TW201908478A - 調節米勒神經膠質細胞之方法 - Google Patents

調節米勒神經膠質細胞之方法

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Abstract

揭示用於治療眼科疾病、特別是視網膜變性之方法及組成物，其包括使用產後衍生細胞調節米勒神經膠質細胞、恢復視網膜突觸連接、及形成含α2δ1之突觸。

Description

調節米勒神經膠質細胞之方法 【相關申請案之交互參照】
本申請案主張2017年6月2日申請之美國臨時專利申請案第62/514,329號的優先權，其全部內容以引用方式併入本文中。
本發明係關於用於眼科疾病及病症的基於細胞或再生性療法的領域。詳言之，本發明提供使用前驅細胞(諸如臍帶組織衍生細胞及胎盤組織衍生細胞)及由該些細胞製備之條件培養基來再生或修復眼細胞及組織之方法及組成物。
視網膜變性如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是60歲以上個體失明的主要原因。目前，對於大多數這些患者沒有有效的治療方法。皇家外科學院(Royal College of Surgeons,RCSRCS)大鼠係廣泛用作為用於遺傳性視網膜變性的動物模型(Lund等人，Stem Cells,2007；25；602-611；亦於Eisenfeld等人，J Comp Neurol,1984；223：22-34；LaVail，Prog Brain Res,2001；131：617-627；Vollrath等人，PNAS USA,2001；98：12584-12589；Cuenca等人，Eur J Neurosci,2005；22：1057-1072；Wang等人，Invest Ophthalmol Vis Sci,2008；49：416-421)。RCS大鼠在MER受體酪胺酸激酶(MERTK)基因中含有缺失突變。MERTK缺失影響視網膜色素上皮(RPE)細胞對光受體外節碎片的吞噬作用。已經描述了變性過程期間在RCS大鼠中的突觸異常，並且先前已經報導了使用如野 生型MERTK的RPE移植或病毒媒介遞送的治療方法恢復突觸連接(Vollrath等人，PNAS USA,2001；98：12584-12589；Cuenca等人，Eur J Neurosci,2005；22：1057-1072；Peng,T.等人，Neuroscience,2003；119：813-820；Pinilla,N.等人，Exp Eye Res 2007；85：381-392)。儘管這兩種方法都能夠促進顯著的視力恢復，但是仍然存在進行性光受體變性(Vollrath等人，PNAS USA,2001；98：12584-12589；Pinilla,N.等人，Exp Eye Res 2007；85：381-392)。
本發明提供適用於眼科疾病及病症的基於細胞或再生性療法的組成物及方法。詳言之，本發明之特徵在於用於治療眼科疾病或病狀之方法及組成物，包括使用諸如產後衍生細胞(PPDC)之前驅細胞來再生或修復眼組織。產後衍生細胞可為臍帶組織衍生細胞(UTC)或胎盤組織衍生細胞(PDC)。
本發明的一個態樣是一種在視網膜變性中調節米勒神經膠質細胞(Müller glia)的方法，其包含將產後衍生細胞群投予至患有視網膜變性的對象之眼睛。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞(hUTC)係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在本發明的實施例中，該細胞群分泌至少一種突觸新生因子。在實施例中，該突觸新生因子是血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-2(TSP2)。
本發明的另一態樣是一種增強或恢復視網膜突觸連接的方法，其包含將產後衍生細胞群投予至患有視網膜變性的對象之眼睛。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在本發明的實施例中，該細胞群分泌至少一種突觸新生因子。在實施例中，該突觸新生因子是血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-2(TSP2)。
進一步的實施例是一種在視網膜變性中保留或恢復含α2δ1之突觸的方法，其包含將產後衍生細胞群投予至患有視網膜變性的對象之眼睛。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上 不含血液之人類臍帶組織。在本發明的實施例中，該細胞群分泌至少一種突觸新生因子。在實施例中，該突觸新生因子是TSP1或TSP2。
另一實施例是一種預防或減弱米勒神經膠質細胞之反應性神經膠變性的方法，其包含將產後衍生細胞群投予至患有視網膜變性的對象之眼睛。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。
一些實施例關於一種用於在視網膜變性中調節米勒神經膠質細胞的組成物，其包含產後衍生細胞群。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在一些實施例中，該組成物係包含醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
另一實施例包括一種用於增強或恢復視網膜突觸連接的組成物，其包含產後衍生細胞群。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在本發明的實施例中，該細胞群分泌至少一種突觸新生因子。在實施例中，該突觸新生因子是TSP1或TSP2。在一些實施例中，該組成物係包含醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
進一步的實施例是一種用於在視網膜變性中保留或恢復含α2δ1之突觸的組成物，其包含產後衍生細胞群。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在實施例中，該細胞群分泌至少一種突觸新生因子。在實施例中，該突觸新生因子是TSP1或TSP2。在一些實施例中，該組成物係包含醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
又另一實施例是一種用於預防或減弱米勒神經膠質細胞之反應性神經膠變性的組成物，其包含產後衍生細胞群。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在實施例中，該細胞群分泌至少一種突觸新生因子。在實施例中，該突觸新生因子是TSP1或TSP2。在一些實施例中，該組成物係包含醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
其他實施例係關於用於治療視網膜變性的產後衍生細胞群。一實施例是一種用於在視網膜變性中調節米勒神經膠質細胞的產後衍生細胞群。另一實施例是一種用於增強或恢復視網膜突觸連接的產後衍生細胞群。進一步的實施例是一種用於保留或恢復含α2δ1之突觸的產後衍生細胞群。另一實施例包括一種用於預防或減弱米勒神經膠質細胞之反應性神經膠變性的產後衍生細胞群。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。
在本文所述的實施例中，使用從產後臍帶組織分離之細胞的方法及組成物亦可使用從該等細胞產生的條件培養基。在本文之實施例中，臍帶組織衍生細胞或從該等細胞產生的條件培養基減弱或調節米勒神經膠質細胞活性，且/或保留米勒神經膠質細胞的形態及功能。在實施例中，該等米勒神經膠質細胞分泌至少一種血小板反應蛋白突觸新生因子，例如血小板反應蛋白-1及血小板反應蛋白-2。在實施例中，由米勒神經膠質細胞(米勒細胞)產生的血小板反應蛋白突觸新生因子介導α2δ1(阿伐2德他1)受體表現。
在本文所述的實施例中，臍帶組織衍生細胞群分泌至少一種突觸新生因子，例如血小板反應蛋白-1或血小板反應蛋白-2。在實施例中，由該細胞群產生的條件培養基含有至少一種突觸新生因子，例如由該等細胞分泌的血小板反應蛋白-1或血小板反應蛋白-2。在本文所述的實施例中，臍帶組織衍生細胞或從該等細胞產生的條件培養基係至少在突觸發育期間遞送，且係至少在光受體損失或死亡之前遞送。
在本文所述的本發明之實施例中，產後衍生細胞係衍生自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在實施例中，該細胞能夠在培養物中擴增且具有分化成神經表型之細胞的潛能。該細胞進一步包含下列特徵中之一或多者：(a)在培養物中進行至少約40次倍增的潛能；(b)在經塗布或未經塗布的組織培養容器上附著並擴增，其中經塗布之組織培養容器包含明膠、層黏蛋白、膠原蛋白、聚鳥胺酸、玻璃連接蛋白、或纖連蛋白素之塗層；(c)生產組織因子、波形蛋 白(vimentin)、或α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin)中之至少一者；(d)生產CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2及HLA-A、HLA-B、HLA-C中之至少一者；(e)不生產CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ中之至少一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測；(f)針對編碼下列之至少一種基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；趨化激素(C--X--C模體)配體1(黑色素瘤生長刺激活性物，α)；趨化激素(C--X--C模體)配體6(顆粒性細胞趨化蛋白質2)；趨化激素(C--X--C模體)配體3；腫瘤壞死因子，α-誘發蛋白質3；C型凝集素超家族成員2；威爾姆斯(Wilms)腫瘤1；醛去氫酶1家族成員A2；腎素(renin)；氧化低密度脂蛋白受體1；智人(Homo sapiens)殖株IMAGE：4179671；蛋白質激酶C ζ；假想蛋白質DKFZp564F013；卵巢癌向下調控因子1；及殖株DKFZp547k1113之智人基因；(g)針對編碼下列之至少一種基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經減少：矮小同源盒(short stature homeobox)2；熱休克27kDa蛋白質2；趨化激素(C--X--C模體)配體12(基質細胞衍生因子1)；彈性蛋白(瓣上主動脈狹窄，威廉-波倫(Williams-Beuren)症候群)；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp586M2022(來自殖株DKFZp586M2022)；間葉同源盒2(生長停滯特異性同源盒(growth arrest-specific homeo box))；sine oculis同源盒同源物1(果蠅(Drosophila))；αB水晶體蛋白；形態發生紊亂關聯活化物2(disheveled associated activator of morphogenesis 2)；DKFZP586B2420蛋白質；類似於neuralin 1者；結合四素(tetranectin，纖維蛋白溶酶原(plasminogen)結合蛋白質)；src同源體3(SH3)與多半胱胺酸區(cysteine rich domain)；膽固醇25-羥化酶；矮小相關轉錄因子3(runt-related transcription factor 3)；介白素11受體，α；原膠原蛋白C-內肽酶增強子(procollagen C- endopeptidase enhancer)；捲曲同源物7(frizzled homolog 7)(果蠅)；假想基因BC008967；第三型膠原蛋白α1；固生蛋白C(tenascin C,hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白質5(iroquois homeobox protein 5)；希菲斯特蛋白(hephaestin)；整合素β8；突觸囊泡醣蛋白(synaptic vesicle glycoprotein)2；神經胚細胞瘤，致腫瘤性抑制因子1；類胰島素生長因子結合蛋白質2，36kDa；智人cDNA FLJ12280 fis，殖株MAMMA1001744；類細胞介素受體因子1；鉀中間物/小電導鈣活化通道，次家族N，成員4；整合素β7；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蠅)；KIAA1034蛋白質；囊泡相關膜蛋白質5(肌短蛋白(myobrevin))；含EGF類fibulin細胞外基質蛋白質(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein)1；早期生長反應蛋白質(early growth response)3；無背端同源盒(distal-less homeo box)5；假想蛋白質FLJ20373；醛基-酮基還原酶家族1，成員C3(3-α羥類固醇去氫酶(3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase)，II型)；雙聚醣(biglycan)；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；纖連蛋白素1；腦啡肽前質(proenkephalin)；整合素，類β1(具有類EGF重複區)；智人mRNA全長***物cDNA殖株EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白質；利尿鈉胜肽受體C(natriuretic peptide receptor C)/鳥苷酸環化酶C(guanylate cyclase C)(心房利尿鈉胜肽受體C(atrionatriuretic peptide receptor C))；假想蛋白質FLJ14054；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp564B222(來自殖株DKFZp564B222)；BCL2/類腺病毒E1B 19kDa交互作用蛋白質3(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like)；AE結合蛋白質1；細胞色素c氧化酶次單元VIIa多肽1(肌肉)；類似於neuralin 1者；B細胞轉位基因1；假想蛋白質FLJ23191；及DKFZp586L151；及(h)不表現hTERT或端粒酶。在一實施例中，臍帶組織衍生細胞進一步具有以下特徵：(i)分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、 I309、MDC、RANTES、及TIMP1中之至少一者；(j)不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb、及VEGF中之至少一者，如藉由ELISA所偵測。在另一實施例中，胎盤組織衍生細胞進一步具有以下特徵：(i)分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、及TIMP1中之至少一者；(j)不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF、及VEGF中之至少一者，如藉由ELISA所偵測。
在如本文詳述的特定實施例中，產後衍生細胞具有以下細胞型之所有識別特徵：細胞型UMB 022803(P7)(ATCC存取號PTA-6067)；細胞型UMB 022803(P17)(ATCC存取號PTA-6068)、細胞型PLA 071003(P8)(ATCC存取號PTA-6074)；細胞型PLA 071003(P11)(ATCC存取號PTA-6075)；或細胞型PLA 071003(P16)(ATCC存取號PTA-6079)。在一實施例中，衍生自臍組織之產後衍生細胞具有細胞型UMB 022803(P7)(ATCC存取號PTA-6067)或細胞型UMB 022803(P17)(ATCC存取號PTA-6068)之所有識別特徵。在另一實施例中，衍生自胎盤組織之產後衍生細胞具有以下細胞型之所有識別特徵：細胞型PLA 071003(P8)(ATCC存取號PTA-6074)；細胞型PLA 071003(P11)(ATCC存取號PTA-6075)；或細胞型PLA 071003(P16)(ATCC存取號PTA-6079)。
在如本文詳述的實施例中，產後衍生細胞在一或多種酶活性存在下分離，該等酶活性包含金屬蛋白酶活性、黏液分解活性及中性蛋白酶活性。較佳地，該等細胞具有正常核型，其在細胞繼代培養時維持。
在較佳實施例中，產後衍生細胞包含CD10、CD13、CD44、CD73、CD90中之各者。在一些實施例中，產後衍生細胞包含CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、及HLA-A、B、C中之各者。在較佳實施例中，產後衍生細胞不包含CD31、CD34、CD45、CD117中之任一者。在一些實施例中，產後衍生細胞不包含CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、或HLA-DR、DP、DQ中之 任一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測。在上述實施例中，細胞群為HLA-A、HLA-B、HLA-C陽性，及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性。在所述的實施例中，該等細胞不表現hTERT或端粒酶。
在本文之實施例中，該細胞群為實質上均質性產後衍生細胞群。在特定實施例中，該族群為均質性產後衍生細胞群。在實施例中，該等產後衍生細胞係衍生自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在本文之實施例中，該細胞群可在組成物中；在一些實施例中，該組成物可係包含醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
在某些實施例中，如上文所述之產後衍生細胞群係與至少一種其他細胞型一起投予，該等其他細胞型諸如星狀細胞、寡樹突細胞、神經元、神經前驅、神經幹細胞、視網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、或其他多潛能性或多能性幹細胞。在這些實施例中，其他細胞型可與該細胞群或該條件培養基同時、在其之前、或在其之後投予。
在這些及其他實施例中，如上文所述之產後衍生細胞群係與至少一種其他藥劑(諸如用於眼治療之藥品)、或另一有益的輔助劑(諸如消炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑或生長因子)一起投予。在這些實施例中，其他劑可與該細胞群或該條件培養基同時、在之前、或在之後投予。
在各種實施例中，產後衍生細胞群係向眼睛表面投予、或向眼睛內部或向靠近眼睛之位置(例如於眼睛後面)投予。產後衍生細胞群可藉由通過套管或自植入於眼睛內或靠近眼睛之患者體內之裝置對眼睛注射(諸如視網膜下注射)來投予，或可藉由植入具有產後衍生細胞群或條件培養基之基質或支架來投予。在本文之實施例中，產後衍生細胞群可在各種時間，作為單一時間點或在多個時間點投予。在特定實施例中，該等細胞可藉由作為單次注射或多於一次注射並在不同的時間點之注射來投予。
在某些實施例中，該組成物或醫藥組成物經調配用於向眼睛表面投予。或者，其可經調配用於向眼睛內部或靠近眼睛處(例 如眼睛後面)投予。組成物亦可調配為含有產後衍生細胞或條件培養基之基質或支架。
圖1A至圖1E.藉由視網膜下hUTC移植恢復視覺功能取決於在出生後(P)第21天(P21)的細胞注射。(A)實驗設計的示意圖.在P21或P60(出生後第60天)或在P21與P60兩者將hUTC注射到的視網膜下腔(subretinal space)內。在P30、P60及P90至P95評估視覺功能恢復，然後在P95從相同動物收穫視網膜樣本。(B)視動反射(OKR)測試展示在RCS大鼠中無注射的左眼顯示視覺逐漸喪失。(C)僅在P21(G3)或在P21及P60(G6)視網膜下接受hUTC的RCS大鼠之右眼展示出與健康對照LE大鼠(GI)相當的視覺反應，而媒劑對照組(BSS，G4)或P60 hUTC處理組(G5)則類似於未處理對照(G2)逐漸失去視覺功能。(D)在P90的右眼OKR結果展示G3及G6具有改善的視覺功能。(E)在P90的亮度閾記錄(LTR)展示G6動物的上丘比G3的動物對光刺激更具反應性。所有數據均獲自六隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示。顯著性係以單因子ANOVA及杜凱(Tukey)事後檢驗* p<0.05展示。
圖2A至圖2G.光受體(PR)損失在P21與P30之間開始，並且P21的hUTC注射保留RCS光受體。用TUNEL(綠色)染色之視網膜切片的代表性影像顯露在(圖2A)P21、(圖2B)P30及(圖2C)P60之DAPI複染(藍色)切片中的凋亡光受體。(圖2D)標準化至年齡匹配對照(LE)的RCS之相對ONL厚度的定量分析顯示P21與P30之間顯著的PR損失。(圖2E)視網膜下hUTC注射延遲了RCS大鼠中的PR損失，如藉由相較於RCS+BSS，於RCS+hUTC P21 & P60中增加的ONL厚度及減少的TUNEL(綠色)陽性光受體所展示。(圖2F)ONL厚度之相對變化的定量。(圖2G)ONL中TUNEL+PR密度的定量。所有數據均獲自最少三隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示；顯著性係以* p<0.05展示；n.s.不顯著。
圖3A至圖3H.RCS大鼠中的突觸發育受損早於光受體損失。(圖3A)視網膜層的示意圖。突觸前(綠色)及突觸後(紅色，興奮性；藍色，抑制性)係標記於突觸層中。(圖3B)來自在P14、P21及P30之LE(健康)及RCS(變性)視網膜的具有針對Bassoon(綠色)及mGluR6(紅色)標記之光受體緞帶突觸的外叢狀層(OPL)之代表性影像。(圖3C)在P14與P30之間的OPL中之緞帶突觸的定量顯露RCS中的突觸發育在P14時已經受損。(圖3D)來自在P21之LE(健康)及RCS(變性)視網膜的具有針對VGIuTI(綠色)及PSD95(紅色)標記之雙極緞帶突觸的內叢狀層(IPL)之代表性影像。(圖3E)在P14與P30之間的IPL中之雙極緞帶突觸的定量顯露RCS大鼠中的突觸發育在P14與P21之間受到破壞。(圖3F)來自在P21之LE(健康)及RCS(變性)視網膜的具有針對Bassoon(前，綠色)、PSD95(興奮性後，紅色)、及Gephyrin(抑制性後，藍色)標記之興奮性及抑制性突觸的IPL之代表性影像。在P14與P30之間在IPL中形成之(圖3G)興奮性及(圖3H)抑制性突觸的定量顯露興奮性突觸發育缺陷發生在抑制性突觸缺陷之前。所有數據均獲自最少三隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示；顯著性係以* p<0.05展示。
圖4A至圖4E.在給光型亞層(on-sublaminae layer)及撤光型亞層(off-sublaminae layer)兩者的突觸皆發育性受損。(圖4A)來自在P21的LE(健康)及RCS(變性)視網膜的具有針對Bassoon(前，綠色)、PSD95(興奮性後，紅色)、及Gephyrin(抑制性後，藍色)標記之興奮性及抑制性突觸的IPL之代表性影像。藉由Bassoon的分層富集識別撤光型層及給光型層。興奮性突觸定量顯示在P21之RCS大鼠中的(圖4B)撤光型層及(圖4D)給光型層兩者皆具有減少的突觸數目，而在(圖4C)撤光型層及(圖4E)給光型層兩者中形成之抑制性突觸的數目沒有顯著變化。所有數據均獲自最少三隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示；顯著性係以* p<0.05展示；n.s.不顯著。
圖5A至圖5H.早於RCS大鼠中之PR損失，米勒神經膠質細胞在早期發育期間展現出反應性形態。在(圖5A)P14、(圖5B)P21、及(圖5C)P30的早期發育期間，米勒神經膠質細胞特異性標記物麩醯胺酸合成酶(GS)(綠色)及SOX9(紅色)顯示出形態變化。(圖5D)視網膜層及米勒神經膠質細胞的示意圖。藉由IHC標記米勒神經膠質細胞的突(GS，綠色)及核(SOX9，紅色)。在P21，RCS大鼠中被GS-陽性突覆蓋的(圖5E)OPL及(圖5F)IPL面積之百分比的定量減少。在RCS大鼠中，(圖5G)SOX9陽性細胞體的數目及(圖5H)SOX9細胞體之間的距離增加。所有數據均獲自最少三隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示；顯著性係以* p<0.05展示。
圖6A至圖6J.藉由米勒神經膠質細胞表現的TSP1及TSP2在RCS大鼠視網膜中減少。來自在(圖6A)P14及(圖6B)P30之LE(健康)及RCS(變性)大鼠的針對TSP1染色之視網膜的代表性影像。定量染色強度分析展示TSP1在突觸層中富集，並且早在(圖6C)P14時在RCS大鼠中的表現就減少，且在(圖6D)P30時表現差距變得更明顯。在(圖6E)P14及(圖6F)P30的針對TSP2染色之視網膜的代表性影像。定量染色強度分析展示TSP2在OPL中富集，並且早在(圖6G)P14時在RCS大鼠中的表現就減少，且在(圖6H)P30時表現差距變更大。(圖6I)顯示對應於大鼠視網膜中GS陽性細胞體(虛線)中的Thbs1(青色)及Thbs2(黃色)mRNA之螢光點的共焦顯微鏡影像。(圖6J)在GS陽性突3D描繪之影像(右圖)中，Thbs1及Thbs2 mRNA亦在突觸層中富集。
圖7A至圖7K.TSP受體α2δ-1在視網膜中突觸表現並且其表現在RCS大鼠中減少。來自在(圖7A)P14及(圖7B)P30之LE(健康)及RCS(變性)視網膜的針對α2δ-1染色之視網膜的代表性影像。(圖7C)定量染色強度分析展示早在P14時，RCS大鼠中的α2δ-1表現就降低了。(圖7D)在OPL及IPL兩者中α2δ-1都是富集的，並且在P30時表現差距變得更明顯。來自在P21的LE視網膜 的具有針對Bassoon(綠色)、α2δ-1(紅色)及NR1(藍色)標記之突觸的(圖7E)OPL及(圖7F)IPL之代表性影像展示出α2δ-1的突觸後表現。(圖7G)具有針對VGluT1(綠色)、α2δ-1(紅色)及NR1(藍色)標記之突觸的IPL之代表性影像。來自在P21之LE(健康)及RCS(變性)視網膜的針對Bassoon(綠色)及α2δ-1(紅色)標記之(圖7H)OPL及(圖7I)IPL突觸的代表性影像。在(圖7J)OPL及(圖7K)IPL中形成之含α2δ-1突觸的定量顯露在P21前RCS大鼠中的α2δ-1突觸數目已經減少。所有數據均獲自最少三隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示；顯著性係以*** p<0.0001展示。
圖8A至圖8F.視網膜下hUTC移植保留RCS大鼠中的OPL突觸。來自在P95之LE(對照)、RCS+BSS及RCS+hUTC P21&P60視網膜的具有針對Bassoon(綠色)(圖8A)及mGluR6(紅色)(圖8B)Bassoon(綠色)及α2δ-1(紅色)、及(圖8C)VGIuTI(綠色)標記之光受體緞帶突觸的OPL之代表性影像。OPL中之突觸數目的定量顯露hUTC移植保護了(圖8D及圖8F)緞帶突觸。(圖8E)尤其，在hUTC處理後特異性地保留含α2δ-1之突觸。所有數據均獲自最少三隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示；顯著性係以*** p<0.05展示；n.s.不顯著
圖9A至圖9F.視網膜下hUTC移植保留在RCS大鼠之IPL中的含α2δ-1突觸。(圖9A)來自在P95之LE(對照)、RCS+BSS及RCS+hUTC P21&P60視網膜的針對Bassoon(綠色)、PSD95(紅色)及Gephyrin(藍色)標記之IPL的代表性影像。IPL中之(圖9B)興奮性及(圖9C)抑制性突觸的定量顯露RCS+BSS與RCS+hUTC P21 & P60之間的突觸數目沒有區別。(圖9D)來自在P95之LE(對照)、RCS+BSS及RCS+hUTC P21&P60視網膜的針對Bassoon(綠色)及α2δ-1(紅色)標記之IPL的代表性影像。(圖9E)含α2δ-1突觸利用hUTC移植而被特異性地保留，而雙極緞帶突觸的數目在hUTC處理組與媒劑處理組之間沒有顯著區別(圖9F)。 所有數據均獲自最少三隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示；顯著性係以*** p<0.05展示；n.s.不顯著。
圖10A至圖10G.hUTC移植保留米勒神經膠質細胞形態並減弱反應性。(圖10A)來自在P95之LE(對照)、RCS+BSS及RCS+hUTC P21&P60視網膜的針對GS(綠色)及SOX9(紅色)標記之米勒神經膠質細胞的代表性影像。在RCS大鼠中，hUTC移植後，被GS陽性突覆蓋之(圖10B)OPL及(圖10C)IPL面積的百分比增加。在受到hUTC移植的RCS大鼠中，(圖10D)SOX9陽性細胞體的數目及(圖10E)SOX9細胞體之間的距離減少。(圖10F至圖10G)來自在P95之LE(對照)、RCS+BSS及RCS+hUTC P21 & P60視網膜的針對GS(綠色)及GFAP(紅色)標記之米勒神經膠質細胞的代表性影像展示在RCS+hUTC P21&P60中反應性神經膠細胞表型急劇減少。所有數據均獲自最少三隻混合性別的動物並以平均值±SEM表示；顯著性係以***p<0.05展示；n.s.不顯著。
本說明書中提及各種專利及其他出版物。這些出版物之各者之全部內容以引用方式併入本文中。
在下列說明性實施例之詳細說明中，參照形成本說明書之一部分的隨附圖式。這些實施例係以足夠詳細之方式描述以讓所屬技術領域中具有通常知識者能夠實行本發明，並會理解到尚可利用其他實施例，而且可在不偏離本發明之精神或範疇下作出邏輯變化。為了避免非為所屬技術領域中具有通常知識者能夠實行本文中所述之實施例所需之細節，本說明書可能會省略某些所屬技術領域中具有通常知識者所習知之資訊。因而不會以限制性的意義來採取下列詳細說明。
定義
本說明書及申請專利範圍中所使用之各種用語如以下闡 述所定義且意欲闡明本發明。除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學用語，均與具有本發明有關技藝之通常知識者所一般了解之意義相同。雖然任何類似或等效於本文中所述者之方法或材料可在用於測試本發明之實務中使用，但本文中係描述較佳材料及方法。在描述及請求本發明時，將使用下列用語。
幹細胞(stem cell)為未分化之細胞，其係以單一細胞同時具有自我更新及分化以生產後裔細胞(progeny cell)的能力來定義，包括自我更新前驅(self-renewing progenitor)、非更新前驅(non-renewing progenitor)與最終分化細胞(terminally differentiated cell)。幹細胞之特徵亦在於其具有體外分化為多個胚層(內胚層、中胚層與外胚層)之各種細胞譜系之功能性細胞的能力，以及在移植後形成多個胚層之組織的能力，並且能夠在注入胚胞(blastocyst)後實質上促成大多數(如果不是全部)組織形成。
目前，幹細胞根據其發展潛能分類如下：(1)全能性(totipotent)；(2)多能性(pluripotent)；(3)多潛能性(multipotent)；(4)少能性(oligopotent)；與(5)單能性(unipotent)。全能性細胞能夠形成所有胚胎與胚外細胞型。多能性細胞能夠形成所有胚胎細胞型。多潛能性細胞包括該些能夠形成細胞譜系亞群，但全部在特定組織、器官、或生理系統內之細胞(例如，造血幹細胞(HSC)可生產後裔，包括HSC(自我更新)、血液細胞限制少能性前驅、及作為血液正常組分之所有細胞型及元件(例如，血小板))。少能性細胞可以形成比多潛能性幹細胞更受限之細胞譜系亞群；及單能性細胞能夠形成單一細胞譜系(例如生精幹細胞)。
幹細胞亦根據其獲得來源來分類。成體幹細胞(adult stem cell)通常為多潛能性未分化細胞，其在包含多重分化細胞型之組織中發現。成體幹細胞可自我更新。在正常環境下，其亦可分化以產生其始源組織之特化細胞型，並且亦可能產生其他組織型。誘導型多能性幹細胞(iPS細胞)為轉變成多能性幹細胞之成體細胞。(Takahashi等人，Cell,2006；126(4)：663-676；Takahashi等人，Cell, 2007；131：1-12)。胚胎幹細胞(embryonic stem cell)為來自胚胞階段胚胎之內細胞團(inner cell mass)的多能性細胞。胎體幹細胞(fetal stem cell)為源自胎體組織或膜之幹細胞。產後幹細胞(postpartum stem cell)為多潛能性或多能性細胞，其實質上源自生產後所能取得之胚外組織，亦即胎盤及臍帶。已發現這些細胞擁有多能性幹細胞之特性特徵，包括快速增生及分化為多種細胞譜系之潛能。產後幹細胞可為血液衍生(例如該些得自臍帶血之幹細胞)或非血液衍生(例如得自臍帶及胎盤之非血液組織)。
胚胎組織通常定義為源自胚胎(在人類係指自受精至發育約六週之期間)之組織。胎體組織係指源自胎體之組織，胎體在人類係指自發育約六週至分娩之期間。胚外組織為與胚胎或胎體相關但非源自胚胎或胎體之組織。胚外組織包括胚外膜(絨毛膜、羊膜、卵黃囊及尿囊)、臍帶及胎盤(其自身形成自絨毛膜及母體底蛻膜)。
分化(Differentiation)為未特化(「未定向(uncommitted)」)或特化較低之細胞藉以獲得特化細胞(諸如舉例來說神經細胞或肌肉細胞)特徵的過程。已分化細胞為佔據細胞譜系內較高特化(「定向(committed)」)位置之細胞。用語定向(committed)當應用於分化過程時，係指細胞在分化路徑中已進行達到一點，在正常環境下達到該點之細胞將會持續分化為特定細胞型或細胞型亞群，並且在正常環境下無法分化為不同細胞型或回復為較低分化之細胞型。去分化(de-differentiation)係指細胞藉以回復至細胞譜系內較低特化(或定向)位置的過程。如本文中所使用，細胞之譜系(lineage)定義細胞之遺傳，即細胞係來自哪些細胞以及細胞可形成哪些細胞。細胞之譜系將細胞放置於發育及分化之遺傳方案(hereditary scheme)內。
廣義而言，前驅細胞(progenitor cell)為能夠產生較其本身更高分化之後裔，但又保有補充前驅池之能力的細胞。就此定義而言，幹細胞本身亦為前驅細胞，如同終末分化細胞之較直接前體細胞(more immediate precursor)。當提及本發明之細胞時，如以下所更詳述說明者，可使用此較廣之前驅細胞定義。狹義而言，前驅細胞通常 定義為在分化路徑中作為中間者之細胞，即其係由幹細胞所形成並且在成熟細胞型或細胞型亞群之生產中作為中間者。此類型之前驅細胞通常無法自我更新。因此，如果在本文中提及此類型之細胞，將會稱其為非新生前驅細胞(non-renewing progenitor cell)或中間前驅或前體細胞(intermediate progenitor or precursor cell)。
如本文中所使用，片語「分化成眼譜系或表型(differentiates into an ocular lineage or phenotype)」係指細胞變得部分或完全定向至特定眼表型，包括但不限於視網膜及角膜幹細胞、視網膜及虹膜之色素上皮細胞、光受體、視網膜神經節及其他視神經譜系(例如，視網膜神經膠細胞、微膠細胞、星狀細胞、繆氏細胞(Mueller cell))、形成水晶體之細胞、及鞏膜、角膜、角膜緣(limbus)及結膜之上皮細胞。片語「分化成神經譜系或表型(differentiates into a neural lineage or phenotype)」係指細胞變得部分或完全定向至CNS或PNS之特定神經表型，亦即，神經元或膠細胞，後一類別包括但不限於星狀細胞、寡樹突細胞、許旺氏細胞(Schwann cell)及微膠細胞。
本文所例示且較佳用於本發明之細胞通常稱為產後衍生細胞(或PPDC)。其有時亦可更具體地被稱為臍衍生細胞(UDC)或胎盤衍生細胞(PDC)。此外，該些細胞可被描述為幹細胞或前驅細胞(progenitor cell)，後項用語係以廣義的方式來使用。用語衍生(derived)係用來指明細胞係得自其生物來源，且於體外生長或經其他方式調控(例如培養於生長培養基以擴增族群及/或生產細胞系(cell line))。臍幹細胞及胎盤幹細胞之體外調控以及本發明之臍衍生細胞及胎盤衍生細胞之獨有特性係詳述於後文中。藉由其他手段分離自產後胎盤及臍之細胞亦被認為適合用於本發明中。這些其他細胞在本文中稱為產後細胞(而非產後衍生細胞)。
使用各種用語來描述在培養物中之細胞。細胞培養物(cell culture)通常係指取自活體生物並且在受控制條件下生長(「在培養物中(in culture)」或「經培養(cultured)」)的細胞。初代細胞培養物(primary cell culture)為直接取自生物且在第一次亞培養前之細胞、 組織或器官的培養物。當細胞置於生長培養基中並處於有利細胞生長及/或***之條件下時，其在培養物中擴增從而導致更大的細胞群。當細胞在培養物中擴增時，細胞增生之速率有時係以細胞數目倍增所需的時間量來量測。此稱為倍增時間(doubling time)。
細胞系(cell line)為由初代細胞培養物之一或多個亞培養(subcultivation)所形成的細胞群。每一輪亞培養稱為一個繼代(passage)。當細胞經過亞培養時，將它們稱為已繼代。特定之細胞群或細胞系有時會以其繼代次數來指稱或表徵。例如，繼代十次的經培養細胞群可稱為P10培養物。初代培養物(在細胞自組織分離出來後的第一次培養物)係命名為P0。在第一次亞培養後，該些細胞係描述為二次培養物(P1或繼代1)。在第二次亞培養後，該些細胞即變成三次培養物(P2或繼代2)，依此類推。所屬技術領域中具有通常知識者將會理解到，在繼代期間會有多次族群倍增；因此，培養物之族群倍增次數大於其繼代次數。在繼代間隔期間的細胞擴增(即族群倍增次數)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基材、培養基、生長條件及繼代間隔時間。
用語生長培養基(growth medium)通常係指足以培養PPDC之培養基。詳言之，用於培養本發明的實施例之細胞的一種目前較佳培養基包含達爾伯克改良必需培養基(Dulbecco's Modified Essential Media)(在本文中亦縮寫為DMEM)。尤其較佳的是DMEM-低葡萄糖(在本文中亦稱為DMEM-LG)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。DMEM-低葡萄糖較佳係補充有15%(v/v)胎牛血清(例如特級胎牛血清(defined fetal bovine serum)，Hyclone,Logan Utah)、抗生素/抗黴劑(較佳為50至100個單位/毫升青黴素、50至100微克/毫升鏈黴素、及0至0.25微克/毫升兩性黴素B；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、及0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma,St.Louis Mo.)。如以下實例中所用，生長培養基係指具有15%胎牛血清及抗生素/抗黴劑之DMEM-低葡萄糖(當包括青黴素/鏈黴素時，其較佳分別為50U/ml及50微克/ml；當使用青黴素/鏈黴素/兩性黴素時，其較佳 分別為100U/ml、100微克/ml、及0.25微克/ml)。在一些情況下，使用不同生長培養基，或提供不同補充劑，這些通常在文中指明為生長培養基之補充劑。
條件培養基(conditioned medium)為其中特定細胞或細胞群係經培養且隨後移除之培養基。當細胞培養於培養基中時，其可分泌可提供營養支持給其他細胞之細胞因子。此類營養因子包括但不限於荷爾蒙、細胞介素、細胞外基質(ECM)、蛋白質、囊泡、抗體、及顆粒。含有細胞因子之培養基為條件培養基。
通常，營養因子(trophic factor)係定義為促進細胞生存、生長、分化、增生及/或成熟之物質，或刺激細胞提高活性之物質。細胞之間經由營養因子的交互作用可發生在不同類型的細胞之間。藉助營養因子之細胞交互作用見於基本上所有的細胞型中，且為神經細胞型之通訊所尤其顯著的手段。營養因子亦可以自泌(autocrine)之方式作用，亦即，細胞可生產影響其自身生存、生長、分化、增生及/或成熟之營養因子。
當指稱經培養之脊椎動物細胞時，用語衰老(senescence)(複製衰老(replicative senescence)或細胞衰老(cellular senescence)亦同)係指可歸因於有限細胞培養之性質；亦即，彼等無能力生長超越有限的族群倍增次數(有時稱為海富利克限度(Hayflick’s limit))。儘管細胞衰老最先係使用纖維母細胞樣細胞(fibroblast-like cell)來描述，但是可在培養物中成功生長之大部分正常人類細胞型均經歷細胞衰老。不同細胞型之體外壽命不同，但是最大壽命通常少於100次族群倍增(此為培養物中之所有細胞變衰老且因此使培養物無法***之倍增次數)。衰老並非取決於時序時間，而是由培養物所經歷之細胞***、或族群倍增之次數所量測。
用語眼(ocular)、眼科(ophthalmic)及視(optic)在本文中可互換使用以定義「眼睛的、或有關眼睛、或與眼睛相關(of,or about,or related to the eye)」。用語眼變性病狀(ocular degenerative condition)(或病症(disorder))為包括性用語，涵蓋涉及細胞損傷、 變性或損失之眼睛(包括眼睛與腦之間的神經連接)的急性及慢性病狀、病症或疾病。
用語治療眼變性病狀(treating an ocular degenerative condition)或眼變性病狀之治療(treatment of an ocular degenerative condition)係指緩解如本文所定義之眼變性病狀之作用，或延緩、暫停或逆轉眼變性病狀之進展，或延緩或預防眼變性病狀之發生。
用語有效量(effective amount)係指試劑或醫藥組成物諸如生長因子、分化劑、營養因子、細胞群或其他藥劑之濃度或量，該濃度或量可有效產生預期結果，包括如本文所述之體外或體內之細胞生長及/或分化，或治療眼變性病狀。關於生長因子，有效量可在約1奈克/毫升至約1微克/毫升之範圍內。關於向患者體內投予之PPDC，有效量可在少至數百或更少、至多達數百萬或更多之範圍內。在特定實施例中，有效量可在103至1111個細胞之範圍內，更特定言之為至少約104個細胞。應理解待投予之細胞數目將取決於待治療病症之細節，包括但不限於待治療之大小或總體積/表面積，以及投予位點與待治療區域之位置之靠近性，以及醫藥生物學家熟悉的其他因素而變化。
用語有效期間(effective period)(或時間(time))及有效條件(effective condition)係指對於劑或醫藥組成物而言，為達成其預期結果所必需或較佳的時間期間或其他可控條件(例如，體外方法之溫度、濕度)。
用語患者(patient)或對象(subject)係指用本文所述之細胞或醫藥組成物、或根據本文所述之方法治療之動物，包括哺乳動物，較佳為人類。
用語醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)(或介質(medium))可與用語生物可相容之載劑或介質(biologically compatible carrier or medium)互換使用，係指試劑、細胞、化合物、材料、組成物、及/或劑型，其不僅可與待治療性投予之細胞及其他藥劑相容，而且在合理的醫學判斷之範疇內適用於與人類 及動物之組織接觸，而無過度毒性、刺激、過敏反應、或符合合理的利益/風險比的其他併發症。
在本文中使用數個關於細胞置換療法(cell replacement therapy)之用語。用語自體轉移(autologous transfer)、自體移植(autologous transplantation)、自體移接(autograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者亦為細胞置換療法之接受者之治療。用語同種異體轉移(allogeneic transfer)、同種異體移植(allogeneic transplantation)、同種異體移接(allograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者與細胞置換療法之接受者為相同物種，但非相同個體之治療。捐贈者細胞與接受者組織相容性匹配之細胞轉移有時稱為同基因轉移(syngeneic transfer)。用語異種轉移(xenogeneic transfer)、異種移植(xenogeneic transplantation)、異種移接(xenograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者與細胞置換療法之接受者為不同物種之治療。如本文中所使用之移植係指將自體、或同種異體捐贈者細胞置換療法引入至接受者。
實施方式
衍生自前驅細胞(諸如根據所屬技術領域中已知之任何方法分離自產後臍帶或胎盤之細胞)之條件培養基為治療眼變性病狀提供了另一新來源。因此，本文所述的各種實施例的特徵在於用於修復及再生眼組織的方法及組成物，其使用從產後臍帶或胎盤分離的細胞以及從該等細胞產生的條件培養基。本發明適用於眼變性病狀，但預期尤其適用於一些難以治療或治癒或無可得治療或療法之眼病症。這些眼病症包括但不限於年齡相關性黃斑變性、色素性視網膜炎、及糖尿病性及其他視網膜病變。
製備細胞
用於本發明之組成物及方法中之細胞、細胞群及包含細胞溶解產物、條件培養基及其類似物之製劑係描述於本文，且詳細描述於美國專利第7,524,489號、第7,510,873號、及第9,579,351號 中，其各自以引用方式併入本文中。根據使用產後細胞之該些方法，將哺乳動物臍帶及胎盤在足月或不足月懷孕結束時或結束後不久例如在排出胎衣(after-birth)後回收。產後組織可在無菌容器例如燒瓶、燒杯、培養皿或袋中自生產地運輸至實驗室。該容器可具有溶液或培養基，包括但不限於鹽溶液如達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle's Medium,DMEM)或磷酸鹽緩衝液(PBS)，或者任何用來運輸用於移植之器官的溶液如威斯康辛大學溶液(University of Wisconsin solution)或全氟化化合物溶液(perfluorochemical solution)。可將一或多種抗生素及/或抗黴劑(例如但不限於青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)、兩性黴素B(amphotericin B)、建它黴素(gentamicin)與制黴菌素(nystatin))加至該培養基或緩衝液。產後組織可用抗凝劑溶液例如含肝素溶液來潤洗。較佳者為使該組織在萃取PPDC前保持在約4至10℃下。更佳者為使該組織在萃取PPDC前未經冷凍。
PPDC之分離較佳為在無菌環境中進行。臍帶可藉由該項技術領域中習知之手段來與胎盤分開。或者，臍帶與胎盤未經分開即可使用。較佳為在分離PPDC前自產後組織移除血液與碎屑。例如，產後組織可用緩衝液來清洗，諸如但不限於磷酸鹽緩衝液。清洗緩衝液亦可包含一或多種抗黴劑及/或抗生素，諸如但不限於青黴素、鏈黴素、兩性黴素B、建它黴素及制黴菌素。
包含完整胎盤或臍帶、或其片段或區段之產後組織係藉由機械力(切碎或剪切力)來崩解。在目前較佳實施例中，分離程序亦利用酶消化法。許多種酶在該項技術領域中係習知可用來自複雜組織基質中分離出個別細胞以利於在培養物中生長。此類酶為市售可得，範圍從弱消化性(例如去氧核糖核酸酶及中性蛋白酶分散酶(dispase))到強消化性(例如木瓜酶及胰蛋白酶)皆有。相容於本文中之酶的非詳盡無遺清單包括黏液分解酶活性物、金屬蛋白酶(metalloprotease)、中性蛋白酶、絲胺酸蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶)與去氧核糖核酸酶。目前較佳者為選自金屬 蛋白酶、中性蛋白酶與黏液分解活性物之酶活性物。例如，膠原蛋白酶已知可用來自組織分離出各種細胞。去氧核糖核酸酶可消化單股DNA並且可使分離期間的細胞結塊(cell clumping)降至最低。較佳方法涉及用例如膠原蛋白酶及分散酶、或膠原蛋白酶、分散酶、及玻尿酸酶進行酶處理，且提供此類方法，其中在某些較佳實施例中，膠原蛋白酶與中性蛋白酶分散酶之混合物係用於解離步驟中。更佳者為該些於至少一種來自溶組織芽胞梭菌(Clostridium histolyticum)之膠原蛋白酶以及蛋白酶活性物、分散酶與嗜熱菌蛋白酶中之任一者存在下來進行消化之方法。再佳者為同時使用膠原蛋白酶與分散酶酶活性物來進行消化之方法。同樣較佳者為包括除了膠原蛋白酶與分散酶活性物外使用玻尿酸酶活性物來進行消化之方法。熟悉該項技藝人士將會瞭解到，許多種此類酶處理在該項技術領域中皆為習知可用於自各種組織來源分離出細胞。舉例而言，酶組合之LIBERASETM Blendzyme 3(Roche)系列適合用於本發明方法中。其他酶來源為習知者，並且熟悉該項技藝人士亦可直接自此類酶之天然來源獲得這些酶。熟悉該項技藝人士亦擁有充足知識，能夠針對新的或其他酶或酶組合在用於分離本發明之細胞方面評估其實用性。較佳酶處理費時0.5、1、1.5或2小時或更久。在其他較佳實施例中，組織在解離步驟之酶處理期間係培養於37℃下。
在本發明之一些實施例中，產後組織係分開為包含各種組織態樣舉例而言例如胎盤之新生兒、新生兒/母體及母體態樣的區段。分開之區段接著根據本文中所述之方法藉由機械及/或酶解離來解離。新生兒或母體譜系之細胞可藉由該項技術領域中習知的任何手段來識別，例如藉由核型分析(karyotype analysis)或Y染色體之原位雜交。
經分離之細胞或PPDC自其所生長出之產後組織可用來起始或接種細胞培養物。將經分離之細胞轉移至無菌組織培養容器，並且容器未經塗布或經細胞外基質或配體如層黏蛋白、膠原蛋白(原生、變性或交聯)、明膠、纖連蛋白素與其他細胞外基質蛋白質塗布。 PPDC係於任何能夠維持該等細胞生長之培養基中培養，諸如但不限於DMEM(高或低葡萄糖)、進階DMEM、DMEM/MCDB 201、伊格爾基礎培養基(Eagle’s basal medium)、哈姆F10培養基(Ham's F-10 medium,F10)、哈姆F-12培養基(F12)、伊思考夫改良達爾伯克培養基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)、間葉幹細胞生長培養基(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium,MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640及cellgro FREETM。培養基可補充一或多種組分，包括例如胎牛血清(FBS)(較佳為約2-15%(v/v))；馬血清(ES)；人血清(HS)；β-巰基乙醇(beta-mercaptoethanol,BME或2-ME)，較佳為約0.001%(v/v))；一或多種生長因子，例如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子-1(IGF-1)、白血球抑制因子(LIF)及紅血球生成素；胺基酸，包括L-纈胺酸；以及一或多種抗生素及/或抗黴劑以控制微生物污染，例如青黴素G、硫酸鏈黴素、兩性黴素B、建它黴素及制黴菌素，不論單獨或組合使用。培養基較佳包含生長培養基(DMEM-低葡萄糖、血清、BME、及抗生素)。
細胞係以允許細胞生長之密度接種於培養容器中。在一較佳實施例中，細胞在約0至約5體積百分比的CO2在空氣中培養。在一些較佳實施例中，細胞在約2至約25百分比的O2在空氣中、較佳在約5至約20百分比的O2在空氣中培養。細胞較佳在約25至約40℃下培養，且更佳在37℃下培養。較佳為細胞係於培養器中培養。培養容器中的培養基可為靜止或經攪拌，例如使用生物反應器。較佳為使PPDC在低氧化應力(oxidative stress)下生長(例如添加麩胱甘肽、維生素C、過氧化氫酶、維生素E、N-乙醯半胱胺酸)。如本文所用之「低氧化應力(Low oxidative stress)」係指對於所培養細胞無自由基傷害或最低自由基傷害之條件。
用於選擇最適當培養基、培養基製備與細胞培養技術之方法在該項技術領域為熟知者，並且係描述於各種不同來源中，包括Doyle等人，(編)，1995,Cell &TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES,John Wiley & Sons,Chichester；與Ho及Wang(編)，1991,ANIMAL CELL BIOREACTORS,Butterworth-Heinemann,Boston，上述皆以引用方式併入本文中。
在培養分離之細胞或組織片段一段足夠時間後，PPDC將會生長出來，此係因自產後組織遷移出來或因細胞***所致，或者兩者皆是。在本發明的一些實施例中，PPDC係經繼代或移除至含有與初始使用之培養基相同或不同類型之新鮮培養基的分開培養容器中，其中細胞群可經有絲***擴增。本發明之細胞可在繼代0與衰老之間的任何時點使用。較佳為將細胞繼代約3與約25次之間，更佳為繼代約4至約12次，並且較佳為繼代10或11次。可執行選殖(Cloning)及/或次選殖(subcloning)以確認已分離出細胞的殖株族群(clonal population)。
在本發明之一些態樣中，存在於產後組織中的不同細胞型係經離拆(fractionated)為亞群，而PPDC可自該些亞群分離出來。此可使用細胞分離標準技術來達成，包括但不限於進行酶處理以將產後組織解離為其組分細胞，接著選殖及選擇特定細胞型，例如但不限於根據形態及/或生化標記來選擇；選擇性生長所欲之細胞(正向選擇)、選擇性破壞非所欲之細胞(負向選擇)；根據混合族群中之差別細胞可凝集性來進行分離，例如使用黃豆凝集素；冷凍-解凍程序；在混合族群中之細胞的差別貼附性；過濾；傳統與區帶(zonal)離心；離心淘析(對流離心(counter-streaming centrifugation))；單元重力分離(unit gravity separation)；逆流分配(countercurrent distribution)；電泳；及螢光活化細胞分選(FACS)。關於殖株選擇及細胞分離技術之綜述，參見Freshney,1994,CULTURE OF ANIMAL CELLS：A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES，第3版，Wiley-Liss,Inc.,New York，其以引用方式併入本文。
視需要更換培養基，例如使用例如吸量管小心將培養基自皿吸出，然後以新鮮培養基補足。持續培養直到皿中累積足夠細胞數目或密度。可將原始外植之組織區段取出，然後使用標準技術或使 用細胞刮勺來讓剩餘細胞進行胰蛋白酶消化(trypsinized)。在胰蛋白酶消化後，將細胞收集、移至新鮮培養基然後如上述培養。在一些實施例中，培養基在胰蛋白酶消化後約24小時更換至少一次以移除任何飄浮細胞。培養物中剩餘之細胞被視為是PPDC。
PPDC可經凍存。因此，在以下更詳細描述之較佳實施例中，用於自體轉移之PPDC(無論是用於母親或嬰兒)可衍生自在嬰兒出生後之適當產後組織，接著經過凍存以使得之後需要移植該些細胞時可供使用。
細胞之特徵
本發明之前驅細胞諸如PPDC可藉由下列加以表徵：例如生長特徵(例如族群倍增能力、倍增時間、到達衰老之繼代數)、核型分析(例如正常核型；母體或新生兒譜系)、流動式細胞測量術(例如FACS分析)、免疫組織化學法及/或免疫細胞化學法(例如偵測表位)、基因表現概況(例如基因晶片陣列分析；聚合酶連鎖反應(例如反轉錄酶PCR、即時PCR及傳統PCR))、蛋白質陣列分析、蛋白質分泌法(例如藉由血漿凝固檢定或PDC條件培養基分析(例如藉由酶聯免疫吸附檢定法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)))、混合淋巴球反應(例如作為PBMC刺激作用之量測)及/或其他該項技術領域中所習知的方法。
衍生自臍組織之PPDC之實例係於2004年6月10日寄存於美國菌種保存中心(ATCC,10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110)，且所獲派之ATCC存取號如下：(1)細胞株代號UMB 022803(P7)所獲派之存取號為PTA-6067；以及(2)細胞株代號UMB 022803(P17)所獲派之存取號為PTA-6068。衍生自胎盤組織之PPDC之實例係寄存於ATCC(Manassas,Va.)，且所獲派之ATCC存取號如下：(1)細胞株代號PLA 071003(P8)係於2004年6月15日寄存且所獲派之存取號為PTA-6074；(2)細胞株代號PLA 071003(P11)於2004年6月15日寄存且所獲派之存取號為PTA-6075；以及(3)細胞株代號 PLA 071003(P16)於2004年6月16日寄存且所獲派之存取號為PTA-6079。
在各種實施例中，PPDC擁有以下生長特徵中之一或多者：(1)在培養中需要L-纈胺酸以供生長；(2)它們能夠生長於含有約5%至至少約20%之氧的氛圍中；(3)它們在培養中於達到衰老前具有至少約40次倍增之潛力；以及(4)它們在經塗布或未經塗布的組織培養容器上附著並擴增，其中經塗布之組織培養容器包含明膠、層黏蛋白、膠原蛋白、聚鳥胺酸、玻璃連接蛋白、或纖連蛋白素之塗層。
在某些實施例中，PPDC擁有正常核型，其在細胞繼代時維持。核型分析尤其可用於識別並區分衍生自胎盤之新生兒與母體細胞。核型分析方法為所屬技術領域中具有通常知識者可使用且習知者。
在其他實施例中，PPDC可藉由生產某些蛋白質來表徵，包括：(1)生產波形蛋白(vimentin)與α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin)中之至少一者；以及(2)生產CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2與HLA-A、HLA-B、HLA-C細胞表面標記中之至少一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測。在其他實施例中，PPDC可藉由不生產下列之至少一者來表徵：CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G以及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ細胞表面標記，如藉由流動式細胞測量術所偵測。尤其較佳者為生產波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白的細胞。
在其他實施例中，PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；趨化激素(C--X--C模體)配體1(黑色素瘤生長刺激活性物，α)；趨化激素(C--X--C模體)配體6(顆粒性細胞趨化蛋白質2)；趨化激素(C--X--C模體)配體3；腫瘤壞死因子，α-誘發蛋白質3；C型凝集素超家族成員2；威爾姆斯(Wilms)腫瘤1；醛去氫酶1家族 成員A2；腎素(renin)；氧化低密度脂蛋白受體1；智人(Homo sapiens)殖株IMAGE：4179671；蛋白質激酶C ζ；假想蛋白質DKFZp564F013；卵巢癌向下調控因子1；及殖株DKFZp547k1113之智人基因。在一實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；或趨化激素(C--X--C模體)配體3。在另一實施例中，衍生自胎盤組織之PPDC可藉由針對編碼腎素或氧化低密度脂蛋白受體1之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵。
在其他實施例中，PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經減少來表徵：矮小同源盒2；熱休克27kDa蛋白質2；趨化激素(C--X--C模體)配體12(基質細胞衍生因子1)；彈性蛋白(瓣上主動脈狹窄，威廉-波倫(Williams-Beuren)症候群)；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp586M2022(來自殖株DKFZp586M2022)；間葉同源盒2(生長停滯特異性同源盒(growth arrest-specific homeo box))；sine oculis同源盒同源物1(果蠅(Drosophila))；αB水晶體蛋白；形態發生紊亂關聯活化物2(disheveled associated activator of morphogenesis 2)；DKFZP586B2420蛋白質；類似於neuralin 1者；結合四素(tetranectin，纖維蛋白溶酶原(plasminogen)結合蛋白質)；src同源體3(SH3)與多半胱胺酸區(cysteine rich domain)；膽固醇25-羥化酶；矮小相關轉錄因子3(runt-related transcription factor 3)；介白素11受體，α；原膠原蛋白C-內肽酶增強子(procollagen C-endopeptidase enhancer)；捲曲同源物7(frizzled homolog 7)(果蠅)；假想基因BC008967；第三型膠原蛋白α1；固生蛋白C(tenascin C,hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白質5(iroquois homeobox protein 5)；希菲斯特蛋白(hephaestin)；整合素β8；突觸囊 泡醣蛋白(synaptic vesicle glycoprotein)2；神經胚細胞瘤，致腫瘤性抑制因子1；類胰島素生長因子結合蛋白質2，36kDa；智人cDNA FLJ12280 fis，殖株MAMMA1001744；類細胞介素受體因子1；鉀中間物/小電導鈣活化通道，次家族N，成員4；整合素β7；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蠅)；KIAAI034蛋白質；囊泡相關膜蛋白質5(肌短蛋白(myobrevin))；含EGF類fibulin細胞外基質蛋白質(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein)1；早期生長反應蛋白質(early growth response)3；無背端同源盒(distal-less homeo box)5；假想蛋白質FLJ20373；醛基-酮基還原酶家族1，成員C3(3-α羥類固醇去氫酶(3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase)，II型)；雙聚醣(biglycan)；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；纖連蛋白素1；腦啡肽前質(proenkephalin)；整合素，類β1(具有類EGF重複區)；智人mRNA全長***物cDNA殖株EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白質；利尿鈉胜肽受體C(natriuretic peptide receptor C)/鳥苷酸環化酶C(guanylate cyclase C)(心房利尿鈉胜肽受體C(atrionatriuretic peptide receptor C))；假想蛋白質FLJ14054；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp564B222(來自殖株DKFZp564B222)；BCL2/類腺病毒E1B 19kDa交互作用蛋白質3(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like)；AE結合蛋白質1；以及細胞色素c氧化酶次單元VIIa多肽1(肌肉)。
在本文所述的實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由分泌選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、及血小板反應蛋白-4之營養因子來表徵。在實施例中，PPDC可藉由分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、RANTES、MDC、及TIMP1中之至少一者來表徵。在一些實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1a及VEGF中之至少一者來表徵，如藉由ELISA所偵測。在替代實施例中，衍生自胎盤組織之PPDC可藉由分 泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、及TIMP1中之至少一者，且不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF、及VEGF中之至少一者來表徵，如藉由ELISA所偵測。在進一步實施例中，PPDC不表現hTERT或端粒酶。
在較佳實施例中，細胞包含二或更多種以上列舉之生長、蛋白質/表面標記生產、基因表現或物質分泌之特徵。更佳者為該些包含三、四、或五或更多種該等特徵之細胞。再佳者為包含六、七或八或更多種該等特徵之PPDC。再佳者為該些包含所有上述特徵之細胞。
在特別較佳的實施例中，細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，該等細胞能夠在培養物中擴增、不生產CD117或CD45、且不表現hTERT或端粒酶。在一實施例中，細胞不生產CD117及CD45且可選地亦不表現hTERT及端粒酶。在另一實施例中，細胞不表現hTERT及端粒酶。在另一實施例中，細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織、能夠在培養物中擴增、不生產CD117或CD45、且不表現hTERT或端粒酶，且具有以下特徵之一或多者：表現CD10、CD13、CD44、CD73、及CD90；不表現CD31或CD34；相對於人類纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞，表現增加水準之介白素8或內質網蛋白1；且具有分化之潛能。在本文之實施例中，臍帶組織衍生細胞分泌選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、及血小板反應蛋白-4之突觸新生營養因子。
在本發明之數個態樣中所使用之目前較佳的細胞為具有上述特徵之產後細胞，並且尤其是其中該些細胞具有正常核型並且在繼代時維持正常核型者，而進一步是其中該些細胞表現下列各標記者：CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，其中該些細胞生產免疫學上可偵測且對應上列標記之蛋白質。再佳者為除了前述者外不生產對應於任何下列標記之蛋白質之該些細胞：CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA- DR、HLA-DP、HLA-DQ如由流動式細胞測量術所偵測。在進一步較佳實施例中，該些細胞不表現hTERT或端粒酶。
具有譜系分化的潛能而導致各種表型之某些細胞係不穩定且因此可自行分化。目前較佳用於本發明的細胞為不會例如沿著神經譜系自行分化之細胞。當生長於生長培養基中時，較佳細胞在生產在其表面上之細胞標記方面、及在各種基因之表現模式方面為實質上穩定的，例如如使用Affymetrix GENECHIP所判定。經由多次族群倍增的繼代，該些細胞例如在其表面標記特徵方面仍保持實質上恆定。
然而，PPDC之一個特徵在於可藉由使其經歷分化誘導細胞培養條件來有意地誘導其分化成各種譜系表型。在治療某些眼變性病狀的用途中，可使用所屬技術領域中已知的一或多種方法誘導PPDC分化成神經表型。舉例而言，如本文所例示，可將PPDC接種於經層黏蛋白塗布之培養瓶中之含有B27(B27補充物，Invitrogen)、L-麩醯胺酸及青黴素/鏈黴素之Neurobasal-A培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)，其組合在本文稱為神經前驅擴增(NPE)培養基。NPE培養基可進一步補充有bFGF及/或EGF。或者，可藉由以下誘導PPDC體外分化：(1)將PPDC與神經前驅細胞共培養；或(2)使PPDC於神經前驅細胞條件培養基中生長。
PPDC分化成神經表型可藉由具有伸長突起之雙極細胞形態來證明。經誘導之細胞群可針對巢蛋白(nestin)之存在染色為陽性。經分化之PPDC可藉由偵測巢蛋白、TuJ1(BIII微管蛋白)、GFAP、酪胺酸羥化酶、GABA、04及/或MBP來評估。在一些實施例中，PPDC展現出形成神經球(neurosphere)之神經元幹細胞形成之三維體特徵的能力。
細胞群
本發明之另一態樣之特徵在於前驅細胞諸如產後衍生細胞或其他前驅細胞之族群。產後衍生細胞可分離自胎盤或臍組織。在 較佳實施例中，細胞群包含上文所述之PPDC，且這些細胞群係描述於下節中。
在一些實施例中，細胞群為異質性。本發明之異質性細胞群可包含至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的細胞。本發明之異質性細胞群可進一步包含前驅細胞(產後衍生細胞)、或其他前驅細胞，諸如上皮或神經前驅細胞，或其可進一步包含經完全分化之細胞。
在一些實施例中，該族群實質上為均質性，即實質上僅包含PPDC(較佳為至少約96%、97%、98%、99%或更多的細胞)。在一些實施例中，細胞群係均質性。在實施例中，本發明之均質性細胞群可包含臍衍生細胞或胎盤衍生細胞。臍衍生細胞之均質性族群較佳為不含母體譜系細胞。胎盤衍生細胞之均質性族群可為新生兒或母體譜系。細胞群之均質性可藉由任何該項技術領域中所習知的方法來達成，例如根據習知方法藉由細胞分選(例如流動式細胞測量術)或藉由殖株擴增達成。因此，較佳均質性PPDC族群可包含產後衍生細胞之殖株細胞系。當分離出具有高度所欲功能性之細胞殖株時，此類族群為尤其有用的。
本文亦提供在一或多種因子存在下，或在刺激幹細胞沿著所欲路徑(例如，神經、上皮)分化之條件下培養之細胞群。此類因子為所屬技術領域中已知的且熟悉該項技藝人士將會瞭解到，判定合適的分化條件可以常規實驗完成。此類條件之最佳化可藉由統計實驗設計及分析來完成，例如回應面方法論(response surface methodology)允許同時最佳化例如在生物培養物中的多個變數。目前較佳因子包括但不限於以下因子，諸如生長或營養因子、去甲基化劑、與神經或上皮譜系細胞共培養或於神經或上皮譜系細胞條件培養基中培養，以及所屬技術領域中已知用以刺激幹細胞沿著這些路徑分化的其他條件(關於可用於神經分化之因子，參見例如Lang,K.J.D.等人，2004,J.Neurosci.Res.76：184-192；Johe,K.K.等人，1996, Genes Devel.10：3129-3140；Gottleib,D.,2002,Ann.Rev.Neurosci.25：381-407)。
先前已證明，人類臍帶組織衍生細胞會改善視覺功能並緩解視網膜變性(US 2010/0272803)。亦已證明，產後衍生細胞可在RCS模型中用於促進光受體救援且因此保留光受體。(US 2010/0272803)。將hUTC視網膜下注射至RCS大鼠眼睛中改善了視敏度並緩解了視網膜變性。此外，以衍生自hUTC之條件培養基(CM)進行治療，可使體外失養性RPE細胞恢復對ROS之吞噬。(US 2010/0272803)。在此，本發明的實施例揭示hUTC可用於在視網膜變性中調節米勒神經膠質細胞(Müller glia)、恢復視網膜突觸連接、保留及恢復含α2δ1突觸、及預防或減弱米勒神經膠質細胞之反應性神經膠變性。
條件培養基
在一個態樣中，本發明提供來自經培養之前驅細胞諸如產後衍生細胞、或其他前驅細胞之條件培養基，其如下文所述用於體外及體內。此類條件培養基之使用允許由細胞分泌之有益營養因子同種異體地用於患者中，而無需引入可能引發排斥、或其他不良免疫反應之完整細胞。條件培養基係藉由於培養基中培養細胞(諸如細胞群)，隨後自培養基移除該些細胞來製備。在某些實施例中，產後細胞為UTC或PDC，更佳為hUTC。
由上文所述之細胞群所製備之條件培養基可按原樣使用、經進一步濃縮例如藉由超濾或凍乾、或甚至乾燥後使用、經部分純化後使用、如所述技術領域中已知與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑組合使用、或與其他化合物諸如生物製品例如醫藥上可用的蛋白質組成物組合使用。條件培養基可在體外或體內單獨使用，或例如與自體或同基因活細胞一起使用。條件培養基若經引入體內，可被引入局部治療位點、或引入遠端以提供例如需要的細胞生長或營養因子給患者。
細胞改質、組分及產物
前驅細胞諸如產後細胞(較佳PPDC)亦可經基因改質以生產治療可用的基因產物，或生產用於治療腫瘤之抗癌藥物。基因改質可使用多種載體(vector)中之任一者實現，包括但不限於整合型病毒載體，例如，反轉錄病毒載體或腺相關病毒載體；非整合型複製載體，例如，乳突病毒載體、SV40載體、腺病毒載體；或複製缺陷型病毒載體。將DNA引入至細胞中之其他方法包括使用脂質體、電穿孔、粒子槍、或藉由直接DNA注射。
宿主細胞較佳係經DNA轉形或轉染，該DNA受到一或多種適當的表現控制元件諸如啟動子或增強子序列、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等其他元件，及可選擇的標記控制或與其操作性相連。任何啟動子可用於驅動***基因之表現。舉例而言，病毒啟動子包括但不限於CMV啟動子/增強子、SV40、乳突病毒、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)或彈性蛋白基因啟動子。在一些實施例中，用於控制關注基因之表現的控制元件可允許基因之調節表現，以使得產物僅於需要時在體內合成。若需要暫態表現，則組成性啟動子係較佳地用於非整合型及/或複製缺陷型載體中。或者，可誘導啟動子可用於當需要時驅動***基因之表現。可誘導啟動子包括但不限於與金屬硫蛋白及熱休克蛋白質有關之啟動子。
在引入外來DNA之後，可允許經工程化之細胞生長於濃化培養基中且隨後切換至選擇性培養基。外來DNA中之可選擇的標記賦予選擇抗性且允許細胞將例如質體上之外來DNA穩定地整合至其染色體中且生長以形成細胞群落(foci)，其轉而可經選殖且擴增成細胞系。此方法可有利地用於工程化表現基因產物之細胞系。
細胞可經基因工程化以「敲除(knock out)」或「剔除(knock down)」在植入位點處促進發炎或排斥之因子之表現。以下討論用於減少目標基因表現水準或目標基因產物活性水準之負調控技術。如本文中所使用之「負調控(negative modulation)」係指相對於目 標基因產物在調控處理不存在下之水準及/或活性，減少該目標基因產物之水準及/或活性。神經元或膠細胞之天然基因之表現可使用許多技術來減少或敲除，包括例如藉由使用同源重組技術使基因失活來抑制表現。一般而言，編碼蛋白質之重要區域之外顯子(或位在該區域5’側之外顯子)由陽性可選擇的標記(例如neo)中斷，而防止由目標基因生產正常mRNA且導致該基因之失活。基因亦可藉由產生基因之一部分之刪除、或藉由刪除整個基因來失活。藉由使用具有兩個與目標基因同源之區域且該兩個區域在基因體中相隔遙遠之建構體，可將在該兩個區域之間的序列刪除(Mombaerts等人，PNAS USA,1991,88：3084-3087)。反義、DNA酶、核糖核酸酶、小干擾RNA(siRNA)及抑制目標基因表現之其他此類分子亦可用於減少目標基因活性之水準。舉例而言，抑制主要組織相容性基因複合體(HLA)表現之反義RNA分子已顯示在免疫反應方面最為多樣化。此外，三螺旋分子可被用於減少目標基因活性之水準。這些技術係詳述於L.G.Davis等人(eds),1994,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第2版，Appleton & Lange,Norwalk,CT中。
在其他態樣中，本發明提供自產後幹細胞製備之細胞溶解產物及細胞可溶部分，產後細胞較佳PPDC、或包含PPDC之異質性或均質性細胞群、以及經基因改質或經刺激以沿著神經性路徑分化之PPDC或其族群。此類溶解產物及其部分具有許多用途。在體內使用細胞溶解產物可溶部分(亦即，實質上不含膜)例如允許將有益的細胞內環境(intracellular milieu)同種異體地用於患者，而不需引入最可能引發排斥、或其他不良免疫反應之可察覺量的細胞表面蛋白質。溶解細胞之方法為所屬技術領域中所熟知且包括機械破裂、酶破裂、或化學破裂、或其組合之各種手段。此類細胞溶解產物可由在生長培養基中之細胞直接製備，因此含有分泌的生長因子及其類似物，或可由經例如PBS或其他溶液清洗而不含培養基之細胞製備。經清洗之細胞可以大於原始族群密度之濃度再懸浮(若較佳)。
在一實施例中，全細胞溶解產物係例如藉由使細胞破裂而稍後不分離細胞部分來製備。在另一實施例中，藉由所屬技術領域中已知的常規方法，例如離心、過濾、或類似方法，將細胞膜部分與細胞之可溶部分分離。
由前驅細胞(諸如產後衍生細胞)群所製備之細胞溶解產物或細胞可溶部分可按原樣使用、經進一步濃縮例如藉由超濾或凍乾、或甚至乾燥後使用、經部分純化後使用、如所述技術領域中已知與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑組合使用、或與其他化合物諸如生物製品例如醫藥上可用的蛋白質組成物組合使用。細胞溶解產物或其部分可在體外或體內單獨使用，或例如與自體或同基因活細胞一起使用。溶解產物若經引入體內，可被引入局部治療位點、或引入遠端以提供例如需要的細胞生長因子給患者。
在進一步實施例中，產後細胞較佳PPDC可於體外培養以生產高產率之生物產物。舉例而言，此類細胞不論是天然生產受關注的特定生物產物(例如，營養因子)，或經基因工程化以生產生物產物，皆可使用本文所述之培養技術選殖擴增。或者，細胞可於誘導分化成所要譜系之培養基中擴增。在任一情況下，由細胞生產且分泌至培養基中之生物產物可使用標準分離技術容易地自條件培養基分離，例如，諸如差別蛋白質沉澱、離子交換層析、膠濾層析、電泳、及HPLC等不及備舉。可使用「生物反應器(bioreactor)」以利用流動法饋送例如體外三維培養物。基本上，在新鮮培養基通過三維培養物時，生物產物被洗出培養物且隨後可自流出物進行如上文所述之分離。
或者，關注的生物產物可保留於細胞內，因此其收集可能需要將細胞進行如上文所述之溶解。隨後可使用上文所列舉之技術中之任一或多者將生物產物純化。
在另一實施例中，藉由於液體、固體或半固體基材上培養產後細胞(較佳PPDC)所生產之細胞外基質(ECM)係經製備、收集且用作為植入活細胞至需要組織修復或置換之對象中之替代物。將 細胞體外培養於如本文其他地方所述之三維架構上，且培養條件將使得所要量之ECM分泌至架構上。將細胞及架構移除，且ECM係經處理以供進一步使用，例如作為可注射製劑。為實現此目的，將架構上之細胞殺死且將任何細胞碎屑自架構移除。此製程可以許多不同方式進行。舉例而言，可將活組織置於不加冷凍保存劑之液態氮中驟冷凍，或可將組織浸沒於無菌蒸餾水中以使得細胞因滲透壓爆裂。
一旦細胞被殺死，細胞膜可能破裂且細胞碎屑藉由用溫和清潔劑潤洗之處理來移除，諸如EDTA、CHAPS或兩性離子清潔劑。或者，組織可經酶消化及/或用破壞細胞膜且允許移除細胞內容物之試劑萃取。此類酶之實例包括但不限於玻尿酸酶、分散酶、蛋白酶、及核酸酶。清潔劑之實例包括非離子清潔劑，諸如，例如烷芳基聚醚醇(TRITON X-100)、辛苯氧基聚乙氧基乙醇(Rohm and Haas Philadelphia,Pa.)、BRIJ-35，聚乙氧基乙醇月桂醚(Atlas Chemical Co.,San Diego,Calif.)、聚山梨醇酯20(TWEEN 20)、聚乙氧基乙醇去水山梨醇單月桂酸酯(Rohm and Haas)、聚乙烯月桂醚(Rohm and Haas)；及離子清潔劑，諸如，例如十二烷基硫酸鈉、硫酸化高級脂族醇、於支鏈或非支鏈中含有7至22個碳原子之磺化烷烴及磺化烷基芳烴。
ECM之收集可以多種方式實現，其取決於例如新組織係形成於可生物降解或不可生物降解之三維架構上。舉例而言，若架構為不可生物降解者，則ECM可藉由使架構經歷超音波處理、高壓射水機、機械刮削、或用清潔劑或酶溫和處理、或以上之任何組合來移除。
若架構為可生物降解者，則ECM可例如藉由使架構降解或溶解於溶液中來收集。或者，若可生物降解架構係由其自身可與ECM一起注射之材料組成，則可將架構及ECM全部一起處理以用於稍後注射。或者，可藉由上文所述之用於自不可生物降解架構收集ECM之任何方法，將ECM自可生物降解架構移除。所有收集製程係經較佳地設計，以使ECM不致變性。
在收集ECM之後，可將其進一步處理。舉例而言，可使用所述技術領域中熟知的技術諸如超音波處理，將ECM均質化成微細粒子，以使得其可通過外科針。若需要，ECM之組分可藉由γ照射來交聯。較佳地，ECM可經0.25至2百萬雷得之間照射，以使ECM滅菌及交聯。使用具有毒性的劑諸如戊二醛之化學交聯係可能但通常不佳的。
蛋白質諸如存在於ECM中之各種類型之膠原蛋白之量及/或比率，可藉由將本發明之細胞所生產之ECM與一或多種其他細胞型之ECM混合來調整。此外，可將生物活性物質諸如蛋白質、生長因子及/或藥品併入至ECM中。例示性生物活性物質包括組織生長因子，諸如TGF-β，及類似物，其促進注射位點之癒合及組織修復。此類額外劑可用於上文所述之任何實施例中，例如與全細胞溶解產物、可溶細胞部分、或經進一步純化的由細胞所生產之組分及產物一起利用。
醫藥組成物
在另一態樣中，本發明提供醫藥組成物，其於多種用於治療眼變性病狀之方法中使用非胚胎幹細胞諸如產後細胞(較佳PPDC)、其細胞群、由此類細胞所生產之條件培養基、及由此類細胞所生產之細胞組分及產物。某些實施例涵蓋包含活細胞(例如，單獨PPDC或PPDC與其他細胞型混合)之醫藥組成物。其他實施例涵蓋包含PPDC條件培養基之醫藥組成物。其他實施例可使用PPDC之細胞組分(例如，細胞溶解產物、可溶細胞部分、ECM、或前述任一者之組分)或產物(例如，由細胞天然生產或經由基因改質所生產之營養因子及其他生物因子、培養該些細胞之條件培養基)。在任一情況下，醫藥組成物可進一步包含其他活性劑，諸如消炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑、生長因子、神經營養因子或所屬技術領域中已知的神經再生、神經保護或眼科藥品。
可添加至醫藥組成物之其他組分之實例包括但不限於：(1)其他神經保護或神經有益藥品；(2)選定之細胞外基質組分，諸如所屬技術領域中已知的一或多種類型的膠原蛋白、及/或生長因子、富血小板血漿、及藥品(或者，PPDC可經基因工程化以表現且生產生長因子)；(3)抗細胞凋亡劑(例如，紅血球生成素(EPO)、EPO模擬體(mimetibody)、血小板生成素(thrombopoietin)、類胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、肝細胞生長因子、凋亡蛋白酶抑制劑)；(4)消炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制劑、TGF-β抑制劑、斯他汀類(statins)、IL-6及IL-1抑制劑、PEMIROLAST、TRANILAST、REMICADE、SIROLIMUS、及非固醇類消炎藥品(NSAIDS)(諸如TEPOXALIN、TOLMETIN、及SUPROFEN))；(5)免疫抑制或免疫調節劑，諸如鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、mTOR抑制劑、抗增生劑、皮質類固醇及各種抗體；(6)抗氧化劑，諸如普洛布克(probucol)、維生素C與E、輔酶Q-10、麩胱甘肽、L-半胱胺酸及N-乙醯半胱胺酸；以及(6)局部麻醉劑等不及備舉。
本發明之醫藥組成物包含前驅細胞諸如產後細胞(較佳PPDC)、由該些細胞產生之條件培養基、或其組分或產物，其與醫藥上可接受之載劑或培養基調配。合適的醫藥上可接受之載劑包括水、鹽溶液(諸如林格氏液(Ringer’s solution))、醇、油、明膠、及碳水化合物(諸如乳糖、直鏈澱粉、或澱粉)、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、及聚乙烯吡咯啶。此類製劑可經滅菌，且若有需要與輔助劑諸如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、及著色劑混合。通常但不排他地，包含細胞組分或產物而非活細胞之醫藥組成物係經調配成液體。包含PPDC活細胞之醫藥組成物一般係經調配成液體、半固體(例如，凝膠)或固體(例如，基質、支架及類似物，以適用於眼科組織工程)。
醫藥組成物可包含醫藥化學家或生物學家所熟悉之輔助劑組分。舉例而言，其可含有在一定範圍內的抗氧化劑，該些範圍取決於所使用之抗氧化劑之種類而異。普遍使用的抗氧化劑之合理範圍 為約0.01重量/體積%至約0.15重量/體積%之EDTA、約0.01重量/體積%至約2.0重量/體積%之亞硫酸鈉、及約0.01重量/體積%至約2.0重量/體積%之偏亞硫酸氫鈉。所屬技術領域中具有通常知識者可使用約0.1重量/體積%之濃度的上述各者。其他代表性化合物包括巰基丙醯基甘胺酸、N-乙醯基半胱胺酸、β-巰基乙胺、麩胱甘肽及類似物質，但亦可採用合適於眼投予之其他抗氧化劑，例如抗壞血酸及其鹽或亞硫酸鹽或偏亞硫酸氫鈉。
可使用緩衝劑以將眼滴劑配方之pH維持在約4.0至約8.0之範圍內；以便使眼睛之刺激最小。至於直接玻璃體內或眼內注射，配方應在pH 7.2至7.5，較佳在pH 7.3至7.4。眼科組成物亦可包括適合用於向眼睛投予之張力劑。其中合適者為氯化鈉以使配方與0.9%鹽水溶液大致等滲。
在某些實施例中，醫藥組成物係與黏度增強劑一起調配。例示性劑為羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、及聚乙烯吡咯啶酮。若需要，醫藥組成物可添加共溶劑。合適的共溶劑可包括甘油、聚乙二醇(PEG)、聚山梨醇酯、丙二醇、及聚乙烯醇。亦可包括防腐劑，例如，氯化烷基二甲基苄基銨、氯化苯釷、氯丁醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、硫柳汞、對羥苄酸甲酯、或對羥苄酸丙酯。
用於注射之配方較佳經設計用於單次使用投予且不含有防腐劑。可注射溶液應具有等於0.9%氯化鈉溶液(290至300毫滲莫耳之滲透壓)之等滲度。此可藉由添加氯化鈉或如上文所列舉之其他共溶劑、或如上文所列舉之賦形劑諸如緩衝劑及抗氧化劑獲得。
眼前房之組織浸浴於前房液中，而視網膜係持續暴露於玻璃體。這些流體/凝膠以高度還原之氧化還原狀態存在，因為其含有抗氧化劑化合物及酶。因此，眼科組成物中包括還原劑可為有利的。合適的還原劑包括N-乙醯半胱胺酸、抗壞血酸或鹽形式、及亞硫酸鈉或偏亞硫酸氫鈉，其中抗壞血酸及/或N-乙醯半胱胺酸或麩胱甘肽尤其適合用於可注射溶液。
包含細胞或條件培養基、或細胞組分或細胞產物之醫藥組成物可以所屬技術領域中已知的數種遞送方式中之一或多者遞送至患者眼睛。在可適合用於一些情況中之一個實施例中，組成物以眼滴劑或洗眼劑之形式局部遞送至眼睛。在另一實施例中，組成物可經由週期性眼內注射或藉由輸注於灌洗溶液諸如BSS或BSS PLUS(Alcon USA,Fort Worth,Tex.)中遞送至眼睛內之各種位置。或者，組成物可以所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他眼科劑型施加，諸如預形成或原位形成之凝膠或脂質體，例如Herrero-Vanrell之美國專利第5,718,922號中所揭示。在另一實施例中，組成物可經由隱形眼鏡(例如Lidofilcon B,Bausch & Lomb CW79或DELTACON(Deltafilcon A))或其他暫時停留在眼睛表面上的物體遞送至或遞送通過需要治療之眼睛之水晶體。在其他實施例中，可採用諸如膠原蛋白角膜護罩(例如BIO-COR可溶性角膜護罩，Summit Technology,Watertown,Mass.)之支持物。組成物亦可藉由輸注至眼球中來投予，該輸注係經由滲透泵(ALZET,Alza Corp.,Palo Alto,Calif.)之套管或藉由植入定時釋放膠囊(OCCUSENT)或可生物降解盤(OCULEX,OCUSERT)之任一者進行。此等投予途徑具有向眼睛提供醫藥組成物之連續供應之優點。此可有利於角膜之局部遞送。
包含於半固體或固體載劑中之活細胞之醫藥組成物一般經調配用於外科植入眼損傷或痛苦之部位。應理解，液體組成物亦可藉由外科程序投予，例如條件培養基。在具體實施例中，半固體或固體醫藥組成物可包含半透性凝膠、格架(lattice)、細胞支架及類似物，其可為不可生物降解者或可生物降解者。舉例而言，在某些實施例中，使外源性細胞與其周圍環境隔絕，但仍使該些細胞得以分泌且遞送生物分子至周圍細胞可為合意的或適當的。在這些實施例中，細胞可經調配成包含活的PPDC或含PPDC之細胞群之自主性植入物(autonomous implant)，該等活的PPDC或含PPDC之細胞群係由不可降解、選擇性可滲透之阻障圍繞以物理性分離移植細胞與宿主組織。此類植入物有時稱為「免疫保護性(immunoprotective)」，因為其具有 防止免疫細胞及巨分子在醫藥誘導免疫抑制不存在下殺死移植細胞之能力(有關此類裝置及方法之綜述，參見例如P.A.Tresco等人，2000,Adv.Drug Delivery Rev.42：3-27)。
在其他實施例中，不同種類之可降解凝膠及網狀物(network)可用於本發明之醫藥組成物。舉例而言，尤其合適於持續釋放配方之可降解材料包括生物相容性聚合物，諸如聚(乳酸)、聚(乳-共-乙醇酸)、甲基纖維素、玻尿酸、膠原蛋白、及類似物。藥品遞送媒劑中可降解聚合物之結構、選擇、及用途已綜述於數個出版物中，包括A.Domb等人，1992,Polymers for Advanced Technologies 3：279-291。Wong等人之美國專利第5,869,079號揭示可生物降解持續釋放眼植入物中親水性與疏水性實體之組合。此外，Guo等人之美國專利第6,375,972號、Chen等人之美國專利第5,902,598號、Wong等人之美國專利第6,331,313號、Ogura等人之美國專利第5,707,643號、Weiner等人之美國專利第5,466,233號、及Avery等人之美國專利第6,251,090號各自描述了可用於遞送醫藥組成物的眼內植入裝置及系統。
在例如用於修復神經病灶諸如損傷或切斷之視神經之其他實施例中，遞送於可生物降解(較佳生物可再吸收或生物可吸收)支架或基質之上或之中的細胞可為合意的或適當的。這些一般三維生物材料含有附著至支架、分散於支架內、或併入包埋於支架中之細胞外基質中之活細胞。一旦植入至身體之目標區域中，這些植入物變得與宿主組織整合，其中移植細胞逐漸變得確立(參見例如P.A.Tresco等人，2000，見前文；亦參見D.W.Hutmacher,2001,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.12：107-174)。
可用於本發明中之支架或基質(有時統稱為「架構(framework)」)材料之實例包括非織物墊、多孔發泡體、或自組裝肽。非織物墊可例如使用包含乙醇酸及乳酸(PGA/PLA)之合成可吸收共聚物之纖維形成，其以商品名VICRYL(Ethicon,Inc.,Somerville,N.J)銷售。亦可利用由例如聚(ε-己內酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚 物所組成之發泡體，其藉由諸如冷凍乾燥、或凍乾之製程形成，如美國專利第6,355,699號中所討論。亦可使用諸如自組裝肽(例如，RAD16)之水凝膠。原位形成之可降解網狀物亦適合用於本發明(參見例如Anseth,K.S.等人，2002,J.Controlled Release 78：199-209；Wang,D.等人，2003,Biomaterials 24：3969-3980；He等人之美國專利公開案2002/0022676)。這些材料係經調配成適用於注射之流體，且隨後可藉由多種手段(例如，改變溫度、pH、暴露於光)誘導以原位或體內形成可降解水凝膠網狀物。
在另一實施例中，架構為毛氈(felt)，其可由自生物可吸收材料(例如，PGA、PLA、PCL共聚物或摻合物、或玻尿酸)製成之多絲纖維紗(multifilament yarn)組成。使用由捲曲、裁剪、分梳及針刺所組成之標準紡織加工技術將紗製成毛氈。在另一實施例中，細胞係經接種至可為複合結構之發泡體支架上。
在許多上文所提及之實施例中，可將架構模製成有用的形狀。此外應理解，可將PPDC培養於預形成、不可降解之外科或可植入裝置上，該培養方式為例如對應於用於製備例如含纖維母細胞GDC血管內線圈之方式(Marx,W.F.等人，2001,Am.J.Neuroradiol.22：323-333)。
在接種細胞之前，基質、支架或裝置可經處理以增強細胞附著。舉例而言，在接種之前，尼龍基質可用0.1莫耳乙酸處理且培養於聚離胺酸、PBS、及/或膠原蛋白中以塗布尼龍。聚苯乙烯可使用硫酸類似地處理。架構之外表面亦可經改質以改善細胞之附著或生長及組織之分化，諸如藉由血漿塗布架構或添加一或多種蛋白質(例如，膠原蛋白、彈性纖維、網狀纖維)、醣蛋白、醣胺聚醣(例如，硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白)、細胞基質及/或其他材料，諸如但不限於明膠、藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖、及植物膠等其他者。
含有活細胞之架構係根據所屬技術領域中已知的方法製備。舉例而言，細胞可自由生長於培養容器中至次長滿或長滿、自培 養物剝離(lifted)且接種至架構上。若需要，可在接種細胞之前、之期間、或之後，將生長因子添加至培養基以引發分化及組織形成。或者，架構本身可經改質以使得其上之細胞生長增強，或使得排斥植入物之風險減少。因此，可將一或多種生物活性化合物包括但不限於消炎劑、免疫抑制劑或生長因子添加至架構以用於局部釋放。
使用方法
前驅細胞諸如產後細胞(較佳hUTC或PDC)、或其細胞群、或由此類細胞所生產之條件培養基或其他組分或產物可以多種方式使用以支持且有利眼細胞及組織之修復及再生。此類用途涵蓋體外、離體及體內方法。以下所闡述之方法係關於PPDC，但其他前驅細胞亦可適用於該些方法中。
體外及離體方法
在一實施例中，前驅細胞諸如產後細胞(較佳hUTC或PDC)、及由其產生之條件培養基可於體外使用以篩選多種化合物之有效性及醫藥劑、生長因子、調節因子及類似物之細胞毒性。舉例而言，此類篩選可於實質上均質性PPDC族群上進行以評估欲與PPDC一起調配或共同投予以用於治療眼病症之候選化合物之效力或毒性。或者，出於評估新醫藥藥品候選者之效力之目的，此類篩選可於經刺激以分化成眼睛中所發現之細胞型之PPDC、或其前驅上進行。在此實施例中，PPDC係維持在體外並暴露於待測試之化合物。潛在細胞毒性化合物之活性可藉由其損傷或殺死培養物中之細胞的能力來量測。此可藉由活體染色技術容易地評估。
如上文所討論，PPDC可於體外培養以生產由細胞自然生產、或由細胞在經誘導以分化成其他譜系時所生產、或由細胞經由基因改質所生產之生物產物。舉例而言，發現TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC與IL-8皆分泌自生長於生長培養基中之臍衍生細胞。臍 衍生細胞亦分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、及血小板反應蛋白-4。發現TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、伊紅趨素(Eotaxin)、及IL-8皆分泌自培養於生長培養基中之胎盤衍生PPDC(參見實例)。
就此而言，本發明之實施例之特徵在於使用PPDC以生產條件培養基。自PPDC生產條件培養基可來自未分化之PPDC或來自在刺激分化之條件下培養之PPDC。此類條件培養基係經考慮用於例如上皮或神經前體細胞之體外或離體培養，或用於體內以支持包含PPDC之均質性族群或包含PPDC及其他前驅之異質性族群之移植細胞。
出於多種目的可使用PPDC之細胞溶解產物、可溶細胞部分或組分、或其ECM或組分。如上文所提及，此等組分中之一些可用於醫藥組成物中。在其他實施例中，細胞溶解產物或ECM係用於塗布或以其他方式處理欲用於外科、或用於植入、或用於離體目的之物質或裝置，以促進在此類治療程序中所接觸之細胞或組織之癒合或生存。
已證明當PPDC與成體神經前驅細胞共培養生長時，PPDC具有支持該等細胞生存、生長及分化之能力。因此，PPDC有利地用於體外共培養物中以提供營養支持給其他細胞，尤其神經細胞及神經和眼前驅(例如，神經幹細胞及視網膜或角膜上皮幹細胞)。至於共培養，將PPDC與所要其他細胞在兩種細胞型相接觸之條件下共培養可為合意的。此可例如藉由將細胞以異質性細胞群之形式接種於培養基中或接種至合適的培養基材上來達成。或者，首先可使PPDC生長至長滿，且隨後充當培養物中第二所要細胞型之基材。在此後者之實施例中，在共培養時期之後，可例如藉由膜或類似裝置將細胞進一步物理分離，以使得該其他細胞型可經移除且單獨使用。使用PPDC共培養以促進神經或眼細胞型之擴增及分化可具有在研究及臨床/治療領域中之適用性。舉例而言，可利用PPDC共培養以利培養物中之此類細胞之生長及分化，例如為了基礎研究目的或用於藥品篩選檢定。 PPDC共培養亦可用於神經或眼前驅之離體擴增，以供稍後投予用於治療目的。舉例而言，神經或眼前驅細胞可自個體收集、與PPDC共培養離體擴增、隨後返回至該個體(自體轉移)或另一個體(同基因或同種異體轉移)。在此等實施例中，應理解在離體擴增之後，可將包含PPDC及前驅之混合細胞群向需要治療之患者投予。或者，在自體轉移為適當的或合意的情況下，可將共培養細胞群在培養物中物理分離，使得能夠移除自體前驅以用於向患者投予。
體內方法
如實例中所闡述，前驅細胞(PPDC)、或由此類細胞產生之條件培養基可有效地用於治療眼變性病狀。一旦移植至眼睛中之目標位置中，前驅細胞或來自前驅細胞(諸如PPDC)之條件培養基原位提供營養支持給眼細胞，包括神經元細胞。
前驅細胞(PPDC)、或來自前驅細胞之條件培養基可與以下一起投予：其他有益的藥品、生物分子(諸如生長因子、營養因子)、條件培養基(來自前驅細胞或分化細胞培養物)、或其他活性劑(諸如消炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑、生長因子、神經營養因子或如所屬技術領域中已知的神經再生或神經保護藥品)。當條件培養基與其他藥劑投予時，其可以單一醫藥組成物之形式一起投予，或與其他劑同時或依次(在投予其他劑之前或之後)投予之分開醫藥組成物。
可與前驅細胞(諸如PPDC)及條件培養基產物一起投予之其他組分之實例包括但不限於：(1)其他神經保護或神經有益藥品；(2)選定之細胞外基質組分，諸如所屬技術領域中已知的一或多種類型的膠原蛋白、及/或生長因子、富血小板血漿、及藥品(或者，細胞可經基因工程化以表現且生產生長因子)；(3)抗細胞凋亡劑(例如，紅血球生成素(EPO)、EPO模擬體(mimetibody)、血小板生成素(thrombopoietin)、類胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、肝細胞生長因子、凋亡蛋白酶抑制劑)；(4)消炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制 劑、TGF-β抑制劑、斯他汀類(statins)、IL-6及IL-I抑制劑、PEMIROLAST、TRANILAST、REMICADE、SIROLIMUS、及非固醇類消炎藥品(NSAIDS)(諸如TEPOXALIN、TOLMETIN、及SUPROFEN))；(5)免疫抑制或免疫調節劑，諸如鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、mTOR抑制劑、抗增生劑、皮質類固醇及各種抗體；(6)抗氧化劑，諸如普洛布克(probucol)、維生素C與E、輔酶Q-10、麩胱甘肽、L-半胱胺酸及N-乙醯半胱胺酸；以及(6)局部麻醉劑等不及備舉。
液體或流體醫藥組成物可經投予至眼睛中更一般的位置(例如，局部地或眼內地)。
其他實施例涵蓋藉由投予醫藥組成物來治療眼變性病狀之方法，該些醫藥組成物包含來自前驅細胞(諸如PPDC)之條件培養基、或由該些細胞天然生產或經由細胞之基因改質生產之營養因子及其他生物因子。此外，這些方法可進一步包含投予其他活性劑，諸如生長因子、神經營養因子或如所屬技術領域中已知的神經再生或神經保護藥品。
用於投予來自前驅細胞(諸如PPDC)之條件培養基、或本文所述之任何其他醫藥組成物的劑型及方案係根據良好的醫療實踐發展，其考慮到個別患者之條件，例如，眼變性病狀之性質與程度、年齡、性別、體重及一般醫學病狀、及醫學從業者已知的其他因素。因此，欲向患者投予之醫藥組成物之有效量係藉由如所屬技術領域中已知的這些考量判定。
在開始細胞治療之前，以醫藥免疫抑制患者可為合意的或適當的。此可經由使用全身或局部免疫抑制劑來實現，或可藉由遞送於囊封裝置中之細胞來實現，如上文所述。這些及其他用於減少或消除對移植細胞之免疫反應之手段為所屬技術領域中已知的。替代地，條件培養基可自經基因改質以減少其免疫原性(immunogenicity)之PPDC製備，如上文所提及。
移植細胞於活體患者中之生存可經由使用多種掃描技術來判定，例如，電腦化斷層(CAT或CT)掃描、磁共振成像(MRI)或正電子發射斷層攝影(PET)掃描。判定移植之生存亦可藉由移除組織且目視或經由顯微鏡檢查該組織來進行事後分析。或者，細胞可用對神經或眼細胞或其產物(例如，神經傳遞物)具特異性之染色劑處理。移植細胞亦可藉由事先併入示蹤染料諸如玫瑰紅或螢光素標記微球、快藍(fast blue)、鐵微粒、雙苯甲醯胺或基因引入之報告基因產物，諸如β-半乳糖苷酶或β-葡萄醣醛酸酶來識別。
將移植細胞或條件培養基功能性整合至眼組織或對象中可藉由檢查受損或患病之眼功能的恢復來評估。舉例而言，治療黃斑變性或其他視網膜病變之有效性可藉由視敏度之改善、及評估立體眼底彩色照片之異常及分級來判定。(年齡相關性眼睛疾病研究調查小組，NEI,NIH,AREDS報告第8號，2001,Arch.Ophthalmol.119：1417-1436)。
縮寫
以下縮寫可出現於實例和說明書之其他地方及申請專利範圍中：ANG2(或Ang2)為血管生成素2；APC為抗原呈現細胞；BDNF為腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)；bFGF為鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)；bid(BID)為「一日兩次」(每天兩次)；CK18為細胞角蛋白(cytokeratin)18；CNS為中樞神經系統；CNTF為睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)；CXC配體3為趨化激素受體配體(chemokine receptor ligand)3；DMEM為達爾伯克(Dulbecco’s)最低必需培養基；DMEM：lg(或DMEM：Lg、DMEM：LG)為具有低葡萄糖之DMEM；EDTA為乙二胺四乙酸；EGF(或E)為表皮生長因子(epidermal growth factor)；FACS為螢光活化細胞分選(fluorescent activated cell sorting)；FBS為胎牛血清；FGF(或F)為纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor)；GBP為加巴噴丁(gabapentin)；GCP-2為 顆粒性細胞趨化蛋白質(granulocyte chemotactic protein)-2；GDNF為膠細胞衍生神經營養因子(glial cell-derived neurotrophic factor)；GFAP為膠細胞纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)；HB-EGF為肝素結合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor)；HCAEC為人類冠狀動脈內皮細胞(Human coronary artery endothelial cell)；HGF為肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor)；hMSC為人類間葉幹細胞(Human mesenchymal stem cell)；HNF-1α為肝細胞特異性轉錄因子(hepatocyte-specific transcription factor)；HVVEC為人類臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell)；I309為趨化激素及CCR8受體之配體；IGF-1為類胰島素生長因子(insulin-like growth factor)1；IL-6為介白素(interleukin)6；IL-8為介白素8；K19為角蛋白(keratin)19；K8為角蛋白8；KGF為角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor)；LIF為白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)；MBP為髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein)；MCP-1為單核細胞趨化蛋白質(monocyte chemotactic protein)1；MDC為巨噬細胞衍生趨化激素(macrophage-derived chemokine)；MIP1α為巨噬細胞發炎蛋白質(macrophage inflammatory protein)1α；MIP1β為巨噬細胞發炎蛋白質1β；MMP為基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)；MSC為間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)；NHDF為正常人類皮膚纖維母細胞(Normal Human Dermal Fibroblast)；NPE為神經前驅細胞擴增培養基(Neural Progenitor Expansion media)；NT3為神經營養蛋白(neurotrophin)3；04為寡樹突細胞(oligodendrocyte)或膠細胞分化標記(glial differentiation marker)04；PBMC為周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell)；PBS為磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline)；PDGF-CC為血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor)C；PDGF-DD為血小板衍生生長因子D；PDGFbb為血小板衍生生長因子bb；PO為「經口(per os)」(經由嘴巴)；PNS為周邊神經系統(peripheral nervous system)；Rantes(或RANTES)為調控活化、正 常T細胞表現與分泌(regulated on activation,normal T cell expressed and secreted)；rhGDF-5為重組人類生長及分化因子(recombinant human growth and differentiation factor)5；SC為皮下(subcutaneously)；SDF-1α為基質衍生因子(stromal-derived factor)1α；SHH為音蝟(sonic hedgehog)；SOP為標準作業程序；TARC為胸腺與活化調控趨化激素(thymus and activation-regulated chemokine)；TCP為組織培養塑膠(Tissue culture plastic)；TCPS為組織培養聚苯乙烯；TGFβ1為轉形生長因子(transforming growth factor)β1；TGFβ2為轉形生長因子(transforming growth factor)β2；TGF β-3為轉形生長因子β-3；TIMP1為基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase)1；TPO為血小板生成素(thrombopoietin)；TSP為血小板反應蛋白；TUJ1為BIII微管蛋白(tubulin)；VEGF為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor)；vWF為馮威里氏因子(von Willebrand factor)；及αFP為α-胎蛋白(fetoprotein)。
提供以下實例以更詳細描述本發明。該等實例意欲說明而非限制本發明。
鑒於以下列非限制實例可進一步了解本發明。
實例1 恢復視覺功能
hUTC的視網膜下移植(在出生後第21天投予)恢復RCS大鼠中的視覺功能(Lund等人，Stem Cells,2007；25；602-611)。得到hUTC移植的治療效果而沒有將移植細胞轉分化為視網膜神經元。研究了視覺功能恢復期間之hUTC治療的效果。
材料和方法
hUTC製備：如於以下實例5至11以及美國專利第7,524,489號、第7,510,873號、及第9,579,351號中所述分離並凍存 hUTC，該等專利各自以引用方式併入本文中。經凍存之hUTC(約31.3次族群倍增；2×106活細胞/mL)係用於本實例中。在注射的每一天，將冷凍細胞(2至3小瓶)在37℃的水浴中解凍約2分鐘。解凍後，將細胞轉移至含有8mL平衡鹽水溶液(BSS)無菌灌洗溶液(Alcon,Fort Worth,TX)的單一15mL錐形管中。將額外1mL的BSS添加至冷凍小瓶中，隨後將潤洗液轉移至15mL錐形管中。將細胞在室溫下以250×g離心5分鐘。將上清液移除，並將團塊再懸浮於5mL的BSS中。使用C-Chip Neubauer Improved Disposable Hemocytometer(IN CYTO,Chungnam-do,Korea)將細胞計數以判定活細胞的總數。隨後將剩餘的細胞以250×g離心5分鐘。將上清液移除，並將細胞再懸浮於BSS中至約10,000個細胞/μL的最終濃度。將各細胞懸浮液從錐形管轉移至Eppendorf管並置於冰上。記錄細胞置於冰上的時間。此時間是用來設定兩小時窗口以完成視網膜下注射。
用於細胞移植的動物：將經著色之雌性及雄性失養性RCS大鼠(P21至P22、P60)用於研究。年齡匹配的Long Evans(LE)大鼠作為對照。將動物分成6個研究組，每組6隻研究動物(表1)。程序係根據對於在眼科和視力研究中動物之使用的聲明(Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research,ARVO®)執行，並由Cedars-Sinai醫學中心之比較醫學部門的動物照護和使用委員會核准。
視網膜下注射：在P21至P22(第3組及第4組)及P60(第5組)在RCS大鼠中執行視網膜下注射。第6組動物在同一隻眼睛中接受2次注射。第一次注射在P21投予，且第二次注射在P60投予。所有注射均在右眼執行。左眼沒有處理。用稀釋於抑菌的0.9% NaCl(Hospira Inc.,Lake Forest,IL)中之75mg/kg Zetamine(VetOne,Boise,ID)及0.25mg/kg右美托咪啶(dexmedetomidine)(Zoetis,Florham Park,NJ)將動物腹膜內(i.p.)麻醉。用1%托吡卡胺(tropicamide)眼用溶液USP(Bausch and Lomb,Bridgewater,NJ)及接著2.5%鹽酸去氧腎上腺素(phenylephrine hydrochloride)眼用溶液(Paragon BioTek,Inc.,Portland,OR)散瞳。使用非可吸收縫線(4-0)(Ethicon,Inc.,Somerville,NJ)使眼睛穩定。將縫線放置在眼球赤道後方以將眼球向前拉並讓眼睛的背顳(dorsal-temporal)部分暴露。
為了清楚地觀察眼底，將Gonak(Hub Pharmaceuticals,LLC,Rancho Cucamonga,CA)置於全眼球的角膜上。隨後在眼瞼上放置塑膠環以保持Gonak的位置。使用剪刀剪去結膜，並使用30 ½ G金屬針在眼睛的上顳區進行鞏膜切開術。經由填充有BSS的塑膠管將兩μL細胞懸浮液吸入無菌玻璃吸量管(內徑50至150μm)中，所述塑膠管係附接至25μL Hamilton注射器。為了降低眼內壓及限制細胞外流，使用30 ½ G金屬針刺穿角膜。通過鞏膜切開術的部位注射細胞或BSS(2μL，體積)。注射後立即針對視網膜損傷或血管窘迫跡象檢查眼底。用非可吸收的手術縫線(10-0)(Ethicon,Inc.)縫合傷口。移除眼球周圍的縫線，然後將眼瞼放至其正常位置中。最後，局部使用0.5%紅黴素眼膏(Bausch & Lomb,Bridgewater,NJ)。i.p.給予大鼠1mg/kg的阿替美唑(atipamezole)(Orion Corporation,Espoo,Finland)以逆轉右美托咪啶的效果。使動物在溫墊(37℃)上從麻醉狀態恢復，之後將他們放回其繫留室。接受hUTC及BSS注射的動物在視網膜下手術後每日接受***(dexamethasone)(Fresenius Kabi USA,Lake Zurich,IL)注射(1.6mg/kg,i.p.)持續2週。此外，這些動物在整個實 驗過程中在其飲用水中接受環孢素-A(Teva Pharmaceuticals USA,North Wales,PA)(210mg/L)。
視覺功能評估：如前所述，使用視動測試設備(Cerebral Mechanics Inc.,Lethbridge,AB,Canada)在不同的預定時間點(P30/31、P60及P88至P93)測試所有動物的空間視敏度。視動反應(OKR)允許非侵入性粗視測量視敏度，其隨反射性影像穩定而變動。
如前所述，在P90至P95對來自各組的3隻動物執行亮度閾(LT)記錄。從經處理及未處理之眼睛進行記錄。簡言之，將動物麻醉並在上丘(SC)上方做出小的皮膚切口，並使15至20個開口鑽穿過SC背側投影之區域上方的顱骨。將經玻璃塗佈之鎢微電極(電阻：0.5MΩ；帶通500Hz至5KHz)通過開口引入SC中。使用中性密度濾光片(最小步長為0.1對數單位)在5.2對數單位的基線級別上改變5°點的亮度，直到獲得背景活性之兩倍的反應：這被定義為該點在視野的閾值級別。從各個SC記錄了總共15個位置。數據係以具有低於所定義之級別的LT之SC面積的百分比圖表示。
用於免疫組織化學的視網膜製備：在視覺功能評估之後，收集來自LE和RCS大鼠的視網膜。在P94至P96，藉由CO2窒息、接著兩側氣胸終結動物。將眼睛移除並浸入2%多聚甲醛中一小時，且隨後用10、20及30%蔗糖浸潤。使眼睛於各溶液中在室溫下維持一小時，然後轉移至30%蔗糖中4℃整夜。將眼睛包埋在OCT(冷凍組織基質)中並在低溫恆溫器上依次切割(相隔10gm水平切片)。將每個第六切片放置在與第一切片相同的玻片上，且每片玻片共收集四個切片(相隔50pm)。總共切割40至50片玻片/眼睛。
針對發育期間的免疫組織化學(IHC)分析，藉由以補充有7.5μM肝素之Tris緩衝鹽水(TBS，25mM Tris鹼、135mM NaCI、3mM KCI，pH 7.6)、然後以於TBS中之4%多聚甲醛(PFA；Electron Microscopy Sciences,PA)進行心內灌注，收集年齡匹配的LE和RCS視網膜(P14、P21及P30)。將眼睛摘出 (enucleate)，並藉由在角膜中做出切口來移除水晶體。在室溫下用4%的於TBS中之PFA將眼杯固定2小時。用30%於TBS中之蔗糖將眼杯冷凍保護整夜，然後包埋在O.C.T.(Tissue-Tek,Sakura,Japan)化合物中並冷凍。
TUNEL檢定：為了偵測變性光受體，根據製造商的規程，藉由末端去氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記(TUNEL，原位細胞死亡偵測套組(In Situ Cell Death Detection Kit)，Roche)染色來偵測凋亡細胞。簡言之，用PBS清洗冰凍切片(10至12μm)之視網膜30分鐘，並在冰上在0.1% Triton X-100中透化2分鐘。將玻片用PBS清洗兩次，接著與TUNEL反應混合物在黑暗中於37℃下培養6分鐘。將玻片用PBS清洗三次，並將其固定於具有DAPI之Vectashield(Vector Laboratories)中。在Leica SP5共焦雷射掃描顯微鏡上獲取TUNEL陽性細胞的影像。
統計分析：定量數據的統計分析係使用Student氏t檢驗及單因子變異數分析(ANOVA)執行，如果適用的話，接著執行事後檢驗(杜凱氏HSD)。針對亮度閾分析，執行用於變異數同質性的Levene檢驗，以確認不同組的變異數是相同的。將JMP Genomics Pro 13.0軟體(SAS,Cary,NC)用於數據的所有統計分析。所有數據均以平均值±SEM表示；顯著性係以* p<0.05展示。
結果
藉由視網膜下hUTC移植恢復視覺功能取決於細胞投予的時間。在RCS大鼠中研究了在兩個不同時間點P21和P60之hUTC注射的功效。在P21(G3)、P60(G5)或P21與P60(G6)將hUTC視網膜下注射到RCS大鼠的右眼(圖1A)。左眼沒有接受處理。以未接受處理之年齡匹配的Long Evans(LE；G1)及RCS(G2)大鼠及接受媒劑之RCS大鼠(G4)作為對照(圖1A)。藉由測量在P30、P60及P90的視動反射(OKR)，然後藉由在P95的亮度閾反應(LTR)測試來評估視覺功能。在亮度測試之後，收集視網膜以用於IHC分析。
視動反射測試沒有顯露6個研究組之中在P30或P60的視覺功能有任何顯著差異；然而，在P90前，未處理之RCS大鼠(G2)、媒劑注射組(G4)及在P60以細胞處理的那些RCS大鼠(G5)顯示顯著的視覺損失。在P21接受一次視網膜下hUTC移植的RCS大鼠(G3)、或在P21及P60接受兩次視網膜下hUTC移植的RCS大鼠(G6)顯示等同於健康LE大鼠的視動反應(圖1C、圖1D)。來自所有RCS動物的左眼(未處理)沒有顯示視覺功能的任何改善(圖1B)。
為了評估hUTC移植對視網膜突觸功能的影響，測量了從視網膜接收直接突觸輸入的上丘之電生理活性。如前所述進行亮度閾記錄(Girman等人，2005)。LTR結果展示，在幾乎所有測試的光刺激範圍內，G6(在P21+P60注射)的視網膜具有比G3(在P21單次注射)更高程度的光反應性。而且，G3在亮度強度的小範圍內顯示出比G4(媒劑對照)更高的光敏度(圖1E)。在顯著的光受體細胞損失之前之hUTC移植對於治療效果至關重要，並且藉由hUTC的重複遞送增強治療效果。
此外，hUTC處理預防光受體細胞凋亡並延緩外核層(ONL)變性。RCS大鼠中的進行性光受體損失已經以早在P22偵測到的光受體損失來表徵(Dowling和Sidman，1962)，且以在P20偵測到的少量TUNEL陽性細胞及在P25前明顯的TUNEL陽性染色來表徵(Tso等人，1994)。從P14(開眼後不久)到變性過程晚期(P90)的未處理之動物收集RCS和LE視網膜。在P21，在RCS大鼠中觀察到偶發的凋亡光受體細胞核，但此時視網膜厚度與對照大鼠沒有顯著區別，但在P30是明顯的(圖2A至圖2D)。在P21之hUTC的視網膜下投予延遲光受體損失，如藉由與P95的媒劑對照相比顯著增加的ONL厚度所展示(圖2E至圖F)。在P21及P60的投予保留光受體(圖2F)。值得注意的是，對照RCS大鼠中許多剩餘的光受體是TUNEL陽性的；然而，hUTC移植顯著地降低了TUNEL陽性光受體的數目及密度兩者，且hUTC的重複投予進一步增強了保護效果(圖2G)。在光受體喪失之前或RCS之P21之前的hUTC遞送對於保留或 恢復視覺功能的治療效果至關重要，並且藉由hUTC的重複投予增強了保護效果。
實例2 對RCS大鼠視網膜中之突觸發育的影響 材料和方法
實例1中描述用於hUTC製備、用於細胞移植的動物、視網膜下注射、視覺功能評估、以及用於免疫組織化學的視網膜製備的程序。
藉由免疫細胞化學識別突觸：將視網膜切片清洗三次，然後在具有0.4% Triton-X 100的PBS(PBST；Roche,Switzerland)中在室溫下透化。在室溫下，將切片在於磷酸鹽緩衝鹽水-Triton(PBST)中之5%正常山羊血清(NGS)或牛血清白蛋白(BSA)中阻斷1小時。使一級抗體(小鼠抗Bassoon 1：500[RRID：AB_10618753，ADI-VAM-PS003-F，Enzo,NY]、兔抗mGluR6 1：150[RRID：不適用(n/a)，RA13105，Neuromics,MN]、天竺鼠抗VGlutl 1：750[AB5905，Millipore,MA]、兔抗PSD95 1：500[RRID：AB_87705，51-6900，Invitrogen,CA]、小鼠抗Gephyrin 1：250[RRID：AB_1279448，147-021，Synaptic Systems,Goettingen,Germany]、山羊抗TSP1 1：200[RRID：AB_2201958，AF3074，R and D Systems,MN]、山羊抗TSP2 1：200[RRID：AB_2202068，AF1635，R and D Systems]、小鼠抗麩醯胺酸合成酶1：1,000[RRID：AB_397879，610517，BD Biosciences,CA]、兔抗SOX9 1：4,000[RRID：AB_2239761，AB5535，Millipore]、山羊抗膽鹼乙醯轉移酶[RRID：AB_11214092，AB144P，Millipore]、兔抗α2δ-1[RRID：AB_258885，C5105，Sigma])、兔抗α2δ-1[RRID：AB_2039785，ACC-015，Alomone lab,Israel]、及兔抗GFAP[RRID：AB_10013382，Z033429-2，Dako]於含PBST的5% NGS或5% BSA中稀釋。將切片用一級抗體在4℃培養整夜。針對TSP染 色，如先前所述(Huang等人，2013)，將一級抗體在4℃下培養48小時。在室溫下經2小時添加二級Alexa-螢光團共軛抗體(Invitrogen)(1：200在具有5% NGS或5% BSA的PBST中)。將玻片固定於具有DAPI之Vectashield(Vector Laboratories,CA)中，並在Leica SP5和SP8共焦雷射掃描顯微鏡上獲取影像。
突觸的定量(突觸分析)：將每個年齡的LE或RCS之3至4隻動物用於突觸分析。將處理(第1組至第6組)或年齡(P14、P21及P30)中之各組的三個獨立視網膜切片用於免疫組織化學。每切片在63x放大率下獲得5μm厚的共焦z堆疊。從原始的5μm z堆疊產生1μm深度的五個連續最大投影。使用針對NIH影像處理包Image J的客製化插件Puncta分析器分析所產生之1μm影像的共定位突觸點(puncta)。藉由突觸前點及突觸後點的共定位判定突觸。突觸密度(每擷取面積的突觸數目)由共定位的突觸點數目除以由Image J.測量的總面積(μm2)來判定。
統計分析：定量數據的統計分析係使用Student氏t檢驗及單因子變異數分析(ANOVA)執行，如果適用的話，接著執行事後檢驗(杜凱氏HSD)。將JMP Genomics Pro 13.0軟體(SAS,Cary,NC)用於數據的所有統計分析。所有數據均以平均值±SEM表示，且顯著性係以* p<0.05展示。
結果
為了表徵RCS視網膜的突觸發育、以及在P21之hUTC注射的時間時RCS大鼠中是否失去視網膜神經元，對在P14、P21及P30的RCS大鼠中形成之突觸數目相較與年齡匹配的野生型LE對照進行定量分析。視網膜的各細胞層係由神經元組成，該等神經元通過位於外叢狀層及內叢狀層(分別為OPL及IPL)內的突觸接觸而彼此硬體布線(hardwired)(圖3A)。為了判定形成在這些層中的突觸數目，藉由突觸前(綠色)及突觸後(紅色，興奮性；藍色，抑制性)標記的共定位而將突觸可視化，此係使用前述方法(Ippolito,J Vis Exp.,2010；45：2270)。在OPL中，藉由一對突觸前及突觸後蛋白(分別為Bassoon(綠色)及mGluR6(紅色))的共定位來評估緞帶突觸的數目(圖3B)。結果展示，與年齡匹配的LE對照相比，在所有檢測時間點，RCS大鼠視網膜中的OPL緞帶突觸之數目顯著降低(圖3C)。LE對照中的緞帶突觸在P14與P30之間持續發育；然而，RCS大鼠在所有檢測時間點均顯示出較差的突觸發育。
從光受體發射的視覺信號藉由雙極細胞進行突觸後傳遞，然後雙極細胞向在具有視網膜神經節細胞的IPL層中形成的突觸提供突觸前信號(圖3A)。為了判定OPL及IPL的突觸發育是否為同步調節，使用VGluT1(突觸前，綠色)及PSD95(突觸後，紅色)分析並比較LE與RCS大鼠之間的IPL中之緞帶突觸(圖3D)。結果展示RCS大鼠中的IPL緞帶突觸發育亦受損(圖3E)。LE視網膜展示在P14至P21之間形成的突觸數目急劇增加，而RCS大鼠在同一時間段期間未能形成突觸(圖3E)。為了確認RCS大鼠中之突觸發育的缺陷，將興奮性突觸前及抑制性突觸前兩者染色的突觸前標記Bassoon之抗體與用於興奮性(PSD95)或抑制性(Gephyrin)特異性突觸後標記的抗體組合(圖3F)。結果展示，在P14時，LE與RCS大鼠之間的興奮性或抑制性突觸的數目沒有顯著差異(圖3G至圖3H)。在P21時，RCS大鼠中的興奮性突觸急劇減少，而抑制性突觸的數目與LE對照相當(圖3G、圖3H)。在P30前，相較於LE對照，在RCS大鼠中觀察到顯著較少的興奮性及抑制性突觸。(圖3G至圖3H)。
IPL係由兩個亞層(給光型及撤光型)組成(圖4A)。定量在這些層中在P21形成的給光型突觸及撤光型突觸的數目，以評估IPL中的任何層特異性發育缺陷。結果展示受損的興奮性突觸發育同步發生於給光型層及撤光型層兩者中。(圖4B及圖4D)；然而，在任一亞層中之抑制性突觸的數目都沒有顯著差異(圖4C及圖4E)，這與從整個IPL獲得的結果相平行(圖3H)。
RCS視網膜的興奮性突觸發育在P21前受損，在顯著的光受體損失發生之前。在突觸層OPL和IPL兩者中都發現了突觸發育缺陷。
藉由使用新鮮冷凍切片、將米勒神經膠質細胞的細胞突(麩醯胺酸合成酶(GS)，綠色)及細胞核(SRY-盒9，SOX9，紅色，圖5A)免疫染色，檢測米勒神經膠質細胞的形態變化。米勒神經膠質細胞向突觸層分枝出細突，以與突觸相互作用並調節突觸連接(圖5A)。在早期發育期間，在突觸層中藉由麩醯胺酸合成酶展示的米勒神經膠質細胞突在LE大鼠中變得更加分枝化，而在RCS大鼠中的分枝化則受損(圖5B至圖5D)。
在P21進一步定量分析米勒神經膠質細胞突。藉由定量突觸層中由GS陽性染色所覆蓋的面積(%)來評估米勒神經膠質細胞突的分枝化。這些結果展示在RCS大鼠中的OPL(圖5E)及IPL(圖5F)兩者中，米勒神經膠質細胞突的面積覆蓋率顯著降低。另外，與非失養性動物相比，SOX9陽性米勒神經膠質細胞的數目增加(圖5G)。結果顯示，在突觸發育期期間，早於光受體損失，RCS大鼠中的米勒神經膠質細胞具反應性，並且米勒神經膠質細胞反應性變化與突觸發育受損平行發生。
實例3 在RCS大鼠中由米勒神經膠質細胞產生的突觸新生因子的影響
此實例研究RCS大鼠視網膜中藉由米勒神經膠質細胞介導的突觸新生傳訊。神經膠細胞分泌的血小板反應蛋白(TSP)家族蛋白在腦中的興奮性突觸形成中起作用(Christopherson等人，Cell,2005；120：421-433)，並且之前已經報導了藉由體外培養之米勒神經膠質細胞分泌TSP-1。
材料和方法
實例1中描述用於hUTC製備、用於細胞移植的動物、 視網膜下注射、視覺功能評估、以及用於免疫組織化學的視網膜製備的程序，且實例2中描述用於識別及定量突觸的程序。
RNA螢光原位雜交(FISH)：靶向Thbs1或Thbs2的一組FISH探針係購自Stellaris(LGC Biosearch Technologies,CA)。各探針組由48個寡核苷酸(各20個核苷酸)組成，其選擇性地結合至TSP1(Thbs I)或TSP2(Thbs2)的轉錄物。將探針組用螢光染料CAL Fluor® Red 610或Quasar® 670分別針對Thbs1或Thbs2標記。簡言之，將10μm視網膜切片用4% PFA固定15分鐘，並用含有RNAse抑制劑(Invitrogen)的PBS清洗兩次。在室溫下將切片用乙醇透化2小時。在用PBS清洗及再水合後，將切片依序以一級(小鼠抗GS，1：200)及二級(抗小鼠-IgG Alexa Fluor 488，1：200)抗體在室溫下培養一小時，並在步驟間用PBS清洗。免疫染色後，將切片在室溫下用4% PFA後固定15分鐘，接著用PBS清洗。然後，按照製造商推薦的規程執行RNA FISH。
統計分析：定量數據的統計分析係使用Student氏t檢驗及單因子變異數分析(ANOVA)執行，如果適用的話，接著執行事後檢驗(杜凱氏HSD)。將JMP Genomics Pro 13.0軟體(SAS,Cary,NC)用於數據的所有統計分析。所有數據均以平均值±SEM表示，且顯著性係以* p<0.05展示。
結果
使用IHC及RNA-螢光原位雜交(RNA-FISH)的組合方法來定位轉譯TSP的mRNA。結果展示在MG細胞體所在的INL中，Thbs1及Thbs2兩者的mRNA均定位於GS陽性細胞體的細胞質中(圖6I)。結果亦展示在MG突內，mRNA在OPL中高度富集(圖6J)。
為了判定RCS大鼠視網膜中TSP傳訊是否受到影響，將視網膜切片針對TSP1或TSP2進行免疫染色，並檢測早期發育期間之彼等的表現(圖6A至圖6H)。結果展示TSP1及TSP2兩者從P14 到P30都受到發育性調節。在這些時間，整個LR視網膜都可偵測到TSP1及TSP2。(圖6A至圖6B及圖6E至圖6F，左圖)。相反地，RCS大鼠始終展現出降低級別的TSP1及TSP2(圖6A至圖6H)。RCS大鼠中TSP1及TSP2的受損上調與米勒神經膠質細胞中的反應性變化相對應。
發現在P14之TSP1的最高濃度定位於OPL及IPL(圖6C)。在P30，TSP染色顯示偏移，其中在IPL的表現最高(圖6D)。在P14，TSP1表現在OPL處最顯著，然後在P30前逐漸減少。另一方面，在此發育期期間，TSP1定位往IPL增強(圖6D)。此外，在P30，TSP1定位對於兩層IPL更具特異性(圖6D)。與TSP1不同，TSP2在P14及P30的表現強烈定位至OPL(圖6G至圖6H)。
這些結果證明米勒神經膠質細胞在視網膜中產生TSP。TSP mRNA似乎在突觸區被局部運輸及轉譯以被分泌到突觸位點。結果顯示在RCS大鼠中由米勒神經膠質細胞提供的突觸新生傳訊受損，導致由於突觸發育期間之米勒神經膠質細胞的反應性變化而引起突觸發育缺陷。
TSP與其突觸新生受體、鈣通道次單元α2δ-1相互作用以促進興奮性突觸形成(Eroglu等人，Cell,2009；139：380-392)。因此，α2δ-1在視網膜中的表現對於TSP介導之突觸新生是必需的。為了判定α2δ-1是否在視網膜中表現，使用針對α2δ-1的抗體來檢查健康LE大鼠中的表現模式。結果展示在P14與P30之間的整個早期發育中，α2δ-1的表現急劇增加(圖7A至圖7B，左圖)。α2δ-1上調的時間對應於在相同時間段期間增加的TSP表現。另外，α2δ-1亦強烈地往TSP富集的OPL及IPL定位(圖7B，左圖)。相反地，與年齡匹配的LE對照相比，RCS大鼠展示α2δ-1的表現減少(圖7A至圖7B，右圖)。LE與RCS大鼠之間的染色強度分析進一步證實了在兩個突觸層中α2δ-1的富集以及在RCS大鼠中α2δ-1的下調(圖7C至圖7D)。如所示，TSP受體a2δ-1在視網膜中突觸表現。
此外，α2δ-1突觸在RCS大鼠中減少。將組織切片用與突觸前(Bassoon，綠色)及突觸後(N-甲基-D-天門冬胺酸受體次單元1，NR1)標記聯合之針對α2δ1的抗體染色，以判定在突觸末端是否存在α2δ-1。結果展示α2δ-1在突觸後末端的子集上表現，如在視網膜的OPL及IPL兩者中與NR1的共定位所顯示(圖7E至圖7F)。在IPL中的緞帶突觸上亦發現含有突觸後α2δ-1的突觸，如藉由α2δ1與VGluT1的共定位所示(圖7G)。在P21 RCS大鼠中分析Bassoon/α2δ-1突觸，以判定在視網膜變性之前TSP反應性之含有α2δ-1的突觸是否亦受到影響。染色分析展示含有α2δ-1的突觸在OPL及IPL兩者中都減少(圖7H至圖7K)。
實例4 hUTC在視網膜變性中保留突觸發育的效果
在此實例中，研究了hUTC的視網膜下注射對於恢復RCS大鼠中受損的突觸連接之效果。
材料和方法
實例1中描述用於hUTC製備、用於細胞移植的動物、視網膜下注射、視覺功能評估、用於免疫組織化學的視網膜製備、以及免疫組織化學的程序。實例2中描述用於識別及定量突觸的方法。
結果
定量在P95 LE大鼠(健康對照)中、在用BSS視網膜下處理(P21)的RCS大鼠中、或在用hUTC視網膜下處理(P21或P21 & P60)的RCS大鼠中之OPL緞帶突觸的數目。用針對突觸前標記Bassoon(綠色)及突觸後標記mGluR6(紅色)的抗體對視網膜切片進行染色(圖8A)。結果展示，在hUTC視網膜下投予後，保留了RCS大鼠中的OPL緞帶突觸。在接受一次(P21)或兩次(P21+P60)注射的動物之間，緞帶突觸的增加數目沒有顯著區別(圖8D)。藉由 Bassoon(突觸前)及α2δ-1(突觸後)的共定位而可視化的TSP反應性突觸在接受2次注射(P21+P60)的大鼠中被特異性地救援(圖8B及圖8E)。此外，接受2次劑量(P21+P60)hUTC的大鼠顯示增強的突觸前功能，如由增加的VGluT1表現所示(圖8C及圖8F)。
在IPL中，藉由Bassoon(突觸前，綠色)與PSD95(突觸後，紅色，興奮性)或Gephyrin(突觸後，藍色，抑制性)的共定位來檢測興奮性突觸及抑制性突觸兩者(圖9A)。儘管用單次注射hUTC(P21)處理的大鼠顯示出興奮性突觸的數目減少，但媒劑對照組及hUTC雙重注射組在形成之興奮性突觸的數目方面沒有顯著區別(圖9B)。此外，媒劑對照RCS大鼠與健康對照(LE)之間的興奮性突觸的數目沒有顯著區別，然而，與LE對照相比，用2次劑量hUTC處理的大鼠具有顯著更少數目的興奮性突觸(圖9B)。與健康對照(LE)相比，所有RCS動物具有的抑制性突觸數目均減少，無論處理為何。接受媒劑或2次劑量hUTC(P21+P60)的大鼠具有相似數目的抑制性突觸，而接受單次注射的大鼠具有較少的抑制性突觸(圖9C)。在hUTC的2次視網膜下劑量(P21+P60)後，含有突觸後α2δ-1的TSP反應性突觸增加(圖9D至圖9E)。進一步分析展示這些恢復的α2δ-1突觸不是緞帶突觸(VGluT1/PSD95)(圖9F)。
這些結果顯示RCS大鼠中的hUTC移植增強突觸連接。重複的hUTC注射在OPL及IPL兩者中都特異性地促進了TSP反應性之含有α2δ-1的突觸之形成。RCS大鼠顯示米勒神經膠質細胞反應性，其在早期發育期間導致TSP傳訊減少及含有α2δ-1的突觸損失(圖5A至圖7K)。
hUTC移植亦減弱反應性並保留米勒神經膠質細胞形態。藉由針對GS及SOX9之免疫染色將米勒神經膠質細胞可視化(圖10A)。相較於用媒劑(BSS)處理者，接受2次hUTC(P21&P60)注射的RCS大鼠展示出顯著改善的MG結構及GS表現(圖10A)。雙重注射組(P21 & P60)中的外限界膜(OLM，白色箭頭)維持其緊密閉合的結構，其與健康對照(LE)相當，而媒劑對照組的OLM顯示異 常延伸及開放的結構(圖10A)。麩醯胺酸合成酶在hUTC處理組(P21 & P60)中亦上調，而在媒劑處理對照中，特別是在突觸層內的麩醯胺酸合成酶表現減少(圖10B至圖10C)。另外，相較於媒劑對照及健康對照兩者，hUTC處理組含有較少數目的SOX9陽性米勒神經膠質細胞體(圖10D)。使用反應性膠質標記膠質纖維酸性蛋白(GFAP)來確認RCS大鼠中的反應性變化(圖10F)。在健康對照大鼠(LE)中，GFAP表現最小並且僅在GCL中發現，而媒劑處理的RCS大鼠(BSS)顯示在整個視網膜層中沿著主要米勒神經膠質細胞突的GFAP染色增加(圖10F)。如藉由減少的GFAP染色連同維持的GS表現所示，hUTC移植防止了RCS大鼠中的反應性米勒神經膠質細胞變化(圖10F)。這些數據證明hUTC移植減弱米勒神經膠質細胞之反應性神經膠變性。
實例5 自產後組織衍生細胞
此實例描述自胎盤及臍帶組織製備產後衍生細胞。在足月或不足月生產後獲得產後臍帶及胎盤。細胞係收集自五位不同捐贈者之臍帶及胎盤組織。測試不同的細胞分離方法產出具有以下潛能之細胞的能力：1)分化成具有不同表型之細胞的潛能；或2)提供可用於其他細胞及組織之營養因子之潛能。
方法及材料
臍細胞分離：臍帶係獲自國家疾病研究交換中心(NDRI,Philadelphia,Pa.)。組織係在正常分娩後獲得。細胞分離規程係在層流櫃(laminar flow hood)中無菌執行。為了移除血液及碎屑，將臍帶在磷酸鹽緩衝液(PBS；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中於抗黴劑及抗生素(100單位/毫升的青黴素、100微克/毫升的鏈黴素、0.25微克/毫升的兩性黴素B)存在下來清洗。接著在150cm2組織培養盤上並且於50毫升的培養基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen) 存在下機械解離組織，直到將組織切碎為細泥。將切碎的組織轉移至50毫升錐形管(每管約5公克的組織)。
隨後將組織於DMEM-低葡萄糖培養基或DMEM-高葡萄糖培養基中消化，各培養基含有如上文所述之抗黴劑及抗生素。在一些實驗中，使用膠原蛋白酶與分散酶的酶混合物(「C：D」)(膠原蛋白酶(Sigma,St Louis,Mo.)，500個單位/毫升；與分散酶(Invitrogen)，50個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖培養基中)。在其他實驗中，使用膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶的混合物(「C：D：H」)(膠原蛋白酶，500個單位/毫升；分散酶，50個單位/毫升；與玻尿酸酶(Sigma)，5個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖中)。使含有組織、培養基與消化酶的錐形管在37℃下在迴轉式振盪器(Environ,Brooklyn,N.Y)中以225rpm培養2小時。
在消化後，將組織以150 x g離心5分鐘，且將上清液吸出。將團塊再懸浮於20毫升的生長培養基(DMEM-低葡萄糖(Invitrogen)、15百分比(v/v)胎牛血清(FBS；特級牛血清(defined bovine serum)；批號AND18475；Hyclone,Logan,Utah)、0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma)、每100毫升1毫升如上文所述之抗生素/抗黴劑。使細胞懸浮液通過70微米尼龍細胞濾器(BD Biosciences)過濾。使額外5毫升包含生長培養基的潤洗液通過濾器。接著使細胞懸浮液通過40微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，然後用額外5毫升的生長培養基潤洗液來趕出。
將濾液再懸浮於生長培養基(總體積50毫升)中然後以150xg離心5分鐘。將上清液吸出然後將細胞再懸浮於50毫升的新鮮生長培養基中。將此過程再重複兩次。
在最終離心後，將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於5毫升的新鮮生長培養基中。使用台盼藍染色來判定活細胞數目。接著在標準條件下培養細胞。
將分離自臍帶的細胞以5,000個細胞/cm2接種於經明膠塗布T-75cm2培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)上並且於具有如上 文所述之抗生素/抗黴劑的生長培養基中。2天後(在各種實驗中，細胞培養2至4天)，將用過的培養基自瓶吸出。用PBS清洗細胞三次以去除碎屑與血衍生細胞。接著用生長培養基補充細胞並讓其生長至長滿(自繼代0至繼代1約10日)。在後續繼代時(自繼代1至2等等)，細胞在4至5日後達到次長滿(75至85百分比長滿)。針對這些後續繼代，以5000個細胞/cm2接種細胞。使細胞在加濕培養器中於5百分比二氧化碳及大氣氧氣、37℃下生長。
胎盤細胞分離：胎盤組織係獲自NDRI(Philadelphia,Pa.)。該些組織係來自孕婦且在正常外科分娩時獲得。胎盤細胞係如臍細胞分離所述分離。
以下實例應用於自胎盤組織分離母體衍生及新生兒衍生之分開細胞群。
細胞分離規程係在層流櫃(laminar flow hood)中無菌執行。將胎盤組織在磷酸鹽緩衝液(PBS；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中於抗黴劑及抗生素(如上文所述)之存在下清洗，以移除血液及碎屑。隨後將胎盤組織解剖成三區：頂線(新生兒側或態樣)、中線(混合的細胞分離新生兒及母體)及底線(母體側或態樣)。
將分開的區個別於具有抗生素/抗黴劑之PBS中清洗數次以進一步移除血及碎屑。接著在150cm2組織培養盤上於50毫升的DMEM-低葡萄糖存在下機械解離各區，直到將各區切碎為細泥。將泥轉移至50毫升錐形管中。各管含有大致5公克組織。將組織於含有抗黴劑及抗生素(100U/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、0.25微克/毫升兩性黴素B)及消化酶之DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖培養基中消化。在一些實驗中，使用膠原蛋白酶與分散酶的酶混合物(「C：D」)，其於DMEM-低葡萄糖培養基中含有500個單位/毫升之膠原蛋白酶(Sigma,St Louis,Mo.)與50個單位/毫升之分散酶(Invitrogen)。在其他實驗中，使用膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶的混合物(C：D：H)(膠原蛋白酶，500個單位/毫升；分散酶，50個單位/毫升；與玻尿酸酶(Sigma)，5個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖 中)。使含有組織、培養基與消化酶的錐形管在37℃下在迴轉式振盪器(Environ,Brooklyn,NY)中以225rpm培養2小時。
在消化後，將組織以150xg離心5分鐘，將所得上清液吸出。將團塊再懸浮於20毫升的具有青黴素/鏈黴素/兩性黴素B之生長培養基中。使細胞懸浮液過濾通過70微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，用額外5毫升的生長培養基潤洗液來趕出。使總細胞懸浮液通過40微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，接著用額外5毫升的生長培養基作為潤洗液。
將濾液再懸浮於生長培養基(總體積50毫升)中然後以150xg離心5分鐘。將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於50毫升的新鮮生長培養基中。將此過程再重複兩次。在最終離心後，將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於5毫升的新鮮生長培養基中。使用台盼藍排除測試來判定細胞計數。接著在標準條件下培養細胞。
LIBERASE細胞分離：於具有LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)(每毫升2.5毫克，Blendzyme 3；Roche Applied Sciences,Indianapolis,Ind.)及玻尿酸酶(5個單位/毫升，Sigma)之DMEM-低葡萄糖培養基中將細胞自臍組織分離。組織消化與細胞分離係如以上之其他蛋白酶消化所述，但使用LIBERASE/玻尿酸酶混合物代替C：D或C：D：H酶混合物。用LIBERASE消化組織會使來自產後組織迅速擴增的細胞族群得以分離出來。
使用其他酶組合的細胞分離：對於使用不同酶組合以自臍帶分離出細胞的程序進行比較。用於消化比較之酶包括：i)膠原蛋白酶；ii)分散酶；iii)玻尿酸酶；iv)膠原蛋白酶：分散酶混合物(C：D)；v)膠原蛋白酶：玻尿酸酶混合物(C：H)；vi)分散酶：玻尿酸酶混合物(D：H)；與vii)膠原蛋白酶：分散酶：玻尿酸酶混合物(C：D：H)。觀察利用這些不同酶消化條件之細胞分離的差異(表5-1)。
結果
使用不同酶組合之細胞分離：C：D：H之組合提供最佳分離後細胞產率，並且比起其他條件在培養中產生擴增更多代的細胞(表5-1)。單獨使用膠原蛋白酶或玻尿酸酶無法獲得可擴增的細胞群。未試圖判定此結果是否專屬於所測試之膠原蛋白。
使用不同酶組合及生長條件分離細胞：在所有針對酶消化及生長所測試的條件下，細胞皆在繼代0與1之間附著及擴增良好(表5-2)。實驗條件5至8與13至16中之細胞皆在接種後良好增生多達4次繼代，將這些細胞在此時點凍存。所有細胞皆經凍存以備進一步研究。
總結：可使用膠原蛋白酶(基質金屬蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)、及玻尿酸酶(分解玻尿酸之黏液分解酶)的酶組合，可有效地將細胞群自臍帶及胎盤組織衍生出來。亦可使用名為Blendzyme之LIBERASE。特定言之，亦可使用Blendzyme 3並搭配玻尿酸酶來分離細胞，Blendzyme 3為膠原蛋白酶(4 Wunsch單位/g)與嗜熱菌蛋白酶(1714酪蛋白單位/g)。當在明膠塗布之塑膠上的生長培養基中培養時，這些細胞迅速擴增許多個繼代。
實例6 產後衍生細胞之核型分析
細胞療法所用之細胞系較佳為均質性並且不含任何汙染細胞型。細胞療法所用之細胞應具有正常染色體數目(46)及結構。為了要識別出均質性且不含非產後組織來源之細胞的胎盤及臍帶衍生細胞系，對於細胞樣本之核型進行分析。
方法及材料
在含有青黴素/鏈黴素之生長培養基中培養來自男新生兒之產後組織的PPDC。選用來自男新生兒(X,Y)的產後組織以能夠區別新生兒衍生細胞與母體衍生細胞(X,X)。將細胞以每平方公分5,000細胞接種於T25培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中的培養基中並且擴增至80%長滿。將含有細胞之T25培養瓶用生長培養基填充至 頸部。由快遞員將樣本送至臨床細胞遺傳學實驗室(估計實驗室至實驗室交通時間為一小時)。在中期(metaphase)分析細胞，此時染色體係最佳可視化。在所計數之二十個處於中期的細胞中，有五個分析出具有正常均質性核型數目(兩個)。如果觀察到兩個核型，即將細胞樣本歸類為均質性。如果觀察到超過兩個核型，即將細胞樣本歸類為異質性。當識別出異質性核型數目(四個)時，即計數額外中期細胞並加以分析。
結果
所有送交染色體分析的細胞樣本皆判讀為展現正常外觀。16個經分析之細胞系中的三個展現異質性表型(XX與XY)，從而指示同時存在衍生自新生兒及母體來源的細胞(表6-1)。將衍生自組織胎盤-N之細胞自胎盤之新生兒態樣分離。在繼代零，此細胞系顯現出均質性XY。然而，在繼代九，該細胞系為異質性(XX/XY)，指出先前未偵測出的母體來源細胞存在。
總結：染色體分析識別出核型顯現為正常(由臨床細胞遺傳學實驗室判讀)的胎盤及臍衍生細胞。核型分析亦識別出不含母體細胞的細胞系，此係由均質性核型來判定。
實例7 藉由流動式細胞測量術評估人類產後衍生細胞表面標記
藉由流動式細胞測量術來特徵化細胞表面蛋白質或「標記」可用來判定細胞系的身份(identity)。表現的一致性可由多個捐贈者來判定，並且在暴露於不同處理與培養條件的細胞中判定。自胎盤及臍分離出的產後衍生細胞(PPDC)系係經表徵(藉由流動式細胞測量術)，從而提供用於識別這些細胞系的概況。
方法及材料
培養基及培養容器：將細胞培養於具有青黴素/鏈黴素之生長培養基(Gibco Carlsbad,Calif.)中。使細胞在經血漿處理之T75、T150與T225組織培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中培養直到長滿。培養瓶的生長表面係藉由在室溫下培養2%(w/v)明膠(Sigma,St.Louis,Mo.)20分鐘來塗布明膠。
抗體染色及流動式細胞測量術分析：將瓶中之貼附細胞於PBS中清洗且用胰蛋白酶/EDTA脫附。將細胞收集、離心，且以每毫升1×107的細胞濃度再懸浮於3%(v/v)FBS於PBS中。根據製造商規範，將關注的細胞表面標記之抗體(請見後文)添加至一百微升的細胞懸浮液，然後將混合物在黑暗中在4℃下培養30分鐘。在培養之後，將細胞用PBS清洗且離心以移除未結合的抗體。將細胞再懸浮於 500微升PBS中且藉由流動式細胞測量術分析。流動式細胞測量術分析係用FACScaliburTM儀器(Becton Dickinson,San Jose,Calif.)來執行。表7-1列舉所使用之細胞表面標記之抗體。
胎盤與臍比較：在繼代8將胎盤衍生細胞與臍衍生細胞進行比較。
繼代對繼代比較：在繼代8、15、及20分析胎盤衍生細胞及臍衍生細胞。
捐贈者對捐贈者比較：為了比較捐贈者之間的差異，將來自不同捐贈者之胎盤衍生細胞互相比較，且將來自不同捐贈者之臍衍生細胞互相比較。
表面塗層比較：將培養在經明膠塗布之培養瓶上的胎盤衍生細胞與培養於未經塗布之培養瓶上的胎盤衍生細胞進行比較。將培養於經明膠塗布培養瓶上的臍衍生細胞與培養於未塗布培養瓶上之臍衍生細胞進行比較。
消化酶比較：對四種用於分離及製備細胞的處理進行比較。分離自用1)膠原蛋白酶；2)膠原蛋白酶/分散酶；3)膠原蛋白酶/玻 尿酸酶；與4)膠原蛋白酶/玻尿酸酶/分散酶處理之胎盤之細胞係經比較。
胎盤層比較：將衍生自胎盤組織之母體態樣的細胞與衍生自胎盤組織之絨毛區的細胞以及衍生自胎盤之新生胎兒態樣的細胞進行比較。
結果
胎盤與臍比較：藉由流動式細胞測量術分析之胎盤衍生細胞及臍衍生細胞顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C之陽性表現，此係由相對於IgG對照組的螢光值增加來指示。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的可偵測表現為陰性，此係由螢光值與IgG對照組可相比來指示。考慮到陽性曲線之螢光值之變異。陽性曲線之平均值(亦即CD13)及範圍(亦即CD90)顯示一些變異，但曲線顯現正常，證實為均質性族群。兩個曲線個別展現大於IgG對照組之值。
繼代對繼代比較-胎盤衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析之繼代8、15、及20的胎盤衍生細胞皆陽性表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，如相對於IgG對照組的螢光值增加所反映。該些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。
繼代對繼代比較-臍衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析之繼代8、15、及20之臍衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，此係由相對於IgG對照組的螢光增加來指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。
捐贈者對捐贈者比較-胎盤衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析分離自不同捐贈者之胎盤衍生細胞各表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，其相對於IgG對照組具有增加的螢光值。該些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ表現陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。
捐贈者對捐贈者比較-臍衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析分離自不同捐贈者之臍衍生細胞各顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C之陽性表現，此係反映在相對於IgG對照組增加的螢光值。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。
明膠表面塗層對胎盤衍生細胞的效果：藉由流動式細胞測量術分析在經明膠塗布或未經塗布之培養瓶上擴增的胎盤衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，此係反映在相對於IgG對照組增加的螢光值。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ表現陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。
明膠表面塗層對臍衍生細胞的效果：藉由流動式細胞測量術分析在明膠上及在未經塗布之培養瓶上擴增的臍衍生細胞皆陽性表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，其相對於IgG對照組具有增加的螢光值。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。
用於製備細胞之酶消化程序對細胞表面標記概況的效果：藉由流動式細胞測量術分析之使用各種消化酶分離的胎盤衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，如藉由相對於IgG對照組之螢光值增加所指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA- DR、HLA-DP、HLA-DQ表現陰性，如藉由螢光值與IgG對照組一致來指示。
胎盤層比較：藉由流動式細胞測量術分析之分別分離自胎盤之母體、絨毛、及新生兒層的細胞顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C之陽性表現，如藉由相對於IgG對照組之螢光值增加所指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ表現陰性，如藉由螢光值與IgG對照組一致來指示。
總結：胎盤衍生細胞及臍衍生細胞的流動式細胞測量術分析已建立這些細胞系的身份。胎盤衍生細胞及臍衍生細胞為CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C陽性，且為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性。此身份在變項包括捐贈者、繼代、培養容器表面塗層、消化酶與胎盤層的變異間皆一致。觀察到在個別螢光值直方圖曲線平均值與範圍上有一些變異，但在所有測試條件下的所有陽性曲線皆為正常並且表現出大於IgG對照組的螢光值，因而確認該些細胞包含具有該些標記之陽性表現的均質性族群。
實例8 產後組織表型的免疫組織化學特徵
人類產後組織(即臍帶及胎盤)中所發現的細胞之表型係以免疫組織化學法分析。
方法及材料
組織製備：收穫人類臍帶及胎盤組織並在4℃下浸漬固定於4%(w/v)多聚甲醛中整夜。使用針對下列表位的抗體來執行免疫組織化學法：波形蛋白(1：500；Sigma,St.Louis,Mo.)、肌間線蛋白(desmin，1：150，對抗兔而生成；Sigma；或1：300，對抗小鼠而生成；Chemic on,Temecula,Calif.)，α-平滑肌肌動蛋白(SMA；1：400； Sigma)，細胞角蛋白18(CK18；1：400；Sigma)，馮威里氏因子(vWF；1：200；Sigma)與CD34(人類CD34 Class III；1：100；DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外，測試以下標記：抗人類GROα--PE(1：100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、抗人類GCP-2(1：100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,Calif)、抗人類氧化LDL受體1(ox-LDL R1；1：100；Santa Cruz Biotech)與抗人類NOGO-A(1：100；Santa Cruz Biotech)。用解剖刀修剪經固定之樣品，然後將其置於在含乙醇之乾冰浴上的OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura,Torrance,Calif)內。接著使用標準低溫恒溫器(Leica Microsystems)將冷凍之包埋塊切片(10μm厚)然後固定於玻片上以備染色。
免疫組織化學：類似於先前研究執行免疫組織化學(例如，Messina等人，2003,Exper.Neurol.184：816-829)。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗組織切片然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白質阻斷液中1小時以獲取細胞內抗原。在感興趣表位會位於細胞表面(CD34、ox-LDL R1)上的情況中，省略該程序的所有步驟中之Triton以避免表位流失。再者，在一級抗體係對抗山羊(GCP-2,ox-LDL R1,NOGO-A)而生成的情況中，整個程序中使用3%(v/v)驢血清來取代山羊血清。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於切片歷時4小時。將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷劑以及山羊抗小鼠IgG--Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,Oreg.)及/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)或驢抗山羊IgG--FITC(1：150；Santa Cruz Biotech)。清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。
在免疫染色後，在Olympus倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。高於 對照組染色的螢光信號即代表陽性染色。使用數位彩色攝影機與ImagePro軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝各影像。接著使用Adobe Photoshop軟體(Adobe,San Jose,Calif.)來製備分層合成影像(Layered montage)。
結果
臍帶之表徵：波形蛋白、肌間線蛋白、SMA、CKI8、vWF、及CD34標記係表現於臍帶內發現之細胞亞群中。特定而言，vWF與CD34表現限制於臍帶內所含之血管。CD34+細胞係位於最內層(管腔側)上。波形蛋白表現係發現於整個臍帶基質與血管中。SMA限於動脈及靜脈的基質與外壁，但血管本身則不含。僅在血管內觀察到CK18與肌間線蛋白，且肌間線蛋白限於中層及外層。
胎盤之表徵：波形蛋白、肌間線蛋白、SMA、CKI8、vWF、及CD34全部在胎盤內觀察到且為區域特異性。
GROα、GCP-2、ox-LDL RI、及NOGO-A組織表現：此等標記皆未在臍帶或胎盤組織內觀察到。
總結：人類臍帶及胎盤內的細胞中皆會表現波形蛋白、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、細胞角蛋白18、馮威里氏因子、及CD 34。
實例9 使用寡核苷酸陣列分析產後組織衍生細胞
Affymetrix GENECHIP陣列係用來比較臍衍生與胎盤衍生細胞與纖維母細胞、人類間葉幹細胞與另一個衍生自人類骨髓之細胞系的基因表現概況。此分析提供產後衍生細胞之特徵並識別這些細胞的獨特分子標記。
方法及材料
細胞之分離及培養：人類臍帶與胎盤係獲自國家疾病研究交換中心(NDRI,Philadelphia,Pa.)，其等係來自正常足月分娩並且獲得患者同意。如實例5中所述接受組織並分離細胞。將細胞培養於經明膠塗布的組織培養塑膠培養瓶上之生長培養基(使用DMEM-LG)中。培養物係在37℃下以5% CO2培養。
人類皮膚纖維母細胞係購自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.；批號9F0844)與ATCC CRL-1501(CCD39SK)。將兩個細胞系在DMEM/F12培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中培養，培養基含有10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)與青黴素/鏈黴素(Invitrogen)。使細胞生長於標準組織處理塑膠上。
人類間葉幹細胞(hMSC)係購自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.；批號2F1655、2F1656與2F1657)並根據製造商規範在MSCGM Media(Cambrex)中培養。使細胞在37℃下以5% CO2生長於標準組織培養塑膠上。
人類髂骨崤骨髓係接受自NDRI並獲得患者同意。骨髓係根據Ho等人(W003/025149)所概述之方法來處理。將骨髓與裂解緩衝液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3與0.1mM EDTA，pH 7.2)混合，並且混合比例為1份骨髓對20份裂解緩衝液。使細胞懸浮液渦動、在環境溫度下培養2分鐘然後以500xg離心10分鐘。將上清液丟棄，並將細胞團塊再懸浮於補充10%(v/v)胎牛血清與4mM麩醯胺酸之最低必需培養基α(Invitrogen)中。將細胞再次離心然後將細胞團塊再懸浮於新鮮培養基中。使用台盼藍排除法(Sigma,St.Louis,Mo.)來計數存活單核細胞。將單核細胞以5×104個細胞/cm2接種於組織培養塑膠瓶中。將細胞在37℃下以5% CO2、在標準大氣O2或在5% O2下培養。將細胞培養5日並且未進行培養基更換。在5日的培養後將培養基與非貼附細胞移除。將貼附細胞維持於培養中。
mRNA之分離及GENECHIP分析：將活性生長之細胞培養物用細胞刮勺自培養瓶移除於冷PBS中。將細胞以300xg離心5 分鐘。將上清液移除，然後將細胞再懸浮於新鮮PBS並再次離心。將上清液移除，並將細胞團塊立刻冷凍並儲存於-80℃。萃取細胞mRNA並將細胞mRNA轉錄成cDNA，然後將cDNA轉錄成cRNA並進行生物素標記。使經生物素標記之cRNA與HG-U133A GENECHIP寡核苷酸陣列(Affymetrix,Santa Clara,Calif.)雜交。雜交及數據收集係根據製造商規範執行。分析係使用「Significance Analysis of Microarrays」(SAM)第1.21版電腦軟體(Stanford University；Tusher,V.G.等人，2001,PNAS USA 98：5116-5121)。\
結果
分析了十四個不同細胞群。細胞連同繼代資訊、培養基材、及培養基係列於表9-1。
數據藉由主組分分析(Principle Component Analysis)評估，分析在細胞中有差別表現的290個基因。此分析允許族群之間相似性之相對比較。
表9-2顯示計算用於細胞對比較之歐幾里德距離(Euclidean distance)。歐幾里德距離係根據基於290個基因的細胞比較結果，這些基因在不同細胞型間有差別表現。歐幾里德距離與290個基因之表現之間的相似性成反比(亦即，距離越大，存在的相似性越小)。
表9-3、表9-4、及表9-5顯示在胎盤衍生細胞中增加表現(表9-3)、在臍衍生細胞中增加表現(表9-4)、及在臍與胎盤衍生細胞中減少表現(表9-5)之基因。標題「探針組ID」之欄係指製造商對於定位於晶片上具體位點上之數種寡核苷酸探針組之識別碼，該等探針組與經列名之基因(「基因名稱」欄)雜交，該等基因包含可在NCBI(GenBank)資料庫內以指定存取號(「NCBI存取號」欄)查找之序列。
表9-6、表9-7、及表9-8顯示在人類纖維母細胞(表9-6)、ICBM細胞(表9-7)、及MSC(表9-8)中增加表現之基因。
總結：本檢測係為了提供衍生自臍帶及胎盤之產後細胞的分子表徵而執行。此分析包括衍生自三個不同臍帶與三個不同胎盤的細胞。此檢測亦包括兩個不同的皮膚纖維母細胞系、三個間葉幹細胞系與三個髂骨崤骨髓細胞系。這些細胞所表現之mRNA係使用寡核苷酸陣列來分析，該陣列含有22,000個基因的探針。結果顯示，290個基因在這五種不同細胞型中有差別表現。這些基因包括十個在胎盤衍生細胞中特異地增加的基因，以及七個在臍帶衍生細胞中特異地增加的基因。發現相較於其他細胞型，四十四個基因具有在胎盤與臍帶中特異地較低的表現水準。選定基因之表現已藉由PCR來確認(參見以下實例)。此等結果證明，產後衍生細胞具有獨特的基因表現概況，例如相較於骨髓衍生細胞及纖維母細胞。
實例10 產後衍生細胞之細胞標記
在前述實例中，衍生自人類胎盤及人類臍帶之細胞的相似性及差異性係藉由比較其基因表現概況與衍生自其他來源之細胞的基因表現概況來評估(使用寡核苷酸陣列)。識別六個「簽名(signature)」基因：氧化LDL受體1、介白素-8、凝乳酶、內質網蛋白、趨化激素受體配體3(CXC配體3)、及顆粒性細胞趨化蛋白質2(GCP-2)。此等「簽名」基因在產後衍生細胞中以相對高的水準表現。
進行此實例中所述之程序以驗證微陣列數據且找出基因與蛋白質表現之間的一致性/不一致性，以及建立一系列可靠的檢定以用於偵測胎盤衍生細胞與臍衍生細胞之唯一識別符。
方法及材料
細胞：胎盤衍生細胞(三個分離株，包括一個經核型分析所識別主要為新生兒之分離株)、臍衍生細胞(四個分離株)、及正常人類皮膚纖維母細胞(NHDF；新生兒及成人)，生長於經明膠塗布之T75瓶中具有青黴素/鏈黴素之生長培養基中。間葉幹細胞(MSCS)係生長於間葉幹細胞生長培養基Bullet套組(MSCGM；Cambrex,Walkerville,Md.)。
至於IL-8規程，將細胞自液態氮解凍並以5,000個細胞/cm2接種於經明膠塗布之瓶中，於生長培養基中生長48小時，然後於10毫升的血清饑餓培養基[DMEM--低葡萄糖(Gibco,Carlsbad,Calif.)、青黴素/鏈黴素(Gibco,Carlsbad,Calif.)及0.1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma,St.Louis,Mo.)]中再生長8小時。在此處理之後，萃取RNA且將上清液以150xg離心5分鐘以移除細胞碎屑。隨後將上清液冷凍在-80℃下以供ELISA分析。
ELISA檢定之細胞培養物：將衍生自胎盤及臍之產後細胞、以及衍生自人類新生兒***之人類纖維母細胞培養在經明膠塗布之T75培養瓶中的生長培養基中。將細胞在繼代11時冷凍於液態氮中。將細胞解凍且轉移至15毫升離心管。在以150xg離心5分鐘之後，將上清液丟棄。將細胞再懸浮於4毫升培養基中且計數。使細胞以375,000個細胞/培養瓶生長於含有15毫升生長培養基之75cm2培養瓶中24小時。將培養基更換成血清饑餓培養基8小時。在培養結束時以14,000xg離心5分鐘來收集血清饑餓培養基(且保存在-20℃下)。
為了估計各培養瓶中細胞之數目，各培養瓶中添加2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)。在細胞自培養瓶脫離之 後，用8毫升的生長培養基中和胰蛋白酶活性。將細胞轉移至15毫升離心管且以150xg離心5分鐘。移除上清液且將1毫升生長培養基添加至各管以再懸浮細胞。使用血球計估計細胞數目。
ELISA檢定：由細胞分泌至血清饑餓培養基的IL-8之量係使用ELISA檢定(R&D Systems,Minneapolis,Minn.)來分析。所有檢定皆根據製造商所提供之說明書來測試。
總RNA分離：將RNA自長滿之產後衍生細胞及纖維母細胞萃取出、或就IL-8表現而言自如上文所述處理之細胞萃取。將細胞用350微升含有β-巰基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)之緩衝液RLT溶解，此係根據製造商之說明書進行(RNeasy® Mini Kit；Qiagen,Valencia,Calif)。RNA係根據製造商之說明書萃取(RNeasy® Mini Kit；Qiagen,Valencia,Calif)，並使其進行DNase處理(2.7U/樣本)(Sigma St.Louis,Mo.)。用50微升經DEPC處理水將RNA沖提出來然後儲存於-80℃下。
反轉錄：RNA亦自人類胎盤及臍萃取出。將組織(30毫克)懸浮於700微升含有2-巰基乙醇之緩衝液RLT中。將樣本機械均質化且根據製造商之規範進行RNA萃取。用50微升經DEPC處理水將RNA萃取出來然後儲存於-80℃下。使用隨機六聚物以TaqMan®反轉錄試劑(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)來反轉錄RNA，反轉錄在25℃下歷時10分鐘、在37℃下歷時60分鐘、且在95℃下歷時10分鐘。樣本儲存於-20℃。
藉由cDNA微陣列識別為在產後細胞中所獨特調節之基因(簽名基因--包括氧化LDL受體、介白素-8、凝乳酶、及內質網蛋白)係使用即時及傳統PCR進一步研究。
即時PCR：使用Assays-on-Demand®基因表現產物對cDNA樣本執行PCR：使用具有ABI Prism 7000 SDS軟體之7000序列偵測系統(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，根據製造商之說明書(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，將氧化LDL受體(Hs00234028)；凝乳酶(Hs00166915)；內質網蛋白(Hs003825 15)； CXC配體3(Hs00171061)；GCP-2(Hs00605742)；IL-8(Hs00174103)；及GAPDH(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)與cDNA及TaqMan® Universal PCR主混合物混合。熱循環條件初始為50℃歷時2min及95℃歷時10min，接著為40個95℃歷時15秒及60℃歷時1分鐘之循環。根據製造商之規範分析PCR數據(Applied Biosystems關於ABI Prism 7700序列偵測系統之使用者佈告#2)。
傳統PCR：使用ABI PRISM 7700(Perkin Elmer Applied Biosystems,Boston,Mass.,USA)執行傳統PCR以確認即時PCR之結果。使用2微升cDNA溶液、1x AmpliTaq Gold通用混合物PCR反應緩衝液(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)及在94℃下初始變性歷時5分鐘來執行PCR。擴增係針對各引子組最佳化。針對IL-8、CXC配體3、及內質網蛋白(94℃歷時15秒、55℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續30個循環)；針對凝乳酶(94℃歷時15秒、53℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續38個循環)；針對氧化LDL受體與GAPDH(94℃歷時15秒、55℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續33個循環)。擴增所使用之引子係列於表10-1。最終PCR反應中之引子濃度為1微莫耳，除了GAPDH為0.5微莫耳。GAPDH引子與即時PCR相同，除了未將製造商之TaqMan®探針添加至最終PCR反應。將樣本於2%(w/v)瓊脂糖凝膠上運行(run)且用溴化乙錠(Sigma,St.Louis,Mo.)染色。使用667 Universal Twinpack膜(VWR International,South Plainfield,N.J.)，使用焦距Polaroid照相機(VWR International,South Plainfield,N.J.)擷取影像。
免疫螢光：將PPDC在室溫下用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)固定10分鐘。使用臍衍生細胞及胎盤衍生細胞各者在繼代0(P0)(分離後直接使用)的一個分離株，及臍衍生細胞及胎盤衍生細胞之繼代11(P 11)(兩個胎盤衍生細胞分離株、兩個臍衍生細胞分離株)及纖維母細胞(P 11)。使用針對以下表位的抗體執行免疫細胞化學：波形蛋白(1：500,Sigma,St.Louis,Mo.)、肌間線蛋白(1：150；Sigma--對抗兔而生成；或1：300；Chemicon,Temecula,Calif--對抗小鼠而生成)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA；1：400；Sigma)，細胞角蛋白18(CK18；1：400；Sigma)，馮威里氏因子(vWF；1：200；Sigma)與CD34(人類CD34 Class III；1：100；DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外，於繼代11產後細胞上測試以下標記：抗人類GRO α--PE(1：100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、抗人類GCP-2(1：100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,Calif)、抗人類氧化LDL受體1(ox-LDL R1；1：100；Santa Cruz Biotech)與抗人類NOGA-A(1：100；Santa Cruz,Biotech)。
用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗培養物然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma,St.Louis,Mo.)的蛋白質阻斷液中30分鐘以獲取細胞內抗原。當感興趣表位係位於細胞表面(CD34、ox-LDL R1)上時，省略該程序的所有步驟中之Triton X-100以避免表位流失。再者，在一級抗體係對抗山羊(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)而生成的情況中，全程會使用3%(v/v)驢血清來取代山羊血清。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於培養物歷時1小時。將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷劑以及山羊抗小鼠 IgG--Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,Oreg.)及/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)或驢抗山羊IgG--FITC(1：150,Santa Cruz Biotech)。隨後清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。
在免疫染色後，在Olympus®倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。在所有情況下，陽性染色代表高於對照組染色的螢光訊號，其中遵照上文所概述的全部程序，除了施加一級抗體溶液。使用數位彩色攝影機與ImagePro®軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝各影像。接著使用Adobe Photoshop®軟體(Adobe,San Jose,Calif)來製備分層合成影像(Layered montage)。
製備細胞以進行FACS分析：將培養瓶中之貼附細胞於磷酸鹽緩衝液(PBS)(Gibco,Carlsbad,Calif)中清洗且用胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)脫附。將細胞收集、離心，且以每毫升1×10 7的細胞濃度再懸浮於3%(v/v)FBS於PBS中。將一百微升等分遞送至錐形管中。細胞內抗原經染色之細胞係用Perm/Wash緩衝液(BD Pharmingen,San Diego,Calif)穿透。將抗體按製造商規範添加至等分中且將細胞在4℃下於黑暗中培養30分鐘。培養後，用PBS清洗細胞並離心以去除過量抗體。將需要二級抗體之細胞再懸浮於100微升3% FBS中。將二級抗體按製造商規範添加且將細胞在4℃下於黑暗中培養30分鐘。在培養之後，將細胞用PBS清洗且離心以移除過量二級抗體。將經清洗之細胞再懸浮於0.5毫升PBS中且藉由流動式細胞測量術分析。使用以下抗體：氧化LDL受體1(sc-5813；Santa Cruz,Biotech)、GROa(555042；BD Pharmingen,Bedford,Mass.)、小鼠IgG1κ(P-4685及M-5284；Sigma)、驢抗山羊IgG(sc-3743；Santa Cruz,Biotech.)。流動式細胞測量術分析係用FACScaliburTM(Becton Dickinson San Jose,Calif.)來執行。
結果
在來自衍生自人類胎盤、成體及新生兒纖維母細胞與間葉幹細胞(MSC)之細胞的cDNA上所執行之針對選定「簽名」基因之即時PCR之結果指出，氧化LDL受體及凝乳酶兩者在胎盤衍生細胞中相較於其他細胞以較高水準表現。獲自即時PCR之數據係藉由AACT方法分析且以對數標度之形式表達。臍衍生細胞中內質網蛋白與氧化LDL受體表現水準相較於其他細胞為較高的。在產後衍生細胞與對照組之間未發現CXC配體3及GCP-2之表現水準有顯著差異。即時PCR之結果係藉由傳統PCR確認。PCR產物之定序進一步驗證這些觀察。使用上表10-1中所列之傳統PCR CXC配體3引子，發現產後衍生細胞與對照之間CXC配體3之表現水準沒有顯著差異。
產後細胞介素IL-8之生產在經生長培養基培養及經血清饑餓培養之產後衍生細胞兩者中均提高。所有即時PCR數據皆用傳統PCR及藉由定序PCR產物來驗證。
當檢測生長於無血清培養基中之細胞的上清液中IL-8之存在時，最高量在衍生自臍細胞及胎盤細胞之一些分離株之培養基中偵測出(表10-2)。在衍生自人類皮膚纖維母細胞之培養基中未偵測出IL-8。
亦藉由FACS分析檢測胎盤衍生細胞的氧化LDL受體、GCP-2及GROα之生產。經測試細胞為GCP-2陽性。此方法未偵測到氧化LDL受體及GRO。
亦藉由免疫細胞化學分析測試胎盤衍生細胞之選定蛋白質之生產。在分離後(繼代0)，立即將衍生自人類胎盤之細胞用4%多聚甲醛固定且暴露於針對六種蛋白質之抗體：馮威里氏因子、CD34、細胞角蛋白18、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、及波形蛋白。經染色細胞呈現α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性。此模式直到繼代11仍保留。在繼代0時僅一些細胞(<5%)為細胞角蛋白18染色陽性。
衍生自人類臍帶之細胞在繼代0時藉由免疫細胞化學分析探查到選定蛋白質之生產。在分離後(繼代0)，立即將細胞用4%多聚甲醛固定且暴露於針對六種蛋白質之抗體：馮威里氏因子、CD34、細胞角蛋白18、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、及波形蛋白。臍衍生細胞為α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性，其中染色模式直到繼代11仍一致。
總結：對於以下四種基因，已確立藉由微陣列及PCR(即時及傳統兩者)所量測之基因表現水準之間的一致性：氧化LDL受體1、凝乳酶、內質網蛋白、及IL-8。這些基因之表現在PPDC中的mRNA水準上受到差別調節，其中IL-8在蛋白質水準上亦受差別調節。藉由FACS分析，在衍生自胎盤之細胞中的蛋白質水準上未偵測出氧化LDL受體之存在。藉由FACS分析，GCP-2及CXC配體3於胎盤衍生細胞中在mRNA水準上之差別表現未經確認，但是在蛋白質水準上偵測出GCP-2。儘管此結果未由最初獲自微陣列實驗之數據反映出，但是此可能由於方法之靈敏度不同所致。
在分離後(繼代0)，立即染色衍生自人類胎盤之細胞呈現α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性。此模式亦在繼代11的細胞中觀察到。波形蛋白及α-平滑肌肌動蛋白表現可在繼代(在生長培養基中及在這些程序中所利用之條件下)細胞中保留。在繼代0之衍生自 人類臍帶之細胞係經探查α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白之表現，且兩者皆為陽性。此染色模式直到繼代11仍保留。
實例11 臍組織衍生細胞中之端粒酶表現
端粒酶的功能是合成端粒重複序列(telomere repeat)，端粒重複序列用來保護染色體完整性並延長細胞的複製壽命(Liu,K，等人，PNAS,1999；96：5147-5152)。端粒酶由兩個組分所組成，即端粒酶RNA模板(hTER)與端粒酶反轉錄酶(hTERT)。端粒酶的調控係由hTERT而非hTER的轉錄來決定。hTERT mRNA的即時聚合酶連鎖反應(PCR)因而是一種已獲認可的用於判定細胞端粒酶活性的方法。
細胞分離。執行即時PCR實驗以判定人類臍帶組織衍生細胞的端粒酶生產。根據上文所述之實例製備人類臍帶組織衍生細胞。一般而言，得自國家疾病研究交換中心(Philadelphia,Pa.)的臍帶在正常分娩後會經過清洗以去除血液與碎屑然後進行機械解離。接著，將組織於37℃下以包括膠原蛋白酶、分散酶、及玻尿酸酶之消化酶培養。根據上文實例中所述之方法培養人類臍帶組織衍生細胞。間葉幹細胞與正常皮膚纖維母細胞(cc-2509批號9F0844)係得自Cambrex,Walkersville,Md。多能性人類睪丸胚胎性癌(畸胎瘤)細胞系nTera-2細胞(NTERA-2 cl.Dl)(參見Plaia等人，Stem Cells,2006；24(3)：531-546)係購自ATCC(Manassas,Va.)並且將其根據上文中所述之方法來培養。
總RNA分離。使用RNeasy®套組(Qiagen,Valencia,Ca.)將RNA自細胞萃取出來。用50微升經DEPC處理水將RNA沖提出來然後儲存於-80℃下。使用隨機六聚物以TaqMan®反轉錄試劑(Applied Biosystems,Foster City,Ca.)來反轉錄RNA，反轉錄在25℃下歷時10分鐘、在37℃下歷時60分鐘、且在95℃下歷時10分鐘。將樣本儲存在-20℃下。
即時PCR。使用Applied Biosystems Assays-On-DemandTM(亦已知為TaqMan® Gene Expression Assays)根據製造商規範(Applied Biosystems)在cDNA樣本上執行PCR。此商用套組廣泛用來檢定人類細胞中的端粒酶。簡言之，使用7000序列偵測系統(搭載ABI prism 7000 SDS軟體(Applied Biosystems))，將hTert(人類端粒酶基因)(Hs00162669)及人類GAPDH(內部對照組)與cDNA及TaqMan® Universal PCR主混合物混合。熱循環條件初始為50℃歷時2分鐘然後95℃歷時10分鐘，接著進行40次95℃歷時15秒鐘然後60℃歷時1分鐘的循環。依據製造商規範來分析PCR數據。
人類臍帶組織衍生細胞(ATCC存取號PTA-6067)、纖維母細胞及間葉幹細胞係針對hTert及18S RNA來檢定。如表17-1中所示，hTert及因此端粒酶皆未在人類臍帶組織衍生細胞中偵測到。
人類臍帶組織衍生細胞(分離株022803，ATCC存取號PTA-6067)與nTera-2細胞經檢定，而結果顯示在兩批人類臍帶組織衍生細胞中皆沒有端粒酶表現，然而畸胎瘤細胞系則顯露出高表現水準(表17-2)。
因此，可做出本發明之人類臍組織衍生細胞不表現端粒酶之結論。
本說明書中提及各種專利及其他出版物。這些出版物之各者之全部內容以引用方式併入本文中。
儘管上文已藉由實例與較佳實施例說明本發明之各種態樣，但是應理解，本發明之範疇並不由前文描述限定，而是以下根據專利法原理正確解讀的申請專利範圍來限定。
在描述本發明及其各種實施例中，為了清楚起見，採用特定用語。不過，本發明不意欲被限制於所選擇的特定用語。在相關技術領域中具有通常知識者將理解可在不脫離目前發明的廣泛概念下，採用其他均等組件且開發其他方法。在本說明書中任一處所引述之所有參考係以引用方式併入，如同各參考被個別併入。
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Claims (14)

  1. 一種用於在視網膜變性中調節米勒神經膠質細胞(Müller glia)的產後衍生細胞群，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，且其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群自我更新並在培養物中擴增且不表現CD117，且其中該細胞群分泌血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-1(TSP2)。
  2. 一種用於增強或恢復視網膜突觸連接的產後衍生細胞群，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群自我更新並在培養物中擴增且不表現CD117，且其中該細胞群分泌血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-1(TSP2)。
  3. 一種用於保留或恢復含α2δ1之突觸的產後衍生細胞群，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群自我更新並在培養物中擴增且不表現CD117，且其中該細胞群分泌血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-1(TSP2)。
  4. 一種用於預防或減弱米勒神經膠質細胞之反應性神經膠變性的產後衍生細胞群，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，且其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群自我更新並在培養物中擴增且不表現CD117，且其中該細胞群分泌血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-1(TSP2)。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之細胞群，其中該細胞群具有分化成至少一種神經表型之細胞的潛能、在繼代之後維持正常核型、且具有以下特徵：a)在培養物中進行40次族群倍增的潛能；b)表現CD10、CD13、CD44、CD73、及CD90；c)不表現CD31、CD34、CD45、及CD141；及 d)相對於纖維母細胞、間葉幹細胞、或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞，增加編碼介白素8及內質網蛋白1之基因的表現。
  6. 如請求項5所述之細胞群，其中該細胞群為HLA-A、HLA-B、HLA-C陽性，及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性。
  7. 如請求項1至4中任一項所述之細胞群，其中該細胞群缺乏端粒酶的表現。
  8. 一種用於在視網膜變性中調節米勒神經膠質細胞的組成物，其包含產後衍生細胞群，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，且其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群自我更新並在培養物中擴增且不表現CD117，且其中該細胞群分泌血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-1(TSP2)。
  9. 一種用於增強或恢復視網膜突觸連接的組成物，其包含產後衍生細胞群，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群自我更新並在培養物中擴增且不表現CD117，且其中該細胞群分泌血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-1(TSP2)。
  10. 一種用於在視網膜變性中保留或恢復含α2δ1之突觸的組成物，其包含產後衍生細胞群，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群自我更新並在培養物中擴增且不表現CD117，且其中該細胞群分泌血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-1(TSP2)。
  11. 一種用於減弱米勒神經膠質細胞之反應性神經膠變性的組成物，其包含產後衍生細胞群，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，且其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群自我更新並在培養物中擴增且不表 現CD117，且其中該細胞群分泌血小板反應蛋白-1(TSP1)或血小板反應蛋白-1(TSP2)。
  12. 如請求項8至11中任一項所述之組成物，其中該細胞群具有分化成至少一種神經表型之細胞的潛能、在繼代之後維持正常核型、且具有以下特徵：a)在培養物中進行40次族群倍增的潛能；b)表現CD10、CD13、CD44、CD73、及CD90；c)不表現CD31、CD34、CD45、及CD141；及d)相對於纖維母細胞、間葉幹細胞、或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞，增加編碼介白素8及內質網蛋白1之基因的表現。
  13. 如請求項12所述之組成物，其中該細胞群為HLA-A、HLA-B、HLA-C陽性，及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性。
  14. 如請求項8至11中任一項所述之組成物，其中該細胞群缺乏端粒酶的表現。
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