TW202102669A

TW202102669A - 含有新穎選擇標記的細胞株及其用於蛋白製造的用途

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Publication number: TW202102669A
Application number: TW109109257A
Authority: TW
Inventors: 布魯諾當馬斯; *** 路易士
Original assignee: 法商賽諾菲公司
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2021-01-16
Also published as: JP2022526497A; CN113811615A; AU2020242966A1; KR20210141511A; SG11202110105UA; ZA202106718B; WO2020188021A1; BR112021018124A2; MX2021011303A; US20220177909A1; EP3942054A1; CA3134116A1; IL286419A

Abstract

本發明係關於包括部分或完全失活之內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因之細胞株以及其用於製造重組蛋白的用途。

Description

含有新穎選擇標記的細胞株及其用於蛋白製造的用途

本發明係關於用於蛋白製造之細胞株和選擇標記。

工業規模的重組蛋白製造需要分離出製造高量重組蛋白之選殖株。將異源性基因導入動物宿主細胞並就加入的基因表現進行篩選為一冗長及複雜的方法。此方法涉及轉染和選擇具有穩定長期表現之選殖株，以及篩選對相應的重組蛋白具有高表現率的選殖株。

當從表現載體產生表現一重組蛋白之選殖株時，宿主細胞通常係以編碼感興趣蛋白和在相同載體上的選擇標記二者之DNA載體轉染。此一表現載體因此係包括一得以選擇其中有表現載體存在之選殖株的可選擇標記。此一可選擇標記亦可使經轉染的DNA同步擴增，藉此而得以分離出高產量的選殖株。

大部分的選擇標記為賦予抗生素或其他毒性物質之抗藥性的蛋白或為細胞存活之必須蛋白。在本項技術中已知有數種此等選擇標記，包括，例如G418、潮黴素(hygromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、博來黴素(zeomycin)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、麩醯胺酸合成酶(GS)和次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(HPRT)。特言之，GS係廣泛地用作為真核細胞之工業級重組蛋白生產領域中的選擇標記。GS基因允許麩醯胺酸合成，為細胞生長所需，且受到MSX(L-甲硫胺酸磺醯亞胺)抑制。在MSX存在下，只有表現較高量GS的細胞能存活。在適當篩選後，可能選擇出製造外生性蛋白的細胞。

在先前的申請案WO2016/062837中，發明者們開發了一種以使用二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)作為選擇標記為基礎的表現系統。DHODH為一種嘧啶合成所需要的酵素。抑制DHODH的化合物因此係抑制DNA合成且因而抑制細胞增生。此選擇標記因此係包括一編碼用於與DHODH抑制劑，例如來氟米特(leflunomide)和特立氟胺(teriflunomide)組合之DHODH的表現載體。

然而大部分與上述選擇標記一起使用的抑制劑為有毒的。在DHODH選擇標記的情況下，例如特立氟胺為一強力的免疫抑制劑且其尤其是在大規模處理上就安全性理由可能具挑戰性。在GS選擇標記的情況下，MSX高劑量時為一驚厥劑且可能因此亦有處理問題。在DHFR選擇標記的情況下，甲胺喋呤(methotrexate)已知具有造血和消化毒性，因此亦有處理問題。

因此，對於其中可進行製造感興趣蛋白選殖株之選擇而不會增加處理化合物之困難性的表現系統，有其需求。

本發明符合此項需求。

本發明係源自於細胞株發明者們的設計，其中由於該細胞株中部分或完全失活的DHODH基因，而可在無尿苷(uridine)的培養基中選出製造感興趣蛋白的細胞。此細胞株，其中DHODH基因為部分或完全失活的，典型地係在添加尿苷的培養基中生長，但當以一包括編碼哺乳動物DHODH，尤其是編碼突變的哺乳動物DHODH之核苷酸序列及一表現感興趣蛋白之表現匣的表現載體轉染時，此培養基典型地被換成無尿苷的培養基，藉此來選擇製造感興趣蛋白之細胞。

此一表現系統特別有利，因為藉由避開使用抑制劑作為選擇壓力，而增加製造細胞的存活。發明者們進一步驗證此毒性的下降係與高產量有關。

本發明因此係關於包括部分或完全失活的內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因的細胞株。

在一特定的具體實例中，該細胞株為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。

在一更特定的具體實例中，此細胞株係藉由下列所製造a)使一細胞中的內生性DHODH基因失活，尤其是藉由基因編輯法，例如CRISPR-Cas9法，及b)在適合產生其中內生性DHODH基因為部分或完全失活之細胞株的條件下，於包括尿苷的培養基中培養此細胞。

在一特定的具體實例中，該細胞株的內生性DHODH基因之所有等位基因為部分或完全失活的。

在另一具體實例中，該細胞株進一步係包括一包含編碼外生性哺乳動物DHODH之核苷酸序列和至少一用於表現重組蛋白之表現匣的表現載體，其中該外生性DHODH係包括與序列SEQ ID NO：2或與序列SEQ ID NO：4至少60%相同之序列。

在一其特定的具體實例中，該核苷酸序列係包括SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：3之序列。

在其另外特定的具體實例中，該重組蛋白為一單株抗體。

又在其特定的具體實例中，該載體係包括一適用於選殖抗體輕鏈之第一表現匣和一適用於選殖抗體重鏈之第二表現匣。

本發明另外的目標為一表現系統，其係包括：(i)包括如上所定義之部分或完全失活的內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因之細胞株，及(ii)包括一編碼外生性哺乳動物DHODH之核苷酸序列和至少一用於表現重組蛋白之表現匣的表現載體，其中該外生性DHODH係包括與序列SEQ ID NO：2或與序列SEQ ID NO：4至少60%相同之序列。

在一特定的具體實例中，該核苷酸序列係包括SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：3之序列。

在另外特定的具體實例中，該重組蛋白為一單株抗體。

又在一特定的具體實例中，該載體係包括一適用於選殖抗體輕鏈之第一表現匣和一適用於選殖抗體重鏈之第二表現匣。

本發明進一步係關於(i)如上所定義之細胞株，或如上所定義之表現系統，以及(ii)無尿苷之培養基。

本發明另外的目標係關於活體外製造重組蛋白之方法，其係包括下列步驟：A)a1)提供進一步包括一表現載體之如上所定義的細胞株，而該表現載體係包括一編碼外生性哺乳動物DHODH之核苷酸序列和至少一用於表現重組蛋白之表現匣，其中該外生性DHODH係包括與序列SEQ ID NO：2或與序列SEQ ID NO：4至少60%相同之序列；或

a2)提供一如上所定義的細胞株，及

a2’)將一如上所定義的表現載體導入步驟a2)所提供的細胞株中；或

a3)提供一包括內生性DHODH基因之細胞株，

a3’)使步驟a3)所提供的細胞株中內生性DHODH基因部分或完全失活，及

a3”)將如上所定義的表現載體導入步驟a3’)所得到的包括部分或完全失活之內生性DHODH基因的細胞株中；B)於適合製造此重組蛋白之條件下培養該細胞株；及C)分離及/或純化該重組蛋白。

在一特定的具體實例中，該方法之步驟B)係在一無尿苷的培養基中進行。

在一另外特定的具體實例中，該方法進一步係包括將該重組蛋白調配成醫藥組成物之步驟D)。

本發明進一步係關於如上所定義的細胞株、如上所定義的表現系統或如上所定義的套組用於製造重組蛋白之用途。

在一特定的具體實例中，細胞株、表現系統或套組係與無尿苷的培養基組合使用。

圖1係顯示參照2018年12月21日於Genbank NCBI可取得的基因ID：100756632之人類DHODH基因的基因體結構。

圖2係顯示序列n°1 DHODH外顯子2.PAM：前間隔鄰近模體序列(Protospacer Adjacent Motif sequence)(TGG)之比對。

圖3係顯示在不同濃度特立氟胺作為選擇劑之存在下，篩選用於製造抗體之不同KO(基因剔除)DHODH選殖株。

圖4係顯示使用不同DHODH變體作為選擇標記所製造的蛋白之產量(以mg/mL表示)。

圖5係顯示使用人類DHODH G202A或人類GS選擇標記和DHODH KO或野生型CHO細胞在第14天之脂解酶產量。

圖6係顯示使用人類DHODH G202A或人類GS選擇標記和DHODH KO或野生型CHO細胞在第14天之單株抗體mAb-B產量。

圖7係顯示使用人類DHODH G202A及/或人類GS選擇標記和DHODH KO或野生型CHO細胞在第14天之雙專一性抗體產量。

圖8係顯示使用人類DHODH G202A和人類GS選擇標記以及DHODH KO或野生型CHO細胞在第14天之三專一性抗體產量。

二氫乳清酸脫氫酶

如文中所用，術語「二氫乳清酸脫氫酶」或「DHODH」係指能催化以下式反應表示之二氫乳清酸(4,5-二氫乳清酸或2,6-二側氧-1,3-二

烷-4-羧酸)轉變為乳清酸(乳清酸或1,2,3,6-四氫-2,6-二側氧-4-嘧啶羧酸)的多肽：

(S)-二氫乳清酸+O₂

乳清酸+H₂O₂此一多肽係歸類於Enzyme Commission(EC)編號1.3.3.1。能催化上述反應的多肽係具有「DHODH活性」。

上述反應為合成DNA和RNA所須之單磷酸尿苷(rUMP)全程合成的第四個步驟。抑制DHODH或使其失活因此具有抑制DNA和RNA合成的效應且因而抑制細胞增生。

細胞株

本發明係關於包括部分或完全失活的內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因之細胞株。

此細胞株為真核細胞株，例如哺乳動物細胞株，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株、猴子細胞株或人類細胞株。

在一特定的具體實例中，此細胞株為CHO細胞株。

CHO細胞常用於工業蛋白製造，且許多CHO細胞株已為熟習本項技術者所知。例如，此等CHO細胞株包括可從美國菌種保存中心公開取得的株系，例如CHO-K1細胞株(ATCC編號：CCL-61)、CHO-S細胞株(例如Invitrogen和Gibco所販售的)、CHO DP-12細胞株(ATCC編號CRL-12444和12445)及CHO 1-15細胞株(ATCC編號CRL-9606)。適合工業蛋白製造之另外的細胞株有CHO 9E4細胞株。9E4細胞株係從CHO-K1細胞株的選殖株經由單一細胞選殖方法所建立。9E4細胞株的建立係更深入呈現在實例1中。CHO-K1細胞株係在1957年由Puck所製得且存放在ATCC編號為CCL-61。

為了得到原態醣基化型式之重組人類蛋白，人類細胞例如HEK293(ATCC編號CRL-1573)、HKB11(ATCC編號CRL-12568)、PER-C6(Crucell)、HT1080(ATCC編號CRL-121)、Jurkat、Daudi、Raji和CAP(ATCC編號CRL-1098)細胞亦可用於蛋白製造。

在一具體實例中，此細胞株能生長於無血清培養基(例如化學成分確定的培養基)及/或懸浮液中。此一細胞株可由熟習本項技術者藉著讓母細胞株適應生長於無血清培養基中而容易地製得(例如，經由單一細胞選殖，經由逐步適應及/或經由「飢餓和生存」法)。

本發明之細胞株為一包括部分或完全失活的內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因之細胞株。

「內生性DHODH基因」在文中係指正常存在特定環境條件下該特定細胞特定發育時期中的DHODH基因。

「內生性DHODH基因」與下文所定義的「外生性DHODH」的區別在於該外生性DHODH係藉由如下所定義的表現載體提供，若該表現載體經導入該細胞株中，則其可能存在本發明之細胞株中。

熟習本項技術者應了解，內生性DHODH基因係依照細胞株而定。例如，在一CHO細胞株中，此內生性DHODH基因為中國倉鼠DHODH基因；在人類細胞株中，此內生性DHODH基因為人類DHODH基因。

典型地，野生型中國倉鼠DHODH係指包括或由SEQ ID NO：2所組成的序列，以及具有DHODH活性之其變體。此等變體可例如相當於天然發生在倉鼠物種中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。

典型地，野生型人類DHODH係指包括或由SEQ ID NO：4所組成的序列，以及具有DHODH活性之其變體。此等變體可例如相當於天然發生在人類中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。

如文中所用，「基因」包括編碼一基因產物的DNA區，以及調節基因產物製造的所有DNA區，無論此調節序列有或無與編碼及/或轉錄序列相鄰。因此，基因係包括啟動子序列、終止子、轉譯調節序列例如核糖體結合位點和內部核糖體進入位點、強化子、沉默子、隔絕子、邊界元素、複製起點、基質附著位點和基因座控制區。

基因「失活」係指相較於對應的野生型細胞之任何基因表現的下降。基因失活可為完全性(完全失活或基因剔除)或部分的(例如，其中基因具有低於正常表現量之亞效等位基因或在其影響的活性上顯示部分下降之突變基因的產物)。

在一特定的具體實例中，此內生性DHODH基因的所有等位基因為部分或完全失活。

在一特定的具體實例中，該內生性DHODH基因為完全失活的。

在一更特定的具體實例中，此內生性DHODH基因的所有等位基因為完全失活的。

在一特定的具體實例中，此內生性DHODH基因係使用如Aga et al.(2015)BMC Proceedings 9(suppl 9)：P2中所述之CRISPR-Cas9法，使其失活。

如熟習技術者所熟知的，CRISPR-Cas9系統為一使用非編碼RNA來引導Cas9核酸酶引發位點-專一性DNA裂解之原核細胞後天性免疫反應系統。此DNA損傷係藉由細胞DNA修復機制，經由非同源性末端接合DNA修復路徑(NHEJ)或同源引導修復(HDR)路徑加以修復。為了製造基因破壞，單一引導RNA(gRNA)，由對DNA標靶具專一性之crRNA序列所組成，和與Cas9蛋白相互作用的tracrRNA序列，係與具有DNA核酸內切酶活性之重組形式Cas9蛋白結合。所產生的複合物將造成目標專一性雙股DNA裂解。裂解位點將藉由非同源性末端接合(NHEJ)DNA修復路徑，一種可能造成基因功能破壞之***/刪除(INDEL)的錯誤傾向法，加以修復。

在一特定的具體實例中，係針對至少一個DHODH基因的外顯子進行失活化，尤其是藉由編輯法，例如CRIPR-Cas9法。在一更特定的具體實例中，係針對編碼DHODH蛋白N-端部分之部分DHODH基因進行失活，尤其是藉由編輯法，例如CRIPR-Cas9法。又在另外的具體實例中，係針對DHODH基因的第二外顯子進行失活化，尤其是藉由編輯法，例如CRIPR-Cas9法。

在一具體實例中，係使用序列CAAGGATGATGGCTGCATCC(SEQ ID NO：23)或GGATGCAGCCATCATCCTTG(SEQ ID NO：5)的20個-核苷酸序列或任何與剔除DHODH基因相容而不會損害CHO存活的序列作為對應的DNA片段供產生gRNA，其係以DHODH基因的第二外顯子為標靶。此gRNA典型地係使用序列CACCGCACCGGGATGCAGCCATCATCCTTG(SEQ ID NO：6)和AAAACCAAGGATGATGGCTGCATCC(SEQ ID NO：7)的寡核苷酸或使用序列GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT(SEQ ID NO：24)和CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG(SEQ ID NO：25)的寡核苷酸所製得，典型地在質體的獨特限制性位點，例如pCM3561質體的BaeI位點(由Invitrogen公司商品化)選殖，因此所選殖的DNA序列係在U6啟動子的控制下，且一旦該質體導入到細胞中，則轉錄至含有一crRNA融合tracrRNA之單一轉錄單元，該crRNA部分對DHODH基因的第二外顯子具專一性而該tracrRNA部分則可被Cas9酵素所辨識。

為了鑑別失活化的細胞株，就DHODH基因，典型地係藉由孔盤中限制稀釋分離單一細胞，及達到適當的滿度(confluence)，例如90%滿度後，將細胞分置於至少2個條件，例如一種在添加尿苷的培養基而另一種在無尿苷的培養基。感興趣的選殖株典型地係對缺乏尿苷具敏感性的選殖株。

一旦分離後，這些感興趣細胞可於包括嘧啶鹼基的培養基，尤其是包括尿苷的培養基中培養。

「嘧啶」在文中係指嘧啶本身和各種具有嘧啶核作為架構之嘧啶衍生物。此等嘧啶鹼基的實例包括尿嘧啶相關的物質，例如尿嘧啶、尿苷、磷酸尿苷，尤其是單磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)和三磷酸尿苷(UTP)、去氧尿苷、磷酸去氧尿苷，尤其是單磷酸去氧尿苷(dUMP)、二磷酸去氧尿苷(dUDP)和三磷酸去氧尿苷(dUTP)；胞嘧啶核酸相關的物質，例如胞嘧啶、磷酸胞嘧啶，尤其是單磷酸胞嘧啶(CMP)、二磷酸胞嘧啶(CDP)、三磷酸胞嘧啶(CTP)、去氧胞嘧啶、2’-去氧胞嘧啶、磷酸去氧胞嘧啶，尤其是單磷酸去氧胞嘧啶(dCMP)、二磷酸去氧胞嘧啶(dCDP)和三磷酸去氧胞嘧啶(dCTP)；胸腺嘧啶、胸苷、磷酸胸苷，尤其是單磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、去氧胸苷、磷酸去氧胸苷，尤其是單磷酸去氧胸苷(dTMP)、二磷酸去氧胸苷(dTDP)和三磷酸去氧胸苷(dTTP)以及乳清酸。

在一特定的具體實例中，該嘧啶鹼基為尿苷。

「尿苷」在文中係指下式之核苷

「無尿苷培養基」係指任何適合特定細胞株生長的基礎培養基，其中該培養基係包括低於1mM的尿苷，尤其是該培養基不包括任何尿苷。

「包括尿苷的培養基」係指任何適合特定細胞株生長的基礎培養基，其中該培養基進一步係包括1mM至25mM的尿苷，尤其是5mM至10mM的尿苷。

「基礎培養基」在文中係指適合暴露於細胞，例如CHO細胞之無添加培養基。熟習技術者應了解，所使用的基礎培養基將依照所使用的細胞類型而定。基礎培養基的實例包括CDCHO培養基、OPTiCHO^TM培養基、Fecto CHO^TM培養基、FortiCHO^TM培養基、ExpiCHO^TM培養基、Ex-Cell^TM培養基、ActiPRO^TM培養基、MAM PF77^TM培養基和PowerCHO^TM培養基。

在一特定的具體實例中，此基礎培養基進一步係添加麩醯胺酸，典型地4至6mM的麩醯胺酸。

因此，在一特定的具體實例中，本發明之細胞株係藉由下列所產生：a)使一細胞中的內生性DHODH基因失活化，尤其是藉由基因編輯法，例如CRISPR-Cas9法，及b)於一包括尿苷的培養基中在適合產生細胞株的條件下培養細胞，其中該內生性DHODH基因為部分或完全失活。

藉由CRISPR-Cas9法製造包括部分或完全失活之內生性DHODH基因的CHO細胞株係更深入以實例2和3示例說明。

製造包括部分或完全失活之內生性DHODH基因的細胞株，例如CHO細胞株可藉由本項技術中已知的各種其他分子生物法來產生。例如，可用於產生具有部分或完全失活之內生性DHODH基因之細胞株的其他基因編輯技術包括使用鋅指核酸酶(ZFN)或類轉錄因子效應子核酸酶(TALEN)。亦可使用Cre/Lox法剔除DHODH基因的一或多個或所有的等位基因。

在一特定的具體實例中，本發明之細胞株進一步係包括如下文「表現載體」章節中所定義之表現載體。

該表現載體可藉由任何熟習技術者熟知的適合技術來導入，例如藉由轉染，尤其是藉由電穿孔或化學轉染或轉導。

在一特定的具體實例中，該本發明之細胞株可進一步包括與本發明載體不相同之包含選擇標記的另外表現載體，典型地另外的表現載體係包括一編碼麩醯胺酸合成酶之序列。

外生性DHODH

由用於本發明之表現載體所編碼的DHODH(另外稱為「外生性DHODH」)可包括或由至少60%、62%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%；92%；93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相同之序列所組成。其亦可包括或由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之至少100個、150個、200個、250個、300個或350個連續胺基酸的片段所組成，其限制條件為此蛋白保留DHODH活性。

在某些具體實例中，根據本發明之外生性DHODH係包括或由至少60%、62%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%；93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%與SEQ ID NO：2序列及與SEQ ID NO：4相同之序列所組成。

在某些具體實例中，根據本發明之外生性DHODH為人類DHODH，亦即人類來源之DHODH。

如文中所用，術語「人類DHODH」係指包括或由SEQ ID NO：4所組成之蛋白序列，以及具有DHODH活性之其變體。此等變體可例如相當於天然發生在人類中變體(例如等位基因變體或剪接變體)。另一種選擇，此等變體可相當於藉由基因工程所得到的變體。在一具體實例中，當相較於SEQ ID NO：4時，此等變體與SEQ ID NO：4序列的差異最多僅存在有150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、40個、30個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸變異(該變異包括取代、***和刪除)。

在一特定的具體實例中，該人類DHODH相較於野生行序列為一包括G202A突變的變體，典型地係包括或由胺基酸序列SEQ ID NO：26所組成之蛋白。

在某些具體實例中，此外生性DHODH為一倉鼠DHODH，亦即倉鼠來源之DHODH。此倉鼠DHODH可為，例如中國倉鼠(Cetulus griseus)DHODH。

如文中所用，術語「中國倉鼠DHODH」係指包括或由SEQ ID NO：2所組成之蛋白序列，以及具有DHODH活性之其變體。此等變體可例如相當於天然發生在倉鼠中變體(例如等位基因變體或剪接變體)。另一種選擇，此等變體可相當於藉由基因工程所得到的變體。在一具體實例中，當相較於SEQ ID NO：2時，此等變體與SEQ ID NO：2序列的差異最多僅存在有150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、40個、30個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸變異(該變異包括取代、***和刪除)。

在另外的具體實例中，此變異的DHODH將具有DHODH活性，視需要與野生型蛋白同等級的活性，或為野生型蛋白之50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或更高等級的活性。

具有與本發明尋求的胺基酸序列至少，例如95%「相同」的胺基酸序列之多肽，係希望此目標多肽的胺基酸序列係與所尋求的序列相同，但是該目標多肽序列每100個此尋求胺基酸序列的胺基酸可能包括至高5個胺基酸改變。換言之，就得到具有與尋求的胺基酸至少95%相同的胺基酸序列之多肽，在目標序列中至高5%(100個中有5個)的胺基殘基可為***的、刪除的或經另外的胺基酸取代。

序列相同度可在全長的變體序列、全長的參照序列或二者中測定。例如，相同度百分比可使用全局比對(亦即以其全長比較二個序列)來計算。比較二或多個序列之相同度和同源性的方法已為本項技術所熟知。當考量其全長時，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)全局比對演算法的「尼氏(needle)」程式(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol. 48：443-453)找到了二個序列的最佳比對(包括缺位)，當進行全局比對時可例如使用此法。此尼氏程式(needle progam)可列如在ebi.ac.uk全球資訊網站中取得。依據本發明之相同度百分比，較佳地係使用EMBOSS：：尼氏(全局)程式以「開放缺位」參數等於10.0、「缺位延長」參數等於5和Blosum62矩陣來計算。

相較於參照序列，參照序列的變體可包括突變，例如刪除、***及/或取代。就取代的情況，取代較佳地係相當於如下表中所指的保守性取代。

表現載體

用於本發明內容中的表現載體係適用於製造重組蛋白並且包括一編碼二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)之序列。

此表現載體較佳地為DNA載體。

用於本發明內容中的表現載體係包括一編碼如上文「外生性DHODH」章節中所定義的外生性DHODH之序列。

在一特定的具體實例中，導入表現載體的細胞為一CHO細胞株，而該外生性DHODH為異源性來源(亦即，外生性DHODH並非倉鼠DHODH)。

編碼此一外生性DHODH的序列可為天然生成的核苷酸序列。另一種選擇，編碼此一DHODH的序列三聯密碼子在CHO細胞中的表現可能有偏差。用於得到最佳表現之偏向序列的軟體和演算法已為本項技術所知並包括，例如Raab et al.(2010)Syst Synth Biol. 4：215-225中所述的演算法。此演算法不僅提供最佳可取得的表現密碼子，亦考量GC含量且無不欲的DNA模組。

例如，編碼外生性DHODH的序列可包括或由至少60%、62%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%與SEQ ID NO：3序列(亦即編碼SEQ ID NO：4之人類DHODH的序列，其係就CHO細胞中最佳表現所設計)及/或與SEQ ID NO：1序列(亦即編碼SEQ ID NO：2之倉鼠DHODH的序列，其係就CHO細胞中最佳表現所設計)相同的序列所組成。

在一具體實例中，編碼外生性DHODH的序列係包括或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之序列所組成。

用於本發明內容中的表現載體、編碼如上所定義的外生性DHODH之序列可由任何熟習本項技術者已知的啟動子來控制。

例如，編碼如上所定義的外生性DHODH之序列可例如由適合驅動DHODH表現的啟動子來控制，例如猴空泡病毒40(SV40)啟動子(例如，SV40的晚期和早期啟動子)、CMV啟動子、延伸因子1啟動子、GAPDH啟動子、RPL37啟動子、Actin啟動子。早期SV40啟動子例如係描述於Benoist和Chambon(1981)Nature 290：304-310以及Moreau et al.(1981)Nucleic Acids Res. 9：6047-6068中。特言之，該SV40啟動子為全長啟動子。該SV40啟動子亦可具有一含有72bp重複區的複製起點。

在某些具體實例中，該SV40啟動子並非其中位置128至270已移除的SV40啟動子，亦即該SV40啟動子並非韓國專利第10-0267720號中所描述的SV40啟動子以及於1997年12月17日存放在Gene Bank,Institute of Bioengineering,KIST，存放編號：KCTC 8860 P之轉化大腸桿菌(E.coli)轉化體。

在其他的具體實例中，編碼如上所定義的外生性DHODH之序列並非由SV40啟動子所控制。

適用於製造重組蛋白的表現載體已為熟習本項技術者所知。此等載體典型地係相當於包括一複製起點及至少一個得以選殖和表現所欲製造的重組蛋白之表現匣的表現載體。表現匣典型地係包括5’非轉譯區(包括或由啟動子及視需要一強化子序列所組成)、一或多個得以選殖編碼重組蛋白之序列的限制位點、3'非轉譯區(亦即polyA訊號)及視需要一或多個內含子。啟動子序列可等同於任何本項技術熟知的強啟動子，例如人類CMV啟動子。視需要，用於本發明內容中的表現載體係包括一原核生物複製起點(例如，原核複製子，例如大腸桿菌中的ColE1)及至少一個原核生物-選擇標記基因，因而使此等載體得以在原和生物細胞中複製。複製此等載體的細胞亦表現原核生物-選擇標記基因，且因此可被辨識和選擇。原核生物-選擇標記基因已為熟習本項技術者所熟知。原核生物-選擇標記基因的實例有，例如編碼賦予抗生素抗藥性之蛋白的核酸序列(例如，編碼賦予抗安比西林(ampicillin)、氯黴素(chloramphenicol)、滅瘟素(blasticidin)或卡納黴素(kanamycin)抗藥性之蛋白的序列)。

重組蛋白可相當於熟習本項技術者感興趣的任何蛋白。

如文中所用，術語「蛋白」係指涵蓋胜肽(亦即低於50個胺基酸的胺基酸鏈)、多肽(亦即至少50個胺基酸的胺基酸鏈)、單體蛋白(亦即由一條胺基酸鏈組成的蛋白)和多聚體蛋白(亦即由二條或二條以上的胺基酸鏈所組成的蛋白，例如單株抗體)。

用於本發明內容中的表現載體典型地係包括許多與構成此蛋白之不同胺基酸鏈數目相同的表現匣(例如在單體蛋白或同源二聚體蛋白的情況為一個表現匣，就異源二聚體或單株抗體等等的情況為二個)。

另一種選擇，用於本發明內容中的表現載體可僅包括一個表現匣，即使是在希望製造異源性二聚體蛋白或單株抗體時。在此一情況下，編碼此蛋白之其他胺基酸鏈的序列係存在個別的表現載體上，與根據本發明之表現載體共轉染至宿主細胞株中，尤其是轉染至CHO細胞株中。

在該情況下，此補充的個別表現載體可包括與文中所述的DHODH選擇標記不同的選擇標記，例如DHFR、GS或HPRT。

在一具體實例中，用於本發明內容中的表現載體可無表現匣。在此一情況下，適合表現重組蛋白的表現匣係存在個別的載體上，與根據本發明之表現載體共轉染至宿主細胞株中，尤其是轉染至本發明之DHODH-失活的細胞株中，更特言之，轉染至本發明之DHODH-失活的CHO細胞株中。

因此，在某些具體實例中，用於本發明內容中的表現載體係包括：

-一編碼如上所定義之外生性DHODH，由早期SV40啟動子所控制的序列；

-一第一表現匣，其中編碼該抗體輕鏈之序列係由CMV啟動所控制；

-一第二表現匣，其中編碼該抗體重鏈之序列係由CMV啟動所控制；

-一原核生物之複製起點；及

-一用於原核細胞的選擇標記，亦即一編碼賦予抗安西林抗藥性之蛋白、由其天然啟動子所控制的序列。

在整個說明書中，術語「重組蛋白」係指任何希望製造的重組蛋白。其可例如相當於治療性及/或預防性蛋白，亦即希望用作為醫藥品(包括疫苗)之蛋白。在一特定的具體實例中，所希望製造的重組蛋白並非DHODH。在另外的特定具體實例中，所希望製造的重組蛋白為抗體，例如單株抗體。又在另外的特定具體實例中，所希望製造的重組蛋白為抗原蛋白。

術語「抗體」在文中係以最廣義來使用，且特言之係涵蓋任何同功型之單株抗體(包括全長的單株抗體)，例如lgG、lgM、lgA、lgD和lgE，多株抗體、多專一性抗體(包括雙專一性和三專一性抗體)、抗體片段(例如，Fv、scFv、ds、Fab、Fab’或F(ab’)₂片段)、單區抗體及其片段，以及包括一抗體片段的融合蛋白。具特定抗原反應性之抗體可藉由重組法產生，例如選擇在噬菌體或類似載體中重組抗體之資料庫，或藉由以抗原或編碼抗原的核酸使一動物免疫。

「單株抗體」如文中所用，係由實質上同源抗體之族群的抗體所製得，亦即形成此群族之抗體，除了可小量存在之可能天然發生的突變之外，基本上為相同的。這些抗體係直接對抗一單一表位(或在多專一性單株抗體的情況下為一單一群族的表位)且因此具高度專一性。

典型的單株抗體係包括藉由雙硫鍵相連結的二條相同重鏈和二條相同輕鏈。各重鏈和輕鏈係含有一恆定區和一可變區。各可變區含有三段稱為「互補決定區」(「CDR」)或「高可變區」之部分，其主要係負責與抗原的表位結合。其由N-端起依序編號，通常稱為CDR1、CDR2和CDR3(參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition,National Institute of Health,Bethesda,MD,1991)。可變區的更高保守部分係稱為「架構區」。

此單株抗體可為，例如鼠科抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人類抗體。

此單株抗體可為單專一性、雙專一性或三專一性抗體。

當所欲製造的重組蛋白為單株抗體時，根據本發明之表現載體可包括適用於選殖抗體輕鏈之第一表現匣及適用於選殖抗體重鏈之第二表現匣。

在一特定的具體實例中，該第一和第二表現匣各自係包括巨細胞病毒(CMV)啟動子，例如來自人類或鼠科CMV之CMV啟動子。更特言之，該第一和第二表現匣可包括：-一CMV前早期強化子啟動子(例如，一具有Teschendorf et al.(2002)Anticancer Res. 22：3325-3330中所描述的序列者)；或 -一來自小鼠CMV之IE2啟動子/強化子區(例如，一具有Chatellard et al.(2007)Biotechnol Bioeng. 96：106-117中所描述的序列者)；或-一hCMV-MIE調節元件(例如，一具有WO 89/01036中所描述的序列者)。

術語「抗原蛋白」在文中係以最廣義來使用且係涵蓋，單獨或與佐劑組合，能產生免疫反應之任何蛋白。其可能希望用於預防性疫苗或治療性疫苗中。在一特定的具體實例中，此抗原蛋白為一疫苗蛋白，亦即希望用於預防性疫苗的蛋白。

此表現載體可包括至少一編碼感興趣重組蛋白之序列(例如，一編碼單體蛋白之序列，一編碼抗體鏈之序列，或二條分別編碼抗體輕鏈和抗體重鏈之序列)，或其可為空白的(亦即，缺乏此一編碼感興趣重組蛋白之序列)。

表現系統、套組、方法和用途

本發明係提供包含下列之表現系統：(i)一如上文「細胞株」章節中所定義的細胞株，其係包括一如上文「細胞株」章節中所定義之部分或完全失活的內生性DHODH基因，及(ii)一如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體。

本發明之表現系統可進一步包括補充的個別表現載體，其各自係包括一編碼不同於DHODH的選擇標記，例如DHFR、GS或HPRT之核苷酸序列，以及至少一用於表現重組蛋白之表現匣。

另一種選擇，本發明之表現載體可進一步包括如上文「表現載體」章節中所定義的補充表現載體。

本發明係提供一套組，其包括(i)包括如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體之根據本發明細胞株，或根據本發明之表現系統，以及(ii)如上所定義，無尿苷之培養基。

此套組可包括一如上所定義之編碼外生性DHODH表現載體(在表現系統中)。在此一套組中，載體較佳地為空白的，因為這樣才能使熟習技術者得以選殖感興趣蛋白。此外，表現載體較佳地係從此一套組中的細胞株分離。

此套組進一步係包括一如上文「細胞株」章節中所定義的無尿苷培養基。

此套組可進一步包括適合培養此細胞株的培養基，適合將載體轉染至細胞株的培養基，包裝材料及/或使用表現系統的說明。

在一特定的具體實例中，此套組並無DHODH抑制劑。

DHODH抑制劑的實例包括二辛可寧酸(bicinchoninic acid)、布喹那(brequinar)(6-氟-2-(2'-氟-1,1’-聯苯-4-基)-3-甲基-4-喹啉羧酸)、萘醌衍生物，例如二氯烯丙基指甲花醌(dichlororally lawsone)，異

唑衍生物例如來氟米特(5-甲基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-異

唑-4-甲醯胺)及其活性代謝物特立氟胺((2Z)-2-氰基-3-羥基-N-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯醯胺)、喹諾酮(quinolone)羧酸、萘醌、異

唑、苯喹啉、redoxal及衍生物、指甲花醌(lawsone)、拉帕醇(Lapachol)、阿托奎酮(atovaquone)和(8-氯-4-(2-氯-4-氟-苯氧基)喹啉)。DHODH之抑制劑可能能夠抑制至少20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100%的DHODH活性。

在一特定的具體實例中，此套組並無特立氟胺。

本發明進一步係提供包括如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體之細胞株、根據本發明之表現系統或根據本發明之套組，用於活體外製造重組蛋白之用途。

在一特定的具體實例中，該細胞株、表現系統或套組係與如上所定義的無尿苷培養基組合使用，更特言之無DHODH抑制劑。

本發明進一步係提供根據本發明之表現系統、包括如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體之根據本發明之細胞株或根據本發明之套組，用於分離出活體外製造高量重組蛋白之選殖細胞(「高產量選殖株」)的用途，特言之無DHODH抑制劑。

在本發明內容中，術語「高量重組蛋白」希望係指培養基中重組蛋白的濃度為至少0.05g/l，較佳地至少0.1g/l，又較佳地至少0.2g/l，更佳地至少介於0.3至1g/l。重組蛋白的濃度可藉由熟習本項技術者熟知的方法來測定，包括尤其是酵素連接免疫吸附分析(ELISA)、西方墨點、化微器技術(caliper technology)和相當於重組蛋白之一濃度範圍的純化蛋白。

本發明進一步係提供活體外製造重組蛋白的方法，其係包括下列步驟：A)a1)提供一包括如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體之根據本發明的細胞株；或

a2)提供一根據本發明之細胞株，及

a2’)將如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體導入步驟a2)所提供的細胞株中；或

a3)提供一包括內生性DHODH基因的細胞株，

a3’)使步驟a3)所提供的細胞株中的內生性DHODH基因部分或完全失活，及

a3”)將如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體導入步驟a3’)所得到之包括部分或完全失活的內生性DHODH基因之細胞株；B)於適用於製造重組蛋白的條件下培養該細胞株；及C)分離及/或純化該重組蛋白。

在一特定的具體實例中，上述方法之步驟B)係在無尿苷的培養基中進行，更特言之亦無DHODH抑制劑，及尤其是包括一在於選擇轉染細胞之子步驟，其中該轉染細胞儘管缺乏尿苷，尤其是進一步在無DHODH抑制劑下仍能生長。

本發明係提供一活體外分離出製造高量重組蛋白之選殖細胞的方法，該方法係包括或由下列步驟所組成：A)a1)提供一包括如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體之根據本發明細胞株；或

a2)提供一根據本發明之細胞株，及

a3)提供一包括內生性DHODH基因的細胞株，

a3”)將如上文「表現載體」章節中所定義的表現載體導入步驟a3’)所得到之包括部分或完全失活的內生性DHODH基因之細胞株；B)於適合製造重組蛋白的條件下培養該細胞株；及C)分離出製造高量重組蛋白之選殖株。

在步驟a2')或a3")中，可藉由任何熟習技術者所熟知的技術將該表現載體導入該細胞株中，例如藉由轉染，尤其是藉由電穿孔或化學轉染或轉導。

適用於製造重組蛋白的條件已為熟習本項技術者所熟知。例如可使用實例中所述的方法。

在一特定的實施例中，用於步驟B)的培養基係包括遞減濃度的尿苷。此舉能選擇出其中載體衍生的外生性DHODH基因(及因此編碼此重組蛋白的序列)已擴增的選殖株。

上述方法可進一步包括將重組蛋白調配成醫藥組成物的步驟。

整個說明書中，術語例如「包括」係具有大多數專利管轄權，較佳地所指的管轄權中歸因於彼等之意義；例如，其可指「包含」等。術語例如「由...組成」、「基本上由...組成」係具有在大多數專利管轄權，較佳地所指的管轄權中歸因於彼等之意義；例如，其係意味著排除所有、大部分或全部而非可忽略量的其他元素，其係允許未明確敘述的元素，但排除在先前技術中所見的元素或影響本發明之基本或新穎特徵之元素。

在整個本說明書的文本中引述了數個文件。文中所引述的各文件(包括任何期刊文章或摘要、公開或未公開的專利申請案、頒布的專利、製造商說明書、用法說明等)係以引用的方式併入。然而，並非承認文中所引述的任何文件確實為本發明相關的先前技術。

本發明將藉由參照下列圖式和實例進一步描述，而該圖式和實例僅為說明性，且不希望限制本發明。

本發明係藉由申請專利範圍加以定義，其應在說明書和圖式的幫助下闡釋。

序列之簡單說明

實例

實例1：獲得CHO 9E4細胞株

本實例係描述從ATCC編號ATCC CCL-61之市售CHO-K1細胞株得到CHO 9E4細胞株。

1.CHO-K1細胞株

從ATCC得到1969年在牛血清存在下冷凍的CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)小瓶。

2.以Ex-Cell ^TM 302培養基解凍小瓶並製備CHO-LG-APF庫

將CHO-K1小瓶直接以添加4mM麩醯胺酸的Ex-Cell^TM 302培養基(SAFC)解凍並於靜置式撐體上擴增，然後置於旋轉器中。在12個繼代和17.3個世代後，將產生的CHO-LG-APF庫冷凍於Ex-Cell^TM 302培養基中。

3.將Ex-Cell ^TM 302培養基中的CHO-LG-APF庫解凍並製備ABC-024 P22庫

將CHO-LG-APF小瓶以Ex-Cell^TM 302培養基解凍並擴增。在18.5個世代後將所生成的ABC-024 P22庫解凍。

4.使CMV07-024庫適應CDCHO融合培養基及製備ABC-003庫

將CMV07-024庫解凍並直接使其適應添加4mM麩醯胺酸的Ex-cell^TM CDCHO融合培養基(SAFC)並於震盪器中適應培養歷經12.5個世代，直到將ABC-003庫冷凍於Ex-cell^TM CDCHO融合培養基。

5.以CDCHO融合培養基解凍ABC-003庫並以CDCHO融合培養基製備ABC-053庫

將ABC-003小瓶以CDCHO融合培養基解凍，及稀釋後，於4.2個世代後將ABC-53庫冷凍。

6.以CDCHO融合培養基解凍ABC-053庫、選擇、選殖及以CDCHO融合培養基製備P15A11庫。

將ABC-053庫以添加4mM麩醯胺酸的Ex-cell^TM CDCHO融合培養基(SAFC)解凍。擴增培養後，於培養盤中藉由限制稀釋選殖，及然後於CDCHO融合培養基中擴增。將由該選殖所產生的選殖株P15A11細胞庫冷凍。此選殖和擴增相當於大約94個世代。

7.將P15A11庫以CDCHO融合培養基解凍，藉由以CDCHO直接繼代培養使細胞庫適應並以CDCHO培養基製備CHOSP10-002庫。

將P15A11庫以添加4mM麩醯胺酸的Ex-cell^TM CDCHO融合培養基(SAFC)溶解，及在CDCHO融合培養基中2個繼代後，將細胞以CDCHO培養基稀釋。在CDCHO培養基中3個繼代後，總計15.9個世代後將CHOSP10-002庫冷凍。

8.以CDCHO培養基解凍CHOSP10-002庫、擴增、以離心移除團塊及藉由96-孔盤中無團塊繼代培養選擇，於6-孔盤中擴增及於震盪器中以CDCHO培養基製備CHOSP10-012庫

將CHOSP10-002庫以添加6mM麩醯胺酸的CDCHO培養基(Invitrogen)解凍，然後擴增。將培養物離心以便移除細胞團塊並持續培養從上清液分離出的單純細胞。從解凍起，在此階段產生了11.3個世代。

將此培養物以每孔10個細胞分置於96-孔盤中。於6-孔盤中將帶有多次分離於懸浮液中之細胞的孔槽擴增，然後置於震盪器中。直到將CHOSP10-012庫冷凍為止，有23.2個額外的世代。

9.將CHOSP10-012庫解凍、擴增及製備CHOSP11-008庫(9E4庫)

將CHOSP10-012庫以添加6mM麩醯胺酸的CDCHO培養基(Invitrogen)解凍，然後從Erlenmeyer階段擴增至17 l生物反應器。

總計10個世代後將9E4庫冷凍。

實例2：製造其中DHODH基因為無效之CHO細胞株

A-設計和建構CRISPR CAS9引導RNA(gRNA)

為了使CHO細胞中的DHDOH基因失效，發明者們係由回收倉鼠基因序列開始並使用可公開取得的Tefor軟體設計不同的引導RNA(gRNA)供以CHO基因體中的CRISPR-Cas9轉染。整個CHO DHODH序列，包含內含子和外顯子係如圖1所示。

此軟體係測定8個能以DHODH基因為標靶的序列：

序列1

CACCGGGATGCAGCCATCATCCTTG(SEQ ID NO：6)

AAAACCAAGGATGATGGCTGCATCC(SEQ ID NO：7)

序列2

CACCGGATGCAGCCATCATCCTTGG(SEQ ID NO：8)

AAAACCCAAGGATGATGGCTGCATC(SEQ ID NO：9)

序列3

CACCGGCAGCCATCATCCTTGGGGG(SEQ ID NO：10)

AAAACCCCCCAAGGATGATGGCTGC(SEQ ID NO：11)

序列4

CACCGGCCATCATCCTTGGGGGAGG(SEQ ID NO：12)

AAAACCCTCCCCCAAGGATGATGGC(SEQ ID NO：13)

序列5

CACCGGCTATTCGCTTCACGTCCCT(SEQ ID NO：14)

AAAACAGGGACGTGAAGCGAATAGC(SEQ ID NO：15)

序列6

CACCGGCCTCTACAAACTGGGCTTT(SEQ ID NO：16)

AAAACAAAGCCCAGTTTGTAGAGGC(SEQ ID NO：17)

序列7

CACCGGGCTTTGGGTTTGTCGAGGT(SEQ ID NO：18)

AAAACACCTCGACAAACCCAAAGCC(SEQ ID NO：19)

序列8

CACCGGCTGGTCTGAGGAGCCTACA(SEQ ID NO：20)

AAAACTGTAGGCTCCTCAGACCAGC(SEQ ID NO：21)

雖然檢測和選殖8個序列，但8個序列中僅轉染了的4個選殖序列且僅有1個成功地產生剔除DHODH基因。使用下列20個核苷酸GGATGCAGCCATCATCCTTG(SEQ ID NO：5)作為產生如圖2所示之gRNA的對應DNA片段。其係以DHODH基因的第二外顯子為標靶。為了得到適當gRNA的轉錄，係以合成製造二條寡核苷酸CACCGGGATGCAGCCATCATCCTTG(oligo1,SEQ ID NO：6)和AAAACCAAGGATGATGGCTGCATCC(oligo2,SEQ ID NO：7)，黏合及於pCM3561的獨特BaeI位點(由Invitrogen公司商品化)選殖。

將選殖的DNA序列藉此由U6啟動子控制且一旦DNA轉染於CHO細胞中，其係轉錄成含有crRNA融合tracrRNA之單一轉錄單元。此crRNA部分對於DHODH基因的第二外顯子具有專一性，而tracrRNA可被Cas9酵素本身所辨識。

B-製備用於CRISPR-Cas9基因編輯之物質

如實例1中所揭示，從購自ATCC的CHO K-1細胞分離及選擇CHO 9E4細胞，並以懸浮液培養於添加6mM L-麩醯胺酸之CDCHO無血清和化學成份確定對中國倉鼠卵巢(CHO)細胞最佳化的培養基中在37℃含有8% CO₂和80%濕度的培養箱中生長及維養。

將10μg的sgRNA表現載體(pCM3561)以1μL添加20μM S-腺苷基甲硫胺酸(SAM)的BaeI酵素以5個單位/μl於25℃消化1小時，然後藉由電穿孔使用1%瓊膠分離消化的質體。然後藉由凝膠萃取套組(Qiagen Kit)回收所產生的sgRNA選殖載體。

使用T4 DNA連接酶酵素(Biolabs)綁紮sgRNA選殖載體和黏合的引導寡核苷酸並於室溫培養10min。

將5μL的綁紮產物加到50μL的大腸桿菌DH5a勝任細胞(Invitrogen)。

將細胞和DNA於冰上培養30min，及然後於42℃熱震盪45秒。加入500mL S.O.C培養基後，於37℃(以800rpm)培養1小時得到細菌用以產生編碼在質體架構上的抗生素抗藥性蛋白之時間。培養後，將各試管塗覆一層添加100μg/mL安比西林之LB。將培養皿於37℃培養至隔夜。使用負性對照(以水取代***的DNA)評估轉化是否成功。

就擴增步驟，每次建構係選擇二個菌落並植入試管內添加100μg/ml安比西林之2mL的LB培養基中，放置於培養箱中至隔夜(於37℃,700rpm)。藉由離心收取培養至隔夜的培養物。使用QIAprep Miniprep Kit^TM(QIAGEN)回收擴增的DNA(以EB緩衝係溶析)。然後藉由桑格定序(Sanger sequencing)(正義和反義定序，GATC公司)檢查感興趣的引導寡核苷酸序列。於Vector NTI軟體上(Thermofisher Scientific)藉由比對確認後，使用對應的菌落植入添加100μg/ml安比西林之200mL的LB培養基中。培養24小時後，藉由於4℃以6000g離心15min收取細菌。使用EndoFree Plasmid Maxi Kit^TM(QIAGEN)製備MaxiPrep。藉由於室溫加入異丙醇沉澱DNA。1h-離心後(於4℃,8000rpm)，以無內毒素、室溫70%的乙醇沖洗DNA團塊。再一次短暫離心後，於1h期間將團塊風乾並再溶解於適量無內毒素的無菌水，得到5mg/mL的DNA濃度。使用超微量(nanodrop)裝置測量DNA濃度。

製備4種不同的質體，即pBH6840質體(KO DHODH SEQ1)、pBH6841質體(KO DHODH SEQ4)、pBH6842質體(KO DHODH SEQ5)和pBH6843質體(KO DHODH SEQ7)。在CHO DHODH基因中這些質體的標靶係顯示於SEQ ID NO：22上。

DNA定序係由GATC分包商-Eurofins Genomics公司來進行。

C-CRISPR-Cas9基因編輯

藉由電穿孔使用MaxCyte STX及其CHO定義規程進行轉染。其係於OC-100(每次轉染2千萬個細胞)處理組件上進行。

轉染的前一天，將細胞以1.5×10⁶個細胞/mL植入添加6mM L-麩醯胺酸的CDCHO培養基中。

轉染當天，以ViCell裝置(Beckman & Coulter)計算細胞數。將需要的細胞數以250g離心10min並丟棄上清液。

就各轉染條件，係將20×10⁶個細胞以250g離心10min。將團塊以70μL Maxcyte緩衝液再懸浮。加入30μg的DNA並將混合物(細胞、緩衝液和DNA)轉置於100μL Maxcyte電穿孔匣。所使用的處理組件為專門用於100μL卡匣之OC-100，並選擇CHO之最適化程式。

進行下列的轉染。

電穿孔後，將細胞轉置於25mL工作Erlenmeyer燒瓶中。將其放置在37℃、5% CO₂靜置式培養箱中歷時45min。然後加入25mL添加6mM L- 麩醯胺酸之CDCHO培養基將細胞再懸浮並將Erlenmeyer燒瓶放置於37℃、5% CO₂、70%濕度、110rpm震盪器中。

電穿孔後當天，藉由從上述CHO9E4轉染池之限制稀釋於每個孔槽植入單一細胞。大約20天後，一旦細胞為大約90%滿度且當於顯微鏡下檢查時顯示為健康的，將細胞分置於2個有或無尿苷的新96孔盤。

就其對無尿苷的敏感性選擇數個選殖株。讓這些選殖株適應在添加6mM麩醯胺酸和5mM尿苷的CDCHO培養基中生長。

為了確認基因編輯是否成功，係使用Qiagen DNeasy kit^TM(Qiagen)從CRISPR-Cas9選殖株細胞萃取基因體DNA。將目標基因座藉由PCR使用作為CRISPR-Cas9標靶之DHODH基因座區域的適當引子擴增，並將PCR產物藉由NGS使用涵蓋可能刪除區的PCR片段定序。

實例3：製造其中DHODH基因為失效的CHO細胞株之替代選擇

A-設計和建構CRISPR CAS9引導RNA(gRNA)

為了使CHO細胞中的DHDOH基因失效，發明者們係由回收倉鼠基因序列開始並使用可公開取得的Tefor軟體設計不同的引導RNA(gRNA)供以CHO基因體中的CRISPR-Cas9轉染。

此軟體係測定8個能以DHODH基因標靶的序列：

序列1’

GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT(SEQ ID NO：24)

CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG(SEQ ID NO：25)

序列2’

GATGCAGCCATCATCCTTGGGTTTT(SEQ ID NO：27)

CCAAGGATGATGGCTGCATCCGGTG(SEQ ID NO：28)

序列3’

GCAGCCATCATCCTTGGGGGGTTTT(SEQ ID NO：29)

CCCCCAAGGATGATGGCTGCCGGTG(SEQ ID NO：30)

序列4’

GCCATCATCCTTGGGGGAGGGTTTT(SEQ ID NO：31)

CCTCCCCCAAGGATGATGGCCGGTG(SEQ ID NO：32)

序列5’

GCTATTCGCTTCACGTCCCTGTTTT(SEQ ID NO：33)

AGGGACGTGAAGCGAATAGCCGGTG(SEQ ID NO：34)

序列6’

GCCTCTACAAACTGGGCTTTGTTTT(SEQ ID NO：35)

AAAGCCCAGTTTGTAGAGGCCGGTG(SEQ ID NO：36)

序列7’

GGCTTTGGGTTTGTCGAGGTGTTTT(SEQ ID NO：37)

ACCTCGACAAACCCAAAGCCCGGTG(SEQ ID NO：38)

序列8’

GCTGGTCTGAGGAGCCTACAGTTTT(SEQ ID NO：39)

TGTAGGCTCCTCAGACCAGCCGGTG(SEQ ID NO：40)

雖然檢測和選殖8個序列，但8個序列中僅轉染了4個選殖序列且僅有1個成功地產生剔除DHODH基因。使用下列20個核苷酸GGATGCAGCCATCATCCTTG(SEQ ID NO：5)作為產生gRNA的對應DNA片段。其係以DHODH基因的第二外顯子為標靶。為了得到適當gRNA的轉錄，係以合成製造二條寡核苷酸GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT(oligo1’,SEQ ID NO：24)和CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG(oligo2’,SEQ ID NO：25)，黏合及於pCM3561的獨特BaeI位點(由Invitrogen公司商品化)選殖。

將選殖的DNA序列藉此由U6啟動子控制且一旦DNA轉染在CHO細胞中，其係轉錄成含有crRNA融合tracrRNA之單一轉錄單元。此crRNA部分對於DHODH基因的第二外顯子具有專一性，而tracrRNA可被Cas9酵素本身所辨識。

B-製備用於CRISPR-Cas9基因編輯之物質

將10μg的sgRNA表現載體(pCM3561)以1μL以5個單位/μl添加20μM S-腺苷基甲硫胺酸(SAM)的BaeI酵素於25℃消化1小時，然後藉由電穿孔使用1%瓊膠來分離消化的質體。然後藉由凝膠萃取套組(Qiagen Kit)回收所產生的sgRNA選殖載體。

將5μL的綁紮產物加到50μL的大腸桿菌DH5a勝任細胞(Invitrogen)。

將細胞和DNA於冰上培養30min，及然後於42℃熱震盪45秒。加入500mL S.O.C培養基後，於37℃(以800rpm)培養1小時得到細菌之產生編碼在質體架構上的抗生素抗藥性蛋白的時間。培養後，將各試管塗覆一層添加100μg/mL安比西林之LB。將培養皿於37℃培養至隔夜。使用負性對照(以水取代***的DNA)評估轉化是否成功。

就擴增步驟，每次建構係選擇二個菌落並植入試管內添加100μg/ml安比西林之2mL的LB培養基中，放置於培養箱中至隔夜(於37℃,700rpm)。藉由離心收取培養至隔夜的培養物。使用QIAprep Miniprep Kit^TM(QIAGEN)回收擴增的DNA(以EB緩衝液溶析)。然後藉由桑格定序(Sanger sequencing)(正義和反義定序，GATC公司)檢查感興趣的引導寡核苷酸序列。於Vector NTI軟體上(Thermofisher Scientific)藉由比對確認後，使用對應的菌落植入添加100μg/ml安比西林之200mL的LB培養基中。培養24小時後，藉由於4℃以6000g離心15min收取細菌。使用EndoFree Plasmid Maxi Kit^TM(QIAGEN)製備 MaxiPrep。藉由於室溫加入異丙醇沉澱DNA。1h-離心後(於4℃,8000rpm)，以無內毒素、室溫70%的乙醇沖洗DNA團塊。再一次短暫離心後，於1h期間將團塊風乾並再溶解於適量無內毒素的無菌水，得到5mg/mL的DNA濃度。使用超微量(nanodrop)裝置測量DNA濃度。

製備4種不同的質體，即pBH6840質體(KO DHODH SEQ1)、pBH6841質體(KO DHODH SEQ4)、pBH6842質體(KO DHODH SEQ5)和pBH6843質體(KO DHODH SEQ7)。

DNA定序係由GATC分包商-Eurofins Genomics公司來進行。

C-CRISPR-Cas9基因編輯

轉染的當天，以ViCell裝置(Beckman & Coulter)計算細胞數。將需要的細胞數以250g離心10min並丟棄上清液。

進行下列的轉染。

電穿孔後，將細胞轉置於25mL工作Erlenmeyer燒瓶中。將其放置在37℃、5% CO₂靜置式培養箱中歷時45min。然後加入25mL添加6mM L-麩醯胺酸之CDCHO培養基將細胞再懸浮並將Erlenmeyer燒瓶放置於37℃、5% CO₂、70%濕度、110rpm震盪器中。

實例4：使用DHODH-缺陷CHO細胞株製造重組蛋白

於實例2或3所得到的有效DHODH-缺陷CHO選殖株上檢測抗體的產量，用以確認這些選殖株能否在無特立氟胺之下表現抗體。

製造及製備所設計的載體，濃度為5mg/mL。其全部皆具有ITR而能使用轉位子系統進行製造細胞基因體中的質體整合，但pBH6209除外，其為編碼轉位酶之質體。

所使用的細胞株為CHO 9E4_SP11野生型和DHODH基因剔除的KO2及KO19。

將CHO 9E4_SP11置於添加6mM L-麩醯胺酸之CDCHO培養基中培養。

將KO2和KO19置於添加6mM L-麩醯胺酸和5mM尿苷之CDCHO培養基中培養。

開始時其係在25mL-工作Erlenmeyer燒瓶中培養並擴增，直到達到所需要的活細胞數為止。

使用由Maxcyte所開發的高效電穿孔規程於Maxcyte STX裝置上製造不同的蛋白。

在轉染的前一天以1.5×10⁶均分細胞。

轉染當天，以二個載體共轉染細胞：含有人類抗CD38重鏈(HC)和輕鏈(LC)表現匣及二側帶有PiggyBac辨識位點(反向末端重複，ITR)之DHODH選擇標記(如WO2016/062837中所述)的DNA質體表現載體，以及來自Transposagen公司的轉位酶載體，其係催化轉位子移動於TTAA位點進入CHO基因體。

就各轉染條件，係將80×10⁶個細胞以250g離心10min。將團塊以250μL Maxcyte緩衝液再懸浮。加入120μg的DNA並將混合物(細胞、緩衝液和DNA)轉置於400μL Maxcyt電穿孔匣。所用的處理組件為專門用於400μL匣的OC-400，並選擇CHO之最佳程式。

就回收階段，係將轉染過的細胞於37℃，40min無攪動下立即轉置於125ml燒瓶中。加入25mL添加6mM麩醯胺酸(KO細胞+5mM尿苷)之預熱過CDCHO培養基並將轉染培養物維養於37℃具有8% CO₂和80%濕度的培養箱中。轉染後第1-天，將細胞離心並以1×10⁶個細胞/mL再懸浮於添加6mM麩醯胺酸、30% FeedB(Gibco)和不同量的特立氟胺(0、5、15和25μM)之CD OPTiCHO^TM選擇培養基(Gibco)中。

在轉染後第14天，將細胞於25℃以200g離心10min。將上清液經由0.22μm PES過濾器過濾並使用Octet裝置測量抗體效價。

如圖3所示。二株選殖株(KO2和KO19)在無特立氟胺下展現優良的產量，且基因體NGS顯示這二株選擇株在DHODH基因座的二個對等基因上含有基因剔除的突變。

顯然，所有的KO選殖株即使在缺乏特立氟胺作為選擇劑下皆產生抗體。選擇2株選殖株KO2和KO19進行進一步研究。再者，這些引用的選殖株為顯示同型接合之DHODH基因剔除的僅有選殖株。

因此本實例係顯示，本發明提供了一組能在無使用任何選擇壓力下製造抗體的細胞株和載體。

實例5：評估三種人類DHODH變體

為了確認使用缺損形式的人類DHODH是否能增進整合至CHO基因體的複製數目並藉此得到較佳的產量，係以三種米勒症候群(Miller syndrome)病患中所描述的人類DHODH cDNA變體(R135C、G202A和R346W，參見，特言之，Fang et al.(2012)Biosci. 32：631-639)轉染DHODH KO2、KO19和WT CHO 9E4細胞株。轉染帶有一編碼人類WT DHODH之cDNA的質體，作為對照載體。

將50ng編碼人類抗CD38單株抗體mAb-A(pBH6204)的質體載體以SalI-BglII限制酶消化，與37.5ng對應各變體的SalI-BglII純化DNA片段(R135C、G202A和R346W)混合。加入1μL的T4-DNA連接酶(BioLabs)和濃縮的連接緩衝液後，於室溫進行綁紮反應(最終體積10μL)10min。

然後使用DNA蓄池的等分試樣轉化大腸桿菌勝任細胞(Stellar^TM,Takara)。

以市售的Qiagen plasmid miniprep套組(Qiagen)，根據製造商的建議進行小規模的質體製備。

使用603正義(序列GTTGGCCTTCCAATGGCTT,SEQ ID NO：41)和503反義(序列GTTCCTTCACAAAGAT,SEQ ID NO：42)寡核苷酸由GATC分包商-Eurofins Genomics公司進行DNA定序。

使用MaxCyte STX藉由電穿孔進行DHODH變體的轉染。其係在如上述的OC-100處理組件中進行。

在轉染後的隔天，將細胞離心及以1×10⁶個細胞/mL就9E4 CHO細胞係再懸浮於添加6mM麩醯胺酸和25μM特立氟胺的選擇培養基中，而就KO2和KO19選殖株則無特立氟胺。

二個繼代後，以1×10⁶個細胞/mL就9E4 CHO係於添加30% FeedB和6mM麩醯胺酸及25μM特立氟胺的CD OPTiCHO培養基中開始製造mAb-A，而就KO2和KO19選殖株則無特立氟胺。

如圖4所示，在WT CHO 9E4的R138C和R346W DHODH突變體以及DHODH KO選殖株上並未觀察到顯著的效應。另一方面，G202A突變體能讓WT CHO 9E4細胞株得到公克級的抗體產量以及增進DHODH KO2和KO19選殖株的產量。

實例6：使用本發明之表現系統製造蛋白

，使用本發明之表現系統製造不同類型的蛋白，尤其是使用在實例3中所接揭示的有效選殖株CHO 9E4 KO2和KO19上包括上文所揭示的G202A突變體的人類DHODH cDNA，用以確認最終的產量至少係在等同先前技術之表現系統的範圍內，其中該先前技術係使用人類麩醯胺酸合成酶(GS)作為選擇標記。

製造下列蛋白：

-脂解酶：

○使用單順反子cDNA PLBL2-His，及

○使用選擇標記hDHODH G202A質體或hGS質體，

-單株抗體(mAb-B)：

○使用編碼抗體之VH和VL鏈的雙順反子cDNA，及

○使用選擇標記hDHODH G202A質體或hGS質體；

-雙專一性抗體：

○使用(i)編碼抗體之VH和VL鏈的單順反子cDNA或(ii)二個分別編碼抗體之VH和VL鏈的單順反子cDNA，及

○使用選擇標記(i)hDHODH G202A質體(就雙順反子cDNA而言)或(ii)二個hDHODH G202A質體或hDHODH G202A質體及hGS質體(就單順反子cDNA而言)；

-三專一性抗體：

○使用二個雙順反子cDNAs，及

○使用選擇標記hDHODH G202A質體和hGS質體。

FectoPRO®轉染的前一天，將細胞以1.5×10⁶個細胞/mL以添加6mM麩醯胺酸和5mM尿苷之CD CHO培養基稀釋。

轉染當天，將細胞懸浮液以1.1×10⁶個細胞/mL以添加6mM L-麩醯胺酸和5mM尿苷之CD CHO稀釋。將FectoPRO®試劑渦漩震盪5秒及低速離心，之後以25μL/試管加至空的50mL試管中。在第二50mL試管中，以CD CHO培養基稀釋12.5μg的cDNA並將稀釋過的DNA立即全部倒入純的FectoPRO®試劑。立刻將溶液均質並培養10min。將FectoPRO®/DNA轉染混合物倒在細胞上並將培養物於37℃、190rpm和8% CO₂量下培養。

轉染細胞後24小時，以Invitrogen^TM Countess^TM裝置計算細胞數。將全細胞培養物以200g離心10min。將團塊於下列所揭示的條件下以2 5mL預熱過的生產培養基再懸浮。

就包括3種或以上的亞單位之複合蛋白的情況下，再次使用上述的轉染法進行第二次轉染。

-就脂解酶單順反子載體(帶有組胺酸標籤(His-tag)之蛋白)

MSX：L-甲硫胺酸磺醯亞胺；Gln：麩醯胺酸：Uri：尿苷；TNF：特立氟胺

-就單株抗體mAb-B雙順反子VH和VL載體：

MSX：L-甲硫胺酸磺醯亞胺；Gln：麩醯胺酸：Uri：尿苷；TNF：特立氟胺；FeedB：市售饋料

-就雙專一性抗體雙順反子或二個單順反子VH和VL載體：

-就三專一性抗體雙順反子VH和VL載體：

轉染細胞後72小時，以Invitrogen^TM Countess^TM裝置計算細胞數，且因換成另外的培養基而蛋白產量提升。再者，在轉染後3和7天測量轉染細胞的存活率。

在轉染後第14天，將細胞於25℃以200g離心10min。將上清液經由0.22μm PES過濾器過濾並使用Octet裝置測量蛋白效價。

得到下列蛋白。

a)脂解酶

在第14天脂解酶的產量係如圖5所示。

這些結果顯示，二種KO DHODH細胞株具有在缺乏特立氟胺選擇壓力下製造脂解酶的能力，其能降低對生產細胞的毒性。

再者，KO DHODH細胞株能製造等同先前技術GS系統(在野生型9E4 CHO細胞中)範圍的脂解酶，亦即25ml量級，1g/l。

b)單株抗體mAb-B

在第14天單株抗體mAb-B產量係如圖6所示。

這些結果顯示，KO DHODH細胞株在製造該特別抗體期間表現不同。實際上，即使二種細胞株比先前技術特立氟胺製造得到更佳的產量，但KO19選殖株得到比KO2選殖株明顯更佳的產量。

在最佳的KO細胞株(KO19)中，抗體產量係在等同先前技術GS系統(在野生型9E4 CHO細胞中)的範圍內，25ml量級，大約0.67g/l。

再者，觀察到使用KO細胞株生存率增加。

c)雙專一性抗體

在第14天雙專一性抗體產量係如圖7所示。

在所有試驗的案例中，雙專一性抗體製造並不如單專一性抗體有效率。然而，儘管製造此類的雙專一性抗體困難，但最佳的KO細胞株之產量係在等同先前技術GS系統(在野生型9E4 CHO細胞中)的範圍內，25ml量級，大約0.145g/l。

再者，觀察到使用KO細胞株生存率增加。

d)三專一性抗體

在第14天三專一性抗體產量係如圖8所示。

在所有的條件下，二種KO細胞株得到等同先前技術選擇系統範圍內的結果，亦即出色的0.5g/l。

本實例因此確定KO DHODH CHO選殖株適用於表現各種蛋白形式(蛋白、單株抗體、雙專一性抗體、三專一性抗體)。這些選殖株甚至可用於雙重轉染用以製造複合蛋白。

<110> 法商賽諾菲公司(SANOFI)

<120> 含有新穎選擇標記的細胞株及其用於蛋白製造的用途

<130> BET 18P4548

<150> EP19305331.1

<151> 2019-03-19

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1188

<212> DNA

<213> 歐洲倉鼠(Cricetus cricetus)

<400> 1

<210> 2

<211> 395

<212> PRT

<213> 歐洲倉鼠(Cricetus cricetus)

<400> 2

<210> 3

<211> 1188

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 395

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於產生gRNA的對應DNA片段

<400> 5

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列1)

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列1)

<400> 7

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列2)

<400> 8

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列2)

<400> 9

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列3)

<400> 10

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列3)

<400> 11

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列4)

<400> 12

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列4)

<400> 13

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列5)

<400> 14

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列5)

<400> 15

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列6)

<400> 16

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列6)

<400> 17

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列7)

<400> 18

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列7)

<400> 19

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列8)

<400> 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列8)

<400> 21

<210> 22

<211> 14437

<212> DNA

<213> 中國倉鼠(Cricetulus griseus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1992)..(2015)

<223> 質體pBH6840 KO DHODH SEQ1和pBH6841 KO DHODH SEQ4的標靶

<220>

<221> misc_feature

<222> (2129)..(2147)

<223> 質體pBH6842 KO DHODH SEQ5的標靶

<220>

<221> misc_feature

<222> (4015)..(4047)

<223> 質體pBH6843 KO DHODH SEQ7的標靶

<400> 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於產生gRNA的對應DNA片段

<400> 23

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列1')

<400> 24

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列1')

<400> 25

<210> 26

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類DHODH G202A的胺基酸序列

<400> 26

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列2')

<400> 27

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列2')

<400> 28

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列3')

<400> 29

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列3')

<400> 30

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列4')

<400> 31

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列4')

<400> 32

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列5')

<400> 33

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列5')

<400> 34

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列6')

<400> 35

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列6')

<400> 36

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列7')

<400> 37

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列7')

<400> 38

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列8')

<400> 39

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於得到gRNA的寡核苷酸(序列8')

<400> 40

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 603正義寡核苷酸

<400> 41

<210> 42

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 503反義寡核苷酸

<400> 42

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包括標靶序列和PAM的序列

<400> 43

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包括CrispR序列n°1的正義DHODH外顯子2序列區

<400> 44

<210> 45

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包括CrispR序列n°1的反義DHODH外顯子2序列區

<400> 45

Claims

一種細胞株，其係包括部分或完全失活的內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因。
根據請求項1之細胞株，其為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。
根據請求項1或2之細胞株，其中該細胞株係藉由下列所製造

a)使細胞中的內生性DHODH基因失活，及

b)在適合產生其中內生性DHODH基因為部分或完全失活之細胞株的條件下，於包括尿苷的培養基中培養該細胞。
根據請求項3之細胞株，其中係藉由基因編輯法使該內生性DHODH基因失活。
根據請求項4之細胞株，其中係藉由CRISPR-Cas9法使該內生性DHODH基因失活。
根據請求項1至5中任一項之細胞株，其中該內生性DHODH基因之一或多個或全部等位基因為部分或完全失活的。
根據請求項1至6中任一項之細胞株，其中該細胞株進一步係包括包含編碼外生性哺乳動物DHODH之核苷酸序列和至少一用於表現重組蛋白之表現匣的表現載體，其中該外生性DHODH係包括與序列SEQ ID NO：2或與序列SEQ ID NO：4至少60%相同之序列。
一種表現系統，其係包括：

(i)根據請求項1至6中任一項之細胞株，及

(ii)包含編碼哺乳動物DHODH之核苷酸序列和至少一用於表現重組蛋白之表現匣的表現載體，其中該DHODH係包括與序列SEQ ID NO：2或與序列SEQ ID NO：4至少60%相同之序列。
根據請求項7之細胞株或根據請求項8之表現系統，其中該核苷酸序列係包括SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：3之序列。
根據請求項7或9之細胞株或根據請求項8或9之表現系統，其中該重組蛋白為單株抗體。
根據請求項7、9和10中任一項之細胞株或根據請求項8至10中任一項之表現載體，其中該載體係包括適用於選殖抗體輕鏈之第一表現匣和適用於選殖抗體重鏈之第二表現匣。
一種套組，其係包括(i)根據請求項7和9-11中任一項之細胞株或根據請求項8至11中任一項之表現系統，以及(ii)無尿苷，尤其是進一步無DHODH抑制劑之培養基。
一種活體外製造重組蛋白之方法，其係包括下列步驟：

A)a1)提供根據請求項7和9-11中任一項之細胞株；

或

a2)提供根據請求項1至6中任一項之細胞株，及

a2’)將如請求項9至11中任一項所定義的表現載體導入步驟a2)所提供的細胞株中；

或

a3)提供包括內生性DHODH基因之細胞株，

a3’)使步驟a3)所提供的細胞株中內生性DHODH基因部分或完全失活，及

a3”)將如請求項9至11中任一項所定義的表現載體導入步驟a3’)所得到的包括部分或完全失活之內生性DHODH基因的細胞株中；

B)於適合製造重組蛋白之條件下培養該細胞株；及

C)分離及/或純化該重組蛋白。
根據請求項13之方法，其中步驟B)係在無尿苷，尤其是進一步無DHODH抑制劑的培養基中進行。
根據請求項13或14之方法，其進一步係包括將該重組蛋白調配成醫藥組成物之步驟D)。
一種根據請求項7和9-11中任一項之細胞株、根據請求項9-11中任一項之表現系統或根據請求項12之套組用於製造重組蛋白之用途。
根據請求項16之用途，其中該細胞株、表現系統或套組係與無尿苷，尤其是無DHODH抑制劑的培養基組合使用。