CN109777837A - 一种利用CRISPR/Cas9***构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及一种利用CRISPR/Cas9***构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法。本发明包括以下步骤:1)设计高效识别敲除后致死基因PAM区域的sgRNA序列;2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合,将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射,注射后胚胎移植,品系基因鉴定,得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠;3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代,基因鉴定确认后最终得到致死基因全身性敲除的杂合子F1代鼠,完成可传代繁育的小鼠模型构建。本发明的技术方案与ES细胞基因打靶方式构建致死基因全身性敲除小鼠模型的现有技术相比,操作步骤简单,操作难度低,并且制作周期短,周期仅为4个月左右。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及一种利用CRISPR/Cas9***构建致死 基因全身性敲除小鼠模型的方法。
背景技术
全身性基因敲除小鼠模型是研究基因功能中较为普遍的一种方法,广泛运用到目的基因对全身生理或病理的功能研究中。其中,致死基因因为在机体内发挥重要 作用从而受到特别关注。致死基因是指基因功能的缺失导致个体在胚胎期和出生后 死亡的一类基因,包括胚胎期致死性基因和出生后致死基因。致死基因全身性敲除 的小鼠模型必须通过杂合子的形式进行传代繁育。研究预测在小鼠基因中,致死基 因约占23%(Cell,2013,154:452;Nature 2016,537:508)。
基于胚胎干细胞(ES细胞)基因打靶或敲除的方法是构建致死基因全身性敲除 小鼠模型的现有方法,大体包括以下4个步骤:(1)敲除载体设计与构建;(2)敲除ES 细胞筛选;(3)敲除ES细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠;(4)由嵌合体小鼠繁殖出生殖 遗传系的致死性基因敲除小鼠。但是,此方法制作步骤繁琐,技术操作难度高,并 且制作周期长,周期为1年以上(Nat Rev Genet,2005,6:507)。
CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的 技术。使用CRISPR***将Cas9 mRNAs或蛋白和向导RNA显微注射到小鼠受精卵 里,实现基因敲除,从而构建全身性基因敲除小鼠模型。与传统的ES细胞基因打靶 方法相比,该方法的实验周期和材料成本大大缩短和降低,已广泛运用到非致死性 基因全身性敲除的小鼠模型构建中(Cell,2013,153:910)。但是,由于CRISPR/Cas9系 统基因敲除效率高,受精卵显微注射方式通常造成致死性基因全身性敲除的首建鼠 (F0代)无法出生(胚胎期致死性基因)或性成熟前死亡(出生后致死性基因)。性 成熟期后F0代鼠的缺乏限制致死性基因敲除的传代繁育(F1代)。因此,运用 CRISPR/Cas9***通过受精卵显微注射方式无法实现可传代繁育的致死基因全身性 敲除小鼠模型的构建。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足,提供一种可传代繁育的致死基因全身性敲除小鼠模型的制备方法,此方法适用于胚胎期致死性基因和出生后致死性基 因。通过该方法可以简单、快速、高效地获得可传代繁育的致死基因全身性敲除小 鼠。
本发明的具体技术方案如下:
本发明的利用CRISPR/Cas9***构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法,包 括以下步骤:
1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列;
2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合,将混合物对小鼠 二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射,注射后胚胎移植,品系基因鉴定, 得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠;
3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代,基因鉴定确认后最终得到致死基因 全身性敲除的杂合子F1代鼠,完成可传代繁育的小鼠模型构建。
本发明所述的方法,可以针对任意种类的致死基因,包括但不限于Actr6,Armc7,Armh3,Arpc3,Atad3a,Atp5e,Atp5f1,Atxn10,Cenpl,Chka,Chmp6,Copg1, Cpsf3,Crls1,Ctla-4,Ctr9,Dars2,Dctn1,Dctn4,Ddx55,Dhodh,Dhps,Dhx33, Dpm1,Dync1i2,Dynlrb1,Ears2,Elac2,Exoc3,Exosc9,Fdft1,Fignl1,Gbf1, Gtf2h2,Ints11,Ints2,Kif18b,L3mbtl2,Lars,Leo1,Lsm10,Mau2,Med19,Mrps21, Mrps5,Mtor,Nat10,Ndufb8,Nelfe,Nhlrc2,Nhp2,Npat,Nup85,Ogdh,Orc1, Pam16,Pdcd2,Pgap2,Pitrm1,Pold3,Polr2f,Polr3f,Polr3g,Rbm33,Rnasek, Rpia,Sap130,Setd1a,Sfpq,Slc17a5,Slu7,Smc3,Smg1,Srsf7,Supt5,Taf11, Tet3,Timeless,Tmem30a,Trub2,Usp37,Usp5,Virma,Vps33b,Wac等中的一 种或几种,进一步优选地,所述致死基因为Slc17a5和/或Virma。
根据本发明所述的方法,作为优选地,所述致死基因为Slc17a5,sgRNA序列如 SEQID NO.1所示。或者,所述致死基因为Virma,sgRNA序列如SEQ ID NO.2所 示。
本发明还提供一种致死基因全身性敲除小鼠模型,所述小鼠模型由上述任一的方法构建而成。
本发明还提供了所述构建的小鼠模型在分析致死基因在机体内功能的科学研究及构建疾病模型用于药物筛选方面的应用。
本发明还提供了一种构建致死基因全身性敲除小鼠模型的试剂盒,所述试剂盒包括致死基因PAM区域的sgRNA序列和Cas9的mRNA或蛋白。所述试剂盒可以 针对任意种类的致死基因,其中包括但不限于上述的致死基因。作为优选地,所述 致死基因为Slc17a5(出生后致死基因),sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示;或者, 所述致死基因为Virma(胚胎期致死基因),sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示;再 或者,所述sgRNA序列为前述两种的组合。
针对致死性基因全身性敲除小鼠模型,运用CRISPR/Cas9***通过常规的受精 卵显微注射的方式,不能得到致死性基因全身性敲除的首建鼠(F0代),从而无法构 建致死性基因全身性敲除的小鼠模型。本发明运用CRISPR/Cas9***通过二细胞胚 胎注射的方式成功构建致死性基因全身性敲除的首建鼠(包括胚胎致死性基因和出 生后致死基因),并将致死性突变传递给F1代,从而证明二细胞胚胎注射的方式构 建致死性基因全身性敲除小鼠模型的创新性和可行性。
基于胚胎干细胞(ES细胞)基因打靶或敲除的方法是构建致死基因全身性敲除 小鼠模型的现阶段报道的唯一方法,此方法制作步骤繁琐,技术操作难度高,并且 制作周期长,周期为1年以上。但是,本发明的二细胞胚胎注射的方法操作步骤简 单,操作难度低,并且制作周期短,周期为4个月左右。本发明可以完全替代常规 的胚胎干细胞基因打靶的方法构建致死基因全身性敲除小鼠模型,提高工作效率, 降低生产成本。并且,此方法适用于各类品系小鼠致死基因全身性敲除模型的制备。
本发明的技术方案与ES细胞基因打靶方式构建致死基因全身性敲除小鼠模型 的现有技术相比,操作步骤简单,操作难度低,并且制作周期短,周期仅为4个月 左右。
附图说明
图1为本发明实施例1中首建鼠的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果;
图2为本发明实施例1中首建鼠的基因型鉴定突变位点片段TA克隆结果;
图3为本发明实施例1的F1代鼠的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果;
图4为本发明本发明实施例2中首建鼠的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序 结果;
图5为本发明实施例2的F1代鼠的的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明,均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或 制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均参照《分 子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试 剂盒和产品说明书进行。
本发明的利用CRISPR/Cas9***构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法,具 体构建过程如下:
1、CRSIPR/Cas9***原件的构建:
NCBI网站搜索致死性基因的Gene ID后,进入 https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design网站,输入Gene ID查找可用的sgRNA。PCR法制备sgRNA体外转录模板,体外转录得到sgRNA。 进行Cas9 mRNA体外转录。
2、小鼠的二细胞胚胎显微注射和胚胎移植:
配制Cas9 mRNA或蛋白和sgRNA的混合物,二细胞胚胎中一个卵裂球的显微 注射,胚胎移植。
3、嵌合体首建鼠的基因型鉴定
将新生仔鼠剪脚趾编号,并剪取部分尾巴提取基因组DNA。通过PCR,Sanger 测序和单克隆来确定是否发生了致死基因移码突变导致的基因敲除,出生的首代为 founder小鼠(F0)。
4、致死性基因全身性敲除的杂合子F1代鼠的获得
每个founder鼠都将被视为一个独立的品系与野生型小鼠交配进行传代繁育,产生F1代仔鼠,并剪脚趾编号。F1代通过PCR和Sanger测序确定杂合子F1阳性鼠。
本发明的实施例中需要的实验材料具体包括:
Hot Start High-fidelity DNA Ploymerase(NEB,M0493);
HieffTM PCR Master Mix(Yeasen,10102);
DNA Clean&ConcentratorTM-5(Zymo Research,D4014);
ZymocleanTM Gel DNA Recovery(Zymo Research,D4007)
mMESSAGE mMACHINETM T7ULTRA Transcription kit(Invitrogen,AM1345);
MEGAshortscriptTM T7Transcription kit(Invitrogen,AM1354);
MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit(Invitrogen,AM1908);
HieffTM PCR Master Mix(Yeasen,10102);
Simple Cloning Vector(Transgen,CT111);
Animal Tissues/Cells Genomic DNA Extraction Kit(Solarbio,D1700);
PX330plasmid(Addgene,plasmid#42230);
Cas9核酸酶,S.pyogenes(Neb,M0386);
Plus DNA Marker(Transgen,BM111);
Pregnant Mare Serum Gonadotrophin(PMSG)(Prospec,HOR-272);
Human Chorionic Gonadotrophin(hCG)(Prospec,HOR-250);
M2media(Sigma-Aldrich,M7167-100ML);
Modified M16Medium(1X)(Merck,MR-016-D);
Mineral oil(Sigma-Aldrich,M8410);
Hyaluronidase(Sigma-Aldrich,H3506)。
实施例1
一种利用CRISPR/Cas9***通过二细胞胚胎显微注射方式构建可传代繁育的出生后致死基因Slc17a5全身性敲除小鼠模型的方法,下面结合具体实施例,进一步阐 述本发明。
1.1 CRISPR-Cas9***元件的构建
1.1.1用于基因敲除的sgRNA序列的设计
(1)进入NCBI网站,查询小鼠Slc17a5的Gene ID:235504。
(2)进入https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design网 站,输入Gene ID查找可用的sgRNA。
(3)根据网站给出的分值选择sgRNA,分数越高代表其脱靶效应越低,sgRNA的 特异性越好。同时也要综合考虑sgRNA在CDS上的位置,使用NCBI的domain architectureretrieval工具预测该基因CDS编码的蛋白有哪些重要结构域,尽量保证 sgRNA位于结构域之前。
(4)根据上述(1)-(3)步骤,共设计一个sgRNA序列,命名为sgRNA1,序列为 5’-GGGCGCCCGGCAGACCGAAG-3’(SEQ ID NO.1)。
1.1.2sgRNA体外转录模板的制备
(1)Sangon Biotech公司合成寡聚脱氧核苷酸(DNA oligo,5’→3’)
sgRNA1F:taatacgactcactatagGGGCGCCCGGCAGACCGAAGgtttaagagctatgctggaaa(SEQ ID NO.3);
sgRNAR:aaaagcaccgactcggtgcc(SEQ ID NO.4);
(2)高保真酶PCR扩增编码sgRNA1序列的DNA片段(约120bp),每条sgRNA 配3管相同体系,体系具体如下表1所示。
表1 PCR扩增编码sgRNA1序列的体系
(3)进行PCR,PCR反应程序如下表2所示。
表2 PCR反应程序
(4)使用DNA Clean&ConcentratorTM-5试剂盒回收T7promoter/sgRNA PCR产 物的DNA。
1.1.3sgRNA体外转录和回收
(1)使用MEGAshortscriptTM T7Transcription kit转录试剂盒,配体外转录反应体 系如下表3所示。
表3配体外转录反应体系
混匀,37℃反应2h。
(2)加入1μL TURBO DNase,混匀,37℃反应15min。
(3)使用MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit回收sgRNA。
(4)混匀,取1.5μL测浓度(RNA40),260/280在2.0左右为正常,剩余sgRNA暂 放于冰。
(5)取1μL跑2%琼脂糖凝胶,正常情况下100bp左右应有明显亮带。
(6)如果浓度、跑胶结果均正常,则分装,迅速冻于-80℃冰箱,得sgRNA。
1.1.4Cas9 mRNA体外转录和回收
(1)XbaI单酶切pX330质粒,作为体外转录模板,XbaI单酶切pX330质粒体系 如下表4所示。
表4 XbaI单酶切pX330质粒体系
组分 | 体积 |
PX330 | 5μg |
XbaI | 2μL |
10×Cutsmart Buffer | 5μL |
ddH<sub>2</sub>O | 补至50μL |
混匀,37℃反应过夜。
(2)配1%琼脂糖凝胶,跑胶,切下线性化DNA所在胶块,使用ZymocleanTMGel DNARecovery回收DNA。
(3)使用mMESSAGE mMACHINETM T7ULTRA Transcription kit体外转录Cas9 mRNA:
a.配体外转录反应体系,具体如下表5所示:
表5体外转录反应体系
组分 | 体积 |
T7 2×NTP/ARCA | 10μL |
10×T7Reaction Buffer | 2μL |
体外转录模板 | 1μg |
T7Enzyme Mix | 2μL |
Nuclease-free water | 补至20μL |
混匀,37℃反应2h。
b.加入1μL TURBO DNase,混匀,37℃反应15min。
c.配加polyA尾的反应体系,具体如下表6所示:
表6加polyA尾的反应体系
组分 | 体积 |
体外转录反应体系 | 20μL |
5×E-PAP Buffer | 20μL |
25mM MnCl<sub>2</sub> | 10μL |
ATP Solution | 10μL |
Nuclease-free water | 36μL |
混匀,吸出2.5μL冰上保存。
d.加入4μL E-PAP Mix,混匀,37℃反应30min,放于冰上。
e.加入10μL Ammonium Acetate Stop,混匀。
f.使用MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit回收加尾的Cas9 mRNAs。
g.混匀,取1.5μL测浓度(RNA40),260/280在2.0左右为正常,剩余mRNA暂 放于冰。
h.根据测得浓度将mRNA稀释至约1μg/μL,取1μL以及加polyA尾前的2.5μL 跑2%琼脂糖凝胶,正常情况下加polyA尾前应有明显亮带,加polyA尾后的条带应 更大(可能略微模糊,不影响使用)。
i.如果浓度、跑胶结果均正常,则1μg每管分装,迅速冻于-80℃冰箱,得Cas9mRNA。
1.2小鼠的二细胞胚胎显微注射和胚胎移植
使用的小鼠(品系C57BL/6J)均饲养在无特定病原体(specific-pathogen-free,SPF) 的屏障环境中。
1.2.1小鼠体内受精卵的获取,体外培养发育至二细胞胚胎。
(1)0d,11:00,抓取周龄5周左右的C57BL/6J雌鼠,每只鼠腹腔注射7.5IU的 孕马血清***(PMSG)。
(2)2d,11:00,抓取注射过PMSG的C57BL/6J雌鼠,每只鼠腹腔注射7.5IU 人绒毛膜***(hCG),并将每只雌鼠单独与1只C57BL/6J公鼠合笼交配。
(3)做M16胚胎培养液滴:35mm Petri培养皿底,约50μL/滴,整齐排列,最 后用Mineral oil封住液面,37℃,5%CO2培养箱中平衡过夜。
(4)3d,8:00,检查雌鼠有无***栓(雄鼠交配后留下的分泌物痕迹),如有, 则取出鼠房。
(5)颈椎脱臼法处死雌鼠:将小鼠放在鼠笼的铁架上,使其前爪抓住上面的钢 丝条,紧紧压住它的颈部(头骨后),同时水平向后拉伸尾部,使其断颈。
(6)把处死的小鼠背部朝上,立即用75%酒精喷洒小鼠背部,尽量减少小鼠毛 发的污染。
(7)捏住小鼠背部皮肤,用外科剪刀在中下区剪开一个小口,用力抓住剪开的 皮肤,向头部和尾部拉伸使背部皮肤完全打开,毛发也完全离开内部组织。
(8)用眼科镊和锋利的剪刀打开背膜,用镊子夹起白色脂肪组织,轻轻地把子 宫、输卵管、卵巢和脂肪垫整体拉出体腔,用镊子夹住卵巢下方的子宫,用剪刀在 靠近输卵管的子宫系膜上刺一个洞,剪开子宫系膜,再用剪刀将卵巢与输卵管分离(确 保输卵管的完整性),最后剪断靠近输卵管的子宫,将输卵管放入M2体外操作液。
(9)在解剖镜下用注射器的针尖刺破输卵管膨大的壶腹部,获得卵丘细胞包裹 的受精卵团。
(10)收集所有团块,在0.1%透明质酸酶中37℃消化3-5min后,受精卵与卵 丘细胞分离。
(11)在酒精灯的火焰上灼烧毛细玻璃管拉针并断针,内径大约150μm,组装 口吸管。用口吸管移卵,分离出来的受精卵在M2滴中洗3遍,洗去残留的卵丘细 胞和透明质酸酶。
(12)将受精卵移入M16滴中洗3遍,37℃,5%CO2培养箱中培养12h,大部 分受精卵发育至二细胞胚胎阶段。
1.2.2 Slc17a5 sgRNA和Cas9 mRNA混合物配制
用于二细胞胚胎注射的混合物为25ng/μL Cas9 mRNA和12.5ng/μL Slc17a5sgRNA。一般注射需配置5μL混合物。
Cas9 mRNA 125ng
Slc17a5 sgRNA 62.5ng
注射buffer 补至5μL
4℃10000rpm离心10min,-80℃保存。
1.2.3二细胞胚胎中一个卵裂球细胞的显微注射操作
(1)将卵裂球均匀的二细胞胚胎移入M2体外操作液滴中洗3遍,37℃等待注 射。
(2)使用显微操作仪,将配制的Slc17a5 sgRNA和Cas9 mRNA混合物注入到 二细胞胚胎的一个卵裂球细胞内。约注射60个二细胞胚胎。
(3)将显微注射完后的二细胞胚胎移入M16滴中洗3遍,37℃,5%CO2培养 箱中培养3h。
1.2.4胚胎移植
A、结扎公鼠的准备
(1)称重后按100ml/kg的剂量麻醉6-8周龄公鼠,背位固定小鼠,75%乙醇消 毒手术切口部位,防止毛发污染切口。
(2)于生殖器前方约1.3cm处横向剪开下腹部皮肤,做约1cm的切口。
(3)切开腹膜,进行膀胱定位。每侧都可见有一条管道走行,用镊子轻轻夹持 左侧管道,提起部分使手术视野清晰可见,确定其为输精管。
(4)用镊子将输精管捏成U型,另一把镊子在酒精灯上加热,在两结扎点间烫 断输精管,将结扎的输精管放入体内再进行另一侧结扎。
(5)两侧手术完毕后,用0-5号缝合线缝合内外术口。将小鼠放于37℃恒温台 上直到苏醒。手术后小鼠饲养2周后确定手术是否成功。
(6)实验性饲养:将1-2只母鼠与输精管切除小鼠合笼饲养,次晨进行***栓 检查。有***栓的母鼠可用栓做涂片,显微镜下观察是否有***。也可培养至次日 取输卵管检查是否有二细胞胚胎。如果有***或有二细胞胚胎则公鼠结扎不成功。
B、受体鼠的准备
(1)同时挑选发情的ICR与结扎公鼠合笼。
(2)次日清晨检查受体鼠是否见栓,见栓当天用于胚胎移植。
C、输卵管移植
(1)准备好消毒的手术器械、缝合线等。
(2)称重后按200ml/kg的剂量对小鼠实施1.25%阿佛丁溶液麻醉,剪去小鼠背部被毛,75%酒精消毒后,在脊柱侧1cm,约与最后1肋骨平齐处,剪开皮肤,用镊子沿 切口钝性分离皮肤肌肉,用镊子轻轻拉出卵巢、输卵管和子宫,夹住部分脂肪,置 于鼠背后皮肤上。
(3)用移植针吸入25枚注射后存活的二细胞胚胎(两个完整的卵裂球),吸入顺 序为:M16培养液&空气&M16培养液&空气&二细胞胚胎,在保证胚胎完全吸入的 情况下,尽量减少培养液的吸入量。
(4)将小鼠放在解剖镜下,用小号止血钳捏住脂肪垫,用眼科镊子将包裹卵巢的膜撕开一小口,暴露出输卵管伞部,***移卵针,将受精卵吹入输卵管内,输卵管 壶腹部有明显的气泡表明移植成功。
(5)用钝镊子将脂肪垫、卵巢、子宫和输卵管一并送回腹腔,缝合腹膜及皮肤切口,移植好的受体鼠在温台上放置10min恢复后移送到屏障环境内饲养。
(6)移植后的小鼠做标记,注明移植时间、品系名称、胚胎数量。产仔后注明出 生日期和出生数量,每天观察出生幼仔的存活情况。
1.3Slc17a5基因敲除首建鼠的基因型鉴定
Slc17a5 sgRNA和Cas9 mRNA混合物注射二细胞胚胎并移植到假孕母鼠输卵管 中后,一般19-20天生育小鼠。小鼠出生6天以后,其趾间分开,可剪趾作编号标记, 剪尾尖小块组织用于基因组DNA的提取。
1.3.1鼠尾基因组DNA的提取。
鼠尾基因组DNA的提取使用Animal Tissues/Cells Genomic DNA ExtractionKit 试剂盒。
(1)200μL溶液A添加20μL的蛋白酶K(10mg/ml),加入鼠尾,55℃水浴消化过 夜。
(2)加入200μL体积溶液B,充分颠倒混匀,可放置于75℃水浴30min。
(3)加入200μL无水乙醇,充分混匀,把混悬液加入吸附柱中。
(4)12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
(5)向吸附柱中加入600μL漂洗液,12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放 入收集管中。
(6)加入600μL漂洗液再次漂洗。
(7)12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温放置数分钟。
(8)将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50μL的洗脱液,室温放置5min,12000rpm离心2min。
(9)可将离心所得洗脱液再加入吸附柱中,12000rpm离心2min,即可得到基因 组DNA。
1.3.2包含预测突变位点片段的PCR扩增,并Sanger测序。
(1)引物:Primer-F:5’-CAACAAGGCGCTACCAGATCA-3’(SEQ ID NO.5); Primer-R:5’-CACGGCGAAGGGCTGTCCTGC-3’(SEQ ID NO.6)。
(2)PCR扩增包含预测突变位点的DNA片段(约500bp),体系如下表7所示。
表7 PCR扩增包含预测突变位点的DNA片段体系
组分 | 体积(μL) |
2×Hieff<sup>TM</sup> PCR Master Mix | 25μL |
Primer-F(10μM) | 1μL |
Primer-R(10μM) | 1μL |
鼠尾基因组DNA | 1μL |
Nuclease-free water | 补至50μL |
(3)PCR反应程序如表8所示。
表8 PCR扩增程序
(4)PCR产物胶回收后,Sanger测序。
Sanger测序结果显示,本发明出生的阳性首建鼠从突变位置开始会出现一个显著的套峰,而野生型的小鼠则不会有。详细结果见图1。
1.3.3PCR产物克隆后测序确认。
PCR产物胶回收之后,用Simple Cloning Vector试剂盒连接,克隆,挑菌单克隆,做菌液PCR,筛选出阳性菌。将单克隆阳性菌送去公司Sanger测序, 筛选出移码突变的阳性敲除首建鼠。详细结果见图2与表9。
表9首建鼠基因移码突变结果
1.4 Slc17a5基因敲除杂合子F1代鼠的获得
Slc17a5基因敲除首建鼠饲养到8周龄后,与野生型C57BL/6J小鼠配种,产生 F1代小鼠。F1代小鼠的鼠尾进行鼠尾DNA的提取、突变位点片段的PCR扩增、Sanger 测序后,筛选出F1代Slc17a5基因敲除杂合子小鼠。详细结果见图3与表10。
表10 F1代鼠基因移码突变结果
实施例2
一种利用CRISPR/Cas9***通过二细胞胚胎显微注射方式构建可传代繁育的胚胎致死基因Virma全身性敲除小鼠模型的方法,下面结合具体实施例,进一步阐述 本发明。
2.1CRISPR-Cas9***元件的构建
详细步骤参照1.1的方法,Virma的Gene ID:66185。sgRNA序列,sgRNA1 序列为5’-CUAUGGGCUCGUACUCCCGG-3’(SEQ ID NO.2)。
Sangon Biotech公司合成寡聚脱氧核苷酸(DNA oligo,5’→3’)
sgRNA1F:taatacgactcactatagCTATGGGCTCGTACTCCCGGgtttaagagctatgctggaaa(SEQ ID NO.7);
sgRNAR:aaaagcaccgactcggtgcc(SEQ ID NO.4)
最终完成Virma sgRNA1和Cas9 mRNA的体外转录、纯化。
2.2小鼠的二细胞胚胎显微注射和胚胎移植
详细步骤参照实施例1中步骤1.2的方法
Virma sgRNA和Cas9 mRNA混合物配制
用于二细胞胚胎注射的混合物为25ng/μL Cas9 mRNA和12.5ng/μL VirmasgRNA1。一般注射需配置5μL混合物。
Cas9 mRNA 125ng
Virma sgRNA1 62.5ng
注射buffer 补至5μL。
使用显微操作仪,将配制的Virma sgRNA和Cas9 mRNA混合物注入到二细胞 胚胎的一个卵裂球细胞内。约注射60个二细胞胚胎。将注射完后的二细胞胚胎移植 到受体母鼠输卵管内。
2.3 Virma基因敲除首建鼠的基因型鉴定
Virma sgRNA和Cas9 mRNA混合物注射二细胞胚胎并移植到假孕母鼠输卵管中后,一般19~20天生育小鼠。小鼠出生6天以后,其趾间分开,可剪趾作编号标记, 剪尾尖小块组织用于基因组DNA的提取。
详细步骤参照实施例1中步骤1.3的方法。
基因型PCR鉴定引物:Primer-F:5’-CCCTGGATTTTAAGATTGTTGGCT-3’ (SEQ IDNO.8);Primer-R:5’-TCCACCCTGAATCTGTCCCATA-3’(SEQ ID NO. 9)。
PCR产物胶回收后,Sanger测序的结果显示:从突变位置开始会出现一个显著 的套峰,而野生型的小鼠则不会有。详细结果见图4与表9。
2.4Virma基因敲除杂合子F1代鼠的获得
Virma基因敲除首建鼠饲养到8周龄后,与野生型C57BL/6J小鼠配种,产生F1 代小鼠。F1代小鼠的鼠尾进行鼠尾DNA的提取、突变位点片段的PCR扩增、Sanger 测序后,筛选出F1代Virma基因敲除杂合子小鼠。详细结果见图5与表10。
最后所应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管 参照实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应该理解,对本发明 的技术方案进行修改或者等同替换,都不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均 应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 首都医科大学
<120> 一种利用CRISPR/Cas9***构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 1
gggcgcccgg cagaccgaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 2
cuaugggcuc guacucccgg 20
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
taatacgact cactataggg gcgcccggca gaccgaaggt ttaagagcta tgctggaaa 59
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
caacaaggcg ctaccagatc a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
cacggcgaag ggctgtcctg c 21
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
taatacgact cactatagct atgggctcgt actcccgggt ttaagagcta tgctggaaa 59
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
ccctggattt taagattgtt ggct 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
tccaccctga atctgtccca ta 22
Claims (10)
1.一种利用CRISPR/Cas9***构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法,包括以下步骤:
1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列;
2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合,将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射,注射后胚胎移植,品系基因鉴定,得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠;
3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代,基因鉴定确认后最终得到致死基因全身性敲除的杂合子F1代鼠,完成可传代繁育的小鼠模型构建。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述致死基因为Actr6,Armc7,Armh3,Arpc3,Atad3a,Atp5e,Atp5f1,Atxn10,Cenpl,Chka,Chmp6,Copg1,Cpsf3,Crls1,Ctla-4,Ctr9,Dars2,Dctn1,Dctn4,Ddx55,Dhodh,Dhps,Dhx33,Dpm1,Dync1i2,Dynlrb1,Ears2,Elac2,Exoc3,Exosc9,Fdft1,Fignl1,Gbf1,Gtf2h2,Ints11,Ints2,Kif18b,L3mbtl2,Lars,Leo1,Lsm10,Mau2,Med19,Mrps21,Mrps5,Mtor,Nat10,Ndufb8,Nelfe,Nhlrc2,Nhp2,Npat,Nup85,Ogdh,Orc1,Pam16,Pdcd2,Pgap2,Pitrm1,Pold3,Polr2f,Polr3f,Polr3g,Rbm33,Rnasek,Rpia,Sap130,Setd1a,Sfpq,Slc17a5,Slu7,Smc3,Smg1,Srsf7,Supt5,Taf11,Tet3,Timeless,Tmem30a,Trub2,Usp37,Usp5,Virma,Vps33b,Wac等中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述致死基因为Slc17a5和/或Virma。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述致死基因为Slc17a5,sgRNA序列如SEQID NO.1所示。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述致死基因为Virma,sgRNA序列如SEQID NO.2所示。
6.一种致死基因全身性敲除小鼠模型,其特征在于,所述小鼠模型由权利要求1-5任一所述的方法构建而成。
7.权利要求6所述小鼠模型在分析致死基因在机体内功能的科学研究及构建疾病模型用于药物筛选方面的应用。
8.一种构建致死基因全身性敲除小鼠模型的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括致死基因PAM区域的sgRNA序列和Cas9的mRNA或蛋白。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述致死基因为Actr6,Armc7,Armh3,Arpc3,Atad3a,Atp5e,Atp5f1,Atxn10,Cenpl,Chka,Chmp6,Copg1,Cpsf3,Crls1,Ctla-4,Ctr9,Dars2,Dctn1,Dctn4,Ddx55,Dhodh,Dhps,Dhx33,Dpm1,Dync1i2,Dynlrb1,Ears2,Elac2,Exoc3,Exosc9,Fdft1,Fignl1,Gbf1,Gtf2h2,Ints11,Ints2,Kif18b,L3mbtl2,Lars,Leo1,Lsm10,Mau2,Med19,Mrps21,Mrps5,Mtor,Nat10,Ndufb8,Nelfe,Nhlrc2,Nhp2,Npat,Nup85,Ogdh,Orc1,Pam16,Pdcd2,Pgap2,Pitrm1,Pold3,Polr2f,Polr3f,Polr3g,Rbm33,Rnasek,Rpia,Sap130,Setd1a,Sfpq,Slc17a5,Slu7,Smc3,Smg1,Srsf7,Supt5,Taf11,Tet3,Timeless,Tmem30a,Trub2,Usp37,Usp5,Virma,Vps33b,Wac等中的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述sgRNA序列为A:致死基因为Slc17a5,sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示;或者
所述sgRNA序列为B:致死基因为Virma,sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示;
或者所述sgRNA序列为A和B的组合。
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