TW202128770A - 新型多肽複合物 - Google Patents

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張玲
毛浪勇
石金平
黎婷婷
賴煒明
覃千山
金薪盛
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Abstract

本披露涉及新型多肽複合物。具體地，本披露涉及一種結構域改造的抗體，該抗體的至少一個恆定區結構域CH1和/或CL被替代，該結構域CH1/CL被Titin T鏈/Obscurin-O鏈或被Titin T鏈/類Obscurin-O鏈替代。

Description

新型多肽複合物
本申請要求2020年01月09日提交的中國專利申請的優先權(申請號CN202010020878.7)。
本披露涉及抗體藥物領域。具體地包括CH1和CL結構被替代的新型抗體以及其應用。
這裡的陳述僅提供與本披露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
隨著抗體人源化技術的不斷完善，近年來單株抗體發展迅速。多種單株抗體已被用於治療惡性腫瘤、自身免疫病等重大疾病。但是腫瘤的免疫逃逸往往伴隨著多種不同的機制，而單一的單株抗體只能結合一個特定靶點，這使得單株抗體的治療效果被大打折扣。
而雙特異性抗體(Bispecific antibody，BsAb)是藉由基因工程手段將靶向兩個不同抗原或兩個不同抗原表位的抗體組合在一起而形成的人工抗體。與單株抗體不同，雙特異性抗體具有同時靶向2個不同表位的能力，並能 發揮特殊的生物學功能，例如免疫細胞召集、受體共刺激或共抑制、多價病毒中和等，有望獲得比單一的單株抗體甚至抗體聯用更好的臨床治療效果。
已經開發了廣泛多樣的重組雙特異性抗體形式，例如藉由融合例如IgG抗體形式和單鏈結構域的四價雙特異性抗體(參見Coloma，M.J.，等，Nature Biotech.15(1997)159-163；Morrison，S.L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。其它雙特異性形式，如DVD-Ig、CrossMab、BiTE等(Spiess等，Molecular Immunology，67(2)，pp.95-106(2015))。
有關雙特異性抗體的各種結構模型也已見公開：例如，向Fc區引入突變“knobs-into-holes”(Ridgway等，Protein Engineering，9(7)，pp.617-21(1996))；引入靜電設計(Gunasekaran等，Journal of Biological Chemistry，285(25)，pp.19637-19646(2010))，或負狀態設計(Kreudenstein等，mAbs，5(5)，pp.646-654(2013)；Leaver-Fay等，Structure，24(4)，pp.641-651(2016))、交換CH1和CL結構域(CrossMab平臺)(Schaefer等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America，108(27)，pp.11187-11192(2011))、與TCR恆定區融合(WO2019057122A1)等等。
然而，在製備雙特異性抗體過程中，不同的多肽鏈隨機組合會產生多種不同的產物，而僅有一種產物是所需的，這些副產物包括缺失一條輕鏈的抗體、半抗體、重鏈聚合物、輕鏈和重鏈錯配等等，這給下游工藝開發提出了很大的挑戰。為此，本披露提供了一種新的結構域改造的多肽複合物。
在一些實施方案中，本披露提供一種多肽複合物，其包含第一抗原結合部分，該第一抗原結合部分包括：
A)第一多肽，該第一多肽包含從N末端到C末端的第一重鏈可變結構域(VH1)，該VH1可操作地連接至第一結構域，該第一結構域包含Titin-T鏈，和
第二多肽，該第二多肽包含從N末端到C末端的第一輕鏈可變結構域(VL1)，該VL1可操作地連接至第二結構域，該第二結構域包含能夠與Titin-T鏈相互作用的結構域；
或
B)第一多肽，該第一多肽包含從N末端到C末端的VH1，該VH1可操作地連接至第一結構域，該第一結構域包含能夠與Titin-T鏈相互作用的結構域，和
第二多肽，該第二多肽包含從N末端到C末端的VL1，該VL1可操作地連接至第二結構域，該第二結構域包含Titin-T鏈；
或
C)第一多肽，該第一多肽包含從N末端到C末端的VH1，該VH1可操作地連接至第一結構域，該第一結構域包含Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈，和
第二多肽，該第二多肽包含從N末端到C末端的VL1，該VL1可操作地連接至第二結構域，該第二結構域包含能夠與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈相互作用的結構域；
或
D)第一多肽，該第一多肽包含從N末端到C末端的VH1，該VH1可操作地連接至第一結構域，該第一結構域包含能夠與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈相互作用的結構域，和
第二多肽，該第二多肽包含從N末端到C末端的VL1，該VL1可操作地連接至第二結構域，該第二結構域包含Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；
其中，該第一抗原結合部分與第一抗原特異性結合，該第一結構域與第二結構域能夠形成二聚體。
在一些實施方案中，前述的多肽複合物，該能夠與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈相互作用的結構域是Titin-T鏈，該能夠與Titin-T鏈相互作用的結構域是Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈。
在一些實施方案中，前述的多肽複合物，該第一抗原結合部分的VH1和VL1形成與第一抗原特異性結合的第一抗原結合位點。
在一些實施方案中，該VH1的C端與第一結構域的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，該VL1的C端與第二結構域的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，前述的多肽複合物，該第一結構域與第二結構域藉由天然鏈間鍵和/或非天然鏈間鍵形成二聚體。
在一些實施方案中，該第一結構域與第二結構域藉由天然鏈間鍵形成二聚體；在一些實施方案中，該Titin-T鏈上選自第7-15、19-24、26、55、59和60位中的一個或多個殘基與Obscurin-O鏈上的選自第3-6、9、41、 73、75和80-90位中的一個或多個殘基彼此相結合，或者該Titin-T鏈上的選自第1、7-10、13-16、19-26、59-60和96位中的一個或多個殘基與類Obscurin-O鏈上的選自第4-5、10、12-13、74、76、78和82-91位中的一個或多個殘基彼此相結合；該Titin-T鏈殘基位中點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈殘基位中點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述任一項所述的多肽複合物，該第一結構域與第二結構域藉由至少一個非天然鏈間鍵形成二聚體。
在一些實施方案中，該非天然鏈間鍵在第一結構域中的特定突變殘基和第二結構域中的特定突變殘基之間形成。在一些實施方案中，第一結構域中的特定突變殘基和第二結構域中的特定突變殘基中的至少一個是半胱胺酸殘基。
在一些實施方案中，該非天然鏈間鍵為二硫鍵；在一些實施方案中，其中該二聚體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非天然鏈間鍵。
在一些實施方案中，前述的多肽複合物，該第一結構域中的特定突變殘基和第二結構域中的特定突變殘基位於第一結構域與第二結構域的接觸界面。
在一些實施方案中，前述第一結構域中的特定突變殘基和第二結構域中的特定突變殘基具有選自以下突變，該Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變；或者Titin-T 鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變。該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些具體的實施方案中，前述第一突變殘基和第二突變殘基具有選自以下突變：Titin-T鏈具有選自8C、20C、22C、25S、26C和39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自3C、9C、25S、76S和88C中的一個或多個胺基酸殘基突變；或者該Titin-T鏈具有選自8C、20C、22C、25S、26C和39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自6E、26S、74C、77S、84C和86C中的一個或多個胺基酸殘基突變。在一些實施方式中，Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有88C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和20C突變，且Obscurin-O鏈具有3C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和26C突變，且Obscurin-O鏈具有9C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S和88C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和20C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S和3C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和26C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S和9C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E和74C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和20C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E和84C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和22C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E和86C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E、26S、77S和74C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和20C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E、26S、77S和84C突變；或者
Titin-T鏈具有25S、39T和22C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E、26S、77S和86C突變；
Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些具體的實施方案中，前述第一突變殘基和第二突變殘基具有選自以下突變：該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變；或者該Titin-T鏈 具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變。該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述第一結構域中的特定突變殘基和第二結構域中的特定突變殘基具有選自以下突變：Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有A88C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，Obscurin-O鏈具有A3C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，Obscurin-O鏈具有R9C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A88C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A3C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和R9C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和V74C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和G84C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和A86C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和V74C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和G84C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和A86C突變。該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自 然順序編號對應的位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號對應的位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號對應的位點。
在一些實施方案中，前述第一結構域和第二結構域為選自以下Titin-T鏈/Obscurin-O鏈，或者Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈：該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變的多肽，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變的多肽；或者該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變的多肽，和/或該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變的多肽。
在一些實施方案中，前述第一結構域和第二結構域為選自以下：Titin-T鏈/Obscurin-O鏈，或者Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈。該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變；或者該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序 列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述第一結構域和第二結構域為選自以下：Titin-T鏈/Obscurin-O鏈，或者Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈。該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有A88C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和V20C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有A3C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A26C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有R9C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有C25S、C76S和A88C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和V20C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有C25S、C76S和A3C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A26C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有C25S、C76S和R9C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E和V74C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和V20C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E和G84C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和T22C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E和A86C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E、C26S、C77S和V74C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和V20C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E、C26S、C77S和G84C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和T22C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E、C26S、C77S和A86C突變。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號對應的位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號對應的位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號對應的位點。
在一些實施方案中，前述多肽複合物，該Obscurin-O鏈具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變。在一些實施方案中，該Obscurin-O鏈具有選自7R或7K、62K或62H、和11L的一個或多個胺基酸殘基突變；最較佳地，該Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S、88C、7K和62K突變；Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S、88C、7K和62H突變；Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S、88C、11L和62K突變；或者Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S、88C、11L和62H；Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，該Obscurin-O鏈具有選自L7K或L7R、K11L、T62K或T62H的一個或多個胺基酸殘基突變；在一些實施方案中，Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62K突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62H突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62K突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62H。該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號對應的位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號對應的位點。
在一些實施方案中，前述多肽複合物，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變的Obscurin-O鏈；在一些實施方案中，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有選自L7K或L7R、K11L和T62K或T62H的一個或多個胺基酸殘基突變；在一些實施方案中，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62K突變；Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62H突變；Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62K突變；Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62H突變。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號對應的位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號對應的位點。
在一些實施方案中，前述多肽複合物，該第一結構域和第二結構域具有選自以下一個或多個胺基酸殘基突變：Titin-T鏈具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變。該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述多肽複合物，該第一結構域和第二結構域為選自以下的Titin-T鏈/Obscurin-O鏈：該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變的多肽，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變的多肽。該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述第一結構域和第二結構域具有選自以下一個或多個殘基突變：Titin-T鏈具有選自3W、11I、13L、22M、40S、 42K、45S、47E、49G、56S、58E、66S或66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D和84L中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈具有選自2E、11K、12S、13Y、14T、17E、20L、22M或22S、30D、32P、34E、36T、41K、42L、44I、45T、53L、58V、62E、67Q或67T、69S、89L、92E、94G和97G中的一個或多個胺基酸突變。在一些實施方案中，該Titin-T鏈具有66S和77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有11K、12S、13Y、14T和22S胺基酸突變；該Titin-T鏈具有66K、70R、79T和81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有2E、17E、30D、32P、34E、36T、44I、45T、58V、62E、67Q、69S和97G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有3W、11I、13L、22M和82M胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有20L、22M和53L胺基酸突變；該Titin-T鏈具有11I、66K、79T和81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有41K、45T、67Q、69S和89L胺基酸突變；該Titin-T鏈具有40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、75V、83D和84L胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有42L、45T、67T、69S、92E和94G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有47E、49G、56S、58E和75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有42L、45T、67T、69S、92E和94G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有56S、58E和75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有42L、45T、67T、69S、92E和94G胺基酸突變；或者該Titin-T鏈具有56S、58E、66S和77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有12S、13Y、22S、42L、45T、67Q、69S、92E和94G胺基酸突變；上述Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述第一結構域和第二結構域具有選自以下一個或多個殘基突變：Titin-T鏈具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變。該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述第一結構域和第二結構域為選自以下的Titin-T鏈/Obscurin-O鏈：該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述Titin-T鏈具有M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有L11K、A12S、F13Y、V14T和T22S胺基酸突變；該Titin-T鏈具有M66K、K70R、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有G2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S和A97G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有P3W、S11I、I13L、T22M和N82M胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有D20L、T22M和A53L胺基酸突變；該Titin-T鏈具有S11I、M66K、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q41K、A45T、A67Q、G69S和V89L胺基酸突變；該Titin-T鏈具有G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D和F84L胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有Q47E、Q49G、N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；或者該Titin-T鏈具有N56S、D58E、M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有A12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變。該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述第一結構域和第二結構域為選自以下Titin-T鏈/Obscurin-O鏈：該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基 礎上具有L11K、A12S、F13Y、V14T和T22S胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有M66K、K70R、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有G2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S和A97G胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有P3W、S11I、I13L、T22M和N82M胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有D20L、T22M和A53L胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有S11I、M66K、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有Q41K、A45T、A67Q、G69S和V89L胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D和F84L胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有Q47E、Q49G、N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；或者該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有N56S、D58E、M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有A12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自 然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述的多肽複合物，該VH1藉由第一連接域與第一結構域可操作地連接，VL1藉由第二連接域與第二結構域可操作地連接。
在一些實施方案中，前述第一和/或第二連接域選自：Titin-T鏈的N末端片段，Obscurin-O鏈的N末端片段或類Obscurin-O鏈的N末端片段，和(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數(示例是1、2、3、4、5)，Y選自1-6的整數(示例是1、2、3、4、5、6)。
在一些實施方案中，前述第一和/或第二連接域選自：“KAGIR”，“DQPQF”，(G4S)1和(G4S)2。
在一些實施方案中，前述的多肽複合物，當該第一結構域為Titin-T鏈時，該第一連接域為KAGIR多肽；當該第二結構域為Obscurin-O鏈時，該第二連接域為DQPQF多肽。在另一些實施方案中，該第二結構域為Titin-T鏈時，該第二連接域為KAGIR多肽，該第一結構域為Obscurin-O鏈時，該第一連接域為DQPQF多肽。
在一些多肽複合物的實施方案中，其中：
(A)該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或在SEQ ID NO：32序列基礎上還具有選自8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、 G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中一個或多個位點胺基酸突和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；和/或
(B)該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或在SEQ ID NO：33的序列基礎上還具有選自3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94和97中一個或多個位點的胺基酸突變和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；或者
該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或在SEQ ID NO：34序列基礎上還具有選自6、26、74、77、84和86中一個或多個位點胺基酸突變的序列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變的序列；
上述Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些多肽複合物的實施方案中，其中：(A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和 C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
(B)該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；較佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45序列基礎上還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自L7K或L7R、T62K或T62H、和K11L的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：45的自然順序編號位點；更佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個 或多個胺基酸突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點；或者
該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變，該類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些多肽複合物的實施方案中，其中：該Titin-T鏈包含序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列有至少80%同一性的多肽，和/或該Obscurin-O鏈包含序列如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一序列有至少80%同一性的多肽；或者該Titin-T鏈包含序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列有至少80%同一性的多肽，和/或該類Obscurin-O鏈包含序列如SEQ ID NO：34、59-64任一所示或與SEQ ID NO：34、59-64任一所示序列具有至少80%同一性多肽。其中該具有至少80%同一性：例如是具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。
在一些實施方案中，前述Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：68所示多肽，Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：80所示多肽。
在另一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：73所示多肽，Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：83所示多肽。
在另一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：84所示多肽。
在另一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽。
在另一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽。
在另一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：75所示多肽，Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽。
在一些實施方案中，該Titin-T鏈為如SEQ ID NO：68所示多肽，Obscurin-O鏈為如SEQ ID NO：80所示多肽；Titin-T鏈為如SEQ ID NO：73所示多肽，Obscurin-O鏈為如SEQ ID NO：83所示多肽；Titin-T鏈為如SEQ ID NO：76所示多肽，Obscurin-O鏈為如SEQ ID NO：84所示多肽；Titin-T鏈為如SEQ ID NO：76所示多肽，Obscurin-O鏈為如SEQ ID NO：86所示多肽；Titin-T鏈為如SEQ ID NO：76所示多肽，Obscurin-O鏈為如SEQ ID NO：86所示多肽；或者Titin-T鏈為如SEQ ID NO：75所示多肽，Obscurin-O鏈為如SEQ ID NO：86所示多肽。
在一些實施方案中，前述的多肽複合物，其中第一抗原選自：外源抗原、內源抗原、自身抗原、新抗原、病毒抗原和腫瘤抗原。
在一些實施方案中，公開了一種多特異性多肽複合物，包括：
第一多肽複合物，其為前面任一項所述的多肽複合物，其與第一抗原特異性結合，和
第二多肽複合物，其包含第二抗原結合部分，其與第二抗原特異性結合。
在一些實施方案中，該第一多肽複合物和第二多肽複合物結合兩種不同的抗原。
在一些實施方案中，該第一多肽複合物和第二多肽複合物結合同一種抗原上的兩種不同表位。
在一些實施方案中，該多特異性多肽複合物為多特異性多肽複合物，更佳地，該多特異性多肽複合物為雙特異性抗體。
在一些實施方案中，該多特異性多肽複合物的第二多肽複合物包含第二重鏈可變結構域(VH2)和第二輕鏈可變結構域(VL2)。第一多肽複合物的VH1與第二多肽複合物的VL2，和/或第二多肽複合物的VH2與第一多肽複合物的VL1之間不容易發生錯配。在一些實施方案中，該第二抗原結合部分的VH2和VL2形成與第二抗原特異性結合的第二抗原結合位點。
在一些實施方案中，前述的多特異性多肽複合物，該第二多肽複合物的第二抗原結合部分包含：
第三多肽，其包含從N末端到C末端的VH2，其可操作地連接至第三結構域，該第三結構域包含CH1，和
第四多肽，其包含從N末端到C末端的VL2，其可操作地連接至第四結構域，該第四結構域包含CL。
在一些實施方案中，該VH2的C端與CH1的N端結合，該VL2的C端與CL的N端結合。
在一些實施方案中，前述的多特異性多肽複合物，該第一多肽複合物還包含可操作地連接的第一二聚化結構域，該第二多肽複合物還包含可操作地連接的第二二聚化結構域，該第一二聚化結構域和第二二聚化結構域相結合。
在一些實施方案中，該第一多肽複合物的第一結構域的C端與第一二聚化結構域的N端可操作地連接，該第二多肽複合物的第三結構域的C端與第二二聚化結構域的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，前述第一二聚化結構域和第二二聚化結構域藉由抗體鉸鏈區或其部分、連接子、二硫鍵、氫鍵、靜電相互作用、鹽橋、疏水-親水相互作用或其組合的結合方式結合形成二聚體。
在一些實施方案中，前述該第一二聚化結構域和第二二聚化結構域藉由抗體鉸鏈區或其部分結合形成二聚體，較佳IgG1、IgG2或IgG4的鉸鏈區或其部分結合形成二聚體。在一些實施方案中，較佳IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的鉸鏈區或其部分結合形成二聚體。
在一些實施方案中，前述的多特異性多肽複合物，該第一二聚化結構域和/或第二二聚化結構域還包含抗體CH2結構域和/或抗體CH3結構域。
在一些實施方案中，前述多特異性多肽複合物，抗體CH2結構域和/或抗體CH3結構域源自IgG1，IgG2或IgG4。在一些實施方案中，該抗體CH2結構域和/或抗體CH3結構域源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4
在一些實施方案中，前述多特異性多肽複合物，該第一多肽從N末端到C末端的依次為：VH1-L1-T鏈-L2-CH2-CH3，該第二多肽從N末端 到C末端的依次為：VL1-L3-O鏈或VL1-L4-OL鏈，該第三多肽從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-CH2-CH3，該第四多肽從N末端到C末端的依次為：VL1-CL；或者，該第一多肽從N末端到C末端的依次為：VH1-L2-O鏈-L3-CH2-CH3，或VH1-L4-OL鏈-L5-CH2-CH3；該第二多肽從N末端到C末端的依次為：VL1-L1-T鏈，該第三多肽從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-CH2-CH3，該第四多肽從N末端到C末端的依次為：VL2-CL；該L1-L5為間隔區(也稱連接域)，間隔區可存在或不存在。較佳的，該間隔區選自：Titin-T鏈的N末端片段，或Obscurin-O鏈的N末端片段，或類Obscurin-O鏈的N末端片段、或連接子(例如(GxS)y連接子)，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數。最佳地，該間隔區選自：“KAGIR”，“DQPQF”，(G4S)1和(G4S)2。
在一些實施方案中，前述的多特異性多肽複合物，該第一二聚化結構域和第二二聚化結構域不相同，並且以阻止同源二聚化和/或有利於異二聚化的方式結合。
在一些實施方案中，前述第一二聚化結構域和第二二聚化結構域藉由knob-into-hole、疏水相互作用、靜電相互作用、親水相互作用或增加的柔韌性的方式結合形成二聚體。
在一些實施方案中，前述第一二聚化結構域具有如SEQ ID NO：2所示的序列的第104至330位胺基酸殘基，該第二二聚化結構域具有如SEQ ID NO：3所示的序列的第104至330位胺基酸殘基；或者該第一二聚化結構域具有如SEQ ID NO：3所示的序列的第104至330位胺基酸殘基，該第二二聚化結構域具有如SEQ ID NO：2所示的序列的第104至330位胺基酸殘基。
在一些實施方案中，本披露提供一種結構域改造抗體，其至少一個恆定區結構域CH1和至少一個恆定區結構域CL被替代，其中：
該結構域CH1被Titin-T鏈替代，該結構域CL被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
該結構域CL被Titin-T鏈替代，該結構域CH1被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
該結構域CH1被Obscurin-O鏈替代，該結構域CL被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
該結構域CL被Obscurin-O鏈替代，該結構域CH1被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
該結構域CH1被類Obscurin-O鏈替代，該結構域CL被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該結構域CL被類Obscurin-O鏈替代，該結構域CH1被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體，該能夠與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈相互作用的結構域是Titin-T鏈，該能夠與Titin-T鏈相互作用的結構域是Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；
在一些實施方案中，該抗體包含重鏈可變區VH1和輕鏈可變區VL1，該VH1和VL1形成與其抗原特異性結合的原結合位點；該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可 操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，本披露提供一種結構域改造抗體的Fab片段，其中恆定區結構域CH1和恆定區結構域CL被替代，其中，
該結構域CH1被Titin-T鏈替代，該結構域CL被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該結構域CL被Titin-T鏈替代，該結構域CH1被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該結構域CH1被Obscurin-O鏈替代，該結構域CL被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該結構域CL被Obscurin-O鏈替代，該結構域CH1被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該結構域CH1被類Obscurin-O鏈替代，該結構域CL被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該結構域CL被類Obscurin-O鏈替代，該結構域CH1被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代。
在一些實施方案中，前述Fab片段，該與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；該與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Titin-T鏈。
在一些實施方案中，該Fab包含重鏈可變區VH1和輕鏈可變區VL1，該VH1和VL1形成與其抗原特異性結合的原結合位點；該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類 Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，本披露提供一種包含前述Fab片段的結構域改造抗體。
在一些實施方案中，本披露提供一種雙特異性抗體，其包含特異性結合第一抗原的第一重鏈和第一輕鏈，還包含特異性結合第二抗原的第二重鏈和第二輕鏈，其中，
該第一重鏈的CH1結構域被Titin-T鏈替代，第一輕鏈的CL結構域被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該第一輕鏈的CL結構域被Titin-T鏈替代，該第一重鏈的CH1結構域被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該第一重鏈的結構域CH1被Obscurin-O鏈替代，該第一輕鏈的結構域CL被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該第一輕鏈的結構域CL被Obscurin-O鏈替代，該第一重鏈的結構域CH1被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該第一重鏈的結構域CH1被類Obscurin-O鏈替代，該第一輕鏈的結構域CL被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
該第一輕鏈的結構域CL被類Obscurin-O鏈替代，該第一重鏈的結構域CH1被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代。
該雙特異性抗體結合的第一抗原和第二抗原不相同，或是同一種抗原上的兩種不同表位。
在具體的實施方案中，第一重鏈和第二輕鏈之間，第一輕鏈與第二重鏈之間不容易發生錯配。
在一些實施方案中，前述雙特異性抗體，其中該與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；該與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Titin-T鏈。
在一些實施方案中，其中該第一重鏈包含第一重鏈可變區(VH1)，該第一輕鏈包含第一輕鏈可變區(VL1)，該VH1和VL1形成與第一抗原特異性結合的抗原結合位點，且該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，前述的雙特異性抗體，其中該第二重鏈包含從N末端到C末端的第二重鏈可變區(VH2)，其可操作地連接至CH1；該第二輕鏈包含從N末端到C末端的第二輕鏈可變區(VL2)，其可操作地連接至CL。
在一些實施方案中，前述的雙特異性抗體，該VH2和VL2形成與第二抗原特異性結合的抗原結合位點，該VH2的C端與CH1的N端可操作地連接；該VL2的C端與CL的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，前述的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體結構模型選自F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab、KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、Fc△Adp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb、IgG和Fab-IgG等。
在一些實施方案中，前述的雙特異性抗體，該第一重鏈和第二重鏈的C末端包含CH2和/或CH3結構域。
在一些實施方案中，前述CH1、CH2和CH3結構域源自IgG1，IgG2或IgG4。在一些實施方案中，前述CH1、CH2和CH3結構域源自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在一些實施方案中，前述第一重鏈和第二重鏈藉由抗體鉸鏈區或其部分、連接子、二硫鍵、氫鍵、靜電相互作用、鹽橋、疏水-親水相互作用或其組合的結合方式結合形成二聚體。
在一些實施方案中，前述的雙特異性抗體，該第一重鏈從N末端到C末端的依次為：VH1-L1-T鏈-L2-CH2-CH3，該第一輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL1-L3-O鏈或VL1-L4-OL鏈，該第二重鏈從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-CH2-CH3，該第二輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL2-CL；或者
該第一輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL1-L1-T鏈，該第一重鏈從N末端到C末端的依次為：VH1-L2-O鏈-L3-CH2-CH3，或VH1-L4-OL鏈-L5-CH2-CH3；該第二重鏈從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-CH2-CH3，該第二輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL2-CL；
其中，該L1-L5為間隔區，間隔區可存在或不存在，較佳的，該間隔區為Titin-T鏈的N末端片段，或Obscurin-O鏈N末端片段，或類Obscurin-O鏈的N末端片段，或連接子，例如(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數；較佳地，該間隔區選自：“KAGIR”，“DQPQF”，(G4S)1和(G4S)2。
在一些實施方案中，前述的雙特異性抗體，該第一重鏈的CH2和CH3與第二重鏈的CH2和CH3不相同，並且以阻止同源二聚化和/或有利於異二聚化的方式結合。
在一些實施方案中，前述第一重鏈和第二重鏈藉由knob-into-hole、疏水相互作用、靜電相互作用、親水相互作用或增加的柔韌性的方式結合形成二聚體。
在一些實施方案中，前述第一重鏈和第二重鏈藉由knob-into-hole方式結合形成二聚體。在一些實施方案中，前述第一重鏈CH2-CH3結構域具有如SEQ ID NO：2所示的序列的第104至330位胺基酸殘基，該第二重鏈CH2-CH3結構域具有如SEQ ID NO：3所示的序列的第104至330位胺基酸殘基；或者該第一重鏈CH2-CH3結構域具有如SEQ ID NO：3所示的序列的第104至330位胺基酸殘基，該第二重鏈CH2-CH3結構域具有如SEQ ID NO：2所示的序列的第104至330位胺基酸殘基。
在一些實施方案中，前述的雙特異性抗體，該第一重鏈從N末端到C末端的依次為：VH1-L1-T鏈-L2-knob-Fc，該第一輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL1-L3-O鏈或VL1-L4-OL鏈，該第二重鏈從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-hole-Fc，該第二輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL1- CL；或者該第一重鏈從N末端到C末端的依次為：VH1-L1-T鏈-L2-hole-Fc，該第一輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL1-L3-O鏈或VL1-L4-OL鏈，該第二重鏈從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-knob-Fc，該第二輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL2-CL；或者
該第一輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL1-L1-T鏈，該第一重鏈從N末端到C末端的依次為：VH1-L2-O鏈-L3-knob-Fc，或VH1-L4-OL鏈-L5-knob-Fc；該第二重鏈從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-hole-Fc，該第二輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL2-CL；該第一輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL1-L1-T鏈，該第一重鏈從N末端到C末端的依次為：VH1-L2-O鏈-L3-hole-Fc，或VH1-L4-OL鏈-L5-hole-Fc；該第二重鏈從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-knob-Fc，該第二輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL2-CL；
該L1-L5為間隔區，間隔區可存在或不存在，較佳的，該間隔區為Titin-T鏈的N末端片段，或Obscurin-O鏈N末端片段，或類Obscurin-O鏈的N末端片段，或連接子，例如(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數；較佳地，該間隔區選自：“KAGIR”，“DQPQF”，(G4S)1和(G4S)2。
在一些實施方案中，前面任一項該結構域改造抗體、或結構域改造抗體的Fab片段，或雙特異性抗體，其中該與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；該與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Titin-T鏈。前面任一項該結構域 改造抗體、或結構域改造抗體的Fab片段，或雙特異性抗體，該可操作地連接是兩條多肽序列藉由間隔區連接或兩條多肽直接連接。
在一些實施方案中，前述的結構域改造抗體、或雙特異性抗體，或結構域改造抗體的Fab片段，其中該Titin-T鏈與Obscurin-O鏈，或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈藉由天然鏈間鍵和/或非天然鏈間鍵結合形成二聚體。
在一些實施方案中，該第一結構域與第二結構域藉由天然鏈間鍵形成二聚體，該Titin-T鏈上選自第7-15、19-24、26、55、59和60位中的一個或多個殘基與Obscurin-O鏈上的選自第3-6、9、41、73、75和80-90位中的一個或多個殘基彼此相結合，或者
該Titin-T鏈上的選自第1、7-10、13-16、19-26、59-60和96位中的一個或多個殘基與類Obscurin-O鏈上的選自第4-5、10、12-13、74、76、78和82-91位中的一個或多個殘基彼此相結合。該Titin-T鏈殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體，或結構域改造抗體的Fab片段，該Titin-T鏈與Obscurin-O鏈或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈藉由至少一個非天然鏈間鍵形成二聚體。在一些實施方案中，該非天然鏈間鍵為二硫鍵；在一些實施方案中，其中該二聚體包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個非天然鏈間鍵。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
該Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變；或者
Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變。
在一些實施方案中，該Titin-T鏈/Obscurin-O鏈，或者Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈為：
該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變的多肽，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變的多肽；或者
該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變的多肽，和/或該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變的多肽。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
該Titin-T鏈具有選自8C、20C、22C、25S、26C和39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自3C、9C、25S、76S和88C中的一個或多個胺基酸殘基突變；或者
該Titin-T鏈具有選自8C、20C、22C、25S、26C和39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自6E、26S、74C、77S、84C和86C中的一個或多個胺基酸殘基突變；
更佳地，該非天然鏈間鍵位於選自以下的突變位點：
Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有88C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和20C突變，且Obscurin-O鏈具有3C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和26C突變，且Obscurin-O鏈具有9C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S和88C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和20C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S和3C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和26C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S和9C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E和74C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和20C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E和84C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和22C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E和86C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E、26S、77S和74C突變；
Titin-T鏈具有25S、39T和20C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E、26S、77S和84C突變；或者
Titin-T鏈具有25S、39T和22C突變，且類Obscurin-O鏈具有6E、26S、77S和86C突變；
Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變；或者
該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變；該Titin-T 鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序位點。
在一些實施方案中，前述Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變；或者該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
該Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有A88C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，Obscurin-O鏈具有A3C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，Obscurin-O鏈具有R9C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A88C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A3C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和R9C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和V74C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和G84C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和A86C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和V74C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和G84C突變；
Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和A86C突變；
該Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序位點。
在一些實施方案中，在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段：該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有A88C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和V20C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有A3C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A26C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有R9C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有C25S、C76S和A88C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和V20C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有C25S、C76S和A3C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A26C突變，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有C25S、C76S和R9C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E和V74C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和V20C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E和G84C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和T22C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E和A86C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E、C26S、C77S和V74C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和V20C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E、C26S、C77S和G84C突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有C25S、C39T和T22C突變，該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有C6E、C26S、C77S和A86C突變。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號對應的位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號對應的位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號對應的位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，該Obscurin-O鏈還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變。在一些實施方案中，，該Obscurin-O鏈具有選自7R或7K、62K或62H、和11L的一個或多個胺基酸殘基突變；最佳地，該Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S、88C、7K和62K突變；Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S、88C、7K和62H突變；Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S、88C、11L和62K突變；或者Titin-T鏈具有25S、39T和8C突變，且Obscurin-O鏈具有25S、76S、88C、11L和62H。在一些實施方案中，該Obscurin-O鏈具有選自L7K或L7R、K11L、T62K或T62H的一個或多個胺基酸殘基突變；在一些實施方案中，Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62K突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62H突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C 突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62K突變；或者Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62H。上述Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變的Obscurin-O鏈；在一些實施方案中，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有選自L7K或L7R、K11L和T62K或T62H的一個或多個胺基酸殘基突變；在一些實施方案中，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62K突變；Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62H突變；Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62K突變；Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32基礎上具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45基礎上具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62H突變。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號對應的位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號對應的位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，該Titin-T鏈具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變。在一些實施方案中，Titin-T鏈具有選自3W、11I、13L、22M、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、66S或66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D和84L中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈具有選自2E、11K、12S、13Y、14T、17E、20L、22M或22S、30D、32P、34E、36T、41K、42L、44I、45T、53L、58V、62E、67Q或67T、69S、89L、92E、94G和97G中的一個或多個胺基酸突變。更佳地，該Titin-T鏈具有66S和77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有11K、12S、13Y、14T和22S胺基酸突變；該Titin-T鏈具有66K、70R、79T和81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有2E、17E、30D、32P、34E、36T、44I、45T、58V、62E、67Q、69S和97G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有3W、11I、13L、22M和82M胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有20L、22M和53L胺基酸突變；該Titin-T鏈具有11I、66K、79T和81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有41K、45T、67Q、69S和89L胺基酸突變；該Titin-T鏈具有40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、75V、83D和84L胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有42L、45T、67T、69S、92E和94G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有47E、49G、56S、58E和75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有42L、45T、67T、69S、92E和94G胺基酸突變；該Titin-T 鏈具有56S、58E和75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有42L、45T、67T、69S、92E和94G胺基酸突變；或者該Titin-T鏈具有56S、58E、66S和77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有12S、13Y、22S、42L、45T、67Q、69S、92E和94G胺基酸突變。上述Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。在一些實施方案中，該Titin-T鏈具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變。在一些實施方案中，該Titin-T鏈具有M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有L11K、A12S、F13Y、V14T和T22S胺基酸突變；該Titin-T鏈具有M66K、K70R、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有G2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S和A97G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有P3W、S11I、I13L、T22M和N82M胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有D20L、T22M和A53L胺基酸突變；該Titin-T鏈具有S11I、M66K、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q41K、A45T、A67Q、G69S和V89L胺基酸突變；該Titin-T鏈具有G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D和F84L胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、 A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有Q47E、Q49G、N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈具有N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；或者該Titin-T鏈具有N56S、D58E、M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有A12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變。上述Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段：該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變的多肽，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變的多肽。該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。在一些實施方案中，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、 V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變。在一些實施方案中，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有L11K、A12S、F13Y、V14T和T22S胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有M66K、K70R、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有G2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S和A97G胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有P3W、S11I、I13L、T22M和N82M胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有D20L、T22M和A53L胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有S11I、M66K、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有Q41K、A45T、A67Q、G69S和V89L胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D和F84L胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有Q47E、Q49G、N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有 Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；或者該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有N56S、D58E、M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有A12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，該Titin-T鏈、Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端藉由連接域與VH或VL可操作地連接。在一些實施方案中，該連接域選自：Titin-T鏈的N末端片段，Obscurin-O鏈N末端片段或類Obscurin-O鏈的N末端片段，和(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數。在一些實施方案中，該連接域選自：“KAGIR”，“DQPQF”，(G4S)1和(G4S)2。
在一些實施方案中，該Titin-T鏈藉由KAGIR多肽與VH或VL連接，和/或該Obscurin-O鏈藉由DQPQF多肽與VL或VH連接。
在一些實施方案中，前述的多肽複合物，其中：
(A)該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或在SEQ ID NO：32序列基礎上還具有選自8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、 T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；和/或
(B)該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或在SEQ ID NO：33的序列基礎上還具有選自3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94和97中一個或多個位點的胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；或者
該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或在SEQ ID NO：34序列基礎上還具有選自6、26、74、77、84和86中一個或多個位點胺基酸突變的序列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變的序列；
上述Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點；
較佳地，其中：
(A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變， 該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；更較佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
(B)該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；較佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45序列基礎上還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自L7K或L7R、T62K或T62H、和K11L的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：45的自然順序編號位點；更較佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點；或者
該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變，該類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，前述結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，該Titin-T鏈包含序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列有至少80%同一性的多肽，和/或該Obscurin-O鏈包含序列如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一序列有至少80%同一性的多肽；或者該Titin-T鏈包含序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列有至少80%同一性的多肽，和/或該類Obscurin-O鏈包含序列如SEQ ID NO：34、59-64任一所示或與SEQ ID NO：34、59-64任一所示序列具有至少80%同一性多肽。其中該具有至少80%同一性：例如是具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。
在一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：68所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：80所示多肽；Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：73所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：83所示多肽；Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：84所示多肽；Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽；Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多 肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽；Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：75所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽。
在一些實施方案中，前述雙特異性抗體，其為選自以下A至I中任一項所述的雙特異性抗體：
A、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：89所示或與SEQ ID NO：89具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：90所示或與SEQ ID NO：90具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：87所示或與SEQ ID NO：87具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：88所示或與SEQ ID NO：88具有至少85%序列同一性；
B、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：93所示或與SEQ ID NO：93具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：94所示或與SEQ ID NO：94具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：91所示或與SEQ ID NO：91具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：92所示或與SEQ ID NO：92具有至少85%序列同一性；
C、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：97所示或與SEQ ID NO：97具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：98所示或與SEQ ID NO：98具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：95所示或與SEQ ID NO：95具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：96所示或與SEQ ID NO：96具有至少85%序列同一性；
D、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：99所示或與SEQ ID NO：99具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：100所示或與SEQ ID NO：100具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：101所示或與SEQ ID NO：101具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：96所示或與SEQ ID NO：96具有至少85%序列同一性；
E、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：102所示或與SEQ ID NO：102具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：100所示或與SEQ ID NO：100具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：95所示或與SEQ ID NO：95具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：96所示或與SEQ ID NO：96具有至少85%序列同一性；
F、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：103所示或與SEQ ID NO：103具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：104所示或與SEQ ID NO：104具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：95所示或與SEQ ID NO：95具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：96所示或與SEQ ID NO：96具有至少85%序列同一性；
G、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：107所示或與SEQ ID NO：107具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：108所示或與SEQ ID NO：108具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：109所示或與SEQ ID NO：109具有至少85%序列同一性， 第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：110所示或與SEQ ID NO：110具有至少85%序列同一性；；
H、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：122所示或與SEQ ID NO：122具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：123所示或與SEQ ID NO：123具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：116所示或與SEQ ID NO：116具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：117所示或與SEQ ID NO：117具有至少85%序列同一性；
I、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：118所示或與SEQ ID NO：118具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：119所示或與SEQ ID NO：119具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：124所示或與SEQ ID NO：124具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：125所示或與SEQ ID NO：125具有至少85%序列同一性；
其中，前述具有至少85%同一性：例如是具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。
在一些實施方案中，本披露提供一種製備多特異性抗體的方法，該方法包括用Titin-T鏈和Obscurin-O鏈、或者Titin-T鏈和類Obscurin-O鏈替換抗體CH1/CL。在一些製備多特異性抗體的方法的實施方案中，相較於CH1/CL未被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈、或者Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換的野生型，本披露的多特異性抗體具有減少的輕鏈與重鏈錯配。
在一些實施方案中，本披露還提供前述製備多特異性抗體的方法製備獲得的多特異性抗體。在一些實施方案中，該多特異性抗體包含第一重鏈可變區(VH1)和第一輕鏈可變區(VL1)，該VH1和VL1形成與第一抗原特異性結合的抗原結合位點，且該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，該製備多特異性抗體的方法，該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一條序列所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任條一序列具有至少80%同一性的多肽，和/或該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一條序列所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一條序列有至少80%同一性的多肽；或者該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一條序列所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一條序列具有至少80%同一性的多肽，和/或該類Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：34、59-64任一條序列所示或與SEQ ID NO：34、59-64任一條序列具有至少80%同一性多肽。
在一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：68所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：80所示多肽；在一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：73所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：83所示多肽；在一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：84所示多肽；在一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽；在一些實施方案中，Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：75所示多肽，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽。
在一些實施方案中，其中：
(A)該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或在SEQ ID NO：32序列基礎上還具有選自8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；和/或
(B)該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或在SEQ ID NO：33的序列基礎上還具有選自3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94和97中一個或多個位點的胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；或者
該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或在SEQ ID NO：34序列基礎上還具有選自6、26、74、77、84和86中一個或多個位點胺基 酸突變的序列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變的序列；
上述Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點；
較佳地，其中，
(A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；更較佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
(B)該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；較佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45序列基礎上還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自L7K或L7R、T62K或T62H、和K11L的一個或多 個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：45的自然順序編號位點；更佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點；或者
該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變，該類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
在一些實施方案中，本披露提供一種綴合物，其包含前面任一項所述的多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片段或雙特異性抗體、或多特異性抗體。
在一些實施方案中，本披露提供一種多肽，其序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列有至少80%同一性；或者序列如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一序列有至少80%同一性；或者序列如SEQ ID NO：34、59-64任一所示或與SEQ ID NO：34、59-64任一所示序列具有至少80%同一性；較佳地，該多肽可用於替換抗體CH1和/或CL。更佳地，該多 肽為Titin-T鏈和Obscurin-O鏈、或Titin-T鏈和類Obscurin-O鏈，雙特異性抗體的單側CH1和CL被Titin-T鏈和Obscurin-O鏈替換、或Titin-T鏈和類Obscurin-O鏈替換後，第一重鏈與第二輕鏈之間、第一輕鏈與第二重鏈之間不容易發生錯配。
在一些實施方案中，該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或是SEQ ID NO：32序列還具有選自8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中一個或多個位點胺基酸突變序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或是SEQ ID NO：33的序列還具有選自3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94和97中一個或多個位點的胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或SEQ ID NO：34序列還具有選自6、26、74、77、84和86中一個或多個位點胺基酸突變序列；較佳具有選自 C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變序列。
一種用於替換抗體的CH1和/或CL、替換抗原結合片段的CH1和/或CL，或替換多肽複合物的CH1和/或CL的多肽，該多肽的序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列有至少80%同一性；或者序列如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一序列有至少80%同一性；或者序列如SEQ ID NO：34、59-64任一所示或與SEQ ID NO：34、59-64任一所示序列具有至少80%同一性；較佳地，該多肽為Titin-T鏈和Obscurin-O鏈、或Titin-T鏈和類Obscurin-O鏈。更佳地，該多肽替換雙特異性抗體的單側CH1和CL後，雙特異性抗體的第一重鏈與第二輕鏈之間、第一輕鏈與第二重鏈之間不容易發生錯配。
在一些實施方案中，本披露提供一種Titin-T鏈、Obscurin-O鏈和/或類Obscurin-O鏈，其中該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列有至少80%同一性，Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一序列有至少80%同一性；類Obscurin-O鏈序列如SEQ ID NO：34、59-64任一所示或與SEQ ID NO：34、59-64任一所示序列具有至少80%同一性。在一些實施方案中，該Titin-T鏈/Obscurin-O鏈，或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈可用於替換抗體CH1和/或CL。
在一些實施方案中，該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或是SEQ ID NO：32序列還具有選自8、20、22、25、26、39、3、11、13、 40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中一個或多個位點胺基酸突變序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中一個或多個位點胺基酸突變序列；該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或是SEQ ID NO：33的序列還具有選自3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94和97中一個或多個位點的胺基酸突變序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中一個或多個位點胺基酸突變序列；該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或SEQ ID NO：34序列還具有選自6、26、74、77、84和86中一個或多個位點胺基酸突變序列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變序列。
在一些實施方案中，本披露還公開Titin-T鏈和Obscurin-O鏈、或者Titin-T鏈和類Obscurin-O鏈在減少多特異性抗體輕鏈/重鏈錯配中的應用；在一些實施方案中，該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一條序列所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任條一序列具有至少80%同一性的多肽，和/或該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一條序列所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一條序列有至少80%同一 性的多肽；或者該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一條序列所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一條序列具有至少80%同一性的多肽，和/或該類Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：34、59-64任一條序列所示或與SEQ ID NO：34、59-64任一條序列具有至少80%同一性多肽。
在一些實施方案中，前述Titin-T鏈和Obscurin-O鏈、或者Titin-T鏈和類Obscurin-O鏈在減少多特異性抗體輕鏈/重鏈錯配中的應用，該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或是SEQ ID NO：32序列還具有選自8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中一個或多個位點胺基酸突變，和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中一個或多個位點胺基酸突變序列，和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或是SEQ ID NO：33的序列還具有選自3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94和97中一個或多個位點的胺基酸突變序列，和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中一個或多個位點胺基酸突變序列，和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基 的序列；該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或SEQ ID NO：34序列還具有選自6、26、74、77、84和86中一個或多個位點胺基酸突變序列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變序列。
在一些實施方案中，該多特異性抗體包含第一重鏈可變區(VH1)和第一輕鏈可變區(VL1)，該VH1和VL1形成與第一抗原特異性結合的抗原結合位點，且該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
在一些實施方案中，本披露提供一種核酸分子，其編碼前面任一項所述的多肽複合物，或多特異性多肽複合物，或結構域改造抗體、或結構域改造抗體的Fab片段、或雙特異性抗體、或多肽、或多特異性抗體。
在一些實施方案中，本披露提供一種載體，其包含前述的核酸分子。
在一些實施方案中，本披露提供一種宿主細胞，其由前述的載體轉化(或轉導、轉染)獲得；該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳哺乳動物細胞。在一些實施方案中，該宿主細胞不包括任何能夠發育成完整個體的動物或植物細胞，如人胚胎幹細胞、受精卵、生殖細胞。
在一些實施方案中，該宿主細胞為真核細胞，更佳哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞包括但不限於CHO、293、NSO，以及在哺乳動物細胞中進行基因編輯可改變抗體或其抗原結合片段的糖基化修飾，進而改變抗體 或其抗原結合片段的ADCC功能的細胞，例如，敲除FUT8或GnT-III等基因。在一些實施方案中，該哺乳動物細胞不包括人細胞。
在一些實施方案中，本披露提供一種製備前面任一項所述的多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片段、雙特異性抗體、或多肽、或多特異性抗體的方法，該方法包括以下步驟：
培養權前述的宿主細胞，然後純化並回收多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片段、雙特異性抗體或多肽、或多特異性抗體。
在一些實施方案中，本披露提供一種醫藥組成物，其含有前面任一項所述的多肽複合物、或多特異性多肽複合物、或結構域改造抗體、或結構域改造抗體的Fab片段、或雙特異性抗體、或核酸、或多特異性抗體、或綴合物，以及一種或多種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。較佳地，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的前述多肽複合物、或多特異性多肽複合物、或結構域改造抗體、或結構域改造抗體的Fab片段、或雙特異性抗體、或多特異性抗體、或綴合物，或醫藥組成物單位劑量中含前述多肽複合物、或多特異性多肽複合物、或結構域改造抗體、或結構域改造抗體的Fab片段、或雙特異性抗體、或多特異性抗體、或綴合物的量較佳為0.1-2000mg，更佳為1-1000mg。
在一些實施方案中，本披露提供前面任一項所述的多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片段、雙特異性抗體、醫藥組成物、或核酸分子、或多特異性抗體，在製備用於治療或預防疾病或病症的藥物中的用途。在一些實施方案中，該疾病或病症為腫瘤、 炎性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病。在一些實施方案中，該疾病或病症為骨相關性疾病，骨質疏鬆症、骨質減少或骨關節炎、類風濕性關節炎、牙周病或多發性骨髓瘤的疾病或障礙。在一些實施方案中，該腫瘤選自癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或類淋巴惡性瘤。在一些實施方案中，該腫瘤選自：鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性類髓細胞白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性類髓細胞白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、類髓細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生綜合症(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、***癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈類澱粉變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生綜合症、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睾丸癌和皮膚癌。在一些實施方案中，該炎性疾病選自：類風濕關節炎、牛皮癬、克羅恩病、強硬性脊椎炎、多發性硬化症、I型糖尿病、肝炎(例如B肝、A肝、C肝)、心肌炎、Sjogren綜合症、移植排斥後的自體免疫性溶血性貧血、水皰性類天皰瘡、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、 系統性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、天皰瘡、惡性貧血。在一些實施方案中，該免疫性疾病可選自：類風濕性關節炎、牛皮癬、關節銀屑病、皮炎、系統性硬皮病及硬化症、炎症性腸病(IBD)、Crohn病、潰瘍性結腸炎、呼吸窘迫綜合症、腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、腎小球腎炎、濕疹、哮喘、動脈硬化、白細胞黏附缺陷病、多發性硬化症、Raynaud症候群、Sjogren症候群、青少年糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫複合物性腎炎、IgA腎病、IgM多發性神經病、免疫介導的血小板減少症狀(如急性特發性血小板減少性紫癜、慢性特發性血小板減少性紫癜)、溶血性貧血、重症肌無力、狼瘡性腎炎、系統性紅斑狼瘡、風濕關節炎(RA)、異位性皮炎、天皰瘡、Graves病、橋本甲狀腺炎、Wegener肉芽腫、Omenn症候群、慢性腎功能衰竭、急性傳染性單核細胞增多症、HIV和皰疹病毒相關的疾病、嚴重急性呼吸綜合症、脈絡視網膜炎(choreoretinitis)、以及病毒感染引起的免疫性疾病(如伊波病毒(EBV)感染B細胞引起或介導的疾病)。
在一些實施方案中，本披露提供一種治療或預防疾病或病症方法，該方法包括給予受試者預防有效量或治療有效量的前面任一項所述的多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片段、雙特異性抗體、醫藥組成物、或核酸分子、或多特異性抗體。在一些實施方案中，該疾病或病症為腫瘤、炎性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病。在一些實施方案中，該疾病或病症為骨相關性疾病，骨質疏鬆症、骨質減少或骨關節炎、類風濕性關節炎、牙周病或多發性骨髓瘤的疾病或障礙。在一些實施方案中，該腫瘤選自癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或類淋巴惡性瘤。在一些實施方案中，該腫瘤選自：鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非 小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性類髓細胞白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性類髓細胞白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、類髓細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生綜合症(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、***癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈類澱粉變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生綜合症、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睾丸癌和皮膚癌。在一些實施方案中，該炎性疾病選自：類風濕關節炎、牛皮癬、克羅恩病、強硬性脊椎炎、多發性硬化症、I型糖尿病、肝炎(例如乙肝、甲肝、丙肝)、心肌炎、Sjogren綜合症、移植排斥後的自體免疫性溶血性貧血、水皰性類天皰瘡、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、天皰瘡、惡性貧血。在一些實施方案中，該免疫性疾病可選自：類風濕性關節炎、牛皮癬、關節銀屑病、皮炎、系統性硬皮病及硬化症、炎症性腸病(IBD)、Crohn病、潰瘍性結腸炎、呼吸窘迫綜合症、腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、腎小球腎炎、濕疹、哮喘、動脈硬化、白細胞黏附缺陷病、多發性硬化 症、Raynaud症候群、Sjogren症候群、青少年糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫複合物性腎炎、IgA腎病、IgM多發性神經病、免疫介導的血小板減少症狀(如急性特發性血小板減少性紫癜、慢性特發性血小板減少性紫癜)、溶血性貧血、重症肌無力、狼瘡性腎炎、系統性紅斑狼瘡、風濕關節炎(RA)、異位性皮炎、天皰瘡、Graves病、橋本甲狀腺炎、Wegener肉芽腫、Omenn症候群、慢性腎功能衰竭、急性傳染性單核細胞增多症、HIV和皰疹病毒相關的疾病、嚴重急性呼吸綜合症、脈絡視網膜炎(choreoretinitis)、以及病毒感染引起的免疫性疾病(如伊波病毒(EBV)感染B細胞引起或介導的疾病)。
在一些實施方案中，本披露提供一種用作藥物的前面任一項所述的多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片段、雙特異性抗體、醫藥組成物、或核酸分子、或多特異性抗體。在一些實施方案中，該藥物用於治療或預防疾病或病症。在一些實施方案中，該疾病或病症為腫瘤、炎性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病。在一些實施方案中，該疾病或病症為骨相關性疾病，骨質疏鬆症、骨質減少或骨關節炎、類風濕性關節炎、牙周病或多發性骨髓瘤的疾病或障礙。在一些實施方案中，該腫瘤選自癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或類淋巴惡性瘤。在一些實施方案中，該腫瘤選自：鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性類髓細胞白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性類髓細胞白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴 瘤、多發性骨髓瘤、類髓細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生綜合症(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、***癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈類澱粉變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生綜合症、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睾丸癌和皮膚癌。在一些實施方案中，該炎性疾病選自：類風濕關節炎、牛皮癬、克羅恩病、強硬性脊椎炎、多發性硬化症、I型糖尿病、肝炎(例如乙肝、甲肝、丙肝)、心肌炎、Sjogren綜合症、移植排斥後的自體免疫性溶血性貧血、水皰性類天皰瘡、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、天皰瘡、惡性貧血。在一些實施方案中，該免疫性疾病可選自：類風濕性關節炎、牛皮癬、關節銀屑病、皮炎、系統性硬皮病及硬化症、炎症性腸病(IBD)、Crohn病、潰瘍性結腸炎、呼吸窘迫綜合症、腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、腎小球腎炎、濕疹、哮喘、動脈硬化、白細胞黏附缺陷病、多發性硬化症、Raynaud症候群、Sjogren症候群、青少年糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫複合物性腎炎、IgA腎病、IgM多發性神經病、免疫介導的血小板減少症狀(如急性特發性血小板減少性紫癜、慢性特發性血小板減少性紫癜)、溶血性貧血、重症肌無力、狼瘡性腎炎、系統性紅斑狼瘡、風濕關節炎(RA)、異位性皮炎、天皰瘡、Graves病、橋本甲狀腺炎、Wegener肉芽腫、Omenn症候群、 慢性腎功能衰竭、急性傳染性單核細胞增多症、HIV和皰疹病毒相關的疾病、嚴重急性呼吸綜合症、脈絡視網膜炎(choreoretinitis)、以及病毒感染引起的免疫性疾病(如伊波病毒(EBV)感染B細胞引起或介導的疾病)。
在一些實施方案中，本披露提供一種檢測方法，該方法包括：使用前面任一項所述的多肽複合物，或多特異性多肽複合物，或結構域改造抗體、或結構域改造抗體的Fab片段、或雙特異性抗體、或多特異性抗體接觸待測樣本的步驟。
在一些實施方案中，本披露提供一種用於檢測或測定的試劑，該試劑包含：前面任一項所述的多肽複合物，或多特異性多肽複合物，或結構域改造抗體、或結構域改造抗體的Fab片段、或雙特異性抗體、或多特異性抗體。
圖1A和圖1B為Titin-T和Obscurin-O或Titin-T和類Obscurin-O鏈結構域間相互作用界面結構圖；
圖2為CH1和CL被替換的Fab示意圖；
圖3為雙側CH1和CL被替換的IgG單特異性抗體結構示意圖；
圖4為單側CH1和CL被替換IgG雙特異性抗體結構示意圖；
圖5為DI-1雙特異性抗體結構示意圖；
圖6A至圖6C為DI-1質譜分析圖。圖6A為LC1/LC2質譜圖，圖6B為HC1/HC2質譜圖；圖6C為為LC1+LC2+HC1+HC2質譜圖；
圖7為抗體輕鏈/重鏈交叉錯配分子結構示意圖；
圖8為BU5雙特異性抗體結構示意圖；
圖9A至圖9C為BU5質譜分析圖；
圖10為DI-1雙特異性抗體破骨細胞分化實驗結果圖；
圖11為DI-1雙特異性抗體TF1細胞增殖實驗結果圖；
圖12為雙特異性抗體HJ-1、HJ-2、HJ-3和HJ-4的結構示意圖；
圖13A至圖13D為雙特異性抗體HJ-1、HJ-2、HJ-3、HJ-4的四條鏈共表達的質譜分析圖；
圖14A至圖14B為雙特異性抗體HJ-1的HJ-1-H1、HJ-1-H2、HJ-1-L2的3條鏈共表達的質譜分析圖；
圖15A至圖15B為雙特異性抗體HJ-3的HJ-3-H1、HJ-3-H2、HJ-3-L2的3條鏈共表達的質譜分析圖；
圖16A至圖16B為殘基之間的相互作用。
為了更容易理解本披露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本披露所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本披露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“抗體(antibody，Ab)”一般是免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，一個天然完整抗體是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈，據此可以將抗體分為兩型(type)。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。根據λ鏈恆定區個別胺基酸的差異，又可分為λ1、λ2、λ3和λ4四個亞型(subtype)。
本披露所稱抗體包括抗體或其抗原結合片段，包括在免疫球蛋白基礎上經過改造，同時保留結合抗原的能力的抗體或其抗原結合片段；包括單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)；還包括一價抗體、或多價抗體(例如二價抗體)。抗體的抗原結合片段，例如可以是包含至少一個VH-CH1和至少一個VL-CL結構，其中VH和VL結構能夠基於鏈間相互作用而靠近，並保留結合抗原的能力的抗原結合片段。在一些實施方案中，該抗體的抗原結合片段為一價Fab片段(Fab1片段)、二價Fab片段(F(ab)2)、三價Fab片段(F(ab)3)、多價(兩個或以上)Fab片段，也可以是其它包含至少一個Fab片段的單特異性、雙特異性或多特異性抗原結合片段。
本披露所述“結構域改造抗體”是指抗體的CH1和/或CL被其他結構域或肽片段替換後形成的抗體，可用於替換抗體的CH1/CL結構域的結構域或肽片段通常具有分子間相互作用；可選擇的結構域組合包括但不限於：IL13RA1 Fibronectin type-III 3結構域/IL4R Fibronectin type-III結構域、IL6ST Fibronectin型-III 2結構域/IL6R Fibronectin型-III 2結構域、類HFE IgC1-型結 構域/類B2M IgC1-型結構域、類CD1B Ig結構域/類B2M Ig C1-型結構域、類Obscurin Ig1結構域/類Titin Ig152結構域或類Obscurin類Ig1/類Titin Ig152結構域。在一些實施方案中，該結構改造抗體為單特異性抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體；在一些實施方案中，該結構改造抗體為一價抗體、二價抗體或多價抗體；在一些實施方案中，該結構改造抗體為完整抗體或其抗原結合片段；在一些實施方案中，該抗體抗原結合片段是Fab片段，可以是一價Fab片段(Fab1片段)、二價Fab片段(F(ab)2)、三價Fab片段(F(ab)3)或多價(兩個或以上)Fab片段。示例性地，抗體Fab片段的CH1和CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈或被Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換的結構示意圖見圖2；抗體的CH1和CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈、或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換結構示意圖見圖3；雙特異性抗體的一側CH1和CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈、或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換的結構示意圖見圖4。至少一個CH1和至少一個CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈、或被Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換的其它抗體：例如，二價抗體的一側CH1和CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換；雙特異性抗體的兩側CH1和CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈、或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換；F(ab)2片段的2個CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈、或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換；F(ab)3片段的1個或2個或3個CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈、或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換。
“Titin”(肌聯蛋白)是一個巨大的肌小節蛋白，具有複雜的分子折疊結構。已知它具有將粗肌絲與Z-線連接，維持肌原纖維的完整性和穩定性等功能。肌聯蛋白是骨骼肌纖維中第三類豐富蛋白質，它的分子量為2700kDa(25000多個胺基酸)，長度為1μm，約占肌節的一半。
“類Titin Ig152結構域”是Titin蛋白上一段命名為類Titin Ig152的類Ig結構域，該結構域能夠與類Obscurin Ig1或類Obscurin類Ig1結構域藉由分子間相互作用結合形成二聚體複合物(可從RCSB PDB數據庫獲得)。
“Titin-T鏈”、“T鏈”是指Titin蛋白中一段長度為78-118個胺基酸的包含類Titin Ig152結構域的肽段或其功能變體，該Titin-T鏈能夠與類Obscurin Ig1或類Obscurin類Ig 1結構域藉由分子間相互作用結合形成複合物。該T鏈功能變體是對野生型T鏈的部分胺基酸進行突變，但依然具有與類Obscurin Ig1或類Obscurin類Ig1藉由分子間相互作用結合形成複合物的肽段。本披露中，Titin-T鏈可用於替換抗體的CH1或CL結構域，而不影響抗體VH和VL的結合及抗體與抗原表位的結合。可以對Titin-T鏈部分胺基酸進行突變，只要其仍能夠與類Obscurin Ig 1結構域彼此締合形成複合物。例如，在類Titin Ig152結構域C端和/或N端增加或截短合適長度的胺基酸；例如，可增加或截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基；例如，在類Titin Ig152結構域N端增加5個Titin蛋白中緊鄰類Titin Ig152結構域N端的“KAGIR”這5個胺基酸，；也可在類Titin Ig152結構域的N端和/或C端添加適當長度的連接序列(例如，(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數，如“G4S”、“(G4S)2”)，使類Titin Ig152結構域的N端藉由連接序列連接抗體的VH/或VL。還可對類Titin Ig152結構域胺基酸進行其它突變，例如，對某些胺基酸突變以便增加鏈間二硫鍵，提高複合物穩定性。本披露的一些實施方案中，該Titin-T鏈為序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列有至少80%同一性的多肽，該多肽能與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈彼此締合形成複合物。
“Obscurin”(遮蔽蛋白)，是一種由OBSCN基因編碼的蛋白質，屬於巨型肌胺酸信號蛋白家族。Obscurin在心肌和骨骼肌中表達，並在肌節組 裝過程中在肌原纖維的組織中發揮重要作用。Obscurin是肌漿網狀蛋白sANK1的主要細胞質配體，其可以阻止sANK1的降解(Lange S等.Molecular Biology of the Cell.23(13)：2490-504)；Obscurin在肌漿網狀結構域和肌漿網狀結構域之間發揮信號聯繫的作用(BagnatoP等，The Journal of Cell Biology.160(2)：245-53.)；Obscurin在肌原纖維組裝過程中參與新肌節的形成(Borisov AB，等，Biochemical and Biophysical Research Communications.310(3)：910-918)。
“類Obscurin Ig1結構域”是Obscurin蛋白中一段命名為類Obscurin Ig1的類Ig結構域，該結構域能夠與類Titin Ig152結構域藉由分子間相互作用形成複合物(可從RCSB PDB數據庫獲得)。
“Obscurin-O鏈”、“O鏈”是指Obscurin蛋白上一段長度為87-117個胺基酸的包含類Obscurin Ig1結構域的肽段或其功能變體，該Obscurin-O鏈能夠與類Titin Ig152結構域藉由分子間相互作用形成複合物。該Obscurin-O鏈功能變體是對野生型O鏈的部分胺基酸進行突變，但其依然具有與類Titin Ig152結構域藉由分子間相互作用形成複合物的肽段。本披露中，Obscurin-O鏈可替換抗體的CH1或CL結構域，而不影響抗體VH和VL的結合及抗體與抗原表位的結合。可以對Obscurin-O鏈部分胺基酸進行突變，只要其能夠與類Titin Ig152結構域彼此締合形成複合物。例如，在Obscurin-O結構域C端和/或N端增加或截短合適長度的胺基酸，例如增加或截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸；例如在Obscurin-O結構域N端增加5個野生型Obscurin蛋白中緊鄰類Obscurin Ig 1結構域N端的“DQPQF”這5個胺基酸。也可在Obscurin-O結構域的N端和/或C端添加適當長度的連接序列(例如，(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數，如“G4S”、“(G4S)2”)，使Obscurin-O結構域的N端藉由連接序列連接抗體的VH/或VL。還可對類Obscurin Ig1結構域部分胺基酸進行其它突變，例如，對某些胺基酸突變以便 增加鏈間二硫鍵，進一步提高抗體穩定性等。本披露的一些實施方案中，該Obscurin-O鏈為序列如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一序列有至少80%同一性的多肽，該多肽能與Titin-T鏈彼此締合形成複合物。
“類Obscurin1”、“類遮蔽蛋白1”，是由位於人染色體2q35的SPEG內的OBSL1基因編碼的一種蛋白質，該蛋白與Obscurin密切相關。其可變剪接產生多種同工型，預測分子量範圍為130kD至230kD(Geisler SB等.(2007).Genomics.89(4)：521-31)。
“類Obscurin類Ig1結構域”是類Obscurin1蛋白中一段命名為類Obscurin類Ig1的類Ig結構域，該結構域能夠與類Titin Ig152結構域藉由分子間天然相互作用形成複合物(可從RCSB PDB數據庫獲得)。
“類Obscurin-O鏈”、“OL鏈”是指類Obscurin1蛋白上一段長度為78-118個胺基酸的包含類Obscurin類Ig1結構域的肽段或其功能變體。該類Obscurin-O鏈能夠與類Titin Ig152結構域藉由分子間相互作用形成複合物。該類Obscurin-O鏈功能變體為對野生型OL鏈的部分胺基酸進行突變，但其依然具有與類Titin Ig152結構域相互作用形成複合物的肽。本披露中，類Obscurin-O鏈可替換抗體的CH1或CL結構域，而不影響抗體VH和VL的結合及抗體與抗原表位的結合。還可以對類Obscurin-O鏈部分胺基酸進行突變，只要其能夠與類Titin Ig152結構域彼此締合形成複合物。在一些實施方案中，例如，在Obscurin-O結構域C端和/或N端增加或截短合適長度的胺基酸，例如增加或截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)。也可在類Obscurin-O結構域的N端和/或C端添加適當長度的連接序列(例如，(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數，如“G4S”、“(G4S)2”)，使類Obscurin-O結構域的N端藉由連接序列連接抗體的VH或VL。還可對類Obscurin類Ig1結 構域部分胺基酸進行其它突變，例如，對某些胺基酸突變以便增加鏈間二硫鍵、進一步提高抗體穩定性等。本披露的一些實施方案中，該類Obscurin-O鏈為序列如SEQ ID NO：34、59-64任一所示或與SEQ ID NO：34、59-64任一所示序列具有至少80%同一性多肽，該多肽能與Titin-T鏈彼此締合形成複合物。
另外，可對類Titin Ig152結構域、類Obscurin Ig1結構域或類Obscurin類Ig1結構域上的部分胺基酸進行突變，只要其仍能夠使類Titin Ig152結構域與類Obscurin Ig1結構域，或類Titin Ig152結構域與類Obscurin類Ig1結構域彼此締合形成複合物。在一些實施方案中，可以在類Titin Ig152結構域、類Obscurin Ig1結構域或類Obscurin類Ig1結構域的C端和/或N端增加或截短合適長度的胺基酸(例如緊鄰結構域的野生型蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)，只要其仍能夠使類Titin Ig152結構域與類Obscurin Ig1結構域，或類Titin Ig152結構域與類Obscurin類Ig1結構域彼此締合形成複合物。例如，在類Titin Ig152結構域N端增加5個野生型Titin蛋白中緊鄰類Titin Ig152結構域N端的“KAGIR”這5個胺基酸；或在類Obscurin Ig1結構域N端增加5個野生型Obscurin蛋白中緊鄰類Obscurin Ig1結構域N端的“DQPQF”這5個胺基酸。在一些實施方案中，可以在類Titin Ig152結構域、類Obscurin Ig1結構域或類Obscurin類Ig1結構域的N端和/或C端可添加適當長度的連接序列(例如，(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數，如“G4S”、“(G4S)2”)，使類Titin Ig 152結構域、類Obscurin Ig 1結構域、類類Obscurin Ig 1結構域的N端藉由連接序列連接抗體的VH或VL。在一些實施方案中，還可對類Titin Ig 152結構域、類Obscurin Ig 1結構域或類類Obscurin Ig 1結構域上的部分胺基酸進行其它突變，只要其仍能夠使類Titin Ig 152結構域與類Obscurin Ig 1結構域，或類Titin Ig 152結構域與類類 Obscurin Ig 1結構域彼此相互作用形成複合物，例如，對部分胺基酸突變以增加鏈間二硫鍵，進一步提高抗體穩定性等。
“Fab片段”，是指可以藉由酶處理單株抗體來生產獲得的能夠結合抗原的片段，該片段包含輕鏈(VL-CL)和重鏈的VH-CH1結構。
“結構域改造的Fab片段”是指抗體Fab片段中CL和/或CH1被其他結構域或肽片段替換後形成的多肽片段，結構域改造的Fab片段仍保留VH和VL間的相互作用，以及保留抗體與抗原的結合能力。在一些實施方案中，結構域改造的Fab片段可以作為多價抗體或多價多肽複合物的一部分。在另一些實施方案中，結構域改造的Fab片段作為一個單一的蛋白分子。Fab片段可以是一價Fab片段(Fab片段1)、二價Fab片段(F(ab)2)、三價Fab片段(F(ab)3)或多價(兩個或以上)Fab片段。示範性地，Fab片段的CH1和CL被替換的示意圖見圖2。
術語“特異性抗體”或“特異性多肽複合物”指能夠對目標抗原或抗原表位特異性結合的抗體或多肽複合物。根據抗體結合的不同目標抗原或不同抗原表位的數目，分為單特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、四特異性抗體......，多特異性(結合兩個或兩個以上不同目標抗原或不同抗原表位)抗體。根據多肽複合物結合的不同目標抗原或不同抗原表位的數目，分為單特異性多肽複合物、多特異性多肽複合物、三特異性多肽複合物、四特異性多肽複合物......，多特異性(結合兩個或兩個以上不同目標抗原或不同抗原表位)多肽複合物。例如，“雙特異性抗體”指能夠對兩個不同抗原或同一抗原的兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。現有技術已公開了各種結構的雙特異性抗體；根據IgG分子的完整性分可為類IgG雙特異性抗體和抗體片段型雙特異性抗體；根據抗原結合區域的數量構型可分為二價、三價、四價或更多價的雙特異性抗體；根據結構左右是否對稱性可分 為對稱結構雙特異性抗體和不對稱結構雙特異性抗體。其中，基於抗體片段的雙特異性抗體，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其藉由將2個或多個Fab片段結合在一個分子中形成雙特異性抗體，其具有較低的免疫原性，且分子量小，具有較高的腫瘤組織滲透性，該類型的典型的抗體結構如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab等雙特異性抗體；類IgG雙特異性抗體(例如具有Fc片段)，這類抗體相對分子量較大，Fc片段有助於抗體後期的純化，並提高其溶解性、穩定性，Fc部分還可能會與受體FcRn結合，增加抗體血清半衰期，典型的雙特異性抗體結構模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、Fc△Adp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等等雙特異性抗體(參見Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019：4516041)。
術語“一價”、“二價”、“三價”或“多價”是指抗體或多肽複合物中存在指定數量的抗原結合位點。例如“一價抗體”表示抗體中存在一個抗原結合位點，“一價多肽複合物”表示多肽複合物中存在一個抗原結合位點；“二價抗體”表示抗體中存在兩個抗原結合位點，“二價多肽複合物”表示多肽複合物中存在兩個抗原結合位點；“三價抗體”表示抗體中存在三個抗原結合位點，“三價多肽複合物”表示多肽複合物中存在三個抗原結合位點；“多價抗體”表示抗體中存在多個(例如，存在三個或三個以上抗原結合位點)抗原結合位點，“多價多肽複合物”表示多肽複合物中存在多個(例如，存在兩個或兩個以上抗原結合位點)抗原結合位點。
術語“多肽”、“肽”或“蛋白”在本披露中可互換使用，其指胺基酸殘基的聚合物，或多個胺基酸殘基聚合物的集合體。這些術語應用於其中的一個或多個胺基酸殘基為對應的天然存在的胺基酸的人造化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。多肽序列通常記述為多肽序列的左手端為胺基末端(N末端、N端)；多肽序列的右手端為羧基末端(C末端、C端)。本披露的“多肽複合物”是指包含一個或多個與實現某些功能相關的多肽的複合物。在一些實施方式中，該多肽複合物為能與抗原特異性結合的抗體或其抗原結合片段。
術語針對抗原的“結合區”或“結合位點”、“結合結構域”是指在特異性蛋白分子(例如抗體分子)中，能夠與抗原特異性結合的區域或部分，抗原結合區可以是能直接與抗原結合的配體結合結構域部分，也可以是能直接與抗原結合的包含抗體可變區的結構域。
術語“可操作地連接”或“可操作的連接”或“可操作連接”是指兩個或更多個生物學序列以使其處於以目的方式作用的方式連接，無論是否存在間隔區(也稱接頭、連接子、連接序列)。當用於多肽時，該術語表示多肽序列以使所連接的產物具有目的生物學功能的方式連接，兩條序列間可以存在或不存在間隔區。例如，可將抗體可變區可操作地連接至恆定區，以形成具有抗原結合活性的穩定產物。該術語還可用於多核苷酸。例如，當編碼多肽的多核苷酸可操作地連接至調控序列(例如啟動子、增強子、沉默子序列等)時，該術語表示該多核苷酸序列以允許該多肽由該多核苷酸調控表達的方式連接。
術語“二聚化結構域”是指能夠促進彼此締合以形成二聚體的多肽結構域。在一些實施方案中，第一二聚化結構域可以與第二二聚化結構域締合。該締合可以藉由任何合適的方式進行結合或連接或鍵合；例如，藉由連接子，二硫鍵，氫鍵，靜電相互作用，鹽橋，或疏水-親水相互作用，或者其組 合。示例性二聚化結構域包括但不限於抗體鉸鏈區、抗體CH2結構域、抗體CH3結構域、和能夠彼此二聚化和相互作用的其他合適的蛋白質單體或多肽。鉸鏈區、CH2、CH3可以衍生自任何抗體同種型，例如IgG1，IgG2、IgG3和IgG4。
術語“相互作用結構域”是指能夠促進兩個或更多個同源或異源多肽的相互作用或締合的多肽的結構域。例如相互作用結構域為促進彼此締合以形成二聚體的二聚化結構域。蛋白間相互作用的結構域是兩個或更多個蛋白之間相互作用或締合的多肽的結構域，例如，Obscurin-like蛋白中的Obscurin-like Ig-like 1結構域，能夠與Titin蛋白的Titin Ig-like 152結構域藉由分子間相互作用形成複合物。在一些實施方案中，與Titin-T鏈相互作用的結構域是Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈。
術語“二聚體”是指兩個分子(例如多肽或蛋白質)藉由共價或非共價相互作用而形成的結構。同型二聚體或同型二聚化由兩個相同的分子形成，異二聚體或異二聚化由兩個不同的分子形成。兩個分子可藉由天然鏈間鍵形成二聚體，也可以藉由非天然鏈間鍵形成二聚體。本披露的一些實施方案中，Titin-T鏈與Obscurin-O鏈或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈可藉由天然鏈間鍵形成二聚體。本領域技術人員公知，兩個彼此締合形成二聚體的結構域，其中第一結構域與第二結構域之間間距在6埃以內的接觸界面殘基(尤其是4.5埃以內的殘基)對維持兩個結構域的締合起到關鍵作用(Yan,Changhui et al.“Characterization of protein-protein interfaces.”The protein journal vol.27,1(2008)：59-70)。藉由MOE(Molecular Operating Environment)系統分析Titin-T鏈與Obscurin-O鏈或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈締合形成的複合物(見圖1A和圖1B)，發現Titin-T鏈上的第7-15、19-24、26、55、59和60位中的一個或多個殘基與Obscurin-O鏈上的第3-6、9、41、73、75和80-90位中的一個或多個殘 基彼此相互作用，Titin-T鏈上的第1、7-10、13-16、19-26、59-60和96位中的一個或多個殘基與類Obscurin-O鏈上的第4-5、10、12-13、74、76、78和82-91位中的一個或多個殘基彼此相互作用(參見圖16A和圖16B)，上述位點的接觸界面殘基間距在4.5埃以內，其對維持兩個結構域的締合起到重要作用。另外，在另外一些實施方案中，Titin-T鏈與Obscurin-O鏈或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈可藉由非天然鏈間鍵形成二聚體，其中該二聚體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個非天然鏈間鍵。可以藉由對Titin-T鏈、Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈上的一些胺基酸進行突變，從而使Titin-T鏈與Obscurin-O鏈或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈之間形成二硫鍵，從而穩定化二聚體。在一些實施方案中，該Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變；或者Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變。在一些實施方案中，該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變；或者該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變。在一些實施方案中，該Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有A88C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，Obscurin-O鏈具有A3C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，Obscurin-O鏈具有R9C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A88C突變； Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A3C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和R9C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和V74C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和G84C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E和A86C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和V74C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和G84C突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和A86C突變。在一些實施方案中，該Obscurin-O鏈還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變；較佳地，該Obscurin-O鏈具有選自L7K或L7R、K11L、T62K或T62H的一個或多個胺基酸殘基突變；最佳地，該Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62K突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62H突變；Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62K突變；或者Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62H。上述Titin-T鏈突變位點為相對於T.0鏈(序列SEQ ID NO：32)的自然順序位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於O.0鏈(序列SEQ ID NO：33)的自然順序位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於OL.0鏈(序列SEQ ID NO：34)的自然順序位點。
本披露中，”錯配”是指兩個或更多個同源或異源多肽相互作用或締合形成不期望的二聚體或多聚體配對。“不容易發生錯配”意指，例如，當多肽A1、B1和B2共表達時，如果期望的A1-B1二聚體的表達量大於A1-B 2二 聚體的量，則認為在A1-B 1之間發生優先配對，即A1-B 2之間不容易發生錯配。本披露中，在一些實施例中，多特異性多肽複合物中，第一多肽複合物的VH1與第二多肽複合物的VL2之間不容易發生錯配，和/或第一多肽複合物的VL1與第二多肽複合物的VH2之間不容易發生錯配，而是VH1-VL1之間優先配對，VH2-VL2之間優先配對。
“二硫鍵”是指結構R-S-S-R'中硫原子間形成的共價鍵。胺基酸半胱胺酸包含硫醇基團，其可以與第二個硫醇基團形成二硫鍵，例如與另一個半胱胺酸殘基的硫醇基團形成二硫鍵。二硫鍵可以在分別位於兩條多肽鏈上的兩個半胱胺酸殘基的硫醇基團之間形成，從而形成鏈間橋或鏈間鍵。
靜電相互作用是非共價相互作用，並且在蛋白質折疊，穩定性，柔韌性和功能中起到重要作用，包括離子相互作用，氫鍵和鹵素鍵合。靜電相互作用可以在多肽中形成，例如，在Lys和Asp之間，在Lys和Glu之間，在Glu和Arg之間，或在第一鏈上的Glu，Trp和在第二鏈上的Arg，Val或Thr之間。
鹽橋是近距離靜電相互作用，其主要來自Asp或Glu的陰離子羧酸根和來自Lys的陽離子銨或Arg的胍基，其是天然蛋白質結構中的空間上靠近的帶相反電荷殘基對。疏水的界面中的帶電和極性殘基可以作為用於結合的熱點。其中，具有可電離側鏈的殘基如His，Tyr和Ser也可參與鹽橋的形成。
親水相互作用，帶有極性基團的分子，對水有大的親和能力，分子能透過氫鍵和水形成短暫鍵結。疏水相互作用是非極性分子之間的一種非共價的相互作用。這些非極性分子(如一些中性胺基酸殘基，也稱疏水殘基)在水相環境中具有避開水而相互聚集的傾向。例如可以在第一鏈上的一個或多個Val，Tyr和Ala與第二鏈上的一個或多個Val，Leu和Trp之間形成疏水相互作 用，或者在第一鏈上形成His和Ala，在第二鏈上形成Thr和Phe。(參見Brinkmann等，2017)。
術語“氫鍵”，當氫原子與高電負性原子如氮，氧或氟共價結合時，藉由兩個極性基團之間的靜電引力形成氫鍵。在多肽的兩個殘基的骨架氧(例如硫族元素基團)和醯胺氫(氮基團)之間可以形成氫鍵，例如Asn中的氮基團和His中的氧基團，或者Asn中的氧基團和Lys中的氮基團之間形成氫鍵。氫鍵比范德華相互作用強，但弱於共價鍵或離子鍵，並且對於維持二級結構和三級結構是關鍵的。例如，當胺基酸殘基的間隔在位置i和i+4之間有規律地發生時形成α螺旋，當兩條肽藉由至少兩個或三個骨架氫鍵連接時形成的3-10個胺基酸長的肽段形成扭曲的褶皺的片層為β折疊。
如本文所用，“旋鈕進入孔”、“knob-into-hole”是指兩條多肽之間的相互作用，其中一條多肽由於存在具有龐大側鏈的胺基酸殘基(例如酪胺酸或色胺酸)而具有突起(即“旋鈕”、knob)。另一條多肽具有空腔(即“孔”、hole)，其中存在小的側鏈胺基酸殘基(例如丙胺酸或蘇胺酸)，並且突起可定位在空腔中，以促進兩種多肽的相互作用以形成異二聚體或複合物。產生具有突起到孔的多肽的方法是本領域已知的，可參見專利US5731169、WO1996027011等。
“非天然的鏈間鍵”是指在野生型多肽聚合物中未發現的鏈間鍵。例如，非天然鏈間鍵可以在一條多肽的突變的胺基酸殘基和另一條多肽的野生型胺基酸殘基或突變胺基酸殘基之間形成。在某些實施方案中，至少一個非天然鏈間鍵為胺基酸突變後形成的“二硫鍵”。在本披露的一些實施方案中，Titin-T鏈與Obscurin-O鏈、或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈之間的非天然的鏈間鍵是藉由對Titin-T鏈上選自第8、20、22、25、26和39位，和/或Obscurin-O鏈上選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變而形成；或者 藉由對Titin-T鏈選自第8、20、22、25、26和39位，和/或類Obscurin-O鏈上選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變而形成。
術語“接觸界面”是指多肽上的特定區域，其中多肽彼此接觸或相互作用。接觸界面包含一個或多個胺基酸殘基，相互作用發生時，某多肽上的接觸界面胺基酸殘基能夠和與其接觸的相應胺基酸殘基相互作用。接觸界面中的胺基酸殘基可以是連續或不連續序列。例如，當界面是三維時，界面內的胺基酸殘基可以在線性序列上的不同位置分開。
“連接結構域”或“連接域”或“間隔區”是指兩條多肽序列融合或組合的邊界或邊界區域。例如，連接結構域可包含來自第一融合多肽的至少一部分C末端片段，其與來自第二融合多肽的N末端片段的至少一部分融合，其間具有或不具有其它間隔區。例如，間隔區可富含甘胺酸和脯胺酸殘基。例如具有由蘇胺酸/絲胺酸和甘胺酸組成的單個或重複序列的間隔區，GGGGS、TGGGG、SGGGG、或其串聯重複序列(例如2，3，4，5或更多個重複)。在某些實施方案中，間隔區包含GGGGS或其2個或更多個串聯重複序列。
天然完整抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈由可變區(“HCVR”、VH)和第一，第二和第三恆定區(CH1，CH2和CH3)組成，抗體第二(CH2)和第三(CH3)恆定區組成“Fc”，CH2的N端可含或不含抗體鉸鏈區部分，鉸鏈區部分富含脯胺酸，包括鏈間二硫鍵；而每條輕鏈由可變區(“LCVR”、VL)和恆定區組成(CL)。靠近重鏈和輕鏈N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指 LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本披露的抗體，例如，可以是源自動物的抗體(如鼠、禽、兔、駱駝、猴等來源抗體)、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。本披露抗體除包括全長抗體外，還包括能結合抗原的抗原結合片段。
術語“鼠源抗體”在本披露中為根據本領域知識和技能製備的針對抗原的單株抗體。製備時用抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本披露一個較佳的實施方案中，該鼠源抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將其它第一物種抗體的可變區與第二物種抗體的恆定區融合而成的抗體。例如，建立人鼠嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後***表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本披露一個較佳的實施方案中，該嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該抗原嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(例如L234A和/或L235A突變，和/或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基 因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫獲得，以及在Kabat，E.A.等人發表，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本披露的人源化抗體也包括進一步由酵母菌展示對CDR進行親和力成熟突變後的人源化抗體。
在本披露一個的實施方案中，該抗體或其抗原結合片段，可進一步包含人源或鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區；較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(例如L234A和/或L235A突變、和/或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
本本披露公開中所述人抗體重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區包括其的“常規變體”是指，其為現有技術已公開的來源於人的不改變抗體可變區結構和功能的重鏈恆定區或輕鏈恆定區的變體，示例性變體包括對重鏈恆定區進行定點改造和胺基酸替換的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區變體，具體替換如現有技術已知的YTE突變，L234A和/或L235A突變，S228P突變，和/或獲得knob-into-hole結構的突變(使得抗體重鏈具有knob-Fc和hole-Fc組合)，這些突變已被證實使得抗體具有新的性能，但不改變抗體可變區的功能。
“人抗體”((HuMAb))、“人源抗體”、“全人抗體”、“完全人抗體”可以互換使用，可以是源於人的抗體或者是從一種轉基因生物體中獲得的抗體，該轉基因生物體經“改造”以響應於抗原刺激而產生特異性人抗體並且可以藉由本領域已知的任何方法產生。轉基因生物可以合成人抗體，並且該生物可以用於產生人抗體-分泌融合瘤。人抗體還可以是一種抗體，其中重鏈和輕鏈是由源於一個或更多個人DNA來源的核苷酸序列編碼的。完全人抗體還可以藉 由基因或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術來構建，或者由體外活化的B細胞構建，所有的這些都是本領域已知的。
術語“全長抗體”、“完整抗體”、“完全抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體，與下文定義的抗原結合片段相區分。該術語特別指輕鏈和重鏈包含恆定區的抗體。本披露“抗體”包含“全長抗體”及其抗原結合片段。
在一些實施方案中，本披露的全長抗體包括輕鏈可變區與輕鏈恆定區連接的輕鏈和重鏈可變區與重鏈恆定區連接的重鏈所形成的全長抗體。本領域技術人員可以根據實際需要選擇不同的抗體來源的輕鏈恆定區、重鏈恆定區，例如人抗體來源的輕鏈恆定區和重鏈恆定區。
術語抗體的“抗原結合片段”是指抗體中保持抗原(例如，抗原)結合能力的一個或更多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)dsFv，由VH和VL經鏈間二硫鍵形成的穩定的抗原結合片段；(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的雙抗體、雙特異性抗體和多特異性抗體。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體 的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。
F(ab')2是藉由用酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100，000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50，000並具有抗原結合活性的抗體片段。本披露的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本披露的特異性識別抗原的F(ab')2來生產。
此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本披露的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
雙抗體是其中scFv或Fab被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。
本披露的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得本披露的抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA***到表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。
dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering，7，697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
本披露的全長抗體或抗原結合片段或雙特異性抗體或多特異性抗體、多肽、多肽複合物、多特異性多肽複合物，可以藉由以下步驟來生產：獲得本披露的抗體的編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA***到表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。
術語“胺基酸差異”或“胺基酸突變”是指相較于原蛋白質或多肽，變體蛋白質或多肽存在胺基酸的改變或突變，包括在原蛋白質或多肽的基礎上發生1個、2個、3個或更多個胺基酸的***、缺失或替換。
術語“抗體框架”或“FR區”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。術語“互補決定區”、“CDR”或”高變區”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)， “Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則(參見Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，抗原分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”或“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10-7M，例如大約小於10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更小的親和力(KD)結合。
術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本披露的抗體以小於大約10-7M，例如小於大約10-8M或10-9M的解離平衡常數(KD)結合抗原，例如，在本披露中抗體與抗原的親和力採用FACS法測定KD值。
當術語“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其藉由以下測定法來測定：在該測定法中，待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫學功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相 直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常該測定法涉及使用結合荷有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白任一種的固態表面或細胞的純化的抗原。藉由測量在所測抗原結合蛋白存在下結合固態表面或細胞的標記的量來測量競爭性抑制。通常所測抗原結合蛋白過量存在。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括：結合與參考抗原結合蛋白同一表位的抗原結合蛋白；和結合充分接近參考抗原結合蛋白的結合表位的鄰近表位的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙發生結合。在本文實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，較佳是雙鏈DNA或單鏈mRNA或修飾的mRNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
術語“表達載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用抗原免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或更多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌(enterobacteria)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌(Bacillus)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、293細胞和NS0細胞。
本披露工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本披露的任一種結合化合物的組合物，該受試者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及 藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本披露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。示例性保守取代於下表“示例性胺基酸保守取代”中陳述。示例性胺基酸保守取代：
原始殘基 保守取代
Ala(A)Gly；Ser
Arg(R)Lys；His
Asn(N)Gln；His；Asp
Asp(D)Glu；Asn
Cys(C)Ser；Ala；Val
Gln(Q)Asn；Glu
Glu(E)Asp；Gln
Gly(G)Ala
His(H)Asn；Gln；Lys；Arg
Ile(I)Leu；Val
Leu(L)Ile；Val
Lys(K)Arg；His
Met(M)Leu；Ile；Tyr
Phe(F)Tyr；Met；Leu
Pro(P)Ala
Ser(S)Thr
Thr(T)Ser
Trp(W)Tyr；Phe
Tyr(Y)Trp；Phe
Val(V)Ile；Leu。
“有效量”或“有效劑量”是指獲得任一種或多種有益的或所需的治療結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。對於預防用途，有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作，包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用，有益的或所需的結果包括臨床結果，諸如減少各種本披露靶抗原相關病症的發病率或改善該病症的一個或更多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩受試者的本披露靶抗原相關病症的進展。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據情況在生物、細胞或人體內產生的物質。
“同源性”、“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據 時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。通常，當比對兩個序列時進行比較以給出最大百分比同源性。例如，可以藉由BLAST算法執行比較，其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。以下參考文獻涉及經常用於序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的常規BLAST算法也為本領域技術人員所熟知。本披露中，例如“相對於XX序列的自然順序編號位點”，既包括XX序列上的自然順序編號相應的位點，也包括XX序列的突變序列中與XX序列等同位置的位點，等同位置可藉由將XX序列的突變序列與XX序列進行比對以獲得最高百分比同一性，此時XX序列的突變序列上與XX序列相對應的位點即為等同位點。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利US4683195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引物；這些引物在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引物的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。
術語“綴合物”、“藥物偶聯物”指配體藉由穩定的連接單元與具有生物活性的藥物相連而成的新型藥物。例如，“抗體藥物偶聯物”(antibody drug conjugate，ADC)，其是將抗體或者抗體片段藉由連接單元與具有生物活性的藥物相連。抗體可直接地或經接頭地偶聯至藥物。每個抗體的平均藥物模塊數，其範圍可以是例如每個抗體約0到約20個藥物模塊，在一些實施方案中是每個抗體1個到約10個藥物模塊，在某些實施方案中是每個抗體1個到約8個藥物模塊。本披露的綴合物，其中每個抗體的平均藥物載荷是約2個至約5個或約3個至約4個。
“分離的”指純化狀態，並且在這種情況下意味著在指定的分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物或其他材料，例如細胞碎片和生長培養基。通常，術語“分離的”並不意圖指完全不存在這些材料或不存在水、緩衝液或鹽，除非它們以顯著干擾如本文所述的化合物的實驗或治療用途的量存在。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“藥學上可接受的載體”指適合用於製劑中用於遞送抗體或抗原結合片段的任何無活性物質。載體可以是抗黏附劑、黏合劑、包衣、崩解劑、充填劑或稀釋劑、防腐劑(如抗氧化劑、抗菌劑或抗真菌劑)、增甜劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等。合適的藥學上可接受的載體的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄欖油)、鹽水、緩衝液、緩衝的鹽水和等滲劑例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化鈉。
此外，本披露包括用於治療疾病或病症的藥物製劑，例如治療與目標抗原陽性細胞相關的疾病的藥劑，該製劑包含本披露的多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片段、雙特異性抗體、醫藥組成物、或核酸分子、或多特異性抗體，作為活性成分。
本披露中的疾病沒有限制，例如利用本披露的分子誘導的治療反應可藉由結合人類抗原，然後阻遏抗原與其受體/配體的結合，或殺傷過表達抗原的腫瘤細胞。
此外，本披露涉及用於免疫檢測或測定目標抗原的方法、用於免疫檢測或測定目標抗原的試劑、用於免疫檢測或測定表達目標抗原的細胞的方法和用於診斷與目標抗原陽性細胞相關的疾病的診斷劑，其包含本披露的多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片 段、雙特異性抗體、醫藥組成物、或核酸分子、或多特異性抗體作為活性成分。
在本披露中，用於檢測或測定目標抗原的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、熒光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
上述與抗原陽性細胞相關的疾病可以藉由用本披露的抗體檢測或測定表達抗原的細胞來診斷。
為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、熒光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的熒光抗體染色法等。
在本披露中，對用於檢測或測定目標抗原的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達目標抗原的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法，含有本披露的抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的受質等。
在以上說明書中提出了本披露一種或多種實施方式的細節。雖然可使用與本文該類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本披露，但是以下描述較佳的方法和材料。藉由說明書和申請專利範圍，本披露的其他特點、 目的和優點將是顯而易見的。在說明書和申請專利範圍中，除非上下文中有清楚的另外指明，單數形式包括複數指代物的情況。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都具有本披露所屬領域普通技術人員所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都藉由引用納入。提出以下實施例是為了更全面地說明本披露的較佳實施方式。這些實施例不應以任何方式理解為限制本披露的範圍。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
儘管實施例中所用抗體靶向特定的抗原，但是技術人員在本披露的教導下，能夠理解技術效果的實現不依賴於特定的CDR序列，也不依賴於特定的抗原序列，而是受益於Titin T鏈/Obscurin-O鏈、或Titin T鏈/類Obscurin-O鏈對CH1/CL的替代，以改善重鏈/輕鏈之間的錯配。
實施例1. 抗體或多肽蛋白的製備方法
設計引物PCR搭建基因片段(例如，抗體VH/VK基因片段)，再與表達載體(例如pHr(帶信號肽及恆定區基因(例如CH1-Fc/CL)片段))進行同源重組，構建表達載體(例如VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr)，然後將構建的表達載體導入到原核生物或真核生物中表達，最後對產物進行純化，從而獲得所需的抗體或多肽蛋白。非限制性地，抗體恆定區可選自人κ、λ鏈輕鏈恆定區，以及選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區。非限制性實施例，還包括對人抗體恆定區進行優化設計，例如對重鏈恆定區恆定區的L234A/L235A或L234F/L235E等位點突變等。示例性的，抗體輕/重鏈恆定區序列如下：
>IgG1重鏈恆定區(簡稱hIgG1)
Figure 110100845-A0101-12-0101-1
Figure 110100845-A0101-12-0101-2
(SEQ ID NO：1)；
備註：序列中，單下劃線部分為CH1，點劃線部分為CH2，斜體字部分為CH3。
>knob-IgG1重鏈恆定區(簡稱knob-IgG1)：
Figure 110100845-A0101-12-0101-4
Figure 110100845-A0101-12-0101-5
(SEQ ID NO：2)；
備註：序列中，單下劃線部分為CH1，點劃線部分為CH2，斜體字部分為CH3。
>hole-IgG1重鏈恆定區(簡稱hole-IgG1)：
Figure 110100845-A0101-12-0101-3
Figure 110100845-A0101-12-0102-6
Figure 110100845-A0101-12-0102-7
(SEQ ID NO：3)；
備註：序列中，單下劃線部分為CH1，點劃線部分為CH2，斜體字部分為CH3。
>kappa輕鏈恆定區(簡稱kappa或hκ)
Figure 110100845-A0101-12-0102-8
Figure 110100845-A0101-12-0102-9
(SEQ ID NO：4)。
>lambda輕鏈恆定區(簡稱lambda或hλ)
Figure 110100845-A0101-12-0102-10
Figure 110100845-A0101-12-0102-11
(SEQ ID NO：5)。
本披露實施例或測試例中提及的針對B7H3、CD3等多種抗原的抗體的輕鏈和重鏈可變區的胺基酸序列如下：
>F0抗體VH胺基酸序列：
Figure 110100845-A0101-12-0102-12
Figure 110100845-A0101-12-0102-13
(SEQ ID NO：6)；
>F0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0102-14
Figure 110100845-A0101-12-0102-15
(SEQ ID NO：7)；
>N0抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0103-283
Figure 110100845-A0101-12-0103-284
(SEQ ID NO：8)；
>N0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0103-285
Figure 110100845-A0101-12-0103-286
(SEQ ID NO：9)；
>S0抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0103-287
Figure 110100845-A0101-12-0103-288
(SEQ ID NO：10)；
>S0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0103-289
Figure 110100845-A0101-12-0103-290
(SEQ ID NO：11)；
>V0抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0103-291
Figure 110100845-A0101-12-0103-292
(SEQ ID NO：12)；
>V0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0103-281
Figure 110100845-A0101-12-0103-282
(SEQ ID NO：13)；
>J0抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0104-293
Figure 110100845-A0101-12-0104-295
(SEQ ID NO：14)；
>J0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0104-294
Figure 110100845-A0101-12-0104-296
(SEQ ID NO：15)；
>H0抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0104-297
Figure 110100845-A0101-12-0104-298
(SEQ ID NO：16)；
>H0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0104-301
Figure 110100845-A0101-12-0104-304
(SEQ ID NO：17)；
>R0抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0104-299
Figure 110100845-A0101-12-0104-300
(SEQ ID NO：18)；
>R0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0104-302
Figure 110100845-A0101-12-0104-303
(SEQ ID NO：19)；
>Bmab(簡稱B0)抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0105-305
Figure 110100845-A0101-12-0105-316
(SEQ ID NO：20)；
>Bmab(簡稱B0)抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0105-306
Figure 110100845-A0101-12-0105-314
(SEQ ID NO：21)；
>Umab(簡稱U0)抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0105-307
Figure 110100845-A0101-12-0105-315
(SEQ ID NO：22)；
>Umab(簡稱U0)抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0105-312
Figure 110100845-A0101-12-0105-313
(SEQ ID NO：23)；
>Dmab(簡稱D0)抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0105-308
Figure 110100845-A0101-12-0105-311
(SEQ ID NO：24)；
>Dmab(簡稱D0)抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0105-309
Figure 110100845-A0101-12-0105-310
(SEQ ID NO：25)；
>Tmab(簡稱I0)抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0106-317
Figure 110100845-A0101-12-0106-318
(SEQ ID NO：26)；
>Tmab(簡稱I0)抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0106-319
Figure 110100845-A0101-12-0106-328
(SEQ ID NO：27)；
>C0抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0106-321
Figure 110100845-A0101-12-0106-327
(SEQ ID NO：28)；
>C0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0106-320
Figure 110100845-A0101-12-0106-325
(SEQ ID NO：29)；
>A0抗體VH胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0106-322
Figure 110100845-A0101-12-0106-326
(SEQ ID NO：105)；
>A0抗體VL胺基酸序列
Figure 110100845-A0101-12-0106-323
Figure 110100845-A0101-12-0106-324
(SEQ ID NO：106)；
上述抗體F0、N0、S0、V0、J0、H0、R0、B0、U0、D0、I0、C0、A0抗體的重鏈恆定區序列為IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：1)，N0、S0、H0、R0、U0、I0、C0抗體輕鏈恆定區序列為kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO：4)；F0、V0、J0、B0、D0、A0抗體輕鏈恆定區序列為lambda輕鏈恆定區(SEQ ID NO：5)。
另外，hB7H3抗原蛋白的序列如下：
Figure 110100845-A0101-12-0107-329
Figure 110100845-A0101-12-0107-330
(SEQ ID NO：111)；
hCD3抗原蛋白為hCD3抗原的δ亞基和ε亞基組成的異源二聚體，其中，hCD3抗原的δ亞基序列：
Figure 110100845-A0101-12-0107-331
Figure 110100845-A0101-12-0107-333
(SEQ ID NO：112)；
hCD3抗原的ε亞基序列：
Figure 110100845-A0101-12-0107-332
Figure 110100845-A0101-12-0108-334
(SEQ ID NO：113)。
實施例2、抗體CH1/CL結構域的替換
分別使用天然Titin/Obscurin複合物、Titin/類Obscurin O複合物和IL6Ra/IL6Rb複合物中具備天然的分子間相互作用的類Ig結構域，來替換抗體的CH1/CL結構域，獲得CH1/CL結構域改造的抗體。
其中，IL6Ra/IL6Rb複合物中，用於替換抗體CH1或CL的IL6Ra蛋白中的類Ig結構域為IL6Ra.0鏈，用於替換抗體CL或CH1的IL6Rb蛋白中的類Ig結構域為IL6Rb.0鏈；Titin/Obscurin複合物中，用於替換抗體CH1或CL的Titin蛋白中的類Ig結構域(類Titin Ig152結構域)為T.0鏈，用於替換抗體CL或CH1的Obscurin蛋白中的類Ig結構域(類Obscurin Ig-1結構域)為O.0鏈；Titin/類Obscurin O複合物中，用於替換抗體CH1或CL的類Obscurin蛋白中的類Ig結構域(類Obscurin-類Ig-1結構域)為OL.0鏈，用於替換抗體CL或CH1的Titin蛋白中的類Ig結構域(類Titin Ig 152結構域)為T.0鏈。其中：
>IL6Ra.0鏈序列為：
Figure 110100845-A0101-12-0108-335
Figure 110100845-A0101-12-0108-338
(SEQ ID NO：30)；
>IL6Rb.0鏈序列為：
Figure 110100845-A0101-12-0108-336
Figure 110100845-A0101-12-0108-337
(SEQ ID NO：31)；
>T.0鏈序列為：
Figure 110100845-A0101-12-0109-341
Figure 110100845-A0101-12-0109-342
(SEQ ID NO：32)；
>O.0鏈序列為：
Figure 110100845-A0101-12-0109-339
Figure 110100845-A0101-12-0109-340
(SE Q ID NO：33)；
>OL.0鏈序列為：
Figure 110100845-A0101-12-0109-343
Figure 110100845-A0101-12-0109-344
(SE Q ID NO：34)；
構建多種CH1/CL被替換的抗體，按照測試例2和4的方法，檢測待測的抗體的純度和與相應抗原的結合活性。實驗結果見下表1，實驗結果表明，F0、V0、S0、N0、J0、H0、R0、和C0等結合不同抗原的抗體，其CH1/CL同時被T.0鏈/O.0鏈或T.0鏈/OL.0鏈替換後，抗體仍保持良好的結合活性，且抗體純度高。
表1. CH1/CL結構域替換後的抗體的純度和親和力
Figure 110100845-A0101-12-0110-345
Figure 110100845-A0101-12-0111-346
備註：例如，F1表示F0抗體的重鏈CH1被IL6Rb.0鏈(SEQ ID NO：31)替換，輕鏈CL被IL6Ra.0鏈(SEQ ID NO：30)替換，其它部分保持與F0相同，而獲得的抗體。其它依此類推。表中“-”表示未檢測，SEC為尺寸排阻色譜法檢測抗體的純度結果(NA表示因表達過低而未檢測)。
實施例3、CH1/CL結構域改造抗體的優化設計
對類Titin Ig 152結構域(T.0鏈)、類Obscurin Ig 1結構域(O.0鏈)、類類Obscurin Ig 1結構域(OL.0鏈)的個別胺基酸進行突變，包括胺基酸的***、缺失或替換，驗證結構域改造抗體的活性。
示例性地，首先，藉由對T.0鏈、O.0鏈以及OL.0鏈上的少量胺基酸進行突變，增加鏈間二硫鍵；其次，還對結構域中的其它個別胺基酸進行突變，例如對類Obscurin Ig 1結構域的第7、62、11位進行胺基酸突變；在類Titin Ig 152結構域N端增、減胺基酸(例如增加5個野生型Titin蛋白中緊鄰類Titin Ig 152結構域N端的5個胺基酸“KAGIR”)；在類Obscurin Ig 1結構域N端增、減少胺基酸(例如增加5個野生型Obscurin蛋白中緊鄰類Obscurin Ig 1 結構域N端的5個胺基酸“DQPQF”)；此外，還在類Titin Ig 152結構域、類Obscurin Ig 1結構域或類類Obscurin Ig 1結構域的N端或C端添加連接序列(例如在N端增加“G4S”、“(G4S)2”連接序列)，抗體VH或VL的C端藉由連接序列與類Titin Ig 152結構域、類Obscurin Ig 1結構域或類類Obscurin Ig 1結構域連接。具體結構域優化設計見表2。
表2. T.0鏈、O.0鏈、OL.0鏈的胺基酸突變
Figure 110100845-A0101-12-0112-347
Figure 110100845-A0101-12-0113-348
Figure 110100845-A0101-12-0114-349
備註：表中Obscurin-O鏈中的O.1突變方式“A88C”，表示將O.0(SEQ ID NO：33)序列的第88位胺基酸殘基由A突變為C；O.11突變方式“C25S，C76S，A88C+Obscurin_DQPQF”，表示對O.0(SEQ ID NO：33)序列進行C25S、C76S、A88C胺基酸突變，並在N末端增加“DQPQF”5個胺基酸。其它依此類推。
部分胺基酸突變後的Titin-T鏈、Obscurin-O鏈、類Obscurin-O鏈序列如下：
>T.1(T.0具有C25S，C39T，A8C的突變)
Figure 110100845-A0101-12-0114-350
Figure 110100845-A0101-12-0114-351
(SEQ ID NO：35)；
>T.2(T.0具有C25S，C39T，V20C的突變)
Figure 110100845-A0101-12-0114-352
Figure 110100845-A0101-12-0114-353
(SEQ ID NO：36)；
>T.3(T.0具有C25S，C39T，A26C的突變)
Figure 110100845-A0101-12-0114-354
Figure 110100845-A0101-12-0114-355
(SEQ ID NO：37)；
>T.4(T.0具有C25S，C39T，T22C的突變)
Figure 110100845-A0101-12-0115-360
Figure 110100845-A0101-12-0115-361
(SEQ ID NO：38)；
>T.5(T.0具有C25S，C39T，A8C的突變；N端添加KAGIR)
Figure 110100845-A0101-12-0115-362
Figure 110100845-A0101-12-0115-363
(SE Q ID NO：39)；
>T.6(T.0具有C25S，C39T，A8C的突變；N端添加(G4S)1連接子)
Figure 110100845-A0101-12-0115-364
Figure 110100845-A0101-12-0115-365
(SE Q ID NO：40)；
>T.7(T.0具有C25S，C39T，A8C的突變；N端添加(G4S)2連接子)
Figure 110100845-A0101-12-0115-366
Figure 110100845-A0101-12-0115-367
(SEQ ID NO：41)；
>O.1(O.0具有A88C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0115-356
Figure 110100845-A0101-12-0115-357
(SE Q ID NO：42)；
>O.2(O.0具有A3C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0115-358
Figure 110100845-A0101-12-0115-359
(SE Q ID NO：43)；
>O.3(O.0具有R9C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0116-368
Figure 110100845-A0101-12-0116-369
(SE Q ID NO：44)；
>O.4(O.0具有C25S，C76S，A88C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0116-370
Figure 110100845-A0101-12-0116-371
(SE Q ID NO：45)；
>O.5(O.0具有C25S，C76S，A3C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0116-372
Figure 110100845-A0101-12-0116-373
(SE Q ID NO：46)；
>O.6(O.0具有C25S，C76S，R9C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0116-374
Figure 110100845-A0101-12-0116-375
(SE Q ID NO：47)；
>O.7(O.0具有C25S，C76S，A88C，L7K，T62K突變)
Figure 110100845-A0101-12-0116-376
Figure 110100845-A0101-12-0116-377
(SE Q ID NO：48)；
>O.8(O.0具有C25S，C76S，A88C，L7K，T62H突變)
Figure 110100845-A0101-12-0117-384
Figure 110100845-A0101-12-0117-385
(SE Q ID NO：49)；
>O.9(O.0具有C25S，C76S，A88C，K11L，T62K突變)
Figure 110100845-A0101-12-0117-386
Figure 110100845-A0101-12-0117-387
(SE Q ID NO：50)；
>O.10(O.0具有C25S，C76S，A88C，K11L，T62H突變)
Figure 110100845-A0101-12-0117-382
Figure 110100845-A0101-12-0117-383
(SE Q ID NO：51)；
>O.11(O.0具有C25S，C76S，A88C突變；N端添加DQPQF)
Figure 110100845-A0101-12-0117-381
Figure 110100845-A0101-12-0117-380
(SEQ ID NO：52)；
>O.12(O.0具有C25S，C76S，A88C，L7K，T62K突變；N端添加DQPQF)
Figure 110100845-A0101-12-0117-378
Figure 110100845-A0101-12-0117-379
(SEQ ID NO：53)；
>O.13(O.0具有C25S，C76S，A88C，L7K，T62H突變；N端添加DQPQF)
Figure 110100845-A0101-12-0118-388
Figure 110100845-A0101-12-0118-397
(SEQ ID NO：54)；
>O.14(O.0具有C25S，C76S，A88C，L7R，T62K突變；N端添加DQPQF)
Figure 110100845-A0101-12-0118-389
Figure 110100845-A0101-12-0118-396
(SEQ ID NO：55)；
>O.15(O.0具有C25S，C76S，A88C，L7R，T62H突變；N端添加DQPQF)
Figure 110100845-A0101-12-0118-390
Figure 110100845-A0101-12-0118-395
(SEQ ID NO：56)；
>O.16(O.0具有C25S，C76S，A88C突變；N端添加(G4S)1連接子)
Figure 110100845-A0101-12-0118-391
Figure 110100845-A0101-12-0118-394
(SEQ ID NO：57)；
>O.17(O.0具有C25S，C76S，A88C突變；N端添加(G4S)2連接子)
Figure 110100845-A0101-12-0118-392
Figure 110100845-A0101-12-0118-393
(SEQ ID NO：58)；
>OL.1(OL.0具有C6E，V74C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0119-402
Figure 110100845-A0101-12-0119-403
(S EQ ID NO：59)；
>OL.2(OL.0具有C6E，G84C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0119-404
Figure 110100845-A0101-12-0119-407
(S EQ ID NO：60)；
>OL.3(OL.0具有C6E，A86C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0119-405
Figure 110100845-A0101-12-0119-406
(S EQ ID NO：61)；
>OL.4(OL.0具有C6E，C26S，C77S，V74C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0119-408
Figure 110100845-A0101-12-0119-409
(S EQ ID NO：62)；
>OL.5(OL.0具有C6E，C26S，C77S，G84C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0119-400
Figure 110100845-A0101-12-0119-401
(S EQ ID NO：63)；
>OL.6(OL.0具有C6E，C26S，C77S，A86C突變)
Figure 110100845-A0101-12-0119-398
Figure 110100845-A0101-12-0119-399
(S EQ ID NO：64)。
利用上述突變的或結構改造的Titin-T鏈、Obscurin-O鏈、類Obscurin-O鏈構建多種CH1/CL被替換的抗體，藉由本披露的測試例4的方法，檢測優化後各突變抗體與相應抗原結合的結合活性，實驗結果見表3。結果表明，二硫鍵改造後抗體保持良好抗原結合活性。
表3. CH1/CL結構域改造後的抗體親和力
Figure 110100845-A0101-12-0120-410
Figure 110100845-A0101-12-0121-411
備註：例如，表中抗體“F5”表示F0抗體的重鏈CH1被T.1鏈(SEQ ID NO：35)替換，且輕鏈CL被O.1鏈(SEQ ID NO：42)替換，其它部分保持與F0相同，而獲得的抗體，其它依此類推。
另外，利用上述突變或結構改造的Titin-T鏈、Obscurin-O鏈，構建CH1/CL被替換的抗體，藉由本披露的測試例2和測試例4的方法，檢測其它CH1/CL被替換的抗體功能活性。實驗結果見表4，實驗結果表明，CH1/CL被替換後，抗體仍具有良好的抗原結合活性，抗體純度SEC(%)較高。
表4. CH1/CL結構域改造後抗體的純度及結合活性的檢測結果
Figure 110100845-A0101-12-0122-412
Figure 110100845-A0101-12-0123-413
備註：例如，表中抗體“F16”表示F0抗體的重鏈CH1被T.5鏈(SEQ ID NO：39)替換，輕鏈CL被O.4鏈(SEQ ID NO：45)替換，其它部分保持與F0相同，而獲得的抗體，其它依此類推。
另外，還對類Titin Ig 152結構域、類Obscurin Ig 1結構域的其它胺基酸進行突變，具體胺基酸突變設計如表5。
表5. T.1鏈/O.9鏈的胺基酸突變設計
Figure 110100845-A0101-12-0124-414
Figure 110100845-A0101-12-0125-415
備註：表中，例如T.8表示對T.1(SEQ ID NO：35)序列進行M66S、T77S胺基酸突變後獲得的Titin-T鏈；O.24表示對O.9(SEQ ID NO：50)先進行A12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變，然後在N末端添加“DQPQF”序列，最後在N末端添加“GGGGS”連接序列後獲得的Obscurin-O鏈，其它依此類推。
T.1鏈和O.9鏈的突變體序列如下：
>T.8(T.1具有M66S，T77S突變)
Figure 110100845-A0101-12-0125-416
Figure 110100845-A0101-12-0125-417
(SEQ ID NO：65)；
>T.9(T.1具有M66K，K70R，S79T，G81R突變)
Figure 110100845-A0101-12-0125-418
Figure 110100845-A0101-12-0125-419
(SEQ ID NO：66)；
>T.10(T.1具有P3W，S11I，I13L，T22M，N82M突變)
Figure 110100845-A0101-12-0126-420
Figure 110100845-A0101-12-0126-421
(SEQ ID NO：67)；
>T.11(T.1具有S11I，M66K，S79T，G81R突變)
Figure 110100845-A0101-12-0126-422
Figure 110100845-A0101-12-0126-429
(SEQ ID NO：68)；
>T.12(T.1具有G40S，R42K，H45S，Q47E，Q49G，N56S，D58E，L75V，E83D，F84L突變)
Figure 110100845-A0101-12-0126-423
Figure 110100845-A0101-12-0126-424
(SEQ ID NO：69)；
>T.13(T.1具有Q47E，Q49G，N56S，D58E，L75V突變)
Figure 110100845-A0101-12-0126-425
Figure 110100845-A0101-12-0126-524
(SEQ ID NO：70)；
>T.14(T.1具有N56S，D58E，L75V突變)
Figure 110100845-A0101-12-0126-427
Figure 110100845-A0101-12-0126-428
(SEQ ID NO：71)；
>T.15(T.1具有N56S，D58E，M66S，T77S突變)
Figure 110100845-A0101-12-0127-430
Figure 110100845-A0101-12-0127-431
(SEQ ID NO：72)；
>T.16(T.1具有S11I，M66K，S79T，G81R突變+(G4S)1連接序列)
Figure 110100845-A0101-12-0127-432
Figure 110100845-A0101-12-0127-433
(SE Q ID NO：73)；
>T.17(T.1具有N56S，D58E，M66S，T77S突變，+KAGIR)
Figure 110100845-A0101-12-0127-434
Figure 110100845-A0101-12-0127-435
(SEQ ID NO：74)；
>T.18(T.1具有N56S，D58E，M66S，T77S突變，+KAGIR，+(G4S)1連接序列)
Figure 110100845-A0101-12-0127-436
Figure 110100845-A0101-12-0127-438
(SEQ ID NO：75)；
>T.19(T.1具有N56S，D58E，M66S，T77S突變，+(G4S)1連接序列)
Figure 110100845-A0101-12-0127-437
Figure 110100845-A0101-12-0127-439
(SEQ ID NO：76)；
>O.18(O.9具有L11K，A12S，F13Y，V14T，T22S突變)
Figure 110100845-A0101-12-0128-441
Figure 110100845-A0101-12-0128-442
(SE Q ID NO：77)；
>O.19(O.9具有G2E，V17E，N30D，T32P，Q34E，S36T，V44I，A45T，L58V，K62E，A67Q，G69S，A97G突變)
Figure 110100845-A0101-12-0128-440
Figure 110100845-A0101-12-0128-443
(SEQ ID NO：78)；
>O.20(O.9具有D20L，T22M，A53L突變)
Figure 110100845-A0101-12-0128-444
Figure 110100845-A0101-12-0128-445
(SE Q ID NO：79)；
>O.21(O.9具有Q41K，A45T，A67Q，G69S，V89L突變)
Figure 110100845-A0101-12-0128-448
Figure 110100845-A0101-12-0128-449
(SE Q ID NO：80)；
>O.22(O.9具有Q42L，A45T，A67T，G69S，Q92E，D94G突變)
Figure 110100845-A0101-12-0128-446
Figure 110100845-A0101-12-0128-447
(SEQ ID NO：81)；
>O.23(O.9具有A12S，F13Y，T22S，Q42L，A45T，A67Q，G69S，Q92E，D94G突變)
Figure 110100845-A0101-12-0129-457
Figure 110100845-A0101-12-0129-458
(SEQ ID NO：82)；
>O.24(O.9具有Q41K，A45T，A67Q，G69S，V89L突變；+(G4S)1連接序列)
Figure 110100845-A0101-12-0129-456
Figure 110100845-A0101-12-0129-459
(SEQ ID NO：83)；
>O.25(O.9具有A12S，F13Y，T22S，Q42L，A45T，A67Q，G69S，Q92E，D94G突變，+(G4S)1連接序列)
Figure 110100845-A0101-12-0129-454
Figure 110100845-A0101-12-0129-455
(SEQ ID NO：84)；
>O.26(O.9具有A12S，F13Y，T22S，Q42L，A45T，A67Q，G69S，Q92E，D94G突變；+DQPQF)
Figure 110100845-A0101-12-0129-452
Figure 110100845-A0101-12-0129-453
(SEQ ID NO：85)；
>O.27(O.9具有A12S，F13Y，T22S，Q42L，A45T，A67Q，G69S，Q92E，D94G突變；+DQPQF；和+(G4S)1連接序列)
Figure 110100845-A0101-12-0129-450
Figure 110100845-A0101-12-0129-451
(SEQ ID NO：86)。
利用上述突變或結構改造的Titin-T鏈、Obscurin-O鏈，構建CH1/CL被替換的抗體，並藉由本披露的測試例4的方法對CH1/CL被替換的抗體進行檢測，實驗結果見表6所示。結果顯示，CH1/CL被被優化後的Titin-T鏈、Obscurin-O鏈替換後，抗體仍保持良好抗原結合活性。
表6. CH1/CL被替換後抗體與相應抗原結合實驗結果
Figure 110100845-A0101-12-0130-460
Figure 110100845-A0101-12-0131-461
備註：表中例如抗體“B1”表示B0抗體的重鏈CH1被T.1鏈(SEQ ID NO：35)替換，輕鏈CL被O.9鏈(SEQ ID NO：50)替換，其它部分與B0相同，而獲得的抗體，其它依此類推。
另外，藉由本披露測試例1的方法對CH1/CL被替換後的抗體的蛋白表達量進行檢測，實驗結果見表7。結果顯示，類Titin Ig 152結構域和類Obscurin Ig 1結構域的一些胺基酸突變後，抗體的表達量獲得了很大的提高。
表7. CH1/CL結構域改造後抗體表達量
Figure 110100845-A0101-12-0132-462
實施例4、CH1/CL結構域改造後抗體的半衰期
為了評價抗體的CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換後，抗體在動物體內的穩定性是否受影響，我們檢測了替換前後抗體在大鼠體內的半衰期。示例性地，我們分別檢測了F0抗體的CH1/CL被T.1/O.9替換後的抗體F20，以及C0抗體的CH1/CL被T.1/O.9替換後的抗體C3在大鼠體內的半衰期。具體方法如下：
將3mpk抗體以靜脈注射的方式對大鼠給藥，並分別於給藥後5min，、8h，、1d，、2d，、4d，、7d，、10d，、14d，、21d，、28d採集全血0.3ml，不加抗凝，取血後在4℃放置30min，1000g離心15min，取上清(血清)置於EP管中，於-80℃保存。各個時間點抗體藥物濃度的檢測方法採取夾心ELISA，即將相應抗原包被在ELISA板，4度孵育過夜後，用洗滌液清洗，隨後加入封閉緩衝液室溫孵育1-3小時，用洗滌液清洗，然後加入100μl標準品或待測血清樣品於37℃孵育3小時，用洗滌液清洗，加入二抗Anti-Human IgG FC(HRP)mouse preadsorbed(Abcam，貨號ab98624，1：10000稀釋)於37℃孵育1-1.5h，用wash緩衝液清洗後，加入TMB室溫避光孵育10分鐘，隨後加入終止液，讀取OD450值。
實驗結果見表8，結果顯示，抗體的CH1/CL被替換成Titin-T鏈/Obscurin-O鏈後，抗體在大鼠體內仍然保有原始抗體的半衰期，提示CH1/CL被替換後的抗體和原始抗體一樣，在體內具有良好的穩定性。
表8. CH1/CL結構域被替換的抗體半衰期
Figure 110100845-A0101-12-0134-463
實施例5、雙特異抗體的構建與檢測
將結合第一抗原的抗體與結合第二抗原的抗體，藉由搭橋PCR，構建雙特異性抗體。示例性地，我們構建了多種雙特異性抗體。
一、雙特異抗體的構建
首先，我們構建了DI-1雙特異性抗體，DI-1雙特異性抗體是由D0抗體的一條重鏈(Fc區進行knob修飾)和一條輕鏈，與I0抗體的CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換後的改造抗體的一條重鏈(Fc區進行hole修飾)和一條輕鏈所構成的類IgG雙特異性抗體，其結構示意圖見圖5，其序列如下所示：
DI-1鏈1(DI-1-H1)的胺基酸序列：
Figure 110100845-A0101-12-0134-464
Figure 110100845-A0101-12-0135-465
Figure 110100845-A0101-12-0135-468
(SEQ ID NO：87)；
備註：序列中，粗體字部分為D0的VH，單下劃線部分為CH1，點劃線部分為CH2，斜體字部分為CH3。
DI-1鏈2(DI-1-L1)的胺基酸序列：
Figure 110100845-A0101-12-0135-466
Figure 110100845-A0101-12-0135-467
(SEQ ID NO：88)；
備註：序列中，粗體字部分為D0的VL，單下劃線部分為D0輕鏈恆定區CL。
DI-1鏈3(DI-1-H2)的胺基酸序列：
Figure 110100845-A0101-12-0135-469
Figure 110100845-A0101-12-0136-470
Figure 110100845-A0101-12-0136-473
(SEQ ID NO：89)；
備註：序列中，粗體字部分為I0的VH，單下劃線部分為T.16，點劃線部分為CH2，斜體字部分為CH3；
DI-1鏈4(DI-1-L2)的胺基酸序列：
Figure 110100845-A0101-12-0136-471
Figure 110100845-A0101-12-0136-472
(SEQ ID NO：90)；
備註：序列中，粗體字部分為I0的VL，單下劃線部分為O.24。
另外，構建了由B0或B0的CH1/CL結構改造抗體與U0或U0的CH1/CL結構改造抗體構建的類IgG雙特異性抗體(示例性的，BU5結構示意圖見圖8)，所得雙特異性抗體的4條鏈序列如下表9：
表9.類IgG雙特異性抗體序列表
Figure 110100845-A0101-12-0137-474
Figure 110100845-A0101-12-0138-475
Figure 110100845-A0101-12-0139-476
Figure 110100845-A0101-12-0140-477
Figure 110100845-A0101-12-0141-478
備註：序列中，粗體字部分為可變區序列，單下劃線部分為CH1或Titin-T鏈，點劃線部分為CH2，斜體字部分為CH3，雙下劃線部分為CL或Obscurin-O鏈。
此外，還構建了FA-1雙特異性抗體，FA-1雙特異性抗體是由A0抗體的一條重鏈(Fc區進行knob修飾)和一條輕鏈，與F0抗體的一條重鏈(Fc區進行hole修飾，CH1被T.16替換)和一條輕鏈(CL被O.24替換)構成的類IgG雙特異性抗體。FA-1的四條鏈序列如下表10：
表10. FA-1雙特異性抗體序列表
Figure 110100845-A0101-12-0142-479
備註：序列中，粗體字部分為可變區序列，單下劃線部分為CH1或Titin-T鏈，點劃線部分為CH2，斜體字部分為CH3，雙下劃線部分為CL或Obscurin-O鏈。
二、雙特異抗體的檢測
藉由本披露測試例3方法檢測DI-1，將DI-1的4條鏈共同轉染細胞進行表達，然後進行質譜分析，實驗結果見表11和圖6A至圖6C，質譜分析結果未檢測到同型二聚體和錯配分子，DI-1正確組裝。
表11. DI-1質譜數據
Figure 110100845-A0101-12-0143-480
另外，藉由本披露測試例3和測試例2方法檢測BU5表達。首先將BU5的四條鏈共同轉染細胞表達雙特異性抗體，另外B0、U0做為對照。然後對表達產物進行純度及質譜分析，實驗結果見表12及圖9A至圖9C，實驗結果表明，雙特異性抗體BU5被成功表達，BU5四條鏈成功組裝成目標分子，且無錯配出現。且雙特異性分子BU5純度高，SEC%達88%。
表12. BU5質譜分析結果
Figure 110100845-A0101-12-0143-481
備註：表中，“
Figure 110100845-A0101-12-0143-279
”表示正確配對
此外，藉由本披露的測試例2和測試例4的方法檢測構建的BU1-BU4雙特異性抗體的抗體純度以及抗原結合活性，實驗結果見表13，實 驗結果表明，CH1/CL被替換後的雙特異性抗體，仍保持良好的抗原結合活性，且抗體純度高。
表13、雙特異性抗體抗原結合活性及純度實驗結果
Figure 110100845-A0101-12-0144-482
測試例
測試例1、抗體的表達量測試方法
使用單株抗體或雙特異性抗體的表達質粒轉染HEK293E細胞，6天后收集表達上清，高速離心去除雜質。上清用Protein A管柱(GE Healthcare)進行純化。用PBS沖洗管柱子，至A280讀數降至基線，再用100mM乙酸緩衝液(pH3.5)沖洗層析管柱，用1M Tris-HCl，pH8.0中和。抗體的表達量由最終純化得到的抗體量/表達體積來定量。
測試例2、抗體的純度檢測方法
使用SEC-HPLC進行抗體純度監控。檢測根據儀器操作說明書進行，使用Waters e2695色譜儀，色譜管柱為Waters Xbridge BEH 200A SEC， 流動相為PBS(用稀鹽酸調節pH至6.8)，進樣100μg蛋白，等度沖提，流速為0.5mL/min。抗體純度為主峰的峰面積占總出峰面積的百分比(SEC(%))。
測試例3、抗體質譜檢測方法
(一)樣品準備：
1.脫糖完整分子量測定：取所表達抗體30μg，凍乾後加入10μl 8M Gua-HCl，70℃水浴變性10min。加入90μl蒸餾水，取30μl加入0.8μL PNG酶F(肽N-糖苷酶F)，放入37℃水浴中孵育2h，取0.5μg進行脫糖完整分子量測定。
2.脫糖還原分子量測定：取所表達抗體30μg，凍乾後加入10μl 8M Gua-HCl，70℃水浴變性10min。加入90μl蒸餾水，取30μl加入0.8μL PNG酶F(肽N-糖苷酶F)，放入37℃水浴中孵育2hr。再加入2μl 0.025M DTT，70℃水浴中還原10min，取0.5μg進行脫糖還原分子量測定。
(二)色譜-質譜條件：
色譜條件：
色譜管柱：Poroshell 300SB-C8 5um 2.1*75mm
流動相：A：0.1%HCOOH/H2O B：0.1% HCOOH/CAN
管柱溫：75℃
梯度：
Figure 110100845-A0101-12-0145-483
質譜條件：
質譜：Agilent 6530 Q-TOF LC-MS
電離模式ESI
採集模式：1GHz(質量範圍500-5000 m/z)
乾燥氣溫度：325℃
乾燥氣流量：10L/min
霧化器：40psi
鞘氣溫度：350℃
鞘氣流速：12L/min
噴霧電壓：500V
毛細管電壓：3，500V
裂解電壓：200V
Skimmer電壓：65V
Rf電壓：7500V
將待測抗體進行質譜分析，實驗結果表明CH1/CL被Titin-T/Obscurin-O替換後，抗體保持正確組裝。
測試例4、抗體結合活性檢測方法
對膜蛋白靶點的抗體，其與抗原結合活性檢測可採用FACS的方法。例如，C0、N0、F0、V0、S0，及其CH1/CL結構改造抗體，可藉由FACS的方法進行檢測。在96孔U型底板(corning，3795)中加入FACS緩衝液(98% PBS，2% FBS)重懸的細胞(2×106細胞/ml，90μl)，並加入10μl梯度稀釋 的抗體，4℃孵育1h，FACS緩衝液清洗2次，隨後每孔加入Alexa Fluor 488羊抗-人IgG(H+L)(invitrogen，Cat# 2015982，1：1000稀釋)，4℃孵育一小時，清洗2次後用FACS緩衝液重懸細胞，最後用FACS CantoII(BD)讀取熒光信號值。最後用FlowJo 7.6和Graphpad Prism 5對數據進行處理分析。
對於靶點為可溶性蛋白的抗體，用ELISA的方法檢測抗體與可溶性蛋白的結合活性，例如，D0、I0、B0、U0、H0、R0、J0，及其CH1/CL結構改造抗體，可藉由ELISA的方法檢測。方法如下：用pH7.4的PBS(源培生物，B320)緩衝液將蛋白稀釋至1μg/ml，以100μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，9018)中，4℃過夜孵育。棄去液體後，每孔加入300μl用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD，232100)進行封閉，37℃孵育2小時。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.1% tween-20)洗板3次後，每孔加入100μl梯度稀釋的抗體溶液，於37℃孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板3次，每孔加入100μl鼠抗-人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，209-035-088，1：8000稀釋)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，每孔加入100μl TMB顯色受質(KPL，5120-0077)，室溫孵育10-15min，每孔加入50μl 1M H2SO4終止反應，用酶標儀讀取在450nm處的吸收值，用軟件擬合出抗體與抗原的結合曲線，計算出EC50值。
本測試例中抗體相應抗原如下：D0及其CH1/CL結構改造抗體結合的抗原為hRANKL(購自Sino biological，11682-HNCH)；I0及其CH1/CL結構改造抗體結合的抗原為hNGF(購自Sino biological，11050-HNAC)；B0及其CH1/CL結構改造抗體結合的抗原為hBAFF(購自Sino biological，10056-HNCH)；U0及其CH1/CL結構改造抗體結合的抗原為hP40(購自Sino biological，10052-H08H)；H0、R0，及其CH1/CL結構改造抗體結合的抗原為hIL-5(購自R&D systems，205-IL-025/CF)；J0及其CH1/CL結構改造抗體結合 的抗原為hTSLP(購自Sino biological，16135-H08H)；C0、N0，及其CH1/CL結構改造抗體結合的抗原為CEA(過表達CEA細胞MKN45(購自南京科佰，CBP60488))；F0、V0、S0，及其CH1/CL結構改造抗體結合的抗原為B7H3(過表達B7H3重組細胞系CT26-B7H3(CT26來源於中科院細胞庫，B7H3序列參見ID：XP_005254757.1)。
測試例5、CH1/CL結構改造抗體減少錯配實驗方法
一、不同抗體輕/重鏈交叉錯配分子的表達檢測方法
本實驗藉由分析不同輕/重鏈抗體配對表達來驗證CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈或Titin-T鏈/類Obscurin-O鏈替換後能有效減少重/輕鏈錯配的發生。具體地，在轉染細胞表達抗體時，將D0和I0的重/輕鏈分別交換(即I/D-1(D0重鏈+I0輕鏈)；I/D-2(I0重鏈+D0輕鏈)來檢測野生型CH1和CL是否會形成交叉錯配分子；同時，將D0和I0的CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換後的結構改造的抗體D3(D0的重鏈CH1被T.11替換，輕鏈CL被O.21替換)、I3(I0的重鏈CH1被T.11替換，輕鏈CL被O.21替換)的重輕鏈分別交換，構建錯配分子：I/D-3(D0重鏈+I3輕鏈)、I/D-4(D3重鏈+I0輕鏈)、I/D-5(I0重鏈+I3輕鏈)、I/D-6(I3重鏈+D0輕鏈)，構建的抗體結構示意圖見圖7。
藉由測試例1方法檢測抗體表達量，藉由測試例3方法對表達產物進行質譜分析，檢測是否會形成錯配分子。實驗結果見表14，實驗結果表明，D0重鏈+I0輕鏈，或I0重鏈+D0輕鏈，共同表達時，均可形成完整IgG分子(150kDa)，表達量很高，分別達到74.4mg/L和73.8mg/L，且LC-MS結果證明所得蛋白為錯配後的IgG分子，這說明如果不對CH1-CL進行改造或替換， 雙特異性抗體的四條不同重輕鏈共同表達，將會形成大量輕/重鏈錯配分子。而經Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換CH1/CL後，I/D-3(D0重鏈+I3輕鏈)、I/D-4(D3重鏈+I0輕鏈)、I/D-5(I0重鏈+I3輕鏈)、I/D-6(I3重鏈+D0輕鏈)四種形式交叉錯配表達均無目的分子產生(150kDa)，除D3重鏈+I0輕鏈組合形成有少量兩條重鏈的錯誤分子外(分子量為100kDa，)，其他三種形式無錯配分子產生，這說明改造後的非同源配對不會形成IgG結構形式的錯配分子。因此，用Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換CH1-CL後將有效避免或減少類IgG的雙特異性抗體的輕/重鏈間的非同源交叉配對分子的形成。
表14. 不同輕/重鏈交叉配對的抗體表達量和質譜分析
Figure 110100845-A0101-12-0149-484
備註：表中，“√”表示檢測到該錯配分子，“×”表示未檢測到該錯配分子。
二、雙特異性抗體輕/重鏈錯配表達檢測方法
為驗證CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換後將不會發生錯配或減少錯配，本測試例設計了三種形式的輕/重鏈交叉配對表達，即用兩條不 同的重鏈和一條相同的VL-CL輕鏈來做雙特異性抗體表達，或兩條不同的重鏈和一條相同的Obscurin-O鏈替換CL的輕鏈來做表達，或用兩條不同的重鏈和兩條不同的輕鏈的正常表達做對照(具體配對見表15)。
然後對表達產物進行質譜分析(方法見本披露測試例3)，並檢測抗體純度SEC(方法見本披露測試2)。實驗結果見表15，結果表明，Obscurin-O鏈替換的輕鏈和未進行CL替換的輕鏈共同加入時才會形成正確的分子，而只加一條未進行CL替換的輕鏈或只加一條Obscurin-O鏈替換CL的輕鏈的交叉配對中沒有找到正確的目標分子。這說明被Obscurin-O鏈替換CL的輕鏈會更容易與CH1被Titin-T鏈替換的重鏈配對結合形成分子，而不會與CH1未被Titin-T鏈替換的重鏈發生交叉錯配；CL未被Obscurin-O鏈替換的輕鏈更容易與CH1未進行Titin-T鏈替換的重鏈配對結合，而不會與CH1被Titin-T鏈替換的重鏈結合。
表15. 雙特異性抗體輕/重鏈錯配的檢測結果
Figure 110100845-A0101-12-0151-485
備註(表中，“
Figure 110100845-A0101-12-0151-280
”表示檢測到該4條鏈配對分子，“--”表示未檢測到該4條鏈配對分子)。
測試例6、雙特異性抗體與抗原的親和力檢測
用Biacore T200(GE)儀器測定待測抗體與抗原蛋白的親和力。按照人抗捕獲試劑盒(GE，Cat# BR-1008-39)說明書中的方法，用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556，GE)親和捕獲待測抗體，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度的可溶性抗原，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用甘胺酸-鹽酸再生溶液(pH 1.5 Cat.# BR-1003-54，GE)將生物傳感芯片洗淨再生。實驗得到的數據用BIAevaluation version 4.1，GE軟件以(1：1)Langmuir模型擬合數據，得出親和力數值，實驗結果見表16。
實驗結果表明，本披露的結構改造的雙特異性抗體完全保留了兩個母源單株抗體對其抗原的親和力。本實驗中，抗原hRANKL(購自Sino biological，11682-HNCH)，hNGF(購自Sino biological，11050-HNAC)，hBAFF(購自Sino biological，10056-HNCH)，hP40(購自Sino biological，10052-H08H)，hB7H3(實驗室製備，序列參見SEQ ID NO：111)，hCD3抗原(實驗室製備，為hCD3的δ亞基(序列參見SEQ ID NO：112)和ε亞基(序列參見SEQ ID NO：113)組成的異源二聚體)。
表16. 雙特異性抗體親和力檢測結果
Figure 110100845-A0101-12-0153-486
測試例7、CH1-CL結構改造後的雙抗同時結合兩個靶抗原實驗
藉由用Biacore T200(GE)儀器測定待測抗體與抗原蛋白的親和力，驗證本披露的CH1-CL結構改造的雙特異性抗體可以同時結合兩個靶抗原。具體實驗步驟為：用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556，GE)親和捕獲抗體BU5，然後於芯片表面流經雙特異性抗體的第一抗原分子hP40(購自Sino biological，10052-H08H)至飽和，再進樣一定濃度的第二抗原分子 hBAFF(購自Sino biological，10056-HNCH)，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用甘胺酸-鹽酸再生溶液(pH 1.5 Cat.# BR-1003-54，GE)將生物傳感芯片洗淨再生，數據擬合模型採用BIAevaluation version 4.1，GE軟件以(1：1)Langmuir模型擬合。然後，再用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556，GE)親和捕獲抗體BU5，然後於芯片表面流經雙特異性抗體的第一抗原分子hP40(購自Sino biological，10052-H08H)至飽和，再進樣一定濃度的第二抗原分子hBAFF(購自Sino biological，10056-HNCH)，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線在每個實驗循環解離完成後，用甘胺酸-鹽酸再生溶液(pH 1.5 Cat.# BR-1003-54，GE)將生物傳感芯片洗淨再生，數據擬合模型採用BIAevaluation version 4.1，GE軟件以(1：1)Langmuir模型擬合。
實驗結果見表17，實驗結果表明雙特異性抗體BU5在結合抗原hP40達到飽和後，可繼續結合抗原hBAFF，且再結合hBaFF的能力和單抗B0相當。同樣地，雙特異性抗體BU5在結合抗原hBAFF達到飽和後，可繼續結合抗原hP40，且再結合hP40的能力和U0相當。這說明本披露的CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換的雙特異性抗體具備雙靶性特點，可同時結合兩個靶抗原。
表17. 抗體親和力檢測結果
Figure 110100845-A0101-12-0155-487
測試例8、DI-1雙特異性抗體破骨細胞分化實驗
消化Raw264.7細胞(中科院細胞庫，SCSP-5036)並重懸計數，鋪在24孔細胞培養板(Corning，3524)中，37℃細胞培養箱中過夜培養。次日將抗體溶液按不同濃度進行稀釋並與RANKL(Sino biological，11682-HNCH)混合均勻加入細胞培養板中，RANKL終濃度為50ng/ml，37℃繼續培養。96h後除去24孔板中的溶液，每孔加入100μl細胞裂解液(碧雲天，P0013J)，吹打混勻，將裂解液轉移到EP管中，12000g離心5min，取上清液用抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒(碧雲天，P0332)按說明書的方法進行檢測，用酶標儀讀取405nm處的吸收值。將檢測值用軟件擬合成曲線，計算IC50值。實驗結果見圖10，實驗結果表明CH1/CL被替換後的雙特異性抗體DI-1保持良好的活性，有效抑制破骨細胞分化。
測試例9、DI-1雙特異性抗體TF1細胞增殖實驗
藉由NGF誘導的TF-1細胞(ATCC，CRL-2003)增殖實驗來評價抗體在細胞水平的活性。實驗方法如下：消化收集TF1細胞，重懸後計數，鋪 在96孔板(Corning，3903)中，37℃培養箱中過夜培養。次日將抗體溶液按不同濃度進行稀釋並與NGF(Sino biological，11050-HNAC)混合均勻加入細胞培養板中，NGF的終濃度為10ng/ml，細胞放入培養箱中繼續培養。72h後取出細胞培養板，每孔加入50μl Cell-titer Glo(Promega，G755B)檢測液，放在搖床上孵育10min，室溫靜置10min。用酶標儀(PerkinElmer，Victor3)檢測發光信號。將檢測的信號值用軟件擬合出曲線圖，計算IC50值。實驗結果見圖11，實驗結果表明CH1/CL被替換後的雙特異性抗體DI-1具有良好的活性。
測試例10、雙特異性抗體CH1/CL被不同結構域替換後輕重鏈錯配檢測
以下藉由實驗分析CH1/CL被Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換或被TCRα/TCRβ替換對雙特異性抗體的輕重鏈錯配情況，具體實驗如下：
一、雙特異性抗體四條鏈共表達時輕重鏈錯配實驗
用TCRα/TCRβ替換H0或J1的CH1/CL，構建由四條鏈組成的雙特異性抗體HJ-1和HJ-2；用Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換H0或J1的CH1/CL，構建由四條鏈組成的雙特異性抗體HJ-3和HJ-4，雙特異性抗體的結構示意圖參見圖12，雙特異性抗體的全長序列參見表18：
表18. 雙特異性抗體序列表
Figure 110100845-A0101-12-0157-488
Figure 110100845-A0101-12-0158-489
Figure 110100845-A0101-12-0159-490
備註：序列中，粗體字部分為被替換部分，點劃線部分為恆定區部分，單下劃線部分為可變區。
J1重鏈：
Figure 110100845-A0101-12-0160-523
(SEQ ID NO：126)；
J1輕鏈：
Figure 110100845-A0101-12-0160-493
(SEQ ID NO：117)；
分別將HJ-1、HJ-2、HJ-3、HJ-4的四條鏈共轉染表達，然後對表達產物進行質譜分析(方法見本披露測試例3)，檢測是否有輕重鏈錯配分子。實驗結果見圖13A至圖13D及表19。
表19. 雙特異性抗體表達質譜分析實驗結果
Figure 110100845-A0101-12-0161-494
備註：表中“√”表示檢測到該分子，“X”表示未檢測到該分子，“HJ(1+2+3+4)”表示由其左側對應的編號為1、2、3和4這四條鏈形成的雙特異性抗體，“錯配分子1(1+2+3+3)”表示由其左側對應的編號為1、2、3和3這四條鏈形成的錯配分子1；“錯配分子2(1+2+4+4)”表示由其左側對應的編號為1、2、4和4這四條鏈形成的錯配分子2。
實驗結果表明，以TCRβ/TCRα替換CH1/CL的雙特異性抗體，當其四條鏈共轉染表達時，其輕重鏈會發生錯配。而Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換CH1/CL的雙特異性抗體，均沒有出現輕重鏈的錯配。這說明本披露的Titin-T鏈/Obscurin-O鏈替換CH1/CL的雙特異性性抗體具有出色的減少輕重鏈錯配的能力。
二、3條鏈共表達雙特異性抗體實驗
本測試用三條鏈(1條CH1被TCRβ或Titin-T鏈替換的重鏈，1條CH1未被替換的重鏈，1條CL未被替換的野生型輕鏈(VL-CL)，具體序列參見表18)共轉染表達，然後對表達產物進行質譜分析(方法見本披露測試例3)，檢測抗體純度SEC(方法見本披露測試2)，驗證野生型輕鏈(VL-CL)是否會與CH1被TCRβ或Titin-T鏈替換的重鏈組合形成錯配分子。實驗結果見圖14A、圖14B、圖15A、圖15B和表20。
表20. 3條鏈共表達雙特異性抗體實驗結果
Figure 110100845-A0101-12-0162-495
備註：表中“√”表示檢測到該分子，“X”表示未檢測到該分子，“分子(1+2+3)”表示由其左側對應的編號為1、2、3這3條鏈形成的分子，“錯配分子(1+2+3+3)”表示由其左側對應的編號為1、2、3、3這四條鏈形成的錯配分子。
實驗結果表明：VL-CL很容易與CH1被TCRβ替換的重鏈結合從而表達出有兩條相同輕鏈的錯配分子。但是VL-CL輕鏈並未與CH1被Titin-T鏈替換的重鏈結合形成兩條相同輕鏈的錯配分子，這也間接說明相比重鏈CH1被TCRβ替換的雙特異性抗體，本披露的Titin-T鏈替換重鏈CH1的雙特異性性抗體具有更出色的減少輕重鏈錯配的能力。

Claims (50)

  1. 一種多肽複合物，其包含第一抗原結合部分，該第一抗原結合部分包括：
    A)第一多肽，該第一多肽包含從N末端到C末端的第一重鏈可變結構域(VH1)，該VH1可操作地連接至第一結構域，該第一結構域包含Titin-T鏈，和
    第二多肽，該第二多肽包含從N末端到C末端的第一輕鏈可變結構域(VL1)，該VL1可操作地連接至第二結構域，該第二結構域包含能夠與Titin-T鏈相互作用的結構域；
    或
    B)第一多肽，該第一多肽包含從N末端到C末端的VH1，該VH1可操作地連接至第一結構域，該第一結構域包含能夠與Titin-T鏈相互作用的結構域，和
    第二多肽，該第二多肽包含從N末端到C末端的VL1，該VL1可操作地連接至第二結構域，該第二結構域包含Titin-T鏈；
    或
    C)第一多肽，該第一多肽包含從N末端到C末端的VH1，該VH1可操作地連接至第一結構域，該第一結構域包含Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈，和
    第二多肽，該第二多肽包含從N末端到C末端的VL1，該VL1可操作地連接至第二結構域，該第二結構域包含能夠與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈相互作用的結構域；
    或
    D)第一多肽，該第一多肽包含從N末端到C末端的VH1，該VH1可操作地連接至第一結構域，該第一結構域包含能夠與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈相互作用的結構域，和
    第二多肽，該第二多肽包含從N末端到C末端的VL1，該VL1可操作地連接至第二結構域，該第二結構域包含Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；
    其中，該第一抗原結合部分與第一抗原特異性結合，該第一結構域與第二結構域能夠形成二聚體。
  2. 如請求項1所述的多肽複合物，其中：
    該能夠與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈相互作用的結構域是Titin-T鏈，
    該能夠與Titin-T鏈相互作用的結構域是Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈。
  3. 如請求項1或2所述的多肽複合物，其中，該第一抗原結合部分的VH1和VL1形成與第一抗原特異性結合的第一抗原結合位點；該VH1的C端與第一結構域的N端可操作地連接，該VL1的C端與第二結構域的N端可操作地連接。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的多肽複合物，其中，該第一結構域與第二結構域藉由天然鏈間鍵和/或非天然鏈間鍵形成二聚體；
    較佳地，該第一結構域與第二結構域藉由天然鏈間鍵形成二聚體；
    更佳地，該Titin-T鏈上選自第7-15、19-24、26、55、59和60位中的一個或多個殘基與Obscurin-O鏈上的選自第3-6、9、41、73、75和80-90位中的一個或多個殘基彼此相結合；或者
    該Titin-T鏈上的選自第1、7-10、13-16、19-26、59-60和96位中的一個或多個殘基與類Obscurin-O鏈上的選自第4-5、10、12-13、74、76、78和82-91位中的一個或多個殘基彼此相結合；
    該Titin-T鏈中殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；該Obscurin-O鏈中殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；該類Obscurin-O鏈中殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的多肽複合物，其中，該第一結構域與第二結構域藉由至少一個非天然鏈間鍵形成二聚體；
    較佳地，該非天然鏈間鍵在第一結構域的特定突變殘基和第二結構域的特定突變殘基之間形成，
    更佳地，該突變殘基中的至少一對是半胱胺酸殘基；
    最佳地，該非天然鏈間鍵為二硫鍵；
    更佳地，其中該二聚體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非天然鏈間鍵。
  6. 如請求項5所述的多肽複合物，其中，該第一結構域的特定突變殘基和第二結構域的特定突變殘基選自以下突變：
    (A)該Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變；或者
    (B)該Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變；
    較佳地，該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C中的一個或多個胺基酸殘基突變；或者
    該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個胺基酸殘基突變；
    更佳地，該第一結構域的突變殘基和第二結構域的突變殘基選自如下突變：
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有A88C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，且Obscurin-O鏈具有A3C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，且Obscurin-O鏈具有R9C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A88C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A3C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和R9C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E和V74C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E和G84C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E和A86C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和V74C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和G84C突變；或者
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和A86C突變；
    Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
  7. 如請求項6所述的多肽複合物，其中，該Obscurin-O鏈還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變；
    較佳地，該Obscurin-O鏈具有選自L7R或L7K、T62K或T62H、和K11L的一個或多個胺基酸殘基突變；
    最佳地，該Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62K突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62H突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62K突變；或者
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62H；
    Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的多肽複合物，其中，該第一結構域和第二結構域具有選自以下一個或多個胺基酸殘基突變：
    Titin-T鏈具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變；
    較佳地，該第一結構域和第二結構域具有選自以下一個或多個殘基突變：
    Titin-T鏈具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變，和/或Obscurin-O鏈具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變；
    更佳地，該Titin-T鏈具有M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有L11K、A12S、F13Y、V14T和T22S胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有M66K、K70R、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有G2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S和A97G胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有P3W、S11I、I13L、T22M和N82M胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有D20L、T22M和A53L胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有S11I、M66K、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q41K、A45T、A67Q、G69S和V89L胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D和F84L胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有Q47E、Q49G、N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；或者
    該Titin-T鏈具有N56S、D58E、M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有A12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；
    上述Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的多肽複合物，其中，該VH1藉由第一連接域與第一結構域可操作地連接，該VL1藉由第二連接域與第二結構域可操作地連接；
    較佳地，該第一連接域和/或該第二連接域選自：Titin-T鏈的N末端片段，Obscurin-O鏈N末端片段、Obscurin-樣-O鏈的N末端片段，和(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數；
    更佳地，該第一連接域和/或該第二連接域選自以下多肽片段：“KAGIR”、“DQPQF”、(G4S)1和(G4S)2，
    最佳地，該第一結構域為Titin-T鏈，該第一連接域為KAGIR多肽，該第二結構域為Obscurin-O鏈，該第二連接域為DQPQF多肽；或者
    該第二結構域為Titin-T鏈，該第二連接域為KAGIR多肽，該第一結構域為Obscurin-O鏈，該第一連接域為DQPQF多肽。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的多肽複合物，其中，
    (A)該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或在SEQ ID NO：32序列基礎上還具有選自3、8、11、13、20、22、25、26、39、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；
    較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；和/或
    (B)該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或在SEQ ID NO：33的序列基礎上還具有選自2、3、7、9、11、12、13、14、17、20、22、25、30、 32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、76、88、89、92、94和97中一個或多個位點的胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；或者
    該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或在SEQ ID NO：34序列基礎上還具有選自6、26、74、77、84和86中一個或多個位點胺基酸突變的序列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變的序列；
    上述Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點；
    較佳地，其中，
    (A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；
    更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、 L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
    (B)該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；
    更佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45序列基礎上還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自L7K或L7R、T62K或T62H、和K11L中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：45的自然順序編號位點；
    最佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點；
    或者
    (A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；
    更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
    (B)該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變，該類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的多肽複合物，該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示的序列或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列具有至少80%同一性的序列，和/或該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一所示的序列或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一序列具有至少80%同一性的序列；或者
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示的序列或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一序列具有至少80%同一性的序列，和/或該類Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：34、59-64任一所示的序列或與SEQ ID NO：34、59-64任一序列具有至少80%同一性的序列；
    更佳地，該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：68所示序列，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：80所示序列；
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：73所示序列，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：83所示序列；
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示序列，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：84所示序列；
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示序列，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示序列；或者
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：75所示序列，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示序列。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的多肽複合物，其中，該第一抗原選自：外源抗原、內源抗原、自身抗原、新抗原、病毒抗原和腫瘤抗原。
  13. 一種多特異性多肽複合物，其包括：
    第一多肽複合物，其為如請求項1至12中任一項所述的多肽複合物，其與第一抗原特異性結合，和
    第二多肽複合物，其包含第二抗原結合部分，其與第二抗原特異性結合，
    該第一多肽複合物和第二多肽複合物結合兩種不同的抗原，或結合同一種抗原上的兩種不同表位；
    較佳地，該第二多肽複合物包含第二重鏈可變結構域(VH2)和第二輕鏈可變結構域(VL2)，該第一多肽複合物的VH1與第二多肽複合物的VL2，和/或第二多肽複合物的VH2與第一多肽複合物的的VL1之間不容易發生錯配；更佳地，該多特異性多肽複合物為雙特異性多肽複合物最較佳地，該第二抗原結合部分的VH2和VL2形成與第二抗原特異性結合的第二抗原結合位點。
  14. 如請求項13所述的多特異性多肽複合物，其中，該第二多肽複合物的第二抗原結合部分包含：
    第三多肽，其包含從N末端到C末端的VH2，其可操作地連接至第三結構域，該第三結構域包含CH1，和
    第四多肽，其包含從N末端到C末端的VL2，其可操作地連接至第四結構域，該第四結構域包含CL；
    較佳地，該VH2的C端與CH1的N端可操作地連接，該VL2的C端與CL的N端可操作地連接。
  15. 如請求項13或14所述的多特異性多肽複合物，其中，該第一多肽複合物還包含第一二聚化結構域，該第二多肽複合物還包含第二二聚化結構域，該第一二聚化結構域和第二二聚化結構域相結合；
    較佳地，該第一多肽複合物的第一結構域的C端與第一二聚化結構域的N端可操作地連接，該第二多肽複合物的第三結構域的C端與第二二聚化結構域的N端可操作地連接；
    更佳地，該第一二聚化結構域和第二二聚化結構域藉由選自以下的方式相結合：抗體鉸鏈區或其部分、連接子、二硫鍵、氫鍵、靜電相互作用、鹽橋、疏水-親水相互作用、或其組合；
    最佳地，該第一二聚化結構域和第二二聚化結構域藉由選自以下的方式相結合：抗體鉸鏈區或其部分結合；較佳IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的鉸鏈區或其部分。
  16. 如請求項15所述的多特異性多肽複合物，其中，該第一二聚化結構域包含抗體CH2結構域和/或抗體CH3結構域，和/或該第二二聚化結構域包含抗體CH2結構域和/或抗體CH3結構域；
    較佳地，該抗體CH2結構域和/或抗體CH3結構域源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  17. 如請求項15或16所述的多特異性多肽複合物，其中，該第一二聚化結構域和第二二聚化結構域不相同，並且以阻止同源二聚化和/或有利於異二聚化的方式結合；
    較佳地，該第一二聚化結構域和第二二聚化結構域藉由選自以下的方式相結合：knob-into-hole、疏水相互作用、靜電相互作用、親水相互作用、或增加柔韌性的方式；
    更佳地，該第一二聚化結構域具有如SEQ ID NO：2所示序列中的第104至330位胺基酸殘基，且該第二二聚化結構域具有如SEQ ID NO：3所示序列中的第104至330位胺基酸殘基；或者
    該第一二聚化結構域具有如SEQ ID NO：3所示序列中的第104至330位胺基酸殘基，且該第二二聚化結構域具有如SEQ ID NO：2所示序列中的第104至330位胺基酸殘基。
  18. 一種結構域改造抗體，該抗體的至少一個重鏈恆定區結構域CH1和至少一個輕鏈恆定區結構域CL被替代，其中：
    (A)該結構域CH1被Titin-T鏈替代，該結構域CL被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    (B)該結構域CL被Titin-T鏈替代，該結構域CH1被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    (C)該結構域CH1被Obscurin-O鏈替代，該結構域CL被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    (D)該結構域CL被Obscurin-O鏈替代，該結構域CH1被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    (E)該結構域CH1被類Obscurin-O鏈替代，該結構域CL被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
    (F)該結構域CL被類Obscurin-O鏈替代，該結構域CH1被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    較佳地，該能夠與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域是Titin-T鏈，
    該能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域是Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；
    更佳地，該抗體包含重鏈可變區VH1和輕鏈可變區VL1；該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者
    該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
  19. 一種結構域改造抗體的Fab片段，其中該Fab片段的恆定區結構域CH1和恆定區結構域CL被替代，其中，
    該結構域CH1被Titin-T鏈替代，該結構域CL被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該結構域CL被Titin-T鏈替代，該結構域CH1被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該結構域CH1被Obscurin-O鏈替代，該結構域CL被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該結構域CL被Obscurin-O鏈替代，該結構域CH1被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該結構域CH1被類Obscurin-O鏈替代，該結構域CL被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
    該結構域CL被類Obscurin-O鏈替代，該結構域CH1被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    較佳地，該與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；
    該與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Titin-T鏈；
    更佳地，該Fab包含重鏈可變區VH1和輕鏈可變區VL1，該VH1和VL1形成抗原結合位點；該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者
    該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
  20. 一種結構域改造抗體，該抗體包含如請求項19所述的Fab片段。
  21. 一種雙特異性抗體，其包含特異性結合第一抗原的第一重鏈和第一輕鏈，和還包含特異性結合第二抗原的第二重鏈和第二輕鏈，其中，
    該第一重鏈的CH1結構域被Titin-T鏈替代，第一輕鏈的CL結構域被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該第一輕鏈的CL結構域被Titin-T鏈替代，該第一重鏈的CH1結構域被能夠與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該第一重鏈的CH1結構域被Obscurin-O鏈替代，該第一輕鏈的CL結構域被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該第一輕鏈的CL結構域被Obscurin-O鏈替代，該第一重鏈的CH1結構域被能夠與Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該第一重鏈的CH1結構域被類Obscurin-O鏈替代，該第一輕鏈的CL結構域被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；或者
    該第一輕鏈的CL結構域被類Obscurin-O鏈替代，該第一重鏈的CH1結構域被能夠與類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域替代；
    該第一抗原和第二抗原不相同，或該第一抗原和第二抗原是同一種抗原上的兩種不同表位；
    較佳地，該第一重鏈與第二輕鏈之間、第一輕鏈與第二重鏈之間不容易發生錯配；更較佳地，該與Titin-T鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈；
    該與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈具有蛋白間相互作用的結構域為Titin-T鏈。
  22. 如請求項21所述的雙特異性抗體，其中，該第一重鏈包含第一重鏈可變區(VH1)，該第一輕鏈包含第一輕鏈可變區(VL1)，該VH1和VL1形成與第一抗原特異性結合的抗原結合位點，且
    該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者
    該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
  23. 如請求項21或22所述的雙特異性抗體，其中，該第二重鏈包含從N末端到C末端的第二重鏈可變區(VH2)，其可操作地連接至CH1；該 第二輕鏈包含從N末端到C末端的第二輕鏈可變區(VL2)，其可操作地連接至CL；
    較佳地，該VH2和VL2形成與第二抗原特異性結合的抗原結合位點，該VH2的C端與CH1的N端可操作地連接；該VL2的C端與CL的N端可操作地連接。
  24. 如請求項21至23中任一項所述的雙特異性抗體，其中，該第一重鏈和第二重鏈的C末端包含CH2和/或CH3結構域；
    較佳地，該CH1、CH2和CH3結構域源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；
    更佳地，該第一重鏈和第二重鏈藉由選自以下的方式結合：抗體鉸鏈區或其部分、連接子、二硫鍵、氫鍵、靜電相互作用、鹽橋、疏水-親水相互作用或其組合。
  25. 如請求項24所述的雙特異性抗體，其中：
    該第一重鏈從N末端到C末端依次為：VH1-L1-Titin-T鏈-L2-CH2-CH3，
    該第一輕鏈從N末端到C末端依次為：VL1-L3-Obscurin-O鏈或VL1-L4-類Obscurin-O鏈；
    該第二重鏈從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-CH2-CH3，
    該第二輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL2-CL；
    或者，
    該第一輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL1-L1-Titin-T鏈，
    該第一重鏈從N末端到C末端的依次為：VH1-L2-Obscurin-O鏈-L3-CH2-CH3，或VH1-L4-類Obscurin-O鏈-L5-CH2-CH3；
    該第二重鏈從N末端到C末端的依次為：VH2-CH1-CH2-CH3，
    該第二輕鏈從N末端到C末端的依次為：VL2-CL；
    該L1至L5為間隔區，間隔區可存在或不存在；
    較佳的，該間隔區選自：Titin-T鏈的N末端片段，Obscurin-O鏈的N末端片段，類Obscurin-O鏈的N末端片段，或(GxS)y連接子；其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數；
    最佳地，該間隔區選自：“KAGIR”、“DQPQF”、(G4S)1和(G4S)2。
  26. 如請求項25所述的雙特異性抗體，其中，該第一重鏈的CH2和CH3與第二重鏈的CH2和CH3不相同，並且以阻止同源二聚化和/或有利於異二聚化的方式結合；
    較佳地，該第一重鏈和第二重鏈藉由選自以下的方式結合：knob-into-hole、疏水相互作用、靜電相互作用、親水相互作用或增加的柔韌性的方式；
    更佳地，該第一重鏈和第二重鏈包括藉由knob-into-hole的方式結合；
    最佳地，該第一重鏈CH2-CH3結構域具有如SEQ ID NO：2所示序列中的第104至330位胺基酸殘基，該第二重鏈CH2-CH3結構域具有如SEQ ID NO：3所示序列中的第104至330位胺基酸殘基；或者
    該第一重鏈CH2-CH3結構域具有如SEQ ID NO：3所示序列中的第104至330位胺基酸殘基，該第二重鏈CH2-CH3結構域具有如SEQ ID NO：2所示序列中的第104至330位胺基酸殘基。
  27. 如請求項18或20所述的結構域改造抗體、或如請求項19所述的結構域改造抗體的Fab片段，或如請求項21至26中任一項所述的雙特異性抗體，其中，該可操作地連接是兩條多肽序列藉由連接域連接或兩條多肽直接連接。
  28. 如請求項27所述的結構域改造抗體、或雙特異性抗體，或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
    該Titin-T鏈與Obscurin-O鏈，或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈藉由天然鏈間鍵結合和/或非天然鏈間鍵形成二聚體；
    較佳地，該Titin-T鏈與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈藉由天然鏈間鍵形成二聚體，該Titin-T鏈上選自第7-15、19-24、26、55、59和60位中的一個或多個殘基與Obscurin-O鏈上的選自第3-6、9、41、73、75和80-90位中的一個或多個殘基彼此相結合，或者
    該Titin-T鏈上的選自第1、7-10、13-16、19-26、59-60和96位中的一個或多個殘基與類Obscurin-O鏈上的選自第4-5、10、12-13、74、76、78和82-91位中的一個或多個殘基彼此相結合；
    該Titin-T鏈殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈殘基位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
  29. 如請求項27或28所述的結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中，該Titin-T鏈與Obscurin-O鏈，或Titin-T鏈與類Obscurin-O鏈藉由至少一個非天然鏈間鍵形成二聚體；
    較佳地，該非天然鏈間鍵為二硫鍵；
    更佳地，其中該二聚體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非天然鏈間鍵。
  30. 如請求項27至29中任一項所述的結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
    該Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該Obscurin-O鏈具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變；或者
    該Titin-T鏈具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或該類Obscurin-O鏈具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變；
    較佳地，該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或
    該Obscurin-O鏈具有選自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的中一個或多個胺基酸殘基突變；或者
    該Titin-T鏈具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，和/或
    該類Obscurin-O鏈具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個胺基酸殘基突變；
    更佳地，該Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有A88C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，且Obscurin-O鏈具有A3C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，且Obscurin-O鏈具有R9C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A88C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和A3C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A26C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S和R9C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E和V74C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E和G84C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E和A86C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和V74C突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和V20C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和G84C突變；或者
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和T22C突變，且類Obscurin-O鏈具有C6E、C26S、C77S和A86C突變；
    上述Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序位點；類Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：34的自然順序位點。
  31. 如請求項29或30所述的結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
    該Obscurin-O鏈還具有選自第7、11和62位中的一個或多個胺基酸殘基突變；
    較佳地，該Obscurin-O鏈具有選自L7K或L7R、K11L、和T62K或T62H中的一個或多個胺基酸殘基突變；
    最佳地，該Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62K突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、L7K和T62H突變；
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62K突變；或者
    Titin-T鏈具有C25S、C39T和A8C突變，且Obscurin-O鏈具有C25S、C76S、A88C、K11L和T62H；
    上述Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點。
  32. 如請求項27至31中任一項所述的結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
    該Titin-T鏈具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，和/或
    Obscurin-O鏈具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變；
    較佳地，該Titin-T鏈具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、 T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變，和/或
    Obscurin-O鏈具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變；
    更佳地，該Titin-T鏈具有M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有L11K、A12S、F13Y、V14T和T22S胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有M66K、K70R、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有G2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S和A97G胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有P3W、S11I、I13L、T22M和N82M胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有D20L、T22M和A53L胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有S11I、M66K、S79T和G81R胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q41K、A45T、A67Q、G69S和V89L胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D和F84L胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有Q47E、Q49G、N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；
    該Titin-T鏈具有N56S、D58E和L75V胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有Q42L、A45T、A67T、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；或者
    該Titin-T鏈具有N56S、D58E、M66S和T77S胺基酸突變，和/或該Obscurin-O鏈具有A12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E和D94G胺基酸突變；
    上述Titin-T鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為相對於序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點。
  33. 如請求項27至32中任一項所述的結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，該Titin-T鏈、Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端藉由連接域與VH1或VL1可操作地連接；
    較佳地，該連接域選自：Titin-T鏈的N末端片段、Obscurin-O鏈的N末端片段、類Obscurin-O鏈的N末端片段，和(GxS)y連接子，其中，X選自1-5的整數，Y選自1-6的整數；
    更佳地，該連接域選自：“KAGIR”、“DQPQF”、(G4S)1和(G4S)2；
    最佳地，該Titin-T鏈藉由KAGIR多肽與VH1或VL1連接，和/或該Obscurin-O鏈藉由DQPQF多肽與VL1或VH1連接。
  34. 如請求項27至33中任一項所述的結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
    (A)該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示；或在SEQ ID NO：32序列基礎上還具有選自3、8、11、13、20、22、25、26、39、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、 T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；和/或
    (B)該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或在SEQ ID NO：33的序列基礎上還具有選自2、3、7、9、11、12、13、14、17、20、22、25、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、76、88、89、92、94和97中一個或多個位點的胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；或者
    該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或在SEQ ID NO：34序列基礎上還具有選自6、26、74、77、84和86中一個或多個位點胺基酸突變的序列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變的序列；
    上述Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點；
    較佳地，其中，
    (A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；
    更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
    (B)該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；
    較佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45序列基礎上還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自L7K或L7R、T62K或T62H、和K11L的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：45的自然順序編號位點；
    更佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點；
    或者
    (A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；
    更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
    (B)該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C的一個或多個胺基酸殘基突變，該類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
  35. 如請求項27至34中任一項所述的結構域改造抗體、雙特異性抗體或結構域改造抗體的Fab片段，其中：
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一所示的序列或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一序列具有至少80%同一性的序列，和/或
    該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：33、42-58、77-86任一所示的序列或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86中任一序列有至少80%同一性的序列；或者
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76任一所示的序列或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一序列具有至少80%同一性的序列，和/或
    該類Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：34、59-64中任一所示的序列或與SEQ ID NO：34、59-64任一序列具有至少80%同一性序列；
    更佳地，
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：68所示多肽，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：80所示多肽；
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：73所示多肽，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：83所示多肽；
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：84所示多肽；
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示多肽，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽；
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：75所示多肽，且該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示多肽。
  36. 如請求項21至35中任一項所述的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體為選自以下A至I中任一項所述的雙特異性抗體：
    A、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：89所示或與SEQ ID NO：89具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：90所示或與SEQ ID NO：90具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：87所示或與SEQ ID NO：87具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：88所示或與SEQ ID NO：88具有至少85%序列同一性；
    B、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：93所示或與SEQ ID NO：93具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：94所示或與SEQ ID NO：94具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：91所示或與SEQ ID NO：91具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：92所示或與SEQ ID NO：92具有至少85%序列同一性；
    C、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：97所示或與SEQ ID NO：97具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：98所示或與SEQ ID NO：98具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：95所示或與SEQ ID NO：95具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：96所示或與SEQ ID NO：96具有至少85%序列同一性；
    D、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：99所示或與SEQ ID NO：99具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：100所示或與SEQ ID NO：100具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：101所示或與SEQ ID NO：101具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：96所示或與SEQ ID NO：96具有至少85%序列同一性；
    E、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：102所示或與SEQ ID NO：102具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：100所示或與SEQ ID NO：100具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：95所示或與SEQ ID NO：95具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：96所示或與SEQ ID NO：96具有至少85%序列同一性；
    F、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：103所示或與SEQ ID NO：103具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：104所示或與SEQ ID NO：104具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：95所示或與SEQ ID NO：95具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：96所示或與SEQ ID NO：96具有至少85%序列同一性；和
    G、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：107所示或與SEQ ID NO：107具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：108所示或與SEQ ID NO：108具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：109所示或與SEQ ID NO：109具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：110所示或與SEQ ID NO：110具有至少85%序列同一性；
    H、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：122所示或與SEQ ID NO：122具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：123所示或與SEQ ID NO：123具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：116所示或與SEQ ID NO：116具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：117所示或與SEQ ID NO：117具有至少85%序列同一性；
    I、該雙特異性抗體的第一重鏈的序列如SEQ ID NO：118所示或與SEQ ID NO：118具有至少85%序列同一性，第一輕鏈的序列如SEQ ID NO：119所示或與SEQ ID NO：119具有至少85%序列同一性，第二重鏈的序列如SEQ ID NO：124所示或與SEQ ID NO：124具有至少85%序列同一性，第二輕鏈的序列如SEQ ID NO：125所示或與SEQ ID NO：125具有至少85%序列同一性。
  37. 一種製備多特異性抗體的方法，該方法包括用Titin-T鏈和Obscurin-O鏈、或者Titin-T鏈和類Obscurin-O鏈替換抗體的CH1/CL的步驟；
    更佳地，該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一所示的序列或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一序列具有至少80%同一性的序列，和/或
    該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：33、42-58、77-86中任一所示的序列或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86中任一條序列有至少80%同一性的序列；或者
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一所示的序列或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一條序列具有至少80%同一性的序列，和/或
    該類Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：34、59-64中任一所示的序列或與SEQ ID NO：34、59-64中任一條序列具有至少80%同一性序列；
    最佳地，
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：68所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：80所示序列；
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：73所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：83所示序列；
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：84所示序列；
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示序列，且ObScurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示序列；或者
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：75所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示序列。
  38. 一種多特異性抗體，其是根據如請求項37所述的方法製備獲得的；其中：
    該多特異性抗體包含第一重鏈可變區(VH1)和第一輕鏈可變區(VL1)，該VH1和VL1形成與第一抗原特異性結合的抗原結合位點，且
    該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者
    該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接。
  39. 如請求項38所述的多特異性抗體，其中，
    (A)該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或在SEQ ID NO：32序列基礎上還具有選自8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中的一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；和/或
    (B)該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或在SEQ ID NO：33的序列基礎上還具有選自3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94和97中的一個或多個位點的胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；或者
    該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或在SEQ ID NO：34序列基礎上還具有選自6、26、74、77、84和86中的一個或多個位點胺基酸突變的序 列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變的序列；
    上述Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點；
    較佳地，其中，
    (A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；
    更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
    (B)該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；
    較佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45序列基礎上還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自L7K或L7R、 T62K或T62H、和K11L中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：45的自然順序編號位點；
    更佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點；
    或者
    (A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；
    更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
    (B)該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自C6E、 C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個胺基酸殘基突變，該類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
  40. 一種綴合物，其包含選自以下的(A)至(F)中任一項：
    (A)請求項1至12中任一項所述的多肽複合物；
    (B)請求項13至17中任一項所述的多特異性多肽複合物；
    (C)請求項18、20、27至35中任一項所述的結構域改造抗體；
    (D)請求項19、27至35中任一項所述的結構域改造抗體的Fab片段；
    (E)請求項21至36中任一項所述的雙特異性抗體；和
    (F)請求項38或39所述的多特異性抗體。
  41. 一種多肽，其序列如SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一序列所示或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一條序列有至少80%同一性；或者
    序列如SEQ ID NO：33、42-58、77-86中任一條序列所示或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86中任一條序列有至少80%同一性；或者
    序列如SEQ ID NO：34、59-64中任一條序列所示或與SEQ ID NO：34、59-64中任一條序列具有至少80%同一性；
    較佳地，該多肽可用於替換抗體CH1和/或CL。
  42. 一種Titin-T鏈和Obscurin-O鏈的組合、或者Titin-T鏈和類Obscurin-O鏈的組合在減少多特異性抗體輕鏈/重鏈錯配中的用途；
    較佳地，該多特異性抗體包含第一重鏈可變區(VH1)和第一輕鏈可變區(VL1)，該VH1和VL1形成與第一抗原特異性結合的抗原結合位點，且
    該VH1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VL1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接，或者
    該VL1的C端與Titin-T鏈的N端可操作地連接，該VH1的C端與Obscurin-O鏈或類Obscurin-O鏈的N端可操作地連接；
    更佳地，該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一所示的序列或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一序列具有至少80%同一性的序列，和/或該Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：33、42-58、77-86中任一所示的序列或與SEQ ID NO：33、42-58、77-86中任一條序列有至少80%同一性的序列；或者
    該Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一所示的序列或與SEQ ID NO：32、35-41、65-76中任一條序列具有至少80%同一性的序列，和/或該類Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：34、59-64中任一所示的序列或與SEQ ID NO：34、59-64中任一條序列具有至少80%同一性序列；
    最佳地，
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：68所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：80所示序列；
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：73所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：83所示序列；
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：84所示序列；Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：76所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示序列；或者
    Titin-T鏈包含如SEQ ID NO：75所示序列，且Obscurin-O鏈包含如SEQ ID NO：86所示序列。
  43. 如請求項42所述的用途，其中，
    (A)該Titin-T鏈的序列如SEQ ID NO：32所示或在SEQ ID NO：32序列基礎上還具有選自8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84中的一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加5個胺基酸殘基KAGIR的序列；較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S或M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加KAGIR胺基酸殘基的序列；和/或
    (B)該Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：33所示或在SEQ ID NO：33的序列基礎上還具有選自3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94和97中的一個或多個位點的胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；較佳具有選自A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K或L7R、T62K或T62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個位點胺基酸突變和/或N端增加DQPQF胺基酸殘基的序列；或者
    該類Obscurin-O鏈的序列如SEQ ID NO：34所示或在SEQ ID NO：34序列基礎上還具有選自6、26、74、77、84和86中的一個或多個位點胺基酸突變的序列；較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個位點胺基酸突變的序列；
    上述Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點；
    較佳地，其中，
    (A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；
    更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
    (B)該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：33序列基礎上具有選自第3、9、25、76和88位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳自A3C、R9C、C25S、C76S和A88C中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：33的自然順序編號位點；
    較佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：45序列基礎上還具有選自第7、11、62位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自L7K或L7R、T62K或T62H、和K11L中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：45的自然順序編號位點；
    更佳地，該Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：50序列基礎上具有選自的第2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94和97位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M或T22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q或A67T、G69S、V89L、Q92E、D94G和A97G中的一個或多個胺基酸突變，該Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：50的自然順序編號位點；
    或者
    (A)該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：32序列基礎上具有選自第8、20、22、25、26和39位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自A8C、V20C、T22C、C25S、A26C和C39T中的一個或多個胺基酸殘基突變，該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：32的自然順序編號位點；
    更佳地，該Titin-T鏈為在SEQ ID NO：35序列基礎上具有選自第3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83和84位中的一個或多個胺基酸突變，較佳具有選自P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D和F84L中的一個或多個胺基酸突變；該Titin-T鏈突變位點為序列SEQ ID NO：35的自然順序編號位點，和/或
    (B)該類Obscurin-O鏈為在SEQ ID NO：34序列基礎上具有選自6、26、74、77、84和86位中的一個或多個胺基酸殘基突變，較佳具有選自C6E、C26S、C77S、V74C、G84C和A86C中的一個或多個胺基酸殘基突變，該類Obscurin-O鏈突變位點為序列SEQ ID NO：34的自然順序編號位點。
  44. 一種核酸分子，其編碼選自以下(A)至(G)中的任一項：
    (A)如請求項1至12中任一項所述的多肽複合物，
    (B)如請求項13至17中任一項所述的多特異性多肽複合物，
    (C)如請求項18、20、27至35中任一項所述的結構域改造抗體，
    (D)如請求項19、27至35中任一項所述的結構域改造抗體的Fab片段，
    (E)如請求項21至36中任一項所述的雙特異性抗體，
    (F)如請求項41所述的多肽，和
    (G)如請求項38或39所述的多特異性抗體。
  45. 一種載體，其包含如請求項44所述的核酸分子。
  46. 一種宿主細胞，其由如請求項45所述的載體轉化獲得；該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳哺乳動物細胞。
  47. 一種製備方法，其製備選自以下的任一項：
    如請求項1至12中任一項所述的多肽複合物，或如請求項13至17中任一項所述的多特異性多肽複合物，或如請求項18、20、27至35中任一項所述的結構域改造抗體、或如請求項19、27至35中任一項所述的結構域改造抗體的Fab片段、或如請求項21至36中任一項所述的雙特異性抗體、或如請求項41所述的多肽，或如請求項38或39所述的多特異性抗體；
    該方法包括以下步驟：
    培養如請求項46所述的宿主細胞，然後純化並回收多肽複合物、多特異性多肽複合物、結構域改造抗體、結構域改造抗體的Fab片段、雙特異性抗體、多肽或多特異性抗體。
  48. 一種醫藥組成物，其包含一種或多種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，以及選自以下的任一項：
    如請求項1至12中任一項所述的多肽複合物，或如請求項13至17中任一項所述的多特異性多肽複合物，或如請求項18、20、27至35中任一項所述的結構域改造抗體、或如請求項19、27至35中任一項所述的結構域改造抗體的Fab片段、或如請求項21至36中任一項所述的雙特異性抗體、或如請求項38或39所述的多特異性抗體、或如請求項40所述的綴合物。
  49. 一種選自以下的任一項在製備用於治療或預防疾病或病症的藥物中的用途：如請求項1至12中任一項所述的多肽複合物，或如請求項13至17中任一中多特異性多肽複合物，或如請求項18、20、27至35中任一項所述的結構域改造抗體、或如請求項19、27至35中任一項所述的結構域改造抗體的Fab片段、或如請求項21至36中任一項所述的雙特異性抗體、或如請求項48所述的醫藥組成物、或如請求項38或39所述的多特異性抗體、或如請求項40所述的綴合物。
  50. 一種檢測方法，該方法包括使選自以下的任一項接觸待測樣本：
    如請求項1至12中任一項所述的多肽複合物，或如請求項13至17中任一項所述的多特異性多肽複合物，或如請求項18、20、27至35中任一項所述的結構域改造抗體、或如請求項19、27至35中任一項所述的結構域改造抗體的Fab片段、或如請求項21至36中任一項所述的雙特異性抗體、或如請求項38或39所述的多特異性抗體。
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