TW201734054A

TW201734054A - 胞漿素原活化素抑制劑-１（ｐａｉ-１）之抗體及其用途

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Publication number: TW201734054A
Application number: TW106104833A
Authority: TW
Inventors: 艾拉皮茲克; 派翠克葛拉; 亞歷克斯拉克; 麥格里馬修; 克里斯摩根; 尼可拉斯保林; 布魯諾波拉; 西里達沃; 法蘭斯杜菲克斯; 漢李; 多羅西可米諾; 菲力浦傑尼克
Original assignee: 賽諾菲公司
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2014-08-11
Publication date: 2017-10-01
Also published as: WO2015023752A1; EA201991409A2; MA44593A1; EP3620472A1; UY35703A; TW201520229A; MA44593B1; EA201991409A3; SG11201600928SA; IL244018A0; TW201722994A; CA2920890A1; TWI592426B; AU2014306649A1; EP3033359A1; EP3033359B1; MA38828A1

Abstract

本發明提供特異性結合第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的抗體。本發明還提供醫藥組成物，以及編碼抗PAI-1抗體的核酸，用於生成此類抗體的重組達現載體和宿主細胞，或其片段。還提供在體外或在體內使用抗體來調控PAI-1活性或檢測PAI-1的方法。本揭示進一步提供生成處於活性構象狀態的特異性結合PAI-1的抗體的方法。

Description

胞漿素原活化素抑制劑-1(PAI-1)之抗體及其用途

第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)是組織型胞漿素原活化素(tPA)和尿激酶型胞漿素原活化素(uPA)，負責胞漿素生成的關鍵絲胺酸蛋白酶，的主要抑制劑。PAI-1通過在血管區室中抑制胞漿素原活化來調節纖維蛋白溶解。纖維蛋白溶解是用於降解通過凝血級聯的活化而形成的纖維蛋白凝塊的嚴密協調的過程。凝血/纖維蛋白溶解平衡的調節異常導致異常的血液凝集事件，如流血或栓塞性疾病。PAI-1亦為細胞周圍區室(血管內的和組織的)中胞漿素原活化的關鍵調節物，在所述區室中，受體結合的胞漿素原主要通過結合域尿激酶受體(uPAR)的尿激酶活化。通過抑制細胞周圍的蛋白水解，PAI-1調節多種細胞功能，如胞外基質(ECM)降解，生長因子活化和從ECM釋放，基質金屬蛋白酶(MMP)活化，和細胞凋亡。近來，已通過PAI-1與輔因子(如玻連蛋白(vitronectin)，肝素，糖胺聚糖)、uPAR-尿激酶複合物或細胞受體(LRP：低密度脂蛋白受體相關蛋白)或整聯蛋白(其影響細胞功能如粘附/解附、遷移、增值和胞內生物活性)的相互作用鑒定了其非蛋白酶作用。通過這些細胞機制和抗纖維蛋白溶解作用，已在腫瘤生長和轉移、纖維化、急性心肌梗塞和代謝疾病如動脈粥樣硬化、肥胖和糖尿病中確立了PAI-1的致病作用。

人SERPINE1(PAI-1)基因位於第7染色體，其由八個內含子和九個外顯子組成，並具有12,169 b的大小(Klinger,K.W.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：8548,1987)。PAI-1是來自SERPIN(絲胺酸蛋白酶抑制劑)超家族的大約50kDa(379個胺基酸)的單鏈糖蛋白，其以活性構象合成，但在玻連蛋白(Vn)不存在下自發地變為潛伏的。玻連蛋白，PAI-1的主要輔因子，以反應性中心環(RCL)穩定化活性構象，所述環大約20個胺基酸並暴露於表面。PAI-1的兩個主要靶(tPA和uPA)的抑制的機制是自殺抑制。PAI-1的RCL區攜帶誘餌肽鍵(R346-M347，亦稱作P1-P1’)，其攜帶該絲胺酸的切割位點。首先形成與tPA或uPA的Michaelis複合物，然後催化三元組與誘餌肽鍵反應以形成醯基酶複合物，當切割P1-P’1肽鍵之後，該複合物誘導強烈的構象變化。該構象變化導致切割的PCL***β-鏈，且蛋白酶作為醯基酶保持與PAI-1的共價結合。在非生理情況下，該醯基酶複合物的水解可能誘導切割的PAI-1的釋放並使得活性蛋白酶游離(Blouse等，Biochemistry,48：1723,2009)。

PAI-1以高度可變的濃度(nM範圍)在血液中迴圈，並相對於t-PA或uPA濃度是過量的。PAI-1顯示結構可塑性，並可見於三種構象之一：(1)潛伏的構象，(2)有活性的構象，或(3)基質構象(見圖1)。PAI-1主要作為與玻連蛋白的非共價複合物(Kd~1nM)存在，其使得潛伏性轉換減少1.5至3倍。潛伏的、切割的或符合的PAI-1對玻連蛋白的親和力顯著減少。基質結合的玻連蛋白亦位於細胞周圍空間中的PAI-1處。內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞合成該PAI-1，然後其由血小板可作為潛伏形式大量儲藏(在α粒中)。PAI-1是融合中tPA和uPA迅速而特異的抑制劑(二級速率常數為106至107M-1s-1)，但對於結合於纖維蛋白或其細胞受體的蛋白酶不具活性。其它蛋白酶如凝血酶、胞漿素、活化的蛋白C亦可由PAI-1抑制，但效力較低。

自從人PAI-1的潛伏構象的3D結構於1992年首先描述以來，已經辨析了數個所述3D結構(Mottonen等，Nature 355：270,1992)。這些3D結構包括基質中的PAI-1突變形式(Aertgeerts等，Proteins 23：118,1995)，穩定化的活性構象(Sharp等，Structure 7：111,1999)，複合於玻連蛋白-體介素(somatomedin)B域的PAI(Zhou等，Nat.Struct.Biol.10：541,2003)，或連同來自RCL環的抑制性五肽(Xue等，Structure 6：627,1998)。最近，潛伏構象的小鼠PAI-1結構由Dewilde等(J Struct.Biol.171：95,2010)闡明，並揭示了其在RCl位置，門戶區，和α-helix A的位置方面與人PAI-1的差異。PAI-1中的結構/功能關係已通過使用超過600個突變蛋白加以研究(由De Taeye等，Thromb.Haemost.92：898,2004綜述)以定位該多功能性絲胺酸蛋白酶抑制劑的多種活性所涉及的域。

因為PAI-1可由幾乎每種細胞類型(包括肝細胞、脂肪細胞、腎小球膜細胞、成纖維細胞、成肌纖維細胞、和上皮細胞)合成，其表現在生理(例如血漿PAI-1濃度的晝夜差異)和病例條件(例如肥胖、代謝綜合征、胰島素抗性、感染、炎性疾病、癌症)下差異巨大。認為PAI-1是急性期蛋白。PAI-1mRNA表現的轉錄調節由數種細胞因子和生長因子(例如TGF β，TNF α，EGF，FGF，胰島素，血管緊張素II & IV)，激素(例如醛甾酮，糖皮質激素，PMA，高葡萄糖)和緊迫因子(例如缺氧，反應性氧物種，脂多糖)誘導。

而且，在PAI-1基因的啟動子(位置-675)中的多態性影響表現水準。4G等位基因增加PAI-1濃度，且4G/4G變體(發生於大約群體中的25%)與5G/5G(25%發生率)和4G/5G(50%發生率)相比誘導血漿PAI-1濃度增加大約25%。4G/4G多態性與心肌梗塞(Dawson等，Arterioscler Thromb.11：183，1991)特異類型的肺纖維化(特發性間質性肺炎)(Kim等，Mol Med.9：52，2003)相關，且4G/4G基因型供體組由於間質性纖維化和腎小管萎縮對於腎臟移植物喪失是獨立的風險因子(Rerolle等，Nephrol.Dial.Transplant 23：3325，2008)。

在栓塞性疾病如動脈和靜脈栓塞，急性心肌梗塞，和動脈粥樣硬化中，已將數種致病作用歸咎於PAI-1。其涉及於代謝疾病如胰島素抗性綜合征和肥胖已得到充分確認。亦已知PAI-1對於數種器官為增殖因子，並已顯示其在纖維化組織(即肝、肺、腎、心、腹腔粘連、皮膚：瘢痕或硬皮病)中過表現(由Ghosh和Vaughan，J.Cell Physiol.227：493，2012綜述)。在不同模型如肝(膽總管結紮或異型生物質)、腎(單側輸尿管結紮模型(UUO))、肺(博來黴素吸入)中，PAI-1敲除(KO)小鼠免於纖維化(Bauman等，J.Clin.Invest. 120：1950，2010；Hattori等，Am.J.Pathol.164：1091，2004；Chuang-Tsai等，Am.J.Pathol.163：445，2003)，而在心臟中，該缺失免於誘導性纖維化(Takeshita等，AM.J.Pathol.164：449，2004)，但易感年齡依存性心臟選擇性纖維化(Moriwaki等，Cric.Res.95：637，2004)。已報導通過siRNA(Senoo等，Thorax 65：334，2010)或化學化合物(Izuhara等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.28：672，2008；Huang等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.46：87，2012)下調PAI-1表現減少肺纖維化，而野生型的PAI-1過表現(Eitzman等，J.Clin.Invest.97：232，1996)或僅保留玻連蛋白結合而非tPA抑制劑功能的PAI-1突變體加劇了肺纖維化(Courey等，Blood 118：2313，2011)。

膽總管結紮(BDL)肝纖維化由中和PAI-1的抗體減輕(美國專利號7,771,720)，而siRNA所致的下調減輕BDL和異型生物質誘導的肝纖維化(Hu等，J.Hepatol.51：102，2009)。PAI-1 KO小鼠免於BDL中膽汁淤積誘導的肝損傷和纖維化(Bergheim等，J.Pharmacol.Exp.Ther.316：592，2006；Wang等，FEBS Lett.581：3098，2007；Wang等，Hepatology 42：1099，2005)和免於血管緊張素II誘導的肝纖維化(Beier等，Arch.Bioch.Biophys.510：19，2011)。

PAI-1 KO小鼠在UUO模型中(Oda等，Kidney Int.60，587，2001)，在糖尿病腎病中(Nicholas等，Kidney Int.67：1297，2005)和血管緊張素II誘導的腎病中(Knier等，J.Hypertens.29：1602，2011；關於綜述，參見Ma等Frontiers Biosci.14：2028，2009和Eddy A.A.Thromb.Haemost.101：656，2009)免於腎纖維化。已顯示非抑制性PAI-1突變體(PAI-1 R)在大鼠中的實驗性腎小球腎炎(thy1)中通過減少尿蛋白表現和腎小球基質蓄積(Huang等，Kidney Int.70：515，2006)保護小鼠免於發生纖維化。阻斷PAI-1的肽在UUO小鼠中抑制膠原蛋白3、4和纖連蛋白(fibronectin)蓄積(Gonzalez等，Exp.Biol.Med.234：1511，2009)。

對於過去20年，PAI-1，作為多種病理學靶標，已成為抑制其活性或調節其表現深入研究的焦點。已設計了化學化合物(Suzuki等，Expert Opin.Investig.Drugs 20：255，2011)，單株抗體(Gils和Declerk，Thromb Haemost；91：425，2004)，肽，突變體(Cale和Lawrence，Curr.Drug Targets 8：971，2007)，siRNA或反義RNA以抑制其多種功能或調節其表現。然而，儘管深入研究，仍需解決開發PAI-1治療上有效的調製劑。因此，在本領域存在對於抑制PAI-1活性以供用於PAI-1介導的人類疾病的新穎藥劑的需求。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：6中的CDR1(SEQ ID NO：34)，CDR2(SEQ ID NO：33)，和CDR3(SEQ ID NO：32)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：7中的CDR1(SEQ ID NO：37)，CDR2(SEQ ID NO：36)，和CDR3(SEQ ID NO：35)。另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：6的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：7的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：6為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：7為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。所有%同一性近似值指示最小%同一性；本揭示文本還涵蓋比所述數值要高的%同一性。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：34的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：36的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：6中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：7中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：2中的CDR1(SEQ ID NO：22)，CDR2(SEQ ID NO：21)，和CDR3(SEQ ID NO：20)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：3中的CDR1(SEQ ID NO：25)，CDR2(SEQ ID NO：24)，和CDR3(SEQ ID NO：23)。另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：2的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：3的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：2為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：3為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：22的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：21的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：20的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：25的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：24的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：23的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：26中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：3中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：4中的CDR1(SEQ ID NO：28)，CDR2(SEQ ID NO：27)，和CDR3(SEQ ID NO：26)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：5中的CDR1(SEQ ID NO：31)，CDR2(SEQ ID NO：30)，和CDR3(SEQ ID NO：29)。另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：4的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：5的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：4為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：5為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

另一方面，本文中揭示一種分離的特異性結合PAI-1的單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：28的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：27的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：26的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：31的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：30的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：29的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：4中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：5 中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：8中的CDR1(SEQ ID NO：40)，CDR2(SEQ ID NO：39)，和CDR3(SEQ ID NO：38)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：9中的CDR1(SEQ ID NO：43)，CDR2(SEQ ID NO：42)，和CDR3(SEQ ID NO：41)。另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：8的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：9的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：8為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：9為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：40重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：39的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：38的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：43的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：42的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：41的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：8中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：9中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：10中的CDR1(SEQ ID NO：52)，CDR2(SEQ ID NO：51)，和CDR3(SEQ ID NO：50)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：11中的CDR1(SEQ ID NO：55)，CDR2(SEQ ID NO：54)，和CDR3(SEQ ID NO：53)。另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：10的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：11的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：10為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：11為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：52的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：51的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：50的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：55的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：54的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：53的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：10中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：11中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：12中的CDR1(SEQ ID NO：58)，CDR2(SEQ ID NO：57)，和CDR3(SEQ ID NO：56)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：13中的CDR1(SEQ ID NO：61)，CDR2(SEQ ID NO：60)，和CDR3(SEQ ID NO：59)。另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：12的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：13的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：12為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：13為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，且包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：58的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：57的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：56重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：61的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：60的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：59的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：12中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：13中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：14中的CDR1(SEQ ID NO：64)，CDR2(SEQ ID NO：63)，和CDR3(SEQ ID NO：62)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15中的CDR1(SEQ ID NO：67)，CDR2(SEQ ID NO：66)，和CDR3(SEQ ID NO：65)。另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：14的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：15的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：14為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：15為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：64的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：63的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：62的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：67的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：66的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：65的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：14中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈與SEQ ID NO：15中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：16中的CDR1(SEQ ID NO：70)，CDR2(SEQ ID NO：69)，和CDR3(SEQ ID NO：68)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17中的CDR1(SEQ ID NO：73)，CDR2(SEQ ID NO：72)，和CDR3(SEQ ID NO：71)。

另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：16的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：17的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：16為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：17為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：70的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：69的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：68的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：73的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：72的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：71的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：16中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：17中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文中揭示一種特異性結合人第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：80中的CDR1(SEQ ID NO：46)，CDR2(SEQ ID NO：45)，和CDR3(SEQ ID NO：44)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：81中的CDR1(SEQ ID NO：49)，CDR2(SEQ ID NO：48)，和CDR3(SEQ ID NO：47)。

另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：80的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：81的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：80為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：81為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：46的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：45的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：44的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：49的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：48的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：47的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：80中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：81中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

另一方面，本文揭示一種特異性結合第1型胞漿素原活化素抑制劑(PAI-1)的單離單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：18中的CDR1(SEQ ID NO：76)，CDR2(SEQ ID NO：75)，和CDR3(SEQ ID NO：74)，所述輕鏈可變區包含SEQ ID 19中的CDR1(SEQ ID NO：79)，CDR2(SEQ ID NO：78)，和CDR3(SEQ ID NO：77)。另一方面，該重鏈包含包含SEQ ID NO：18的重鏈可變區，且該輕鏈包含包含SEQ ID NO：19的輕鏈可變區。又一方面，該重鏈可變區與SEQ ID NO：18為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：19為99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：76的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：75的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：74的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：79的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：78的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：77的輕鏈CDR3區。在某些方面，該抗體重鏈包含與SEQ ID NO：18中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：19中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。

一方面，本文揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：146的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：145的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。

一方面，本文揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：147的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：36的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。

一方面，本文揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：147的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：145的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。

一方面，本文揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：146的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：145的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。

一方面，本文揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：34的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：145的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。

另一方面，本文揭示一種單離單株抗體，其與單離單株抗體結合PAI-1上基本上相同的表位，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：6中的CDR1(SEQ ID NO：34)，CDR2(SEQ ID NO：33)，和CDR3(SEQ ID NO：32)，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：7中的CDR1(SEQ ID NO：37)，CDR2(SEQ ID NO：36)，和CDR3(SEQ ID NO：35)。

某一方面，本文揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：76的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：75的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：74的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：79的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：78的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：77的輕鏈CDR3區。

一方面，本文揭示一種特異性結合人PAI-1的人源化單株抗體，其中該抗體包含：(a)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：82的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：91的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(b)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：83的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：92的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(c)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：84的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(d)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：85的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：91的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(e)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：85的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(f)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：86的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：94的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(g)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：87的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：95的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(h)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：88的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：96的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(i)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：89的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：97的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(j)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：90的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：98的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(k)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：86的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(l)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：86的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：95的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(m)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：89的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；或(n)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：89的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：95的輕鏈可變區，或其抗原結合片段。又一方面，人源化重鏈可變區與任何先前揭示的人重鏈可變區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且人源化輕鏈可變區與任何先前揭示的人輕鏈可變區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

一方面，本文揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區和包含SEQ ID NO：86的重鏈可變區，和(b)輕鏈框架區和包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區。在某些方面，該分離的單株重鏈包含與SEQ ID NO：86中的重鏈框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的重鏈框架區，且該單離單株抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：93中的框架區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同的輕鏈框架區。在某些其它方面，該單離單株抗體重鏈包含與SEQ ID NO：86中的重鏈框架區95%相同的重鏈框架區，且該單離單株抗體輕鏈包含與SEQ ID NO：93中的框架區95%相同的輕鏈框架區。

另一方面，本文揭示一種特異性結合人PAI-1的人源化單株抗體，其中該抗體包含重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：154的重鏈可變區，或其抗原結合片段；該輕鏈具有包含SEQ ID NO：153的輕鏈可變區，或其抗原結合片段。另一方面，本文揭示一種特異性結合人PAI-1的人源化單株抗體，其中該抗體包含重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：155的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：153的輕鏈可變區，或其抗原結合片段。又一方面，人源化重鏈可變區與任何先前揭示的人重鏈可變區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同，且人源化輕鏈可變區與任何先前揭示的人輕鏈可變區99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

另一方面，本文揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其中該抗體結合包含SEQ ID NO：158的多肽。在另一個具體實施例中，該單離單株抗體結合包含SEQ ID NO：158的多肽的片段。在還有另一個具體實施例中，該特異性結合PAI-1的單離單株抗體結合包含SEQ ID NO：156和/或SEQ ID NO：158的多肽。在另一個具體實施例中，該特異性結合PAI-1的單離單株抗體結合包含SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：158，和/或SEQ ID NO：157的多肽。在仍有另一個具體實施例中，該特異性結合PAI-1的單離單株抗體包含針對SEQ ID NO：1殘基160，262，296-297，300-307，和/或310-316的特異性結合親和力。在某些具體實施例中，本文中揭示的單離單株抗體至少與SEQ ID NO：1殘基311，312，和313(D-Q-E)相互作用。在某些具體實施例中，該抗體結合的PAI-1為人PAI-1。在其它具體實施例中，該抗體結合的PAI-1為人PAI-1的活性形式。

在其它具體實施例中，本文揭示的特異性結合PAI-1的單離單株抗體結合包含SEQ ID NO：161的多肽。在其它具體實施例中，該單離單株抗體結合包含SEQ ID NO：159和/或SEQ ID NO：161的多肽。在仍有其它具體實施例中，該單離單株抗體結合包含SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：160，和/或SEQ ID NO：161的多肽。在另一個具體實施例中，該特異性結合PAI-1的單離單株抗體包含針對獼猴PAI-1(SEQ ID NO：162)殘基44-64和/或殘基307-321的特異性結合親和力。在某些具體實施例中，該抗體結合的PAI-1為獼猴PAI-1。在其它具體實施例中，該抗體結合的PAI-1為獼猴PAI-1的潛伏形式(latent form)。

又一方面，本文中揭示一種單離單株抗體，其競爭性抑制任何揭示的抗體對PAI-1的結合。在一個具體實施例中，本文中揭示一種單離單株抗體，其與本文中揭示的任何單離單株抗體競爭結合和/或競爭性抑制本文中揭示的任何單離單株抗體的結合。在某些具體實施例中，該單離單株抗體競爭或競爭性抑制對人PAI-1的結合。在某些具體實施例中，該單離單株抗體競爭或競爭性抑制對包含SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：157，和/或SEQ ID NO：158的多肽的結合。在另一個具體實施例中，該單離單株抗體競爭或競爭性抑制對包含SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：160，和/或SEQ ID NO：161的多肽的結合。在一個具體實施例中，該單離抗體與如下的單離單株抗體競爭對包含SEQ ID NO：156，157，和/或158的多肽的結合，該單離單株抗體包含(a)重鏈框架區，包含SEQ ID NO：34的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區，包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：145的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。

另一方面，本文中揭示編碼本文中揭示的任何單離單株抗體的核苷酸。

一方面，本文中揭示一種治療由升高的PAI-1表現或升高的對PAI-1的敏感性引起的疾患的方法，其包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對患者或其它受試者施用藥學有效量的PAI-1抗體。

一方面，本文中揭示一種恢復胞漿素生成的方法，其包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對有需要的患者或其它受試者施用藥學有效量的PAI-1抗體。本文中揭示的胃腸外施用包括靜脈內，滴注，動脈內，腹膜內，肌肉內，皮下，直腸或***，靜脈內，動脈內，皮下，和肌肉內形式的胃腸外施用。在一些具體實施例中，對患者或其它受試者的施用包括多次施用。另一方面，恢復胞漿素生成的方法推動包含纖維變性組織程度增高的疾患的治療性處理。在一些方面，該疾患特徵在於纖維化。在一些方面，該疾患為纖維化，皮膚纖維化，系統性硬化，肺纖維化，特發性肺纖維化，間質性肺病，和慢性肺病。在其它方面，胞漿素生成推動肝纖維化，腎纖維化，包括慢性腎病，血栓形成，靜脈和動脈血栓形成，深靜脈血栓形成，四肢(peripheral limb)缺血，散佈性血管內凝固血栓形成(disseminated intravascular coagulation thrombosis)，有和無溶栓的急性缺血性發作，或支架再狹窄的治療性處理。

另一方面，本文中揭示藥學有效量的PAI-1抗體在製備用於治療由升高的PAI-1表現或升高的對PAI-1的敏感性引起的疾患的藥物中的用途，包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對患者或其它受試者施用。

一方面，該藥物用於治療包含纖維變性組織程度增高的疾患。在一些方面，該疾患特徵在於纖維化。在一些方面，該疾患為纖維化，皮膚纖維化，系統性硬化，肺纖維化，特發性肺纖維化，間質性肺病，和慢性肺病。在其它方面，該藥物用於治療包含肝纖維化，腎纖維化，包括慢性腎病，血栓形成，靜脈和動脈血栓形成，深靜脈血栓形成，四肢(peripheral limb)缺血，散佈性血管內凝固血栓形成(disseminated intravascular coagulation thrombosis)，有和無溶栓的急性缺血性發作，或支架再狹窄的疾患。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其中該抗體抑制肺纖維化。在某些具體實施例中，該抗體抑制受試者的肺中的纖維化。在某些具體實施例中，該抗體抑制具有特發性肺纖維化(IPF)的受試者的肺中的纖維化。在一些具體實施例中，本文中揭示的單離單株抗體誘導受試者中的纖維蛋白降解升高。在某些具體實施例中，該抗體提高受試者的血漿中的纖維蛋白降解。在一些其它具體實施例中，本文中揭示的單離單株抗體抑制受試者的肺中的膠原積累。在一些具體實施例中，該受試者具有IPF。在一些其它具體實施例中，本文中揭示的單離單株抗體提高受試者的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的D-二聚體濃度。在一些具體實施例中，該受試者具有IPF。在一些其它具體實施例中，本文中揭示的單離單株抗體特異性結合PAI-1，其中該抗體抑制受試者中纖維化所致肺重量升高。在一個具體實施例中，該受試者具有IPF。

另一方面，本文中揭示藥學有效量的PAI-1抗體在製備用於治療由升高的PAI-1表現或升高的對PAI-1的敏感性引起的疾患的藥物中的用途，包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對患者施用，其中該疾患為特發性肺纖維化。

另一方面，本文中揭示一種恢復胞漿素生成的方法，其包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對患者或其它受試者施用藥學有效量的PAI-1抗體，其中胞漿素生成推動特發性肺纖維化的治療性處理。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其中該抗體恢復受試者中的纖維蛋白溶解活性。在某些具體實施例中，該抗體恢復具有急性缺血性發作的受試者中的纖維蛋白溶解活性。急性缺血性發作可以有或無溶栓。在一些具體實施例中，該單離單株抗體恢復血塊溶解。在某些具體實施例中，該抗體在體外恢復血塊溶解。在仍有其它具體實施例中，該抗體以約2nM的IC₅₀在體外恢復血塊溶解。

在其它方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其中該抗體在受試者中恢復纖維蛋白分解。在一些具體實施例中，該受試者具有急性缺血性發作。

另一方面，本文中揭示藥學有效量的PAI-1抗體在製備用於治療由升高的PAI-1表現或升高的對PAI-1的敏感性引起的疾患的藥物中的用途，包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對患者施用，其中該疾患為有和無溶栓的急性缺血性發作。

另一方面，本文中揭示一種恢復胞漿素生成的方法，其包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對有需要的患者或其它受試者施用藥學有效量的PAI-1抗體，其中胞漿素生成推動有和無溶栓的急性缺血性發作的治療性處理。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其中該抗體抑制受試者中的粘連形成。在一些具體實施例中，粘連形成在受試者經受手術或損傷之後發生。在一些具體實施例中，受試者中的粘連形成在腹部。在其它具體實施例中，粘連形成發生於受試者的肩，骨盆，心，脊柱，手，和其它身體區域。

另一方面，本文中揭示藥學有效量的PAI-1抗體在製備用於治療或預防由升高的PAI-1表現或升高的對PAI-1的敏感性引起的疾患的藥物中的用途，包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對患者施用，其中該疾患為腹部粘連形成。

另一方面，本文中揭示一種恢復胞漿素生成的方法，其包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對有需要的患者或其它受試者施用藥學有效量的PAI-1抗體，其中胞漿素生成推動粘連形成的治療性處理或預防。在一些具體實施例中，受試者中的粘連形成在腹部。

另一方面，本文中揭示一種單離單株抗體，其結合PAI-1/玻連蛋白複合物。另一方面，本文中揭示一種單離單株抗體，其通過誘導PAI-1基質構象而中和PAI-1活性。在一個具體實施例中，該抗體恢復或能夠恢復胞漿素生成。在另一個具體實施例中，該單離單株抗體誘導或能夠誘導纖連蛋白降解。在還有另一個具體實施例中，該單離單株抗體誘導或能夠誘導基質金屬蛋白酶(MMP)活化。

另一方面，本文中揭示的單離單株抗體為抗體片段。在一些具體實施例中，該抗體為單鏈Fv抗體。在其它具體實施例中，重鏈和輕鏈通過柔性接頭而連接以形式單鏈抗體。在其它具體實施例中，該抗體為Fab，Fab'，或(Fab')₂抗體。

另一方面，本文中揭示一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其中該抗體為結晶抗體。在一個具體實施例中，本文中揭示一種單離晶體，其包含單株抗體A44的Fab'片段，其中該Fab'片段由輕鏈序列SEQ ID NO：7和重鏈序列SEQ ID NO：6組成。在另一個具體實施例中，本文中揭示一種單離晶體，其包含Fab'片段，其中該Fab'片段包含輕鏈序列SEQ ID NO：93和重鏈序列SEQ ID NO：86。在一個具體實施例中，該單離晶體包含不對稱的晶胞細胞尺寸a=105Å，b=152Å和c=298Å。在一個具體實施例中，該單離晶體屬於P212121空間群。在另一個具體實施例中，該單離晶體包含3.3Å解析度的x-射線衍射。在一個具體實施例中，該單離晶體保留結晶抗體的生物學活性。在一些具體實施例中，該單離晶體具有比結晶抗體的可溶性對應物要長的體內半衰期。

一方面，本文中揭示一種醫藥組成物，其包含：(a)特異性結合PAI-1的結晶抗體和(b)至少一種包埋或封裝晶體的藥學賦形劑。

另一方面，本文中揭示一種醫藥組成物，其包含藥學可接受載體和治療有效量的本文中揭示的任何抗體。

一方面，本文中揭示一種生成針對PAI-1的抗體的方法，其包括用由PAI-1，或其片段，和玻連蛋白構成的複合物免疫哺乳動物。

另一方面，本文中揭示一種在ELISA中對PAI-1抗體篩選其阻斷PAI-1作為tPA活性抑制劑的功能的能力的方法，其包括下述步驟：(a)使PAI-1結合至ELISA盤；(b)將ELISA盤與PAI-1抗體一起培養；(c)將ELISA盤與tPA一起培養；(d)將ELISA盤與經過標記的抗tPA抗體一起培養；並(e)測量由經過標記的抗tPA抗體發射的OD₄₀₅；其中正讀出(positive readout)指示PAI-1抗體結合PAI-1但不阻斷PAI-1和tPA之間共價鍵的形成，而負讀出(negative readout)指示PAI-1抗體阻斷tPA與PAI-1的相互作用。

另一方面，本文中揭示一種篩選融合瘤的方法。在某些具體實施例中，該篩選方法包括使用固定化抗小鼠抗PAI-1抗體進行的逆向篩選方法。在其它具體實施例中，該篩選方法包括使用游離PAI-1作為配體或針對固定化玻連蛋白進行的正向篩選測定法。在某些具體實施例中，應用該方法來測定抗體針對PAI-1/玻連蛋白複合物的親和力。在一些具體實施例中，該方法包括：將玻連蛋白固定化至表面；使PAI-1與固定化至表面的玻連蛋白接觸，由此形成複合物；使包含複合物的表面與抗體接觸；將結合至複合物的抗體與未結合的抗體分開；檢測結合至複合物的抗體，並分析結合至複合物的抗體的濃度以測定抗體對複合物的親和力。

圖1描述了PAI-1和絲胺酸蛋白酶組織型胞漿素原活化素(tPA)和尿激酶型胞漿素原活化素(uPA)之間的機轉的示意表示。PAI-1顯示結構可塑性，並可以潛伏構象或(當其結合於玻連蛋白(Vn)時)活性構象存在。PAI-1的RCL區攜帶誘餌肽鍵(亦稱作P1-P1’)，其為絲胺酸蛋白酶的切割位點。首先形成與tPA或uPA的Michaelis複合物，然後催化三元組與誘餌肽鍵反應以形成醯基酶複合物，當切割P1-P’1肽鍵之後，該複合物誘導強烈的構象變化。醯基酶是由來自絲胺酸蛋白酶(tPA)的催化三元組的絲胺酸殘疾(黑色三角形)和來自基質的胺基酸(黑色圈)之間的共價鍵形成的不穩定複合物，其發生進一步水解。該構象變化導致切割的PCL***β-鏈，且蛋白酶作為醯基酶保持與PAI-1的共價結合。在非生理情況下，該醯基酶複合物的水解可能誘導切割的PAI-1的釋放並使得活性蛋白酶游離。

圖2描述了實施例2中所述的結合ELISA中抗體滴定的通常的標準曲線。抗體31C9、33B8和33H1是陽性對照，而IgG1是陰性對照。

圖3描述了實施例4中所述的為了選擇阻斷PAI-1與tPA的相互作用的抗體的功能性ELISA。抗體33H1是陽性對照，IgG1是陰性對照，而A44鑒定為陽性對照選殖株。

圖4描述了實施例4中描述的生色測定法中A44和商業上可獲得的抗體(33B8和33H1)對tPA的人PAI-1阻斷活性的中和。

圖5描述了來自不同融合產生的抗體選擇對tPA的人PAI-1阻斷活性的中和(參見實施例4)。

圖6描述了在具有類似效力的產色測定法中人PAI-1及其直向同源物阻斷人tPA活性。

圖7描述了實施例4中所述的產色測定法中A44和33B8(商業上可獲得的)抗體對人tPA的獼猴(cyno)和小鼠PAI-1阻斷活性的中和。

圖8描述了抗體33H8(將PAI-1從活性轉化為潛伏構象)，33H1(將PAI-1從活性轉化為基質構象)，和A44阻斷PAI-1與tPA相互作用的作用機理的SDS-PAGE分析。泳道1分子量標記；泳道2：僅PAI-1；泳道3：僅tPA；泳道4：tPA存在下的PAI-1；泳道5：33B8+PAI-1+tPA；泳道6：33H1+PAI-1+tPA；泳道7：A44+PAI-1+tPA；泳道8：mAb是同種型對照抗體。

圖9描述了抗體33H8(將PAI-1從活性轉化為潛伏構象)，33H1(將PAI-1從活性轉化為基質構象)，和從融合物C26、E16和E21開發的抗體阻斷PAI-1與tPA相互作用的作用機理的SDS-PAGE分析。泳道1分子量標記；泳道2：僅PAI-1；泳道3：僅tPA；泳道4：tPA存在下的PAI-1；泳道5：33B8+PAI-1+tPA；泳道6：33H1+PAI-1+tPA；泳道7：C26+PAI-1+tPA；泳道8：E16+PAI-1+tPA；泳道9：E21+PAI-1+tPA；泳道10：mAb是同種型對照抗體。

圖10描述了抗體33H8(將PAI-1從活性轉化為潛伏構象)，33H1(將PAI-1從活性轉化為基質構象)，和從融合物A39、B109和C45開發的抗體阻斷PAI-1與tPA相互作用的作用機理的SDS-PAGE分析。泳道1分子量標記；泳道2：僅PAI-1；泳道3：僅tPA；泳道4：tPA存在下的PAI-1；泳道5：33B8+PAI-1+tPA；泳道6：33H1+PAI-1+tPA；泳道7：A39+PAI-1+tPA；泳道8：B109+PAI-1+tPA；泳道9：C45+PAI-1+tPA；泳道10：mAb是同種型對照抗體。

圖11描述了下述鼠類抗體的輕鏈的比對：A105(SEQ ID NO：3)、A39(SEQ ID NO：5)、A44(SEQ ID NO：7)、A71(SEQ ID NO：9)、A75(SEQ ID NO：81)、B109(SEQ ID NO：11)、B28(SEQ ID NO：13)、C45(SEQ ID NO：15)、E16(SEQ ID NO：17)、和E21(SEQ ID NO：19)。CDR以粗體凸顯。

圖12描述了下述鼠類抗體的重鏈的比對：A105(SEQ ID NO：2)、A39(SEQ ID NO：4)、A44(SEQ ID NO：6)、A71(SEQ ID NO：8)、A75(SEQ ID NO：80)、B109(SEQ ID NO：10)、B28(SEQ ID NO：12)、C45(SEQ ID NO：14)、E16(SEQ ID NO：16)、和E21(SEQ ID NO：18)。通過IMGT定義的CDR以粗體凸顯。

圖13描述了鼠類A44輕鏈(SEQ ID NO：7)與vk1(SEQ ID NO：101)和vλ3(SEQ ID NO：102)的比對。

圖14描述了鼠類A44輕鏈(SEQ ID NO：7)與vh2(SEQ ID NO：103)和vh4(SEQ ID NO：104)的比對。

圖15描述了選殖株A44人源化VL，其中比對了所有構建體。所有比對的序列(SEQ ID NO：91-98)進一步在下表25中描述。黑色盒代表CDR域。凸顯的殘基與比對中緊鄰上一排的殘基序列上不同。殘基編號如IMGT所述。

圖16描述了選殖株A44人源化VH，其中比對了所有構建體。所有比對的序列(SEQ ID NO：82-90)進一步在下表25中描述。黑色盒代表CDR域。凸顯的殘基與比對中緊鄰上一排的殘基序列上不同。殘基編號如IMGT所述。

圖17描述了將PAI-1活性的抑制百分比作為mAB濃度的函數作圖，並使用Biostat speed軟體的Imax確定IC50。

圖18描述了同質重組6-His標記的Fab A44的純化。

圖19描述了使用結合域固定化APG抗體的人糖基化PAI-1的單次動力學分析的用Biacore 2000進行的SPR分析。來自單迴圈動力學的感應譜(sensorgrams)灰色顯示。擬合模型以黑色顯示。

圖20描述了如通過ELISA進行的UK-PAI-1複合物形成檢測所確定的APG、APGv2、和APGv4抗體對人血漿PAI-1的中和。將PAI-1活性的抑制百分比作為APG、APGv2、或APGv4抗體的濃度的函數作圖。

圖21描述了通過濁度法動力學(作為時間(分鐘)函數的在340nm的吸光度讀數)測量檢測的在tPA 1nM和PAI-1 3nM存在下A44V11(1、3或10nM)對人血漿凝塊溶解的恢復。

圖22描述了通過作為時間(分鐘)函數的在340nm的吸光度讀數檢測的tPA 1nM和PAI-1 3nM存在下人IgG1陰性對照(1、3或10nM)缺乏對人血漿凝塊溶解的恢復。

圖23描述了在多種濃度A44V11或人IgG1同種型對人血漿凝塊溶解的恢復。

圖24描述了通過作為時間(分鐘)函數的在340nm的吸光度讀數檢測的tPA 1nM和PAI-1 3nM存在下3nM的APG、APGV2或APGV4對人血漿凝塊溶解的恢復。

圖25描述了在多種濃度APG變體2和4對人血漿凝塊溶解的恢復。

圖26描述了在由A44V11或IgG同種型對照mAb在50nM和TGFβ 5ng/ml處理之後48H時抗PAI-1對人LL29成肌纖維細胞上清的免疫印跡。

圖27描述了在用PBS(對照)、胞漿素原(Pg)、A44v11和胞漿素原(A+Pg)或陰性人IgG和胞漿素原(Neg+Pg)進行細胞處理48小時之後人初級肺成纖維細胞中的類屬MMP活性。

圖28描述了在第4日用A44或IgG1在10mg/kg或PBS通過i.p.施用處理之後，在第7日和第9日博來黴素處理小鼠的支氣管肺泡灌洗液(BALF)(A)和肺溶解物(B)中人活性PAI-1濃度。活性PAI-1通過ELISA(# HPAIKT Molecular Innovation)確定。抑制百分比通過將A44 bleo和IgG bleo之間的差異除以IgG bleo和未經處理的(PBS)小鼠組之間的差異來計算。

圖29描述了通過ELISA(Asserachrom D-Di,Diagnostica Stago)確定的在第4日用A44或IgG1在10mg/kg或PBS通過i.p.施用處理之後，來自在第7日和第9日博來黴素(bleomycin)處理小鼠的BALF中小鼠D-二聚體濃度。標示了由A44誘導的D-二聚體的倍數增加與IgG的比較。

圖30描述了在第4日至第20日每3日以鹽水或博來黴素處理繼以PBS(媒介)、IgG1或A44 10mg/kg i.p.施用之後21日，轉基因人源化小鼠的右肺重量。

圖31描述了在第4日至第20日每3日以鹽水或博來黴素處理繼以PBS(媒介)、IgG1或A44 10mg/kg i.p.施用之後21日，轉基因人源化小鼠中的羥脯胺酸肺含量。

圖32描述了LPS攻擊(100ug/kg iv)之前24小時來自由A44V11(A)mAb(n=5)或IgG1同種型對照(B)(n=4)(5mg/kg ip)處理的猴的血漿中活性PAI-1濃度。在標示的時間點收穫血樣，並在血漿中使用ELISA(# HPAIKT，來自Molecular Innovation)確定活性PAI-1濃度。

圖33描述了LPS攻擊(100ug/kg iv)之前24小時來自由A44V11(A)mAb(n=5)或IgG1同種型對照(B)(n=4)(5mg/kg ip)處理的肝生檢中的活性PAI-1濃度。在標示的時間點在經麻醉的猴中收穫肝生檢，並使用ELISA(# HPAIKT，來自Molecular Innovation)確定裂解液中的活性PAI-1濃度。

圖34描述了LPS攻擊(100ug/kg iv)之前24小時來自由A44V11(A)mAb(n=5)或IgG1同種型對照(B)(n=4)(5mg/kg ip)處理的猴中的D-二聚體濃度。在標示的時間點收穫血樣，並在血漿中使用ELISA確定活性PAI-1濃度。

圖35描述了LPS攻擊(100ug/kg iv)之前24小時來自由A44V11(A)mAb(n=5)或IgG1同種型對照(B)(n=4)(5mg/kg ip)處理的猴中的胞漿素-α2抗胞漿素(PAP)複合物濃度。在標示的時間點收穫血樣，並在血漿中使用ELISA(# Asserachrom PAP，來自Diagnostica Stago)確定PAP濃度。

圖36描述了腹腔內液(IPF)和子宮角裂解物中的活性PAI-1的濃度。在腹腔內液(A)和子宮角裂解物(B)中的活性PAI-1濃度。在第6小時和第7日的時點，在用A44V11抗體處理的動物中，在腹腔內液(IPF)和子宮角(UH)裂解物中的活性PAI-1濃度與同種型對照抗體處理的動物相比均較低，在第72小時時間點未觀察到差異(通過Student T-檢驗計算* p<0.001)。

圖37描述了同質重組6-His標記的Fab A44的純化的另一個實施例。

圖38描述了與人wt PAI-1蛋白複合的同質重組6-His標記的的Fab A44的純化。

圖39(a)描述了Fab A44/PAI-1複合物的複合結晶，而圖39(b)描述了最佳優化的晶體。

圖40描述了Fab A44/PAI-1複合物的杆狀單晶。

圖41描述了Fab A44對人PAI-1的活性形式和獼猴PAI-1的潛伏形式的識別。

圖42描述了在(A)有活性的人PAI-1和(B)潛伏的獼猴PAI-1中由Fab A44識別的PAI-1表位。

圖43描述了Fab A44/PAI-1複合物的重鏈互補位。

圖44描述了Fab A44/PAI-1複合物的輕鏈互補位。

圖45描述了獼猴、人、大鼠和小鼠PAI-1的提出的A44結合表位的序列比對。序列摘自SEQ ID NO：1(人PAI-1)、SEQ ID NO：162(獼猴PAI-1)、SEQ ID NO：163(小鼠PAI-1)、和SEQ ID NO：164(大鼠PAI-1)。

圖46描述了小鼠PAI-1結構與人PAI-1/A44V11複合物結構的比較。

圖47顯示了人PAI-1/A44V11複合物的結構和玻連蛋白結合域PAI-1的模型的比較。

圖48描述了獼猴-PAI-1(SEQ ID NO：162)的胃蛋白酶肽覆蓋；從150個重疊的胃蛋白酶肽獲得了95.3%序列覆蓋。

圖49描述了在未結合(圓圈線)、APGv2結合(x-線)和A44v11結合(菱形線)狀態中獼猴PAI-1肽的氘攝取圖。殘基範圍/位置來自SEQ ID NO：162。(A)大多數胃蛋白酶肽在獼猴PAI-1本身或與任一mAb結合之間未顯示任何區別。(B)覆蓋殘基44-64的肽顯示來自兩種mAb結合狀態中的交換中類似的保護。 (C)組入殘基295-322的肽在兩種mAb結合狀態下組入較少的氘，然而對於A44v11保護程度較大。

圖50描述了獼猴PAI-1本身和結合於A44v11的氫/氘交換(HDX)比較。(A)在上的未結合狀態和在下的結合狀態之間的平均相對級分交換的蝶形圖。各線對應於在10秒、1分鐘、5分鐘、和240分鐘時間點獲得的資料。在(B)中，為對於獼猴PAI-1本身或結合於A44v11的來自上述(A)中的圖的差異資料(以道爾頓計)的圖。

圖51描述了獼猴PAI-1本身和結合於APGv2的HDX比較。在(A)中，為在上的未結合狀態和在下的結合狀態之間的平均相對級分交換的蝶形圖。各線對應於在10秒、1分鐘、5分鐘、和240分鐘時間點獲得的資料。在(B)中，為對於獼猴PAI-1本身或結合於APGv2的來自上述(A)中的圖的差異資料(以道爾頓計)的圖。

圖52描述了獼猴PAI-1結合於A44v11和結合於APGv2的HDX比較。在(A)中，為在上的APGv2結合狀態和在下的A44v11結合狀態之間的平均相對級分交換的蝶形圖。各線對應於在10秒、1分鐘、5分鐘、和240分鐘時間點獲得的資料。在(B)中，為對於獼猴PAI-1結合於APGv2或A44v11的來自上述(A)中的圖的差異資料(以道爾頓計)的圖。

圖53描述了通過HDX MS確定的獼猴-PAI-1：A44v11表位。顯示免於A44v11抗體結合狀態的交換的獼猴PAI-1(SEQ ID NO：162)的殘基以粗體顯示。從結晶研究確定的獼猴-PAI-1：A44v11表位元顯示於框中。

本發明提供特異性結合人PAI-1及調控PAI-1生物學功能的抗體及其片段。此類抗體對於治療PAI-1相關疾病或病症(例如纖維化)特別有用。本發明還提供醫藥組成物，以及編碼PAI-1抗體的核酸，用於生成此類抗體的重組表現載體和宿主細胞，或其片段。本發明還涵蓋在體外或在體內使用本文中揭示的抗體來檢測PAI-1或調控PAI-1活性的方法。

I.定義

為了可以更加容易地理解本發明，首先定義某些術語。

如本文中使用的，術語「人PAI-1」指包含下文所列胺基酸序列或由下文所列胺基酸序列組成的肽： (SEQ ID NO：1)，或其片段。

如本文中使用的，術語「抗體」指免疫球蛋白分子，其包含通過二硫鍵相互連接的四條多肽鏈，兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈，及其多聚體(例如IgM)。每條重鏈包含一個重鏈可變區(縮寫為V_H或VH)和一個重鏈恒定區(C_H或CH)。重鏈恒定區包含三個結構域，C_H1，C_H2和C_H3。每條輕鏈包含一個輕鏈可變區(縮寫為V_L或VL)和一個輕鏈恒定區(C_L或CL)。輕鏈恒定區包含一個結構域(C_L1)。V_H和V_L區可進一步細分成高變性區域，稱作互補決定區(CDR)，散佈於更加保守的區域，稱作框架區(FR)。每個V_H和V_L由三個CDR和四個FR構成，從胺基端至羧基端以下述次序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。

如本文中使用的，術語抗體的「抗原結合片段」包括特異性結合抗原以形成複合物的，任何天然發生的，酶促可得的，合成的，或遺傳工程的多肽或糖蛋白。抗體的抗原結合片段可使用任何合適標準技術衍生自例如完整抗體分子，諸如蛋白水解消化或重組遺傳工程技術，其涉及操作和表現編碼抗體可變域和(任選的)恒定域的DNA。抗原結合部分的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')₂片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區的胺基酸殘基組成的最小識別單元(例如單離互補決定區(CDR))。其它工程化分子，諸如雙抗體，三抗體，四抗體和迷你抗體也涵蓋在表述「抗原結合片段」內。

如本文中使用的，術語「CDR」或「互補決定區」表示在重和輕鏈多肽二者的可變區內找到的非連續抗原結合位點。這些特別的區域已經記載於Kabat et al.，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat et al.，Sequences of protein of immunological interest(1991)，和Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和MacCallum et al.，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，其中定義包括彼此比較時胺基酸殘基的子集或交疊。Kabat定義基於序列變異性。所有物種的所有IG和TR V區的IMGT唯一編號方式依賴於可變區結構的高度保守性(Lefranc，Mp et al.，Dev comp.Immunol.27：55-77，2003)。在比對超過5,000條序列後建立的IMGT編號方式考慮並下拉式列示方塊架和CDR的定義。Clothia定義基於結構環區域的定位。接觸定義(MacCallum et al.)基於對複合物晶體結構和抗體-抗原相互作用的分析。列出了涵蓋通過上文引用的每一篇參考文獻定義的CDR的胺基酸殘基進行比較。在本文中揭示的一個具體實施例中，術語「CDR」為通過Kabat定義來定義的CDR。在本文中揭示的另一個具體實施例中，CDR為通過IMGT來定義的CDR。

如本文中使用的，術語「框架(FR)胺基酸殘基」指Ig鏈的框架區中的那些胺基酸。如本文中使用的，術語「框架區」或「FR區」包括構成可變區的一部分，但不構成CDR(例如使用CDR的接觸定義)的一部分的胺基酸殘基。因此，可變區框架的長度介於約100-120胺基酸之間，但是只包括CDR以外的那些胺基酸。

本發明還涵蓋本文中揭示的抗體的CDR胺基酸序列中的「保守胺基酸替代」，即不消除抗體對抗原，即PAI-1的結合的胺基酸序列修飾。保守替代為用非天然殘基替代天然胺基酸殘基，使得對該位置的胺基酸殘基的極性或電荷影響很小或沒有影響。例如，保守替代源自將多肽中的非極性殘基用任何其它非極性殘基替換。而且，多肽中的任何天然殘基也可用丙胺酸替代，正如先前關於「丙胺酸掃描誘變」記載的(Cunningham et al.，Science 244：1081-85(1989))。保守胺基酸替代包括將一個類別的胺基酸用相同類別的胺基酸替代，其中類別通過共同物理化學胺基酸側鏈特性和在自然界中找到的同源蛋白中的高替代頻率(如例如通過標準Dayhoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣確定的)來定義。已經歸類出六大類胺基酸側鏈，包括：I類(Cys)；II類(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；III類(Asn，Asp，Gln，Glu)； IV類(His，Arg，Lys)；V類(Ile，Leu，Val，Met)；和VI類(Phe，Tyr，Trp)。例如，Asp替代另一種III類殘基諸如Asn，Gln，或Glu為保守替代。因此，將PAI-1抗體中預測為不重要的胺基酸殘基用來自相同類別的另一種胺基酸殘基替換。鑒定不消除抗原結合的胺基酸保守替代的方法是本領域熟知的(參見例如Brummell et al.，Biochem.32：1180，1993；Kobayashi et al.，Protein Eng.12：879，1999；和Burks et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412，1997)。下文表1列出了保守胺基酸替代的一般規則。

保守胺基酸替代還涵蓋非天然發生的胺基酸殘基，它們通常是通過化學肽合成而非通過生物學系統中的合成摻入的。這些包括肽類比物(peptidomimetics)，和胺基酸模組的其它反向或倒置形式。

對胺基酸序列的保守修飾(及對編碼核苷酸的相應修飾)預期生成具有與天然發生PAI-1抗體相似的功能和化學特徵的PAI-1抗體。相反，對PAI-1抗體的功能或化學特徵的實質性修飾可通過選擇在維持(a)替代區域中分子主鏈的結構，例如片層或螺旋構象，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積的效果方面顯著不同的替代來實現。天然發生殘基可基於共同側鏈特性來分組：1)疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；2)中性親水性：Cys，Ser，Thr；3)酸性：Asp，Glu；4)鹼性：Asn，Gln，His，Lys，Arg；5)影響鏈取向的殘基：Gly，Pro；和6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。

非保守性替代可涉及用這些類別之一的成員交換另一類別的成員。可將此類替代殘基引入人PAI-1抗體中與非人PAI-1抗體同源的區域，或分子的非同源區域。

在某些方面，重或輕鏈可變區可以與本文中揭示的任何可變區序列99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，或90%相同。

如本文中使用的，術語「特異性結合」指抗體或其抗原結合片段以低於1 x 10^-6M，1 x 10^-7M，1 x 10^-8M，1 x 10^-9M，1 x 10^-10M，1 x 10^-11M，1 x 10^-12M，或更低的Kd結合抗原的能力。該術語還指抗體或其抗原結合片段以比其對非特異性抗原的親和力大至少兩倍的親和力結合抗原的能力。

本揭示文本還提供競爭性抑制抗體對本文中揭示的表位的結合的抗體，如通過本領域已知用於測定競爭性結合的任何方法測定的，例如本文中描述的免疫測定法。在某些具體實施例中，抗體將對表位的結合競爭性抑制至少95%，至少90%，至少85%，至少80%，至少75%，至少70%，至少60%，或至少50%。

如本文中使用的，術語「抗原」指受抗體或其抗原結合片段識別的結合位點或表位。

如本文中使用的，術語「載體」意圖指能夠轉運與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體為「質體」，指其中可連接別的DNA區段的環狀雙鏈DNA環。另一種類型的載體為病毒載體，其中可將別的DNA區段連接入病毒基因組。某些載體能夠在它們導入的宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。可將其它載體(例如非附加體哺乳動物載體)在導入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，並由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與其可操作連接的基因的表現。此類載體在本文中稱作「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。一般而言，重組DNA技術中利用的表現載體常常處於質體的形式。術語「質體」和「載體」可互換使用。然而，本發明意圖包括此類其它形式的表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)，它們發揮等同的功能。

為了本發明的目的可採用眾多表現載體系統。例如，一類載體利用衍生自動物病毒諸如牛乳頭瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，杆狀病毒，反轉錄病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它涉及使用具有內部核糖體結合位點的多順反子系統。另外，有DNA整合入染色體的細胞可通過導入一種或多種容許選擇經過轉染的宿主細胞的標誌物來選擇。標誌物可以提供原養型給營養缺陷型宿主，生物殺滅劑抗性(例如抗生素)或針對重金屬諸如銅的抗性。可將可選擇標誌物基因直接連接至要表現的DNA序列，或通過共轉化導入同一細胞。最佳mRNA合成可能還需要別的元件。這些元件可包括信號序列，剪接信號，以及轉錄啟動子，增強子，和終止信號。在具體的具體實施例中，與如上所述合成的重和輕鏈恒定區基因(例如人的)一起將選殖株的可變區基因***表現載體。

更一般地，一旦製備編碼抗體或其片段的載體或DNA序列，就可將表現載體導入適宜宿主細胞。就是說，可轉化宿主細胞。將質體導入宿主細胞可通過本領域技術人員熟知的多種技術來實現。這些包括但不限於轉染(包括電泳和電穿孔)，原生質體融合，磷酸鈣沉澱，包膜DNA的細胞融合，顯微注射，和完整病毒感染。參見Ridgway，A.A.G."Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2，pp.470-472 Vectors，Rodriguez and Denhardt，Eds.(Butterworths，Boston，Mass。1988)。本文中揭示的一個具體實施例是經電穿孔將質體導入宿主。在適合於輕鏈和重鏈生成的條件下培養經過轉化的細胞，並測定重或輕鏈蛋白質合成。例示性測定技術包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，放射免疫測定法(RIA)，或螢光啟動細胞分選儀分析(FACS)，免疫組織化學，等等。

如本文中使用的，術語「轉化」應當以廣義使用，指將DNA導入接受者宿主細胞，改變基因型並隨後導致接受者細胞改變。

「宿主細胞」指經過使用重組DNA技術構建且編碼至少一種異源基因的載體轉化的細胞。在關於自重組宿主分離多肽的工藝的描述中，術語「細胞」和「細胞培養物」互換使用，表示抗體的來源，除非另有清楚說明。換言之，自「細胞」回收多肽可表示來自沉降完整細胞，或來自含有培養基和懸浮細胞二者的細胞培養物。

應當理解，此術語意圖不僅指特定主題細胞，而且還指此類細胞的後代。因為後續世代中可由於突變或環境影響而發生某些修飾，所以此類後代事實上可能與親本細胞不同，但是仍然包括在本文中使用的術語「宿主細胞」的範圍內。

如本文中使用的，術語「治療」和「處理」指本文中描述的治療性或預防性措施。「治療」方法採用將本文中揭示的抗體或抗原結合片段施用於受試者，例如具有PAI-1相關疾病或病症(例如纖維變性疾病)或傾向於患上此類疾病或病症的受試者，從而預防，治癒，延遲疾病或病症或者復發疾病或病症，降低疾病或病症或者復發疾病或病症的嚴重程度，或改善疾病或病症或者復發疾病或病症的一種或多種症狀，或者為了延長受試者的存活，超出在此類治療缺失下的預期。

如本文中使用的，術語「PAI-1相關疾病或病症」包括發現改變的PAI-1濃度或活性的疾病狀態，其中有或無與疾病狀態有關的症狀。例示性PAI-1相關疾病或病症包括各種類型的纖維化。

如本文中使用的，術語「有效量」指在施用於受試者時，結合PAI-1的抗體或其抗原結合片段足以實現PAI-1相關疾病或病症治療，預後或診斷的量，如本文中描述的。治療有效量會根據所治療的受試者和疾病狀況，受試者的重量和年齡，疾病狀況的嚴重程度，施用的方式，等等而變化，本領域普通技術人員能容易地確定。施用劑量的範圍可以是例如約1ng至約10,000mg，約1ug至約5,000mg，約1mg至約1,000mg，約10mg至約100mg本文中揭示的抗體或其抗原結合片段。可調整劑量方案以提供最佳治療回應。有效量還指抗體或其抗原結合片段的任何有毒或有害作用(即副作用)最小化或被有益作用超越的量。

如本文中使用的，術語「受試者」或「哺乳動物」包括任何人或非人動物。

如本文中使用的，術語「表位」指與抗體分子的可變區中的特定抗原結合位點(稱作互補位)相互作用的抗原決定簇。一種抗原可具有超過一個表位。因此，不同抗體可結合抗原上的不同區域且可具有不同生物學效果。表位元可以是構象的或線性的。構象表位元是由來自線性多肽鏈不同區段的，在空間上毗鄰的胺基酸生成的。線性表位元是由多肽鏈中的鄰近胺基酸殘基生成的。

此處記錄，如本說明書和所附申請專利範圍中使用的，單數形式「一個」和「一種」包括複數所指物，除非上下文另有清楚說明。

II.抗PAI-1抗體

一方面本發明提供特異性結合人PAI-1的抗體或其抗原結合片段。表2列出了本文中揭示的抗體的例示性VH，VL和CDR胺基酸序列和核苷酸序列。表2中所示CDR區是通過IMGT定義的。

在另一個具體實施例中，本發明提供與包含SEQ ID NO：6和7分別所列VH和VL區胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段結合相同表位或競爭性抑制的抗PAI-1抗體。此類抗體可使用例行競爭結合測定法來鑒定，包括例如基於表面等離振子共振(SPR)的競爭測定法。

III.經過修飾的抗PAI-1抗體

在某些具體實施例中，本文中揭示的抗PAI-1抗體可包含一處或多處修飾。可使用本領域已知的任何技術來生成本文中揭示的修飾形式的抗PAI-1抗體。

i)降低免疫原性

在某些具體實施例中，使用本領域公認的技術修飾本文中揭示的抗PAI-1抗體或其抗原結合片段以降低它們的免疫原性。例如，可對抗體或其片段進行嵌合化，人源化，或去免疫化。

在一個具體實施例中，本文中揭示的抗體或其抗原結合片段可以是嵌合的。嵌合抗體為抗體的不同部分衍生自不同動物物種的抗體，諸如具有自鼠單株抗體衍生的可變區和人免疫球蛋白恒定區的抗體。用於生成嵌合抗體或其片段的方法是本領域已知的。參見例如Morrison，Science 229：1202，1985；Oi et al.，BioTechniques 4：214，1986；Gillies et al.，J.Immunol.Methods 125：191，1989；美國專利No.5,807,715；No.4,816,567；和No.4,816,397，通過提述將其完整收入本文。可採用為生成「嵌合抗體」開發的技術(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851，1984；Neuberger et al.，Nature 312：604，1984；Takeda et al.，Nature 314：452，1985)來合成所述分子。例如，可將編碼小鼠抗PAI-1抗體分子的結合特異性的遺傳序列與來自具有適宜生物學活性的人抗體分子的序列融合到一起。如本文中使用的，嵌合抗體為不同部分衍生自不同動物物種的分子，諸如那些具有自鼠單株抗體衍生的可變區和人免疫球蛋白恒定區的，例如人源化抗體。

在另一個具體實施例中，本文中揭示的抗體或其抗原結合片段是人源化的。人源化抗體具有包含一個或多個來自非人抗體的互補決定區(CDR)和來自人抗體分子的框架區的結合特異性。通常，人框架區中的框架殘基會用來自CDR供體抗體的相應殘基替代以改變或改進抗原結合。這些框架替代是通過本領域熟知的方法鑒定的，例如通過對CDR和框架殘基的相互作用建模以鑒定對於抗原結合重要的框架殘基和序列比較以鑒定特定位置處的非常見框架殘基。參見例如Queen et al.，美國專利No.5,585,089；Riechmann et al.，Nature 332：323，1988，通過提述將其完整收入本文。可使用本領域已知的多種技術將抗體人源化，例如CDR嫁接(EP 239,400；國際揭示文本No.WO 91/09967；美國專利No.5,225,539；No.5,530,101；和No.5,585,089)，鑲嵌或表面重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28：489，1991；Studnicka et al.，Protein Engineering 7：805，1994；Roguska et al.，PNAS 91：969，1994)，和鏈改組(美國專利No.5,565,332)。

在一個具體的具體實施例中，採用基於抗體的分子柔性在免疫識別期間和之時的影響的人源化方法(常見國際揭示文本No.WO2009/032661，通過提述將其完整收入本文)。蛋白質柔性涉及蛋白質分子的分子運動。蛋白質柔性為完整蛋白質，蛋白質的一部分或單個胺基酸殘基採取彼此顯著不同的構象的全體的能力。關於蛋白質柔性的資訊可通過實施蛋白質X-射線結晶學實驗來獲得(參見例如Kundu et al.，Biophys.J.83：723，2002)，核磁共振實驗(參見例如Freedberg et al.，J.Am.Chem.Soc.120：7916，1998)或運行分子動力學(MD)模擬。蛋白質的MD類比在電腦上進行且通過計算原子彼此的物理相互作用容許確定所有蛋白質原子在一段時間裡的運動。MD模擬的輸出為所研究的蛋白質在模擬時間段裡的軌跡。軌跡為在模擬時段裡定期(例如每1皮秒(ps))採樣的蛋白質構象(也稱作快照)的全體。通過分析快照的全體，能量化蛋白質胺基酸殘基的柔性。因此，柔性殘基為在該殘基駐留其中的多肽的背景中採取不同構象的全體的殘基。MD方法是本領域已知的，參見例如Brooks et al."Proteins：A Theoretical Perspective of Dynamics,Structure and Thermodynamics"(Wiley，New York，1988)。數種軟體能夠進行MD類比，諸如Amber(參見Case et al.，J.Comp.Chem.26：1668，2005；Brooks et al.，J.Comp.Chem.4：187，1983；和MacKerell et al.(1998)於"The Encyclopedia of Computational Chemistry"vol.1：271-177，Schleyer et al.，編，Chichester：John Wiley & Sons)或Impact(參見Rizzo et al.，J.Am.Chem.Soc.122：12898，2000)。

大多數蛋白質複合物分享相對較大且平坦埋藏的表面，而且已經顯示結合配偶的柔性為它們的塑性提供起源，使得它們能夠在構象上彼此適應(Sundberg and Mariuzza，Structure 8，R137-R142，2000)。因此，已經顯示「誘導擬合」的例子在蛋白質-蛋白質介面中發揮支配性作用。另外，數量穩步增長中的資料顯示蛋白質實際上結合不同形狀，尺寸和組合的配體(Protein Science 11：184-187，2002)，而且構象多樣性看來是識別不同配偶的能力的必要成分(James et al.，Science 299：1362，2003)。柔性殘基涉及蛋白質-蛋白質配偶的結合(Grunberg et al.，Structure 14，683，2006)。

柔性殘基能採取多種構象，提供有可能受到記憶B細胞識別及觸發免疫原性應答的相互作用區域的全體。因此，抗體人源化可通過修飾一些來自框架的殘基來進行，使得由經過修飾的抗體展示的構象和識別區域的全體盡可能類似人抗體所採取的。這可通過修飾有限數目的殘基來實現，如下進行：(1)構建親本單抗的同源性模型並運行MD類比；(2)分析柔性殘基並鑒定非人抗體分子的最柔性殘基，以及鑒定有可能作為異質性或降解反應來源的殘基或基序；(3)鑒定展示與親本抗體最相似的識別區域全體的人抗體；(4)確定要突變的柔性殘基，還突變有可能作為異質性和降解來源的殘基或基序；並(5)檢查已知的T細胞或B細胞表位元的存在情況。可使用本文中教導的MD計算來尋找柔性殘基，這使用考慮了水溶劑與蛋白質原子在模擬時間段裡的相互作用的隱含溶劑模型進行。

一旦在可變輕和重鏈內鑒定出一套柔性殘基，鑒定與感興趣抗體的重和輕鏈可變區框架密切類似的一套人重和輕鏈可變區框架。這可例如針對抗體人種系序列資料庫對一套柔性殘基使用BLAST搜索來進行。也可通過比較親本單抗的動力學與種系規範結構文庫的的動力學來進行。CDR殘基和鄰近殘基排除在搜索之外以確保對抗原的高親和力得到保留。然後替換柔性殘基。

當數個人殘基顯示相似同源性時，選擇還受到殘基有可能影響人源化抗體溶液行為的性質的驅動。例如，極性殘基常常會比疏水性殘基更多地存在於暴露的柔性環。還突變作為不穩定性和異質性的潛在來源的殘基，即使是在CDR中找到的。這會包括暴露的甲硫胺酸(因為亞碸形成可源自氧根)，酸不穩定鍵(諸如Asp-Pro二肽的)的蛋白水解切割(Drug Dev.Res.61：137，2004)，以暴露的天冬醯胺殘基繼以小胺基酸，諸如Gly，Ser，Ala，H is，Asn或Cys找到的脫醯胺位點(J.Chromatog.837：35，2006)和N-糖基化位點，諸如Asn-X-Ser/Thr位點。通常，暴露的甲硫胺酸會用Leu替代，暴露的天冬醯胺會用穀胺醯胺或用天冬胺酸替換，或者會改變後續殘基。對於糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)，會改變Asn或Ser/Thr殘基。

對所得複合抗體序列檢查已知的B細胞或線性T細胞表位元的存在情況。實施搜索，例如用公眾可得的免疫表位元資料庫(IEDB)(PLOS Biol.(2005)3(3)e91)進行。如果在複合序列內找到已知的表位，那麼獲取並替代另一套人序列。因此，與美國專利No.5,639,641的重建表面方法不同，該方法解決B-細胞介導的和T-細胞介導的免疫原性應答二者。該方法還避免有時在CDR嫁接時觀察到的活性損失問題(美國專利No.5,530,101)。另外，在工程改造和選擇過程中還考慮了穩定性和溶解性問題，產生針對低免疫原性，高抗原親和力和改進的生物物理學特性進行了優化的抗體。

在一些具體實施例中，去免疫可用於降低抗體或其抗原結合片段的免疫原性。如本文中使用的，術語「去免疫」包括改變抗體或其抗原結合片段以修飾T細胞表位(參見例如國際揭示文本No.WO9852976A1，No.WO0034317A2)。例如，可以分析來自起始抗體的VH和VL序列，並且可以自每個V區生成人T細胞表位元「地圖」，顯示表位元相對於互補決定區(CDR)和序列內其它關鍵殘基的定位。分析來自T細胞表位地圖的各個T細胞表位以鑒定改變最終抗體活性的風險較低的備選胺基酸替代。設計包含胺基酸替代組合的一系列備選VH和VL序列，並隨後將這些序列摻入一系列PAI-1特異性抗體或其片段，供本文中揭示的診斷和治療方法使用，然後可以測試功能。通常，生成並測試12至24種抗體變體。然後將包含經過修飾的V和人C區的完整重和輕鏈基因選殖入表現載體，隨後將質體導入細胞系，用於生成完整抗體。然後在適宜生物化學和生物學測定法中比較抗體，並鑒定最佳變體。

ii)效應器功能和Fc修飾

本文中揭示的抗PAI-1抗體可包含介導一種或多種效應器功能的抗體恒定區(例如IgG恒定區，人IgG恒定區，人IgG1或IgG4恒定區)。例如，補體的C1成分對抗體恒定區的結合可活化補體系統。補體的活化在細胞病原體的調理和裂解中是重要的。補體的活化還刺激炎症應答，而且還可涉及自身免疫超敏感性。而且，抗體經Fc區結合多種細胞上的受體，抗體Fc區上的Fc受體結合位點結合細胞上的Fc受體(FcR)。有一些對不同類別的抗體特異性的Fc受體，包括IgG(γ受體)，IgE(ε受體)，IgA(α受體)和IgM(μ受體)。抗體對細胞表面上的Fc受體的結合觸發一些重要且不同的生物學應答，包括抗體包被顆粒的吞食和破壞，免疫複合物的清除，殺傷細胞對抗體包被靶細胞的裂解(稱作抗體依賴性細胞介導的細胞毒性，或ADCC)，炎症介質的釋放，胎盤轉移和免疫球蛋白生成的控制。在某些具體實施例中，本文中揭示的抗體或其片段結合Fc-γ受體。在備選具體實施例中，本文中揭示的抗PAI-1抗體可包含缺乏一種或多種效應器功能(例如ADCC活性)或不能結合Fc受體的恒定區。

本文中揭示的某些具體實施例包括已經刪除或以其它方式改變一個或多個恒定區結構域中的至少一個胺基酸以提供期望的生物化學特徵的抗PAI-1抗體，諸如與具有大致相同的免疫原性的完整的，未改變的抗體相比降低的或增強的效應器功能，非共價二聚化的能力，升高的定位至身體中特定部位(例如腫瘤部位或特定器官)的能力，縮短的血清半衰期，或延長的血清半衰期。例如，供本文中描述的診斷和治療方法使用的某些抗體或其片段為域刪除抗體，其包含與免疫球蛋白重鏈相似的多肽鏈，但至少缺乏一個或多個重鏈結構域的一部分。例如，在某些抗體中，會刪除經過修飾的抗體的恒定區的一個完整結構域，例如會刪除整個或部分CH2域。

在某些其它具體實施例中，抗PAI-1抗體包含自不同抗體同種型衍生的恒定區(例如來自人IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4中兩項或更多項的恒定區)。在其它具體實施例中，抗PAI-1抗體包含嵌合鉸鏈(即包含自不同抗體同種型的鉸鏈域衍生的鉸鏈部分的鉸鏈，例如來自IgG4分子的上部鉸鏈域和IgG1中部鉸鏈域)。在一個具體實施例中，抗PAI-1抗體包含來自人IgG4分子的Fc區或其部分和該分子核心鉸鏈區中的Ser228Pro突變(Kabat編號方式)。

在某些抗PAI-1抗體中，可使用本領域已知技術突變Fc部分以提高或降低效應器功能。例如，恒定區結構域的刪除或滅活(經由點突變或其它手段)可降低迴圈中的經過修飾的抗體的Fc受體結合，由此提高腫瘤定位。在其它情況中，符合本發明的恒定區修飾可降低補體結合並因此縮短血清半衰期和降低綴合的細胞毒素的非特異性聯合。還可使用恒定區的還有其它修飾來修飾二硫化物連接或寡糖模組(由於抗原特異性或柔性升高，容許增強的定位)。可使用熟知的免疫學技術容易地測量及量化修飾的所得生理學概況，生物利用度和其它生物化學效果，諸如腫瘤定位，生物分佈和血清半衰期，無需過度實驗。

在某些具體實施例中，本文中揭示的抗體中採用的Fc域為Fc變體。如本文中使用的，術語「Fc變體」指相對於衍生所述Fc域的野生型Fc域具有至少一處胺基酸替代的Fc域。例如，在Fc域衍生自人IgG1抗體的情況中，所述人IgG1 Fc域的Fc變體相對於所述Fc域包含至少一處胺基酸替代。

Fc變體的胺基酸替代可位於Fc域內的任何位置(即任何EU規則胺基酸位置)。在一個具體實施例中，Fc變體在位於鉸鏈域或其部分中的胺基酸位置處包含替代。在另一個具體實施例中，Fc變體在位於CH2域或其部分中的胺基酸位置處包含替代。在另一個具體實施例中，Fc變體在位於CH3域或其部分中的胺基酸位置處包含替代。在另一個具體實施例中，Fc變體包含在位於CH4域或其部分中的胺基酸位置處替代。

本文中揭示的抗體可採用已知對於賦予效應器功能或FcR結合改進(例如降低或增強)重要的，任何本領域公認的Fc變體。所述Fc變體可包括例如下述中揭示的任一胺基酸替代：國際PCT揭示文本WO88/07089A1，WO96/14339A1，WO98/05787A1，WO98/23289A1，WO99/51642A1，WO99/58572A1，WO00/09560A2，WO00/32767A1，WO00/42072A2，WO02/44215A2，WO02/060919A2，WO03/074569A2，WO04/016750A2，WO04/029207A2，WO04/035752A2，WO04/063351A2，WO04/074455A2，WO04/099249A2，WO05/040217A2，WO05/070963A1，WO05/077981A2，WO05/092925A2，WO05/123780A2，WO06/019447A1，WO06/047350A2，和WO06/085967A2或美國專利No.5,648,260；No.5,739,277；No.5,834,250；No.5,869,046；No.6,096,871；No.6,121,022；No.6,194,551；No.6,242,195；No.6,277,375；No.6,528,624；No.6,538,124；No.6,737,056；No.6,821,505；No.6,998,253；和No.7,083,784，其併入本文做為參考。在一個例示性具體實施例中，本文中揭示的抗體可包含在EU位置268處包含胺基酸替代(例如H268D或H268E)的Fc變體。在另一個例示性具體實施例中，本文中揭示的抗體可在EU位置239(例如S239D或S239E)或EU位置332(例如I332D或I332Q)處包含胺基酸替代。

在某些具體實施例中，本文中揭示的抗體可包含Fc變體，該Fc變體包含改變抗體的抗原不依賴性效應器功能(特別是抗體的迴圈半衰期)的胺基酸替代。此類抗體展現與缺乏這些替代的抗體相比升高的或降低的對FcRn的結合，因此分別在血清中具有延遲的或縮短的半衰期。具有改進的對FcRn的親和力的Fc變體預期具有更長的血清半衰期，而且此類分子在治療哺乳動物的方法中具有有用的應用，其中期望施用的抗體的半衰期較長，例如治療慢性疾病或病症。相反，具有降低的FcRn結合親和力的Fc變體預期具有更短的半衰期，而且此類分子也是有用的，例如在縮短的迴圈時間可能是有益的情況中施用於哺乳動物，例如體內診斷成像或起始抗體較長時段存在于迴圈中時具有有毒副作用的情形。具有降低的FcRn結合親和力的Fc變體還不太可能穿過胎盤，因此，在妊娠女性中治療疾病或病症中也是有用的。另外，可能期望降低的FcRn結合親和力的其它應用包括期望腦，腎，或肝定位的那些應用。在一個例示性具體實施例中，本文中揭示的改變的抗體展現降低的自脈管系統穿過腎小球上皮的轉運。在另一個具體實施例中，本文中揭示的改變的抗體展現降低的自腦穿過血腦屏障(BBB)進入血管空間的轉運。在一個具體實施例中，具有改變的FcRn結合的抗體包含在Fc域的「FcRn結合環」內具有一處或多處胺基酸替代的Fc域。FcRn結合環由胺基酸殘基280-299(依照Kabat編號方式)構成。國際PCT揭示文本No.WO05/047327中揭示了改變FcRn結合活性的例示性胺基酸替代，通過提述將其收入本文。在某些例示性具體實施例中，本文中揭示的抗體或其片段包含具有一處或多處下述替代的Fc域：V284E，H285E，N286D，K290E和S304D(Kabat編號方式)。

在其它具體實施例中，供本文中描述的診斷和治療方法使用的抗體具有經過改變以降低或消除糖基化的恒定區，例如IgG1或IgG4重鏈恒定區。例如，本文中揭示的抗體還可包含Fc變體，該Fc變體包含改變抗體糖基化的胺基酸替代。例如，所述Fc變體可具有降低的糖基化(例如N-或O-連接的糖基化)。在例示性具體實施例中，Fc變體包含降低的，正常情況下在胺基酸位置297(EU編號方式)處找到的N-連接聚糖的糖基化。在另一個具體實施例中，抗體具有糖基化基序(例如含有胺基酸序列NXT或NXS的N-連接的糖基化基序)附近或內的胺基酸替代。在一個具體具體實施例中，抗體包含在胺基酸位置228或299(EU編號方式)處具有胺基酸替代的Fc變體。在更多具體的具體實施例中，抗體包含IgG1或IgG4恒定區，該IgG1或IgG4恒定區包含S228P和T299A突變(EU編號方式)。

國際PCT揭示文本No.WO05/018572中揭示了賦予降低的或改變的糖基化的例示性胺基酸替代，通過提述將其收入本文。在某些具體實施例中，修飾本文中揭示的抗體或其片段以消除糖基化。此類抗體或其片段可稱作「無糖」抗體或其片段(例如「無糖」抗體)。不受理論限制，認為「無糖」抗體或其片段可具有改進的體內安全性和穩定性概況。例示性無糖抗體或其片段包含缺乏Fc-效應器功能的無糖基化IgG4抗體Fc區，由此消除Fc介導的對表現PAI-1的正常生命器官的毒性的潛力。在還有其它具體實施例中，本文中揭示的抗體或其片段包含經過改變的聚糖。例如，抗體可在Fc區的 Asn297處的N-聚糖上具有數目減少的岩藻糖殘基，即是無糖基化的。在另一個具體實施例中，抗體可在Fc區的Asn297處的N-聚糖上具有數目改變的唾液酸殘基。

iii)共價附著

可修飾本文中揭示的抗PAI-1抗體，例如通過將某分子共價附著至抗體，使得共價附著不阻止抗體特異性結合其關聯表位。例如，但非限制，可通過糖基化，乙醯化，PEG化，磷酸化，醯胺化，已知的保護/封閉基團的衍生化，蛋白水解切割，連接細胞配體或其它蛋白，等修飾本文中揭示的抗體或其片段。可通過已知技術來進行眾多化學修飾任一，包括但不限於特異性化學切割，乙醯化，甲醯化，等。另外，衍生物可含有一個或多個非經典胺基酸。

本文中揭示的抗體或其片段可以進一步在N-或C-端與異源多肽重組融合或者與多肽或其它組合物化學綴合(包括共價和非共價綴合)。例如，抗PAI-1抗體可以與在檢測測定法中作為標記物有用的分子和效應器分子諸如異源多肽，藥物，放射性核素，或毒素重組融合或綴合。參見例如國際PCT揭示文本No.WO 92/08495；No.WO 91/14438；No.WO 89/12624；美國專利No.5,314,995；和EP 396,387。

抗PAI-1抗體可以與異源多肽融合以延長體內半衰期或用於免疫測定法，使用本領域已知方法進行。例如，在一個具體實施例中，可以將PEG與本文中揭示的抗PAI-1抗體綴合以延長它們的體內半衰期(Leong，S.R.，et al.，Cytokine 16：106，2001；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531，2002；或Weir et al.，Biochem.Soc.Transactions 30：512，2002)。

此外，本文中揭示的抗PAI-1抗體可以與標誌物序列，諸如肽融合以推動它們的純化或檢測。在某些具體實施例中，標誌物胺基酸序列為六組胺酸肽，諸如pQE載體(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的標籤，諸如此類，許多是商品化的。如Gentz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824，1989中描述的，例如，六組胺酸提供便利的融合蛋白純化。對純化有用的其它肽標籤包括但不限於「HA」標籤(其對應於自流感血凝素蛋白衍生的表位(Wilson et al.，Cell 37：767，1984))和「flag」標籤。

本文中揭示的抗PAI-1抗體可以以非綴合形式使用，或者可以與至少一個多種分子綴合，例如為了改進分子的治療特性，推動靶物檢測，或患者的成像或治療。在實施純化時，可以在純化之前或之後標記或綴合本文中揭示的抗PAI-1抗體。特別地，本文中揭示的抗PAI-1抗體可以與治療劑，前藥，肽，蛋白質，酶，病毒，脂質，生物學應答修飾劑，藥學製劑，或PEG綴合。

本發明進一步涵蓋與診斷或治療劑綴合的抗PAI-1抗體。抗PAI-1抗體可以在診斷上用於例如監測免疫細胞病症(例如CLL)的形成或進展，作為臨床測試規程(例如測定給定治療或預防方案的功效)的一部分。檢測可通過將抗PAI-1抗體與可檢測基質偶聯來推動。可檢測基質的例子包括各種酶，輔基，發螢光材料，發冷光材料，生物發光材料，放射性材料，各種正電子發射斷層攝影術中使用的正電子發射金屬，和非放射性順磁性金屬離子。關於可以與抗體綴合，作為依照本發明的診斷劑使用的金屬離子參見例如美國專利No.4,741,900。合適的酶的非限制性例子包括辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物的非限制性例子包括鏈黴親合素/生物素和親合素/生物素；合適的發螢光材料的非限制性例子包括傘形酮(umbelliferone)，螢光素，異硫氰酸螢光素，羅丹明(rhodamine)，二氯三嗪胺螢光素，丹醯氯(dansyl chloride)或藻紅蛋白(phycoerythrin)；發冷光材料的非限制性例子包括魯米諾(luminol)；生物發光材料的非限制性例子包括螢光素酶，螢光素，和水母發光蛋白(aequorin)；而合適的放射性材料的非限制性例子包括125I，131I，111In或99Tc。

供本文中揭示的診斷和治療方法使用的抗PAI-1抗體可以與細胞毒素(諸如放射性同位素，細胞毒性藥物，或毒素)，治療劑，細胞抑制劑，生物學毒素，前藥，肽，蛋白質，酶，病毒，脂質，生物學應答修飾劑，藥學製劑，免疫學活性配體(例如淋巴因子或其它抗體，其中所得分子結合贅生性細胞和效應器細胞諸如T細胞二者)，或PEG綴合。

在另一個具體實施例中，供本文中揭示的診斷和治療方法使用的抗PAI-1抗體可以與降低腫瘤細胞生長的分子綴合。在其它具體實施例中，所揭示的組合物可包含與藥物或前藥偶聯的抗體或其片段。本文中揭示的仍有其它具體實施例包含與特定生物毒素或它們的細胞毒性片段諸如蓖麻毒蛋白，白樹毒素，假單胞菌外毒素或白喉毒素綴合的抗體或其片段的用途。要使用的綴合的或未綴合的抗體的選擇會取決於癌症的類型和階段，輔助治療(例如化學療法或外部照射)的使用和患者狀況。會領會的是，本領域技術人員能根據本文中的教導容易地進行此類選擇。

會領會的是，在先前的研究中，用同位素標記的抗腫瘤抗體已經在動物模型中，及在人的一些情況中成功用於破壞腫瘤細胞。例示性放射性同位素包括：90Y，125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re和188Re。放射性核素通過生成電離輻射起作用，電離輻射在核DNA中引起多處鏈斷裂，導致細胞死亡。用於生成治療性綴合物的同位素通常生成高能α-或β-粒子，它們具有較短的徑長。此類放射性核素殺死密切接近它們的細胞，例如綴合物附著或進入的贅生性細胞。它們對非定位細胞影響很小或沒有影響。放射性核素本質上沒有免疫原性。

IV.抗PAI-1抗體或其抗原結合片段的表現

在如上所述操作單離遺傳材料以提供本文中揭示的抗PAI-1抗體之後，通常將基因***表現載體，用於導入可用於生成期望數量的要求保護的抗體或其片段的宿主細胞。

在其它具體實施例中，可使用多順反子構建體來表現本文中揭示的抗PAI-1抗體或其片段。在此類表現系統中，可以自單一多順反子構建體生成多種感興趣基因產物諸如抗體重和輕鏈。這些系統有利地使用內部核糖體進入位點(IRES)，在真核宿主細胞中提供相對較高濃度的本文中揭示的多肽。美國專利No.6,193,980中揭示了相容IRES序列，通過提述將其收入本文。本領域技術人員會領會，此類表現系統可用於高效生成本申請中揭示的全部多肽。

在一個具體實施例中，用於抗體表現的宿主細胞系具有哺乳動物起源；本領域技術人員能確定最適合要在其中表現的期望基因產物的具體宿主細胞系。例示性宿主細胞系包括但不限於DG44和DUXB11(中國倉鼠卵巢系，DHFR-)，HELA(人宮頸癌)，CVI(猴腎系)，COS(CVI具有SV40 T抗原的衍生物)，R1610(中國倉鼠成纖維細胞)，BALBC/3T3(小鼠成纖維細胞)，HAK(倉鼠腎系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛內皮細胞)，RAJI(人淋巴細胞)，293(人腎)。在一個具體實施例中，細胞系對自其表現的抗體提供改變的糖基化，例如無岩藻糖基化(例如PER.C6.RTM.(Cru細胞)或FUT8敲除CHO細胞系(Potelligent^TM細胞)(Biowa，Princeton，N.J.))。在一個具體實施例中，可使用NS0細胞。在某些具體具體實施例中，可使用CHO細胞。宿主細胞系通常可自商業性服務，美國組織培養物保藏中心或已發表的文獻獲得。

體外生成容許放大規模以給出較大量的期望多肽。用於在組織培養條件下進行哺乳動物細胞培養的技術是本領域已知的，而且包括均質懸浮培養，例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中，或固定化或俘獲細胞培養，例如在中空纖維，微膠囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷筒上。如果必要或想要，可以通過慣例層析方法來純化多肽溶液，例如凝膠過濾，離子交換層析，DEAE-纖維素上的層析或(免疫)親和層析。

編碼本文中揭示的抗PAI-1抗體或其片段的基因也可在非哺乳動物細胞諸如細菌或酵母或植物細胞中表現。在這點上，會領會的是，也可轉染各種單細胞非哺乳動物微生物諸如細菌；即那些能夠在培養或發酵中生長的。對轉化易感的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，諸如大腸埃希氏菌/大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌屬(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌屬(Pneumococcus)；鏈球菌屬(Streptococcus)，和流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。進一步會領會的是，在細菌中表現時，多肽可變成包含體的一部分。必須分離，純化多肽，然後裝配成功能性分子。

在原核生物之外，也可使用真核微生物。啤酒糖酵母/釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見的麵包酵母是真核微生物中最常用的，儘管一些其它菌株是普遍可得的。為了糖酵母屬中的表現，普遍使用例如質體YRp7(Stinchcomb et al.，Nature，282：39(1979)；Kingsman et al.，Gene，7：141(1979)；Tschemper et al.，Gene，10：157(1980))。這種質體早就含有TRP1基因，為缺乏在色胺酸中生長的能力的酵母突變株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，85：12(1977))提供選擇標誌物。然後，作為酵母宿主細胞基因組的特徵，trpl損害的存在為通過色胺酸缺失下的生長來檢測轉化提供有效環境。

V.藥物配製劑和施用抗PAI-1抗體的方法

另一方面，本發明提供包含抗PAI-1抗體或其片段的醫藥組成物。

本文中揭示的抗體或其片段的製備和施用於受試者的方法是本領域技術人員熟知的或本領域技術人員容易確定的。本文中揭示的抗體或其片段的施用路徑可以是口服，胃腸外，通過吸入或表面。如本文中使用的，術語胃腸外包括靜脈內，動脈內，腹膜內，肌肉內，皮下，直腸或***施用。在某些具體實施例中可使用靜脈內，動脈內，皮下和肌肉內形式的胃腸外施用。雖然所有這些形式的施用清楚地涵蓋在本文中揭示的範圍內，但是施用的一種形式會是可注射溶液，特別是用於靜脈內或動脈內注射或滴注的。通常，適合注射的醫藥組成物可包含緩衝劑(例如乙酸鹽，磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑)，表面活性劑(例如聚山梨酯)，任選的穩定劑(例如人清蛋白)，等。然而，在與本文中的教導相容的其它方法中，可以將多肽直接投遞至不利細胞群部位，由此提高患病組織對治療劑的暴露。

用於胃腸外施用的製劑包括無菌的含水或不含水的溶液，懸浮液，和乳狀液。不含水的溶劑的例子為丙二醇，聚乙二醇，植物油諸如橄欖油，和可注射有機酯諸如油酸乙酯。含水的載體包括水，含醇/含水的溶液，乳狀液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。在本發明中，藥學可接受載體包括但不限於0.01-0.1M(例如0.05M)磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其它常用胃腸外媒介包括磷酸鈉溶液，林格(Ringer)氏右旋糖，右旋糖和氯化鈉，含乳酸鹽的林格氏液，或不揮發性油。靜脈內媒介包括流體和營養補充物，電解液補充物，諸如那些基於林格氏右旋糖的，等等。也可存在防腐劑和其它添加劑，諸如例如抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，和惰性氣體，等等。更具體地，適合於注射使用的醫藥組成物包括無菌的含水的溶液(在水溶性的情況中)或分散體及用於即時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。在此類情況中，組合物必須是無菌的，而且流動性的程度應當易於注射。它在製造和貯存的條件下應當是穩定的，而且在一個具體實施例中會針對微生物(諸如細菌和真菌)的污染作用提供防護。載體可以是溶劑或分散介質，包括例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，和液體聚乙二醇，等等)，及其合適混合物。可以例如通過使用塗層諸如卵磷脂，通過維持所需細微性(在分散體的情況中)及通過使用表面活性劑來維持恰當的流動性。通過各種抗細菌劑和抗真菌劑可實現針對微生物作用的防護，例如對羥基苯甲酸酯類，氯丁醇，酚，抗壞血酸，硫柳汞(thimerosal)，等等。在某些具體實施例中，組合物中包括等張劑，例如糖，多元醇，諸如甘露醇，山梨醇，或氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鋁和明膠可實現可注射組合物的延長吸收。

在任何情況中，可以通過以需要量在適宜溶劑(根據需要含有一種或一組本文中列舉的組分)中摻入活性化合物(例如抗體自身或與其它活性劑組合)，接著過濾除菌來製備無菌可注射溶液。通常，通過將活性化合物摻入無菌媒介(其含有基礎分散介質和需要的其它組分，來自上文列舉的那些)來製備分散體。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況中，製備方法可以是真空乾燥和冷凍-乾燥，這自先前無菌過濾的溶液產生活性組分加任何別的期望組分的粉末。依照本領域已知方法在無菌條件下加工用於注射的製劑，填充入容器諸如安瓿，袋，瓶，注射器或管形瓶，並密封。而且，製劑可以以試劑盒的形式包裝和銷售，諸如共同懸而未決的美國流水號09/259,337和美國流水號09/259,338中描述的那些，通過提述將每一篇收入本文。此類製品在一個具體實施例中會具有標籤或包裝插頁，指出相關組合物可用於治療罹患或傾向於自身免疫性或贅生性病症的受試者。

穩定化的本文中揭示的抗體或其片段用於治療上文所述疾患的有效劑量根據許多不同因素而變化，包括施用的手段，靶部位，患者的生理狀態，患者是人還是動物，施用的其它藥療，及治療是預防性的還是治療性的。通常，患者為人，但是也可以治療非人哺乳動物(包括轉基因哺乳動物)。可使用本領域技術人員已知的例行方法滴定治療劑量以優化安全性和功效。

對於本文中揭示的抗體的被動免疫，劑量的範圍可以為例如約0.0001至100mg/kg，更加通常地為0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，等)宿主體重。例如，劑量可以為1mg/kg體重或10mg/kg體重或者在1-10mg/kg的範圍內，或在特定具體實施例中為至少1mg/kg。上述範圍中間的劑量也意圖在本文中揭示的範圍內。

可以每天，隔天，每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表給受試者施用此類劑量。一種例示性治療要求在較長的時段(例如至少六個月)裡施用多個劑量。別的例示性治療方案要求每兩週一次或每月一次或每3至6個月一次的施用。例示性劑量日程表包括連續多天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每週60mg/kg。在一些方法中，同時施用兩種或更多種具有不同結合特異性的單株抗體，在這種情況中每種抗體施用的劑量可落在指示的範圍內。

本文中揭示的抗體或其片段可在多個時機施用。單個劑量之間的間隔可以是例如每天，每週，每月或每年。間隔也可以是不規則的，通過測量患者中多肽或靶分子的血液濃度來指示。在一些方法中，調整劑量以實現某種血漿抗體或毒素濃度，例如1-1000ug/ml或25-300ug/ml。或者，抗體或其片段可以作為持續釋放配製劑施用，在這種情況中要求不太頻繁的施用。劑量和頻率根據抗體在患者中的半衰期而變化。一般而言，人源化抗體顯示最長的半衰期，接著是嵌合抗體和非人抗體。在一個具體實施例中，本文中揭示的抗體或其片段可以以未綴合形式施用。在另一個具體實施例中，本文中揭示的抗體可以以綴合形式施用多次。在仍有另一個具體實施例中，本文中揭示的抗體或其片段可以以未綴合形式，然後以綴合形式施用，反之亦然。

施用的劑量和頻率可以根據治療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性應用中，將含有本發明抗體或其混合物的組合物施用於並非早就處於疾病狀態的患者以增強患者的抵抗力。此類量定義為「預防有效量」。在這種用途中，精確量再次取決於患者的健康狀況和一般免疫力，但是通常範圍為0.1至25mg每劑，尤其是0.5至2.5mg每劑。在較長的時間段裡以相對不頻繁的間隔施用相對較低的劑量。一些患者在他們的餘生繼續接受治療。

在治療性應用中，有時需要以相對較短的間隔施用相對較高的劑量(例如約1至400mg/kg抗體每劑，其中5至25mg的劑量更常用於放射免疫綴合物，而更高的劑量用於細胞毒性-藥物綴合分子)，直至疾病的進展減慢或終止，而且在特定具體實施例中，直至患者顯示疾病症狀的部分或完全改善。因此，可對患者施用預防方案。

在一個具體實施例中，可以用編碼本文中揭示的多肽的核酸分子(例如在載體中)治療受試者。編碼多肽的核酸的劑量範圍為約10ng至1g，100ng至100mg，1ug至10mg，或30-300ug DNA每位患者。感染性病毒載體的劑量為10-100，或更多病毒體每劑。

治療劑可通過胃腸外，表面，靜脈內，口服，皮下，動脈內，顱內，腹膜內，鼻內或肌肉內手段來施用，用於預防性或治療性處理。可使用肌肉內注射或靜脈內輸注來施用本文中揭示的抗體。在一些方法中，將治療性抗體或其片段直接注射入顱骨。在一些方法中，作為持續釋放組合物或裝置(諸如Medipad^TM裝置)施用抗體或其片段。

本文中揭示的藥劑可任選與有效治療需要治療(例如預防性的或治療性的)的疾患或狀況的其它藥劑組合施用。別的藥劑為那些本領域公認的且對於特定病症例行施用的。

90Y標記的本文中揭示的抗體的有效單次治療劑量(即治療有效量)的範圍介於約5和約75mCi之間，在一個具體實施例中介於約10和約40mCi之間。131I標記的抗體的有效單次治療非骨髓消融劑量的範圍介於約5和約70mCi之間，在一個具體實施例中介於約5和約40mCi之間。131I標記的抗體的有效單次治療消融劑量(即可要求自體骨髓移植)的範圍介於約30和約600mCi之間，在一個具體實施例中介於約50和少於約500mCi之間。聯合嵌合修飾抗體，由於與鼠抗體相比更長的迴圈半衰期，碘131標記的嵌合抗體的有效單次治療非骨髓消融劑量的範圍介於約5和約40mCi之間，在一個具體實施例中少於約30mCi。例如111In標記物的成像標準通常少於約5mCi。

雖然已經用131I和90Y得到了很多臨床經驗，但是其它放射性標記物是本領域已知的且已經用於類似目的。仍有其它放射性同位素用於成像。例如，與本發明的範圍相容的別的放射性同位素包括但不限於123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211A 213Bi。在這個方面，α，γ和β發射體都與本發明相容。而且，鑒於本揭示文本，認為本領域技術人員能夠容易地確定哪些放射性核素與選定治療過程相容，無需過度實驗。為此，早就用於臨床診斷的別的放射性核素包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga，以及111In。還已經用多種放射性核素標記抗體，潛在用於靶向免疫療法(Peirersz et al.，Immunol.Cell Biol.65：111，1987)。這些放射性核素包括188Re和186Re，以及較少見的199Au和67Cu。美國專利No.5,460,785提供了別的關於此類放射性同位素的資料，通過提述收入本文。

如先前討論的，本文中揭示的抗體或其片段可以以藥學有效量施用，用於在體內治療哺乳動物病症。在這點上，會領會的是，會配製所揭示的抗體或其片段，從而推動施用及提升活性劑的穩定性。在某些具體實施例中，依照本發明的醫藥組成物包含藥學可接受的，無毒的，無菌的載體，諸如生理鹽水，無毒緩衝劑，防腐劑，等等。為了本申請的目的，本文中揭示的抗體(與或未與治療劑綴合)的藥學有效量應當認為表示足以實現有效結合靶物及實現好處(例如改善疾病或病症的症狀或者檢測物質或細胞)的量。在腫瘤細胞的情況中，多肽在某些具體實施例中會能夠與贅生性或免疫反應性細胞上的選定免疫反應性抗原相互作用並提供那些細胞的死亡升高。當然，本文中揭示的醫藥組成物可以以單劑或多劑施用以提供藥學有效量的多肽。

與本揭示文本的範圍一致，本文中揭示的抗體可依照上述治療方法以足以產生治療或預防效果的量施用於人或其它動物。本文中揭示的多肽可以以依照已知技術通過組合本文中揭示的抗體與常規藥學可接受載體或稀釋劑而製備的常規劑量形式施用於此類人或其它動物。本領域技術人員會認可，藥學可接受載體或稀釋劑的形式和特徵由要與它組合的活性組分的量，施用的路徑和其它熟知的變數規定。本領域技術人員會進一步領會，包含一種或多種依照本發明的多肽的混合物可證明是特別有效的。

VI.治療PAI-1相關疾病或病症的方法

本文中揭示的抗PAI-1抗體或其片段對於拮抗PAI-1活性是有用的。因而，另一方面，本發明提供治療PAI-1相關疾病或病症的方法，通過對有需要的受試者施用包含一種或多種本文中揭示的抗PAI-1抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物。

適合治療的PAI-1相關疾病或病症包括但不限於病理生理狀況諸如腎，肝或肺纖維化或預防腹部粘連形成。

腹內粘連的發生是人生病的一項主要起因。粘連的併發症可以像危及生命的腸梗阻一樣嚴重，但是女性中的慢性骨盆痛和***也是腹膜粘連的常見後遺症。大多數粘連是由手術誘發的，但是在一些情況中還顯示是由炎症，子宮內膜異位元症，化學性腹膜炎，放射線治療，異物反應，和連續流動式腹膜透析引起的。腹膜損傷引起局部炎症應答，導致纖維蛋白沉積。由組織胞漿素原活化素(tPA)減少和胞漿素原活化素抑制劑PAI-1和PAI-2增多引起的，腹膜纖維蛋白溶解活性的損傷後不足假設允許沉積的纖維蛋白變得組成成永久粘連。

當前可得的且有效的治療選項(像Seprafilm®)受到只可用於開放式通路(剖腹術)的限制，不能用於腹腔鏡檢查。對潛在治療的搜索正在進行中。

在某些例示性具體實施例，本文中揭示的抗體可用於治療腎纖維化及相關急性腎損傷以及慢性腎病，它們是末期腎衰竭的主要起因。

本領域技術人員會能夠通過例行實驗確定抗體(或別的治療劑)對於治療PAI-1相關疾病或病症目的而言的有效，無毒量。例如，多肽的治療活性量可根據諸如受試者的疾病階段(例如I期對IV期)，年齡，性別，醫學併發症(例如免疫抑制疾患或疾病)和重量，和抗體在受試者中引發期望應答的能力等因素而變化。可調整劑量方案以提供最佳治療回應。例如，可以每天施用數個分份劑量，或者可以根據治療情況的緊急程度所示按比例較低劑量。通常，然而，有效劑量預期在約0.05至100毫克每千克體重每天的範圍中，在一個具體實施例中，在約0.5至10毫克每千克體重每天的範圍中。

本文中揭示的不同方面及其具體實施例可以彼此組合。另外，上文所述任何方面及其具體實施例可以與本文中下文描述的任何具體方面和具體實施例組合。

下面給出用來進一步例示本發明的一些具體方面和具體實施例：

具體方面和具體實施例的描述

聲明範圍1，一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含： (a)重鏈框架區和重鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：34的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：145的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。

聲明範圍2，一種結合特異性PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區和包含SEQ ID NO：86的重鏈可變區，和(b)輕鏈框架區和包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區。

聲明範圍3，一種結合特異性PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)與聲明範圍2的抗體的重鏈可變區至少95%相同的重鏈可變區，和/或(b)與聲明範圍2的抗體的輕鏈可變區至少95%相同的輕鏈可變區。

聲明範圍4，一種單離單株抗體，其與聲明範圍1的抗體結合基本上相同的表位。

聲明範圍5，一種結合特異性PAI-1的單離單株抗體，其包含：(a)重鏈框架區和重鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：34的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：36的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。

聲明範圍6，聲明範圍5的抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：6，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：7。

聲明範圍7，一種單離單株抗體，其與聲明範圍5的抗體結合基本上相同的表位。

聲明範圍8，一種特異性結合人PAI-1的人源化單株抗體，其中該抗體包含：(a)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：82的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：91的輕鏈可變區，或其抗原結合片段； (b)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：83的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：92的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(c)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：84的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(d)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：85的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：91的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(e)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：85的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(f)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：86的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：94的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(g)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：87的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：95的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(h)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：88的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：96的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(i)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：89的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：97的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(j)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：90的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：98的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；(l)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：86的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：95的輕鏈可變區，或其抗原結合片段； (m)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：89的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區，或其抗原結合片段；或(n)重鏈和輕鏈，該重鏈具有包含SEQ ID NO：89的重鏈可變區，或其抗原結合片段，該輕鏈具有包含SEQ ID NO：95的輕鏈可變區，或其抗原結合片段。

聲明範圍9，一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其包含(a)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：22的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：21的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：20的重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：25的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：24的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：23的輕鏈CDR3區，(b)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：28的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：27的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：26的重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：31的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：30的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：29的輕鏈CDR3區，(c)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：40的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：39的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：38的重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：43的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：42的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：41的輕鏈CDR3區，(d)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：46的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：45的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：44的重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：49的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：48的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：47的輕鏈CDR3區，(e)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：52的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：51的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：50的重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：55的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：54的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：53的輕鏈CDR3區，(f)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：58的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：57的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：56重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：61的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：60的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：59的輕鏈CDR3區，(g)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：64的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：63的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：62的重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：67的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：66的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：65的輕鏈CDR3區，(h)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：70的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：69的重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：68的重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：73的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：72的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：71的輕鏈CDR3區；或(i)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：76的重鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：75重鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：74的重鏈CDR3區；該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：79的輕鏈CDR1區，包含SEQ ID NO：78的輕鏈CDR2區，和包含SEQ ID NO：77的輕鏈CDR3區。

聲明範圍10，一種特異性結合PAI-1的單離單株抗體，其與聲明範圍8或聲明範圍9的人源化單株抗體結合PAI-1上基本上相同的表位。

聲明範圍11，一種恢復胞漿素生成的方法，其包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對有需要的受試者施用藥學有效量的PAI-1抗體。

聲明範圍12，聲明範圍11的方法，其中該方法治療包含纖維變性組織程度增高的疾患。

聲明範圍13，聲明範圍12的方法，其中該疾患為纖維化，皮膚纖維化，系統性硬化，肺纖維化，特發性肺纖維化，間質性肺病，慢性肺病，肝纖維化，腎纖維化，慢性腎病，血栓形成，靜脈和動脈血栓形成，深靜脈血栓形成，四肢(peripheral limb)缺血，散佈性血管內凝固血栓形成(disseminated intravascular coagulation thrombosis)，有和無溶栓的急性缺血性發作，或支架再狹窄。

聲明範圍14，聲明範圍11，12，或13的方法，其中該PAI-1抗體包括前述聲明範圍任一項的抗體。

聲明範圍15，藥學有效量的PAI-1抗體在製備用於治療由PAI-1濃度增高或對PAI-1的敏感性增高所引起的疾患的藥物中的用途，包括通過口服，使用可注射溶液通過胃腸外，通過吸入，或通過表面對患者施用。

實施例

本發明通過下述實施例進一步說明，所述實施例不應視為進一步限制性的。整個本申請中引用的序列表，附圖和所有的參考文獻、專利和揭示的專利申請的內容明確地通過提述併入本文。

此外，依照本發明，可採用本領域技術內的常規分子生物學、微生物學和重組DNA技術。參見，例如Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(在本文中為“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames & S..J.Higgins eds.(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney,ed.(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(1994)。

實施例1：融合瘤生成：用PAI-1蛋白免疫接種小鼠和抗體生成

開發了會對人(h)和獼猴(cyno)活性PAI-1(糖基化或非糖基化形式)交叉反應並會中和PAI-1的抑制活性並恢復下游的胞漿素產生由此成為治療腎、肝或肺纖維化或預防腹部粘連形成和瘢痕瘤瘢痕形成的有效治療物的抗體。已描述了通過單株抗體中和PAI-1抑制性功能屬於三種機理：(1)通過空間位阻阻斷PAI-1對tPA或uPA的結合，(2)將PAI-1轉化為潛伏構象，或(3)將PAI-1轉化為基質構象。

a)抗體

從細胞分泌的PAI-1為活性構象，其通過其以亞納摩爾親和力結合於玻連蛋白而穩定化。PAI-1在37℃在數分鐘內，而在室溫在數小時內發生自發的構象變化成為潛伏構象。一旦結合於玻連蛋白，PAI-1對構象變化更具抗性，這將活性構象的PAI-1的半壽期從數分鐘延長至數小時。為了在受免疫接種的動物中延長活性構象的PAI-1的半壽期和允許小鼠免疫系統識別活性PAI-1構象，使用了玻連蛋白和PAI-1的複合物用於免疫接種。

在昆蟲細胞中產生的人糖基化PAI-1購自Innovative Research(Cat# IGLYHPAI-A)。玻連蛋白(Cat# IHVN)和tPA(Cat# HTPA-TC)亦購自Innovative Research。為了產生免疫原，將PAI-1與玻連蛋白以1：1摩爾比在室溫培養1小時，或與tPA以1：1摩爾比在37℃培養15分鐘。所有免疫原使用滅菌鹽水作為稀釋劑來製備。

b)免疫接種

實施了本領域中已知的標準融合瘤產生規程。文獻中之前描述的標準方法使用PAI-1本身或PAI-1/tPA複合物。相反，本發明人生成了針對PAI-1的活性構象的抗體。使用PAI-1/玻連蛋白複合物作為新穎的生成針對PAI-1的抗體的方法。採用了下文概述的三方面策略生成抗體：(1)用PAI-1/玻連蛋白複合物對小鼠進行規範的免疫接種以獲得小鼠脾細胞以供與作為融合伴侶的小鼠骨髓瘤細胞系融合以產生融合瘤；(2)用PAI-1/tPA複合物對小鼠進行經典的免疫接種以獲得小鼠脾細胞以供與作為融合伴侶的小鼠骨髓瘤細胞系融合以產生融合瘤；和(3)用PAI-1本身對小鼠進行經典的免疫接種以獲得小鼠脾細胞以供與作為融合伴侶的小鼠骨髓瘤細胞系融合以產生融合瘤。

在研究中對於每種抗原(僅PAI-1，Vn/PAI-1複合物，tPA/PAI-1複合物)使用三隻小鼠。所述小鼠為9-20周齡的未免疫(naïve)雌性BALB/c小鼠(Charles River，品系編號028)。在第0日，對九隻小鼠用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的PAI-1本身、Vn/PAI-1或tPA/PAI-1複合物進行腹膜內免疫接種。將每只小鼠總共10ug的抗原以1：1體積對體積比混合於Sigma Adjuvant System (Sigma cat #6322)，總體積為每只小鼠200μl。在第14日，對小鼠用相同量的抗原進行增強，所述抗原以如在第0日一樣方式製備。在第21日，收集血樣以供PAI-1特異性抗體效價評估。用PAI-1/tPA複合物免疫接種的小鼠對PAI-1顯示非常低特異性的反應性和高抗tPA效價，而不用於下游融合。

在第51日，將具有最高的抗-PAI-1特異性抗體效價和最低的針對與PAI-1複合的蛋白(即Vn或tPA)的小鼠，而選擇那些對小鼠和大鼠PAI-1直向同源物具有最高效價的小鼠進行融合。將選擇用於融合的小鼠用PBS中的PAI-1本身或PAI-1/Vn複合物增強，其中總量為10ug每只小鼠的抗原以1：1比例與Sigma Adjuvant System(Sigma cat #6322)混合，其總體積為如上所述的200μl每只小鼠。在第55日，通過CO₂室犧牲小鼠，通過心臟穿刺收集血液，並收穫脾以供融合瘤產生。之後，對另外四隻小鼠進行了相同的步驟(在第一隻小鼠用於融合之後2-4個月)。

對於PAI-1本身和PAI-1/tPA對三隻小鼠，對於PAI-1/Vn使用實施例2中所述的ELISA規程(Binding ELISA)對兩隻小鼠進行了血清滴定。

用PAI-1/tPA複合物免疫接種的小鼠並未達到高特異性滴定標準，且未用於融合(表3)。基於表3中呈現的血清效價，選擇了總共5只針對PAI-1具有高特異性效價的小鼠用於融合。

b)融合

選擇了五隻針對PAI-1具有最高特異性效價的小鼠用於融合。在融合之日，將小鼠在CO₂室中犧牲，通過心臟穿刺收集血液，並將脾取出並置入含有10ml不含血清的融合瘤融合培養基(IMDM；Iscove's Modified Dulbecco's Medium 500ml(HyClone SH30259.01)的培養皿。通過鑷子將脾細胞的纖維彈性包衣擠去，並將脾細胞在10ml不含血清的IMDM(包括初始旋出物)中洗滌兩次。

將細胞在Countess Automated Cell Counter中計數。然後將融合伴侶細胞(骨髓瘤：FO(ATCC ref CRL-1646))和脾細胞以1：2至1：10(以細胞數量計)的比例合併於一個50ml試管中，並在970rpm離心10分鐘(緩慢旋轉)以形成鬆散的沉澱。將經預熱(在37℃)的1ml PEG(75mM Hepes 50% w/v中的PEG 1500 Roche產品號783641(10783641001))在1分鐘的期間逐滴添加至細胞沉澱，並在每滴PEG添加之後混合細胞。將沉澱與PEG再培養1分鐘，接著用1分鐘添加10ml不含血清的IMDM培養基，使得10ml中最初的1ml用30秒添加。將細胞在970rpm緩慢旋轉10分鐘以保持生活力。將融合的細胞以200ul在96孔盤中鋪板於選擇培養基(200ml Gibco Hybridoma(SFM # 12045)，20ml 10% HyClone SuperLow IgG Defined FBS(# SH30898.03)，2ml penicillin/streptomycin，4ml(Hybridoma Fusion and Cloning Supplement(Roche Diagnostics 11 363 735 001(50X))和4ml HAT(次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸腺嘧啶))中)。在約10至14日之後或當孔中的培養基變成黃色時，級分已可用於篩選。然後將來自發育的融合瘤的上清通過ELISA檢測(實施例2)結合於PAI-1和PAI-1/Vn複合物的抗體的存在。

實施例2：篩選針對PAI-1-玻連蛋白複合物的特異性的對於融合瘤上清的結合ELISA

來自五個所選小鼠的脾的每次融合產生約5000個選殖株，其需要就對PAI-1/Vn複合物的結合進行篩選作為第一步初步篩選。融合瘤上清的初步少選使用ELISA針對PAI-1或PAI-1-玻連蛋白複合物平行進行以選擇特異性結合複合於玻連蛋白的PAI-1的融合瘤。用於ELISA的材料如下所述：Immulon 4 HBX ELISA平盤(Dynax產品號N0541216)；人單體玻連蛋白，5ug/ml(Innovative Research產品號IHVN)；糖基化的人PAI-1(活性形式) (Molecular Innovations產品號GLYHPAI-A)；對於有些融合物為未糖基化的小鼠PAI-1(Molecular Innovations產品號MPAI-A)；二抗，其為HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Labs # 115-035-166)；和ABTS基質：Roche Diagnostics(# 11 204 521 001)。

使用的對照抗體為：a)33B8，針對PAI-1的小鼠單株抑制性抗體(IgG1；Innovative Research產品號IMA-33B8)；b)33H1，針對PAI-1的小鼠單株抑制性抗體(IgG1；Innovative Research產品號IMA-33H1)；c)31C9，針對PAI-1的小鼠單株非抑制性抗體(IgG1；Innovative Research產品號IMA-31C9)；和d)1B7.11，IgG1同種型對照抗體(抗TNP mAb-從購自ATCC的融合瘤細胞系(Cat# TIB-191)內部產生)

ELISA方法如下所述：將平盤用PBS中的5ug/ml Vn在4℃以50ul/孔包被過夜；翌日，將平盤用200ul PBS中的1%牛血清白蛋白(BSA/PBS)封閉1小時；將平盤用200ul/孔PBS洗滌四次；將1% BSA/PBS中的2ug/ml的活性PAI-1以50ul/孔添加至平盤並培養1小時；將平盤用200ul/孔PBS洗滌四次；將1% BSA/PBS中的抗體稀釋或來自初始96孔盤的融合瘤上清以50ul/孔添加至ELISA平盤；將平盤在室溫(RT)培養1小時；將平盤用200ul/孔洗滌四次；添加1% BSA/PBS中的HRP-抗小鼠IgG 50ul 1：2000並在室溫培養1小時；將平盤用200ul/孔PBS洗滌四次；將50ul/孔的ABTS基質(一丸溶解於5ml)添加至平盤，然後在BioTek Synergy HT儀器上使用OD₄₀₅對平盤讀數。結合ELISA中對於抗體滴定的通常的標準曲線示於圖2。抗體31C9，33B8和33H1用作陽性對照，而IgG1用作陰性對照。表4顯示在生成的約5000個選殖株中，675個選殖株對於結合PAI-1和PAI-1/Vn兩者為陽性。接著對這些選殖株篩選PAI-1親和力。

實施例3：通過親和力排序對融合瘤上清進行的Biacore篩選

對具有低解離率的高親和力抗體的進一步選擇由Biacore進行。Biacore融合瘤上清篩選以如下之一進行：(1)使用抗小鼠固定化的抗PAI-抗體進行反向篩選或(2)使用PAI-1作為配體或針對固定化的Vn進行的正向篩選測定。

使用的儀器為BIACORE 2000或BIACORE 3000(GE Healthcare)，其涉及用於即時生物分子相互作用分析(BIA)。使用的傳感晶片為CM5晶片(GE Healthcare)，其表面上具有羧甲基化的右旋糖酐基質。每個傳感晶片具有四個平行的流通池(Fc)。每個流通池與抗小鼠IgG Fc mAb通過標準的胺基偶聯根據生產商關於晶片製備的規程偶聯。

在Biacore反向篩選測定中，選擇ELISA陽性融合瘤上清，並將其經過0.2μm濾器過濾，接著將其注射至Biacore晶片表面。將每個融合瘤上清注射至流通池Fc2-Fc4的一個流通池上，且融合瘤上清中的IgG會由抗小鼠IgG Fc mab捕獲至晶片表面，而Fc1單獨留作參照池。然後將PBS中的人PAI-1蛋白注入Fc1至Fc4。亦將PBS緩衝液注射至晶片表面作為空白。在減去Fc1和空白緩衝液運行的信號之後，分析來自上清的抗體對PAI-1蛋白的結合親和力(KD)/解離率(kd)並使用Scrubber 2軟體進行排序。

在Biacore正向篩選測定中，將純化的人玻連蛋白蛋白固定化於CM5晶片流通池Fc1至Fc4。將人或獼猴PAI-1捕獲至所有流通池上。然後將經過濾的選定的融合瘤上清每流通池一份地注射於捕獲的PAI-1上，但是Fc1除外，其留作參照流通池。亦將PBS緩衝液注射至晶片表面作為空白。在減去Fc1和空白緩衝液運行的信號之後，分析來融合瘤上清中抗體對玻連蛋白捕獲的PAI-1的結合親和力並使用Scrubber 2軟體(version 2.0a，2005； BioLogic Software，BioLogic Software Rty Ltd.，116 Blamey Court，Campbell，ACT 2612 Australia)進行排序。

表5顯示從融合A、B、C、D和E選擇陽性和陰性抗體選殖株。因為經篩選的抗體選殖株數量龐大，並未顯示所有的資料。僅將針對人和獼猴PAI-1蛋白顯示優勢結合解離率(kd<10-⁴l/s)的抗體選殖株選用於功能性產色測定。

實施例4：對於融合瘤上清篩選的功能性ELISA以選擇阻斷PAI-1與tPA相互作用的抗體

為了允許選擇功能性抗體，開發了新穎的ELISA以允許區分僅結合於PAI-1的抗體和阻斷PAI-1作為tPA抑制劑的功能的那些抗體(功能性ELISA)。

將融合瘤上清在新穎的功能性ELISA中篩選以鑒定具有阻斷tPA-PAI-1相互作用的能力的來自不同選殖株的融合瘤上清。功能性ELISA的設計如下所述：(1)如果抗體結合域PAI-1但所述抗體結合並不阻斷PAI-1和tPA之間的共價鍵形成，則抗tPA抗體會結合於tPA(其通過PAI-1結合於平盤)並給出陽性的讀取；(2)如果抗體阻斷PAI-1，並因此通過改變PAI-1構象或通過空間位阻阻斷tPA相互作用，則所述抗-tPA抗體將無法結合於平盤，而讀取會是陰性的(較低OD₄₀₅)。平行地，在實施例2中所述的ELISA中就結合PAI-1測試融合瘤上清。因為融合瘤上清中的抗體的量是未知的，低於對照讀取(即低於同種型對照讀取)便視為鑒定出感興趣的抗體。由於上清中差異的抗體濃度，在一些情況下，阻斷僅為部分地。

將抗生蛋白鏈菌素包被的平盤(NUNC # 436014)在RT用。50ul/ml的1% BSA/PBS中的2ug/ml生物素-PAI-1(N端生物素標記的人PAI-1，活性級分；Molecular Innovations產品號NTBIOPAI-A)培養2小時。將平盤用200ul 1%BSA/PBS在RT封閉1小時，並用200ul/孔PBS洗滌四次。將純化的抗體稀釋和融合瘤上清以50ul/孔添加至孔，並培養15分鐘。將平盤用200ul/孔PBS洗滌四次。將1ug/ml的雙鏈tPA(Innovative Research產品號HTPA-TC)以50ul/孔添加至平盤，並在RT培養30分鐘。將平盤用200ul/孔PBS洗滌四次。將1：：3000稀釋的抗tPA HRP綴合抗體(Life Span Technologies，cat#LS-C39721)添加至平盤，並培養45分鐘。將平盤用200ul/孔PBS洗滌四次。將50ul/孔的ABTS(一丸溶解於5ml；Roche Diagnostics # 11 204 521 001)添加至平盤，並給予時間允許顯色。在BioTek Synergy HT儀器上使用OD₄₀₅讀取平盤。具有低於IgG同種型對照的值的OD表明阻斷了tPA對PAI-1的結合。

在一些情況下，在Biacore上清篩選之前進行了功能性ELISA，且其作為融合瘤培育中更重要的選擇步驟。以33H1作為陽性對照，IgG1為陰性對照，而A44為鑒定出的陽性抗體選殖株的代表曲線示於圖3。

篩選了超過200份上清。表6顯示對陽性和陰性融合瘤上清的選擇。每個融合物約10個融合瘤顯示在功能性ELISA中阻斷PAI-1對tPA結合的能力。基於來自融合瘤上清的資料，選擇融合瘤進行測序和中等規模抗體產生。儘管D4並未良好地結合於非糖基化的PAI-1，但基於其Biacore中對糖基化PAI-1的結合將其選用於純化和測序。將純化的抗體在Biacore進一步表徵其親和力動力學，並在產色和細胞測定中表徵其與商業上可獲得的抗體相比的效力。

實施例5：通過5’-RACE(cDNA末端的快速擴增)進行的測序和小鼠抗體純化

從一系列融合生成的針對特定靶的抗體可具有相同的序列。通過在抗體生成的早期階段進行抗體基因測序，消除了任何可能的冗餘抗體，且正確的抗體基因序列指導抗體選擇和人源化，以及嵌合抗體構建。

5’-RACE是從信使RNA範本在確定的內部位元點和mRNA的3’或5’末端的未知序列之間擴增核酸序列的方法。該具有單側特異性的擴增方法已描述為「單側」PCR或「錨定」PCR。先導抗體的原始可變性鼠類抗人PAI-1抗體序列通過5’-RACE cDNA測序確定，並通過N段蛋白測序確認。

為了確定可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)IgG序列，將來自融合瘤細胞的總RNA使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，產品號74104)根據生產商的指示分離。簡言之，將細胞(5x 10⁶個細胞)在350ul試劑盒的RLT緩衝液中裂解，接著在旋轉柱上捕獲總RNA。RNA在試劑盒的TE緩衝液中洗脫，並儲存於冰上。

第一鏈cDNA使用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit(ClonTech，產品號634923)製備。根據生產商的指示進行5’-RACE規程。將VH和VL鏈cDNA分別通過聚合酶鏈式反應(CPR)使用SMARTer^TM試劑盒供應的5’引子和下面列出的3’VH和VL基因特異性引子分別擴增：

重鏈3’-引子：5’-TATGCAAGGCTTACAACCACA-3’(SEQ ID NO：105)

輕鏈3’-引子：5’-CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAG-3’(SEQ ID NO：106)

將擴增的VH和VL基因使用TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen，產品號K4520-01)分別選殖入TOPO載體。根據生產商的指示進行所述步驟。為了轉化細菌，將反應混合物添加入感受態大腸桿菌細胞，並在冰上培養20分鐘。將含有大腸桿菌細胞和反應混合物的試管在42℃加熱40秒，並添加250微升試劑盒的SOC培養基。在將大腸桿菌在37℃在300rpm振盪下培養60分鐘之後，將細菌在含有100微克每ml安比西林(ampicillin)的LB瓊脂平盤上塗布，接著在37℃培養過夜。

在通過PCR確認***的VH和VL基因之後，選擇了五個細菌選殖株，並在含有100微克每ml安比西林的LB培養液中繁殖以供質體DNA製備。質體DNA使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN，產品號27104)根據生產商的指示分離。融合瘤的VH和VL IgG基因通過Sanger方法測序，且CDR使用Contact定義(MacCallum等)來確定。

單株抗體在CELLine生物反應器瓶(Wilson Wolf Manufacturing Corp.；Cat.#CL350或產品號CL1000)中根據生產商的指示在不含血清的培養基(Gibco Cat.#12045)中產生並通過Protein A/G層析術(GE Healthcare Life Sciences，Cat.#28-4083-47和#28-4082-53)純化。在Biacore進一步表徵其親和力動力學，並在產色和細胞測定中表徵其與商業上可獲得的抗體相比的效力。

實施例6：使用純化抗體的功能性產色測定法

將純化的抗體在產色測定法中測試其阻斷PAI-1的能力。PAI-1抑制tPA功能，因此，阻斷PAI-1的抗體會導致tPA功能的恢復。產色測定法利用蛋白水解酶，其通過水解一個或多個肽鍵作用於其天然基質(蛋白和肽)。該過程通常是高度特異性的，其含義是僅鄰接某些胺基酸的肽鍵受切割。產色基質為與蛋白水解酶反應導致形成可定量的顏色的肽。產色基質是人工合成的，並設計為對於所述酶具有類似於天然基質的選擇性。附於產色基質的肽部分的是化學基團，當其在酶切割之後釋放時，產生顏色。顏色變化可用分光光度法追蹤，並與蛋白水解酶活性成比例。

使用產色測定法確認抗體中和PAI-1作為tPA抑制劑功能的能力。tPA能夠從產色基質S2288釋放pNA。在溶液中，S228不具顏色，然而在暴露於tPA並接著釋放pNA之後，溶液產生黃色，這可在OD₄₀₅讀取。可用2-3個小時觀察顏色形成用確定酶促反應的動力學。PAI-1能夠以濃度依存性方式阻斷tPA的酶促活性。

進行了兩步產色測定法。所有試劑在將其添加至基質溶液的步驟之前均為10x濃度。在第一步中，PAI-1對於tPA抑制的效力使用產色測定法測量(具有固定的tPA濃度的PAI-1滴定)。分析PAI-1滴定曲線以確定對於PAI-1阻斷tPA活性的IC50。之後，選擇從曲線計算出的IC80進行進一步調查抗體中和PAI-1阻斷功能和恢復tPA酶促活性的能力。將等量(25ul)的tPA(14nM)(Innovative Research，Cat.no.IHTPA-TC)和糖基化的(活性形式)人PAI-1(Molecular Innovations，Cat.no.GLYHPAI-A)或非糖基化的(活性形式)小鼠PAI-1(Molecular Innovations Cat.# IMPAI)合併，並使用從108nM開始的PAI-1的3倍系列稀釋和固定濃度的tPA培養。所有蛋白稀釋用1% BSA/PBS製備。將混合物在96孔微滴定盤的孔中在室溫培養15分鐘。然後將根據生產商的指示稀釋的200ul產色基質S2288(1.25mM)(Chromogenix，Cat.no.S-820852)添加至孔，並在2小時內每10分鐘記錄在405nm的OD₄₀₅吸光度變化以測量剩餘tPA活性。對於對照，在tPA不存在下(無沒反應)測量背景，陽性對照為無PAI-1(100% tPA活性)，而陰性對照為相對於tPA10倍過量的PAI-1(完全阻斷tPA活性)。對於33B8，A44，33H1和IgG1的代表性曲線，參見圖4。

對於第二步，通過利用PAI-1中和測定法評估抗體抑制PAI-1和恢復tPA功能的能力來確定抗體的功能性質。對於該步驟，將活性PAI-1 12.5ul(在56nM)與等量的含有1% BSA(Sigma，Cat.no.A3059)的PBS(Invitrogen，Cat.no.14190-144)或從2uM起的抗體的系列3倍稀釋培養。將對照和未知抗體在0.1至300nM範圍的濃度(5倍稀釋)及3nM PAI-1來培養，並將tPA添加至混合物。將所有成分在室溫以10x濃度培養，並進一步用tPA基質S2288稀釋，所述SS2288在受tPA切割之後，顏色從澄清變為黃色。在37℃每10分鐘在OD405讀取樣品達2小時。允許混合物在96孔微滴定盤的孔中在室溫反應30分鐘以實現抗體-抗原複合物形成。然後將25ul的tPA(14nM，這對應於tPA活性的IC₈₀抑制)添加至孔，並在室溫培養15分鐘。最終，將200ul 1.25 mM根據生產商的指示稀釋的基質S2288添加至混合物。記錄在405nm的吸光度變化以每10分鐘測量剩餘tPA活性達2小時。百分之百PAI-1活性定義為在抗體不存在下觀察到的PAI-1活性。通過抗體對PAI-1活性的中和根據在抗體存在下測得的剩餘PAI-1活性來計算。對照為IgG1作為同種型對照(陰性)而33H1 mAb和33B8 mAb作為陽性對照。對於B28，E16，E21，A75和IgG1的代表性曲線，參見圖5。

在兩步產色測定系統中測試抑制人tPA的人PAI-1的直向同源物。直向同源物的滴定如上所述對人PAI-1(對於滴定的代表性曲線，參見圖6)進行，而tPA活性通過產色方法(對於33B8和A44針對獼猴和小鼠PAI-1的代表性曲線，參見圖7)。用於該測定的人tPA的最終濃度為1.4nM。將12.5ul活性PAI-1(56nM)用等體積的含有1% BSA的PBS或從2uM開始的抗體的系列3倍稀釋培養。允許混合物在96孔微滴定盤的孔中在室溫反應30分鐘。然後將25ul的tPA(14nM)添加至孔，並在室溫培養15分鐘。為了完成反應，將200ul tPA基質S2288(Chromogenix)(1.25mM)添加至混合物。PAI-1直向同源物從Molecular Innovations獲得：小鼠PAI-1(野生型活性級分；cat# MPAI)；大鼠PAI-1(野生型活性級分；cat# RPAI)；和兔PAI-1(穩定突變體；cat# RbPAI-I91L)；獼猴PAI-1(活性獼猴PAI-1)在大腸桿菌中內部產生。由於兔和大鼠直向同源物在Biacore篩選中不良的解離率(資料未顯示)，未針對這些直向同源物進行抗體篩選。

每個融合的一個或多個抗體在該測定中呈現了阻斷獼猴和人PAI-1抑制功能二者的能力，其中約14個抗體具有溫和至強的阻斷活性。A39和B28具有獨特的分佈，即這兩種抗體阻斷糖基化hPAI-1但針對人或獼猴非糖基化PAI-1不具活性。除了C26，這些抗體均無法有效地阻斷小鼠PAI-1活性(在10倍人PAI-1之內)。

實施例7：單株抗體的作用機理

單株抗體可通過三種不同的機理抑制PAI-1：a)通過空間位阻，b)通過結合後將PAI-1轉化為潛伏構象，和c)通過將PAI-1轉化為tPA的基質構象而非抑制劑(基質構象)。PAI-1在與絲胺酸蛋白酶相互作用後與tPA形成共價鍵。

使用產色測定法和SDS-PAGE技術鑒定抗體的作用機理。如上關於功能性產色測定法所述進行了單株抗體(或對照)抗體、PAI-1和tPA之間的反應。將樣品與Laemmli樣品緩衝液混合，並在非還原條件下載入於SDS-PAGE凝膠，並運行30分鐘。之後，將凝膠用考馬斯藍染色以使PAI-1的蛋白、複合物和切割形式顯色。使用具有已知作用機理的對照單株抗體作為對比物。已知33B8將PAI-1轉化為潛伏構象，而已知33H1將PAI-1轉化為基質構象。該測定可正面地鑒定基質構象，但無法區分潛伏構象或空間位阻。代表性SDS-凝膠示於圖8，9和10。

A44，C26，C45和E21通過將活性構象轉化為基質構象來阻斷PAI-1活性。A39和B109具有不同的作用機理，但該測定無法區分這些抗體是通過將PAI-1從活性構象轉化為潛伏構象或通過空間位阻來阻斷PAI-1活性。

實施例8：純化的抗體的結合動力學

在動力學測量中，將抗體在25℃反向評估。在反向測定中，將PAI-1抗體捕獲於在CM5晶片上製備的抗小鼠IgG Fc抗體表現，接著從40nM開始注射PAI-1蛋白(人或獼猴)的系列2x稀釋。選擇50ul/分鐘的高流速以避免品質輸運限制。給予兩千秒的解離時間以適應選定的抗體的緩慢解離率。在每輪抗體-PAI-1結合之後，晶片通過甘胺酸-HCl，pH 1.7緩衝液再生。動力學資料分析使用Biacore BIAevaluation軟體進行。感應譜通過減去參照的流通池的值和空白緩衝液值進行雙重參照。使用類比的具有局部Rmax的動力學1：1(Langmuir)模型擬合感應譜。關於測試的抗體的資料示於下表9。

進一步分析了代表性抗體的結合動力學，並將其與玻連蛋白和PAI-1的複合物在Biacore正向測定中加以比較。在正向測定中，將人玻連蛋白通過胺偶聯固定化於流通池Fc1至Fc4中的CM5晶片上。然後將人PAI-1捕獲於流通池Fc2-Fc4中的玻連蛋白表面作為配體。將Fc1留作參照池。將抗體從40nM開始稀釋2x，並注入Fc1至4。動力學資料分析使用Biacore BIAevaluation軟體進行。感應譜首先通過減去參照池的值和空白緩衝液值進行雙重參照。然後使用類比的具有局部Rmax的動力學1：1(Langmuir)模型擬合。

表10中的資料表明A44結合游離的人PAI-1以及玻連蛋白複合物中的PAI-1。

實施例9：初級人細胞中的功能測定

為了進一步調查每種抗體恢復初級人細胞下游胞漿素產生的能力，使用了胞漿素生成測定。僅使用了在產色測定中顯示高效力和在Biacore中顯示良好親和力的抗體在該測定中進行測試。

在第1日，將人初級肝星形細胞(Sciencell CA，cat no SC5300)以20000細胞/孔在37℃在5%CO₂下鋪板於饑餓培養基(DMEM Gibco+glutamax-1 4.5g/L D-葡萄糖，丙酮酸(31966-021)，0.2%胎牛血清gold PAA(A11-152))。在第2日，為了中和PAI-1活性，將抗體用重組PAI-1(Molecular Innovation，cat# IGLYHPAI-A，重組糖基化人PAI-1，最終濃度5nM)在室溫預培養15分鐘。與此同時，將tPA(Molecular Innovations(cat# HTPA-TC)，無酚紅的DMEM中的5nM)與細胞在37℃培養15分鐘。在洗去未結合的tPA之後，將PAI-1/mAb混合物添加於細胞，然後通過添加glu-胞漿素原/基質混合物(Glu-Pg：Sigma產品號9001-91-6；0.5μM最終濃度)和胞漿素產色基質：(CBS00.65 Stago產品號00128，0.5mM最終濃度)來測量剩餘tPA活性。

胞漿素原至胞漿素的活化通過使用恒溫於37℃的分光光度計(IEMS，Thermofisher)每45秒在A405/492進行動力學讀取來檢測。Biolise軟體(Thermofischer)計算產色基質切割的最大速率：胞漿素產生表示為Vmax：計算出的每分鐘A405/492nm的最大速率(mDO/分鐘)。然後用作為參照的tPA本身(100%抑制)和PAI-1(無mAb，即無抑制)計算PAI-1抑制，並使用Biostat speed軟體作圖以計算IC₅₀和Imax。

實施例10：通過Biacore競爭測定進行的抗體結合表位探查

在Biacore競爭測定中對具有優異結合和阻斷活性的選定組的抗PAI-1抗體探查其潛在的結合表位。在該測定中，將新鑒定出的抗體以及幾種商業上可獲得的、具有已知的在人PAI-1上的結合位點抗PAI-1抗體設置為競爭對人PAI-1蛋白的結合。將每種抗體使用標準的胺偶聯反應固定化於Biacore CM5晶片中的流通池上。除了選殖株B28，所有測試的抗體在胺偶聯之後保留了結合位點或I系那個。將人PAI-1蛋白捕獲於晶片上的固定化的抗體，接著注入每種抗體作為分析物。僅與來自固定化的抗體在人PAI-1上具有不同的結合位點的分析吳抗體在Biacore中顯示附加的結合信號。對於每種固定化的抗體將該競爭實驗重複兩次，且結果示於下表：

當A44受固定化並結合PAI-1時，C45(分析物抗體)無法結合於與PAI-1結合的A44(在表12中標示為「c/c」)，或A44對PAI-1的結合干擾C45對PAI-1的結合。當在相反方向重複該實驗時，該分析得到確認。具體而言，當C45為固定化的抗體並結合於PAI-1時，作為分析物抗體的A44無法結合於與C45結合的PAI-1(在表12中標示為「c/c」)。在類似的分析中，A71和A75競爭PAI-1上的相同位點。Biacore分析確認A44和C45，以及A71和A75當結合於PAI-1時彼此競爭或彼此干擾。

相反地，商業上可獲得的抗體33H1和33B8並不與A44競爭。當A44為固定化的抗體並結合於PAI-1時，33H1和33B8兩者均仍能夠結合於與A44結合的PAI-1(在表12中標示為「b/b」)。這在反向實驗中得到確認。當PAI-1結合域固定化的33H1或固定化的33H8時，A44仍能夠結合於PAI-1。因此，商業上可獲得的抗體33H1和33B8並不與A44競爭或干擾其對PAI-1的結合。

有趣地是，一些固定化的抗體(即B109)阻斷分析物抗體(即33B8)結合域捕獲的PAI-1蛋白；然而，當將固定化的抗體和分析物抗體的位置互換時(例如，將該對在晶片上互換)，該抗體對不再彼此競爭對PAI-1的結合。例如，當B109為結合於PAI-1的固定化的抗體時，33B8無法結合於PAI-1。然而，當33B8為結合於PAI-1的固定化的抗體時，B109能夠結合於PAI-1。關於該結果一種可能的解釋是當固定化的抗體結合於PAI-1時，PAI-1可能轉換為對於第二或分析物抗體不利的構象，並阻止分析物抗體結合(例如，當B109是固定化的抗體而33B8是分析物抗體時。然而，當抗體對互換時，固定化的抗體可能以下述方式結合，使得PAI-1構象相對未改變，因此允許分析物抗體結合於結合的PAI-1(即，分析物抗體B109能夠結合與固定化的抗體33B8結合的PAI-1)。因此，在33B8和B109之間觀察到的競爭並非因為在PAI-1上重疊的結合位點，但更可能是由於當結合於B109時PAI-1中的構象變化。

另一個令人感興趣的觀察是當通過胺偶聯固定化時，B28喪失了對人PAI-1的結合，這表明B28的CDR區涉及具有伯胺基團的胺基酸。

實施例11：選擇供人源化的小鼠單株抗體

表13顯示表徵來自五次進行的融合的最具活性的單株抗體的體外資料的總結。基於這些資料，選擇A44進行人源化，因為A44在產色測定和在胞漿素生成方面為最具效力的抗體，並在Biacore中具有最高親和力。

表1中所示的重鏈和輕鏈序列在圖12中比對，且如IMGT所定義的CDR以粗體凸顯。基於表13中呈現的該體外資料，選擇A44進行人源化。

實施例12：抗PAI-1 A44 Fab的工程改造：人源化，穩定化，和不希望的序列基序的突變

採用數種下述討論的方法來人源化、穩定化針對PAI-1的A44鼠類抗體並優化其序列基序。

1)人源化

所用的人源化規程已描述於PCT/US08/74381(US20110027266)，其通過全文提述併入本文。使用鼠類A44的可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)序列在Molecular Operating Environment(MOE；v.2010.10；Chemical Computing Group)中構建抗PAI-1A44輕鏈(LC)和重鏈(HC)的同源模型。使用下述範本：輕鏈框架區-1D5I(在框架區中具有94%同一性)，重鏈框架區-3KSO(在框架區中具有96%同一性)，L3-1AXS(72%同一性)，H1-1IC7(82%同一性)，H2-1MBU(68%同一性)和H3-2WDB(62%同一性)。H3環特別難以建模，因為Trp是第一個殘基。2WDB，儘管是較短的環，亦在環起始處具有Trp和相同的在H3環末端的Phe-Asp-Tyr序列。重建Glu-105(LC)和His-99的側鏈，並將後續模型使用MOE中實施的標準步驟能量最小化。接著進行了對A44的最小化3D同源性模型的分子動力學(MD)類比在500K的溫度達1.1納秒(ns)，其對蛋白骨架施以在Generalized Born隱溶劑中的限制。對於最後1ns，每100皮秒(ps)從該初始MD運行提取了十個歧異的構象。然後將這些歧異的構象分別提交於MD類比在300K溫度達2.3ns，其對蛋白骨架無限制。然後，對於10次MD運行的每一次，使用來自MD軌跡的最後2000張快照(每ps一張)對於每個鼠類A44胺基酸計算其與參照中心點的均方根偏差(rmsd)。通過比較給定胺基酸十次不同MD運行的平均rmsd與所有A44鼠類胺基酸的總體平均rmsd，可決定是否該胺基酸在MD過程中觀察到具有足夠的塑性，從而視為可能與T細胞受體相互作用並參與免疫應答活化。在所述鼠類A44抗體中，37個胺基酸鑒定為具塑性，其中排除了CDR及其周圍5Å。

然後將在20ns(10 x 2ns)過程中62個最具塑性的A44胺基酸的運動與49個人種系同源模型(對於每一個均運行了10 x 2ns MD模擬)的相應的塑性胺基酸的運動相比較。這49個人種系模型是通過系統性合併7個最常見的人種系輕鏈(vk1，vk2，vk3，vk4，vλ1，vλ2，vλ3)和7個最常見的人種系重鏈(vh1a，vh1b，vh2，vh3，vh4，vh5，vh6)來構建的。vk1-vh2人種系抗體的塑性胺基酸與鼠類A44抗體的塑性胺基酸相比顯示0.58 4D類似度；因此，使用vk1-vh2種系抗體人源化A44抗體，著重於塑性胺基酸。vλ3-vh4人種系顯示次高的4D類似度，0.57，並亦用作A44抗體人源化的基礎。對於鼠類A44和vk1-vh2胺基酸的逐對胺基酸關聯，將2個序列基於2個對應的同源模型的alpha碳的最優3D疊置進行比對。鼠類A44和vλ3-vh4的逐對胺基酸關聯以類似方式進行。圖13顯示了鼠類A44輕鏈與vk1和vλ3的比對。圖14顯示了鼠類A44重鏈與vh2和vh4的比對。

2)穩定化

a)基於已知的方法

提出將與其相應的經典序列相比具有低出現頻率的輕鏈和重鏈的胺基酸(排除CDR)突變為最頻繁出現的胺基酸(△△Gth>0.5kcal/mol；(E.Monsellier，H.Bedouelle.J.Mol.Biol.362，2006，p.580-593))。對於LC和HC的該共同突變的最初列表限制於在最接近的人種系(vk1-vh2)中發現的胺基酸。將在CDR周圍最鄰近區域(5埃「Vernier」區(J.Mol.Biol.224，1992，p.487-499))提出的變化從考慮中排除。這導致在LC中的兩個穩定化突變(參見表15)和在HC中的五個穩定化突變(參見表16)。考慮了其它標準以考慮這些突變供潛在地穩定化抗PAI-1 A44抗體。這些標準是在表面有利的親水性變化或對突變體基於分子力學預測的穩定化。同樣，考慮了其它據文獻報導為成功的穩定化突變(E.Monsellier & H.Bedouelle，J.Mol.Biol.，362，2006，p.580-593；B.J.Steipe等J.Mol.Biol，1994，240，188-192)(參見表17和18)。然而，未提出其它突變。

b)基於3D和MD的方法

之前已報導了基於3D和MD的方法(Seco J.，Luque F.J.，Barril X.，J.Med.Chem.2009 Apr 23：52(8)：2363-71；Malin Jonsson等，J.Phys.Chem.B 2003，107：5511-5518)。抗體的疏水區通過在二元溶劑(20%水中的異丙醇，20ns產生模擬)中分析Fab的分子動力學模擬而明確地鑒定出。完成了在Schrodinger’s maestro軟體(v.8.5.207)中使用疏水性表面圖的附加分析。通過這兩種方法分析的蛋白表面非常親水。儘管使用了這兩種技術，未發現任何殘基導致在表面上的任何疏水片區，因此認為不存在抗聚集突變。

3)通過移植進行的人源化

之前已報導了使用移植技術的人源化(P.T.Jones，P.H.Dear，J.Foote，M.S.Neuberger，G.Winter，Nature 1986，321：522-525)。所述人源化首先鑒定與抗PAI1 A44可變域輕鏈和重鏈最接近的兩個人種系。這是通過對於系統枚舉(對於κ和λ鏈，所有可能的V和J域的組合，對於重鏈為V、D和J域的組合)的所有人種系進行BLAST檢索來完成。BLAST檢索使用由National Center for Biotechnology Information(NCBI)提供的Sequence Information Retrieval and Analysis(SIRA)服務所連結的局域網應用進行。

最接近的人種系鑒定為分別與抗PAI1 A44可變域輕鏈和重鏈具有70%和67%的序列同一性。使用內部VBASE種系序列，發現輕連結近於VκI-O18(大約64%同一性)基因座而重連結近於VH4亞家族的4-30(大約69%同一性)基因座。CDR區(基於Kabat)和Vernier殘基對於mA44輕鏈(A44LC)和對於IGVK1-33-01_IGKJ4-01(IGVK1)標示為斜體。定義於J.Mol.Biol.，1992，224，487的Vernier殘基以底線表示。人源化突變(粗體)通過對兩個比對的序列進行逐對比較來獲得，其中排除了如上定義的CDR & Vernier區殘基(在鼠類中亦以底線表示)。將來自鼠類輕鏈的T46L和Q69T和鼠類重鏈中的M2V(Vernier區殘基)突變為主要為保守的人種系序列作為通過移植進行的人源化方法的一部分(LC5a，HC5a)。在另一個變體中，如初始鼠類序列中所見保留這三個Vernier區殘基(LC5b，HC5b)。

mA44-輕鏈(SEQ ID NO：141)

IGKV1-33-01_IGKJ4-01(SEQ ID NO：107)

mA44-重鏈(SEQ ID NO：140)

IGHV4-59-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02(SEQ ID NO：108)

次接近的人種系鑒定為分別與抗PAI1 A44可變域輕鏈和重鏈具有59%和58%序列同一性。使用內部VBASE種系，發現該輕連結近於VκIII-L6(~56%同一性)基因座而該重連結近於VH6亞家族的6-01基因座。CDR區(基於Kabat)和Vernier區以斜體標示。Vernier區(如定義於J.Mol.Biol.，1992，224，487)以底線標示。人源化突變通過對兩個比對的序列進行逐對比較來獲得並以粗體顯示，其中排除了如上定義的CDR & Vernier區殘基(在鼠類中亦以底線表示)。

mA44-輕鏈(SEQ ID NO：141)

IGKV3-11-02_IGKJ4-01(SEQ ID NO：143)

mA44-重鏈(SEQ ID NO：140)

IGHV6-1-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02(SEQ ID NO：144)

4)不希望的序列基序的突變

考慮了下述的序列的基序：Asp-Pro(酸不穩定鍵)，Asn-X-Ser/Thr(糖基化，X=任何除Pro外的胺基酸)，Asp-Gly/Ser/Thr(在塑性區琥珀醯亞胺/異天冬胺酸形成)，Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys(暴露的脫醯胺位點)，和Met(在暴露區受氧化)。鼠類抗PAI1 A44的VL和VH域具有兩個潛在的糖基化位點：LC中的N⁵²RS(在CDR2中)和在HC中的N⁷²TS。一個暴露的脫醯胺位點存在於HC的CDR1(N³¹G)。在初始鼠類序列中鑒定了三個潛在的琥珀醯亞胺形成位點：LC中的D⁵⁶G(CDR2末端)，以及HC中的D²⁷S(在CDR1中)和D⁸⁹T。LC中存在問題的基序：N⁵²RS和D⁵⁶G，均在CDR2中。因為這些突變發生於CDR中，它們通過在兩個提出的下述工程改造序列(LC2和LC4)進行突變得以解決。N⁵²保守地突變為Gln，而D⁵⁶突變為Glu。在HC中存在四個存在問題的殘基。前兩個發生於CDR1：潛在的琥珀醯亞胺形成位點，D²⁷S，和脫醯胺位點N³¹G。兩個其它存在問題的基序亦發生於第三框架區。在CDR1中，將D²⁷突變為E以避免琥珀醯亞胺的形成，而將N³¹改變為Q。分別將N⁷²和D⁸⁹改變為Q和E。這些存在問題的基序在下文所述的工程改造的序列HC2a和HC4中得以解決。HC2b變體僅含有N³¹G脫醯胺位點的突變。

將所得的人源化序列針對IEDB資料庫(見於萬維網immuneepitope.com，2009年6月版本；Vita R.，Zarebeski L.，Greenbaum J.A.，Emami H.，Hoof I.，Salimi N.，Damle R.，Sette A.，Peters B.The immune epitope database 2.0 Nucleic Acids Res.2010，Jan，38(Database issue)：D854-62.Epub 2009，nov 11)進行BLAST探查序列類似性以確保所有序列均不包含任何已知的人B或T細胞表位(70%同一性用作經由BLAST檢索獲得的結果的截取值，並僅考慮來自人物種的結果)。DeClerck等(國際揭示號WO 2002034776)揭示了PAI-1的抗體結合表位，對於本文中揭示的表位，其均不存在問題。

對於鼠類A44 LC，根據Kirschmann等(The Journal of Immunology，1995，155，5655-5662)，存在一個人表位。其與下文所示的14胺基酸區段具有~71%同一性。該問題序列為未經質譜法證實的部分序列。對於該肽未報導任何結合資料。該表位見於所有提出的LC變體。當對HC進行類似的檢索時未鑒定出潛在存在問題的表位。

5)抗PAI1可變域的起始序列

CDR以粗體凸顯，而Vernier區(如由Foote & Winter，J.Mol.Biol.，1992，224：487-499定義)以底線標示

輕鏈(SEQ ID NO：142)

發展性指數(germinality index)=70%(相對於IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])

重鏈(SEQ ID NO：140)

發展性指數=67%(相對於IGHV4-59-02_IGHD6-137-01_IGHJ4-02[VH4 4-30])

6)工程改造的序列

將4D人源化和移植方法應用於最接近的兩個人種系序列

a)工程改造的輕鏈序列

使用最接近的種系序列vk1，LC1a含有七個源自4D人源化方法的突變。LC1b對於次接近的人種系序列vl3具有12個源自4D人源化的突變。LC2與LC1a相比含有CDR2中2個附加的突變。這些突變解決了潛在的糖基化位點(N⁵²RS)和潛在的琥珀醯亞胺形成位點(D⁵⁶G)。LC3對於最接近的種系序列含有來自4D人源化的突變，並具有2個穩定化突變。LC4組合了人源化、穩定化和不希望的基序突變。CDR和Vernier區以斜體表示，Vernier殘基以底線表示，人源化突變以粗體表示，存在問題的基序以雙刪除線表示，而穩定化突變以小寫顯示。圖16和17顯示這些突變的總結。

LC1a(SEQ ID NO：91)：

對於序列LC1a在IEDB資料庫中未發現其它人表位。LC1a發展性指數=76%(相對於IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。

LC1b(SEQ ID NO：92)：

除了上述第4部分中所述的表位之外，K39PGQSPKTLI與KPGQPPRLLI具有70%序列同一性(Kirschmann等J.Immun.，1995，155，5655-5662)。該肽據報導對於所有測試的HLA-DR等位基因具有IC50>100,000nM。LC1b發展性指數=67%(相對於IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。

LC2(SEQ ID NO：93)：

對於序列LC2在IEDB資料庫中未發現其它人表位。

LC2發展性指數=76%(相對於IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。

LC3(SEQ ID NO：94)：

對於序列LC3在IEDB資料庫中未發現其它人表位。LC3發展性指數=78%(相對於IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。

LC4(SEQ ID NO：95)：

對於序列LC4在IEDB資料庫中未發現其它人表位。LC4發展性指數=78%(相對於IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。

LC5a(SEQ ID NO：96)：

除了上述第4部分中所述的表位之外，A43PKLLIYRAN與APKLLIYAASSL具有80%序列同一性(Kirschmann等J.Immun.，1995，155，5655-5662)。對於該肽未確定其分子量，且無結合資料的報導。LC5a發展性指數(germinality index)=85%(相對於IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。

LC5b(SEQ ID NO：97)：

對於序列LC5b在IEDB資料庫中未發現其它人表位。LC5b發展性指數=78%(相對於IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。

LC5c(SEQ ID NO：98)：

除了上述第4部分中所述的表位之外，K³⁹PGQAPRTLI與KPGQPPRLLI具有80%序列同一性(Kirschmann等J.Immun.，1995，155，5655-5662)。該肽據報導對於所有測試的HLA-DR等位基因具有IC50>100,000nM。 LC5c發展性指數=79%(相對於IGKV3-11-02_IGKJ4-01[VκIII-L6])。所有輕鏈突變的概述示於圖15。

b)工程改造的重鏈序列

HC1a對於最接近的人種系序列含有八個源自4D人源化方法的突變。HC1b對於次接近的人種系序列具有六個源自4D人源化的突變。HC2a與HC1a相比含有四個附加的突變以解決不希望的序列基序。HC3僅含有來自HC1a的人源化突變，並具有五個其它的穩定化突變。HC4含有來自HC1a的人源化突變，來自HC3的穩定化突變，和來自HC2a的解決存在問題的基序的突變。CDR和Vernier區以斜體表示，Vernier殘基以底線表示，人源化突變以粗體表示，存在問題的基序以雙刪除線表示，而穩定化突變以小寫顯示。

HC1a(SEQ ID NO：82)：

對於序列HC1a在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC1a發展性指數=68%(相對於IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。

HC1b(SEQ ID NO：83)：

對於序列HC1b在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC1b發展性指數=73%(相對於IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。

HC2a(SEQ ID NO：84)：

對於序列HC2a在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC2a發展性指數=73%(相對於IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。

HC2b(SEQ ID NO：85)：

對於序列HC2b在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC2b發展性指數=67%(相對於IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。

HC3(SEQ ID NO：86)：

對於序列HC3在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC3發展性指數=72%(相對於IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。

HC4(SEQ ID NO：87)：

對於序列HC4在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC4發展性指數=70%(相對於IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。

HC5a(SEQ ID NO：88)：

對於序列HC5a在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC5a發展性指數=84%(相對於IGHV4-59-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02[VH4 4-59])。

HC5b(SEQ ID NO：89)：

對於序列HC5b在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC5b發展性指數=84%(相對於IGHV4-59-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02[VH4 4-59])。

HC5c(SEQ ID NO：90)：

對於序列HC5c在IEDB資料庫中未發現其它人表位。HC5c發展性指數=78%(相對於IGHV6-1-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02[VH6 6-01])。

所有重鏈突變的概述示於圖16。

c)重鏈和輕鏈序列的組合

對於移植，構建了三種型式的輕鏈(LC5a，LC5b，LC5c)和三種型式的重鏈(HC5a，HC5b，HC5c)。LC5a含有16個突變，其源自移植於最接近的人種系序列並保留鼠類CDR和大部分鼠類Vernier區殘基。兩個鼠類Vernier殘基，T46和N69不存在於任何人種系序列，並保守地突變。LC5b含有14個突變，其源自移植於最接近的人種系序列並保留鼠類CDR和全部鼠類 Vernier區殘基。LC5c含有22個突變，其源自移植於次接近的人種系序列並保留鼠類CDR和全部鼠類Vernier區殘基。

HC5a含有20個突變，其源自移植於最接近的人種系序列並保留鼠類CDR和大部分鼠類Vernier區殘基，除了M2V。在人種系序列的該位置，Met以非常低的傾向出現。HC5b含有20個突變，其源自移植於最接近的人種系序列並保留鼠類CDR和全部鼠類Vernier區殘基。HC5c含有23個突變，其源自移植於次接近的人種系序列並保留鼠類CDR和全部鼠類Vernier區殘基。

總共製備了十個組合(總結於表19)：LC1a x HC1a(基於最接近的種系序列解決4D人源化的突變)

●LC1b x HC1b(基於次接近的種系序列解決4D人源化的突變)

●LC2 x HC2a(解決4D人源化和不希望的序列的突變)

●LC2 x HC2b(解決4D人源化和不希望的序列的突變)

●LC1a x HC2b(解決4D人源化和不希望的序列的突變)

●LC3 x HC3(解決4D人源化和穩定化的突變)

●LC4 x HC4(解決4D人源化，不希望的序列和穩定化的突變)

●LC5a x HC5a(解決通過移植進行的人源化，保留CDR並組入3個保守Vernier修飾的突變)

●LC5b x HC5b(解決通過移植進行的人源化，保留CDR和Vernier區的突變)

●LC5c x HC5c(解決通過移植進行的人源化，保留CDR和Vernier區的突變)

總之，在人源化過程中生成了十個變體。於下所述數個體外測定中進行這些變體表現及測定特徵。

7)人源化變體的特徵

基於上述實施例中呈現的電腦建模，生成了十個變體(通過4D人源化生成變體1-8，和通過CDR移植生成變體9-10，變體3和10是基於次接近的種系構建的)。製備了人源化A44的輕鏈和重鏈DNA的可變區以供HEK293表現。在將對應的DNA選殖入pXL質體之後生成了蛋白(New England Biolabs；對於HC為NheI/Eco47III，對於LC為NheI/BsiWI)。將人源化序列就HEK表現進行密碼子優化，並將基因通過GeneArt(Life Technologies的子公司)合成。將所得的質體在FreeStyle^TM293 Expression System(Invitrogen，Cat#K9000-01)中共轉染和暫態表現。變體3和10表現非常不良，且並未進一步對其進行操作。將所有其它的變體表現並使用蛋白A柱純化。分析凝膠顯示變體5和7中的重鏈(資料未顯示)和變體6和9中的輕鏈部分地糖基化(約5-10%)。將剩餘八個變體在使用hPAI的產色測定中和在人星形細胞中使用糖基化PAI的胞漿素生成測定中進行測試。結果示於表23。

變體6和9在胞漿素生成測定中顯示最佳效力，但在輕鏈中具有部分(5%-10%)糖基化。基於這些結果，使用來自變體6和9的重鏈和來自變體5和7的輕鏈的組合產生新變體11-14。表24總結了所有構建的變體。

除了不良表現的變體3和10外，在Biacore中針對人和獼猴PAI-1和玻連蛋白-PAI-1複合物測試了所有的變體。數據呈現於表26。

Biacore資料並未揭示人源化變體之間的顯著差異。所有人源化變體，除了變體8，均在可接受範圍內顯示對獼猴PAI-1和人PAI-1以及複合於玻連蛋白的PAI-1的親和力。與親本A44相比較，人源化並未顯示改變抗體親和力。

儘管人源化變體的親和力和效力在產色和Biacore測定中並未無顯著差異，但對於一些變體，在細胞測定中變體恢復胞漿素的能力顯著低於親本小鼠抗體(參見表27，其總結了產色測定和下述細胞測定的比較)。對人源化變體11-14測試了在細胞測定中阻斷PAI-1的能力。

變體11至14顯示了在胞漿素生成測定中的良好效力，並在其它體外測定中進一步表徵。

8)人肝中人源化變體的特徵

人源化變體11-14的附加篩選使用從人血漿和人纖維化肝樣品內源產生的人PAI-1進行。

PAI-1活性通過測定該絲胺酸蛋白酶抑制劑與96孔盤上固定化的尿激酶形成穩定複合物的能力來評估。在洗滌了未結合的PAI-1之後，uPA-PAI-1複合物通過使用多選殖株抗PAI-1抗體來檢測。然後將結合的多選殖株抗PAI-1抗體(其與樣品中的活性PAI-1成比例)通過使用辣根過氧化物酶綴合的二抗(Molecular Innovation Cat.no.HPAIKT)來檢測。將多種濃度的A44人源化變體在室溫用人或獼猴重組PAI-1(0.31nM最終濃度)培養15分鐘，然後使用上述的ELISA通過uPA-PAI-1複合物測試功能性活性PAI-1。將樣品與人PAI-1標樣相比較。將來自具有高活性PAI-1濃度的高BMI患者的人血漿稀釋4倍，並用增加量的A44人源化變體來培養。剩餘的活性PAI-1濃度使用通過ELISA的uPA-PAI-1複合物檢測來確定。亦通過胞漿素產生測試了獼猴重組PAI-1中和以確認交叉反應性。

將人纖維化肝樣品(由Biopredic International，Rennes，France從肝部結腸轉移的手術切片提供)如下所述勻漿：將稱重的凍結肝樣品在含有陶瓷珠的幹試管(產品號03961-1-003，Bertin Technology，France)中使用Precellys勻漿機(Bertin Technology，France；4℃，在6800rpm進行2x30秒)勻漿，然後使用1ml/g的連接緩衝液(TBS中的NaCl 1.5M-Tris緩衝溶液0.1M Tris+0.15M NaCl pH7.4)溶解。在4℃在5000g離心10分鐘之後，收穫上清中的肝裂解物，並在-80℃凍結儲藏。總蛋白濃度使用標準BCA測定和活性和總PAI-1濃度(通過由Mol Innov產品號HPAIKT &產品號MPAIKT-TOT提供的UK-PAI complex ELISA確定)根據生產商的指示進行，即使用Biostat Calibration軟體將人PAI-1濃度針對A450nm作圖。如前所述評估用稀釋至2.5nM活性PAI-1的肝裂解物培養的增加濃度的A44人源化變體，並分析資料。對於每個mAb濃度計算PAI-1活性的抑制(不含mAb的PAI-1活性為0%抑制，用IgG1並無顯著和劑量依賴性的PAI-1抑制)。將PAI-1活性的抑制百分比作為mAb濃度的函數作圖，並通過使用Biostat speed軟體的Imax確定IC50。數據示於圖17和表29。

根據上述資料，選擇A44-hv11在附加的結構研究和其它體外和體內研究中進一步表徵。

實施例13：通過移植進行的APG抗體的人源化

之前已報導了使用移植技術進行的人源化(P.T.Jones，等，Nature 1986，321：522-525)。抗PAI1鼠類抗體APG的人源化始以來自德國專利申請號DE2000153251的鼠類輕鏈(SEQ ID NO：148)和鼠類重鏈(SEQ ID NO：149)。該鼠類抗體亦描述於Debrock等，Biochimica et Biophysica Acta，1337(2)：257-266(1997)。對該鼠類抗體的HC和LC鏈的種系和規範類型的鑒定分別產生了muIGHV1-39和muIGKV14-111。接著，鑒定了與抗PAI1 APG可變域輕鏈和重鏈的人種系的清單，並根據百分比同一性排行。兩個步驟均通過對於系統枚舉(對於κ和λ鏈，所有可能的V和J域的組合，對於重鏈為V、D和J域的組合)的所有人種系進行BLAST檢索來完成。BLAST檢索使用http：//www.imgt.org.(See Ehrenmann，等Cold Spring Harbor Protocols 2011.6(2011))提供的IMGT/DomainGapAlign工具進行。最接近的人種系鑒定為與抗PAI1 APG可變域輕鏈和重鏈具有67.4%和63.3%序列同一性。使用IMGT資料庫，發現所述輕連結近於HuIGKV1-33而重連結近於HuIGHV1-46。發現規範類型匹配下與抗PAI1 APG可變域重鏈最接近的人種系為HuIGHV7-4-1，具有62.2%的序列同一性。

對於親本鼠類APG(mAPG)輕鏈(mAPG)輕鏈(SEQ ID NO：148)，IGKV1-33-01_IGKJ4-01(IGKV1a)(SEQ ID NO：107)和IGKV1-33-01_IGKJ2-02(IGKV1b)(SEQ ID NO：150)(參見下表30)，CDR區(對於APG，基於Kabat和IMGT的組合)和Vernier殘基以斜體表示。如定義於Foote，等J.Mol.Biol.224(2)：487-99(1992)的Vernier殘基以底線表示。人源化突變(以粗體表示)通過對兩個比對的序列進行逐對比較獲得，其中排除如上所定義的CDR和Vernier區殘基(在mAPG序列中亦以底線表示，表30)。對鼠類APG抗體並未進行進一步工程改造。這些工程改造的抗體命名為APGv2和APGv4。

工程化序列

將4D人源化和移植方法應用於上述的人種系序列匹配。對於工程化輕鏈序列，APGv2含有移植入人IGKV1-33種系的鼠類輕鏈CDR(APGv2發展性指數=94%，相對於IGKV1-33-01_IGKJ2-01)。對於工程化重鏈序列，APGv2和APGv4分別含有移植入人類IGHV7-4-1和IGHV1-46的鼠類重鏈CDR(APG_VH2發展性指數=91%，相對於IGHV7-4-1-02_IGHD6-25-01_IGHJ4-02；APG_VH4發展性指數=91%，相對於IGHV1-46-01_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。參見上表30。

重鏈和輕鏈變體序列的組合

為了移植，構建了一種型式的輕鏈(APGv2_VL2；SEQ ID NO：153)和兩種型式的重鏈(APGv2_VH2；SEQ ID NO：154和APGv4_VH4；SEQ ID NO：155)。APG_VL2含有15個源自移植於最接近的人種系序列並保留鼠類CDR和Vernier區殘基的突變。APG_VH2含有21個源自移植於最接近的人種系序列、具有匹配的規範類型並保留鼠類CDR和Vernier區殘基的突變。APG_VH4含有20個源自移植於最接近的人種系序列並保留鼠類CDR和Vernier區殘基的突變。對於該移植規程，CDR的分界大致地基於文獻中可獲得的多種不同定義。

●APG_VL2 x APG_VH2(解決通過移植進行的人源化，保留CDR和Vernier區的突變)

●APG_VL2 x APG_VH4(解決通過移植進行的人源化，保留CDR和Vernier區的突變)

在該人源化過程中生成了兩個mAPG變體，其命名為APGv2和APGv4。將這些變體表現並如下所述在數種體外測定中表徵。

實施例14：通過表面等離子共振進行的對於APG抗體的親和力動力學

通過Surface Plasmon Resonance(SPR)對於小鼠APG和兩個人源化變體(APGv2 & APGv4)使用Biacore 2000儀器(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)調查對於人糖基化PAI-1(GIYHPAI-A，Molecular Innovation)的親和力。

首先，使用常規胺偶聯製備傳感晶片CM5(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)的表面以供捕獲小鼠和人抗Fc(Anti-human IgG(Fc)antibody & Anti-mouse IgG antibody kits，GE Healthcare)。將所有的單株抗體(mAb)使用HBS-EP運行緩衝液稀釋至5nM。將每個純化的mAb在不同的流通池表面捕獲3分鐘。將人PAI-1以多種濃度(2.5，5，10，20和40nM)注入，其中之間的締合時間較短，而最後的締合時間較長(接觸時間：120秒，短締合：90秒；長締合：1800秒，流速：50μl/min)。在每輪抗體-PAI-1結合之後晶片通過甘胺酸-HCl，pH 1.7緩衝液再生。動力學資料分析使用Biacore BIAevaluation軟體進行。將感應譜通過減去參照的流通池值和空白緩衝液值進行雙重參照。將感應譜通過使用具有局部Rmax的類比的動力學1：1(Langmuir)模型進行擬合(參見圖19)。對於三個APG抗體的資料示於表31。

實施例15：在人血漿中APG抗體的特徵

根據本文中所述的功能測定(參見，例如上述實施例6和9)對小鼠APG和人源化的變體APGv2和APGv4篩選其阻斷PAI-1的能力。簡言之，PAI-1活性通過該絲胺酸蛋白酶抑制劑與96孔上固定化的尿激酶形成穩定複合物的能力來進行評估。在洗滌了未結合的PAI-1之後，uPA-PAI-1複合物通過使用多選殖株抗PAI-1抗體來檢測。然後將結合的多選殖株抗PAI-1抗體(其與樣品中的活性PAI-1成比例)通過使用辣根過氧化物酶綴合的二抗(Molecular Innovation Cat.no.HPAIKT)來檢測。

將多種濃度的APG人源化變體(APGv2，APGv4)或親本小鼠APG抗體在室溫用未稀釋的具有高活性PAI-1濃度的人血漿培養15分鐘。剩餘的活性PAI-1濃度如上所述(參見，例如實施例6)和根據生產商的指示使用通過ELISA的uPA-PAI-1複合物檢測來確定。

對於每個mAb濃度計算PAI-1活性的抑制。將PAI-1活性的百分比抑制作為APG人源化變體(APGv2，APGv4)或親本小鼠APG抗體的濃度的函數進行作圖。使用Biostat speed軟體在三次獨立實驗(一式兩次)之後用於確定IC₅₀和I_max(參見圖20)。數據呈現於下表32。

實施例16：人血漿中的凝塊溶解測定：A44V11，mAPG，和APG變體活性

纖溶系統在中風患者中常常改變。可使用凝塊溶解測定來通過測量纖維蛋白降解的程度來確定纖溶活性。一般地，參見Lindgren，A.等Stroke 27：1066-1071(1996)。凝塊溶解測定在其它文獻中更詳細描述。參見，例如Beebe，等Thromb.Res.47：123-8(1987)；Tilley等，J.Vis.Exp.67：e3822。

A44V11和其它PAI-1中和抗體的功能活性使用人血漿凝塊溶解測定來確定。簡言之，本文中應用的測定使用組織因子/Ca2+的混合物在tPA存在下和已知抑制凝塊溶解的PAI-1濃度誘導凝塊形成。纖維蛋白聚合誘導濁度的增加，其通過在340nm的吸光度測量來檢測。抗體恢復凝塊溶解的能力通過將增加劑量的抗體與正常的缺乏血小板的人血漿培養來確定。

簡言之，凝塊溶解實驗在微滴定盤中進行。將經檸檬酸處理的人血漿(Biopredic International，Rennes，France)用稀釋於測定緩衝液(NaCl，Tris-HCl pH=7.4)的抗PAI-1抗體或同種型對照IgG培養。在室溫培養15分鐘之後，將人糖基化PAI-1(GLYHPAI-A，Molecular Innovation)添加至3nM的最終濃度，並再培養10分鐘。然後將t-PA(sctPA，Molecular Innovation)添加至1nM的最終濃度。凝塊形成通過包含稀釋至鈣測定緩衝液(CaCl₂)中7.5mM 的最終濃度的組織因子(Innovin®，Siemens Healthcare Diagnostics，Marburg，Germany)的活化混合物來誘導。

在340nm的吸光度的動力學讀取用iEMS微盤讀數器(ThermoFischer)或SpectrostarNano(BMG Labtech)每30秒進行達5小時。為了定量對凝塊溶解的作用，使用GraphPad Prism Software計算曲線下面積(AUC)，其反映了凝塊形成和凝塊溶解之間的平衡。在抗體處理之後凝塊溶解的恢復根據下述計算確定：恢復=100 x (AUC _最大溶解 -AUC _處理的)/(AUC _無溶解 -AUC _最大溶解)

IC₅₀和I_max使用Biostat speed軟體計算。

1nM濃度的t-PA在2小時內產生正常血漿的完全溶解。3nM濃度的PAI-1抑制t-PA誘導的凝塊溶解。添加t-PA或PAI-1本身並不影響凝塊形成。既不添加t-PA也不添加PAI-1不影響凝塊形成。

A44V11抗PAI-1抗體恢復了人缺乏血小板的血漿的凝塊溶解(參見圖21)，而同種型IgG1並非如此(參見圖22)。A44V11呈現2nM的IC₅₀和在100nM處103%的I_max(參見圖23)。

APG抗PAI-1抗體的人源化變體亦恢復了人缺乏血小板的血漿的凝塊溶解(參見圖24)。APGv2顯示2.1nM的IC₅₀和在100nM處114%的I_max。APGv4顯示2.8nM的IC₅₀和在100nM處116%的I_max(參見圖25)。凝塊溶解資料總結於下表33。

實施例17：對初級人非細胞中PAI-1的A44V11中和的評估

在基於肺細胞的系統中調查了抗體A44V11對PAI-1的中和的作用。TGFβ被視為最強力和通用的促纖維形成細胞因子。已顯示在培養的鼠類胚胎成纖維細胞(NIH3T3細胞)中，TGFβ誘導PAI-1表現並抑制t-PA和胞漿素的活性，以及膠原蛋白降解。參見Liu，R-M.Antioxid Redox Signal.10(2)： 303-319(2008)。將來自ATCC(Manassas，Virginia)的初級肺成纖維細胞菌株LL29(CCL-134)和LL97A(CCL-191)在12孔盤中以200,000個細胞每孔的濃度鋪板過夜。將細胞用A44V11抗體或同種型對照(IgG)和TGFβ(R&D Systems，Minneapolis，Minn.，cat.#100-B-001)以5ng/ml的濃度培養48小時。在48小時之後，收穫細胞上清，並用兔pAb抗PAI-1(abcam，ab66705)通過Western Blot分析以供檢測PAI-1形式。

在TGFβ刺激之後用A44V11抗體處理的細胞顯示PAI-1條帶為雙條帶，這對應於PAI-1的切割形式(參見圖26，泳道5)。用對照IgG處理的細胞並未顯示該雙條帶形成(參見圖26，泳道6)。該研究說明用A44V11處理初級人肺細胞誘導內源PAI-1基質構象，這允許PAI-1受蛋白酶切割。

實施例18：A44V11增加MMP的活化

胞漿素可活化MMP，其為降解大多數ECM蛋白的酶，ECM蛋白包括膠原蛋白，其為纖維組織主要的蛋白成分。就此考慮，胞漿素常常被提及為MMP的通用活化素(參見Loskutoff，等J.Clin.Invest.106(12)：1441-43(2000))。PAI-1通過阻斷胞漿素生成，繼以抑制成纖維細胞凋亡減少MMP活化和和基質降解。在基於肺細胞的系統中調查了A44v11刺激MMP活化的能力。將來自ATCC(Manassas，Virginia)初級肺成纖維細胞LL29(CCL-134)和LL97A(CCL-191)以250,000個細胞每孔的濃度在12孔盤中鋪板過夜。將細胞用A44V11或同種型對照(IgG)和Lys-Plasminogen(Molecular Innovation，cat.# HGPG-712)以0.1μM的濃度培養48小時。在48小時之後，收穫細胞上清，並使用Sensolyte 520 Generic MMP Assay kit(AnaSpec，Fremont，CA，cat.# 71158)根據生產商的指示檢測多種MMP(包括，例如MMP-1，2，3，7，8，9，12，13和14)的活性。

如圖27中所示，A44V11在人肺成纖維細胞中刺激胞漿素依存性MMP的活化。該圖顯示兩個單獨的代表性實驗。用A44V11和胞漿素原處理的細胞當與用陰性IgG1抗體處理的細胞相比時顯示顯著增加的活化。該研究說明A44V11在胞漿素介導的現象中刺激MMP活化。

實施例19：在肺纖維化小鼠模型(博來黴素攻擊)中對A44V11效力的分析

由博來黴素誘導的實驗性肺纖維化是由充足文獻支持的、充分研究的纖維生成模型。該肺纖維化模型類似在人體中所見，並已用於評估潛在的治療劑的作用，以及基礎研究(參見，例如Molina-Molina等Thorax 61：604-610(2006))。

在博來黴素處理的小鼠中進行的藥效學研究(纖維化模型)

表現人PAI-1的轉基因小鼠(人源化的PAI-1轉基因小鼠)通過用對應的人野生型PAI-1基因CDS(NCBI Ref.no.NM_000602.3；NC_000007.13)(參見Klinger，K.W.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：8548(1987))在C57BL/6 x 129小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)中內源小鼠PAI-1基因調節序列的調控下替代PAI-1(SERPINE1)基因CDS(外顯子和內含子)(NCBI Ref.no.NM_008871)。分子選殖株和轉基因小鼠的生成根據傳統技術和根據生產商和飼養員的指示進行。人PAI-1的表現和小鼠PAI-1的無表現在同型合子小鼠中確認。mRNA和蛋白濃度分別通過標準qPCR和通過ELISA確認。將8-9周齡並體重22-25g的雌性同型合子人源化PAI-1轉基因小鼠用於這些步驟。齧齒類的食物和水自由提供。

小鼠通過經由微霧化器的氣管內注射以2mg/kg的劑量接受溶解於0.9% NaCl中的50μl Bleomycin®(Sanofi，France)。對照小鼠接受50μl的0.9% NaCl。對於這些步驟，將小鼠用異氟烷(TEM，Lormont，France)通過吸入麻醉，然後用18G套管插管。所述套管連接於輸送氧/異氟烷混合物的換氣裝置以維持麻醉。在麻醉之後，將霧化器引入套管中以供將博來黴素直接注入肺中。然後對小鼠拔管，並允許其從麻醉恢復。在第4日，在隨機分入3個組之後，對小鼠以PBS(1mg/ml)中10mg/kg施以一次腹膜內注射A44v11或陰性對照小鼠IgG1。

在博來黴素攻擊之後規定的時間點(第7日或第9日)，將小鼠用甲苯噻嗪(xylazine)/***(ketamine)混合物麻醉，並通過開胸犧牲。血液收集通過在檸檬酸包被的試管上心內收穫來進行。鉗住左支氣管，並去除左肺，並用固定器(FineFix®，Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL)在控制壓力下固定以供組織學分析。然後將套管置入氣管以供支氣管-肺泡灌洗(BAL)步驟(注入1.5ml的0.9% NaCl，並以三次0.5ml注入進行收穫)。然後收穫右肺的四個肺葉，切割為兩片，並裂解以供蛋白分析。所有實驗依照歐洲倫理法進行，並經內部的倫理委員會批准(CEPAL，sanofi)。

A44V11濃度使用ELISA(Molecular Innovation，cat.# HPAIKT)用包被的生物素化人PAI-1平盤確定，並使用硫標記的抗小鼠IgG二抗(MesoScale Discovery，Gaithersburg，Maryland)檢測。對於在第七日用A44V11處理的小鼠，結果為血漿中為200nM，BALF中為11nM，和肺裂解液中為12nM。

如圖28中所示，在第4日腹腔內施用單劑(10mg/kg)A44V11在博來黴素攻擊之後第7日在犧牲的小鼠中在BAL液和肺裂解液中均取得了人活性PAI-1幾乎完全的抑制。對於第9日的動物，A44V11(10mg/kg)在肺裂解液中取得了人活性PAI-1的幾乎完全抑制，但在BALF中僅取得了部分抑制。

可測量D-二聚體，一種纖維蛋白降解產物，以評估纖維蛋白降解的程度。為了測量纖維蛋白降解，將BALF中D-二聚體濃度通過ELISA(Asserachrom D-Di，Diagnostica Stago，Asnieres，France)根據生產商的指示檢測。A44V11處理組中BALF中的D-二聚體濃度與IgG1陰性對照組相比在第7日增加至大約2.8倍而在第9日增加至1.6倍，表明A44V11處理增加纖維蛋白降解(參見圖29)。

進行了其它研究以進一步評估A44V11減少用博來黴素攻擊的小鼠肺中的纖維化的活性。對於這些研究，對小鼠進行與上述藥效學研究類似的規程，只不過研究持續長度為博來黴素攻擊起21日，且用抗體(10mg/kg的A44V11或IgG1對照抗體)的處理從第4日直至第20日每三日重複一次。在博來黴素攻擊之後第21日，如上所述將動物犧牲。

已知肺重量的增加是增加的纖維化的指征。在所有實驗組中，對於小鼠確定右肺重量，作為纖維化的量度。如圖30中所示，博來黴素滴注誘導了右肺重量的增加，其通過在10mg/kg重複的A44V11抗體給藥部分抑制。使用IgG1陰性對照抗體的重複給藥並未抑制由於博來黴素攻擊造成的右肺重量的增加。當與用IgG1陰性對照抗體處理的類似的博來黴素誘導的小鼠相比時，在A44V11處理的小鼠中博來黴素誘導的右肺重量增加的減少是顯著的(p<0.001)。統計分析通過單路ANOVA繼以Newman-Keuls校驗進行。該結果表明A44V11在人源化PAI小鼠肺中抑制博來黴素誘導的纖維化，而對照IgG1抗體則否。

肺中膠原蛋白累積是另一個已知的纖維化指征。為了測定膠原蛋白累積，製備了來自在第21日犧牲的小鼠的肺組織，並通過HPLC分離，接著測量羥脯胺酸。該技術在其它地方有詳細記載，例如n Hattori，等J Clin Invest.106(11)：1341-1350(2000)。簡言之，肺組織通過在酸性條件(6M HCl)在105℃水解22小時，繼以蒸發來製備。肺組織中的伯胺通過OPA(肽醛)阻斷，而脯胺酸/羥脯胺酸使用NBD(4-氯-7-硝基苯並呋咱；4-chloro-7-benzofurazan)(Santa Cruz Biotech.，Santa Cruz，CA)特異性標記。然後將水解物在Synergi^TM 4μm Hydro-RP 80Å，LC Column 150 x 3mm柱(Phenomenex，Torrance，CA，cat.# 00F-4375-Y0)上使用HPLC(Shimazu Corp.，Kyoto，Japan)在乙腈梯度下分離。使用已知濃度的羥脯胺酸的標準曲線作為參照對峰進行定量。定量資料的代表示於圖31。

通過羥脯胺酸含量檢測的肺膠原蛋白累積在博來黴素攻擊的動物中增加。肺膠原蛋白累積的該增加通過在10mg/kg重複的A44V11抗體給藥顯著減少(p<0.08)(參見圖31)。使用IgG1陰性對照抗體的重複給藥並未抑制由於博來黴素攻擊造成的肺膠原蛋白累積。當與用IgG1陰性對照抗體處理的類似的博來黴素誘導的小鼠相比時，在A44V11處理的小鼠中博來黴素誘導的膠原蛋白累積的減少是顯著的(p<0.05)。A44V11處理的小鼠與IgG1對照處理的小鼠相比顯示膠原蛋白累積增加方面大約44%的減少。

實施例20：在猴中在LPS攻擊模型中A44V11活性的評估

應用猴中的急性脂多糖(LPS)攻擊模型在體內確定PAI-1中和效力。LPS攻擊模型描述於Hattori，等J Clin Invest.106(11)：1341-1350(2000)。評估了A44V11 mAb對在小鼠血漿和肝樣品中的PAI-1的活性。具體而言，設計實驗評估高劑量的LPS(100μg/kg-IV)對用A44V11(5mg/kg，IP)或IgG1(陰性對照，5mg/kg，腹膜內給藥)預處理(24小時之前)的麻醉的猴中PAI-1的血漿和組織濃度的作用。實驗依照歐洲倫理法進行，並通過內部倫理委員會批准(CEPAL，sanofi)。

將重量為4至9kg的食蟹獼猴(雄性和雌性)在長期麻醉(至少8小時)之前禁食過夜，所述麻醉包括用Zoletil 50(Virbac，Taguig City，Philippines)以0.12至0.16mL/kg進行IM誘導，繼以吸入空氣/氧和異氟烷(1至3%)的氣體混合物。猴體溫使用加熱墊維持在生理範圍內。在導管***之後，將 LPS(Serotype 0127-B8)以1分鐘單次大量給藥以100μg/kg(0.4mL/kg)的劑量施用於副頭靜脈。在多個時間點，取血液樣品和肝樣品。收穫血液樣品(在檸檬酸/EDTA中)並離心分離缺乏血小板的血漿。肝生檢和終末屍檢儲藏於-80℃。

活性PAI-1，D-二聚體和胞漿素α2抗胞漿素濃度使用商業上可獲得的ELISA測定(Mol.Innovation，cat.# HPAIKT；Asserachrom D-Dimer；Plasmin-A2 antiplasmin，Diagnostica Stago)根據生產商的指示來確定。

在血漿中，活性PAI-1濃度在所有施用A44v11的猴中從約30ng/ml減少至低於10ng/ml(參見圖32(A))。在LPS施用(100ug/kg)之後不存在活性PAI-1濃度的增加(參見圖32(A))。與之相對，用陰性IgG1對照處理的猴在LPS施用之後顯示活性PAI-1的強烈增加，其最大值發生於約4小時(大約50至約250ng/ml)(參見圖32(B))。因此，用陰性IgG1對照的處理並未減少血漿中的在LPS施用之後強烈增加的活性PAI-1濃度(參見圖32(B))。

在肝生檢裂解液中，觀察到類似的現象。用A44V11處理的猴並未在LPS處理之後顯示活性PAI-1濃度的增加(參見圖33(A))。與之相對，LPS施用在來自陰性IgG1對照處理的猴的肝生檢裂解液中誘導了活性PAI-1的強烈增加(高至3ng/mg)(參見圖33(B))。

與PAI-1中和同時，發現A44V11處理的猴中D二聚體濃度(參見圖34(A))通常高於在陰性IgG對照處理的猴中(參見圖34(B))，因此表明猴中的A44V11亦增加了血漿中的纖維蛋白降解。

最終，當與陰性IgG對照處理的猴中的胞漿素-α2抗胞漿素(PAP)複合物濃度相比時，A44V11處理的猴的血漿樣品顯示PAP複合物濃度的增加(參見圖35(A)和(B))。在A44V11存在下PAP複合物和D二聚體的增加表明胞漿素生成的增加。

實施例21：在腹腔粘連小鼠模型中A44V11活性的評估

用抗PAI-1抗體A44V11處理對粘連形成的效果在小鼠子宮角的手術損傷模型中評估。所述小鼠子宮角接近和電烙步驟破壞了絨毛膜表面，導致子宮組織的熱損傷，並在愈傷過程中使得損傷組織表面接近，這最終導致未處理的動物中100%的手術後粘連。該模型和手術步驟之前已描述於Haney A.F.等，(1993).Fertility和Sterility，60(3)：550-558。

對於這些粘連研究，使用了上述生成的、表現人源化PAI-1轉基因、大約9周齡、重量約20g的轉基因雌性小鼠。將四十二隻成熟的轉基因雌性小鼠分為兩組，並對其進行設計用於在子宮角(UH)之間產生粘連的手術步驟，如詳細描述於Haney A.F.等，(1993)。簡言之，將每只動物根據IACUC指南用異氟烷麻醉以供手術，並在劍突尾側大約1.0cm進行了常規的中線剖腹術。鑒定了UH，用單個7-0 Prolene縫線(Ethicon Inc.，Somerville，N.J)小心地穿過每個角的肌肉壁在中部接近，在輸卵管和子宮輸卵管接合處緊接下側系住。小心不損傷卵巢的血液供應。為了誘導電烙損傷，對每個子宮角的中側表面使用了雙極的電烙單元(Valley Lab Surgistat，Solid state Electrosurgery Unit，Model no.B-20)，覆蓋大約2x6mm的區域。電烙單元設定如下：Volts 100，130Hz，50-60 Amps。使用3mm寬的燒烙尖，其設定為3的純凝結電流，通電，並在每個角的兩處燒灼點接觸組織1秒。肌肉切開用5-0 Vicryl，BV-1錐形針(Ethicon Inc.)以連續縫線樣式閉合。皮膚用-0 Prolene，BV-1錐形針(Ethicon Inc.)以橫褥式縫合樣式閉合。

在產生UH損傷之後，將第1組動物用0.16mL體積的同種型對照抗體(30mg/kg)處理，將其施於燒烙傷口。將第2組動物用0.16mL體積的A44V11抗體(30mg/kg)以類似方式處理。對於每組，將動物在6小時(n=5)，72小時(n=4)，或在第7日(n=12)犧牲(參見下表34)。預訂在72小時和在第7日犧牲的動物在手術80小時之後腹腔內(IP)注射第二劑抗體(30mg/kg)。

效力評估和分析

在標記的時點將動物犧牲，並評估粘連的形成。簡言之，從子宮分叉到輸卵管正下方接近的縫合處測量角的長度。將圍繞子宮角的兩個外側縫線去除，並在顯微鏡的說明下測量並記錄子宮角之間粘連的長度，並注以存在或不存在(是/否)。同樣，記錄任何涉及粘連形成的組織，但不包括在粘連區的長度中。使用Shapiro-Wilk校驗檢查子宮角之間粘連的長度的平均百分比的分佈的正態性。如果正態分佈，將各組使用Tukey Kramer分析彼此比較，如果不正態分佈，則用Wilcoxon Rank-Sum分析。在所有情況下，p-值0.05視為統計學顯著。用A44V11處理的動物在接近的子宮角之間顯示顯著較低的粘連形成長度的百分比(參見表35)。

活性PAI-1和tPA濃度的檢測

在犧牲之後，收集動物的血液(血漿)、腹膜內液(IPF)和子宮角樣品供評估。樣品的收集使用常規技術進行。對血漿、IPF和子宮角樣品評估使用ELISA的活性PAI-1和tPA濃度(Human PAI-1 Activity ELISA kits,Cat.# HPAIKT,Molecular Innovations,Novi,MI)。資料使用Excel、JMP和Prism Graph pad軟體處理。在所有情況下，p-值0.05視為統計學顯著。在第6小時和第7日時間點，在用A44V11處理的動物相對於同種型對照在IP液和子宮角裂解物中發現了活性PAI-1濃度的減少(參見圖36)。在6小時處IPF中活性PAI-1的濃度的減少是在用A44處理的動物中與同種型對照相比在6小時時間點在IP液中顯示的統計學顯著結果(根據Student T檢驗p<0.001)。

實施例22：人源化抗體A44V11的晶體結構

Fab A44V11的表現和純化

重組Fab(rFab)從暫態轉染的HEK293細胞使用編碼輕鏈或C末端His標記的重鏈的質體來獲得。在離心和過濾之後將來自細胞上清的rFab施於固定化金屬親和樹脂。在從樹脂洗脫之後，將rFab針對PBS徹底透析並儲藏於4℃。

食蟹猴PAI-1的來源，稱作獼猴PAI-1

重組成熟獼猴PAI-1(24-402)作為包涵體在大腸桿菌中表現，且重組蛋白使用常規方法純化。

人PAI-1的來源：

重組成熟人PAI-1(24-402)購自Molecular Innovations Inc.(catalogue number CPAI)。其通過引入突變(N150H，K154T，Q319L，M354I)穩定化於活性構象，如Berkenpas等(1995，EMBO J.，14，2969-2977)所述。

複合物的製備和純化

將重組Fab和抗原以1.5：1摩爾比混合，在室溫培養30分鐘，並將所述複合物進一步通過用25mM MES pH 6.5，150mM NaCl平衡的Superdex 200 PG柱(GE Healthcare)上的製備性大小排阻進一步純化。

Fab A44V11+獼猴PAI-1複合物的結晶

將複合物在25mM MES pH 6.5，150mM NaCl中濃縮至10mg/ml。其在16-24%乙醇，100mM Tris pH 8.5中結晶。使用乙二醇(30%)作為冷凍保護劑。將晶體在空間組P321(a=b=193Å，c=144Å)中在ESRF的ID29束線中衍射至約3.3Å。資料用XDS和Scala的組合處理(GlobalPhasing Ltd.，Cambridge，UK)。

複合物Fab A44V11/Cyno-PAI-1的結構確定

使用Prime in Maestro(Schrodinger，New York，NY)構建了Fab可變域的模型。恒定域從揭示的結構3FO2獲得。使用了兩個人PAI-1的不同模型。潛伏構象獲得自1LJ5，活性構象獲得自1OC0。Matthews Coefficient(V_M，每單位蛋白分子量的晶體體積)的計算表面在每個不對稱單元中存在多至四個複合物(V_M 2.2，假定複合物大小為90千道爾頓(KD)。Molecular Replacement使用Phaser(CCP4套件)(McCoy，等J.Appl.Cryst.40：658-674 (2007)進行，其鑒定出潛伏PAI-1的兩個單體和Fab的兩個可變域。對於恒定域清晰可見額外的密度，其必須手動配置。對於該對應於V_M為4.3(71%溶劑)的溶液亦仔細檢查了堆積一致性。該結構用Buster(GlobalPhasing)使用非晶體學對稱優化至29.2%的Rfree(R因子25.8%)。恒定域不受晶體堆積穩定化，並在電子密度圖中解析不良。

Fab A44V11+人PAI-1複合物的結晶

蛋白結晶是通過x射線晶體學方法進行生物分子結構確定的瓶頸。蛋白結晶方面的成功直接與用於結晶實驗的蛋白分子的品質成比例，而最重要的品質標準是溶液中蛋白的純度和同質性(分子和構象二者)。

起初，為了確定PAI-1/Fab mAb複合物結構，使用天然mAb A44通過木瓜蛋白酶消化製備其Fab片段。該Fab放大製備導致異質的Fab片段，其與人野生型(wt)PAI-1蛋白複合和以該複合物純化。將獲得的蛋白複合物濃縮至7mg/ml濃度並在800種單獨的結晶條件下在兩種不同溫度，4℃和19℃篩選結晶化。未檢測到結晶化命中。為了改善蛋白複合物的同質性，產生了重組6-His標記的Fab A44，將其純化並與人野生型PAI-1蛋白複合(參見圖36)。

該複合物結晶化篩選導致在20%PEG10K+0.1M乙酸鈉pH 4.6條件下的第一次結晶化命中。通過常規結晶方法Microseed Matrix Seeding和原位Trypsinolysis結晶化來優化結晶並未顯著改善晶體的品質。獲得的最佳晶體為針狀的，且在x射線衍射中無法充分解析以供結構確定(10Å)。

複合物晶體結晶化的失敗可潛在地由複合物構象異質性解釋。已知野生型PAI-1分子採納三種不同的構象(活性、潛伏和基質)，其可干擾結晶。為了改善晶體的品質，產生了與潛伏PAI-1複合的6-His標記的A44 Fab(參見圖37)。

產生了對應的複合物，並從頭開始結晶和在之前用於6-His標記的Fab A44/wt PAI-1蛋白複合物的條件下進行篩選。在測試的超過1000種條件下唯一的結晶化命中鑒定為在20% PEG3350+0.2M乙酸銨+4% MPD+50mM Mes pH6條件下的複合物(參見圖39(a))。在充分優化之後獲得了3D結晶。使用同步加速器高強度X射線束的X射線衍射測試未顯示衍射跡象(參見圖39(b)，描述代表性優化的結晶)。

為了減少蛋白各部分的塑性，決定重組產生A44 fab片段，但不含人工標記如之前使用的6-His標記。為了進一步增加成功結晶化的機會，PAI-1的活性形式突變體(N150H，K154T，Q319L，M354I)購自Molecular Innovations(Cat.#CPAI，novi，MI)並用於與缺乏人工標記的Fab A44蛋白進行複合物製備。將該複合物在25mM MES pH 6.5，150mM NaCl中濃縮至12mg/ml。可接受的杆狀單晶在10% PEG3350，100mM硫酸銨中獲得，並通過添加30%乙二醇冷凍保護(參見圖40)。將這些晶體衍射至3.7Å解析度，且在充分的冷凍保護優化之後，得到適於結構確定的X射線衍射資料組(3.3Å)。在同步加速器SOLEIL(Saint-Aubin，France)的束線Proxima 1在3.3Å收集了資料組。空間群為P212121(a=105，b=152c=298)。資料使用XDSme scripts(XDS ref，Xdsme ref)處理。

複合物Fab A44V11/人PAI-1的結構確定

Pointless(CCP4)在空間群鑒定中僅指示40%置信度。因此，以Amore(CCP4)進行了初始Molecular Replacement以測試P222點群的所有可能的空間群變體。毫無疑義地確認了P212121。用Phaser(Phaser，CCP4)的最終Molecular Replacement鑒定出不對稱單元中Fab的可變域/活性PAI-1的四個二聚體。恒定域在電子密度圖中人工添加。將結構使用肺晶體學對稱用Buster(GlobalPhasing)優化至28%的Rfree(R因子24.1%)。

表位元和互補位元結構分析

在獼猴和人複合物中鑒定出形成表位和互補位，並將複合物相互比較。對於與人和獼猴PAI-1複合的A44V11，將晶體結構確定至3.3Å。兩個結構的層疊(參見圖40)顯示A44V11的互補位對於PAI-1的潛伏和活性形式兩者是類似的。Fab A44識別人PAI-1的活性形式和獼猴PAI-1的潛伏形式。圖42描述了由Fab A44在活性人PAI-1(圖42(A))和潛伏的獼猴PAI-1(圖42(B))二者中識別的PAI-1表位。識別潛伏構象的互補位是識別活性構象的互補位的一部分。

PAI-1多數情況下與A44V11的重鏈相互作用，如可通過對相互作用的表面面積的分析所見。活性人PAI-1和重鏈之間的相互作用的表面面積(4個複合物的平均值)為674Å²。人PAI-1和輕鏈之間的相互作用的表面面積(4個複合物的平均值)為372Å²。潛伏的獼猴PAI-1和重鏈之間的相互作用的表面面積(2個複合物的平均值)為703Å²。潛伏的獼猴PAI-1和輕鏈之間的相互作用的表面面積(2個複合物的平均值)為360Å²。關於重鏈和輕鏈的互補位的描述，分別參見圖43和44。A44V11互補位元部分的殘基示於下表36。斜體的殘基涉及與活性PAI-1但非潛伏形式的相互作用，而底線的殘基僅與潛伏形式相互作用。所有其它殘基均涉及兩種介面。

儘管人和獼猴PAI-1分子的不同構象，相同的殘基涉及與Fab A44的相互作用(顯示於下面人PAI-1序列中的粗體殘基)(SEQ ID NO：1)：

對於人PAI-1的A44V11結合表位的縮寫如下所述：E-X-X-Q(SEQ ID NO：156)；L-X-R(SEQ ID NO：157)；T-D-X-X-R-Q-F-Q-A-D-F-T-X-X-S-D-Q-E-P-L(SEQ ID NO：158)。

總之，識別Fab A44的PAI-1獼猴和人表位在兩種構象中是形同的。Fab A44識別人和獼猴PAI-1兩者，但可能不識別小鼠或大鼠PAI-1。

實施例23：A44V11特異性和交叉反應性的確定

為了確定A44V11的特異性和反應性，使用A44V11表位的序列(見上)在其它蛋白中使用用ScanProsite(SIB Swiss Institute of Bioinformatics)資料庫的基序檢索來檢索類似的表位。對於更多細節，參見Artimo，P.等Nucleic Acids Res.40(W1)：W597-603(2012)。所有在檢索中發現的表位序列匹配涉及PAI-1，表明A44V11對PAI-1具特異性。

亦將A44V11表位與其它已知的X射線結構(3D檢索)使用電腦概貌分析和根據Med-SuMo的分子建模相比較，所述分子建模檢測和比較蛋白表面的生化功能，包括例如氫鍵、電荷、疏水和芳香組。Med-SuMo在Jambon，等Bioinformatics 21(20)：3929-30(2005)中進一步描述。A44V11表位的3D檢索在人α-1-抗胰蛋白酶(AAT1)中定位出類似的基序。然而，在進一步調查後，發現AAT1基序與A44V11表位具有顯著差異，使得A44V11不太可能結合。因此，A44V11表位元的序列樣式和3D樣式分析表明與其它人蛋白應會有最小限的交叉反應性。將針對A44V11的人和獼猴PAI-1表位與來自小鼠和大鼠PAI-1的提出的表位相比較。序列摘自SEQ ID NO：1(PAI-1人)，SEQ ID NO：162(PAI-1獼猴)，SEQ ID NO：163(PAI-1小鼠)，和SEQ ID NO：164(PAI-1大鼠)。大鼠和小鼠PAI-1分別與人PAI-1具有75%和79%序列同一性。不同PAI-1序列的比對顯示大鼠/小鼠和人/獼猴序列在其相應的表位之間存在顯著差異，表明A44V11不太可能識別大鼠或小鼠PAI-1(參見圖45)。例如，小鼠PAI-1胺基酸Ser300，Thr302，Gln314不同於人/獼猴PAI-1相應胺基酸。這些殘基中的不同代表了提出的表位中的變化，使得小鼠PAI-1無法由A44V11識別。小鼠PAI-1與複合物人PAI-1/A44V11的結構的結構比較(圖46)進一步表明不應能從A44V11抗體獲得人和小鼠活性兩者。

為了進一步驗證A44V11鑒定出的表位，將人和獼猴A44V11表位與玻連蛋白的結合區相比較。與玻連蛋白的體介素B域複合的人PAI1的結構已揭示(1OC0)。比較了這兩種複合物的結構(參見圖47)。結構比較表明A44V11的結合不會影響PAI-1與玻連蛋白的相互作用。

將A44V11表位與其它揭示的抗PAI1抗體的表位相比較。未發現A44V11表位與其它揭示的抗PAI-1抗體MA-55F4C2和MA-33H1存在重疊，後者結合128-156區的殘基(參見Debrock等Thromb Haemost，79：597-601(1998))。

最終，A44V11抗體的特異性和缺乏交叉反應性通過Biacore確認。基於A44V11表位預測的獨特序列和3D結構，分子建模研究強烈地表明A44V11對人和獼猴PAI-1具特異性。

實施例24：通過氫/氘交換質譜(HDX MS)進行的表位映射

將通過質譜法(MS)監視的氫/氘交換(HDX)應用於本文中揭示的PAI-1結合抗體以進一步表徵每種抗體的表位。HDX MS對於比較相同蛋白的多種狀態是特別游泳的技術。詳細的方法學和將HDX MS應用於蛋白療法揭示於Wei等，Drug Discovery Today，19(1)：95-102(2014)。簡言之，如果將水性的全H₂O溶劑用具有不同光譜性質的氫同位素替代，則可追蹤該交換過程。對於大多數現代HDX實驗，使用氘化的水即「重水」(D₂O)。特別地，結合於骨架氮的氫(亦稱作骨架醯胺氫)可用於探查蛋白構象。參見，例如Marcsisin等Anal Bioanal Chem.397(3)：967-972(2010)。蛋白的暴露的和動態區會迅速交換，而蛋白的保護的和剛性區會較慢交換。所有相關條件(pH，溫度，離子強度等)維持恒定，因此僅結構(溶劑可接近性，氫鍵)影響該交換。抗體與PAI-1的相互作用會阻斷抗原某些部分的標記，因此基於結合位元點(表位)產生不同的讀出。

實驗方法：

獼猴PAI-1(10uM)，結合於A44v11的獼猴PAI-1(各10μm)和結合於APGv2的獼猴PAI-1(各10μm)在PBS，pH 7.2中製備。通過在室溫培養1小時允許蛋白溶液達到結合平衡。基於<50pM的K_d值，在下述的標記條件下，每種抗體：抗原複合物為>99%結合。

氘交換、淬滅和樣品注入由自動機器人系統(LEAP Tech.，Carrboro，NC)處理。將蛋白溶液的等分試樣用標記緩衝液(99.9% D₂O中的PBS，pD 7.2)稀釋10倍，並允許在20℃培養10秒、1分鐘、5分鐘或4小時。在氘交換結束時的時間點，標記反應通過將50μL標記溶液添加至相同體積的預冷卻(0℃)100mM磷酸鈉，4M胍鹽酸鹽，0.5M TCEP，pH 2.5來淬滅。未氘化的對照以相同購房時以H₂O中的PBS稀釋10倍來製備。

將每個淬滅的樣品(50μL，每種蛋白50pmol)立即注射入具有HDX Technology的Waters nanoAcquity(Waters Corp.，Milford，MA)。將蛋白用維持在20℃的2.1mm x 30mm Enzymate BEH胃蛋白酶柱(Waters Corp.)連線消化。所有層析原件在超高效液相色譜(UPLC)的冷卻室內維持在0.0±0.1℃。將所得的肽捕獲並在100μL/分鐘脫鹽3分鐘，然後在1.0 x 100.0mmACQUITY UPLC HSS T3柱(Waters Corp.)上以12分鐘的2-40%乙腈/水梯度以40μL/分鐘進行分離。所有對比實驗在相同條件下進行，消除了對反向交換校正的需要。所有反應進行一式三次。注射間的肽遺留通過在每次運行後對所有柱注射50μL的1.5M胍鹽酸鹽，0.8%甲酸，和4%乙腈來消除。

在以HDMSe模式運行的、配置有標準電噴霧源的Waters Synapt G2-Si裝置獲得了質譜。裝置設定如下：毛細管為3.5kV，取樣錐為30V，源補償為30V，源溫度為80℃，解析溫度為175℃，錐氣體為50L/小時，解析氣體為600L/小時，而霧化器氣體為6.5巴。質譜在50-1700的m/z範圍獲得。品質準確性在每次運行通過經由lockmass探針輸注100fmol/uL人Glu1]-Fibrinopeptide B來維持。

未氘化胃蛋白酶肽的MSE鑒定使用ProteinLynx Global Server軟體(Waters Corp.)進行。對於每種肽的氘攝入使用DynamX 2.0軟體(Waters Corp.)確定。相對氘濃度通過將對於未氘化的肽同位素分佈的形心從來自氘標記肽相應的形心減去來計算。氘攝入圖通過軟體自動生成。

對於PAI-1狀態監視氘攝入

在連線胃蛋白酶消化之後，鑒定出了150個相互重疊的獼猴PAI-1胃蛋白酶肽，導致95.3%的序列覆蓋(參見圖48)。在所有150個肽中對於三種蛋白狀態監視氘攝入(從10秒至4小時)：(1)僅獼猴PAI-1；(2)結合於獼猴PAI-1的A44v11；和(3)結合於獼猴PAI-1的APGv2。

大多數獼猴PAI-1肽在三種狀態之間顯示幾乎相同的氘攝入，這表明在獼猴PAI-1和這些區中的任一mAb之間不存在相互作用。參見圖49(A)，其描述了該結果的一個代表性肽區(殘基139-152)。與之相對，組入殘基 44-64的肽當結合於A44v11或APGv2時(圖49(B))顯示顯著的免受交換的保護(減少的氘攝入)。此外，組入參加295-322的肽當結合於A44v11或APGv2時(圖49(C))亦顯示顯著的免受交換的保護。就此原因，當獼猴PAI-1結合於A44v11而非APGv2時保護的程度更大(參見圖49(C))。這表明A44v11與APGv2相比，當結合於獼猴PAI-1時，可提供更大的免受交換的總體保護。

比較研究：

對於比較研究，對於所有150個從三種獼猴PAI-1狀態生成的肽監視氘攝入(一般地，參見Wei，等，Drug Discovery Today，19(1)：95-102(2014))。將來自三種狀態每一個的資料圖彼此比較，並生成蝶形圖以便於資料詮釋(參見，例如圖50(A)，51(A)，和52(A))。對於每個蝶形圖，x軸是對於比較的150個肽的每一個計算的肽中點位置，i；y軸為平均相對級分交換(比例)。

亦對獼猴PAI-1狀態之間的每次比較生成了不同的圖(參見，例如圖圖50(B)，51(B)，和52(B))。在這些圖中，將來自一個狀態的氘攝入從另一個減去，並類似地作圖為蝶形圖。對於每種肽差異的總和由垂直棒代表。濃度虛線代表單次測量(±0.5Da)或差異之和(±1.1Da)超出了測量的誤差，並可視為兩種狀態之間的真實差異的值。其它關於該技術的細節揭示於Houde D.等，J.Pharm.Sci.100(6)：2071-86(2011)。

首先，將獼猴PAI-1本身與A44v11：獼猴PAI-1結合狀態相比較(圖50)。對於該比較的蝶形圖示於圖50(A)。該比較的差異圖示於圖50(B)。在結合於A44v11的獼猴PAI-1與游離形式的獼猴PAI-1之間觀察到的差異主要位於獼猴PAI-1的兩個區中。一個區接近N段(殘基44-64)，而另一個區接近C末端(殘基307-321)(參見圖50(B))。

其次，將獼猴PAI-1本身與APGv2：獼猴PAI-1結合狀態相比較(圖51)。對於該比較的蝶形圖示於圖51(A)。該比較的差異圖示於圖51(B)。在結合於A44v11的獼猴PAI-1與游離形式的獼猴PAI-1之間觀察到的差異主要位於獼猴PAI-1的兩個區中。一個區接近N段，而另一個區接近C末端，其類似於A44v11：獼猴PAI-1結果。與獼猴PAI-1複合的APGv2和A44v11均具有當在結合狀態顯示減少的氘攝入的肽，這可表明兩種抗體的表位是類似的。

最終，將兩種抗體結合的獼猴PAI-1狀態相互比較(圖52)。該比較的蝶形圖示於圖52(A)。該比較的差異圖示於圖52(B)。A44v11：獼猴-PAI-1和APGv2：獼猴-PAI-1之間觀察到的差異位於獼猴PAI-1的C段區(參見圖52(B))。

實施例25：抗體A44v11和APGv2的表位比較

使用HDX MS進一步限定A44v11和APGv2抗體的表位。通過使用在HDX MS中生成的重疊肽，可將抗體表位限定至略好於肽濃度解析度(例如，參見圖48)。將顯示顯著的免於與A44V11結合交換的保護的肽的HDX MS資料進行進一步分析以確定獼猴-PAI-1：A44v11相互作用的表位。發現對於獼猴PAI-1的A44V11表位元的HDX資料與使用晶體學方法確定的表位一致。使用HDX MS鑒定的獼猴PAI-1的A44V11表位元顯示於圖53(粗體)，和下述縮寫形式：T-T-G-G-E-T-R-Q-Q-I-Q(SEQ ID NO：159)；R-H-L(SEQ ID NO：160)；T-D-M-X-X-X-F-Q-A-D-F-T-S-L-S-N-Q-E-P-L-H-V(SEQ ID NO：161)。

將顯示顯著的免於與APGv2結合交換的保護的肽的HDX MS資料進行進一步分析以確定獼猴-PAI-1：APGv2相互作用的表位。對於A44v11和APGv2的HDX MS表位映射資料顯示表位位於相同區，如圖52中一般性所見。在殘基307-321的區中，相同肽對於A44v11和APGv2的抗體結合狀態顯示保護。然而，當獼猴PAI-1結合於A44v11而非APGv2時保護的程度更大(參見圖49(C))。該發現在圖52(B)中更加明顯，其描述了獼猴PAI-1的殘基307-321區中不同的峰。這表明在獼猴PAI-1與A44V11和APGv2抗體任一產生的特異性接觸中存在差異。因此，看來儘管A44V11和APGv2的表位位於PAI-1的類似區，各抗體的表位並不相同。

<110> 賽諾菲公司SANOFI

<120> 胞漿素原活化素抑制劑-1(PAI-1)之抗體及其用途

<130> 13-596-PRO

<160> 169

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 379

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA105 VH

<400> 2

<210> 3

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA105 VL

<400> 3

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA39 VH

<400> 4

<210> 5

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA39 VL

<400> 5

<210> 6

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 VH

<400> 6

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 VL

<400> 7

<210> 8

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA71 VH

<400> 8

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA71 VL

<400> 9

<210> 10

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB109 VH

<400> 10

<210> 11

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB109 VL

<400> 11

<210> 12

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB28 VH

<400> 12

<210> 13

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB28 VL

<400> 13

<210> 14

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mC45 VH

<400> 14

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mC45 VL

<400> 15

<210> 16

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE16 VH

<400> 16

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE16 VL

<400> 17

<210> 18

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE21 VH

<400> 18

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE21 VL

<400> 19

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA105 HCDR3

<400> 20

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA105 HCDR2

<400> 21

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA105 HCDR1

<400> 22

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA105 LCDR3

<400> 23

<210> 24

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA105 LCDR2

<400> 24

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA105 LCDR1

<400> 25

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA39 HCDR3

<400> 26

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA39 HCDR2

<400> 27

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA39 HCDR1

<400> 28

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA39 LCDR3

<400> 29

<210> 30

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA39 LCDR2

<400> 30

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA38 LCDR1

<400> 31

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 HCDR3

<400> 32

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 HCDR2

<400> 33

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 HCDR1

<400> 34

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 LCDR3

<400> 35

<210> 36

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 LCDR2

<400> 36

<210> 37

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 LCDR1

<400> 37

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA71 HCDR3

<400> 38

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA71 HCDR2

<400> 39

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA71 HCDR1

<400> 40

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA71 LCDR3

<400> 41

<210> 42

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA71 LCDR2

<400> 42

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA71 LCDR1

<400> 43

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA75 HCDR3

<400> 44

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA75 HCDR2

<400> 45

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA75 HCDR1

<400> 46

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA75 LCDR3

<400> 47

<210> 48

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA75 LCDR2

<400> 48

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA75 LCDR1

<400> 49

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB109 HCDR3

<400> 50

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB109 HCDR2

<400> 51

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB109 HCDR1

<400> 52

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB109 LCDR3

<400> 53

<210> 54

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB109 LCDR2

<400> 54

<210> 55

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB109 LCDR1

<400> 55

<210> 56

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB28 HCDR3

<400> 56

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB28 HCDR2

<400> 57

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB28 HCDR1

<400> 58

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB28 LCDR3

<400> 59

<210> 60

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB28 LCDR2

<400> 60

<210> 61

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mB28 LCDR1

<400> 61

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mC45 HCDR3

<400> 62

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mC45 HCDR2

<400> 63

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mC45 HCDR1

<400> 64

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mC45 LCDR3

<400> 65

<210> 66

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mC45 LCDR2

<400> 66

<210> 67

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mC45 LCDR1

<400> 67

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE16 HCDR3

<400> 68

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE16 HCDR2

<400> 69

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE16 HCDR1

<400> 70

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE16 LCDR3

<400> 71

<210> 72

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE16 LCDR2

<400> 72

<210> 73

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE16 LCDR1

<400> 73

<210> 74

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE21 HCDR3

<400> 74

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE21 HCDR2

<400> 75

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE21 HCDR1

<400> 76

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE21 LCDR3

<400> 77

<210> 78

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE21 LCDR2

<400> 78

<210> 79

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mE21 LCDR1

<400> 79

<210> 80

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA75 VH

<400> 80

<210> 81

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA75 VL

<400> 81

<210> 82

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC1a

<400> 82

<210> 83

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC1b

<400> 83

<210> 84

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC2a

<400> 84

<210> 85

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC2b

<400> 85

<210> 86

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC3

<400> 86

<210> 87

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC4

<400> 87

<210> 88

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC5a

<400> 88

<210> 89

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC5b

<400> 89

<210> 90

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC5a

<400> 90

<210> 91

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC1a

<400> 91

<210> 92

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC1b

<400> 92

<210> 93

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC2

<400> 93

<210> 94

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC3

<400> 94

<210> 95

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC4

<400> 95

<210> 96

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC5a

<400> 96

<210> 97

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC5b

<400> 97

<210> 98

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC5c

<400> 98

<210> 99

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH

<400> 99

<210> 100

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL

<400> 100

<210> 101

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> vk1

<400> 101

<210> 102

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> vλ3

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (87)..(87)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 102

<210> 103

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> vh2

<400> 103

<210> 104

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> vh4

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 104

<210> 105

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈3’-引子

<400> 105

<210> 106

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈3’-引子

<400> 106

<210> 107

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IGKV1-33-01_IGKJ4-01

<400> 107

<210> 108

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IGHV4-59-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02

<400> 108

<210> 109

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv1LC1a x HC1a

<400> 109

<210> 110

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv2LC1b x HC1b

<400> 110

<210> 111

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv3LC2 x HC2a

<400> 111

<210> 112

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv4LC1a x HC2b

<400> 112

<210> 113

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv5LC2 x HC2b

<400> 113

<210> 114

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv6LC3 x HC3

<400> 114

<210> 115

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv7LC4 x HC4

<400> 115

<210> 116

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv8LC5a x HC5a

<400> 116

<210> 117

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv9LC5b x HC5b

<400> 117

<210> 118

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv10LC5c x HC5c

<400> 118

<210> 119

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv11LC2 x HC3

<400> 119

<210> 120

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv12LC4 X HC3

<400> 120

<210> 121

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv13LC2 x HC5b

<400> 121

<210> 122

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A44-hv14LC4 x HC5b

<400> 122

<210> 123

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC1a

<400> 123

<210> 124

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC1b

<400> 124

<210> 125

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC2a

<400> 125

<210> 126

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC2b

<400> 126

<210> 127

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC3

<400> 127

<210> 128

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC4

<400> 128

<210> 129

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC5a

<400> 129

<210> 130

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC5b

<400> 130

<210> 131

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC5c

<400> 131

<210> 132

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC1a

<400> 132

<210> 133

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC1b

<400> 133

<210> 134

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC2

<400> 134

<210> 135

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC3

<400> 135

<210> 136

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC4

<400> 136

<210> 137

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC5a

<400> 137

<210> 138

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC5b

<400> 138

<210> 139

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC5c

<400> 139

<210> 140

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 VH

<400> 140

<210> 141

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 VL

<400> 141

<210> 142

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mA44 VL

<400> 142

<210> 143

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IGKV3-11-02_IGKJ4-0

<400> 143

<210> 144

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IGHV6-1-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02

<400> 144

<210> 145

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 145

<210> 146

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 146

<210> 147

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 147

<210> 148

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 148

<210> 149

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 149

<210> 150

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 150

<210> 151

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222>(99)..(103)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 151

<210> 152

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (99)..(103)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 152

<210> 153

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 153

<210> 154

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 154

<210> 155

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 155

<210> 156

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 156

<210> 157

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 157

<210> 158

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 158

<210> 159

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 159

<210> 160

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 160

<210> 161

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 161

<210> 162

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 162

<210> 163

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 163

<210> 164

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 164

<210> 165

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 165

<210> 166

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然發生胺基酸

<400> 166

<210> 167

<211> 402

<212> PRT

<213> 獼猴(cynomolgus)

<400> 167

<210> 168

<211> 402

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 168

<210> 169

<211> 402

<212> PRT

<213> 褐家鼠(Mus musculus)

<400> 169

Claims

一種單離單株抗體或其片段，其競爭性抑制抗PAI-1抗體或其抗原結合片段之結合，其中該抗PAI-1抗體或其抗原結合片段包含：(a)重鏈框架區和重鏈可變區，該重鏈可變區包含含SEQ ID NO：34的重鏈CDR1區、含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區和含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和(b)輕鏈框架區和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區、含SEQ ID NO：145的輕鏈CDR2區和含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。
一種單離單株抗體或其片段，其競爭性抑制抗PAI-1抗體或其抗原結合片段之結合，其中該抗PAI-1抗體或其抗原結合片段包含：(a)重鏈框架區和含SEQ ID NO：86的重鏈可變區，和(b)輕鏈框架區和含SEQ ID NO：93的輕鏈可變區。
一種單離單株抗體或其片段，其競爭性抑制抗PAI-1抗體或其抗原結合片段之結合，其中該抗PAI-1抗體或其抗原結合片段包含：(a)與請求項2的抗體重鏈可變區為至少95%相同的重鏈可變區及請求項2的輕鏈可變區；(b)請求項2的抗體重鏈可變區及與請求項2的抗體輕鏈可變區為至少95%相同的輕鏈可變區；或(c)與請求項2的抗體重鏈可變區為至少95%相同的重鏈可變區及與請求項2的抗體輕鏈可變區為至少95%相同的輕鏈可變區。
一種單離單株抗體或其片段，其競爭性抑制抗PAI-1抗體或其抗原結合片段之結合，其中該抗PAI-1抗體或其抗原結合片段包含：(a)重鏈框架區和重鏈可變區，該重鏈可變區包含含SEQ ID NO：34的重鏈CDR1區、含SEQ ID NO：33的重鏈CDR2區和含SEQ ID NO：32的重鏈CDR3區；和 (b)輕鏈框架區和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含SEQ ID NO：37的輕鏈CDR1區、含SEQ ID NO：36的輕鏈CDR2區和含SEQ ID NO：35的輕鏈CDR3區。
如請求項4的單離單株抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：6，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：7。
一種單離單株抗體或其片段，其競爭性抑制抗PAI-1抗體或其抗原結合片段之結合，其中該抗PAI-1抗體或其抗原結合片段包含：(a)具有含SEQ ID NO：82之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(b)具有含SEQ ID NO：83之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：92之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(c)具有含SEQ ID NO：84之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：93之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(d)具有含SEQ ID NO：85之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(e)具有含SEQ ID NO：85之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：93之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(f)具有含SEQ ID NO：86之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：94之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(g)具有含SEQ ID NO：87之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：95之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段； (h)具有含SEQ ID NO：88之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：96之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(i)具有含SEQ ID NO：89之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：97之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(j)具有含SEQ ID NO：90之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：98之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(k)具有含SEQ ID NO：86之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：95之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；(l)具有含SEQ ID NO：89之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：93之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段；或(m)具有含SEQ ID NO：89之重鏈可變區的重鏈或其抗原結合片段，及具有含SEQ ID NO：95之輕鏈可變區的輕鏈或其抗原結合片段。
一種前述請求項中任一項的單離單株抗體或其片段於製備用於在所需受試者中恢復胞漿素生成之藥物的用途，其中該藥物可藉由口服、以溶液之非胃腸道注射、吸入或局部投與。
如請求項7的用途，其中該藥物可治療包含纖維變性組織程度增高的症狀。
如請求項8的用途，其中該症狀為纖維化、皮膚纖維化、系統性硬化、肺纖維化、特發性肺纖維化、間質性肺病、慢性肺病、肝纖維化、腎纖維化、慢性腎病、血栓形成、靜脈和動脈血栓形成、深靜脈血栓形成、四肢(peripheral limb)缺血、散佈性血管內凝固血栓形成 (disseminated intravascular coagulation thrombosis)、有和無溶栓的急性缺血性發作或支架再狹窄。
一種藥學有效量的如請求項1-6中任一項的單離單株抗體或其片段在製備藥物中的用途，該藥物用於治療由PAI-1濃度升高或對PAI-1的敏感性升高所引起的症狀，包含其藉由口服、以溶液之非胃腸道注射、吸入或局部投予患者。