TW202030202A - 抗bmp10抗體及以該抗體為有效成份之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑 - Google Patents
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Abstract
本發明之目的在於提供一種抗BMP10抗體及以該抗體為有效成份之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑。本發明係關於一種結合至人類BMP10(Bone morphogenetic protein-10)之抗BMP10單株抗體或其抗體片段。又，本發明係關於一種含有針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑之高血壓及高血壓性疾病之治療劑、與人類BMP10相關之疾病之診斷藥或醫藥組合物、使用該拮抗劑之人類BMP10之免疫學檢測方法或測定方法、以及用以製造高血壓及高血壓性疾病之治療用醫藥組合物之該拮抗劑之用途。
Description
本發明係關於一種結合至人類BMP10(Bone morphogenetic protein-10，骨形態生成蛋白-10)之抗BMP10單株抗體或其抗體片段、編碼該抗體或該抗體片段之DNA、含有該DNA之重組載體、將該重組載體導入至宿主細胞所獲得之轉形株、及使用該轉形株之抗體或該抗體片段之製造方法。
又，本發明係關於一種含有針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑之高血壓及高血壓性疾病之治療劑、與人類BMP10相關之疾病之診斷藥或醫藥組合物、使用該拮抗劑之人類BMP10之免疫學檢測方法或測定方法、以及用以製造高血壓及高血壓性疾病之治療用醫藥組合物之該拮抗劑之用途。
BMP10係骨形態生成蛋白10(Bone morphogenetic protein 10)之縮寫。BMP10屬於包含約20種之BMP(骨形成蛋白質)家族分子，人類BMP10係包含424個胺基酸之分泌蛋白質(非專利文獻1、2)。BMP10藉由結合至I型及II型之2個受體而使受體活化，使Smad1/5/8磷酸化，進而藉由磷酸化而活化之Smad1/5/8與Smad4形成複合體後，轉移至核內而作為轉錄因子發揮功能。
已知BMP10主要於心臟中表現(非專利文獻2、3、4)，且人類BMP10係於血液中以約10 ng/mL之濃度存在之血中循環因子(非專利文獻5)。
關於活體內之BMP10之任務，根據目前為止BMP10缺損小鼠之分析，報告有如下情況，即該BMP10係對於胎兒期之心臟之產生、血管新生重要之因子(非專利文獻6、7)。然而，BMP10缺損小鼠由於胎胚致死，故而沒有成體期中之BMP10之作用之報告，又，沒有基於在成體期中對動物投予抗BMP10抗體之報告。
又，於伴隨高血壓之擴張型心肌病即HT-DCM(Hypertensive-Dilated cardiomyopathy，高血壓-擴張型心肌病)之患者中報告有如下情況：存在BMP10之基因變異，因該基因變異而過剩分泌BMP10(非專利文獻12)。於非專利文獻12中表示若對於高血壓大鼠提供高鹽而引起心肥大，則BMP10 mRNA之表現上升。然而，於非專利文獻12中沒有關於BMP10之中和及缺損之記載，利用BMP10之中和之降壓作用之預測非常困難。
因此，極難預想抗BMP10抗體於活體內具有降壓作用、腎保護作用、心保護作用。
作為特異性地中和BMP10之抗BMP10單株抗體，已知有R＆D Systems公司所市售之MAB2926(純系No.462732)及論文上所報告之1種抗體(純系No.13C11)。又，顯示MAB2926較13C11具有強力之BMP10中和活性(非專利文獻8)。關於其他對於BMP10之特異性中和抗體，並無知曉。
高血壓係患者數最多之生活習慣疾病。存在Ca拮抗藥、利尿藥、ACE(Angiotensin Converting Enzyme，血管收縮素轉化酶)抑制劑、ARB(Angiotensin Receptor Blocker，血管緊張素受體拮抗劑)等大量藥劑，但於美國報告有僅35%可適當地控制血壓(非專利文獻9)。作為無法控制高血壓之原因之一，可列舉由長期之服用期間導致之依從性降低。因此，期望可持續且穩定地控制血壓之新穎降壓藥。
作為難以利用既有降壓藥進行控制之一種高血壓，可列舉鹽敏感性高血壓。健康人係視食鹽之攝取量自腎臟***鈉而保持恆常性，但若為鹽敏感性高血壓患者，則腎臟之鈉***機制產生異常。於產生鹽敏感性亢進之病態中，為了***與健康人等量之鈉而需要更高之血壓，因此視鹽攝取量而呈現出高血壓。作為對症方法，進行低鹽療法，但因由低鹽飲食引起之QOL(Quality of life，生活質量)降低等，故而可藉由低鹽療法達成降壓之患者並不多(非專利文獻10)。因此，要求有可治療鹽敏感性高血壓之以新穎分子為靶之新穎機理之降壓藥。
控制不良之高血壓係與腦中風、心臟病發作、心衰竭、腎病等循環器官疾病之發病風險相關。由於腎衰竭進展而導致血中鈉之蓄積、體液蓄積、血壓調節因子之活化、尿毒癥物質之蓄積等，進而使血壓上升。又，由體液蓄積導致之心衰竭導致心排血量之降低，結果引起交感神經或體液調節因子之異常，從而使血壓控制變得困難。如上所述，產生稱為心腎綜合症之惡性循環，即腎衰竭、心衰竭使高血壓等血流動力學障礙惡化，血流動力學障礙使腎衰竭、心衰竭病態惡化(非專利文獻11)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：美國專利第8287868號說明書
專利文獻2：美國專利申請公開第2017/0137503號說明書
[非專利文獻]
非專利文獻1：FEBS Letters 586 1846-1859 (2012)
非專利文獻2：J Biol Chem. 2011 Jul 1; 286 (26): 22785-94
非專利文獻3：Mech Dev. 1999 Feb; 80 (2): 181-4.
非專利文獻4：Dev Genes Evol. 2004 Feb; 214 (2): 96-8.
非專利文獻5：Blood. 2012 Jun 21; 119 (25): 6162-6171.
非專利文獻6：Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jul 16; 110 (29): 11887-92
非專利文獻7：Development. 2004 May; 131 (9): 2219-2231.
非專利文獻8：Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jun 23; 112(25): E3207-15
非專利文獻9：Expert Opin Biol Ther. 2010 Jul; 10 (7): 1077-87
非專利文獻10：實驗醫學 33 (7): 1078-1084, 2015.
非專利文獻11：Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2014 Oct; 18 (19): 2918-26.
非專利文獻12：Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007 Dec ; 293 (6): H3396-403.
[發明所欲解決之問題]
因此，作為新穎之高血壓治療藥，期望可達成腎臟保護作用、心臟保護作用兩者之治療劑。又，如上所述，對於新穎之高血壓治療藥，要求如下三個特徵：持續且穩定之血壓之控制、經由新穎之靶之降壓作用、及對於腎臟及心臟之保護作用。
本發明之目的在於提供一種抗BMP10抗體及以該抗體為有效成份之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑。
[解決問題之技術手段]
本發明人等為了明確抗BMP10抗體於活體內之作用，而使用大鼠來嘗試取得抗BMP10抗體，結果成功地取得與既有抗體相比，對於BMP10之中和活性及結合活性得到顯著提高之抗BMP10抗體。此外，亦明確對於ALK1高表現細胞，既有抗體不具有中和活性，相對於此，所取得之抗BMP10抗體具有強力之中和活性。
進而發現既有抗體與ALK1競爭，相對於此，所取得之抗BMP10抗體具有與BMPRII、內皮糖蛋白(Endoglin)拮抗之新穎抑制方式。此外亦明確，藉由使用所取得之抗BMP10抗體，而於血中存在包含BMP9與BMP10之異質二聚物。進而明確，所取得之抗BMP10抗體於ALK1高表現細胞中對於包含BMP9與BMP10之異質二聚物具有強力之中和活性。
進而使用所取得之抗體，對於抗BMP10抗體於活體內之作用進行了研究。其結果發現，本發明之抗BMP10抗體有持續性之降壓作用；進而顯著地改善鹽敏感性病態中之高血壓及鈉***障礙；具有對於伴隨高血壓之絲球體損傷、腎小管損傷、心臟舒張功能障礙之治療效果。
本發明人等基於該等見解，想到可提供一種以抗BMP10抗體作為有效成份之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑，以至完成本發明。
即，本發明係關於以下之(1)～(18)。
(1)一種單株抗體或該抗體片段，其包含：重鏈，該重鏈包括分別包含序列編號29及31所表示之胺基酸序列之互補決定區(complementary determining region；以下縮寫為CDR)1及3、以及包含序列編號30所表示之胺基酸序列或序列編號30所表示之胺基酸序列之第16號之絲胺酸被置換為天冬醯胺之胺基酸序列之CDR2；以及輕鏈，該輕鏈包括分別包含序列編號32～34所表示之胺基酸序列之CDR1～3。
(2)如(1)記載之單株抗體或該抗體片段，其包括包含選自序列編號71～87之任一個胺基酸序列之重鏈可變區(以下縮寫為VH)及/或包含選自序列編號70及88～97之任一個胺基酸序列之輕鏈可變區(以下縮寫為VL)。
(3)如(1)或(2)記載之單株抗體或該抗體片段，其選自以下之(a)～(w)，
(a)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號73所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(b)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號73所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(c)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號75所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(d)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號75所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(e)包括包含序列編號89所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號77所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(f)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號77所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(g)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號78所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(h)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號78所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(i)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(j)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(k)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(l)包括包含序列編號89所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(m)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(n)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(o)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(p)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(q)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(r)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(s)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(t)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(u)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(v)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段；
(w)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段。
(4)如(1)至(3)中任一項記載之單株抗體或該抗體片段，其具有BMP10之中和活性。
(5)如(1)至(4)中任一項記載之單株抗體或該抗體片段，其具有BMP9/BMP10異質二聚物之中和活性。
(6)如(1)至(5)中任一項記載之單株抗體或該抗體片段，其係基因重組抗體。
(7)如(1)至(6)中任一項記載之抗體片段，其係選自Fab、Fab'、F(ab')2
、單鏈抗體(scFv)、二聚物化V區(雙功能抗體(diabody))、二硫鍵穩定化V區(dsFv)及包含CDR之肽之抗體片段。
(8)一種DNA，其編碼如(1)至(7)中任一項之單株抗體或該抗體片段。
(9)一種重組載體，其含有如(8)記載之DNA。
(10)一種轉形株，其係將如(9)記載之重組載體導入至宿主細胞而獲得。
(11)一種如(1)至(7)中任一項記載之單株抗體或該抗體片段之製造方法，其特徵在於：將如(10)記載之轉形株於培養基中進行培養，自培養物採集該抗體或該抗體片段。
(12)一種高血壓及/或高血壓性疾病之治療劑，其含有針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑。
(13)如(12)記載之治療劑，其係與BMP9拮抗劑同時或逐次地投予。
(14)一種含有BMP9拮抗劑之高血壓及/或高血壓性疾病之治療劑，其特徵在於：與針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑同時或逐次地投予。
(15)一種與人類BMP10相關之疾病之診斷藥，其含有針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑。
(16)一種人類BMP10之免疫學檢測方法或測定方法，其使用針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑。
(17)一種醫藥組合物，其含有針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑與藥理學上所容許之載體。
(18)一種針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑之用途，其用以製造高血壓及高血壓性疾病之治療用醫藥組合物。
[發明之效果]
本發明之抗體係與既有抗體相比，對於BMP10之中和活性及結合活性之至少一者得到顯著提高之抗BMP10抗體。又，本發明之抗體於ALK1高表現細胞中具有對於BMP10之中和活性。又，本發明之抗體抑制人類BMP10與人類BMPRII及人類內皮糖蛋白之結合。
又，顯示藉由本發明之抗體，而包含人類BMP9與人類BMP10之異質二聚物存在於人血中。進而，本發明之抗體於ALK1高表現細胞中具有對於包含人類BMP9與人類BMP10之異質二聚物之中和活性。
又，本發明之抗體具有於高血壓病態中使血壓持續下降之作用。進而，本發明之抗體使鹽敏感性高血壓中之高血壓及鈉***障礙顯著改善。此外，本發明之抗體具有對於伴隨高血壓之腎臟腎小管間質損傷、腎臟絲球體損傷、心臟舒張功能障礙之改善作用。
本發明之抗體係具有上述一個以上或全部特徵之抗體。可提供編碼具有此種特徵之該抗體之DNΑ、含有該DNΑ之載體、導入該載體所獲得之轉形株、使用該轉形株之該抗體或該抗體片段之製造方法、藉由以該抗體或該抗體片段為有效成份而針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑。
本發明係關於一種結合至人類BMP10之單株抗體。又，本發明係關於一種結合至BMP9/BMP10異質二聚物之單株抗體。
於本發明中，與本發明之單株抗體競爭性地結合至人類BMP10之抗體係指於所需之結合檢測系統中，抑制本發明之單株抗體與人類BMP10之結合的抗體。
所謂結合至與本發明之單株抗體所結合之表位相同之表位之抗體，係指識別與本發明之單株抗體所識別之人類BMP10之胺基酸序列相同之序列並結合之抗體。
人類BMP10具有序列編號47所表示之胺基酸序列，並以單鏈之前驅物蛋白質(Pre-Pro體)之形式合成。該單鏈之Pre-Pro體於將序列編號2所表示之胺基酸序列中第1號至第21號為止之訊息肽區域切斷而成為全長體後，經由存在於第388號之半胱胺酸殘基間之雙硫鍵而形成二聚物(Pro二聚物、或全長體二聚物)。
其後，藉由furin樣蛋白酶而於序列編號47所表示之胺基酸序列之第316號與第317號之胺基酸殘基間發生切斷，分割為N末側片段之前導肽(Pro-peptide)區域(包含序列編號47所表示之胺基酸序列中第22號之胺基酸至第316號之胺基酸為止之肽；亦稱為N末前導肽體)、與包含序列編號48所表示之胺基酸序列之C末側片段(亦稱為成熟區或成熟體)。
上述成熟區係於前導肽區域之切斷後，亦經由殘留於序列編號48所表示之胺基酸序列之第72號之半胱胺酸殘基間的雙硫鍵而形成二聚物(以下，記載為成熟二聚物)。經切斷之N末側之前導肽區域之2個分子與該成熟二聚物1分子經由非共價鍵而形成複合體，並以該複合體之形態自細胞分泌出。成熟二聚物及於成熟二聚物結合有N末前導肽區域之複合體均具有BMP10之功能。
因此，作為本發明中之人類BMP10，係指包含序列編號47或基因庫登錄號NP_055297所示之胺基酸序列中相當於成熟區之第317號至第424號之胺基酸序列(序列編號48)、且具有人類BMP10之功能之多肽。
又，作為本發明中之人類BMP10，係指包含於序列編號48所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加有1個以上胺基酸之胺基酸序列、且具有人類BMP10之功能之多肽。進而，作為本發明中之人類BMP10，係指包含與序列編號48所示之胺基酸序列具有60%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上、最佳為95%以上之同源性之胺基酸序列、且具有人類BMP10之功能之多肽。進而，作為本發明中之人類BMP10，亦包含上述成熟二聚物、及於成熟二聚物結合有N末前導肽區域之複合體。
人類BMP9具有序列編號66所表示之胺基酸序列，並以單鏈之前驅物蛋白質(Pre-Pro體)之形式合成。該單鏈之Pre-Pro體於將序列編號66所表示之胺基酸序列中第1號至第22號之訊息肽區域切斷後，經由存在於第392號之半胱胺酸殘基間之雙硫鍵而形成二聚物(Pro二聚物)。
其後，藉由furin樣蛋白酶而於序列編號66所表示之胺基酸序列之第319號與第320號之胺基酸殘基間發生切斷，分割為N末側片段之前導肽區域(包含序列編號66所表示之胺基酸序列中第23號之胺基酸直至第319號之胺基酸為止之肽)與包含序列編號65所表示之胺基酸序列之C末側片段(成熟區)。
上述成熟區於前導肽區域之切斷後，亦經由殘留於序列編號65所表示之胺基酸序列之第73號之半胱胺酸殘基間之雙硫鍵而二聚物(以下記載為成熟二聚物)。經切斷之N末側之前導肽區域之2個分子與該成熟二聚物1分子經由非共價鍵而形成複合體，並以該複合體之形態自細胞分泌出[J.Biol.Chem., 280, 26, 25111(2005)]。成熟二聚物及於成熟二聚物結合有N末前導肽區域之複合體均具有BMP9之功能。
因此，作為本發明中之人類BMP9，係指包含序列編號66或基因庫登錄號NP_057288所示之胺基酸序列中相當於成熟區之第320號至第429號之胺基酸序列(序列編號65)、且具有人類BMP9之功能之多肽。
又，作為本發明中之人類BMP9，係指包含於序列編號65所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加有1個以上胺基酸之胺基酸序列、且具有人類BMP9之功能之多肽。
進而作為本發明之人類BMP9，係指包含與序列編號65所示之胺基酸序列具有60%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上、最佳為95%以上之同源性之胺基酸序列、且具有人類BMP9之功能之多肽。進而，作為本發明之人類BMP9，亦包含上述成熟二聚物、及於成熟二聚物結合有N末前導肽區域之複合體。
上述BMP不僅為同一蛋白質之二聚物(以下，記載為同型二聚物)，亦與屬於BMP家族之其他蛋白質形成二聚物(以下，記載為異質二聚物)。本發明中之包含BMP9與BMP10之異質二聚物(亦記載為BMP9/BMP10異質二聚物)包含相當於序列編號48所示之BMP10成熟區之胺基酸序列、與相當於序列編號65所示之BMP9成熟區之胺基酸序列兩者。
又，本發明之BMP9/BMP10異質二聚物亦包括包含於序列編號48所示之胺基酸序列及序列編號65所示之胺基酸序列之至少一者中缺失、置換或加成有1個以上胺基酸之胺基酸序列、且具有人類BMP9/BMP10異質二聚物之功能之多肽。進而，本發明之BMP9/BMP10異質二聚物亦包括：包含與序列編號48所示之胺基酸序列及序列編號65所示之胺基酸序列之至少一者具有60%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上、最佳為95%以上之同源性之胺基酸序列、且具有人類BMP9/10異質二聚物之功能之多肽。進而本發明之BMP9/BMP10異質二聚物亦包含於人類BMP9/10異質二聚物結合有N末前導肽區域之複合體。
作為上述BMP10之功能，係指與BMP10之細胞內之訊號傳遞相關。於細胞內之訊號傳遞中，BMP10結合至屬於TGFβ超家族之I型及II型之2個受體，藉此使該受體活化，使Smad1/5/8磷酸化，進而藉由磷酸化所活化之Smad1/5/8與Smad4形成複合體後，轉移至核內，而作為轉錄因子發揮功能。
作為上述BMP9之功能，係指與BMP9之細胞內之訊號傳遞相關。於細胞內之訊號傳遞中，BMP9結合至屬於TGFβ超家族之I型及II型之2個受體，藉此使該受體活化，使Smad1/5/8磷酸化，進而藉由磷酸化所活化之Smad1/5/8與Smad4形成複合體後，轉移至核內，而作為轉錄因子發揮功能。
作為I型受體，可列舉：ALK1及ALK2、ALK3、ALK6。又，作為II型受體，可列舉：BMPII型受體(BMPRII)、活化素IIa型受體(ActRIIa)、及活化素IIb型受體(ActRIIb)。又，作為I型及II型以外之受體，可列舉內皮糖蛋白(Endoglin)。
作為獲得具有於序列編號48所示之胺基酸序列及序列編號65所示之胺基酸序列之至少一者中缺失、置換或附加有1個以上胺基酸之胺基酸序列之多肽的方法，可列舉如下方法：使用定點突變法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)]等，對例如編碼具有序列編號48或序列編號65所示之胺基酸序列之多肽之基因導入定點突變。
缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳為1個～數十個、例如1～20個，更佳為1個～數個、例如1～5個胺基酸。
作為編碼人類BMP10之基因，可列舉序列編號49或基因庫登錄號(Genbank Accession)NM_014482所示之鹼基序列。其中，本發明之編碼人類BMP10之基因亦包括：包含編碼包含於相當於成熟區之序列編號50所示之鹼基序列中缺失、置換或附加有1個以上鹼基之鹼基序列、且具有人類BMP10之功能之多肽之DNA的基因。又，本發明之編碼人類BMP10之基因亦包括：包含編碼包含與序列編號50所示之鹼基序列具有至少60%以上、較佳為80%以上、進而較佳為95%以上之同源性之鹼基序列、且具有人類BMP10之功能之多肽之DNA的基因。進而，本發明之編碼人類BMP10之基因亦包括：包含編碼包含與具有序列編號50所示之鹼基序列之DNA在嚴格條件下進行雜交之DNA、且具有人類BMP10之功能之多肽之DNA的基因等。
作為在嚴格條件下進行雜交之DNA係指藉由如下方法所獲得之能夠進行雜交之DNA：將具有序列編號50所示之鹼基序列之DNA用於探針之菌落雜交法、溶菌斑雜交法、南方墨點雜交法或DNA微陣列法等。
具體而言，可列舉如下DNA：使用固定有源自經雜交之菌落或溶菌斑之DNA、或者具有該序列之PCR產物或寡DNA的過濾器或載玻片，於0.7～1.0 mol/L之氯化鈉之存在下，於65℃下進行雜交[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]後，使用0.1～2倍濃度之SSC(Saline sodium citrate，檸檬酸鈉鹽水)溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成包含150 mmol/L氯化鈉、15 mmol/L檸檬酸鈉)，於65℃條件下將過濾器或載玻片洗淨，藉此能夠進行鑑定之DNA。
作為能夠進行雜交之DNA，可列舉：與序列編號50所示之鹼基序列具有至少60%以上之同源性之DNA、較佳為具有80%以上之同源性之DNA、進而較佳為具有95%以上之同源性之DNA。
編碼真核生物之蛋白質之基因之鹼基序列經常可見基因之多態性。本發明之編碼BMP10之基因亦包括本發明所使用之基因中因此種多態性而於鹼基序列中產生小規模突變而成之基因。
關於本發明中之同源性之數值，除特別標明之情形以外，可為使用業者公知之同源性檢索程式所算出之數值，關於鹼基序列，可列舉：於BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]中使用預設之參數所算出之數值等，關於胺基酸序列，可列舉：於BLAST2[Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997)、Genome Res., 7, 649 (1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中使用預設之參數所算出之數值等。
作為預設之參數，G(起始空位罰分(Cost to open gap))於鹼基序列之情形時為5，於胺基酸序列之情形時為11，-E(空位延伸罰分(Cost to extend gap))於鹼基序列之情形時為2，於胺基酸序列之情形時為1，-q(核苷酸錯配罰分(Penalty for nucleotide mismatch))為-3，-r(核苷酸匹配獎分(reward for nucleotide match))為1，-e(期望值(expect value))為10，-W(序列長度(wordsize))於鹼基序列之情形時為11個殘基，於胺基酸序列之情形時為3個殘基，-y[以位數表示之非空位延伸下降值(Dropoff(X)for blast extensions inbits)]於blastn之情形時為20，於blastn以外之程式中為7，-X(以位數表示之空位比對下降值(X dropoff value for gapped alignment in bits))為15，且-Z(以位數表示之最終空位比對下降值(final X dropoff value for gapped alignment in bits))於blastn之情形時為50，於blastn以外之程式中為25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
包含序列編號47或基因庫登錄號NP_055297所示之胺基酸序列之部分序列的多肽可藉由業者公知之方法進行製作，例如可藉由如下方式進行製作：使編碼序列編號47所示之胺基酸序列之DNA之一部分缺失，並導入包含其之表現載體而獲得轉形株，將該轉形株進行培養。
又，基於藉由上述方法所製作之多肽或DNA，並藉由與上述相同之方法，可獲得具有於序列編號47或基因庫登錄號NP_055297所示之胺基酸序列之部分序列中缺失、置換或附加有1個以上胺基酸之胺基酸序列的多肽。
進而，包含序列編號47或基因庫登錄號NP_055297所示之胺基酸序列之部分序列之多肽、或具有於序列編號47或基因庫登錄號NP_055297所示之胺基酸序列之部分序列中缺失、置換或附加有1個以上胺基酸之胺基酸序列的多肽亦可藉由茀基甲氧基羰基(Fmoc)法、第三丁氧羰基(tBoc)法等化學合成法進行製造。
關於BMP9，亦可藉由上述方法、或日本專利特開2017-25011號公報所記載之方法等公知之方法，製作具有缺失、置換或附加有1個以上胺基酸之胺基酸序列的多肽。
本發明之拮抗劑係指藉由抑制配體與其受體蛋白質之結合而抑制受體之活化者。
本發明之BMP10拮抗劑係指藉由抑制BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者與該等之受體蛋白質之結合而抑制受體之活化者。又，本發明之BMP10拮抗劑係指具有BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之中和活性者。本發明之BMP10拮抗劑包含本發明之抗BMP10單株抗體或該抗體片段。
本發明之BMP9拮抗劑係指藉由抑制BMP9與其受體蛋白質之結合而抑制受體之活化者。又，本發明之BMP9拮抗劑係指具有BMP9之中和活性者。作為本發明之BMP9拮抗劑，例如可列舉抗BMP9抗體。
本發明之抗BMP10單株抗體(以下亦稱為本發明之抗體或本發明之單株抗體) 或其抗體片段之一態樣係識別人類BMP10之胺基酸序列、或其立體結構且進行結合之抗體或其抗體片段。本發明之或其抗體片段之一態樣係結合至人類BMP10之胺基酸序列、或其立體結構，抑制BMP10與BMPRII之結合，抑制BMP10與內皮糖蛋白之結合，不會抑制BMP10與ALK1之結合之抗體或其抗體片段。又，本發明之抗體或其抗體片段之一態樣係識別人類BMP9/BMP10異質二聚物之胺基酸序列、或其立體結構且進行結合之抗體或其抗體片段。本發明之或其抗體片段之一態樣係具有BMP10之中和活性之抗體或其抗體片段。本發明之或其抗體片段之一態樣係具有BMP9/BMP10異質二聚物之中和活性之抗體或其抗體片段。
作為本發明之抗體或其抗體片段，只要具有1個或複數個上述任一特徵，則可為任何者，最佳為具有如下全部特徵者，即結合至BMP10，抑制BMP10與BMPRII之結合及BMP10與內皮糖蛋白之結合，不抑制BMP10與ALK1之結合，具有BMP10之中和活性，結合至BMP9/BMP10異質二聚物，具有BMP9/BMP10異質二聚物之中和活性。
又，作為本發明之單株抗體或其抗體片段之一態樣，亦包含與本發明之單株抗體競爭性地結合至人類BMP10之抗體或其抗體片段。較佳為與本發明之單株抗體或其抗體片段競爭性地結合至人類BMP10，且具有BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之中和活性之抗體或其抗體片段。
進而，作為本發明之單株抗體或其抗體片段之一態樣，亦包含結合至與本發明之單株抗體或其抗體片段所結合之表位相同之表位之抗體或其抗體片段。較佳為亦包含：結合至與本發明之單株抗體或其抗體片段所結合之表位相同之表位，且具有BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之中和活性之抗體或其抗體片段。
作為本發明中之人類BMP10之胺基酸序列，例如可列舉：包含序列編號48所表示之人類BMP10成熟區之胺基酸序列2個，且第72號之半胱胺酸殘基間形成有雙硫鍵者。
作為本發明中之人類BMP10之立體結構，只要具有與包含序列編號47、基因庫登錄號NP_055297或序列編號48所示之胺基酸序列之人類BMP10於天然狀態下可採取之結構同等之結構，則可為任意結構。人類BMP10於天然狀態下可採取之立體結構係指人類BMP10之天然型之立體結構。
作為本發明中之人類BMP9之胺基酸序列，例如可列舉：包含序列編號65所表示之人類BMP9成熟區之胺基酸序列2個，且第73號之半胱胺酸殘基間形成有雙硫鍵者。
作為本發明中之人類BMP9之立體結構，只要具有與包含序列編號66、基因庫登錄號NP_057288或序列編號65所示之胺基酸序列之人類BMP9於天然狀態下可採取之結構同等之結構，則可為任意結構。人類BMP9於天然狀態下可採取之立體結構係指人類BMP9之天然型之立體結構。
作為本發明中之人類BMP9/BMP10異質二聚物之胺基酸序列，例如可列舉：包含序列編號48所表示之人類BMP10成熟區之胺基酸序列及序列編號65所表示之人類BMP9成熟區之胺基酸序列各1個，且半胱胺酸殘基間形成有雙硫鍵者。
作為本發明中之人類BMP9/10異質二聚物之立體結構，只要具有與包含序列編號47、基因庫登錄號NP_055297或序列編號48所示之胺基酸序列及序列編號66、基因庫登錄號NP_057288或序列編號65所示之胺基酸序列2個之人類BMP9/10異質二聚物於天然狀態下可採取之結構同等之結構，則可為任意結構。人類BMP9/10異質二聚物於天然狀態下可採取之立體結構係指人類BMP9/10異質二聚物之天然型之立體結構。
作為本發明中之BMPRII，可列舉：包含序列編號51或基因庫登錄號NP_001195所示之胺基酸序列中相當於細胞外區域之第27號至第150號之胺基酸序列之多肽。
作為本發明中之ALK1，可列舉：包含序列編號52或基因庫登錄號NP_000011所示之胺基酸序列中相當於細胞外區域之第22號至第118號之胺基酸序列之多肽。
作為本發明中之內皮糖蛋白，可列舉：包含序列編號69或基因庫登錄號NP_001108225所示之胺基酸序列中相當於細胞外區域之第27號至第586號之胺基酸序列之多肽。
本發明中之ALK1高表現細胞係指較通常大量地表現ALK1之細胞。ALK1高表現細胞亦包括下述實施例3之3-1)所記載之人類ALK1表現報導細胞及ALK1/Id1-Luc/CHO細胞。
作為本發明中之抗體，具體而言，可列舉：以下之(A)或(B)所表示之單株抗體及該抗體片段。
(A)如下單株抗體及該抗體片段，其包含：重鏈，該重鏈包括分別包含序列編號29～31所表示之胺基酸序列之互補決定區(complementary determining region；以下縮寫為CDR)1～3；以及輕鏈，該輕鏈包括分別包含序列編號32～34所表示之胺基酸序列之CDR1～3。
(B)如下單株抗體及該抗體片段，其包括：重鏈，該重鏈包括分別包含序列編號29及31所表示之胺基酸序列之互補決定區(complementary determining region；以下縮寫為CDR)1及3、以及包含序列編號30所表示之胺基酸序列之第16號之絲胺酸被置換為天冬醯胺之胺基酸序列(序列編號99)之CDR2；以及輕鏈，該輕鏈包括分別包含序列編號32～34所表示之胺基酸序列之CDR1～3。
又，作為本發明之單株抗體或其抗體片段，可列舉：與上述單株抗體或其抗體片段競爭性地結合至人類BMP10之抗體及該抗體片段。
進而，作為本發明之單株抗體或其抗體片段，可列舉：結合至與上述單株抗體或其抗體片段所結合之存在於人類BMP10之表位相同之表位的單株抗體及該抗體片段。
所謂結合活性，例如係指本發明之抗體或其抗體片段具有結合於人類BMP10之胺基酸序列、或其立體結構之活性。
本發明之抗體之結合活性例如可藉由使用固相抗原之酶聯免疫吸附法(ELISA)等針對人類BMP10或表現出人類BMP10之組織之公知之免疫學檢測法、可調查特定抗原及抗體對於特定抗原之結合性之方法等而進行確認。此外，亦可列舉：使用Biacore Systems(GE Healthcare公司製造)等之表面電漿子共振、使用ITC(DKSH公司製造)等之等溫滴定熱量測定(Isothermal Titration Calorimetry)等方法。
抗體對於抗原之結合解離常數(Kd值)可藉由根據ELISA、表面電漿子共振、等溫滴定熱量測定之任一種方法，依據史卡查作圖法(Scatchard plot)、或各裝置之隨附文件來進行分析而求出。具體而言，Kd值可藉由根據使用Biacore Systems(GE Healthcare公司製造)所測得之感測器圖譜(sensorgram)，藉由單循環動力學算出法(BIAevaluation Software ver.3、GE Healthcare公司製造)進行分析而算出。
本發明之所謂對於BMP10之中和活性，係例如結合至人類BMP10之抗體或該抗體片段抑制人類BMP10向受體之結合而抑制受體活化。中和活性例如可藉由使用人類BMP10受體表現細胞之方法、可調查抗體對於人類BMP10與受體蛋白質之結合之抑制的方法等來進行測定。
本發明之所謂對於人類BMP9/BMP10異質二聚物之中和活性，係例如結合至人類BMP9/BMP10異質二聚物之抗體或該抗體片段抑制人類BMP9/BMP10異質二聚物向受體之結合而抑制受體活化。
作為中和人類BMP9/BMP10異質二聚物之方法，例如可列舉如下方法：將結合至人類BMP9之抗體或該抗體片段與結合至人類BMP10之抗體或該抗體片段進行混合，而抑制人類BMP9/BMP10異質二聚物向受體之結合從而抑制受體活化。又，亦可列舉如下方法：使用結合至人類BMP10且抑制人類BMP9/BMP10異質二聚物向受體之結合之抗體而抑制受體活化。
作為中和活性之測定方法，例如可藉由使用人類BMP9/BMP10異質二聚物之受體表現細胞之方法、可調查抗體對於人類BMP9/BMP10異質二聚物與受體蛋白質之結合之抑制之方法等來進行確認。
作為使用人類BMP10受體表現細胞或人類BMP9/BMP10異質二聚物受體表現細胞之中和活性之測定方法，例如可列舉：利用螢光素酶等酶對轉錄因子之活化進行檢測之報告基因檢測(reporter assay)等方法。
作為調查抗體對於人類BMP10與受體蛋白質、或人類BMP9/BMP10異質二聚物與受體蛋白質之結合之抑制的方法，例如可列舉：使用Biacore Systems(GE Healthcare公司製造)等之表面電漿子共振、酶聯免疫吸附法(ELISA)等方法。
本發明之抗體或其抗體片段結合至人類BMP10之胺基酸序列、或其立體結構之情況可藉由使用固相抗原之酶聯免疫吸附法(ELISA)等針對人類BMP10或表現出人類BMP10之組織之公知之免疫學檢測法、可調查特定抗原及抗體對於特定抗原之結合性之方法等來進行確認。
又，亦可組合公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗指南、Kodansha Scientific(1987)]等而進行確認。
作為表現出人類BMP10之組織，只要表現該BMP10，則可為任意組織，例如可列舉：血液、心臟、肝臟等。
作為本發明之單株抗體，可列舉：由融合瘤產生之抗體、或由經包含抗體基因之表現載體轉形而成之轉形株產生之基因重組抗體。
所謂單株抗體，係單一純系之抗體產生細胞所分泌之抗體，且特徵在於僅識別一個表位(亦稱為抗原決定基)且構成單株抗體之胺基酸序列(一級序列(primary sequence))均一。
作為表位，例如可列舉：單株抗體所識別、結合之單一胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、結合有糖鏈之胺基酸序列及包含結合有糖鏈之胺基酸序列之立體結構等。
本發明之單株抗體結合於人類BMP10之胺基酸序列。
本發明之單株抗體所結合之表位包含於序列編號47所示之人類BMP10之胺基酸序列中，更佳為包含於序列編號48所示之胺基酸序列中。
本發明中，雙特異性抗體係指具有特異性不同之2種抗原結合區之抗體。雙特異性抗體之各抗原結合區可結合至單一抗原之不同表位，亦可結合至不同抗原。
一分子之雙特異性抗體係一個以上之抗原結合區結合至單一抗原之不同表位、或不同抗原各者，即分別以一價以上進行結合。例如於本發明中，一分子之雙特異性抗體於具有結合至BMP10之抗原結合區及結合至BMP9之抗原結合區各一個之情形時，該雙特異性抗體係分別以一價結合至BMP10及BMP9。
本發明之抗體亦包括結合至BMP9與BMP10之雙特異性抗體。
融合瘤例如可藉由如下方式進行製備：將上述人類BMP10以抗原之形式進行製備，自免疫了該抗原之動物誘發具有抗原特異性之抗體生產細胞，進而使該抗體生產細胞與骨髓瘤細胞進行融合。將該融合瘤進行培養，或將該融合瘤細胞投予至動物而使該動物腹水癌化，將該培養液或腹水進行分離、純化，藉此可取得抗BMP10單株抗體。
作為免疫抗原之動物，只要可製作融合瘤，則可使用任何者，較佳為可使用小鼠、大鼠、倉鼠、雞或兔等。又，自此種動物取得具有抗體產生能力之細胞，對該細胞在活體外實施免疫後，與骨髓瘤細胞融合所製作之融合瘤所產生之抗體等亦包括於本發明之抗體中。
作為本發明中之基因重組抗體，包括人型嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或抗體片段等藉由基因重組所製造之抗體。於基因重組抗體中，具有單株抗體之特徵，且抗原性較低，血中半衰期得到延長者作為治療藥較佳。基因重組抗體例如可列舉：使用基因重組技術改型上述本發明之單株抗體而成者。
人型嵌合抗體係指包含人類以外之動物之抗體之重鏈可變區(亦記為VH)及輕鏈可變區(亦記為VL)與人類抗體之重鏈恆定區(亦記為CH)及輕鏈恆定區(亦記為CL)的抗體。本發明之人型嵌合抗體可藉由如下方式表現而製造：自上述融合瘤取得編碼VH及VL之cDNA，分別***至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體中而構建人型嵌合抗體表現載體，將之導入至動物細胞。
作為人型嵌合抗體之CH，只要屬於人類免疫球蛋白(以下，記載為hIg)，則可為任何者，較佳為使用hIgG型者，進而可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或者該等之改型體等所有亞型。作為上述改型體，例如可使用分別將hIgG4之重鏈恆定區之EU-index中之第228號之Ser殘基置換為Pro、將第235號之Leu殘基置換為Glu、及將第409號之Arg殘基置換為Lys而成之IgG4變異體(以下，記載為IgG4PE R409K)的重鏈恆定區。又，作為人型嵌合抗體之CL，只要屬於hIg，則可為任意者，可使用κ型或λ型者。
作為本發明之人型嵌合抗體，具體而言，可列舉：包括包含序列編號23所表示之胺基酸序列之抗體之VH，且包括包含序列編號26所表示之胺基酸序列之抗體之VL的嵌合抗體。又，可列舉：包括包含序列編號24所表示之胺基酸序列之抗體之VH，且包括包含序列編號27所表示之胺基酸序列之抗體之VL的嵌合抗體。又，可列舉：包括包含序列編號25所表示之胺基酸序列之抗體之VH，且包括包含序列編號28所表示之胺基酸序列之抗體之VL的嵌合抗體。
作為人源化抗體，可列舉：人型CDR移植抗體或利用表面重建法之人源化抗體。又，藉由組合有製作該等人源化抗體之方法之方法所製作之抗體亦包括於本發明之人源化抗體中。進而，具有於藉由該等方法所設計之人源化抗體之胺基酸序列中缺失、置換或附加有1個以上胺基酸之胺基酸序列，且特異性地識別人類BMP10及/或BMP9/BMP10異質二聚物之抗體亦包括於本發明之人源化抗體中。
人型CDR移植抗體係指將人類以外之動物之抗體之VH及VL之CDR的胺基酸序列移植至人類抗體之VH及VL的適當位置而成之抗體。本發明之人型CDR移植抗體可以下述方式進行製造。即，構建編碼特異性地識別人類BMP10及/或BMP9/BMP10異質二聚物，且將結合至人類BMP10及/或BMP9/BMP10異質二聚物之胺基酸序列、或其立體結構之人類以外之動物的單株抗體之VH及VL之CDR之胺基酸序列移植至任意之人類抗體的VH及VL之架構區(以下記為FR)之V區的cDNA。繼而，分別***至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因之動物細胞用表現載體而構建人型CDR移植抗體表現載體，導入至動物細胞，藉此來表現。
利用表面重建法之人源化抗體係指藉由表面重建方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994, 91 (3): 969-73及Protein Enginerring 1996, 10, 895-90)，將人類以外之動物之抗體之可變區之胺基酸中認為不會對抗體之結合活性造成影響之FR的胺基酸殘基置換為認為會使抗原性降低之胺基酸殘基而成的抗體。本發明之利用表面重建法之人源化抗體可以下述方式進行製造。即，構建編碼特異性地識別人類BMP10及/或BMP9/BMP10異質二聚物，且將結合至人類BMP10及/或BMP9/BMP10異質二聚物之胺基酸序列、或其立體結構之人類以外之動物的單株抗體之VH及VL之FR中任意之胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基之V區的cDNA。繼而，分別***至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因之動物細胞用表現載體而構建利用表面重建法之人源化抗體表現載體，導入至動物細胞，藉此來表現。
作為人源化抗體之CH，只要屬於hIg，則可為任何者，較佳為使用hIgG型者，進而可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4等所有亞型或該等之改型體。作為上述改型體，例如可使用IgG4PE R409K之CH。又，作為人源化抗體之CL，只要屬於hIg，則可為任意者，可使用κ型或λ型者。
作為本發明之人源化抗體，具體而言，可列舉如下人源化抗體，其包含：重鏈，該重鏈包括分別包含序列編號29及31所表示之胺基酸序列之互補決定區(complementary determining region；以下縮寫為CDR)1及3、以及包含序列編號30所表示之胺基酸序列或序列編號30所表示之胺基酸序列之第16號之絲胺酸被置換為天冬醯胺之胺基酸序列之CDR2；以及輕鏈，該輕鏈包括分別包含序列編號32～34所表示之胺基酸序列之CDR1～3。
作為本發明之人源化抗體，具體而言，可列舉包含以下之(a)VH及(b)VL之至少一者之人源化抗體。
(a)包含序列編號70所表示之胺基酸序列、或將選自序列編號70所表示之胺基酸序列之第14號之Pro、第20號之Leu、第27號之Gly、第29號之Val、第30號之Ser、第37號之Ile、第48號之Ile、第67號之Val、第71號之Val、第76號之Asn、第78號之Phe、第82號之Leu、第85號之Val、第92號之Val、第94號之Tyr、及第109號之Thr之至少1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的抗體之VH
(b)包含序列編號71所表示之胺基酸序列、或將選自序列編號71所表示之胺基酸序列中之第7號之Pro、第10號之Val、第12號之Glu、第14號之Pro、第16號之Lys、第19號之Thr、第20號之Ile、第41號之Pro、第48號之Val、第75號之Ser、第81號之Leu、第82號之Lys、第88號之Asp、及第90號之Tyr之至少1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的抗體之VL
作為本發明之人源化抗體，亦包括將VH之CDR之胺基酸序列如以下之(A)所示般置換而成者。
(A)VH之CDR1包含序列編號29所表示之胺基酸序列、或者導入有將序列編號29所表示之胺基酸序列中之第4號之Val置換為Ala之改變的胺基酸序列，VH之CDR2包含序列編號30所表示之胺基酸序列、或者導入有將序列編號30所表示之胺基酸序列中之第16號之Ser置換為Asp之改變的胺基酸序列，VH之CDR3包含序列編號31所表示之胺基酸序列的CDR之胺基酸序列。
進而，作為本發明之人源化抗體所包含之VH，較佳為以下之(1)～(14)。
(1)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第14號之Pro、第20號之Leu、第27號之Gly、第29號之Val、第30號之Ser、第37號之Ile、第48號之Ile、第67號之Val、第71號之Val、第76號之Asn、第78號之Phe、第82號之Leu、第85號之Val、第92號之Val、第94號之Tyr、及第109號之Thr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(2)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第20號之Leu、第27號之Gly、第29號之Val、第30號之Ser、第37號之Ile、第48號之Ile、第67號之Val、第71號之Val、第78號之Phe、第82號之Leu、第85號之Val、第94號之Tyr、及第109號之Thr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(3)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第20號之Leu、第27號之Gly、第30號之Ser、第48號之Ile、第67號之Val、第71號之Val、第78號之Phe、第82號之Leu、第92號之Val、及第94號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(4)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第27號之Gly、第29號之Val、第30號之Ser、第48號之Ile、第67號之Val、第71號之Val、第92號之Val、及第94號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(5)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第20號之Leu、第27號之Gly、第48號之Ile、第71號之Val、第78號之Phe、第82號之Leu、及第92號之Val置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(6)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第27號之Gly、第30號之Ser、第48號之Ile、第67號之Val、第71號之Val、及第92號之Val置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(7)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第48號之Ile、第67號之Val、第71號之Val、第78號之Phe、及第92號之Val置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(8)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第27號之Gly、第71號之Val、第78號之Phe、及第92號之Val置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(9)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第27號之Gly、第48號之Ile、第67號之Val、及第92號之Val置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(10)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第27號之Gly、第71號之Val、第92號之Val、及第94號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(11)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第27號之Gly、第71號之Val、及第92號之Val置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(12)包含將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第71號之Val、及第92號之Val置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VH
(13)包含序列編號70所表示之胺基酸序列之VH
(14)包含將上述(1)～(13)所示之VH之CDR之胺基酸序列置換為上述(A)所記載之CDR之胺基酸序列而成之胺基酸序列的VH
作為上述VH之胺基酸序列，例如可列舉：導入有選自將序列編號70所表示之胺基酸序列中之第14號之Pro置換為Leu、將第20號之Leu置換為Ile、將第27號之Gly置換為Phe、將第29號之Val置換為Leu、將第30號之Ser置換為Thr、將第34號之Val置換為Ala、將第37號之Ile置換為Val、將第48號之Ile置換為Met、將第65號之Ser置換為Asp、將第67號之Val置換為Leu、將第71號之Val置換為Arg、將第76號之Asn置換為Ser、將第78號之Phe置換為Val、將第82號之Leu置換為Met、將第85號之Val置換為Leu、將第92號之Val置換為Lys、將第94號之Tyr置換為Phe、或將第109號之Thr置換為Ile之改變之至少1個改變的胺基酸序列。
又，作為本發明之人源化抗體所包含之VL，較佳為以下之(1)～(15)。
(1)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第7號之Pro、第10號之Val、第12號之Glu、第14號之Pro、第16號之Lys、第19號之Thr、第20號之Ile、第41號之Pro、第48號之Val、第75號之Ser、第81號之Leu、第82號之Lys、第88號之Asp、及第90號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(2)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第7號之Pro、第10號之Val、第12號之Glu、第14號之Pro、第19號之Thr、第20號之Ile、第41號之Pro、第48號之Val、第75號之Ser、及第88號之Asp置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(3)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第7號之Pro、第12號之Glu、第19號之Thr、第20號之Ile、第48號之Val、第75號之Ser、第81號之Leu、第88號之Asp、及第90號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(4)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第7號之Pro、第12號之Glu、第14號之Pro、第16號之Lys、第19號之Thr、第41號之Pro、第75號之Ser、及第88號之Asp置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(5)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第12號之Glu、第20號之Ile、第41號之Pro、第48號之Val、第75號之Ser、第88號之Asp、及第90號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(6)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第12號之Glu、第16號之Lys、第19號之Thr、第41號之Pro、第82號之Lys、及第88號之Asp置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(7)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第16號之Lys、第20號之Ile、第41號之Pro、第48號之Val、第88號之Asp、及第90號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(8)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第14號之Pro、第20號之Ile、第48號之Val、第75號之Ser、第81號之Leu、及第88號之Asp置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(9)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第12號之Glu、第14號之Pro、第20號之Ile、第48號之Val、第82號之Lys、及第90號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(10)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第19號之Thr、第41號之Pro、第48號之Val、第88號之Asp、及第90號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(11)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第12號之Glu、第14號之Pro、第41號之Pro、第75號之Ser、及第88號之Asp置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(12)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第41號之Pro、第75號之Ser、第88號之Asp、及第90號之Tyr置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(13)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第19號之Thr、第41號之Pro、第48號之Val、及第88號之Asp置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(14)包含將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Ile、第48號之Val、及第88號之Asp置換為其他胺基酸殘基而成之胺基酸序列的VL
(15)包含序列編號71之胺基酸序列的VL
作為上述VL之胺基酸序列，例如可列舉：導入有選自將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第7號之Pro置換為Ser、將第10號之Val置換為Met、將第12號之Glu置換為Thr、將第14號之Pro置換為Leu、將第16號之Lys置換為Ser、將第19號之Thr置換為Lys、將第20號之Ile置換為Leu、將第41號之Pro置換為Glu或Arg、將第48號之Val置換為Met、將第75號之Ser置換為Phe、將第81號之Leu置換為Val、將第82號之Lys置換為Gln、將第88號之Asp置換為Ile、或將第90號之Tyr置換為Phe之改變之至少1個改變的胺基酸序列。
又，作為本發明之人源化抗體，具體而言，可列舉：包含以下之(a)或(c)所示之VH及/或(b)所示之VL之人源化抗體。
(a)包含將選自序列編號23所表示之胺基酸序列之第11號之Leu、第14號之Leu、第19號之Ser、第27號之Phe、第68號之Ser、第71號之Arg、第77號之Gln、第79號之Phe、第83號之Asn、第85號之Leu、及第107號之His之至少1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基的胺基酸序列的抗體之VH
(b)包含將選自序列編號26所表示之胺基酸序列中之第3號之Val、第8號之Asn、第14號之Leu、第19號之Lys、第75號之Phe、第80號之Asn、第83號之Ile、及第88號之Ile之至少1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL
(c)包含將選自序列編號70所表示之胺基酸序列之第10號之Gly、第13號之Lys、第19號之Ser、第20號之Leu、第27號之Gly、第29號之Val、第30號之Ser、第37號之Ile、第48號之Ile、第67號之Val、第68號之Thr、第71號之Val、第77號之Gln、第78號之Phe、第79號之Ser、第82號之Leu、第83號之Ser、第85號之Val、第86號之Thr、第87號之Ala、第88號之Ala、第92號之Val、第94號之Tyr、及第109號之Thr之至少1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VH
作為上述人源化抗體，亦包括將VH之CDR之胺基酸如下述般置換而成者。
VH之CDR1包含序列編號29所表示之胺基酸序列、或者導入有將序列編號29所表示之胺基酸序列中之第4號之Val置換為Ala之改變的胺基酸序列，VH之CDR2包含序列編號30所表示之胺基酸序列、或者導入有將序列編號30所表示之胺基酸序列中之第16號之Ser置換為Asp之改變的胺基酸序列，VH之CDR3包含序列編號31所表示之胺基酸序列的抗體之VH。
作為上述VH之胺基酸序列，例如可列舉：導入有選自將序列編號23所表示之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為Ala、將第14號之Leu置換為Pro、將第19號之Ser置換為Asp、將第27號之Phe置換為Ala、將第34號之Val置換為Ala、將第65號之Ser置換為Asp、將第68號之Ser置換為Ala、將第71號之Arg置換為Lys、將第77號之Gln置換為Glu、將第79號之Phe置換為Ala、將第83號之Asn置換為Asp、將第85號之Leu置換為Asp、或將第107號之His置換為Gln之改變之至少1個改變的胺基酸序列。進而可列舉：導入有選自將序列編號70所表示之胺基酸序列之第10號之Gly置換為Asp、將第13號之Lys置換為Gln、將第19號之Ser置換為Asp、將第20號之Leu置換為Ile、將第27號之Gly置換為Phe、將第29號之Val置換為Leu、將第30號之Ser置換為Thr、將第37號之Ile置換為Val、將第48號之Ile置換為Met、將第65號之Ser置換為Asp、將第67號之Val置換為Leu、將第68號之Thr置換為Ala、將第71號之Val置換為Arg、將第76號之Asn置換為Ser、將第77號之Gln置換為Glu、將第78號之Phe置換為Val、將第79號之Ser置換為Phe、將第82號之Leu置換為Met、將第83號之Ser置換為Asp、將第85號之Val置換為Leu、將第86號之Thr置換為Gln、將第87號之Ala置換為Thr、將第88號之Ala置換為Asp、將第92號之Val置換為Lys、將第94號之Tyr置換為Phe、將第109號之Thr置換為Ile、或將第110號之Leu置換為Met之改變之至少1個改變的胺基酸序列。
作為上述VL之胺基酸序列，例如可列舉：導入有選自將序列編號26所表示之胺基酸序列中之第3號之Val置換為Ala、將第8號之Asn置換為Asp、將第14號之Leu置換為Ala、將第19號之Lys置換為Thr、將第75號之Phe置換為Ser、將第80號之Asn置換為Asp、將第83號之Ile置換為Val、或將第88號之Ile置換為Val之改變之至少1個改變的胺基酸序列。
作為本發明之人源化抗體之具體例，可列舉：含有包含圖16、圖17、或圖19所示之胺基酸序列之任一個之VH、及包含圖18A或圖18B所示之胺基酸序列之任一個之VL之至少一者的人源化抗體。
又，作為本發明之人源化抗體之具體例，可列舉：含有包含選自序列編號71～87之任一個胺基酸序列之VH及/或包含選自序列編號70及88～97之任一個胺基酸序列之VL的人源化抗體。
進而，作為本發明之人源化抗體之具體例，可列舉以下之(a)～(w)之人源化抗體。
(a)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號73所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(b)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號73所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(c)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號75所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(d)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號75所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(e)包括包含序列編號89所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號77所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(f)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號77所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(g)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號78所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(h)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號78所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(i)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(j)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(k)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(l)包括包含序列編號89所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(m)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(n)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(o)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(p)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(q)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(r)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(s)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(t)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(u)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(v)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
(w)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的人源化抗體。
人類抗體本來係指天然地存在於人類體內之抗體，但亦包括：自藉由最近之基因工程、細胞工程、發育工程之技術的進步所製作之人類抗體噬菌體庫及人類抗體產生基因轉殖動物獲得之抗體等。
關於天然地存在於人類體內之抗體，例如將人類末梢血淋巴球進行單離，使EB病毒等感染其而使之永生化，進行選殖，藉此可培養產生該抗體之淋巴球，自培養上清液中可純化該抗體。
人類抗體噬菌體庫係藉由將自人類B細胞製備之抗體基因***至噬菌體基因，而使Fab、scFv等抗體片段於噬菌體表面表現出之庫。自該庫，以對於固定有抗原之基質之結合活性作為指標，可回收於表面表現出具有所需抗原結合活性之抗體片段之噬菌體。該抗體片段亦可進而藉由基因工程方法，而轉化為包含兩條完整之H鏈及兩條完整之L鏈之人類抗體分子。
人類抗體產生基因轉殖動物係指人類抗體基因組入至細胞內之動物。具體而言，向小鼠ES細胞導入人類抗體基因，將該ES細胞向小鼠之早期胚移植後使之滋生，藉此可製作人類抗體產生基因轉殖小鼠。來自人類抗體產生基因轉殖動物之人類抗體可藉由如下方式製作：使用通常於人類以外之動物中進行之融合瘤製作方法取得人類抗體產生融合瘤，並進行培養，藉此使人類抗體於培養上清液中產生並儲積。
本發明之單株抗體或其抗體片段亦包括：於構成上述抗體或其抗體片段之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸經缺失、附加、置換或***，且具有與上述抗體或或其抗體片段相同之活性之單株抗體或該抗體片段。
所缺失、置換、***及/或加成之胺基酸之數量為1個以上，其數量並無特別限定，係藉由定點突變法[Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley＆Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315(1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, 488 (1985)]等周知之技術，可缺失、置換或附加之程度之數量。例如較佳為1～數十個，更佳為1～20個，進而較佳為1～10個，尤佳為1～5個。
於上述抗體之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸殘基經缺失、置換、***或附加係表示如下情況。即，意指於同一序列中之任意且1個或複數個胺基酸序列中有1個或複數個胺基酸殘基之缺失、置換、***或附加。又，有缺失、置換、***或附加同時發生之情形，亦有所置換、***或附加之胺基酸殘基為天然型與非天然型之任一種之情形。
作為天然型胺基酸殘基，例如可列舉：L-丙胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬醯胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-***酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、或L-半胱胺酸等。
於以下表示能夠相互置換之胺基酸殘基之較佳例。同一群中所包含之胺基酸殘基能夠相互置換。
A群：白胺酸、異白胺酸、甘白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、O-甲基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸
B群：天冬醯胺酸、麩胺酸、異天冬醯胺酸、異麩胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸
C群：天冬醯胺、麩醯胺
D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸
E群：脯胺酸、3-基脯胺酸、4-基脯胺酸
F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸
G群：***酸、酪胺酸
本發明中，作為抗體片段，可列舉：Fab、Fab'、F(ab')2
、單鏈抗體(scFv)、二聚物化V區(雙功能抗體(diabody))、二硫鍵穩定化V區(dsFv)及包含CDR之肽等。
Fab係利用作為蛋白質分解酶之木瓜酶對IgG進行處理所獲得之片段中(由H鏈之第224號之胺基酸殘基切割)H鏈之N末端側約一半與L鏈整體以雙硫鍵(S-S鍵)結合之分子量約5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。
本發明之Fab可利用木瓜酶對本發明之單株抗體進行處理而獲得。又，亦可將編碼該抗體之Fab之DNA***至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，並將該載體導入至原核生物或真核生物，藉此進行表現而製造Fab。
F(ab')2
係利用作為蛋白質分解酶之胃蛋白酶使IgG之鉸鏈區之雙硫鍵之下部分解而獲得之2個Fab區域以鉸鏈部分結合所構成的分子量約10萬之具有抗原結合活性之片段。
本發明之F(ab')2
可利用胃蛋白酶對本發明之單株抗體進行處理而獲得。又，亦可使下述Fab'進行硫醚鍵結或雙硫鍵結而製作。
Fab'係上述F(ab')2
之鉸鏈區域之雙硫鍵經切割之分子量約5萬之具有抗原結合活性的抗體片段。本發明之Fab'可利用二硫蘇糖醇等還原劑對本發明之F(ab')2
進行處理而獲得。又，亦可將編碼該抗體之Fab'片段之DNA***至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，並將該載體導入至原核生物或真核生物，藉此使之表現而製造Fab'。
scFv係使用適當之肽連接子(以下記載為P)將1條VH與1條VL連結的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且係具有抗原結合活性之抗體片段。
本發明之scFv可藉由如下方式表現而製造：取得編碼本發明之單株抗體之VH及VL之cDNA，構建編碼scFv之DNA，將該DNA***至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物。
雙功能抗體(Diabody)係scFv二聚物化而成之抗體片段，且係具有二價之抗原結合活性之抗體片段。二價之抗原結合活性可相同，亦可設為互不相同之抗原結合活性。
本發明之雙功能抗體可藉由如下方式表現而製造：取得編碼本發明之單株抗體之VH及VL之cDNA，將編碼scFv之DNA以肽連接子之胺基酸序列之長度成為8殘基以下的方式進行構建，將該DNA***至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物。
dsFv係指使將VH及VL中之各1個胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基而成之多肽經由該半胱胺酸殘基間的雙硫鍵結合而成者。置換為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可依據已知之方法[Protein Engineering, 7, 697 (1994)]，基於抗體之立體結構預測來選擇。
本發明之dsFv可藉由如下方式表現而製造：取得編碼本發明之單株抗體之VH及VL之cDNA，構成編碼dsFv之DNA，將該DNA***至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物。
包含CDR之肽包含VH或VL之CDR之至少1個區域以上。包含複數個CDR之肽可直接結合或經由適當之肽連接子結合。
本發明之包含CDR之肽可藉由如下方式表現而製造：構建編碼本發明之單株抗體之VH及VL之CDR的DNA，將該DNA***至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物。又，包含CDR之肽亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學合成法進行製造。
本發明之單株抗體或其抗體片段包括：使放射性同位元素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、蛋白質等化學或基因工程地結合至本發明之單株抗體或其抗體片段而成的抗體或或其抗體片段之衍生物。於將抗體或該抗體片段之衍生物用作檢測方法、定量方法、檢測用試劑、或定量用試劑之情形時，作為結合至本發明之單株抗體或其抗體片段之藥劑，可列舉：通常之免疫學檢測或測定法中所使用之標記物。
本發明中之抗體或其抗體片段之衍生物可藉由如下方式製造：利用化學方法[抗體工程入門，地人書館(1994)]使放射性同位元素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、蛋白質等結合至本發明之單株抗體或其抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側或C末端側、抗體或其抗體片段中之適當取代基或側鏈、進而單株抗體或其抗體片段中之糖鏈等。
又，本發明中之抗體或其抗體片段之衍生物可藉由如下基因工程方法進行製造：使編碼本發明之單株抗體或其抗體片段之DNA、與編碼欲結合之蛋白質之DNA連結並***至表現載體，將該表現載體導入至適當之宿主細胞並使之表現。
作為放射性同位元素，例如可列舉：131
I、125
I、90
Y、64
Cu、99
Tc、77
Lu、或211
At等。放射性同位元素可藉由氯胺T法等直接結合至抗體。又，亦可使抗體與使放射性同位元素螯合之物質結合。作為螯合劑，例如可列舉：1-異硫氰酸酯基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作為低分子之藥劑，例如可列舉：吖啶鎓酯或咯吩等發光物質、或者螢光異硫氰酸鹽(FITC)或異硫氰酸四甲基羅丹明(RITC)等螢光物質等。
作為使低分子藥劑與抗體鍵結之方法，例如可列舉：經由戊二醛使藥劑與抗體之胺基間鍵結之方法、或者經由水溶性碳二醯亞胺使藥劑之胺基與抗體之羧基鍵結之方法等。
作為高分子之藥劑，例如可列舉：聚乙二醇(以下，記載為PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、吡喃共聚物、或者羥丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物結合至抗體或抗體片段，而期待(1)對於化學、物理或生物上之各種因子之穩定性之提高、(2)血中半衰期之顯著延長、或者(3)免疫原性之消失或抗體產生之抑制等效果[生物綴合物(Bioconjugates)醫藥品，廣川書店(1993)]。例如，作為使抗體與PEG結合之方法，可列舉：與PEG化修飾試劑反應之方法等[生物綴合物(Bioconjugates)，廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑，可列舉：對於離胺酸之ε-胺基之修飾劑(日本專利特開昭61-178926號公報)、對於天冬胺酸及麩胺酸之羧基之修飾劑(日本專利特開昭56-23587號公報)、或者對於精胺酸之胍基之修飾劑(日本專利特開平2-117920號公報)等。
作為蛋白質，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶或螢光素酶等酶。
本發明係關於一種針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑，其含有BMP10拮抗劑。又，本發明亦包括一種含有BMP10拮抗劑之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑，其特徵在於：同時或逐次投予BMP9拮抗劑。進而，發明亦包括一種含有BMP9拮抗劑之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑，其特徵在於：同時或逐次投予BMP10拮抗劑。
本發明之BMP10拮抗劑中，如上所述含有本發明之抗BMP10單株抗體及該抗體片段。
作為高血壓，包括所有血壓超過正常範圍之情形，尤其是存在鹽敏感性高血壓等。再者，所謂正常範圍，係指收縮期血壓未達140 mmHg，舒張期血壓未達90 mmHg。
作為高血壓性疾病，有高血壓其本身及由高血壓持續引起之併發症。作為高血壓，分為原因無法特定之原發性高血壓及由特定原因引起之續發性高血壓。作為被認為原發性高血壓之原因者，尤其是有鹽敏感性高血壓。
作為續發性高血壓，例如可列舉：腎血管性高血壓、腎實質性高血壓、原發性醛固酮症、睡眠呼吸暫停綜合症、嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma)、庫欣綜合症、藥物誘發性高血壓、妊娠高血壓、主動脈縮窄症、甲狀腺功能減退症、甲狀腺功能亢進症、副甲狀腺功能亢進症、腦幹部血管壓迫等。又，作為高血壓性疾病，例如亦可列舉：鈉***障礙、伴隨高血壓之腎臟腎小管間質損傷、腎臟絲球體損傷、心臟舒張功能障礙等。
作為由高血壓持續引起之併發症，例如有腦梗死、腦出血、蛛網膜下出血、動脈硬化、狹心症、心肌梗塞、鬱血性心衰竭(例如，收縮功能不全型心衰竭、舒張功能不全型心衰竭等)、心肌病(例如，舒張型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病等)、右心衰竭、慢性腎臟病(例如，糖尿病性腎病、腎硬化症、多囊腎病、慢性絲球體腎炎、腎小管間質性腎炎等)、急性腎損傷(例如，快速進行性絲球體腎炎、急性腎小管壞死等)、主動脈剝離、主動脈瘤、視網膜出血等。
作為本發明之治療劑，含有上述本發明之單株抗體或該抗體片段作為有效成份。
作為本發明之醫藥組合物，含有上述本發明之單株抗體或該抗體片段作為有效成份。
作為本發明之醫藥組合物，亦可為含有生理學上可容許之稀釋劑或載體且與其他抗體或抗生素之類之其他藥劑之混合物。作為適當之載體，例如可列舉：生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水葡萄糖液及緩衝生理鹽水，但並不限定於該等。又，抗體亦可進行冷凍乾燥(Freeze dry)，於需要時藉由添加如上述之緩衝水溶液而再構成從而使用。
作為投予路徑，例如可列舉：經口投予、或者口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內及靜脈內等非經口投予，較佳為靜脈內投予。作為投予形態，可以各種形態進行投予，作為該等形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏及貼劑等。
如乳劑或糖漿劑之液體製備物例如可使用水、蔗糖、山梨糖、果糖等糖類；聚乙二醇、丙二醇等二醇類；芝麻油、橄欖油、大豆油等油類；對羥基苯甲酸酯類等防腐劑；草莓香料、胡椒薄荷等香料類等作為添加劑來製造。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等例如可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等賦形劑；澱粉、海藻酸鈉等崩解劑；硬脂酸鎂、滑石等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等結合劑；脂肪酸酯等界面活性劑；甘油等塑化劑等作為添加劑來製造。注射劑可使用、水、蔗糖、山梨糖、木糖、海藻糖、果糖等糖類；甘露醇、木糖醇、山梨糖醇等糖醇；磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、麩胺酸緩衝液等緩衝液；脂肪酸酯等界面活性劑等作為添加劑。
作為適合非經口投予之製劑，例如可列舉：注射劑、栓劑或噴霧劑等。於注射劑之情形時，通常以單位投予量安瓿或多投予量容器之狀態來提供。亦可為於使用時適合之載體、例如於不含有發熱物質之經殺菌之水中再溶解之粉體。該等之劑型通常於該等組合物中含有製劑上一般使用之乳化劑、懸濁劑等添加劑。
作為注射方法，例如可列舉：點滴靜脈內注射、靜脈內注射、肌內注射、腹腔內注射、皮下注射及皮內注射等。又，其投予量係根據投予對象之年齡、投予路徑、投予次數而不同，可於廣範圍內變更。
栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體來製備。又，噴霧劑亦可使用本發明之抗體或抗體之功能片段本身來製備，或者使用不會刺激接受者(患者)之口腔及呼吸道黏膜，且用以使上述抗體或抗體之功能片段以微細粒子之形式分散而使吸收變得容易的載體等來製備。
作為載體，具體而言，例如可列舉乳糖及甘油等。視上述抗體或抗體之功能片段之性質或所使用之載體之性質，能夠實現氣溶膠或乾粉等製劑。又，於該等非經口劑中亦可添加經口劑中作為添加劑所例示之成份。
其投予量根據症狀、年齡或體重等而不同，通常於經口投予時，對於成人，1天為約0.01 mg～1000 mg，且可將該等投予1次、或分為數次來投予。又，於非經口投予時，可藉由皮下注射、肌內注射或靜脈注射而1次投予約0.01 mg～1000 mg。
含有本發明之抗體或該抗體片段、或該等之衍生物之治療劑可為僅含有作為有效成份之該抗體或該抗體片段、或者該等之衍生物者，較佳為通常與藥理學上所容許之1個以上之載體一併混合，而以藉由製藥學之技術領域中所公知之任意方法所製造之醫藥製劑的形式提供。
投予路徑較佳為使用治療時最具效果者，可列舉：經口投予、或者口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內或靜脈內等非經口投予，較佳為可列舉靜脈內投予或皮下投予。
作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、或貼劑等。
進而，本發明係關於一種特異性地識別BMP10之胺基酸序列、或其立體結構，且含有所結合之單株抗體或其抗體片段作為有效成份的BMP10之免疫學檢測或測定方法。
本發明中作為檢測或測定BMP10之量之方法，可列舉任意之公知方法。例如可列舉免疫學檢測或測定方法等。
所謂免疫學檢測或測定方法，係使用施加了標記之抗原或抗體，對抗體量或抗原量進行檢測或測定之方法。作為免疫學檢測或測定方法，可列舉：放射性物質標記免疫抗體法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(luminescent immunoassay)、西方點墨法或物理化學方法等。
於以下針對本發明之抗體之製造方法、疾病之治療方法、及疾病之診斷方法，具體地進行說明。
1.單株抗體製造方法
(1)抗原之製備
成為抗原之BMP10或表現出BMP10之組織可藉由將包含編碼BMP10全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等中而獲得得。又，亦可自大量地表現BMP10之人類組織純化BMP10而獲得。又，亦可將該組織等直接用作抗原。進而亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法製備具有BMP10之部分序列之合成肽用於抗原。
本發明中所使用之BMP10可使用Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley＆Sons(1987-1997)等所記載之方法等，例如藉由以下之方法使編碼該BMP10之DNA於宿主細胞中表現而進行製造。
首先，將包含編碼BMP10之部分之全長cDNA***至適當之表現載體之啟動子之下游，藉此製作重組載體。亦可使用基於全長cDNA所製備之包含編碼多肽之部分之適當長度之DNA片段代替上述全長cDNA。繼而，將所獲得之該重組載體導入至適於該表現載體之宿主細胞，藉此可獲得生產多肽之轉形株。
作為表現載體，只要為可實現於使用之宿主細胞中自主複製或向染色體中組入，且於可轉錄編碼多肽之DNA之位置含有適當之啟動子者，則可使用任一種。
作為宿主細胞，只要為屬於大腸桿菌等艾氏菌屬等之微生物、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等可表現目標之基因者，則可使用任一種。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，重組載體較佳為於原核生物中能夠自主複製，同時含有啟動子、核糖體結合序列、包含編碼BMP10之部分之DNA、及轉錄終止序列之載體。又，對於該重組載體，轉錄終止序列並非必需，但較佳為於結構基因之正下方配置轉錄終止序列。進而，於該重組載體中亦可含有控制啟動子之基因。
作為該重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之夏因-達爾加諾序列(S
hine-Dalgarno sequence)(亦稱為SD序列)與起始密碼子之間調節為適當距離(例如6～18個鹼基)的質體。
又，作為編碼該BMP10之DNA之鹼基序列，可以成為最適合宿主內之表現之密碼子之方式置換鹼基，藉此，可提高目標之BMP10之生產率。
作為表現載體，只要為能夠於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則可使用任一種，例如可列舉：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上為Roche-Diagnostics公司製造)、pKK233-2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(Qiagen公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600號公報)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agricbiol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)製備]、pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol., 172, 2392 (1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET系統(Novagen公司製造)、或pME18SFL3等。
作為啟動子，只要為能夠於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則可為任何者。例如可列舉：trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子或T7啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，亦可使用使2個Ptrp串聯而成之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子或let I啟動子等經人工設計改型之啟動子等。
作為宿主細胞，例如可列舉：大腸桿菌XL-1Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49或大腸桿菌DH5α等。
作為向宿主細胞導入重組載體之方法，只要為向所使用之宿主細胞導入DNA之方法，則可使用任一種方法，例如可列舉：使用鈣離子之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]。
於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只要為能夠於動物細胞中發揮功能者，則可使用任一種，例如可列舉：pcDNA I、pcDM8(舟越公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報；Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pcDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNA I/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pME18SFL3、N5KG4PE R409K(國際公開第2006/033386號)、或pKANTEX93(國際公開第97/10354號)等。
作為啟動子，只要為能夠於動物細胞中發揮功能者，則可使用任一種，例如可列舉：巨細胞病毒(CMV)之即刻早期(IE)基因之啟動子、SV40之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子或來源於小鼠白血病病毒(Molony Murine Leukemia Virus)之啟動子或促進子。又，亦可將人類CMV之IE基因之促進子與啟動子一併使用。
作為宿主細胞，例如可列舉：人類白血病細胞Namalwa細胞、猴細胞COS細胞、中國・倉鼠卵巢細胞CHO細胞[Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900)]、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC編號：CCL-61)、DUkXB11(ATCC編號：CCL-9096)、Pro-5(ATCC編號：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat＃11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14、金倉鼠細胞BHK或HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)等。
作為向宿主細胞導入重組載體之方法，只要為向動物細胞導入DNA之方法，則可使用任一種方法，例如可列舉：電穿孔法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)或脂轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等。
將源自保有組入有以上述方式獲得之編碼BMP10之DNA之重組載體的微生物、或動物細胞等之轉形株於培養基中進行培養，使該BMP10於培養物中生成儲積，自該培養物進行採集，藉此可製造BMP10。將該轉形株於培養基中進行培養之方法可依據宿主之培養所使用之通常方法進行。
於以源自真核生物之細胞表現之情形時，可獲得附加有糖或糖鏈之BMP10。
於培養經使用誘導性之啟動子之重組載體轉形之微生物時，亦可視需要將誘導劑(inducer)添加至培養基中。例如，於培養經使用lac啟動子之重組載體轉形之微生物之情形時，亦可將異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等添加至培養基中，於培養經使用trp啟動子之重組載體轉形之微生物之情形時，亦可將吲哚丙烯酸等添加至培養基中。
作為培養將動物細胞作為宿主所獲得之轉形株之培養基，例如可列舉：通常所使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]、Eagle之MEM培養基[Science, 122, 501 (1952)]、杜爾貝科改良MEM培養基[Virology, 8, 396 (1959)]、199培養基[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)]、Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培養基或於該等培養基中添加有胎牛血清(FBS)等之培養基等。培養係通常於pH值6～8、30～40℃、5%CO2
存在下等條件下進行1～7天。又，於培養中亦可視需要，將康黴素或青黴素等抗生素添加至培養基中。
作為編碼BMP10之基因之表現方法，除直接表現以外，亦可使用分泌生產或融合蛋白質表現等方法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]。
作為BMP10之生產方法，有使BMP10於宿主細胞內生產之方法、使BMP10分泌至宿主細胞外之方法、或使BMP10於宿主細胞外膜上生產之方法，藉由改變所使用之宿主細胞或所生產之BMP10之結構，可選擇適當之方法。
於在宿主細胞內或宿主細胞外膜上生產BMP10之情形時，藉由使用Paulson等人之方法[J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、LOW等人之方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、日本專利特開平05-336963號公報或國際公開第94/23021號等所記載之方法，可使BMP10積極地分泌至宿主細胞外。
又，亦可利用使用二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系統(日本專利特開平2-227075號公報)而使BMP10之生產量上升。
所獲得之BMP10例如可以下述方式進行單離、純化。
於BMP10以溶解狀態在細胞內表現之情形時，於培養結束後藉由離心分離回收細胞，於水系緩衝液中懸濁後，使用超音波破碎機、法式壓碎機、Manton Gaulin均質機或球磨機等將細胞破碎，而獲得無細胞萃取液。
藉由將上述無細胞萃取液進行離心分離而獲得上清液，自所獲得之上清液，將通常之蛋白質之單離純化法、即溶劑萃取法、利用硫酸銨等之鹽析法、除鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、二乙基胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、使用DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠(Butyl Sepharose)、苯基瓊脂糖凝膠(Phenyl Sepharose)等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦(Chromatofocusing)法、或等電點聚焦等電泳法等方法單獨使用或組合使用，而可獲得純化標本。
於BMP10在細胞內形成不溶體而表現之情形時，以與上述相同之方式回收細胞後將之破碎，進行離心分離，藉此回收作為沈澱組份之該BMP10之不溶體。利用蛋白質改性劑使所回收之該BMP10之不溶體可溶化。對該可溶化液進行稀釋或透析，藉此使該BMP10恢復成正常之立體結構後，藉由與上述相同之單離純化法，可獲得多肽之純化標本。
於BMP10或其糖修飾體等衍生物被分泌至細胞外之情形時，可於培養上清液中回收該BMP10或其糖修飾體等衍生物。以與上述相同之方式藉由離心分離等方法對該培養物進行處理，藉此取得可溶性組份，藉由使用與上述相同之單離純化法，可自該可溶性組份獲得純化標本。
又，本發明中所使用之BMP10亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學合成法進行製造。又，亦可利用Advanced ChemTech公司製造、PerkinElmer公司製造、Pharmacia公司製造、Protein Technology Instrument公司製造、Synthecell-Vega公司製造、Perceptive公司製造或島津製作所公司製造等之肽合成機而進行化學合成。
(2)動物之免疫與融合用抗體產生細胞之製備
使3～20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物對(1)中所獲得之抗原產生免疫，採集該動物之脾臟、淋巴結、末梢血中之抗體產生細胞。又，於免疫原性較低而於上述動物中未發現抗體效價之充分上升之情形時，亦可使用BMP9剔除小鼠作為被免疫動物。
免疫可藉由將抗原與例如弗氏完全佐劑、或氫氧化鋁凝膠與百日咳菌疫苗等適當之佐劑一併投予至動物之皮下、皮內、靜脈內或腹腔內而進行。於抗原為部分肽之情形時，與BSA(牛血清白蛋白)或KLH(鑰孔蟲戚血藍蛋白(Keyhole Limpet hemocyanin))等載體蛋白製作偶聯物，將其用作免疫原。
抗原之投予係於第1次之投予後，每隔1～2週進行2～10次。於各投予後第3～7天自眼底靜脈叢進行採血，使用酶免疫測定法[Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等，對其血清之抗體效價進行測定。將其血清對於用於免疫之抗原顯示出充分之抗體效價之動物作為融合用抗體產生細胞之供給源。
於抗原之最終投予後第3～7天，自免疫之動物摘除脾臟等包含抗體產生細胞之組織，並採集抗體產生細胞。於使用脾臟細胞之情形時，將脾臟切碎、擢碎後，進行離心分離，進而去除紅血球而取得融合用抗體產生細胞。
(3)骨髓瘤細胞之製備
作為骨髓瘤細胞，使用自小鼠獲得之培養細胞株，例如使用8-氮鳥嘌呤耐性小鼠(源自Balb/C)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)]、P3-NS1/1Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6, 511 (1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269 (1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, 123, 1548 (1979)]或P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495 (1975)]等。
該骨髓瘤細胞係於正常培養基(添加有麩醯胺、2-巰基乙醇、健他黴素(Gentamycin)、FBS、及8-氮鳥嘌呤之RPMI1640培養基)中進行繼代培養，於細胞融合之3～4天前於正常培養基中進行繼代培養，確保融合當天有2×107
個以上之細胞數。
(4)細胞融合與單株抗體產生融合瘤之製備
利用最低基礎培養基(Minimum Essential Medium)(MEM)或PBS(Phosphate buffer saline，磷酸鹽緩衝液)(磷酸氫二鈉1.83 g、磷酸二氫鉀0.21 g、食鹽7.65 g、蒸餾水1升、pH值7.2)將(2)中所獲得之融合用抗體產生細胞與(3)中所獲得之骨髓瘤細胞充分洗淨，以細胞數成為融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞＝5～10：1之方式進行混合，進行離心分離後，去除上清液。
將所沈澱之細胞群充分地擢碎後，一面攪拌一面於37℃下加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培養基及二甲基亞碸之混液。進而每1～2分鐘添加數次MEM培養基1～2 mL後，添加MEM培養基以使總量成為50 mL。離心分離後，將上清液去除。將所沈澱之細胞群緩慢地擢碎後，對於融合用抗體產生細胞，於HAT培養基[添加有次黃嘌呤、胸苷、及胺基喋呤之正常培養基]中緩慢地使細胞懸濁。將該懸濁液於5%CO2
培養箱中以37℃培養7～14天。
培養後，將培養上清液之一部分抽出，藉由下述之結合測定(binding assay)等融合瘤之選擇方法，選擇與包含BMP10之抗原反應而不會與不包含BMP10之抗原反應之細胞群。繼而，藉由極限稀釋法反覆2次選殖[第1次使用HT培氧基(自HAT培養基去除胺基喋呤後所得之培養基)，第2次使用正常培養基]，選擇發現穩定且較強之抗體效價者作為單株抗體產生融合瘤。
(5)純化單株抗體之製備
對於經姥鮫烷處理[將2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane)0.5 mL進行腹腔內投予，飼養2週]之8～10週齡之小鼠或裸小鼠，將(4)中所獲得之單株抗體產生融合瘤注射至腹腔內。於10～21天融合瘤發生腹水癌化。自該小鼠採集腹水，進行離心分離，將固形物成份去除後，利用40～50%硫酸銨進行鹽析，利用辛酸沈澱法、DEAE-瓊脂糖凝膠管柱、蛋白A-管柱或凝膠過濾管柱進行純化，收集IgG或IgM組份，設為純化單株抗體。
又，將(4)中所獲得之單株抗體產生融合瘤於添加有10%FBS之RPMI1640培養基等中進行培養後，藉由離心分離去除上清液，於融合瘤SFM培養基中進行懸濁，並培養3～7天。將所獲得之細胞懸濁液進行離心分離，自所獲得之上清液，利用蛋白A-管柱或蛋白G-管柱進行純化，收集IgG組份，亦可獲得純化單株抗體。再者，亦可於融合瘤細胞無血清培養基(融合瘤SFM培養基)中添加5%Daigo's GF21。
抗體之亞型之確定係使用亞型分型套組(subtype typing kit)，藉由酶免疫測定法進行。蛋白質量之定量係根據勞立法(Lowry method)或280 nm下之吸光度而算出。
(6)單株抗體之選擇
單株抗體之選擇係藉由以下所示之利用酶免疫測定法之結合測定、及利用Biacore之動力學分析而進行。
(6-a)結合測定
作為抗原，使用將(1)中所獲得之包含編碼BMP10之cDNA之表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等中所獲得之基因導入細胞、重組蛋白質、或自人類組織獲得之純化多肽或部分肽等。於抗原為部分肽之情形時，亦可與BSA或KLH等載體蛋白製作偶聯物，而使用其作為抗原。
將抗原分注至96孔板等培養板中，進行固相化後，分注作為第1抗體之血清、融合瘤之培養上清液或純化單株抗體等受驗物質而進行反應。利用PBS或包含0.05～0.1%之Tween-20之PBS(以下亦稱為PBST)等充分洗淨後，分注作為第2抗體之經生物素、酶、化學發光物質或放射線化合物等標記之抗免疫球蛋白抗體而進行反應。利用PBST充分地洗淨後，進行與第2抗體之標記物質對應之反應，選擇與免疫原特異性地反應之單株抗體。
又，本發明之單株抗體可藉由於上述結合測定系統中添加受驗抗體並使之反應而取得。即，藉由篩選添加受驗抗體時單株抗體之結合受到阻礙之抗體，可取得與所取得之單株抗體競爭性地向BMP10之胺基酸序列、或其立體結構結合之單株抗體。
進而，結合至與本發明之單株抗體所識別之表位相同之表位的抗體可藉由鑑定於上述結合測定系統中所取得之抗體的表位，製作經鑑定之表位之部分合成肽、或擬態為表位之立體結構之合成肽等並進行免疫而取得。
(6-b)利用Biacore之動力學分析
使用Biacore T100，測定抗原與受驗物之間之結合中之動力學，利用機器附帶之分析軟體對其結果進行分析。藉由胺偶合法將抗小鼠IgG抗體固定至感測器晶片CM5後，使融合瘤培養上清液或純化單株抗體等試驗樣品流過，使適當量結合，進而使濃度已知之複數種濃度之抗原流過，測定結合、解離。
使用機器附帶之軟體，並藉由1：1結合模型，對所獲得之資料進行動力學分析，取得各種參數。或者，例如藉由胺偶合法將人類BMP10固定至感測器晶片上後，使濃度已知之複數種濃度之純化單株抗體流過，測定結合、解離。使用機器附帶之軟體，並藉由二價結合模型對所獲得之資料進行動力學分析，取得各種參數。
2.基因重組抗體之製作
作為基因重組抗體之製作例，於以下表示人型嵌合抗體及人源化抗體之製作方法。
(1)基因重組抗體表現用載體之構建
基因重組抗體表現用載體係組入有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體，可藉由將編碼人類抗體之CH及CL之DNA分別選殖至動物細胞用表現載體而構建。
人類抗體之C區域可使用任意之人類抗體之CH及CL。例如使用人類抗體之γ1亞型之CH及κ類型之CL等。編碼人類抗體之CH及CL之DNA可使用cDNA，但亦可使用包含外顯子與內含子之染色體DNA。
關於動物細胞用表現載體，只要為可組入編碼人類抗體之C區域之基因並表現者，則可使用任何者。例如使用pAGE107[Cytotechnol., 3, 133 (1990)]、pAGE103[J. Biochem., 101, 1307 (1987)]、pHSG274[Gene, 27, 223 (1984)]、pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol., 4, 173 (1990)]或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol., 13, 79 (1993)]等。又，於表現IgG4PE R409K抗體之情形時，例如可使用N5KG4PE R409K(國際公開第2006/033386號)等。
關於動物細胞用表現載體中之啟動子與促進子，使用SV40之初期啟動子[J. Biochem., 101, 1307 (1987)]、來源於小鼠白血病病毒LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)]或免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell, 41, 479 (1985)]與促進子[Cell, 33, 717 (1983)]等。
關於基因重組抗體表現用載體，就基因重組抗體表現載體之構建容易性、向動物細胞之導入容易性、動物細胞內之抗體H鏈及L鏈之表現量之平衡性均衡等方面而言，可使用抗體H鏈及L鏈存在於同一載體上之類型(串聯型)之基因重組抗體表現用載體[J.Immunol. Methods, 167, 271(1994)]。又，亦可使用抗體H鏈及L鏈存在於不同載體上之類型。關於串聯型之基因重組抗體表現用載體，係使用pKANTEX93(國際公開第97/10354號)、pEE18[Hybridoma, 17, 559 (1998)]、或N5KG4PE R409K(國際公開第2006/033386號)等。
(2)編碼源自人類以外之動物之抗體之V區之cDNA的取得及胺基酸序列之分析
編碼非人類抗體之VH及VL之cDNA之取得及胺基酸序列之分析可以下述方式進行。
自產生非人類抗體之融合瘤細胞提取mRNA而合成cDNA。將所合成之cDNA選殖至噬菌體或質體等載體而製作cDNA庫。
使用編碼小鼠抗體之C區域部分或V區部分之DNA作為探針，自該庫分別單離具有編碼VH或VL之cDNA之重組噬菌體或重組質體。分別確定重組噬菌體或重組質體上之設為目標之小鼠抗體之VH或VL的完整鹼基序列，根據鹼基序列分別推測VH或VL之完整胺基酸序列(complete amino acid sequence)。
關於製作產生非人類抗體之融合瘤細胞之人類以外之動物，可使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔等，但只要能夠製作融合瘤細胞，則可使用任何動物。
於自融合瘤細胞製備總RNA時，使用硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)]、或RNA easy kit(Qiagen公司製造)等套組等。
於自總RNA製備mRNA時，使用寡(dT)固定化纖維素管柱法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]、或Oligo-dT30＜Super＞mRNA純化套組(TAKARA BIO公司製造)等套組等。又，亦可使用Fast Track mRNA提取套組(Invitrogen公司製造)、或QuickPrep mRNA純化套組(Pharmacia公司製造)等套組，而自融合瘤細胞製備mRNA。
於cDNA之合成及cDNA庫之製作時，使用公知之方法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)]、或者SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen公司製造)或ZAP-cDNA合成套組(Stratagene公司製造)等套組等。
於製作cDNA庫時，關於供組入以自融合瘤細胞提取之mRNA為模板而合成之cDNA的載體，只要為供組入該cDNA之載體，則可使用任何者。例如使用ZAP Express[Strategies, 5, 58 (1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]、λZAPII(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49 (1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司製造)、λExCell、pT7T3-18U(Pharmacia公司製造)、pCD2[Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)]或pUC18[Gene, 33, 103 (1985)]等。
關於供導入由噬菌體或質體載體構建之cDNA庫之大腸桿菌，只要為可導入、表現及維持該cDNA庫者，則可使用任何者。例如使用XL1-Blue MRF'[Strategies, 5, 81 (1992)]、C600[Genetics, 39, 440 (1954)]、Y1088、Y1090[Science, 222, 778 (1983)]、NM522[J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)]、K802[J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]或JM105[Gene, 38, 275 (1985)]等。
自cDNA庫選擇編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA純系時，使用利用同位素或經螢光標記之探針之菌落・雜交法、或者溶菌斑・雜交法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]等。
又，製備引子，以自mRNA合成之cDNA或cDNA庫為模板，而進行聚合酶鏈反應法[以下，記載為PCR法，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)]，藉此亦可製備編碼VH或VL之cDNA。
利用適當之限制酶等切割所選擇之cDNA後，選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，藉由通常所使用之鹼基序列分析方法等而確定該cDNA之鹼基序列。關於鹼基序列分析方法，例如進行雙脫氧法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]等反應後，使用ABI PRISM3700(PE Biosystems公司製造)或A.L.F.DNA定序儀(Pharmacia公司製造)等鹼基序列自動分析裝置等。
根據所確定之鹼基序列分別推測VH及VL之完整胺基酸序列，與已知之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比較，藉此分別確認所取得之cDNA是否編碼包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列。
關於包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列，與已知之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比較，藉此可推測分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可知其等所屬之亞群(subgroup)。又，關於VH及VL之各CDR之胺基酸序列，可藉由與已知之抗體之VH及VL之胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比較而找出。
又，使用所獲得之VH及VL之完整胺基酸序列，例如針對SWISS-PROT或PIR-Protein等任意之資料庫，進行BLAST法[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]等同源性檢索，而可確認VH及VL之完整胺基酸序列是否為新穎者。
(3)人型嵌合抗體表現載體之構建
將各編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA分別選殖至(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因的上游，藉此可構建人型嵌合抗體表現載體。
為了將編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA之3'末端側、與人類抗體之CH或CL之5'末端側連結，而製作以編碼連結部分之鹼基序列適當之胺基酸，且成為適當之限制酶識別序列之方式設計的VH及VL之cDNA。
將所製作之VH及VL之cDNA以其等以適當形式表現的方式分別選殖至(1)中所獲得之人型CDR移植抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游，而構建人型嵌合抗體表現載體。
又，亦可使用兩端具有適當之限制酶之識別序列之合成DNA，藉由PCR法分別擴增編碼非人類抗體VH或VL的cDNA，而選殖至(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體。
(4)編碼人型CDR移植抗體之V區之cDNA之構建
編碼人型CDR移植抗體之VH或VL之cDNA可以下述方式進行構建。
分別選擇用以移植非人類抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列的人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列。關於所選擇之FR之胺基酸序列，只要為源自人類抗體者，則可使用任一者。
例如使用登陸於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中之人類抗體之FR之胺基酸序列、或者人類抗體之FR之各亞群之共通胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]等。為了抑制抗體之結合活性之降低，而選擇相對於原本之抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列，具有儘可能高之同源性(至少60%以上)之FR的胺基酸序列。
繼而，將原本之抗體之CDR之胺基酸序列分別移植至所選擇的人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列，而分別設計人型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列。考慮抗體之基因之鹼基序列中可見之密碼子的使用頻度[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]，將所設計之胺基酸序列轉化為DNA序列，而分別設計編碼人型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列。
基於所設計之DNA序列，合成包含100個鹼基左右長度之數條合成DNA，使用其等進行PCR反應。於該情形時，根據PCR反應中之反應效率及可合成之DNA之長度，較佳為H鏈、L鏈均設計6條合成DNA。
又，將適當之限制酶之識別序列導入至位於兩端之合成DNA之5'末端，藉此可容易地將編碼人型CDR移植抗體之VH或VL之cDNA選殖至(1)中所獲得之人型CDR移植抗體表現用載體。
或者，可藉由使用基於所設計之DNA序列，以1條DNA之形式所合成之各H鏈、L鏈全長合成DNA來實施。
PCR反應後，將擴增產物分別選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，藉由與(2)所記載之方法相同之方法而確定鹼基序列，而取得所需之具有編碼人型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列的質體。
(5)人型CDR移植抗體之V區之胺基酸序列之改變
人型CDR移植抗體若僅將非人類抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR，則其抗原結合活性較原本之非人類抗體降低[BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]。
於人型CDR移植抗體中，於人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中，鑑定與直接結合至抗原相關之胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構且與間接地結合至抗原相關的胺基酸殘基，將該等胺基酸殘基置換為原本之非人類抗體之胺基酸殘基，藉此可使降低之抗原結合活性上升。
為了鑑定與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，而使用X射線結晶分析[J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)]或電腦建模(computer modeling)[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)]等，藉此可進行抗體之立體結構之構建及分析。又，關於各抗體，製作數種改型體，反覆研究各自與抗原結合活性之相關性，並進行試誤，藉此取得具有所需之抗原結合活性之改型人型CDR移植抗體。
人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用改變用合成DNA進行(4)所記載之PCR反應而進行改變。關於PCR反應後之擴增產物，藉由(2)所記載之方法確定鹼基序列以確認實施過目標之改變。
(6)利用表面重建法之編碼人源化抗體之V區之cDNA之構建
利用表面重建法之編碼人源化抗體之VH或VL之cDNA可以如下方式進行構建。
分別選擇非人類抗體之VH或VL之FL之FR之胺基酸序列中被認為對於抗原結合活性影響較低的胺基酸殘基，將該胺基酸殘基置換為被認為抗原性更低之胺基酸殘基。
考慮抗體之基因之鹼基序列中可見之密碼子的使用頻度[A.L.F.DNA, US Dept.Health and Human Services(1991)]，將如此設計之VH或VL之胺基酸序列轉化為DNA序列，而分別設計利用表面重建法之編碼人源化抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列。
基於所設計之DNA序列，合成包含100個鹼基左右長度之數條合成DNA，使用其等進行PCR反應。於該情形時，根據PCR反應中之反應效率及可合成之DNA之長度，較佳為H鏈、L鏈均設計6條合成DNA。
又，將適當之限制酶之識別序列導入至位於兩端之合成DNA之5'末端，藉此可容易地將利用表面重建法之編碼人源化抗體之VH或VL之cDNA選殖至(1)中所獲得之人源化抗體表現用載體。
或者，可藉由使用基於所設計之DNA序列，以1條DNA之形式所合成之各H鏈、L鏈全長合成DNA來實施。
PCR反應後，將擴增產物分別選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，藉由與(2)所記載之方法相同之方法而確定鹼基序列，而取得所需之具有編碼人類抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列的質體。
(7)人源化抗體表現載體之構建
將所構建之編碼基因重組抗體之VH或VL之cDNA分別選殖至(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游，而可構建人源化抗體表現載體。
例如，將適當之限制酶之識別序列導入至(4)、(5)或(6)中所獲得之構建人源化抗體之VH或VL時所使用之合成DNA中，位於兩端之合成DNA的5'末端，藉此以其等以適當之形式進行表現之形式分別選殖至(1)中所獲得之人源化抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游。
(8)基因重組抗體之短暫性表現
可使用(3)及(7)中所獲得之基因重組抗體表現載體、或改型其等所得之表現載體而進行基因重組抗體的短暫性表現，從而可有效率地評價所製作之多種人源化抗體之抗原結合活性。
關於供導入表現載體之宿主細胞，只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任何細胞，例如使用COS-7細胞[American Type Culture Collection(ATCC)編號：CRL1651][Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)]。
向COS-7細胞導入表現載體時，使用DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res., CRC press (1991)]、或脂轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等。
導入表現載體後，培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性係使用酶免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、單株抗體實驗指南、Kodansha Scientific(1987)]等進行測定。
(9)穩定地表現基因重組抗體之轉形株之取得與基因重組抗體之製備
將(3)及(7)中所獲得之基因重組抗體表現載體導入至適當之宿主細胞，藉此可獲得穩定地表現基因重組抗體之轉形株。
向宿主細胞導入表現載體時，使用電穿孔法[日本專利特開平2-257891號公報、Cytotechnology, 3, 133 (1990)]等。
關於供導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞，只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任何細胞。
例如使用CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14(ATCC編號：CRL1581)、小鼠P3-X63-Ag8653細胞(ATCC編號：CRL1580)、缺失有二氫葉酸還原酶基因之CHO細胞)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)]、獲得了凝集素耐性之Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)]、缺失有α1,6-海藻糖基轉移酶基因之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC編號：CRL1662)等。
導入表現載體後，穩定地表現基因重組抗體之轉形株係藉由在包含G418硫酸鹽等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養而選擇(日本專利特開平2-257891號公報)。
關於動物細胞培養用培養基，使用RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)或融合瘤SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或者於該等培養基中添加有FBS等各種添加物之培養基等。
將所獲得之轉形株於培養基中進行培養，藉此使基因重組抗體於培養上清液中表現儲積。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行測定。又，轉形株可利用DHFR基因擴增系統(日本專利特開平2-257891號公報)等而使基因重組抗體之表現量上升。
基因重組抗體係使用蛋白A-管柱，自轉形株之培養上清液進行純化[Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]。又，亦可將凝膠過濾、離子交換層析法及超過濾等蛋白質之純化中所使用之方法組合。
經純化之基因重組抗體之H鏈、L鏈或抗體分子整體之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature, 227, 680 (1970)]、或西方墨點法(Western blotting)法[Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等進行測定。
3.純化單株抗體或其抗體片段之活性評價
經純化之本發明之單株抗體或其抗體片段之活性評價可以下述方式進行。
對於BMP10及BMP10表現組織之結合活性可使用上述1-(6-a)所記載之結合測定及(6-b)所記載之使用Biacore Systems等之表面電漿子共振法進行測定。又，可使用螢光抗體法[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)]進行測定。
雙特異性抗體之製造例如可藉由國際公開第2009/131239號所記載之方法等公知之方法進行。
4.使用本發明之抗BMP10單株抗體或該抗體片段之疾病之治療方法
本發明之單株抗體或該抗體片段可用於高血壓及高血壓性疾病之治療。
含有本發明之單株抗體或其抗體片段、或者該等之衍生物之治療劑可為僅含有作為有效成份的該抗體或該抗體片段、或者該等之衍生物者，但通常與藥理學上所容許之1種以上之載體一併混合，而以藉由製劑學之技術領域中所公知之方法製造所得之醫藥製劑之形式提供。
作為投予路徑，例如可列舉：經口投予、或者口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內或靜脈內等非經口投予。作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。
作為適合經口投予之製劑，可列舉：乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等。
如乳劑或糖漿劑之液體製備物係使用水、蔗糖、山梨糖醇或果糖等糖類；聚乙二醇或丙二醇等二醇類；芝麻油、橄欖油或大豆油等油類；對羥基苯甲酸酯類等防腐劑、或者草莓香料或胡椒薄荷等香料類等作為添加劑而進行製造。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等係使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等賦形劑；澱粉或海藻酸鈉等崩解劑；硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素或明膠等結合劑；脂肪酸酯等界面活性劑或者甘油等塑化劑等作為添加劑而進行製造。
作為適合非經口投予之製劑，係注射劑、栓劑或噴霧劑等。
注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或者上述兩者之混合物之載體等而進行製造。
栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體而進行製造。
噴霧劑係使用不會刺激接受者之口腔及呼吸道黏膜，且使本發明之單株抗體或其抗體片段以微細粒子之形式分散而使吸收變得容易的載體等而進行製造。作為載體，例如使用乳糖或甘油等。又，亦可以氣溶膠或乾粉之形式進行製造。
進而，於上述非經口劑中，亦可添加於適合經口投予之製劑中作為添加劑所例示之成份。
以下，藉由實施例對本發明具體地進行說明，但本發明並不限定於下述實施例。所使用之試劑類只要無特別記載，則設為依據隨附文件所使用者。
[實施例]
[實施例1]抗人類BMP10單株抗體之製作
1-1)免疫原之製備
作為免疫原，使用人類BMP10重組蛋白質、或人類BMP10成熟二聚物(R＆D Systems公司製造，Cat＃2926-BP)。人類BMP10重組蛋白質係依據國際公開第2014/007198號之實施例20所記載之方法所製備。藉由該方法所製備之人類BMP10重組蛋白質包括成熟體、N末前導肽體及全長體。
1-2)對於動物之免疫與抗體產生細胞之製備
佐劑使用Sigma佐劑系統(Sigma Adjuvant System)(註冊商標)(Sigma-Aldrich公司製造)、或Alum＋百日咳疫苗佐劑(Nacalai Tesqu公司製造)，依據隨附文件而製備以實施例1之1-1)中所製備之人類BMP10作為抗原的抗原懸濁液後，以腹腔及皮下或肌內路徑對WKY/NcrlCrlj大鼠或SD大鼠進行免疫。關於免疫之抗原量，以人類BMP10重組蛋白質為20 μg/head，人類BMP10成熟二聚物為10 μg/head進行。免疫係包括最終增強免疫在內，合計進行2次或4次。脾臟係於最終投予之3～4天後摘取。
將摘取之脾臟於初代細胞培養液(minimum essential media)(Nacalai Tesqu公司製造)(以下稱為MEM培氧基)中切碎後，藉由離心分離(1200 rpm、5分鐘)回收脾細胞。所獲得之脾細胞組份由於包含紅血球，故而藉由添加紅細胞裂解液(RED Blood Cell Lysing Buffer)(Sigma-Aldrich公司製造)並於冰上進行處理而去除紅血球。或者，採集髂骨淋巴結，於MEM培養基中擢碎細胞而獲得淋巴球。所獲得之脾細胞或淋巴球係於MEM培養基中洗淨2次後，供於細胞融合。
1-3)小鼠骨髓瘤細胞之製備
將8-氮鳥嘌呤耐性小鼠骨髓瘤細胞株p3-U1[P3X63Ag8U.1, ATCC：CRL-1597, European Journal of Immunology, 6, 511(1976)]於在S-Clone cloning medium CM-B(三光純藥公司製造)中添加有慶大黴素(10 μg/mL)之培養基(以下，記載為無血清培養基)中進行馴化培養，確保細胞融合時所需之細胞數(4×107
個以上)而供於細胞融合。
1-4)融合瘤之製作
將實施例1之1-2)中所獲得之小鼠脾細胞或淋巴球與實施例1之1-3)中所獲得之骨髓瘤細胞以成為8：1之方式進行混合，進行離心分離(1200 rpm、5分鐘)。對於所獲得之沈澱組份(細胞群)，一面緩慢地添加聚乙二醇-1000(純正化學公司製造，Cat＃69257-1210)、MEM培養基、二甲基亞碸(DMSO，Sigma Aldrich公司製造，Cat＃D2650)之混液500 μL一面平穩地搖盪。繼而，一面於該細胞液中添加MEM培養基5 mL一面平穩地搖盪，進而添加MEM培養基45 mL。繼而，將上述包含該細胞液之管進行離心分離(900 rpm、5分鐘)。
使用含有HAT之無血清培養基，將所獲得之沈澱組份(細胞群)以每孔200 μL之方式接種至除A行以外之96孔板。此時，將脾細胞或淋巴球數以每片培養板成為1.5×107
個/18 mL之方式進行調整，於37℃、5%CO2
之條件下進行培養。培養基更換係使用含有HAT之無血清培養基適當進行直至孔內之細胞成為適於篩選的細胞數。
1-5)利用固相抗原ELISA之抗BMP10抗體產生融合瘤之篩選
於抗BMP10抗體產生融合瘤之篩選時，ELISA用培養板係使用使人類BMP10固相化之固相抗原ELISA系統。具體而言，將利用磷酸緩衝液(Nacalai Tesqu公司製造)將實施例1之1-1)中所製備之人類BMP10重組體、或人類BMP10成熟二聚物(R＆D Systems公司製造，Cat＃2926-BP)製備成0.5 μg/mL者以50 μL/孔之方式分注至96孔之ELISA用培養板(F96 MAXISORP NUNC-IMMNO PLATE，Thermo Fisher Scientific公司製造，Cat＃442404)，於4℃下靜置一夜而進行吸附。
除去固相化液後，利用PBS洗淨3～5次，將1%BSA-PBS(Nacalai Tesqu公司製造，Cat＃099968－35)以200 μL/孔之方式添加，於室溫下靜置1小時，進行阻斷。
繼而，將融合瘤上清液以50 μL/孔之方式分注，於室溫下靜置1小時。利用PBST將該培養板洗淨3～5次後，將經1%BSA-PBS稀釋1000倍之Goat F(ab')2
Anti-Rat IgG-Fc(HRP)，預吸附(Abcam公司製造，Cat＃ab6257)以50 μL/孔之方式分注，於室溫下靜置1小時。
利用PBST將該培養板洗淨3～5次，將ABTS(2,2'-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，Wako公司製造，Cat＃016-08521)基質液或TMB基質液以50 μL/孔之方式進行添加，使之顯色而獲得適當之顯色時，將5%SDS溶液或1 mol/L鹽酸以50 μL/孔之形式進行添加，使用讀板儀(Spectra Max，Molecular Devices公司製造)測定樣本波長415 nm、參考波長490 nm下之吸光度(415 nm-490 nm)或樣本波長450 nm、參考波長570 nm下之吸光度(450 nm-570 nm)。
1-6)能夠檢測到BMP訊號之細胞之製作
作為產生抗BMP10抗體之融合瘤之篩選，使用能夠檢測到各種BMP蛋白質之訊號之細胞(以下，BMP訊號檢測細胞)。BMP訊號檢測細胞係使用日本專利特開2017-25011號公報之實施例5所記載之Id1-Luc/CHO細胞。
1-7)使用Id1-uc/CHO之抗BMP10中和抗體產生融合瘤之篩選
將人類BMP10成熟二聚物以最終濃度成為3 ng/mL之方式添加至96孔螢光-發光用培養板(康寧公司製造，Cat＃3916)中。繼而，將融合瘤培養上清液以最終濃度成為50%之方式進行添加。其後，將於Excell 325培養基[Excell 325 PF CHO(SAFC公司製造，Cat＃14340C-1000 mL)、4 mM L-麩醯胺、1×青黴素、1×鏈黴素(Nacalai公司製造，Cat＃09367-34)、0.5 μg/mL潮黴素]中懸濁而成之Id1-Luc/CHO細胞液以成為5×104
個/孔之方式添加。
再者，全部樣品係利用Excell 325培養基進行稀釋，若添加全部樣品，則成為100 μL/孔。其後，利用培養板攪拌器使孔內之液體均一後，於37℃下培養20小時。20小時後，將依據隨附文件所製備之Nano-Glo螢光素酶檢測測定液(Promega公司製造，Cat＃N1120)以40 μL/孔進行添加並攪拌後，利用Glomax(Promega公司製造)測定螢光素酶活性。
關於融合瘤培養上清液中之抗體之中和活性(%)，將不添加融合瘤培養上清液而僅添加有BMP10成熟二聚物之孔之值設為0%，將未添加抗體而僅添加有Excell 325培養基之孔之值設為100%而算出。
1-8)抗BMP10中和抗體產生融合瘤之單離
利用上述篩選，將顯示50%以上之中和活性者判斷為陽性。判斷為陽性之融合瘤係利用無血清培養基進行極限稀釋，接種至96孔板而進行單株化。單株化係對於來自在第1次判斷為陽性之孔之融合瘤進行計1～2次。藉由以上之操作，將產生18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體之融合瘤單離。
1-9)自融合瘤取得大量抗體
將實施例1之1-8)中所單離之融合瘤接種至大燒瓶2個中。培養基係使用無血清培養基。於37℃下培養6-8天後，回收包含細胞之培養基。將所回收之培養基進行離心分離，藉由0.22 μm過濾器來過濾所獲得之培養上清液。
使用填充有蛋白G瓊脂糖凝膠(Protein G Sepharose)4 Fast Flow(GE Healthcare公司製造)或Ab-Capchure Extra(Protenova公司製造)之開口管柱，而自經過濾器過濾之培養上清液純化抗人類BMP10抗體。
[實施例2]使用Id1-Luc/CHO細胞之所取得之抗體與已知抗體之BMP10中和活性比較
關於所取得之抗BMP10抗體與已知抗體，使用實施例1之1-6)中所製作之Id1-Luc/CHO細胞進行BMP10之中和活性的比較。9將人類BMP10成熟二聚物(R＆D Systems公司製造，Cat＃2926-BP)以最終濃度成為3 ng/mL之方式添加至6孔螢光-發光用培養板(康寧公司製造，Cat＃3916)，繼而，將已知抗體MAB2926(所謂已知抗體，係指MAB2926)及實施例1之1-9)中所純化之抗BMP10抗體18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體、或對照抗體(Purified Rat IgG1 λ Isotype control，BD公司製造，Cat＃553993)自最終濃度3000 ng/mL利用3倍稀釋階段性地製備成6種濃度並進行添加。
其後，將於Excell 325培養基[Excell 325 PF CHO(SAFC公司製造，Cat＃14340C-1000mL)、4 mM L-麩醯胺、1×青黴素、1×鏈黴素(Nacalai公司製造，Cat＃09367-34)、0.5 mg/mL潮黴素]中懸濁而成之Id1-Luc/CHO細胞液以成為5×104
個/孔之方式進行添加。添加全部樣品後，利用培養板攪拌器使孔內之液體均一後，於37℃下培養20小時。
20小時後，將依據隨附文件所製備之Nano-Glo螢光素酶檢測測定液(Promega公司製造，Cat＃N1120)以40 μL/孔進行添加並攪拌後，利用Glomax(Promega公司製造)測定螢光素酶活性。關於抗體之中和活性(%)，將未添加抗體而僅添加有BMP10成熟二聚物之孔之值設為0%，將未添加抗體而僅添加有Excell 325培養基之孔之值設為100%而算出。將結果示於圖1。
如圖1所示，除對照抗體以外，所有抗體均顯示對於BMP10之中和活性。可知，已知抗體MAB2926以3 μg/ml無法完全地中和成熟BMP10 3 ng/ml。相對於此，取得抗體11H10抗體、12H3抗體、18C1抗體以3 μg/ml完全中和成熟BMP10 3 ng/ml。又，18C1抗體、12H3抗體以較MAB2926低之濃度顯示BMP10中和活性。
根據以上之結果，已明確3個取得抗體全部為BMP10中和活性較已知抗體顯著提高之抗體。
[實施例3]
使用人類ALK1表現報導細胞之取得抗體與已知抗體之BMP10之中和活性比較
關於所取得之抗BMP10抗體與已知抗體對於BMP10之中和活性，使用使人類ALK1高表現之人類ALK1表現報導細胞來進行比較。已知抗體係使用MAB2926(R＆D Systems公司)。
3-1)人類ALK1表現報導細胞之製作
人類ALK1表現報導細胞係使用日本專利特開2017-25011號公報之實施例6所記載之ALK1/Id1-Luc/CHO細胞。
3-2)新穎取得抗體與已知抗體之BMP10中和活性比較
將人類BMP10成熟二聚物(R＆D Systems公司製造，Cat＃2926-BP)以最終濃度成為0.3 ng/mL之方式添加至96孔螢光-發光用培養板(康寧公司製造，Cat＃3916)。繼而，將作為抗BMP10抗體之18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體、MAB2926、或對照抗體(Purified Rat IgG1 λ Isotype control，BD公司製造，Cat＃553993)自最終濃度3000 ng/mL利用3倍稀釋階段性地製備成6種濃度並進行添加。
其後，將利用Excell 325培養基所製備之ALK1/Id1-Luc/CHO細胞懸濁液以成為5×104
個/孔之方式進行添加。全部樣品係利用Excell 325培養基進行稀釋，並使之與人類BMP10、抗體稀釋液、細胞懸濁液合計成為100 μL/孔。其後，利用培養板攪拌器使孔內之液體均一後，於37℃下培養20小時。
20小時後，將依據隨附文件所製備之Nano-Glo螢光素酶檢測測定液以40 μL/孔進行添加並攪拌後，使用Glomax(Promega公司製造)測定螢光素酶活性。關於抗體之中和活性(%)，將未添加抗體而僅添加有BMP10成熟二聚物之孔之值設為0%，將未添加抗體而僅添加有Excell 325培養基之孔之值設為100%而算出。將結果示於圖2。
如圖2所示，對照抗體及已知抗體MAB2926於ALK1/Id1-Luc/CHO細胞中未顯示中和活性。另一方面，取得抗體18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體於ALK1/Id1-Luc/CHO細胞中顯示明確之BMP10中和活性。又，中和活性之強度依序為18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體。
根據以上之結果明確，取得抗體係於ALK1高表現細胞中顯示中和活性之新穎抗體。
[實施例4]取得抗體對於各種BMP家族分子之抑制作用
為了確認18C1抗體特異性地中和BMP10，而使用實施例1之1-6)中所製作之Id1-Luc/CHO細胞，對18C1抗體對於各種BMP訊號之抑制作用進行研究。
將人類各種BMP成熟二聚物以最終濃度成為3 ng/mL之方式添加至96孔螢光-發光用培養板(康寧公司製造，Cat＃3916)，繼而將18C1抗體之稀釋液以最終濃度成為1.0 μg/mL之方式進行添加。人類各種BMP成熟二聚物係使用人類BMP2、人類BMP4、人類BMP6、人類BMP7、人類BMP9、人類BMP10、人類BMP15、人類GDF5、人類GDF7(均為R＆D Systems公司製造)。其後，將於Excell 325培養基[Excell 325 PF CHO(SAFC公司製造，Cat＃14340C-1000mL)、4 mM L-麩醯胺、1×青黴素、1×鏈黴素(Nacalai公司製造，Cat＃09367-34)、0.5 μg/mL 潮黴素]中懸濁而成之Id1-Luc/CHO細胞液以成為5×104
個/孔之方式進行添加。
全部樣品係利用Excell 325培養基進行稀釋，並最終成為100 μL/孔。其後，利用培養板攪拌器使孔內之液體均一後，於37℃下培養20小時。
20小時後，將依據隨附文件所製備之Nano-Glo螢光素酶檢測測定液(Promega公司製造，Cat＃N1120)以40 μL/孔進行添加並攪拌後，利用Glomax(Promega公司製造)測定螢光素酶活性。
關於抗體之中和活性(%)，將未添加抗體而僅添加有BMP成熟二聚物之孔之值設為0%，將未添加抗體而僅添加有Excell 325培養基之孔之值設為100%而算出。將結果示於圖3。
如圖3所示，明確人類BMP2、人類BMP4、人類BMP6、人類BMP7、人類BMP9、人類BMP15、人類GDF5、人類GDF7之訊號均完全不受18C1抗體抑制，18C1抗體係僅特異性地抑制人類BMP10之訊號之抗體。
[實施例5]編碼抗BMP10單株抗體之VH及VL之基因序列之單離
5-1)自抗BMP10單株抗體產生融合瘤細胞製備總RNA
使用Maxwell 16 LEV simplyRNA組織套組(Tissue kit)(Promega公司製造＃AS1280)，自實施例1所記載之產生18C1抗體、12H3抗體及11H10抗體之融合瘤1×106
個製備各融合瘤之總RNA。
5-2)抗BMP10單株抗體之VH及VL之基因選殖
使用SMARTer RACE cDNA擴增套組(Amplification Kit)(Clontech公司製造，Cat＃634924)，自實施例5-1中所取得之各融合瘤之總RNA 1 μg製作cDNA。以所獲得之cDNA為模板，將套組所隨附之通用引子A mix(含有正向引子)、與編碼大鼠之IgG1、IgG2a重鏈恆定區之反向引子進行組合，藉此進行VH之cDNA序列確定。
具體而言，使用對於大鼠IgG1具有特異性之引子(序列編號1)、對於大鼠IgG2a具有特異性之引子(序列編號2)，並分別與通用引子A組合，藉此進行PCR反應而擴增各抗體之VH之cDNA片段。
又，同樣地使用大鼠Ig(κ)特異性引子(序列編號3)或大鼠Ig(λ)特異性引子(序列編號4)，並分別與通用引子A組合，藉此進行PCR而擴增各抗體之VL之cDNA片段。
PCR係將包含94℃下30秒鐘、72℃下3分鐘之反應週期進行5次，將包含94℃下30秒鐘、70℃下30秒鐘、72℃下3分鐘之反應週期進行5次，將包含94℃下30秒鐘、68℃下30秒鐘、72℃下3分鐘之反應週期進行25次。
進行瓊脂糖凝膠電泳，結果為，源自18C1抗體融合瘤之cDNA於使用編碼IgG1重鏈恆定區之特異性引子時獲得PCR擴增產物。源自12H3抗體產生及11H10抗體融合瘤之cDNA於使用編碼IgG2a重鏈恆定區之特異性引子時獲得PCR擴增產物。
又，源自12H3抗體、11H10抗體產生融合瘤之cDNA於使用大鼠Ig(κ)特異性引子時亦獲得PCR擴增產物。源自18C1抗體產生融合瘤之cDNA於使用大鼠Ig(λ)特異性引子時亦獲得PCR擴增產物。使用凝膠提取試劑盒(Gel Extraction Kit)(QIAEX II，QIAGEN公司製造，Cat＃20021)來純化各PCR擴增產物。
使用測序用Zero Blunt拓樸異構酶PCR選殖套組(Invitrogen公司製造，Cat＃K287540SP)，將所獲得之基因片段***至pCR4載體(Invitrogen公司製造)。
將所獲得之質體導入至大腸桿菌DH5α株。使用自動質體提取機(Kurabo公司製造)，自所獲得之轉形株提取質體，對鹼基序列進行分析。其結果為，確認到取得了於cDNA之5'末端存在推測為起始密碼子之ATG序列之全長VH cDNA、及VL cDNA。
5-3)抗人類BMP10單株抗體V區之基因序列之分析
將實施例5-2中所獲得之18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體之VH之完整鹼基序列分別示於序列編號5、6、7，將自該序列推測之包括訊號序列在內之VH之完整胺基酸序列分別示於序列編號8、9、10，將VL之完整鹼基序列分別示於序列編號11、12、13，將自該序列推測之包括訊號序列在內之VL之完整胺基酸序列分別示於序列編號14、15、16。
又，將自序列編號5、6、7去除訊號序列後之鹼基序列分別示於序列編號17、18、19，將自序列編號11、12、13去除訊號序列後之鹼基序列分別示於序列編號20、21、22，將自序列編號8、9、10去除訊號序列後之胺基酸序列分別示於序列編號23、24、25，將自序列編號14、15、16去除訊號序列後之胺基酸序列分別示於序列編號26、27、28。
根據與已知之大鼠抗體之序列資料[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services(1991)]的比較，確認到單離之各cDNA係包含分泌訊號序列之編碼18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體之全長cDNA。
藉由將18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體之VH及VL之CDR與已知之抗體之胺基酸序列進行比較而鑑定。將18C1抗體之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號29、30及31，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號32、33及34。將12H3抗體之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號35、36及37，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號38、39及40。將11H10抗體之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號41、42及43，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列分別示於序列編號44、45及46。
5-3)抗BMP10嵌合抗體之製作
於18C1嵌合抗體之重組表現中，使用具有人類λ型輕鏈恆定區及人類IgG4改變型重鏈恆定區之N5LG4PE(R409K)載體，12H3及11H10嵌合抗體之重組表現中，使用具有人類κ型輕鏈恆定區及人類IgG4改變型重鏈恆定區之N5KG4PE(R409K)載體。製作於國際專利廣報第WO2006033386中所使用之N5KG4PE載體骨架中導入有將人類IgG4重鏈恆定區之EU-index中之第409號之Arg置換為Lys之改變者，並命名為N5KG4PE(R409K)載體。又，將於該載體中將人類κ鏈恆定區部分置換為人類λ恆定區而成者命名為N5LG4PE(R409K)載體。將編碼VH、VL之cDNA***至上述抗體表現載體。分別為VH***至SalI、NheI位點間，VL***至BgIII、BlpI(λ型)或BgIII、BsiWI(κ型)位點間。
將***有18C1抗體之VH之鹼基序列及VL之鹼基序列分別示於序列編號5、11，將藉此表現之VH之胺基酸序列及VL之胺基酸序列分別示於序列編號8、14。將***有12H3抗體之VH之鹼基序列及VL之鹼基序列分別示於序列編號6、12，將藉此表現之VH之胺基酸序列及VL之胺基酸序列分別示於序列編號9、15。將***有11H10抗體之VH之鹼基序列及VL之鹼基序列分別示於序列編號7、13，將藉此表現之VH之胺基酸序列及VL之胺基酸序列分別示於序列編號10、16。
於18C1抗體之VL、VH之鹼基序列之擴增時，使用分別包含序列編號53～56所示之鹼基序列之引子進行PCR，於12H3抗體之VL、VH之鹼基序列之擴增時，使用分別包含57～60所示之鹼基序列之引子進行PCR，於11H10抗體之VL、VH之鹼基序列之擴增時，使用分別包含61～64所示之鹼基序列之引子進行PCR。
使用所製作之表現載體及Expi293F表現系統套組(Expression System Kit)(Life Technologies公司製造)來使重組嵌合抗體表現。使用Mab Select SuRe(GE healthcare公司製造)，自培養上清液純化抗體。使用NAP-25管柱(GE healthcare公司製造)，將緩衝液置換為D-PBS(-)(Nacalai Tesqu公司製造，Cat＃14249-24)後，測定280 nm之吸光度而確定抗體之濃度。作為分子吸光係數，使用1.50 mL/(mg・cm)。
5-4)利用Biacore之抗BMP10嵌合抗體對於人類BMP10蛋白質之結合活性評價
為了將實施例5-3中所獲得之抗BMP10嵌合抗體、與作為已知抗體之MAB2926(R＆D Systems公司)之對於人類BMP10之結合活性進行比較，使用利用表面電漿子共振法(SPR法)之BiacoreT100(GE healthcare Bioscience公司製造)測定對於人類BMP10成熟二聚物(R＆D Systems公司製造，Cat＃2926-BP)之結合活性。
嵌合抗體之結合活性係以下述方式測定。使用人類抗體捕獲套組(GE healthcare Bioscience公司製造，Cat＃BR-1008-39)，依據隨附之操作說明，將抗人IgG抗體固定至CM5感測器晶片(GE healthcare Bioscience公司製造，BR100530)。將製備成5 μg/mL之18C1嵌合抗體(以下稱為ch18C1抗體)或12H3嵌合抗體(以下稱為ch12H3抗體)、11H10嵌合抗體(以下稱為ch11H10抗體)以10 μL/min之流速添加至於固定有抗人IgG抗體之流槽中10秒鐘。
又，繼而，使自300 ng/mL利用3倍稀釋階段性地製備成5種濃度之人類成熟BMP10以30 μL/min之流速流動，對結合反應觀察1分鐘，對解離反應觀察30分鐘。所取得之感測器圖譜係使用Bia Evaluation Software(GE healthcare Bioscience公司製造)進行分析，算出各抗體之動力學常數。
MAB2926之結合活性係以下述方式測定。使用小鼠抗體捕獲套組(GE healthcare Bioscience公司製造，Cat＃BR-1008-38)，依據隨附之操作說明，將抗小鼠IgG抗體固定至CM5感測器晶片(GE healthcare Bioscience公司製造，BR100530)。將製備成5 μg/mL之MAB2926以10 μL/min之流速添加至固定有抗人IgG抗體之流槽中10秒鐘。
又，繼而，使自300 ng/mL利用3倍稀釋階段性地製備成5種濃度之人類成熟BMP10以30 μL/min之流速流動，觀察結合反應1分鐘、解離反應30分鐘。所取得之感測器圖譜係使用Bia Evaluation Software(GE healthcare Bioscience公司製造)進行分析，算出MAB2926之動力學常數。將所算出之各抗體之結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)及解離常數[kd/ka＝KD
]示於表1。
[表1]
| 抗體名 | ka | kd | KD |
| MAB2926 | 4.06E+07 | 0.001343 | 3.31E-011 |
| ch11H10抗體 | 3.22E+07 | 2.02E-04 | 6.26E-012 |
| ch12H3抗體 | 1.31E+07 | 1.54E-004 | 1.18E-011 |
| ch18C1抗體 | 3.88E+07 | 1.02E-004 | 2.62E-012 |
| *ka係由於超過機器之檢測極限，故而設為參考值。 |
如表1所示，明確所取得之ch18C1抗體、ch12H3抗體、ch11H10抗體之結合較已知抗體MAB2926強。
[實施例6]
與所取得之抗體競爭之受體之分析
6-1)ALK1-Fc之製備
ALK1-Fc係依據國際公開第2010/126169號之實施例1所記載之方法製備。
6-2)利用Biacore之競爭之受體之分析
BMP10藉由結合至I型與II型之2個受體而傳遞訊號。為了分析所取得之抗BMP10抗體與何種受體競爭，而使用利用表面電漿子共振法(SPR法)之BiacoreT100(GE healthcare Bioscience公司製造)進行測定。
使用人類抗體捕獲套組(GE healthcare Bioscience公司製造，Cat＃BR-1008-39)，依據隨附之操作說明，將抗人IgG抗體固定至CM5感測器晶片(GE healthcare Bioscience公司製造，BR100530)。
將製備成10 μg/mL之ALK1-Fc、BMPR2-Fc(R＆D Systems公司製造，Cat＃811-BR-100)、內皮糖蛋白-Fc(R＆D Systems公司製造，Cat＃6578-EN-025)之任一者以10 μL/min之流速添加至固定有抗人IgG抗體之流槽中10秒鐘。
又，繼而，將混合製備成100 ng/ml之人類成熟BMP10(R＆D Systems公司製造，Cat＃2926-BP)與抗BMP10抗體 1 μg/ml而成者以10 μL/min之流速添加30秒鐘。
將結果示於表2。於表2中，將抗體與成熟BMP10之混合物結合至所捕獲之ALK1-Fc、BMPR2-Fc、內皮糖蛋白-Fc之情形記載為＋，將未結合之情形記載為－。
[表2]
| 抗體名 | ALK1-Fc | BMPR2_Fc | 內皮糖蛋白-Fc |
| MAB2926 | - | + | + |
| 11H10抗體 | + | - | - |
| 12H3抗體 | + | - | - |
| 18C1抗體 | + | - | - |
如表2所示，於成熟BMP10與抗體之混合物未結合至所捕獲之受體之情形時，可謂抗體與受體競爭。結果可知，MAB2926抑制BMP10與ALK1-Fc之結合。
另一方面，MAB2926未抑制BMP10與BMPR2-Fc及內皮糖蛋白-Fc之結合。18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體均未抑制BMP10與ALK1-Fc之結合。另一方面，18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體均抑制了BMP10與BMPR2-Fc及內皮糖蛋白-Fc之結合。
根據以上之結果明確，18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體係與已知抗體相比所抑制之受體不同之新穎抑制方式的抗體。
[實施例7]
取得抗體對於正常動物之血壓之作用之評價
使用SD大鼠，評價18C1抗體對於血壓之作用。購入6週齡之雄性SD大鼠(日本Charles River公司製造)而供於實驗。飲水係自由攝取且提供殺菌自來水，食餌係自由攝取且提供固體飼料FR-2(Funabashi Farm公司製造)。馴化飼養後，於7週齡時實施遙測發射機之嵌入手術。
具體而言，將戊巴比妥鈉(東京化成工業股份有限公司製造)50 mg/kg投予至大鼠之腹腔內來實施麻醉。將遙測發射機(TA11PA-C40，Data Sciences International)之血壓感測器***至腹部大動脈內，使本體嵌入至腹腔內。藉由一般狀態觀察及血液動力學觀察，確認到自手術之影響順利地恢復。針對嵌入有遙測發射機之動物，以收縮期血壓之平均值為指標而進行分群。於12週齡時進行抗體之投予。
具體而言，將利用PBS將18C1抗體以成為1 mg/mL之方式製備而成者以1 mL/kg的用量進行投予。又，將利用PBS將12H3抗體、或11H10抗體以成為5 mg/ml之方式製備而成者以1 mL/kg的用量進行投予。投予係以皮下路徑進行。利用設置於籠(cage)下之接收板(RPC-1，Data Sciences International)接收自發射機發送之血壓波形之信號。信號經由資料交換矩陣(Data Exchange Matrix)(Data Sciences International)而進入資料取得/分析系統(DATAQUEST ART Gold ver2.30, Data Sciences International)，每隔5分鐘取得10秒鐘之收縮期血壓之測定資料。將結果示於圖4A～圖4C。
如圖4A及圖4B所示，發現藉由18C1抗體、12H3抗體之投予而收縮期血壓降低。又，18C1抗體之降壓作用強於12H3抗體。另一方面，如圖4C所示，於11H10抗體之投予時，未發現對於收縮期血壓之影響。根據以上情況，新穎地發現抗BMP10抗體具有降壓作用。
進而，可知降壓作用係與抗體於活體外之BMP10中和活性相關，關於具有相對較弱之中和活性之11H10抗體，未發現降壓作用。根據該情況，新穎地發現僅具有強力之BMP10中和活性之抗體具有降壓作用。
[實施例8]
18C1抗體對於自發性高血壓大鼠之血壓之作用的評價
為了調查取得抗體對於高血壓動物之降壓作用，而使用雄性自發性高血壓大鼠(SHR/Izm，Japan SLC公司)來評價18C1抗體對於血壓之作用。
購入14週齡之雄性SHR/Izm大鼠(Japan SLC)而供於實驗。飲水係自由攝取且提供殺菌自來水，食餌係自由攝取且提供固體飼料FR-2(Funabashi Farm公司製造)。馴化飼養後，於16週齡時實施遙測發射機之嵌入手術。遙測發射機之嵌入手術方法及血壓波形之取得係依據實施例7進行。於21週齡時，將利用PBS將18C1抗體以成為5 mg/ml之方式製備而成者以1 mL/kg之用量進行投予。投予係以皮下路徑進行。將結果示於圖5。
如圖5所示，藉由投予18C1抗體5 mg/kg，觀察到在約1個月期間收縮期血壓持續降低。根據以上情況，表示BMP10之中和於高血壓病態時具有治療效果。
[實施例9]
18C1抗體對於Dahl鹽敏感性大鼠之作用之評價
對於Dahl鹽敏感性大鼠(以下Dahl-S大鼠)提供高鹽，評價BMP10抗體對於所誘發之高血壓及心臟或腎臟之損傷之作用。購入5週齡之雄性Dahl鹽敏感性大鼠(DIS/Eis：Slc)(Japan SLC公司製造)而供於實驗。
提供FR-2飼料(Funabashi Farm公司製造)直至6週齡，以後提供高鹽飼料(含有8%NaCl之FR-2飼料，Oriental Yeast公司製造)。作為正常對照群，使用於6週齡以後亦提供正常飲食(FR-2飼料)之Dahl-S大鼠。飲水係自由地攝取動物用飲水。
於8週齡時點進行血壓及心率之測定。血壓及心率之測定係使用小鼠-大鼠非侵入式血壓計(BP-98E，Softron公司製造)，於2次之測定馴化後實施。於8週齡時點以體重、血壓及心率為指標，將高鹽飼料群以各群12隻之方式分為2個群，將介質(PBS 1 mL/kg)或18C1抗體以成為5 mg/kg之用量之方式以週1次之頻度進行皮下投予。
於16週齡時點實施血壓測定、心臟ECHO檢查、尿參數測定。進而，於異氟醚吸入麻醉下自腹部大動脈進行採血，於放血致死後進行解剖調查。摘取心臟、肺及兩側腎臟，對組織重量進行測量。
心臟ECHO檢查係於異氟醚吸入麻醉下將大鼠之前胸部進行剃毛，使用小動物用超音波高解像度成像系統(Vevo2100，Visual Sonic公司製造)及高頻・高幀頻探針(MS-200，VisualSonic公司製造)，以中心頻率15.0 MHz之超音波進行。藉由M模式法，以乳頭肌等級測量左心室後壁厚度(LVPW；s、LVPW；d)。藉由於二尖瓣環設置有樣品量之組織多普勒法，測定二尖瓣環運動速度(e')。
采尿係於自由攝餌及自由飲水下於代謝籠(T-480，TOKIWA KAGAKU KIKA公司製造)中進行24小時。尿樣品於尿量測定後進行1870×g、4℃、15分鐘離心分離，將其上清液用於測定。尿中參數係使用自動分析裝置日立7170S(日立製作所公司製造)或者全自動電解質分析裝置[PVA-EXII，A&T公司製造]進行測定。
所採集之心臟、大動脈及腎臟係供於病理組織學分析。具體而言，利用10 vol%中性緩衝福馬林液固定所採集之心臟、大動脈及腎臟。依據慣例，自石蠟包埋塊體製作切片，實施馬松三色(Masson trichrome)(MT)染色或蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin)(HE)染色。
關於腎臟絲球體損傷病理評分，於光學顯微鏡下觀察HE染色標本，每個個體將100個以上絲球體作為對象，將每個絲球體中之病變(腎小球環間膜擴張(mesangial expansion)、絲球體硬化(glomerular sclerosis)、及/或絲球體毛細管塌陷(glomerular capillary collapse))區域比例等級化為下述5個階段(0：正常(normal)、1：1-25%、2：26-50%、3：51-75%、4：76-100%)。其後，算出每個個體之絲球體病變評分(“各等級之分數”ד 每個等級之絲球體之比例”之總和)。統計分析係以評分1以上之絲球體數進行比較。
關於腎臟腎小管間質損傷病理評分，於光學顯微鏡下觀察HE染色標本，每個個體將各切片之腎小管及間質病變(嗜鹼性腎小管(basophilic tubule)、透明尿圓柱(hyaline cast)、間質性炎症(interstitial inflammation)及/或管狀擴張(tubular dilatation))於各切片面積中所占之比例等級化為5個階段(0：正常(normal)、1：1-25%、2：26-50%、3：51-75%、4：76-100%)。
將結果示於圖6～13。
如圖6所示，藉由高鹽飲食而Dahl-S大鼠之血壓顯著地上升。藉由投予18C1抗體，由高鹽飲食誘發之Dahl-S大鼠之高血壓被抑制至與正常飲食群相同之程度。
又，如圖7A、圖7B所示，藉由高鹽飲食而Dahl-S大鼠之血中鈉量、尿中鈉***量均增加。藉由投予18C1抗體，尿中鈉***量進一步增加。進而藉由投予18C1抗體，血中鈉量正常化至與正常飲食群相同之程度。根據以上之結果明確，抗BMP10抗體對於Dahl-S大鼠之由高鹽飲食引起之鈉蓄積及高血壓顯示明顯效果。
另一方面，如圖8所示，藉由高鹽飲食而Dahl-S大鼠之尿量增加，藉由抗BMP10抗體而降低。即，表示抗BMP10抗體具有使鹽敏感性病態中之腎臟鈉***障礙正常化的作用，提示具有與增加尿量之利尿藥不同之作用機理。
如圖9所示，於高鹽飲食群中發現與正常飲食群相比，尿中蛋白質***量增加。又，如圖10A、圖10B及圖11B所示，於高鹽飲食群中，於腎臟中發現透明尿圓柱、嗜鹼性腎小管、腎小管擴張，確認到腎臟腎小管間質明顯損傷。進而如圖10D、圖10E及圖11A所示，於高鹽飲食群中發現絲球體透明化，確認到腎臟絲球體明顯損傷。另一方面，如圖9、圖10C及圖10F所示，於高鹽飲食＋18C1抗體投予群中，尿蛋白質***量之增加、腎臟絲球體損傷及腎臟腎小管間質損傷得到較強抑制。
根據以上之結構提示，抗BMP10抗體具有對於由高血壓惹起之絲球體損傷、腎小管間質損傷之治療效果。
如圖12A所示，於高鹽飲食群中發現與正常飲食群相比，左心室後壁厚度肥厚。進而如圖12B所示，於高鹽飲食群中發現與正常飲食群相比，左心室舒張功能指標e'減少，提示引起了心臟舒張功能障礙。
如圖13所示，於高鹽飲食群中發現肺重量增加，提示引起了由左心室舒張功能障礙引起之肺充血。另一方面，如圖12A、圖12B及圖13所示，於高鹽飲食＋18C1抗體投予群中，左心室後壁厚度、e'及肺重量被維持在與正常飲食群相同之程度。
根據以上之結果，提示抗BMP10抗體對於由高血壓惹起之舒張功能不全心衰竭具有治療效果。
[實施例10]
抗BMP10抗體對於人血清之中和活性之評價
作為ALK1之配體，除BMP10以外，亦已知有BMP9。為了評價對於血中之BMP9、BMP10之中和活性，將利用人血清對人類ALK1表現報導細胞刺激時之中和活性進行比較。
10-1)作為抗BMP9抗體之10D5抗體之取得
抗BMP9抗體10D5係依據國際公開第2014/007198號之實施例7所記載之方法所製備。
10-2)取得抗體與已知抗體之BMP10中和活性比較
將人血清(Human True A serum，pool of donars，Biopredic international公司製造，Cat＃SER019)以最終濃度成為5%之方式添加至96孔螢光-發光用培養板(康寧公司製造，Cat＃3916)。
繼而，添加作為抗BMP10抗體之18C1抗體、12H3抗體、11H10抗體、作為抗BMP9抗體之10D5抗體、或對照抗體(Purified Rat IgG1 λ Isotype control，BD公司製造，Cat＃553993)、或者混合有抗BMP9抗體與抗BMP10抗體者。作為混合有抗BMP9抗體與抗BMP10抗體者，使用混合有12H3抗體與10D5抗體、或者11H10抗體與10D5抗體者。
抗體無論是否混合，各抗體均以自最終濃度10000 ng/mL利用3倍稀釋成為5階段之濃度之方式進行製備並添加。其後，將ALK1/Id1-Luc/CHO細胞懸濁液以成為5×104
個/孔之方式進行添加。全部樣品係利用Excell 325培養基進行稀釋，並使之與人血清、抗體稀釋液、細胞懸濁液合計最終成為100 μL/孔。利用培養板攪拌器使孔內之液體均一後，於37℃下培養20小時。
20小時後，將依據隨附文件所製備之Nano-Glo螢光素酶檢測測定液以40 μL/孔進行添加並攪拌後，使用Glomax(Promega公司製造)測定螢光素酶活性。關於抗體之中和活性(%)，將未添加抗體而僅添加有血清之孔之值設為0%，將未添加抗體而僅添加有Excell 325培養基之孔之值設為100%而算出。
結果為，如圖14所示，對照抗體、作為抗BMP10抗體之12H3抗體、11H10抗體、作為抗BMP9抗體之10D5抗體均未對人血清顯示中和活性。另一方面，混合有12H3抗體與10D5抗體者、及混合有11H10抗體與10D5抗體者對於人血清顯示明確之中和活性。
根據以上之結果，提示於人血清中存在人類BMP9/BMP10異質二聚物。又，作為抗BMP10抗體之18C1抗體單獨地對於人血清顯示中和活性。根據該情況，提示18C1抗體係對於存在於人血清中之人類BMP9/BMP10異質二聚物具有強力中和活性之新穎抗體。
[實施例11]
人血中之BMP9/BMP10異質二聚物之檢測
為了檢測實施例10中所提示之BMP9/BMP10異質二聚物，利用抗BMP9抗體與抗BMP10抗體進行夾層ELISA。
11-1)12H3抗體之生物素化
為了用作夾層ELISA之檢測抗體，進行作為抗BMP10抗體之12H3抗體之生物素化。生物素化係使用同仁化學研究所公司製造之生物素標記套組(Biotin Labeling Kit)-NH2套組(Cat＃LK03)進行。方法係依據製品記載之隨附文件進行。
11-2)使用抗BMP9抗體、抗BMP10抗體之夾層ELISA
將利用碳酸-碳酸氫鹽緩衝液(50 mM NaHCO3 pH值9.6，Sigma-Aldrich公司 Cat＃C3041)將作為抗BMP9抗體之10D5抗體、作為抗BMP10抗體之11H10抗體、或對照抗體(Purified Mouse IgG1 κ Isotype control，BD公司製造，Cat＃554121)稀釋至3 μg/ml而成者作為固相化液，以100 μL/孔添加至96孔之ELISA用培養板(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE，Thermo Fisher Scientific公司製造，Cat＃442404)，於4℃下靜置一夜而進行吸附。
去除抗體液後，將1%BSA-PBS以300 μL/孔添加，於室溫下靜置1小時而進行阻斷，利用PBST洗淨5次。繼而，將利用0.1%BSA-PBST將人血清(Human True A serum，pool of donars，Biopredic international公司製造、Cat＃SER019)以最終濃度成為1%、2%、4%、8%、16%之方式稀釋而成之溶液以100 μL/孔進行添加，於室溫下靜置1小時並進行反應後，利用PBST洗淨5次。
繼而，將利用0.1%BSA-PBST將實施例11之11-1)中所製作之生物素化12H3抗體製備成50 ng/mL而成之溶液以100 μL/孔進行分注，於室溫下靜置1小時。利用PBST將該培養板洗淨5次後，將經0.1%BSA-PBST稀釋500倍之Streptavidin-PolyHRP80，Pre-diluted in Stabilizer(1/20)(Stereospecific Detection Technologies公司製造，Cat＃SP80D50)以100 μL/孔進行添加，於室溫下靜置1小時。
利用PBST將培養板洗淨5次，將TMB受質液(TMB＋顯色底物(Substrate-Chromogen)，Dako公司製造，Cat＃S1599)以50 μL/孔進行添加而使之顯色，獲得了適當顯色，此時，將1 N硫酸溶液(Wako公司製造，Cat＃192-04755)以50 μL/孔進行添加，使用全波長酶標儀(Multiskan Spectrum)(Thermo Labsystems公司製造)測定450、570 nm之吸光度。將結果示於圖15。
如圖15所示，將對照抗體及作為抗BMP10抗體之11H10抗體固相化時，未發現對於血清之反應。另一方面，於將作為抗BMP9抗體之10D5抗體固相化之情形時，發現有血清濃度依賴性之明確反應。根據以上之結果，提示於人血清中存在由抗BMP9抗體、抗BMP10抗體同時識別之BMP9/BMP10異質二聚物。
[實施例12]
18C1抗體之人源化抗體之製作
(1)18C1人源化抗體之VH及VL之胺基酸序列之設計
藉由以下所記載之方法，設計出18C1人源化抗體之各種VH及VL之胺基酸序列。於以下之記述中，作為具有各種VH及VL之胺基酸序列之18C1人源化抗體之總稱，記載為hz18C1抗體。作為適於18C1抗體之CDR之胺基酸序列之移植的已知人類抗體之架構區(以下，記載為FR)之胺基酸序列，自Kabat等人[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]中所報告之人類FR一致序列及人類抗體生殖細胞系(Germ-line)序列中選擇hSGHII及V1-22，將CDR移植至該等之FR。
分別將序列編號29、30、31所示之18C1 VH之CDR1～3的胺基酸序列移植至hSGHII之FR之胺基酸序列之適當位置上，而設計hz18C1 HV0(序列編號70)。又，分別將序列編號32、33、34所示之18C1 VL之CDR1～3之胺基酸序列移植至V1-22之FR(作為FR4，直接使用18C1嵌合抗體者)之胺基酸序列的適當位置，而設計出hz18C1 LV0(序列編號71)。
藉由如上述般設計出之hz18C1 HV0及hz18C1 LV0之電腦模型化，鑑定認為會對抗體之結合活性造成影響之FR之胺基酸殘基。其結果為，作為於hz18C1 LV0HV0抗體之可變區之FR之胺基酸殘基中認為會使抗原結合部位之立體結構變化而對抗體之結合活性造成影響之胺基酸殘基，於VH中，分別選擇序列編號70所表示之胺基酸序列之第14號之Pro、第20號之Leu、第27號之Gly、第29號之Val、第30號之Ser、第37號之Ile、第48號之Ile、第67號之Val、第71號之Val、第76號之Asn、第78號之Phe、第82號之Leu、第85號之Val、第92號之Val、第94號之Tyr、及第109號之Thr；於VL中，分別選擇序列編號71所表示之胺基酸序列之第7號之Pro、第10號之Val、第12號之Glu、第14號之Pro、第16號之Lys、第19號之Thr、第20號之Ile、第41號之Pro、第48號之Val、第75號之Ser、第81號之Leu、第82號之Lys、第88號之Asp、及第90號之Tyr。該等所選擇之胺基酸殘基中，將至少1個以上之胺基酸殘基置換為存在於18C1抗體之相同部位之胺基酸殘基，而設計出具有各種改變之人源化抗體之VH及VL。
除如上述之標準之CDR移植之設計以外，對於一部分之VH或VL，同時進行VH CDR之改變。於進行過該VH CDR之改變之hz18C1抗體之VH中，導入有將序列編號29所表示之VH之CDR1之胺基酸序列中之第4號之Val置換為Ala之改變、將序列編號30所表示之VH之CDR2中之第16號之Ser置換為Asp的改變中至少1個改變。
對於作為藉由以上過程設計出之胺基酸序列之具體者，關於VH示於圖16，關於VL示於圖18A。
又，除上述CDR移植方法以外，藉由表面重建方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994, 91 (3) : 969-73及Protein Enginerring 1996, 10, 895-90)，根據上述中所構建之18C1抗體之可變區之模型結構，將認為不會對抗體之結合活性造成影響之FR內之胺基酸殘基置換為認為會使抗原性降低之胺基酸殘基，而設計出具有各種改變之人源化抗體之VL及VH。對於一部分之VL或VH，同時進行於CDR移植法之情形時所提及之VH CDR之改變。
具體而言，導入有將序列編號26所表示之胺基酸序列中之第3號之Val置換為Ala、將第8號之Asn置換為Asp、將第14號之Leu置換為Ala、將第19號之Lys置換為Thr、將第75號之Phe置換為Ser、將第80號之Asn置換為Asp、將第83號之Ile置換為Val、或將第88號之Ile置換為Val之胺基酸改變中之至少1個改變。藉此，作為hz18C1抗體之VL，設計分別包含序列編號72～87所示之胺基酸序列之hz18C1 VLres01～16並示於圖18B。
又，關於VH，導入有將序列編號23所表示之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為Ala、將第14號之Leu置換為Pro、將第19號之Ser置換為Asp、將第27號之Phe置換為Ala、將第34號之Val置換為Ala、將第65號之Ser置換為Asp、將第68號之Ser置換為Ala、將第71號之Arg置換為Lys、將第77號之Gln置換為Glu、將第79號之Phe置換為Ala、將第83號之Asn置換為Asp、將第85號之Leu置換為Asp、或將第107號之His置換為Gln之胺基酸改變中之至少1個改變。作為如此設計出之hz18C1抗體之VH，將hz18C1 VHres01～32示於圖17。關於hz18C1 VHres16，將其胺基酸序列示於序列編號98。
進而，作為人源化抗體之VH胺基酸序列，將CDR移植方法與表面重建方法組合而設計出VH胺基酸序列。具體而言，導入有將序列編號70所表示之胺基酸序列之第10號之Gly置換為Asp、將第13號之Lys置換為Gln、將第19號之Ser置換為Asp、將第20號之Leu置換為Ile、將第27號之Gly置換為Phe、將第29號之Val置換為Leu、將第30號之Ser置換為Thr、將第37號之Ile置換為Val、將第48號之Ile置換為Met、將第65號之Ser置換為Asp、將第67號之Val置換為Leu、將第68號之Thr置換為Ala、將第71號之Val置換為Arg、將第76號之Asn置換為Ser、將第77號之Gln置換為Glu、將第78號之Phe置換為Val、將第79號之Ser置換為Phe、將第82號之Leu置換為Met、將第83號之Ser置換為Asp、將第85號之Val置換為Leu、將第86號之Thr置換為Gln、將第87號之Ala置換為Thr、將第88號之Ala置換為Asp、將第92號之Val置換為Lys、將第94號之Tyr置換為Phe、將第109號之Thr置換為Ile、及將第110號之Leu置換為Met之胺基酸改變中之至少1個改變。藉此，作為hz18C1抗體之VH，設計hz18C1 HVmut01～10(序列編號88～97)，並將各胺基酸序列示於圖19。其中，hz18C1 HVmut01～04之CDR1～3均包含與18C1抗體相同之胺基酸序列(序列編號29～31分別所表示之胺基酸序列)。另一方面，hz18C1 HVmut05～10係CDR2包含變異。即，hz18C1 HVmut05～10之CDR1及3分別包含序列編號29及31所表示之胺基酸序列，CDR2包含將序列編號30所表示之胺基酸序列之第16號之Ser置換為Asp而成之胺基酸序列(序列編號99)。
(2)人源化抗體之可變區基因之設計
使用動物細胞中高頻使用之密碼子而設計出表3所示之編碼人源化抗體之可變區之胺基酸序列之鹼基序列。
[表3]
| 抗體名 | VH | VL | VH序列編號 | VL序列編號 |
| VLres02HVmut07 | HVmut07 | VLres02 | 序列編號94 | 序列編號73 |
| VLres02HVmut08 | HVmut08 | VLres02 | 序列編號95 | 序列編號73 |
| VLres04HVmut04 | HVmut04 | VLres04 | 序列編號91 | 序列編號75 |
| VLres04VHres16 | VHres16 | VLres04 | 序列編號98 | 序列編號75 |
| VLres06HVmut02 | HVmut02 | VLres06 | 序列編號89 | 序列編號77 |
| VLres06HVmut10 | HVmut10 | VLres06 | 序列編號97 | 序列編號77 |
| VLres07HVmut10 | HVmut10 | VLres07 | 序列編號97 | 序列編號78 |
| VLres07VHres16 | VHres16 | VLres07 | 序列編號98 | 序列編號78 |
| VLres08HVmut04 | HVmut04 | VLres08 | 序列編號91 | 序列編號79 |
| VLres08HVmut08 | HVmut08 | VLres08 | 序列編號95 | 序列編號79 |
| VLres08VHres16 | VHres16 | VLres08 | 序列編號98 | 序列編號79 |
| VLresl0HVmut02 | HVmut02 | VLres10 | 序列編號89 | 序列編號81 |
| VLres10HVmut04 | HVmut04 | VLres10 | 序列編號91 | 序列編號81 |
| VLres10HVmut08 | HVmut08 | VLres10 | 序列編號95 | 序列編號81 |
| VLres10HVmut10 | HVmut10 | VLres10 | 序列編號97 | 序列編號81 |
| VLres10VHres16 | VHres16 | VLres10 | 序列編號98 | 序列編號81 |
| VLres14HVmut07 | HVmut07 | VLres14 | 序列編號94 | 序列編號85 |
| VLres14HVmut08 | HVmut08 | VLres14 | 序列編號95 | 序列編號85 |
| VLres14HVmut10 | HVmut10 | VLres14 | 序列編號97 | 序列編號85 |
| VLres14VHres16 | VHres16 | VLres14 | 序列編號98 | 序列編號85 |
| VLres16HVmut07 | HVmut07 | VLres16 | 序列編號94 | 序列編號87 |
| VLres16HVmut10 | HVmut10 | VLres16 | 序列編號97 | 序列編號87 |
| VLres16VHres16 | VHres16 | VLres16 | 序列編號98 | 序列編號87 |
(3)人源化抗體之製作
使用無縫選殖法，將與(2)中所設計之鹼基序列對應之基因片段導入至表現載體而製作所需之質體。但是，作為VL表現載體，使用具有訊號序列及人類λ鏈恆定區序列之pCI-OtCMV_hL載體，作為VH表現載體，使用具有訊號序列及人類γ鏈恆定區序列之pCI-OtCAG_hG4PE(R409K)載體。pCI-OtCAG_hG4PE(R409K)載體所具有之恆定區序列係、分別將人類IgG4之重鏈恆定區之EU-index中之第228號之Ser殘基置換為Pro、將第235號之Leu殘基置換為Glu、及將第409號之Arg殘基置換為Lys而成之IgG4變異體(以下，記載為IgG4PE R409K(WO2006/033386))之重鏈恆定區。再者，該等載體係將Promega公司之pCI 載體作為共通主骨架並導入使人類抗體基因表現所需要之限制酶位點，藉由全合成所製作之載體。完成之質體係使用NucleoBond Xtra Midi EF套組(塔卡拉生物公司)大量地製備。繼而，使用Expi293 Expression System Kit(Life Technologies公司)，使目標之人源化抗體暫時性表現。質體之導入方法係依據隨附書類。
輕鏈之表現載體與重鏈之表現載體係以1：2之比率混合並導入。將質體導入後之細胞於37℃、5% CO2
、125 rpm之條件下培養3天。其後，進行細胞培養懸濁液之離心分離，通過0.2 μm過濾器(Thermo Scientific公司)來回收培養上清液。藉由使用MabSelect SuRe(GE Healthcare公司)之親和純化，自培養上清液取得純化抗體。
具體而言，利用PBS對填充至管柱中之樹脂進行平衡化後，於該管柱中添加培養上清液，利用PBS洗淨2次，利用Wash緩衝液1(PBS with 1M NaCl)、Wash緩衝液2(20 mM檸檬酸、50 mM NaCl，pH值5.0)各洗淨1次後，使用溶出緩衝液(20 mM檸檬酸、50 mM NaCl，pH值3.4)而使抗體溶出。於所獲得之抗體溶液中添加中和緩衝液(1 M磷酸-NaOH，pH值7.0)添加1/10量而進行中和，使用NAP25(GE Healthcare公司)將抗體溶液之溶劑置換為PBS。關於緩衝液置換後之抗體溶液，使用Amicon Ultra-4離心過濾裝置(Centrifugal Filter Units)(Millipore公司)進行利用超過濾之濃縮，使用Nanodrop(Thermo Scientific公司)測定吸光度A280
，進行抗體溶液之濃度之測定及調整。吸光係數係依據C.N.Pace等人之方法(1995, Prot. Sci.4：2411-2423)自各人源化抗體之胺基酸序列算出。經純化之抗體係利用分析用凝膠過濾層析法(使用島津製作所公司製造之裝置，東梭公司製造之管柱TSKgel SuperSW3000)及SDS-PAGE進行品質確認。
[實施例13]
抗BMP10人源化抗體之結合活性評價
為了將實施例5-3中所獲得之ch18C1抗體、與實施例12中所獲得之抗BMP10人源化抗體之對於人類BMP10之結合活性進行比較，使用BiacoreT100(GE healthcare Bioscience公司製造)並藉由表面電漿子共振法(SPR法)測定對於人類BMP10成熟二聚物(R＆D Systems公司製造，Cat＃2926-BP)之結合活性。
抗BMP10抗體之結合活性係以下述方式測定。使用人類抗體捕獲套組(GE healthcare Bioscience公司製造，Cat＃BR-1008-39)，依據隨附之操作說明，將抗人IgG抗體固定至CM5感測器晶片(GE healthcare Bioscience公司製造，BR100530)。於固定有抗人IgG抗體之流槽中，將製備成5 μg/mL之抗體以10 μL/min之流速添加10秒鐘。
繼而，使自100 ng/mL利用3倍稀釋階段性地製備成5種濃度之人類成熟BMP10以30 μL/min之流速流動，對結合反應觀察1分鐘，對解離反應觀察10分鐘。所取得之感測器圖譜係使用Bia Evaluation Software(GE healthcare Bioscience公司製造)進行分析，算出各抗體之動力學常數。將所算出之各抗體之結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)及解離常數[kd/ka＝KD
]示於表4。
[表4]
| 抗體名 | ka | kd | KD |
| VLres02HVmut07 | 4.48E+07 | 1.33E-04 | 2.97E-12 |
| VLres02HVmut08 | 3.68E+07 | 1.13E-04 | 3.05E-12 |
| VLres04HVmuf04 | 4.09E+07 | 1.30E-04 | 3.19E-12 |
| VLres04HVres16 | 4.4SE+07 | 1.43E-04 | 3.21E-12 |
| VLres06HVmut02 | 4.06E+07 | 1.37E-04 | 3.37E-12 |
| VLres06HVmut10 | 4.30E+07 | 1.26E-04 | 2.94E-12 |
| VLres07HVmut10 | 4.51E+07 | 121E-04 | 2.69E-12 |
| VLres07HVres16 | 4.59E+07 | 1.43E-04 | 3.11E-12 |
| VLres08HVmut04 | 4.72E+07 | 1.36E-04 | 2.88E-12 |
| VLres08HVmut08 | 4.82E+07 | 1.44E-04 | 2.99E-12 |
| VLres08HVres16 | 461E+07 | 1.50E-04 | 3.25E-12 |
| VLres10HVmut02 | 3.58E+07 | 1.22E-04 | 3.41E-12 |
| VLres10HVmut04 | 4.01E+07 | 1.28E-04 | 3.20E-12 |
| VLres10HVmut08 | 4.73E+07 | 1.45E-04 | 3.06E-12 |
| VLreslOHVmut10 | 5.87E+07 | 1.29E-04 | 2.19E-12 |
| VLres10HVres16 | 423E+07 | 1.51E-04 | 3.57E-12 |
| VLres14HVmut07 | 4.18E+07 | 1.25E-04 | 2.99E-12 |
| VLres14HVmut08 | 4.37E+07 | 1.18E-04 | 2.71E-12 |
| VLres14HVmut10 | 4.35E+07 | 1.24E-04 | 2.84E-12 |
| VLres14HVres16 | 4.03E+07 | 1.33E-04 | 3.30E-12 |
| VLres16HVmut07 | 3.93E+07 | 1.25E-04 | 3.19E-12 |
| VLres16HVmut10 | 4.17E+07 | 1.20E-04 | 2.88E-12 |
| VLres16HVres16 | 3.77E+07 | 1.39E-04 | 3.69E-12 |
| ch18C1 | 3.88E+07 | 1.02E-04 | 2.62E-12 |
根據以上之結果，明確所製作之抗BMP10人源化抗體具有與ch18C1抗體同等之結合活性。
[實施例14]
抗BMP10人源化抗體與ch18C1抗體之中和活性比較
14-1)抗BMP10人源化抗體對於BMP10同型二聚物之中和活性評價
關於所取得之抗BMP10人源化抗體與ch18C1抗體，使用實施例3之3-1)中所製作之人類ALK1表現報導細胞來比較對於BMP10之中和活性。
將人類BMP10成熟二聚物(R＆D Systems公司製造，Cat＃2926-BP)以最終濃度成為0.3 ng/mL之方式添加至96孔螢光-發光用培養板(康寧公司製造，Cat＃3916)，繼而，將實施例12中所取得之抗BMP10人源化抗體、或ch18C1抗體自最終濃度3000 ng/mL利用3倍稀釋階段性地製備成7種濃度並進行添加。
其後，將於Excell 325培養基[Excell 325 PF CHO(SAFC公司製造，Cat＃14340C-1000mL)、4 mM L-麩醯胺、1×青黴素、1×鏈黴素(Nacalai公司製造，Cat＃09367-34)、0.5 mg/mL潮黴素]中懸濁而成之ALK1/Id1-Luc/CHO細胞液以成為5×104
個/孔之方式進行添加。添加全部樣品後，利用培養板攪拌器使孔內之液體均一，於37℃下培養20小時。
20小時後，將依據隨附文件所製備之Nano-Glo螢光素酶檢測測定液(Promega公司製造，Cat＃N1120)以40 μL/孔進行添加並攪拌後，利用Glomax(Promega公司製造)測定螢光素酶活性。關於抗體之中和活性(%)，將未添加抗體而僅添加有BMP10成熟二聚物之孔之值設為0%，將未添加抗體而僅添加有Excell 325培養基之孔之值設為100%而算出。將結果示於圖20～25。
如圖20～25所示，所製作之抗BMP10人源化抗體均顯示與ch18C1抗體同等之中和活性。
14-2)抗BMP10人源化抗體之對於人血中BMP9/10異質二聚物之中和活性評價
關於所取得之抗BMP10人源化抗體與ch18C1抗體，使用人類ALK1表現報導細胞來比較對於人血中BMP9/BMP10異質二聚物之中和活性。人類ALK1表現報導細胞係使用實施例3之3-1)中所製作之細胞來進行。
將人血清(Human True A serum，pool of donars，Biopredic international公司製造，Cat＃SER019)以最終濃度成為10%之方式添加至96孔螢光-發光用培養板(康寧公司製造，Cat＃3916)。
繼而，將抗BMP10人源化抗體、或ch18C1抗體以1000 ng/ml之最終濃度添加。其後，將ALK1/Id1-Luc/CHO細胞懸濁液以成為5×104
個/孔之方式添加。對於全部孔，以液量成為100 μL/孔之方式添加Excell 325培養基。利用培養板攪拌器使孔內之液體均一後，於37℃下培養20小時。
20小時後，將依據隨附文件所製備之Nano-Glo螢光素酶檢測測定液以40 μL/孔進行添加並攪拌後，使用Glomax(Promega公司製造)測定螢光素酶活性。
如圖26所示，抗BMP10人源化抗體均對於人血中BMP9/BMP10異質二聚物顯示與ch18C1抗體同等之中和活性。
[實施例15]
對於正常動物之血壓之BMP9/10異質二聚物中和作用之評價
使用SD大鼠，評價中和BMP9/10異質二聚物時之對於血壓之作用。購入6週齡之雄性SD大鼠(日本Charles River公司製造)而供於實驗。飲水係自由攝取且提供殺菌自來水，食餌係自由攝取且提供固體飼料FR-2(Funabashi Farm公司製造)。馴化飼養後，於7週齡時實施遙測發射機之嵌入手術。遙測發射機之嵌入手術方法及血壓波形之取得係依據實施例7進行。
對於BMP9抗體投予群，將利用PBS將BMP9抗體10D5以成為10 mg/ml之方式製備而成者以1 mL/kg之用量投予。對於BMP9/BMP10異質二聚物中和群，將利用PBS將BMP9抗體10D5及BMP10抗體11H10分別以最終濃度成為10 mg/ml、5 mg/ml之方式混合製備而成者以1 mL/kg之用量投予。投予係以皮下路徑進行。
如圖27A所示，與介質投予時相比，未發現藉由10D5抗體之投予而收縮期血壓變化。另一方面，如圖27B所示，與介質投予時相比，於混合投予有10D5抗體與11H10抗體之BMP9/BMP10異質二聚物中和群中，發現收縮期血壓降低。
10D5抗體及11H10抗體均單獨情況下不會惹起收縮期血壓之變化。然而，若併用10D5抗體及11H10抗體，則新穎地發現藉由BMP9/BMP10異質二聚物之中和而顯示降壓作用。
[實施例16]
人類BMP10同型二聚物對於正常動物之血壓之作用之評價
16-1)人類BMP10重組蛋白質之製備
為了評價人類BMP10同型二聚物對於血壓之作用而製備人類BMP10重組蛋白質。人類BMP10表現載體係依據國際公開第2014/007198號之實施例20所記載之方法所製備。又，人類Furin表現質體係藉由使用In-Fusion HD選殖套組(Cloning Kit)(塔卡拉生物公司製造)將人類Furin全長cDNA組入至pEAK8載體(Edge Biosystems公司)而製作。
使用EXPI 293表現系統(ThermoFisher Scientific公司製造)，對於人類BMP10與人類Furin進行暫時性表現，而使人類BMP10重組蛋白質表現。藉由離心分離與使用0.22 μm過濾器之過濾，自培養液取得培養上清液。
繼而，使用Ni-NTA Agarose(QIAGEN公司製造)將各蛋白質純化。使用20 mM HEPES-NaOH(pH值7.4)、500 mM NaCl 40 mM咪唑作為結合緩衝液(Binding buffer)，使用20 mM HEPES-NaOH(pH值7.4)、500 mM NaCl 200 mM咪唑作為溶離緩衝液(Elution buffer)。
使用NAP-25管柱(GE healthcare公司製造，7-0852-02)而將緩衝液置換為PBS。測定280 nm之吸光度而確定各蛋白質溶液之濃度。使用0.96 mL/(mg・cm)作為分子吸光係數。如此獲得之BMP10重組蛋白質不包含全長體而僅包含成熟體及N末前導肽體，與實施例1-1之方法中所製作之包含全長體之BMP10重組蛋白質同樣地形成同型二聚物，具有作為BMP10之功能。
16-2)BMP10重組蛋白質對於血壓之作用之評價
使用SD大鼠，評價投予有人類BMP10重組蛋白質時之對於血壓之作用。購入6週齡之雄性SD大鼠(日本Charles River 公司製造)而供於實驗。飲水係自由攝取且提供殺菌自來水，食餌係自由攝取且提高固體飼料FR-2(Funabashi Farm公司製造)。馴化飼養後，於7週齡時實施遙測發射機之嵌入手術。
遙測發射機之嵌入手術方法及血壓波形之取得係依據實施例7進行。將利用PBS將實施例16-1中所獲得之人類BMP10重組蛋白質以成為0.5 mg/ml之方式製備而成者以1 mL/kg之用量投予。投予係以靜脈內路徑進行。
如圖28所示，與介質投予時相比，發現藉由投予人類BMP10重組蛋白質而收縮期血壓上升。
根據以上之結果，新穎地發現人類BMP10同型二聚物有升壓作用。
已使用特定態樣對本發明詳細地進行了說明，但業者明確，能夠不脫離本發明之精神與範圍而進行各種變更及修正。再者，本申請案係基於2017年12月12日提出申請之日本專利申請(日本專利特願2017-238106號)，且藉由引用將其全部內容援用於本文中。
[序列表非關鍵文字]
序列編號1：對於大鼠IgG1特異性之引子RV1之鹼基序列
序列編號2：對於大鼠IgG2a特異性之引子RV1之鹼基序列
序列編號3：大鼠Ig(κ)特異性之引子RV1之鹼基序列
序列編號4：大鼠Ig(λ)特異性之引子RV1之鹼基序列
序列編號5：18C1抗體之VH完整鹼基序列
序列編號6：12H3抗體之VH完整鹼基序列
序列編號7：11H10抗體之VH完整鹼基序列
序列編號8：18C1抗體之VH完整胺基酸序列(包含訊號序列)
序列編號9：12H3抗體之VH完整胺基酸序列(包含訊號序列)
序列編號10：11H10抗體之VH完整胺基酸序列(包含訊號序列)
序列編號11：18C1抗體之VL完整鹼基序列
序列編號12：12H3抗體之VL完整鹼基序列
序列編號13：11H10抗體之VL完整鹼基序列
序列編號14：18C1抗體之VL完整胺基酸序列(包含訊號序列)
序列編號15：12H3抗體之VL完整胺基酸序列(包含訊號序列)
序列編號16：11H10抗體之VL完整胺基酸序列(包含訊號序列)
序列編號17：18C1抗體之VH鹼基序列(訊號序列除外)
序列編號18：12H3抗體之VH鹼基序列(訊號序列除外)
序列編號19：11H10抗體之VH鹼基序列(訊號序列除外)
序列編號20：18C1抗體之VL鹼基序列(訊號序列除外)
序列編號21：12H3抗體之VL鹼基序列(訊號序列除外)
序列編號22：11H10抗體之VL鹼基序列(訊號序列除外)
序列編號23：18C1抗體之VH胺基酸序列(訊號序列除外)
序列編號24：12H3抗體之VH胺基酸序列(訊號序列除外)
序列編號25：11H10抗體之VH胺基酸序列(訊號序列除外)
序列編號26：18C1抗體之VL胺基酸序列(訊號序列除外)
序列編號27：12H3抗體之VL胺基酸序列(訊號序列除外)
序列編號28：11H10抗體之VL胺基酸序列(訊號序列除外)
序列編號29：18C1抗體VH之CDR1胺基酸序列
序列編號30：18C1抗體VH之CDR2胺基酸序列
序列編號31：18C1抗體VH之CDR3胺基酸序列
序列編號32：18C1抗體VL之CDR1胺基酸序列
序列編號33：18C1抗體VL之CDR2胺基酸序列
序列編號34：18C1抗體VL之CDR3胺基酸序列
序列編號35：12H3抗體VH之CDR1胺基酸序列
序列編號36：12H3抗體VH之CDR2胺基酸序列
序列編號37：12H3抗體VH之CDR3胺基酸序列
序列編號38：12H3抗體VL之CDR1胺基酸序列
序列編號39：12H3抗體VL之CDR2胺基酸序列
序列編號40：12H3抗體VL之CDR3胺基酸序列
序列編號41：11H10抗體VH之CDR1胺基酸序列
序列編號42：11H10抗體VH之CDR2胺基酸序列
序列編號43：11H10抗體VH之CDR3胺基酸序列
序列編號44：11H10抗體VL之CDR1胺基酸序列
序列編號45：11H10抗體VL之CDR2胺基酸序列
序列編號46：11H10抗體VL之CDR3胺基酸序列)
序列編號47：人類BMP10蛋白質之胺基酸序列(包含訊號序列)
序列編號48：人類BMP10成熟區之胺基酸序列
序列編號49：編碼人類BMP10蛋白質之鹼基序列(包含訊號序列)
序列編號50：編碼人類BMP10成熟區之鹼基序列
序列編號51：人類BMPRII之胺基酸序列
序列編號52：人類ALK1之胺基酸序列
序列編號53：18C1抗體之輕鏈之擴增所使用之引子Fwd之鹼基序列
序列編號54：18C1抗體之輕鏈之擴增所使用之引子Rv之鹼基序列
序列編號55：18C1抗體之重鏈之擴增所使用之引子Fwd之鹼基序列
序列編號56：18C1抗體之重鏈之擴增所使用之引子Rv之鹼基序列
序列編號57：12H3抗體之輕鏈之擴增所使用之引子Fwd之鹼基序列
序列編號58：12H3抗體之輕鏈之擴增所使用之引子Rv之鹼基序列
序列編號59：12H3抗體之重鏈之擴增所使用之引子Fwd之鹼基序列
序列編號60：12H3抗體之重鏈之擴增所使用之引子Rv之鹼基序列
序列編號61：11H10抗體之輕鏈之擴增所使用之引子Fwd之鹼基序列
序列編號62：11H10抗體之輕鏈之擴增所使用之引子Rv之鹼基序列
序列編號63：11H10抗體之重鏈之擴增所使用之引子Fwd之鹼基序列
序列編號64：11H10抗體之重鏈之擴增所使用之引子Rv之鹼基序列
序列編號65：人類BMP9成熟區之胺基酸序列
序列編號66：人類BMP9蛋白質之胺基酸序列(包含訊號序列)
序列編號67：編碼人類BMP9蛋白質之鹼基序列(包含訊號序列)
序列編號68：編碼人類BMP9成熟區之鹼基序列
序列編號69：人類內皮糖蛋白之胺基酸序列
序列編號70：人源化18C1抗體HV0之胺基酸序列
序列編號71：人源化18C1抗體LV0之胺基酸序列
序列編號72：人源化18C1抗體VLres01之胺基酸序列
序列編號73：人源化18C1抗體VLres02之胺基酸序列
序列編號74：人源化18C1抗體VLres03之胺基酸序列
序列編號75：人源化18C1抗體VLres04之胺基酸序列
序列編號76：人源化18C1抗體VLres05之胺基酸序列
序列編號77：人源化18C1抗體VLres06之胺基酸序列
序列編號78：人源化18C1抗體VLres07之胺基酸序列
序列編號79：人源化18C1抗體VLres08之胺基酸序列
序列編號80：人源化18C1抗體VLres09之胺基酸序列
序列編號81：人源化18C1抗體VLres10之胺基酸序列
序列編號82：人源化18C1抗體VLres11之胺基酸序列
序列編號83：人源化18C1抗體VLres12之胺基酸序列
序列編號84：人源化18C1抗體VLres13之胺基酸序列
序列編號85：人源化18C1抗體VLres14之胺基酸序列
序列編號86：人源化18C1抗體VLres15之胺基酸序列
序列編號87：人源化18C1抗體VLres16之胺基酸序列
序列編號88：人源化18C1抗體HVmut01之胺基酸序列
序列編號89：人源化18C1抗體HVmut02之胺基酸序列
序列編號90：人源化18C1抗體HVmut03之胺基酸序列
序列編號91：人源化18C1抗體HVmut04之胺基酸序列
序列編號92：人源化18C1抗體HVmut05之胺基酸序列
序列編號93：人源化18C1抗體HVmut06之胺基酸序列
序列編號94：人源化18C1抗體HVmut07之胺基酸序列
序列編號95：人源化18C1抗體HVmut08之胺基酸序列
序列編號96：人源化18C1抗體HVmut09之胺基酸序列
序列編號97：人源化18C1抗體HVmut10之胺基酸序列
序列編號98：人源化18C1抗體VHres16之胺基酸序列
序列編號99：人源化18C1抗體HVmut05～10之CDR2之胺基酸序列
圖1係使用Id1-Luc/CHO細胞，將所取得之抗BMP10單株抗體之BMP10中和活性與已知抗體進行比較之圖表。橫軸表示抗體之添加濃度(μg/ml)，縱軸表示中和活性(%)。黑圈表示對照抗體，黑色四邊形表示MAB2926，白圈表示18C1抗體，白色四邊形表示12H3抗體，白色三角形表示11H10抗體。
圖2係使用ALK1/Id1-Luc/CHO細胞，將所取得之抗BMP10單株抗體之BMP10中和活性與已知抗體進行比較之圖表。橫軸表示抗體之添加濃度(μg/ml)，縱軸表示中和活性(%)。黑圈表示對照抗體，黑色四邊形表示MAB2926，白圈表示18C1抗體，白色四邊形表示12H3抗體，白色三角形表示11H10抗體。
圖3係對所取得之18C1抗體對於各種BMP分子之中和活性進行評價之圖。縱軸表示中和活性(%)。白色條形圖表示18C1抗體，黑色條形圖表示對照抗體。
圖4A～圖4C係表示基於所取得之抗BMP10抗體之單次投予之對於正常大鼠全身血壓之作用的圖。圖4A之圖表係表示基於18C1抗體之單次投予之收縮期血壓之變化。圖4B之圖表係表示基於12H3抗體之單次投予之收縮期血壓之變化。圖4C之圖表係表示基於11H10抗體之單次投予之收縮期血壓之變化。圖表之橫軸表示將投予了抗體之時間設為0時間之時之經過時間，縱軸表示收縮期血壓(mmHg)。
圖5係表示基於所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體之單次投予之對於自發性高血壓大鼠之血壓的作用之圖。圖5之圖表係表示收縮期血壓之變化。圖表之橫軸係表示將投予了抗體之時間設為0時間之時之經過時間，縱軸表示收縮期血壓(mmHg)。
圖6係表示所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之收縮期血壓之作用之圖。圖6之圖表係表示收縮期血壓之變化。圖表之橫軸表示大鼠之週齡(w)，縱軸表示收縮期血壓(mmHg)。黑圈表示正常飲食群(n＝6)，黑色四邊形表示高鹽群(n＝12)，白圈表示高鹽飲食＋18C1抗體群(n＝12)。圖中之誤差槓表示標準誤差(SE)。
圖7A及圖7B係表示所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之鈉***之作用之圖。圖7A係表示血中鈉濃度之變化。圖表之橫軸表示大鼠之週齡(w)，縱軸表示血清鈉濃度(mEq)。圖7B係表示每天之尿中鈉***量之變化。圖表之橫軸表示大鼠之週齡(w)，縱軸表示每天之尿中鈉***量(mEq/day)。黑圈表示正常飲食群(n＝6)，黑色四邊形表示高鹽群(n＝12)，白圈表示高鹽飲食＋18C1抗體群(n＝12)。圖中之誤差槓表示標準誤差(SE)。
圖8係表示所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體之Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之每1天之尿量的變化。圖表之橫軸表示大鼠之週齡(w)，縱軸表示每1天之每單位體重之尿量(mL/Kg/day)。黑圈表示正常飲食群(n＝6)，黑色四邊形表示高鹽群(n＝12)，白圈表示高鹽飲食＋18C1抗體群(n＝12)。圖中之誤差槓表示標準誤差(SE)。
[圖9]圖9係表示所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之腎功能之作用的圖。圖9表示每1天之尿中蛋白質***量之變化。圖表之橫軸表示大鼠之週齡(w)，縱軸表示每1天之尿中蛋白質***量(mg/day)。黑圈表示正常飲食群(n＝6)，黑色四邊形表示高鹽群(n＝12)，白圈表示高鹽飲食＋18C1抗體群(n＝12)。圖中之誤差槓表示標準誤差(SE)。
圖10A～圖10F係表示所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之腎功能之作用的圖。圖10A係表示Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之通常飲食群之腎臟絲球體病理的圖。圖10B係表示Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之高鹽飲食群之腎臟絲球體病理之圖。圖10C係表示對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠提供高鹽飲食並投予有18C1抗體之群(高鹽飲食＋18C1)之腎臟絲球體病理的圖。圖10D係Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之通常飲食群之腎臟腎小管間質病理之照片。圖10E係Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之高鹽飲食群之腎臟腎小管間質病理之照片。圖10F係對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠提供高鹽飲食並投予有18C1抗體之群(高鹽飲食＋18C1)之腎臟腎小管間質病理的照片。
圖11A及圖11B係表示所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之腎功能之作用的圖。圖11A係表示Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之絲球體病理評分之圖表。縱軸表示病理評分。圖11B係表示Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之腎小管間質病理評分之圖表。縱軸表示病理評分。
圖12A及圖12B係表示所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之心臟功能之作用的圖。圖12A係表示16週齡時點之利用心臟ECHO所測得之左心室後壁厚度。圖表之橫軸係表示餌之種類與所投予之藥劑，縱軸表示左心室後壁厚度。圖12B係表示16週齡時點之利用心臟ECHO所測得之二尖瓣環運動速度e'。圖表之橫軸係表示餌之種類與所投予之藥劑，縱軸表示e'。正常飲食群(n＝6)、高鹽群(n＝12)、高鹽飲食＋18C1抗體群(n＝12)。圖中之誤差槓表示標準誤差(SE)。
圖13係表示所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體對於Dahl鹽敏感性高血壓大鼠之心臟功能之作用的圖。圖13係表示於16週齡時點將進行解剖所採集之肺之重量用體重進行修正所得之值。圖表之縱軸係表示肺重量體重比率(mg.肺重量/g.體重)。正常飲食群(n＝6)、高鹽群(n＝12)、高鹽飲食＋18C1抗體群(n＝12)。圖中之誤差槓表示標準誤差(SE)。
圖14係表示於人血中存在BMP9/BMP10異質二聚物，所取得之抗BMP10抗體即18C1抗體具有對於BMP9/BMP10異質二聚物之中和活性之圖。圖14係表示ALK1/Id1-Luc/CHO細胞中之抗BMP9抗體與抗BMP10抗體對於血中BMP之中和活性。橫軸表示抗體之添加濃度(μg/ml)，縱軸表示中和活性(%)。白圈表示對照抗體，黑圈表示18C1抗體，黑色四邊形表示12H3抗體，黑色三角形表示11H10抗體，黑色菱形表示作為抗BMP9抗體之10D5抗體，白色四邊形表示混合12H3抗體與10D5抗體而成者，白色三角形表示混合11H10抗體與10D5抗體而成者。白色四邊形與白色三角形以虛線表示。
圖15係表示於血中存在BMP9/BMP10異質二聚物之圖。圖15係表示將抗BMP10抗體或抗BMP9抗體固相化，使人血清反應，利用經生物素化之抗體檢測抗BMP10抗體12H3抗體之夾層ELISA的結果。縱軸表示ELISA中之吸光度(OD450/570)，橫軸表示人血清之最終濃度(%)。黑圈係將抗BMP9抗體即10D5抗體固相化而成者，白色四邊形係將11H10抗體固相化而成者，黑色三角形係將對照抗體固相化而成者。
圖16係改型18C1抗體所設計之人源化抗體之重鏈可變區之胺基酸序列，表示藉由自序列編號70之胺基酸序列進行改變而設計出之胺基酸序列。序列中之框所包圍之區域表示CDR之胺基酸序列。
圖17係表示改型18C1抗體所設計之人源化抗體之重鏈可變區之胺基酸序列的圖，表示藉由自序列編號23之胺基酸序列進行改變而設計出之胺基酸序列。序列中之框所包圍之區域表示CDR之胺基酸序列。
圖18A及圖18B係表示改型18C1抗體所設計之人源化抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列的圖。各序列中之框所包圍之區域表示CDR之胺基酸序列。圖18A係表示藉由自序列編號71之胺基酸序列進行改變而設計出之胺基酸序列。圖18B係表示藉由自序列編號26之胺基酸序列進行改變而設計出之胺基酸序列。
圖19係表示改型18C1抗體所設計之人源化抗體之重鏈可變區之胺基酸序列的圖，表示自序列編號70之胺基酸序列進行改變而設計出之胺基酸序列。序列中之框所包圍之區域表示CDR之胺基酸序列。
圖20係使用ALK1/Id1-Luc/CHO細胞，將抗BMP10人源化抗體之BMP10中和活性與18C1嵌合抗體進行比較之圖表。橫軸表示抗體之添加濃度(ng/ml)，縱軸表示中和活性(%)。白色四邊形表示VLres02HVmut07，白色三角形表示VLres02HVmut08，黑色三角形表示VLres04HVmut04抗體，黑圈表示VLres04VHres16抗體，白圈表示ch18C1抗體。黑圈與黑色三角形以虛線表示。
圖21係使用ALK1/Id1-Luc/CHO細胞，將抗BMP10人源化抗體之BMP10中和活性與18C1嵌合抗體進行比較之圖表。橫軸表示抗體之添加濃度(ng/ml)，縱軸表示中和活性(%)。白色四邊形表示VLres06HVmut02，白色三角形表示VLres06HVmut10，黑色三角形表示VLres07HVmut10抗體，黑圈表示VLres07VHres16抗體，白圈表示ch18C1抗體。黑圈與黑色三角形以虛線表示。
圖22係使用ALK1/Id1-Luc/CHO細胞，將抗BMP10人源化抗體之BMP10中和活性與18C1嵌合抗體比較之圖表。橫軸表示抗體之添加濃度(ng/ml)，縱軸表示中和活性(%)。白色四邊形表示VLres08HVmut04，白色三角形表示VLres08HVmut08，黑色三角形表示VLres08VHres16抗體，黑圈表示VLres10HVmut02抗體，白圈表示ch18C1抗體。黑圈與黑色三角形以虛線表示。
圖23係使用ALK1/Id1-Luc/CHO細胞，將抗BMP10人源化抗體之BMP10中和活性與18C1嵌合抗體比較之圖表。橫軸表示抗體之添加濃度(ng/ml)，縱軸表示中和活性(%)。白色四邊形表示VLres10HVmut04，白色三角形表示VLres10HVmut08，黑色三角形表示VLres10HVmut10抗體，黑圈表示VLres10VHres16抗體，白圈表示ch18C1抗體。黑圈與黑色三角形以虛線表示。
圖24係使用ALK1/Id1－Luc/CHO細胞，將抗BMP10人源化抗體之BMP10中和活性與18C1嵌合抗體比較之圖表。橫軸表示抗體之添加濃度(ng/ml)，縱軸表示中和活性(%)。白色四邊形表示VLres14HVmut07，白色三角形表示VLres14HVmut08，黑色三角形表示VLres14HVmut10抗體，黑圈表示VLres14VHres16抗體，白圈表示ch18C1抗體。黑圈與黑色三角形以虛線表示。
圖25係使用ALK1/Id1-Luc/CHO細胞，將抗BMP10人源化抗體之BMP10中和活性與18C1嵌合抗體比較之圖表。橫軸表示抗體之添加濃度(ng/ml)，縱軸表示中和活性(%)。白色四邊形表示VLres16HVmut07，白色三角形表示VLres16HVmut10，黑色三角形表示VLres16VHres16，黑圈表示ch18C1抗體。黑圈與黑色三角形以虛線表示。
圖26係使用ALK1/Id1-Luc/CHO細胞，將抗BMP10人源化抗體之對於人血中BMP9/BMP10異質二聚物之中和活性與18C1嵌合抗體比較之圖表。縱軸表示螢光素酶活性。
圖27A及圖27B係表示基於抗BMP9抗體、或抗BMP9抗體與抗BMP10抗體混合液之單次投予之對於正常大鼠全身血壓之作用的圖。圖27A係表示基於10D5抗體之單次投予之收縮期血壓之變化。圖27B係表示基於10D5抗體與11H10抗體之混合液之單次投予之收縮期血壓之變化。白圈表示投予介質(PBS)當天之變化，白色三角形表示投予抗體當天之變化，黑色四邊形表示投予抗體1天後之變化，黑色三角形表示投予抗體2天後之變化。黑色四邊形與黑色三角形以虛線表示。圖表之橫軸表示將投予藥液之時間設為0時間之時之經過時間，縱軸表示收縮期血壓(mmHg)。
圖28係表示基於人類BMP10重組蛋白質之單次投予之對於正常大鼠全身血壓之作用的圖。白圈表示投予介質(PBS)當天之變化，白色三角形表示投予人類BMP10重組蛋白質當天之變化，圖表之橫軸表示將投予藥液之時間設為0時間之時之經過時間，縱軸表示收縮期血壓(mmHg)。
Claims (18)
- 一種單株抗體或該抗體片段，其包含：重鏈，該重鏈包括分別包含序列編號29及31所表示之胺基酸序列之互補決定區(complementary determining region；以下縮寫為CDR)1及3、以及包含序列編號30所表示之胺基酸序列或序列編號30所表示之胺基酸序列之第16號之絲胺酸被置換為天冬醯胺之胺基酸序列之CDR2；以及輕鏈，該輕鏈包括分別包含序列編號32～34所表示之胺基酸序列之CDR1～3。
- 如請求項1之單株抗體或該抗體片段，其包括：包含選自序列編號71～87之任一個胺基酸序列之重鏈可變區(以下縮寫為VH)及/或包含選自序列編號70及88～97之任一個胺基酸序列之輕鏈可變區(以下縮寫為VL)。
- 如請求項1或2之單株抗體或該抗體片段，其選自以下之(a)～(w)， (a)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號73所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (b)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號73所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (c)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號75所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (d)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號75所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (e)包括包含序列編號89所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號77所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (f)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號77所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (g)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號78所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (h)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號78所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (i)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (j)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (k)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號79所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (l)包括包含序列編號89所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (m)包括包含序列編號91所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (n)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (o)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (p)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號81所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (q)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (r)包括包含序列編號95所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (s)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (t)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號85所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (u)包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (v)包括包含序列編號97所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段； (w)包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列之VH及包含序列編號87所表示之胺基酸序列之VL的單株抗體或該抗體片段。
- 如請求項1至3中任一項之單株抗體或該抗體片段，其具有BMP10之中和活性。
- 如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段，其具有BMP9/BMP10異質二聚物之中和活性。
- 如請求項1至5中任一項之單株抗體或該抗體片段，其係基因重組抗體。
- 如請求項1至6中任一項之抗體片段，其係選自Fab、Fab'、F(ab')2 、單鏈抗體(scFv)、二聚物化V區(雙功能抗體(diabody))、二硫鍵穩定化V區(dsFv)及包含CDR之肽之抗體片段。
- 一種DNA，其編碼如請求項1至7中任一項之單株抗體或該抗體片段。
- 一種重組載體，其含有如請求項8之DNA。
- 一種轉形株，其係將如請求項9之重組載體導入至宿主細胞而獲得。
- 一種如請求項1至7中任一項之單株抗體或該抗體片段之製造方法，其特徵在於：將如請求項10之轉形株於培養基中進行培養，自培養物採集該抗體或該抗體片段。
- 一種高血壓及/或高血壓性疾病之治療劑，其含有針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑。
- 如請求項12之治療劑，其係與BMP9拮抗劑同時或逐次地投予。
- 一種含有BMP9拮抗劑之高血壓及/或高血壓性疾病之治療劑，其特徵在於：與針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑同時或逐次地投予。
- 一種與人類BMP10相關之疾病之診斷藥，其含有針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑。
- 一種人類BMP10之免疫學檢測方法或測定方法，其使用針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑。
- 一種醫藥組合物，其含有針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑與藥理學上所容許之載體。
- 一種針對BMP10及BMP9/BMP10異質二聚物之至少一者之拮抗劑之用途，其用以製造高血壓及高血壓性疾病之治療用醫藥組合物。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| TW108104858A TWI825072B (zh) | 2019-02-13 | 2019-02-13 | 抗bmp10抗體及以該抗體為有效成份之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑 |
Applications Claiming Priority (1)
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| TW108104858A TWI825072B (zh) | 2019-02-13 | 2019-02-13 | 抗bmp10抗體及以該抗體為有效成份之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| TW202030202A true TW202030202A (zh) | 2020-08-16 |
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ID=73002530
Family Applications (1)
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| TW108104858A TWI825072B (zh) | 2019-02-13 | 2019-02-13 | 抗bmp10抗體及以該抗體為有效成份之針對高血壓及高血壓性疾病之治療劑 |
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