JP5586146B2 - ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
次に目加田らは、プロテアーゼによる切断部位に変異を入れることにより、分泌型に変換されなくなったHB-EGF(以下、HBucと称す。)、および膜貫通領域が欠損したプロテアーゼ非依存的に分泌されるHB-EGF(以下、HB△tmと称す。)の、2種類の遺伝子を作製した。それぞれのHB-EGF変異体を発現する遺伝子組換えマウスを作製し、膜型および分泌型HB-EGFの生理的機能を解析した(非特許文献25)。その結果、HBuc発現マウスはHB-EGF KOマウスに類似した症状を示したことから、分泌型HB-EGFが活性型タンパク質として機能していると考えられた。HB△tm発現マウスは新生児期以前または新生児期に大半が死亡した。さらに、対立遺伝子の片方のみに変異を導入したHB△tm/+マウスでは、ケラチノサイトの過形成、および新生児期から心室肥大が認められた。これらの症状は、HB-EGF KOマウスやHBuc発現マウスとは正反対の表現型であった。ジフテリアトキシンの変異体として知られているCRM197(非特許文献26)は、HB-EGFの細胞増殖促進活性を特異的に阻害し、かつ細胞膜を透過しない。このCRM197が、HB△tm発現マウスの表現型である過形成や心室肥大を抑制したことから、HB△tm発現マウスで生成したHB△tmは、分泌前に細胞内の受容体に結合して作用するのではなく、細胞外に分泌された後に細胞表面の受容体に結合して作用することが推定されている。したがって、生体内の膜型HB-EGFと分泌型HB-EGFとの量的バランスが、正常な生理機能の維持に必須であり、また生体内ではHB-EGFの膜型から分泌型への変換プロセスが、制御されていると考えられる。
これまでに、乳癌、肝癌、膵癌、膀胱癌等、種々の癌で、HB-EGFが正常組織と比較して高発現していることが報告されている(非特許文献28〜31)。また、最近、HB-EGFが癌の増殖に重要な因子であることが明らかにされた(非特許文献32および33)。目加田らは、ヌードマウスにヒト卵巣癌細胞株を移植するモデル系において、HB-EGFのsmall interference RNA(siRNA)を癌細胞株へ導入すること、あるいは癌細胞株を移植したマウスにCRM197を投与することにより、顕著な腫瘍増殖阻害効果が認められることを明らかにした。また、東山らは、膀胱癌の細胞株にHB-EGF遺伝子を導入した株で、in vitroにおいて細胞増殖、コロニー形成能、血管内皮増殖因子(VEGF)発現およびサイクリンD1などの発現が増加することを明らかにした。また、in vivoにおいても、ヌードマウスにおける造腫瘍性の亢進や腫瘍血管新生の亢進が認められることを報告した。このような増殖促進作用は、膜型HB-EGFまたは分泌型HB-EGF遺伝子を発現させた場合にのみ認められ、プロテアーゼ抵抗性膜型HB-EGF遺伝子を強制発現させた場合には、認められなかった。したがって、分泌型HB-EGFは、卵巣癌や膀胱癌の腫瘍増殖に関わる重要な因子である可能性が示唆された。臨床患者のHB-EGF発現に関しては、目加田らが、卵巣癌患者の腫瘍組織中のHB-EGF mRNA発現量および腹水中の分泌型HB-EGFタンパク質濃度を解析した結果、EGFファミリーの中でHB-EGFのみが発現亢進していることを報告している(非特許文献32)。更に宮本らは、腫瘍のHB-EGFmRNAが高発現している卵巣癌患者では、低発現の患者に比べて予後が不良であることを報告した(非特許文献34)。以上の結果は、少なくとも卵巣癌において、癌の産生する分泌型HB-EGFがオートクラインもしくはパラクラインの機序で、癌の増殖に関与していることを示している(非特許文献35)。分泌型HB-EGFに結合して活性を阻害する抗体としてはいくつかのポリクローナル抗体と、1種のモノクローナル抗体(ともにR&D社製)が知られている。抗HB-EGFヤギポリクローナル抗体(R&D社製)は、COS-7細胞に発現させた細胞表面の膜型HB-EGFに結合することが、報告されている(非特許文献3)。膜型タンパク質が癌などの細胞表面に存在する場合、そのタンパク質に結合するモノクローナル抗体が該細胞の増殖を阻害する治療薬となり得ることが広く知られている(非特許文献36)。しかしながら、分泌型HB-EGF、細胞膜に結合しているHB-EGFおよび膜型HB-EGFに結合するモノクローナル抗体については、現在まで報告がない。
Science,Vol.251,936,1991 J. Biol. Chem. 267(1992)6205-6212 Nature,Vol.402,884,1999 EMBO J. 16(1997)1268-1278 EMBO J. 20(2001)3342-3350 J.Biol.Chem.269(1994)20060-20066 Biochem Biophys. Res. Commun. 198(1994)25-31 J. Pathol. 189(1999)431-438 Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(1993)3889-3893 J. Cell Biol. 151(2000)209-219 J. Clin. Invest.,95,404,1995 Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16 (1996)1524-1531 J. Biol. Chem. 277 (2002)37487-37491 Am.J.Pathol.143(1993)784-793 Hepatology 22 (1995) 1584-1590 Brain Res. 827(1999)130-138 Biochem.Biophys.Acta.,Vol.1333,F179,1997 J.Cell Biol.128 (1995)929-938 J. Cell Biol. 129(1995)1691-1705 Cytokine Growth Factor Rev.,Vol.11,335,2000 Int.J.Cancer,Vol.98,505,2002 J.Histochem.Cytochem.,Vol.49,439,2001 Cell,Vol.69,1051,1992 PNAS,Vol.100,3221,2003 J. of Cell Biology,Vol.163,469,2003 J. Biol.Chem.,Vol.270,1015,1995 Nat.Med.,Vol.8,35,2002 Breast Cancer Res. Treat.,Vol.67,81,2001 Oncol. Rep.,Vol.8,903,2001 Biochem. Biophys. Res. Commun.,Vol.202,1705,1994 Cancer Res.,Vol.61,6227,2001 Cancer Res.,Vol.64,5720,2004 Cancer Res.,Vol.64,5283,2004 Clin.Cancer Res.,Vol.11,4783, 2005 Clin.Cancer Res.,Vol.11,4639, 2005 Nat.Rev.Drug.Discov.,Vol.2,52-62,2003
(1)細胞膜に結合しているヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子(heparin binding epidermal growth factor-like growth factor 以下、HB-EGFと称す。)、膜型HB-EGFおよび分泌型HB-EGFに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(2)細胞膜に結合しているHB-EGF、膜型HB-EGFおよび分泌型HB-EGFの上皮増殖因子様ドメイン(EGF様ドメイン)に結合する(1)に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(3)分泌型HB-EGFとHB-EGF受容体との結合を阻害する、(1)または(2)に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(4)分泌型HB-EGFに対して中和活性を有する(1)〜(3)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(5)分泌型HB-EGFと、HB-EGF受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域に結合する(1)〜(4)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(6)配列番号2で表されるアミノ酸配列の133番目、135番目、および147番目のうち、少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープに結合する(1)〜(5)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(7)配列番号2で表されるアミノ酸配列の133番目、135番目および147番目のアミノ酸を含むエピトープに結合する(6)に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(8)配列番号2で表されるアミノ酸配列の141番目のアミノ酸を含むエピトープに結合する(1)〜(5)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(9)ハイブリドーマKM3579(FERM BP-10491)が生産するモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する(1)〜(3)、(5)および(8)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(10)ハイブリドーマKM3567(FERM BP-10573)が生産するモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する(1)〜(7)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(11)ハイブリドーマKM3566(FERM BP-10490)が生産するモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する(1)〜(7)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(12)抗体の重鎖可変領域(以下、VHと記す)の相補鎖決定領域(complementarity determining region、以下CDRと記す)1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号12、13および14で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体の軽鎖可変領域(以下、VLと記す)のCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号15、16および17で表されるアミノ酸配列を含む、(1)〜(7)および(11)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(13)モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、(1)〜(12)のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片。
(14)遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる、(13)に記載の抗体またはその抗体断片。
(15)ヒト型キメラ抗体のVHが、配列番号9で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、VLが、配列番号11で表されるアミノ酸配列を含む、(14)に記載のヒト型キメラ抗体またはその抗体断片。
(16)ヒト化抗体のVHが、配列番号22で表されるアミノ酸配列または配列番号22で表されるアミノ酸配列の9番目のAlaをThrに、20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、38番目のArgをLysに、41番目のProをThrに、48番目のMetをIleに、67番目のArgをLysに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、95番目のTyrをPheに、および118番目のValをLeuに置換する改変から選ばれる少なくとも1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ヒト化抗体のVLが、配列番号23で表されるアミノ酸配列または配列番号23で表されるアミノ酸配列の15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、21番目のIleをMetに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換する改変から選ばれる少なくとも1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、(14)に記載のヒト化抗体またはその抗体断片。
(17)抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である(1)〜(16)のいずれか1項に記載の抗体断片。
(18)(1)〜(17)のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片をコードするDNA。
(19)(18)に記載のDNAを含有する組換え体ベクター。
(20)(19)に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(21)(20)に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に(1)〜(17)のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする(1)〜(17)のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片の製造方法。
(22)(1)〜(17)のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として含
有する医薬。
(23)(1)〜(17)のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片を有効成分として含
有する、HB-EGFが関与する疾患の治療剤。
(24)HB-EGFが関与する疾患が癌である、(23)に記載の治療剤。
HB-EGFはジフテリアトキシン、EGF受容体ErbB1またはErbB4と結合する活性を有する。
膜型HB-EGFとしては、下記 (a)、(b)、(c)のタンパク質などがあげられる。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ジフテリアトキシンが結合する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ジフテリアトキシンが結合するタンパク質;
また、分泌型HB-EGFとしては、下記 (a)、(b)、(c)のタンパク質などがあげられる。
(a) 配列番号3、4または5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号3、4または5で表されるアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、EGF受容体ErbB1、またはErbB4が結合する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3、4または5で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、EGF受容体ErbB1、またはErbB4が結合するタンパク質;
配列番号2、3、4または5で表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ジフテリアトキシンまたはEGF受容体ErbB1、またはErbB4が結合するタンパク質とは、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research), 10, 6487 (1982)、プロシーディングス・ナショナル・アカデミック・サイエンス・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 79, 6409 (1982)、ジーン(Gene), 34, 315 (1985)、などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号2、3、4または5で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAに、部位特異的変異を導入することにより取得できるタンパク質を意味する。欠失、置換、挿入および/または付加されるアミノ酸の数は1個以上でありその数は特に限定されないが、上記部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換、もしくは付加できる程度の数であり、例えば、1〜数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
EGF様ドメインとは、具体的には配列番号4または5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
分泌型HB-EGFとHB-EGF受容体の結合を阻害する抗体としては、分泌型HB-EGFと、HB-EGF受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域に結合するモノクローナル抗体などがあげられる。
本発明の抗体の具体例としては、配列番号2で表されるアミノ酸を有するポリペプチドの115番目から147番目のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、好ましくは133番目から147番目のうち、少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、より好ましくは115番目、122番目、124番目、125番目、127番目、129番目、133番目、135番目、141番目、および147番目のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、更に好ましくは133番目、135番目、および147番目のアミノ酸のうち、少なくとも133番目および135番目のアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、最も好ましくは133番目、135番目および147番目のアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体などがあげられる。
中和活性を有する抗体の具体例としては、配列番号2で表されるアミノ酸を有するポリペプチドの133番目、135番目および147番目のアミノ酸を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体があげられる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたB細胞と、ミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる所望の抗原特異性を有するモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
本発明の遺伝子組換え抗体の具体例としては、抗体のVHのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号12、13および14でそれぞれ表されるアミノ酸配列、および抗体のVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号15、16および17で表されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLとヒト抗体の重鎖定常領域(以下、CHと表記する)および軽鎖定常領域(以下、CLと表記する)とからなる抗体をいう。
本発明のヒト化抗体は、以下のように作製することができる。まず、ハイブリドーマが産生する、細胞膜に結合しているHB-EGF、分泌型HB-EGFおよび膜型HB-EGFに結合する、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体の、VHおよびVLのCDRを、任意のヒト抗体のVHおよびVLのフレームワーク(以下、FRと記す)に移植した可変領域をコードするcDNAを作製する。作製したcDNAを、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築する。次に、作製したヒト化抗体発現ベクターを、動物細胞へ導入してヒト化抗体を発現させることにより、ヒト化抗体を製造することができる。
本発明のヒト化抗体としては、具体的には、抗体のVHが配列番号22で表されるアミノ酸配列、または配列番号22で表されるアミノ酸配列中の9番目のAla、20番目のVal、30番目のThr、38番目のArg、41番目のPro、48番目のMet、67番目のArg、68番目のVal、70番目のIle、95番目のTyrおよび118番目のValから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列および/または抗体のVLが、配列番号23で表されるアミノ酸配列、または配列番号23で表されるアミノ酸配列中の15番目のLeu、19番目のAla、21番目のIle、、49番目のProおよび84番目のLeuから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をそれぞれ含むヒト化抗体などがあげられるが、導入される改変の数に特に制限はない。
好ましくは30番目のThr、68番目のVal、70番目のIle、95番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは30番目のThr、70番目のIleが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体などがあげられる。
表される上記のアミノ酸改変の結果得られる抗体VHのアミノ酸配列としては、配列番号22で表されるアミノ酸配列中の9番目のAlaをThrに、20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、38番目のArgをLysに、41番目のProをThrに、48番目のMetをIleに、67番目のArgをLysに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、95番目のTyrをPheに、および118番目のValをLeuに置換する改変から選ばれる少なくとも1つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
9番目のAlaをThrに、20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、41番目のProをThrに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、48番目のMetをIleに、67番目のArgをLysに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、95番目のTyrをPheに、および118番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、および
20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、38番目のArgをLysに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、95番目のTyrをPheに、および118番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
9番目のAlaをThrに、30番目のThrをArgに、41番目のProをThrに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、および
20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、95番目のTyrをPheに、および118番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
9番目のAlaをThrに、30番目のThrをArgに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、および
20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
9番目のAlaをThrに、30番目のThrをArgに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、および
30番目のThrをArgに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
9番目のAlaをThrに、30番目のThrをArgに、68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、48番目のMetをIleに、68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、38番目のArgをLysに、68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、41番目のProをThrに、68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、67番目のArgをLysに、68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、および
30番目のThrをArgに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、および118番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
30番目のThrをArgに、68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
9番目のAlaをThrに、30番目のThrをArgに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、38番目のArgをLysに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、41番目のProをThrに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、48番目のMetをIleに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、67番目のArgをLysに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、70番目のIleをLeuに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、および
30番目のThrをArgに、70番目のIleをLeuに、および118番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
30番目のThrをArgに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
9番目のAlaをThrに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
20番目のValをLeuに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
38番目のArgをLysに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
41番目のProをThrに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
48番目のMetをIleに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
67番目のArgをLysに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
68番目のValをAlaに、および70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、
70番目のIleをLeuに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
70番目のIleをLeuに、および118番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、
9番目のAlaをThrに、および30番目のThrをArgに置換したアミノ酸配列、
20番目のValをLeuに、および30番目のThrをArgに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、および38番目のArgをLysに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、および41番目のProをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、および48番目のMetをIleに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、および67番目のArgをLysに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、および68番目のValをAlaに置換したアミノ酸配列、
30番目のThrをArgに、および95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、および
30番目のThrをArgに、および118番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
9番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、20番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、30番目のThrをArgに置換したアミノ酸配列、38番目のArgをLysに置換したアミノ酸配列、41番目のProをThrに置換したアミノ酸配列、48番目のMetをIleに置換したアミノ酸配列、67番目のArgをLysに置換したアミノ酸配列、68番目のValをAlaに置換したアミノ酸配列、70番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、および118番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列、があげられる。
好ましくは19番目のAla、21番目のIle、および84番目のLeuが置換されたアミノ酸配列があげられる。
上記のアミノ酸改変の結果得られるVLのアミノ酸配列としては、配列番号23で表されるアミノ酸配列中の15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、21番目のIleをMetに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換する改変から選ばれる少なくとも1つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
4個の改変が導入されたVLのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号23で表されるアミノ酸配列中の
15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、21番目のIleをMetに、および49番目のProをSerに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、21番目のIleをMetに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、21番目のIleをMetに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、および
19番目のAlaをValに、21番目のIleをMetに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、および21番目のIleをMetに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、および49番目のProをSerに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、21番目のIleをMetに、および49番目のProをSerに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、21番目のIleをMetに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
19番目のAlaをValに、21番目のIleをMetに、および49番目のProをSerに置換したアミノ酸配列、
19番目のAlaをValに、21番目のIleをMetに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
19番目のAlaをValに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、および
21番目のIleをMetに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
15番目のLeuをValに、および19番目のAlaをValに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、および21番目のIleをMetに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、および49番目のProをSerに置換したアミノ酸配列、
15番目のLeuをValに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
19番目のAlaをValに、および21番目のIleをMetに置換したアミノ酸配列、
19番目のAlaをValに、および49番目のProをSerに置換したアミノ酸配列、
19番目のAlaをValに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをMetに、および49番目のProをSerに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをMetに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
および49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
15番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、19番目のAlaをValに置換したアミノ酸配列、21番目のIleをMetに置換したアミノ酸配列、49番目のProをSerに置換したアミノ酸配列、および84番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列、などがあげられる。
ヒト抗体とは、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を単離し培養することができ、培養上清中より該抗体を精製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により2本の完全なH鎖および2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物のゲノム遺伝子に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ES細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで、培養上清中にヒト抗体を生成蓄積させることができる。
欠失、置換、挿入および/または付加されるアミノ酸の数は1個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。、例えば、1〜数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
本発明の抗体断片としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、diabody、dsFvなどがあげられる。
本発明のFabは、抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のFabをコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより、Fabを発現させ、製造することができる。
本発明のF(ab’)2は、抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のFab'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
本発明のFab’は、F(ab’)2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のFab'断片をコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりFab’を発現させ、製造することができる。
本発明の抗体の誘導体は、細胞膜に結合しているHB-EGF、膜型HB-EGFおよび分泌型HB-EGFに特異的に結合する抗体または該抗体断片の、H鎖或いはL鎖のN末端側或いはC末端側、抗体中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体中の糖鎖に薬剤を化学的手法 (抗体工学入門、金光修著、(株) 地人書館、1994) により結合させることにより製造することができる。
薬剤としては、化学療法剤、抗体医薬、サイトカインなどの免疫賦活剤、放射性同位元素、イムノアジュバンドなどがあげられる。
化学療法剤としては、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、P糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、M期阻害剤、キナーゼ阻害剤などのいかなる化学療法剤も包含される。化学療法剤としては、アミフォスチン(エチオール)、シスプラチン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ドキソルビシンリポ(ドキシル)、エピルビシン、ゲムシタビン(ゲムザール)、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ(ダウノゾーム)、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテア)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT-11、10-ヒドロキシ-7-エチル-カンプトテシン(SN38)、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、UFT、オキザロプラチン、ゲフィチニブ(イレッサ)、イマチニブ(STI571)、エルロチニブ、Flt3阻害剤、vascular endothelial growth facotr receptor(VEGFR)阻害剤、fibroblast growth factor(FGFR)阻害剤、EGFR阻害剤(イレッサ、タルセバなど)ラディシコール、17-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール−トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、D−ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン(ターグレチン)、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール(アリミデックス)、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、131トシツテマブ、タルグレチン、ONTAK、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミンおよびメトトレキセート、などがあげられる。
抗体医薬としては、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原に対する抗体、あるいは腫瘍細胞の増殖や転移など、腫瘍の病態形成に関わる抗原に対する抗体のほかに、免疫機能を調節する抗体、病変部位の血管新生を阻害する抗体などがあげられる。
免疫機能を調節する抗体の抗原としては、CD4、CD40、CD40リガンド、B7ファミリー分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7ファミリー分子のリガンド(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA)、OX-40、OX-40リガンド、CD137、tumor necrosis factor(TNF)受容体ファミリー分子(DR4、DR5、TNFR1、TNFR2)、TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor (TRAIL)ファミリー分子、TRAILファミリー分子の受容体ファミリー(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(RANK)、RANKリガンド、CD25、葉酸受容体4、サイトカイン[interleukin-1α(以下、interleukinをと記す)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、transforming growth factor(TGF)β、TNFα等]、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、CTACK等)、これらのケモカインの受容体が好ましい。
免疫賦活剤としては、NK細胞、マクロファージ、好中球などの細胞を亢進するサイトカインであればいかなるものでもよいが、具体例としては、インターフェロン(以下、INFと記す)-α、INF-β、INF-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒球刺激因子(G-CSF)、顆粒球・マクロファージ刺激因子(GM-CSF)、マクロファージ刺激因子(M-CSF)などがあげられる。また、免疫賦活剤として知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β(1→3)グルカン(レンチナン、シゾフィラン)、αガラクトシルセラミド(KRN7000)、菌体粉末(ピシバニール、BCG)、菌体抽出物(クレスチン)があげられる。放射性同位元素としては、131I、125I、90Y、64Cu、 99 Tc、77Lu、211At等があげられる。放射性同位元素は、クロラミンT法等によって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、methylbenzyldiethylene- triaminepentaacetic acid (MX-DTPA)などがあげられる。
抗体医薬としては、上記の標的となり得る抗原に対する抗体があげられ、例えばEGFR抗体(Cetuximab、Panitumumab、Matuzumabなど)等もあげられる。
組み合わせて投与する方法としては、本発明の抗体との同時投与でもよいし、また、本発明の抗体の投与と前後して投与しても構わない。
以下に、本発明を詳細に説明する。
(1)抗原の調製
分泌型HB-EGFまたは分泌型HB-EGFの部分長(以下、これらを単に分泌型HB-EGFと称することもある)をコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより、分泌型HB-EGFまたは分泌型HB-EGFの部分断片を得ることができる。また、HB-EGFを発現している細胞から、プロテアーゼ処理することにより細胞外領域のHB-EGFを精製することができる。分泌型HB-EGFを多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などから分泌型HB-EGFを精製することもできる。さらに、分泌型HB-EGFの部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、分泌型HB-EGFをコードするDNAを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、Gene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法(特開平2-227075)、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等を挙げることができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
分泌型HB-EGFが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288(1990)]、又は特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該遺伝子産物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、本発明において用いられる分泌型HB-EGFは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記のように調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、HB-EGFノックアウトマウスを被免疫動物として用いる方法もある。
(3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(Current Topics in Microbiology and Immunology、18:1-7, 1978)、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)(European J.Immunology, 6: 511-519,1976)、SP2/O -Ag14(SP-2)(Nature,276: 269-270,1978)、P3-X63-Ag8653(653) J.Immunology, 123:1548-1550,1979)、P3-X63-Ag8(X63)(Nature, 256:495-497,1975)などが用いられる。これらの細胞株は、8-アザグアニン培地〔RPMI-1640培地にグルタミン(1.5mM)、2-メルカプトエタノール(5×10-5M)、ジェンタマイシン(10μg/mL)および牛胎児血清(FCS)を加えた培地(以下、正常培地という。)に、さらに8-アザグアニン(15μg/mL)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
(4)細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞をMEM培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1 L、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離(1,200rpm、5分間)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングリコール−1,000(PEG-1,000)2g、MEM 2mLおよびジメチルスルホキシド 0.7mLの混液を抗体産生細胞数 108当たり0.2〜1mLの容量で加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにする。遠心分離(900rpm、5分間)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をHAT培地〔正常培地にヒポキサンチン(10-4M)、チミジン(1.5×10-5M)およびアミノプテリン(4×10-7M)を加えた培地〕100mL中に懸濁する。この懸濁液を96ウェル培養用フ゜レートに100μL/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
また、ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し〔1回目は、HT培地(HAT培地からアミノプテリンを除いた培地)、2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
(5)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mLを腹腔内投与し、2週間飼育する〕した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(4)で得られた抗HB-EGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×106〜5×107細胞/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離(3,000rpm、5分間)して固形分を除去後、40〜50%硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、DEAE-セファロースカラム、プロテインA−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgGあるいはIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
(6)バインディングアッセイ
抗原としては、(1)に記載の方法により、本発明において用いられるHB-EGFをコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して得た遺伝子導入細胞やリコンビナントタンパク質、あるいはヒト組織から得た精製HB-EGFや部分ペプチドを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、BSA(ウシ血清アルブミン)やKLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
得られたモノクローナル抗体のうち、分泌型HB-EGFのHB-EGF受容体への結合阻害活性を有する抗体としては、ハイブリドーマ細胞株KM3566が生産するモノクローナル抗体KM3566、ハイブリドーマ細胞株KM3567が産生するモノクローナル抗体KM3567、およびハイブリドーマKM3579が生産するモノクローナル抗体をあげることができる。ハイブリドーマ細胞株KM3579は、平成18年1月24日付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)にFERM BP-10491として寄託されている。
更に、得られたモノクローナル抗体が分泌型HB-EGFに対して中和活性を有しているか否かは、HB-EGF依存性細胞を用いた細胞増殖阻害アッセイを行うことにより確認することができる。
得られたモノクローナル抗体と分泌型HB-EGFとをプレート上で反応させた後に上述の細胞株を加えて培養を行う。対照として、分泌型HB-EGFを添加しモノクローナル抗体を添加しないプレート、およびモノクローナル抗体と分泌型HB-EGFのいずれも添加しないプレートに、同様に上述の細胞株を加えて培養を行う。各プレートでの細胞数を計測することにより、細胞増殖阻害率を求めることができる。細胞増殖阻害率が高いモノクローナル抗体は、中和活性を有するモノクローナル抗体として選択することができる。
(1)ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のCHおよび/またはCLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればいかなるものでもよい。ヒト化抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
(2) ヒト以外の動物の抗体のV領域をコードするcDNAの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは以下のようにして取得することができる。
ハイブリドーマから全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法(Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987)、また全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法(Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989)などがあげられる。また、ハイブリドーマからmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia社製)などがあげられる。
(3) ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記2(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLの3’末端側の塩基配列とヒト抗体のCHおよびCLの5’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAとそれぞれ連結し、それぞれを上記2(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを含むプラスミドを鋳型として、5’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてPCR法によりVHおよびVLをコードするcDNAを増幅し、それぞれを上記2(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
(4) ヒト化抗体(CDR移植抗体)のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト化抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bankなどのデータベースに登録されているヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの各サブグループの共通アミノ酸配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services,1991)などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト化抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性(少なくとも60%以上)を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列に、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、ヒト化抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services,1991)を考慮して塩基配列に変換し、ヒト化抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、150塩基前後の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR法を行う。この場合、PCRでの反応効率および合成可能なDNAの長さから、VH、VLとも4本の合成DNAを設計することが好ましい。
(5) ヒト化抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのみをヒト抗体のVHおよびVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991)。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLでは、CDRのみならず、FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がCDRの移植に伴い、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やCDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている(BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991)。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにX線結晶解析(Journal of Molecular Biology, 112, 535-542, 1977)あるいはコンピューターモデリング(Protein Engineering, 7, 1501-1507, 1994)などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型CDR移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
(6) ヒト化抗体発現ベクターの構築
上記2(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、上記2(4)および(5)で構築したヒト化抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、上記2(4)および(5)でヒト化抗体のVHおよびVLを構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記2(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
(7) ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記2(3)および(6)に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、COS-7細胞(ATCC CRL1651)が一般に用いられる(Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991)。COS-7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE-デキストラン法(Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991)、リポフェクション法(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 7413-7417, 1987)などがあげられる。
(8) ヒト化抗体の安定発現
上記2(3)および(6)に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法(Cytotechnology, 3, 133-140, 1990)などがあげられる。ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスSP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、マウスP3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(以下、dhfrと表記する)が欠損したCHO細胞(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77, 4216-4220, 1980)、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662、以下、YB2/0細胞と表記する)などがあげられる。
(9) ヒト化抗体と抗原との結合活性評価
ヒト化抗体と抗原との結合活性評価は、上記に記載のELISAを用いて行うことができる。
抗体断片は、上記1および2に記載の抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいはタンパク質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
抗体断片として、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、diabody、dsFvの製造法について以下に具体的に説明する。
(1) Fabの作製
Fabは、タンパク質化学的にはIgGをタンパク質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインA結合性を有するIgGサブクラスであれば、プロテインAカラムに通すことで、IgG分子やFc断片と分離し、均一なFabとして回収することができる(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995)。プロテインA結合性を持たないIgGサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Fabは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995)。また、Fabは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2(2)、2(4)および2(5)に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、Fab発現用ベクターにクローニングし、Fab発現ベクターを作製することができる。Fab発現用ベクターとしては、Fab用のDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pIT106(Science, 240, 1041-1043, 1988)などがあげられる。Fab発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにFabを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるFabとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったFabが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なFabを精製することができる(Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992)。
(2) F(ab’)2の作製
F(ab’)2は、タンパク質化学的にはIgGをタンパク質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Fabと同様の精製操作により、均一なF(ab’)2として回収することができる(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995)。また、下記3(3)に記載のFab’をo-PDMやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、DTNB[5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)]で処理し、S-S結合させる方法によっても作製することができる(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS,1996)。
(3) Fab’の作製
Fab’は、上記3(2)に記載のF(ab’)2をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Fab’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2(2)、2(4)および2(5)に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、Fab’発現用ベクターにクローニングし、Fab’発現ベクターを作製することができる。Fab’発現用ベクターとしては、Fab’用のDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pAK19(BIO/TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992)などがあげられる。Fab’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにFab’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるFab’とすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインGカラムなどを用いることにより、均一なFab’を精製することができる(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS,1996)。
(4) scFvの作製
scFvは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2(2)、2(4)および2(5)に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、scFv発現用ベクターにクローニングし、scFv発現ベクターを作製することができる。scFv発現用ベクターとしては、scFvのDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pCANTAB5E(Pharmacia社製)、pHFA(Human Antibodies &Hybridomas, 5, 48-56, 1994)などがあげられる。scFv発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にscFvがファージ表面タンパク質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにscFvを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるscFvとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なscFvを精製することができる(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(5) diabodyの作製
diabodyは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2(2)、2(4)および2(5)に記載の抗体のVHとVLをリンカーがコードするアミノ酸残基が8残基以下となるように連結したDNAを作製し、diabody発現用ベクターにクローニングし、diabody発現ベクターを作製することができる。diabody発現用ベクターとしては、diabodyのDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pCANTAB5E(Pharmacia社製)、pHFA(Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994)などがあげられる。diabody発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにdiabodyを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるdiabodyとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なdiabodyを精製することができる(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(6) dsFvの作製
dsFvは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記2(2)、2(4)および2(5)に記載の抗体のVHおよびVLをコードするDNAの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたDNAを作製する。作製した各DNAをdsFv発現用ベクターにクローニングし、VHおよびVLの発現ベクターを作製することができる。dsFv発現用ベクターとしては、dsFv用のDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pULI9(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)などがあげられる。VHおよびVLの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにdsFvを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからVHおよびVLを取得し、混合した後に、通常タンパク質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるdsFvとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)。
本発明のモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬は、HB-EGFが関与する各種疾患を治療することができる。
HB-EGFが関与する疾患としては、癌、心疾患、動脈硬化などがあげられる。
癌としては、乳癌、肝癌、膵癌、膀胱癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍などの固形癌があげられる。また、いずれかの固形癌に伴う連続性、血行性またはリンパ性転移、腹膜播種などによる転移癌などもあげられる。また白血病(急性骨髄性白血病、T細胞性白血病など)、リンパ腫、ミエローマなどの造血細胞由来の癌(血液癌、hematological cancer、blood cancer)などの癌種があげられる。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、又は口腔内、鼻腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、腹腔内及び静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体又はペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の例示であり、本発明の範囲を限定するものでない。
(1)免疫原の調製
R&Dシステム社製リコンビナント分泌型ヒトHB-EGF(カタログ番号 259-HE/CF)凍結乾燥品をダルベッコリン酸バッファー(Phosphate buffered saline:PBS)にて溶解し、免疫原として用いた。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例1(1)で調製したリコンビナント分泌型ヒトHB-EGF 25μgを水酸化アルミニウムアジュバント〔Antibodies - A Laboratory ManuaL, CoLd Spring Harbor Laboratory, p99、1988〕2 mgおよび百日咳ワクチン(千葉県血清研究所製)1×109細胞とともにHB-EGF欠損マウス(大阪大学微生物病研究所 細胞機能分野研究室より供与、PNAS、VOL.100、NO.100、3221-3226、2003)に投与した。投与2週間後より、該HB-EGF 25 μgのみを1週間に1回、計4回投与した。該マウスの眼底静脈より部分採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。脾臓をMEM(Minimum Essential Medium)培地(日水製薬社製)中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離(1200 rpm、5分間)した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液(PH7.6)を添加し、1〜2分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分(細胞画分)をMEM培地で3回洗浄し、細胞融合に用いた。
(3)酵素免疫測定法(バインディングELISA)
アッセイには実施例1(1)のリコンビナントヒトHB-EGFを96ウェルのELISA用プレート(グライナー社)に0.5μg/mL、50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させたものを用いた。該プレートを洗浄後、1 % 牛血清アルブミン(BSA)-PBSを50μL/ウェル加え、室温で1時間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、1% BSA-PBSを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイブリドーマ培養上清を50μL/ウェル分注し、2時間放置した。該プレートを0.05 % ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート[(ICI社商標Tween 20相当品:和光純薬社製)]/PBS(以下Tween-PBSと表記)で洗浄後、2次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgGガンマ鎖(キルケガード アンド ペリー ラボラトリーズ社)を50μL/ウェル加えて室温、1時間放置した。該プレートをTween-PBSで洗浄後、ABTS〔2.2-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸)アンモニウム〕基質液〔1 mmoL/L ABTS/0.1 moL/L クエン酸バッファー(PH4.2)、0.1 %H2O2〕を添加し、発色させOD415nmの吸光度をプレートリーダー(Emax;Molecular Devices社)を用いて測定した。
(4)マウス骨髄腫細胞の調製
8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3X63Ag8U.1(P3-U1:ATCCより購入)を10%ウシ胎児血清添加RPMI1640(インビトロジェン社)で培養し、細胞融合時に2×107個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
(5)ハイブリドーマの作製
実施例1(2)で得られたマウス脾細胞と実施例1(4)で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離(1200rpm、5分間)した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングリコール−1000(PEG-1000)1 g、MEM培地1mL、およびジメチルスルホキシド0.35 mLの混液を108個のマウス脾細胞あたり0.5mL加え、該懸濁液に1〜2分間毎にMEM培地1mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにした。該懸濁液を遠心分離(900rpm、5分間)し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにHAT培地〔10%ウシ胎児血清添加RPMI1640培地にHAT Media Supplement(インビトロジェン社製)を加えた培地〕100 mL中に懸濁した。該懸濁液を96ウェル培養用プレートに200μL/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。培養後、培養上清を実施例1(3)に記載した酵素免疫測定法で調べ、リコンビナントヒトHB-EGFに反応するウェルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを2回繰り返し、抗HB-EGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株KM3566、KM3567およびKM3579を確立した。
(6)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス(BALB/c)に実施例1(5)で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取(1〜8 mL/匹)した。該腹水を遠心分離(3000rpm、5分間)し固形分を除去した。精製IgGモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法〔Antibodies - A Laboratory ManuaL, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988〕により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いたELISA法により決定した。モノクローナル抗体KM3566のサブクラスはIgG1、KM3567のサブクラスはIgG1、モノクローナル抗体KM3579はIgG2bであった。
(1)バインディングELISAにおけるHB-EGFとの反応性
実施例1(3)に示した方法に従って行なった。1次抗体には抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566、KM3567、KM3579、市販抗HB-EGFモノクローナル抗体MAB259(R&D社製)、および陰性対照抗体KM511(抗GCSF誘導体モノクローナル抗体)の各精製抗体を、10 μg/mLから5倍希釈で段階的に希釈したものを用いた。結果を図1−1に示した。
(2)ウエスタンブロットにおけるHB-EGFとの反応性
1レーンあたり、20ngのリコンビナントヒトHB-EGF(R&D社製)をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動にて分画し、泳動後のゲルをPVDF膜に転写した。該膜を10% BSA-PBSでブロッキング後、抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566、KM3567、KM3579、MAB259および陰性対照抗体KM511の精製抗体を、それぞれ10%BSA-PBS を用いて1μg/mLに希釈し、室温で2時間反応させた。該膜をTween-PBSでよく洗浄した後、希釈したペルオキシターゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体(ザイメット社)を、室温で1時間反応させた。該膜をTween-PBSでよく洗浄し、ECLTMwestern blotting detection reagents(アマシャムファルマシア社製)を用いてバンドを検出した。
(3) 抗HB-EGFモノクローナル抗体のHB-EGF−EGFR結合阻害活性の評価
抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566、KM3567、KM3579およびMAB259のHB-EGF−EGFR結合阻害活性を32D/EGFR細胞とビオチン標識HB-EGFを用いて検討した。
KM3566、KM3567、KM3579およびMAB259を10 μg/mLより5倍希釈で段階的に希釈し、50μL/ウェルで96ウェルプレートに分注した。その後、32D/EGFR細胞を1×104個/50 μL/ウェルで分注した。更に、至適濃度に希釈したビオチン標識HB-EGFとアレクサ647標識ストレプトアビジンをそれぞれ10 μL/ウェル、50 μL/ウェルで分注し、混合後、室温遮光下で3時間反応させた。レーザー光 633 nm He/Neで励起される650 nm〜685 nmの波長を8200 Cellular Detection System(アプライドバイオシステム社製)で測定した。
抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566、KM3567、KM3579およびMAB259のHB-EGF中和活性を、HB-EGF依存性細胞を用いた細胞増殖阻害アッセイで調べた。HB-EGF依存性細胞としては、EGFR遺伝子をマウス骨髄由来細胞株32D clone3(ATCC CRL-11346)に導入して造成した細胞株(以下、32D/EGFRと記す)を用いた。抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566、KM3567、KM3579、MAB259、および陰性対照抗体KM511の精製抗体を、それぞれ20μg/mLより3〜4倍希釈で段階的に希釈し、50μL/ウェルで96ウェルプレートに分注した。次に、0.1μg/mLのリコンビナントヒトHB-EGF(R&D社)を、10μL/ウェルで分注し、混合した後氷上で2時間反応させた。その後、32D/EGFR細胞を、1×104個/40μL/ウェルで播種し、36時間培養した。生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク社)を10μL/ウェルで添加し、2時間後にOD450nmの吸光度をプレートリーダー(Emax;Molecular Devices社)を用いて測定した。
1〜5×105細胞のヒト胃癌細胞株MKN-28(HSRRB JCRB0253)、ヒト卵巣癌ES-2(ATCC CRL-1978)およびヒト乳癌細胞株MDA-MB-231(ATCC HTB-26)に、0.1 % BSA-PBSで各濃度に希釈した抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566、KM3567、KM3579、MAB259、および陰性対照抗体KM511を加え、混合して全量を50μLとした。これらの細胞懸濁液を、氷上で40分間反応後、0.1% BSA-PBSで3回洗浄を行った。該細胞に、0.1 % BSA-PBSで希釈調製したFITC標識ヤギ抗マウスIgG+IgM(H+L)ポリクローナル抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories社)を50μL添加し、氷冷下40分間反応させた。0.1 % BSA-PBSで洗浄を行った後、0.1 % BSA-PBSに懸濁してフローサイトメーター(コールター社製)用いて、蛍光強度を測定した。
(1)抗HB-EGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からのmRNAの調製
実施例1に記載のハイブリドーマKM3566より、RNAeasy Maxi kit(QIAGEN社製)およびOligotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit(Takara社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマ細胞5×107細胞より約4.8μgのmRNAを調製した。
(2)抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566のH鎖およびL鎖可変領域の遺伝子クローニング
実施例5(1)で取得した抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566のmRNAの1μgから、BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、5’側にキット添付のBD SMART IITM A Oligonucleotide配列を有するcDNAを取得した。そのcDNAを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーAmixと、配列番号6で表される塩基配列を有するマウスIg(γ)特異的プライマーとを用いてPCR反応を行い、VHのcDNA断片を増幅した。またIg(γ)特異的プライマーの代わりに配列番号7で表される塩基配列を有するマウスIg(κ)特異的プライマーを用いてPCRを行い、VLのcDNA断片を増幅した。PCRは、94℃で5分間加熱後、94℃で30秒間、72℃で3分間からなる反応サイクルを5回、94℃で30秒間、70℃で30秒間、72℃で3分間からなる反応サイクルを5回、94℃で30秒間、68℃で30秒間、72℃で3分間からなる反応サイクルを30回それぞれ行った後、72℃で10分間反応させた。PCRはPTC-200 DNA Engine(BioRad社製)を用いて行った。
(3)抗HB-EGFモノクローナル抗体V領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドKM3566VH10G2に含まれていたVHの全塩基配列を配列番号8に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだVHの全アミノ酸配列を配列番号9に、プラスミドKM3566VL10K2に含まれていたVLの全塩基配列を配列番号10におよび該配列から推定された、シグナル配列を含んだVLの全アミノ酸配列を配列番号11にそれぞれ示した。既知のマウス抗体の配列データ[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest、US Dept.Health and Human Services(1991)]との比較、並びに精製した抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566のH鎖及びL鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー(島津製作所社製:PPSQ-10)を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のcDNAは分泌シグナル配列を含む抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566をコードする完全長cDNAであり、H鎖については配列番号9に記載のアミノ酸配列の1から19番目が、L鎖については配列番号11に記載のアミノ酸配列の1から20番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
(1)抗HB-EGFキメラ抗体発現ベクターpKANTEX3566の構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と、実施例5(2)で得られたプラスミドKM3566VH10G2およびKM3566VL10K2を用いて、抗HB-EGFキメラ抗体発現ベクターpKANTEX3566を以下のようにして構築した。
(2)抗HB-EGFキメラ抗体の動物細胞での発現
上記(1)で得られた抗HB-EGFキメラ抗体発現ベクターpKANTEX3566を用いて抗HB-EGFキメラ抗体の動物細胞での発現を、常法[Antibody Engineering, A Practical Guide,W. H.Freeman and Company(1992)]により行い、抗HB-EGFキメラ抗体を産生する形質転換株KM3966を取得した。
(3)精製キメラ抗体の取得
上記(2)で得られた形質転換株KM3966を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、3000rpm、4℃の条件で10分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、0.22μm孔径MillexGVフィルター(ミリポア社製)を通して濾過滅菌した。得られた培養上清よりProtein A High-capacityレジン(Millipore社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗HB-EGFキメラ抗体KM3966を精製した。得られた抗HB-EGFキメラ抗体KM3966の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュエントゲル(ATTO社製、E-T520L)を用いて、添付の説明書に従い、SDS-PAGEにより確認した。
(1)ヒト固形癌細胞株に対する結合活性
実施例6で得られた抗HB-EGFキメラ抗体KM3966のヒト固形癌細胞株に対する結合性を評価するため、蛍光抗体法により以下のように検討した。
ヒト卵巣癌細胞株のMCAS(JCRB0240)、RMG-I(JCRB IF050315)、ES-2(CRL1978)、ヒト乳癌細胞株のMDA-MB-231(ATCC HTB-26)、T47D(HTB-133)、SK-BR-3(ATCC HTB-30)、ZR-75-1(ATCC CRL-1500)、ヒト胃癌細胞株のMKN-28(HSRRB JCRB0253)の各種細胞株を、0.02%-EDTA Solution(ナカライテスク社製)で剥離しPBSで洗浄後、96ウェルU底プレート(FALCON社製)に、1〜2×105個/50μL/ウェルずつ分注した。1%BSA-PBSで20μg/mLに調製した抗HB-EGFキメラ抗体KM3966溶液を、50μL/ウェルずつ分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に30分間静置した。PBSにより2回洗浄後、100倍希釈した2次抗体FITC-conjugated AffiniPure F(ab’)2 Fragment Rabbit Anti-Human IgG(H+L)(Jackson Laboratories社製)を、50μL/ウェルずつ添加し、プレートミキサーで攪拌し、遮光して氷上に30分間静置した。PBSで2回洗浄後、フローサイトメーターEPICS XL System II v3.0(BECKMAN COULTER社製)を用いて蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としては抗FGF8キメラ抗体KM3034(US2004-0253234)を用いた。
(2)抗HB-EGFキメラ抗体KM3966のヒトHB-EGFに対する結合活性測定
マウス抗体KM3566とキメラ抗体KM3966のヒトHB-EGFに対する結合活性を反応速度論的に解析するため、ビアコアを用いて結合活性測定を行った。以下の操作は全てBiacoreT-100(Biacore社製)を用いて行った。HBS-EP Buffer(Biacore社製)を用いて5μg/mLに調製したヒトHB-EGF(R&D社製)を、アミンカップリング法によりCM5センサーチップ(Biacore社製)に80RU(resonance unit)になるように固層化した。その後9nmol/Lから5段階に希釈した各種抗体を10μL/minの速度でチップ上に流し、各濃度におけるセンサーグラムを解析し、各抗体のヒトHB-EGFに対する結合速度定数及び解離速度定数を算出した。
表1
抗体 Ka(1/Ms)
KM3566 2.7×105
KM3966 2.4×10 5
(3)細胞膜に結合しているHB-EGFに対する抗HB-EGFモノクローナル抗体の反応性
細胞株を0.02%-EDTA Solution(ナカライテスク社製)で剥離しPBSで洗浄後、RPMI1640培地(GIBCO-BRL社製)を加え、300 G、5分間遠心して上清を除去した。細胞に、0.1%BSA-PBSで希釈したリコンビナントヒトHB-EGF(R&D社製)を1μg/mLで添加し、37℃で10分間反応させた。リコンビナントヒトHB-EGFを添加しない場合は、0.1%BSA-PBSのみを添加し、同様に37℃で10分間反応させた。1%BSA-PBSにより2回洗浄後、1%BSA-PBSで10μg/mLに調製した抗HB-EGFキメラ抗体KM3966溶液を、50μL/ウェルで分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に30分間静置した。PBSにより2回洗浄後、100倍希釈した2次抗体FITC-conjugated AffiniPure F(ab’)2 Fragment Rabbit Anti-Human IgG(H+L)(Jackson Laboratories社製)を50μL/ウェルずつ添加し、プレートミキサーで攪拌して遮光し、氷上に30分間静置した。PBSにより2回洗浄後、フローサイトメーターEPICS XL System II v3.0(BECKMAN COULTER社製)にて蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としては抗FGF8キメラ抗体(US2004-0253234)を用いた。
(4)ヒト固形癌細胞株に対する中和活性
実施例6で得られた、抗HB-EGFキメラ抗体KM3966のHB-EGFに対する中和活性を評価するため、HB-EGF依存性増殖阻害活性を測定した。HB-EGF依存性細胞としては、HB-EGF陽性ヒト卵巣癌細胞株RMG-I(JCRB IF050315)およびヒト胃癌細胞株MKN-28(HSRRB JCRB)を用いた。
(5)抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)
実施例6で得られた抗HB-EGFキメラ抗体KM3966のADCC活性を、以下に示す方法に従って測定した。
(5)−1 標的細胞溶液の調製
ヒト卵巣癌細胞株のMCAS、RMG-I、ES-2、ヒト乳癌細胞株のMDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、ZR-75-1、ヒト胃癌細胞株のMKN-28の各種細胞株を0.02%-EDTA Solution(ナカライテスク社製)で剥離し、1% FCS(JRH社製)を含むフェノールレッド不含RPMI1640培地(Invitrogen社製)(以下、ADCC用培地と記す)で洗浄後、同培地で至適濃度に調製して標的細胞溶液とした。
(5)−2 エフェクター細胞溶液の調製
末梢血単核球(Peripheral blood mononuclear cell:PBMC)は、健常人末梢血から以下に示した方法により分離した。ヘパリンナトリウム注N「シミズ」(清水製薬社製)を少量含ませたシリンジで健常人末梢血50mLを採血した。採取した末梢血に同量の生理食塩水(メーカー名)を加えて希釈し、良く攪拌した。15mLチューブ(Greiner社製)に約6.5mLずつ分注したPolymorphprep(NYCOMED社製)の上に、同量の希釈末梢血を静かに重層し、室温で800G、30分間遠心分離して単核球層を分離した。ADCC用培地を用いて2回洗浄した後、同培地により至適濃度に調製し、エフェクター細胞溶液とした。
(5)−3 ADCC活性の測定 96ウェルU底プレート(FALCON社製)の各ウェルに、抗体希釈溶液を50μL分注しておき、(4)−1で調製した標的細胞溶液を50μL、(4)−2で調製したエフェクター細胞溶液を50μL添加して(エフェクター細胞(E)と標的細胞(T)の比は25とした)、全量を150μLとし、37℃で4時間反応させた。標的細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液50μL、培地100μLを加えることにより、また、標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液50μL、エフェクター細胞50μL、培地50μLを加えることにより取得した。標的細胞全遊離の値は、標的細胞溶液50μL、培地80μLを加え、反応終了45分前に9%Triton X-100溶液を20μL添加することにより取得した。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を、LDH-Cytotoxic Test(Wako社製)を用いて、添付説明書に従って吸光度を測定することで検出した。ADCC活性は次式により求めた。
(式)
ADCC活性(%)=([検体の吸光度]−[標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離の吸光度])/([標的細胞全遊離の吸光度]−[標的細胞自然遊離の吸光度])×100
結果を図10に示した。抗HB-EGFキメラ抗体KM3966はHB-EGF陽性ヒト固形癌細胞株に対して、抗体濃度依存的に細胞傷害活性を示した。
(6)マウスゼノグラフトを用いた抗腫瘍活性評価
実施例6で得られた抗HB-EGFキメラ抗体KM3966の抗腫瘍活性を評価するため、ヒト卵巣癌、ヒト乳癌のマウスゼノグラフト初期癌および進行癌モデルを用いて評価を行なった。
(6)−1 初期癌モデルでの評価
ヒト卵巣癌細胞株のMCASおよびES-2を0.02%-EDTA Solution(ナカライテスク社製)で剥離しPBSで洗浄後、RPMI1640培地(GIBCO-BRL社製)を加え、300G、5分間遠心分離して上清を除去した。同培地を加えて遠心分離操作により洗浄後、至適濃度に調製した細胞懸濁液をSCIDマウス雌6-8週齢(日本クレア社製)の右脇下にそれぞれ100μLで皮下移植した。同日から、抗体投与群はPBSで希釈した抗体溶液を、コントロール群はPBSのみを100μLずつ尾静脈投与した(1群5-7匹)。投与は1週間に2回、計8回行い、腫瘍が観察された時点からノギスで腫瘍径を測定した。腫瘍体積は以下の式により算出した。
(式) 腫瘍体積(mm3)=長径×短径2 ×0.5
結果を図11に示した。抗HB-EGFキメラ抗体KM3966は、卵巣癌細胞株MCASおよびES-2の腫瘍増殖を有意に阻害した。従って、抗HB-EGFキメラ抗体KM3966は、移初期癌モデルにおいて、抗腫瘍効果を有することが明らかになった。。
(6)−2 進行癌モデルでの評価
ヒト卵巣癌細胞株のMCASおよびES-2、ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231を0.02%-EDTA Solution(ナカライテスク社製)で剥離しPBSで洗浄後、RPMI1640培地(GIBCO-BRL社製)を加え、300 G、5分間遠心して上清を除去した。同培地を加えて遠心分離操作により洗浄後、至適濃度に調製した細胞懸濁液をSCIDマウス雌6-8週齢(日本クレア社製)の右脇下にそれぞれ100μLで皮下移植した。経過を観察して、腫瘍体積が100mm3前後になった段階でマウスを選抜し、各群の平均腫瘍体積が同等になるように群分けを行った。同日から、抗体投与群はPBSで希釈した抗体溶液を、コントロール群はPBSのみを100μLずつ尾静脈投与した(1群6-7匹)。投与は1週間に2回、計8回行い、抗体投与時点からノギスで腫瘍径を測定した。腫瘍体積は以下の式により算出した。
(式) 腫瘍体積(mm3)=長径×短径2 ×0.5
結果を図12に示した。その結果、抗HB-EGFキメラ抗体KM3966は、卵巣癌細胞株MCAS、ES-2および乳癌細胞株MDA-MB-231の腫瘍増殖を有意に阻害した。従って、抗HB-EGFキメラ抗体KM3966は、進行癌モデルでおいて、抗腫瘍活性を有することが明らかになった。
(1)ヒト血液癌細胞株におけるHB-EGF発現解析
ヒト血液癌細胞株におけるHB-EGF発現を評価するため、蛍光抗体法により検討した。ヒト急性骨髄性白血病細胞株のML-1(DSMZ ACC464)、MOLM-13(DSMZ ACC554)、MV-4-11(ATCC CRL9591)、HL-60(ATCC CCL-240)、NB-4(DSMZ ACC207)、KG-1a(ATCC CCL-246.1)およびヒトT細胞性白血病細胞株のKarpas299(DSMZ ACC31)、Jurkat(RCB RCB0806)をPBSで洗浄後、至適濃度に調製し、96ウェルU底プレート(FALCON社製)に50μL/ウェル(約2×105cells)で分注した。1%BSA-PBSにて20μg/mLに調製した抗HB-EGFマウス抗体KM3566溶液を50μL/ウェルを分注してプレートミキサーで攪拌し、氷上に30分間静置した。PBSにより2回洗浄後、50倍希釈した2次抗体Anti-mouse Igs/FITC Goat F(ab’)2(DAKO社製)を50μL/ウェルで添加し、プレートミキサーで攪拌して遮光して氷上に30分間静置した。PBSで2回洗浄後、フローサイトメーターEPICS XL System II v3.0(BECKMAN COULTER社製)を用いて、蛍光強度を測定した。陰性対照抗体としてはmouse IgG1(DAKO社製)を用いた。
(2)ヒト血液癌細胞株に対する抗HB-EGFキメラ抗体の抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)
HB-EGF発現が確認された急性骨髄性白血病細胞株に対する、HB-EGFキメラ抗体KM3966のADCC活性を、以下に示す方法に従って測定した。
(2)−1 標的細胞溶液の調製
ヒト急性骨髄性白血病細胞株のML-1、MOLM-13、MV-4-11、HL-60、NB-4およびKG-1aをPBSで洗浄後、ADCC用培地で洗浄後、同培地で至適濃度に調製して標的細胞溶液とした。
(2)−2 エフェクター細胞溶液の調製
末梢血単核球(Peripheral blood mononuclear cell:PBMC)は、健常人末梢血から以下に示した方法により分離した。ヘパリンナトリウム注N「シミズ」(清水製薬社製)を少量含ませたシリンジで健常人末梢血50mLを採血した。採取した末梢血に同量の生理食塩水(大塚製薬製)を加えて希釈し、良く攪拌した。15mLチューブ(Greiner社製)に約6.5mLずつ分注したPolymorphprep(NYCOMED社製)の上に、同量の希釈末梢血を静かに重層し、室温で800G、30分間遠心分離して単核球層を分離した。ADCC用培地を用いて2回洗浄した後、同培地により至適濃度に調製し、エフェクター細胞溶液とした。
(2)−3 ADCC活性の測定
96ウェルU底プレート(FALCON社製)の各ウェルに、抗体希釈溶液を50μL分注しておき、(2)−1で調製した標的細胞溶液を50μL、(2)−2で調製したエフェクター細胞溶液を50μL添加して(エフェクター細胞(E)と標的細胞(T)の比は25とした)、全量を150μLとし、37℃で4時間反応させた。標的細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液50μL、培地100μLを加えることにより、また、標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離の値は、標的細胞溶液50μL、エフェクター細胞50μL、培地50μLを加えることにより取得した。標的細胞全遊離の値は、標的細胞溶液50μL、培地80μLを加え、反応終了45分前に9%Triton X-100溶液を20μL添加することにより取得した。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を、LDH-Cytotoxic Test(Wako社製)を用いて、添付説明書に従って吸光度を測定することで検出した。ADCC活性は次式により求めた。
(式)
ADCC活性(%)=([検体の吸光度]−[標的細胞およびエフェクター細胞自然遊離の吸光度])/([標的細胞全遊離の吸光度]−[標的細胞自然遊離の吸光度])×100
結果を図14に示した。抗HB-EGFキメラ抗体KM3966はHB-EGF陽性ヒト血液癌細胞株に対して、抗体濃度依存的に細胞傷害活性を示した。従って、本発明の抗EB-EGFモノクローナル抗体および遺伝子組換え抗体が、HB-EGFを発現している卵巣癌などの固形癌のみならず、急性骨髄性白血病、およびT細胞性白血病などの血液癌に対しても有効な可能性が示唆された。
(1)抗HB-EGFヒト化抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
まず、抗HB-EGFヒト化抗体のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
配列番号12〜14でそれぞれ表される抗体VHのCDR1〜3のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVHのFRのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のVHをそのアミノ酸配列の相同性から3種類のサブグループ(HSG I〜III)に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗HB-EGFヒト化抗体のVHのアミノ酸配列を設計した。より結合活性の高い抗HB-EGFヒト化抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のVHの3種類のサブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列のうち、抗HB-EGFマウス抗体KM3566のVHのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するFRのアミノ酸配列を選択した。
以上の結果から、ヒト抗体のVHのサブグループIの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に抗HB-EGFマウス抗体KM3566のVHのCDRのアミノ酸配列を移植した。しかし、配列番号9に記載のKM3566のVHのアミノ酸配列中の74番目のLysは、カバットらがあげるヒト抗体FRのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記のKM3566のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。このようにして、配列番号22で表される抗HB-EGFヒト化抗体のVHのアミノ酸配列HV0を設計した。
配列番号15〜17でそれぞれ表される抗体VLのCDR1〜3のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVLのFRのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のVLをそのアミノ酸配列の相同性から4種類のサブグループ(HSG I〜IV)に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]。そこでVHの場合と同様にして、ヒト抗体のVLの4種類のサブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列のうち、抗HB-EGFマウス抗体KM3566のVLのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するFRのアミノ酸配列を選択した。
以上の結果から、ヒト抗体のVLのサブグループIVの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に抗HB-EGFマウス抗体KM3566のVLのCDRのアミノ酸配列を移植した。しかし、配列番号11に記載のKM3566のVLのアミノ酸配列中の110番目のLeuは、カバットらがあげるヒト抗体FRのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記のKM3566のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。このようにして、配列番号23で表される抗HB-EGFヒト化抗体のVLのアミノ酸配列LV0を設計した。
(2) 抗HB-EGFヒト化抗体のVHをコードするcDNAの構築
本実施例(1)で設計した抗HB-EGFヒト化抗体のVHのアミノ酸配列HV0をコードするcDNAを、PCRを用いて以下のようにして構築した。
(3)抗HB-EGFヒト化抗体のVLをコードするcDNAの構築
本実施例(1)で設計した抗HB-EGFヒト化抗体のVLのアミノ酸配列をコードするcDNAを、PCRを用いて以下のようにして構築した。
(4)抗HB-EGFヒト化抗体発現ベクターの構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の適当な位置に本実施例(2)および(3)で得られたHV0およびLV0をコードするそれぞれのcDNA、あるいはそれらの改変体をコードするcDNAを挿入し、各種抗HB-EGFヒト化抗体発現ベクターを構築した。
(5)抗HB-EGFヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および精製抗体の取得
抗HB-EGFヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清からの抗体の精製は、実施例6(2)および(3)に記載の方法と同様にして行った。
ヒトHB-EGFに対する抗HB-EGF抗体KM3566、KM3579、及びKM3966の結合エピトープについて、下記の解析を行った。
(1)変異型ヒトHB-EGF全長遺伝子導入細胞の造成
抗HB-EGF抗体 KM3566、KM3579、及びKM3966はいずれもヒトHB-EGFに反応し、マウスHB-EGFには交差反応性を示さない。そこで、ヒトHB-EGFのEGF様ドメインのアミノ酸配列中で、マウスHB-EGFと異なる10個のアミノ酸を、各々1個づつマウス由来のアミノ酸に置換した10種類の変異型ヒトHB-EGF全長タンパク質(以下、変異HB-EGFと記す。)を発現する遺伝子導入細胞を造成し、これらに対する抗HB-EGF抗体の結合活性を測定することにより、結合エピトープの解析を行った。作製した10種類の変異HB-EGFを以下に示す。
(1)N末端より115番目のフェニルアラニンをチロシンに置換した変異HB-EGF(以下、F115Yと表記)
(2)N末端より122番目のリジンをアルギニンに置換した変異HB-EGF(以下、K122Rと表記)
(3)N末端より124番目のバリンをロイシンに置換した変異HB-EGF(以下、V124Lと表記)
(4)N末端より125番目のリジンをグルタミンに置換した変異HB-EGF(以下、K125Qと表記)
(5)N末端より127番目のロイシンをフェニルアラニンに置換した変異HB-EGF(以下、L127Fと表記)
(6)N末端より129番目のアラニンをスレオニンに置換した変異HB-EGF(以下、A129Tと表記)
(7)N末端より133番目のイソロイシンをリジンに置換した変異HB-EGF(以下、I133Kと表記)
(8)N末端より135番目のヒスチジンをロイシンに置換した変異HB-EGF(以下、H135Lと表記)
(9)N末端より141番目のグルタミン酸をヒスチジンに置換した変異HB-EGF(以下、E141Hと表記)
(10)N末端より147番目のセリンをスレオニンに置換した変異HB-EGF(以下、S147Tと表記)。
(11)N末端より1番目から49番目までの配列がマウスHB-EGF由来配列、N末端より50番目から208番目までの配列がヒトHB-EGF由来配列から成る、ヒト/マウスキメラ型HB-EGF(以下、pRTHGC-6と記す。)を作製した。EGF様ドメインは、全てヒトHB-EGF由来配列である為、陽性対照として用いた。
(2)変異HB-EGF遺伝子導入細胞を用いた抗HB-EGF抗体の結合活性解析
まず、1×105個の変異HB-EGF遺伝子導入細胞、ヒト/マウスキメラ型HB-EGF遺伝子導入細胞、およびmockに、結合バッファー(Ham’s F12に非必須アミノ酸、20 mM Hepes-NaOH (pH7.2)、10 %ウシ胎児血清を添加したもの)で2 μg/mLに希釈したビオチン標識抗HB-EGF抗体(KM3566、KM3579、KM3966)を4℃、2時間反応させた。反応後、氷冷した洗浄バッファー(PBSに0.5 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2、0.1 % ウシ胎児血清を添加したもの)で2回洗浄し、続いて1回PBS(+)(PBSに0.5 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2を添加したもの)で洗浄した。洗浄した細胞に、PBS(+)で1.8%に希釈したホルムアルデヒド溶液を加え、4℃、20分間、細胞を固定した。次に、PBS(+)で1回洗浄した後、グリシン溶液(0.2M-glycine、100mM-Tris, pH 8.1)で4C、 20 分間処理し、続いて洗浄バッファーで4℃、20分間インキュベートした。次に、結合バッファーで0.1μg/mLに希釈したHRP結合ストレプトアビジンを、4℃、1時間反応させ、洗浄バッファーで2回洗浄、PBS(+)で2回洗浄した。ペルオキシダーゼ検出用キット(ナカライテスク社製、ELISA POD基質OPDキット)を用いて発色を行い、492nmにおける吸光度を測定し、細胞に結合したHRP活性を測定した。
次に、マウスLMTK-細胞の細胞膜上に発現した変異HB-EGF蛋白の発現量を解析するため、全ての変異HB-EGFに等しく結合する抗HB-EGFウサギポリクローナル抗体(抗体名称;H-6、ヒトHB-EGFのN末端から54番目〜73番目までの合成ペプチドをセファロースCL-6Bに架橋したものをウサギに免疫感作することにより作製された抗体、EMBO J.、 13、2322-2330、1994)の変異HB-EGF遺伝子導入細胞、ヒト/マウスキメラ型HB-EGF遺伝子導入細胞、およびmockに対する吸光度を、上記と同様の方法により測定した。ただしビオチン標識H-6抗体は、抗体濃度10 μg/mLで使用した。H-6抗体の各変異HB-EGF遺伝子導入細胞およびヒト/マウスキメラ型HB-EGF遺伝子導入細胞に対する吸光度より、mockに対する吸光度を差し引いた値をB値とした。
結果を図15に示した。抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566は、pRTHGC-6と比べて、I133K、H135LおよびS147Tに殆んど結合しなかった。従って、抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566は133番目のI、135番目のHおよび147番目のSのアミノ酸を含むエピトープを認識していることが明らかになった。また、同一の抗体可変領域を有する抗HB-EGFキメラ抗体KM3966も、抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566と同様に、pRTHGC-6と比べて、I133KおよびH135Lには、殆んど結合せず、S147Tでは約1/3に結合活性が低下した。従って、抗HB-EGFキメラ抗体KM3966は、抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566と同様に、133番目のI、135番目のHおよび147番目のSのアミノ酸を含むエピトープを認識していることが明らかになった。
以上の結果から、抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3566および抗HB-EGFキメラ抗体KM3966と、抗HB-EGFモノクローナル抗体KM3579は、HB-EGFの異なるエピトープを認識していることが明らかになった。
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Claims (18)
- 細胞膜に結合しているHB−EGF、膜型HB−EGFおよび分泌型HB−EGFの上皮増殖因子様ドメイン(EGF様ドメイン)に結合し、ハイブリドーマKM3566(FERM BP−10490)が生産するモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合し、中和活性を有し、マウスHB−EGFに交差反応しないヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子(heparin binding epidermal growth factor−like growth factor 以下、HB−EGFと称す。)に対するモノクローナル抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- 分泌型HB−EGFとHB−EGF受容体との結合を阻害する、請求項1に記載のモノクローナル抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- 分泌型HB−EGFに対して中和活性を有する請求項1または2に記載のモノクローナル抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- 分泌型HB−EGFと、HB−EGF受容体またはジフテリアトキシンとの結合領域で結合する請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- 抗体の重鎖可変領域(以下、VHと記す)の相補性決定領域(complementarity determining region、以下CDRと記す)1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号12、13および14で表されるアミノ酸配列であり、かつ、抗体の軽鎖可変領域(以下、VLと記す)のCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号15、16および17で表されるアミノ酸配列である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる、請求項6に記載の抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- ヒト型キメラ抗体のVHが、配列番号9で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、VLが、配列番号11で表されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のヒト型キメラ抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- ヒト化抗体のVHが、配列番号22で表されるアミノ酸配列または配列番号22で表されるアミノ酸配列の9番目のAlaをThrに、20番目のValをLeuに、30番目のThrをArgに、38番目のArgをLysに、41番目のProをThrに、48番目のMetをIleに、67番目のArgをLysに、68番目のValをAlaに、70番目のIleをLeuに、95番目のTyrをPheに、および118番目のValをLeuに置換する改変から選ばれる少なくとも1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ヒト化抗体のVLが、配列番号23で表されるアミノ酸配列または配列番号23で表されるアミノ酸配列の15番目のLeuをValに、19番目のAlaをValに、21番目のIleをMetに、49番目のProをSerに、および84番目のLeuをValに置換する改変から選ばれる少なくとも1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のヒト化抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
- 抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)およびジスルフィド安定化V領域(dsFv)ペプチドから選ばれる抗体断片である請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗原結合活性を有する抗体断片。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片をコードするDNA。
- 請求項11に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項12に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
- 請求項13に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片の製造方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片を有効成分として含有する医薬。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片を有効成分として含有する、HB−EGFが関与する疾患の治療剤。
- HB−EGFが関与する疾患が癌である、請求項16に記載の治療剤。
- 細胞膜に結合しているHB−EGF、膜型HB−EGFおよび分泌型HB−EGFに結合し、中和活性を有し、マウスHB−EGFに交差反応せず、かつハイブリドーマKM3566(FERM BP−10490)が生産するモノクローナル抗体の6個のCDRを含む抗体または抗原結合活性を有するその抗体断片。
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