KR101515369B1 - 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법 및 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법 및 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 종래 세포 배양방법에 의해 배양된 세포와 유사한 세포 부착능 및 증식율을 나타낸다. 본 발명에서 탯줄 유래 콜라겐 및 탯줄 추출물은 일반적인 동물 세포 및 줄기세포 배양을 위한 보조제 및 혈청 대체물로 사용할 수 있다. 본 발명에서 혈관 내피 (전구)세포, 탯줄 유래 콜라겐 및 추출물은 자가 유래 물질로서 세포 이식 시 발생할 수 있는 면역거부 반응을 예방할 수 있으며, 동물 유래의 단백질원 사용을 배제함으로써 동물 유래 오염원에 의한 오염을 최소화할 수 있다. 본 발명은 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법 및 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Methods for Culturing Endothelial Progenitor Cells Derived from Human Umbilical Cord Bloods and Compositions for Preventing or Treating Ischemic Diseases Comprising Endothelial Progenitor Cells Derived from Human Umbilical Cord Bloods}
본 발명은 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법 및 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
허혈이란, 혈관이 협착 또는 수축하거나, 정상적인 혈관 생성이 충분히 이루어지지 않아 혈류의 공급이 중단되어 세포 손상이 일어나는 부분적 혈액 부족 증상을 말한다. 대표적인 허혈성 질환의 하나인 만성적 허혈성 심장질환의 경우, 심근에 혈액을 공급하는 관상 순환계의 이상으로 심근이 충분한 양의 산소와 영양분을 받지 못해서 흉통, 심부전으로 인한 호흡곤란, 허약감, 실신 등의 증상을 수반하는데, 최근 발생빈도가 급격히 증가하고 있다. 또한, 모근 및 모낭에 혈액의 공급이 원활하지 못하게 되면 모낭의 형성 즉 모발 형성이 되지 않아 탈모자 백발증을 유발할 수 있다. 그 밖에도, 허혈로 인한 혈핵 공급의 중단은 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 안질환, 허혈성 하지질환 등의 각종 허혈성 질환을 유발하게 된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 동물 혈청을 사용하지 않음으로써 종간 교차 오염을 발생시키지 않는 세포 배양 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 탯줄로부터 수득한 콜라겐 및 추출물을 이용하여 제대혈 유래 내피전구세포를 배양하면 세포 부착능 및 증식율이 종래 세포 배양 방법에 의해 배양된 세포와 유사한 수준을 나타낸다는 것을 확인하였으며, 이 방법에 의해 배양된 제대혈 유래 내피전구세포는 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는데 매우 유효하다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법을 제공한다:
(a) 인간 탯줄로부터 분리된 콜라겐으로 도포된 배양접시에 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 접종하는 단계; 및
(b) 상기 인간 제대혈 유래 내피 전구세포가 접종된 상기 배양접시에 인간 탯줄 추출물이 첨가된 배양배지를 첨가 및 배양하는 단계.
본 발명자들은 동물 혈청을 사용하지 않음으로써 종간 교차 오염을 발생시키지 않는 세포 배양 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 탯줄로부터 수득한 콜라겐 및 추출물을 이용하여 제대혈 유래 내피전구세포를 배양하면 세포 부착능 및 증식율이 종래 세포 배양 방법에 의해 배양된 세포와 유사한 수준을 나타낸다는 것을 확인하였으며, 이 방법에 의해 배양된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.
본 발명의 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 콜라겐으로 도포된 배양접시에 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 분주
먼저, 단계 (a)에 앞서 인간 제대혈을 농도구배 원심분리한 다음, 단핵세포(mononuclear cells, MNC)를 분리한다. 분리된 단핵세포를 인간 탯줄로부터 분리한 콜라겐으로 도포된 배양접시에 분주하여 배양한 다음, 비부착 세포를 제거하여 인간 제대혈 유래 내피 전구세포로서 부착세포를 수득한다. 이 단계에서의 배양은 약 16시간-3주일 동안 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 탯줄로부터 수득한 콜라겐으로 표면이 코팅된 세포 배양 접시를 세포 배양에 사용한다.
콜라겐을 세포배양 기재로 세포 배양용 접시에 코팅하는 것은 접촉 세포 배양에서 성장과 증식성을 향상시키는 효과가 있으며, 최초 배양 세포의 배양 조건 개선, 저혈청 및 무혈청의 세포 배양에 효과적이라고 보고되어 있다.
인간 제대혈 유래 내피 전구세포로서 수득한 부착세포를 인간 탯줄로부터 분리한 콜라겐으로 도포된 배양접시에 접종하고, 배양접시에 인간 탯줄 추출물이 첨가된 배양배지를 첨가하여 배양한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 비부착 세포를 제거하여 인간 제대혈 유래 내피 전구세포로서 수득한 부착세포에 인간 탯줄 추출물이 첨가된 배양배지를 첨가하여 배양할 수 있다.
본 발명에서 배양접시에 도포되는 콜라겐의 제조방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다:
인간 탯줄로부터 콜라겐을 수득하기 위해, 인간 탯줄을 약 1 cm 조각으로 절단한 다음, 증류수로 세척한다. 그 다음, 바이러스 등의 감염을 방지하기 위해절단된 탯줄 조직을 4℃, 70% 에탄올에 12-36시간 동안 담가둔다. 에탄올을 제거한 후 H2O2 용액에 12-36시간 동안 담가둔다. 조직을 분쇄하기 위해, 0.5 M 아세트산을 탯줄 조직에 첨가한 다음, 균질화시키고 펩신을 첨가하여4℃에서 12-36시간 동안 배양한다. pH 7의 NaOH를 첨가하여 펩신을 불활성화 시킨 다음, 4℃, 10,000 rpm에서 20-60분간 원심분리한다. 상등액의 단백질은 NaCl을 이용하여 6-24시간 동안 침전시킨 후, 4℃, 10,000 rpm에서 20-60분간 원심분리한 다음, 상등액을 탈염시키고, 한외여과 시스템을 이용하여 농축하여 콜라겐을 수득한다.
단계 (b): 인간 제대혈 유래 내피 전구세포에 탯줄 추출물이 첨가된 배양배지를 첨가하여 배양
상기 단계 (a)에서 배양접시에 분주한 인간 제대혈 유래 내피 전구세포에 탯줄 추출물이 첨가된 배양배지를 첨가하여 배양한다.
본 발명에서 이용되는 배양배지는 혈청-부재 배지이다.
본 명세서에서 용어 “혈청-부재 배지”는 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지에 동물 유래 혈청이 포함되지 않은 배지를 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 “타종 유래 단백질-부재(xeno-free)”를 의미한다.
체외에서 동물세포배양 시스템이 확립된 이래로 혈청은 동물세포의 증식을 촉진하기 위하여 통상적으로 사용되어 왔다. 초대세포(primary cells) 및 확립된 세포주(established cell lines)의 생존 및 증식에 광범위하게 사용되어온 혈청은 그 구성성분이 일부만 밝혀진 혼합물로서 세포배양에서의 생리적 활성이 완전히 파악되고 있지는 않다. 또한, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 우 태아로부터 채취되기 때문에 마이코플라즈마, 바이러스, 프리온, 세균성 미토겐, 호르몬, 외재성 단백질, 성장인자, 단백질 분해효소 등의 위해 요소를 지니고 있으며 공급자의 설비 및 기술수준 및 생산 롯트(lot)에 따라 그 조성이 달라지는 품질의 차이를 가져올 수 있다.
동물세포의 배양에 대한 연구 및 동물세포의 배양을 통한 생물공학 제품의 생산에 있어서, 배지 및 첨가물이 완전히 정의된 조건에서 세포를 배양하기 위해서는 혈청이 포함되지 않은 화학적으로 정의된 배지를 개발해야 한다. 이와 같은 무혈청 배지는 혈청이 갖는 생물학적 불확실성을 배제시켜 줄 뿐만 아니라, 단일항체나 다른 의약용 단백질들을 산업적인 규모로 생산할 때 전체적인 공정의 효율을 높여줄 수 있다. 현재까지 보고된 대부분의 무혈청 배지는 특정 세포만을 성장하게 하고, 혈청 대신에 사용하는 세포 성장인자, 부착인자 등이 고가이며, 무혈청 배지에서는 혈청을 포함한 배지에서 보다 성장 및 산물생산이 안정적이지 못한 점이 보고 되고 있다(Cruz J. H. et al., Cytotechnology, 26: 59-64(1998), 이희찬, 동물세포배양에서의 무혈청배지, Biotechnology News, 2(3):242-252(1994)).
상기한 동물 유래 단백질원(즉, 우태아혈청) 사용에 따른 문제점을 회피할 수 있는 방안으로서, 무혈청 배지를 이용하는 방법 및 인간 혈청을 함유하는 배지를 이용하는 방법을 이용할 수 있다. 무혈청 배지를 이용하는 방법은 성장호르몬 등을 포함한 다량의 사이토카인(cytokine)들을 배지에 함유시켜 세포를 배양하여야 하므로 복잡할 뿐만 아니라 비경제적이다. 또한, 인간 혈청을 함유하는 배지를 이용하는 방법도 재조합 방법으로 만들어진 사이토카인을 대량으로 사용하여야 하며, 고가의 인간혈청을 배양용 단백질원으로 사용하고 있어, 경제적으로 많은 부담이 되는 문제점이 있다.
본 발명자들은 우태아혈청 등의 동물 유래의 단백질원 사용에 따른 안전성 문제를 회피하면서 효율적이고 경제적인 세포 배양방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 산모로부터 출산 후 분리되어 폐기되는 탯줄로부터 단백질 변성을 최소화시킨 탯줄 추출물을 얻을 수 있는 방법을 개발하였으며, 특히 상기 방법으로부터 얻어진 단백질 변성이 최소화된 탯줄 추출물을 배지에 함유시켜 줄기세포 배양에 적용할 경우, 혈청 대체물로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 배양방법에서 성장인자는 배양배지에 첨가되는 탯줄 추출물로부터 제공된다.
단계 (b)에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 EBM2(endothelial cell basal medium-2) 배지이다.
본 발명에 따르면, 도 1에 기재된 바와 같이 태아의 제대혈로부터 수득하여 보관한 혈관 내피세포를 탯줄 유래 콜라겐(UC-콜라겐) 및 탯줄 유래 추출물(UCE)을 이용하여 증식 배양하고 이를 개체(자가)에 이식하여 허혈성 질환 치료에 이용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 혈관 내피세포 및 탯줄 유래 콜라겐, 추출물은 자가 유래 물질로서 세포 이식 시 발생할 수 있는 면역거부 반응을 예방할 수 있으며, 동물 유래의 단백질원 사용을 배제함으로써 동물 유래 오염원에 의한 오염을 최소화하여 이식하는 혈관 내피세포의 치료효과를 극대화 시킬 수 있다.
본 발명에서 이용되는 탯줄 추출물의 제조방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 탯줄의 절단
본 발명에 따르면, 우선 인간 탯줄을 절단한다. 본 발명에 있어서, 탯줄의 절단은 완충액과의 접촉 면적을 넓혀 탯줄 조직에 존재하는 유용물질의 용출을 용이하게 하기 위하여 실시한다.
본 발명에 따르면, 탯줄 추출물 제조에 사용되는 탯줄은 상술한 콜라겐 제조에서 사용한 탯줄과 동일한 조직이다.
탯줄 절단은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 탯줄은 0.5-3.0 cm, 0.5-2.5 cm 또는 1-2 cm의 길이로 절단한다.
(b) 절단된 탯줄을 완충액에 함침
이어, 절단된 탯줄을 완충액에 넣는다. 본 발명에서 이용되는 완충액은 완충력(buffering power)을 가지는 어떠한 완충액도 사용 가능하며 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 포스페이트, 글리신-HCl, Tris-HCl 및 PBS(Phosphate buffered saline)를 포함한다. 특히, PBS를 이용할 수 있고, pH는 2-11, 4-10, 4-8 또는 6.8-7.6이다.
절단된 탯줄을 넣는(함침시키는) 완충액의 양은 특별하게 제한되지 않으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 탯줄 중량의 2-5배, 2-4배 또는 2.5-3.2배의 완충액을 이용한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 절단된 탯줄을 완충액에 넣기 전에 적합한 용액(예컨대, 완충액)으로 세척한다.
(c) 단계 (b)의 결과물의 교반
단계 (b)의 결과물을 교반한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 교반은 4℃-10℃ 또는 4℃-6℃에서 실시한다. 교반은 7-24시간, 12-24시간 또는 18-24시간 동안 실시한다.
교반은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.
(d) 교반 결과물의 원심분리
교반 결과물을 원심분리하여 최종적으로 탯줄 추출물로서 상층액을 수득한다. 상기 상층액은 성장인자 및 싸이토카인 등 세포외기질에 결합되어 있는 다양한 유용 단백질을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 원심분리는 3,000-6,000 rpm 또는 4,000-4,500 rpm의 조건에서 실시한다. 원심분리는 4℃-10℃ 또는 4℃-6℃에서 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 원심분리는 5분-30분, 5분-20분 또는 10분-15분 동안 실시한다.
상기 방법에 의해 제조된 탯줄 추출물은 800-2,200 pg/ml FGF-2(fibroblast growth factor-2), 1,000-2,000 pg/ml G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), 500-1,500 pg/ml MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1), 300-2,000 pg/ml GRO(growth regulated oncogene), 300-1,500 pg/ml IL-1ra(Interleukin-1 receptor antagonist) 및 200-1,700 pg/ml IP-10(IFN-gamma inducible protein-10)을 주요 성분으로 포함한다.
상기 방법에 의해 제조된 탯줄 추출물은 아디포넥틴(Adiponectin), 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), 안지오포이에틴-유사 1(Angiopoietin-like 1), BDNF, BMPR-IB, CCR7, CCR8, CCR9, 코르딘-유사 2(Chordin-Like 2), CNTF, CXCL11, CXCL14, CXCR1, CXCR2, 에리스로포이에틴(Erythropoietin), FGF R4, 폴리스타틴(Follistatin), 폴리스타틴-유사 1(Follistatin-like 1), 칼렉틴-3(Galectin-3), GASP-1, GDF-15, 글루카곤(Glucagon), Glut2, Glut5, 글리피칸 5(Glypican 5), HB-EGF, ICAM-5, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-7, IL-1 ra, IL-17C, IL-17F, IL-23, IL-29, IL-4 R, 레프티-A(LeftyA), 렙틴 R(Leptin R), 리포칼린-1(Lipocalin-1), 루시퍼라아제(Luciferase), M-CSF, MDC, MFG-E8, MIF, MIP-1a, OSM, 오스테오액티빈(Osteoactivin), 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin), Pref-1, 프로락틴(Prolactin), ROBO4, SIGIRR, Siglec-9, TGF-베타 5, 트롬보스폰딘(Thrombospondin), 트롬보스폰딘-1(Thrombospondin-1), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), 토모레굴린-1(Tomoregulin-1), TNF RII, TRADD 및 uPA을 주요 성분으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배양방법에 의해 배양된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 동물 유래 혈청을 포함하는 배지에서 배양된 세포보다 감소된 VE-cad 발현량을 갖는다.
본 명세서에서 용어“(VE-cad 발현량의) 감소”는 동물 유래 혈청을 포함하는 배지에서 배양된 세포(대조군)에 비해 본 발명의 배양방법에 의해 배양된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 VE-cad 발현이 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배양방법에 의해 배양된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 동물 유래 혈청을 포함하는 배지에서 배양된 세포보다 VE-cad 발현량이 3-15%, 3-10%, 4-8% 또는 4-6% 감소된 세포이다. 이 경우, VE-cad 발현량은 당업계에 공지된 통상의 방법 예를 들어 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)을 이용하여 측정될 수 있다(참조: Ormerod, M.G. (ed.) (2000) Flow Cytometry A practical approach. 3rd edition. Oxford University Press, Oxford, UK. ISBN 0-19-963824-1).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 혈액 관류(blood perfusion)를 개선시킨다.
본 발명의 일 실시예에서 뒷다리 허혈 마우스 모델에 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 투여한 경우, 혈액 관류가 투여 후 꾸준히 증가하여 허혈에 의한 뒷다리 손상이 회복된 반면, 대조군(PBS를 투여)에서는 허혈에 의해 뒷다리가 손실되거나 다리 부위에 괴사가 나타났다. 또한, 대조군에서는 허혈 부위의 괴상 근육 퇴행이 관찰된 반면, 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 투여한 경우 근육 퇴행이 약화되었으며, 섬유증이 현저히 감소하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 근육 재생(muscle generation)을 약화시킨다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 배양된된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 또는 허혈성 하지질환이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 혈액 관류(blood perfusion)를 개선시킴으로써 허혈성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서 용어, “약제학적 유효량은”은 혈액 관류를 적절히 유도하여 상기 허혈성 질환 치료제의 약리학적 효과를 나타내는데 필요한 양을 의미한다.
본 발명에서 “약제학적 유효량”은 본 발명의 인간 제대혈 유래 내피 전구세포가 투여 대상인 개체 내에서 혈액 관류를 적절히 유도하여 허혈성 질환을 치료하는 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 “개체(subject)”란 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물을 의미한다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다. 본 발명의 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 상기 기재한 효과 중에서 원하는 효과가 도출될 때까지 투여될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 국소투여와 같은 비경구 투여이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 근육 퇴행(muscle degeneration)을 약화시킨다.
본 명세서에서 용어, “치료(treatment)”는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화(palliation), 일부 또는 완전한 완화(remission)를 포함한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다. 전형적으로 치료는 혈액 관류 유도를 위해 본 발명의 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 투여하는 경우를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 “약제학적으로 허용되는”이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나, 엑스제, 산제, 과립제, 분말제, 과립제, 정제, 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 의약 제형의 일반적인 원리에 대해서는 여러 문헌을 참고할 수 있다(W. Sheridan 및 G. Morstyn amp, Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, Cambridge University Press (1996); E. D. Ball 및 J. Lister amp, Hematopoietic Stem Cell Therapy P. Law, Churchill Livingstone (2000)). 본 발명의 약제학적 조성물은 원하는 목적, 예를 들면 허혈로 손상된 조직의 혈액 관류를 위해 표기된 지시에 따라 적당한 용기 내에 포장될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 1인당 101-1010 세포이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 종래 세포 배양방법에 의해 배양된 세포와 유사한 세포 부착능 및 증식율을 나타낸다.
(ⅲ) 본 발명에서 탯줄 유래 콜라겐 및 탯줄 추출물은 일반적인 동물 세포 및 줄기세포 배양을 위한 보조제 및 혈청 대체물로 사용할 수 있다.
(ⅳ) 본 발명의 혈관 내피 (전구)세포, 탯줄 유래 콜라겐 및 추출물은 자가 유래 물질로서 세포 이식 시 발생할 수 있는 면역거부 반응을 예방할 수 있으며, 동물 유래의 단백질원 사용을 배제함으로써 동물 유래 오염원에 의한 오염을 최소화할 수 있다.
(ⅴ) 본 발명은 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
도 1은 본 발명의 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법에 대한 개략도이다.
도 2는 탯줄 추출물의 사이토카인 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 부착 및 증식에 대한 UC-콜라겐의 효과를 확인한 결과이다. (a) UC-콜라겐 처리에 따른 세포의 형태학적 변화 측정, (b) UC-콜라겐 농도에 따른 세포 부착능 측정, (c) 배양 시간에 따른 세포 증식 측정.
도 4는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 증식에 대한 탯줄 추출물의 효과를 확인한 결과이다. (a) 탯줄 추출물 첨가 후 배양 시간에 따른 세포 증식 측정, (b) 탯줄 추출물 첨가에 따른 세포의 형태학적 변화 측정, (c) FBS 또는 탯줄 추출물 첨가에 따른 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 증식 변화, (d) 세포 동결 및 해동 후에 FBS 또는 탯줄 추출물을 첨가하여 배양한 hUCB-EPC의 생존율 비교.
도 5는 UC-콜라겐 및 UCE 조건에서 배양한 hUCB-EPC의 특성 분석 결과이다. (a) PECAM 및 vWF 발현 변화 측정(면역세포화학법), (b) PECAM 및 VE-cad 발현 변화 측정(FACS), (c) 세포표면 표지인자 발현 변화 측정(FACS), (d) 혈관-유사 관 구조 형성 여부 측정, (e) ac-LDL 흡수 능력 측정.
도 6은 뒷다리 허혈 마우스 모델에서 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 혈액 관류 개선 효과를 확인한 결과이다. (a) 뒷다리 허혈 마우스 모델에서 혈액 관류 측정, (b) 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 혈액 관류 개선 효과 확인, (c) 다리 근육에 대한 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과, (d) 다리 근육에 대한 MT 염색 결과.
도 7은 UC-콜라겐(a) 및 UCE(b) 순도에 대한 SDS-PAGE 분석 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
재료 및 방법
제대혈
인간 탯줄 및 제대혈 샘플은 차병원(한국)의 건강한 자유지원자로부터 제공받아 24시간 이내에 사용하였다. 본 발명의 연구는 기관감사위원회의 승인을 받아 수행하였다. 실험 대상 및 모든 인간 샘플에 대한 정보는 대한민국 법률에 따라 사용되었으며, 모든 인간 참가자에게 사전동의를 구하였다.
콜라겐 정제
인간 탯줄로부터 콜라겐을 수득하기 위해, 본 발명자들은 살균된 수술용 가위를 이용하여 조직은 1 cm 조각으로 절단한 다음, 증류수에 세척하였다. 바이러스 불활성화를 위해, 절단된 조직은 4℃, 70% 에탄올에 24시간 동안 담가두었다. 에탄올을 제거한 후 H2O2 용액에 12-36시간 동안 담가둔다. 조직을 분쇄하기 위해, 0.5 M 아세트산에서 균질화시킨 다음, 펩신(Sigma, 미국)에 넣고 4℃에서 24시간 동안 배양하였다. pH 7의 NaOH로 펩신을 불활성화 및 탈염시키고, 조직 현탁물을 4℃, 10,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액의 단백질은 NaCl을 이용하여 12시간 동안 침전시킨 후, 4℃, 10,000 rpm에서 30분간 원심분리한 다음, 상등액을 탈염시키고, 한외여과 시스템을 이용하여 농축하였다(1). 마지막으로, 콜라겐을 동결건조시킨 다음, 제조된 콜라겐을 하이드록시프롤린 방법을 통해 분석하였다(2).
인간 제대혈 추출물(human umbilical cord extract, UCE)
인간 탯줄 조직을 1 cm 길이 정도의 작은 조각으로 절단한 다음, PBS(Hyclone)에 담가 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 교반시킨 현탁물을 4℃, 4,500 rpm에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 수득한 다음 이를 탯줄 추출물(umbilical cord extract, UCE)이라고 명명하였다. 브래드포드 시약(Bio-Rad Laboratories, 미국)을 단백질 어세이에 이용하였다. 탯줄 추출물은 동결 건조한 다음, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다.
UC-콜라겐 및 UCE 순도에 대한 SDS-PAGE 분석
UC-콜라겐 및 UCE의 순도를 분석하기 위해, 6% 네이티브-폴리아크릴아마이드 겔 및 5% 스태킹 겔을 이용한 Laemmli 방법을 이용한 SDS-PAGE 분석법을 실시하였다(3). 95℃에서 5분간 가열한 후, 샘플(20 μg)을 웰에 로딩한 다음 분자량 마커와 함께 전기영동하였다. 겔은 0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250을 이용하여 염색한 다음, 10% 메탄올 및 10% 아세트산을 포함하는 용액을 이용하여 탈색하였다.
UCE의 사이토카인 정량분석
본 발명에서 혈청 대체물로 사용된 탯줄 추출물 시료를 Millipore사의 MILLIPLEX™ 인간 사이토카인/케모카인 패널(42-plex: EGF, Eotaxin, FGF-2, Flt-3 Ligand, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFNα2, IFNγ, IL-1ra, IL-1α, IL-1β, IL-2, sIL-2Rα, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, sCD40L, TGFα, TNFα, TNFβ 및 VEGF)을 이용하여 42개의 사이토카인에 대한 항원-항체반응 후 Luminex 200 System을 이용하여 정량분석을 수행하였다.
UCE의 사이토카인 정성분석-사이토카인 어레이
RayBio 인간 사이토카인 어레이 V 키트(RayBiotech, 미국)의 제조사 지시에 따라 탯줄 추출물에 존재하는 사이토카인을 분석하였다. 본 실험에서 사용한 어레이 멤브레인은 507개의 다른 성장인자/사이토카인을 분석할 수 있다. 간략히 설명하면, 바이오틴을 탯줄 추출물에 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응하여 바이오틴-라벨링 탯줄추출을 준비하였다. 어레이 멤브레인을 1시간동안 실온에서 블로킹 버퍼를 이용하여 블로킹 한 후, 버퍼 제거 후 바이오틴-라벨링 탯줄 추출물을 실온에서 2시간 반응하였다. 그 후 세척 버퍼로 3회 세척하고, 블로킹 버퍼에 HRP-결합 스트렙타비딘을 1:500으로 희석 후 실온에서 2시간 반응하였다. 세척 버퍼로 3회 세척 후 검출 버퍼를 처리하고, 화학발광 검출 시스템으로 관찰하였다. 얻은 닷 블롯 이미지는 Multi Gauge V3.0 프로그램을 이용하여 사이토카인 발현양을 분석 하였다.
IGFBP-7 정량 분석(효소결합면역흡착제 검정법)
IGFBP-7 enzyme-linked immunosorbent assay kit (USCN, 중국)의 제조사 지시에 따라 탯줄 추출물 내에 있는 IGFBP-7의 양을 분석하였다. 키트 메뉴얼에 따라 준비하여 표준품을 최고 농도 (600 ng/ml)에서부터 8단계로 2배씩 희석액에 희석하여 준비하였다. 탯줄 추출물의 농도가 표준품 범위 내에 들도록 희석하였다. 농도별로 희석한 표준품과 탯줄 추출물을 플레이트 웰에 각 100 μl씩 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 각 웰에 검출 시약 A를 100 μl씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 배양 후 3회 세척하였다. 각 웰에 검출 시약 B를 100 μl씩 분주한 후 37℃에서 30분 동안 배양 후 5회 세척하였다. 각 웰에 기질 용액을 90 μl씩 분주한 후 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 기질을 넣은 플레이트에 있는 표준품 용액의 색이 농도 구배에 따라 색이 변하게 되면 정지(stop) 용액을 50 μl씩 넣어 반응을 종결시켰다. 반응이 종결된 플레이트를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
인간 제대혈 유래 내피 전구세포(hUCB-EPCs)의 배양
hUCB-EPC의 배양 및 유도는 종래에 알려진 방법에 따라 실시하였다(4). 먼저, 신선한 UCB를 Histopaque-1083(Sigma-Aldrich)를 이용하여 농도구배 원심분리함으로써 단핵세포(mononuclear cells, MNC)를 분리하였다. 단핵세포를 4-6 X 106 세포/ml가 되도록 5% FBS 및 혈관 내피 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 하이드로코르티손, 아스코르브산 및 헤파린이 포함된 사이토카인 칵테일(SingleQuot; Clonetics)을 포함하는 EBM 2 배지(Walkersville, MD)에 혼합하여 콜라겐이 코팅된 조직 배양 플라스크에 분주하였다(5). 배양 4일 후, 비부착 세포를 제거하고 배지를 교체하였다. 세포를 7일간 유지시킨 다음, 특성을 분석한 후 EPC 수를 늘리는데 사용하였다.
세포 부착 및 증식율 분석
세포 부착 및 증식율을 분석하기 위해, 3 ×105개 hUCB-EPC를 콜라겐이 코팅되지 않거나, 코팅된 플레이트에 분주한 다음, UCE 또는 FBS를 추가적으로 포함하는 DMEM 또는 EGM2 배지에서 배양하였다. 세포를 모은 다음, 트립판 블루(Sigma) 염색 후 혈구계를 이용하여 세포 수를 계수하였다. 세포 부착 및 증식율은 수득한 세포로부터 트립판 블루 염색된 세포의 백분율로서 계산하였다.
면역조직화학 분석
세포는 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 다음, 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS(Gibco, 미국)를 5분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 1% 노멀 고트 혈청을 30분 동안 처리한 후, 세포에 PECAM(Millipore, 미국) 및 vWF(Abcam Inc., 미국) 항체를 4℃에서 12시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음, 로다민 및 FITC-결합 2차 항체(Molecular Probes Inc., 미국)를 1시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음, DAPI(Invitrogen, 미국)를 이용하여 핵을 염색하였다. 모든 이미지는 LSM 510 META 공초점 현미경(Carl Zeiss Inc., 독일)을 이용하여 분석하였다.
인 비트로 관 구조(tubular structure) 어세이
인 비트로에서 hUCB-EPC의 기능 분석을 수행하기 위해, 5 ×104개 세포를 마트리겔(BD Biosciences, 미국)이 코팅된 웰 플레이트에 분주한 다음, 37℃, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 관 구조 형성은 Ti 형광 현미경(Nikon, 일본)을 이용하여 측정 및 분석하였다(6).
유세포 분석
유세포 염색 및 분석은 종래에 알려진 방법에 따라 실시하였다(7). 먼저, hUCB-EPC를 100 μL 2% FBS가 포함된 PBS(rinsing buffer)로 부유시키고, 항체를 처리하여 배양하였다. 세척 후, 세포를 분석장비는 FACS(Caliber Flow Cytometer, BD Bioscience)를 사용하여 분석하였으며, CELL Quest software(BD Bioscience) 프로그램으로 세포의 반응 효율을 측정하였다.
FACS 칼리버 유세포 분석기에 장착된 세포 퀘스트 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 항체로는 PE(phycoerythrin)-결합 마우스 항-인간 CD31(BD Biosciences) 항체 및 PE-결합 마우스 항-인간 VE-cad(BD Biosciences) 항체를 사용하였다. 유세포 데이터는 아이소타입-매치 IgG 및 염색하지 않은 대조군을 대조군으로 사용하여 분석하였다.
또한, UCE 배양 EPC의 특성분석을 위해 세포 표면 표지인자에 대한 유세포 분석을 수행하였다. 배양세포는 PBS 세척 후, 세포 분리 버퍼(Gibco)를 5분간 처리하여, 단일 세포로 분리한 후, 10% FBS가 포함된 PBS로 세척하였다. 세척한 세포는 상온에서 15분간 PE가 결합된 각각의 세포 표면 표지 인자 (CD31, CD34, CD105, CD90 및 CD45)들과 2% FBS가 포함된 PBS에서 반응시켜 염색한 후, PBS 로 세척하였다. 염색된 세포는 유세포 분석기를 통해 분석하였다.
ac-LDL 흡수 기능성 평가
UCE 배양 EPC의 기능 검증법을 수행하기 위해, EPC의 아세틸화 저밀도 지방 단백질(ac-LDL)의 흡수(uptake) 능력을 알아보기 위해 Dill-labeled-ac-LDL (Biomedical Technologies, 미국)을 10 μg/mL 의 농도로 배양액에 첨가한 후 4시간 동안 37°C 에서 반응시켰다. 반응이 끝나고 PBS로 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드로 20분 동안 고정 시킨 뒤, 형광현미경을 통해 ac-LDL 흡수 세포를 관찰하였다(8).
하지 허혈 마우스 모델의 제작
6-7 주령의 면역 결핍 누드 마우스(Balb/C Nude, Charles River Laboratories 사)에 케타민(ketamine)과 럼푼(Rumpun)을 4:1의 비율로 조제한 마취제를 마리당 50 μl의 양으로 복강 주사하였다. 마취된 마우스를 고정하여 배와 대퇴부 경계면의 피부를 1 cm 정도 세로로 절개한 후, 배와 대퇴부 경계면의 지방을 제거하였다. 외장골 동맥(Iliac artery)을 따라 배쪽의 총 외장 동맥(common illiac artery)을 4-0 블랙 실크 봉합사로 두 번 묶어 주었다. 외장골 동맥을 따라 발목 부분에서 두 갈래로 나뉘는 혈관 바로 위를 한번 묶어 주었다. 발목 혈관 매듭 위에서부터 대퇴부 매듭 아래까지 혈관을 잘 잡아서 근육이 최대한 손상되지 않게 혈관만 박리하였다. 조직을 정리한 후 피부를 봉합하였다.
하지 허혈 동물 모델로의 제대혈 유래 혈관전구세포 이식
상기 배양된 제대혈 유래 혈관전구세포를 제작된 하지허혈 동물 모델에 이식하였다. 6마리의 실험군 동물모델에 세포 이식 시, 3×106의 혈관전구세포를 100 μl의 PBS 용액과 섞어 인슐린 실린지를 이용하여, 하지허혈 동물 모델 제작부위 (혈관 제거 주변 근육) 4군데로 나누어 주사하여 세포를 이식하였다.
제대혈 유래 혈관전구세포의 효력 검증을 위해 동일한 방법으로 제작된 6마리의 하지허혈 동물 모델에 비교군으로 PBS 용액 (100㎕)을 세포이식과 동일한 방법으로 주입한 후, 4주간 혈류량의 증감을 측정하였으며, 세포 이식 4주후 조직학 분석을 실시하였다.
레이저 도플러 이미지 분석
레이저 도플러 이미지 분석은 종래에 알려진 방법에 따라 실시하였다(7). 레이저 도플러 관류 영상장치(Moor Instruments, 영국)는 EPC 처리 후 0, 7, 14 및 28일 째에 뒷다리에서의 혈류를 측정하기 위해 사용되었다. 무릎관절부터 발가락까지의 혈류를 정량화하기 위해 디지털 색 코드 이미지를 분석하고, 관류값을 계산하였다.
조직학적 분석
조직 염색을 실시하기 위해, 마우스를 해부하고 이식 후 4주째에 허혈성 다리 조직을 회수하였다. 조직을 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, 파라핀에 포매하였다. 파라핀 블록을 4 μm 두께로 절단한 다음, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 허혈성 조직에서 섬유증을 평가하기 위해 MT(Masson’s trichrome) 콜라겐 염색을 수행하였다. 양성대조군으로 사용된 정상 다리 근육은 수술과정을 거치지 않았다.
통계학적 분석
정량적 데이터는 ±표준편차로 표시하였다. 통계학적 분석은 SPSS 소프트웨어(SPSS Inc., 미국)를 이용한 일원배치 분산분석(ANOVA)으로 실시하였다. p < 0.05 값은 유의한 것으로 평가하였다.
실험결과
hUCB-EPC에 대한 제노프리 자가조직 배양 시스템
EPC는 신생아의 제대혈로부터 분리하였으며, 자가조직 ECM(콜라겐) 및 혈청 대체물(탯줄 추출물)을 첨가하여 인 비트로에서 배양하였다. EPC는 제노프리(xeno-free) 자가조직 배양 시스템에서 배양되었으며, 추후 사용을 위해 냉동보존 할 수 있다(도 1).
UC-콜라겐 및 UCE 순도에 대한 SDS-PAGE 분석 결과
정제한 UC-콜라겐 타입 I과 판매되고 있는 2개의 콜라겐 타입 I 제품(Vancouver, 캐나다, Bioland, 한국)의 전기영동이동도를 SDS-PAGE 결과로부터 분석하였다(도 7a). 또한, SDS-PAGE 상에서 UCE 및 우태아혈청(Hyclone, 미국)을 비교하였다(도 7b).
UCE의 사이토카인 정량분석
사이토카인 정량분석 결과, 평균 1,400 pg/ml FGF-2, 1,480 pg/ml G-CSF, 860 pg/ml MCP-1, 900 pg/ml GRO, 700 pg/ml IL-1ra 및 620 pg/ml IP-10이 추출되는 사이토카인 중에서 주된 성분으로 확인되었다(도 2).
UCE의 사이토카인 정성분석
상기 방법에 의해 제조된 탯줄 추출물의 정성분석결과, 아디포넥틴(Adiponectin), 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), 안지오포이에틴-유사 1(Angiopoietin-like 1), BDNF, BMPR-IB, CCR7, CCR8, CCR9, 코르딘-유사 2(Chordin-Like 2), CNTF, CXCL11, CXCL14, CXCR1, CXCR2, 에리스로포이에틴(Erythropoietin), FGF R4, 폴리스타틴(Follistatin), 폴리스타틴-유사 1(Follistatin-like 1), 칼렉틴-3(Galectin-3), GASP-1, GDF-15, 글루카곤(Glucagon), Glut2, Glut5, 글리피칸 5(Glypican 5), HB-EGF, ICAM-5, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-7, IL-1 ra, IL-17C, IL-17F, IL-23, IL-29, IL-4 R, 레프티-A(LeftyA), 렙틴 R(Leptin R), 리포칼린-1(Lipocalin-1), 루시퍼라아제(Luciferase), M-CSF, MDC, MFG-E8, MIF, MIP-1a, OSM, 오스테오액티빈(Osteoactivin), 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin), Pref-1, 프로락틴(Prolactin), ROBO4, SIGIRR, Siglec-9, TGF-베타 5, 트롬보스폰딘(Thrombospondin), 트롬보스폰딘-1(Thrombospondin-1), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), 토모레굴린-1(Tomoregulin-1), TNF RII, TRADD 및 uPA을 주요 성분으로 포함하였다.
IGFBP-7 정량 분석 결과
상기 정성 분석의 결과에 따라 IGFBP7의 양은 209.86 ± 20.5 μg/g 으로 측정되었다. 상기 IGFBP7 단백질의 정량 분석은 UCE의 특성을 파악하고자 수행하였다. 이는 매회 제조마다 가장 높거나 또는 상위에서 발현되는 사이토카인으로서 UCE 특성 유지에 중요한 지표가 될 것으로 생각한다.
hUCB-EPC의 부착 및 증식에 대한 UC-콜라겐의 효과
3 × 105 개 hUCB-EPC를 코팅되지 않은 플레이트, 양성대조군으로서 콜라겐 제품이 0.02% 코팅된 플레이트 또는 다양한 농도(1, 25 및 50 μg/ml)의 UC-콜라겐이 코팅된 플레이트에 분주하였다. 세포 부착 및 증식율 평가에 이용되는 모든 실험군의 세포는 10% FBS를 추가적으로 포함하는 DMEM 배지에서 3일간 배양되었다. 현미경 관찰 결과, 모든 실험군의 세포는 분주 후 24시간에 잘 부착되어 있었으며(도 3a, 좌측패널), 각 실험군 간의 실제 부착력은 통계학적으로 유의성을 나타내지 않았다(도 3b). 다른 코팅 물질에 대한 hUCB-EPC의 증식능을 확인하기 위해, 모든 실험군에서 세포 분주 후 24시간째의 증식을 관찰하였다. 그러나 UC-콜라겐(25, 50 μg/ml) 및 콜라겐 제품이 코팅된 플레이트에서 배양한 hUCB-EPC는 일정한 증식율을 보이며, 분주 후 72시간까지 8 × 105 개의 세포로 증식하였다(도 3c). 콜라겐을 코팅하지 않은 플레이트 및 UC-콜라겐(1 μg/ml)이 코팅된 플레이트에서 배양한 hUCB-EPC는 분주 후 72시간까지 4 × 105 개의 세포로 증식되어 낮은 증식율을 나타냈다(도 3c). UC-콜라겐(25, 50 μg/ml) 및 콜라겐 조건에서 배양한 hUCB-EPC는 분주 후 72시간에 플레이트에 가득 채운 반면, 콜라겐을 코팅하지 않은 플레이트 및 UC-콜라겐(1 μg/ml)이 코팅된 플레이트에서 배양한 경우에는 세포 증식이 보다 낮은 수준을 나타내는 것을 현미경 관찰을 통해서도 확인하였다(도 3a, 우측패널). 이러한 데이터는 적정한 농도의 UC-콜라겐(25, 50 μg/ml)은 판매되는 콜라겐과 비슷한 수준으로 hUCB-EPC의 증식을 돕는다는 것을 의미한다.
UCE는 hUCB-EPC의 증식을 효과적으로 유도함
세포 증식을 돕기 위해 hUCB-EPC는 보통 추가적으로 5% FBS를 포함하는 EGM2 배지[사이토카인 칵테일(SingleQuot; Clonetics)을 추가적으로 포함하는 EBM2 배지(Clonetics)]에서 배양한다(5). 그러나, 이러한 배양방법은 종간 교차오염 가능성을 가지고 있어 인간에 대한 의학적 적용에 적합하지 않다. UCE가 동물유래 FBS를 대체할 수 있는지 확인하기 위해, 5% FBS 또는 UCE(0.1, 0.5, 및 1.0 mg/ml)를 추가적으로 포함하는 EGM2 배지를 이용하여 UC-콜라겐이 코팅된 플레이트에서 hUCB-EPC를 3일간 배양하였다. 정량적 분석 결과, 5% FBS 또는 UCE(0.1, 0.5, 및 1.0 mg/ml) 배양 조건에서 분주 후 4, 24 및 72시간째의 세포 증식은 현저한 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 0.1 mg/ml UCE를 포함하는 배지에서 배양한 세포의 증식은 현저하게 감소하였다(도 4a). 현미경 관찰 결과, 세포 부착능 및 증식능 면에서도 5% FBS 및 0.5 mg/ml UCE 배양조건에 대한 시각적 차이는 확인되지 않았다(도 4b).
또한, 본 발명자들은 5% FBS 및 0.5 mg/ml UCE를 추가적으로 포함하는 EGM2 배지에서 hUCB-EPC의 증식을 비교하였다. 각 계대에서 hUCB-EPC의 증식은 5% FBS 포함 배지에서 배양된 1 계대 hUCB-EPC로 표준화하였다. 실험결과, FBS 존재하에서 배양된 hUCB-EPC의 증식은 계대 별로 변이를 나타냈다. 반면, UCE 조건에서 배양한 hUCB-EPC의 증식은 계대 별로 일정한 수준을 나타냈다(도 4c). 동결 융해 사이클 후에 0.5 mg/ml UCE 조건에서 배양한 hUCB-EPC의 생존율은 FBS 조건에서 배양한 hUCB-EPC의 생존율과 비교하여 통계학적으로 차이를 나타내지 않았다(도 4d). 이러한 결과는 UCE가 증식능에 영향을 미치지 않고 인 비트로 세포 배양에 있어서 동물 유래 FBS를 대체할 수 있다는 것을 나타낸다.
UC-콜라겐 및 UCE 조건에서 배양한 hUCB-EPC의 특성 분석
UC-콜라겐 및 UCE 조건에서 배양된 hUCB-EPC에서 주요 특징 및 기능적 특성이 변하는지 확인하기 위해 내피 특이적 마커인 PECAM 및 vWF에 대한 항체를 이용하여 면역세포화학법을 실시하였다. 본 발명의 신규한 배양 시스템에서 배양된 hUCB-EPC는 표준 배양 조건(5% FBS를 추가적으로 포함하는 EGM2 배지, 도 5a)에서 배양된 hUCB-EPC와 비교하여 PECAM 및 vWF를 높은 수준으로 발현한다. FACS 분석 결과, PECAM 양성 세포의 백분율은 상기 두 가지 배양 조건에서 배양된 hUCB-EPC에서 사실상 같았다. 본 발명의 신규 배양조건에서 배양된 세포에서 VE-cad(84.62%)를 발현하는 세포가 높은 비율로 관찰되었는데 이는 표준 배양조건(90.96%, 도 5b) 보다 5% 낮은 수준이다.
FACS 분석 결과, 대조군과 hUCB-EPC 처리군 모두에서 대표적인 EPC 세포 표면 표지인자 CD34, CD31, CD105의 발현 양상은 높은 반면, 대표적인 혈액전구세포 표면 표지인자 CD45, MSC 표면 표지인자 CD90의 경우 현저하게 낮은 발현 양상을 나타냈다(도 5c).
본 발명의 배양 시스템에서 배양된 hUCB-EPC의 기능적 특징을 확인하기 위해, 표준 배양 조건에서 배양된 hUCB-EPC를 마트리겔에 플레이팅하였다. 두 가지 조건의 배양 시스템에서 배양된 세포는 혈관-유사 관 구조를 나타냈다(도 5d). 결과들을 종합하여 볼 때, 자가조직 ECM 및 혈청으로 구성된 본 발명의 신규 배양 시스템은 hUCB-EPC의 특성 및 기능을 변화시키지 않는다. 더불어 대표적인 인 비트로 EPC 기능성 평가 항목인 ac-LDL 흡수 능력을 평가한 결과, 대조군과 실험군 모두에서 ac-LDL의 높은 발현 양상을 확인할 수 있었다(도 5e).
hUCB-EPC는 뒷다리 허혈 마우스 모델에서 혈액 관류를 개선시키고 근육 퇴행을 약화시킴
본 발명의 신규 배양 시스템 하에서 배양한 hUCB-EPC의 치료제로서의 가능성을 평가하기 위해, 뒷다리 허혈 마우스 모델을 제작하고 레이저 도플러 관류 영상장치를 이용하여 혈액 관류를 측정하였다(도 6a). PBS를 투여한 대조군에서는 투여 후 28일 째에 뒷다리의 손실 또는 다리 부위 괴사가 나타났으나, hUCB-EPC를 처리한 군에서는 뒷다리 손상이 회복되었다(도 6a). PBS를 처리한 마우스에서 이식 후 3주 동안 7일 간격으로 혈류를 측정한 결과, 허혈 부위에서 혈류는 낮은 것으로 나타났다. PBS 대조군과 비교하여 hUCB-EPC를 이식한 후 7일 째 혈액 관류의 현저한 증가는 관찰되지 않았다(도 6b). 혈액 관류는 hUCB-EPC 이식 이후 28일째까지 꾸준히 증가하였으며, 이는 PBS 투여 마우스 보다 5배 이상 높은 혈액 관류를 나타냈다(도 6b, *P<0.05). 허혈 다리에 대한 조직학적 평가 결과, 허혈에 의한 괴사성 손상에 대해 hUCB-EPC 이식은 다리 근육을 보호하는 것으로 확인되었다. 대조군(PBS 투여)의 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과, 혀헐 부위에서 괴상(massive) 근육 퇴행이 관찰되었다(도 6c). 반면, hUCB-EPC를 이식한 마우스의 허혈 다리에서의 근육은 세포 이식 후 보호되었다(도 6c). 또한, MT 염색 결과, PBS 처리 대조군과 비교하여 hUCB-EPC를 처리한 군에서 섬유증이 현저하게 감소되었다(도 6c).
참고문헌
[1] K. Sobolewski, E. Bankowski, L. Chyczewski, S. Jaworski, Biology of the neonate 1997, 71, 11.
[2] G. K. Reddy, C. S. Enwemeka, Clinical biochemistry 1996, 29, 225.
[3] U. K. Laemmli, Nature 1970, 227, 680.
[4] M. R. Finney, N. J. Greco, S. E. Haynesworth, J. M. Martin, D. P. Hedrick, J. Z. Swan, D. G. Winter, S. Kadereit, M. E. Joseph, P. Fu, V. J. Pompili, M. J. Laughlin, Biology of blood and marrow transplantation : journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation 2006, 12, 585.
[5] M. Hristov, C. Weber, Journal of cellular and molecular medicine 2004, 8, 498.
[6] S. H. Moon, J. S. Kim, S. J. Park, H. J. Lee, J. T. Do, H. M. Chung, Biomaterials 2011, 32, 6445.
[7] S. W. Cho, S. H. Moon, S. H. Lee, S. W. Kang, J. Kim, J. M. Lim, H. S. Kim, B. S. Kim, H. M. Chung, Circulation 2007, 116, 2409.
[8] Cho SW, Moon SH, Lee SH, Kang SW, Kim J, Lim JM, Kim HS, Kim BS, Chung HM: Circulation 2007;116:2409-2419.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 다음 단계를 포함하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법:
    (a) 인간 탯줄로부터 분리된 콜라겐으로 도포된 배양접시에 인간 제대혈 유래 내피 전구세포를 접종하는 단계; 및
    (b) 상기 인간 제대혈 유래 내피 전구세포가 접종된 상기 배양접시에 인간 탯줄 추출물이 첨가된 배양배지를 첨가 및 배양하는 단계,
    상기 탯줄 추출물은 (1) 분리된 탯줄을 절단하는 단계; (2) 상기 절단된 탯줄을 완충액에 넣는 단계; (3) 상기 단계 (2)의 결과물을 교반하는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3)의 결과물을 원심분리하여 탯줄 추출물로서 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 콜라겐은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법:
    (a) 분리된 인간 탯줄을 절단하는 단계;
    (b) 상기 절단된 탯줄을 70% 에탄올에 넣는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 결과물로부터 에탄올을 제거한 후 H2O2 용액을 첨가하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물에 아세트산을 첨가하고 균질화하는 단계;
    (e) 상기 단계 (d)의 결과물에 펩신을 첨가하고 배양하는 단계;
    (f) 상기 단계 (e)의 결과물에 NaOH를 첨가하고 원심분리하여 콜라겐을 포함하는 상등액을 수득하는 단계.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 배양방법은 단계 (a) 이전에 인간 제대혈로부터 수득한 단핵구 세포(mononuclear cells)를 배양하고, 배양된 세포로부터 비부착(nonadherent) 세포를 제거하여 내피 전구세포로서 단핵구 세포를 수득하는 단계를 추가적으로 포함하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 동물 유래 혈청을 포함하는 배지에서 배양된 세포보다 감소된 VE-cad 발현량을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 혈액 관류(blood perfusion)를 개선시키는 것을 특징으로 하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 제대혈 유래 내피 전구세포는 근육 퇴행(muscle degeneration)을 약화시키는 것을 특징으로 하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 탯줄 추출물은 800-2,200 pg/ml FGF-2(fibroblast growth factor-2), 1,000-2,000 pg/ml G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), 500-1,500 pg/ml MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1), 300-2,000 pg/ml GRO(growth regulated oncogene), 300-1,500 pg/ml IL-1ra(Interleukin-1 receptor antagonist) 및 200-1,700 pg/ml IP-10(IFN-gamma inducible protein-10)을 주요 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 탯줄 추출물은 아디포넥틴(Adiponectin), 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), 안지오포이에틴-유사 1(Angiopoietin-like 1), BDNF, BMPR-IB, CCR7, CCR8, CCR9, 코르딘-유사 2(Chordin-Like 2), CNTF, CXCL11, CXCL14, CXCR1, CXCR2, 에리스로포이에틴(Erythropoietin), FGF R4, 폴리스타틴(Follistatin), 폴리스타틴-유사 1(Follistatin-like 1), 칼렉틴-3(Galectin-3), GASP-1, GDF-15, 글루카곤(Glucagon), Glut2, Glut5, 글리피칸 5(Glypican 5), HB-EGF, ICAM-5, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-7, IL-1 ra, IL-17C, IL-17F, IL-23, IL-29, IL-4 R, 레프티-A(LeftyA), 렙틴 R(Leptin R), 리포칼린-1(Lipocalin-1), 루시퍼라아제(Luciferase), M-CSF, MDC, MFG-E8, MIF, MIP-1a, OSM, 오스테오액티빈(Osteoactivin), 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin), Pref-1, 프로락틴(Prolactin), ROBO4, SIGIRR, Siglec-9, TGF-베타 5, 트롬보스폰딘(Thrombospondin), 트롬보스폰딘-1(Thrombospondin-1), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), 토모레굴린-1(Tomoregulin-1), TNF RII, TRADD 및 uPA로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 포함하는 인간 제대혈 유래 내피 전구세포의 배양방법.
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US20180344777A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Janssen Biotech, Inc. Method of modulating müller glia cells
FR3070262B1 (fr) * 2017-08-23 2020-10-16 Tbf Genie Tissulaire Tbf Composition comprenant de la gelee de wharton, procede de preparation et utilisations
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CN117323411A (zh) * 2023-11-02 2024-01-02 徐州医科大学附属医院 破伤风类毒素在脐带干细胞损伤治疗中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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