TW202016110A

TW202016110A - Ｊａｋ激酶家族之小分子抑制劑

Info

Publication number: TW202016110A
Application number: TW108120432A
Authority: TW
Inventors: 菲利浦費南德斯; 保羅克拉祖克; 馬克蒂奇諾
Original assignee: 比利時商健生藥品公司
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2020-05-01
Also published as: US20210340144A1; MA52900A; NI202000100A; US20200165250A1; AU2019286641A1; CO2020015396A2; US11787807B2; UY38262A; BR112020024744A2; CL2020003227A1; CR20200603A; PH12020551984A1; KR20210021342A; CN112313233A; PE20212113A1; US11066406B2; MX2020013688A; ECSP20080817A; US20200017498A1; WO2019239387A1

Abstract

2-((1r,4r)-4-(咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)環己基)乙腈化合物、含有彼等之醫藥組成物、製造彼等的方法、及使用彼等的方法，包括用於治療由JAK所介導之疾病狀態、病症、及病況的方法。

Description

JAK激酶家族之小分子抑制劑

本發明係關於某些咪唑并吡咯并吡啶化合物、含有彼等之醫藥組成物、製造彼等之方法、及用彼等作為JAK抑制劑及用於治療由JAK所介導之疾病狀態、病症、及病況的方法。

內部因素、外部因素、或兩種因素之組合可以引發體內異常免疫反應的發展或與其有關。因此，病理狀態在易受到此類免疫反應影響之正常存在於體內的成分(諸如受質及組織)中發展。這些狀態通常稱為免疫系統疾病。因為涉及身體的免疫系統且損傷會影響身體組織，此類疾病亦稱為自體免疫疾病。由於此系統及組織係相同身體的一部分，無論何者引發異常的免疫系統反應，在此用語「自體免疫疾病(autoimmune disease)」與「免疫系統疾病(immune system disease)」可互換地使用。此外，潛在的免疫問題之識別或機制並不總是清楚的。參見例如，D.J.Marks,et al.,Crohn’s disease：An immune deficiency state,Clinical Reviews in Allergy and Immunology 38(1),20-30(2010)；J.D.Lalande,et al,Mycobacteria in Crohn’s disease：How innate immune deficiency may result in chronic inflammation,Expert Reviews of Clinical Immunology 6(4),633-41(2010)；J.K.Yamamoto-Furusho,et al.,Crohn’s disease：Innate immunodeficiency,World Journal of Gastroenterology,12(42),6751-55(2006)。如本文中所使用，用語「自體免疫疾病(autoimmune disease)」不排除成因包含外部因素或藥劑(諸如環境或細菌因素)及內部因素(諸如遺傳易感性)的病況。因此，在本文中諸如克隆氏病(Crohn’s disease,CD)之病況係稱為自體免疫疾病，不管其是藉由身體本身或是藉由外部因素引發。參見例如J.L. Casanova等人之Revisiting Crohn’s disease as a primary immunodeficiency of macrophages,J.Exp.Med.206(9),1839-43(2009)。

在由自體免疫疾病造成的各種不良效應中，一般觀察到下列中之至少一者：損傷組織、及有時破壞組織、以及可能影響器官生長及器官功能的器官改變。自體免疫疾病的實例影響大多數主要器官、內分泌和外分泌腺體、血液和肌肉、以及複數個系統，諸如消化系統、血管系統、結締系統、以及神經系統。常採用免疫抑制治療以治療自體免疫疾病。

已知有多個理論解釋自體免疫疾病如何產生，一些關注在內源性因素而其他亦包含外源性因素。在分子層級上，詹納斯激酶/訊號傳導及轉錄活化因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)的傳訊路徑被認為在將信息從細胞外的化學訊號傳遞到細胞核中扮演重要角色，導致參與諸如免疫力之細胞活動的基因調節。細胞介素係細胞外分子之一個實例，其在細胞傳訊中扮演重要角色。由細胞介素及趨化激素徵集的白血球(諸如嗜中性球)最終造成在慢性發炎性疾病中的組織損傷。

詹納斯激酶(Janus kinase,JAK)蛋白質家族由4種酪胺酸激酶所組成：JAK1、JAK2、JAK3、以及Tyk2，彼等係第I型及第II型細胞介素受體之細胞內傳訊的核心。用語JAK係指JAK1、JAK2、JAK3、或Tyk2、或其任何組合。各JAK選擇性地與受體次單元相連，其經二聚化(或多聚化)以形成功能性受體。根據J.D.Clark等人之Discovery and Development of Janus Kinase(JAK)Inhibitors for Inflammatory Diseases,J.Med.Chem.57(12),5023-38(2014)，「活化步驟發生在當細胞介素結合至其受體時，誘導受體次單元的多聚化(二聚化或更高階複合物)。這使得與各次單元相連之JAK彼此接近，引發一系列磷酸化事件，最終導致訊號傳導及轉錄活化因子(STAT)蛋白之磷酸化及活化。然後經磷酸化的STAT二聚物移位至細胞核，其於此結合至調節彼等表現之目標基因」。一旦在核中，STAT經由結合至DNA上特定識別位點來調節在發炎過程中許多中介物之基因轉錄。參見例如上面引用的J.Med.Chem.57(12),5023-38(2014)。存在相當多的證據證明JAK/STAT路徑在發炎性疾病、自體免疫疾病、以及癌症上的重要性。參見例如M.Coskun等人之Involvement of JAK/STAT signaling in the pathogenesis of inflammatory bowel disease,Pharmacological Research 76,1-8(2013)；及J.J.O'Shea等人之JAKs and STATs in immunity,immunodeflciency,and cancer,The New England Journal of Medicine 368,161-70(2013)。

包括克隆氏病及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)的發炎性腸疾病之特徵在於復發性腸發炎、上皮屏障的破壞、及微生物失衡。在腸胃道中過度的發炎反應由數個促發炎細胞介素所介導，包括TNFα、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、及IL-23，在包括T淋巴球及B淋巴球、上皮細胞、巨噬細胞、及樹突細胞(dendritic cell,DC)之先天性及適應性免疫系統的細胞上發揮彼等之效應。參見例如上面引用的Pharmacological Research 76,1-8(2013)；S.Danese等人之JAK inhibition using tofacitinib for inflammatory bowel disease treatment：A hub for multiple inflammatory cytokines,American Journal of Physiology,Gastrointestinal and Liver Physiology 310,G155-62(2016)；及M.F.Neurath,Cytokines in inflammatory bowel disease,Nature Reviews Immunology 14,329-42(2014)。

預防及/或控制此類過度的發炎性反應係所欲的。按照上面概述的此類反應機制，JAK抑制(參見圖1中的圖示，以鋸齒狀箭頭的形式顯示泛JAK抑制劑打在JAK/STAT傳訊路徑及發炎反應上)經設想以預防或控制過度的發炎性反應。抑制複數個此類JAK蛋白的JAK抑制劑在此稱為泛JAK抑制劑。此類預防或控制之治療效益的實例已見於托法替尼(tofacitinib)，其為在美國批准用於治療類風濕性關節炎的口服生物可利用性泛JAK抑制劑，且目前臨床開發用於潰瘍性結腸炎。在一項2期臨床試驗中，據報導評估了194位中度至重度潰瘍性結腸炎患者的臨床療效。參見例如W.J.Sandborn等人之Tofacitinib,an oral Janus kinase inhibitor,in active ulcerative colitis,The New England Journal of Medicine 367,616-24(2012)。在此試驗公開的資訊指出一天兩次(BID)接受劑量為0.5、3、10、及15mg的患者，臨床反應率分別達到32、48、61、及 78%，相較於安慰劑組中觀察到的42%。據進一步的報導，臨床緩解之次要終點(Mayo評分

2)係13、33、48、及41，相較於安慰劑組中觀察到的10%。參見例如上面引用的The New England Journal of Medicine 367,616-24(2012)。在3期UC臨床試驗中，用托法替尼(10mg BID)治療8週後，據報導476位患者中有88位達到臨床緩解，相較於接受安慰劑治療的122位患者中有10位達到臨床緩解。參見W.J.Sandborn,et al.Efficacy and safety of oral tofacitinib as induction therapy in patients with moderate-to-severe ulcerative colitis：results from 2 phase 3 randomised controlled trials,J.Crohns Colitis 10,S15-S(2016)。對克隆氏病的報導指出，托法替尼亦在開發中以用於治療CD；然而，據報導由於在中度至重度CD的4週/2期臨床試驗中未能達到臨床療效而中斷。參見W.J.Sandborn,et al.,A phase 2 study of tofacitinib,an oral Janus kinase inhibitor,in patients with Crohn's disease,Clinical gastroenterology and hepatology：The official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12,1485-93 e2(2014)。根據查閱公開可得的文獻，目前不清楚在CD中托法替尼的失敗是否與臨床研究設計、UC與CD之間的機制差異、或劑量限制全身性不良事件有關。參見上面引用的Pharmacological Research 76,1-8(2013)；上面引用的Clinical gastroenterology and hepatology：the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12,1485-93 e2(2014)；及C.J.Menet,et al.,Triazolopyridines as selective JAK1 inhibitors：from hit identification to GLPG0634,J.Med.Chem.57,9323-42(2014)。按照此JAK抑制劑的特徵，期望發現額外的JAK抑制劑以用於預防及/或控制過度的發炎性反應。

已報導關於使用托法替尼之2期與3期發炎性腸疾病(inflammatory bowel disease,IBD)臨床試驗兩者皆有全身性不良事件。參見上面引用的The New England Journal of Medicine 367,616-24(2012)；上面引用的Clinical gastroenterology and hepatology：the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12,1485-93 e2(2014)；及J.Panes,et al.Efficacy and safety of oral tofacitinib for induction therapy in patients with moderate-to-severe Crohn's disease：results of a Phase 2b randomised placebo-controlled trial,J.Crohns Colitis 10,S18-S19(2016)。這些不良事件包括絕對嗜中性球計數(absolute neutrophil counts,ANC)減少、總膽固醇(低密度和高密度脂質)升高、腸穿孔、及感染。此類不良事件與在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)患者中在托法替尼治療後所觀察到的一致(參見例如J.M.Kremer,et al.The safety and efficacy of a JAK inhibitor in patients with active rheumatoid arthritis：Results of a double-blind,placebo-controlled phase IIa trial of three dosage levels of CP-690,550 versus placebo,Arthritis and Rheumatism 60,1895-905(2009))，其中一些可能由EPO、TPO、及群落刺激因子(csf-2和GM-CSF(顆粒球巨噬細胞群落刺激因子))之JAK2依賴性抑制及/或IL-6之JAK1依賴性抑制所導致。參見上面引用的Arthritis and Rheumatism 60,1895-905(2009)；及O.H.Nielsen,et al.,Will novel oral formulations change the management of inflammatory bowel disease？Expert Opinion on Investigational Drugs 25,709-18(2016)。

參照圖1，口服投予藥物原則上可以順著胃腸道從口到食道(1)、到胃(2)經過十二指腸(3)至空腸(4)、然後至迴腸(5)、且然後至結腸(6)。各種部位的相對吸收面積為空腸(4)大約60%，迴腸(5)大約26%，且結腸(6)大約13%。透過這些不同胃腸區域的吸收可造成全身性分佈的開始，其轉而可能造成非所欲的副作用。胃腸道具有非常大的表面積。參見例如H.F.Helander,et al.,Surface area of the digestive tract-revisited,Scandinavian Journal of Gastroenterology 49(6),681-89(2014)；及K.J.Filipski,et al.,Intestinal Targeting of Drugs：Rational Design Approaches and Challenges Current Topics in Medicinal Chemistry 13,776-802(2013)。此廣大的吸收表面積有利於物質的全身性分佈，其可通過腸道各種部分的壁並進入血流，進而具有潛力造成全身性分佈物質之非所要的副作用。為簡化說明的目的，在圖1中全身性分佈以虛線箭頭表示為滲透通過結腸壁，但此類分佈不限於結腸壁，因為其亦可通過圖1所示胃腸道之其他部分的壁而發生，諸如小腸的壁。亦應理解到，在圖1中的虛線箭頭線表示胃腸道之外的全身性分佈，已知此類全身性分佈係參照胃腸道生理學發生，而此類虛線箭頭僅以示意性說明的方式指此類全身性分佈。參見例如上面引用的Current Topics in Medicinal Chemistry 13,777-80(2013)，針對腸組織、運輸穿過腸組織、及代謝之描述。

在候選藥物中耗損的一個主要原因係安全性及耐受性。參見例如I.Kola,et al.,Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates？Nature Reviews Drug Discovery 3,711-5(2004)；M.J.Waring,et al.,An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.Nature Reviews Drug Discovery 14,475-86(2015)；M.Hay,et al.,Clinical development success rates for investigational drugs,Nature Biotechnology 32,40-51(2014)；及M.E.Bunnage,Getting pharmaceutical R&D back on target,Nature Chemical Biology 7,335-9(2011)。增加化合物到預期目標組織之局部組織濃度、同時限制暴露至其他組織可減少非所要的副作用。參見例如V.P.Torchilin,Drug targeting.European Journal of Pharmaceutical Sciences：Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciencesl1 Suppl 2,S81-91(2000)。此概念已被廣泛接受用於某些疾病及組織，諸如眼睛(參見例如R.Gaudana等人之Ocular drug delivery,The AAPS Journal 12,348-60(2010))、皮膚(參見例如R.Folster-Holst等人之Topical hydrocortisone 17-butyrate 21-propionate in the treatment of inflammatory skin diseases：pharmacological data,clinical efficacy,safety and calculation of the therapeutic index,Die Pharmazie 71,115-21(2016))、及肺(參見例如J.S.Patil等人之Pulmonary drug delivery strategies：A concise,systematic review,Lung India：official organ of Indian Chest Society 29,44-9(2012))。類似於這些組織靶向性的方式，增加腸的藥物濃度同時限制在其他組織中非所要的藥物水平可以增加安全界限。參見例如I.R.Wilding,et al.,Targeting of drugs and vaccines to the gut,Pharmacology & Therapeutics 62,97-124(1994)；D.Charmot,Non-systemic drugs：a critical review,Current Pharmaceutical Design 18,1434-45(2012)；及上面引用的Current Topics in Medicinal Chemistry 13,at 780(2013)。用實現有限全身性暴露的化合物對胃腸組織中之目標的組織予以選擇性調節，可能可以改善此類化合物用於治療包括潰瘍性結腸炎及克隆氏病之胃腸道疾病的治療指數。參見例如O.Wolk,et al.,New targeting strategies in drug therapy of inflammatory bowel disease：mechanistic approaches and opportunities,Expert Opin.Drug Deliv.10(9),1275-86(2013)。用語「全身性效應(systemic effects)」在本文中係用於指全身性暴露及任何此類全身性暴露的效應，即使其不總是相同。

因為一些已知的JAK抑制劑具有與其全身性效應有關的不良效應，所以期望發現新的JAK抑制劑作為用於預防及/或控制過度發炎性反應的活性物質，且其全身性效應經消除或減少。進一步期望發現對胃腸組織具有局部效應且具有減少的全身性效應的JAK抑制劑，以用於治療諸如但不限於IBD的病況。由於各種JAK蛋白所扮演的角色，所以進一步期望發現泛JAK抑制劑。

原則上可根據多個策略實行腸組織靶向。參見例如上面引用的Current Topics in Medicinal Chemistry 13,at 780-95(2013)，其指出的方式包括物理化學性質的方式、運輸介導的方式、前藥的方式、及配方和技術的方式。然而，公認的是如上面引用的Current Topics in Medicinal Chemistry 13,at 795(2013)中所述，「組織靶向方案存在特有的數個挑戰及隱患」，且特別是腸靶向性化合物。

IBD病況可能延伸到胃腸道之多個部分。即使出於簡化說明的目的，在圖1的降結腸中僅顯示一個結腸疾病部位(10)，但發炎性腸疾病可能影響胃腸道之任何部分，如同克隆氏病的情況，或在直腸及結腸中，如同潰瘍性結腸炎。參見例如NIDDK(National Institute of Diabetes,and Digestive and Kidney Diseases,National Institutes of Health,US Department of Health and Human Services,<http：//spotidoc.com/doc/71780/crohns-disease---national-digestive-diseases-information>，2016年11月29日到訪。IBD疾病部位可以係例如迴腸的(位於迴腸)、迴結腸的(影響迴腸及結腸的部分)、及結腸的(位於結腸，如例示性地顯示於圖1之降結腸中)。因此，在某些疾病情境下，沿著整個或大部分腸道的藥物遞送可能係所欲的。在其他疾病情境下，可能所欲的是增加在胃腸道中任何給定部分的局部濃度。又在其他情境下，在腸道不同部位的這兩種遞送形式之組合可能係所欲的。

此類情境中之一者會關注在由於當通過胃腸道時的有限吸收而具有限全身性效應(如由圖1中實線箭頭所例示)同時可以作用於廣泛部分的胃腸(gastrointestinal,GI)道之活性物質的遞送，此係本文中稱為「局部GI效應」之特徵。由於全身性效應減少，對此類物質可評估更廣的劑量範圍。假如此類活性物質具有低滲透性，其將更為所欲的，以使得只有少量通過腸壁進入血流，以限制當其到達非靶向區域時的非所欲不良副作用。

此外，JAK抑制劑係設想為用於其他疾病的治療候選物。彼等係設想使用於治療眼部病況，包括乾眼症(B.Colligris,et al.,Recent developments on dry eye disease treatment compounds,Saudi J.Ophthalmol.28(1),19-30(2014))、骨髓增生性腫瘤、骨髓增生性疾病(E.J.Baxter,et al.,Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders,Lancet 365,1054-1061(2005)；C.James,et al.,A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera,Nature 434,1144-1148(2005)；R.Kralovics,et al.,A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders,N.Engl.J.Med.352,1779-1790(2005)；R.L.Levine,et al.,Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera,essential thrombocythemia,and myeloid metaplasia with myelofibrosis,Cancer Cell 7,387-397(2005)；G.Wernig,et al.,Efficacy of TG101348,a selective JAK2 inhibitor,in treatment of a murine model of JAK2V617F-induced polycythemia vera,Cancer Cell 13,311-320(2008))、骨髓增生性症候群、急性骨髓性白血病、全身性發炎反應症候群、全身性幼年特發性類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎(H.W.Li,et al.,Effect of miR-19a and miR-21 on the JAK/STAT signaling pathway in the peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic juvenile idiopathic arthritis,Exp.Ther.Med.11(6),2531-2536(2016))、第III型過敏反應、第IV型過敏、主動脈發炎、虹膜睫狀體炎/眼色素層炎/視神經炎、青少年型脊髓性肌萎縮症、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性腎病(包括糖尿病腎病變)(F.C.Brosius,et al.,JAK inhibition in the treatment of diabetic kidney disease,Diabetologia 59(8),1624-7,(2016)；C.C.Berthier,et al.,Enhanced expression of Janus kinase-signal transducer and activator of transcription pathway members in human diabetic nephropathy,Diabetes 58(2),469-77,(2009)；E.N.Gurzov,et al.,The JAK/STAT pathway in obesity and diabetes,FEBS J.283(16),3002-15(2016))、微血管病變、發炎(M.Kopf,et al.,Averting inflammation by targeting the cytokine environment,Nature Reviews Drug Discovery 9,703-718(2010)；J.J.O'Shea,et al.,A new modality for immunosuppression：targeting the JAK/STAT pathway,Nature Rev.Drug Discov.3,555-564(2004))、慢性發炎、發炎性腸疾病(包括潰瘍性結腸炎(UC)及克隆氏病)(R.H.Duerr,et al.,A genome-wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene,Science 314,1461-1463(2006)；M.Coskun,et al.,Involvement of JAK/STAT signaling in the pathogenesis of inflammatory bowel disease,Pharmacol.Res.76,1-8(2013)；M.J.Waldner,et al.,Master regulator of intestinal disease：IL-6 in chronic inflammation and cancer development,Semin.Immunol.26(1),75-9(2014)；S.Danese,et al.,JAK inhibition using tofacitinib for inflammatory bowel disease treatment：a hub for multiple inflammatory cytokines,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.310(3),G155-62(2016)；W.Strober,et al.,Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases,Gastroenterology 140,1756-1767(2011))、過敏性疾病、白斑症、異位性皮膚炎(R.Bissonnette,et al.,Topical tofacitinib for atopic dermatitis：a phase IIa randomized trial,Br.J.Dermatol.175(5),902-911(2016)；W.Amano,et al.,JAK inhibitor JTE-052 regulates contact hypersensitivity by downmodulating T cell activation and differentiation,J.Dermatol.Sci.84,258-265(2016)；T.Fukuyama, et al.,Topically Administered Janus-Kinase Inhibitors Tofacitinib and Oclacitinib Display Impressive Antipruritic and Anti-Inflammatory Responses in a Model of Allergic Dermatitis,J.Pharmacol.Exp.Ther.354(3),394-405(2015))、圓禿(A.K.Alves de Medeiros,et al.,JAK3 as an Emerging Target for Topical Treatment of Inflammatory Skin Diseases,PLoS One 11(10)(2016)；L.Xing,et al.,Alopecia areata is driven by cytotoxic T lymphocytes and is reversed by JAK inhibition,Nat.Med.20(9),1043-9(2014))、皮炎硬皮症、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病(P.S.Changelian,et al.Prevention of organ allograft rejection by a specific Janus kinase 3 inhibitor,Science 302,875-878(2003)；F.Behbod,et al.Concomitant inhibition of Janus kinase 3 and calcineurin-dependent signaling pathways synergistically prolongs the survival of rat heart allografts,J.Immunol,166,3724-3732(2001)；S.Busque,et al,.Calcineurin-inhibitor-free immunosuppression based on the JAK inhibitor CP-690,550：a pilot study in de novo kidney allograft recipients,Am.J.Transplant,9,1936-1945(2009))、乾癬性關節病、潰瘍性結腸炎關節病(ulcerative colitic arthropathy)、自體免疫性大皰病、自體免疫性溶血性貧血、類風濕性關節炎(J.M.Kremer,et al.,A randomized,double-blind placebo-controlled trial of 3 dose levels of CP-690,550 versus placebo in the treatment of active rheumatoid arthritis,Arthritis Rheum.54(annual meeting abstract),L40(2006)；W.Williams,et al,.A randomized placebo-controlled study of INCB018424,a selective Janus kinase1&2(JAK1&2)inhibitor in rheumatoid arthritis(RA),Arthritis Rheum.58,S431(2008)；N.Nishimoto,et al.,Study of active controlled monotherapy used for rheumatoid arthritis,an IL-6 inhibitor(SAMURAI)：evidence of clinical and radiographic benefit from an x ray reader-blinded randomised controlled trial of tocilizumab,Ann.Rheum.Dis.66(9),1162-7(2007))、類風濕性關節炎相關之間質性肺病、全身性紅斑性狼瘡(A.Goropev

ek,et al.,The Role of STAT Signaling Pathways in the Pathogenesis of Systemic Lupus Erythematosus,Clin.Rev.Allergy Immunol.(線上先行出版)< http：//www.docguide.com/role-stat-signaling-pathways-pathogenesis-systemic-lupus-erythematosus？tsid=5>2016年5月23日；M.Kawasaki,et al.,Possible role of the JAK/STAT pathways in the regulation of T cell-interferon related genes in systemic lupus erythematosus,Lupus.20(12),1231-9(2011)；Y.Furumoto,et al.,Tofacitinib ameliorates murine lupus and its associated vascular dysfunction,Arthritis Rheumatol.(線上先行出版)<https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27429362>2016年7月18日)、全身性紅斑性狼瘡相關之肺疾病、皮肌炎/多肌炎相關之肺疾病、哮喘(K.Vale,Targeting the JAK/STAT pathway in the treatment of 'Th2-high' severe asthma,Future Med.Chem.8(4),405-19(2016))、僵直性脊椎炎(AS)(C.Thompson,et al.,Anti cytokine therapy in chronic inflammatory arthritis,Cytokine 86,92-9(2016))、AS相關之肺疾病、自體免疫性肝炎、1型自體免疫性肝炎(典型自體免疫或類狼瘡性肝炎)、2型自體免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自體免疫介導之低血糖症、牛皮癬(C.L.Leonardi,et al.,Efficacy and safety of ustekinumab,a human interleukin-12/23 monoclonal antibody,in patients with psoriasis：76-week results from a randomised,double-blind,placebo-controlled trial(PHOENIX 1),Lancet 371,1665-1674(2008)；G.Chan,et al.,Dose-dependent reduction in psoriasis severity as evidence of immunosuppressive activity of an oral Jak3 inhibitor in humans,Am.J.Transplant.6,S87(2006)；K.A.Papp,et al.,Efficacy and safety of tofacitinib,an oral Janus kinase inhibitor,in the treatment of psoriasis：a phase 2b randomized placebo-controlled dose-ranging study,Br.J.Dermatol.167,668-677(2012)；M.Cargill,et al.A large-scale genetic association study confirms IL12B and leads to the identification of IL23R as psoriasis-risk genes,Am.J.Hum.Genet.80,273-290(2007))、1型牛皮癬、2型牛皮癬、斑塊型牛皮癬、中度至重度慢性斑塊型牛皮癬、自體免疫性嗜中性白血球低下症、***自體免疫、多發性硬化症(所有亞型，B.M.Segal,et al.,Repeated subcutaneous injections of IL12/23 p40 neutralising antibody,ustekinumab,in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis：a phase II,double-blind,placebo-controlled,randomised,dose-ranging study,Lancet Neurol.7,796-804(2008)；Z.Yan,et al.,Role of the JAK/STAT signaling pathway in regulation of innate immunity in neurointlammatory diseases,Clin.Immunol.(線上先行出版)<https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27713030>，2016年10月3日到訪；E.N.Benveniste,et al.,Involvement of the janus kinase/signal transducer and activator of transcription signaling pathway in multiple sclerosis and the animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis,J.Interferon Cytokine Res.34(8),577-88(2014)；Y.Liu,et al.,Therapeutic efficacy of suppressing the Jak/STAT pathway in multiple models of experimental autoimmune encephalomyelitis,J.Immunol.192(1),59-72(2014))、急性風濕熱、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)、休格倫氏症候群/疾病相關之肺疾病(T.Fujimura,et al.,Significance of Interleukin-6/STAT Pathway for the Gene Expression of REG Iα,a New Autoantigen in Sjögren's Syndrome Patients,in Salivary Duct Epithelial Cells,Clin.Rev.Allergy Immunol.(線上先行出版)<https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27339601>2016年6月24日)、自體免疫性血小板減少症、神經發炎(包括帕金森氏症(Parkinson’s disease))(Z.Yan,et al.，2016年10月3日，如上引用)。已報導JAK抑制劑除了發炎性疾病之外，在癌症治療中具有治療性應用(S.J.Thomas,et al.,The role of JAK/STAT signaling in the pathogenesis,prognosis and treatment of solid tumors,British J.Cancer 113,365-71(2015)；A.Kontzias,et al.,Jakinibs：A new class of kinase inhibitors in cancer and autoimmune disease,Current Opinion in Pharmacology,12(4),464-70(2012年8月)；M.Pesu,et al.,Therapeutic targeting of JANUS kinases,Immunological Reviews,223,132-42(2008年6月)；P.Norman,Selective JAK inhibitors in development for rheumatoid arthritis,Expert Opinion on Investigational Drugs,23(8),1067-77(2014年8月))。此外，JAK抑制劑在預防結直腸癌上可能為有用的，因為在結腸中減少發炎可能造成在此類器官中的癌症預防。

本發明關於下列化合物：2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺；2-((1r,4r)-4-(2-(1H-咪唑-4-基)咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)環己基)乙腈；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(環丙基甲基)乙醯胺；N-(2-氰基乙基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)乙醯胺；N-(2-氰基-2-甲基丙基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((1-羥基環丁基)甲基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)乙醯胺；N-(4-(氰基甲基)雙環[2.2.1]庚-1-基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1H-吡唑-3-基)乙醯胺； 2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((1-羥基環丙基)甲基)乙醯胺；及此類化合物之醫藥上可接受之鹽、及彼等之組合。

用語「本發明之化合物(compounds of the invention及compound of the invention)」意欲涵蓋至少一種選自上面化合物群組的化合物，無論呈無溶劑形式或呈水合形式及/或溶劑合形式中之任一者，如本文所示。

本發明之實施例關於化合物、含有彼等之醫藥組成物、製造及純化彼等之方法、及用彼等作為JAK抑制劑的方法以及使用彼等治療由JAK所介導之疾病狀態、病症、及病況的方法。

本發明之實施例展現具有局部GI效應及低或可忽略的全身性效應之泛JAK抑制效應。此外，具有此類特徵的本發明之實施例可以經口服投予。

本發明之一額外實施例係一種使用本發明之化合物或本發明之活性劑治療患有或經診斷有由JAK所介導之疾病、病症、或醫療病況之對象的方法。

本發明之額外實施例、特性及優點將由以下實施方式及透過本發明之實施而顯見。

圖1人類胃腸道之部分示意圖，以未按比例的拉直彩現圖(stretched rendering)顯示。在胃(2)和食道(1)之後，十二指腸(3)、空腸(4)、及迴腸(5)(全部示意性地顯示)形成小腸。大腸包含結腸(6)，依次包括盲腸(7)及闌尾(未顯示)、升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸(未顯示在其之彎道(loop))、及直腸(11)。橫結腸係包含結腸右曲(8)與結腸左曲(9)之間的部分，升結腸自盲腸(7) 延伸至結腸右曲(8)，且降結腸自結腸左曲(9)延伸至直腸(11)。為方便起見，各種分佈模式係參照結腸說明，但彼等亦可指胃腸道之其他部位。為簡化說明的目的，在圖1中全身性分佈以虛線箭頭表示為滲透通過結腸壁，但此類分佈不限於結腸壁，因為其亦可通過圖1所示胃腸道之其他部分的壁而發生，諸如小腸的壁。為簡化說明的目的，在圖1中一些組織滲透的分佈以實線箭頭表示為穿透結腸組織，但此類穿透不限於結腸組織，因為其亦可在圖1所示之胃腸道其他部分之組織發生，諸如小腸之組織。根據本發明之JAK抑制劑的實施例之效應係說明性地顯示為破壞JAK/STAT傳訊路徑，否則該JAK/STAT傳訊路徑將造成與發炎性腸疾病(「IBD」)有關之發炎，諸如克隆氏病或潰瘍性結腸炎。舉例說明，但非限制，疾病部位係說明性地顯示為在降結腸中之結腸疾病部位(10)。

圖2顯示化合物Ex.1的實施例之製備/相互轉換的示意圖。實施例19至36、38、及39係獲自實施例1s，且實施例37及40至53係獲自實施例19，如同在此圖中藉由虛線箭頭及在框中之圖例「19-53」所代表的。

圖3化合物Ex.1之下列實施例的高通量X射線粉末繞射(HT-XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：1s、2(藉由在室溫下於1,4-二

烷中平衡獲得)、3b(藉由於環己酮中熱循環獲得)、1b+4(藉由於甲醇/水(50/50,v/v)中在μL規模下冷卻結晶獲得)、5(藉由於氯仿中熱循環獲得)、6(藉由於乙腈中在mL規模下冷卻結晶獲得)、7(獲得1s+7，藉由於庚烷中溶劑平衡依次獲得)、7(藉由1s+7之去溶劑化獲得，藉於庚烷中溶劑平衡依次獲得)、8(藉由循環式微差掃描熱量法藉實施例5之去溶劑化獲得)、及9(藉由循環式微差掃描熱量法藉實施例2之去溶劑化獲得)。

圖4化合物Ex.1之下列實施例的高通量X射線粉末繞射(HT-XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：1s(起始材料)、1a(在暴露於加速老化條件(accelerated aging condition,AAC)(40℃及70%相對濕度)之後獲得實施例1s之數種樣本形式)、1b(藉由在室溫下於甲苯中溶劑平衡獲得)、1c(藉由於乙酸乙酯/1,4-二

烷(50/50,v/v)中在μL規模下冷卻結晶獲得)、1d(藉由於乙腈/氯仿(50/50,v/v)中在μL規模下冷卻結晶獲得)、1e(藉由於乙酸乙酯/1,4-二

烷(50/50,v/v)中在μL規模下冷卻結晶獲得)、1f(藉由在室溫下於對二甲苯中溶劑平衡獲得)、1g(藉由在50℃下於苯甲醚中溶劑平衡獲得)、1h(藉由於對二甲苯中在μL規模下冷卻結晶獲得)。

圖5化合物Ex.1之下列實施例的高通量X射線粉末繞射(HT-XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：1s、3b(藉由於環己酮中熱循環獲得)、3c(藉由於1,4-二

烷中在μL規模下冷卻結晶獲得)、3d(藉由於四氫呋喃中在μL篩選下冷卻結晶獲得)、及3e(藉由於異丁醇中熱循環獲得)。

圖6實施例1s在其初始形式(「1s」)、暴露於40℃及70%相對濕度四天後(「1s 70 RH」)、及暴露於25℃及100%相對濕度四天後(實施例10或「10」)之HR-XRPD繞射圖。

圖7A實施例11之X射線粉末繞射(XRPD)圖形。

圖7B實施例12之X射線粉末繞射(XRPD)圖形。

圖7C實施例13之X射線粉末繞射(XRPD)圖形。

圖7D實施例14之X射線粉末繞射(XRPD)圖形。

圖7E實施例11b之X射線粉末繞射(XRPD)圖形。

圖8 化合物Ex.1之下列實施例的X射線粉末繞射(XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：實施例17、實施例18、實施例15、及實施例16。

圖9實施例19的調製DSC(「mDSC」)曲線圖，其顯示玻璃轉移點(T_g)在115.3℃(在縱座標軸標籤中「Rev」係指「可逆」)。

圖10A實施例18之TGA(熱重分析)，其顯示在30℃與170℃之間損失6.5% w/w。

圖10B實施例18之DSC(微差掃描熱量法)，其顯示在45℃與90℃之間有52.8J/g的吸熱，在140.6℃有31.0J/g的吸熱，在168.8℃有24.3J/g的放熱，且在200.0℃有31.3J/g的吸熱。

圖11化合物Ex.1之下列實施例的X射線粉末繞射(XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：實施例20及實施例21。

圖12A實施例17之TGA，其顯示在30℃與100℃之間損失4.2% w/w。

圖12B實施例17之DSC，其顯示在45℃與100℃之間有90.3J/g的吸熱，在143.8℃有35.5J/g的吸熱，在168.3℃有1.6J/g的吸熱，在178℃有3.8J/g的放熱，且在200.0℃有9.2J/g的吸熱。

圖13化合物Ex.1之下列實施例的X射線粉末繞射(XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：實施例31、實施例30、實施例17、實施例29、實施例16、實施例26、實施例25、實施例18、實施例24、實施例23、實施例27、及實施例22。

圖14 化合物Ex.1之下列實施例的X射線粉末繞射(XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：實施例32、實施例33、實施例23、實施例34、實施例35、實施例36、實施例25、實施例38、實施例17、實施例39、及實施例28。

圖15化合物Ex.1之下列實施例的X射線粉末繞射(XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：實施例46、實施例45、實施例44、實施例43、實施例42、實施例41、實施例40、及實施例37。

圖16化合物Ex.1之下列實施例的X射線粉末繞射(XRPD)圖形之重疊圖，從底部至頂部為：實施例53、實施例52、實施例51、實施例50、實施例49、實施例48、及實施例47。

圖17A實施例11之TGA，其顯示在155℃與185℃之間損失4.7% w/w。

圖17B實施例11之DSC，其顯示由於溶劑損失，在167.8℃有57.8J/g的第一次吸熱；且由於樣本熔融，在194.5℃有90.8J/g的第二次吸熱。

圖18實施例11之重力蒸氣吸附(gravimetric vapor sorption,GVS)等溫圖，其顯示在0至90% RH之間的質量變化為0.66%。縱座標軸上之質量變化係以起始樣本的質量作參考。

圖19A實施例6之TGA，其顯示在溫度高於260℃下的重量損失，該重量損失經解讀為與樣本降解相關。

圖19B實施例6之DSC，其顯示由於樣本熔融，在194.4℃有95.8J/g的吸熱。

圖20A 實施例8之TGA，其顯示在40℃與240℃之間損失1.4% w/w，其對應於0.07mol的1,4-二

烷之損失。

圖20B實施例8之DSC，其顯示由於樣本熔融，在199.7℃有58.6J/g的吸熱。

圖21A實施例2之TGA，其顯示在75℃與110℃之間損失7.4% w/w，在110℃與130℃之間損失11.9% w/w，在130℃與165℃之間損失2.0% w/w，且在165℃與210℃之間損失2.5% w/w。

圖21B實施例2之DSC，其顯示在92.8℃有86.2J/g的吸熱，在111.5℃有11.1J/g的吸熱，在149.0℃有45.5J/g的吸熱，在165.2℃有20.6J/g的放熱，在177.1℃有3.7J/g的吸熱，在200.2℃有43.0J/g的吸熱，且在220.6℃有29.3J/g的吸熱。

圖22A實施例9之TGA。

圖22B實施例9之DSC，其顯示在221.8℃有104.4J/g的吸熱。

圖23A實施例16之TGA，其顯示在30℃與105℃之間損失5.2% w/w。

圖23B實施例16之DSC，其顯示在35℃與90℃之間有48.4J/g的吸熱，在147.0℃有41.8J/g的吸熱，在166.6℃有1.0J/g的吸熱，在180.7℃有4.4J/g的放熱，且在201.1℃有7.7J/g的吸熱。

圖24實施例11(標記為「11」)之X射線粉末繞射(XRPD)及實施例11在可變溫度(variable temperature,VT)-XRPD實驗後(標記為「11 VT後」)之X射線粉末繞射(XRPD)、及實施例6之X射線粉末繞射(XRPD)。

如本文中所使用，用語「包括(including)」、「含有(containing)」、及「包含(comprising)」係以其開放的、非限制性的意義使用。

在本文中給定之任何式係意欲代表具有由該結構式以及某些變異或形式所繪示之結構的化合物。某些結構可以互變異構物存在。此外，本發明之此類化合物之非晶形式、水合物、溶劑合物、多形體、及假多形體、及其混合物亦設想為本發明之部分。本發明之實施例如本文所示係呈無溶劑形式或呈水合形式及/或溶劑合形式中之任一者。

提及本文中的化合物代表提及以下任一者：(a)該化合物之實際記載形式，以及(b)存在於介質中之該化合物的任何形式，該介質係命名該化合物時認定該化合物所在之處。例如，本文中提及化合物如R-COOH時包含提及(例如)R-COOH_(s)、R-COOH_(sol)、及R-COO^- _(sol)中之任一者。在此實例中，R-COOH_(s)係指固體化合物，因其可為例如錠劑或一些其他的固體醫藥組成物或製劑；R-COOH_(sol)係指該化合物在溶劑中的未解離形式；且R-COO^- _(sol)係指該化合物在溶劑中的解離形式，例如該化合物在水性環境中的解離形式，無論該解離形式係衍生自R-COOH、其鹽類、或任何其他在所認為的介質中解離後會產生R-COO^-的實體。在另一實例中，諸如「使實體暴露於式R-COOH之化合物(exposing an entity to compound of formula R-COOH)」的表達方式係指使該實體暴露於存在於介質中的化合物R-COOH之(多個)形式，其中該介質係暴露發生之所在。在又另一實例中，如「將實體與式R-COOH之化合物反應(reacting an entity with a compound of formula R-COOH)」這樣的表示係指，將(a)存在於該反應發生所在之介質中的呈化學相關形式之該實體與(b)存在於該反應發生所在之介質中的呈化學相關形式之化合物R-COOH反應。就此而言，如果該實體係例如在水性環境中，應理解到該化合物R-COOH係存在該相同介質中，且因此該實體係經暴露於諸如R-COOH_(aq)及/或R-COO^- _(aq)之物種，其中下標「(aq)」代表根據化學及生化上習知的「水性(aqueous)」之意義。在這些命名實例中選用羧酸官能基；然而，此選擇並無限制之意，只是一種例示說明。應理解到類似的實例可用其他官能基提供，包括但不限於羥基、鹼性氮員，例如那些在胺中者、及任何其他根據已知方式在含有該化合物之介質中進行交互作用或轉變之基團。該等交互作用及轉變包括但不限於：解離、締合作用、互變異構現象、溶劑分解(包括水解)、溶劑合作用(solvation)(包括水合作用)、質子化作用、及去質子化作用。由於在給定介質中的這些交互作用及轉變係為任何所屬技術領域中具有通常知識者所習知，故本文未就此點提供更進一步的實例。

本文中給定的任何式(formula)也意欲表示化合物之未經標記形式以及經同位素標記形式。經同位素標記之化合物具有本文給定之式所述的結構，除了一或多個原子係由具有選定原子質量或質量數的原子以富集形式置換。可以超過天然豐度的形式併入本發明之化合物的同位素之實例包括氫、碳、氮、及氧之同位素，分別如²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、及¹⁷O。該等同位素標記化合物可用於代謝研究(較佳的是用¹⁴C)、反應動力學研究(利用例如氘(即D或²H)；或氚(即T或³H))、偵測或影像技術(例如正電子發射斷層攝影術(positron emission tomography,PET)或單光子放射電腦斷層攝影(single-photon emission computed tomography,SPECT))包括藥物或受質組織分布檢定法、或對患者之放射性治療。尤其，經¹⁸F或¹¹C標記的化合物可能特別適用於PET或SPECT研究。此外，以諸如氘(即²H)之較重同位素取代可得到由較高代謝穩定性帶來的某些治療優點，例如局部體內半衰期增加或劑量需求降低。本發明之經同位素標記之化合物大致上可藉由進行下述方案或實例及製備方法中所揭示之程序，並以容易取得的經同位素標記之試劑取代未經同位素標記之試劑來製備。

「互變異構物(tautomer)」係指具有可互相轉變之特定化合物結構形式的化合物，其差異在於氫原子及電子的轉位。因此，在不同位置上具有一個H員的兩個結構可以達到平衡同時滿足效價規則。例如，烯醇及酮係互變異構物，因為彼等可藉由酸或鹼之處理而快速地互相轉換。

當提及任何本文所給出之式時，從列出的可能物種中針對指定變數選擇特定部份(moiety)並非意欲為別處出現的該變數界定相同的物種選擇。換句話說，當一變數出現超過一次時，除非特別指明，否則從指定清單所做出的物種選擇與式中它處之該相同變數的物種選擇無關。

舉第一個實例說明取代基用語，倘若取代基S¹ _實例係S₁及S₂中之一者，且取代基S² _實例係S₃及S₄中之一者，則這些指派(assignment)係指根據以下選擇給定之本發明之實施例：S¹ _實例係S₁且S² _實例係S₃；S¹ _實例係S₁且S² _實例係S₄；S¹ _實例係S₂且S² _實例係S₃；S¹ _實例係S₂且S² _實例係S₄；及該等選擇之各者的均等物。為簡明起見，本文因此使用較短之用語「S¹ _實例係S₁及S₂中之一者，且S² _實例係S₃及S₄中之一者」，但並非作為限制。前述以通用用語陳述之關於取代基用語的第一個實例，旨在說明本文所述之各種取代基指派。

此外，當給定任何成員或取代基超過一種指派時，本發明的實施例包含可自所列指派中產生且經獨立地採用之各種群組、及其均等物。舉第二個實例說明取代基用語，倘若在本文中描述取代基S_實例係S₁、S₂、及S₃中之一者，此表列係指下列之本發明實施例：S_實例係S₁；S_實例係S₂；S_實例係S₃；S_實例係S₁及S₂中之一者；S_實例係S₁及S₃中之一者；S_實例係S₂及S₃中之一者；S_實例係S₁、S₂及S₃中之一者；及S_實例係這些選擇之各者的任何均等物。為簡明起見，本文因此使用較短之用語「S_實例係S₁、S₂、及S₃中之一者」，但並非作為限制。前述以通用用語陳述之關於取代基用語的第二個實例，旨在說明本文所述之各種取代基指派。

下列JAK抑制劑係本發明之說明性實施例：2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺；2-((1r,4r)-4-(2-(1H-咪唑-4-基)咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)環己基)乙腈；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(環丙基甲基)乙醯胺； N-(2-氰基乙基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)乙醯胺；N-(2-氰基-2-甲基丙基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((1-羥基環丁基)甲基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)乙醯胺；N-(4-(氰基甲基)雙環[2.2.1]庚-1-基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺；2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1H-吡唑-3-基)乙醯胺；及2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((1-羥基環丙基)甲基)乙醯胺。

本發明之額外實施例係上面給定的化合物之醫藥上可接受之鹽。

本發明之額外實施例係醫藥組成物，各包含有效量的至少一種上面給定的化合物或其醫藥上可接受之鹽。

「醫藥上可接受之鹽(pharmaceutically acceptable salt)」係指無毒、具生物可耐受性、或其他生物學上適合用於投予至對象的化合物之鹽。大致上參見S.M.Berge等人之「Pharmaceutical Salts」，J.Pharm.Sci.66,1-19(1977)、及Handbook of Pharmaceutical Salts,Properties,Selection,and Use,Stahl and Wermuth,Eds.,Wiley-VCH and VHCA,Zurich,2002。本發明之化合物可擁有足夠酸性的基團、足夠鹼性的基團、或兩種類型之官能基，並因此與許多無機或有機鹼類以及無機及有機酸類反應，以形成醫藥上可接受之鹽。醫藥上可接受的鹽之實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸酯、甲酸酯、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、栓酸鹽、癸二酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁炔-1,4-二酸、己炔-1,6-二酸、苯甲酸、氯苯甲酸、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸、羥苯甲酸、甲氧苯甲酸、苯二甲酸鹽、磺酸鹽、茬磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸、苯丁酸、檸檬酸、乳酸、γ-羥丁酸鹽、甘醇酸鹽、酒石酸鹽、甲烷磺酸鹽、丙烷磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽以及杏仁酸鹽。

假如本發明之化合物含有至少一種鹼性氮，所欲之醫藥上可接受之鹽可藉由所屬技術領域中可得之任何合適方法來製備，例如，用以下處理游離鹼：無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、胺磺酸、硝酸、硼酸、及磷酸)、或有機酸(諸如乙酸、苯乙酸、丙酸、硬脂酸、乳酸、抗壞血酸、順丁烯二酸、羥基順丁烯二酸、2-羥乙磺酸、琥珀酸、戊酸、反丁烯二酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、油酸、棕櫚酸、月桂酸)、哌喃糖苷酸(諸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羥酸(諸如苦杏仁酸、檸檬酸、或酒石酸)、胺基酸(諸如天冬胺酸或麩胺酸)、芳香酸(諸如苯甲酸、2-乙醯氧基苯甲酸、萘甲酸、或肉桂酸)、磺酸(諸如月桂基磺酸、對甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸)、任何相容的酸混合物(諸如本文中提供作為實例者)、及根據所屬技術領域中之通常知識被視為均等物或可接受的替代品之任何其他酸及其混合物。

並非根據本發明化合物的醫藥上可接受之鹽的所有實施例可同樣合適於彼等之開發，對於足夠弱鹼性(例如，pK_a約為4)的化合物就開發目的而言，可能不會形成足夠穩定的鹽。參見例如G.A.Stephenson等人之J.Pharm.Sciences 100(5),1607-17(2011)「Physical stability of salts of weak bases in the solid state」。本發明之一些實施例係設想涵蓋具有合適的共晶形成劑的根據本發明化合物之共晶形式。例如，在N.Shan,et al.,Drug Discovery Today,13(9/10),440-46(2008)「The role of cocrystals in pharmaceutical science」、N.Qiao,et al.,Intl.J.Pharmaceutics,419,1-11(2011)「Pharmaceutical cocrystals：An overview」、R.Thakuria,et al.,Intl.J.Pharmaceutics,453,101-25(2013)「Pharmaceutical cocrystals and poorly soluble drugs」中已經給出用於醫藥用途的共晶之設計和性質及製造和表徵彼等之方法。

本發明之化合物，包括彼等醫藥上可接受之鹽，無論單獨或組合(統稱，「活性劑(active agent)」)，係可用作為本發明方法中的JAK抑制劑。用於調節JAK活性的此類方法包含使JAK暴露於有效量的至少一種本發明之化學化合物。

在一些實施例中，JAK抑制劑係使用在經診斷有或患有透過JAK活性所介導之疾病、病症、或醫療病況的對象上，諸如本文中所述者。症狀或疾病狀態意欲包括在「疾病、病症、或醫療病況」之範疇內。

因此，本發明係關於使用本文所述之活性劑以治療經診斷有或患有透過JAK所介導之疾病、病症、或醫療病況的對象之方法。本文中使用之用語「治療(treat或treating)」係意欲指將本發明之活性劑或組成物投予至對象以達到透過調節JAK來影響治療性或預防性效益的目的。治療包括反轉、改善、減輕、抑制進展、減輕嚴重程度、減少、或預防透過調節JAK活性所介導之疾病、病症、或病況、或一或多種此類疾病、病症、或病況之症狀。用語「對象(subject)」係指需要該治療之哺乳類患者，諸如人類。用語「抑制劑(inhibitor)」係指減少、預防、去活化、去敏、或下調JAK表現或活性之化合物。

本發明之實施例提供JAK抑制劑以用於預防及/或控制過度的發炎性反應。根據本發明之JAK抑制劑的實施例係泛JAK(pan-JAK)抑制劑。

除非另有指示，用語「JAK抑制劑物理化學性質(JAK inhibitor physico-chemical property)」係指如下列相應指定的性質：在莫耳質量的情況下，如針對化合物Ex.1至12的描述中給出的；在氫鍵供體、受體、及可旋轉鍵(rotatable bond)之數量的情況下，如根據個別定義判定的；及在血漿濃度的情況下，如參照表1a第2欄測量的，以及在P-gp抑制劑存在下之A-B滲透係數和B-A滲透係數的情況下，如參照表7第3欄和第4欄測量的。

本發明之實施例提供抑制JAK之方法，包含使JAK受體暴露於特徵為具有下列JAK抑制劑物理化學性質的JAK抑制劑：血漿濃度在約0.1ng/mL之至約60ng/mL之範圍內；cLog P在約0.1至約2.8之範圍內；在P-gp抑制劑存在下，A-B滲透係數在約0.1至約2.5之範圍內；B-A滲透係數在約0.5至約20之範圍內；tPSA在約85至約120之範圍內。

在根據本發明之抑制JAK的方法之其他實施例中，血漿濃度係在約10ng/mL至約20ng/mL之範圍內。

在根據本發明之抑制JAK的方法之其他實施例中，cLogP係在約0.8至約1.4之範圍內。

在根據本發明之抑制JAK的方法之其他實施例中，在P-gp抑制劑存在下，A-B滲透係數係在約0.6至約1.5之範圍內。

在根據本發明之抑制JAK的方法之其他實施例中，B-A滲透係數係在約0.5至約5之範圍內。

在根據本發明之抑制JAK的方法之其他實施例中，tPSA係在約100至約120之範圍內。

本發明之進一步實施例提供抑制JAK的方法，包含使JAK受體暴露於進一步特徵為具有下列JAK抑制劑物理化學性質的JAK抑制劑：除了上述用於根據本發明之抑制JAK的方法之血漿濃度、clogP值、滲透係數、及tPSA值之外，還有莫耳質量在約300g mol^-1至約500g mol^-1之範圍內、氫鍵供體之數量在約2至約3之範圍內、氫鍵受體之數量在約4至約5之範圍內、及可旋轉鍵之數量在約3至約6之範圍內。

在根據本發明之抑制JAK的方法之其他實施例中，莫耳質量係在約340g mol^-1至約430g mol^-1之範圍內。

在根據本發明之抑制JAK的方法之其他實施例中，可旋轉鍵之數量係在約5至約6之範圍內。

本發明之實施例提供用於治療對象之胃腸道發炎的方法，包含向對象投予醫藥有效量的JAK抑制劑，其特徵在於具有下列JAK抑制劑物理化學性質：血漿濃度在約0.1ng/mL之至約60ng/mL之範圍內；cLog P在約0.1至約2.8之範圍內；在P-gp抑制劑存在下，A-B滲透係數在約0.1至約2.5之範圍內；B-A滲透係數在約0.5至約20之範圍內；tPSA在約85至約120之範圍內。

在根據本發明之治療胃腸道發炎的方法之其他實施例中，血漿濃度係在約10ng/mL至約20ng/mL之範圍內。

在根據本發明之治療胃腸道發炎的方法之其他實施例中，cLogP係在約0.8至約1.4之範圍內。

在根據本發明之治療胃腸道發炎的方法之其他實施例中，在P-gp抑制劑存在下，A-B滲透係數係在約0.6至約1.5之範圍內。

在根據本發明之治療胃腸道發炎的方法之其他實施例中，B-A滲透係數係在約0.5至約5之範圍內。

在根據本發明之治療胃腸道發炎的方法之其他實施例中，tPSA係在約100至約120之範圍內。

本發明之進一步實施例提供用於治療對象之胃腸道發炎的方法，其中該JAK抑制劑物理化學性質的進一步特徵在於具有下列JAK抑制劑物理化學性質：除了上述用於根據本發明之治療發炎的方法之血漿濃度、cLogP值、滲透係數、及tPSA值之外，還有莫耳質量在約300g mol^-1至約500g mol^-1之範圍內、氫鍵供體之數量在約2至約3之範圍內、氫鍵受體之數量在約4至約5之範圍內、及可旋轉鍵之數量在約3至約6之範圍內。

在根據本發明之治療胃腸道發炎的方法之其他實施例中，莫耳質量係在約350g mol^-1至約430g mol^-1之範圍內。

在根據本發明之治療胃腸道發炎的方法之其他實施例中，可旋轉鍵之數量係在約5至約6之範圍內。

根據本發明之JAK抑制劑之實施例具有下列JAK物理化學性質：血漿濃度在約0.1ng/mL之至約60ng/mL之範圍內；cLogP在約0.1至約2.8之範圍內；在P-gp抑制劑存在下，A-B滲透係數在約0.1至約2.5之範圍內；B-A滲透係數在約0.5至約20之範圍內；tPSA在約85至約120之範圍內。

根據本發明之JAK抑制劑的進一步實施例具有在約10ng/mL至約20ng/mL之範圍內的血漿濃度。

根據本發明之JAK抑制劑的進一步實施例具有在約0.8至約1.4之範圍內的cLogP值。

根據本發明之JAK抑制劑的進一步實施例，在P-gp抑制劑存在下，具有在約0.6至約1.5之範圍內的A-B滲透係數。

根據本發明之JAK抑制劑的進一步實施例具有在約0.5至約5之範圍內的B-A滲透係數。

根據本發明之JAK抑制劑的進一步實施例具有在約100至約120之範圍內的tPSA值。

根據本發明之JAK抑制劑之其他實施例具有下列JAK抑制劑物理化學性質：除了上述用於根據本發明之JAK抑制劑的血漿濃度、cLogP值、滲透係數、及tPSA值之外，還有莫耳質量在約300g mol^-1至約500g mol^-1之範圍內、氫鍵供體之數量在約2至約3之範圍內、氫鍵受體之數量在約4至約5之範圍內、及可旋轉鍵之數量在約3至約6之範圍內。

根據本發明之JAK抑制劑的進一步實施例具有在約350g mol^-1至約430g mol^-1之範圍內的莫耳質量。

根據本發明之JAK抑制劑的進一步實施例具有在約5至約6之範圍內的可旋轉鍵之數量。

在根據本發明之治療方法中，向患有或經診斷有此疾病、病症、或醫療病況之對象投予有效量的至少一種根據本發明之活性劑。「有效量 (effective amount)」意指一量或劑量，其足以在需要該指定疾病、病症、或醫療病況的治療之患者身上大致上得到所欲之治療或預防效益。本發明之活性劑的有效量或劑量可藉由方法(諸如模型化、劑量遞增研究、或臨床試驗)，以及藉由考量因素(例如投予或藥物遞送的模式或途徑、藥劑之藥物動力學、疾病、病症、或病況的嚴重程度和病程、對象先前或進行中的療法、對象的健康狀況和對藥物的反應、及主治醫師的判斷)來確認。對於70公斤的人來說，合適劑量之例示性範圍係自約1至1000mg/天(以單次或多次劑量單位)。

本發明之實施例係新的JAK抑制劑，其作為活性物質以用於預防及/或控制過度的發炎性反應並且其全身性效應經消除或減少。本發明之進一步實施例係對胃腸組織具有局部效應的JAK抑制劑以用於治療諸如但不限於IBD的病況，而不會引起全身性效應或者此類全身性效應係可接受地減少。

本發明之實施例係低滲透性JAK抑制劑。本發明之進一步實施例係具有水性溶解度的JAK抑制劑。

一旦患者的疾病、病症、或病況獲得改善，則可將劑量調整為預防性或維持性的治療。例如，投予的劑量或頻率、或兩者可隨著症狀變化而減少至可維持所欲治療或預防效果之程度。當然，假使症狀已減輕至適當程度，則可停止治療。然而，若有任何症狀的復發，則患者可能需要長期的間歇性治療。

此外，本發明之化合物係設想為單獨使用、與一或多種本發明之其他化合物組合使用、或與額外的活性成分組合使用於治療下面討論的病況。額外的活性成分可與本發明之至少一種化合物、與本發明之活性劑分開共投，或將該藥劑包括在根據本發明之醫藥組成物之中。在一說明性實施例中，額外的活性成分係已知或被發現能有效治療由JAK活性所介導之病況、病症、或疾病者，諸如另一個JAK抑制劑或對與特定病況、病症、或疾病相關之另一目標具活性之化合物。該組合可用於增加療效(例如，藉由於該組合中包括增強根據本發明之藥劑的效力或有效性之化合物)、降低一或多種副作用、或降低根據本發明之活性劑之所需劑量。

當提及抑制目標時，「有效量(effective amount)」意指足以影響至少一種JAK蛋白質家族之活性的量。測量目標的活性可藉由分析方法執行。

本發明之活性劑係設想為單獨使用或與一或多個額外的活性成分組合使用，以配製本發明之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物包含有效量的至少一種依據本發明之活性劑。

醫藥組成物中經常使用之醫藥上可接受的賦形劑係無毒、具生物耐受性或生物學上適合用於投予至對象之物質，諸如添加至藥用組成物或以其他方式用作為媒劑、載劑、或稀釋劑以促進藥劑投予並與其相容之惰性物質。此類賦形劑之實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類及各種類型的澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油、及聚乙二醇。

含有一或多個劑量單位的活性劑之醫藥組成物的遞送形式可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知或可得之醫藥上可接受的賦形劑及化合技術來製備。在本發明方法中，組成物可藉由合適遞送途徑投予，例如口服、腸胃外、直腸、局部、或眼部途徑，或藉由吸入。

製劑之形式可為錠劑、膠囊、囊劑(sachet)、糖衣錠(dragee)、粉劑、粒劑、***錠(lozenge)、重構用粉劑、液體製劑、或栓劑。組成物可經配製為用於複數個投予途徑中之任一者，諸如靜脈內輸注、皮下注射、局部投予、或口服投予。較佳的是，組成物可經配製為用於口服投予。

針對口服投予，本發明之活性劑可以錠劑、膠囊、或珠粒之形式提供，或以溶液、乳化液、或懸浮液之形式提供。為製備口服組成物，活性劑可配製為例如對於70公斤的人產生約1至1000mg/天(單次或多次劑量單位)的劑量作為例示性範圍。

口服錠劑可以包括與相容的醫藥上可接受之賦形劑混合的(多種)活性成分，賦形劑諸如稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、著色劑、及防腐劑。合適的惰性填料包括碳酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈉、磷酸鈣、乳糖、澱粉、糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨糖醇、及類似者。液體口服賦形劑包括乙醇、甘油、水、及類似者。澱粉、聚乙烯吡咯啶酮(polyvinyl-pyrrolidone,PVP)、羥乙酸澱粉鈉(sodium starch glycolate)、微晶纖維素、及藻酸係崩解劑。黏合劑可包括澱粉及明膠。潤滑劑(若存在的話)可為硬脂酸鎂、硬脂酸、或滑石。若為所欲，錠劑可經諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之材料包覆，以延遲在胃腸道的吸收，或者可經腸溶衣包覆。可使用的額外包覆膜包括設計成隨時間、pH、或細菌含量變動而釋放化合物或活性劑的包覆膜。

用於口服投予之膠囊包括硬明膠及軟明膠或(羥基丙基)甲基纖維素膠囊。為了製備硬明膠膠囊，可以將(多種)活性成分與固體、半固體、或液體稀釋劑混合。軟明膠膠囊可以藉由將活性成分與諸如花生油或橄欖油的油、液體石蠟、短鏈脂肪酸之單甘油酯與雙甘油酯的混合物、聚乙二醇400、或丙二醇混合來製備。用於口服投予之液體可為懸浮液、溶液、乳液、或糖漿之形式，或可經凍乾或呈現為使用前用於以水或其他合適媒劑重構之乾燥產物。該等液體組成物可能可選地含有：醫藥上可接受的賦形劑，例如懸浮劑(例如山梨糖醇、甲基纖維素、藻酸鈉、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠、及類似者)；非水性媒劑，例如油(例如杏仁油、或分餾椰子油)、丙二醇、乙醇、或水；防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、或山梨酸)；潤溼劑，例如卵磷脂；以及(若需要的話)調味劑、或著色劑。

本發明之活性劑亦可由非口服途徑投予。例如，組成物可經配製為用於直腸投予之栓劑、灌腸劑、或泡沫劑(foam)。針對腸胃外使用(包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、或皮下途徑)，本發明之劑可於緩衝至適當pH值及等滲性的無菌水性溶液或懸浮液中提供，或於腸胃外可接受的油中提供。合適水性媒劑包括林格氏液及等滲氯化鈉。此類形式可以單位劑量形式(諸如安瓿或一次性注射裝置)、以多劑量形式(諸如可自其中抽取適當劑量的小瓶)、或以可用於製備可注射配方的固體形式或預濃縮物呈現。例示性的輸注劑量範圍為在數分鐘至數天之期間內，約1至1000μg/kg/分鐘的與醫藥載劑混合之藥劑。

針對局部投予，藥劑可與醫藥載劑以約0.01%至約20%之藥物對媒劑的濃度混合，較佳的是0.1%至10%。另一投予本發明之藥劑之模式可利用貼片配方來達到經皮遞送。

或者在本發明之方法中，活性劑可經由鼻腔或口腔途徑藉由吸入投予，例如在亦含有合適載劑的噴霧配方中。

在進一步實施例中，本發明係關於一種治療患有或經診斷有JAK所介導之疾病、病症、或醫療病況之對象的方法，包含向需要該治療之對象投予有效量的活性劑。

在本發明方法之某些實施例中，該疾病、病症、或醫療病況係發炎性腸疾病，諸如克隆氏病及潰瘍性結腸炎。

本發明之其他實施例提供一種用於調節JAK活性的方法，包括當此類激酶在對象中時，該方法包含使JAK暴露於有效量的至少一種選自本發明之化合物的化合物。

本發明之化合物可使用作為JAK抑制劑，其可經口服給藥並特異性地分布至腸組織同時維持低全身性暴露。這與大多數已知的JAK抑制劑相反，其等經口服給藥且由於具有廣泛全身性暴露的事實，而分布至許多組織中。

表1a及表1b顯示體內實驗之結果。這些結果包含如規程1、2、或3所述，已投予至小鼠之十五種化合物的血漿及結腸組織濃度。藉由依循規程1，針對化合物(B)、(C)、及實例6及11使用背側蹠靜脈採血之靜脈穿刺法，獲得血漿及結腸濃度結果。藉由依循規程2，針對化合物(A)、及實例1、及3至5使用眼後採血法，且依循規程2，針對實例2、7至10、及12使用背側蹠靜脈之靜脈穿刺法，獲得血漿及結腸濃度結果。規程1及2的結果顯示於表1a。藉由依循規程3，獲得實例1、3、及4之血漿及結腸濃度結果。規程3的結果顯示於表1b。這些規程係描述於下面標題名稱為體內研究之下。

化合物(A)至(C)係下列參考化合物，在WO2013/007765或WO2011/086053中已揭示彼等可用作為詹納斯激酶抑制劑：

表1a及表1b中之化合物Ex.1至12係於各別實例中所給出的本發明之實施例。

如表1a中所表明，發現化合物Ex.1至12的結腸濃度遠高於各別血漿濃度，其中[結腸(4h)]：[血漿(0.5h)]濃度比的範圍係約52至約3,000。相對而言，化合物(A)至(C)之該濃度比的範圍係約3至約17。表1b亦提供實例1、3、及4在i.c.給藥後具有低全身性暴露量的支持性數據。當比較係指4h血漿濃度值時，本發明之實施例性質之間的對比相較於參考化合物更加突出。就此而言，化合物Ex.1至12的[結腸(4h)]：[血漿(4h)]濃度比的範圍係約888至約6886。相對而言，化合物(A)至(C)之該濃度比的範圍係約11至約538。這些結腸對血漿濃度比指示化合物Ex.1至12在口服給藥後的任何時間具有低全身性效應，而化合物(A)至(C)具有相對高的全身性效應。此係對化合物Ex.1至12的局部GI效應之意外發現。

如表4所示，測量化合物Ex.1至12之酶活性以判定各個別酶的活性。針對所有測試的化合物，測量酶活性之抑制，證明這些化合物係泛JAK抑制劑。在此表中所給出之化合物(A)至(C)的數據亦證明這些化合物對所有JAK蛋白的酶活性之抑制。

如表5所示，在周邊血液單核細胞(PBMC)中使用刺激物(stimuli)IL-2、IFN-α、及GM-CSF評估化合物Ex.1至12之細胞活性，並分別測量STAT5、STAT4、及STAT5的磷酸化之抑制。對於所有測試的化合物，用全部三種刺激物測量STAT磷酸化之抑制。

如表6所示，在模擬胃液(「simulated gastric fluid,SGF」)及模擬腸液(「simulated intestinal fluid,SIF」)中測量化合物Ex.1至12之溶解度。所有測試的化合物顯示在SGF中為400μM以上之可測量的溶解度，並且在SIF中為在81μM至400μM以上之範圍內的溶解度。如同表所示，這些溶解度數據與化合物(A)至(C)之溶解度相當。

如表7所示，在有與沒有依克立達(elacridar)(P-gp抑制劑)下，使用MDCK-MDR1細胞系測量化合物(A)至(C)及Ex.1至12的滲透性。在有與沒有P-gp抑制劑(依克立達)下，所有化合物的頂端至底側(apical-to-basolateral)之運輸測量皆展示出低滲透性。對於不具有依克立達(針對所有此類化合物)及具有依克立達(針對化合物(B)至(C)及化合物Ex.1至12)之頂端至底側運輸，化合物(A)至(C)及Ex.1至12的滲透係數值係低且相當的(該表中之第2欄及第3欄)，但是化合物(A)至(C)之底側至頂端滲透係數係大於大多數化合物Ex.1至12的滲透係數，如同表中之第4欄所示。參照表7中之第3欄及第4欄，在依克立達存在下測量到大多數化合物Ex.1至12具有低的頂端至底側滲透係數(第3欄)、以及低的底側至頂端滲透係數(第4欄)。這兩個特徵表徵此類化合物係低滲透性化合物。無法對化合物(A)至(C)做出相同的表徵，其底側至頂端滲透係數(第4欄)大於大多數化合物Ex.1至12的滲透係數。針對化合物(A)至(C)及Ex.1至12在同表中所給出之外排率顯示所有這些化合物皆係P-gp受質。

沒有已知參考教示或建議指示，與參考化合物(A)至(C)相比，對於本發明之實施例之明顯缺乏全身性效應係可以基於結構比較或化合物(A)至(C)之其他特徵(諸如參照表4、表6、及表7所討論者)來推論及/或預測。即使參考化合物(A)至(C)某些部份與本發明之實施例的類似部份呈現結構相似性亦然。

此外，沒有已知參考教示或建議指示，與參考化合物(A)至(C)相比，本發明之實施例之低滲透性特徵可以基於結構比較來推論及/或預測。

提供下列的具體實例以進一步說明本發明及各種實施例。

除非另有指示，否則依循下列實驗及分析規程，以獲得以下實例中所述之化合物及相應的分析數據。

除非另有指明，否則反應混合物係於室溫(rt)下磁性攪拌。當溶液被「乾燥(dried)」，其通常係以乾燥劑乾燥，諸如Na₂SO₄或MgSO₄。當混合物、溶液及萃取物被「濃縮(concentrated)」，其一般係在旋轉蒸發器上於減壓下濃縮。

薄層層析係使用Merck矽膠60 F₂₅₄ 2.5cm×7.5cm、250μm或5.0cm×10.0cm、250μm預塗佈之矽膠板執行。

除非另有註明，否則正相快速管柱層析(flash column chromatography,FCC)係在矽膠(SiO₂)上執行，並用於MeOH/DCM中之2M NH₃洗提。

除非另有指明，否則質譜(mass spectra,MS)係在Agilent系列1100 MSD上使用正模式電灑游離(electrospray ionization,ESI)獲得。計算出的(calcd.)質量相對應於實際質量。

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)光譜係於Bruker型號DRX光譜儀上獲得。以下¹H NMR數據之格式為：以四甲基矽烷為參考物之低磁場化學位移(以ppm為單位)(多重性，偶合常數J(以Hz為單位)，積分)。

化學名稱係由ChemDraw(CambridgeSoft,Cambridge,MA)或ACD/Name版本9(Advanced Chemistry Development,Toronto,Ontario,Canada)產生。舉例說明，使用Chemdraw Ultra Pro 14.0之命名功能所產生之名稱(1r,4r)係指環己基環周圍的反式位向。

為提供更簡明敘述，本文中給定的一些量化表示未使用用語「約(about)」來修飾。應理解到，不論是否明確地使用用語「約(about)」，本文中每個給定之數量係指實際給定數值，亦指基於該領域中之通常知識可合理推論之該給定數值的近似值，包括該給定數值在實驗及/或測量條件下所得之均等值及近似值。

當產量以百分比表示時，該產量係指實體之質量且係相對於該相同實體在特定化學計量條件下可獲得的最大量來表示。除非另有指示，否則以百分比給出之試劑濃度係指質量比。

諸如TGA、DSC、GVS的實驗一般基於正在分析之個別樣本在所呈現之數據上顯示輕微變異性並顯示水合及/或溶劑存在量的輕微變化。

個別實施例的TGA圖在X軸上係以溫度(以℃計)顯示且在Y軸上係以重量損失(以%計)顯示。

個別實施例的DSC圖在X軸上係以溫度(以℃計)顯示且在Y軸上係以熱流(以W/g計)顯示。DSC加熱速率為10℃/min。吸熱事件及放熱事件的積分提供所吸收的能量(針對吸熱事件)及所釋放的能量(針對放熱事件)(以J/g計)。在橫跨跡線上所顯示的虛線表示積分的面積。

在存在用語「放熱向上(Exo Up)」之圖中，吸熱事件係由向下的曲線反映而放熱事件係由向上的曲線反映。

已將一些繞射圖以重疊排列的繞射圖呈現，該等繞射圖經間隔分開以允許可視化。該等繞射圖之各者係以此等繞射圖之各者與縱座標軸的交叉點之零相對強度、或以此等繞射圖之各者的最低相對強度讀數為參考。

顯示任何單一實施例的複數個XPRD圖形之圖反映了此實施例之以相同方法但在不同溶劑中製備的樣本而獲得之不同圖形。

本文中使用的縮寫及頭字語包括下列，如以下所示：縮寫及頭字語之定義

中間體1的合成及表徵：

2-((1r,4r)-4-((5-硝基-1-(苯磺醯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)胺基)環己基)乙腈

步驟A：三級丁基N-[(1r,4r)-4-(羥基甲基)環己基]胺甲酸酯。向經惰性氮氣氛吹掃並維持的20-L 4頸圓底燒瓶，置放(1r,4r)-4-[[(三級丁氧基)羰基]胺基]環己烷-1-羧酸(1066g，4.38mol，1.00當量)及THF(10L)。此後在-10℃下歷時1h逐滴添加BH₃-Me₂S(10M,660mL)。將所得溶液在15℃下攪拌3h。將此反應並行執行三次並將反應混合物合併。接著藉由添加甲醇(2L)淬熄反應。將所得混合物在真空下濃縮。得到呈白色固體之三級丁基N-[(1r,4r)-4-(羥基甲基)環己基]胺甲酸酯(3000g,99.6%)。MS(ESI)：C₁₂H₂₃NO₃之計算質量為229.32；m/z測得為215.2[M-tBu+MeCN+H]⁺；¹H NMR：(300MHz,CDCl₃)：δ 4.40(s,1H),3.45(d,J=6.3Hz,2H),3.38(s,1H),2.05-2.02(m,2H),1.84-1.81(m,2H),1.44(s,11H),1.17-1.01(m,4H)。

步驟B：三級丁基N-[(1r,4r)-4-[(甲磺醯基氧基)甲基]環己基]胺甲酸酯。向經惰性氮氣氛吹掃並維持的20L 4頸圓底燒瓶，置放三級丁基N-[(1r,4r)-4-(羥基甲基)環己基]胺甲酸酯(1000g，4.36mol，1.00當量)、二氯甲烷(10L)、吡啶(1380g，17.5mol，4.00當量)。此後在-15℃下逐滴添加MsCl(1000g，8.73mol，2.00當量)。將所得溶液在25℃下攪拌整夜。將此反應並行執行3次並將反應混合物合併。接著藉由添加2L的水淬熄反應。以乙酸乙酯(1×9L)萃取水相。將有機層分離，並用1M HCl(3×10L)、NaHCO₃(飽和aq.)(2×10L)、水(1×10L)、及鹽水(1×10L)洗滌。將混合物以無水硫酸鈉乾燥、過濾、並在真空下濃縮。得到呈白色固體之三級丁基N-[(1r,4r)-4-[(甲磺醯基氧基)甲基]環己基]胺甲酸酯(3300g,82%)。LC-MS：MS(ESI)：C₁₃H₂₅NO₅S之計算質量為307.15；m/z測得為292.1，[M-tBu+MeCN+H]⁺；¹H NMR：(300MHz,CDCl₃)：δ 4.03(d,J=6.6Hz,2H),3.38(s,1H),3.00(s,3H),2.07-2.05(m,2H),1.87-1.84(m,2H),1.72-1.69(m,1H),1.44(s,9H),1.19-1.04(m,4H)。

步驟C：三級丁基N-[(1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基]胺甲酸酯。向10L 4頸圓底燒瓶置放三級丁基N-[(1r,4r)-4-[(甲磺醯基氧基)甲基]環己基]胺甲酸酯(1100g，3.58mol，1.00當量)、DMSO(5500mL)、及NaCN(406g，8.29mol，2.30當量)。將所得混合物在90℃下攪拌5h。將此反應並行執行3次並將反應混合物合併。接著藉由添加15L的水/冰淬熄反應。藉由過濾收集固體。將固體用水(3×10L)洗滌。得到呈白色固體之三級丁基N-[(1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基]胺甲酸酯(2480g,97%)。MS(ESI)：C₁₃H₂₂N₂O₂之計算質量為238.17；m/z測得為224[M-tBu+MeCN+H]⁺；¹H NMR：(300MHz,CDCl₃)：δ 4.39(s,1H),3.38(s,1H),2.26(d,J=6.9Hz,2H),2.08-2.04(m,2H),1.92-1.88(m,2H),1.67-1.61(m,1H),1.44(s,9H),1.26-1.06(m,4H)。

步驟D：2-[(1r,4r)-4-胺基環己基]乙腈鹽酸鹽。向10L圓底燒瓶置放三級丁基N-[(1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基]胺甲酸酯(620g，2.60mol，1.00當量)、及1,4-二

烷(2L)。此後在10℃下在攪拌下逐滴添加HCl於1,4-二

烷中之溶液(5L,4M)。將所得溶液在25℃下攪拌整夜。將此反應執行4次並將反應混合物合併。藉由過濾收集固體。將固體用1,4-二

烷(3×3L)、乙酸乙酯(3×3L)、及己烷(3×3L)洗滌。得到呈白色固體之2-[(1r,4r)-4-胺基環己基]乙腈鹽酸鹽(1753g,96%)。MS(ESI)：C₈H₁₄N₂之計算質量為138.12；M/z測得為139.25，[M+H]⁺；¹H NMR：(300MHz,DMSO-d ₆)：δ 8.14(s,3H),2.96-2.84(m,1H),2.46(d,J=6.3Hz,2H),1.98(d,J=11.1Hz,2H),1.79(d,J=12.0Hz,2H),1.64-1.49(m,1H),1.42-1.29(m,2H),1.18-1.04(m,2H)。

步驟E：2-((1r,4r)-4-((5-硝基-1-(苯磺醯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)胺基)環己基)乙腈。向含有2-[(1r,4r)-4-胺基環己基]乙腈鹽酸鹽(29.10g,166.6mmol)之1000mL圓底燒瓶，添加DMA(400mL)。將所得懸浮液用4-氯-5-硝基-1-(苯磺醯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(51.53g,152.6mmol)處理，之後用DIPEA(63.0mL,366mmol)。將反應混合物置於N₂下並在80℃下加熱4h。將粗製反應混合物冷卻至室溫，並緩慢地倒入含有1.6L水之劇烈攪拌的2L燒瓶中。將所得懸浮液在室溫下攪拌15分鐘，然後過濾並在真空烘箱中於70℃下加熱乾燥16h，以提供呈黃色固體之標題化合物(63.37g,95%)。MS(ESI)：C₂₁H₂₁N₅O₄S之計算質量為439.1；m/z測得為440.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)：δ 9.10(s,1H),8.99(d,J=7.8Hz,1H),8.23-8.15(m,2H),7.66-7.59(m,2H),7.56-7.49(m,2H),6.67(d,J=4.2Hz,1H),3.95-3.79(m,1H),2.38(d,J=6.2Hz,2H),2.32-2.21(m,2H),2.08-1.98(m,2H),1.88-1.76(m,1H),1.60-1.32(m,4H)。

中間體2的合成及表徵：

2-((1r,4r)-4-((5-胺基-1-(苯磺醯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)胺基)環己基)乙腈

將2-((1r,4r)-4-((5-硝基-1-(苯磺醯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)胺基)環己基)乙腈(中間體1，58.60g，133.3mmol)溶解於THF/MeOH(1：1,4800mL)中。使混合物以流速10mL/min與100%氫氣(大氣壓力，80℃)通過諸如Thales Nano H-Cube®之連續流氫化反應器(10% Pd/C)，然後濃縮該溶液以提供呈紫色固體之產物。將固體用EtOAc(400mL)研磨(triturated)，接著用MeOH(200mL)再次研磨，然後過濾並在真空下乾燥，以提供標題化合物(50.2g，產率91.9%)。MS(ESI)：C₂₁H₂₃N₅O₂S之計算質量為409.2；m/z測得為410.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.10-8.03(m,2H),7.76(s,1H),7.51-7.43(m,1H),7.43-7.34(m,3H),6.44(d,J=4.2Hz,1H),4.61(d,J=8.5Hz,1H),3.65-3.51(m,1H),2.74(s,2H),2.26(d,J=6.4Hz,2H),2.19-2.05(m,2H),1.97-1.86(m,2H),1.76-1.59(m,1H),1.33-1.12(m,4H)。

中間體3的合成及表徵：

乙基2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸酯

向含有攪拌子及2-((1r,4r)-4-((5-胺基-1-(苯磺醯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)胺基)環己基)乙腈(中間體2，58.31g，142.4mmol)之1L圓底燒瓶，添加乙基3-乙氧基-3-亞胺基丙酸酯(60.51g,309.3mmol)，之後添加EtOH(600mL，以3Å分子篩乾燥48h)。將回流冷凝器附接至反應燒瓶，將反應物用N₂吹掃，並在90℃下加熱9h。將反應混合物冷卻至室溫並靜置30h，結晶出呈棕色針狀之產物。用刮勺打碎固體並將反應混合物轉移至2L燒瓶中。在劇烈攪拌下經由分液漏斗緩慢地添加水(1.4L)。在添加完水後，將懸浮液攪拌30分鐘。藉由過濾單離棕色針狀物，然後藉由抽空氣通過過濾器1h來乾燥。將產物轉移至500mL燒瓶中並用EtOAc(200mL)處理。添加小量的晶種，其誘導白色固體沉澱物的形成。將懸浮液在室溫下攪拌30分鐘，過濾，用EtOAc(25mL)潤洗，並在真空下乾燥，以提供呈白色固體之產物(48.65g，產率68%)。MS(ESI)：C₂₆H₂₇N₅O₄S之計算質量為505.2；m/z測得為506.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.85(s,1H),8.28-8.19(m,2H),7.84(d,J=4.0Hz,1H),7.61-7.53(m,1H),7.52-7.43(m,2H),6.84(d,J=4.1Hz,1H),4.32(s,1H),4.20(q,J=7.1Hz,2H),4.09(s,2H),2.44(d,J=6.2Hz,2H),2.40-2.27(m,2H),2.16(d,J=13.3Hz,2H),2.12-1.96(m,3H),1.54-1.38(m,2H),1.27(t,J=7.1Hz,3H)。

中間體4的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸鈉

向乙基2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸酯(中間體3，9.50g，18.8mmol)於MeOH(30mL)與THF(30mL)中之溶液，添加aq氫氧化納(56.4mL,56.4mmol,1M)並在室溫下攪拌14小時。將溶劑於室溫下減壓下移除以提供呈棕色固體之標題化合物(7g)，其不經進一步純化即用於下一步驟。MS(ESI)：C₁₈H₁₈ N₅NaO₂之計算質量為359.1；m/z測得為337.9[M+H-Na]⁺。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ 8.52-8.47(m,1H),7.85-7.81(m,2H),7.46-7.41(m,4H),6.85-6.81(m,1H),4.60- 4.46(m,1H),3.96(s,2H),2.59-2.49(m,4H),2.19-2.05(m,6H),1.56-1.43(m,2H)(標題化合物與苯磺酸之1：1混合物)。

實例1的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺

步驟A：2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺。為確保乾燥的起始材料，在反應之前，將乙基2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸酯(中間體3)在50℃真空下加熱18h。在1L燒瓶中，將乙基2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸酯(中間體3，52.585g，104.01mmol)懸浮於DMA(50mL)中。添加1-胺基-2-甲基丙-2-醇(50mL)，並將反應物加熱至110℃持續45分鐘，然後加熱至125℃持續5小時。將反應物冷卻至室溫並用EtOAc(800mL)稀釋。以水/鹽水之溶液萃取有機層三次，其中該溶液係由1L水加50mL鹽水製成。以EtOAc(2×600mL)反萃取水層。將合併之有機層以無水MgSO₄乾燥，濃縮至乾，然後在真空下乾燥3天，以提供呈黃色發泡體之標題化合物(65.9g，產率98%)。產物不經進一步純化即送入下一步驟。MS(ESI)：C₂₈H₃₂N₆O₄S之計算質量為548.22；m/z測得為549.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ 8.76(s,1H),8.26-8.19(m,2H),7.84(d,J=4.1Hz,1H),7.60-7.53(m,1H),7.50-7.44(m,2H),6.84(d,J= 4.2Hz,1H),4.76-4.61(m,1H),3.97(s,2H),3.45(s,1H),3.27(d,J=5.9Hz,2H),2.41(d,J=6.5Hz,2H),2.38-2.25(m,2H),2.23-2.12(m,2H),2.09-1.94(m,4H),1.48(qd,J=13.6,4.0Hz,2H),1.21(s,6H)。

步驟B：2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺。將2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺(65.90g,102.1mmol)添加至含有攪拌子之1L燒瓶中。添加1,4-二

烷(300mL)，之後添加aq KOH(3M,150mL)。將反應物在80℃下加熱2h。將反應物冷卻至室溫，並在旋轉蒸發器上將溶劑體積減至約200mL。將殘餘物用水/鹽水(100mL/100mL)之溶液處理，然後以於CH₂Cl₂(2×1L)中之10% MeOH萃取。將有機層合併，以無水MgSO₄乾燥，並濃縮至乾，以提供黃色固體。將固體懸浮於CH₂Cl₂(200mL)中，劇烈攪拌30分鐘，然後藉由過濾收集。用CH₂Cl₂(100mL)潤洗固體，藉由抽空氣通過過濾器來乾燥，然後在真空下在室溫下進一步乾燥16h，以提供呈白色固體之標題化合物(41.59g，產率89%)。MS(ESI)：C₂₂H₂₈N₆O₂之計算質量為408.23；m/z測得為409.2[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz,DMSO-d ₆)：δ 11.85(s,1H),8.50(s,1H),8.21-8.10(m,1H),7.49-7.43(m,1H),6.74-6.65(m,1H),4.53-4.42(m,2H),4.07(s,2H),3.08(d,J=6.0Hz,2H),2.58(d,J=6.1Hz,2H),2.41-2.28(m,2H),2.09-1.92(m,5H),1.42-1.31(m,2H),1.09(s,6H)。本發明之實施例之各者的合成及活性化合物表徵在本文中係以實例的形式提供。由於本發明之一些實施例之晶體結構，可實行多形體篩選以進一步表徵任何此類化合物之特定形式。此係藉由在標題名稱為多形體篩選下的實例以非限制性的方式針對化合物Ex.1說明。本文中所記述之關於化合物Ex.1之測試係用如以下於多形體篩選實例中所述之實施例1s所給出之形式的此類化合物執行。

實例2的合成及表徵：

2-((1r,4r)-4-(2-(1H-咪唑-4-基)咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)環己基)乙腈

步驟A：2-((1r,4r)-4-(2-(1H-咪唑-4-基)-6-(苯磺醯基)咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)環己基)乙腈。將2-((1r,4r)-4-((5-硝基-1-(苯磺醯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)胺基)環己基)乙腈(中間體1，23.3g，53.0mmol)加入含有磁性攪拌子之1L圓底燒瓶中，之後添加DMSO(200mL)及甲醇(200mL)。添加呈固體之1H-咪唑-4-甲醛(8.56g,89.1mmol)，之後添加低亞硫酸鈉(32.7g，188mmol，為於水(100mL)中之溶液)。將反應容器配備回流冷凝器，並在加熱組中加熱至90℃持續15h。然後將反應混合物冷卻至室溫，並在攪拌下添加至含有水(2000mL)之燒瓶中，其導致白色沉澱物之形成。將混合物攪拌30分鐘，並藉由過濾收集固體。將固體藉由抽空氣通過過濾器6h來乾燥，然後在真空烘箱中於60℃下加熱3天來進一步乾燥，以提供呈黃色固體之標題化合物(22.7g，產率88%)。MS(ESI)：C₂₅H₂₃N₇O₂S之計算質量為485.16；m/z測得為486.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ 8.74(s,1H),8.29(s,1H),8.20-8.11(m,2H),8.04-7.96(m,2H),7.76-7.68(m,1H),7.68-7.60(m,2H),7.19(d,J=4.2Hz,1H),5.56(s,1H),2.58(d,J=6.3Hz,2H),2.38-2.24(m,2H),2.07(s,1H),1.98(d,J=10.8Hz,5H),1.35(q,J=12.3Hz,2H)。

步驟B：2-((1r,4r)-4-(2-(1H-咪唑-4-基)咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)環己基)乙腈。使用類似於實例1中所述者之條件製備標題化合物，步驟B使用2-((1r,4r)-4-(2-(1H-咪唑-4-基)-6-(苯磺醯基)咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-1(6H)-基)環己基)乙腈(222mg,0.46mmol)代替2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺，且殘餘物係藉由快速管柱層析法純化(0至15%的 2N NH₃-MeOH/EA)，以提供標題化合物(97mg，產率69%)。MS(ESI)：C₁₉H₁₉N₇計算質量為345.17；m/z測得為346.0[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)：δ 12.61(s,1H),11.86(s,1H),8.55(s,1H),7.92(d,J=1.3Hz,1H),7.83(s,1H),7.48(t,J=3.0Hz,1H),6.76(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),5.85(s,1H),2.60(d,J=6.0Hz,2H),2.57-2.41(m,2H),2.14-1.88(m,5H),1.45-1.27(m,2H)。

實例3的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(環丙基甲基)乙醯胺

步驟A：2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(環丙基甲基)乙醯胺。將乙基2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸酯(中間體3，555mg，1.06mmol)與環丙基甲基胺(1.87mL,21.1mmol)之混合物在微波反應器中於125℃下加熱1h。將殘餘物用水處理，然後以乙酸乙酯萃取。將有機層合併，以硫酸鈉乾燥，通過二氧化矽塞，並使用旋轉蒸發器濃縮至乾，以提供標題化合物(642mg)。MS(ESI)：C₂₈H₃₀N₆O₃S之計算質量為530.21；m/z測得為531.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)：δ 8.64(s,1H),8.19-8.11(m,2H),7.95(d,J=4.1Hz,1H),7.66-7.57(m,1H),7.57-7.48(m,2H),7.11(d,J=4.1Hz,1H),4.53(s,1H),4.08(s,2H),3.07(d,J=7.1 Hz,2H),2.53(d,J=5.9Hz,2H),2.45-2.30(m,2H),2.14-2.03(m,5H),1.55-1.42(m,2H),1.02-0.94(m,1H),0.54-0.47(m,2H),0.24-0.18(m,2H)。

步驟B：2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(環丙基甲基)乙醯胺。向2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(環丙基甲基)乙醯胺(560mg,1.05mmol)於1,4-二

烷(4.22mL)中之混合物，添加3N KOH(2.81mL)。將混合物在80℃下加熱1hr，然後用鹼性HPLC(Xbridge Prep OBD C₁₈ 50mm×100mm，5μm管柱(洗提液為0至100%的aq NH₄OH/ACN(10min))純化，以提供標題化合物(187mg，產率46%)。MS(ESI)：C₂₂H₂₆N₆O之計算質量為390.22；m/z測得為391.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)：δ 8.57(s,1H),7.50(d,J=3.5Hz,1H),6.86(d,J=3.5Hz,1H),4.57(s,1H),4.11(s,2H),3.13(d,J=7.0Hz,2H),2.67-2.52(m,4H),2.20-2.03(m,5H),1.58-1.44(m,2H),1.12-0.97(m,1H),0.60-0.48(m,2H),0.31-0.22(m,2H)。

實例4的合成及表徵：

N-(2-氰基乙基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺

向2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸鈉(中間體4，400mg，1.11mmol)及3-胺基丙腈(320mg,2.24mmol)於DMF(5mL)中之溶液，添加PyBOP(870mg,1.67mmol)及DIPEA(0.60mL,3.5mmol)。將反應混合物於室溫下攪拌40h。在真空中移除DMF之後，殘餘物係藉由使用50至100%乙酸乙酯(於庚烷中)之快速管柱層析法純化。將所收集的流份在真空中濃縮至小體積，並將析出之白色固體濾出，用於CH₂Cl₂中之10% MeOH洗滌並乾燥，以提供標題化合物(75mg，產率17%)。將濾液濃縮至乾，並藉由使用Varian Pursuit XR_s5 Diphenyl 100mm×30mm管柱(洗提液為10至90% CH₃CN於水中，含0.1% TFA)之逆相HPLC純化，以提供澄清油狀物。將此材料溶解在於CH₂Cl₂中之10% MeOH中，通過三個500mg SILICYCLE SPE-R66030B-03P Carbonate(SiliaBond酸清除劑固相萃取匣)管柱以移除TFA，並用於CH₂Cl₂中之10% MeOH洗提，以提供標題化合物之額外流份(88mg，產率20%)。將兩個流份合併以提供呈白色固體之最終產物(163mg，產率37%)。MS(ESI)：C₂₁H₂₃N₇O之計算質量為389.20；m/z測得為390.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)：δ 8.53(s,1H),7.48(d,J=3.0Hz,1H),6.84(d,J=3.5Hz,1H),4.51(br s,1H),4.12(s,2H),3.50(t,J=6.6Hz,2H),2.71(t,J=6.6Hz,2H),2.45-2.63(m,4H),2.03-2.19(m,5H),1.44-1.57(m,2H)。

實例5的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙醯胺

將乙基2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸酯(中間體3，309mg，0.61mmol)與4-胺基四氫哌喃(195mg,1.93mmol)於1,4-二

烷(0.5mL)中之混合物在微波反應器中於180℃下加熱1hr。然後將反應混合物以1,4-二

烷(1.5mL)稀釋，用aq 3N KOH(2mL)處理，並在80℃下加熱1.5hr。然後將殘餘物用水(10mL)處理，並以CH₂Cl₂(3×50mL)萃取。將有機層合併，以MgSO₄乾燥，並在真空中濃縮。粗製材料係使用快速管柱層析法(5至10% MeOH/CH₂Cl₂)純化，以產出標題化合物(146mg，產率57%)。MS(ESI)：C₂₃H₂₈N₆O₂之計算質量為420.23；m/z測得為421.2[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz,DMSO-d ₆)：δ 11.84(s,1H),8.49(s,1H),8.36(d,J=7.5Hz,1H),7.46(t,J=3.0Hz,1H),6.73-6.67(m,1H),4.54-4.41(m,1H),3.98(s,2H),3.86-3.81(m,2H),3.81-3.74(m,1H),3.40-3.34(m,2H),2.60(d,J=6.0Hz,2H),2.41-2.29(m,2H),2.10-2.01(m,1H),2.00-1.93(m,4H),1.77-1.70(m,2H),1.49-1.33(m,4H)。

實例6的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)乙醯胺

向微波小瓶添加乙基2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸酯(中間體3，300mg，0.593mmol)及4-胺基甲基四氫哌喃(683mg,5.93mmol)。將所得溶液在125℃下攪拌1h。接下來添加二

烷(2.37mL)及KOH(3M於水中，1.58mL，4.75mmol)，並且將反應物在微波中於80℃下攪拌1h。將反應物以使用Waters Xbridge Prep OBD C₁₈ 150mm×30mm，5μm管柱(洗提液為0至100%的水(含0.05% NH₄OH)/ACN(10min))之鹼性HPLC純化，以提供標題化合物(97mg，產率38%)。MS(ESI)：C₂₄H₃₀N₆O₂之計算質量為434.24；m/z測得為435.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)：δ 8.43(s,1H),7.38(d,J=3.5Hz, 1H),6.74(d,J=3.5Hz,1H),4.43(s,1H),4.03-3.96(m,2H),3.89-3.79(m,2H),3.34-3.25(m,2H),3.04(d,J=6.8Hz,2H),2.54-2.38(m,4H),2.08-1.96(m,5H),1.74-1.63(m,1H),1.59-1.54(m,2H),1.46-1.33(m,2H),1.25-1.14(m,2H)。

實例7的合成及表徵：

N-(2-氰基-2-甲基丙基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺

將2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸鈉(中間體4，300mg，0.835mmol)、3-胺基-2,2-二甲基丙腈(82.0mg,0.835mmol)、DIPEA(216mg,1.67mmol)、及DMF(5mL)之溶液在0℃下攪拌1h。然後添加PyBrOP(467mg,1.00mmol)，並將反應混合物於室溫下攪拌整夜。將混合物以10mL的水淬熄，並藉由使用Waters Xbridge Prep OBD C₁₈ 150mm×30mm 5μm管柱(洗提液：28%的水(含0.05%氨水v/v)-ACN)之製備型HPLC純化，以提供呈白色固體之標題化合物(58mg，產率16%)。MS(ESI)：C₂₃H₂₇N₇O之計算質量為417.23；m/z測得為418.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)：δ 11.86(br s,1H),8.71-8.66(m,1H),8.50(s,1H),7.48-7.45(m,1H),6.73-6.69(m,1H),4.53-4.42(m,1H),4.10(s,2H),3.33-3.31(m,1H),2.57(d,J=5.6Hz,2H),2.41-2.27(m,2H),2.05-1.93(m,5H),1.45-1.26(m,9H)。

實例8的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((1-羥基環丁基)甲基)乙醯胺

將2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸鈉(中間體4，300mg，0.835mmol)、1-(胺基甲基)環丁醇(84.4mg,0.835mmol)、DIPEA(216mg,1.67mmol)、及DMF(5mL)之溶液於0℃下攪拌1h。接下來，添加PyBrOP(467mg,1.00mmol)並在室溫下攪拌整夜，然後以10mL的水淬熄。反應物係藉由使用Kromasil 150mm×25mm，10μm管柱(洗提液：水(含0.05%氨水v/v)-ACN，自9%至39%，v/v)之製備型鹼性HPLC純化，以提供呈白色固體之標題化合物(90mg，產率26%)。MS(ESI)：C₂₃H₂₈N₆O₂之計算質量為420.23；m/z測得為421.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)：δ 11.58(br s,1H),8.50(s,1H),7.94-7.85(m,1H),7.46-7.40(m,1H),6.75-6.70(m,1H),4.89(br s,1H),4.57-4.47(m,1H),4.04(s,2H),3.27(d,J=6.0Hz,2H),2.55(d,J=6.0Hz,2H),2.45-2.31(m,2H),2.10-1.88(m,9H),1.71-1.60(m,1H),1.54-1.35(m,3H)。

實例9的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)乙醯胺

向2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸鈉(中間體4，100mg，0.278mmol)及1-甲基-1H-吡唑-4-胺(54.0mg,0.557mmol)於DMF(0.8mL)中之溶液，添加PyBrOP(217mg,0.417mmol)及DIPEA(0.144mL,0.835mmol)，並將混合物於室溫下攪拌整夜。在減壓下移除DMF，並將殘餘物藉由快速管柱層析法(50至100% EtOAc/庚烷、然後10% MeOH/DCM)純化，隨後藉由使用Varian Pursuit XR_s5 Diphenyl 100mm×30mm管柱(洗提液為10至90% CH₃CN於水中，含0.1% TFA)之逆相HPLC純化，以提供呈TFA鹽之產物。將此材料溶解在於CH₂Cl₂中之10% MeOH中，通過一個500mg SILICYCLE SPE-R66030B-03P Carbonate(SiliaBond酸清除劑固相萃取匣)管柱以移除TFA，以提供呈白色固體之標題化合物(34mg，產率29%)。MS(ESI)：C₂₂H₂₄N₈O之計算質量為416.21；m/z測得為417.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ=12.77(br s,1H),11.24(br s,1H),7.94(s,1H),7.89(br s,1H),7.46(s,1H),7.29-7.20(m,1H),6.74(br s,1H),4.85-4.65(m,1H),4.23(s,2H),3.85(s,3H),2.80-2.55(m,1H),2.45(d,J=6.6Hz,2H),2.32-1.98(m,6H),1.62-1.44(m,2H)。

實例10的合成及表徵：

N-(4-(氰基甲基)雙環[2.2.1]庚-1-基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺

步驟A：二甲基環戊烷-1,3-二羧酸酯。將環戊烷-1,3-二羧酸(70.0g,443mmol)及無水甲醇(300mL)之溶液於冰水浴中冷卻至0℃。逐滴添加濃縮硫酸(14mL)，將溫度維持在<15℃下。添加之後，將反應物加熱至90℃並攪拌整夜。將反應物冷卻至室溫並濃縮至乾。將殘餘物用MTBE(500mL)及H₂O(100mL)處理。將水層分離並以MTBE(2×100mL)萃取。將合併之有機萃取物以飽和碳酸氫鈉(2×100mL)、鹽水(100mL)洗滌，以無水MgSO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾，以提供呈淡黃色油狀物之標題化合物(72.5g,88%)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 3.65(s,6H),2.84-2.72(m,2H),2.26-2.17(m,1H),2.11-2.02(m,1H),1.96-1.88(m,4H)。

步驟B：二甲基雙環[2.2.1]庚烷-1,4-二羧酸酯。將正丁基鋰(2.5M於己烷中，419.0mL，1048mmol)在N₂下於-78℃(乾冰/丙酮)下，緩慢添加至二異丙基胺(152mL,1090mmol)及無水THF(1000mL)之溶液中。接下來，在冷卻至-78℃之前，將反應物於0℃下攪拌0.5小時。經由加料漏斗添加DMPU(404mL,3350mmol)。然後經由加料漏斗緩慢添加二甲基環戊烷-1,3-二羧酸酯(78.0g,419mmol)及無水THF(300mL)之溶液。將反應物升溫至0℃並攪拌30分鐘，然後冷卻至-78℃，並用1-溴-2-氯乙烷(59.0mL,712mmol)及無水THF(200mL)之溶液處理。讓反應物緩慢升溫至室溫，並在室溫下攪拌12小時。以飽和的氯化銨水溶液(400mL)淬熄反應。將反應物用乙酸乙酯(500mL)稀釋，將有機層分離，並將水層進一步以乙酸乙酯(2×500mL)萃取。將合併之有機萃取物用鹽水(2×300mL)洗滌，以無水MgSO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾。使殘餘物過濾通過矽膠墊，並用乙酸乙酯(2000mL)洗滌。將濾液濃縮至乾，且殘餘物係藉由快速管柱層析法純化(石油醚/乙酸乙酯，30：1至20：1，梯度洗提)，以提供呈白色固體之標題化合物(48.5g,54%)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ 3.69(s,6H),2.08-1.99(m,4H),1.91(s,2H),1.73-1.63(m,4H)。

步驟C：4-(甲氧基羰基)雙環[2.2.1]庚烷-1-羧酸。將氫氧化鈉(5.145g,128.6mmol)之甲醇(80mL)溶液在0℃下緩慢添加至二甲基雙環[2.2.1]庚烷-1,4-二羧酸酯(27.3g,129mmol)及THF(700mL)之溶液中，並將反應混合物在室溫下攪拌整夜。將反應物濃縮至乾，並將殘餘物用MTBE(15mL)研磨。藉由過濾收集沉澱物，用MTBE(5mL)洗滌，並溶解在100mL的H₂O中。將溶液用2M HCl酸化至pH=4。藉由過濾收集沉澱物，並在真空下乾燥，以提供呈白色固體之標題化合物(13.0g,51.0%)。將濾液用乙酸乙酯(3×75mL)萃取，並將合併之有機萃取物用鹽水(50mL)洗滌，以無水MgSO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾，以提供呈白色固體之標題化合物的第二流份(8.0g,31%)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 12.21(br s,1H),3.59(s,3H),1.94-1.86(m,4H),1.74(s,2H),1.61-1.54(m,4H)。

步驟D：甲基4-(((苄氧基)羰基)胺基)雙環[2.2.1]庚烷-1-羧酸酯。將疊氮磷酸二苯酯(17.1mL,78.6mmol)添加至4-(甲氧基羰基)雙環[2.2.1]庚烷-1-羧酸(13.0g,65.6mmol)、DIPEA(22.8mL,131mmol)、及無水甲苯(200mL)之溶液中，並將反應混合物在110℃下攪拌2小時。將反應物冷卻至50℃，且添加芐醇(13.6mL,131mmol)，並將反應混合物在110℃下攪拌整夜。將反應物濃縮至乾，溶解於MTBE(250mL)中，並用H₂O(150mL)洗滌。將有機層分離，並以MTBE(2×100mL)萃取水層。將合併之有機萃取物用鹽水(100mL)洗滌，以無水MgSO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾。藉由快速管柱層析法(石油醚/乙酸乙酯，10：1至5：1，梯度洗提)純化殘餘物，以提供呈淡黃色油狀物之不純產物(28.5g)。產物係藉由使用Phenomenex Synergi Max-RP 250×50mm×10μm管柱(洗提液：38%至68%(v/v)的CH₃CN及H₂O，且具有0.1% TFA)之製備型酸性HPLC純化。將純流份合併，且在真空下將揮發物移除。用H₂O (80mL)稀釋殘餘物，用飽和NaHCO₃水溶液將溶液之pH調整至pH=8，並將所得溶液以CH₂Cl₂(3×100mL)萃取。將合併之有機萃取物用鹽水(75mL)洗滌，以無水MgSO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾，以提供呈無色油狀物之標題化合物(17.3g,85%)。MS(ESI)：C₁₇H₂₁NO₄之計算質量為303.2；m/z測得為303.9[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.56(br s,1H),7.37-7.30(m,5H),4.97(s,2H),3.58(s,3H),1.90-1.80(m,6H),1.65-1.59(m,4H)。

步驟E：甲基4-((三級丁氧基羰基)胺基)雙環[2.2.1]庚烷-1-羧酸酯。將甲基4-(((苄氧基)羰基)胺基)雙環[2.2.1]庚烷-1-羧酸酯(17g,56mmol)、二-三級丁基二碳酸酯(18.35g,84.06mmol)、MeOH(200mL)、及濕式Pd/C(4g,10wt.%,50% H₂O)之混合物添加至具有氫氣球(13psi)之500mL圓底燒瓶中，並在室溫下攪拌72小時。將催化劑濾出，並將濾液濃縮至乾。殘餘物係藉由快速管柱層析法純化(石油醚/乙酸乙酯，20：1至1：1，梯度洗提)，以提供呈白色固體之標題化合物(12.0g,79.5%)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.04(br s,1H),3.57(s,3H),1.93-1.78(m,4H),1.77(s,2H),1.63-1.53(m,4H),1.35(s,9H)。

步驟F：4-((三級丁氧基羰基)胺基)雙環[2.2.1]庚烷-1-羧酸。向甲基4-((三級丁氧基羰基)胺基)雙環[2.2.1]庚烷-1-羧酸酯(5.0g,19mmol)、THF(40mL)、及MeOH(20mL)之溶液，在室溫下添加氫氧化鈉(1.0M,46.4mL,46.4mmol)水溶液，並將反應混合物在室溫下攪拌24小時。將反應物濃縮至乾，並將殘餘物用H₂O(20mL)稀釋，用2M HCl酸化至pH=4至5，以提供沉澱物。將沉澱物溶解在150mL的乙酸乙酯中，用鹽水(45mL)洗滌，以無水Na₂SO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾，以提供呈白色固體之標題化合物(4.74g，產率100%)，其直接用於下一步驟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 12.06(br s,1H),7.00(br s,1H),1.87-1.73(m,6H),1.58-1.50(m,4H),1.35(s,9H)。

步驟G：三級丁基(4-(羥基甲基)雙環[2.2.1]庚-1-基)胺甲酸酯。在氮氣氛下於0℃下，將硼烷-四氫呋喃錯合物(1.0M,37.1mL,37.1mmol)之溶液緩慢添加至4-((三級丁氧基羰基)胺基)雙環[2.2.1]庚烷-1-羧酸(4.74g,18.6 mmol)及無水THF(50mL)之溶液中。添加完成之後，將反應物在室溫下攪拌整夜。將水(30mL)緩慢添加至混合物，並將其攪拌額外30分鐘。將反應物濃縮至乾，並將殘餘物用乙酸乙酯(50mL)稀釋，用H₂O(15mL)及鹽水(10mL)洗滌，以無水Na₂SO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾。殘餘物係藉由快速管柱層析法純化(石油醚/乙酸乙酯，2：1)，以提供呈白色固體之標題化合物(4.0g，產率89%)。TLC(石油醚/乙酸乙酯，2：1)，R_f=0.5。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)：6.88(br s,1H),4.38(t,J=5.4Hz,1H),3.36(d,J=5.4Hz,2H),1.73(br s,2H),1.64-1.49(m,4H),1.42(s,2H),1.39-1.33(m,9H),1.25-1.16(m,2H)。

步驟H：(4-((三級丁氧基羰基)胺基)雙環[2.2.1]庚-1-基)甲基甲磺酸酯。將吡啶(2.7mL,33mmol)添加至三級丁基(4-(羥基甲基)雙環[2.2.1]庚-1-基)胺甲酸酯(2.0g,8.3mmol)及無水CH₂Cl₂(30mL)之溶液中。將反應物冷卻至0℃，且添加甲基磺醯氯(2.0mL,25.0mmol)，並將混合物在室溫下攪拌3小時。將反應物用CH₂Cl₂(50mL)及水(30mL)稀釋。將有機層分離，用鹽水(15mL)洗滌，以無水MgSO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾。殘餘物係藉由快速管柱層析法純化(石油醚/乙酸乙酯，5：1至1：1，梯度洗提)，以提供呈白色固體之標題化合物(2.58g,97%)。TLC(石油醚/乙酸乙酯，1：1)，R_f=0.85。¹H NMR(400M Hz,CDCl₃)4.73(br s,1H),4.21(s,2H),2.98(s,3H),1.93-1.90(m,2H),1.78-1.62(m,6H),1.53-1.34(m,11H)。

步驟I：三級丁基(4-(氰基甲基)雙環[2.2.1]庚-1-基)胺甲酸酯。向(4-((三級丁氧基羰基)胺基)雙環[2.2.1]庚-1-基)甲基甲磺酸酯(2.58g,8.07mmol)及DMSO(25mL)之溶液，添加氰化鈉(1.20g,24.5mmol)。將反應物加熱至100℃，並攪拌24小時。將反應物用50mL的水稀釋，並以乙酸乙酯(3×40mL)萃取。將合併之有機萃取物用鹽水(20mL)洗滌，以無水Na₂SO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾。殘餘物係藉由快速管柱層析法純化(石油醚/乙酸乙酯，5：1)，以提供呈白色固體之標題化合物(1.8g，產率89%)。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d ₆)：δ 7.00(br s,1H),2.67(s,2H),1.82(br s,2H),1.69-1.52(m,6H),1.47-1.40(m,2H),1.37(s,9H)。

步驟J：2-(4-胺基雙環[2.2.1]庚-1-基)乙腈鹽酸鹽。向三級丁基(4-(氰基甲基)雙環[2.2.1]庚-1-基)胺甲酸酯(850mg,3.40mmol)及乙酸乙酯(2mL)之懸浮液，在0℃下添加HCl於乙酸乙酯中之溶液(4.0M,10mL,40mmol)。在室溫下攪拌2小時之後，將混合物在減壓下濃縮至乾。將殘餘物用MTBE(5mL)研磨，並經由過濾單離懸浮液。將濾餅用MTBE(1mL)洗滌，並在減壓下乾燥，以得出呈白色固體之標題化合物(450mg,71%)。MS(ESI)：C₉H₁₄N₂之計算質量為150.12，m/z測得為151.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 8.59(br.s.,3H),2.78(s,2H),1.90-1.77(m,2H),1.74-1.62(m,4H),1.60(s,2H),1.56-1.46(m,2H)。

步驟K：N-(4-(氰基甲基)雙環[2.2.1]庚-1-基)-2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙醯胺。向2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸鈉(中間體4，300mg，0.835mmol)、2-(4-胺基雙環[2.2.1]庚-1-基)乙腈鹽酸鹽(138mg,0.918mmol)、及DIPEA(0.291mL,1.67mmol)於乾燥DMF(6mL)中之溶液，在0℃下添加PyBrOP(428mg,0.918mmol)。將反應物在室溫下攪拌12h。將混合物以10mL水淬熄，並以EtOAc(3×20mL)萃取。將合併之有機相用鹽水洗滌，以無水Na₂SO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾。殘餘物係藉由使用Xtimate C₁₈ 150×25mm×5μm管柱(洗提液：23%至33%(v/v)的CH₃CN及H₂O，且具有10mM NH₄HCO₃)之製備型HPLC及藉由製備型TLC(二氯甲烷：甲醇=15：1)純化，以提供呈白色固體之標題化合物(36.6mg，產率9%)。MS(ESI)：C₂₇H₃₁N₇O之計算質量為469.3；m/z測得為470.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)：δ 8.53(s,1H),7.48(d,J=4.0Hz,1H),6.84(d,J=4.0Hz,1H),4.47(br s,1H),4.07-4.02(m,2H),2.63(s,2H),2.61-2.50(m,4H),2.18-1.98(m,7H),1.94-1.84(m,2H),1.82(s,2H),1.79-1.68(m,2H),1.62-1.43(m,4H)。

實例11的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1H-吡唑-3-基)乙醯胺

步驟A：2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1H-吡唑-3-基)乙醯胺。標題化合物(383mg,70%)係以類似於實例1中所述之方式製備，步驟A使用1H-吡唑-3-胺(465mg,5.48mmol)代替1-胺基-2-甲基丙-2-醇。MS(ESI)：C₂₇N₂₆N₈O₃S之計算質量為542.2；m/z測得為543.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO-d ₆)δ 12.36(s,1H),11.36(s,1H),10.81(s,1H),8.65(s,1H),8.14-8.10(m,2H),7.96(d,J=4.1Hz,1H),7.72-7.68(m,1H),7.63-7.60(m,2H),7.30(s,1H),7.13(d,J=4.2Hz,1H),6.44-6.41(m,1H),5.41(s,1H),4.57(s,1H),4.44(s,2H),4.24(s,2H),2.56(d,J=6.2Hz,2H),2.23-2.13(m,2H),2.02-1.95(m,1H),1.41-1.32(m,2H)。

步驟B：2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1H-吡唑-3-基)乙醯胺。標題化合物係以類似於實例1之方式製備，步驟B使用2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(1H-吡唑-3-基)乙醯胺(270mg,0.500mmol)代替2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺，並藉由使用Xbridge Prep OBD C₁₈ 150mm×30mm，5μm，洗提液為5%的ACN/NH₄OH(aq)(10min)之鹼性HPLC純化，以提供標題化合物(15mg,7%)。MS(ESI)： C₂₁H₂₂N₈O之計算質量為402.5；M/z測得為403.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO-d ₆)：δ 12.35(s,1H),11.85(s,1H),10.84(s,1H),8.50(s,1H),7.58(d,J=2.3Hz,1H),7.46(d,J=3.4Hz,1H),6.72(d,J=3.5Hz,1H),6.47-6.39(m,1H),4.64-4.46(m,1H),4.21(s,2H),2.57(d,J=6.1Hz,2H),2.45-2.26(m,2H),2.08-1.88(m,5H),1.39(q,J=11.7Hz,2H)。

實例12的合成及表徵：

2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-((1-羥基環丙基)甲基)乙醯胺

將2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)乙酸鈉(中間體4，300mg，0.835mmol)、1-(胺基甲基)環丙醇(72.7mg,0.835mmol)、DIPEA(216mg,1.67mmol)、及DMF(5mL)之溶液於0℃下攪拌1h。然後添加PyBrOP(467mg,1.00mmol)，並在室溫下攪拌整夜。將混合物以10mL水淬熄，並藉由使用Kromasil 150mm×25mm，10μm管柱(洗提液：水(含0.05%氨水v/v)-ACN，自5%至35%，v/v)之製備型鹼性HPLC純化，以提供呈白色固體之標題化合物(84mg，產率25%)。MS(ESI)：C₂₂H₂₆N₆O₂之計算質量為406.21；M/z測得為407.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)：δ 11.53(br s,1H),8.50(s,1H),8.03-7.93(m,1H),7.44-7.40(m,1H),6.74-6.71(m,1H),5.04(s,1H),4.58-4.49(m,1H),4.02(s,2H),3.29(d,J=6.0Hz,2H),2.55(d,J=6.0Hz,2H),2.45-2.31(m,2H),2.10-1.97(m,5H),1.50-1.37(m,2H),0.62-0.55(m,2H),0.55-0.48(m,2H)。

多形體篩選實例

根據本發明之化合物作為游離鹼的一些實施例呈現具有複雜固態行為之多個結晶構形，其中一些由於不同的摻入溶劑量進而可在彼等之間呈現出鑑別特徵。根據本發明之化合物的一些實施例係呈假多形體的形式，其係相同化合物之實施例因晶格本身中不同量的溶劑而呈現晶格組成的差異。此外，通道溶劑合作用(channel solvation)亦可存在於根據本發明之化合物的一些結晶實施例中，其中溶劑係摻入存在於晶格中的通道或空隙內。例如，針對化合物Ex.1，發現各種結晶構形，包括在表2中所給出者。由於這些特徵，非化學計量溶劑合物係常觀察到的，如表2所示。此外，存在於根據本發明之一些實施例的晶體結構中之此類通道與空隙使水及/或溶劑分子之存在成為可能，彼等以不同程度的接合強度保留在晶體結構中。因此，特定環境條件的改變可輕易地造成根據本發明之一些實施例中的水分子及/或溶劑分子的一些損失或增加。應理解的是，表2中所列出的實施例之各者的「溶劑合作用(solvation)」(表2中第三欄)係化學式溶劑合作用(formula solvation)，而其以化學計量數字之實際判定(表2中第四欄)取決於當時實驗判定時的實際環境條件，而可能稍微與化學式溶劑合作用不同。例如，若在實施例中約一半的水分子可能以與晶格中的活性化合物以氫鍵結的形式存在，而約另一半的水分子可能在晶格中的通道或空隙中，則環境條件的變化可能改變在空隙或通道中此類鬆散地含有之水分子的量，因此造成在根據例如單晶繞射指派的化學式溶劑合作用與藉由例如熱重分析串聯質譜法判定的化學計量之間有稍微差異。一旦製成此類實施例之各者，藉由諸如單晶繞射(single crystal diffraction)、及熱重分析串聯質譜法之技術判定根據本發明之化合物的特徵，諸如化學式溶劑合作用及化學計量。

如實例1所述而獲得之化合物係藉由下列來進一步結晶：於DCM中製備漿液(1：3，例如10g的化合物在30ml的DCM中)，將其在40℃下攪拌4小時，並在25℃下進一步攪拌14小時，然後在25℃下緩慢添加庚烷(1：2，例如將20ml的庚烷加入化合物/DCM漿液/溶液中)，在40℃下攪拌4小時，冷卻至25℃，並在25℃下進一步攪拌14小時。隨後的過濾造成呈泛白色(off-white)固體形式之化合物Ex.1，其經識別為單水合物，即實施例1s。

化合物Ex.1的非晶形式(實施例19)係如下製備。將實施例1s(1g)溶解在三級丁醇(40vol)中並在50℃下攪拌。向該溶液添加經預乾燥之分子篩並攪拌10分鐘。將該溶液過濾並等分至HPLC小瓶(1ml)中，繼而將該等小瓶在乾冰-丙酮浴中冷凍。然後將樣本置於冷凍乾燥器中48h.。材料藉由XRPD係非晶形的且與藉由¹H-NMR所提出的結構一致，其中每分子的化合物Ex.1存在0.4mol的三級丁醇。將此材料加熱至150℃並保持在150℃下10min。將最終樣本藉由XRPD及¹H-NMR分析，且其經判定為非晶形的且每分子的化合物Ex.1保留0.03mol的三級-丁醇。

表2及圖2中之實施例1至18係結晶的，且圖2中之實施例19係非晶形的。實施例1s及1a至1h係同構造的。實施例1s在中心對稱三斜晶系P-1空間群中結晶。用語「實施例1(embodiment 1)」統指同構造的實施例1s及1a至1h。此類實施例1s及1a至1h中之任一者有時係稱為實施例1之同構造成員或僅稱為實施例1之成員。實施例3b、3c、3d、及3e係同構造的，並在單斜晶系統、空間群C 2/c中結晶。用語「實施例3(embodiment 3)」統指同構造的實施例3b、3c、3d、及3e。此類實施例3b、3c、3d、及3e中之任一者有時係稱為實施例3之同構造成員或僅稱為實施例3之成員。同構造的實施例係彼等擁有相似的晶體結構性質(相同的對稱性及相似的單位晶胞參數和晶體堆積)而具有不同的化學組成(即在晶格中摻入不同的溶劑及/或/水分子)。在同構造的實施例中之單位晶胞參數可因不同組成(摻入晶體結構之溶劑或水)而稍微不同。表2中提到的實施例係如圖2中示意性所示、並如於下列中更詳細描述的來製備及/或互相轉換。

用於此等製備的結晶規程包括在純淨溶劑中的溶劑平衡、蒸發結晶、用熱過濾冷卻結晶、用反溶劑急速結晶、藉由熱循環結晶、在低溫下培養、熱/冷成熟、在升溫下培養、使用非晶形材料(實施例19)之高溫成熟、及使用非晶形材料(實施例19)之熱循環。固體係藉由HT-XRPD或XRPD分析。當適用時，將母液完全蒸發，且剩餘的固體亦藉由HT-XRPD或XRPD析。為單水合物之起始材料實施例1s係主要固體形式。

在25℃及50℃下進行溶劑平衡

藉由將化合物實施例1s懸浮在二十種純淨溶劑中，並在室溫下攪拌兩週及在50℃下攪拌一週來執行長期漿液實驗。當平衡時間完成後，自母液分離殘餘的固體。將固體在環境條件下乾燥，並在藉由HT-XRPD分析前於真空(5mBar)下乾燥。隨後，使固體暴露於加速老化條件(40℃/70%相對濕度)下兩天，並由HT-XRPD再次分析。

從大多數結晶溶劑中，獲得起始材料實施例1s。發現數種結晶溶劑的HT-XRPD圖形與初始實施例1s的圖形相似。在大多數這些繞射圖形中，識別出尖峰位移及/或額外尖峰。這些圖形之各者對應於經標記為1a至1h中之一者的實施例，並基於此類實施例之HT-XRPD繞射圖形中的相似性，彼等係表示為實施例1之同構造成員的實施例。實施例1之所有同構造成員在暴露於40℃及75% RH下兩天後轉換為實施例1a。

當實施例1s在25℃下暴露於100% RH時，其轉換成水合的實施例10。不過，實施例10在環境條件下係物理不穩定的。儘管實施例1s在三斜晶系統、P-1空間群中結晶，實施例10被發現在單斜晶系統、C 2/c空間群中結晶。實施例10在環境條件下物理穩定性有限，並且其轉換為另一個實施例，諸如1s或1a。此行為歸因於所有水合作用/溶劑合作用分子之不相等牢固的結合。在這種情況下，實施例10會具有在環境條件下會失去之結合較不牢固的第二水分子。更確切的說，實施例1s之物理穩定性係在氣候室中藉由使20mg的此類實施例之樣本暴露於40℃及70%相對濕度下四天，且使另外20mg的相同實施例之樣本亦暴露於25℃及100%相對濕度下四天來探討。在四天之後，將各種固體樣本藉由HR-XRPD分析，判定晶胞參數並檢索繞射圖。繞射圖顯示於圖6。從底部至頂部，圖6中第一個繞射圖對應於為起始材料之實施例1s，且第二個繞射圖對應於在40℃及70%相對濕度下暴露4天後的相同形式，於同一圖中標記為「1s 70 RH」。儘管具有少量的第二結晶形式(其可能是具有較高水含量的另一水合的實施例)，此分析顯露出已恢復為初始的實施例1s。檢索此類形式係不可能的，原因在於其存在的量很小。第三個繞射圖對應於在25℃及100%相對濕度下暴露4天後的實施例1s，於同一圖中標記為「10」。這些條件造成實施例1s轉換成具有初始實施例1s之少量汙染的實施例10，且溶劑合作用如表2所表徵。當脫水作用後，實施例1s與實施例10兩者皆再結晶成具有148℃熔點之無水形式。

實施例10亦藉由實施例1s或實施例19在水中的漿液轉化(slurry conversion)來製備，其中溫度循環為25至5℃。漿液係藉由將50mg的材料懸浮於1mL水中來製備。25至5℃的溫度循環係：將混合物在25℃下加熱1小時，然後在2小時的期間內將溫度降低至5℃。然後將混合物保持在5℃之溫度下1小時。然後在2小時的期間內將溫度提高至25℃。重複此溫度循環方案總共約24小時。藉由真空過濾單離固體然後在過濾器上乾燥10分鐘。實施例10在環境條件及真空下乾燥的期間轉換成實施例1s。

在室溫下的溶劑平衡從作為結晶溶劑之甲苯中產出實施例1b，且從作為結晶溶劑之對二甲苯中產出實施例1f。

識別出三個額外的固體實施例並定名為實施例2、3、及7。實施例2(其TGA及DSC分別顯示於圖21A及圖21B中)係從於室溫下在1,4-二

烷中執行的溶劑平衡實驗識別出，而實施例7係在50℃下從庚烷之單一溶劑平衡實驗中發現為與實施例1s之混合物。識別出數個相似但不相同的繞射圖，其被分組為實施例3b、3c、3d、及3e，係實施例3之同構造成員。發現實施例3之同構造成員與實施例1之成員混合。含有實施例3之成員的混合物在一些情況下轉化成實施例1a、或轉化成實施例1a與3e之混合物。實施例7似乎是物理穩定的，但是實施例2在暴露於AAC兩天後轉換成實施例3e。

蒸發結晶

將從在RT下執行的溶劑平衡實驗所保存之母液使用於緩慢蒸發結晶實驗。將母液過濾以移除任何顆粒物質，並讓其在環境條件下緩慢蒸發。將所獲得之固體藉由HT-XRPD分析，並在暴露於AAC兩天後再次分析。

由於化合物Ex.1在一些溶劑中的溶解度差，所以當使用此類溶劑時沒有回收到固體。在其中固體已沉澱的實驗中，回收到實施例1或3之非晶形殘餘物或同構造成員。在穩定性研究期間，實施例1之不同成員轉換成實施例1a，而實施例3之樣本似乎係物理穩定的。在一些情況下，非晶形固體在穩定性研究之後仍保持為非晶形、變成潮解或顯示一些結晶性之跡象。

冷卻結晶

將於50℃下執行之溶劑平衡實驗的母液在50℃下過濾，以移除任何顆粒物質。在50℃下使用0.2μm的PTFE過濾器過濾懸浮液，且將溶液放置於5℃下並老化72小時。當在老化期間固體已沉澱時，將這些固體自液體中分離，在環境條件下及真空下乾燥，並藉由HT-XRPD分析。讓剩餘的母液緩慢蒸發，並藉由HT-XRPD分析殘留的固體。將沒有沉澱發生的樣本放置於真空下，並藉由HT-XRPD分析經乾燥的固體。然後使所有的固體暴露於AAC(在40℃/70% RH下2天)下，並藉由HT-XRPD再分析。

在一些溶液中當冷卻後沒有固體沉澱，於此情況下將溶液於環境條件下蒸發。由於化合物Ex.1在一些溶劑中溶解度低，所以從一些溶液中沒有獲得固體。

但從四種溶劑(2-丙醇、2-丁酮、乙腈、及甲醇)中，發生了沉澱。實施例6係在800μL乙腈中、濃度為25mg/mL、mL規模下之單一冷卻結晶實驗之蒸發後識別出。實施例6在2天的AAC後似乎是穩定的固體形式，而其似乎為非溶合性實施例。

冷卻/蒸發結晶(在μL規模下)

冷卻/蒸發結晶實驗(在μL規模下)係於96孔盤中執行，使用12種純淨溶劑及12種溶劑混合物並施加四種溫度曲線。在各個孔中大約4mg的實施例1s為固體用量。隨後，添加結晶溶劑(80μL)及溶劑混合物以達到50mg/mL的濃度，並使各個孔個別密封的盤隨後經歷四種溫度曲線中的一種。當完成溫度曲線後，讓溶劑在低環境壓力下蒸發(24小時)，並且在暴露於AAC 2天(40℃/70% RH)之前及之後，藉由HT-XRPD分析殘留的固體。

從大多數溶劑系統及溫度曲線中發現實施例1及3之成員。然而，觀察到固體形式對溫度曲線的某些傾向。實施例1b係主要自短的溫度曲線(3小時的老化)識別出。不過，相同溶劑系統在長的老化時間下，造成識別出實施例1f、實施例3之成員、或實施例1與3之成員的混合物。實施例3c係以1,4-二

烷作為結晶溶劑且在以50℃作為初始溫度、保持60min、之後以1℃/h的速率冷卻至最終溫度20℃、保持48h之溫度曲線下獲得；實施例3d係以四氫呋喃作為結晶溶劑且與實施例3c相同的溫度曲線下獲得。

當施加短的老化條件時，實施例4係於在甲醇/水(50/50,v/v)、THF、及DCM/IPA(50/50,v/v)中執行的實驗中識別出。實施例4係藉由將實施例1s用水與甲醇之混合物(50/50)處理且在以50℃作為初始溫度、保持60min、之後以20℃/h的速率冷卻至最終溫度5℃、保持3h之溫度曲線下獲得，其產出實施例4連同實施例1b。實施例4連同實施例1b亦藉由將1s用水與甲醇之混合物(50/50)處理且在以50℃作為初始溫度、保持60min、之後以20℃/h的速率冷卻至最終溫度20℃、保持3h之溫度曲線下獲得。實施例4在環境條件下似乎不是物理穩定的。冷卻結晶實驗從作為結晶溶劑之乙酸乙酯/1,4-二

烷(50/50,v/v) 中且在以50℃作為初始溫度、保持60min、之後以1℃/h的速率冷卻至最終溫度5℃、保持48h之溫度曲線下產出實施例1c；從作為結晶溶劑之乙腈/氯仿(50/50,v/v)中且在以50℃作為初始溫度、保持60min、之後以1℃/h的速率冷卻至最終溫度5℃、保持48h之溫度曲線下產出實施例1d；且從作為結晶溶劑之乙酸乙酯/1,4-二

烷(50/50,v/v)中且在以50℃作為初始溫度、保持60min、之後以1℃/h的速率冷卻至最終溫度20℃、保持48h之溫度曲線下產出實施例1e。

實施例5係在以氯仿作為結晶溶劑且在以50℃作為初始溫度、保持60min、之後以1℃/h的速率冷卻至最終溫度20℃、保持48h之溫度曲線下所執行的實驗中識別出。

在穩定性研究期間看到如先前觀察到在其他結晶方法中的類似轉換。在大多數的情況下，所有固體形式皆轉換成實施例1a或轉換成含有實施例1a之混合物。

自固體混合物之蒸發結晶

在蒸發結晶中，使用溶劑/反溶劑混合物製備化合物之澄清溶液，從其中溶劑首先蒸發(高蒸汽壓)造成化合物在一些程度上以晶體的形式沉澱。當反溶劑(低蒸汽壓)蒸發時，這些晶體接著充當晶種。

化合物Ex.1在溶劑系統之各者中不會完全溶解。出於此原因，所有的實驗在蒸發前皆包括過濾。

HT-XRPD分析的結果證明在溶劑混合物之蒸發時化合物Ex.1主要結晶為實施例1s。這是針對下列溶劑/反溶劑系統所觀察到的：四氫呋喃/水、乙腈/水、氯仿/乙醇、甲醇/乙酸乙酯、2-丁酮/異丙醇、及庚烷/丙酮。從丙酮/異丙苯及1,4-二

烷/甲酸乙酯的兩個系統中，識別出同構造的實施例3b和3e，其等在AAC之後分別轉換成實施例1a和3d、及實施例1s和3e之不同混合物。

反溶劑結晶

在純淨溶劑中製備化合物Ex.1之飽和溶液。反溶劑添加係以正向及逆向添加執行。在正向添加中，反溶劑係以三個等分試樣添加至化合物溶液中。逆向添加係藉由將一定體積的化合物溶液添加至大幅過量之反溶劑(20mL)中來執行。

在沉澱之後，將固體自液體分離，在環境條件下乾燥，並在藉由HT-XRPD分析前於真空(5mbar)下乾燥。將當反溶劑添加時沒有發生沉澱的實驗於5℃下儲存48小時以誘導沉澱。過後將沉澱固體分離並藉由HT-XRPD分析。當沒有獲得固體時，將溶液在溫和條件下蒸發，並藉由HT-XRPD分析殘餘的固體。使所有的固體暴露於AAC(在40℃/70%RH下2天)下，並藉由HT-XRPD再分析。

正向反溶劑結晶在所有情況中均顯示出沉澱。可將所有的固體分類為實施例1之同構造成員(1s、1b、1j、1f)或實施例3之同構造成員(3b、3d、3f)。在暴露於AAC之後，除了一個轉換成實施例1a與實施例3e之混合物之外，所有固體樣本均轉換成實施例1a。

在以DMSO作為溶劑中執行的逆向反溶劑結晶實驗取決於所使用的反溶劑，給出不同的固體形式。用二氯甲烷或對二甲苯識別出實施例1之同構造成員(1s及1b)，而用MTBE則獲得非晶形殘餘物。用庚烷及水作為反溶劑所進行之兩種溶液的蒸發，其在反溶劑添加時不具有沉澱而造成油狀物。在AAC之後，觀察到轉換成實施例1a，且非晶形殘餘物變成潮解。

熱過濾實驗

用熱過濾之冷卻結晶實驗係自於50℃下在不同溶劑混合物中所製備的化合物Ex.1之過飽和溶液來執行。使經熱過濾之溶液經歷48小時的冷卻曲線。在該溫度曲線後，將固體已沉澱於其中的小瓶離心，且自液體分離固體，並藉由HT-XRPD(在真空下乾燥之後)分析。若沒有固體沉澱，則將溶液在真空下蒸發，並藉由HT-XRPD分析固體。使所有的固體暴露於AAC(在40℃/70% RH下2天)下，並藉由HT-XRPD再分析。在一半的熱過濾實驗中沒有發生沉澱，且當溶劑蒸發後，由於化合物Ex.1在該等溶劑系統中的溶解度差，因此未能回收到足夠的固體。在三個實驗中，回收到非晶形殘餘物，其在AAC之後結晶成實施例1(1s或1a)之成員與實施例3(3e)之混合物、或變成潮解。實施例5係自丙酮/氯仿(50/50,v/v)的實驗中識別出。此實施例似乎是物理不穩定的，因為在AAC之後觀察到轉換成實施例1a。

熱循環實驗

在室溫下於10種溶劑中製備約6mg之實施例1s的懸浮液。將懸浮液在5℃與50℃之間循環。當熱循環完成時，將固體藉由離心分離，並在藉由HT-XRPD分析前在環境條件下及在真空(5mbar)下乾燥。隨後，使所有的固體暴露於AAC下兩天，並藉由HT-XRPD再次分析。熱循環實驗通常促進形成更穩定的多形體形式。除了在環己酮中執行的實驗外，所有小瓶在熱曲線後均含有固體。將環己酮溶液在溫和真空下緩慢蒸發。在濕的固體中主要識別出實施例1、3之成員或彼等之混合物。當將這些固體乾燥後，觀察到轉換成實施例1s。實施例3b及3e係以51mg/mL(3b)之濃度自於300μL的環己酮中、及以37.3mg/mL(3e)之濃度自於400μL的異丁醇中之熱循環獲得。實施例5係以18.6mg/mL之濃度自於800μL的氯仿中之熱循環獲得。

圖3、圖4、及圖5顯示表2所列的一些實施例之HT-XRPD圖形的重疊圖，並亦在上述的篩選中提及。

實施例1s係自大多數結晶實驗中回收。其為通道水合物，取決於環境條件具有可變數量的水分子及/或其他溶劑摻入。觀察到轉換成實施例1a。此形式含有稍微多的水(1.3分子的水)。實施例1之所有同構造成員在暴露於40℃及75% RH下兩天後轉換成實施例1a。實施例1之成員在XRPD圖形中一些繞射尖峰的位移可能歸因於摻入晶格中之不同的溶劑或水分子。圖4顯示實施例1之成員的HT-XRPD圖形之重疊圖。繞射圖1s對應於化合物Ex.1，其為起始材料且呈實施例1s之形式。繞射圖1a對應於實施例1a，其係在數個實施例1s樣本暴露於AAC後獲得。繞射圖1b對應於實施例1b，其係自在RT下於甲苯中之溶劑平衡實驗獲得。繞射圖1c對應於實施例1c，其係自於乙酸乙酯/1,4-二

烷(50/50,v/v)中在μL規模下之冷卻結晶實驗獲得。繞射圖1c對應於實施例1d，其係自於乙腈/氯仿(50/50,v/v)中在μL規模下之冷卻結晶實驗獲得。繞射圖1e對應於實施例1e，其係自於乙酸乙酯/1,4-二

烷(50/50,v/v)中在μL規模下之冷卻結晶實驗獲得。繞射圖1f對應於實施例1f，其係自在RT下於對二甲苯中之溶劑平衡實驗獲得。繞射圖1g對應於實施例1 g，其係自在50℃下於苯甲醚中之溶劑平衡實驗獲得。繞射圖1h對應於實施例1h，其係自於對二甲苯中在μL規模下之冷卻結晶實驗獲得。

實施例3之成員的繞射圖顯示於圖5。在不同HT-XRPD圖形中所觀察的位移最可能歸因於摻入晶格中之不同的溶劑分子。實施例3係藉由將實施例2於70% RH下加熱至40℃持續4天而獲得。實施例3b到實施例3e係溶劑合物形式，其含有取決於摻入晶體結構中之溶劑(0.3至0.7分子)而變化的非化學計量的溶劑量。含有實施例3之成員的混合物當暴露於AAC時係不穩定的，且彼等在一些情況下轉化成實施例1a、或轉化成實施例1a與3e之混合物。轉換成實施例1a係歸因於當暴露於高相對濕度時，由水分子交換溶劑分子，並再結晶成水合的實施例1a。

實施例9係藉由將實施例2加熱至約200℃之溫度、之後冷卻至25℃而獲得，且亦藉由循環的DSC 25-200-25-300℃獲得。實施例9亦藉由額外程序獲得。此類程序之一者係兩步驟程序：將實施例1s(1.5g)在RT下用1,4-二

烷(10vol)處理。添加實施例2之晶種(5mg)並將樣本在RT下攪拌24小時。將所得懸浮液過濾並將樣本風乾1.5小時。此樣本藉由XRPD判定為實施例2。在此兩步驟程序的第二步驟中，將實施例2以10℃/min加熱至210℃並保持在210℃下30min。然後允許樣本冷卻至RT。所得固體藉由XRPD分析判定為實施例9。此類程序之另一者亦為用於獲得實施例9之兩步驟程序。在此程序中，將實施例1s(1.5g)用1,4-二

烷(10vol)處理。添加實施例2之晶種(5mg)並將樣本在RT下攪拌24小時。將所得懸浮液過濾並將樣本風乾1.5小時。此樣本藉由XRPD判定為實施例2。在此程序的第二步驟中，將實施例2以10℃/min加熱至 150℃，之後以2℃/min進一步加熱至170℃。允許樣本冷卻至RT。所得固體藉由XRPD分析判定為實施例9。實施例9之TGA及DSC係分別顯示於圖22A及圖22B中。

實施例1s係藉由在50℃下將實施例9在下列溶劑中漿化6天而獲得：2-丁酮、丙酮/水(90/10,v/v)、及乙腈/水(90/10,v/v)。當在室溫下執行相同實驗時，亦獲得實施例1s。

實施例8係藉由將實施例5加熱至約175℃之溫度而獲得。實施例8亦藉由額外程序獲得。此類程序之一者係兩步驟程序：將實施例1s(1.5g)用1,4-二

烷(10vol)處理並在RT下攪拌72小時。將所得懸浮液過濾並將所獲得之固體在真空烘箱中於RT下乾燥16小時。自此第一步驟獲得之固體藉由XRPD判定為實施例3c。在第二步驟中，將實施例3c(100mg)以10℃/min加熱至150℃，然後以2℃/min的較慢速率加熱達180℃。然後允許樣本冷卻回到RT。所得固體藉由XRPD判定為實施例8。此類程序之另一者亦係用於獲得實施例8之兩步驟程序。在此程序中，將實施例19(300mg)用1,4-二

烷(3vol)處理並在60℃下振盪24小時。將所得懸浮液過濾，且自此第一步驟獲得之固體藉由XRPD判定為實施例3c。在第二步驟中，將實施例3c(300mg)以10℃/min加熱至180℃。然後允許樣本冷卻回到RT。所得固體藉由XRPD判定為實施例8。實施例8之TGA及DSC係分別顯示於圖20A及圖20B中。

除了如上所述之實施例6的製備之外，此實施例亦藉由將實施例11(80至100mg)加熱而獲得，其製備係如下述，藉由熱重分析，以10℃/min從環境溫度至185℃並保持等溫3分鐘。允許樣本冷卻至RT。實施例6亦藉由使實施例11經受漿液實驗而自其獲得。漿液實驗係如下列運作：將溶劑添加至實施例11(50mg)中並將混合物在指定溫度下攪拌0.5小時。添加形式9之晶種(5mg)並將混合物在指定溫度下攪拌整夜。將固體藉由離心單離並藉由XRPD分析。在30℃及50℃兩者下使用乙酸異丙酯(0.5mL)進行。實施例6的產生係藉由XRPD確認。實施例6之TGA及DSC係分別顯示於圖19A及圖19B中。

本發明之額外實施例係如下述而獲得。

藉由使實施例5經受漿液實驗將其轉換成實施例9。漿液實驗係如下列在識別的溫度下使用各種溶劑進行：將溶劑添加至實施例5(50mg)中並將混合物在指定溫度下攪拌0.5小時。添加形式9之晶種(5mg)並將混合物在指定溫度下攪拌整夜。固體藉由離心單離並藉由XRPD分析。在50℃下運作之漿液實驗係使用下列溶劑進行：TBME(0.75mL)及乙酸異丙酯：庚烷的33：67混合物(0.5mL)。在75℃下運作之漿液實驗係使用下列溶劑進行：乙酸異丙酯(0.5mL)及甲基乙基酮(0.5mL)。

實施例11係如下獲得：將實施例1s(45g)在乙醇(絕對乙醇，水含量<0.1%，300mL)中之懸浮液在50℃下攪拌16.5小時。然後將懸浮液以0.25℃/分鐘冷卻至5℃。隨後，將懸浮液在5℃下攪拌3小時。然後將固體濾出並用冷(5℃)乙醇(絕對乙醇，水含量<0.1%，90mL)洗滌，且在真空下在40℃下乾燥17小時，以產生大約39g的實施例11。實施例11之TGA及DSC係分別顯示於圖17A及圖17B中。

實施例11亦如下獲得：將絕對乙醇(170mL)添加至實施例1s(19g)中並加熱至約該溶劑的沸點。少量的固體(5%)並未溶解並藉由熱過濾移除。經濾出之固體經判定為實施例1s。因此將該等固體添加回濾液中並將此混合物加熱直到所有固體溶解。經由分液漏斗向此熱溶液逐滴添加庚烷(535mL)。在此逐滴添加庚烷期間，劇烈攪拌熱溶液。在完成庚烷的添加之後，將含有熱溶液/庚烷混合物的燒瓶浸入冰水浴中並劇烈攪拌一小時。然後藉由過濾收集固體，並將白色固體濾餅藉由抽空氣通過其15分鐘來乾燥。將濾餅進一步乾燥，此係藉由使其在高度真空下及70℃下加熱16小時，然後藉由使其在80℃下加熱18小時，以產生16.3g的實施例11。實施例11的繞射圖係顯示於圖7中。

在實施例11的吸濕性研究中，發現其僅稍微吸濕，在GVS分析中，在0至90% RH之間質量變化為0.66%，如圖18中所示。GVS分析後之XRPD分析顯示材料係物理穩定的。執行可變溫度(VT)-XRPD以評估實施例11在加熱時的穩定性。當材料經受至多約175℃之溫度時，如藉由XRPD分析所示，該材料保持不變，然而在180℃以上時，樣本轉換成實施例6。在VT-XRPD實驗之前及之後的實施例11的繞射圖連同實施例6的繞射圖係顯示於圖24中。實施例11亦經受在40℃/75% RH下長達48天的靜態儲存分析(static storage analysis)。將樣本在2天、5天、及48天之後藉由XRPD及卡爾-費雪(Karl Fisher,KF)分析。如藉由XRPD分析所示，實施例11保持不變，且在48天之後具有1.2%的總吸水率。48天靜態儲存後，材料的¹H-NMR顯示材料保留0.36mol eq的乙醇。藉由¹H-NMR顯示在研究期間在環境條件下儲存的實施例11含有0.46mol eq的乙醇。

實施例11b係如下獲自實施例1s：將10mL的乾燥甲醇添加至3.3g的實施例1s中。使此混合物經受下列溫度循環：將混合物在40℃下加熱1小時，然後在2小時的期間內將溫度提高至60℃。然後將混合物在60℃下加熱1小時。然後在2小時的期間內將溫度降低至40℃。重複此溫度循環方案總共約20小時。屆時，在2小時的期間內將混合物冷卻至5℃。將固體在5℃下藉由真空過濾單離，然後在環境溫度及真空下乾燥約66小時。替代地，實施例11b係使用下列程序獲自實施例1s：將1mL的乾燥甲醇添加至330mg的實施例1s中。使此混合物經受下列溫度循環：將混合物在40℃下加熱1小時，然後在2小時的期間內將溫度提高至60℃。然後將混合物在60℃下加熱1小時。然後在2小時的期間內將溫度降低至40℃。重複此溫度循環方案總共約18小時。屆時，將固體藉由離心單離，然後在環境溫度及真空下乾燥約33小時。用於以上實驗的甲醇係使用分子篩(3Å，在100℃及真空下活化至少24h)乾燥。實施例11b的繞射圖係顯示於圖7E中。

實施例12係獲自實施例1s，將實施例1s在25℃下暴露於低於10% RH之濕度條件以提供實施例12。實施例12的繞射圖係顯示於圖7B中。

實施例13係如下獲得：在25±5℃下向250mL 4頸燒瓶中添加實施例1s的樣本。接著將MeOH(4.0V,40mL)及純化水(10mL,1.0V)裝入燒瓶並攪拌直到所有固體溶解。將N₂鼓泡入混合物中1小時，然後將混合物冷卻至0至5℃。製備0.225mL體積的NaBH₄/水(0.006當量，2.5% w/w)之冷卻溶液 (0至5℃)，其中在N₂及0℃下將純化水(40mL)裝入100mL的4頸燒瓶中，之後添加NaBH₄(1.0g)；將混合物在0℃下攪拌直到所有NaBH₄溶解。將此NaBH₄溶液添加至經冷卻之250-mL燒瓶(0至5℃)中並在0至5℃下攪拌。反應混合物的顏色轉變成黃色。在0至5℃下在1小時內逐滴添加純化水(40mL，4.0V，使用之前用N₂除氣)。將反應在N₂及0至5℃下攪拌4小時。在0至5℃下在1小時內逐滴添加額外的純化水(30mL，3.0V，經除氣)，並將反應混合物在N₂及0至5℃下再攪拌16小時。接著將反應過濾，並將所得固體在手套箱環境中在N₂(O₂含量為200ppm)下用純化水(20mL，2V，使用之前用N₂除氣)洗滌。將固體在真空下用加濕氮氣在35±5℃下乾燥，以提供呈泛白色固體之實施例13。實施例13的繞射圖係顯示於圖7C中。

實施例14係如下製備：將2-(1-((1r,4r)-4-(氰基甲基)環己基)-6-(苯磺醯基)-1,6-二氫咪唑并[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-N-(2-羥基-2-甲基丙基)乙醯胺(48.15kg，在Ex.2步驟B中製備)、EtOH(工業級，481L)、及KOH(6.613kg)在10至20℃下攪拌9小時。然後將反應以乙酸(6.74L)淬熄，維持溫度在10至20℃下。添加乙腈(240L)並將溶劑在減壓下蒸發至約240L的體積。將此乙腈的添加及蒸發再重複兩次。將所得混合物加熱至60至70℃持續5小時，之後將其冷卻至10至15℃並攪拌2h。然後將此混合物中之固體濾出並用乙腈(48L)洗滌兩次。然後將固體添加至水(240L)中，並將反應混合物加熱至45至50℃持續3至5小時，之後冷卻至15至20℃持續4小時。濾出剩餘的固體並將濾餅用水(96L，兩次)洗滌。將此濾餅於45℃下乾燥以提供實施例14(26.28kg)。實施例14的繞射圖係顯示於圖7D中。

本發明之額外實施例係如下述而獲得。

溶解度評估

將實施例1s(15mg)用遞增體積的溶劑處理直到材料完全溶解或直到最多添加100mL的溶劑為止。溶劑係以下列增量添加：5mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、70mL、及100mL。在每次添加溶劑之後，在溫和攪拌將系統保持在50℃下5min並目測評估固體的存在。持續此程序直到總共添加100mL的溶劑為止。如果沒有固體殘留，則不用添加額外的溶劑。在完成評估後，將溶液保持在50℃下1h，然後在攪拌下以0.1℃/min將溶液從50℃冷卻至5℃。如果固體存在，則將混合物在真空下使用96孔盤過濾並藉由XRPD分析。如果獲得澄清溶液，則將溶液置於RT下蒸發。根據此程序在5℃及50℃的溫度下使用下列溶劑，產生以下經註記的實施例，其中添加的總量係註記在緊接在溶劑之後的括弧中，其中在各溫度之後的括弧內給出溶解程度：水(100mL)，在5℃(懸浮液)及在50℃(懸浮液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲醇(10mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙醇(30mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；2-丙醇(30mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；1-丙醇(30mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；丙酮(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙酸乙酯(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(混濁)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙腈(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生實施例6，其繞射圖係顯示於圖3中；甲苯(100mL)，在5℃(部分溶解)及50℃(混濁)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙酸異丙酯(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(混濁)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲基三級丁基醚(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(懸浮液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；2-丁酮(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；THF(70mL)，在5℃(部分溶解)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；DMSO(5mL)，在5℃(溶液，樣本經冷凍並置於RT下蒸發)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；N-甲基吡咯啶酮(5mL)，在5℃(溶液，置於RT下蒸發)及50℃(溶液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；二乙基醚(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(懸浮液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲基異丁基酮(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(懸浮液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；DCM(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(懸浮液)下，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；庚烷(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(懸浮液)下，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖8中；1-4-二

烷(100mL)，在5℃(部分溶解，樣本經冷凍並置於RT下蒸發)及50℃(懸浮液)下，產生呈乾燥形式之實施例3c，其繞射圖係顯示於圖5中；硝基甲烷(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(懸浮液)下，產生低結晶性(poorly crystalline)的實施例(未顯示繞射圖)；1-甲氧基-2-丙醇(20mL)，在5℃(溶液)及50℃(溶液)下，產生呈乾燥形式之實施例20，其繞射圖係顯示於圖11中；2-甲基-THF(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(懸浮液)下，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖8中，且其TGA及DSC係分別顯示於圖10A及圖10B中；四氫萘(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(混濁)下，產生實施例4及實施例1b的混合物，其繞射圖係顯示於圖3中；3-甲基-1-丁醇(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生實施例17，其繞射圖係顯示於圖8中，且其TGA及DSC係分別顯示於圖12A及圖12B中；苯甲醚(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(混濁)下，產生實施例4及實施例1b的混合物，其繞射圖係顯示於圖3中；三級丁醇/水(1：1,10mL)，在5℃(溶液)及50℃(溶液)下，產生呈乾燥形式之實施例19，其調製DSC係顯示於圖9中；1,2-二甲氧基乙烷(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(混濁)下，產生實施例4及實施例1b的混合物，其繞射圖係顯示於圖3中；異丙苯(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(混濁)下，產生實施例4及實施例1b的混合物，其繞射圖係顯示於圖3中；二異丙基醚(100mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(懸浮液)下，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖8中；嗎啉(5mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生呈乾燥形式之實施例21，其繞射圖係顯示於圖11中；乙醇：水(95：5,10mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生低結晶性的實施例(未顯示繞射圖)；乙醇：水(9：1,5mL)，在5℃(溶液)及50℃(溶液)下，產生呈乾燥形式之實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；及乙腈：水(95：5,30mL)，在5℃(懸浮液)及50℃(溶液)下，產生低結晶性的實施例(未顯示繞射圖)。

在5℃下培養

在5℃下培養的數個實驗係藉由將實施例1s(30mg)用各溶劑處理來執行，並將混合物在5℃下漿化48h。取出等分試樣並立即藉由XRPD分析。將各等分試樣乾燥16h並藉由XRPD再次分析。然後將經風乾之樣本置於真空烘箱(RT)中24h，然後藉由XRPD進一步分析。根據此程序使用下列溶劑，產生以下經註記的實施例，其中添加的總溶劑量係註記在緊接在溶劑之後的括弧中，之後為溶解程度：水(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲醇(5mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙醇(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；2-丙醇(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；1-丙醇(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；丙酮(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙酸乙酯(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙腈(30mL，懸浮液)，產生低結晶性的實施例(未顯示繞射圖)；甲苯(30mL，懸浮液)，產生實施例15，其繞射圖係顯示於圖8中；乙酸異丙酯(30mL，懸浮液)，產生實施例17，其繞射圖係顯示於圖8中；甲基三級丁基醚(30mL，懸浮液)，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖8中；2-丁酮(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；THF(30mL，懸浮液)，產生實施例17，其繞射圖係顯示於圖8中；二乙基醚(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲基異丁基酮(30mL，懸浮液)，產生實施例17，其繞射圖係顯示於圖8中；DCM(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；庚烷(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；1,4-二

烷(30mL，懸浮液)，產生實施例3c，其自此實驗的繞射圖係顯示於圖5中；硝基甲烷(30mL，懸浮液)，產生低結晶性形式的實施例1s，未顯示其繞射圖；丙二醇(30mL，懸浮液)，產生低結晶性的實施例(未顯示繞射圖)；2-甲基-四氫呋喃(30mL，懸浮液)，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖8中；四氫萘(30mL，懸浮液)，產生低結晶性的實施例1s，未顯示其繞射圖；3-甲基-1-丁酮(30mL，懸浮液)，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖8中；苯甲醚(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其具有之繞射圖類似於(如圖5中所示之)實施例1s的繞射圖，惟其顯示出一些額外的峰；1,2-二甲氧基乙烷(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其具有之繞射圖類似於(如圖5中所示之)實施例1s的繞射圖，惟其顯示出一些額外的峰；異丙苯(30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其具有之繞射圖類似於(如圖5中所示之)實施例1s的繞射圖，惟其顯示出一些額外的峰；二異丙基醚(30mL，懸浮液)，產生實施例17，其繞射圖係顯示於圖8中；乙醇：水(95：5，30mL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙腈：水(95：5，30mL，懸浮液)，產生低結晶性的實施例(未顯示繞射圖)；及丙二醇(30mL，懸浮液)，產生低結晶性的實施例(未顯示繞射圖)。

熱/冷成熟

將實施例1s(30mg)在各溶劑中的懸浮液置於平台式振盪培養箱中並經受一系列的從環境溫度至大約50℃之熱-冷循環達24h。此係藉由每4小時將加熱開啟及關閉而達成。整個過程均維持振盪。從各樣本取得等分試樣並使其允許風乾2h。將經風乾之固體藉由XRPD分析，然後使用真空烘箱(RT,24h)真空乾燥並藉由XRPD再次分析。將此實驗中所獲得之各樣本真空乾燥並在真空乾燥之後，藉由XRPD分析在升溫培養下之各樣本。根據此程序使用下列溶劑，產生以下經註記的實施例，其中添加的總溶劑量係註記在緊接在溶劑之後的括弧中：水(20mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲醇(5mL)，產生實施例22，其繞射圖係顯示於圖13中；乙醇(5mL)，產生實施例 1s，其繞射圖係顯示於圖5中；2-丙醇(10mL)，產生實施例27，其針對此實驗的繞射圖係顯示於圖13中；1-丙醇(10mL)，產生實施例23，其繞射圖係顯示於圖13中；丙酮(20mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙酸乙酯(20mL)，產生低結晶性形式的實施例1s，未顯示其繞射圖；乙腈(20mL)，產生低結晶性的實施例24，其繞射圖係顯示於圖13中；甲苯(20mL)，產生低結晶性的實施例1s，未顯示其繞射圖；乙酸異丙酯(20mL)，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖13中；甲基三級丁基醚(20mL)，產生低結晶性的實施例1s，未顯示其繞射圖；2-丁酮(20mL)，產生實施例26，其繞射圖係顯示於圖13中；THF(20mL)，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖13中；二乙基醚(20mL)，產生低結晶性的實施例1s，未顯示其繞射圖；甲基異丁基酮(20mL)，產生實施例25，其繞射圖係顯示於圖13中；DCM(20mL)，產生低結晶性形式的實施例1s，未顯示其繞射圖；庚烷(20mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；1,4-二

烷(20mL)，產生實施例27，其針對此實驗的繞射圖係顯示於圖13中；硝基甲烷(20mL)，產生低結晶性的實施例1s，未顯示其繞射圖；丙二醇(5mL)，產生低結晶性的實施例(未顯示繞射圖)；2-甲基-四氫呋喃(20mL)，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖13中；四氫萘(20mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；3-甲基-丁醇(20mL)，產生實施例18，其繞射圖係顯示於圖13中；苯甲醚(20mL)，產生實施例16，其繞射圖係顯示於圖13中，且其TGA及DSC係分別顯示於圖23A及圖23B中；1,2-二甲氧基乙烷(20mL)，產生實施例29，其繞射圖係顯示於圖13中；異丙苯(20mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；二異丙基醚(20mL)，產生實施例17，其繞射圖係顯示於圖13中；乙醇：水(95：5,20mL)，產生實施例30，其繞射圖係顯示於圖13中；乙腈：水(95：5,20mL)，產生低結晶性形式的實施例1s，未顯示其繞射圖；及聚乙二醇(5mL)，產生實施例31，其繞射圖係顯示於圖13中。

在60℃下培養實施例1s

將實施例1s(30mg)用溶劑處理並在60℃下振盪24h。將等分試樣取出並使其風乾16h。然後將經風乾之固體藉由XRPD分析。根據此程序使用下列溶劑，產生以下經註記的實施例，其中添加的總溶劑量係註記在緊接在溶劑之後的括弧中：水(10mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙醇(10mL)，產生實施例32，其繞射圖係顯示於圖14中；2-丙醇(10mL)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；1-丙醇(10mL)，產生實施例23，其繞射圖係顯示於圖14中；丙酮(10mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙酸乙酯(10mL)，產生實施例34，其繞射圖係顯示於圖14中；乙腈(10mL)，產生實施例35，其繞射圖係顯示於圖14中；甲苯(10mL)，產生實施例36，其繞射圖係顯示於圖14中；乙酸異丙酯(10mL)，產生實施例25，其針對此實驗的繞射圖係顯示於圖14中；甲基三級丁基醚(10mL)，產生實施例35，其繞射圖係顯示於圖14中；2-丁酮(10mL)，產生實施例38，其繞射圖係顯示於圖14中；THF(10mL)，產生實施例33，其針對此實驗的繞射圖係顯示於圖14中；二乙基醚(10mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲基異丁基酮(10mL)，產生實施例25，其針對此實驗的繞射圖係顯示於圖14中；DCM(10mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；庚烷(10mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；1-4-二

烷(10mL)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；硝基甲烷(10mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；丙二醇(10mL)，產生實施例28，其針對此實驗的繞射圖係顯示於圖14中；2-甲基-四氫呋喃(10mL)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；四氫萘(10mL)，產生實施例1s及實施例19的混合物(未顯示混合物的繞射圖)，其中實施例1s的繞射圖係顯示於圖5中且實施例19的調製DSC曲線圖係顯示於圖9中；3-甲基-1-丁醇(10mL)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；苯甲醚(10mL)，產生實施例36，其繞射圖係顯示於圖14中；1,2-二甲氧基乙烷(10mL)，產生實施例34，其繞射圖係顯示於圖14中；異丙苯(10mL)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；二異丙基醚(10mL)，產生實施例17，其繞射圖係顯示於圖8中；乙醇：水(95：5,10mL)，產生實施例28，其繞射圖係顯示於圖14中；及聚乙二醇(5mL)，產生實施例39，其針對此實驗的繞射圖係顯示於圖14中。

高溫成熟

將複數個實施例19(25mg)樣本之各者用如以下所指示之一定量的溶劑處理，進而產生複數個樣本，各樣本均在60℃下攪動24h。將來自各樣本的固體單離、風乾16小時並藉由XRPD分析。根據此程序使用下列溶劑，產生以下經註記的實施例，其中添加的總溶劑量係註記在緊接在溶劑之後的括弧中，之後為溶解程度：水(125μL，懸浮液)產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲醇(125μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖類似於在圖5中所示之實施例1s的繞射圖，惟其顯示出一些額外的峰；乙醇(125μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；2-丙醇(75μL，懸浮液)，產生實施例37，其繞射圖係顯示於圖15中；1-丙醇(75μL，懸浮液)，產生實施例40，其繞射圖係顯示於圖15中；丙酮(75μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙酸乙酯(75μL，懸浮液)產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙腈(75μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲苯(75μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；乙酸異丙酯(75μL，懸浮液)，產生實施例37，其繞射圖係顯示於圖15中；甲基三級丁基醚(75μL，懸浮液)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；2-丁酮(75μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；THF(75μL，懸浮液)，產生實施例37，其繞射圖係顯示於圖15中；二乙基醚(150μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲基異丁基酮(150μL，懸浮液)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；DCM(75μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；庚烷(150μL，懸浮液)，產生實施例41，其繞射圖係顯示於圖15中；1,4-二

烷(75μL，懸浮液)，產生實施例3c，其繞射圖係顯示於圖5中；硝基甲烷(75μL，懸浮液)，產生實施例42，其繞射圖係顯示於圖15中；丙二醇(75μL，懸浮液)，產生實施例43，其繞射圖係顯示於圖15中；2-甲基-四氫呋喃(150μL，懸浮液)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；四氫萘(150μL，懸浮液)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；3-甲基-1-丁酮(75μL，懸浮液)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；苯甲醚(150μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；1,2-二甲氧基乙烷(75μL，懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；異丙苯(150μL，懸浮液)，產生實施例44，其繞射圖係顯示於圖15中；二異丙基醚(150μL，懸浮液)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；乙醇：水(95：5，75μL，懸浮液)，產生實施例45，其繞射圖係顯示於圖15中；乙腈：水(95：5，75μL，懸浮液)，產生實施例1s，當與圖5中所示的繞射圖相比時，其繞射圖顯示晶胞擴大(cell expansion)；及聚乙二醇(75μL，懸浮液)，產生實施例46，其繞射圖係顯示於圖15中。

熱循環

將複數個實施例19(25mg)樣本之各者用如以下所指示之一定量的溶劑處理，進而產生複數個樣本，各樣本均藉由熱循環(40℃至60℃，4h循環)成熟24h。將固體單離、風乾16小時並藉由XRPD分析。根據此程序使用下列溶劑，產生以下經註記的實施例，其中添加的總溶劑量係註記在緊接在溶劑之後的括弧中，之後為在24小時所觀察到的外觀：水(125μL，淡綠色固體)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；甲醇(75μL，透明固體)，產生實施例11，當與圖7中之繞射圖相比時，其繞射圖顯示在高角度偏移的峰；乙醇(100μL，淡綠色固體)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；2-丙醇(75μL，淡黃色固體)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；1-丙醇(75μL，白色懸浮液)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；丙酮(75μL，淡綠色固體)，產生實施例47，其繞射圖係顯示於圖16中；乙酸乙酯(75μL，白色懸浮液)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；乙腈(75μL，白色懸浮液)，產生低結晶性的實施例6，其繞射圖係顯示於圖3中；甲苯(75μL，透明固體)，產生實施例36，其繞射圖係顯示於圖14中；乙酸異丙酯(75μL，白色固體)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；甲基三級丁基醚(75μL，白色懸浮液)，產生實施例6，其繞射圖係顯示於圖3中；2-丁酮(75μL，泛白色固體)，產生實施例33，其繞射圖係顯示於圖14中；THF(75μL，泛白色固體)，產生實施例48，其繞射圖係顯示於圖16中；二乙基醚(150μL，泛白色固體)，產生實施例49，其繞射圖係顯示於圖16中；甲基異丁基酮(150μL，泛白色固體)，產生實施例25，其繞射圖非常類似於圖13中所示之實施例25的繞射圖。DCM(125μL，白色懸浮液)，產生實施例1s，其繞射圖係顯示於圖5中；庚烷(150μL，白色固體)，產生實施例19，其改良DSC曲線圖係顯示於圖9中；1,4-二

烷(75μL，白色固體)，產生實施例3c，其繞射圖係顯示於圖5中；硝基甲烷(75μL，白色懸浮液)，產生實施例50，其繞射圖係顯示於圖16中；丙二醇(75μL，奶油色懸浮液)，產生實施例10，其繞射圖非常類似於(如圖16中所示之)實施例10的繞射圖，惟其顯示出非晶暈環(amorphous halo)；2-甲基-四氫呋喃(150μL，白色固體)，產生實施例48，其繞射圖係顯示於圖16中；四氫萘(150μL，白色固體)，產生低結晶性的實施例，未顯示其繞射圖；3-甲基-1-丁酮(75μL，白色懸浮液)，產生實施例25，其繞射圖係顯示於圖13中；苯甲醚(150μL，白色懸浮液)，產生實施例51，其繞射圖係顯示於圖16中；1,2-二甲氧基乙烷(75μL，白懸浮液)，產生實施例52，其繞射圖係顯示於圖16中；異丙苯(150μL，白色固體)，產生低結晶性的實施例，未顯示其繞射圖；二異丙基醚(150μL，白色固體)，產生實施例6，其繞射圖係顯示於圖3中；乙醇：水(95：5，75μL，透明固體)，產生實施例11，其繞射圖係顯示於圖7中；乙腈：水(95：5，75μL，透明固體)，產生實施例53，其繞射圖係顯示於圖16中；及丙二醇(75μL，淡粉色懸浮液)，產生實施例31，其繞射圖非常類似於(如圖13中所示之)實施例31的繞射圖，惟其顯示出非晶暈環。

化合物Ex.1的實施例11、11b、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、及53中之任一者及其任何組合係根據本發明之化合物的實施例。根據本發明之化合物的又其他實施例包括作為非吸濕溶劑合物之化合物Ex.1，諸如化合物Ex.1的實施例11。根據本發明之化合物的又其他實施例包括呈非晶形式之化合物Ex.1，諸如化合物Ex.1的實施例19。化合物Ex.1的實施例11、16、17、及18中之任一者及其任何組合係根據本發明之化合物的實施例。本發明之進一步實施例包括呈醫藥上可接受之共晶體形式的根據本發明之化合物。本發明之額外實施例包括呈醫藥上可接受之鹽形式的根據本發明之化合物。

實例1至12係JAK抑制劑，並在酶及細胞檢定中測試。酶檢定的結果呈現在標題為酶抑制檢定結果的表4中。亦在三個細胞檢定中測試實例1至12：IL-2 pSTAT5(JAK1/JAK3)、IFNα pSTAT4(JAK1/TYK2)、及GM-CSF pSTAT5(JAK2/JAK2)，結果呈現在標題為基於細胞之檢定數據的表5中。下面為如何執行酶檢定的描述，包括在檢定中所使用的材料(在材料的標題名稱下)、如何建立檢定(在檢定規程的標題名稱下)、及分析數據所使用的方法(在高通量質譜(High-throughput Mass Spectrometry,HTMS)方法的標題名稱下)。

酶抑制檢定

材料

受質(NH2-KGGEEEEYFELVKK-CO2)、內部標準肽(NH2-SWGAIETDKEYYTVKD-CO2)、及產品肽(僅用於標準曲線)(NH2-KGGEEEEY-Pi-FELVKK-CO2)係購自AnaSpec(Fremont,CA,USA)。JAK1-JH1JH2(574-1154，具有His-GST標籤及C端tev(ENLYFQ-G)切割位點)、JAK3-JH1JH2(512-1124，具有GST標籤及C端tev(ENLYFQ-G)切割位點)、及Tyk2-JH1JH2(8H_tev_580-1182-C936A-C1142A，具有C端tev(ENLYFQ-G) 切割位點)經內部純化。JAK2-JH1JH2(532-1132，具有GST標籤及C端tev(ENLYFQ-G)切割位點)係購自Invitrogen。LC/MS等級水及乙腈(ACN)係購自HoneyWell,Burdick & Jackson(Muskegon,MI,USA)。二甲基亞颯(99.8%,DMSO)及三氟乙酸(99.5%,TFA)係購自EMD Chemical(Gibbstown,NJ,USA)。三磷酸腺苷(ATP)、4-嗎啉丙磺酸(MOPS)、氯化鎂(MgCl₂)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、甲酸(>95%,FA)、及Tween-20係購自Sigma(St Louis,MO,USA)。384孔聚丙烯盤(Cat#781280)係購自Greiner(Monroe,NC)，RapidFireTM匣A C4管柱係購自Agilent Technologies,Santa Clara,CA。

HTMS實驗係在RapidFire 300儀器(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上以正游離模式執行，串聯具有電灑游離源之ABSiex QTrap 4000系統(RF-MS)(Concord,ON,Canada)。RapidFire系統係用3個Agilent Technologies(Santa Clara,CA)的Agilent 1200系列等度泵(isocratic pump)及一個蠕動泵(型號ISM832C，來自Ismatec(Wertheim,Germany))來運行。整個系統係使用RapidFire軟體介接質譜儀Analyst軟體來操作。

檢定規程

藉由於DMSO中以1：3或1：4連續稀釋製作各化合物之11點的給藥系列，其中點12為DMSO對照組。使用Labcyte Echo(Sunnyvale,CA)、或Biosero ATS(San Diego,CA)，將樣本自系列稀釋盤轉移至384孔檢定盤(#781280,Greiner,Monroe,NC)。化合物係以二重複測試。第12行係用於陽性對照，且第24行含有未添加酶的陰性對照。將自吾等內部收集之對JAK異構體具有抑制活性的化合物用作為參考化合物。在20μL的反應物中，DMSO之最終濃度

0.25%。蛋白質之各者的檢定條件總結在表3中。酶反應係藉由將10μL的酶與ATP混合物添加至於反應緩衝液(50mM MOPS pH 7.5、10mM MgCl₂、1mM EDTA、2mM DTT、0.002% Tween-20)中製備之10μL的受質溶液中來啟動。將Tyk2酶在反應啟動前，用2mM ATP預培養30min。在酶添加至反應混合物之後，立即將盤以1000rpm離心1分鐘，並在25℃下，JAK3為培養45分鐘，且JAK1、JAK2、及Tyk2為培養90分鐘。藉由使用Multidrop Combi試劑分配器(Thermo Scientific,Waltham,MA)添加20μL的0.5% TFA(含有0.15μM的內部標準肽)，以淬熄反應物。第24行中的數個孔一般係用於產品標準曲線。在淬熄之後，將檢定盤以3000rpm離心3分鐘，並使用PlateLoc(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)以可穿刺鋁箔(Cat# 06644-001,Agilent)密封。然後將盤轉移至RapidFire上以用於MS分析。化合物抑制係藉由與不受抑制的酶反應相比，在樣本孔中磷酸化產物水平的減少來評估。以上檢定的檢定條件係顯示於表3，且這些檢定中所測試的Ex.1至12之結果係顯示於表4。

高通量質譜(HTMS)法

RapidFire上的樣本分析係使用由水/TFA/FA(100：0.01：0.1,v/v/v)所組成之移動相A1、由ACN/水/TFA/FA(80：20：0.01：0.1,v/v/v)所組成之移動相B1來執行。下列為使用的運行參數：狀態1(吸取)，250ms；狀態2(填充/洗滌)，3000ms；狀態3(洗提)，4000ms；狀態4(再平衡)，1000ms，流速為1.25mL/min。將樣本直接自384孔檢定盤吸取，並遞送到RF-MS微型固相C4萃取匣(A型)。將非所欲組分諸如鹽類、輔助因子、清潔劑、及大蛋白質洗出，並且將保留的分析物(受質、產物、及IS)直接在ABSiex Qtrap 4000系統上共洗提。肽(受質)、磷酸化肽(產物)、及內部標準肽(IS)之定量係藉由MRM分別使用562→136.0、589.2→215.7、及953.2→158.8(或974.2→158.8)的轉移來執行。

細胞檢定

IL-2 pSTAT5(JAK1/JAK3)細胞檢定

AlphaLISA檢定(基於PerkinElmer的Alpha Technology)首先藉由將新鮮解凍的PBMC(Biological Specialty Corporation)於HBSS(Hank氏平衡鹽溶液，含有0.1%無IgG(免疫球蛋白G)、無蛋白酶的BSA(牛血清白蛋白)(Jackson ImmunoResearch Cat.No.001-000-161))中，以每孔每4μL 30,000個細胞接種在384孔盤中來執行。然後將細胞用2μL/孔的以半對數滴定濃度稀釋於DMSO中的化合物(具有最高的測試濃度為10μM且最終DMSO濃度為0.5%)在37℃下處理三十分鐘。接下來，將細胞以2μL/孔、5ng/mL的IL- 2(R&D Systems Cat.No.202-IL-050)在37℃下刺激三十分鐘。藉由添加2μL/孔的裂解緩衝液(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST5-A10K)，之後在室溫下培養五分鐘來終止細胞反應。將5μL/孔的Acceptor mix(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST5-A10K)添加至細胞中，並在室溫下於黑暗中培養一小時。然後，將5μL/孔的Donor mix(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST5-A10K)添加至細胞中，並在室溫下於黑暗中培養整夜。最後，在PerkinElmer EnVision上讀取盤，以偵測時間解析螢光訊號。在化合物測試濃度下判定IL-2依賴性pSTAT5抑制的百分比；且針對各化合物，產生劑量曲線並計算IC₅₀。化合物IC₅₀係藉由化合物濃度對Alpha訊號之半對數稀釋滴定曲線的非線性迴歸、S形劑量反應分析計算。頭字語「Alpha」代表放大發光親和均相檢定(amplified luminescent proximity homogeneous assay)；Alpha訊號係發光/螢光訊號。

IFNα pSTAT4(JAK1/TYK2)細胞檢定

AlphaLISA檢定(基於PerkinElmer的Alpha Technology)首先藉由將新鮮解凍的PBMC(Biological Specialty Corporation)於DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養基，含有10% FBS(胎牛血清)及1,000I.U./mL青黴素及1,000μg/mL鏈黴素)中，以每孔每6μL 100,000個細胞接種在384孔盤中來執行。然後將細胞用2μL/孔的以半對數滴定濃度稀釋於DMSO中的化合物(具有最高的測試濃度為10μM且最終DMSO濃度為0.5%)在37℃下處理三十分鐘。接下來，將細胞以2μL/孔、4ng/mL的IFNα(PBL Assay Science Cat.No.11101-2)在37℃下刺激三十鐘。藉由添加2μL/孔的裂解緩衝液(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST4-A10K)，之後在室溫下培養五分鐘來終止細胞反應。將4μL/孔的Acceptor mix(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST4-A10K)添加至細胞中，並在室溫下於黑暗中培養一小時。然後，將4μL/孔的Donor mix(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST4-A10K)添加至細胞中，並在室溫下於黑暗中培養整夜。最後，在PerkinElmer EnVision上讀取盤，以偵測時間解析螢光訊號。在化合物測試濃度下判定IFNα依賴性pSTAT4抑制的百分比；且針對各化合物，產生劑量曲線並計算IC₅₀。化合物IC₅₀係藉由化合物濃度對Alpha訊號之半對數稀釋滴定曲線的非線性迴歸、S形劑量反應分析計算。用語「Alpha」係在緊接在前之細胞檢定描述中定義。

GM-CSF pSTAT5(JAK2/JAK2)細胞檢定

AlphaLISA檢定(基於PerkinElmer的Alpha Technology)首先藉由將新鮮解凍的PBMC(Biological Specialty Corporation)於HBSS(含有0.1%無IgG、無蛋白酶的BSA(Jackson ImmunoResearch Cat.No.001-000-161))中，以每孔每4μL 30,000個細胞接種在384孔盤中來執行。然後將細胞用2μL/孔的以半對數滴定濃度稀釋於DMSO中的化合物(具有最高的測試濃度為10μM且最終DMSO濃度為0.5%)在37℃下處理三十分鐘。接下來，將細胞以2μL/孔、11pg/mL的GM-CSF(R&D Systems Cat.No.215-GM-050)在37℃下刺激十五分鐘。藉由添加2μL/孔的裂解緩衝液(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST5-A10K)，之後在室溫下培養五分鐘來終止細胞反應。將5μL/孔的Acceptor mix(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST5-A10K)添加至細胞中，並在室溫下於黑暗中培養一小時。然後，將5μL/孔的Donor mix(PerkinElmer Cat.No.ALSU-PST5-A10K)添加至細胞中，並在室溫下於黑暗中培養整夜。最後，在PerkinElmer EnVision上讀取盤，以偵測時間解析螢光訊號。在化合物測試濃度下判定GM-CSF依賴性pSTAT5抑制的百分比；且針對各化合物，產生劑量曲線並計算IC₅₀。化合物IC₅₀係藉由化合物濃度對Alpha訊號之半對數稀釋滴定曲線的非線性迴歸、S形劑量反應分析計算。用語「Alpha」係在IL-2 pSTAT5(JAK1/JAK3)細胞檢定描述中定義。

在溶解度檢定及滲透性檢定中測試實例1至12。溶解度檢定的結果呈現在標題為溶解度檢定數據之表6中，滲透性檢定的結果呈現在標題為MDCK-MDR1滲透性數據之表7中。這些溶解度檢定及滲透性檢定係分別描述於下面標題名稱為溶解度檢定及滲透度檢定之下。

溶解度檢定

溶解度測量係在下列溶解度介質中進行：模擬胃液(34.2mM氯化鈉及100mM鹽酸)或模擬腸液(空腹狀態[pH 6.5]：3mM牛磺膽酸鈉、0.75mM卵磷脂、28.4mM磷酸二氫鈉、8.7mM氫氧化納、及105.9mM氯化鈉)。將測試化合物以10mM的濃度溶解在DMSO中。將測試化合物分配(20μL)至Nunc 1-mL 96深孔PP盤中，並經由從TurboVap 96吹出的氮氣使DMSO蒸發6小時或直至產生乾燥的殘餘物為止。然後將400μL的溶解度介質添加至含有乾燥固體的孔中。將預切口(pre-slit)孔蓋牢固地置放在孔盤組上，並將樣本在環境溫度下劇烈攪拌2至5天。在培養期之後，使樣本過濾通過AcroPrep 1-mL-96過濾器盤至新的2-mL-96深孔PP盤中，並將上清液藉由使用3點校正(範圍自0.004至0.55mM)之UV-HPLC定量。各化合物之溶解度係由下列方程式計算：

溶解度值係在4至400μM之範圍內。在此範圍外的值係記述為<4μM或>400μM。只要研究中的化合物足夠穩定以完成相應的溶解度判定，就記述溶解度。

滲透性檢定

滲透性測量係根據Cyprotex規程使用獲自NIH(Rockville,MD,USA)的MDCK-MDR1細胞系進行。將繼代數目介於6至30之間的細胞以3.4× 10⁵個細胞/cm²之細胞密度接種至Multiscreen plate^TM(Millipore)上，並在進行滲透度研究之前培養三天。在此檢定中細胞形成內聚薄片狀的單一細胞層，填滿培養皿之表面積，亦稱為鋪滿的單層(confluent monolayer)，並在第四天將測試化合物添加至膜的頂端側，並在60min時間段內監測化合物穿過單層的運輸。

以簡單及基本的方式介紹在這些檢定中常使用的用語「A」及「B」，實體之頂端(「A」)側或區室係此類實體暴露於腔室或外部環境之該側，而實體之底側(「B」)之側或區室係此類實體暴露於一般內部環境之該側或區室，涵蓋對面側。舉例而言，當此類實體為例示性腸上皮細胞時，此腸細胞的頂端側為細胞暴露於腸腔之該側，而底側之側為暴露於血液之該側。

將測試化合物以10mM的濃度溶解在DMSO中。給藥溶液係藉由用檢定緩衝液(Hank氏平衡鹽溶液)稀釋測試化合物製備，pH為7.4，最終濃度為5μM。為評估頂端至底側(「A-B」)滲透性，將緩衝液自頂端區室移除，並以具有或不具有滲透性醣蛋白(「PgP」、「P-gP」、「Pgp」、或「P-gp」)抑制劑依克立達(2μM)的測試化合物給藥溶液置換。為評估底側至頂端(「B-A」)滲透性，將緩衝液自成對盤移除，並以測試化合物給藥溶液置換。在37℃、5% CO₂之氣氛、相對濕度為95%下以二重複進行的培養。各檢定包括參考標誌普潘奈(propranolol)(高滲透性)及普拉辛(prazosin)(PgP受質)。在培養60分鐘之後，將頂端及底側樣本稀釋，並藉由LC/MS/MS，用樣本之適當稀釋液(接受體稀釋倍率=1；供體及C₀稀釋倍率=10)在0.0039至3μM之範圍內使用8點校正來定量測試化合物。各化合物之滲透係數(P_app)係從下列方程式計算：P_app=(dQ/dt)/(C₀×S)，其中dQ/dt係藥物穿過細胞的滲透速率，C₀係時間為零時的供體區室濃度，且S係細胞單層的面積。

針對所有培養條件測量回收百分比。這些測量沒有顯露出不可接受的化合物/盤結合或在細胞單層中的化合物累積。

表7中第二欄及第三欄顯示不具有(第二欄)及具有P-gp抑制劑(依克立達)(第三欄，標記為P^e _app(A-B))之頂端至底側化合物運輸的P_app(A-B)值。P_app(A-B)給出在此檢定中穿過細胞之滲透程度的指示，其經設想以模擬穿過Pgp表現性細胞(諸如Pgp表現性胃腸道細胞)的跨細胞運輸。在第3欄給出的P^e _app(A-B)值(在P-gp抑制劑存在下之P_app(A-B))經判定，以確認P-gp在化合物外排中的角色。表7中第四欄顯示底側至頂端化合物運輸之P_app(B-A)值。測試化合物外排率係藉由使用從表7第四欄及第二欄中對應的滲透係數，以P_app(B-A)/P_app(A-B)給在同表之第五欄。化合物(A)至(C)的外排率一致地大於2且化合物Ex.1至12亦是如此(第五欄，表7)，指示化合物外排發生在所有此類化合物上。

參考化合物(A)至(C)在第2欄中的P_app(A-B)值大致上為低且相當的，且化合物Ex.1至12亦是如此。這些低值指示所有此類化合物的低滲透性，這是由於P-gp效應，因為所有此類化合物皆為P-gp受質，如由第5欄所給出之值均大於2所指示。為被表徵為具有低滲透性，在第三欄及第四欄分別給出的P^e _app(A-B)及P_app(B-A)值應該是低的。然而，這些數據顯示化合物(A)至(C)的P_app(B-A)值大於化合物Ex.1至12之對應值。

各單層的完整性係藉由螢光分析檢測螢光黃之滲透來監測。此檢測顯露出在此檢定中細胞維持著另人滿意之鋪滿的單層。

體內研究

口服給藥-規程1

向三隻未禁食的雌性C57BL/6小鼠口服投予劑量為25mg/kg p.o的測試化合物(劑量體積為5mL/kg，為於20%羥基丙基-β-環糊精(HPβCD)中之溶液)。血液樣本係在給藥後0.5、2、及4小時經由眼後採血法或背側蹠靜脈之靜脈穿刺法收集。將血液樣本收集至含有抗凝血劑(肝素-Na)的管中並放置在濕冰上。將血漿部分藉由離心分離，並在-20℃下冷凍至多4h，並於4h後冷凍在-80℃下(除非在樣本收集之後馬上分析)。結腸樣本係在給藥後4h收集。從盲腸之開頭，切下4至6cm的結腸樣本，在縱軸上切開，並用2mL鹽水沖洗以移除固體內容物。結腸係藉由將其置於5mL鹽水中並振盪5秒以進一步洗滌。然後將結腸樣本拍乾、秤重，並以1份組織(g)對4份HPLC等級水(mL)加以均質化。化合物在血漿及結腸均質物中的濃度係使用合格的液相層析三段式四極質譜(LC-MS/MS)法判定。本規程係用於評估下列測試化合物：化合物(B)和(C)及實例6和11。

口服給藥規程2

向三隻未禁食的雌性C57BL/6小鼠口服投予劑量為25mg/kg p.o的測試化合物(劑量體積為5mL/kg，為於20% HPβCD中之溶液)。血液樣本係在給藥後0.5、2、及4小時經由眼後採血法或背側蹠靜脈收集。將血液樣本收集至含有抗凝血劑(肝素-Na)的管中並放置在濕冰上。將血漿部分藉由離心分離，並在-20℃下冷凍至多4h，並於4h後冷凍在-80℃下(除非在樣本收集之後馬上分析)。結腸樣本係在給藥後4h收集。從盲腸下方2cm，切下4cm的結腸樣本，在縱軸上切開，並用2mL鹽水沖洗以移除固體內容物。結腸係藉由將其置於5mL鹽水中並振盪5秒以進一步洗滌。然後將結腸樣本拍乾、秤重，並以1份組織(g)對4份HPLC等級水(mL)加以均質化。化合物在血漿及結腸均質物中的濃度係使用合格的液相層析三段式四極質譜(LC-MS/MS)法判定。本規程係用於評估下列測試化合物：化合物(A)及實例1至5、7至10、和12。

IC給藥-規程3

結腸內(IC)給藥組：在藉由吸入異氟烷麻醉後，向三隻未禁食的雌性C57BL/6小鼠透過在腹壁上的小切口使用注射器及注射針以5mg/kg的劑量結腸內投予化合物(劑量體積為1mL/kg，為於20% HPβCD中之溶液)。血液樣本係在給藥後0.5、2、及4小時經由眼後採血法收集。將血液樣本收集至含有抗凝血劑(肝素-Na)的管中並放置在濕冰上。將血漿部分藉由離心分離，並在-20℃下冷凍至多4h，並於4h後冷凍在-80℃下(除非在樣本收集之後馬上分析)。結腸樣本係在給藥後4h收集。從盲腸下方2cm，切下4-cm的結腸樣本，在縱軸上切開，並用2mL鹽水沖洗以移除固體內容物。結腸係藉由將其置於5mL鹽水中並振盪5秒以進一步洗滌。然後將結腸樣本拍乾、秤重，並以1份組織(g)對4份HPLC等級水(mL)加以均質化。化合物在血漿及結腸均質物中的濃度係使用合格的液相層析三段式四極質譜(LC-MS/MS)法判定。本規程係用於評估下列測試化合物之IC給藥：實例1、3、和4。

化合物Ex.1至12係藉由表8所給出之物理化學性質進一步表徵。cLogP及tPSA值係藉由使用ChemBioDraw Ultra 14.0計算，其中P係正辛醇- 水分配係數。總極性表面積(tPSA)係計算為所有極性原子的表面和，主要為氧及氮，亦包括彼等所附接之氫。

Claims

一種化合物，其具有式
其中該化合物係呈形式1s、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、11b、12、15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、及53中之至少一者。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式11、11b、15、16、17、及18中之至少一者。
如請求項2所述之化合物，其中該化合物係呈形式11。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式11及11b中之至少一者。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s、6、10、5、8、及11中之至少一者。
如請求項5所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s、6、10、及11中之至少一者。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式19。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s及16中之至少一者。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s及11b中之至少一者。
如請求項5所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s及11中之至少一者。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s及17中之至少一者。
如請求項9所述之化合物，其中該化合物係呈形式11b。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式12。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式16。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式20。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s及12中之至少一者。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s及15中之至少一者。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s、15、及19中之至少一者。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式1s及18中之至少一者。
如請求項17所述之化合物，其中該化合物係呈形式15。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式17。
如請求項19所述之化合物，其中該化合物係呈形式18。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式21。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式22。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式23。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式24。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式25。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式26。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式27。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式28。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式29。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式30。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式31。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式32。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式33。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式34。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式35。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式36。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式37。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式38。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式39。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式40。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式41。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式42。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式43。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式44。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式45。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式46。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式47。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式48。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式49。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式50。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式51。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式52。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物係呈形式53。