KR20150094617A - 항 ｆｏｌｒ１ 항체 - Google Patents

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마리코 나카노
나오야 가메야마
츠구오 구보타
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교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 인간 FOLR1 발현 세포가 관여하는 질환에 대하여 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하고, 또한 항체 의존적 세포 상해 활성(ADCC 활성) 등의 이펙터 활성이 높은 항 인간 FOLR1 항체를 제공한다. 본 발명은 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하고, 또한 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 해당 항체를 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입해서 얻어지는 형질전환체, 해당 형질전환체를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약을 제공할 수 있다.

Description

항 ＦＯＬＲ１ 항체{ANTI-FOLR1 ANTIBODY}
본 발명은 엽산 수용체(Folate receptor) α(이하, FOLR1이라 기재함)에 결합하고, 항체 의존적 세포 상해 활성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, 이하 ADCC 활성이라 기재함) 및/또는 보체 의존성 세포 상해 활성(Complement-Dependent Cytotoxicity, 이하, CDC 활성이라 기재함)을 발휘하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입해서 얻어지는 형질전환체, 해당 형질전환체를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약에 관한 것이다.
FOLR1은 엽산에 고친화성을 갖는 GPI 앵커형의 막 단백질이며, 세포의 증식이나 생존에 중요한 기능을 갖는다(비특허문헌 1). 정상 조직에서 FOLR1은 신장, 폐, 장 등, 국한되어 발현하고 있다(비특허문헌 2).
또한, 그 발현 부위는 관강측으로 되어 있다. 한편, 암 조직에서의 FOLR1 발현은 관강측에 국한되지 않고, 난소암(비특허문헌 2, 비특허문헌 3, 비특허문헌 4), 신장암(비특허문헌 2), 폐암(비특허문헌 2, 비특허문헌 3), 유방암(비특허문헌 2), 중피종(mesothelioma)(비특허문헌 4) 등 많은 암종에서 고발현하고 있다.
특히 난소암에서는, FOLR1 발현량은 악성도, 진행, 예후에 영향을 미치는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 5, 비특허문헌 6). 또한, 난소암 환자의 혈청 중에 포함되는 가용형 FOLR1은 건강인에 비하여 유의미하게 증가하고 있는 것도 알려져 있다(비특허문헌 7). 이렇게 FOLR1은 암 치료 표적으로서 기대되는 분자이다.
FOLR1에 대한 마우스 모노클로날 항체로서, LK26이 알려져 있다(특허문헌 1). 이 LK26은 암 치료 항체로서 환자에게 투여하기 위해서, CDR 이식법에 의한 인간화가 행하여졌다(특허문헌 2). 그러나, 인간화에 수반되는 현저한 어피니티 저하가 보였다.
그래서 Ebel 등은 인간화 LK26 항체를 바탕으로, LK26 항체와 동등한 FOLR1에 대한 어피니티를 갖는 MORAb-003 항체를 제작했다(비특허문헌 8). MORAb-003의 생체 외 항종양 활성은 ADCC 활성 및 CDC 활성에 기초하는 것이라 여겨지고 있다.
그러나 MORAb-003에는 FOLR1 양성 세포에 대한, 엽산, 5-메틸테트라히드로폴레이트(methyltetrahydrofolate)(5-MTHF), 또는 페메트렉스드(pemetrexed)의 결합을 저해하는 활성은 없고, 항체 단독으로 FOLR1 양성 세포의 증식을 억제하는 활성도 없는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9).
MORAb-003에 대해서는, 12.5 내지 400mg/m2를 투여한 제1상 임상시험에서, 안전성 및 용인성이 보고되었다(비특허문헌 10). 또한, 플라티나 감수성 재발 난소암 환자를 대상으로 한 제2상 임상시험에서는, 파클리탁셀 및 카르보플라틴과 MORAb-003을 병용함으로써, 우수한 항종양 활성을 나타내는 것이 보고되었다.
그러나, 플라티나 내성 재발 난소암 환자에 대한 임상시험은 중간 해석에 서, 통계학적으로 미리 설정된 평가 항목(무증악 생존 기간, 전체 생존 기간)의 개선 목표에 도달하지 않을 가능성이 높다고 하여 중지되었다.
FOLR1을 암치료 표적으로 한 약제로서는, 상기 항체 이외에, 예를 들어 엽산에 항암제를 접합한 EC-145 등을 들 수 있다. 엽산에 항암제를 접합한 약제는 FOLR1이 엽산을 도입하는 성질에 기초하여 약효를 발현한다. 따라서, 엽산에 항암제를 접합한 약제는 체내의 암세포가 FOLR1을 발현하고 있어도, 엽산 도입 활성이 낮은 암세포에는 무효라고 생각된다.
고형암에 대한 치료법과 예후의 개선은 날로 발전하고 있다. 그러나 난소암에 대해서는, 1980년대에 플라티나 제제에 의한 치료법이 등장한 이후, 현저하게 예후가 개선되었다고는 말할 수 없고(비특허문헌 11), 여전히, 부인과 암에 의한 사망의 주요한 원인이다. 그 이유는 난소암에 플라티나 제제에 대한 내성이 생겨, 재발한 결과, 치료가 곤란해지는 것에 있다고 여겨진다.
즉, 플라티나 제제 등의 화학요법에 의한 주효로부터 재발까지의 기간을 연장하는 것, 난소암의 플라티나 제제에 대한 내성화를 저지하는 것, 플라티나 제제에 대하여 내성화된 난소암에 대한 치료법을 확립하는 것이 난소암 치료의 과제가 되었다.
또한, 난소암은 복막파종에 의한 복수의 저류를 수반하기 쉽고, 플라티나 내성 난소암에서는 특히 복수의 저류에 수반되는 QOL(삶의 질; Quality of Life)의 저하가 문제가 된다는 점에서 원발소의 암세포뿐만 아니라, 복막파종이나 복수에 존재하는 암세포에도 유효한 치료약이 요구되고 있다.
또한, FOLR1이 고발현하고 있어도, 엽산 도입 활성이 저하되어 있는 암세포에도 유효한 치료약이 요구되고 있다.
유럽 특허 출원 공개 제0197435호 명세서 미국 특허 제5952484호 명세서
Int J Cancer, 2006. 119(2): p.243-50. Anal Biochem, 2005. 338(2): p.284-93. J Thorac Oncol, 2012. 7(5): p.833-840. J Thorac Cardiovasc Surg, 2001. 121(2): p.225-33. Int J Cancer, 1997. 74(2): p.193-8. Int J Cancer, 1998. 79(2): p.121-6. PLoS One, 2009. 4(7): p.e 6292. Cancer Immun, 2007. 7: p.6. Cancer Chemother Pharmacol, 2012. 70(1): p.113-20. Clin Cancer Res, 2010. 16(21): p.5288-95. Nat Rev Cancer, 2011. 11(10): p.719-25.
비약적으로 항체의 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 높인 항 FOLR1 항체는 치료 곤란한 플라티나 내성 난소암을 비롯한, FOLR1이 암세포에서 발현하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 항체로서 기대되고 있다.
본 발명은 플라티나 내성 난소암 유래의 세포주에 대해서도 생체 외 및 생체 내로 항종양 활성을 나타내는 항체 또는 해당 항체 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입해서 얻어지는 형질전환체, 해당 형질전환체를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약을 제공한다.
본 발명의 요지는 다음과 같다.
(1) 이하의 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 하나의 항체와 경합하여, 인간 FOLR1을 특이적으로 인식하고, 상기 항체가 결합하는 인간 FOLR1에 존재하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하고, 또한 항종양 활성을 나타내는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편:
(a) 상보쇄 결정 영역(complementarity determining region, 이하 CDR이라 기재함) 1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄(이하, H쇄라 기재함)를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄(이하, L쇄라 기재함)를 포함하는 항체
(b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체이고, 서열 번호 32(항체 H쇄의 CDR3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 시스테인이 트레오닌, 메티오닌, 이소류신, 발린, 페닐알라닌 또는 글루타민으로 치환된 항체
(c) 서열 번호 98로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 서열 번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체.
(2) 유전자 재조합 항체인, (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(3) 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인, (2)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(4) 이하의 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 하나의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편:
(a) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 30 내지 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33 내지 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편
(b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체로, 서열 번호 32(항체 H쇄의 CDR3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 시스테인이 트레오닌, 메티오닌, 이소류신, 발린, 페닐알라닌 또는 글루타민으로 치환된 항체
(c) 서열 번호 98로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 서열 번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체.
(5) 서열 번호 1로 표시되는 인간 FOLR1의 아미노산 서열에 결합하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편.
(6) Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V 영역(디아바디; diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 단편.
(7) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA.
(8) (7)에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
(9) (8)에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입해서 얻어지는 형질전환주.
(10) (9)에 기재된 형질전환주를 배지에서 배양하고, 배양물 중에 (1) 또는 (4)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 생성 축적시켜, 배양물로부터 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법.
(11) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 치료 방법.
(12) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편과 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 치료약.
(13) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하는, 인간 FOLR1 또는 인간 FOLR1 양성 세포의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
(14) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 인간 FOLR1 양성 세포를 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 진단 방법.
(15) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 진단약.
(16) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 당해 항체에 의한 치료 유효성을 치료 개시 전에 판단하는 방법.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합한다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖고, 또한 플라티나 내성 난소암 유래의 세포주에 대해서도 항종양 활성을 나타낸다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은 FOLR1 저발현 세포에도 ADCC 활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은 복수에 존재하는, FOLR1을 발현하는 암세포에도 ADCC 활성을 갖는다. 이에 더하여, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은 FOLR1을 발현하는 암세포에 대하여 그의 엽산 도입 활성이 저하되어 있어도 ADCC 활성을 갖는다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은 FOLR1에 대한 엽산의 결합을 저해하지 않는다. 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하고, 또한 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 치료 및 진단 등에 유용하다.
또한, 본 발명은 해당 항체를 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입해서 얻어지는 형질전환체, 해당 형질전환체를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약 및 진단약을 제공할 수 있다.
도 1은 시그널 서열을 포함하지 않는 RA15-7 항체 중쇄 가변 영역 및 각 인간화 RA15-7 항체 개변체 중쇄 가변 영역(HV0, HV2, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 시그널 서열을 포함하지 않는 RA15-7 항체 경쇄 가변 영역 및 각 인간화 RA15-7 항체 개변체 경쇄 가변 영역(LV0, LV2, LV3, LV4, LV6)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 ChRA15-7Acc 항체의 친화성을 100으로 했을 경우의, FOLR1-mycHis에 대한 HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체의 친화성 평가 결과(표면 플라즈몬 공명법)를 나타낸다.
도 4(a), (b), (c) 및 (d)는 FOLR1-Fc(검정색 동그라미), 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) FOLR1-Fc(흰색 동그라미), FOLR2-Fc(검정색 세모) 및 FOLR3-Fc(×)에 대한 각 항체(DNPDF, MORAb-003DF, ChRA15-7DF, HuRA15-7CTDF)의 반응성 평가 결과(ELISA)를 나타낸다. 종축은 흡광도, 횡축은 항체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 5(a) 및 (b)는 플라티나 내성 난소암 세포주 SKOV-3 또는 OVCAR-3에 대한 HuRA15-7CTAcc 항체(검정색 동그라미), HuRA15-7Acc 항체(검정색 네모) 및 ChRA15-7Acc 항체(검정색 세모)의 ADCC 활성 평가 결과를 나타낸다. 종축은 ADCC 활성(%), 횡축은 항체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 6(a) 및 (b)는 난소암 세포주 IGR-OV1에 대한 CDC 활성을 나타낸다. 종축은 CDC 활성(%), 횡축은 항체 농도(μg/mL)를 나타낸다. 도 6(a)는 HuRA15-7CTAcc 항체(검정색 동그라미), HuRA15-7CTDF 항체(흰색 동그라미), ChRA15-7Acc 항체(흑색 세모) 및 ChRA15-7DF 항체(흰색 세모)의 CDC 활성 평가 결과를 나타낸다. 도 6(b)는 HuRA15-7CTAcc 항체(검정색 동그라미) 및 MORAb-003 항체(검정색 세모)의 CDC 활성 평가 결과를 나타낸다.
도 7(a), (b) 및 (c)는 난소암 세포주 IGR-OV1, SKOV-3, 또는 OVCAR-3에 대한 HuRA15-7CTAcc 항체(검정색 동그라미), MORAb-003Acc 항체(흰색 세모) 및 MORAb-003 항체(검정색 세모)의 ADCC 활성 평가 결과를 나타낸다. 종축은 ADCC 활성(%), 횡축은 항체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 8은 마우스에 피하 이식해서 진행 암으로 한 플라티나 내성 난소암 세포주 SKOV-3에 대한 HuRA15-7CTDF-770 항체(검정색 동그라미) 및 MORAb-003DF-770 항체(검정색 세모)의 집적성 평가 결과를 나타낸다. 종축은 종양 부위에서의 내부 표준 DNPDF-680 항체의 형광 강도에 대한 각각의 항체의 형광 강도비, 횡축은 투여후 시간(일)을 나타낸다.
도 9는 플라티나 내성 난소암 세포주 OVCAR-3에 대한 HuRA15-7CTAcc 항체(검정색 동그라미), HuRA15-7CRAcc 항체(흰색 동그라미) 및 MORAb-003DF 항체(검정색 세모)의 ADCC 활성 평가 결과를 나타낸다. 종축은 ADCC 활성(%), 횡축은 항체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 10은 마우스 IgG2a를 음성 대상으로 하고, 난소암 세포주 IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3, 또는 MCAS에서 발현하는 FOLR1을, LK26 항체를 사용해서 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 해석함으로써, 각 난소암 세포주 상에서 발현하는 FOLR1 분자수를 정량화한 결과를 나타낸다. 종축은 1세포당의 FORL1 발현 분자수를 나타낸다.
도 11(a), (b), (c) 및 (d)는 난소암성 복수 중의 세포 집단에 대하여 HuRA15-7CTAcc 항체(검정색 동그라미), MORAb-003 항체(검정색 세모) 및 음성 대상으로서 DNPDF 항체(×)를 가했을 때의, FOLR1 양성 세포에의 세포 장애 활성을 나타낸다. 종축은 세포 장애 활성(%), 횡축은 항체 농도(ng/mL)를 나타낸다. FZ12, FZ21, FZ26 및 FZ44는 각각 난소암성 복수의 도너를 나타낸다.
도 12(a) 및 (b)는 각종 난소암 세포주의 FOLR1 발현량 및 엽산 도입량을 해석한 결과를 나타낸다. 도 12(a)는 HuRA15-7CTAcc 항체를 사용해서 유세포 분석에 의해 FOLR1 발현량을 해석한 결과를 나타낸다. 도 12(b)는 표지화 엽산을 사용해서 유세포 분석에 의해 엽산 도입량을 해석한 결과를 나타낸다. 종축은 음성 대상에 대한 상대 MFI값을, 횡축은 해석한 난소암 세포주를 나타낸다.
본 발명에서의 인간 FOLR1로서는, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 FOLR1의 기능을 갖는 폴리펩티드, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 FOLR1의 기능을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열과 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 FOLR1의 기능을 갖는 폴리펩티드, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 FOLR1의 기능을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
인간 FOLR1의 기능으로서는 리간드(예를 들어, 엽산)와의 결합에 의해, 엔도사이토시스를 야기하고, 세포 내에 엽산을 도입하는 것을 말한다.
서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻는 방법으로서는, 부위 특이적 변이 도입법(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley&Sons(1987-1997)], [Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409, (1982)], [Gene, 34, 315(1985)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)]) 등을 사용해서, 예를 들어 서열 번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 즉 인간 FOLR1을 코딩하는 유전자에 부위 특이적 변이를 도입하는 방법을 들 수 있다.
결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개 내지 수십 개, 예를 들어 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 수개, 예를 들어 1 내지 5개의 아미노산이다.
인간 FOLR1을 코딩하는 유전자로서는, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 염기 서열을 들 수 있다. 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM＿016725로 나타내는 염기 서열에 있어서, 1 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열을 포함하고、또한 인간 FOLR1의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 유전자, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM＿016725로 나타내는 염기 서열도 적어도 60％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 바람직하게는 80％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 또한 인간 FOLR1의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 유전자, 및 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM＿016725로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA를 포함하고, 또한 인간 FOLR1의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자 등도 본 발명의 인간 FOLR1을 코딩하는 유전자에 포함된다.
스트린젠트한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA로서는, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA를 프로브에 사용한, 콜로니·하이브리다이제이션법, 플라크·하이브리다이제이션법, 서던 블롯·하이브리다이제이션법, 또는 DNA 마이크로어레이법 등에 의해 얻어지는 하이브리다이즈 가능한 DNA를 의미한다.
구체적으로는, 하이브리다이즈한 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA, 또는 해당 배열을 갖는 PCR 산물 또는 올리고 DNA를 고정화한 필터 또는 슬라이드 글래스를 사용하여, 0.7 내지 1.0mol/L의 염화나트륨 존재 하, 65℃에서 하이브리다이제이션(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley&Sons(1987-1997)], [DNA Cloning 1: Coretechniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University(1995)])을 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mmol/L 염화나트륨, 15mmol/L 시트르산 나트륨으로 이루어짐)을 사용하고, 65℃ 조건하에서 필터 또는 슬라이드 글래스를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다.
상기 하이브리다이즈 가능한 DNA로서는, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
진핵생물의 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열에는, 종종 유전자의 다형이 인정된다. 본 발명에서 사용되는 유전자에, 이러한 다형에 의해 염기 서열에 소규모 변이가 발생한 유전자도, 본 발명의 FOLR1을 코딩하는 유전자에 포함된다.
본 발명에서의 상동성의 수치는 특별히 명시한 경우를 제외하고, 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 사용해서 산출되는 수치이어도 좋지만, 염기 서열에 대해서는, BLAST(문헌 [J.Mol.Biol., 215, 403(1990)])에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용해서 산출되는 수치 등, 아미노산 서열에 대해서는, BLAST2(문헌 [Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997), Genome Res., 7, 649(1997), http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information 3.html])에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용해서 산출되는 수치 등을 들 수 있다.
디폴트의 파라미터로서는, G(Cost to open gap)가 염기 서열인 경우에는 5, 아미노산 서열인 경우에는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기 서열인 경우에는 2, 아미노산 서열인 경우에는 1, -q(Penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r (reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기 서열인 경우에는 11 잔기, 아미노산 서열인 경우에는 3 잔기, -y[Dropoff(X) for blast extensions in bits]가 blastn인 경우에는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 7, -X(X dropoff value for gapped alignment in bits)가 15 및 Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits)가 blastn인 경우에는 50, blastn 이외의 프로그램에서는 25이다(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html).
서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 얻는 방법으로서는, 예를 들어 서열 번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 일부를 결실시켜, 이것을 포함하는 발현 벡터를 도입한 형질전환체를 배양함으로써 제작할 수 있다.
또한, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열의 부분 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도, 상술한 부위 특이적 변이 도입법 등을 사용해서 얻을 수 있다.
또한, 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 1 또는 GenBank 액세션 번호 NM_016725로 나타내는 아미노산 서열의 부분 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)법 또는 t-부틸옥시카르보닐(tBoc)법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 모노클로날 항체(이하, 본 발명의 항체라고도 함) 또는 해당 항체 단편은 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 항체 또는 해당 항체 단편이며, 항종양 활성을 갖는다.
본 발명에서의 인간 FOLR1의 입체 구조로서는, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째로부터 257번째로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 인간 FOLR1이 천연 상태로 취할 수 있는 구조와 동등한 구조를 가지고 있으면 어느 구조라도 좋다. 인간 FOLR1이 천연 상태로 취할 수 있는 입체 구조란, 인간 FOLR1의 천연형의 입체 구조인 것을 말한다.
본 발명에서의 항종양 활성이란, 구체적으로는 ADCC 활성 및 CDC 활성을 들 수 있다.
본 발명에서의 ADCC 활성이란, 세포 표면의 인간 FOLR1에 결합한 항체가 Fc 부분을 통해 주로 내추럴 킬러세포(이하, NK세포라 기재함) 표면의 FcγRIIIa에 결합하고, 그 결과, NK세포로부터 방출되는 파포린 또는 글란자임 등의 세포 상해성 분자에 의해 일어나는 세포 융해 반응이다(문헌 [Clark M, Chemical Immunology, 65, 88(1997)]; [Gorter A들, Immunol. Today, 20, 576(1999)]).
본 발명의 항체는 FOLR1 고발현 세포뿐만 아니라, 저발현 세포에도 ADCC 활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 항체는 FOLR1 저발현 세포에 대하여 종래의 항 FOLR1 모노클로날 항체에 비하여 보다 높은 ADCC 활성을 나타낸다. 세포에서의 FOLR1 발현량은 웨스턴 블로트법이나, 공지된 면역학적 검출법, 형광 세포 염색법 등에 의해 확인할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어 FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오시스템사제) 등을 사용하는 형광 항체 염색법(문헌 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)]), 유세포 분석을 사용하는 형광 세포 염색법 등의 방법을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 ADCC 활성은 세포의 엽산 도입량에 의존하지 않는다. 본 발명의 항체는 엽산 도입량이 낮은 FOLR1 발현 세포에 대해서도, ADCC 활성을 갖는다.
세포에서의 엽산 도입량은, 예를 들어 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에서 사용되는 표지체에 의해 표지된 엽산을 사용해서 확인할 수 있다. 표지체로서는, 예를 들어 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제 또는 루시페라아제 등의 효소, 아크리디늄 에스테르 또는 로핀 등의 발광 물질, 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질, 방사성 동위원소 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 CDC 활성이란, 세포 표면의 인간 FOLR1에 결합한 항체가 Fc 부분을 통해 보체계의 C1의 한 성분인 C1q에 결합하고, 그 결과, C1 내지 C9의 각 보체 성분이 활성화되고, 최종적으로는 C5 내지 C9가 막 침습 복합체라고 불리는 구멍 형성 중합체를 세포막 상에서 형성하여 세포의 용해를 야기하는 반응이다(문헌 [Immunol Today. 1999 Dec; 20(12): 576-82]).
상기 항체로서, 구체적으로는 이하의 (i) 또는 (ii)의 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편을 들 수 있다:
(i) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
(ii) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체이고, 서열 번호 32(항체 H쇄의 CDR3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 시스테인이 트레오닌, 메티오닌, 이소류신, 발린, 페닐알라닌 또는 글루타민으로 치환된 항체.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서 보다 구체적으로는, 이하의 (a)의 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편을 들 수 있다:
(a) 서열 번호 98로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 또한 서열 번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서는 상기 모노클로날 항체와 경합하여, 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 인간 FOLR1에 존재하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 모노클로날 항체와 경합하는 항체란, 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하거나 또는 부분적으로 동일한 인간 FOLR1에 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 갖고, 해당 에피토프에 결합하는 항체를 말한다. 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 항체란, 본 발명의 모노클로날 항체가 인식하는 인간 FOLR1의 아미노산 서열과 같은 배열을 인식해 결합하는 항체를 말한다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편이 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 것은, 인간 FOLR1을 고상화한 것을 사용한 효소 면역 측정법(ELISA), 웨스턴 블로트법, 면역 조직 염색(IHC)법, 인간 FOLR1을 발현한 세포에 대한 공지된 면역학적 검출법, 형광 세포 염색법 등, 특정한 항원과 특정 항원에 대한 항체의 결합성을 조사하는 방법에 의해 확인할 수 있다.
구체적으로는, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오시스템사제) 등을 사용하는 형광 항체 염색법(문헌 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)]), 유세포 분석을 사용하는 형광 세포 염색법, Biacore시스템(GE 헬스케어사제) 등을 사용한 표면 플라즈몬 공명, ITC(DKSH사제) 등을 사용한 등온 적정 칼로리메트리 등의 방법을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편이 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 것을, Biacore시스템(GE 헬스케어사제) 등을 사용한 표면 플라즈몬 공명으로 확인하는 경우에는, 항 IgG 항체를 센서 칩 CM5에 아민 커플링법에 의해 고정한 후, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 흘리고, 적당량 결합시키고, 또한 농도를 이미 알고 있는 복수 농도의 FOLR1 또는 그의 융합체를 흘리고, 결합, 해리를 측정하는 것이 바람직하다.
또한, 기타의 공지된 면역학적 검출법(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)], [단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]) 등을 조합해서 확인할 수도 있다.
인간 FOLR1을 발현하는 세포로서는, 해당 FOLR1을 발현하고 있으면 어느 세포라도 좋고, 예를 들어 인간 체내에 천연으로 존재하는 세포, 인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로부터 수립된 세포주, 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 세포 등을 들 수 있다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로서는, 예를 들어 암환자 체내에서 해당 FOLR1이 발현하고 있는 세포를 들 수 있고, 구체적으로는 난소암 세포, 신장암 세포, 자궁내막암 세포, 폐암 세포, 유방암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포 및 결장암 세포 등을 들 수 있다(문헌 [Anal Biochem, 2005.338(2): p.284-93]).
인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로부터 수립된 세포주로서는, 예를 들어 상기 암환자로부터 얻어진 해당 FOLR1이 발현하고 있는 세포를 주화해서 얻어진 세포주 중, 해당 FOLR1을 발현하고 있는 세포주를 들 수 있다.
예를 들어, 인간으로부터 수립된 세포주인 난소암 유래 세포주 SKOV-3 [American Type Culture Collection(이하, ATCC로 기재함) 번호: HTB-77], TOV-112D(ATCC 번호: CRL-11731), ES-2(ATCC 번호: CRL-1978), OV-90(ATCC 번호: CRL-11732), PA-1(ATCC 번호: CRL-1572), Caov-3(ATCC 번호: HTB-75), OVISE(JCRB 세포 번호: JCRB1043), MCAS(JCRB 세포 번호: JCRB0240), NIH: OVCAR-3(ATCC 번호: HTB-161), IGR-OV1(국립 암 연구소; National Cancer Institute), 또는 RMG-1(JCRB 세포 번호: JCRB0172) 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 세포로서는, 구체적으로는, 예를 들어 해당 FOLR1을 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입함으로써 얻어지는, 해당 FOLR1을 발현한 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체로서는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 또는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 형질전환체에 의해 생산되는 유전자 재조합 항체를 들 수 있다.
모노클로날 항체란, 단일 클론의 항체 생산 세포가 분비하는 항체이며, 단지 하나의 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 인식하고, 모노클로날 항체를 구성하는 아미노산 서열(1차 구조)이 균일한 것이 특징이다.
에피토프로서는, 예를 들어 모노클로날 항체가 인식하고, 결합하는 단일의 아미노산 서열, 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조, 당쇄가 결합한 아미노산 서열 및 당쇄가 결합한 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프는 서열 번호 1로 표시되는 인간 FOLR1의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NM_016725.1) 중 55번째 내지 62번째의 아미노산 서열에 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프의 아미노산 서열은 서열 번호 1의 55번째 내지 62번째의 아미노산에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하고, 55번째, 56번째, 57번째, 58번째, 59번째, 60번째, 61번째 및 62번째의 아미노산에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프의 아미노산 서열은 인간 FOLR1의 아미노산 서열 중, 서열 번호 1의 55번째 내지 62번째의 아미노산 서열에서 선택되는 적어도 연속한 2 이상의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하고, 55번째, 56번째, 57번째, 58번째, 59번째, 60번째, 61번째 및 62번째의 아미노산에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함하고, 또한 서열 번호 1의 55번째 내지 62번째의 아미노산 서열에서 선택되는 적어도 연속한 2 이상의 아미노산을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
구체적으로는, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프의 아미노산 서열로서는 서열 번호 1의 55번째 내지 62번째의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
하이브리도마는, 예를 들어 상기한 인간 FOLR1을 발현한 세포 등을 항원으로서 제조하고, 해당 항원을 면역한 동물로부터 항원 특이성을 갖는 항체 생산 세포를 유도하고, 또한 해당 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 제조할 수 있다. 해당 하이브리도마를 배양하거나, 또는 해당 하이브리도마 세포를 동물에 투여해서 해당 동물을 복수암화시켜, 해당 배양액 또는 복수를 분리, 정제함으로써 항 FOLR1 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
항원을 면역하는 동물로서는, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터, 닭 또는 래빗 등이 사용된다. 또한, 이러한 동물로부터 항체 생산능을 갖는 세포를 취득하고, 해당 세포에 생체 외로 면역을 실시한 후에, 골수종 세포와 융합해서 제작한 하이브리도마가 생산하는 항체 등도 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명에서 유전자 재조합 항체로서는 인간형 키메라 항체, 인간형 CDR 이식 항체, 인간 항체 또는 항체 단편 등, 유전자 재조합에 의해 제조되는 항체를 포함한다. 유전자 재조합 항체에서, 모노클로날 항체의 특징을 갖고, 항원성이 낮고 혈중반감기가 연장된 것은 치료약으로서 바람직하다. 유전자 재조합 항체는, 예를 들어 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 유전자 재조합 기술을 이용해서 개변한 것을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL과 인간 항체의 중쇄 정상 영역(이하, CH로 기재함) 및 경쇄 정상 영역(이하, CL로 기재함)을 포함하는 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 키메라 항체는 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하여, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH로서는, 인간 이뮤노글로블린(이하, hIg로 기재함)에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 사용되고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4와 같은 서브클래스 중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋고, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간형 키메라 항체로서 구체적으로는, 서열 번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 또한 서열 번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 키메라 항체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 키메라 항체로서는, 본 발명의 모노클로날 항체와 경합하여, 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 인간 FOLR1에 존재하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 키메라 항체를 들 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체란, 인간화 항체라고 하는 경우도 있고, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 CDR 이식 항체는 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 인간 이외의 동물의 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을, 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임 워크 영역(이하, FR로 기재함)에 이식한 V 영역을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체의 CH로서는, hIg에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 사용되고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4와 같은 서브클래스 중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋고, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간형 CDR 이식 항체로서는, 구체적으로는 CDR1 내지 3이 서열 번호 30 내지 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 서열 번호 33 내지 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다.
본 발명의 인간화 항체로서, 구체적으로는 이하의 (a) VH 및 (b) VL 중 적어도 한쪽을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다:
(a) 서열 번호 100의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu, 30번째의 Ser, 37번째의 Val, 40번째의 Ala, 41번째의 Pro, 44번째의 Gly, 45번째의 Leu, 48번째의 Val, 76번째의 Asp 및 95번째의 Val에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH
(b) 서열 번호 101의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val, 43번째의 Ala, 45번째의 Lys, 71번째의 Phe, 85번째의 Thr 및 87번째의 Tyr에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL.
또한, 본 발명의 인간화 항체에 포함되는 VH로서는, 이하의 (1) 내지 (8)이 바람직하다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu, 30번째의 Ser, 37번째의 Val, 40번째의 Ala, 41번째의 Pro, 44번째의 Gly, 45번째의 Leu, 48번째의 Val, 76번째의 Asp 및 95번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val, 40번째의 Ala, 41번째의 Pro, 44번째의 Gly, 45번째의 Leu, 48번째의 Val, 76번째의 Asp 및 95번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 30번째의 Ser, 40번째의 Ala, 44번째의 Gly, 45번째의 Leu, 48번째의 Val, 76번째의 Asp 및 95번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val, 40번째의 Ala, 41번째의 Pro, 45번째의 Leu, 48번째의 Val 및 95번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val, 40번째의 Ala, 41번째의 Pro, 45번째의 Leu 및 48번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala, 41번째의 Pro, 45번째의 Leu 및 95번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(7) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 41번째의 Pro, 45번째의 Leu 및 95번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(8) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala 및 95번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH.
상기 VH의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 또는 95번째의 Val을 Thr로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 1개의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
10개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
9개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (10)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로 및 76번째의 Asp를 Asn으로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(10) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열.
8개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (11)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 76번째의 Asp를 Asn으로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 76번째의 Asp를 Asn으로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(10) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 76번째의 Asp를 Asn으로 치환한 아미노산 서열
(11) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 30번째의 Ser을 Thr로, 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 48번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열.
7개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (5)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 30번째의 Ser을 Thr로, 40번째의 Ala를 Pro로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 76번째의 Asp를 Asn으로 치환한 아미노산 서열.
6개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 48번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열.
5개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 48번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열.
4개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (7)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 40번째의 Ala를 Pro로, 41번째의 Pro를 Ala로, 및 45번째의 Leu를 Pro로 치환한 아미노산 서열.
3개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala를 Pro로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 41번째의 Pro를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 44번째의 Gly를 Ala로, 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 45번째의 Leu를 Pro로, 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열.
2개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (9)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 30번째의 Ser을 Thr로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 41번째의 Pro를 Ala로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 44번째의 Gly를 Ala로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 45번째의 Leu를 Pro로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 48번째의 Val을 Leu로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 76번째의 Asp를 Asn으로, 및 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열.
1개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (10)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 18번째의 Leu를 Met로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 30번째의 Ser을 Thr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 37번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 40번째의 Ala를 Pro로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 41번째의 Pro를 Ala로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 44번째의 Gly를 Ala로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 45번째의 Leu를 Pro로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 48번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 76번째의 Asp를 Asn으로 치환한 아미노산 서열
(10) 서열 번호 100의 아미노산 서열 중의 95번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열.
또한, 본 발명의 인간화 항체에 포함되는 VL로서는 이하의 (1) 내지 (4)가 바람직하다:
(1) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val, 43번째의 Ala, 45번째의 Lys, 71번째의 Phe, 85번째의 Thr 및 87번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(2) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val, 45번째의 Lys, 71번째의 Phe 및 87번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(3) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val, 71번째의 Phe 및 87번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(4) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 45번째의 Lys 및 71번째의 Phe가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL.
상기 VL의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 1개의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
6개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
5개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 43번째의 Ala를 Ser로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 43번째의 Ala를 Ser로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로 및 85번째의 Thr을 Gly로 치환한 아미노산 서열.
4개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 71번째의 Phe를 Tyr로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 85번째의 Thr을 Gly로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로 및 85번째의 Thr을 Gly로 치환한 아미노산 서열.
3개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (4)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 71번째의 Phe를 Tyr로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 45번째의 Lys를 Gln으로, 71번째의 Phe를 Tyr로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 45번째의 Lys를 Gln으로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로, 45번째의 Lys를 Gln으로 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 서열.
2개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (9)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 45번째의 Lys를 Gln으로 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 43번째의 Ala를 Ser로 및 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 71번째의 Phe를 Tyr로 및 85번째의 Thr을 Gly로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 71번째의 Phe를 Tyr로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로 및 45번째의 Lys를 Gln으로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 43번째의 Ala를 Ser로 및 45번째의 Lys를 Gln으로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 45번째의 Lys를 Gln으로 및 85번째의 Thr을 Gly로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 45번째의 Lys를 Gln으로 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열.
1개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다:
(1) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 15번째의 Val을 Leu로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 43번째의 Ala를 Ser로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 45번째의 Lys를 Gln으로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 71번째의 Phe를 Tyr로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 101의 아미노산 서열 중의 85번째의 Thr을 Gly로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 101의 아미노산 서열중의 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열.
또한, 본 발명의 인간화 항체의 구체예로서는, 항체의 VH가 서열 번호 98 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 98 및/또는 항체의 VL이 도 2에 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체 또는 항체의 VH가 도 1에 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 인간화 항체로서는, 본 발명의 모노클로날 항체와 경합하여, 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 인간 FOLR1에 존재하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 인간화 항체를 들 수 있다.
인간 항체는 원래 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하는데, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리(phage library) 및 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 항체는, 예를 들어 인간 말초혈 림프구를 단리하고, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화하고, 클로닝함으로써, 해당 항체를 생산하는 림프구를 배양할 수 있고, 배양 상청 중으로부터 해당 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는 인간 B 세포로부터 제조한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 해당 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합활성을 지표로서 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 표면에 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 해당 항체 단편은 또한 유전자 공학적 방법에 의해 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 생산 트랜스제닉 동물은 인간 항체 유전자가 세포 내에 내장된 동물을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 해당 ES 세포를 마우스의 초기 배에 이식 후, 발생시킴으로써 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 제작할 수 있다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체는 통상의 인간 이외의 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법을 사용하고, 인간 항체 생산 하이브리도마를 취득하여, 배양함으로써 배양 상청 중에 인간 항체를 생산 축적시킴으로써 제작할 수 있다.
상술한 항체 또는 항체 단편을 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 또는 삽입되고, 또한 상술한 항체 또는 해당 항체 단편과 마찬가지인 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편도, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편에 포함된다.
결실, 부가, 치환 및/또는 삽입되는 아미노산의 수는 1개 이상이며, 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 부위 특이적 변이 도입법(문헌 [Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley&Sons(1987-1997)], [Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)], [Gene, 34, 315(1985)], [Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)]) 등의 주지의 기술에 의해, 결실, 부가, 치환 또는 삽입할 수 있는 정도의 수이다. 예를 들어, 바람직하게는 1 내지 수십 개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개, 특히 바람직하게는 1 내지 5개이다.
상기 항체의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실, 부가, 치환 또는 삽입되었다란, 다음과 같은 것을 나타낸다. 즉, 항체의 아미노산 서열 중에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 치환 또는 삽입이 있는 것을 의미한다. 또한, 결실, 부가, 치환 또는 삽입이 동시에 발생하는 경우도 있고, 결실, 부가, 치환 또는 삽입되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형 중 모든 경우도 있다.
천연형 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 또는 L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 바람직한 예를 나타낸다. 같은 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환가능하다.
A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
B군: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산
C군: 아스파라긴, 글루타민
D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산
E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린
F군: 세린, 트레오닌, 호모세린
G군: 페닐알라닌, 티로신
본 발명에서, 항체 단편으로서는 Fab, F(ab')2, Fab', 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V 영역(디아바디), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는 IgG를 단백질 분해 효소인 파파인으로 처리해서 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기에서 절단됨), H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디술피드 결합으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 Fab는 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체를 파파인으로 처리해서 얻을 수 있다. 또한, 해당 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab를 제조할 수도 있다.
F(ab')2는 IgG의 힌지 영역의 2개의 디술피드 결합의 하부를 단백질 분해 효소인 펩신으로 분해해서 얻어진, 2개의 Fab 영역이 힌지 부분에서 결합하여 구성된, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 단편이다.
본 발명의 F(ab')2는 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체를 펩신으로 처리해서 얻을 수 있다. 또한, 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합시켜, 제작할 수도 있다.
Fab'는 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명의 Fab'는 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 F(ab')2를 디티오트레이톨 등의 환원제로 처리해서 얻을 수 있다. 또한, 해당 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab'를 제조할 수도 있다.
scFv는 1개의 VH와 1개의 VL을 적당한 펩티드 링커(이하, P로 기재함)를 사용해서 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 scFv는 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
디아바디는 scFv가 2량체화한 항체 단편이고, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은 동일할 수도 있고, 한쪽을 다른 항원 결합 활성으로 할 수도 있다.
본 발명의 디아바디는 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 펩티드 링커의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하로 되도록 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
dsFv는 VH 및 VL 중 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 해당 시스테인 잔기 간의 디술피드 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 기지의 방법(문헌 [Protein Engineering, 7, 697(1994)])에 따라, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다.
본 발명의 dsFv는 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
CDR을 포함하는 펩티드는 VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킬 수 있다.
본 발명의 CDR을 포함하는 펩티드는 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩티드는 Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체에는, 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편에 방사성 동위원소, 저분자의 약제, 고분자의 약제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 또는 유전자 공학적으로 결합시킨 항체의 유도체를 포함한다.
본 발명에서의 항체의 유도체는 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 H쇄 또는 L쇄의 N 말단측 또는 C 말단측, 항체 또는 해당 항체 단편 중의 적당한 치환기 또는 측쇄, 나아가 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편 중의 당쇄 등에, 방사성 동위원소, 저분자의 약제, 고분자의 약제, 면역 촉매제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 방법(문헌 [항체 공학 입문, 지진쇼칸(1994)])에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 DNA와, 결합시키고 싶은 단백질 또는 항체 의약을 코딩하는 DNA를 연결시켜서 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하여 발현시키는 유전자 공학적 방법으로 제조할 수 있다.
방사성 동위원소로서는, 예를 들어 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등을 들 수 있다. 방사성 동위원소는 클로라민 T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위원소를 킬레이트 하는 물질을 항체에 결합시켜도 된다. 킬레이트제로서는 1-이소티오시아네이트 벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA) 등을 들 수 있다.
저분자의 약제로서는, 예를 들어 알킬화제, 니트로소우레아제, 대사 길항제, 항생 물질, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제(topoisomerase) 저해제, 호르몬요법제, 호르몬 길항제, 아로마타아제 저해제, P당단백 저해제, 백금 착체 유도체, M기 저해제 또는 키나아제 저해제 등의 항암제(문헌 [임상종양학, 암과 화학요법사 (1996)]), 또는 히드로코르티손, 프레드니존 등의 스테로이드제, 아스피린, 인도메타신 등의 비스테로이드제, 금 티오말레이트, 페니실라민 등의 면역 조절제, 사이클로포스파미드, 아자티오프린 등의 면역 억제제, 말레산 클로르페니라민 또는 클레마스틴과 같은 항히스타민제 등의 항염증제(문헌 [염증과 항염증요법, 이시야꾸 슛빤 가부시끼가이샤(1982)]) 등을 들 수 있다.
항암제로서는, 예를 들어 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소 머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 겜시타빈(겜자르), 다우노루비신, 프로카르바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 다우노마이신, 페플로마이신, 에스트라무스틴, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소텔), 알데스류킨, 아스파라기나아제, 부술판, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 클라드리빈, 캄토테신, 10-히드록시-7-에틸-캄토테신(SN38), 플록스우리딘, 플루다라빈, 히드록시 우레아, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸(CPT-11), 노기테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토 퓨린, 히드록시 카르바미드, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 타목시펜, 고세렐린, 류프롤레닌, 플루타미드, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실머스타드, 비노렐빈, 클로람부실, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸 프레드니솔론, 빈데신, 니무스틴, 세무스틴, 카페시타빈, 토뮤덱스, 아자시티딘, UFT, 옥살로플라틴, 게피티니브(이렛사), 이마티니브(STI571), 에를로티니브, FMS-like-tyrosine kinase 3(Flt3) 저해제, Vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR) 저해제, fibroblast growth factor receptor(FGFR) 저해제, 타세바 등의 epidermal growth factor receptor(EGFR) 저해제, 라디시콜, 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 라파마이신, 암사크린, 올-트랜스 레티노산, 탈리도마이드, 파드로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 금 티오말레이트, D-페니실라민, 부실라민, 아자티오프린, 미조리빈, 시클로스포린, 히드로코르티손, 벡사로텐(타그레틴), 덱사메타손, 프로게스틴류, 에스트로겐류, 아나스트로졸(아리미덱스), 류프린, 아스피린, 인도메타신, 셀레콕시브, 말레산 클로르페니라민, 클로르페니라민, 클레마스틴, 트레티노인, 비소, 보르테조밉, 알로푸리놀, 칼리케아마이신, 이브리투모맵 튜세탄, 타르그레틴, 오조가민, 클래리트로마이신, 류코보린, 이포스파미드, 케토코나졸, 아미노글루테티미드, 수라민, 마이탄시노이드, 또는 그의 유도체 등을 들 수 있다.
저분자의 약제와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어 글루타르알데히드를 통해 약제와 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법, 또는 수용성 카르보디이미드를 통해 약제의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
고분자의 약제로서는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(이하, PEG로 기재함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌 말레산 공중합체, 폴리비닐 피롤리돈, 피란 공중합체 또는 히드록시프로필 메타크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들 고분자 화합물을 항체 또는 항체 단편에 결합시킴으로써, (1) 화학적, 물리적 또는 생물적인 여러 가지 인자에 대한 안정성의 향상, (2) 혈중 반감기의 현저한 연장, (3) 면역원성의 소실 또는 항체 생산의 억제 등의 효과가 기대된다(문헌 [바이오 콘쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐(1993)]). 예를 들어, PEG와 항체를 결합시키는 방법으로서는 PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다(문헌 [바이오 콘쥬게이트의약품, 히로카와 쇼텐(1993)]). PEG화 수식 시약으로서는 리신의 e-아미노기에의 수식제(일본 특허 공개 (소)61-178926호 공보), 아스파라긴산 및 글루탐산의 카르복실기에의 수식제(일본 특허 공개 (소)56-23587호 공보), 또는 아르기닌의 구아니디노기에의 수식제(일본 특허 공개 (평)2-117920호 공보) 등을 들 수 있다.
면역 촉매제로서는, 예를 들어 면역 보조제로서 알려져 있는 천연물이어도 되고, 구체예로서는 면역을 항진하는 약제가 β(1→3)글루칸(렌티난, 시조피란), 또는 α갈락토실 세라마이드 등을 들 수 있다.
단백질로서는, NK세포, 매크로파지, 또는 호중구 등의 면역 담당 세포를 활성화하는 사이토카인 또는 증식인자, 또는 독소 단백질 등을 들 수 있다.
사이토카인 또는 증식인자로서는, 예를 들어 IFNα, IFNβ, IFNγ, 인터류킨(이하, IL로 기재함)-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 또는 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 등을 들 수 있다.
독소 단백질로서는, 예를 들어 리신, 디프테리아톡신 또는 ONTAK 등을 들 수 있고, 독성을 조절하기 위해서 단백질에 변이를 도입한 단백 독소도 포함된다.
항체 의약으로서는 항체의 결합에 의해 아포토시스(apoptosis)가 유도되는 항원, 종양의 병태 형성에 관계되는 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항원, 병변 부위의 혈관 신생에 관여하는 항원에 대한 항체를 들 수 있다.
항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원으로서는, 예를 들어 분화 클러스터(Cluster of differentiation)(이하, CD로 기재함)19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen)(HLA)-Class II, 또는 표피 생장 인자 수용체(Epidermal growth Factor Receptor)(EGFR) 등을 들 수 있다.
종양의 병태 형성에 관계되는 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항원으로서는, 예를 들어 CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3 또는 B7-H4), B7 패밀리 분자의 리간드(CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 또는 BTLA), OX-40, OX-40 리간드, CD137, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)(TNF) 수용체 패밀리 분자(DR4, DR5, TNFR1 또는 TNFR2), TNF-관련 아포토시스-유도 리간드 수용체(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor)(TRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 또는 TRAIL-R4), 핵 인자 카파 B의 수용체 활성제(receptor activator of nuclear factor kappa B)(RANK), RANK 리간드, CD-25, 엽산 수용체 4, 사이토카인[IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, 형질전환 생장 인자(transforming growth factor)(TGF)β 또는 TNFα 등], 이들 사이토카인의 수용체, 케모카인(SLC, ELC, I-309, TARC, MDC 또는 CTACK 등), 또는 이들 케모카인의 수용체를 들 수 있다.
병변 부위의 혈관 신생을 저해하는 항원으로서는, 예를 들어 혈관 표피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)(VEGF), 안지오포이에틴(Angiopoietin), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor)(FGF), EGF, 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor)(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor)(IGF), 에리트로포이에틴(erythropoietin)(EPO), TGFβ, IL-8, 에필린(Ephilin), SDF-1, 또는 이들의 수용체 등을 들 수 있다.
단백질 또는 항체 의약과의 융합 항체는 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 cDNA에 단백질을 코딩하는 cDNA를 연결시켜, 융합 항체를 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜, 융합 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서의 항체의 유도체를, 인간 FOLR1의 면역학적 검출 또는 측정, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 진단에 사용하는 경우에는, 본 발명의 인간 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 또한 결합하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 H쇄 또는 L쇄의 N 말단측 또는 C 말단측, 항체 또는 해당 항체 단편 중의 적당한 치환기 또는 측쇄, 나아가 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편 중의 당쇄 등에 결합시키는 약제로서, 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에서 사용되는 표지체를 선택할 수도 있다.
표지체로서는, 예를 들어 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제 또는 루시페라아제 등의 효소, 아크리디늄 에스테르 또는 로핀 등의 발광 물질, 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 치료약에 관한 것이다.
FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환으로서는, FOLR1이 발현하고 있는 세포가 관여하는 질환이면 어떠한 것이라도 되고, 예를 들어 암을 들 수 있다.
암으로서는, 예를 들어 혈액암, 유방암, 자궁암, 대장암, 식도암, 위암, 난소암, 폐암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 자궁경부암, 소장암, 전립선암, 중피종 또는 췌장암 등을 들 수 있고, 바람직하게는 난소암, 신장암, 폐암, 유방암, 췌장암 또는 중피종을 들 수 있다.
본 발명의 치료약으로서는, 상술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 유효 성분으로서 함유한다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료약은, 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 혼합하고, 제제학의 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는 치료 시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥 내 투여를 들 수 있다.
투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
투여량 또는 투여 횟수는 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령 및 체중 등에 따라 상이한데, 통상 성인 1일당 10μg/kg 내지 10mg/kg이다.
본 발명의 치료약은 단독으로 사용해도 되고, 상술한 방사성 동위원소, 저분자의 약제, 고분자의 약제, 단백질 또는 항체 의약 중 적어도 하나의 치료약을 병용해도 된다. 본 발명의 치료약과 그 밖의 치료약과의 병용 방법으로서는, 본 발명의 치료약과 병용되는 치료약이 본 발명의 치료약과 동시에 투여되어도 되고, 연속적으로 투여되어도 된다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하는 인간 FOLR1 또는 인간 FOLR1 양성 세포의 면역학적 검출 또는 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명에서의 면역학적 검출 또는 측정 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. FOLR1의 면역학적 검출 또는 측정 방법으로서는, 구체적으로는 방사성 물질 표지 면역 항체법(RIA), 효소 면역 측정법(EIA 또는 ELISA), 형광 면역 측정법(FIA), 발광 면역 측정법(luminescent immunoassay), 웨스턴 블로트법, 면역 침강법, 형광 세포 염색법, 면역 조직 염색법 또는 물리화학적 방법 등에 의해, FOLR1 또는 FOLR1 양성 세포를 검출 또는 측정하는 방법을 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 인간 FOLR1 양성 세포를 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 진단 방법에 관한 것이다.
FOLR1 양성 세포를 검출 또는 측정하기 위해서는, 상술한 공지된 면역학적 검출법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 면역 침강법, 형광 세포 염색법 또는 면역 조직 염색법 등이 사용된다. 또한, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오시스템사제) 등의 형광 항체 염색법 등도 사용할 수 있다.
본 발명에서 FOLR1 양성 세포를 검출 또는 측정하는 대상이 되는 생체 시료로서는 조직 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌액, 소변, 분변, 조직액 또는 배양액 등, FOLR1이 발현한 세포를 포함할 가능성이 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서의, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 진단 방법으로서는, 예를 들어 검출 또는 측정 대상으로 한 생체시료에서 관측된 FOLR1 양성 세포수를, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환으로 진단하는 지표로 하는 방법을 들 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 진단약에 관한 것이다.
본 발명의 진단약으로서는 상술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 유효 성분으로서 함유한다.
본 발명의 진단약은 목적으로 하는 진단법에 따라, 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약, 해당 반응의 검출용 시약을 포함해도 된다. 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약으로서는 완충제, 염 등을 들 수 있다. 검출용 시약으로서는 해당 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 인식하는 표지된 2차 항체, 또는 표지에 대응한 기질 등, 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에 사용되는 시약을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 항체의 제조 방법, 질환의 치료 방법 및 질환의 진단 방법에 대해서 구체적으로 설명한다.
1. 모노클로날 항체의 제조 방법
(1) 항원의 제조
항원이 되는 FOLR1 또는 FOLR1을 발현시킨 세포는 FOLR1 전체 길이 또는 그의 부분 길이를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입함으로써 얻을 수 있다. 또한, FOLR1을 다량으로 발현하고 있는 각종 인간 종양 배양 세포, 인간 조직 등으로부터 FOLR1을 정제하여 얻을 수 있다. 또한, 해당 종양 배양 세포 또는 해당 조직 등을 그대로 항원으로서 사용할 수도 있다. 또한, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 FOLR1의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드를 제조하여, 항원으로 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 FOLR1은 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 또는 [Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley&Sons(1987-1997)] 등에 기재된 방법 등을 사용하고, 예를 들어 이하의 방법에 의해, 해당 FOLR1을 코딩하는 DNA를 숙주 세포 중에서 발현시켜 제조할 수 있다.
먼저, FOLR1을 코딩하는 부분을 포함하는 완전 길이 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 발현 벡터를 제작한다. 상기 완전 길이 cDNA 대신에 완전 길이 cDNA를 바탕으로 해서 제조된, 폴리펩티드를 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 사용해도 된다. 이어서, 얻어진 해당 발현 벡터를, 해당 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 폴리펩티드를 생산하는 형질전환체를 얻을 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포에서의 자율 복제 또는 염색체 중으로의 내장이 가능하고, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에, 적당한 프로모터를 함유하고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
숙주 세포로서는 대장균 등의 에스케리키아 속 등에 속하는 미생물, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
대장균 등의 원핵생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우, 발현 벡터는 원핵생물 중에서 자율 복제가 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 배열, FOLR1을 코딩하는 부분을 포함하는 DNA, 및 전사 종결 배열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 해당 발현 벡터에는, 전사 종결 배열은 반드시 필요한 것은 아니지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 배열을 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 해당 발현 벡터에는 프로모터를 제어하는 유전자를 포함하고 있어도 된다.
해당 발현 벡터로서는 리보솜 결합 배열인 샤인·달가르노 배열(Shine·Dalgarno sequence)(SD 배열이라고도 함)과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예를 들어, 6 내지 18 염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 해당 FOLR1을 코딩하는 DNA의 염기 서열로서는, 숙주 내에서의 발현에 최적인 코돈(codon)이 되도록 염기를 치환할 수 있고, 이것에 의해 목적으로 하는 FOLR1의 생산율을 향상시킬 수 있다.
발현 벡터로서는 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(이상, 로슈·다이아그노스틱스(Roche·diagnostics)사제), pKK233-2(파마시아(Pharmacia)사제), pSE280(인비트로젠사제), pGEMEX-1(프로메가사제), pQE-8(퀴아젠사제), pKYP10(일본 특허 공개 (소)58-110600호 공보), pKYP200(문헌 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)]), pLSA1(문헌 [Agric Biol.Chem., 53, 277(1989)]), pGEL1(문헌 [Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, 4306(1985)]), pBluescript II SK(-)(스트라타진사제), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 제조], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 제조], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로부터 제조, 일본 특허 공개 (소)60-221091호 공보], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP6798)로부터 제조, 일본 특허 공개 (소)60-221091호 공보], pTerm2(US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400(문헌 [J. Bacteriol., 172, 2392(1990)]), pGEX(파마시아사제), pET 시스템(노바젠사제) 또는 pME18SFL3 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, trp프로모터(Ptrp), lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터 또는 T7프로모터 등의, 대장균 또는 파지 등에서 유래되는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac프로모터, lacT7프로모터 또는 let I프로모터 등의 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 예를 들어 대장균 XL-1Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No. 49, 대장균 W3110, 대장균 NY49 또는 대장균 DH5α 등을 들 수 있다.
숙주 세포에의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 사용하는 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)], [Gene, 17, 107(1982)], [Molecular&General Genetics, 168, 111(1979)])을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 발현 벡터로서는 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어 pcDNA I, pcDM8(후나코시사제), pAGE107(일본 특허 공개 (평)3-22979호 공보; 문헌 [Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 (평)2-227075호 공보), pcDM8(문헌 [Nature, 329, 840(1987)]), pcDNA I/Amp(인비트로젠사제), pcDNA 3.1(인비트로젠사제), pREP4(인비트로젠사제), pAGE103(문헌 [J. Biochemistry, 101, 1307(1987)]), pAGE210, pME18SFL3, 또는 pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 전초기(immediate early)(IE) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα프로모터, 또는 모로니 마우스 백혈병 바이러스의 프로모터 또는 인핸서를 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주 세포로서는, 예를 들어 인간 백혈병 세포 Namalwa 세포, 원숭이 세포 COS세포, 차이니즈·햄스터 난소 세포 CHO 세포(문헌 [Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958)]; [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968)]; [Genetics, 55, 513(1968)]; [Chromosoma, 41, 129(1973)]; [Methods in Cell Science, 18, 115(1996)]; [Radiation Research, 148, 260(1997)]; [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)]; [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968)]; [Cell, 6, 121(1975)]; [Molecular Cellgenetics, Appendix I, II(pp.883-900)]), CHO/DG44, CHO-K1(ATCC 번호: CCL-61), DUkXB11(ATCC 번호: CCL-9096), Pro-5(ATCC 번호: CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat#11619), Pro-3, 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NS0, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14, 시리안 햄스터 세포 BHK 또는 HBT5637(일본 특허 공개 (소)63-000299호 공보) 등을 들 수 있다.
숙주 세포에의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션법(문헌 [Cytotechnology, 3, 133(1990)]), 인산칼슘법(일본 특허 공개 (평)2-227075호 공보), 또는 리포펙션법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)]) 등을 들 수 있다.
이상과 같이 해서 얻어지는 FOLR1을 코딩하는 DNA를 내장한 발현 벡터를 보유하는 미생물, 또는 동물 세포 등에서 유래되는 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 해당 FOLR1을 생성 축적시켜 해당 배양물로부터 채취함으로써, FOLR1을 제조할 수 있다. 해당 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
진핵생물 유래의 세포에서 발현시켰을 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가 된 FOLR1을 얻을 수 있다.
유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양하는 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양하는 경우에는 인돌 아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 예를 들어 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지(문헌 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)]), Eagle의 MEM 배지(문헌 [Science, 122, 501(1952)]), 둘베코 개변 MEM 배지(문헌 [Virology, 8, 396(1959)]), 199 배지(문헌 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)]), 이스코브 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM) 배지, 또는 이들 배지에 소태아 혈청(FBS) 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은 통상 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃, 5% CO2 존재 하 등의 조건하에서 1 내지 7일간 행한다. 또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신 또는 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
FOLR1을 코딩하는 유전자의 발현 방법으로서는 직접 발현 이외에, 분비 생산 또는 융합 단백질 발현 등의 방법(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)])을 사용할 수 있다.
FOLR1의 생산 방법으로서는 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외에 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외 막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주 세포, 또는 생산시키는 FOLR1의 구조를 바꿈으로써, 적절한 방법을 선택할 수 있다.
FOLR1이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외 막 상에 생산된 경우, 폴슨들의 방법(문헌 [J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)]), 로우들의 방법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989)], [Genes Develop., 4, 1288(1990)]), 일본 특허 공개 (평)05-336963호 공보 또는 국제 공개 제94/23021호 등에 기재된 방법을 사용함으로써, FOLR1을 숙주 세포 외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 디히드로엽산 환원효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계(일본 특허 공개 (평)2-227075호 공보)를 이용해서 FOLR1의 생산량을 상승시킬 수도 있다.
얻어진 FOLR1은, 예를 들어 이하와 같이 해서 단리, 정제할 수 있다.
FOLR1이 세포 내에 용해 상태로 발현한 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨톤가우린 호모게나이저 또는 다이노 밀 등을 사용해서 세포를 파쇄하여, 무 세포 추출액을 얻는다.
상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 단백질의 단리 정제법, 즉 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쯔비시 가가꾸사제) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(파마시아사제) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸 세파로스, 페닐 세파로스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 또는 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 방법을 단독 또는 조합해서 사용하여, 정제 표품을 얻을 수 있다.
FOLR1이 세포 내에 불용체를 형성해서 발현한 경우에는, 상기와 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하여, 원심 분리를 행함으로써, 침전 획분으로서 해당 FOLR1의 불용체를 회수한다. 회수한 해당 FOLR1의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 해당 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 해당 FOLR1을 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 마찬가지의 단리 정제법에 의해 폴리펩티드의 정제 표품을 얻을 수 있다.
FOLR1 또는 그의 당 수식체 등의 유도체가 세포 외로 분비되었을 경우에는, 배양 상청에서 해당 FOLR1 또는 그의 당 수식체 등의 유도체를 회수할 수 있다. 해당 배양물을 상기와 마찬가지로 원심 분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 가용성 획분을 취득하고, 해당 가용성 획분으로부터, 상기와 마찬가지의 단리 정제법을 사용함으로써, 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 FOLR1은 Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스드 캠텍사제, 퍼킨·엘머사제, 파르마시아(Parmacia)사제, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사제, 신디사이저 셀-베가사제, 퍼셉티브사제, 또는 시마즈 세이사꾸쇼사제 등의 펩티드 합성기를 이용해서 화학 합성할 수도 있다.
(2) 동물의 면역과 융합용 항체 생산 세포의 제조
3 내지 20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터 등의 동물에, (1)에서 얻어지는 항원을 면역하여, 그 동물의 비(脾), 림프절, 말초혈 중의 항체 생산 세포를 채취한다. 또한, 면역원성이 낮아 상기 동물에서 충분한 항체값의 상승이 인정되지 않을 경우에는, FOLR1 녹아웃 마우스를 피면역 동물로서 사용할 수도 있다.
면역은 동물의 피하, 정맥 내 또는 복강 내에, 예를 들어 프로인드의 완전 보조제, 또는 수산화알루미늄 겔과 백일해균 백신 등의 적당한 보조제와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA(소 혈청 알부민), 또는 KLH(키홀 림펫 헤모사이아닌; Keyhole Limpet Hemocyanin) 등의 캐리어 단백질과 콘쥬게이트를 제작하고, 이것을 면역원으로서 사용한다.
항원의 투여는 1회째의 투여 후, 1 내지 2주 간격으로 5 내지 10회 행한다. 각 투여 후 3 내지 7일째에 안와정맥총(venous plexus in ocular fundus)으로부터 채혈하고, 그의 혈청의 항체값을 효소 면역 측정법(문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]) 등을 사용하여 측정한다. 면역에 사용한 항원에 대하여 그의 혈청이 충분한 항체값을 나타낸 동물을 융합용 항체 생산 세포의 공급원으로 한다.
항원의 최종 투여 후 3 내지 7일째에, 면역한 동물로부터 비장 등의 항체 생산 세포를 함유하는 조직을 적출하여, 항체 생산 세포를 채취한다. 비장 세포를 사용하는 경우에는, 비장을 가늘게 절단하여, 풀어준 후, 원심 분리하고, 또한 적혈구를 제거해서 융합용 항체 생산 세포를 취득한다.
(3) 골수종 세포의 제조
골수종 세포로서는 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 사용하고, 예를 들어 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(문헌 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)]), P3-NS1/1Ag41(NS-1)(문헌 [European J.Immunology, 6, 511(1976)]), SP2/0-Ag14(SP-2)(문헌 [Nature, 276, 269(1978)]), P3-X63-Ag8653(653)(문헌 [J.Immunology, 123, 1548(1979)]), 또는 P3-X63-Ag8(X63)(문헌 [Nature, 256, 495(1975)]) 등을 사용한다.
해당 골수종 세포는 정상 배지[글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타마이신, FBS 및 8-아자구아닌을 첨가한 RPMI1640 배지]로 계대하고, 세포융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지에 계대하고, 융합 당일 2×107개 이상의 세포수를 확보한다.
(4) 세포융합과 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 제조
(2)에서 얻어지는 융합용 항체 생산 세포와 (3)에서 얻어지는 골수종 세포를 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium)(MEM) 배지 또는 PBS(인산2나트륨 1.83g, 인산1칼륨 0.21g, 식염 7.65g, 증류수 1리터, pH 7.2)로 잘 세정하고, 세포수가 융합용 항체생산 세포:골수종 세포=5 내지 10:1이 되도록 혼합하여, 원심 분리한 후, 상청을 제거한다.
침전된 세포군을 잘 풀어준 후, 폴리에틸렌 글리콜-1000(PEG-1000), MEM 배지 및 디메틸 술폭시드의 혼합액을 37℃에서 교반하면서 가한다. 또한, 1 내지 2분간마다 MEM 배지 1 내지 2mL를 수회 가한 후, MEM 배지를 가해서 전량이 50mL가 되도록 한다. 원심 분리 후, 상청을 제거하다. 침전된 세포군을 완만하게 풀어준 후, 융합용 항체 생산 세포에 HAT 배지[히포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린을 가한 정상 배지] 중에 완만하게 세포를 현탁한다. 이 현탁액을 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 7 내지 14일간 배양한다.
배양 후, 배양 상청의 일부를 빼내어, 후술하는 바인딩 분석 등의 하이브리도마의 선택 방법에 의해, FOLR1을 포함하는 항원에 반응하고, FOLR1을 포함하지 않는 항원에 반응하지 않는 세포군을 선택한다. 이어서, 한계 희석법에 의해 클로닝을 2회 반복하고[1회째는 HT 배지(HAT 배지로부터 아미노프테린을 제외한 배지), 2회째는 정상 배지를 사용함], 안정되어서 강한 항체값이 인정된 것을 모노클로날 항체 생산 하이브리도마로서 선택한다.
(5) 정제 모노클로날 항체의 제조
프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane) 0.5mL를 복강 내 투여하고, 2주간 사육함]한 8 내지 10주령의 마우스 또는 누드마우스에, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 복강 내에 주사한다. 10 내지 21일에 하이브리도마는 복수 암화된다. 이 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심 분리해서 고형분을 제거 후, 40 내지 50% 황산암모늄으로 염석하고, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 칼럼, 단백질 A-칼럼 또는 겔 여과 칼럼에 의한 정제를 행하고, IgG 또는 IgM 획분을 모아, 정제 모노클로날 항체로 한다.
또한, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를, 10% FBS 첨가를 첨가한 RPMI1640 배지 등에서 배양한 후, 원심 분리에 의해 상청을 제거하고, 하이브리도마-SFM 배지에 현탁하여, 3 내지 7일간 배양한다. 얻어진 세포 현탁액을 원심 분리하고, 얻어진 상청으로부터 단백질 A-칼럼 또는 단백질 G-칼럼에 의한 정제를 행하고, IgG 획분을 모아, 정제 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 또한, 하이브리도마-SFM 배지에는 5% 다이고 GF21을 첨가할 수도 있다.
항체의 서브클래스의 결정은 서브클래스 타이핑 키트를 사용해서 효소 면역 측정법에 의해 행한다. 단백량의 정량은 로리법 또는 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.
(6) 모노클로날 항체의 선택
모노클로날 항체의 선택은 이하에 나타내는 효소 면역 측정법에 의한 바인딩 분석 및 Biacore에 의한 kinetics 해석에 의해 행한다.
(6-a) 바인딩 분석
항원으로서는, (1)에서 얻어지는 FOLR1을 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입해서 얻어진 유전자 도입 세포, 리콤비넌트 단백질, 또는 인간 조직으로부터 얻은 정제 폴리펩티드 또는 부분 펩티드 등을 사용한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA 또는 KLH 등의 캐리어 단백질과 콘쥬게이트를 제작하여 이것을 사용한다.
항원을 96웰 플레이트 등의 플레이트에 분주하고, 고상화한 후, 제1 항체로서 혈청, 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 분주하여 반응시킨다. PBS 또는 PBS-Tween 등으로 잘 세정한 후, 제2 항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항 이뮤노글로블린 항체를 분주해서 반응시킨다. PBS-Tween으로 잘 세정한 후, 제2 항체의 표지 물질에 따른 반응을 행하고, 면역원에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 선택한다.
또한, 본 발명의 항 FOLR1 모노클로날 항체와 경합해서 FOLR1에 결합하는 모노클로날 항체는 상술한 바인딩 분석계에, 피검 항체를 첨가해서 반응시킴으로써 취득할 수 있다. 즉, 피검 항체를 가했을 때에 모노클로날 항체의 결합이 저해되는 항체를 스크리닝함으로써, FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조에의 결합에 대해서, 취득한 모노클로날 항체와 경합하는 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 FOLR1의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조에 결합하는 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프와, 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 상술한 바인딩 분석계로 취득된 항체의 에피토프를 동정하고, 동정한 에피토프의, 부분적인 합성 펩티드, 또는 에피토프의 입체 구조에 의태시킨 합성 펩티드 등을 제작하고, 면역함으로써 취득할 수 있다.
(6-b) Biacore에 의한 kinetics 해석
Biacore T100을 사용하고, 항원과 피검물 간의 결합에서의 kinetics를 측정하고, 그 결과를 기기 부속의 해석 소프트웨어로 해석을 한다. 항 마우스 IgG 항체를 센서 칩 CM5에 아민 커플링법에 의해 고정한 후, 하이브리도마 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 흘려, 적당량 결합시키고, 또한 농도 기지의 복수 농도의 항원을 흘리고, 결합, 해리를 측정한다. 얻어진 데이터를 기기 부속의 소프트웨어를 사용하고, 1:1 바인딩 모델에 의해 kinetics 해석을 행하여, 각종 파라미터를 취득한다.
또는, 인간 FOLR1을 센서 칩 상에, 예를 들어 아민 커플링법에 의해 고정한 후, 농도 기지의 복수 농도의 정제 모노클로날 항체를 흘리고, 결합, 해리를 측정한다. 얻어진 데이터를 기기 부속의 소프트웨어를 사용하고, 바이밸런트 바인딩 모델(bivalent binding model)에 의해 kinetics 해석을 행하여, 각종 파라미터를 취득한다.
2. 유전자 재조합 항체의 제작
유전자 재조합 항체의 제작예로서, 이하에 인간형 키메라 항체 및 인간형 CDR 이식 항체의 제작 방법을 나타낸다.
(1) 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 구축
유전자 재조합 항체 발현용 벡터는 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA가 내장된 동물 세포용 발현 벡터이며, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 γ1 서브클래스의 CH 및 κ 클래스의 CL 등을 사용한다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA에는 cDNA를 사용하는데, 엑손과 인트론을 포함하는 염색체 DNA를 사용할 수도 있다.
동물 세포용 발현 벡터에는 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자를 내장 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107(문헌 [Cytotechnol., 3, 133(1990)]), pAGE103(문헌 [J. Biochem., 101, 1307(1987)]), pHSG274(문헌 [Gene, 27, 223(1984)]), pKCR(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)]), pSG1bd2-4(문헌 [Cytotechnol., 4, 173(1990)]), 또는 pSE1UK1Sed1-3(문헌 [Cytotechnol., 13, 79(1993)]) 등을 사용한다.
동물 세포용 발현 벡터 중 프로모터와 인핸서에는 SV40의 초기 프로모터(문헌 [J. Biochem., 101, 1307(1987)]), 모로니 마우스 백혈병 바이러스 LTR(문헌 [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)]), 또는 면역 글로불린 H쇄의 프로모터(문헌 [Cell, 41, 479(1985)])와 인핸서(문헌 [Cell, 33, 717(1983)]) 등을 사용한다.
유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, 유전자 재조합 항체 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포에의 도입의 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형잡힘 등의 점에서, 항체 H쇄 및 L쇄가 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터(문헌 [J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)])를 사용하는데, 항체 H쇄 및 L쇄가 별도의 벡터 상에 존재하는 타입을 사용할 수도 있다. 탠덤형의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호 공보), pEE18(문헌 [Hybridoma, 17, 559(1998)]) 등을 사용한다.
(2) 인간 이외의 동물 유래의 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석
비인간 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석은 이하와 같이 해서 행할 수 있다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하여, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝해서 cDNA 라이브러리를 제작한다.
상기 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 코딩하는 DNA를 프로브로서 사용하고, VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적으로 하는 마우스 항체의 VH 또는 VL의 전체 염기 서열을 각각 결정하고, 염기 서열로부터 VH 또는 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정한다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제작하는 인간 이외의 동물에는 마우스, 래트, 햄스터 또는 래빗 등을 사용하는데, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 동물도 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터의 전체 RNA의 제조에는, 티오시안산 구아니딘-트리플루오로아세트산 세슘법(문헌 [Methods in Enzymol., 154, 3(1987)]), 또는 RNA 이지 키트(easy kit)(퀴아젠사제) 등의 키트 등을 사용한다.
전체 RNA로부터의 mRNA의 제조에는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]), 또는 Oligo-dT30<Super>mRNA 퓨리피케이션 키트(Purification Kit)(다카라 바이오사제) 등의 키트 등을 사용한다. 또한, 패스트 트랙 엠알엔에이 아이솔레이션 키트(Fast Track mRNA Isolation Kit)(인비트로젠사제), 또는 퀵프레프 엠알엔에이 퓨리피케이션 키트(QuickPrep mRNA Purification Kit)(파마시아사제) 등의 키트를 사용해서 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 제조할 수도 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제작에는, 공지된 방법(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1, John Wiley&Sons(1987-1997)]), cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝용 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템(Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning)(인비트로젠사제), 또는 ZAP-cDNA 신더시스 키트(Synthesis Kit)(스트라타진사제) 등의 키트 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리의 제작 시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로서 합성한 cDNA를 내장하는 벡터에는, 해당 cDNA를 내장시킬 수 있는 벡터이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP ExPress(문헌 [Strategies, 5, 58(1992)]), pBluescript II SK(+)(문헌 [Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)]), λZAPII(스트라타진사제), λgt10, λgt11(문헌 [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49(1985)]), Lambda BlueMid(클론테크사제), λEx Cell, pT7T3-18U(파마시아사제), pcD2(문헌 [Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)]), 또는 pUC18(문헌 [Gene, 33, 103(1985)]) 등을 사용한다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균에는, 해당 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL-1Blue MRF(문헌 [Strategies, 5, 81(1992)]), C600(문헌 [Genetics, 39, 440(1954)]), Y1088, Y1090(문헌 [Science, 222, 778(1983)]), NM522(문헌 [J. Mol. Biol., 166, 1(1983)]), K802(문헌 [J. Mol. Biol., 16, 118(1966)]), 또는 JM105(문헌 [Gene, 38, 275(1985)]) 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA 클론의 선택에는, 동위원소 또는 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니·하이브리다이제이션법, 또는 플라크·하이브리다이제이션법(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]) 등을 사용한다.
또한, 프라이머를 제조하고, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)법(이하, PCR법이라 기재함, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1, John Wiley&Sons(1987-1997)])을 행함으로써 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 제조할 수도 있다.
선택된 cDNA를, 적당한 제한 효소 등으로 절단 후, pBluescript SK(-)(스트라타진사제) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법 등에 의해 해당 cDNA의 염기 서열을 결정한다. 염기 서열 해석 방법에는, 예를 들어 디데옥시법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 74, 5463(1977)]) 등의 반응을 행한 후, ABI PRISM3700(PE 바이오시스템즈사제) 또는 A. L. F. DNA시퀀서(파마시아사제) 등의 염기 서열 자동 분석장치 등을 사용한다.
결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(문헌 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 각각 확인한다.
분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 대해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(문헌 [A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가 그것들이 속하는 서브 그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열(문헌 [A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써 발견할 수 있다.
또한, 얻어진 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 사용해서, 예를 들어 SWISS-PROT 또는 PIR-Protein 등의 임의의 데이터베이스에 대하여 BLAST법(문헌 [J.Mol.Biol., 215, 403(1990)]) 등의 상동성 검색을 행하여, VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열이 신규한 것인지를 확인할 수 있다.
(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 각각 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝함으로써 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA의 3' 말단측과, 인간 항체의 CH 또는 CL의 5' 말단측을 연결하기 위해서, 연결 부분의 염기 서열이 적절한 아미노산을 코딩하고, 또한 적당한 제한 효소 인식 서열이 되도록 설계한 VH 및 VL의 cDNA를 제작한다.
제작된 VH 및 VL의 cDNA를, (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝하고, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축한다.
또한, 비인간 항체 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를, 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA를 사용해서 PCR법에 의해 각각 증폭하고, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수도 있다.
(4) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축
인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA는 이하와 같이 해서 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하는 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열을 각각 선택한다. 선택하는 FR의 아미노산 서열에는, 인간 항체에서 유래되는 것이면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
예를 들어, 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 FR의 아미노산 서열, 또는 인간 항체의 FR의 각 서브 그룹의 공통 아미노산 서열(문헌 [A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]) 등을 사용한다. 항체의 결합 활성의 저하를 억제하기 위해서, 원래의 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)의 FR의 아미노산 서열을 선택한다.
이어서, 선택한 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열에, 원래의 항체의 CDR의 아미노산 서열을 각각 이식하고, 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 각각 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 보이는 코돈(codon)의 사용 빈도(문헌 [A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)])를 고려해서 DNA 서열로 변환하고, 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 각각 설계한다.
설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이를 포함하는 몇 개의 합성 DNA를 합성하고, 그것들을 사용해서 PCR 반응을 행한다. 이 경우, PCR 반응에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, 바람직하게는 H쇄, L쇄와 함께 6개의 합성 DNA를 설계한다.
또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터에 용이하게 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 수 있다.
또는, 설계한 DNA 서열에 기초하여, 1개의 DNA로서 합성된 각 H쇄, L쇄 전체 길이 합성 DNA를 사용함으로써 실시할 수 있다. PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(스트라타진사제) 등의 플라스미드에 각각 클로닝하고, (2)에 기재된 방법과 마찬가지의 방법에 의해, 염기 서열을 결정하고, 원하는 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(5) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변
인간형 CDR 이식 항체는 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그의 항원 결합 활성은 원래의 비인간 항체에 비해서 저하된다(문헌 [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)]).
인간형 CDR 이식 항체에서는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기, 및 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하고, 그들의 아미노산 잔기를 원래의 비인간 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 저하된 항원 결합 활성을 상승시킬 수 있다.
항원 결합 활성에 관계되는 FR의 아미노산 잔기를 동정하기 위해서, X선 결정 해석(문헌 [J.Mol.Biol., 112, 535(1977)]) 또는 컴퓨터 모델링(문헌 [Protein Engineering, 7, 1501(1994)]) 등을 사용함으로써, 항체의 입체 구조의 구축 및 해석을 행할 수 있다. 또한, 각각의 항체에 대해서 수종의 개변체를 제작하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 것을 반복하고, 시행착오함으로써 필요한 항원 결합 활성을 갖는 개변 인간형 CDR 이식 항체를 취득할 수 있다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기는 개변용 합성 DNA를 사용해서 (4)에 기재된 PCR 반응을 행함으로써, 개변시킬 수 있다. PCR 반응 후의 증폭 산물에 대해서 (2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하고, 목적으로 하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(6) 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 구축한 유전자 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예를 들어, (4) 및 (5)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝한다.
(7) 유전자 재조합 항체의 일과성 발현
(3) 및 (6)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현 벡터, 또는 그들을 개변한 발현 벡터를 사용해서 유전자 재조합 항체의 일과성 발현을 행하고, 제작한 많은 종의 인간형 CDR 이식 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가할 수 있다.
발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포이면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있지만, 예를 들어 COS-7 세포(ATCC 번호: CRL1651)를 사용한다(문헌 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283(1991)]).
COS-7 세포에의 발현 벡터의 도입에는, DEAE-덱스트란법(문헌 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press(1991)]), 또는 리포펙션법(문헌 [Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, 7413(1987)]) 등을 사용한다.
발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)], [단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]) 등을 사용하여 측정한다.
(8) 유전자 재조합 항체를 안정하게 발현하는 형질전환주의 취득과 유전자 재조합 항체의 제조
(3) 및 (6)에서 얻어진 유전자 재조합 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 유전자 재조합 항체를 안정하게 발현하는 형질전환주를 얻을 수 있다.
숙주 세포에의 발현 벡터의 도입에는, 일렉트로포레이션법(일본 특허 공개 (평)2-257891호 공보, 문헌 [Cytotechnology, 3, 133(1990)]) 등을 사용한다.
유전자 재조합 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포이면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예를 들어, CHO-K1(ATCC 번호: CCL-61), DUkXB11(ATCC 번호: CCL-9096), Pro-5(ATCC 번호: CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat#11619), 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NS0, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호: CRL1581), 마우스 P3-X63-Ag8653 세포(ATCC 번호: CRL1580), 디히드로엽산 환원효소 유전자가 결손된 CHO 세포(문헌 [Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77, 4216(1980)]), 렉틴 내성을 획득한 Lec13(문헌 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55(1986)]), α1,6-푸코오스 전이효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호), 래트 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포(ATCC 번호: CRL1662) 등을 사용한다.
또한, 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 등의 단백질 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코오스의 1위치가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 등의 단백질, 또는 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골기체에의 수송에 관여하는 단백질 등의 활성이 저하 또는 결실된 숙주 세포, 예를 들어 α1,6-푸코오스 전이효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호) 등을 사용할 수도 있다.
발현 벡터의 도입 후, 유전자 재조합 항체를 안정하게 발현하는 형질전환주는 G418 황산염 등의 약제를 포함하는 동물 세포배양용 배지에서 배양함으로써 선택한다(일본 특허 공개 (평)2-257891호 공보).
동물 세포배양용 배지에는 RPMI1640 배지(인비트로젠사제), GIT 배지(닛폰세이야꾸사제), EX-CELL301 배지(JRH사제), IMDM 배지(인비트로젠사제), 하이브리도마-SFM 배지(인비트로젠사제), 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용한다.
얻어진 형질전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 유전자 재조합 항체를 발현 축적시킨다. 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질전환주는 DHFR 증폭계(일본 특허 공개 (평)2-257891호 공보) 등을 이용하여 유전자 재조합 항체의 발현량을 상승시킬 수 있다.
유전자 재조합 항체는 형질전환주의 배양 상청으로부터 단백질 A-칼럼을 사용하여 정제한다(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]). 또한, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등의 단백질의 정제에서 사용되는 방법을 조합할 수도 있다.
정제한 유전자 재조합 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(문헌 [Nature, 227, 680(1970)]), 또는 웨스턴 블로팅법(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]) 등을 사용하여 측정할 수 있다.
3. 정제 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 활성 평가
정제한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 활성 평가는 이하와 같이 행할 수 있다.
FOLR1 발현 세포주에 대한 결합 활성은 상술한 1. (6-a)에 기재된 바인딩 분석 및 (6-b)에 기재된 Biacore 시스템 등을 사용한 표면 플라즈몬 공명법을 사용하여 측정한다. 또한, 형광항체법(문헌 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)]) 등을 사용하여 측정할 수 있다.
항원 양성 배양 세포주에 대한 CDC 활성, 또는 ADCC 활성은 공지된 측정 방법(문헌 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)])에 의해 측정한다.
4. 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법
본 발명의 항 FOLR1 모노클로날 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법으로서는 항체의 Fc 영역의 297번째의 아스파라긴(Asn)에 결합하는 N 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 α1,6 결합하는 푸코오스(코어 푸코오스라고도 함)의 양을 제어하는 방법(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제2002/31140호, 국제 공개 제00/61739호), 또는 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 제어하는 방법 등이 알려져 있다. 본 발명의 항 FOLR1 모노클로날 항체에는 어느 방법을 사용해도, 이펙터 활성을 제어할 수 있다.
이펙터 활성이란, 항체의 Fc 영역을 통해 야기되는 항체 의존성의 활성을 말하고, ADCC 활성, CDC 활성, 또는 매크로파지 또는 수상 세포 등의 식세포에 의한 항체 의존성 파고사이토시스(Antibody-dependent phagocytosis, ADP 활성) 등이 알려져 있다.
이펙터 활성의 측정법으로서, 예를 들어 표적으로서 암세포, 이펙터로서 인간 말초혈 단핵구(PBMC), 그리고 암세포 특이적인 항체를 혼합하고, 4시간 정도 인큐베이션한 후, 세포 장애의 지표로서 유리해 온 락트산 탈수소 효소(LDH)를 측정할 수 있다. 또는, 인간 PBMC에, 예를 들어 CD20과 같은 혈액 세포 특이적인 항원을 인식하는 항체를 혼합하여, 인큐베이션한 후, 유리 LDH의 측정이나 유세포 분석에 의한 해당 세포수의 감소를 이펙터 활성으로서 측정할 수 있다. 또는, 암성 복수에 암세포 특이적인 항체를 혼합하고, 인큐베이션한 후, 유리 LDH의 측정이나 유세포 분석에 의한 해당 세포수의 감소를 이펙터 활성으로서 측정할 수 있다.
항체의 Fc의 N 결합 복합형 당쇄의 코어 푸코오스의 함량을 제어함으로써, 항체의 이펙터 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 항체의 Fc에 결합하고 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코오스의 함량을 저하시키는 방법으로서는, α1,6-푸코오스 전이효소 유전자가 결손된 CHO 세포를 사용해서 항체를 발현함으로써, 푸코오스가 결합하고 있지 않은 항체를 취득할 수 있다. 푸코오스가 결합하고 있지 않은 항체는 높은 ADCC 활성을 갖는다.
한편, 항체의 Fc에 결합하고 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코오스의 함량을 증가시키는 방법으로서는, α1,6-푸코오스 전이효소 유전자를 도입한 숙주 세포를 사용해서 항체를 발현시킴으로써, 푸코오스가 결합하고 있는 항체를 취득할 수 있다. 푸코오스가 결합하고 있는 항체는 푸코오스가 결합하고 있지 않은 항체보다도 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
또한, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0148165호 명세서에 기재된 Fc 영역의 아미노산 서열을 사용함으로써 항체의 CDC 활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 미국 특허 제6,737,056호 명세서, 미국 특허 제7,297,775호 명세서 또는 미국 특허 제7,317,091호 명세서에 기재된 아미노산 개변을 행함으로써, ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증가시킬 수도 저하시킬 수도 있다.
또한, 상술한 방법을 조합하여, 하나의 항체에 사용함으로써, 항체의 이펙터 활성이 제어된 항체를 취득할 수 있다.
5. 본 발명의 항 FOLR1 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 질환의 치료 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편은 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료약은 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 혼합하고, 제제학의 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공된다.
투여 경로로서는, 예를 들어 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내, 정맥 내, 또는 복강 내 등의 비경구 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등을 들 수 있다.
유제 또는 시럽제와 같은 액체 제조물은 물, 자당, 소르비톨 또는 과당 등의 당류, 폴리에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜 등의 글리콜류, 호마유, 올리브유 또는 대두유 등의 유류, p-히드록시벤조산 에스테르류 등의 방부제, 또는 스트로베리 플레이버 또는 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용해서 제조한다.
캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등은 유당, 포도당, 자당 또는 만니톨 등의 부형제, 전분 또는 알긴산 나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산 마그네슘 또는 탈크 등의 활택제, 폴리비닐 알코올, 히드록시프로필 셀룰로오스 또는 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면 활성제 또는 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용해서 제조한다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 주사제, 좌제 또는 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는 염 용액, 포도당 용액, 또는 그 양자의 혼합물을 포함하는 담체 등을 사용해서 제조한다.
좌제는 카카오 버터, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용해서 제조한다.
분무제는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 미세한 입자로서 분산시키고, 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용해서 제조한다. 담체로서는, 예를 들어 유당 또는 글리세린 등을 사용한다. 또한, 에어로졸 또는 드라이 파우더로서 제조할 수도 있다.
또한, 상기 비경구제에 있어서도, 경구 투여에 적당한 제제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
6. 본 발명의 항 FOLR1 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용한 질환의 진단 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, FOLR1 또는 FOLR1이 발현한 세포를 검출 또는 측정함으로써, FOLR1이 관련하는 질환을 진단할 수 있다.
FOLR1이 관련하는 질환의 하나인 암의 진단은, 예를 들어 이하와 같이 FOLR1의 검출 또는 측정하여 행할 수 있다.
환자 체내의 암 원발소, 전이소, 또는 암성 복수 중의 암세포에 발현하고 있는 FOLR1을 유세포 분석 등의 면역학적 방법을 사용해서 검출함으로써 진단을 행할 수 있다.
면역학적 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 예를 들어, 방사성 물질 표지 면역 항체법, 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 발광 면역 측정법, 웨스턴 블로트법 또는 물리화학적 방법 등을 사용한다.
방사성 물질 표지 면역 항체법은, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에, 본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 반응시키고, 또한 방사선 표지를 실시한 항 이뮤노글로블린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 신틸레이션 카운터(scintillation counter) 등으로 측정한다.
효소 면역 측정법은, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에, 본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 반응시키고, 또한 표지를 실시한 항 이뮤노글로블린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 발색 색소를 흡광 광도계로 측정한다. 예를 들어, 샌드위치 ELISA법 등을 사용한다.
효소 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는 공지(문헌 [효소 면역 측정법, 의학서원(1987)])의 효소 표지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 알칼리 포스파타아제 표지, 퍼옥시다아제 표지, 루시페라아제 표지 또는 비오틴 표지 등을 사용한다.
샌드위치 ELISA법은 고상에 항체를 결합시킨 후, 검출 또는 측정 대상인 항원을 포획시켜, 포획된 항원에 제2 항체를 반응시키는 방법이다. 해당 ELISA법에서는 검출 또는 측정하고 싶은 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편이며, 항원 인식 부위가 다른 2종류의 항체를 준비하고, 그 중, 제1 항체 또는 항체 단편을 미리 플레이트(예를 들어, 96웰 플레이트)에 흡착시키고, 다음으로 제2 항체 또는 항체 단편을 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소 또는 비오틴 등으로 표지해 둔다.
상기 항체가 흡착한 플레이트에, 생체 내에서 분리된 세포 또는 그의 파쇄액, 조직 또는 그의 파쇄액, 세포배양 상청, 혈청, 흉수, 복수, 또는 안액 등을 반응시킨 후, 표지한 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 반응시켜, 표지 물질에 따른 검출 반응을 행한다. 농도 기지의 항원을 단계적으로 희석해서 제작한 검량선으로부터, 피검 샘플 중의 항원 농도를 산출한다.
샌드위치 ELISA법에 사용하는 항체로서는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것을 사용해도 되고, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 등의 항체 프래그먼트를 사용해도 된다. 샌드위치 ELISA법에서 사용하는 2종류의 항체의 조합으로서는, 다른 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편의 조합이어도 되고, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 또는 항체 단편과의 조합이어도 된다.
형광 면역 측정법은 문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 형광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 예를 들어 공지(문헌 [형광항체법, soft science사(1983)])의 형광 표지를 들 수 있다. 예를 들어, FITC 또는 RITC 등을 들 수 있다.
발광 면역 측정법은 문헌 [생물발광과 화학발광 임상 검사 42, 히로카와 쇼텐(1998)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 발광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 예를 들어 공지된 발광체 표지를 들 수 있고, 아크리디늄 에스테르, 로핀 등을 들 수 있다.
웨스턴 블로트법은 항원 또는 항원을 발현한 세포 등을 SDS(도데실 황산 나트륨)-PAGE(문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)])로 분획한 후, 해당 겔을 폴리불화 비닐리덴(PVDF) 막 또는 니트로셀룰로오스 막에 블로팅하고, 해당 막에 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편을 반응시키고, 또한 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지, 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항 마우스 IgG 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 해당 표지를 가시화함으로써 측정한다. 일례를 이하에 나타내었다.
서열 번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포 또는 조직을 용해하고, 환원 조건하에서 레인(lane)당의 단백량으로서 0.1 내지 30μg를 SDS-PAGE법에 의해 영동한다. 영동된 단백질을 PVDF막에 트랜스퍼하여 1 내지 10% BSA를 포함하는 PBS(이하, BSA-PBS로 기재함)에 실온에서 30분간 반응시켜 블로킹 조작을 행한다.
여기서 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시켜, 0.05 내지 0.1%의 Tween-20을 포함하는 PBS(이하, Tween-PBS로 기재함)로 세정하고, 퍼옥시다아제 표지한 염소 항 마우스 IgG를 실온에서 2시간 반응시킨다. Tween-PBS로 세정하고, ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약(Western Blotting Detection Reagents)(아마추어 샴사제) 등을 사용해서 모노클로날 항체가 결합한 밴드를 검출함으로써, 서열 번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 검출한다. 웨스턴 블로팅에서의 검출에 사용되는 항체로서는 천연형의 입체 구조를 유지하고 있지 않은 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체가 사용된다.
물리화학적 방법은, 예를 들어 항원인 FOLR1과 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 결합시킴으로써 응집체를 형성시켜서, 이 응집체를 검출함으로써 행한다. 그 밖에 물리화학적 방법으로서, 예를 들어 모세관법, 일차원 면역확산법, 면역 비탁법 또는 라텍스 면역 비탁법(문헌 [임상 검사법 제요, 가네하라(Kanehara)출판(1998)]) 등을 들 수 있다.
라텍스 면역 비탁법은 항체 또는 항원을 감작시킨 입경 0.1 내지 1 ㎛ 정도의 폴리스티렌 라텍스 등의 담체를 사용하여, 대응하는 항원 또는 항체에 의해 항원 항체 반응을 일으키게 하면, 반응액 중의 산란광은 증가하고, 투과광은 감소한다. 이 변화를 흡광도 또는 적분구 탁도로서 검출함으로써 피검 샘플 중의 항원 농도 등을 측정한다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 당해 항체에 의한 치료 유효성을 치료 개시 전에 판단하는 방법으로서는, 예를 들어 이하를 들 수 있다.
먼저, 치료 개시 전에, 환자 체내에서 암성 복수를 채취하여, 그의 현탁액에 본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편을 첨가하고, 일정 시간 후, 항종양 활성을 측정한다. 측정 결과, 항종양 활성이 관측된 경우, 그 복수를 갖는 환자의 치료에는 본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편이 유효하다고 치료 개시 전에 판단할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
FOLR1, FOLR2 및 FOLR3 cDNA의 입수
인간 FOLR1(이하, FOLR1로 기재함, 서열 번호 1), 인간 FOLR2(이하, FOLR2로 기재함) 및 인간 FOLR3(이하, FOLR3으로 기재함)의 cDNA는 각각 SC122853(Origene), SC119666(Origene) 및 #100015838(Open Biosystem)을 구입하여, 이후의 시험에 사용하였다.
[실시예 2]
FOLR1 발현 벡터의 구축
먼저, 프라이머 FOLR1-F(서열 번호 2) 및 FOLR1-R(서열 번호 3)을 사용하여, FOLR1 유전자를 PCR에 의해 증폭하였다. 증폭 유전자가 목적으로 하는 서열인 것을 확인한 후, 제한 효소 EcoRI 및 KpnI 인식 서열에서 벡터 pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호)과 연결하고, FOLR1 유전자 발현 벡터를 구축하였다.
[실시예 3]
FOLR1 발현 세포의 조성
DHFR 유전자 결손 CHO(차이니즈·햄스터 난소) 세포 DG44주(CHO/DG44 세포)를 미쯔비시 가가꾸 가부시끼가이샤·요코하마 소고 겡뀨쇼로부터 입수하고, FOLR1 발현 세포 조성에 사용하였다. 배양에는 10% 비동화 완료 투석 소 태아 혈청(dFBS)(GIBCO), HT supplement(GIBCO) 및 50μg/mL 겐타마이신을 첨가한 IMDM(GIBCO)(배양 배지)을 사용하였다.
먼저, FOLR1 유전자 발현 벡터를 AatII 처리에 의해 절단하고, 얻어진 직쇄상 DNA를 정제하여, 멸균수에 용해하였다. 이 DNA를 일렉트로포레이션법에 의해, CHO/DG44 세포에 도입하고, HT supplement를 뺀 배양 배지에서 3일 정도 배양하였다. 그 후, 선택 배지[IMDM, 10% 비동화 완료 dFCS, 0.5mg/mL G418(나카라이) 및 50μg/mL 겐타마이신]로 약제 내성 세포를 선택하였다. 선택한 약제 내성 세포를, 96웰 플레이트에 75cells/플레이트가 되도록 파종하고, 또한 2주일 정도 선택 배지에서 배양하였다. 웰마다 현미경 하에서 관찰하고, 싱글 클론이 되어 있는 것을 순차 확대 배양하였다.
[실시예 4]
FOLR1 발현의 확인
얻어진 약제 내성 세포를 0.02% EDTA 용액(나카라이)으로 박리하고, PBS로 세정한 후, 1% BSA/PBS로 현탁하였다. 이어서, 1웰당 2×105개가 되도록 96웰 플레이트에 파종하고, 1700rpm으로 1분간의 원심 분리를 행하였다. 상청을 제거한 후, 1% BSA/PBS로 2μg/mL로 제조한 LK26 항체(GeneTex)를 첨가하고, 4℃에서 1시간의 반응을 행하였다.
세포를 세정한 후, 1% BSA/PBS로 100배로 희석한 Anti-mouse IgG-FITC(Dako)를 첨가하고, 4℃에서 1시간의 반응을 행하였다. 다시 세포를 세정한 후, 세포를 1% BSA/PBS로 현탁하고, 형광 강도를 유세포 분석기(베크만 콜터사제, FC500MPL)로 해석하였다. FOLR1이 현저하게 발현하는 클론을 선택하고, 이 세포를 FOLR1 발현 CHO 세포로 하였다.
[실시예 5]
필리핀 원숭이 FOLR1의 클로닝
동결된 필리핀 원숭이 신장 조직으로부터, 필리핀 원숭이 FOLR1을 클로닝하였다. 각 변이 몇 mm인 동결 신장 조직에 RNAiso Plus(Takara)를 가하여, 호모게나이저 펫스루(AsOne)를 사용해서 조직을 균질화시켰다. 실온에서 5분간 정치한 후, RNAiso plus의 권장 프로토콜에 따라서 total RNA를 취득하고, DEPC 처리수(인비트로젠)에 용해하였다. 다음으로 total RNA로부터 cDNA를 합성하기 위해서, PrimeScript II 1st 스트랜드 cDNA 합성 키트(다카라) 및 올리고 dT를 프라이머로서 사용해서 역전사 반응을 행하였다.
이어서, 인간 FOLR1(NM_000802) 및 붉은 털 원숭이 FOLR1(XM_001114655)을 참고로 설계한, 프라이머 CyFOLR1-F(서열 번호 4) 및 CyFOLR1-R(서열 번호 5)을 사용하여, 필리핀 원숭이 FOLR1 유전자를 PCR에 의해 증폭하였다.
PCR 샘플을 2% 아가로오스 겔에서 전기영동하고, 증폭된 밴드를 잘라내어, QIA퀵 젤 익스트랙션 키트(QIAquick Gel Extraction kit)(퀴아젠)에서 회수하였다. 서열화용 TOPO TA 클로닝 키트(TOPO TA Cloning Kit for Sequencing)(인비트로젠)을 사용해서 TA 클로닝하고, Competent high E.coli DH5α(도요보)에 도입하여, 100μg/mL의 암피실린을 포함한 LB 플레이트에서 37℃, 밤새 배양하였다. 그 후, 각 콜로니를 배양하고, 플라스미드를 NA-2000(KURABO)으로 추출한 후, 염기 서열을 각각 해석하였다.
그 결과, 클로닝된 필리핀 원숭이 FOLR1의 염기 서열은 서열 번호 6인 것이 명확해지고, 이 서열에 기초하는 아미노산 서열(서열 번호 7)은 붉은 털 원숭이 FOLR1(XM_001114655)과 동일한 것이 명확해졌다.
[실시예 6]
FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 붉은 털 원숭이 FOLR1-Fc 발현 벡터의 구축
FOLR1(1-233 아미노산), FOLR2(1-227 아미노산), FOLR3(1-243 아미노산) 및 필리핀 원숭이 FOLR1(1-233 아미노산)의 C 말단에 Human IgG1 Fc(Hinge부 및 CH2-CH3부)를 부가한 재조합 단백질(이하, FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc로 기재함)을 발현하는 벡터를 구축하기 위해서, PCR을 실시하였다.
FOLR1-Fc 발현 벡터 제작용 프라이머로서 FOLR1-Fc-F(서열 번호 8) 및 FOLR1-Fc-R(서열 번호 9), FOLR2-Fc 발현 벡터 제작용 프라이머로서 FOLR2-Fc-F(서열 번호 10) 및 FOLR2-Fc-R(서열 번호 11), FOLR3-Fc 발현 벡터 제작용 프라이머로서 FOLR3-Fc-F(서열 번호 12) 및 FOLR3-Fc-R(서열 번호 13), 그리고 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc 발현 벡터 제작용 프라이머로서 CyFOLR1-Fc-F(서열 번호 14) 및 CyFOLR1-Fc-R(서열 번호 15)을 사용하였다.
PCR 산물을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠)을 사용해서 증폭한 유전자를 단리하여, TA 클로닝 키트(인비트로젠)로 서브 클로닝하였다. 목적 서열을 갖는 벡터를 선택하여, EcoRI 및 AhdI로 목적 배열을 잘라냈다.
한편, pKANTEX93으로부터, AhdI 및 SpeI로 Human IgG1 Fc 영역을 잘라냈다. 잘라낸 목적 배열과 Human IgG1 Fc 영역을, EcoRI 및 SpeI로 처리한 pKANTEX93에 연결하고, FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc 재조합 단백질 발현 벡터로 하였다.
[실시예 7]
FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc 발현 세포의 조성
FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc 발현 세포의 조성에는, CHO/DG44로부터 제작된 FUT8 녹아웃 CHO/DG44 세포인 CHO/Ms704 세포(국제 공개 제03/85107호)를 사용하였다. 또한, 발현 벡터는 실시예 6에서 제작한 FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc 발현 벡터를 사용하였다. 통상 계대 시의 배양, 유전자 도입 및 약제 내성 세포의 선택은 실시예 3과 마찬가지로 행하였다.
선택한 약제 내성 세포를 순차 확대 배양한 후, PBS로 세포를 세정하고, 회수 배지[CHO 셀 용 EX-CELL 302 세럼-프리 배지(EX-CELL 302 Serum-Free Medium for CHO Cells)(시그마 알드리치, 6mmol/L L-글루타민(인비트로젠) 및 50μg/mL 겐타마이신]에서 1주일 배양하였다. 배양 상청을 회수하여, 다음 정제에 제공하였다.
[실시예 8]
FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc의 정제
배양 상청으로부터, 칼럼에 충전한 ProSep-vA High Capacity를 사용하여, FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc를 정제하였다.
먼저, 배양 상청을 칼럼에 통과시키고, PBS로 칼럼을 세정한 후, pH 5.0, 3.5, 3.0의 용출 버퍼(0.1M 시트르산 1수화물-NaOH/pH 5.0, 3.5, 3.0)로 순서대로 용출하였다. 용출한 프랙션은 빠르게 중화 버퍼(2M Tris-HCl/pH 8.5)로 중화하였다. 각각의 프랙션의 흡광도(280nm)를 측정하고, 측정값이 높은 연속 프랙션을 항체 획분으로서 회수하였다. PBS로 투석을 행하고, 0.22 ㎛의 필터를 통과시킨 것을 정제 단백질로 하였다. 280nm의 흡광 계수를 각각, FOLR1-Fc는 2.2, FOLR2-Fc는 2.3, FOLR3-Fc는 2.1, 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc는 2.2로서, 농도를 산출하였다.
[실시예 9]
FOLR1-mycHis 발현 벡터의 구축
FOLR1(1-233 아미노산)의 C 말단에 myc 및 His 태그를 부가한 재조합 단백질(이하, FOLR1-mycHis로 기재함)을 발현하는 벡터를 구축하기 위해서, PCR을 실시하였다. FOLR1-mycHis 발현 벡터 제작용 프라이머로서 FOLR1-mH-F(서열 번호 16) 및 FOLR1-mH-R(서열 번호 17)을 사용하였다.
PCR 산물로부터 목적 서열을 정제하고, EcoRI 및 SpeI로 처리한 pKANTEX93에 연결하여, FOLR1-mycHis 발현 벡터로 하였다.
[실시예 10]
FOLR1-mycHis 발현 세포의 조성
FOLR1-mycHis 발현 세포의 조성에는 CHO/DG44 세포를 사용하였다. 또한, 발현 벡터는 실시예 9에서 제작한 FOLR1-mycHis 발현 벡터를 사용하였다. 통상 계대 시의 배양, 유전자 도입, 약제 내성 세포의 선택 및 배양 상청의 회수는 실시예 7과 마찬가지로 행하였다.
[실시예 11]
FOLR1-mycHis의 정제
배양 상청으로부터, 칼럼에 충전한 Ni-NTA 아가로스(Agarose)(인비트로젠)를 사용하여, FOLR1-mycHis를 정제하였다.
먼저, 세정 버퍼(50mmol/L NaH2PO4(pH 8.0), 300mmol/L NaCl)를 칼럼에 흘리고, 배양 상청을 칼럼에 통과시키고, 세정 버퍼로 칼럼을 세정한 후, 용출 버퍼(세정 버퍼에 500mmol/L 이미다졸을 첨가한 것)로 용출하였다. 용출한 프랙션의 흡광도(280nm)를 측정하고, 측정값이 높은 연속 프랙션을 FOLR1-mycHis 획분으로서 회수하였다. PBS로 투석을 행하고, 0.22 ㎛의 필터를 통과시킨 것을 정제 FOLR1-mycHis로 하였다. 280nm의 흡광 계수를 2.8로 하여 농도를 산출하였다.
[실시예 12]
래트에서의 면역
FOLR1에 대한 모노클로날 항체를 취득하기 위해서, 4주령의 암컷 SD 래트를 면역하였다. 먼저, 50μg의 FOLR1-Fc를, 2mg의 수산화알루미늄 보조제(문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]) 및 백일해 백신(나카라이)과 함께, SD 래트에 복강 내 투여하였다. 첫회 투여 2주일 후로부터, 50μg의 FOLR1-Fc를 1주일에 1회의 빈도로 3회 투여하였다.
[실시예 13]
래트 항혈청 평가
실시예 12의 최종 투여 3일 후에 SD 래트의 꼬리 정맥에서 채혈하고, FOLR1에 대한 혈청 항체값을 유세포 분석으로 해석하였다. 양성 대상 세포 및 음성 대상 세포로는 각각 FOLR1 발현 CHO 세포 및 FOLR2 발현 CHO 세포를 사용하였다.
먼저, FOLR1 발현 CHO 세포 및 FOLR2 발현 CHO 세포를 0.02% EDTA 용액(나카라이)으로 박리하고, PBS로 세정한 후, 1% BSA/PBS로 현탁하였다. 이어서, 1웰당 5×105개가 되도록 96웰 플레이트에 파종하고, 1500rpm으로 1분간의 원심 분리를 행하였다.
상청을 제거한 후, 1% BSA/PBS로 100 내지 1000배로 희석한 SD 래트 혈청을 세포에 첨가하고, 4℃에서 30분간의 반응을 행하였다. 세포를 세정한 후, 1% BSA/PBS로 희석한 Alexa488 표지 항 래트 IgG(H+L) 폴리클로날 항체(인비트로젠)를 세포에 첨가하고, 4℃에서 30분간의 반응을 행하였다. 다시 세포를 세정한 후, 세포를 1% BSA/PBS로 현탁하고, 형광 강도를 유세포 분석으로 해석하였다.
[실시예 14]
하이브리도마의 제작
FOLR1 발현 CHO 세포에 대하여 충분한 혈청 항체값을 나타낸 SD 래트에 대하여 50μg의 FOLR1-Fc를 추가 면역하였다. 그 3일 후, 외과적으로 SD 래트로부터 비장을 적출하여, 세포융합에 제공하였다.
먼저, 적출한 비장을 슬라이드 글래스에서 균질화하고, 조직을 풀었다. 이 비장 조직을 MEM(인비트로젠)에 의해 현탁하고, 셀 스트레이너(strainer)를 통과시킴으로써, 여분의 조직을 제거하였다. 원심 분리에 의해 상청을 제거한 후, 적혈구 용해 버퍼(Red blood cell lysing buffer)(SIGMA)를 가해서 용혈시켰다. MEM을 가하여 반응을 중지시키고, 원심 분리에 의해 상청을 제거한 후, 다시 MEM으로 현탁하여, 비장 세포로 하였다.
얻어진 비장 세포에 대하여 1/8배량의 마우스 미엘로마 세포주 P3-U1을 혼합하였다. 원심 분리에 의해 상청을 제거한 후, 37℃의 온욕 안에서 따뜻하게 하면서, 500μL의 PEG 용액[폴리에틸렌 글리콜 1000(준세 가가꾸) 및 MEM을 각각 1mL씩 혼합하고, DMSO(나카라이)를 350μL 가한 것]을 온화하게 첨가하고, 또한 45mL의 MEM을 첨가하였다. 원심 분리에 의해 상청을 제거한 후, 세포를 HAT 배지[500mL의 RPMI 1640(와코)에 대하여 5mL의 HAT 용액(GIBCO), 0.5mL의 55mmol/L 2-머캅토에탄올(인비트로젠)을 첨가한 것]로 현탁하였다. 얻어진 하이브리도마를, 96웰 플레이트에 파종하고, 배양하였다.
[실시예 15]
하이브리도마 스크리닝(ABI8200 셀룰러 디텍션 시스템)
하이브리도마를 10일간 배양한 후, 각 웰의 배양 상청을 채취하고, FOLR1에 대한 반응성을 형광 항체 염색법(ABI8200 셀룰러 디텍션 시스템, 이하 FMAT로 기재함)에 의해 해석하였다. 양성 대상 세포 및 음성 대상 세포는 각각 FOLR1 발현 CHO 세포 및 FOLR2 발현 CHO 세포로 하였다. 먼저, 양성 대상 세포 및 음성 대상 세포를 0.05% 트립신 용액(인비트로젠)으로 박리하고, 1웰당 각각 1×104개/100μL가 되도록 96웰 플레이트에 파종하고, 밤새 배양하였다.
이어서, 10μL의 하이브리도마 배양 상청 및 최종적으로 1/5000배가 되도록 희석한 50μL의 Alexa647 표지 항 래트 IgG(H+L) 폴리클로날 항체(인비트로젠)를 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 3시간 반응시킨 후, FMAT에 의해 형광 강도를 해석하였다. FMAT에 의해 FOLR1 양성 CHO 세포에 특이적인 반응이 보인 웰의 하이브리도마에 대해서, 한계 희석법에 의한 클로닝을 2회 행하였다.
[실시예 16]
하이브리도마 스크리닝(표면 플라즈몬 공명법)
클로닝 후의 하이브리도마 배양 상청을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명법에 의해 FOLR1과의 어피니티를 측정하였다. 측정 기기는 Biacore T100(GE 헬스케어)을 사용하고, CM5 칩(GE 헬스케어)을 사용하였다. 먼저, 마우스 항체 포획 키트(Mouse Antibody Capture Kit)(GE 헬스케어)을 아민 커플링법으로 CM5 칩에 고정화하였다.
이어서, HBS-EP+버퍼(GE 헬스케어)를 사용해서 하이브리도마 배양 상청을 흘리고, 상청에 포함되는 항체를 CM5 칩에 포획시켰다. 계속해서 5단계의 농도 (188, 375, 750, 1500, 3000ng/mL)로 희석한 FOLR1-mycHis를 애널라이트로서 흘렸다.
어피니티는 Single-cycle kinetics법으로 결합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)를 해석하였다. 속도론 정수(ka, kd, KD)는 Biacore T-100 이밸류에이션 소프트웨어(Evaluation software)(GE 헬스케어)를 사용하고, 1:1 바인딩 모델(binding model)에 의해 산출하였다.
그 결과, LK26 항체(GeneTex) 및 MOv18 항체(ALEXIS BIOCHEMICALS)의 FOLR1-mycHis에 대한 어피니티(KD, kd/ka에 의해 산출)는 각각 66nmol/L 및 92nmol/L이었다. 한편, 하이브리도마 RA15-7클론(이하, RA15-7로 기재함)의 배양 상청의 FOLR1-mycHis에 대한 어피니티는 1.9nmol/L이었다.
따라서, RA15-7 배양 상청은 기존의 LK26 항체 및 MOv18 항체에 비하여, FOLR1에 대하여 극히 높은 어피니티를 나타내는 항체를 포함하는 것이 명확해졌다.
[실시예 17]
RA15-7 배양 상청의 반응성 평가(유세포 분석)
LK26 항체가 반응을 나타내는 인간 난소암 세포주 PA-1(ATCC 번호: CRL-1572)에 대한, RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체의 반응성을, 유세포 분석으로 해석하였다. 또한, LK26 항체가 반응을 나타내지 않는 인간 난소암 세포주 TOV-112D(ATCC 번호: CRL-11731)를 음성 대상으로 하여, RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체의 반응성을 마찬가지로 해석하였다.
먼저, 인간 난소암 세포주 PA-1 및 TOV-112D 세포를 0.02% EDTA 용액(나카라이)으로 박리하고, PBS로 세정한 후, 1% BSA/PBS로 현탁하였다. 이어서, 1웰당 2×105개가 되도록 96웰 플레이트에 파종하고, 1500rpm으로 1분간의 원심 분리를 행하였다. 상청을 제거한 후, RA15-7 배양 상청을 1웰당 50μL 첨가하고, 4℃에서 30분간의 반응을 행하였다.
세포를 세정한 후, 1% BSA/PBS로 희석한 Alexa488 표지 항 래트 IgG(H+L) 폴리클로날 항체(인비트로젠)를 첨가하고, 4℃에서 30분간의 반응을 행하였다. 다시 세포를 세정한 후, 세포를 1% BSA/PBS로 현탁하여, 형광 강도를 유세포 분석으로 해석하였다.
그 결과, LK26 항체와 마찬가지로, RA15-7 배양 상청은 PA-1에 대해서만 반응을 보이고, TOV-112D에는 반응을 보이지 않았다. 따라서, RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체는 FOLR1을 고발현하는 암세포를 인식한다는 것이 시사되었다.
마찬가지로, 필리핀 원숭이 신장 유래 세포주 JTC-12(RCB1485, RIKEN CELL BANK)에 대한 RA15-7 배양 상청의 반응성을, 유세포 분석으로 해석하였다. 그 결과, LK26 항체와 마찬가지로, RA15-7 배양 상청은 JTC-12 세포에 대하여 반응을 나타냈다. 따라서, RA15-7 배양 상청은 인간 FOLR1뿐만 아니라, 필리핀 원숭이 FOLR1도 인식하는 항체를 포함한다는 것이 시사되었다.
[실시예 18]
RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체의 서브클래스의 동정
ELISA법에 의해, RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체의 서브클래스를 동정하였다.
먼저, PBS로 50μg/mL로 제조한 항 래트 IgG(H+L) 폴리클로날 항체(MP 바이오메디칼(Biomedical))를 50μL/웰로 ELISA용 96웰 플레이트에 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하였다. PBS로 웰을 세정 후, 1% BSA/PBS를 100μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 블로킹을 행하였다. 다시 PBS로 웰을 세정한 후, RA15-7 배양 상청을 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다.
각 웰을 0.05% tween20/PBS로 세정하고, 1% BSA/PBS로 희석한 HRP 표지된 각 래트 Ig 아이소타입(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM) 항체 및 래트 κ쇄 특이적 항체(사우던 바이오테크(Southern Biotech))를 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다.
각 웰을 PBS로 세정한 후, ABTS[2.2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸-6-술폰산)암모늄, Wako] 기질액[(1mmol/L ABTS, 0.1mol/L 시트르산 버퍼(pH 4.2), 0.1% H2O2)]을 50μL/웰 가하여 실온에서 반응시켰다. 충분히 발색이 확인된 후, 5% SDS 용액을 50μL/웰 가하여 반응을 정지시키고, 415nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체는 래트 IgG1κ 항체인 것이 명확해졌다.
[실시예 19]
RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체의 특이성의 평가(ELISA법)
RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체의 FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc에 대한 반응성을 평가하였다.
먼저, PBS로 1000배로 희석한 goat anti-rat IgG(H+L)(CALTAG)를 50μL/웰로 ELISA용 96웰 플레이트에 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하였다.
PBS로 웰을 세정 후, 1% BSA/PBS를 100μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 블로킹을 행하였다. 다시 PBS로 웰을 세정한 후, RA15-7 배양 상청을 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 각 웰을 0.05% tween20/PBS로 세정하고, 1% BSA/PBS로 희석한 FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc를 50μL/웰 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다.
각 웰을 0.05% tween20/PBS로 세정한 후, 1% BSA/PBS로 2000배로 희석한 Goat anti-human IgG(H+L)-POD(아메리칸 쿼렉스(American Qualex))를 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 각 웰을 PBS로 세정한 후, ABTS 기질액을 50μL/웰 가해서 실온에서 반응시켰다. 발색이 충분히 확인된 후, 5% SDS 용액을 50μL/웰 가해서 반응을 정지시키고, 415nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc에는 결합하는데, FOLR2-Fc 및 FOLR3-Fc에는 결합하지 않는 것이 나타났다. 즉, RA15-7 배양 상청에 포함되는 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 FOLR1에 특이적인 항체인 것이 나타났다.
[실시예 20]
RA15-7 항체의 정제
하이브리도마-SFM(인비트로젠)에 5%의 소 태아 혈청 울트라 로우 IgG(Fetal Bovine Serum Ultra Low IgG)(인비트로젠)를 첨가한 배지에서, 하이브리도마 RA15-7을 1주일 배양하였다. 배양 상청으로부터의 RA15-7 항체의 정제는 실시예 8과 마찬가지의 방법으로 행하였다. 280nm의 흡광 계수를 1.4로 하여 농도를 산출하였다.
[실시예 21]
경합 ELISA법에 의한 항체 결합성 평가
RA15-7 항체, LK26 항체 및 MOv18 항체가 서로 FOLR1에 대하여 경합적으로 결합하는 지를 평가하였다.
먼저, PBS로 2μg/mL로 제조한 각각의 항체를, 50μL/웰로 ELISA용 96웰 플레이트에 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하였다. PBS로 웰을 세정 후, 1% BSA/PBS를 200μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 블로킹을 행하였다. 다시 PBS로 웰을 세정한 후, 항 FOLR1 항체(0.012 내지 3μg/mL) 및 FOLR1-Fc(0.2μg/mL)를 각각 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다.
각 웰을 0.05% tween20/PBS로 세정하고, 1% BSA/PBS로 5000배로 희석한 Goat anti-Human IgG(H+L)-POD(아메리칸 쿼렉스)를 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 각 웰을 PBS로 세정한 후, ABTS 기질액을 50μL/웰 가해서 실온에서 반응시켰다. 발색이 충분히 확인된 후, 5% SDS 용액을 50μL/웰 가해서 반응을 정지시키고, 415nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, FOLR1에 대한 결합에서, RA15-7 항체 및 LK26 항체는 경합적으로 결합하는 것이 명확해졌다. 한편, FOLR1에 대한 결합에서, RA15-7 항체 및 MOv18 항체는 경합하지 않고, LK26 항체 및 MOv18 항체도 경합하지 않는 것이 명확해졌다.
[실시예 22]
RA15-7 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 클로닝
RNAiso plus(다카라)를 사용하여, 첨부서에 따라, PBS로 세정한 하이브리도마 RA15-7을 용해하고, total RNA를 제조하였다. 얻어진 total RNA는 DEPC treated water(인비트로젠)에 용해하였다.
이어서, 올리고텍스(Oligotex) -dT30<Super> mRNA 정제 키트(Purification Kit)(From Total RNA)(다카라)을 사용하여, 첨부서에 따라, 얻어진 total RNA로부터 mRNA를 정제하였다. 또한, SMART RACE cDNA 증폭 키트(Amplification Kit)(클론테크(Clontech))을 사용하여, 첨부서에 따라, 정제한 mRNA로부터 cDNA를 제조하였다.
얻어진 cDNA를 주형으로, 프라이머 RatIgG1H-A(서열 번호 18) 및 RatIgG1H-B(서열 번호 19)를 사용하여, 래트 IgG1 중쇄 유전자를, 프라이머 Ratk-A(서열 번호 20) 및 Ratk-B(서열 번호 21)를 사용하여, 래트 경쇄(κ쇄) 유전자를, 각각 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭시킨 유전자를 서브 클로닝하여, 염기 서열을 해석하였다.
그 결과, 시그널 서열을 포함하는 RA15-7 항체 중쇄 가변 영역은 염기 서열이 서열 번호 22, 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 표시되고, 시그널 서열을 포함하는 RA15-7 항체 경쇄 가변 영역은 염기 서열이 서열 번호 24, 아미노산 서열이 서열 번호 25로 표시되는 것이 명확해졌다.
또한, Kabat들(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)])의 보고로부터, 시그널 서열을 포함하지 않는 RA15-7 항체 중쇄 가변 영역은 염기 서열이 서열 번호 26, 아미노산 서열이 서열 번호 27로 표시되고, 시그널 서열을 포함하지 않는 RA15-7 항체 경쇄 가변 영역은 염기 서열이 서열 번호 28, 아미노산 서열이 서열 번호 29로 표시되는 것이 명확해졌다.
또한, RA15-7 항체 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 30, 31 및 32로 표시되는 것이 명확해졌다. 또한, RA15-7 항체 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 33, 34 및 35로 표시되는 것이 명확해졌다.
[실시예 23]
래트/인간 키메라형 RA15-7 항체 발현 벡터의 구축
RA15-7 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를, 인간 IgG1 중쇄 및 κ쇄 정상 영역 유전자에 연결함으로써, 래트/인간 키메라형 RA15-7 항체 발현 벡터를 제작하였다. 인간 IgG1κ의 정상 영역 유전자를 포함하는 pKANTEX93을 벡터로서 사용하였다.
먼저, 프라이머 RA15-7-VLF(서열 번호 36) 및 RA15-7-VLR(서열 번호 37)을 사용하여, RA15-7 항체 경쇄 가변 영역 유전자를 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물로부터 목적 서열을 정제하고, EcoRI 및 BsiWI로 처리한 pKANTEX93에 연결하였다.
마찬가지로, 프라이머 RA15-7-VHF(서열 번호 38) 및 RA15-7-VHR(서열 번호 39)을 사용하여, RA15-7 항체 중쇄 가변 영역 유전자를 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물로부터 목적 배열을 정제하고, NotI 및 ApaI로 처리한, RA15-7 항체 경쇄 가변 영역 유전자 내장 완료 pKANTEX93과 연결하고, 래트/인간 키메라형 RA15-7(이하, ChRA15-7로 기재함) 항체 발현 벡터로 하였다.
[실시예 24]
ChRA15-7 항체 및 푸코오스를 포함하지 않는 당쇄가 부가된 ChRA15-7 항체 발현 세포의 조성
푸코오스를 포함하는 당쇄가 부가된(이하, 종래형이라고 칭함) ChRA15-7 항체의 발현 세포의 조성에는 CHO/DG44 세포를 사용하였다. 또한, 푸코오스를 포함하지 않는 당쇄가 부가된(이하, 디퍼렌셜 코스형이라고 칭함) ChRA15-7(이하, ChRA15-7DF로 기재함) 항체의 조성에는 CHO/Ms704 세포를 사용하였다. 또한, 발현 벡터는 실시예 23에서 제작한 벡터를 사용하였다. 통상 계대 시의 배양, 유전자 도입, 약제 내성 세포의 선택 및 배양 상청의 회수는 실시예 7과 마찬가지로 행하였다.
[실시예 25]
ChRA15-7 항체 및 ChRA15-7DF 항체의 정제
회수한 배양 상청으로부터의 ChRA15-7 항체 및 ChRA15-7DF 항체의 정제는 실시예 8과 마찬가지의 방법으로 행하였다. 종래형인지 디퍼렌셜 코스형인지에 관계없이, 280nm의 흡광 계수를 1.37로 하여 농도를 산출하였다.
[실시예 26]
CDC 활성 증강 기술을 적용한 디퍼렌셜 코스형 항체 발현 벡터의 제작
CDC 활성 증강 기술을 적용한 디퍼렌셜 코스형의 항체를 제작하는 것을 목적으로, 국제 공개 제2007/011041호 및 국제 공개 제2011/108502호의 보고를 참고로 pKANTEX93의 항체 중쇄 정상 영역을 개변하였다. 개변 후의 염기 서열 및 아미노산 서열을, 각각 서열 번호 40 및 41로 나타낸다. 이 벡터에, RA15-7 항체 및 MORAb-003 항체(국제 공개 제2005/080431호)의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 도입하고, CDC 활성 증강 기술을 적용한 디퍼렌셜 코스형의 ChRA15-7(이하, ChRA15-7Acc로 기재함) 항체 및 MORAb-003(이하, MORAb-003Acc로 기재함) 항체 발현 벡터로 하였다.
[실시예 27]
ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003Acc 항체 발현 세포의 조성
ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003Acc 항체 발현 세포의 조성에는 CHO/Ms704 세포를 사용하였다. 또한, 발현 벡터는 실시예 26에서 제작한 ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003Acc 항체 발현 벡터를 사용하였다. 통상 계대 시의 배양, 유전자 도입, 약제 내성 세포의 선택 및 배양 상청의 회수는 실시예 7과 마찬가지로 행하였다.
[실시예 28]
ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003Acc 항체의 정제
회수한 배양 상청으로부터의 ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003Acc 항체의 정제는 실시예 8과 마찬가지의 방법으로 행하였다. ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003Acc 항체의 280nm의 흡광 계수를 각각 1.34 및 1.60로 하여 농도를 산출하였다.
[실시예 29]
ChRA15-7Acc 항체의 어피니티 측정(표면 플라즈몬 공명법)
표면 플라즈몬 공명법에 의해, ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003 항체의 FOLR1에 대한 어피니티를 측정하였다. CM5 칩에 인간 항체 포획 키트(Human Antibody Capture Kit)(GE 헬스케어)을 아민 커플링법으로 고정화하는 것, 및 5단계의 농도(12.3, 37, 111, 333, 1000ng/mL)로 희석한 FOLR1-mycHis를 애널라이트로서 흘리는 것 외에는, 실시예 16과 마찬가지로 행하였다.
그 결과, ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003 항체의 FOLR1-mycHis에 대한 어피니티(KD, kd/ka에 의해 산출)는 각각 0.57nmol/L 및 57nmol/L이었다(표 1). 따라서, RA15-7 항체로부터 제작된 래트/인간 키메라형 항체 ChRA15-7Acc는 기존 항체 MORAb-003에 비하여, FOLR1에 대한 높은 어피니티를 나타내는 항체인 것이 명확해졌다.
Figure pct00001
[실시예 30]
ChRA15-7DF 항체의 결합성 평가(웨스턴 블로트법)
웨스턴 블로트법을 사용하여, ChRA15-7DF 항체 및 MORAb-003 항체의 반응성을 평가하였다.
먼저, FOLR1-mycHis를 레인 마커 리듀싱 샘플 버퍼(Lane Marker Reducing Sample Buffer) 및 레인 마커 논-리듀싱 샘플 버퍼(Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer)(써모(Thermo))로 현탁하고, 100℃에서 5분간 처리함으로써, 각각 환원 FOLR1-mycHis 및 비환원 FOLR1-mycHis로 하였다. SDS-PAGE용 겔 e-PAGEL(ATTO)에, 환원 및 비환원 FOLR1-mycHis를 5배씩 5단계의 농도(0.5, 2.7, 13, 67, 333ng/레인)로 SDS-PAGE를 행하였다.
이어서, 영동이 끝난 겔을 PVDF 멤브레인(밀리포어)에 겹치고, 상하를 트랜스퍼 버퍼(12.1g Tris, 14.4g 글리신, 200mL 메탄올/1L 멸균수)로 침지한 여과지로 끼우고, 전사를 행하였다.
그 후, PVDF 멤브레인을 1% 글로불린 프리 BSA(나카라이)/TBS로 블로킹을 행하였다. 이어서, 1% 글로불린 프리 BSA/TBS로 5μg/mL로 제조한 ChRA15-7DF 항체 및 MORAb-003 항체를 PVDF 멤브레인에 실온에서 1시간 반응시켰다.
이 PVDF 멤브레인을 세정한 후, 1% 글로불린 프리 BSA/TBS로 희석한 Goat anti-Human IgG(H+L)-POD(아메리칸 쿼렉스)를 실온에서 1시간 반응시켰다.
다시 PVDF 멤브레인을 세정한 후, 케미-루미 원 슈퍼(Chemi-Lumi One Super)(나카라이)를 1분간 반응시켜, PVDF 멤브레인의 형광을 ImageQuant LAS 4000mini(GE 헬스케어)로 검출하였다.
그 결과, ChRA15-7DF 항체 및 MORAb-003 항체는 모두 비환원 FOLR1-mycHis에 대하여만 반응을 보이고, FOLR1의 고차구조를 인식하고 있는 항체인 것이 시사되었다.
또한, MORAb-003 항체는 67ng 이상의 비환원 FOLR1-mycHis를 검출한 것에 대해, ChRA15-7DF 항체는 2.7ng 이상의 비환원 FOLR1-mycHis를 검출하였다.
즉, MORAb-003 항체에 대하여 ChRA15-7DF 항체는 비환원 상태의 FOLR1-mycHis 검출 감도가 현저하게 높은 것이 나타났다.
[실시예 31]
ChRA15-7DF 항체와 MORAb-003 항체의 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성 비교
난소암 세포주에 대한 ADCC 활성을 평가하였다. 표적으로 하는 암세포주[Caov-3(ATCC 번호: HTB-75), PA-1(ATCC 번호: CRL-1572), IGR-OV1(국립 암 연구소), SKOV-3(ATCC 번호: HTB-77), RMG-1(JCRB 세포 번호: JCRB0172), OVCAR-3(ATCC 번호: HTB-161)]를, 배양 플라스크로부터 0.02% EDTA 용액(나카라이)으로 박리하고, ADCC 측정 배지[페놀 레드 불포함 RPMI1640(GIBCO), 5% 비동화 완료 dFCS(GIBCO), 50μg/mL 겐타마이신(나카라이)]로 1×104cells/50μL로 제조하여, 타깃 세포 용액으로 하였다.
이어서, 헤파린 처리한 건강한 사람의 말초혈을, Lymphoprep(코스모 바이오)를 충전한 LeucoSep 림프구 분리 튜브(그라이너)에 중층하고, 1000×g로 20분간, 실온에서 원심 분리를 행하였다. 원심 분리 후, 혈청 획분을 제거하고, PBMC층을 회수하였다. ADCC 측정 배지로 세포를 세정하였다. PBMC를 ADCC 측정 배지로 2.5×105cells/50μL로 제조하여, 이펙터 세포 용액으로 하였다.
항체 용액은 최종 농도가 0.033, 0.33, 3.3, 33, 333ng/mL가 되도록, 먼저 ADCC 측정 배지에서 0.1, 1, 10, 100, 1000ng/mL로 제조하였다.
상기와 같이 제조한 타깃 세포 용액, 이펙터 세포 용액, 그리고 항체 용액을, U자 바닥의 96웰 플레이트에 각각 50μL/웰씩 혼합하고, 전량으로 150μL/웰로 하였다. 각각의 웰을 잘 혼합한 후, 50×g, 5분간, 실온의 원심 분리에 의해 세포를 침전시켜, 37℃에서 4시간 반응시켰다.
이어서, 각각의 웰을 잘 교반하고, 다시 원심 분리로 세포를 침전시킨 후, 웰의 상청을 각각 50μL씩 새로운 ELISA 플레이트에 분취하였다. 분취한 상청 중의 락트산 데히드로게나제(LDH) 활성을 사이토톡스 96-비-방사성 세포독성 분석법(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 조작은 첨부서에 따라 행하였다.
ADCC 활성의 산출은, 먼저 각 웰의 LDH 활성 측정값으로부터 ADCC 측정 배지만의 웰의 LDH 활성 측정값을 빼고, 각 웰의 LDH 활성 측정 보정값으로 한 후, 다음 식으로 계산을 행하였다.
Figure pct00002
여기서, Exp는 각 샘플의 LDH 활성 측정 보정값, ET spo는 이펙터 세포 용액 및 타깃 세포 용액의 혼합 웰의 LDH 활성 측정 보정값, T total은 타깃 세포와 사이토톡스 96-비-방사성 세포독성 분석법 첨부의 용균 용액(Lysis Solution)을 혼합한 웰의 LDH 활성 측정 보정값, D는 용균 용액의 LDH 활성 측정 보정값, T spo는 타깃 세포만의 웰의 LDH 활성 측정 보정값을 나타낸다.
그 결과, ChRA15-7DF 항체는 MORAb-003 항체보다 낮은 농도에서 ADCC 활성이 검출되어, 최대 세포 상해 활성도 높았다. 또한, ChRA15-7DF 항체는 디퍼렌셜 코스형의 MORAb-003(MORAb-003DF) 항체에 비해서도 낮은 농도에서 ADCC 활성이 검출되어, 최대 세포 상해 활성도 높았다.
따라서, ChRA15-7DF 항체는 기존의 항 FOLR1 인간화 항체(MORAb-003)에 기존의 ADCC 활성 증강 기술(디퍼렌셜 코스화)을 조합한 MORAb-003DF 항체와 비교하여, 높은 ADCC 활성을 갖는 것이 명확해졌다. 동시에, ChRA15-7DF 항체는 난소암에 대한 치료 항체로서, MORAb-003 및 MORAb-003DF보다 유용하다는 것이 시사되었다.
[실시예 32]
래트/인간 키메라형 FOLR1 발현 벡터의 구축
항체의 에피토프 해석을 하기 위해서, FOLR1-mycHis의 염기 서열의 일부를 래트 FOLR1(NM_133527)로 치환한 래트/인간 키메라형 FOLR1-mycHis를 3종류(이하, Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis로 기재함) 제작하였다.
Rat1-FOLR1-mycHis는 서열 번호 1로 표시되는 인간 FOLR1의 아미노산 서열 중 3 내지 28번째의 아미노산 서열을, 서열 번호 102로 표시되는 래트 FOLR1의 아미노산 서열 중 3 내지 26번째에 상당하는 아미노산 서열로 치환하고, C 말단에 myc 및 His 태그를 부여한 것이다.
Rat2-FOLR1-mycHis는 서열 번호 1로 표시되는 인간 FOLR1의 아미노산 서열 중 55 내지 62번째의 아미노산 서열을, 서열 번호 102로 표시되는 래트 FOLR1의 아미노산 서열 중 53 내지 60번째에 상당하는 아미노산 서열로 치환하고, C 말단에 myc 및 His 태그를 부여한 것이다.
Rat4-FOLR1-mycHis는 서열 번호 1로 표시되는 인간 FOLR1의 아미노산 서열 중 91 내지 95번째의 아미노산 서열을, 서열 번호 102로 표시되는 래트 FOLR1의 아미노산 서열 중 89 내지 93번째에 상당하는 아미노산 서열로 치환하고, C 말단에 myc 및 His 태그를 부여한 것이다.
Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis의 염기 서열은 각각 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44, 아미노산 서열은 각각 서열 번호 45, 서열 번호 46 및 서열 번호 47로 나타냈다.
각각의 유전자를 합성하고, 실시예 9의 FOLR1-mycHis 발현 벡터 상의 FOLR1-mycHis 유전자와 치환함으로써, Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis 발현 벡터를 구축하였다.
[실시예 33]
Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis 발현 세포의 조성
Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis 발현 세포의 조성에는 CHO/DG44 세포를 사용하였다. 또한, 발현 벡터는 실시예 32에서 제작한 벡터를 사용하였다. 통상 계대 시의 배양, 유전자 도입, 약제 내성 세포의 선택 및 배양 상청의 회수는 실시예 7과 마찬가지로 행하였다.
[실시예 34]
Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis의 정제
Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis의 정제는 실시예 11과 마찬가지로 하였다. 280nm의 흡광 계수는 모두 2.8로 하여 농도를 산출하였다.
[실시예 35]
ChRA15-7Acc 항체의 에피토프 해석(ELISA법)
실시예 11에서 제작한 FOLR1-mycHis 및 실시예 34에서 제작한 Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, Rat4-FOLR1-mycHis를 사용하여, ChRA15-7Acc 항체, MORAb-003 항체 및 MOv18 항체의 반응성을 평가하였다.
먼저, PBS로 10μg/mL로 제조한 FOLR1-mycHis, Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis를, 50μL/웰로 ELISA용 96웰 플레이트에 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하였다. PBS로 웰을 세정 후, 1% BSA/PBS를 200μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 블로킹을 행하였다.
다시 PBS로 웰을 세정한 후, 10000ng/mL로부터 3배씩 희석 7단계의 농도(14, 41, 123, 370, 1111, 3333, 10000ng/mL)로 1% BSA/PBS로 제조한 ChRA15-7Acc 항체, MORAb-003 항체, MOv18 항체를 각각 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다.
각 웰을 0.05% tween20/PBS로 세정하고, ChRA15-7Acc 항체 또는 MORAb-003 항체를 반응시킨 웰에는 1% BSA/PBS로 5000배로 희석한 Goat anti-human IgG(H+L)-POD(아메리칸 쿼렉스)를, MOv18 항체를 반응시킨 웰에는 1% BSA/PBS로 400배로 희석한 폴리클로날 래빗 안티-마우스 IgG-POD(다코)를 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다.
각 웰을 PBS로 세정한 후, ABTS 기질액을 50μL/웰 가해서 실온에서 반응시켰다. 발색이 충분히 확인된 후, 5% SDS 용액을 첨가해서 반응을 정지시키고, 415nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 표 2에 나타내었다. 흰색 동그라미는 반응을 보인 것, ×는 반응을 보이지 않은 것을 나타낸다. FOLR1-mycHis에는, ChRA15-7Acc 항체, MORAb-003 항체 및 MOv18 항체가 반응하였다. Rat1-FOLR1-mycHis에는, ChRA15-7Acc 항체 및 MORAb-003 항체는 반응했지만, MOv18 항체의 반응은 보이지 않았다.
Rat2-FOLR1-mycHis에는, MORAb-003 항체 및 MOv18 항체는 반응했지만, ChRA15-7Acc 항체의 반응은 보이지 않았다. Rat4-FOLR1-mycHis에는, ChRA15-7Acc 항체 및 MOv18 항체는 반응했지만, MORAb-003 항체의 반응은 보이지 않았다.
이상에서, MOv18 항체는 Rat1-FOLR1-mycHis, ChRA15-7Acc 항체는 Rat2-FOLR1-mycHis, MORAb-003 항체는 Rat4-FOLR1-mycHis에 있어서, FOLR1-mycHis 아미노산 서열을 래트형으로 치환한 영역을 포함하는 서열을 각각 인식하는 것이 나타났다.
구체적으로는, MOv18 항체는 FOLR1-mycHis의 3 내지 28번째의 아미노산 서열, ChRA15-7Acc 항체는 FOLR1-mycHis의 55 내지 62번째의 아미노산 서열, 및 MORAb-003 항체는 FOLR1-mycHis의 91 내지 95번째의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 인식하는 것이 시사되었다.
Figure pct00003
[실시예 36]
인간화 RA15-7 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 설계
먼저, 서열 번호 30, 31, 32로 각각 표시되는 RA15-7 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열을 선택하였다. 기지의 인간 항체 중쇄 가변 영역 배열은 국립 생물공학 정보 센터(The National Center for Biotechnology Information)가 제공하는 Ig Germline Genes 데이터베이스에 의해, RA15-7 중쇄 FR 서열과 상동성이 높은 인간 항체 서열을 검색하였다.
그 결과, IGVH3-72가 가장 상동성이 높은 인간 항체 서열이었기 때문에, 이 항체의 FR을 선택하였다. 이상과 같이 해서 결정한 인간 항체 FR 배열의 적절한 위치에 서열 번호 30, 31, 32로 나타낸 RA15-7 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열을 이식함으로써 HV0을 설계하였다.
이어서, 서열 번호 33, 34, 35로 각각 표시되는 RA15-7 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열을 선택하였다.
Kabat 등은 기지의 다양한 인간 항체의 VL을 그의 아미노산 서열의 상동성으로부터 서브그룹(HSG I 내지 IV)으로 분류하고, 그들의 서브그룹마다 공통 서열을 보고하고 있다(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]).
따라서, 인간 항체의 VL의 서브그룹 I 내지 IV(hSGI 내지 hSGIV)의 공통 서열의 FR의 아미노산 서열과 RA15-7 경쇄 FR 서열의 상동성 검색을 실시하였다. 그 결과, hSGI가 가장 상동성이 높은 인간 항체 경쇄 공통 서열이었다. 이상과 같이 해서 결정한 인간 항체 FR 서열의 적절한 위치에 서열 번호 33, 34, 35로 나타낸 RA15-7 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열을 이식함으로써 LV0을 설계하였다.
이어서, 상기에서 설계한 HV0 및 LV0을 포함하는 인간화 항체(HV0LV0) 및 ChRA15-7 항체의 가변 영역의 예상 3차원 구조를 컴퓨터 모델링에 의해 구축하고, 구조 비교를 하였다. 3차원 구조의 구축 및 좌표 데이터의 가시화는 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio)(액셀리스(Accerlys))를 사용하였다.
3차원 구조 비교의 결과, CDR루프 구조의 유지 등의 항원 결합 활성에의 기여가 큰 것이 예상되는 잔기, 소수성 상호작용 등에 의해 전체 구조의 유지에 기여하고 있는 잔기 및 분자 표면에 노출되어 잠재적인 항원성 리스크가 높을 것으로 예상되는 잔기를, 개변 후보 잔기로서 동정하였다.
선택한 개변 후보 잔기 중 1개 이상을 ChRA15-7 항체의 동일 위치에 존재하는 아미노산 잔기와 치환함으로써, 각 인간화 항체 개변체를 설계하였다. 시그널 서열을 포함하지 않는 인간화 RA15-7 항체 개변체의 중쇄 가변 영역으로서, 도 1에 도시하는 아미노산 서열대로, HV0, HV2, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10을 설계하였다.
마찬가지로, 시그널 서열을 포함하지 않는 인간화 RA15-7 항체 개변체의 경쇄 가변 영역으로서, 도 2에 도시하는 아미노산 서열대로, LV0, LV2, LV3, LV4, LV6을 설계하였다.
[실시예 37]
인간화 RA15-7 항체 개변체 발현 벡터의 구축
설계한, 시그널 서열을 포함하지 않는 각 인간화 RA15-7 항체 개변체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 염기 서열 HV0, HV2, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10, LV0, LV2, LV3, LV4 및 LV6(서열 번호 48 내지 61)을 ChRA15-7 발현 벡터의 구축(실시예 23)과 마찬가지로, pKANTEX93에 도입하였다.
[실시예 38]
인간화 RA15-7 항체 개변체 발현 세포의 조성
인간화 RA15-7 항체 개변체 발현 세포의 조성에는 FUT8 유전자 더블 녹아웃 CHO-K1주(문헌 [Tsukahara et al., Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects, 175-183, 2006])를 사용하였다. 실시예 37에서 제작한 각 인간화 항체 개변체 발현 벡터를, 프리 스타일(Free Style) MAX CHO 익스프레션 시스템(Expression System)(인비트로젠)의 조작 수순서에 따라서 일과성으로 도입하였다. 이들 세포를, 일주일간 정도 배양하여, 배양 상청을 회수하였다.
[실시예 39]
인간화 RA15-7 항체 개변체의 정제
실시예 38에서 회수한 배양 상청으로부터, 각 인간화 항체 개변체를 MabSelect SuRe(GE 헬스케어)를 사용해서 정제하였다. 구체적으로는, 담체를 충전한 칼럼에, 멸균수, 0.1M 시트르산 용액(pH 3.6) 및 0.2M 붕산 Na/150mmol/L NaCl 용액(pH 7.5)을 순서대로 흘리고, 평형화하였다.
배양 상청을 칼럼에 통과시킨 후, 0.2M 붕산 Na/150mmol/L NaCl 용액(pH 7.5)으로 칼럼을 세정하고, 0.1M 시트르산 용액(pH 3.6)으로 용출하였다. 용출한 프랙션은 빠르게 1M Tris-HCl(pH 9.0)로 중화하였다.
각각의 프랙션의 흡광도(280nm)를 측정하고, 측정값이 높은 연속 프랙션을 항체 획분으로서 회수하였다. 완충액(10mmol/L 시트르산, 150mmol/L NaCl, pH 6.0)으로 투석을 행하고, 0.22 ㎛의 필터를 통과시킨 것을 각 인간화 항체 개변체의 정제 항체로 하였다. 280nm의 흡광 계수를 1.4로 하여 농도를 산출하였다.
[실시예 40]
인간화 RA15-7 항체 개변체의 어피니티 측정(표면 플라즈몬 공명법)
실시예 29와 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법에 의해, 각 인간화 항체 개변체의 FOLR1에 대한 어피니티를 측정하였다.
그 결과, 5종의 인간화 RA15-7 항체 개변체(HV7LV3, HV10LV2, HV10LV3, HV10LV4 및 HV10LV6)의 FOLR1-mycHis에 대한 어피니티는 ChRA15-7Acc가 갖는 어피니티의 약 70％를 유지하고 있는 것이 나타났다.
[실시예 41]
인간화 RA15-7 항체 개변체 HV7LV3의 Cys(HV7LV3-CDRH3-Cys101) 개변체의 설계
인간화 RA15-7 항체 개변체 HV7LV3의 중쇄 CDR3에는 Cys(Cys101)가 포함되어 있다. Cys101을 다른 아미노산으로 치환할 때, Cys와 유사한 분자 구조, 소수성 강도, 단순 구조 아미노산 등의 요소를 고려하여, Met, Gly, Asp, Ser, Tyr, Ala, Ile, Val, Thr, Phe, Arg, Trp, Pro 및 Gln의 합계 14종류의 아미노산을 개변 후보 아미노산으로 선택하였다.
[실시예 42]
HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체 발현 벡터의 구축
HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체 발현 벡터를 제작하였다. 먼저, 주형으로서 HV7 가변 영역 유전자(서열 번호 62)를 내장한 벡터를 사용하였다. 점 변이 도입 키트[퀵체인지 II 사이트-다이렉티드 뮤타제네시스 키트(QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit)(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))]을 첨부 서에 따라서 사용하여, Cys101을 목적으로 하는 아미노산으로 개변하기 위한 유전자 변이를 도입하였다. 얻어진 DNA 용액을 XL1-Blue로 형질전환하고, 형성한 콜로니로부터, 플라스미드를 추출하였다.
Cys101이 목적의 아미노산으로 치환된, 시그널 서열을 포함하지 않는 HV7 가변 영역의 염기 서열은 Met(C101M_DNA): 서열 번호 63, Gly(C101G_DNA): 서열 번호 64, Asp(C101D_DNA): 서열 번호 65, Ser(C101S_DNA): 서열 번호 66, Tyr(C101Y_DNA): 서열 번호 67, Ala(C101A_DNA): 서열 번호 68, Ile(C101I_DNA): 서열 번호 69, Val(C101V_DNA): 서열 번호 70, Thr(C101T_DNA): 서열 번호 71, Phe(C101F_DNA): 서열 번호 72, Arg(C101R_DNA): 서열 번호 73, Trp(C101W_DNA): 서열 번호 74, Pro(C101P_DNA): 서열 번호 75, Gln(C101Q_DNA): 서열 번호 76으로 각각 표시되었다.
Cys101이 목적의 아미노산으로 치환된, 시그널 서열을 포함하지 않는 HV7 가변 영역의 아미노산 서열은, Met(C101M_AA): 서열 번호 77, Gly(C101G_AA): 서열 번호 78, Asp(C101D_AA): 서열 번호 79, Ser(C101S_AA): 서열 번호 80, Tyr(C101Y_AA): 서열 번호 81, Ala(C101A_AA): 서열 번호 82, Ile(C101I_AA): 서열 번호 83, Val(C101V_AA): 서열 번호 84, Thr(C101T_AA): 서열 번호 85, Phe(C101F_AA): 서열 번호 86, Arg(C101R_AA): 서열 번호 87, Trp(C101W_AA): 서열 번호 88, Pro(C101P_AA): 서열 번호 89, Gln(C101Q_AA): 서열 번호 90으로 각각 표시되었다.
이어서, HV7LV3 항체 발현 벡터의 중쇄 가변 영역 유전자 HV7을, Cys101이 목적의 아미노산으로 치환된 HV7 가변 영역 유전자와 치환하였다. 재조합에는 NotI, ApaI 인식 영역을 사용하였다. 얻어진 벡터를 HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체 발현 벡터로 하였다.
[실시예 43]
HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체 발현 세포의 조성 및 배양
HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체 발현 세포를, 실시예 42에서 제작한 벡터를 사용해 행하였다. 발현 세포, 유전자 도입, 배양 상청의 회수는 실시예 38과 마찬가지로 하였다.
[실시예 44]
HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체의 정제
HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체의 정제 및 농도의 산출은 실시예 39와 마찬가지로 하였다.
[실시예 45]
HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체의 어피니티 측정(표면 플라즈몬 공명법)
실시예 29와 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법에 의해, 각 HV7LV3-CDRH3-Cys101 개변 항체의 FOLR1에 대한 어피니티를 측정하였다.
그 결과, Cys101을 각각 Ile(C101I), Val(C101V), Thr(C101T), Phe(C101F), Gln(C101Q) 및 Met(C101M)으로 개변한 항체의 FOLR1-mysHis에 대한 어피니티는 ChRA15-7Acc 항체가 갖는 어피니티의 50% 이상을 유지하고 있는 것이 나타났다.
구체적으로는, C101I, C101V, C101T, C101F, C101Q 및 C101M으로 개변한 항체는 각각 ChRA15-7Acc 항체의 73%, 55%, 88%, 80%, 64% 및 59%의 어피니티를 나타냈다(도 3). 이 결과는 HV7LV3 인간화 항체 개변체에 대하여 C101T로 개변한 (HuRA15-7CT) 항체의 어피니티가 향상된 것을 나타내고 있다.
시그널 서열을 포함하는 HuRA15-7CT 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 서열 번호 91 및 92로 나타냈다. 또한, 시그널 서열을 포함하지 않는 HuRA15-7CT 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 서열 번호 93 및 94로 나타냈다.
마찬가지로, 시그널 서열을 포함하는 HuRA15-7CT 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 서열 번호 95 및 96으로 나타냈다. 또한, 시그널 서열을 포함하지 않는 HuRA15-7CT 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열 및 아미노산 서열은 서열 번호 97 및 98로 나타냈다.
또한, HuRA15-7CT 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 30, 31 및 99로 나타냈다. 또한, HuRA15-7CT 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 33, 34 및 35로 나타냈다.
[실시예 46]
CDC 활성 증강 기술을 적용한 디퍼렌셜 코스형의 HuRA15-7CT 항체 발현 벡터의 구축
CDC 활성 증강 기술을 적용한 디퍼렌셜 코스형의 HuRA15-7CT(이하, HuRA15-7CTAcc로 기재함) 항체 발현 벡터의 구축은, 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 91을, 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 95를 사용하여, 실시예 26과 마찬가지로 행하였다.
[실시예 47]
디퍼렌셜 코스형의 HuRA15-7CT 항체 발현 세포 및 HuRA15-7CTAcc 항체 발현 세포의 조성
디퍼렌셜 코스형의 HuRA15-7CT(이하, HuRA15-7CTDF로 기재함) 항체 발현 세포 및 HuRA15-7CTAcc 항체 발현 세포의 조성에는, CHO/Ms704를 사용하였다. 발현 벡터는 실시예 42에서 제작한 HuRA15-7CT 항체 발현 벡터, 또는 실시예 46에서 제작한 HuRA15-7CTAcc 항체 발현 벡터를 사용하였다. 통상 계대 시의 배양, 유전자 도입, 약제 내성 세포의 선택, 배양 상청의 회수는 실시예 7과 마찬가지로 하였다.
[실시예 48]
HuRA15-7CTDF 항체 및 HuRA15-7CTAcc 항체의 정제
배양 상청으로부터의 HuRA15-7CTDF 항체 및 HuRA15-7CTAcc 항체의 정제는 실시예 8과 마찬가지로 하였다. 280nm의 흡광 계수를 HuRA15-7CTDF 항체는 1.38, HuRA15-7CTAcc 항체는 1.37로 하여 농도를 산출하였다.
[실시예 49]
HuRA15-7CTAcc 항체의 어피니티 측정(표면 플라즈몬 공명법)
실시예 29와 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법에 의해, HuRA15-7CTAcc 항체의 FOLR1에 대한 어피니티를 측정하였다.
그 결과, HuRA15-7CTAcc 항체의 FOLR1-mycHis에 대한 어피니티는 KD값이 0.65nmol/L이었다(표 3). 따라서, MORAb-003 항체(KD=57nmol/L, 실시예 29)보다 현저하게 높은 어피니티로 FOLR1에 결합하는 항체인 것이 나타났다.
Figure pct00004
[실시예 50]
HuRA15-7CTDF 항체 및 ChRA15-7DF 항체의 특이성 평가(ELISA법)
HuRA15-7CTDF 항체, ChRA15-7DF 항체 및 MORAb-003DF 항체의 FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc에 대한 반응성을 평가하였다.
먼저, PBS로 2μg/mL로 제조한 FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc를, 50μL/웰로 ELISA용 96웰 플레이트에 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하였다. PBS로 웰을 세정 후, 1% BSA/PBS를 200μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 블로킹을 행하였다. 다시 PBS로 웰을 세정한 후, 1% BSA/PBS로 7단계의 농도(1.4, 4.1, 12, 37, 111, 333, 1000ng/mL)로 제조한 HuRA15-7CTDF 항체, ChRA15-7DF 항체, MORAb-003DF 항체 및 음성 대상으로서 디퍼렌셜 코스형 항 DNP 인간 IgG1(DNPDF) 항체를 각각 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다.
각 웰을 0.05% tween20/PBS로 세정하고, 1% BSA/PBS로 2000배로 희석한 Goat anti-Human kappa-HRP(사우던 바이오테크)를 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 각 웰을 PBS로 세정한 후, ABTS 기질액을 50μL/웰 가해서 실온에서 반응시켰다. 발색이 충분히 확인된 후, 5% SDS 용액을 가해서 반응을 정지하고, 415nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, HuRA15-7CTDF 항체, ChRA15-7DF 항체 및 MORAb-003DF 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 FOLR1-Fc에 대해서는 동등한 결합 활성을 갖지만, FOLR2-Fc 및 FOLR3-Fc에는 결합하지 않는 것이 나타났다(도 4). 즉, HuRA15-7CTDF 항체, ChRA15-7DF 항체 및 MORAb-003DF 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 FOLR1에 특이적인 항체인 것이 나타났다.
[실시예 51]
HuRA15-7CTAcc 항체에 의한 면역 조직 염색
OCT 컴파운드에 포매되어, 동결된, 인간 정상 조직 어레이(대뇌, 소뇌, 심장, 폐, 위, 소장, 간장, 췌장, 침샘, 신장, 갑상선, 부신, 골격근, 비장, 난소, 자궁, 태반, 피부, 유선)에 대한 면역 조직 염색(IHC)을 HuRA15-7CTAcc 및 음성 대상 항체로서 DNPDF를 사용해서 실시하였다.
먼저, 아세톤에 의한 고정을 -20℃에서 5분간 행하여, 풍건을 10분간 행한 후, 0.1% NaN3 및 0.3% H2O2를 포함하는 PBS에 의한 내인성 퍼옥시다아제의 실활을 실온에서 행하였다. 계속해서, 비오틴 블로킹 시스템(Daco)에 의한, 내인성 비오틴의 실활을 행하였다.
또한, 1% BSA/PBS로 블로킹을 행하였다. 이어서, 1μg/mL로 제조한 HuRA15-7CTAcc 항체, MORAb-003 항체 및 DNPDF 항체를, 실온에서 1시간 반응시킨 후, PBS로 세정을 행하였다. 퍼옥시다아제 표지 스트렙트아비딘(니치레이)을 첨가하고, 5분간 반응시켜, PBS로 세정하였다. 0.02% H2O2/PBS로 제조한 DAB 태블릿(Tablet)(와코)을 첨가하고, 발색을 위해서 10분간 반응시켰다. 메이어 헤마톡실린(Mayer's Hematoxylin)(와코)을 2초 정도 반응시켜, 유수로 세정하고, 핵을 염색하였다.
염색된 샘플을, 70% 에탄올로 5분간, 95% 에탄올로 5분간, 그리고 100% 에탄올로 5분간 처리하고, 또한 100% 에탄올에 의한 처리를 3회 반복하였다. 계속해서, 100% 크실렌으로 5분간 처리하는 조작을 3회 반복하고, 투철(penetration)을 행하였다. 마지막으로, 엔텔란 뉴(Entellan®new)(메르크(Merck))로 봉입하였다.
염색 표본을 관찰한 결과, HuRA15-7CTAcc 항체의 염색이 양성이었던 조직은 폐(허파꽈리), 위(점막), 소장(점막, 점막근판), 췌장(도관, 선방 세포), 간장(담관), 침샘(선방 세포, 도관), 신장(요세관, 사구체), 부신(피질 세포, 간질조직), 갑상선(여포, 방여포 세포), 유선(선방), 자궁(경관상피), 난소(상피), 태반(합포체성 영양막 세포), 피부(한선)이며, 문헌[Cancer Res, 1992.52(23): p.6708-11., Int J Cancer, 2006.119(2): p.243-50.]의 보고와 마찬가지인 것이 시사되었다.
이어서, 인간 난소암 조직 8례(장액성 낭포암 4례, 장액성 낭포종 1례, 점액성 낭포암 2례, 경계형 점액성 낭포종 1례)에 대해서, 마찬가지의 염색을 실시하였다. 또한, HuRA15-7CTAcc 항체 및 음성 대상 항체의 DNPDF 항체에 더하여, MORAb-003 항체도 염색에 사용하였다.
그 결과, 장액성에서는 5례 중 5례(100%), 점액성에서는 3례 중 1례(33%)에 있어서, HuRA15-7CTAcc 항체 및 MORAb-003 항체에 의한 염색이 가능한 것이 나타났다. 또한, 양쪽 항체에서 염색된 조직 샘플은 염색된 영역이 동일했던 점에서, 난소암에 대한 양쪽 항체의 특이성은 동등한 것이 나타났다. 또한, MORAb-003 항체에 비해 HuRA15-7CTAcc 항체는 더욱 강하게 염색할 수 있는 것이 명확해졌다.
이어서, 상기 염색 샘플의 염색성을, H 스코어에 의해 정량화하였다. H 스코어는 암세포 중에서 양성으로 염색된 세포의 염색 강도를 4단계로 판정하고, 각 스코어의 암세포에서의 양성점거율(%)을 5% 간격으로 구한 후, 각 스코어와 양성점거율을 곱한 값의 총합으로 하였다.
그 결과, MORAb-003 항체 및 HuRA15-7CTAcc 항체 모두에 염색이 인정된 장액성 낭포암 4례, 장액성 낭포종 1례 및 점액성 낭포암 1례에 대해서, 어느 샘플에 있어서도, MORAb-003 항체에 대하여 HuRA15-7CTAcc 항체가 보다 높은 H 스코어를 나타냈다. 한편, 점액성 낭포암 1례 및 경계형 점액성 낭포종 1례에 대해서는, 어느 항체에 있어서도 염색이 인정되지 않았기 때문에, H 스코어는 0이었다.
이상에서, HuRA15-7CTAcc 항체는 난소암에 발현하는 FOLR1에 대하여 기존 난소암 치료 항체 MORAb-003 보다 강하게 결합하는 것이 시사되었다.
[실시예 52]
래트/인간 키메라형 항체 및 인간화 항체의 ADCC 활성 평가
ChRA15-7Acc 항체, CDC 활성 증강 기술을 적용한 디퍼렌셜 코스형 HV7LV3 인간 IgG1(HuRA15-7Acc) 항체 및 HuRA15-7CTAcc 항체를 사용하여, 실시예 31과 마찬가지로, 난소암 세포주에 대한 ADCC 활성을 평가하였다.
그 결과, 플라티나 내성 난소암에서 유래되는 SKOV-3 세포 및 OVCAR-3 세포에 대하여, HuRA15-7Acc 항체 및 HuRA15-7CTAcc 항체의 어느 ADCC 활성도 ChRA15-7Acc 항체와 동등한 것이 나타났다(도 5).
[실시예 53]
래트/인간 키메라형 항체 및 인간화 항체의 CDC 활성 평가
난소암 세포주에 대한 CDC 활성을 평가하였다.
표적으로 하는 암세포주 IGR-OV1을, 배양 플라스크로부터 0.02% EDTA 용액(나카라이)으로 박리하고, CDC 측정 배지[페놀 레드 불포함 RPMI1640(GIBCO), 1.4% BSA(SIGMA)]에서 1×104cells/50μL로 제조하여, 타깃 세포 용액으로 하였다.
이어서, 인간 혈청 동결 건조품(SIGMA)을 정제수 1mL에 용해하고, 또한 CDC 측정 배지 1mL를 가해서 보체 용액으로 하였다. 항체 용액은 최종 농도가 0.032, 0.16, 0.8, 4.0, 20, 100μg/mL가 되도록, HuRA15-7CTAcc 항체, HuRA15-7CTDF 항체, ChRA15-7Acc 항체, ChRA15-7DF 항체 및 MORAb-003을, 먼저, CDC 측정 배지에서 0.096, 0.48, 2.4, 12, 60, 300μg/mL로 제조하였다.
상기와 같이 제조한 타깃 세포 용액, 보체 용액, 그리고 항체 용액을, 평평한 바닥의 96웰 플레이트에서 각각 50μL/웰씩 혼합하고, 전량으로 150μL/웰로 하였다. 각각의 웰을 잘 혼합한 후, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이어서, 각각의 웰을 잘 교반하고, 셀타이터 96 애퀴어스 원 솔루션 셀 프롤리퍼레이션 어세이(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)(프로메가(Promega))를 30μL/well로 첨가하고, 교반 후, 또한 37℃에서 1시간 정도 반응시켰다. 충분한 발색이 보인 후, 490nm의 흡광도를 측정하였다.
CDC 활성의 산출은 먼저 각 웰의 흡광도 측정값으로부터, CDC 측정 배지와 보체 용액을 혼합한 웰의 흡광도 측정값을 빼고, 각 웰의 흡광도 보정값으로 한 후, 다음 식으로 계산을 행하였다.
Figure pct00005
여기서, Exp는 각 샘플의 흡광도 보정값, ST는 타깃 세포 용액 및 보체 용액의 혼합 웰의 흡광도 보정값을 나타낸다.
그 결과, HuRA15-7CTAcc 항체 및 HuRA15-7CTDF 항체는 각각 ChRA15-7Acc 항체 및 ChRA15-7DF 항체에 대하여 유의하게 높은 CDC 활성을 나타내는 것이 명확해졌다[도 6(a)]. 또한, HuRA15-7CTAcc 항체는 MORAb-003보다 유의하게 높은 CDC 활성을 나타냈다[도 6(b)].
[실시예 54]
HuRA15-7CTAcc 항체와 기존 항 FOLR1 항체의 ADCC 활성 비교
HuRA15-7CTAcc 항체, MORAb-003Acc 항체 및 MORAb-003 항체를 사용하여, 실시예 31과 마찬가지로, 난소암 세포주에 대한 ADCC 활성을 평가하였다.
그 결과, 플라티나 내성 난소암에서 유래하는 SKOV-3 세포 및 OVCAR-3 세포에 대하여 MORAb-003 및 MORAb-003Acc 항체보다 저농도에서 HuRA15-7CTAcc 항체의 ADCC 활성이 검출되었다(도 7). 즉, HuRA15-7CTAcc 항체는 기존의 항 FOLR1 인간화 항체(MORAb-003)에 기존의 ADCC 활성 증강 기술(디퍼렌셜 코스화)을 조합한 MORAb-003Acc 항체와 비교하여, 높은 ADCC 활성을 갖는 것이 명확해졌다.
마찬가지로, IGR-OV1 세포에 대하여 MORAb-003 항체보다 저농도에서 HuRA15-7CTAcc 항체의 ADCC 활성이 검출되었다. 또한, 난소암 세포주에 대한 MORAb-003Acc 항체의 ADCC 활성은 IGR-OV1, SKOV-3, 그리고 OVCAR-3 세포의 순서로 저하되지만, HuRA15-7CTAcc 항체의 ADCC 활성은 어느 난소암 세포주에 대해서도, 거의 동등하였다.
이상에서, HuRA15-7CTAcc 항체는 플라티나 내성 난소암에 대한 치료 항체로서, 기존 항체(MORAb-003) 및 기존 항체에 기존 기술을 조합한 항체(MORAb-003Acc)보다 유용한 것이 시사되었다.
[실시예 55]
HuRA15-7CTDF 항체의 종양 집적성 평가
HuRA15-7CTDF 항체 및 MORAb-003DF 항체의 동태를 형광 이미징에 의해 해석하였다. 먼저, HuRA15-7CTDF 항체 및 MORAb-003DF 항체를 각각 제노라이트(XenoLight) CF 770 키트로 표지해(HuRA15-7CTDF-770 항체 및 MORAb-003DF-770 항체), 음성 대상으로서 DNPDF 항체를 제노라이트 CFTM 680 키트로 표지하였다(DNPDF-680 항체). 표지된 각 항체의 결합성은 SKOV-3 세포에 대한 유세포 분석 반응성으로 확인하였다. 또한, 각 항체의 표지화율을 첨부서에 따라서 구하였다.
배양한 SKOV-3 세포를 PBS에 현탁하고, BALB/cAJcl-nu/nu 마우스(암컷, 5주령, 닛폰 크레아)의 측방 배면부에 피하이식하였다. 이식한 종양의 체적이 약 200mm3가 된 곳에서 알팔파 프리(alfalfa-free)의 사료로 변경하고, 1주일 더 사육하였다. 1군당 4마리의 마우스로 하고, 평균 종양 체적이 동등하게 되도록 무작위로 마우스를 3군으로 나누었다.
이어서, 10μg의 HuRA15-7CTDF-770 항체 또는 MORAb-003DF-770 항체와, 2μg의 DNPDF-680 항체를 혼합하고, PBS로 전량을 200μL로 한 것을, 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 투여한 항체의 동태는 IVIS 이미징 시스템(Imaging System)(캘리퍼(Caliper))을 사용해서 마우스로부터의 형광 강도를 촬영하여, 평가하였다. 투여 4시간 후에 최초의 촬영을 하고, 이후 경시적으로 촬영하였다.
촬영된 마우스의 HuRA15-7CTDF-770 항체 및 MORAb-003DF-770 항체 유래의 형광 강도는 각 투여 항체 용액의 형광 강도로 보정하였다. 또한, DNPDF-680 항체 유래의 형광 강도를 마우스 내부 표준으로서, 관찰된 HuRA15-7CTDF-770 항체 및 MORAb-003DF-770 항체의 형광 강도와의 비를 산출하여, 각각의 항체의 동태를 평가하였다.
그 결과, HuRA15-7CTDF-770 항체는 MORAb-003DF-770 항체에 비해, 이식한 SKOV-3 종양 덩어리에 현저하게 많고, 또한 장시간 국재하는 것이 명확해졌다(도 8). 이상의 결과는 본 발명의 항체가 플라티나 내성 난소암 세포주 SKOV-3 유래의 진행암에 대하여 현저한 집적성 및 잔존성을 나타내고, 암 치료 항체로서 보다 높은 항종양 활성을 시사하는 것이다.
[실시예 56]
필리핀 원숭이 단회 투여 시험
HuRA15-7CTAcc 항체(100mg/kg)를 필리핀 원숭이(암컷, 4 내지 6세, 3마리)에 정맥내 투여하고, 그 영향을 해석하였다. 검사 항목으로서는, 일반 상태 관찰, 체중, 섭취량, 체온, 소변 검사(소변량, 소변 비중, 뇨 단백질, 뇨당, 크레아티닌, NAG, Na, K, Cl), 혈액학적 검사(백혈구, 림프구, T 세포, Th 세포, Tc 세포, B 세포, NK 세포, 호중구, 단구, 호산구, 호염기구, 대형 비염색구, 적혈구, Hb 농도, Ht값, 망상적혈구, 혈소판, PT, APTT, 피브리노겐), 혈액 생화학적 검사(ALT, ALP, AST, CK, CRP, IL-6, C3, C4, CH50, 총 빌리루빈, 총 단백질, 알부민, 글로불린, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, 혈당, BUN, 크레아티닌, 무기 인, Ca, Na, K, Cl), 부검, 기관 중량, 병리 조직학적 검사를 실시하였다.
그 결과, 염증, 면역 반응에 관련하는 변화가 인정되었지만 경미하고, 또한 프라세보 투여에서도 마찬가지 변화가 인정되었다. 따라서, 어느 검사 항목에서도, HuRA15-7CTAcc 항체 특이적인 독성은 보이지 않았다.
[실시예 57]
HuRA15-7CRAcc 항체 발현 벡터의 제작
Cys101을 Arg로 아미노산 치환한 HV7LV3 인간화 항체 개변(HuRA15-7CR) 항체 발현 벡터(실시예 42)를 사용하고, 실시예 26과 마찬가지로 CDC 활성 증강 기술을 적용하고, CDC 활성 증강 기술을 적용한 디퍼렌셜 코스형의 HuRA15-7CR(이하, HuRA15-7CRAcc로 기재함) 항체 발현 벡터로 하였다.
[실시예 58]
HuRA15-7CRAcc 항체 발현 세포의 조성
HuRA15-7CRAcc 항체 발현 세포의 조성에는 CHO/Ms704 세포를 사용하였다. 또한, 발현 벡터는 실시예 57에서 제작한 HuRA15-7CRAcc 항체 발현 벡터를 사용하였다. 통상 계대 시의 배양, 유전자 도입, 약제 내성 세포의 선택 및 배양 상청의 회수는 실시예 7과 마찬가지로 하였다.
[실시예 59]
HuRA15-7CRAcc 항체의 정제
회수한 배양 상청으로부터의 HuRA15-7CRAcc 항체의 정제는 실시예 8과 마찬가지의 방법으로 행하였다. HuRA15-7CRAcc 항체의 280nm의 흡광 계수를 1.37로 하여 농도를 산출하였다.
[실시예 60]
HuRA15-7CRAcc 항체의 어피니티 측정(표면 플라즈몬 공명법)
표면 플라즈몬 공명법에 의해, HuRA15-7CRAcc 항체의 FOLR1에 대한 어피니티를 측정하였다. HuRA15-7CTAcc 항체, HuRA15-7CRAcc 항체 및 MORAb-003DF 항체를 사용하여, 조작은 실시예 29와 마찬가지로 하였다.
그 결과, HuRA15-7CRAcc 항체 및 MORAb-003DF 항체의 FOLR1-mycHis에 대한 어피니티는 각각 HuRA15-7CTAcc 항체가 갖는 어피니티의 2.6% 및 1.1%이었다.
[실시예 61]
HuRA15-7CRAcc 항체의 ADCC 활성 평가
HuRA15-7CTAcc 항체, HuRA15-7CRAcc 항체 및 MORAb-003DF 항체를 사용하여, 실시예 31과 마찬가지로, 난소암 세포주에 대한 ADCC 활성을 평가하였다.
그 결과, 플라티나 내성 난소암 세포주 OVCAR-3에 대하여 HuRA15-7CTAcc 항체, HuRA15-7CRAcc 항체, MORAb-003DF 항체의 순서대로, 더 낮은 항체 농도에서 ADCC 활성이 나타났다(도 9). 즉, HuRA15-7CRAcc 항체는 MORAb-003DF 항체와 동등한 어피니티를 가짐(실시예 60)에도 불구하고, HuRA15-7CRAcc 항체는 MORAb-003DF보다 저농도에서, 강한 ADCC 활성을 나타냈다. 이상에서, 항 FOLR1 항체가 강한 ADCC 활성을 발휘하기 위해서는, FOLR1에 대한 어피니티의 강도뿐만 아니라, RA15-7 클론 유래의 항체의 에피토프(실시예 35)를 인식하는 것이 중요하다는 것이 시사되었다.
[실시예 62]
HuRA15-7CTAcc 항체의 에피토프 해석(ELISA법)
실시예 35와 마찬가지로, 실시예 11에서 제작한 FOLR1-mycHis 및 실시예 34에서 제작한 Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, Rat4-FOLR1-mycHis를 사용하여, ChRA15-7Acc 항체, MORAb-003 항체, MOv18 항체 및 HuRA15-7CTAcc 항체의 반응성을 평가하였다.
그 결과를 표 4에 나타내었다. 흰색 동그라미는 반응을 보인 것, ×는 반응을 보이지 않은 것을 나타낸다. HuRA15-7CTAcc 항체는 FOLR1-mycHis, Rat1-FOLR1-mycHis 및 Rat4-FOLR1-mycHis에 반응을 보이고, Rat2-FOLR1-mycHis에는 반응을 보이지 않았다. 따라서, HuRA15-7CTAcc 항체는 ChRA15-7Acc 항체와 마찬가지로, FOLR1-mycHis의 55 내지 62번째의 아미노산 서열을 인식한다는 것이 시사되었다.
Figure pct00006
[실시예 63]
난소암 세포주의 세포막 상에서 발현하는 FOLR1의 정량 해석
난소암 세포주(IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3, MCAS)의 세포막 상의 FOLR1 발현량을, QIFIKIT(다코)를 사용해서 해석하였다. 항 FOLR1 항체로서 LK26(GeneTex) 및 음성 대상으로서 마우스 IgG2a(다코)를 각각 20μg/mL의 농도로 사용하고, QIFIKIT 첨부문서에 따라서 세포 및 캘리브레이션 비즈를 염색하였다.
염색 세포는 3 샘플씩 제조하고, 각각 유세포 분석으로 MFI값을 검출했다(도 10). 3 샘플의 MFI 평균값을 가지고, 각각의 세포의 MFI값으로 하였다. 이어서, 각각의 세포 및 캘리브레이션 비즈의 MFI값을, 야마사 쇼유 가부시끼가이샤가 제공하는 QIFIKIT용 ABC 칼큘레이터(ABC CALCULATOR for QIFIKIT)에 입력하고, 각각의 난소암 세포주 상에서 발현하는 FOLR1 분자수를 구하였다.
그 결과, IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3 및 MCAS의 세포막 상에서 발현하는 FOLR1은 1 세포당 각각 1.17×106, 1.10×105, 6.63×104 및 1.37×104 분자인 것이 나타났다(도 10).
여기서, 실시예 54(도 7)의 결과와 합하면, HuRA15-7CTAcc 항체는 FOLR1 저 발현(세포막 상의 FOLR1 분자수가 1×104 내지 1×105)의 세포이어도, FOLR1 고발현(세포막 상의 FOLR1 분자수가 1×106)의 세포와 마찬가지 ADCC 활성을 나타내는 것이 명확해졌다. 이상에서, FOLR1이 고발현의 암세포뿐만 아니라, 저발현의 암세포에 대한 치료 항체로서도, 기존 항체(MORAb-003) 및 기존 항체에 기존 기술을 조합한 항체(MORAb-003Acc)보다 유용하다는 것이 시사되었다.
[실시예 64]
인간 유방암 조직 면역 염색
실시예 51과 마찬가지로, 인간 유방암 조직 어레이(바이오체인(BioChain))를 면역 조직 염색(IHC)에 제공하였다. 어레이에는 침윤성 유관암(invasive ductal carcinoma) 조직이 35례, 침윤성 소엽암(invasive lobular carcinoma) 조직이 2례, 정상 조직이 3례 포함되어 있고, 각각 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), Her2의 음양 정보가 부수되어 있었다.
염색의 결과, HuRA15-7CTAcc 및 MORAb-003 항체에서 양성이었던 것은, ER 양성 /또는 PR 양성 및 Her2 음성의 조직에서 56% 및 27%, ER 양성 /또는 PR 양성 및 Her2 양성의 조직에서 50% 및 50%, ER 음성 /또는 PR 음성 및 Her2 양성의 조직에서 71% 및 14%, ER 음성, PR 음성 및 Her2 음성의 조직에서 22% 및 11%이었다. 이 결과로부터, MORAb-003 항체와 비교해서 HuRA15-7CTAcc 항체는 보다 감도 좋게 FOLR1 양성의 유방암 조직을 염색할 수 있다는 것이 명확해졌다.
또한, HuRA15-7CTAcc 항체로 염색이 보인 샘플의 H 스코어는 동일한 조직 샘플에 대한 MORAb-003 항체의 H 스코어에 대하여 모두 높은 스코어였다. 이상에서, HuRA15-7CTAcc 항체는 유방암에서 발현하는 FOLR1에 대하여 기존 항체 MORAb-003보다 강하게 결합한다는 것이 시사되었다.
[실시예 65]
난소암성 복수 유래 세포를 사용한 자가 방혈(autologous depletion) 시험
몰레큘러 리스판스(Molecular Response)사(MR사)로부터 동결된 난소암성 복수 유래 세포를 구입하고, 이하의 자가 방혈 시험을 실시하였다.
먼저, 동결 난소암성 복수 유래 세포를 37℃의 수조에서 융해하고, 복수 세포용 배지에 현탁하였다. 복수 세포용 배지는 RPMI1640 GlutaMax(GIBCO)에, 10% 비동화 완료 FCS, 1/100양의 페니실린 & 스트렙토마이신(Penicillin & Streptomycin)(GIBCO), 1/100양의 비필수 아미노산(non essential amino acid)(GIBCO) 및 1/100양의 소듐 피루베이트(Sodium Pyruvate)(GIBCO)를 첨가한 것을 사용하였다.
먼저, 세포 현탁액을 2×106cells/450μL가 되도록 제조하고, 24웰 플레이트에 대하여 각 웰 450μL씩 파종하였다. 이어서, 최종 농도가 1 내지 1000ng/mL가 되도록 HuRA15-7CTAcc 항체, MORAb-003 항체 및 음성 대상으로서 DNPDF 항체를 복수 세포용 배지로 제조하고, 50μL/웰로 첨가하였다. 그 후, 37℃에서 24시간 배양하였다.
배양 후, 각 웰을 잘 피펫팅하여 혼화하고, 250μL씩 별도의 튜브에 분취하였다. 각 튜브를 200×g, 5분간, 4℃에서 원심 분리를 행하여, 상청을 제거하였다. 이어서, 2mL의 스테인 버퍼(Stain Buffer)(FBS)(BD 바이오사이언스(Biosciences))로 세포 펠릿을 현탁하고, 같은 원심 분리를 행하여, 상청을 제거하고, 세포를 세정하였다. 세포 펠릿을, 100μL의 스테인 버퍼(FBS)로 현탁하고, 암세포 검출용 염색 및 음성 대상용 염색을 행하였다.
암세포 검출용 염색에는 CD45-PerCP(BD 바이오사이언스), CD14-FITC(BD 바이오사이언스), EpCAM-APC(BD 바이오사이언스) 및 FOLR1-PE(R&D 시스템)를 사용하였다. 음성 대상용 염색에는 CD45-PerCP(BD 바이오사이언스), CD14-FITC(BD 바이오사이언스), mIgG1-APC(BD 바이오사이언스) 및 mIgG1-PE(BD 바이오사이언스)를 사용하였다.
실온에서 30분간 반응시킨 후, 2mL의 스테인 버퍼(FBS)로 현탁하고, 원심 분리에 의한 세정을 행하였다. 세정 후의 세포 펠릿에, 1/100양의 7-AAD(BD 바이오사이언스)를 첨가한 400μL의 스테인 버퍼(FBS)를 가하여 현탁하고, 유세포 분석 측정 샘플로 하였다.
세포 염색에 사용한 형광 색소에 대하여 적절하게 컴펜세이션(compensation)한 후, 각 샘플을 유세포 분석으로 측정하였다. 먼저, 7-AAD 음성(-)/CD45(-)/CD14(-)의 세포 집단을 게이팅하고, 다음으로 FSC, SSC로 림프구를 제거한 획분을 게이팅하였다. 그 세포 획분에 대하여 음성 대상용 염색 샘플에서 mIgG1-APC 및 mIgG1-PE의 검출 위치를 정한 후에, 암세포 검출용 염색 샘플의 FOLR1 및 EpCAM 양성(+) 획분을 암세포 집단으로 하였다.
또한, 7-AAD(-)/CD14(-)/CD45(+)의 획분의 검출 카운트가 일정수가 되도록 측정함으로써, 각 샘플 간의 암세포 획분의 세포수 변화를 비교하였다.
암세포 획분에 검출되는 세포수가, HuRA15-7CTAcc 항체, MORAb-003 항체, 또는 DNPDF 항체를 첨가한 샘플에서 어느 정도 감소했는지를, 종축에 세포 장애 활성(%)으로서 나타냈다(도 11). 횡축은 항체 농도(ng/mL)를 나타낸다.
여기서, 도 11의 FZ12, FZ21, FZ26 및 FZ44는 각각 난소암성 복수의 도너(SPECNUM/Patient ID가 2003090712/7028, 2009080521/173089, 2009060526/5208 및 2003041044/113139)를 나타낸다. 또한, 어느 샘플도, MR사가 실시한 익스 비보(ex vivo) 약제 내성 시험에서, 시스플라틴 내성의 암세포를 포함하는 난소암성 복수라고 나타내고 있다.
그 결과, 도 11에 도시한 바와 같이, 어느 샘플에서도, MORAb-003 항체에 비하여 HuRA15-7CTAcc 항체에서는, 보다 저농도에서, 더 강한 세포 상해 활성이 검출되었다.
이상에서, 난소암 환자의 복수 유래 세포군에 HuRA15-7CTAcc 항체를 첨가하면, 복수 중의 이펙터 세포에 의해, 복수 중의 플라티나 내성 암세포가 살상되는 것이 나타났다. 또한, HuRA15-7CTAcc 항체에 의한 이 세포 상해 활성은 기존 난소암 치료 항체 MORAb-003보다 높은 것이 나타났다.
[실시예 66]
난소암 세포주의 FOLR1 발현량과 엽산 도입량의 해석
먼저, 난소암 세포주 IGR-OV1(국립 암 연구소), OVISE(JCRB 세포 번호: JCRB1043), SKOV-3(ATCC 번호: HTB-77), Caov-3(ATCC 번호: HTB-75), RMG-1(JCRB 세포 번호: JCRB0172), OV-90(ATCC 번호: CRL-11732), OVCAR-3(ATCC 번호: HTB-161), MCAS(JCRB 세포 번호: JCRB0240) 및 TOV-112D(ATCC 번호: CRL-11731) 상에서 발현하는 FOLR1을 유세포 분석으로 측정하였다.
각각의 세포주를 배양 후, 0.02% EDTA 용액(나카라이)으로 박리하고, PBS로 세정한 후, FCM 버퍼(1mM EDTA, 0.05% 아지드화 나트륨, 5% 비동화 완료 FCS를 포함하는 PBS)에 현탁하였다. 이어서, 1웰당 1×105개가 되도록 96웰 플레이트에 파종하고, 1700rpm으로 1분간의 원심 분리를 행하였다. 상청을 제거한 후, FCM 버퍼로 1μg/mL로 제조한 HuRA15-7CTAcc 항체를 첨가하고, 4℃에서 30분간의 반응을 행하였다.
세포를 세정한 후, FCM 버퍼로 200배로 희석한 Anti-Human IgG-FITC(잭슨(Jackson))를 첨가하고, 4℃에서 30분간의 반응을 행하였다. 다시 세포를 세정한 후, 세포를 FCM 버퍼로 현탁하고, 형광 강도를 유세포 분석기(베크만 콜터사제, FC500MPL)로 해석하고, 각각의 세포의 MFI값을 구하였다. 마찬가지로, DNPDF 항체로 염색한 각각의 세포의 MFI값을 구하고, DNPDF 항체에 대한 HuRA15-7CTAcc 항체에서의 상대 MFI값을 산출했다[도 12(a)].
그 결과, IGR-OV1, OVISE, SKOV-3, Caov-3, RMG-1, OV-90, OVCAR-3, MCAS 및 TOV-112D의 순서대로 FOLR1이 고발현하고 있는 것이 나타났다.
이어서, 동일한 난소암 세포주를 엽산 불포함 배지[10% 비동화 완료 투석 FCS를 포함하는 엽산 불포함 RPMI1640(인비트로젠)]에서 3일간 배양하였다. 그 후, 표지화 엽산을, 최종 농도 100nm가 되도록 첨가하고, 37℃에서 3시간 배양하였다.
이어서, 37℃의 PBS로 세포를 세정 후, 1mM의 엽산을 첨가한 배지에서, 37℃에서 3시간 배양하였다. PBS로 세포를 세정 후, 트립신(GIBCO)으로 세포를 박리하고, FCM 버퍼로 현탁하였다. 형광 강도를 유세포 분석으로 해석하고, 각각의 세포의 MFI값을 구하였다. 마찬가지로, 표지화 엽산을 첨가하지 않은 세포의 MFI값을 구하고, 그것에 대한 100nM의 표지화 엽산 첨가 샘플의 상대 MFI값을 산출했다[도 12(b)].
그 결과, FOLR1 발현량과 엽산 도입량에는, 상관이 보이지 않는 것이 나타났다. 예를 들어, SKOV-3은 IGR-OV1, OVISE에 뒤잇는 FOLR1 발현량이었지만, 엽산 도입량은 IGR-OV1, OVISE, Caov-3, RMG-1 및 OV-90보다 낮았다. 이 결과는 항암제 등을 접합한 엽산에 의한 치료는, FOLR1 발현량이 높은 타입의 암이어도 유효하지 않은 경우가 있는 것을 나타내고 있다.
한편, 엽산 도입량이 낮은 SKOV-3이나 OVCAR-3에 대하여 본 발명의 항체는 효과적인 세포 상해 활성을 나타낸다(실시예 54). 이상의 결과는, 엽산 도입량이 적기 때문에 항암제 등을 접합한 엽산에 의한 항종양 활성이 드러나지 않는 암에 대해서도 본 발명의 항체는 유효하다는 것을 나타내고 있다.
본 발명을 특정한 형태를 사용해서 상세하게 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 여러 변형 및 변형이 가능하다는 것은, 당업자에 있어서 명확하다. 또한, 본 출원은 2012년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원(제61/734,610호) 및 2012년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원(제61/734,547호)에 기초하고 있고, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
서열 번호 1: FOLR1의 아미노산 서열
서열 번호 2: FOLR1-F의 염기 서열
서열 번호 3: FOLR1-R의 염기 서열
서열 번호 4: CyFOLR1-F의 염기 서열
서열 번호 5: CyFOLR1-R의 염기 서열
서열 번호 6: CyFOLR1_DNA의 염기 서열
서열 번호 7: CyFOLR1_AA의 아미노산 서열
서열 번호 8: FOLR1-Fc-F의 염기 서열
서열 번호 9: FOLR1-Fc-R의 염기 서열
서열 번호 10: FOLR2-Fc-F의 염기 서열
서열 번호 11: FOLR2-Fc-R의 염기 서열
서열 번호 12: FOLR3-Fc-F의 염기 서열
서열 번호 13: FOLR3-Fc-R의 염기 서열
서열 번호 14: CyFOLR1-Fc-F의 염기 서열
서열 번호 15: CyFOLR1-Fc-R의 염기 서열
서열 번호 16: FOLR1-mH-F의 염기 서열
서열 번호 17: FOLR1-mH-R의 염기 서열
서열 번호 18: RatIgG1H-A의 염기 서열
서열 번호 19: RatIgG1H-B의 염기 서열
서열 번호 20: Ratk-A의 염기 서열
서열 번호 21: Ratk-B의 염기 서열
서열 번호 22: RA15-7VH_DNA의 염기 서열
서열 번호 23: RA15-7VH_AA의 아미노산 서열
서열 번호 24: RA15-7VL_DNA의 염기 서열
서열 번호 25: RA15-7VL_AA의 아미노산 서열
서열 번호 26: nonS_RA15-7VH_DNA의 염기 서열
서열 번호 27: nonS_RA15-7VH_AA의 아미노산 서열
서열 번호 28: nonS_RA15-7VL_DNA의 염기 서열
서열 번호 29: nonS_RA15-7VL_AA의 아미노산 서열
서열 번호 30: RA15-7VHCDR1_AA의 아미노산 서열
서열 번호 31: RA15-7VHCDR2_AA의 아미노산 서열
서열 번호 32: RA15-7VHCDR3_AA의 아미노산 서열
서열 번호 33: RA15-7VLCDR1_AA의 아미노산 서열
서열 번호 34: RA15-7VLCDR2_AA의 아미노산 서열
서열 번호 35: RA15-7VLCDR3_AA의 아미노산 서열
서열 번호 36: RA15-7-VLF의 염기 서열
서열 번호 37: RA15-7-VLR의 염기 서열
서열 번호 38: RA15-7-VHF의 염기 서열
서열 번호 39: RA15-7-VHR의 염기 서열
서열 번호 40: FcAcc_DNA의 염기 서열
서열 번호 41: FcAcc_AA의 아미노산 서열
서열 번호 42: Rat1-FOLR1-mycHis_DNA의 염기 서열
서열 번호 43: Rat2-FOLR1-mycHis_DNA의 염기 서열
서열 번호 44: Rat4-FOLR1-mycHis_DNA의 염기 서열
서열 번호 45: Rat1-FOLR1-mycHis_AA의 아미노산 서열
서열 번호 46: Rat2-FOLR1-mycHis_AA의 아미노산 서열
서열 번호 47: Rat4-FOLR1-mycHis_AA의 아미노산 서열
서열 번호 48: HV0의 염기 서열
서열 번호 49: HV2의 염기 서열
서열 번호 50: HV3의 염기 서열
서열 번호 51: HV4의 염기 서열
서열 번호 52: HV5의 염기 서열
서열 번호 53: HV6의 염기 서열
서열 번호 54: HV7의 염기 서열
서열 번호 55: HV8의 염기 서열
서열 번호 56: HV10의 염기 서열
서열 번호 57: LV0의 염기 서열
서열 번호 58: LV2의 염기 서열
서열 번호 59: LV3의 염기 서열
서열 번호 60: LV4의 염기 서열
서열 번호 61: LV6의 염기 서열
서열 번호 62: HuRA15-7HV7_DNA의 염기 서열
서열 번호 63: C101M_DNA의 염기 서열
서열 번호 64: C101G_DNA의 염기 서열
서열 번호 65: C101D_DNA의 염기 서열
서열 번호 66: C101S_DNA의 염기 서열
서열 번호 67: C101Y_DNA의 염기 서열
서열 번호 68: C101A_DNA의 염기 서열
서열 번호 69: C101I_DNA의 염기 서열
서열 번호 70: C101V_DNA의 염기 서열
서열 번호 71: C101T_DNA의 염기 서열
서열 번호 72: C101F_DNA의 염기 서열
서열 번호 73: C101R_DNA의 염기 서열
서열 번호 74: C101W_DNA의 염기 서열
서열 번호 75: C101P_DNA의 염기 서열
서열 번호 76: C101Q_DNA의 염기 서열
서열 번호 77: C101M_AA의 아미노산 서열
서열 번호 78: C101G_AA의 아미노산 서열
서열 번호 79: C101D_AA의 아미노산 서열
서열 번호 80: C101S_AA의 아미노산 서열
서열 번호 81: C101Y_AA의 아미노산 서열
서열 번호 82: C101A_AA의 아미노산 서열
서열 번호 83: C101I_AA의 아미노산 서열
서열 번호 84: C101V_AA의 아미노산 서열
서열 번호 85: C101T_AA의 아미노산 서열
서열 번호 86: C101F_AA의 아미노산 서열
서열 번호 87: C101R_AA의 아미노산 서열
서열 번호 88: C101W_AA의 아미노산 서열
서열 번호 89: C101P_AA의 아미노산 서열
서열 번호 90: C101Q_AA의 아미노산 서열
서열 번호 91: HuRA15-7LV3_DNA의 염기 서열
서열 번호 92: HuRA15-7LV3_AA의 아미노산 서열
서열 번호 93: nonS_HuRA15-7LV3_DNA의 염기 서열
서열 번호 94: nonS_HuRA15-7LV3_AA의 아미노산 서열
서열 번호 95: HuRA15-7CTVH_DNA의 염기 서열
서열 번호 96: HuRA15-7CTVH_AA의 아미노산 서열
서열 번호 97: nonS_HuRA15-7CTVH_DNA의 염기 서열
서열 번호 98: nonS_HuRA15-7CTVH_AA의 아미노산 서열
서열 번호 99: HuRA15-7CTVHCDR3_AA의 아미노산 서열
서열 번호 100: HV0_AA의 아미노산 서열
서열 번호 101: LV0_AA의 아미노산 서열
서열 번호 102: Rat FOLR1의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Anti-FOLR1 Antibody <130> W514748 <150> US61/734610 <151> 2012-12-07 <150> US61/734547 <151> 2012-12-07 <160> 102 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly 35 40 45 Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr 65 70 75 80 Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 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Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Tyr Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101A_AA <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 83 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101I_AA <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ile Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101V_AA <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Val Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 85 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101T_AA <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101F_AA <400> 86 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101R_AA <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 88 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101W_AA <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Trp Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101P_AA <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Pro Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 90 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C101Q_AA <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 91 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HuRA15-7LV3_DNA <400> 91 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgac 60 atccagatga cacagtctcc atcttccctg tctgcatctc tcggagatcg cgtcaccatc 120 acctgtcgaa caagtgaaga cattttccgt aatttagcgt ggtatcagca gaagccaggg 180 aaggctccta agctcctgat ctatgataca aataggttgg cagatggggt cccatcacgg 240 ttcagtggca gtggttctgg cacagactac actctaacca tatccagtct gcaacctgaa 300 gatttcgcaa cctatttctg tcaacaatat gacaattatc cgctcacgtt cggtcagggg 360 accaagctgg agatcaaa 378 <210> 92 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HuRA15-7LV3_AA <400> 92 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile 35 40 45 Phe Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Asn 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 93 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nonS_HuRA15-7LV3_DNA <400> 93 gacatccaga tgacacagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctctcggaga tcgcgtcacc 60 atcacctgtc gaacaagtga agacattttc cgtaatttag cgtggtatca gcagaagcca 120 gggaaggctc ctaagctcct gatctatgat acaaataggt tggcagatgg ggtcccatca 180 cggttcagtg gcagtggttc tggcacagac tacactctaa ccatatccag tctgcaacct 240 gaagatttcg caacctattt ctgtcaacaa tatgacaatt atccgctcac gttcggtcag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 94 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> nonS_HuRA15-7LV3_AA <400> 94 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Phe Arg Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 95 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HuRA15-7CTVH_DNA <400> 95 atgaacctcg ggctcagttt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagttgg tggaatctgg tggcggtttg gtacagccgg ggggttcttt gcgactctcc 120 tgtgcagctt ctggcttcac cttcactgat ttctacatga actgggtccg ccagcctcca 180 gggaaggccc ctgagtggct gggttttatt cgaaacaaag ctaatggtta cacaacagag 240 ttcaatccgt ctgtgaaggg gcggttcacc atctcccgag ataattccaa gaacagcctc 300 tatcttcaaa tgaactccct gaagactgag gacactgcca cctactactg tgcacgaacc 360 ctctatggct atgcctatta ctatgttatg gatgcctggg gtcaaggcac tctggtcact 420 gtctcctca 429 <210> 96 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HuRA15-7CTVH_AA <400> 96 Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Phe Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 65 70 75 80 Phe Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 97 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nonS_HuRA15-7CTVH_DNA <400> 97 gaggtgcagt tggtggaatc tggtggcggt ttggtacagc cggggggttc tttgcgactc 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttcact gatttctaca tgaactgggt ccgccagcct 120 ccagggaagg cccctgagtg gctgggtttt attcgaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagttcaatc cgtctgtgaa ggggcggttc accatctccc gagataattc caagaacagc 240 ctctatcttc aaatgaactc cctgaagact gaggacactg ccacctacta ctgtgcacga 300 accctctatg gctatgccta ttactatgtt atggatgcct ggggtcaagg cactctggtc 360 actgtctcct ca 372 <210> 98 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> nonS_HuRA15-7CTVH_AA <400> 98 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 99 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HuRA15-7CTVHCDR3_AA <400> 99 Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Ala 1 5 10 <210> 100 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HV0_AA <400> 100 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Cys Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 101 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV0_AA <400> 101 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Phe Arg Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 102 <211> 255 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 102 Met Ala His Leu Met Ala Gly Gln Trp Leu Leu Leu Leu Met Trp Met 1 5 10 15 Ala Glu Cys Ala Gln Ser Arg Ala Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu 20 25 30 Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu 35 40 45 Asp Lys Leu His Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Thr Asn Ala Cys Cys 50 55 60 Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Asp Thr Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Tyr 65 70 75 80 Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Thr Met Thr Pro Glu Cys Lys Arg 85 90 95 His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly 100 105 110 Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu 115 120 125 Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Val Leu Trp Trp Glu Asp Cys 130 135 140 Lys Ser Ser Phe Thr Cys Lys Ser Asn Trp Leu Lys Gly Trp Asn Trp 145 150 155 160 Thr Ser Gly His Asn Glu Cys Pro Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe 165 170 175 Thr Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Val Leu Cys Glu Lys Ile Trp Ser 180 185 190 His Ser Tyr Lys Leu Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile 195 200 205 Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala 210 215 220 Arg Phe Tyr Ala Glu Val Met Ser Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ala Trp 225 230 235 240 Leu Leu Val Cys Ser Leu Ser Leu Val Leu Phe Cys Val Val Ser 245 250 255

Claims (16)

  1. 이하의 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 하나의 항체와 경합해서 인간 FOLR1을 특이적으로 인식하고, 상기 항체가 결합하는 인간 FOLR1에 존재하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하고, 또한 항종양 활성을 나타내는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편:
    (a) 상보쇄 결정 영역(complementarity determining region, 이하 CDR로 기재함) 1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄(이하, H쇄라 기재함)를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄(이하, L쇄라 기재함)를 포함하는 항체
    (b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체이고, 서열 번호 32(항체 H쇄의 CDR3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 시스테인이 트레오닌, 메티오닌, 이소류신, 발린, 페닐알라닌 또는 글루타민으로 치환된 항체
    (c) 서열 번호 98로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 서열 번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 재조합 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  3. 제2항에 있어서, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  4. 이하의 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 하나의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편:
    (a) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편
    (b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 30, 31, 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 33, 34, 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체이고, 서열 번호 32(항체 H쇄의 CDR3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 시스테인이 트레오닌, 메티오닌, 이소류신, 발린, 페닐알라닌 또는 글루타민으로 치환된 항체
    (c) 서열 번호 98로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하고, 또한 서열 번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1로 표시되는 인간 FOLR1의 아미노산 서열에 결합하는, 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V 영역(디아바디; diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인, 항체 단편.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA.
  8. 제7항에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
  9. 제8항에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입해서 얻어지는 형질전환주.
  10. 제9항에 기재된 형질전환주를 배지에서 배양하고, 배양물 중에 제1항 또는 제4항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 생성 축적시켜, 배양물로부터 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는, 제1항 또는 제4항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 치료 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편과 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 치료약.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하는, 인간 FOLR1 또는 인간 FOLR1 양성 세포의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 인간 FOLR1 양성 세포를 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 진단 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는, 인간 FOLR1 양성 세포가 관여하는 질환의 진단약.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하여, 당해 항체에 의한 치료 유효성을 치료 개시 전에 판단하는 방법.
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