TWI801425B - Il-5 抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 - Google Patents
Il-5 抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI801425B TWI801425B TW107134416A TW107134416A TWI801425B TW I801425 B TWI801425 B TW I801425B TW 107134416 A TW107134416 A TW 107134416A TW 107134416 A TW107134416 A TW 107134416A TW I801425 B TWI801425 B TW I801425B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- seq
- variable region
- chain variable
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
Abstract
本公開涉及IL-5抗體、其抗原結合片段及醫藥用途。進一步地,本公開涉及包含該IL-5抗體CDR區的鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體,以及包含IL-5抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物,以及其作為藥物的用途。特別地,本公開涉及一種人源化的IL-5抗體在製備用於治療IL-5相關的疾病或病症的藥物中的用途。
Description
本公開涉及IL-5抗體以及其抗原結合片段,進一步地,本公開還涉及包含該IL-5抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體,本公開還涉及包含該IL-5抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物,以及其作為IL-5相關疾病診斷劑和治療藥物的用途。
白細胞介素-5(IL-5)是白細胞介素家族的重要成員之一,又稱為T細胞替代因子(T cell replacing factorTRF)、B細胞生長因子-II(B cell growth factor-II BCGF-II)、IgA增強因子(IgA-enhancing factor IgA-EF)、酸性粒細胞分化因子(eosinophil differentiation factor EDF),是一種主要由輔助性T細胞2(Th2)分泌的同二聚體糖蛋白。人的IL-5由134個胺基酸殘基組成,包括由22個胺基酸組成的信號肽和2個糖基化位點,人和鼠IL-5在胺基酸水平同源性為70%。具有活性的IL-5呈現寡二聚體形式,兩條肽鏈以二硫鍵連接,以反向平行的構型存在,而IL-5的單體則無生物學活性(Adv Immunol.1994;57:145-90)。
嗜酸性粒細胞(eosinophil,EOS)與肺部多種炎性疾病包括與過敏性反應有關的變應性病症有關,其中哮喘是一種慢性呼吸道炎症疾病,全球約有3億患者,發病率為10%。其發病機制與多種細胞因子有關,IL-5及其受體IL-5R在哮喘的發病過程中扮演著重要的角色。哮喘患者支氣管肺組織內有大量的炎性細胞浸潤,其中以嗜酸性粒細胞增多最為顯著。許多研究都表明嗜酸性粒細胞是導致哮喘氣道炎症的主要細胞之一(Curr Opin Pulm Med.2005 Jan;11(1):1-6)。IL-5在EOS的分化、成熟、黏附、浸潤和凋亡過程中發揮著極其重要的作用。大量的動物試驗和臨床研究均表明,IL-5可活化骨髓中的EOS祖細胞,並引起外周血和氣道內EOS的聚集,從而導致氣道的慢性炎症和高反應性(J Immunol.2014 Oct 15;193(8):4043-52)。此外,IL-5還能延長EOS的存活時間、增強其對特殊刺激因子(如IgA或IgG)的脫顆粒反應,介導嗜酸性粒細胞的趨化反應(J Asthma Allergy.2015 Nov 3;8:125-34)。在哮喘患者和人支氣管抗原誘發模型中均檢測到IL-5表達水平的增加(Greenfeder et al,Respiratory Research,2:71-79,2001);哮喘患者吸入重組人IL-5蛋白會導致嗜酸性粒細胞數目增多,支氣管高反應性及嗜酸性粒細胞毒性顆粒的釋放,這些都表明IL-5是哮喘發病中的一個關鍵因素。
目前對哮喘治療最有效的方法是藉由鼻腔或口腔給予固醇類藥物來抑制哮喘中一些關鍵介質(包括IL-5)的表達,以減輕肺部炎症。然而長期使用固醇類藥物具有很多 副作用,因此,有必要尋找新的治療哮喘的藥物靶點。已有研究證明,使用IL-5的抗體抑制IL-5與其受體結合,可顯著降低嗜酸性粒細胞在肺內的聚集,降低血液、組織、痰液中的嗜酸性粒細胞水平,並可減少嗜酸性粒細胞所介導的炎症反應,提高肺功能,對嚴重的嗜酸性粒細胞哮喘和復發性哮喘均具有很好的療效(Drugs.2017 May;77(7):777-784)。現有上市的IL-5抗體只有GSK公司的mepolizumab和Teva Pharma公司的reslizumab,其他針對IL-5靶點的抗體均處於臨床前研究階段,相關專利有WO2017033121、WO2016040007、WO2015095539、WO2012083370、WO2012158954、WO2006046689、WO9621000、WO9535375等,但是上述藥物在IL-5誘導的嗜酸性粒細胞的消除和肺功能的改善方面仍有可提高的空間。因此,有必要繼續開發具有高選擇性、高親和力和良好藥效的抗體,為治療哮喘提供更多和更優的抗IL-5治療方案。
本公開提供與IL-5的胺基酸序列或三維結構特異性結合的單株抗體或抗原結合片段(也可稱IL-5結合分子)。
一方面,本公開提供一種單株抗體或其抗原結合片段,該單株抗體或其抗原結合片段結合人IL-5,所述單株抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:(i)重鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:16至18胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區或與SEQ ID NO:16至18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體,輕鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:19至21胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區或與SEQ ID NO:19至21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體;或(ii)重鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:22至24胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區或與SEQ ID NO:22至24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體,輕鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:25至27胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區或與SEQ ID NO:25至27所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體;或(iii)重鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:28至30胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區或與SEQ ID NO:28至30所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體,輕鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:31至33胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區或與SEQ ID NO:31至33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體;或(iv)重鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:34至36胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區或與SEQ ID NO:34至36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體,輕鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:37至39胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區或與SEQ ID NO:37至39所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體;或(v)重鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:40至42胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區或與SEQ ID NO:40至42所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體,輕鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:43至45胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區或與SEQ ID NO:43至45所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體;或(vi)重鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:34至36胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區或與SEQ ID NO:34、82、36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體,輕鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:37至39胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區或與SEQ ID NO:37至39所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體。
在一些實施方式中,該單株抗體或抗原結合片段的CDR(包括3個重鏈CDR和3個輕鏈CDR)具有3、2或1 個胺基酸差異的CDR變體是經親和力成熟方法篩選獲得的具有3、2或1個胺基酸差異的CDR變體。
在一些實施方式中,該單株抗體或抗原結合片段與IL-5的親和力(KD)小於10-8M、小於10-9M、小於10-10M或小於10-11M。
在一些實施方式中,該單株抗體或抗原結合片段特異性結合人IL-5,該單株抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:(vii)重鏈可變區包含如SEQ ID NO:16至18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:19至21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或(viii)重鏈可變區包含如SEQ ID NO:22至24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:25至27所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或(ix)重鏈可變區包含如SEQ ID NO:28至30所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:31至33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或(x)重鏈可變區包含如SEQ ID NO:34至36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:37至39所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或(xi)重鏈可變區包含如SEQ ID NO:40至42所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:43至45所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或(xii)重鏈可變區包含如SEQ ID NO:34、82、36所示 的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:37至39所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
在一些實施方式中,該單株抗體是重組抗體。
在一些實施方式中,該單株抗體選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體的重組抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中,該人源化抗體輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR區序列分別來源於人種系輕鏈和重鏈或其突變序列。
在一些實施方式中,該單株抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體含有SEQ ID NO:49、57、63、69或75所示的重鏈可變區或其變體;該變體是在SEQ ID NO:49、57、63、69或75所示的重鏈可變區序列上具有1至10個胺基酸突變。
在一些實施方式中,該單株抗體或其抗原結合片段,其中該變體是在SEQ ID NO:49、57、63、69或75所示的重鏈可變區的FR區位置上具有1至10個胺基酸的回復突變;較佳的,該回復突變是在SEQ ID NO:49所示的重鏈可變區上選自S49T、V93T和K98S或其組合的胺基酸回復突變,或該回復突變是在SEQ ID NO:57所示的重鏈可變區上選自S49T、V93T和K98T或其組合的胺基酸回復突變,或該回復突變是在SEQ ID NO:63所示的重鏈可變區上選自R38K、M48I、R67K、V68A、M70L、R72V、T74K和L83F或其組合的胺基酸回復突變,或該回復突變是在SEQ ID NO:69所示的重鏈可變區上選自F29I、R38K、V48I、 R72A、T97F和N55V或其組合的胺基酸回復突變,或該回復突變是在SEQ ID NO:75所示的重鏈可變區上選自R38K、M48I、R67K、V68A、R72A、T74K、M81L、L83F和D89E或其組合的胺基酸回復突變。
在一些實施方式中,該單株抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO:50或51所示的重鏈可變區,或包含選自SEQ ID NO:58或59所示的重鏈可變區,或包含選自SEQ ID NO:64、65和66中任一個所示的重鏈可變區,或包含選自SEQ ID NO:70或71所示的重鏈可變區,或包含選自SEQ ID NO:76至79中任一個所示的重鏈可變區。
在一些實施方式中,該單株抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體含有SEQ ID NO:46、54、60、67或72所示的輕鏈可變區或其變體;該變體是在SEQ ID NO:46、54、60、67或72所示的輕鏈可變區上具有1至10個胺基酸變化的序列。
在一些實施方式中,該單株抗體或其抗原結合片段,其中該變體是在SEQ ID NO:46、54、60、67或72所示的輕鏈可變區的FR區位置上具有1-10個胺基酸的回復突變;較佳的,該回復突變選自在SEQ ID NO:46所示的輕鏈可變區上的A43S、L47V、G66R、T69S、F71Y和Y87F或其組合的胺基酸回復突變;或在SEQ ID NO:54所示的輕鏈可變區上的A43S、L47M、F71Y和Y87F或其組合的胺基酸回復突變;或在SEQ ID NO:60所示的輕鏈可變區上的 E1D、I2T、I57V、V84T和Y86F或其組合的胺基酸回復突變;或在SEQ ID NO:67所示的輕鏈可變區上的M4L、A42S、L45P和L46W或其組合的胺基酸回復突變;或在SEQ ID NO:72所示的輕鏈可變區上的A43S、I48V和F71Y或其組合的胺基酸回復突變。
在一些實施方式中,該單株抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO:47或48所示的輕鏈可變區;或包含選自SEQ ID NO:55或56所示的輕鏈可變區;或包含選自SEQ ID NO:61或62中所示的輕鏈可變區;或包含SEQ ID NO:68所示的輕鏈可變區;或包含選自SEQ ID NO:73或74所示的輕鏈可變區。
在一些實施方式中,該單株抗體或其抗原結合片段,其中該人源化抗體包含選自:選自SEQ ID NO:49至51中任一個所示的重鏈可變區和選自SEQ ID NO:46至48中任一個所示的輕鏈可變區;或選自SEQ ID NO:57至59中任一個所示的重鏈可變區和選自SEQ ID NO:54至56中任一個所示的輕鏈可變區;或選自SEQ ID NO:63至66中任一個所示的重鏈可變區和選自SEQ ID NO:60至62中任一個所示的輕鏈可變區;或選自SEQ ID NO:69至71中任一個所示的重鏈可變區和選自SEQ ID NO:67至68中任一個所示的輕鏈可變區; 或選自SEQ ID NO:75至79中任一個所示的重鏈可變區和選自SEQ ID NO:72至74中任一個所示的輕鏈可變區。
在一些實施方式中,該單株抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為全長抗體,進一步包括人抗體恒定區,其中重鏈恒定區較佳人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗體重鏈恒定區,更佳包含SEQ ID NO:52所示的人抗體重鏈恒定區和SEQ ID NO:53所示的人輕鏈恒定區。
在一些實施方式中,該抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
本公開還提供一種分離的單株抗體或其抗原結合片段,其與上述單株抗體或其抗原結合片段競爭結合人IL-5。
本公開還提供一種醫藥組成物,其含有治療有效量的根據本公開的單株抗體或其抗原結合片段,以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。醫藥組成物單位劑量中含單株抗體或其抗原結合片段的量較佳為0.1至2000mg,更佳為1至1000mg。
本公開還提供一種分離的核酸分子,其編碼根據本公開的單株抗體或其抗原結合片段。
本公開還提供一種重組載體,其包含上述的核酸分子。
本公開還提供一種用根據本公開的重組載體轉化的宿主細胞,該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞,較佳為 真核細胞,更佳為哺乳動物細胞。
本公開還提供用於生產根據本公開的單株抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括將上述宿主細胞在培養物中進行培養以形成並積累上述單株抗體或其抗原結合片段,以及從培養物回收該單株抗體或其抗原結合片段。
本公開還提供用於檢測或測定人IL-5的方法,該方法包括使用上述單株抗體或其抗原結合片段。
本公開還提供用於檢測或測定人IL-5的試劑,該試劑包含上述任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段。
本公開還提供用於與人IL-5相關的疾病的診斷劑,該診斷劑包含根據上述的單株抗體或其抗原結合片段。
本公開還提供用於診斷與人IL-5相關的疾病的方法,該方法包括使用上述單株抗體或其抗原結合片段檢測或測定人IL-5或IL-5陽性細胞。
本公開還提供上述單株抗體或其抗原結合片段在製備與人IL-5相關的疾病的診斷劑中的應用。
本公開還提供用於治療與人IL-5相關的疾病的藥物,該治療劑包含上述單株抗體或其抗原結合片段,或包含上述的醫藥組成物,或包含上述核酸分子。
本公開還提供治療與人IL-5相關的疾病的方法,該方法包括向受試者施用藥物有效量的上述單株抗體或其抗原結合片段,或包含上述的醫藥組成物,或上述的核酸分子,以預防或治療人IL-5相關的疾病。
本公開還提供上述單株抗體或其抗原結合片段,或包 含上述醫藥組成物,或上述核酸分子在製備與人IL-5相關的疾病的治療劑中的應用。
上述疾病或病症較佳哮喘、哮喘惡性發作、慢性肺炎、過敏性鼻炎、過敏性支氣管肺麯黴病、嗜酸粒細胞增多症、Churg-Strauss綜合症、特應性皮炎、盤尾絲蟲皮炎、間歇性血管水腫、嗜酸粒細胞性肌痛綜合症、嗜酸粒細胞性胃腸炎、蠕蟲感染、何傑金氏病、鼻息肉、Loeffler’s綜合征、蕁麻疹、嗜酸粒細胞過度增多性支氣管炎、結節性動脈炎、鼻竇炎、嗜酸粒細胞性食管炎、過敏性嗜酸粒細胞性食管炎、變應性結膜炎、盤尾絲蟲皮炎、子宮內膜異位、類固醇依賴性嗜酸細胞性支氣管炎。
本公開IL-5單株抗體或抗原結合片段具有很高的特異性、與IL-5的高親和力,人源化抗體的免疫原性大大降低,同時完全保留了鼠源抗體的特異性,較高的親和力和優異的體內外活性。
本公開IL-5單株抗體或抗原結合片段具有只特異性識別IL5的良好選擇性。
本公開IL-5單株抗體或抗原結合片段具有良好的大鼠上的代謝動力學特性,顯示出很長的半衰期,很高的生物利用度。
本公開IL-5人源化抗體分子具有良好的長期穩定性,無明顯異常化學修飾,高濃度下無明顯聚集,有較高的純度和熱穩定性。
本公開IL-5單株抗體或抗原結合片段除具有降低嗜 酸性粒細胞的增殖作用外,還具有良好的改善肺功能的特性。
第1圖為IL-5抗體阻斷IL-5結合IL-5受體的FACS實驗;第2圖為IL-5抗體與Th2細胞因子的結合特異性檢測;第3圖為IL-5抗體增強呼吸間歇值(Penh)水平。G1:正常對照組(PBS);G2:模型組(IgG);G3:h1705-008抗體10mpk組;G4:h1705-008抗體2mpk組;G5:h1706-009抗體10mpk組;G6:h1706-009抗體2mpk組;G7:Hu39D10 10mpk組;其中,*p<0.05,**<0.01(藉由ANOVA/Bonferroni與G2組進行比較);第4A圖為哮喘小鼠肺部BALF嗜酸性粒細胞水平;第4B圖為哮喘小鼠氣管黏膜厚度評分。G1:正常對照組;G2:模型組;G3:h1705-008抗體10mpk組;G4:h1705-008抗體2mpk組:G5:h1706-009抗體10mpk組;G6:h1706-009抗體2mpk組;G7:Hu39D10 10mpk組;第4C圖為哮喘小鼠肺部BALF嗜酸性粒細胞百分比;第5A圖和第5B圖為顯示IL5單抗降低BALF中嗜酸性粒細胞水平的能力。
為了更容易理解本公開,以下具體定義了某些技術和 科學術語。除非在本文中另有明確定義,本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本公開所述的“抗體”指免疫球蛋白,是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同,故其抗原性也不同。據此,可將免疫球蛋白分為五類,或稱為免疫球蛋白的同種型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別,又可分為不同的亞類,如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本公開中,本公開所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恒定區,該輕鏈恒定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本公開中,本公開所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恒定區,該重鏈恒定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大,為可變區(Fv區);靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定,為恒定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個 序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性,又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區和4個FR區組成,從胺基端到羧基端依次排列的順序為:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3;重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公開所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3,HCDR1-3)。
本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體,較佳人源化抗體。
術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的對人IL-5的單株抗體。製備時用IL-5抗原注射試驗對象,然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。在本公開一個較佳的實施方案中,該鼠源IL-5抗體或其抗原結合片段,可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區,或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恒定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”,是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恒定區融合而成的抗體,可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體,要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤,然後從鼠雜交瘤細胞中株可變區基因,再根據需要株人抗體的恒定區基因,將鼠可變區基因與人恒定區基因連接成嵌合基因後***表達載 體中,最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個具體的實施方案中,該IL-5嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區。該IL-5嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區,較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區,或者包含胺基酸突變(如YTE突變或回復突變)的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”,是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架,即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分,從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)中獲得,以及在Kabat,E.A.等人,1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時,引起的活性下降,可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變,以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本公開一個較佳的實施方案中,該IL-5人源化抗體中鼠的CDR序列選自SEQ ID NO:16至21、22至27、28至33、34至39或40至45;人的抗體可變區框架經過設計選擇,其中該抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列, 來源於人種系重鏈序列,和人種系輕鏈序列。為避免免疫原性下降的同時,引起的活性下降,可對該人抗體可變區可進行最少反向突變(回復突變,即將人抗體來源的FR區胺基酸殘基突變成原始來源抗體對應位置的胺基酸殘基),以保持活性。
CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基的變化而導致產生的IL-5抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此,可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人IL-5抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系,那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果,從而在結合中發揮重要作用。
術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如,IL-5)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來實現抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段;(ii)F(ab')2片段,包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段,(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段;(iv)由抗體的單臂的VH和VL結 構域組成的Fv片段;(v)單結構域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546),其由VH結構域組成;和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外,雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼,但可使用重組方法,藉由合成的接頭連接它們,從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv);參見,例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的一般技術獲得此類抗體片段,並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體,例如,IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。
本公開的抗原結合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)、包含CDR的肽等。
Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段,其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。
本公開的Fab可以藉由用木瓜蛋白酶處理本公開的特異性識別人IL-5並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外,可以藉由將編碼該抗體的Fab的DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產該Fab。
F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
本公開的F(ab')2可以藉由用胃蛋白酶處理本公開的特異性識別人IL-5並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外,可以藉由用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產該F(ab')2。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。本公開的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本公開的特異性識別IL-5並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的F(ab')2來生產。
此外,可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域;VH)和抗體輕鏈 可變結構域(或區域;VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構:NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成,例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immuno 1.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。
本公開的scFv可以藉由以下步驟來生產:獲得本公開的特異性識別人IL-5並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA,構建編碼scFv的DNA,將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中,然後將所述表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。
雙抗體是其中scFv被二聚體化的抗體片段,是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中,兩個抗原可以是相同或不同的。
本公開的雙抗體可以藉由以下步驟來生產:獲得本公開的特異性識別人IL-5並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA,構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少,將所述DNA***到原核生物表達載體或真核生 物表達載體中,然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。
dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
本公開的dsFv可以藉由以下步驟來生產:獲得本公開的特異性識別人IL-5並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA,構建編碼dsFv的DNA,將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中,然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。
包含CDR的肽是藉由包含VH或VL的CDR中的一個或多個區域而構成的。包含多個CDR的肽可以被直接相連或經由適合的肽接頭相連。
本公開的包含CDR的肽可以藉由以下步驟來生產:構建本公開的特異性識別人IL-5並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA,將該DNA***到原核生物表達載體或真核生物表達載體中,然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達所述肽。也可以藉由化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來生產所述包含CDR的肽。
本文中使用的術語“抗體框架”,是指可變結構域VL 或VH的一部分,其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講,其是不具有CDR的可變結構域。
術語“胺基酸差異”是指多肽與其變體之間,在多肽片段上某個或某些胺基酸位點之間的差異,其中變體可以由多肽上某個或某些位點經替換、***或缺失胺基酸獲得。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如,IL-5分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology,第66卷,G.E.Morris,Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常,抗體以大約小於10-8M,例如大約小於10-9M、10-10M、10-11M或更小的親和力(KD)結合。
術語"KD"是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常,本公開的抗體以小於大約10-7M,例如小於大約10-8M、10-9M或10-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合IL-5,例如,如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。
當術語“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時,意指在抗原結合蛋白之間競爭,其藉由以下測定法來測定:待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫學功能片段)防止或抑制 (例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如IL-5抗原或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭,這些測定例如:固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等,1983,Methodsin Enzymology 9:242-253);固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等,1986,J.Immunol.137:3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual(抗體,實驗室手冊),Cold Spring Harbor Press);用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等,1988,Molec.Immunol.25:7-15);固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung,等,1990,Virology176:546-552);和直接標記的RIA(Moldenhauer等,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常所述測定法涉及使用能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合的純化抗原(所述抗原在固態表面或細胞表面上)。在待測抗原結合蛋白存在下,測量結合於固態表面或細胞的標記的量,來測量競爭性抑制。通常,待測抗原結合蛋白是過量存在的。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括:與參考抗原結合蛋白相同的表位發生結合的抗原結合蛋白;以及,與充分接近參考抗原結合蛋白結合的表位所鄰近的表位發生結合的抗原結合蛋白,所述兩個表位在空間上互相妨礙結合的發生。 在本文實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時,其將抑制(例如降低)至少40至45%、45至50%、50至55%、55至60%、6至65%、65至70%、70至75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下,結合被抑制至少80至85%、85至90%、90至95%、95至97%或97%或更多。
本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的,但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時,核酸是“有效連接的”。例如,如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄,那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
術語“載體”是指能夠運輸與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中,載體是“質粒”,其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中,載體是病毒載體,其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如,具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組,從而隨宿主基因組一起複製(例如,非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法,如冷泉港的抗體實驗技術指南,5-8章和15章。例如,鼠可以用人IL-5或其片段免疫,所得到的抗體能被覆 性、純化,並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件,從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到,或者從免疫球蛋白雜誌,2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括微生物(例如細菌)、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員,例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株;芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如,編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列,可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術,哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化,特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人IL-5特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清 培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化。比如,用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體,用SDS-PAGE檢測抗體片段,收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體,也可以用一般方法去除,比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍,如-70℃,或者凍乾。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體時,是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸,以及試劑與流體的接觸,其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時,是指治療處理、預防或預防性措施,研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑,例如包含本公開的任一種抗體或其抗原結合片段的組合物或編碼抗體或其抗原結合片段的核酸分子,該患者具有一種或多種疾病症狀,而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常,在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑,以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床有測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的 治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化,例如患者的疾病狀態、年齡和體重,以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法,可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效,但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定,其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸,使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉,一般而言,多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁,(第4版))。另外,結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化:例如,待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途 徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時,例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時,那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如,在序列最佳比對時,如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源,那麼兩個序列為60%同源;如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源,那麼兩個序列為95%同源。一般而言,當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用,並且所有這類名稱都包括後代。因此,單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物,而不考慮轉移數目。還應當理解的是,由於故意或非有意的突變,所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下,其由上下文清楚可見。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說,需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息,使得可以設計寡核苷酸引物;這些引物在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引物的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51:263;Erlich編輯,(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例,但不是唯一的實例,所述方法包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶,以擴增或產生核酸的特定部分。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生,該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如,“視需要包含1至3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物,該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥,利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
此外,本公開包括用於治療與IL-5相關的疾病的藥劑,該藥劑包含本公開的單株抗體或其抗體片段作為活性成分。
對與IL-5相關的疾病沒有限制,只要它是與IL-5相關的疾病即可,例如利用本公開的分子誘導的治療反應可藉由結合人類IL-5然後阻遏或抑制嗜酸性粒細胞刺激作用而產生。因此,當處於適於治療應用的製備物和製劑中時,本公開的分子對這樣一些人是非常有用的,他們患有變態和/或特應性反應,或與嗜酸性粒細胞有關的反應,例如但不限於,哮喘、哮喘惡化、哮喘惡性發作、慢性肺炎、過敏性鼻炎、常年過敏性鼻炎、過敏性支氣管肺麯黴病、嗜酸粒細胞增多症、Churg-Strauss綜合症、特應性皮炎、盤尾絲蟲皮炎、間歇性血管水腫、嗜酸粒細胞性肌痛綜合症、嗜酸粒細胞性胃腸炎、蠕蟲感染、何傑金氏病、鼻息肉、Loeffler’s綜合症、蕁麻疹、嗜酸粒細胞過度增多性支氣管炎、結節性動脈炎、鼻竇炎、嗜酸粒細胞性食管炎、過敏性嗜酸粒細胞性食管炎、變應性結膜炎、盤尾絲蟲皮炎、子宮內膜異位、類固醇依賴性嗜酸細胞性支氣管炎等。在較佳的實施方案中,這種治療能抑制或減輕嗜酸性細胞的肺組織浸潤。抗體或其片段給予的次數可以從每日三次到每6個月一次,給予的途徑可以是靜脈、皮下、肌肉、胃腸外或局部途徑。
此外,本公開涉及用於免疫檢測或測定IL-5的方法、用於免疫檢測或測定IL-5的試劑、用於免疫檢測或測定表 達IL-5的細胞的方法和用於診斷與IL-5相關的疾病的診斷劑,其包含本公開的特異性識別人IL-5並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體或抗體片段作為活性成分。
在本公開中,用於檢測或測定IL-5的量的方法可以是任何已知方法。例如,它包括免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
上述與IL-5相關的疾病可以藉由用本公開的單株抗體或抗體片段檢測或測定表達IL-5的細胞來診斷。
為了檢測表達多肽的細胞,可以使用已知的免疫檢測方法,並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外,可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。
在本公開中,對用於檢測或測定IL-5的活體樣品沒有特別限制,只要它具有包含表達IL-5的細胞的可能性即可,例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法,含有本公開的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑 包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑,例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與所述標記對應的受質等。
以下結合實施例進一步描述本公開,但這些實施例並非限制著本公開的範圍。本公開實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照一般條件,如冷泉港的抗體技術實驗手冊,分子選殖手冊;或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑,為市場購買的一般試劑。
編碼帶His標簽的人IL-5,恒河猴IL-5,小鼠IL-5,大鼠IL-5,含人IgG1-Fc片段的人IL-5Rα受體胞外區融合蛋白序列裝到phr載體上,構建成表達質粒,然後轉染HEK293。待轉染第6天,取樣4500rpm離心10min收集細胞上清,將含重組的IL-5和IL-5α受體蛋白上清利用鎳管柱進行純化,重組的人IL-5-Fc融合蛋白利用Protein A親和層析柱進行純化。純化的蛋白可用於下述各實施例實驗中。具體抗原的蛋白序列如下:
為篩選有功能的抗體,本公開構建了表達IL-5α的CHO-S/IL-5α細胞株,以及同時表達IL-5α和IL-5β的CHO-S/IL-5α/IL-5β細胞株
具體為將人IL-5α全長基因(Q01344)選殖到哺乳動物細胞表達載體pTargeT上,將線性化質粒電轉染至CHO-S細胞中,經G418篩選2週,再進行2次有限稀釋。藉由 FACS檢測細胞表面的IL-5α基因,挑選出IL-5α表達量高的CHO-S/IL-5α細胞株,在此基礎上電轉染線性化的pcDNA3.1-IL-5β,經G418和zeocin篩選2週,再進行2次有限稀釋,藉由FACS檢測細胞表面的IL-5α和IL-5β基因,挑選出IL-5α和IL-5β表達量高的CHO-S/IL-5α/IL-5β細胞株。
用重組蛋白rhIL-5-his和弗氏佐劑CFA(Sigma,Lot# SLBQ1109V)、IFA(Sigma,Lot# SLBJ2845V)分高低兩個劑量100g/50g/50g和25g/12.5g/12.5g分別免疫兩組Balb/c(5隻/組)小鼠,四組SJL(5隻/組)小鼠。IL-5的特異性免疫反應由檢測血清效價的ELISA,配體受體阻斷實驗和TF-1增殖抑制實驗來測定。選取有較好特異性免疫反應的小鼠,處死後,取脾細胞,與骨髓瘤細胞融合。
初次篩選用針對人IL-5的ELISA結合實驗進行。當將融合瘤細胞轉移到24孔板後,用針對人、食蟹猴、小鼠IL-5的ELISA結合實驗,基於ELISA的針對IL-5的受體阻斷實驗和TF-1增殖抑制實驗,對其上清進行複篩。篩選出的陽性純株經過兩輪亞選植後,得到融合瘤純株,用於抗體生產,並藉由親和層析方法純化。
純化後的抗體分別進行了SEC-HPLC,內毒素含量檢測,biacore測定對各種屬IL-5的親和力,基於FACS的針對IL-5的受體阻斷實驗,和TF-1增殖抑制實驗,嗜酸性粒細胞的黏附實驗,以及小鼠哮喘模型和豚鼠體內中和模 型上的藥效評價,篩選出體內外活性好的單株融合瘤細胞株mAb1705、mAb1706、mAb1780、mAb1773和mAb1779。
從陽性融合瘤中選殖序列過程如下。收集對數生長期融合瘤細胞,用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA,用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序。得到mAb1705和mAb1706,mAb1780,mAb1773,mAb1779的重鏈和輕鏈可變區DNA序列對應的胺基酸序列(VH/VL CDR的胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並註釋):
其中各抗體輕重鏈中CDR序列如表1所示。
其Biacore活性檢測結果見表2。
結果顯示,本公開中的鼠源抗體與抗原親和力高。
4.1 IL-5-Flag-His重組蛋白的純化步驟:
將樣品高速離心去除雜質,並濃縮至適當體積。利用 PBS平衡NI-NTA親和管柱(QIAGEN,Cat No.30721),沖洗2至5倍管柱體積。將除雜後的細胞表達上清樣品上管柱。用PBS沖洗管柱,至A280讀數降至基線。用PBS沖洗管柱,沖洗雜蛋白,並收集。依次用洗滌緩衝液(咪唑20mM)和沖提緩衝液(咪唑300mM)沖提目的蛋白,並收集沖提峰。
收集的沖提液用離子交換(Hiload 16/600 superdex 200管柱)進一步純化。用PBS平衡2個管柱體積左右,保證pH7.4。將鑒定含目的蛋白的沖提緩衝液濃縮後上樣,收集樣品,SDS-PAGE和LC-MS鑒定為正確後分裝備用。
4.2 融合瘤表達抗體,Fc融合蛋白的純化
將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質,融合瘤表達上清用Protein G管柱,Fc融合蛋白表達上清用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱,至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0沖提目的蛋白,用1M Tris-HCl,pH8.0中和。沖提樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化,去聚體的峰收集好後分裝備用。
鼠源抗人IL-5單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之,鼠源抗體的恒定區替換為人恒定區,且將鼠源抗體的CDR移植到FR同源性最高人源模板上,並對FR區維持抗體構象和影響抗體與抗原結合的關鍵胺基酸進行回復突變來實現。
藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫,分別挑選與mAb-1705、mAb-1706、mAb1780、mAb1773和mAb1779抗體胺基酸序列同一性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為模板,將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中,形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。
人源FR區的選擇和關鍵胺基酸的回復突變
在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上,從人源germline數據庫中搜索輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)的同源序列,按FR的同源性由高到低排序,選取FR同源性最高的germline作為主要模板,將鼠源抗體的CDR區移植到人源模板上,然後以鼠源抗體的三維結構為基礎,藉由軟件對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基,以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變,並對化學不穩定胺基酸殘基優化,得到最終的人源化分子。
5.1 融合瘤純株mAb1705號人源化構架選擇
h1705的VH選取IGHV3-23*04作為模板,VL選取IGKV1-12*01作為模板,將mAb1705的CDR移植到人源模板上,並藉由軟件找出包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基並回復突變,設計出人源化抗體不同的輕鏈和重鏈可變區,如表3所示。
注:Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。如A43S表示依照胺基酸序列自然順序編號,將grafted的第43位A突變回S。
注:該表表示各種突變組合所得的序列。如h1705-007表示,人源化的鼠抗體h1705-007含輕鏈h1705_VL.1A、重鏈h1705_VH.1A兩種突變體。其它類推。
h1705號人源化抗體可變區具體序列如下:
將上述輕鏈可變區與如SEQ ID NO:53所示的輕鏈恒定區序列組合形成最終的完整重輕鏈序列。將各重鏈可變 區與如SEQ ID NO:52所示的重鏈恒定區組合形成最終的各重鏈序列。
人源化抗體恒定區序列
5.2 融合瘤純株mAb1706號人源化構架選擇
h1706的VH選取了IGHV3-23*04作為模板,VL選取了IGKV1-12*01作為模板,將鼠源抗體mab1706的CDR區移植到選擇的人源化模板上,並藉由軟體’找出包埋殘基、 與CDR區有直接相互作用的殘基並回復突變,設計出人源化抗體不同的輕鏈和重鏈可變區,如表5所示。
註:Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區。如A43S表示依照胺基酸序列的自然順序編號,將grafted的第43位A突變回S。
將設計的人源化分子按下表組合成不同的分子,如表6所示。
h1706號人源化抗體可變區具體序列如下:
將上述輕鏈可變區與如SEQ ID NO:53所示的輕鏈恒定區序列組合形成最終的完整重輕鏈序列。將各重鏈可變 區與如SEQ ID NO:52所示的重鏈恒定區組合形成最終的各重鏈序列。
5.3 融合瘤純株mAb 1780號人源化構架選擇
h1780的VH選取了IGHV1-2*02作為模板,VL選取了IGKV3-11*01作為模板,將鼠源抗體mAb1780的CDR區移植到選擇的人源化模板上,並藉由軟體找出包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基並回復突變,設計出人源化抗體不同的輕鏈和重鏈可變區,如表7所示。
註:Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區。如E1D表示依照胺基酸序列的自然順序編號,將grafted的第1位E突變回D。
將設計的人源化分子按下表組合成不同的分子,如表8所示。
h1780號人源化抗體可變區具體序列如下:
將上述輕鏈可變區與如SEQ ID NO:53所示的輕鏈恒定區序列組合形成最終的完整重輕鏈序列。將各重鏈可變區與如SEQ ID NO:52所示的重鏈恒定區組合形成最終的各重鏈序列。
5.4 融合瘤純株mAb1773號人源化構架選擇
h1773的VH選取了IGHV3-73*01作為模板,VL選取了IGKV1-39*01作為模板,將鼠源抗體mab1773的CDR區移植到選擇的人源化模板上,並藉由軟體找出包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基並回復突變,設計出人源化抗體不同的輕鏈和重鏈可變區,如表9所示。同時,為消除CDR區的異構化位點,將h1773的HCDR2(RIDPANGDTK HGPKFQG)中N突變為V(即N55V),形成 HCDR2變化(位點突變後的HCDR2序列為SEQ ID NO:82:RIDPAVGDTKHGPKFQG)的重鏈可變區和抗體。
註:Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區。如M4L表示依照胺基酸序列的自然順序編號,將grafted的第4位M突變回L。
將設計的人源化分子按下表組合成不同的分子,如表10所示。
h1773號人源化抗體可變區具體序列如下:
將上述輕鏈可變區與如SEQ ID NO:53所示的輕鏈恒定區序列組合形成最終的完整重輕鏈序列。將各重鏈可變區與如SEQ ID NO:52所示的重鏈恒定區組合形成最終的各重鏈序列。
5.5 融合瘤純株mAb1779號人源化構架選擇
h1779的VH選取了IGHV1-2*02作為模板,VL選取 了IGKV1-33*01作為模板,將鼠源抗體h1779的CDR區移植到選擇的人源化模板上,並藉由軟體找出包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基並回復突變,設計出人源化抗體不同的輕鏈和重鏈可變區,如表11所示。
註:Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區。如A43S表示依照胺基酸序列的自然順序編號,將grafted的第43位A突變回S。
將設計的人源化分子按下表組合成不同的分子,如表12所示。
h1779號人源化抗體可變區具體序列如下:
將上述輕鏈可變區與如SEQ ID NO:53所示的輕鏈恒定區序列組合形成最終的完整重輕鏈序列。將各重鏈可變區與如SEQ ID NO:52所示的重鏈恒定區組合形成最終的各重鏈序列。
同時,本公開將WO2012083370A1中針對IL5的抗體 Hu39D10作為陽性對照,其重鏈和輕鏈序列如SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81所示。
1. 重組嵌合抗體的分子選殖
融合瘤篩選所獲得的陽性抗體分子經過測序後,得到可變區編碼基因序列。以測序所得序列設計首尾引子,以測序基因為模板,經過PCR搭建各抗體VH/VK基因片段,再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG1/hkappa恒定區基因(CH1-Fc/CL)片段)進行同源重組,構建重組嵌合抗體全長表達質粒VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr,形成Ch1705、Ch1706、Ch1780、Ch1773和Ch1779五個嵌合抗體。
2. 人源化抗體的分子選殖
人源化設計之後的抗體序列,經過密碼子優化後產生人密碼子偏好的編碼基因序列,設計引子PCR搭建各抗體VH/VK基因片段,再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG1/hkappa恒定區基因(CH1-Fc/CL)片段)進行同源重組,構建人源化抗體全長表達質粒VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr。
3. 重組嵌合抗體以及人源化抗體的表達與純化
分別表達抗體輕重鏈的質粒以1:1.2的比例轉染HEK293E細胞,6天後收集表達上清,高速離心去除雜質,用protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱,至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性沖提液沖提目的蛋白,用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。沖提樣品適當濃縮後,利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化,以去除聚體,收集單體峰,分裝備用。
以下用測試方法驗證本公開抗體性能及有益效果。
用Biacore T200(GE)儀器測定待測鼠源IL-5抗體和人IL-5的親和力。
用Protein A生物傳感芯片親和捕獲待測分子,然後於芯片表面流經抗原(實施例1製備所得的重組人,猴,鼠IL5),用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後,用甘胺酸-鹽酸再生溶液(pH 1.5)將生物傳感芯片洗淨再生。用BIAevaluation version 4.1,GE軟件以(1:1)Langmuir模型擬合數據,得出親和力數值,如表13所示。
本實施例證明,本公開的抗體mAb1705、mAb1706、mAb1780、mAb1773和mAb1779與不同種屬(人、猴)的IL-5均有較高的親和力。
用Biacore T200(GE)儀器測定待測人源化IL-5抗體和 人IL-5的親和力。
用Protein A生物傳感芯片親和捕獲待測分子,然後於芯片表面流經抗原(實施例1製備所得),用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後,用甘胺酸-鹽酸再生溶液(pH 1.5)將生物傳感芯片洗淨再生。用BIAevaluation version 4.1,GE軟件以(1:1)Langmuir模型擬合數據,得出親和力數值,如表14所示。
結果顯示,人源化IL-5抗體與人IL-5仍均有較高的 親和力(除h1705的各人源化突變體外,其他鼠源抗體的人源化改造突變體僅提供示例性數據)。
為鑒定IL-5抗體阻斷IL-5結合到重組表達的IL-5α受體蛋白胞外區的能力。將IL-5(5μg/ml in PBS)包被ELISA板,37℃孵育1小時,棄去液體後,加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶封閉液200μl/孔,37℃孵育箱孵育2.5小時進行封閉。封閉結束後,棄去封閉液,並用PBST緩衝液(pH7.4PBS含0.05% Tween-20)洗板5次後,先加入25μl用生物素標記試劑盒(東仁化學,LK03)標記的10μg/ml的IL-5Rα(in 1%BSA),再加入25μl梯度稀釋的抗體,抗體和IL-5Rα競爭結合IL-5,37℃孵育1小時。孵育結束後,棄去酶標板中的反應液,用PBST洗板5次後,加入50μl/孔用樣品稀釋液以1:600濃度稀釋的Streptavidin-Peroxidase Polymer(Sigma,S2438-250UG)於37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後,加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL,52-00-03),於室溫孵育3至10min,加入50μl/孔1M H2SO4終止反應,用NOVOStar酶標儀在450nm處讀取吸收值,計算IL-5抗體阻斷IL-5與IL-5Rα結合的IC50值,結果如表15所示,本公開兩個抗體均可有效抑制IL-5與其受體的結合。
為了鑒定篩選到的IL-5抗體可以阻斷細胞表面的IL-5受體,我們構建了高表達IL-5Rα/β的兩種受體的CHOS重組細胞系。本實驗鑒定IL-5抗體可以分別阻斷IL-5結合到CHOS細胞系表面的重組IL-5α/β受體。
具體方法:用含100ng/ml G418,25ng/ml zeozin的CD-CHO來培養CHO-S-IL-5Rα和β,細胞培養過程中,濃度不要超過3×106cell/ml。將狀態良好的IL-5Rα/β-CHOS細胞離心(1000rpm,5min),用10%FBS的PBS洗一遍,並且計數,將細胞濃度調整濃度至4×106cell/ml,取25μl加入到圓底的96孔板中。用含10% FBS的PBS溶液稀釋待測抗體,初始濃度為200μg/ml,按1:10倍比稀釋8個梯度。將25μl 100ng/ml的用生物素標記試劑盒(東仁化學,LK03)標記的IL-5和50μl稀釋的各濃度抗體混合均勻,加到已加入細胞的96孔板中,在4℃孵育1小時。孵育結束後,4℃離心(400g,5min),棄掉上清,用200μl的預冷PBS離心洗滌,重複兩次後加入1:1333稀釋的PE-Avidin二抗,4℃避光孵育40min後,4℃離心(400g, 5min,棄掉上清,加入200μl的預冷PBS,吹起細胞,4℃離心洗滌,重複三次,加入100μl PBS,上機讀板,根據螢光信號值計算IL-5抗體阻斷IL-5與IL-5Rα/β結合的IC50值。結果如表16和第1圖所示。
結果顯示,抗體h1705-008,h1706-009、h1780-017、h1773-007、h1779-014顯示出較強的阻斷IL-5結合到細胞表面IL-5受體的能力。
IL-5可以誘導TF-1細胞增殖,IL-5抗體可以阻止IL-5對TF-1細胞的刺激增殖作用。
具體為:TF-1細胞(ATCC,CRL-2003)培養於10%FBS以及2ng/mL rhGM-CSF(聯科生物,Catalog No.96-AF-300-03-20)的RPMI1640,放置於37℃,5% CO2培養箱中,細胞密度不超過1×106個/ml。檢測抗體時,取對數生長期的細胞用PBS洗三遍800rpm離心5min,用RPMI1640(FBS:2%,重組人IL-5:10ng/ml)調整細胞密度6000個/孔/90μl,並加入10μl梯度稀釋的待測抗體到96孔培養3d後,加入30μl cell titer混勻後進行檢測,根據讀值計算IC50。檢測結果如下表17所示。
IL5可以誘導嗜酸性粒細胞的分化,成熟,遷移和活化,引起呼吸道炎症而導致哮喘。本實驗利用IL-5細胞因子能夠促進嗜酸性粒細胞黏附並使之激活的原理,收集和純化來源於人外周全血的嗜酸性粒細胞來測試IL-5特異性抗體對IL-5該通路的阻斷作用,在體外檢測IL-5抗體對IL5介導的嗜酸性粒細胞數黏附效果的阻斷。
具體為:人外周全血用含2mM EDTA的PBS稀釋5倍,採用PercollTM(密度梯度為1.088)分離單核細胞和粒細胞,小心吸取含有粒細胞的紅細胞層,利用紅細胞裂解液去除紅細胞;將剩餘的細胞計數,按比例加人帶有CD16抗體的分離磁珠(美天旎,Catalog No.130-045-701),孵育 30min後過磁珠管柱,負選收集直接流出細胞亞群即主要為嗜酸性粒細胞。分離得到的嗜酸性粒細胞計數,加入預先以IgG抗體包被的96孔細胞培養板內,每孔約1×104個,加人IL-5(20ng/ml),以及不同濃度的IL-5抗體分子(10μg/ml起始,3倍稀釋,10個濃度點);細胞培養板置於37℃,5% CO2培養箱孵育1h,取出培養板,加入0.3% CTAB裂解細胞,最後加入過氧化物酶反應受質TMB顯色反應,酶標儀讀取OD450吸收值。最大吸附值為只加IL-5孔讀值,不加IL-5及抗體藥物孔為背景對照,計算各濃度下抗體藥物相對於最大吸附孔的抑制值=(最大吸附值-[抗體藥物])/(最大吸附值-背景對照值)×100%,計算IC50。結果如下表18:
結果表明,本公開的人源化抗體顯示較強的抑制IL5介導的嗜酸性粒細胞黏附的能力。
IL-5是Th2細胞因子中的一種,為了驗證IL-5抗體只特異性針對IL-5而與其他細胞因子沒有交叉反應,用Fortebio檢測了12種Th2以及相關細胞因子,包括IL2(R&D,202-IL-010/CF)、IL4(R&D,204-IL-050/CF)、IL-5(R&D,205-IL-025/CF)、IFNgamma、IL6(R&D,7270-IL- 025/CF)、IL9(R&D,209-IL-010/CF)、IL10(R&D,217-IL-025/CF)、IL13(R&D,213-ILB-025/CF)、IL25(R&D,8134-IL-025/CF)、IL31(R&D,2824-IL-010/CF),以及與IL-5共用α受體的IL3(203-IL-050/CF)和GMCSF(R&D,215-GM-010/CF)。
具體為:用Protein A Biosensor(PALL Fortebio,18-5010)來捕獲抗體,記錄捕獲信號,然後再進樣40nM各細胞因子,記錄新的結合信號。最後將與IL-5的結合信號定義為100%,看其他細胞因子與抗體的的結合信號,結果如第2圖所示。
結果顯示,12種相關細胞因子中,IL-5人源化抗體h1705-008和h1706-009只特異性結合IL-5,與其他Th2細胞因子無交叉反應。
實驗用SD大鼠(由西普爾-必凱實驗動物有限公司提供)18隻,雄性,每組3隻,平均分成6組;靜脈注射及皮下注射給藥Hu39D10、h1705-008及h1706-009;另外9隻SD大鼠僅靜脈注射給藥h1773-007、h1779-014、h1780-017。靜脈給藥組於給藥前及給藥後5min、8h、1d、2d、4d、7d、10d、14d、21d、28d採集全血0.2ml,不加抗凝,取血後在4℃放置30min,1000g離心15min,取上清(血清)置於EP管中,於-80℃保存;皮下注射給藥組於給藥前及給藥後1h、2h、4h、8h、1d、2d、4d、7d、10d、 14d、21d、28d採集全血,採用Elisa測定血清中的抗體濃度。
結果表明,本公開人源化抗體分子在大鼠體內半衰期長,生物利用度高。
本測試是基於氣道炎性反應以及氣道重塑來評估IL-5抗體在卵清蛋白(OVA)氣霧誘導的BALB/c小鼠哮喘模型中的藥效。
小鼠根據體重隨機分成7組,每組10隻小鼠:正常對照組(G1);模型組(G2);2個測試抗體h1705-008(G3和G4)和h1706-009(G5和G6),每個測試抗體2個劑量(10mpk和2mpk)的治療組;以及陽性抗體Hu39D10對照組(G7,10mpk)。在第1天和第14天,對所有小鼠腹腔注射致敏 溶液進行致敏。在第28、29、30天,用OVA攻擊溶液對第一組外的其他六組小鼠進行氣霧攻擊30分鐘。攻擊前2小時,第二組(G2)腹腔注射磷酸緩衝液,第三組至第七組(G3-G7)小鼠腹腔注射不同劑量的不同抗體,一天一次,連續三天。每次注射前配製新鮮的測試抗體,配製完成至給藥半小時內完成。第一組的小鼠作為正常對照組用PBS進行氣霧攻擊30分鐘,攻擊前2小時腹腔注射磷酸緩衝液,一天一次,連續三天。
在第31天,使用WBP系統對動物進行氣道高反應性的檢測。所有動物均用霧化吸入1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50mg/mL倍增濃度的乙醯甲膽鹼,測定相應濃度下的增強呼氣間歇值。
在第31天,WBP系統檢測氣道反應1小時後,直徑1.2毫米的氣管插管***氣管內並且固定,肺將被灌洗兩次,每次0.8毫升的磷酸緩衝液含1%的BSA和0.6mM的EDTA。記錄灌洗液的回收體積。
將BALF在4攝氏度300g下離心5分鐘,上清液保留用於細胞因子分析。離心後,細胞重懸在1.5毫升的PBS裡(含1%的BSA和0.6mM的EDTA)進行細胞計數。藉由血球計數器和台盼藍染色實驗對BALF中的總細胞數進行計數。細胞塗片後,萊特染色液染色一分鐘,接著用吉姆沙染色7分鐘,從而區分出嗜酸細胞、中性白細胞、巨噬細胞和淋巴細胞。在光學顯微鏡下計數。
灌洗後,收集肺組織並用10%的中性甲醛溶液浸染, 然後固定在10%的中性甲醛溶液中。固定的組織進行石蠟包埋,切邊,H&E染色,評分。測試結果如第3圖和第4A圖、第4B圖所示。
結果顯示,本公開中抗體分子h1705-008和h1706-009可明顯提高肺功能,且作用方式呈劑量依賴模式,而高劑量(10mpk)的陽性化合物卻不能改善肺功能(參見第3圖)。同時,兩個抗體顯著降低了嗜酸性粒細胞水平和黏膜厚度,在同樣劑量下(10mpk)顯示出比陽性抗體更強的降低嗜酸性粒細胞的能力(參見第4A和4B圖)。而在同樣類型小鼠哮喘模型中,重複實驗也同樣驗證了1mg/ml的h1705-008、h1706-009和h1780-017均比陽性抗體更顯著地降低BalF中的嗜酸性粒細胞水平(參見第4C圖)。
本實驗選用雄性豚鼠建立人IL5誘導的急性哮喘模型,以hu39D10為陽性抗體,評估本公開5個IL-5人源化單抗對人IL5誘導的豚鼠肺支氣管灌流液(BALF)中的嗜酸性粒細胞增加是否有抑制作用。豚鼠共分為9組,每組8至10隻:正常對照組、模型組、hu39D10(1mg/kg)組、h1705-008(1mg/kg)組、h1706-009(1mg/kg)組、h1780-017(1mg/kg)組、h1773-007(1mg/kg)組和h1779-014(1mg/kg)組。其中模型組和給藥組豚鼠分別於第1天氣管注射100μl human IL5(含IL5抗原5μg)激發,正常對照組氣管注射PBS。給藥組激發前2小時腹腔注射分別給予1mg/kg上 述IL5單抗,給藥體積為5ml/kg,模型組給予相應的IgG抗體,正常對照組腹腔給予PBS溶劑。氣管注射後24h後麻醉豚鼠抽取肺支氣管灌流液,待細胞濃度調整至5^106/ml時取15μl滴在載玻片上,晾乾固定後進行HE染色,400倍鏡下計數細胞總數和嗜酸性粒細胞數並計算嗜酸性粒細胞百分比。結果如第5A圖和第5B圖所示,表明本公開5個人源化抗體均可以顯著降低BALF中嗜酸性粒細胞水平。
1.抗體的化學穩定性
脫醯胺修飾是抗體中可能影響後期穩定性的一種常見的化學修飾,尤其是CDR區域的部分胺基酸高度脫醯胺、氧化或者異構化修飾一般選擇儘量避免或者突變降低。將100μg不同時間點取樣的樣品溶於100μl 0.2M His-HCl,8M Gua-HCl,pH 6.0溶液中,加3μl 0.1g/mL DTT,50℃水浴1小時,後用0.02M His-HCl,pH 6.0的溶液超濾兩次,加入3μl 0.25mg/mL的trypsin,37℃水浴酶解過夜,Agilent 6530 Q-TOF進行LC-MS檢測分析。結果顯示,本公開人源化抗體的化學穩定性良好,在40℃ 529緩衝液體系加速一個月後,抗體未發生異常修飾。
2.高濃度條件下抗體聚集程度考察
對待測抗體在高濃度及不同緩衝體系及不同溫度條件下進行一個月穩定性評價,濃度在50mg/ml,在PB9、 His和529三種體系中考察40℃、25℃、4℃及-80℃反復凍融的穩定性,以SEC-HPLC進行聚集程度監控。使用Waters e2695色譜儀,色譜柱為Waters Xbridge BEH 200A SEC,流動相為PBS(用稀鹽酸調節pH至6.8),進樣50μg蛋白,等度沖提,流速為0.5mL/min。經考察,IL-5人源化抗體在高濃度條件下所有抗體均未發生明顯聚集。40℃加速4週後,在三種體系中抗體單體純度均大於95%。
3.高濃度條件下抗體純度考察
對待測抗體在高濃度及不同緩衝體系及不同溫度條件下進行一個月穩定性評價,濃度在50mg/ml,在His體系中考察40℃的穩定性,以CE-SDS進行純度監控。取100μg蛋白,加入sample buffer至95μl,若採用還原模式分析,加入5μl二巰基乙醇;若採用非還原模式分析,加入5μl IAA,70℃水浴反應10min,離心後取上清進樣。使用Beckman PA800plus電泳儀採集數據並分析結果。經考察,抗體蛋白在高濃度條件下純度穩定性良好,在40℃加速28天後,CE-SDS分析顯示抗體主峰僅降低2%。
4.利用UNIT檢測不同抗體的熱穩定性
將樣品置換到對應緩衝液(PBS buffer)中,控制樣品濃度在1mg/ml左右,上樣9μl。參數設置:起始溫度20℃;孵育0s;升溫速度0.3℃/min;Plate Hold 5s;終止溫度95℃。檢測抗體的Tm值,抗體有較高的Tm值,顯示出良好的熱穩定性。
雖然為了清楚的理解,已經借助於圖式和實例詳細描 述了上述發明,但是描述和實例不應當解釋為限制本公開的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地清楚結合。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司
<120> IL-5抗體、其抗原結合片段及醫藥用途
<130> 370337CG
<160> 82
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶his標簽的人IL-5胺基酸序列(rhIL-5-his)
<210> 2
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶his標簽的食蟹猴IL-5胺基酸序列
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶his標簽的小鼠IL-5胺基酸序列
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶his標簽的大鼠IL-5胺基酸序列
<210> 5
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合人Fc片段的人IL-5α受體胺基酸序列
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1705鼠源重鏈可變區
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1705鼠源輕鏈可變區
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1706鼠源重鏈可變區序列
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1706鼠源輕鏈可變區序列
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1780鼠源重鏈可變區序列
<210> 11
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1780鼠源輕鏈可變區序列
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1773鼠源重鏈可變區序列
<210> 13
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1773鼠源輕鏈可變區序列
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1779鼠源重鏈可變區序列
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1779鼠源輕鏈可變區序列
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1705 HCDR1
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1705 HCDR2
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1705 HCDR3
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1705 LCDR1
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1705 LCDR2
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1705 LCDR3
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1706 HCDR1
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1706 HCDR2
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1706 HCDR3
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1706 LCDR1
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1706 LCDR2
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1706 LCDR3
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1780 HCDR1
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1780 HCDR2
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1780 HCDR3
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1780 LCDR1
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1780 LCDR2
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1780 LCDR3
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1773 HCDR1
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1773 HCDR2
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1773 HCDR3
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1773 LCDR1
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1773 LCDR2
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1773 LCDR3
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1779 HCDR1
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1779 HCDR2
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1779 HCDR3
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1779 LCDR1
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1779 LCDR2
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1779 LCDR3
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1705_VL.1
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1705_VL.1A
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1705_VL.1B
<210> 49
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1705_VH.1
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1705_VH.1A
<210> 51
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1705_VH.1B
<210> 52
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈IgG1恒定區
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈kappa恒定區
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1706_VL.1
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1706_VL.1A
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1706_VL.1B
<210> 57
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1706_VH.1
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1706_VH.1A
<210> 59
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1706_VH.1B
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1780_VL.1
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1780_VL.1A
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1780_VL.1B
<210> 63
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1780_VH.1
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1780_VH.1A
<210> 65
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1780_VH.1B
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1780_VH.1C
<210> 67
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1773_VL.1
<210> 68
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1773_VL.1A
<210> 69
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1773_VH.1
<210> 70
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1773_VH.1A
<210> 71
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1773_VH.1B
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1779_VL.1
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1779_VL.1A
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1779_VL.1B
<210> 75
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1779_VH.1
<210> 76
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1779_VH.1A
<210> 77
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1779_VH.1B
<210> 78
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1779_VH.1C
<210> 79
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1779_VH.1D
<210> 80
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu39D10的重鏈序列
<210> 81
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu39D10的輕鏈序列
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h1773抗體重鏈HCDR2變體
Claims (26)
- 一種單株抗體或其抗原結合片段,該單株抗體或其抗原結合片段特異性結合人IL-5,該單株抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中:(i)重鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:16、17和18胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:19、20和21胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區;或(ii)重鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:22、23和24胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3區,輕鏈可變區包含選自如SEQ ID NO:25、26和27胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。
- 如申請專利範圍第1項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該單株抗體是重組抗體。
- 如申請專利範圍第2項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該單株抗體是選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體。
- 如申請專利範圍第2項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體含有SEQ ID NO:49或57所示的重鏈可變區或其變體。
- 如申請專利範圍第4項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該變體是在SEQ ID NO:49或57所示的重鏈可變區的FR區位置上具有1至10個胺基酸的回 復突變。
- 如申請專利範圍第5項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該回復突變是在SEQ ID NO:49所示的重鏈可變區上選自S49T、V93T和K98S或其組合的胺基酸回復突變,或該回復突變是在SEQ ID NO:57所示的重鏈可變區上選自S49T、V93T和K98T或其組合的胺基酸回復突變。
- 如申請專利範圍第5或6項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體包含選自SEQ ID NO:50或51所示的重鏈可變區,或包含選自SEQ ID NO:58或59所示的重鏈可變區。
- 如申請專利範圍第2項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體含有SEQ ID NO:46或54所示的輕鏈可變區或其變體。
- 如申請專利範圍第8項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該變體是在SEQ ID NO:46或54所示的輕鏈可變區的FR區位置上具有1至10個胺基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第9項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該變體回復突變選自在SEQ ID NO:46所示的輕鏈可變區上的A43S、L47V、G66R、T69S、F71Y和Y87F或其組合的胺基酸回復突變;或在SEQ ID NO:54所示的輕鏈可變區上的A43S、L47M、F71Y和Y87F或其組合的胺基酸回復突變。
- 如申請專利範圍第9或10項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體包含選自SEQ ID NO:47或48所示的輕鏈可變區;或包含選自SEQ ID NO:55或56所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第1項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該人源化抗體包含:選自SEQ ID NO:49、50和51中任一個所示的重鏈可變區和選自SEQ ID NO:46、47和48中任一個所示的輕鏈可變區;或選自SEQ ID NO:57、58和59中任一個所示的重鏈可變區和選自SEQ ID NO:54、55和56中任一個所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第1項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體為全長抗體,進一步包括人抗體恒定區。
- 如申請專利範圍第13項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體為全長抗體,進一步包含SEQ ID NO:52所示的人抗體重鏈恒定區和SEQ ID NO:53所示的人輕鏈恒定區。
- 如申請專利範圍第1項所述的單株抗體或其抗原結合片段,其中,該抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
- 一種醫藥組成物,其含有治療有效量的如申請專利範圍 第1至15項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段,以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
- 一種分離的核酸分子,其編碼申請專利範圍第1至15項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段。
- 一種重組載體,其包申請專利範圍第17項所述的分離的核酸分子。
- 一種用如申請專利範圍第18項所述的重組載體轉化的宿主細胞,該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
- 如申請專利範圍第19項所述的宿主細胞,其中,該宿主細胞為真核細胞。
- 如申請專利範圍第20項所述的宿主細胞,其中,該宿主細胞為哺乳動物細胞。
- 一種用於生產申請專利範圍第1至15項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括將申請專利範圍第19至21中任一項所述的宿主細胞在培養基中進行培養以形成並積累申請專利範圍第1至15項中任一項的單株抗體或其抗原結合片段,以及從培養物回收所述單株抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於體外檢測或測定人IL-5的方法,該方法包括使用申請專利範圍第1至15項中任一項的單株抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於檢測或測定人IL-5的試劑,該試劑包含申請專利範圍第1至15項中任一項所述的單株抗體或其抗 原結合片段。
- 一種申請專利範圍第1至15項中任一項的單株抗體或其抗原結合片段,或申請專利範圍第16項所述的醫藥組成物,或申請專利範圍第17項所述的分離的核酸分子或其組合的用途,其用在製備治療或預防疾病或病症的藥物,其中該疾病或病症是人IL-5相關疾病。
- 如申請專利範圍第25項所述的用途,其中該疾病為哮喘、哮喘惡性發作、慢性肺炎、過敏性鼻炎、過敏性支氣管肺麯黴病、嗜酸粒細胞增多症、Churg-Strauss綜合症、特應性皮炎、盤尾絲蟲皮炎、間歇性血管水腫、嗜酸粒細胞性肌痛綜合症、嗜酸粒細胞性胃腸炎、蠕蟲感染、何傑金氏病、鼻息肉、Loeffler’s綜合症、蕁麻疹、嗜酸粒細胞過度增多性支氣管炎、結節性動脈炎、鼻竇炎、嗜酸粒細胞性食管炎、過敏性嗜酸粒細胞性食管炎、變應性結膜炎、盤尾絲蟲皮炎、子宮內膜異位、類固醇依賴性嗜酸細胞性支氣管炎。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710906068 | 2017-09-29 | ||
??201710906068.X | 2017-09-29 | ||
CN201710906068.X | 2017-09-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201915022A TW201915022A (zh) | 2019-04-16 |
TWI801425B true TWI801425B (zh) | 2023-05-11 |
Family
ID=65900695
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW107134416A TWI801425B (zh) | 2017-09-29 | 2018-09-28 | Il-5 抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11365247B2 (zh) |
EP (1) | EP3689906A4 (zh) |
JP (1) | JP7307720B2 (zh) |
KR (1) | KR20200059239A (zh) |
CN (1) | CN111065651B (zh) |
AU (1) | AU2018340557A1 (zh) |
BR (1) | BR112020005766A2 (zh) |
CA (1) | CA3076941A1 (zh) |
MX (1) | MX2020003034A (zh) |
TW (1) | TWI801425B (zh) |
WO (1) | WO2019062831A1 (zh) |
ZA (1) | ZA202001807B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113507938B (zh) * | 2019-03-29 | 2024-04-16 | 广东恒瑞医药有限公司 | 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5683892A (en) * | 1994-12-23 | 1997-11-04 | Smithkline Beecham Corporation | DNA encoding recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
HUT67943A (en) | 1992-02-06 | 1995-05-29 | Schering Corp | Design, cloning and expression of humanized monoclonal antibodies against human interleukin-5 |
GB9412230D0 (en) | 1994-06-17 | 1994-08-10 | Celltech Ltd | Interleukin-5 specific recombiant antibodies |
MX9704779A (es) | 1994-12-23 | 1997-09-30 | Smithkline Beecham Corp | Antagonistas de interleukina-5 recombinante, utiles en la preparacion de composiciones para el tratamiento de perturbaciones mediadas por interleukina-5. |
US7399837B2 (en) | 1995-12-22 | 2008-07-15 | Smithkline Beecham Corporation | Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders |
CA2479927C (en) | 2002-03-29 | 2013-03-12 | Schering Corporation | Human monoclonal antibodies to interleukin-5 and methods and compositions comprising same |
JP4954709B2 (ja) | 2004-10-28 | 2012-06-20 | 協和発酵キリン株式会社 | 子宮内膜症治療剤 |
WO2009068649A2 (en) * | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding constructs |
CN101883862A (zh) * | 2007-12-03 | 2010-11-10 | 爱德芳世株式会社 | 抗体制备方法 |
PT2654790T (pt) | 2010-12-22 | 2019-05-16 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anticorpo modificado com semivida melhorada |
EP2710370A4 (en) | 2011-05-18 | 2015-01-07 | Medimmune Llc | METHODS OF DIAGNOSING AND TREATING PULMONARY DISEASES OR DISORDERS |
EP3083682B1 (en) | 2013-12-20 | 2024-04-17 | F. Hoffmann-La Roche AG | Dual specific antibodies |
ES2811124T3 (es) | 2014-09-08 | 2021-03-10 | Cephalon Inc | Uso de reslizumab para tratar el asma eosinofílica moderada a grave |
CA2996088A1 (en) | 2015-08-24 | 2017-03-02 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited | Biopharmaceutical compositions |
-
2018
- 2018-09-28 TW TW107134416A patent/TWI801425B/zh active
- 2018-09-28 MX MX2020003034A patent/MX2020003034A/es unknown
- 2018-09-28 KR KR1020207010252A patent/KR20200059239A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-09-28 WO PCT/CN2018/108240 patent/WO2019062831A1/zh unknown
- 2018-09-28 US US16/651,639 patent/US11365247B2/en active Active
- 2018-09-28 EP EP18860941.6A patent/EP3689906A4/en active Pending
- 2018-09-28 BR BR112020005766-5A patent/BR112020005766A2/pt unknown
- 2018-09-28 AU AU2018340557A patent/AU2018340557A1/en active Pending
- 2018-09-28 CA CA3076941A patent/CA3076941A1/en active Pending
- 2018-09-28 CN CN201880058448.5A patent/CN111065651B/zh active Active
- 2018-09-28 JP JP2020517497A patent/JP7307720B2/ja active Active
-
2020
- 2020-03-23 ZA ZA2020/01807A patent/ZA202001807B/en unknown
-
2022
- 2022-05-18 US US17/747,627 patent/US20220356239A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5683892A (en) * | 1994-12-23 | 1997-11-04 | Smithkline Beecham Corporation | DNA encoding recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
期刊 Yaghoub Safdari, et al., "Antibody humanization methods – a review and update", Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Vol. 29, No. 2, 無, 02 August 2013, pages 175 - 186. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2021502801A (ja) | 2021-02-04 |
AU2018340557A1 (en) | 2020-04-09 |
MX2020003034A (es) | 2020-07-22 |
ZA202001807B (en) | 2022-09-28 |
CN111065651B (zh) | 2023-07-14 |
BR112020005766A2 (pt) | 2020-10-13 |
RU2020112984A (ru) | 2021-10-29 |
JP7307720B2 (ja) | 2023-07-12 |
US11365247B2 (en) | 2022-06-21 |
US20220356239A1 (en) | 2022-11-10 |
CA3076941A1 (en) | 2019-04-04 |
CN111065651A (zh) | 2020-04-24 |
EP3689906A1 (en) | 2020-08-05 |
RU2020112984A3 (zh) | 2021-11-25 |
WO2019062831A1 (zh) | 2019-04-04 |
KR20200059239A (ko) | 2020-05-28 |
EP3689906A4 (en) | 2021-04-07 |
US20200262909A1 (en) | 2020-08-20 |
TW201915022A (zh) | 2019-04-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109937212B (zh) | B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
TWI679211B (zh) | 抗il-33抗體和彼之組成物、方法及用途 | |
EP3981788A1 (en) | Antibody capable of binding to thymic stromal lymphopoietin and use thereof | |
CN112513090B (zh) | 结合人il-4r的抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
CN112513089A (zh) | 抗cd73抗体、其抗原结合片段及应用 | |
WO2021139758A1 (zh) | 新型多肽复合物 | |
US20230138315A1 (en) | Anti-angptl3 antibody and use thereof | |
WO2022105772A1 (zh) | 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途 | |
TW201831512A (zh) | Tim-3抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 | |
EP3683234A1 (en) | Il-6r antibody and antigen binding fragment thereof and medical use | |
US20220356239A1 (en) | Il-5 antibody, antigen binding fragment thereof, and medical application therefor | |
RU2772716C2 (ru) | Антитело против il-5, его антигенсвязывающий фрагмент и его медицинское применение | |
CN111094354B (zh) | 凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
KR20240063177A (ko) | B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 |