형을 채택하여 본 발명의 분자를 안정화시킬 수 있다. 변형 도입 위치는 분자의 침묵/조절 효능이 크게 감소하는 것을 피하기 위해 신중하게 선택되어야 한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드 단량체에 인접한 제1 뉴클레오티드 단량체는 2'-플루오로-리보뉴클레오티드이다.
4.3 변형된 핵염기
sdDNA 분자 내의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 또한 핵염기 (또는 염기) 변형 또는 치환을 가질 수 있다. 핵염기 (또는 염기) 변형 또는 치환은 자연 발생 또는 합성의 비변형된 핵염기와 구조적으로 구별 가능하지만 기능적으로 상호교환 가능하다. 천연 핵염기 및 변형된 핵염기 둘 다가 수소 결합에 참여할 수 있다. 이러한 핵염기 변형은 sdDNA 분자에 뉴클레아제 안정성, 결합 친화성 또는 일부 다른 유익한 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 변형된 핵염기는 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-Me-C)을 포함한다. 5-메틸시토신 치환을 포함한 특정 핵염기 치환은 안티센스 및 센스 가닥의 결합 친화성을 증가시키는 데 특히 유용하다. 예컨대, 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6-1.2℃까지 증가시키는 것으로 나타났다(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., 안티센스 Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
추가의 변형된 핵염기는 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 히포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 1-메틸 슈도우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
헤테로사이클릭 염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예컨대 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 안티센스 및 센스 가닥의 결합 친화성을 증가시키는 데 특히 유용한 핵염기는 2 아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 염기 변형된 뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 특이한 염기 또는 변형된 염기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 변형된 염기는 5-메틸시토신(5'-Me-C)이다. 특정 실시양태에서, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다. 특정 실시양태에서, 변형된 염기는 5-메틸우라실(5'-Me-U)이다. 특정 실시양태에서, 각각의 우라실은 5-메틸우라실이다.
안정성 또는 친화성에 도움이 될 수 있는 임의의 변형된 뉴클레오티드 또는 유사체는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다. 이러한 화학적 변형의 여러 예는 상기에 요약된 것과 동일하다.
5. 약학 조성물
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 sdDNA, 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 부형제" 또는 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 투여에 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항세균 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하도록 의도된다. 적합한 담체는 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Twentieth Edition," Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA., 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 리포솜 및 고정 오일과 같은 비-수성 비히클도 사용될 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 sdDNA 분자와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
본 발명의 분자와 함께 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체의 예는 약학적 담체, 양전하 담체, 리포솜, 지질 나노입자, 단백질 담체, 소수성 모이어티 또는 분자, 양이온성 모이어티 또는 분자, GalNAc, 다당류, 중합체, 나노입자, 나노에멀젼, 콜레스테롤, 지질, 친유성 화합물 또는 모이어티, 및 유지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상체에게 치료학적 유효량의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물은 정맥내 주사(iv), 피하 주사(sc), 경구(po), 근육내(im) 주사, 경구 투여, 흡입, 국소, 척수강내, 및 다른 영역 투여의 군으로부터 선택되는 경로를 통해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 치료학적 유효량은 1 ng 내지 1 g/일, 100 ng 내지 l g/일, 또는 1 μg 내지 l000 mg/일이다.
제형화 방법은 PCT 국제 출원 PCT/US02/24262(WO03/01 1224), 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0091639 및 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0071775에 개시되어 있으며, 이들 각각은 참조로 본원에 포함된다.
본 발명의 sdDNA 분자는 (활성 성분으로서) 치료학적 유효량(예컨대, 종양 성장의 억제, 종양 세포의 사멸, 세포 증식 장애의 치료 또는 예방 등을 통해 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 효과적인 수준)의 본 발명의 sdDNA 분자를 통상적인 절차에 따라(즉, 본 발명의 약학 조성물을 생성함으로써) 표준 약학적 담체 또는 희석제와 조합하여 제조되는 적합한 투여 형태로 투여된다.
이러한 절차는 원하는 제제를 얻기 위해 적절하게 성분을 혼합, 과립화, 압축 또는 용해시키는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 치료학적 유효량의 sdDNA 분자는 표준 약학적 담체 또는 희석제 없이 적합한 투여 형태로 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료학적 유효량의 본 발명의 듀플렉스 분자는 적합한 투여 형태로 투여된다. 약학적으로 허용되는 담체는 락토스, 테라 알바, 수크로스, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 고체 담체를 포함한다. 예시적인 액체 담체는 시럽, 땅콩유, 올리브유, 물 등을 포함한다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 당업계에 공지된 시간 지연 물질을 단독으로 또는 왁스, 에틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 메틸메타크릴레이트 등과 함께 포함할 수 있다. 다른 충전제, 부형제, 향미제 및 당업계에 공지된 다른 첨가제도 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 일반적으로 공지된 방식으로, 예컨대 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은 센스 올리고뉴클레오티드 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 물론, 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
본 발명의 조성물, 화합물, 조합물 또는 약학 조성물은 현재 화학요법 치료에 사용되는 많은 널리 공지된 방법으로 대상체에게 투여될 수 있다. 예컨대, 암 치료를 위해, 본 발명의 sdDNA 분자는 종양에 직접 주사되거나, 혈류 또는 체강에 주사되거나, 경구로 복용되거나, 패치로 피부를 통해 적용될 수 있다. 건선 병태의 치료를 위해, 전신 투여(예컨대, 경구 투여) 또는 피부의 병든 부위에의 국소 투여가 바람직한 투여 경로이다. 선택된 용량은 효과적인 치료를 구성하기에 충분해야 하지만 수용할 수 없는 부작용을 일으킬 만큼 높지는 않아야 한다. 질환 병태(예컨대, 암, 건선 등)의 상태 및 환자의 건강은 치료 동안 및 치료 후 합리적인 기간 동안 면밀히 모니터링되어야 한다.
6. 유용성
6.1 사용 방법
본 발명은 세포 또는 유기체에서 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 방법을 제공한다. 세포는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포일 수 있다. 이 방법은 선택적 유전자 침묵이 일어날 수 있는 조건 하에서 상기 세포 또는 유기체를 본원 개시된 sdDNA 분자와 접촉시키는 단계, 및 안티센스 가닥에 대해 실질적으로 상보적인 서열 부분을 갖는 표적 핵산에 대해 sdDNA 분자에 의해 수행되는 선택적 유전자 침묵을 매개하는 단계를 포함한다. 표적 핵산은 mRNA 또는 비-코딩 RNA와 같은 RNA일 수 있으며, 이러한 RNA는 단백질을 코딩하거나 질환에 연루된 생물학적 경로의 일부를 조절한다.
한 실시양태에서, 접촉 단계는 선택적 유전자 침묵이 일어날 수 있는 배양물 또는 유기체 내의 표적 세포로 sdDNA 분자를 도입하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 도입 단계는 혼합, 형질감염, 리포펙션, 감염, 전기천공, 또는 다른 전달 기술을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 도입 단계는 iv, sc, 척수강내, po, 흡입, 국소 또는 다른 임상적으로 허용되는 투여 방법을 통해 투여될 약학적 담체, 양전하 담체, 리포솜, 지질 나노입자, 단백질 담체, 중합체, 나노입자, 나노에멀젼, 지질, N-아세틸-갈락토스아민(GalNAc), 친유성 화합물 또는 모이어티 및 유지질의 군으로부터 선택되는 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 또는 희석제를 사용하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 침묵 방법은 세포 또는 유기체에서 유전자의 기능 또는 유용성을 결정하기 위해 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물에 의해 표적화되는 유전자 또는 RNA는 질환, 예컨대 인간 질환 또는 동물 질환, 병리학적 상태, 또는 바람직하지 않은 상태와 관련되거나 이에 연루된다. 추가 실시양태에서, 표적 유전자 또는 RNA는 병원성 미생물의 것이다. 더욱 추가의 실시양태에서, 표적 유전자 또는 RNA는 바이러스 기원의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 표적 유전자 또는 RNA는 종양 관련된다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물에 의해 표적화되는 유전자 또는 RNA는 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 퇴행성 질환, 감염성 질환, 증식성 질환, 대사 질환, 면역 매개 장애, 알러지 질환, 피부 질환, 악성 질환, 위장 장애, 간 장애, 호흡기 장애, 심혈관 장애, 피부 장애, 신장 장애, 류마티스 장애, 신경계 장애, 정신 장애, 내분비 장애, 또는 노화 관련 장애 또는 질환과 관련되거나 보다 구체적으로 이에 연루된 유전자 또는 RNA이다.
6.2 치료 방법
본 발명은 또한 ASO 및 siRNA에 대해 요약된 것을 포함하여 다양한 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다(Czech, 2006; de Fougerolles et al., 2007; Dykxhoorn et al., 2003; Kim and Rossi, 2007; Mack, 2007; Crooke ST et al., 2018; Setten RL et al., 2019; Roberts TC et al., 2020). 이 방법은 바로 위 섹션에 기재된 원하는 유전자 억제가 일어날 수 있는 조건 하에서 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 sdDNA 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
예시적 실시양태에서, sdDNA 분자 및 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 갖는 약학 조성물은 질환 또는 바람직하지 않은 병태를 치료 또는 예방하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 암 요법으로서 또는 암을 예방하기 위해 사용될 수 있다. sdDNA의 조성물은 세포 증식 장애 또는 악성 질환과 관련된 유전자를 침묵시키거나 녹다운시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 k-Ras, β-카테닌, Stat3이다. 이러한 종양유전자는 다수의 인간 암에서 활성적이고 이에 관련된다.
본 발명의 새로운 조성물은 또한 안구 질환(예컨대, 연령 관련된 황반변성(AMD) 및 당뇨병성 망막병증(DR)); 감염성 질환(예컨대, HIV/AIDS, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 단순 포진 바이러스(HSV), RCV, 거대 세포 바이러스(CMV), 뎅기열, 웨스트 나일 바이러스); 호흡 질환(예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스(RSC), 천식, 낭포성 섬유증); 신경계 질환(예컨대, 헌팅턴 질환(HD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 척수 손상, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 통증); 심혈관 질환; 대사 장애(예컨대, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 및 당뇨병); 유전 장애; 및 염증 병태(예컨대, 염증성 장 질환(IBD), 관절염, 류마티스 질환, 자가면역 장애), 피부 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 투여 방법은 정맥내 주사(iv), 피하 주사(sc), 경구(po), 척수강내, 흡입, 국소, 및 영역 투여의 군으로부터 선택되는 경로이다.
실시예
본 발명의 상이한 특색을 추가로 설명하기 위해 실시예가 하기에 제공된다. 실시예는 또한 본 발명을 실시하기 위한 유용한 방법론을 예시한다. 이러한 실시예는 청구된 발명을 제한하지 않는다.
방법 및 재료
세포 배양
HepaRG 세포를 10% FBS, 10 mg/ml 히드르코르티손 및 4 mg/ml 인간 재조합 인슐린이 보충된 윌리엄 배지에서 성장시켰다.
sdDNA를 HepaRG 세포로 형질감염
형질감염 24시간 전에, HepaRG 세포를 6 웰 플레이트에 시딩하였다(1 x 105개 세포/2 mL/웰). 제조 방법에 기재된 바와 같이 sdDNA를 Lipofectamine® RNAiMAX(Thermo Fisher, USA)를 사용하여 100 pM의 최종 농도로 형질감염시켰다. 간략하게 sdDNA 및 RNAiMAX를 무혈청 OPTI-MEM(Thermo Fisher)에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 배양 배지와 함께 세포에 첨가하였다.
정량적 PCR
표시된 sdDNA로 형질감염된 세포를 형질감염 48시간 후에 수거하였다. RNA를 TRIZOL로 단리하고, TaqMan 1 단계 RT-PCR 시약 및 APOCIII mRNA 검출을 위해 APOCIII 검정을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였으며, 유전자 GAPDH mRNA 수준을 내부 대조군으로 사용하였다.
표적 서열
본 발명에 개시된 sdDNA의 유전자 침묵 효과를 입증하기 위해, APOCIII 유전자(APOCIII mRNA)를 표적화하도록 설계되고 만들어진 sdDNA를 하기 실시예에서 사용하였다. 표적 서열은 sdDNA의 안티센스 가닥 또는 상응하는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있는 수탁 # NM_000040로부터의 세그먼트이다.
실시예 1: 다양한 ISR 모티프를 갖는 sdDNA의 유전자 침묵 활성
도 1a는 상이한 ISR 모티프를 갖는 본 발명에 의해 제공되는 sdDNA(sdDNA1-3)의 실시양태의 구조를 나타내며, ISR은 AS(안티센스 가닥) 및 SS(센스 가닥) 모두에 위치되거나 AS에만 위치되고, 설계된 sdDNA(sdDNA1-3)는 APOCIII 유전자를 표적화한다. sdDNA(sdDNA1-3)의 안티센스 가닥과 동일한 구조 및 서열을 갖는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드도 비교를 위해 상응하는 단일 가닥 AS 올리고뉴클레오티드(상응하는 ASO)로 사용된다. 여기에서 사용된 상응하는 ASO(서열번호 1)는 최첨단 ASO 기술 및 노하우로 최적화된 전형적인 ASO 제품인 ISIS304801이다. sdDNA1-3 및 상응하는 ASO로 APOCIII를 표적화하기 위한 유전자 침묵 활성을 HepaRG 세포에서 시험하였다(결과는 도 1b에 나타냄).
도 1a에서, 도시된 구조의 모든 문자 "D"는 DNA 잔기 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체를 나타내고; 도시된 구조의 모든 문자 "R"은 RNA 잔기 또는 리보뉴클레오티드 단량체를 나타내고; 서열의 모든 소문자 "a, c, g, t"는 DNA 잔기를 나타내고; 서열의 모든 대문자 "A, C, G, U"는 2'-MOE 변형된 RNA 잔기를 나타내고, 모든 "U"는 5-메틸 우리딘 2'-MOE RNA 잔기이고; 모든 "C" 및 "c"는 5-Me-C이고; 도시된 구조의 모든 "*"는 PS(포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결)를 나타낸다.
결과는 설계된 모든 sdDNA가 매우 낮은 농도(피코 몰 농도)에서 APOCIII에 대한 유전자 침묵 활성에 대해 큰 효능을 가지며 상응하는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)보다 훨씬 더 강력할 뿐만 아니라 더 효과적이라는 것을 시사한다.
실시예 2: 다양한 길이의 sdDNA
도 2a는 sdDNA의 일부 실시양태를 나타낸다. 이러한 sdDNA에서, AS 및 SS는 대칭적 길이이다. 다양한 sdDNA 듀플렉스 길이(8 내지 36 bp)가 설계되었다(sdDNA_1-10, 도 2a에 나타낸 APOCIII 유전자를 표적화하기 위한 구조 및 서열). sdDNA_1-10의 안티센스 가닥과 동일한 구조 및 서열을 갖는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드도 각각의 sdDNA의 상응하는 단일 가닥 AS로 만들어졌다. APOCIII를 표적화하기 위해 설계된 sdDNA_1-10 및 각각의 상응하는 단일 가닥 ASO의 유전자 침묵 활성을 HepaRG 세포에서 시험하였다(sdDNA의 결과는 도 2b에 나타내고, 상응하는 단일 가닥 AS의 결과는 도 2c에 나타냄).
도 2a에서, 도시된 서열의 모든 소문자 "a, c, g, t", 대문자 "A, C, G, U" 및 "*"는 도 1a에서와 동일함을 나타낸다.
결과는 10 bp의 대칭형 평활 말단 sdDNA가 매우 낮은 농도(피코 몰 농도)에서 매우 강력한 유전자 침묵 활성을 가지며 상응하는 단일 가닥 ASO보다 훨씬 더 강력할 뿐만 아니라 더 효과적이라는 것을 시사한다. 여기서 상응하는 단일 가닥 ASO는 일반적으로 피코 몰 수준에서 낮은 활성을 나타내지만 나노 몰 수준(약 10 nM-30 nM)에서는 유전자 침묵 활성을 나타낼 수 있으며 이는 잘 알려진 현재의 첨단 ASO 기술에서 개발된 알려진 올리고뉴클레오티드와 일치한다. 전형적인 ASO보다 길이가 훨씬 긴 단일 가닥 AS 올리고뉴클레오티드(일반적으로 16 nt 내지 20 nt의 길이를 가짐)가 전형적인 ASO보다 더 강력한 유전자 침묵 활성을 나타낸다는 것도 여기서 놀라운 발견이다. 그러나, 본 발명의 sdDNA는 첨단 ASO 기술에 의해 잘 알려진 전형적인 잘 최적화된 ASO(예컨대, 서열번호 1)를 포함하여 상응하는 단일 가닥 AS 올리고뉴클레오티드보다 항상 상대적으로 더 나은 활성을 나타낼 수 있다.
실시예 3: 다양한 길이의 대칭적 sdDNA
도 3a는 sdDNA의 실시양태의 상이한 구조적 설계를 나타낸다. 이러한 sdDNA에서, AS 및 SS는 대칭적 길이이다. 또한, 8 내지 14 bp의 다양한 길이의 AS 및 SS 듀플렉스를 설계하고 만들었다(sdDNA_1-3, 도 3a에 나타낸 APOC 유전자를 표적화하기 위한 sdDNA의 구조 및 서열). APOCIII을 표적화하도록 설계된 sdDNA_1-3의 유전자 침묵 활성을 HepaRG 세포에서 시험하였다(sdDNA의 결과는 도 2b에 나타냄).
도 3a에서, 도시된 서열의 모든 소문자 "a, c, g, t" 및 "*"는 도 1a에서와 동일함을 나타내고, 도시된 서열의 밑줄 친 모든 대문자 " A , C , G , U "는 LNA 변형된 RNA 잔기를 나타내고, 모든 " U "는 5-메틸 유리딘 LNA RNA 잔기이고 모든 " C "는 5-Me-C LNA RNA 잔기이다.
결과는 모든 설계된 sdDNA가 매우 낮은 농도(피코 몰 농도)에서 매우 강력한 유전자 침묵 활성을 갖는다는 것을 시사한다.
실시예 4: SS 내에 다양한 변형을 갖는 sdDNA
도 4a는 SS 내에 상이한 PS 변형 모티프를 갖는 sdDNA의 실시양태의 상이한 구조적 설계를 나타낸다. 구체적으로, 이러한 sdDNA에서, AS는 일정하게 유지되었고 SS는 뉴클레오시드간 연결(들)을 제외하고 동일하게 유지되었다: 구체적으로, sdDNA_SS:PS는 각각의 뉴클레오시드간 연결이 PS 변형된 전체 SS를 갖고, sdDNA_SS:PO는 각각의 뉴클레오시드간 연결이 자연적으로 PO 뉴클레오시드간 연결인 전체 SS를 갖고, sdDNA_SS:PS/PO는 연결된 데옥시리보뉴클레오시드 단량체의 뉴클레오시드간 연결의 전부가 아닌 일부에서만 PS 변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 혼합된 SS를 갖는다. sdDNA(sdDNA1-3)의 안티센스 가닥과 동일한 구조 및 서열을 갖는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드도 비교를 위해 상응하는 단일 가닥 AS 올리고뉴클레오티드(상응하는 ASO)로 사용된다. 여기에 사용된 상응하는 ASO(서열번호 1)는 최첨단 ASO 기술 및 노하우로 최적화된 전형적인 ASO 제품인 ISIS304801이다. 설계된 sdDNA(PS, PO, PS/PO) 및 상응하는 ASO로 APOCIII를 표적화하는 유전자 침묵 활성을 HepaRG 세포에서 시험하였다(결과는 도 4b에 표시됨).
도 4a에서, 도시된 서열의 모든 소문자 "a, c, g, t", 대문자 "A, C, G, U" 및 "*"는 도 1a에서와 동일함을 나타낸다.
SS 내에 상이한 PS 변형 모티프를 갖는 설계된 모든 sdDNA는 매우 낮은 농도(피코 몰 농도)에서 APOCIII에 대해 매우 강력한 유전자 침묵 활성을 나타내며 상응하는 ASO보다 훨씬 더 강력할 뿐만 아니라 더 효과적이다. 다시 말해, 연결된 데옥시리보뉴클레오시드 단량체/DNA 잔기의 뉴클레오시드간 연결의 다양한 변형 모티프는 적어도 통상적인 ASO 기술에 비해 본 발명에서 제공되는 sdDNA 기반 유전자 침묵 기술에 의해 유전자 침묵화 활성이 크게 개선되는 이점을 유지할 수 있다. PS 뉴클레오시드간 연결로 부분적으로 또는 전체적으로 변형된 SS를 갖는 sdDNA는 적어도 완전히 천연 PO 뉴클레오시드간 연결을 갖는 sdDNA만큼 우수한 강력한 유전자 침묵 활성을 나타내었다. 그러나, 생체내 적용을 위해서는 PS 변형이 필요하다는 것이 당해 분야에 잘 알려져 있다.
또한 이러한 결과는 완전히 PS 변형된 SS를 갖는 sdDNA가 매우 강력하거나 적어도 변형되지 않은 SS를 갖는 sdDNA와 동등하게 강력하기 때문에 전형적인 DNase 이외의 알려지지 않은 메커니즘을 통해 SS가 sdDNA 듀플렉스로부터 제거되거나 분해된다는 것을 시사한다. 또한, SS의 연결된 데옥시리보뉴클레오시드 단량체/DNA 잔기에 적어도 하나의 변형(예컨대, PS 변형 뉴클레오시드간 연결)을 사용하면 더 나은 안정성 및 조직 분포를 포함하여 생체내 적용을 위한 개선된 약학적 특성을 갖는 sdDNA를 설계하는 데 도움이 될 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 5: AS 내의 다양한 위치에 배치된 다양한 ISR 모티프를 갖는 sdDNA
도 5a는 추가의 일련의 sdDNA의 상이한 구조적 설계를 나타낸다. 이러한 sdDNA에서, AS 내의 ISR(들)의 리보뉴클레오티드 단량체의 위치 및 총 수는 변화시키면서 센스 가닥은 일정하게 유지되었다(ISR_0-5, 도 5a에 나타낸 구조 및 서열). 도 5a의 안티센스 가닥 내의 다양한 ISR 모티프는 각각의 ISR이 1 또는 2와 같이 낮은 리보뉴클레오티드 단량체의 수를 갖고, 각각의 ISR이 적어도 하나의 개재하는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체로 이격되어 있음을 나타낸다. 도 5a에서, 도시된 서열의 모든 소문자 "a, c, g, t", 대문자 "A, C, G, U" 및 "*"는 도 1a에서와 동일함을 나타낸다. APOCIII을 표적화하도록 설계된 ISR_0-5의 유전자 침묵 활성을 HepaRG 세포에서 시험하였다(결과는 도 5b에 나타냄).
모든 설계된 sdDNA는 매우 낮은 농도(피코 몰 수준)에서 매우 강력한 유전자 침묵 활성을 갖는다. 결과는 다양한 수의 리보뉴클레오티드 단량체를 갖고 AS 내의 다양한 위치에 배치된 AS 내의 적어도 하나의 ISR(들)이 본 발명에서 제공되는 sdDNA의 매우 강력한 유전자 침묵 활성을 향상시키거나 가능하게 할 수 있음을 추가로 시사한다.
실시예 6: AS에 미스매치를 갖는 sdDNA
도 6a는 추가의 일련의 sdDNA의 상이한 구조적 설계를 나타낸다. 이러한 sdDNA에서, 안티센스 가닥은 표적 RNA에 혼성화할 때 적어도 하나의 미스매치를 포함하도록 설계되었고(Mis1-2, 도 6a에 나타낸 구조 및 서열), 미스매치가 없는 안티센스 가닥(Mis0)은 비교로서 설계되었다. 도 6a에서, 도시된 서열의 모든 소문자 "a, c, g, t", 대문자 "A, C, G, U" 및 "*"는 도 1a에서와 동일함을 나타낸다. APOCIII을 표적화하도록 설계된 Mis_0-3의 유전자 침묵 활성을 HepaRG 세포에서 시험하였다(결과는 도 6b에 나타냄).
모든 설계된 sdDNA는 매우 낮은 농도(피코 몰 수준)에서 매우 강력한 유전자 침묵 활성을 갖는다. 결과는 본 발명에서 제공되는 sdDNA의 안티센스 가닥이 본 발명에서 제공되는 sdDNA의 유전자 침묵 활성을 유지하면서 적어도 2개(표적화 영역의 적어도 10%)의 미스매치를 가질 수 있음을 추가로 시사한다. AS 내의 특정 위치에서 일부 미스매치 또는 다중 미스매치는 sdDNA의 유전자 침묵 활성을 감소시킬 수 있다.
실시예 7: AS보다 긴 SS를 갖는 sdDNA
도 7a는 AS보다 긴 SS를 갖는 추가의 일련의 sdDNA의 상이한 구조적 설계를 나타낸다. 이러한 sdDNA에서, 센스 가닥의 길이는 변화시키면서 안티센스 가닥은 일정하게 유지되었다(sdDNA_1-2, 도 7a에 나타낸 구조 및 서열). 도 7a에서, 도시된 서열의 모든 소문자 "a, c, g, t", 대문자 "A, C, G, U" 및 "*"는 도 1a에서와 동일함을 나타낸다. sdDNA(sdDNA_1-2)의 안티센스 가닥과 동일한 구조 및 서열을 갖는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드도 비교를 위해 상응하는 단일 가닥 AS 올리고뉴클레오티드(상응하는 ASO)로 사용된다. 설계된 sdDNA1-2 및 상응하는 ASO로 APOCIII를 표적화하기 위한 유전자 침묵 활성을 HepaRG 세포에서 시험하였다(결과는 도 7b에 나타냄).
모든 설계된 sdDNA는 매우 낮은 농도(피코 몰 수준)에서 매우 강력한 유전자 침묵 활성을 가지며 상응하는 ASO보다 더 강력할 뿐만 아니라 더 효과적이다. 결과는 sdDNA의 센스 가닥이 안티센스 가닥보다 길 수 있음을 시사한다. 실시예에 나타난 바와 같이, SS는 AS보다 적어도 16개 단량체만큼 더 길 수 있다.
등가물
대표적인 실시예는 본 발명을 예시하는 데 도움을 주기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 없으며, 그렇게 해석되어서는 안 된다. 실제로, 본원 도시되고 기재된 것 외에, 본 발명의 다양한 변형 및 이의 많은 추가 실시양태가 본원에 포함된 실시예 및 과학 및 특허 문헌에 대한 참조를 포함하는 본 문서의 전체 내용으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 실시예는 본 발명을 다양한 실시양태 및 이의 등가물로 실시하는 데 적용될 수 있는 중요한 추가 정보, 예시 및 안내를 함유한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 이제 바람직한 방법 및 재료가 기재된다. 본원에 인용된 방법은 개시된 특정 순서 외에 논리적으로 가능한 임의의 순서로 수행될 수 있다.
참조에 의한 포함
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참조문헌
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Claims (60)

  1. 각각 연결된 뉴클레오티드 단량체를 포함하는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA) 분자로서,
    제1 가닥은 표적화된 RNA의 표적화된 세그먼트에 대해 실질적으로 상보적이고;
    제2 가닥은 제1 가닥에 대해 실질적으로 상보적이고, 제1 가닥과 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 형성하고;
    제2 가닥의 길이는 제1 가닥의 길이와 동일하거나 이보다 길고;
    sdDNA 분자는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체를 포함하는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체(들)의 산재된 세그먼트(ISR)를 포함하는 sdDNA.
  2. 제1항에 있어서, 제1 가닥이 적어도 하나의 ISR을 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 제2 가닥이 적어도 하나의 ISR을 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 제1 가닥이 적어도 하나의 ISR을 포함하고 제2 가닥도 적어도 하나의 ISR을 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  5. 제2항 또는 제4항에 있어서, 적어도 하나의 ISR이 제1 가닥의 적어도 하나의 표적화 영역에 배치되는 것인 sdDNA 분자.
  6. 제5항에 있어서, 제1 가닥의 모든 ISR(들)의 리보뉴클레오티드 단량체의 총 수가 적어도 2인 sdDNA 분자.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 적어도 하나의 ISR이 제2 가닥의 적어도 하나의 이중 가닥 영역에 배치되는 것인 sdDNA 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, sdDNA 분자가 적어도 2개 이상의 ISR을 포함하고, 각각의 ISR은 서로 독립적으로 하나의 리보뉴클레오티드 단량체로 이루어지거나 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 근접한 리보뉴클레오티드 단량체를 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 ISR이 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 근접한 리보뉴클레오티드 단량체를 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  10. 제1항에 있어서, 제1 가닥이 표적화된 RNA의 표적화된 세그먼트에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 상보적이거나 완전히 상보적인 것인 sdDNA 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가닥이 표적화된 RNA에 혼성화될 때 1, 2 또는 3개 이하의 미스매치(들)를 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  12. 제1항에 있어서, 제2 가닥이 제1 가닥에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 상보적이거나 완전히 상보적인 것인 sdDNA 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 가닥이 제1 가닥의 적어도 하나의 영역에 대해 상보적인 듀플렉스를 형성할 때 1, 2, 3개 또는 그 초과의 미스매치(들)를 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  14. 제1항에 있어서, 제1 가닥이 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50개의 뉴클레오티드 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 길이를 갖는 것인 sdDNA 분자.
  15. 제1항에 있어서, 제1 가닥이
    a) 6-50개의 뉴클레오티드 단량체,
    b) 8-36개의 뉴클레오티드 단량체,
    c) 8-33개의 뉴클레오티드 단량체,
    d) 8-36개의 뉴클레오티드 단량체,
    e) 10-30개의 뉴클레오티드 단량체, 및
    f) 8-29개의 뉴클레오티드 단량체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 길이를 갖는 것인 sdDNA 분자.
  16. 제1항에 있어서, 제2 가닥의 길이가 제1 가닥과 동일한 것인 sdDNA 분자.
  17. 제1항에 있어서, 제2 가닥이 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 단량체의 수 만큼 제1 가닥보다 긴 것인 sdDNA 분자.
  18. 제1항에 있어서, 제2 가닥이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50개의 뉴클레오티드 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 길이를 갖는 것인 sdDNA 분자.
  19. 제1항에 있어서, 제2 가닥이
    a) 6-50개의 뉴클레오티드 단량체,
    b) 8-36개의 뉴클레오티드 단량체,
    c) 8-33개의 뉴클레오티드 단량체,
    d) 8-36개의 뉴클레오티드 단량체,
    e) 8-32개의 뉴클레오티드 단량체,
    f) 8-30개의 뉴클레오티드 단량체,
    g) 8-29개의 뉴클레오티드 단량체, 및
    h) 8-25개의 뉴클레오티드 단량체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 길이를 갖는 것인 sdDNA 분자.
  20. 제1항에 있어서, 이중 가닥 영역이 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 염기쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기쌍의 수로 이루어지는 것인 sdDNA 분자.
  21. 제1항에 있어서, 듀플렉스의 양 말단이 평활 말단인 sdDNA 분자.
  22. 제1항에 있어서, 제1 가닥 및 제2 가닥 모두가 3'-돌출부를 갖거나 제1 가닥 및 제2 가닥 모두가 5'-돌출부를 갖는 것인 sdDNA 분자.
  23. 제17항에 있어서, 제2 가닥이 하기 구성: 3'-돌출부 및 5'-돌출부, 3'-돌출부 및 5'-평활 말단, 3'-평활 말단 및 5'-돌출부, 3'-돌출부 및 5'-함몰 말단, 또는 5'-돌출부 및 3'-함몰 말단 중 하나를 갖는 것인 sdDNA 분자.
  24. 제16항 또는 제17항에 있어서, 제1 가닥이 하기 구성: 3'-돌출부 및 5'-평활 말단, 3'-평활 말단 및 5'-돌출부, 3'-돌출부 및 5'-함몰 말단, 5'-돌출부 및 3'-함몰 말단, 3'-평활 말단 및 5'-평활 말단, 또는 3'-함몰 말단 및 5'-함몰 말단 중 하나를 갖는 것인 sdDNA 분자.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 3'-돌출부 또는 5'-돌출부가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 단량체를 갖는 것인 sdDNA 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오티드 단량체가 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체인 sdDNA 분자.
  27. 제26항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 당, 주쇄, 및/또는 염기 변형된 뉴클레오티드인 sdDNA 분자.
  28. 제27항에 있어서, 주쇄 변형된 뉴클레오티드가 뉴클레오시드간 연결에 변형을 갖는 것인 sdDNA 분자.
  29. 제28항에 있어서, 뉴클레오시드간 연결이 질소 또는 황 헤테로원자 중 적어도 하나를 포함하도록 변형된 것인 sdDNA 분자.
  30. 제29항에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트(P=S) 기, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 및 포스포르아미데이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 sdDNA 분자.
  31. 제28항에 있어서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥이 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 sdDNA 분자.
  32. 제26항에 있어서, 제2 가닥이 연결된 데옥시리보뉴클레오티드 단량체 영역에 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 sdDNA 분자.
  33. 제31항에 있어서, 제1 가닥의 각각의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 sdDNA 분자.
  34. 제31항에 있어서, 제2 가닥의 각각의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 sdDNA 분자.
  35. 제26항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 변형된 당 모이어티를 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  36. 제35항에 있어서, 변형된 당 모이어티의 2' 위치가 OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2, 및 CN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 대체되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br 또는 I인 sdDNA 분자.
  37. 제35항에 있어서, 변형된 당 모이어티의 2' 위치가 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 대체되고, 여기서 Rl, Rm 및 Rn은 각각 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬인 sdDNA 분자.
  38. 제35항에 있어서, 변형된 당 모이어티가 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 sdDNA 분자.
  39. 제35항에 있어서, 변형된 당 모이어티가 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2'(cEt) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 4'-C(CH3)(CH3)-O-2', 4'-CH2-N(OCH3)-2', 4'-CH2-O-N(CH3)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2'(여기서, R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임), 4'-CH2-C(H)(CH3)-2', 및 4'-CH2-C-(=CH2)-2'로 이루어진 군으로부터 선택되는 이환식 당에 의해 치환되는 것인 sdDNA 분자.
  40. 제35항에 있어서, 변형된 당 모이어티가 2'-O-메톡시에틸 변형된 당(MOE), 4'-(CH2)-O-2' 이환식 당(LNA), 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노스(FANA), 및 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2) 이환식 당(cEt)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 sdDNA 분자.
  41. 제26항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 변형된 핵염기를 포함하는 것인 sdDNA 분자.
  42. 제41항에 있어서, 변형된 핵염기가 5-메틸시토신(5-Me-C), 이노신 염기, 트리틸화 염기, 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 히포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 1-메틸-슈도-우라실, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 및 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 sdDNA 분자.
  43. 제37항에 있어서, 변형된 핵염기가 5-메틸시토신인 sdDNA 분자.
  44. 제41항에 있어서, 각각의 시토신 염기가 5-메틸시토신인 sdDNA 분자.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, sdDNA가 세포에서 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 능력을 갖는 것인 sdDNA 분자.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, sdDNA 분자가 표적 RNA를 침묵시키는 데 있어서 상응하는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 더 강력하거나 더 효과적인 것인 sdDNA 분자.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 데 사용되는 것인 sdDNA 분자.
  48. 제47항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 sdDNA 분자.
  49. 제48항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 sdDNA 분자.
  50. 제1항에 있어서, 표적화된 RNA가 mRNA 또는 비-코딩 RNA이고, 이러한 RNA는 질환 또는 병태에 연루된 생물학적 경로의 일부를 조절하거나 단백질을 코딩하는 것인 sdDNA 분자.
  51. 제1항에 있어서, 표적화된 RNA가
    a) 인간 또는 동물의 질환 또는 장애에 연루된 유전자의 mRNA,
    b) 병원성 미생물의 유전자의 mRNA,
    c) 바이러스 RNA, 및
    d) 자가면역 질환, 염증성 질환, 퇴행성 질환, 감염성 질환, 증식성 질환, 대사 질환, 면역 매개 장애, 알러지 질환, 피부 질환, 악성 질환, 위장 장애, 호흡기 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 류마티스 장애, 신경계 장애, 내분비 장애, 및 노화 관련 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환에 연루된 RNA
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 sdDNA 분자.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥이 리간드 또는 모이어티에 접합되는 것인 sdDNA 분자.
  53. 제52항에 있어서, 리간드 또는 모이어티가 펩티드, 항체, 중합체, 다당류, 지질, 소수성 모이어티 또는 분자, 양이온성 모이어티 또는 분자, 친유성 화합물 또는 모이어티 올리고뉴클레오티드, 콜레스테롤, GalNAc 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 sdDNA 분자.
  54. 활성제로서 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 sdDNA 분자 및 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 담체가 약학적 담체, 양전하 담체, 지질 나노입자, 리포솜, 단백질 담체, 소수성 모이어티 또는 분자, 양이온성 모이어티 또는 분자, GalNAc, 다당류, 중합체, 나노입자, 나노에멀젼, 콜레스테롤, 지질, 친유성 화합물 또는 모이어티, 및 유지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  56. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 sdDNA 분자 또는 제54항 또는 제55항의 약학 조성물을 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  57. 제50항에 있어서, 질환 또는 병태가 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 퇴행성 질환, 감염성 질환, 증식성 질환, 대사 질환, 면역 매개 장애, 알러지 질환, 피부 질환, 악성 질환, 위장 장애, 간 장애, 호흡기 장애, 심혈관 장애, 피부 장애, 신장 장애, 류마티스 장애, 신경계 장애, 정신 장애, 내분비 장애, 및 노화 관련 장애 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, sdDNA 분자 또는 약학 조성물이 정맥내 주사(iv), 피하 주사(sc), 경구(po), 근육내(im) 주사, 경구 투여, 흡입, 국소, 척수강내, 및 다른 영역 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로를 통해 투여되는 것인 방법.
  59. 진핵 세포를 유효량의 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 sdDNA 분자 또는 제54항 또는 제55항의 약학 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 유전자 발현 또는 유전자 기능을 조정하는 방법.
  60. 각각 뉴클레오티드, 이의 유사체, 및 변형된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결된 뉴클레오티드 단량체를 포함하는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 짧은 듀플렉스 DNA(sdDNA) 분자로서,
    제1 가닥은 길이가 제2 가닥과 동일하거나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8개의 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단량체의 수 만큼 제2 가닥보다 짧고,
    제1 가닥은 적어도 하나의 표적화 영역을 통해 표적화된 RNA의 표적화된 세그먼트에 대해 실질적으로 상보적이고, 제1 가닥은 인접한 단량체 사이의 포스포로티오에이트 연결, 포스포디에스테르 연결, 또는 포스포로티오에이트와 포스포디에스테르 연결의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결을 통해 연결된 8-36개(범위 끝점 모두 포함)의 뉴클레오시드 단량체로 이루어지고,
    제2 가닥은 제1 가닥에 대해 실질적으로 상보적이고, 제1 가닥과 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 형성하고, 제2 가닥은 인접한 단량체 사이의 포스포로티오에이트 연결, 포스포디에스테르 연결, 및 포스포로티오에이트와 포스포디에스테르 연결의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결을 통해 연결된 10-36개(범위 끝점 모두 포함)의 뉴클레오시드 단량체로 이루어지고,
    sdDNA 분자는 데옥시리보뉴클레오티드, 이의 유사체, 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 단량체에 연결된 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체의 산재된 세그먼트(ISR)를 포함하고,
    sdDNA 분자 내의 ISR은 리보뉴클레오티드, 이의 유사체, 및 변형된 리보뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 단량체를 포함하고,
    sdDNA 분자는 세포에서 표적 유전자 발현 또는 기능을 조정하는 데 사용되고,
    sdDNA 분자는 세포에서 상응하는 ASO보다 표적 유전자의 발현을 침묵시키는 데 더 강력하거나 더 효과적인 sdDNA 분자.
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