WO2017010796A1 - 정자의 성 감별용 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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김동구
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/02—Breeding vertebrates
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to an antibody for sperm sex discrimination and its use, and more particularly, to a composition for sperm sex discrimination using the antibody, a sex discrimination method, and a method for producing an animal having specificity.
  • Sperm Sexing Biotechnology is a technology that produces only the sex of the desired sex by inducing fertilization and pregnancy by separating only the sperm of the desired sex, which is very important in terms of production efficiency, management, and commercial aspects. The need for more is growing.
  • cows can selectively produce milk calves that produce milk, and beef cows can grow selectively and produce higher quality cows that have higher growth rates and weight gain than females.
  • beef cows can grow selectively and produce higher quality cows that have higher growth rates and weight gain than females.
  • high-yielding cows can be selectively mass-produced, which enables livestock farmers to achieve efficient management and economic benefits.
  • the sex of the mother in pregnancy is determined by the combination of the two chromosomes that make up the sex chromosome pair, and consequently, Determined by the sex of the sperm.
  • sperm present in the semen of livestock are divided into cancer (X chromosome) or male (Y chromosome) sperm, and differentiated from the spermatocytes of diploids present in the testis tissue to mature sperm with haploid chromosomes.
  • X chromosome cancer
  • Y chromosome male sperm
  • sex determination depends on whether sex sperm with either X chromosome or Y chromosome in semen form sex chromosome pair (XX or XY) through fertilization with egg (X chromosome). This is determined. Therefore, in the general natural state, the ratio of females to males is born in the ratio of 50:50 in the ratio of male to female.
  • sperm sex discrimination technology of Sexing Technologies Inc. (transferring rights from XY LLC) using the difference in X and Y chromosome lengths is now commonly used.
  • the scattered light by the laser mounted on the separator is converted into an electrical signal to discriminate or pass the high-pressure separator to separate the target sperm.
  • the present invention has been made to solve the above problems, the present inventors have developed an antibody that specifically binds to Y chromosome sperm, by using it to separate the desired X chromosome sperm or Y chromosome sperm by sex It was confirmed that the differentiation and based on this, the present invention was completed.
  • an object of the present invention is any one selected from the group consisting of HCDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, HCDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and HCDR3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a heavy chain variable region including the above And a light chain variable comprising at least one selected from the group consisting of LCDR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, LCDR2 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and LCDR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 It is to provide an antibody comprising a region.
  • Another object of the present invention is to provide a related product and / or method of application comprising a discriminating composition and / or kit for sperm separation comprising the antibody as an active ingredient.
  • another object of the present invention is an expression vector for the production of the antibody, comprising the isolated nucleic acid encoding the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, through the in vitro transformed host cell And to provide an antibody production method using the same.
  • another object of the present invention is to collect a semen from a male individual; b) treating said semen with said antibody; And c) separating the sperm specifically bound to the antibody in the semen and the unbound sperm.
  • another object of the present invention is to collect a semen from a male individual; b) treating said semen with said antibody to screen sex of sperm; c) fertilization using the selected sperm; And d) to provide a method for producing a mammal having a specific sex, comprising the step of producing a living sex of the desired sex.
  • the present invention is HCDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, HCDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and HCDR3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a heavy chain variable region comprising at least one selected from the group consisting of:
  • a light chain variable comprising at least one selected from the group consisting of LCDR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • LCDR2 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • LCDR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the heavy chain variable region may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • the light chain variable region may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region comprises HCDR1 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, HCDR2 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, and a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • HCDR3 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • HCDR2 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 11 a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • LCDR1 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • LCDR2 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • SEQ ID NO: 14 It may comprise any one or more selected from the group consisting of LCDR3 consisting of a polynucleotide sequence.
  • the heavy chain variable region may be composed of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, and the light chain variable region may be composed of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the present invention also provides an expression vector for producing an antibody, comprising an isolated nucleic acid encoding an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, in vitro transformed host cell and antibody production using the same. Provide a method.
  • the host cell is any one selected from the group consisting of microorganisms such as bacteria (E.Coli) and yeast (Yeast), CHO cells, F2N cells, HEK293 cells and antibody-producing hybridoma cells Can be.
  • microorganisms such as bacteria (E.Coli) and yeast (Yeast)
  • CHO cells F2N cells
  • HEK293 cells antibody-producing hybridoma cells Can be.
  • the present invention provides a related product and / or method of application comprising a discriminating composition and / or kit for sperm separation comprising the antibody as an active ingredient.
  • the antibody may bind to the Y chromosome sperm of a mammal to induce a sperm aggregation reaction
  • the mammal may be any one selected from the group consisting of bovine, mouse, dog and horse. However, it is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of a) collecting semen from the male individual; b) treating said semen with said antibody; And c) separating the sperm that is specifically bound to the antibody in the semen and the unbound sperm, wherein the mammal comprises cows, mice, dogs and horses. It may be any one selected from the group, but is not limited thereto.
  • the sperm specifically bound to the antibody may be Y chromosome sperm, and the unbound sperm may be X chromosome sperm.
  • step c) may use a method selected from the group consisting of flow cytometry, magnetic separation, filter separation, panning separation, separation using nanomaterials and direct administration. .
  • the present invention comprises the steps of a) collecting semen from the male individual; b) treating said semen with said antibody to screen sex of sperm; c) fertilization using the selected sperm; And d) producing a living sex of a desired sex, the method of producing a mammal having a specific sex, wherein the mammal is any one selected from the group consisting of cattle, mice, dogs and horses. It may be, but is not limited thereto.
  • the step (c) may be in vitro fertilization of the selected sperm in vitro (in vitro).
  • the step (c) may be artificial insemination in the body by injecting the selected sperm directly into the uterus of the mammal.
  • the present invention relates to an antibody for sperm discrimination and its use, and more particularly, to a composition for sperm sex discrimination, a sex discrimination method, and a method for producing an animal having specificity.
  • a composition for sperm sex discrimination for sperm discrimination and its use
  • a composition for sperm sex discrimination for sperm discrimination
  • a sex discrimination method for producing an animal having specificity.
  • by treating the antibody it was confirmed that it is possible to easily distinguish the X chromosome sperm and Y chromosome sperm by inducing the aggregation reaction of the Y chromosome sperm, it is possible to produce a large amount of custom animals with specific characteristics,
  • the selective production of livestock with the desired sex is expected to contribute to planned breeding, improved breeding and efficient management.
  • Figure 2 is a result confirming the binding to sperm according to the antibody protein treatment of the present invention using Hanwoo sperm.
  • Figure 3 shows the result of confirming the binding site of the antibody protein and sperm of the present invention by fluorescence microscope.
  • Figure 4 shows the results of electron microscopy whether the sperm aggregation reaction of bovine sperm (4a), mouse sperm (4b), modification (4c) and horse sperm (4d) according to the antibody protein treatment of the present invention.
  • Figure 6 is a result of verifying the sex discrimination efficacy of the antibody protein of the present invention using sex discrimination sperm for cows currently on the market.
  • Figure 7 is a result of verifying the sex discrimination efficacy of the antibody protein of the present invention using the separation method according to the length difference of X chromosome sperm and Y chromosome sperm of Sexing Technologies.
  • the present inventors confirmed that aggregation of the Y chromosome sperm can be induced by using an antibody that specifically binds to the cell membrane protein of the Y chromosome sperm head. In addition, by using these characteristics of the antibody it was confirmed that the X chromosome sperm and Y chromosome sperm can be separated and utilized in artificial insemination, and completed the present invention based on this.
  • the present invention includes any one or more selected from the group consisting of HCDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, HCDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and HCDR3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Heavy chain variable region; And a light chain variable comprising at least one selected from the group consisting of LCDR1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, LCDR2 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and LCDR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 Antibodies or functional variants are provided comprising the region.
  • the heavy chain variable region may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • the light chain variable region may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region comprises HCDR1 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, HCDR2 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, and a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • HCDR3 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • HCDR2 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 11 a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • LCDR1 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • LCDR2 consisting of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • SEQ ID NO: 14 It may comprise any one or more selected from the group consisting of LCDR3 consisting of a polynucleotide sequence.
  • the heavy chain variable region may be composed of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, and the light chain variable region may be composed of a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • antibody includes immunoglobulin molecules immunologically binding to specific antigens and includes both polyclonal and monoclonal antibodies.
  • the term also includes forms produced by genetic engineering such as antibodies, antibody fragments, chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterologous antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • the antibody has a heavy chain and a light chain and each heavy and light chain comprises a constant region and a variable region (the region is also known as the “domain”).
  • the variable regions of the light and heavy chains comprise three multivariable regions and four "framework regions” called “complementarity-determining regions” (hereinafter referred to as "CDRs").
  • the CDRs mainly serve to bind to epitopes of antigens.
  • the CDRs of each chain are typically called CDR1, CDR2, CDR3, starting sequentially from the N-terminus and also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • CDR1 (HCDR1), CDR2 (HCDR2) and CDR3 (HCDR3) of the heavy chain variable region are amino acids represented by SEQ ID NOS: 1 to 3
  • CDR1 (LCDR1), CDR2 (LCDR2), CDR3 ( LCDR3) may be composed of amino acids represented by SEQ ID NO: 4 to 6, respectively, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 6, respectively, Most preferably, the base sequence may include 95% or more sequence homology.
  • CDR1 (HCDR1), CDR2 (HCDR2) and CDR3 (HCDR3) of the heavy chain variable region are the polynucleotides represented by SEQ ID NOS: 9 to 11, CDR1 (LCDR1), CDR2 (LCDR2), CDR3 (LCDR3)
  • the base sequence may include 95% or more sequence homology.
  • the heavy chain variable region may be composed of an amino acid represented by SEQ ID NO: 7
  • the light chain variable region may be composed of an amino acid represented by SEQ ID NO: 8
  • the heavy chain variable region may be composed of a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 15, and the light chain variable region may be composed of a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 16, and the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and 16 and 70% or more, respectively, preferably May comprise a base sequence having at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% sequence homology.
  • functional variants of such antibodies include biological equivalents of the antibody sequences described herein.
  • further changes can be made to the amino acid or polynucleotide sequence of the antibody to further improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • Such modifications result in deletion of amino acid sequence residues of the antibody.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have a similar shape.
  • arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically equivalent functions.
  • the antibody of the present invention can specifically bind to the cell membrane protein of mammalian Y chromosome sperm, thereby inducing aggregation reaction of Y chromosome sperm. Unlike the Y chromosome sperm, the antibody does not bind specifically to the X chromosome sperm, and thus no sperm aggregation reaction is induced. Thus, by using this property, it is possible to easily discriminate or separate Y chromosome sperm and X chromosome sperm.
  • the present invention also provides an expression vector for producing an antibody, comprising an isolated nucleic acid encoding an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, a transformed host cell and an in vitro antibody production using the same. Provide a method.
  • transformation refers to a DNA chain fragment or plasmid with a foreign gene of a different kind from that of the original cell, infiltrating between the cells and binding to the DNA present in the original cell.
  • transformation for the purposes of the present invention means that the isolated nucleic acid encoding the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 is inserted into a host cell to produce the antibody of the present invention.
  • the host cell is preferably any one selected from the group consisting of microorganisms such as bacteria (E.Coli) or yeast (Yeast), CHO cells, F2N cells, HEK293 cells and antibody-producing hybridoma cells, but is not limited thereto. It doesn't happen.
  • microorganisms such as bacteria (E.Coli) or yeast (Yeast), CHO cells, F2N cells, HEK293 cells and antibody-producing hybridoma cells, but is not limited thereto. It doesn't happen.
  • the protein preparation containing the antibody of the present invention and Y chromosome sperm can bind the antibody protein was confirmed to bind to the cell membrane protein of sperm head (Examples 1 and 2). Reference).
  • the sperm binding to the antibody protein confirmed that the Y chromosome sperm, and the results were verified by the separation method of sex discrimination sperm for cows and sexing technologies currently available, the actual artificial insemination The effect of the frozen sperm used in the test was again verified, and it was confirmed that the present invention can discriminate the sex of sperm with simple and high efficiency (see Examples 3 to 5).
  • the present invention is to provide a related product and / or method of application comprising a discriminating composition and / or kit for sperm separation comprising the antibody or fragment comprising the antigen-binding region thereof as an active ingredient.
  • the sperm may further comprise a diluent prepared according to the characteristics of the animal species to be separated and discriminated.
  • the purpose of dilution is to increase the effective semen amount by inhibiting metabolism to some extent, preventing cold shock, preventing overdensity, and increasing the viability of sperm, and may include exercise promoters, exercise inhibitors, bacterial inhibitors, etc., as necessary.
  • any agent that can enhance the survival of sperm in the external environment can be included without limitation.
  • the present invention comprises the steps of a) collecting semen from the male individual; b) treating the semen with an antibody; And c) separating the sperm specifically bound to the antibody in the semen and the unbound sperm.
  • the term “individual” means an object to be collected from sperm, and more specifically, a mammal such as a primate, a cow, a mouse, a dog, and a horse, which is human or non-human, is not limited thereto. .
  • "cow” is preferably selected based on the purpose of the calf to be produced, preferably beef cattle or cows, including Hanwoo, if the cow has a reproductive ability, can be used without limitation to the breeder.
  • “mouse, dogs and horses” can be selected according to the purpose of the living ( ⁇ ⁇ ) to produce, if it has a reproductive ability, can be used without limitation to the breeder.
  • the term "sex discrimination of sperm” means to separate or discriminate X chromosome sperm and Y chromosome sperm, the sperm is difficult to distinguish only by activity or morphological differences, according to the present invention
  • the sperm separation method through binding and the sperm aggregation reaction through the antibody and antibody fragments were used to separate or discriminate the two.
  • the present invention may be aimed at obtaining X chromosome sperm for efficient production of cows, but may be used to produce male cows by separating Y chromosomes as necessary.
  • beef cattle including Hanwoo can be used to obtain X chromosome sperm as a method for producing only cows and can be used for the production of male cattle according to the purpose.
  • mammalian eggs have only X chromosomes as sex chromosomes, whereas sperm in semen contain sperm with X or Y chromosome at a ratio of about 50:50. It plays a role in determining righteousness. Therefore, by discriminating or separating sex of a sperm, it is possible to produce a litter having a specific sex.
  • the chromosome fluorescent substance dye (Hoechst33342), which is used as a chromosome differentiating agent, cannot be removed by binding to a chromosome. Therefore, there is a possibility of causing genetic abnormalities in the litter.
  • the present invention is to solve the problems of the prior art by using an antibody that is a protein preparation. Since the antibody of the present invention specifically binds to the cell membrane protein of Y chromosome sperm, it is possible to discriminate or isolate X or Y chromosome sperm simply and effectively.
  • the present invention can solve the safety problem that can be generated by the separation method through the chromosome binding by the existing fluorescent material, and can safely separate the target sperm without affecting the chromosome.
  • the X chromosome sperm unbound with the antibody has a normal fertility by sperm free movement, thereby further improving the production yield of female (XX).
  • XX X chromosome sperm unbound with the antibody
  • XY production yield of male
  • a magnetic nanoparticle is attached to the antibody protein.
  • Magnetic separation method to separate by the principle of the magnet after the magnet, filter separation method for separating sediment by sperm agglomeration reaction with a filter, or direct administration method for injecting the sperm by injecting directly into the crystallite, etc.
  • any method that can separate non-aggregated sperm can be used. While the sex discrimination technology of the sperm of Sexing Technologies in the prior art was separated using only a flow cytometer, the present invention has the advantage that various separation methods can be selectively used according to conditions and environments.
  • compositions and / or kits of the present invention may be prepared in the form of vials (vials) comprising fragments comprising said antibody or antigen binding region thereof.
  • vials vials
  • semen may be added to and mixed with a vial containing the fragment containing the antibody or antigen-binding region thereof, followed by mixing to induce agglutination reaction, and then X or Y chromosome sperm may be separated and used for artificial insemination.
  • the present invention comprises the steps of a) harvesting sperm from a male individual; b) treating said semen with said antibody to screen sex of sperm; c) fertilization using the selected sperm; And d) provides a method of producing a mammal having a specific sex, comprising the step of producing a living sex of the desired sex.
  • the step of fertilization using the selected sperm may be in vitro fertilization in vitro or artificial insemination by injecting directly into the uterus,
  • in vitro fertilization refers to obtaining fertilized eggs through incubation with sperm in vitro using eggs collected from slaughterhouses or overovulated females.
  • sperm in vitro eggs collected from slaughterhouses or overovulated females.
  • sex-separated fertilized egg obtained by fertilization in vitro using sperm that has already been sex-separated in vitro, and can use this to produce a litter with a purpose by injecting the female body.
  • the term "artificial insemination” as used herein refers to the concept of artificially injecting the semen from the male and female sperm into the genital organs of the female livestock without artificial mating of the sperm and sperm binding.
  • the male semen is injected into the female genitalia, indicating that the sex-selected sperm enter the cytoplasm of the egg as described above, thereby producing the sex of the desired sex.
  • the present technology produces semen and fertilized eggs for sexual fertilization by separating and obtaining sperm having specific characteristics, thereby contributing to the improvement, proliferation, supply and demand of individuals, and income increase of farm households, and raising livestock, especially Korean cattle. It can contribute to improving competitiveness through improved breeding of beef cattle and cows.
  • the antibody protein of the present invention was added to 100,000 sperm, and then the first binding reaction was performed for about 20 minutes, and the first antigen protein was not bound by centrifugation. Was removed.
  • the first antibody protein-binding sperm of the present invention was stained with a PE fluorescent material-binding anti-rat antibody protein at room temperature for about 20 minutes, and then used as a sample for analysis.
  • Live sperm were added only after the addition of PI fluorescence to exclude dead sperm before flow cytometry, and rat isotype IgG protein was added as a control for each sperm and stained with the same secondary antibody. It was. After selecting only the sperm using forward scatter (SSC) and side scatter (SSC) of the flow cytometer, the sperm population is determined to determine whether the sperm is bound to the antibody protein of the present invention. 10,000 sperm information was stored for each sperm and analyzed.
  • SSC forward scatter
  • SSC side scatter
  • the antibody protein of the present invention can specifically bind with X chromosome sperm or Y chromosome sperm, considering that sperm in semen has X or Y chromosome at a ratio of about 50:50. It is present.
  • the structure of the sperm is largely divided into the head, the neck, and the tail, including the core and the acrosome, and the tail, including the housewife and the apex.
  • the experiment was carried out as follows to identify specific sites of sperm to which the antibody protein of the present invention binds.
  • the antibody protein of the present invention binds to the head cell membrane of the sperm.
  • the antibody protein of the present invention specifically binds to the cell membrane protein of X chromosome sperm or Y chromosome sperm head.
  • the structure of an antibody protein consists of one structural protein FC portion and two antigen binding sites.
  • an aggregation reaction is induced accordingly.
  • the antibody protein of the present invention was added to a culture dish containing fused cows, mice, dogs, and horse sperm, the cells were incubated at 35 ° C. for about 10 minutes, and then observed using an electron microscope.
  • a control group a group without addition of the antibody protein of the present invention was used.
  • FIG. 4 in the case of cows, agglutination reaction of sperm was not observed in the control group to which the antibody protein of the present invention was not added (left side of FIG. 4A). It was confirmed that the antibody protein binds to the sperm tofu protein and induces sperm aggregation reaction of the sperm tofu bound (FIG. 4A right). In addition, in the case of mice, dogs and horses, it was also confirmed that the antibody protein of the present invention binds to the sperm tofu protein and induces the sperm aggregation reaction of the sperm tofu bound (FIGS. 4B to D).
  • the antibody protein of the present invention specifically binds to the cell membrane protein of Y chromosome sperm head and promotes binding between sperm head to induce sperm aggregation reaction.
  • Example 1 the negative sperm of the present invention and the positive sperm of the present invention separated in Example 1 was tested as follows to determine whether the X chromosome sperm or Y chromosome sperm, respectively.
  • PCR Genetic amplification assay
  • the cow sperm stained with the antibody protein of the present invention were separated from the antibody positive sperm and the 100,000 negative sperm of the present invention by a flow cytometer, and then placed in a 1.5 ml tube, and the supernatant was removed by a centrifuge. 50 ⁇ l of distilled water (D.W) was added to the precipitated sperm tube, followed by heat treatment at 99 ° C. for 10 minutes in a PCR instrument to separate sperm nuclei.
  • PCR gene test was performed after adding 2 ⁇ l of BSP Primer and 2 ⁇ l of Y chromosome-specific primer (BY primer) to 2 ⁇ l of sperm DNA in a PCR premixture tube containing the enzyme for PCR. It was.
  • PCR reaction was carried out for 5 minutes at 95 °C, the initial denaturation step, and then performed 45 cycles of 20 seconds at 95 °C, 20 seconds at 52 °C, 1 minute at 72 °C, and extended the reaction at 70 °C for 10 minutes
  • the genes subjected to gene amplification were examined whether the antibody positive or negative sperm of the present invention was X chromosome or Y chromosome.
  • the antibody-positive sperm of the present invention was amplified by a Y chromosome specific primer (BY primer), it was confirmed that the Y chromosome sperm, the antibody-negative sperm of the present invention is X chromosome sperm Confirmed.
  • the antibody antibody protein of the present invention specifically binds to the cell membrane protein of the Y chromosome sperm head and induces the Y chromosome sperm aggregation reaction.
  • Example 2 As sex sex sperm separated and sold by Hankook Securities Biotech Co., Ltd., the same method as in Example 1 above was performed for sexually discriminating sperm and non-sex sex sperm for cows, in which only X sperm was separated by flow cytometry using a conventional Hoechst33342 fluorescent chemical. After immunostaining the antibody protein of the present invention, the binding properties of the protein were analyzed.
  • Hoechst 33342 (Bismenzimide) was added to the sperm stained in the same manner as in Example 1, followed by fluorescence staining by incubation for 30 minutes in a 34 ° C CO 2 incubator. After the fluorescence staining, a UV laser-equipped flow cytometer (BD FACSAria) was used to analyze the fluorescence wavelengths of the UV laser with Aria (A) and Wide (W) in the same manner as that of Sexing Technologies. The stained Y chromosome sperm and the highly stained X chromosome sperm.
  • BD FACSAria UV laser-equipped flow cytometer
  • the antibody protein of the present invention specifically binds to Y chromosome sperm.
  • the frozen sperm was melted prior to artificial insemination and then added to the tube to which the antibody protein of the present invention was added. Afterwards, the cells were cultured at 35 ° C. for about 10 minutes or more, and agglomeration was visually observed. As a control group, a group without addition of the antibody protein of the present invention was used. In addition, after inducing sperm aggregation reaction as described above, X sperm separation efficiency was verified using a mesh filter of 18 ⁇ M size.
  • the sperm aggregation reaction did not occur in the control group to which the antibody protein was not added (left side of FIG. 8), whereas in the group to which the antibody protein of the present invention was added, the sperm aggregation reaction proceeded to the bottom of the tube. It was confirmed that it was precipitated in (Fig. 8 right).
  • the X chromosome sperm and the Y chromosome which existed at a ratio of 50:50 before separation through the antibody protein treatment of the present invention, were separated only by the X chromosome sperm using a filter, resulting in 95% or more high. Separation efficiency was observed.
  • the antibody protein is directly injected into the sperm straw using a syringe, or artificial semen is added to the vial container containing the antibody protein.
  • the reaction was performed at room temperature or hot water for about 20-30 minutes to induce the aggregation reaction of Y sperm.
  • artificial insemination was performed by injecting into the uterus of the cow where heat was induced. Sex ratios of female and male calves were examined by visual inspection on calves born from sperm treated with antibody proteins.
  • the sex ratio of female and male in the cows treated with the antibody protein was 82.4: 17.6, respectively.
  • mice 5 ⁇ g of sex-regulated antibody protein was preinjected into the uterus of estrus female mice and hybridized with male mice 6 hours later. Pregnancy mice with normal mating were screened and sex ratios of female and male mice were examined by visual inspection of 4 week old mice after delivery.
  • the X chromosome sperm can be easily separated and used by reacting with frozen semen before artificial insemination.
  • the aggregated Y chromosome sperm may be separated, and thus may be utilized as a male production sperm through the above method.
  • the present invention relates to an antibody for sperm discrimination and its use, and by treating the antibody, it has been confirmed that it is possible to easily discriminate X chromosome and Y chromosome sperm by inducing aggregation reaction of Y chromosome sperm. It is expected to produce large quantities of customized animals with high yields and to selectively produce livestock with the desired sex, thereby contributing to planned breeding, breeding improvement and efficient management.

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Abstract

본 발명은 정자 성 감별용 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 상기 항체를 이용한 정자 성감별용 조성물, 성감별 방법, 및 특정 성을 갖는 동물의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에서, 상기 항체를 처리함으로써, Y 염색체 정자의 응집 반응을 유도하여 X 염색체 정자와 Y 염색체 정자를 손쉽게 감별할 수 있음을 확인하였는바, 특정 성을 갖는 맞춤식 동물을 대량으로 생산할 수 있으며, 원하는 성을 갖는 가축을 선택적으로 생산함으로써, 계획 번식과 육종 개량 및 경영의 효율화에 기여할 것으로 기대된다.

Description

정자의 성 감별용 항체 및 이의 용도
본 발명은 정자 성감별용 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 상기 항체를 이용한 정자 성 감별용 조성물, 성감별 방법, 및 특정 성을 갖는 동물의 생산 방법 등에 관한 것이다.
정자 성감별 기술 (Sperm Sexing Biotechnology)은 원하는 성별의 정자만을 분리해 수정, 임신을 유도하여 목적의 성을 지닌 산자를 생산하는 기술로서, 생산 효율적 측면, 관리적 측면, 상업적 측면에서 매우 중요하며 기술 개발의 필요성이 더욱 커지고 있다.
특히, 수정란 생산, 인공수정과 같은 여러 가지 생체 내외 프로토콜 등에 있어서, 원하는 성별을 선택하는 것은 큰 경제적 이익을 가져다 줄 수 있다. 예를 들면, 젖소의 경우 우유를 생산할 수 있는 암송아지를, 육우의 경우 암컷에 비해 성장속도 및 증체량이 높아 더 많은 고기를 효율적으로 생산할 수 있는 숫송아지를 선별적으로 생산하거나 고품질의 고기소를 생산하기 위한 육종 개량의 목적으로 고능력우의 암소만을 선별적으로 대량 생산할 수 있으며, 이를 통해 축산 농가는 경영의 효율화 및 이에 따른 경제적 이익을 얻을 수 있다.
한편, 가축의 성별 결정에 대해 살펴보면, 임신을 한 경우 그 산자(産子)의 성별은 성 염색체 쌍을 구성하는 두 염색체가 어떠한 조합으로 이루어졌느냐에 따라 결정되며, 결론적으로는 정자의 염색체, 즉 정자의 성에 의해 결정된다.
구체적으로, 가축의 정액 내 존재하는 정자는 암 (X 염색체) 또는 수 (Y 염색체) 정자로 나뉘어지며, 정소 조직에서 존재하는 이배체의 정모세포로부터 일배체 염색체를 지닌 성숙한 정자로 분화되어진다. 따라서 정액 속에는 50 % 비율의 X 성 염색체를 지닌 정자와 50 % 비율의 Y 성 염색체를 지닌 정자가 존재하게 된다. 그러므로 성별의 결정은 정액 속의 X 염색체 또는 Y 염색체를 지닌 어느 한 성 염색체를 지닌 정자가 난자 (X 염색체)와의 수정을 통하여 성 염색체 쌍 (XX 또는 XY)을 구성하느냐에 따라 산자(産子)의 성별이 결정되게 된다. 따라서 일반적인 자연 상태에서의 암 수의 산자 비율은 대계 암컷과 수컷의 비율이 50 : 50의 비율 태어난다.
실질적으로 축산을 비롯한 많은 분야에서 성을 조절할 수 있는 기술의 중요성과 필요성이 오래전부터 인식되어져 왔으며, X 염색체를 지닌 X 정자와 Y 염색체를 지닌 Y 정자를 물리적인 방법이나 형태학적인 방법에 의해 분리하는 다양한 기술 개발이 시도되어져 왔다.
1982년 미국 농림부, 콜로라도 주립대학 및 영국 캠브리지 대학의 과학자들이 정자가 가진 X 와 Y 성 염색체의 염색체 길이가 다름에 따른 DNA 함량 차이를 이용해 정자의 성감별이 가능하다는 보고를 발표한 이래, 현재까지도 다각적인 연구가 진행되고 있다. 일례로, 정자의 크기, 질량, 밀도에 근거하여, 원심분리, 구슬(bead)층, 여러 재질의 칼럼 등을 통과시켜 정자의 유영에 따른 이동 속도에 기초하여 분리하는 방법 등이 소개된 바 있으나 (한국특허 공개번호 : 10-2009-0024034), 상기 방법들만으로는, 원하는 성별을 가진 정자를 고순도로 얻을 수 없다는 문제점이 있었다.
또한, X와 Y 염색체 길이의 차이를 이용한 Sexing Technologies사 (XY LLC사로부터 권리이전)의 정자 성감별 기술이 현재 보편적으로 사용되고 있으나, 이 역시 정자의 염색체를 형광화학 염색제로 단시간 염색한 후, 세포분리기기에 장착된 레이저에 의한 산란 빛을 전기신호로 전환해 감별하거나 고압의 분리장치를 통과시켜 목적 정자를 분리한다.
이러한 기기적인 분리 과정에서 많은 정자들이 분리되지 않고 손실되며, 장시간의 분리 과정과 레이저 및 전기적 자극에 따른 스트레스로 인하여 난자와의 수정에 매우 중요한 정자의 운동성과 생존율에 큰 영향을 미치게 된다. 또한, 기기를 사용해 분리하기 때문에 비-분리 정액에 비하여 약 4배 이상 고가로 판매되고 있으며, 시판되는 동결 정자 스트로우에 보관된 정자 수도 비-분리 정자 수에 비해서 약 5-10배 적게 들어있어 임신 수율이 떨어지는 큰 원인으로 작용하고 있다.
또한, 본 방법에 의한 정자분리를 위해서 고가의 장비 및 전문적인 인원이 필요하고, 대량 생산을 위해서 부대 시설과 인력 확충이 절대적으로 필요로 하기 때문에 이러한 기기를 이용한 성감별 정자 분리의 한계성으로 인하여 관련 업계는 많은 어려움을 호소하고 있다. 아울러, 가장 염려되는 사항은 상기의 정자 분리를 위해 사용되고 있는 형광 물질은 모든 염색체에 비특이적으로 결합하여 난자와 수정이 이루어지기 전에 제거되지 않은 상태로 수정이 이루어지기 때문에 태어나는 산자의 유전적 안전성에 대해서도 많은 의구심이 제기되고 있는 상태이며, 최근 동물 복지를 최우선시 여기는 유럽 국가에서는 본 정자 분리 방법을 금지하고자 하는 논의가 진행되고 있는 실정이다.
현재는 상기와 같이 기기를 이용한 정자의 분리 방법이 지니고 있는 문제점을 극복할 수 있는 새로운 기술 개발이 절실한 상황으로, X 정자나 Y 정자를 구분할 수 있는 바이오머커를 발굴하기 위하여 많은 과학자들의 연구가 이루어지고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자는 Y 염색체 정자에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고, 이를 이용하여 원하는 X 염색체 정자 또는 Y 염색체 정자를 분리함으로써 정자의 성을 감별할 수 있음을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 정자 성 분리를 위한 감별용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는, 상기 항체 생산용 발현 벡터, 이를 통한 시험관(in vitro) 내 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 항체 생산방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) 수컷 개체로부터 정액을 채취하는 단계; b) 상기 정액에 상기 항체를 처리하는 단계; 및 c) 상기 정액 내 항체와 특이적으로 결합된 정자와 비결합된 정자를 분리하는 단계를 포함하는, 포유동물 정자의 성감별 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) 수컷 개체로부터 정액을 채취하는 단계; b) 상기 정액에 상기 항체를 처리하여 정자의 성을 선별하는 단계; c) 상기 선별된 정자를 이용해 수정시키는 단계; 및 d) 목적하는 성의 산자(産子)를 생산하는 단계를 포함하는, 특정 성을 갖는 포유동물의 생산방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 항체는 단일클론 항체 또는 폴리클론 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는, 항체 생산용 발현 벡터, 이를 통한 시험관(in vitro) 내 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 항체 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 숙주세포는 박테리아 (E.Coli)나 효모 (Yeast)등의 미생물, CHO 세포, F2N 세포, HEK293 세포 및 항체 생산 하이브리도마세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 정자 성 분리를 위한 감별용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 항체는 포유동물의 Y 염색체 정자에 결합하여 정자 응집 반응을 유도할 수 있고, 상기 포유동물은 소, 마우스, 개 및 말로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 a) 수컷 개체로부터 정액을 채취하는 단계; b) 상기 정액에 상기 항체를 처리하는 단계; 및 c) 상기 정액 내 항체와 특이적으로 결합된 정자와 비결합된 정자를 분리하는 단계를 포함하는, 포유동물 정자의 성감별 방법을 제공하고, 상기 포유동물은 소, 마우스, 개 및 말로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단계 c)에서 상기 항체와 특이적으로 결합된 정자는 Y 염색체 정자이고, 비결합된 정자는 X 염색체 정자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단계 c)는 유세포 분리기법, 자석 분리기법, 필터 분리법, 팬닝 분리방법, 나노물질을 이용한 분리방법 및 직접 투여기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 수컷 개체로부터 정액을 채취하는 단계; b) 상기 정액에 상기 항체를 처리하여 정자의 성을 선별하는 단계; c) 상기 선별된 정자를 이용해 수정시키는 단계; 및 d) 목적하는 성의 산자(産子)를 생산하는 단계를 포함하는, 특정 성을 갖는 포유동물의 생산방법을 제공하고, 상기 포유동물은 소, 마우스, 개 및 말로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계는 선별된 정자를 시험관(in vitro) 내에서 체외수정시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계는 선별된 정자를 포유동물의 자궁에 직접 주입하여 체내에서 인공 수정시킬 수 있다.
본 발명은 정자 성 감별용 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 상기 항체를 이용한 정자 성감별용 조성물, 성감별 방법, 및 특정 성을 갖는 동물의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에서, 상기 항체를 처리함으로써, Y 염색체 정자의 응집 반응을 유도하여 X 염색체 정자와 Y 염색체 정자를 손쉽게 감별할 수 있음을 확인하였는바, 특정 성을 갖는 맞춤식 동물을 대량으로 생산할 수 있으며, 원하는 성을 갖는 가축을 선택적으로 생산함으로써, 계획 번식과 육종 개량 및 경영의 효율화에 기여할 것으로 기대된다.
도 1은 젖소 정자를 이용하여 본 발명 항체 단백질 처리에 따른 정자와의 결합 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 한우 정자를 이용하여 본 발명 항체 단백질 처리에 따른 정자와의 결합 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명 항체 단백질과 정자와의 결합 부위를 형광 현미경으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명 항체 단백질 처리에 따른 소 정자 (4a), 마우스 정자 (4b), 개 정자 (4c) 및 말 정자 (4d)의 정자 응집 반응의 유도 여부를 전자 현미경으로 확인한 결과이다.
도 5는 유세포분리기 (Flow cytometer)로 분리된 본 발명의 항체 양성 정자와 항체 정자 각각의 염색체를 PCR을 이용하여 확인한 결과이다.
도 6은 현재 시판되고 있는 젖소용 성감별 정자를 이용하여 본 발명 항체 단백질의 성감별 효능을 검증한 결과이다.
도 7은 Sexing Technologies사의 X 염색체 정자와 Y 염색체 정자의 길이 차이에 따른 분리 방법을 이용해 본 발명 항체 단백질의 성감별 효능을 검증한 결과이다.
도 8은 동결 정자를 이용하여 본 발명 항체 단백질 처리에 따른 정자 응집 여부를 육안으로 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명 항체 단백질을 처리하여 정자 응집 반응을 유도한 후, 메쉬 (mesh) 필터를 이용해 X 정자분리 효율을 검증한 결과이다.
도 10은 본 발명 항체 단백질 처리에 따른 소(한우)의 성 조절 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명 항체 단백질 처리에 따른 마우스의 성 조절 효과를 확인한 결과이다.
본 발명자는, Y 염색체 정자 두부의 세포막 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여, Y 염색체 정자의 응집을 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 항체의 이러한 특성을 이용하여 보다 간이하게 X 염색체 정자와 Y 염색체 정자를 분리하여 인공수정 등에 활용할 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 기능성 변이체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 결합 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 폴리클로날 (polyclonal) 항체 및 모노클로날 (monoclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 항체, 항체 단편, 키메라성 항체 (예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체 (예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
전형적으로 항체는 중쇄 (Heavy chain) 및 경쇄 (Light chain)를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변영역 및 가변영역 (상기 부위는 “도메인”으로 또한 알려져 있음.)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 “상보성 결정 영역” (complementarity-determining region, 이하, ‘CDR’)이라고 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 “구조영역” (framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프 (epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서, 중쇄 가변영역의 CDR1 (HCDR1), CDR2 (HCDR2), CDR3 (HCDR3)은 각각 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산, 경쇄 가변영역의 CDR1 (LCDR1), CDR2 (LCDR2), CDR3 (LCDR3)은 각각 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 상기 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
중쇄 가변영역의 CDR1 (HCDR1), CDR2 (HCDR2), CDR3 (HCDR3)은 각각 서열번호 9 내지 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 경쇄 가변영역의 CDR1 (LCDR1), CDR2 (LCDR2), CDR3 (LCDR3)은 각각 서열번호 12 내지 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 상기 서열번호 9 내지 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 중쇄 가변영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산, 경쇄 가변영역은 서열번호 8로 표시되는 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 상기 서열번호 7 및 8로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
중쇄 가변영역은 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 경쇄 가변영역은 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 상기 서열번호 15 및 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체의 기능성 변이체는 본 명세서에 기재된 항체 서열의 생물학적 균등물들을 포함한다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실. 삽입, 및/또는 치환을 포함하며, 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적인 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
본 발명의 항체는 포유동물의 Y 염색체 정자의 세포막 단백질과 특이적으로 결합하여, Y 염색체 정자의 응집 반응을 유도할 수 있다. 상기 항체는 Y 염색체 정자와 달리, X 염색체 정자와는 특이적인 결합을 하지 않으므로 정자 응집 반응이 유도되지 않는다. 따라서, 이러한 성질을 이용하여, Y 염색체 정자와 X 염색체 정자를 손쉽게 감별 또는 분리할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는, 항체 생산용 발현 벡터, 이를 통한 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 시험관 (in vitro) 내 항체 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “형질전환”은, 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 본 발명의 목적상 형질전환은 상기 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산이 숙주세포 내로 삽입되어 본 발명의 항체를 생산하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는 바람직하게는 박테리아 (E.Coli)나 효모 (Yeast)등의 미생물, CHO 세포, F2N 세포, HEK293 세포 및 항체 생산 하이브리도마세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 항체를 포함하는 단백질 제제와 Y 염색체 정자가 결합할 수 있음을 확인하였으며, 상기 항체 단백질은 정자 두부의 세포막 단백질에 결합하는 것을 확인하였다 (실시예 1 및 2 참조). 또한, 구체적으로, 상기 항체 단백질과 결합하는 정자는 Y 염색체 정자임을 확인하고, 이러한 결과를 현재 시판되고 있는 젖소용 성감별 정자, 및 Sexing Technologies사의 분리 방법을 통하여 분리 효능을 검증하였으며, 실제 인공수정에서 이용되는 동결 정자를 이용하여 재차 그 효과를 검증하였는바, 본 발명을 이용하여 간이하면서도 높은 효율로 정자의 성을 감별할 수 있음을 확인하였다 (실시예 3 내지 5 참조).
이에, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 유효성분으로 포함하는 정자 성 분리를 위한 감별용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서, 정자를 채취하고 감별하고자 하는 축종의 특성에 맞추어 제조한 희석액을 더 포함할 수 있다. 희석의 목적은 어느 정도의 대사 억제, 저온 충격 방지, 과밀도 방지, 정자의 생존성을 증대하여 유효 정액량을 증가시키기 위함이며, 필요에 따라 운동 촉진제, 운동 억제제, 세균 억제제 등을 포함될 수 있고, 외부 환경에서 정자의 생존을 증진시킬 수 있는 제제라면 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 수컷 개체로부터 정액을 채취하는 단계; b) 상기 정액에 항체를 처리하는 단계; 및 c) 상기 정액 내 항체와 특이적으로 결합된 정자와 비결합된 정자를 분리하는 단계를 포함하는, 포유동물 정자의 성감별 방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 정자를 채취하고자 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 소, 마우스, 개 및 말 등의 포유동물을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “소”는 생산할 송아지의 목적에 따라 바람직하게는 한우를 포함한 비육우 또는 젖소를 선택할 수 있으나, 생식 능력을 가지고 있는 소라면, 축종에 제한 없이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에서, “마우스, 개 및 말”은 생산할 산자(産子)의 목적에 따라 선택할 수 있으나, 생식 능력을 가지고 있다면, 축종에 제한 없이 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “정자의 성감별”은 X 염색체 정자와 Y 염색체 정자를 분리 또는 감별하는 것을 의미하며, 상기 정자들은 활동성이나 형태학적 차이만으로는 구분이 어려운 바, 본 발명에서는 항체에 의한 결합을 통한 정자 분리 방법과 항체 및 항체 단편을 매개로 한 정자 응집 반응을 이용하여 양자를 분리 또는 감별하고자 하였다.
본 발명의 일예로, 본 발명은 젖소의 효율적인 생산을 위하여 X 염색체 정자를 수득하는 것을 목적으로 할 수 있으나, 필요에 따라 Y 염색체를 분리하여 수컷 소를 생산하는데 이용될 수 있다. 또한, 한우를 포함한 비육우의 경우에도 암소만을 생산하기위한 방법으로서 X 염색체 정자를 수득하는 것으로 활용될 수 있으며 목적에 따라 수컷 소의 생산을 위하여 이용될 수 있다.
일반적으로 포유동물의 난자는 성염색체로서 X 염색체만을 갖는 반면, 정액내의 정자는 약 50 : 50의 비율로 X 또는 Y 염색체를 지닌 정자를 함유하고 있으며, 정자는 암컷 체내에서 난자와 만나 수정 시 수정란의 성을 결정하는 역할을 한다. 따라서, 정자의 성을 감별 또는 분리함으로써, 특정 성을 갖는 산자(産子)를 생산할 수 있다.
종래 Sexing Technologies사의 정자의 성감별 기술은 X와 Y 염색체 길이에 따른 형광화학물질의 염색 발광 광도의 차이를 이용한 방법으로서, 성감별 정자가 DNA 형광 염색제 (Hoechst33342), UV 레이저, 높은 전압과 같은 물리적인 자극과 더불어 정자 성감별 분리를 위해 장시간의 시간이 요구되어, 정자의 운동성과 생존율에 영향을 미쳐 결과적으로 임신 수율이 낮게 나타난다 (Duane, L. C., Theriogenology 65: 943-957(2006)). 또한, 고가의 장비 및 숙련된 전문 인력이 필요로 하며 성감별 정자 생산량 증대를 위한 관련 부대 시설 확충 등 많은 문제점을 지니고 있었다. 특히, 염색체 성 감별용 제제로서 사용되어지는 염색체 형광 물질 염색제 (Hoechst33342)는 염색체에 결합하면 제거 할 수 없기 때문에 산자의 유전자 이상 유발 가능성도 제기되고 있어 사용을 자제하려고 하고 있는 상황이다.
이에, 본 발명은 단백질 제제인 항체를 이용하여 상기 종래 기술의 문제점을 해소하고자 하였다. 본 발명의 항체는 Y 염색체 정자의 세포막 단백질과 특이적으로 결합하므로 간편하면서도 효과적으로 X 또는 Y 염색체 정자를 감별 또는 분리할 수 있다. 본 발명은 기존의 형광물질에 의한 염색체 결합을 통한 분리 방법에 의해서 발생될 수 있는 안전성의 문제를 해결할 수 있으며, 염색체에 영향을 끼치지 않고 안전하게 목적 정자를 분리 할 수 있다. 또한, 외부적 자극 없이 단시간에 간이한 방법으로 항체 및 항체 단편에 의해 유도되는 정자 응집 반응만을 이용하여 분리함으로써, 정자에 가해지는 물리적 자극을 최소화하여 본래의 정자 운동성과 생존성이 보존된 상태로 분리가 가능하며 이를 이용해 고효율의 체외수정용 정자 또는 인공수정용 정자로 활용함으로써 높은 수태율을 가지는 장점을 지니고 있다.
특히, 항체와 비결합된 X 염색체 정자는 정자 자유 운동에 의한 정상적인 수정능력을 지니고 있으므로, 암컷 (XX)의 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다. 또한, 응집된 Y 염색체 정자만을 선택적으로 분리하여 물리적인 분리방법을 통하여 확보된 정자를 이용해 수컷 (XY)의 생산 수율을 높이는데도 활용될 수 있다.
본 발명에서, 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편과 특이적으로 결합된 Y 염색체 정자와 비결합된 X 염색체 정자를 분리하기 위하여, 유세포 분리기법, 항체 단백질에 자석 (Magnetic nano particle)을 붙인 후 자석의 원리에 의해서 분리하는 자석 분리기법, 정자 응집반응에 의한 침전물을 필터로 분리하는 필터 분리법, 또는 동결정자에 직접 주입하여 정자의 응집반응을 유발시키는 직접 투여기법 등을 사용할 수 있으나, 응집 또는 비응집된 정자를 분리할 수 있는 방법이라면 제한 없이 이용할 수 있다. 종래 Sexing Technologies사의 소 정자의 성감별 기술은 오직 유세포 분리기를 이용하여 분리하였던 반면, 본 발명은 조건과 환경에 따라 다양한 분리 방법을 선택적으로 활용할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에서, 바람직하게 본 발명의 조성물 및/또는 키트는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는 바이알 (유리병) 형태로 제조될 수 있다. 일례로서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는 바이알에 정액을 첨가하고 혼합시켜 응집반응을 유도한 후, X 또는 Y 염색체 정자를 분리하여 인공수정에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 수컷 개체로부터 정자를 채취하는 단계; b) 상기 정액에 상기 항체를 처리하여 정자의 성을 선별하는 단계; c) 상기 선별된 정자를 이용해 수정시키는 단계; 및 d) 목적하는 성의 산자(産子)를 생산하는 단계를 포함하는, 특정 성을 갖는 포유동물의 생산방법을 제공한다.
상기 선별된 정자를 이용해 수정시키는 단계는 시험관 (in vitro) 내에서 체외 수정시키거나, 자궁에 직접 주입하여 체내에서 인공 수정시킬 수 있다,
본 명세서에 사용되는 용어, “체외수정 (in vitro fertilization)”은 도살장 또는 과배란 처리 암컷에서 채취한 난자를 이용해 시험관에서 정자와의 배양을 통하여 수정란을 얻는것을 의미한다. 본 발병의 목적상, 시험관에서 이미 성 분리된 정자를 이용해 시험관에서 수정을 시행하여 얻어지는 성 분리된 수정란을 의미하여 이를 이용해 암컷의 체내 주입을 통한 목적 성을 지닌 산자(産子)를 생산할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, “인공수정 (artificial insemination)”은 난자와 정자의 결합을 자연 교미에 의하지 않고, 인의적으로 수가축의 정액을 암가축의 생식기내에 주입하여 수태시키는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 수컷의 정액을 암컷의 생식기에 주입함으로써, 상기와 같이 성이 선별된 정자가 난자의 세포질에 들어가는 것을 나타내며, 이를 통해 목적하는 성의 산자(産子)를 생산할 수 있다.
이에, 본 기술은 특정 성을 갖는 정자를 분리, 수득함으로써, 인공수정용 성감별 정액 및 수정란을 생산하여 개체의 개량, 증식, 수급 조절, 및 농가의 소득증대에 기여하고, 축산업, 특히 한우를 포함한 비육우 및 젖소의 육종 개량을 통한 경쟁력 향상에 기여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명 단백질 제제의 정자와의 특이적 결합능 확인
본 발명의 항체를 포함하는 단백질 제제의 정자와의 결합능을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
시판되고 있는 젖소 및 한우용 동결 정액을 35 ℃에서 융해한 후, 정자를 1,000,000 개/ml로 정자 희석액에 희석하여 분석용 정자로 이용하였다. 본 발명 항체 단백질의 결합여부를 검증하기 위하여 각각 10만 개의 정자를 대상으로 본 발명 항체 단백질을 첨가한 후, 약 20 분간 1차 결합 반응을 시켰으며, 원심 분리를 통해 결합되지 않은 1차 항원 단백질을 제거하였다. 1차 본 발명 항체 단백질 결합 정자를 대상으로 PE 형광 물질 결합 항-랫트 항체 단백질로 상온에서 약 20 분간 염색을 실시한 후, 이를 분석용 샘플로 이용하였다. 유세포 분석을 시행하기 전에 죽은 정자를 제외하기 위하여 PI 형광물질을 첨가한 후, 살아있는 정자만을 대상으로 하였으며, 각 축종의 정자에 대한 대조군으로 랫트 isotype IgG 단백질을 첨가한 후, 동일한 2차 항체로 염색하였다. 유세포분석기의 전방산란 (Forward Scatter: FSC)과 측방산란 (Side Scatter: SSC)을 이용해 정자부분만을 선택한 후, 정자의 집단만을 대상으로 각 축종별 정자에서의 본 발명 항체 단백질과의 결합 여부를 판별하였고, 각 정자당 1만 개의 정자 정보를 보관하여 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 젖소 및 한우 모두 동일하게 항체 단백질 무첨가 대조군의 경우 비결합 정자로 나타났으나 (도 1 및 2의 왼쪽), 본 발명 항체 단백질 첨가 그룹의 경우, 본 발명 항체-음성 정자 (본 발명 항체 단백질 비결합 정자) 및 본 발명 항체-양성 정자(본 발명 항체 단백질 결합 정자)가 50 : 50의 비율로 분리 관찰되었다 (도 1 및 2의 오른쪽).
이러한 결과는, 정액 내의 정자는 약 50 : 50의 비율로 X 또는 Y 염색체를 가진다는 점을 고려해 볼 때, 본 발명의 본 발명 항체 단백질이 X 염색체 정자 또는 Y 염색체 정자와 특이적으로 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2. 본 발명 단백질 제제의 정자와의 결합 부위 및 정자 응집 반응 확인
2-1. 정자와의 결합 부위 확인
정자의 구조는 크게 핵과 첨체를 포함하고 있는 두부, 경부, 및 주부와 종부를 포함하는 미부로 구분된다. 이에, 상기 실시예 1의 결과를 토대로 본 발명 항체 단백질이 결합하는 정자의 구체적인 부위를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
정자의 결합 부위를 검사하기 위하여 면역 염색을 실시하였으며, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 소 정자에 결합되어 있는 본 발명 항체 단백질을 염색한 후, 형광 현미경을 이용하여 결합 부위를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명 항체 단백질은 소 정자의 두부 세포막에 결합하고 있음을 확인하였다.
이러한 결과는, 본 발명의 본 발명 항체 단백질이 X 염색체 정자 또는 Y 염색체 정자 두부의 세포막 단백질에 특이적으로 결합함을 나타낸다.
2-2. 정자 응집 반응의 확인
항체 단백질의 구조는 한 개의 구조 단백질 FC 부분과 2개의 항원 결합부위로 이루어져 있으며, 항체 단백질이 항원에 결합하면, 이에 따른 응집 반응이 유발된다. 이에, 본 발명 항체 단백질과 정자의 결합에 의한 정자 응집 반응 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
융해된 젖소, 마우스, 개 및 말 정자가 포함된 배양 디쉬에 본 발명 항체 단백질을 첨가한 후, 35 ℃에서 약 10분간 배양시킨 후, 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다. 대조군으로는 본 발명 항체 단백질을 첨가하지 않은 군을 이용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 젖소의 경우, 본 발명 항체 단백질을 첨가하지 않은 대조군에서는 정자의 응집 반응이 관찰되지 않은 반면(도 4A 왼쪽), 본 발명 항체 단백질을 첨가한 군에서는 본 발명 항체 단백질이 정자의 두부 단백질과 결합하여 정자의 두부끼리 결합된 정자 응집 반응이 유도됨을 확인하였다(도 4A 오른쪽). 또한, 마우스, 개 및 말의 경우도 마찬가지로 본 발명 항체 단백질이 정자의 두부 단백질과 결합하여 정자의 두부끼리 결합된 정자 응집 반응이 유도됨을 확인하였다(도 4B 내지 D).
이러한 결과는, 본 발명의 본 발명 항체 단백질이 Y 염색체 정자 두부의 세포막 단백질에 특이적으로 결합하고, 정자 두부간 결합을 촉진하여 정자 응집 반응을 유도함을 나타낸다.
실시예 3. X 또는 Y 염색체 정자 분리 효능 확인
본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 구분된 본 발명 음성 정자와 본 발명 양성 정자가 각각 X 염색체 정자 또는 Y 염색체 정자인지를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
염색체 특이적인 프라이머 (BSP Primer, BY primer)를 이용하여 유전자 증폭 검사 (PCR)를 실시하였으며, 서열 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머 뉴클레오타이드 서열 유전자 크기
BSP Forward 5'-TTTACCTTAGAACAAACCGAGGCAC-3' (서열번호 17) 538bp
Reverse 5'-TACGGAAAGGAAAGATGACCTGACC-3' (서열번호 18)
BY Forward 5'-CTCAGCAAAGCACACCAGAC-3' (서열번호 19) 300bp
Reverse 5'-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3' (서열번호 20)
본 발명 항체 단백질을 염색한 젖소 정자를 유세포분리기 (Flowcytometer)로 본 발명 항체 양성 정자와 음성 정자 10만 개를 각각 분리한 후, 1.5 ml 튜브에 넣고, 원심분리기로 상층액을 제거하였다. 침전 정자 튜브에 50 μl의 증류수 (D.W)를 첨가 한 후 PCR 기기에서 99 ℃, 10 분간 가열 처리하여 정자 핵을 분리하였다. PCR용 효소 등이 함유된 PCR premixture 튜브에 정자 DNA 2 μl에 소 염색체와 결합하는 프라이머 (BSP Primer) 2 μl 및 Y 염색체 특이적인 프라이머 (BY primer) 2 μl를 첨가한 후, PCR 유전자 검사를 시행하였다. PCR 반응은 초기 변성 단계인 95 ℃에서 5분 간 시행한 후, 95 ℃에서 20초, 52 ℃에서 20초, 72 ℃에서 1분씩 총 45 사이클을 실시하였고, 70 ℃에서 10 분간 연장 반응을 시켜 유전자 증폭을 시행한 유전자를 대상으로 본 발명 항체 양성 또는 음성 정자가 X 염색체 정자 또는 Y 염색체 정자인지 조사하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명 항체-양성 정자는 Y 염색체 특이적인 프라이머 (BY primer)에 의해 증폭되었는바, Y 염색체 정자임을 확인하였으며, 본 발명 항체-음성 정자는 X 염색체 정자임을 확인하였다. 상기의 결과들을 종합해 볼 때, 본 발명항체 항체 단백질은 Y 염색체 정자 두부의 세포막 단백질에 특이적으로 결합하여, Y 염색체 정자 응집 반응을 유도함을 알 수 있다.
실시예 4. 종래의 정자 성감별 기술을 이용한 성감별 효능 검증
우선, 현재 시판되고 있는 젖소용 성감별 정자를 이용하여 본 발명 항체 단백질의 성감별 효능을 검증하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
㈜ 한국섹싱바이오텍에서 분리하여 판매하는 성감별 정자로서, 기존의 Hoechst33342 형광 화학 물질을 이용해 유세포분리기로 X 정자만을 분리한 젖소용 성감별 정자와 비 성감별 젖소용 정자를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 본 발명 항체 단백질을 면역염색한 후, 단백질의 결합 특성을 분석하였다.
또한, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 염색을 실시한 정자에 5 μg/ml 농도의 Hoechst 33342 (Bismenzimide)를 첨가한 후, 34 ℃의 CO2 배양기에서 30 분간 배양을 통하여 형광염색을 실시하였다. 상기 형광염색 실시 후, UV 레이저가 장착된 유세포분리기 (BD FACSAria)를 이용해 Sexing Technologies사 제품과 동일한 방법으로 UV 레이저에 의한 형광파장을 Aria (A)와 Wide (W)로 분석하여 Hoechst 33342이 적게 염색된 Y 염색체 정자와 많이 염색된 X 염색체 정자를 구분하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, X 염색체 정자와 Y 염색체 정자 모두가 포함된 비 성감별 정자에서는 본 발명 항체 양성 정자와 본 발명 항체 음성 정자 50 : 50의 비율로 관찰된 반면(도 6 왼쪽), 성감별 정자에서는 8 : 92의 비율로 관찰되었다(도 6 오른쪽). 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 본 발명 항체 단백질은 Y 염색체 정자가 게이팅 부분에는 결합되어 있는 반면, X 염색체 정자가 게이팅 부분에는 결합되지 않음을 확인하였다.
이러한 결과는, 본 발명 항체 단백질은 Y 염색체 정자에만 특이적으로 결합함을 의미한다.
실시예 5. 동결 정자를 이용한 성감별 효능 검증
실제 인공 수정에 본 기술의 활용여부를 확인하기 위하여 실제 인공수정에서 사용되고 있는 동결 정자를 이용하여 성감별 효능을 검증하고자 하기와 같이 실험하였다.
인공수정에 앞서서 동결 정자를 융해한 후, 본 발명 항체 단백질이 첨가된 튜브에 첨가하였다. 이 후, 35 ℃에서 약 10분 이상 배양을 실시하고, 응집여부를 육안으로 관찰하였다. 대조군으로는 본 발명 항체 단백질을 첨가하지 않은 군을 이용하였다. 또한, 상기와 같이 정자 응집 반응을 유도한 후, 18 μM 사이즈의 메쉬 (mesh) 필터를 이용해 X 정자 분리 효율을 검증하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명 항체 단백질을 첨가하지 않은 대조군에서는 정자 응집 반응이 일어나지 않은 반면(도 8 왼쪽), 본 발명 항체 단백질을 첨가한 군에서는 정자 응집 반응이 진행되어 튜브 하단에 침전되어 있음을 확인하였다(도 8 오른쪽). 또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 본 발명 항체 단백질 처리를 통해 분리 전, 50 : 50의 비율로 존재하던 X 염색체 정자와 Y 염색체를 필터를 이용해 X 염색체 정자만을 분리한 결과, 95% 이상의 높은 분리 효율이 관찰되었다.
실시예 6. 본 발명 단백질 제제의 임상 효능 확인
본 발명에 따른 항체 단백질에 의한 성 조절 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
6-1. 소 (한우)에 대한 성 조절 효과
한우 사육 농가를 대상으로 인공수정 시 냉동 보관된 정자를 온수로 융해 한 후, 정자 스트로우에 주사기를 이용해 직접 항체 단백질을 주입하거나, 항체 단백질이 들어있는 바이알 용기에 인공수정용 정액을 첨가한 후, 실온 또는 온수에서 약 20-30분간 반응을 시켜 Y 정자의 응집반응을 유도시켰다. 반응 후 발정이 유발된 암소의 자궁에 주입하여 인공수정을 실시하였다. 항체 단백질이 처리된 정자에 의해서 태어난 송아지를 대상으로 육안 검사를 통하여 암컷과 수컷 송아지의 성비를 검사하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 항체단백질을 처리한 소에서 암컷과 수컷의 성 비율이 각각 82.4 : 17.6으로 확인되었다.
6-2. 마우스에 대한 성 조절 효과
성 조절용 항체 단백질 5 μg을 발정기 암컷 마우스 자궁에 사전 주입하고 6 시간 후에 수컷 마우스와의 교배를 실시하였다. 정상적인 교배가 이루어진 임신 마우스를 선별하여 분만 후 4주령의 새끼 마우스를 대상으로 육안 검사를 통하여 암컷과 수컷 마우스의 성비를 검사하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군의 마우스는 암컷과 수컷의 성 비율이 각각 56 : 44의 비율을 나타내었으나 항체 단백질을 처리한 마우스에서는 암컷과 수컷의 성 비율이 각각 93.3 : 6.7로 확인되었다.
이러한 결과는, 항체 단백질 처리에 의하여 Y 염색체 정자의 응집반응이 유도되고, 이에 따라 X 염색체 정자가 분리 수정된 것을 의미한다.
이에, 바이알 병에 본 발명항체 단백질이 첨가된 형태의 키트 (홀맘)를 제조 및 활용하여 인공수정 전, 동결 정액과 반응시킴으로써, 간편하게 X 염색체 정자를 분리하여 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 응집된 Y 염색체 정자만을 회수하여 응집된 정자에 수차례의 피펫팅을 실시할 경우, 응집된 Y 염색체 정자가 분리될 수 있는바, 상기 방법을 통해 수컷 생산용 정자로 활용이 가능할 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 정자 성 감별용 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 상기 항체를 처리함으로써, Y 염색체 정자의 응집 반응을 유도하여 X 염색체 정자와 Y 염색체 정자를 손쉽게 감별할 수 있음을 확인하였는바, 특정 성을 갖는 맞춤식 동물을 대량으로 생산할 수 있으며, 원하는 성을 갖는 가축을 선택적으로 생산함으로써, 계획 번식과 육종 개량 및 경영의 효율화에 기여할 것으로 기대된다.
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<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody heavy chain CDR1 region
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody heavy chain CDR2 region
<400> 2
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile
1 5
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody heavy chain CDR3 region
<400> 3
Ala Arg Pro
1
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody light chain CDR1 region
<400> 4
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody light chain CDR2 region
<400> 5
Leu Val Ser
1
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody light chain CDR3 region
<400> 6
Gln His Ile Arg Glu
1 5
<210> 7
<211> 132
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody heavy chain peptide sequence
<400> 7
Ser Ala Arg Gln Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
1 5 10 15
Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Phe Thr
20 25 30
Phe Ser Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys
65 70 75 80
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Pro Arg Arg Tyr Thr Thr Asp Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Thr Thr Thr Val Ser
115 120 125
Ser Thr Ser Asp
130
<210> 8
<211> 138
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody light chain peptide sequence
<400> 8
Gly Ile Ser Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu
1 5 10 15
Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
20 25 30
Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg
35 40 45
Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser
65 70 75 80
Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Trp Lys Ser Asn Val Ser Arg Arg
130 135
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody heavy chain CDR1 region nucleotide
<400> 9
ggattcactt tcagtaacta tgga 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody heavy chain CDR2 region nucleotide
<400> 10
attagtagta gtagcagtta catc 24
<210> 11
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody heavy chain CDR3 region nucleotide
<400> 11
gcaagacca 9
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody light chain CDR1 region nucleotide
<400> 12
aaaagtgtca gtacatctgg ctatagttat 30
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody light chain CDR2 region nucleotide
<400> 13
cttgtatcc 9
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody light chain CDR3 region nucleotide
<400> 14
cagcacatta gggag 15
<210> 15
<211> 416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody heavy chain nucleotide sequence
<400> 15
agcgtcgact tacgttttat ttccagcttg gtcccccctc cgaacgtgta agctccctaa 60
tgtgctgaca gtaataggtt gcagcatcct cctcctccac aggatggatg ttgagggtga 120
agtctgtccc agacccactg ccactgaacc tggcagggac cccagattct aggttggata 180
caagatagat gaggagtctg ggtggctgtc ctggtttctg ttggttccag tgcatataac 240
tatagccaga tgtactgaca cttttgctgg ccctgtatga gatggtggcc ctctgcccca 300
gagatacagc taaccaagca ggagactgtg tcagcacaat gtcaccagtg gaacctggaa 360
cccagagcag cagtacccat agcaggagtg tgtctgtctc catggtggat atcccc 416
<210> 16
<211> 416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antibody light chain nucleotide sequence
<400> 16
ggggatatcc accatggaga cagacacact cctgctatgg gtactgctgc tctgggttcc 60
aggttccact ggtgacattg tgctgacaca gtctcctgct tccttagctg tatctctggg 120
gcagagggcc accatctcat acagggccag caaaagtgtc agtacatctg gctatagtta 180
tatgcactgg aaccaacaga aaccaggaca gccacccaga ctcctcatct atcttgtatc 240
caacctagaa tctggggtcc ctgccaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcac 300
cctcaacatc catcctgtgg aggaggagga tgctgcaacc tattactgtc agcacattag 360
ggagcttaca cgttcggagg ggggaccaag ttggaaatca aacgtaagtc gacgct 416
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSP Forward primer
<400> 17
tttaccttag aacaaaccga ggcac 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSP Reverse primer
<400> 18
tacggaaagg aaagatgacc tgacc 25
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BY Forward primer
<400> 19
ctcagcaaag cacaccagac 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BY Reverse primer
<400> 20
gaactttcaa gcagctgagg c 21

Claims (24)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역은 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 단일클론 항체 또는 폴리클론 항체인 것을 특징으로 하는, 항체.
  6. 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 생산용 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터로 시험관(in vitro) 내 형질전환된 숙주세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 숙주세포는 박테리아 (E.Coli)나 효모 (Yeast)등의 미생물, CHO 세포, F2N 세포, HEK293 세포 및 항체 생산 하이브리도마세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 숙주세포.
  9. 제6항의 발현 벡터를 이용하여 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 생산방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 유효성분으로 포함하는, 정자 성감별용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항체는 포유동물의 Y 염색체 정자에 결합하여 정자 응집 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는, 정자 성감별용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 포유동물은 소, 마우스, 개 및 말로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 정자 성감별용 조성물.
  13. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 유효성분으로 포함하는, 정자 성감별용 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 정자 성감별용 키트.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역은 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR2 및 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정자 성감별용 키트.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 정자 성감별용 키트.
  17. 하기의 단계를 포함하는 포유동물 정자의 성감별 방법:
    a) 수컷 개체로부터 정액을 채취하는 단계;
    b) 상기 정액에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 처리하는 단계; 및
    c) 상기 정액 내 항체와 특이적으로 결합된 정자와 비결합된 정자를 분리하는 단계.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 포유동물은 소, 마우스, 개 및 말로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 단계 c)에서 상기 조성물과 특이적으로 결합된 정자는 Y 염색체 정자이고, 비결합된 정자는 X 염색체 정자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 단계 c)는 유세포 분리기법, 자석 분리기법, 필터 분리법, 팬닝 분리방법, 나노물질을 이용한 분리방법 및 직접 투여기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 하기의 단계를 포함하는 특정 성을 갖는 포유동물의 생산방법:
    a) 수컷 개체로부터 정액을 채취하는 단계;
    b) 상기 정액에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 처리하여 정자의 성을 선별하는 단계;
    c) 상기 선별된 정자를 이용해 수정시키는 단계; 및
    d) 목적하는 성의 산자(産子)를 생산하는 단계.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 포유동물은 소, 마우스, 개 및 말로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 생산방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 선별된 정자를 시험관(in vitro) 내에서 체외 수정시키는 것을 특징으로 하는, 생산방법.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 선별된 정자를 포유동물의 자궁에 직접 주입하여 체내에서 인공 수정시키는 것을 특징으로 하는, 생산방법.
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