TW201718856A - 用於使b型肝炎病毒基因表現沈默之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含靶向B型肝炎病毒(HBV)基因表現之諸如siRNA之治療性核酸的組合物、包含該等治療性核酸中之一或多者(例如組合)的脂質粒子以及遞送及/或投與該等脂質粒子(例如用於治療人類之HBV感染及/或HDV感染)之方法。

Description

用於使B型肝炎病毒基因表現沈默之組合物及方法 相關申請案之交叉參考
本專利申請案主張2015年7月29日申請之美國申請系列案第62/198,526號、2015年8月21日申請之美國申請系列案第62/208,382號、2015年12月18日申請之美國申請系列案第62/269,763號及2016年6月03日申請之美國申請系列案第62/345,379號之優先權權益，該等申請案以引用之方式併入本文。
B型肝炎病毒(縮寫為「HBV」)為肝DNA病毒科之成員。病毒粒子(有時稱為病毒體)包括外部脂質包膜及由蛋白質組成之二十面體核衣殼核心。核衣殼包圍病毒DNA及具有逆轉錄酶活性之DNA聚合酶。外部包膜含有包埋之蛋白質，其參與易感細胞(典型地肝臟之肝細胞)之病毒結合且進入易感細胞。除感染性病毒粒子之外，在感染個體之血清中亦會發現缺少核心之絲狀體及球狀體。此等粒子不具感染性且由形成病毒體之表面的一部分的脂質及蛋白質組成，該脂質及蛋白質稱為表面抗原(HBsAg)，且在病毒之生命週期期間過量產生。
HBV之基因組由環狀DNA構成，但其為反常的，因為DNA不完全為雙股的。全長鏈之一端鍵聯至病毒DNA聚合酶。基因組為3020-3320個核苷酸長(對於全長鏈)及1700-2800個核苷酸長(對於較短鏈)。負義(非編碼)者與病毒mRNA互補。病毒DNA係在細胞感染之後不久在核中發現。存在由基因組編碼之四個已知基因，稱為C、X、P及S。核心蛋白由基因C(HBcAg)編碼，且其起始密碼子前面為產生前核心蛋白之上游框內AUG起始密碼子。HBeAg係藉由蛋白水解加工前核心蛋白而產生。DNA聚合酶由基因P編碼。基因S為編碼表面抗原(HBsAg)之基因。HBsAg基 因為一個長開放閱讀框，但含有三個框內「起始」(ATG)密碼子，其將基因分成三個部分：pre-S1、pre-S2及S。因為存在多個起始密碼子，故產生稱為大、中及小的三種不同尺寸之多肽。由基因X編碼之蛋白質的功能未完全理解，但其與肝癌之發展有關。HBV之複製為複雜過程。雖然複製在肝臟中進行，但病毒擴散至血液，其中病毒蛋白及針對其之抗體存在於已感染之人中。HBV之結構、複製及生物學評述於D.Glebe及C.M.Bremer,Seminars in Liver Disease，第33卷，第2期，第103-112頁(2013)中。
人類感染HBV可引起肝臟之感染性炎性疾病。感染個體可能多年不展現症狀。據估計約三分之一的世界人口已在生命中之一個時刻受到感染，包括3.5億長期攜帶者。
病毒藉由暴露於感染性血液或體液而傳播。圍產期感染亦可為感染之主要途徑。急性疾病引起肝臟炎症、嘔吐、黃疸及可能發生之死亡。慢性B型肝炎可最終引起肝硬化及肝癌。
雖然感染HBV之大多數人通過其免疫系統之作用清除感染，但一些感染之人具有侵襲性感染過程(暴發型肝炎)；而其他為慢性感染，藉此增加其肝病可能性。若干藥物當前經批准用於治療HBV感染，但感染個體以各種成功程度對此等藥物作出反應，且此等藥物中無一者自感染之人中清除病毒。
D型肝炎病毒(HDV)為小環狀的包膜RNA病毒，其僅可在B型肝炎病毒(HBV)存在下繁殖。特定而言，HDV需要HBV表面抗原蛋白來使自身繁殖。與感染單獨HBV相比，感染HBV與HDV兩者導致更嚴重之併發症。此等併發症包括在急性感染中經歷肝衰竭之可能性更大及快速進展至肝硬化，並且在慢性感染中發展肝癌之可能性增加。在所有肝炎感染中D型肝炎與B型肝炎病毒組合具有最高死亡率。HDV之傳播途徑類似於HBV。感染很大程度上受限於處於高HBV感染風險之中的人，特定而言注射藥物用戶及接收凝血因子濃縮物之人。
因此，對用於治療人類之HBV感染以及用於治療人類之HBV/HDV感染之組合物及方法存在繼續需要。
如本文更充分描述，在一個態樣中，本發明提供雙股siRNA分子，其各自包括正義股及與正義股雜交之反義股。本發明之此態樣的siRNA靶向HBV基因組之一或多個基因及/或轉錄物。本發明之此態樣之siRNA分子之實例為闡述於本文之表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子(例如siRNA分子1m-80m中之任一者)。本發明之siRNA分子適用於例如當以治療量向感染HBV或HBV/HDV之人類個體投與時治療HBV感染及/或HDV感染。更一般而言，本發明提供能夠在活體外及活體內抑制HBV基因表現或使HBV基因表現沈默之siRNA分子。
在另一態樣中，本發明提供單股核酸分子，諸如闡述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子之正義及反義股。如本文更充分描述，本發明之siRNA及單股核酸分子經修飾且包括例如一或多個UNA部分及/或一或多個2’O-甲基修飾。
本發明亦提供包括本發明之一或多個siRNA分子(參見例如表A、B、C、D、E及/或F中所描述之siRNA分子)的組合物，諸如醫藥組合物。在一個實施例中，本發明提供包括本發明之兩個不同之siRNA分子(例如選自揭示於本文之表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子的兩個不同之siRNA分子)的組合物。在另一實施例中，本發明提供包括本發明之三個不同之siRNA分子(例如選自揭示於本文之表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子的三個不同之siRNA分子)的組合物。因此，在一個態樣中，本發明提供包括闡述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA的上述二者或三者組合中之一者的組合物(例如醫藥組合物)。在一個態樣中，本發明提供兩個或三個siRNA分子之組合(諸如揭示於實例中之組合)，及包含此類組合之組合物，及此類組合之用途。
本發明亦提供核酸-脂質粒子及其調配物，其中脂質粒子各自包括本文所描述之siRNA中的一或多者(例如摻合物)、陽離子脂質及非陽離子脂質及視情況存在之抑制粒子聚集之結合脂質。可包括在本發明之脂質粒子中之siRNA分子之實例為闡述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子及前述siRNA之組合(例如本文所描述之二者及三者組合)。典型地，siRNA完全封裝於脂質粒子內。本發明之脂質粒子適用於例如將治 療有效量之siRNA遞送至感染HBV或HBV/HDV之人體的細胞(例如肝細胞)中，藉此治療HBV感染及/或HDV感染及/或改善HBV感染及/或HDV感染之一或多種症狀。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含靶向HBV基因表現之siRNA分子中之一者或摻合物及醫藥學上可接受之載劑。舉例而言，本發明提供醫藥組合物，其各自包括闡述於表A、B、C、D、E及/或F中之靶向HBV基因表現之siRNA分子中的一者、兩者或三者。就包括封裝於脂質粒子內之siRNA摻合物的調配物而言，不同siRNA分子可共封裝於同一脂質粒子中，或以摻合物形式存在之各類型之siRNA種類可封裝於其自己之粒子中，或一些siRNA種類可共封裝於同一粒子中，而其他siRNA種類封裝於調配物內之不同粒子中。典型地，本發明之siRNA分子完全封裝於脂質粒子中。
本發明之核酸-脂質粒子適用於向感染HBV或HBV/HDV之人類中預防性或治療性遞送使一或多個HBV基因之表現沈默的siRNA分子，藉此改善人類中HBV感染及/或HDV感染之至少一種症狀。在一些實施例中，本文所描述之siRNA分子中之一或多者係調配至核酸-脂質粒子中，且粒子係向需要此類治療之哺乳動物(例如人類)投與。在某些情況下，可向哺乳動物投與治療有效量之核酸-脂質粒子(例如用於治療人類之HBV及/或HDV感染)。本發明之核酸-脂質粒子尤其適合用於靶向人類中作為大多數HBV基因表現位點之肝細胞。核酸-脂質粒子之投與可藉由諸如以下之此項技術中已知之任何途徑來進行，諸如經口、鼻內、靜脈內、腹膜內、肌肉內、關節內、病灶內、氣管內、皮下或皮內。在特定實施例中，核酸-脂質粒子係全身投與，例如經由經腸或非經腸投藥途徑。
在一些實施例中，HBV基因表現之下調係藉由偵測在核酸-脂質粒子投與之後來自哺乳動物之生物樣品中之HBV RNA或蛋白質含量來測定。在其他實施例中，HBV基因表現之下調係藉由偵測在核酸-脂質粒子投與之後來自哺乳動物之生物樣品中之HBV mRNA或蛋白質含量來測定。在某些實施例中，HBV基因表現之下調係藉由監測在粒子投與之後哺乳動物之與HBV感染相關之症狀來偵測。
在另一實施例中，本發明提供用於將使HBV基因表現沈默之siRNA引入活細胞中的方法，該方法包括使細胞與本發明之核酸-脂質粒子在使siRNA進入細胞且使B型肝炎病毒基因在細胞內之表現沈默的條件下接觸的步驟，其中核酸-脂質粒子包括靶向HBV之siRNA。
在另一實施例中，本發明提供一種用於改善人類中與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀的方法，該方法包括向人類投與治療有效量之本發明之核酸-脂質粒子的步驟。在一些實施例中，本發明此態樣之方法中所用之核酸-脂質粒子包括獨立地選自闡述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA的一個、兩個或三個或更多個不同之siRNA。
在另一實施例中，本發明提供用於使有需要之哺乳動物(例如人類)中之HBV基因表現沈默的方法，其中該等方法各自包括向哺乳動物投與本發明之核酸-脂質粒子的步驟。
在另一態樣中，本發明提供用於治療及/或改善人類中與HBV及/或HDV感染相關之一或多種症狀的方法，其中該等方法各自包括向人類投與治療有效量之本發明之核酸-脂質粒子的步驟。
本發明之某些實施例提供用於藉由向感染HDV之個體投與治療有效量之本發明之抑制HBV表面抗原之合成的一或多種組合物或核酸-粒子來抑制HDV之複製及/或改善HDV感染之一或多種症狀的組合物及方法。
在另一態樣中，本發明提供用於抑制有需要之哺乳動物(例如感染HBV或HBV/HDV之人類)中之HBV表現的方法，其中該等方法各自包括向哺乳動物投與治療有效量之本發明之核酸-脂質粒子的步驟。
在另一態樣中，本發明提供用於治療人類之HBV及/或HDV感染的方法，其中該等方法各自包括向人類投與治療有效量之本發明之核酸-脂質粒子的步驟。
在另一態樣中，本發明提供本發明之siRNA分子的用途，其用於抑制B型肝炎病毒基因在活細胞中之表現。
在另一態樣中，本發明提供本發明之醫藥組合物的用途，其 用於抑制B型肝炎病毒基因在活細胞中之表現。
本發明之組合物(例如siRNA分子及其正義及反義股及核酸-脂質粒子)亦適用於例如對抑制一或多個HBV基因及/或轉錄物之表現的生物分析(例如活體內或活體外分析)，以研究HBV及/或HDV複製及生物學，及/或研究或調節一或多個HBV基因或轉錄物的功能。舉例而言，本發明之siRNA分子可使用生物分析進行篩選，以鑑別抑制HBV及/或HDV之複製且為用於治療人類之HBV及/或HDV感染及/或改善人類中與HBV及/或HDV感染相關之至少一種症狀的候選治療劑的siRNA分子。
由以下實施方式及任何圖來看，本發明之其他目標、特徵及優點對本領域技術人員來說將顯而易見。
引言
本文所描述之siRNA藥物治療有利地提供用於治療人類之HBV及/或HDV感染及與其相關之症狀的重要的新組合物及方法。本發明之實施例可例如每天一次、每週一次或每幾週一次(例如每兩週、三週、四週、五週或六週一次)進行投與。
此外，本文所描述之核酸-脂質粒子使諸如siRNA之核酸藥物能夠有效遞送至體內之靶組織及細胞中。脂質粒子之存在產生防止在血流中核酸酶降解之保護作用，允許在靶組織中優先累積且提供藥物進入細胞質之手段，在細胞質中siRNA可執行其RNA干擾之預期功能。
定義
除非另外指示，否則如本文所用，以下術語具有歸屬於其之含義。
術語「B型肝炎病毒」(縮寫為HBV)係指正肝DNA病毒(orthohepadnavirus)屬之病毒種類，其為肝DNA病毒(hepadnaviridae)科病毒之一部分，且其能夠在人類中引起肝臟炎症。
術語「D型肝炎病毒」(縮寫為HDV)係指代爾塔病毒屬 (deltaviridae)之病毒種類，其能夠在人類中引起肝臟炎症。
如本文所用之術語「小-干擾RNA」或「siRNA」係指當siRNA與靶基因或序列在相同細胞中時能夠降低或抑制靶基因或序列之表現(例如藉由調節與siRNA序列互補之mRNA降解或抑制其轉譯)的雙股RNA(亦即雙螺旋RNA)。siRNA可與靶基因或序列具有實質或完全一致性，或可包含錯配之區域(亦即錯配基元)。在某些實施例中，siRNA之長度可為約19-25個(雙螺旋)核苷酸，且長度較佳為約20-24、21-22或21-23個(雙螺旋)核苷酸。siRNA雙螺旋可包含具有約1至約4個核苷酸或約2至約3個核苷酸之3’突出物及5’磷酸酯末端。siRNA之實例包括但不限於由兩個單獨股分子組裝之雙股聚核苷酸分子，其中一股為正義股且另一股為互補反義股。
較佳地，siRNA為化學合成的。siRNA亦可藉由在大腸桿菌(E.coli)RNA酶III或Dicer存在之較長dsRNA(例如長度大於約25個核苷酸之dsRNA)之裂解而產生。此等酶將dsRNA加工成生物活性siRNA(參見例如Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99：9942-9947(2002)；Calegari等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99：14236(2002)；Byrom等人，Ambion TechNotes,10(1)：4-6(2003)；Kawasaki等人，Nucleic Acids Res.,31：981-987(2003)；Knight等人，Science,293：2269-2271(2001)；及Robertson等人，J.Biol.Chem.,243：82(1968))。較佳地，dsRNA之長度為至少50個核苷酸至約100、200、300、400或500個核苷酸。dsRNA之長度可為長達1000、1500、2000、5000個核苷酸，或更長。dsRNA可編碼用於整個基因轉錄物或部分基因轉錄物。在某些情況下，siRNA可由質體編碼(例如轉錄為自動摺疊至具有髮夾環之雙螺旋中的序列)。
片語「抑制靶基因之表現」係指本發明之siRNA使靶基因(例如HBV基因組內之基因)之表現沈默、降低或抑制靶基因(例如HBV基因組內之基因)之表現的能力。為檢驗基因沈默之程度，使測試樣品(例如來自表現靶基因之所關注之有機體的生物樣品或表現靶基因之培養物中之細胞的樣品)與使靶基因之表現沈默、降低或抑制靶基因之表現的siRNA接觸。將靶基因在測試樣品中之表現與靶基因在不與siRNA接觸之對照樣品(例如來自表現靶基因之所關注之有機體的生物樣品或表現靶基因之培養物中之細 胞的樣品)中之表現相比較。對照樣品(例如表現靶基因之樣品)可分配100%之值。在特定實施例中，使靶基因之表現沈默、抑制或降低靶基因之表現係在測試樣品相對於對照樣品(例如僅緩衝液、靶向不同基因之siRNA序列、錯義siRNA序列等)之值為約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或0%時達成。適合之分析包括但不限於使用熟習此項技術者已知之技術檢驗蛋白質或mRNA含量，諸如熟習此項技術者已知之斑點墨點(dot blot)、北方墨點(Northern blot)、原位雜交、ELISA、免疫沈澱、酶功能以及表型分析。諸如siRNA之治療性核酸的「有效量」或「治療有效量」為足以產生所要效應，例如與在不存在siRNA之情況下所偵測到之正常表現水準相比抑制靶序列之表現的量。在特定實施例中，抑制靶基因或靶序列之表現係在存在siRNA之情況下所獲得之值相對於對照(例如僅緩衝液、靶向不同基因之siRNA序列、錯義siRNA序列等)為約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或0%時達成。適合用於量測靶基因或靶序列之表現的分析包括但不限於使用熟習此項技術者已知之技術檢驗蛋白質或mRNA含量，諸如熟習此項技術者已知之斑點墨點、北方墨點、原位雜交、ELISA、免疫沈澱、酶功能以及表型分析。
如本文所用之術語「核酸」係指含有呈單股或雙股形式之至少兩個核苷酸(亦即脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物且包括DNA及RNA。「核苷酸」含有脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、鹼基及磷酸基。核苷酸通過磷酸基鍵聯在一起。「鹼基」包括嘌呤及嘧啶，其進一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷以及嘌呤及嘧啶之天然類似物及合成衍生物，其包括但不限於放置諸如但不限於胺、醇、硫醇、羧酸酯及鹵代烷之新反應基團的修飾形式。核酸包括含有已知核苷酸類似物或經修飾骨架殘基或鍵聯的核酸，其為合成、天然存在及非天然 存在的，且其與參考核酸具有類似結合特性。此類類似物及/或經修飾殘基之實例包括但不限於硫代磷酸酯、磷醯胺酯、膦酸甲酯、對掌性-膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸及肽-核酸(PNA)。另外，核酸可包括一或多個UNA部分。
術語「核酸」包括任何寡核苷酸或聚核苷酸，其中含有至多60個核苷酸之片段通常稱為寡核苷酸，且更長之片段稱為聚核苷酸。脫氧核糖寡核苷酸由稱為脫氧核糖之5-碳糖在此糖之5'及3'碳處共價連接至磷酸酯以形成交替、不分枝聚合物而組成。DNA可呈例如反義分子、質體DNA、預縮合DNA、PCR產物、載體、表現盒、嵌合序列、染色體DNA或此等群之衍生物及組合的形式。核糖寡核苷酸由類似重複結構組成，其中5-碳糖為核糖。RNA可呈例如小干擾RNA(siRNA)、Dicer-受質dsRNA、小髮夾RNA(shRNA)、不對稱干擾RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)及其組合之形式。因此，在本發明之上下文中，術語「聚核苷酸」及「寡核苷酸」係指由天然存在之鹼基、糖及糖間(骨架)鍵聯組成的核苷酸或核苷單體之聚合物或寡聚物。術語「聚核苷酸」及「寡核苷酸」亦包括包含非天然存在之單體的聚合物或寡聚物或其類似地起作用之部分。此類經修飾或經取代之寡核苷酸因為諸如增強之細胞吸收、降低之免疫原性及增加之在核酸酶存在下之穩定性的特性而常常優於天然形式。
除非另外指示，否則特定核酸序列無疑亦涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、等位基因、異種同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定而言，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res.,19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.,260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes,8：91-98(1994))。
本發明涵蓋分離或實質上純化之核酸分子及含有彼等分子之組合物。在本發明之上下文中，「分離」或「純化」之DNA分子或RNA分子為離開天然環境而存在之DNA分子或RNA分子。分離之DNA分子 或RNA分子可以純化形式存在或可存在於諸如轉基因宿主細胞之非天然環境中。舉例而言，「分離」或「純化」之核酸分子或其生物活性部分實質上不含其他細胞物質，或當藉由重組技術產生時實質上不含培養基，或當化學合成時實質上不含化學前驅體或其他化學品。在一個實施例中，「分離」之核酸不含在衍生核酸之有機體之基因組DNA中天然地側接核酸的序列(亦即位於核酸之5'及3'末端的序列)。舉例而言，在多個實施例中，分離之核酸分子可含有小於約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在衍生核酸之細胞的基因組DNA中天然地側接核酸分子之核苷酸序列。
術語「基因」係指包含為製備多肽或前驅體多肽所必需之部分長度或整個長度編碼序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。
如本文所用，「基因產物」係指基因之產物，諸如RNA轉錄物或多肽。
術語「解鎖核鹼基類似物」(縮寫為「UNA」)係指核糖環之C2'及C3'原子未共價鍵聯的非環形核鹼基。術語「解鎖核鹼基類似物」包括具有以下標識為結構A之結構的核鹼基類似物：
其中R為羥基，且鹼基為任何天然或非天然鹼基，諸如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)及胸腺嘧啶(T)。適合用於實踐本發明之UNA包括在美國專利序列號8,314,227中識別為非環形2'-3'-斷裂-核苷酸單體之分子，該專利以全文引用之方式併入本文中。
術語「脂質」係指包括但不限於脂肪酸之酯且特徵為不溶於水但可溶於許多有機溶劑的有機化合物之群。其通常分成至少三個類別：(1)「簡單脂質」，其包括脂肪及油以及蠟；(2)「複合脂質」，其包括磷脂及醣脂；及(3)「衍生脂質」，諸如類固醇。
術語「脂質粒子」包括可用於將治療性核酸(例如siRNA)遞 送至所關注之靶位點(例如細胞、組織、器官及類似物)之脂質調配物。在較佳實施例中，本發明之脂質粒子典型地由陽離子脂質、非陽離子脂質及視情況存在之防止粒子聚集之結合脂質形成。包括核酸分子(例如siRNA分子)之脂質粒子稱為核酸-脂質粒子。典型地，核酸完全地封裝於脂質粒子內，藉此使核酸不發生酶降解。
在某些情況下，核酸-脂質粒子極其適合用於全身性施加，因為其可在靜脈內(i.v.)注射之後展現延長之循環壽命，其可在遠端位點(例如與投與位點物理分離之位點)累積，且其可介導在此等遠端位點處靶基因表現之沈默。核酸可如PCT公開案第WO 00/03683號中所闡述與縮合劑複合且封裝於脂質粒子內，該公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
本發明之脂質粒子典型地具有約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm、約70nm至約100nm、約80nm至約100nm、約90nm至約100nm、約70至約90nm、約80nm至約90nm、約70nm至約80nm或約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm之平均直徑，且為實質上無毒的。此外，當存在於本發明之脂質粒子中時，核酸在水溶液中對在核酸酶存在之降解具耐性。核酸-脂質粒子及其製備方法揭示於例如美國專利公開案第20040142025號及第20070042031號中，該等專利公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，「脂質封裝的」可指在完全囊封、部分囊封或兩者之情況下提供諸如siRNA之治療性核酸的脂質粒子。在一較佳實施例中，核酸(例如siRNA)完全封裝於脂質粒子中(例如以形成核酸-脂質粒子)。
術語「脂質結合物」係指抑制脂質粒子聚集之結合脂質。此類脂質結合物包括但不限於PEG-脂質結合物，諸如偶合至二烷氧基丙基之PEG(例如PEG-DAA結合物)、偶合至二醯基甘油之PEG(例如PEG-DAG結合物)、偶合至膽固醇之PEG、偶合至磷脂醯乙醇胺之PEG及結合至神經 醯胺之PEG(參見例如美國專利第5,885,613號)、陽離子PEG脂質；聚噁唑啉(POZ)-脂質結合物(例如POZ-DAA結合物)；聚醯胺寡聚物(例如ATTA-脂質結合物)；及其混合物。POZ-脂質結合物之其他實例描述於PCT公開案第WO 2010/006282號中。PEG或POZ可直接結合至脂質或可經由連接子部分鍵聯至脂質。可使用適合用於使PEG或POZ偶合至脂質之任何連接子部分，包括例如不含酯連接子部分及含酯連接子部分。在某些較佳實施例中，使用不含酯連接子部分，諸如醯胺或胺基甲酸酯。
術語「兩親性脂質」部分地指任何適合之物質，其中脂質材料之疏水性部分定向至疏水相中，而親水性部分朝向水相定向。親水性特徵係因存在諸如以下之極性或帶電荷基團而產生：碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根合(sulfato)、胺基、硫氫基、硝基、羥基及其他類似基團。疏水性可藉由包括非極性基團而產生，該等非極性基團包括但不限於長鏈飽和及不飽和脂肪烴基團及經一或多個芳族、環脂族或雜環基團取代之此類基團。兩親性化合物之實例包括但不限於磷脂、胺基脂及鞘脂。
磷脂之代表性實例包括但不限於磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼及二亞油醯基磷脂醯膽鹼。缺乏磷之其他化合物(諸如鞘脂、糖鞘脂家族、二醯基甘油及β-醯氧基酸)亦在命名為兩親性脂質之群內。另外，上文所描述之兩親性脂質可與包括三酸甘油酯及固醇之其他脂質混合。
術語「中性脂類」係指在所選pH值下以不帶電荷或中性兩性離子形式存在之許多脂質種類中之任一者。在生理pH值下，此類脂質包括例如二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺、鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂及二醯基甘油。
術語「非陽離子脂質」係指任何兩親性脂質以及任何其他中性脂類或陰離子脂質。
術語「陰離子脂質」係指在生理pH值下帶負電荷之任何脂質。此等脂質包括但不限於磷脂醯甘油、心磷脂、二醯基磷脂醯絲胺酸、 二醯基磷脂酸、N-十二醯基磷脂醯乙醇胺、N-丁二醯基磷脂醯乙醇胺、N-戊二醯基磷脂醯乙醇胺、離胺醯基磷脂醯甘油、棕櫚醯基油醯基磷脂醯甘油(POPG)及連接至中性脂質之其他陰離子修飾基團。
術語「疏水性脂質」係指具有非極性基團之化合物，該等非極性基團包括但不限於長鏈飽和及不飽和脂肪烴基及視情況經一或多個芳族、環脂族或雜環基團取代之此類基團。適合之實例包括但不限於二醯基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基胺基、1,2-二醯氧基-3-胺基丙烷及1,2-二烷基-3-胺基丙烷。
術語「陽離子脂質」及「胺基脂質」在本文中可互換地用於包括具有一個、兩個、三個或更多個脂肪酸或脂肪烷基鏈及pH可滴定胺基頭部基團(例如烷基胺基或二烷基胺基頭部基團)之彼等脂質及其鹽。陽離子脂質典型地在低於陽離子脂質之pKa的pH值下經質子化(亦即帶正電荷)且在高於pKa之pH值下實質上為中性的。本發明之陽離子脂質亦可稱為可滴定陽離子脂質。在一些實施例中，陽離子脂質包含：可質子化三級胺(例如pH可滴定)頭部基團；C18烷基鏈，其中各烷基鏈獨立地具有0至3(例如0、1、2或3)個雙鍵；及頭部基團與烷基鏈之間的醚、酯或縮酮鍵聯。此類陽離子脂質包括但不限於DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA(亦稱為DLin-C2K-DMA、XTC2及C2K)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA(亦稱為MC2)，及DLin-M-C3-DMA(亦稱為MC3)。
術語「鹽」包括任何陰離子及陽離子複合物，諸如陽離子脂質與一或多個陰離子之間形成的複合物。陰離子之非限制性實例包括無機及有機陰離子，例如氫離子、氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、草酸根(例如半草酸根)、磷酸根、膦酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、氧離子、碳酸根、碳酸氫根、硝酸根、亞硝酸根、氮離子、亞硫酸氫根、硫離子、亞硫酸根、硫酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氫根、硼酸根、甲酸根、乙酸根、苯甲酸根、檸檬酸根、酒石酸根、乳酸根、丙烯酸根、聚丙烯酸根、反丁烯二酸根、順丁烯二酸根、衣康酸根、羥乙酸根、葡糖酸根、蘋果酸根、 扁桃酸根、惕各酸根、抗壞血酸根、水楊酸根、聚甲基丙烯酸根、過氯酸根、氯酸根、亞氯酸根、次氯酸根、溴酸根、次溴酸根、碘酸根、烷基磺酸根、芳基磺酸根、砷酸根、亞砷酸根、鉻酸根、重鉻酸根、氰離子、氰酸根、硫氰酸根、氫氧根、過氧離子、高錳酸根及其混合物。在特定實施例中，本文所揭示之陽離子脂質的鹽為結晶鹽。
術語「烷基」包括含有1至24個碳原子之直鏈或分枝鏈、非環狀或環狀、飽和脂族烴。代表性飽和直鏈烷基包括但不限於甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基及類似物，而飽和分枝鏈烷基包括但不限於異丙基、第二丁基、異丁基、第三丁基、異戊基及類似物。代表性飽和環狀烷基包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基及類似物，而不飽和環狀烷基包括但不限於環戊烯基、環己烯基及類似物。
術語「烯基」包括相鄰碳原子之間含有至少一個雙鍵的如上文所定義之烷基。烯基包括順式與反式異構體。代表性直鏈及分枝鏈烯基包括但不限於乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基及類似物。
術語「炔基」包括相鄰雙鍵之間另外含有至少一個三鍵的如上文所定義之任何烷基或烯基。代表性直鏈及分枝鏈炔基包括但不限於乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1丁炔基及類似物。
術語「醯基」包括連接點處之碳經如以下所定義之側氧基取代的任何烷基、烯基或炔基。以下為醯基之非限制性實例：-C(=O)烷基、-C(=O)烯基及-C(=O)炔基。
術語「雜環」包括5員至7員單環或7員至10員雙環雜環，其為飽和、不飽和或芳族的，且其含有1或2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子，且其中氮及硫雜原子可視情況經氧化，且氮雜原子可視情況經季銨化；包括以上雜環中之任一者融合至苯環之雙環。雜環可經由任何雜原子或碳原子連接。雜環包括但不限於如以下所定義之雜芳基，以及嗎啉基、吡咯啶酮基、吡咯啶基、哌啶基、哌嗪基、乙內醯脲基、戊內醯胺基、環 氧乙烷基、氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻喃基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻喃基及類似物。
術語「視情況經取代之烷基」、「視情況經取代之烯基」、「視情況經取代之炔基」、「視情況經取代之醯基」及「視情況經取代之雜環」意謂當取代時，至少一個氫原子經取代基置換。在側氧基取代基(=O)之情況下，兩個氫原子經置換。在此方面，取代基包括但不限於側氧基、鹵素、雜環、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx及-SOnNRxRy，其中n為0、1或2，Rx及Ry相同或不同且獨立地為氫、烷基或雜環，且烷基及雜環取代基各自可進一步經以下中之一或多者取代：側氧基、鹵素、-OH、-CN、烷基、-ORx、雜環、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx及-SOnNRxRy。術語「視情況經取代」當在一系列取代基之前使用時，意謂該系列中之取代基各自可如本文所描述視情況經取代。
術語「鹵素」包括氟、氯、溴及碘。
術語「融合性」係指脂質粒子與細胞之膜融合的能力。膜可為圍繞細胞器(例如內體、核等)之質膜。
如本文所用，術語「水溶液」係指完全或部分地包含水之組合物。
如本文所用，術語「有機脂質溶液」係指完全或部分地包含具有脂質之有機溶劑的組合物。
術語「電子緻密核心」當用於描述本發明之脂質粒子時係指當使用冷凍透射電子顯微術(「cyroTEM」)目視觀察時脂質粒子內部部分之深色外觀。本發明之一些脂質粒子具有電子緻密核心且缺少脂質雙層結構。本發明之一些脂質粒子具有電子緻密核心，缺少脂質雙層結構，且具有倒六角或立方相結構。雖然不希望受理論約束，但認為非雙層脂質填充提供內部具有水及核酸之脂質圓柱體3維網路，亦即，基本上為由於含有核酸之水性通道而滲透的脂質小滴。
如本文所用之「遠端位點」係指物理上分開之位點，其不限 於相鄰毛細血管床，但包括廣泛地分佈於整個有機體中之位點。
關於核酸-脂質粒子之「血清-穩定」意謂粒子在暴露於將顯著降解游離DNA或RNA之血清或核酸酶分析之後不顯著降解。適合之分析包括例如標準血清分析、DNA酶分析或RNA酶分析。
如本文所用之「全身遞送」係指在有機體內產生諸如siRNA之活性劑的廣泛生物分佈的脂質粒子遞送。一些投與技術可產生某些藥劑之全身遞送，而其他投與技術則不如此。全身遞送意謂使適用、較佳治療量之藥劑暴露於身體之大多數部分。為獲得廣泛生物分佈，通常需要使得藥劑在到達投與位點遠端之疾病位點之前不快速降解或清除(諸如藉由第一道器官(肝臟、肺臟等)或藉由快速、非特異性細胞結合)的血液壽命。脂質粒子之全身遞送可藉由此項技術中已知之包括例如靜脈內、皮下及腹膜內之任何手段來進行。在一較佳實施例中，脂質粒子之全身遞送係藉由靜脈內遞送來進行。
如本文所用之「局部遞送」係指將諸如siRNA之活性劑直接遞送至有機體內之靶位點。舉例而言，可藉由直接注射至疾病位點、其他靶位點或靶器官(諸如肝臟、心臟、胰腺、腎臟及類似器官)中而局部遞送藥劑。
如本文所用，術語「病毒粒子加載量」係指存在於人體流體(諸如血液)中之病毒粒子(例如HBV及/或HDV)的數目的度量。舉例而言，粒子加載量可以每毫升例如血液之病毒粒子之數目來表示。粒子加載量測試可使用基於核酸擴增之測試以及不基於核酸之測試來執行(參見例如Puren等人，The Journal of Infectious Diseases,201：S27-36(2010))。
術語「哺乳動物」係指任何哺乳動物種類，諸如人類、小鼠、大鼠、狗、貓、倉鼠、豚鼠、兔、家畜及類似哺乳動物。
某些實施例之描述
本發明提供靶向一或多個HBV基因之表現的siRNA分子、包含該等siRNA中之一或多者(例如摻合物)的核酸-脂質粒子及遞送及/或投與核酸-脂質粒子(例如用於治療人類之HBV及/或HDV感染)之方法。
在一個態樣中，本發明提供靶向一或多個HBV基因之表現 的siRNA分子。在某些情況下，本發明提供包含靶向HBV基因組之不同區域之siRNA的組合(例如摻合物、彙集物或混合物)的組合物。在某些情況下，本發明之siRNA分子能夠抑制HBV及/或HDV活體外或活體內之複製。
在特定實施例中，本發明提供表A、B、C、D、E及/或F中所示之siRNA分子。如表A、B、C、D、E及/或F中所示，siRNA分子可包含具有2'-O-甲基修飾及/或一或多個UNA部分之一或多個核糖核苷酸。
表A、B、C、D、E及/或F中所示之此等正義及反義股適用於例如製備適用於降低一或多個HBV基因在活體內或活體外之表現的siRNA分子。此等正義及反義股亦適合用作例如用於鑑別及量測生物材料(諸如來自感染HBV或HBV/HDV之人類的組織或血液樣品)中HBV基因組之量的雜交探針。
在特定實施例中，本發明之寡核苷酸(諸如闡述於表A、B、C、D、E及/或F中之正義及反義RNA股)與靶聚核苷酸序列特異性雜交或與其互補。如本文所用之術語「可特異性雜交」及「互補」指示足以使得DNA或RNA靶與寡核苷酸之間發生穩定及特異性結合之互補程度。應瞭解，寡核苷酸不需要與其可特異性雜交之靶核酸序列100%互補。在較佳實施例中，當寡核苷酸結合至靶序列妨礙靶序列之正常功能以使得其功效或表現損失，且存在足以避免在需要特異性結合之條件下，亦即在活體內分析或治療性治療之情況下在生理條件下，或在活體外分析之情況下在進行分析之條件下寡核苷酸非特異性結合至非靶序列的互補程度時，寡核苷酸可特異性雜交。因此，寡核苷酸與其靶向或與其特異性雜交之基因或mRNA序列之區域相比可包括1、2、3個或更多個鹼基取代。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之siRNA中之一或多者(例如摻合物)及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，本文所描述之組合物包含一或多個siRNA分子，該一或多個siRNA分子使B型肝炎病毒基因之表現沈默。
在另一態樣中，本發明提供一種靶向HBV基因表現之核酸-脂質粒子。核酸-脂質粒子典型地包含本文所描述(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述)之雙股siRNA分子中之一或多者(例如摻合物)、陽離子 脂質及非陽離子脂質。在某些情況下，核酸-脂質粒子進一步包含抑制粒子聚集之結合脂質。較佳地，核酸-脂質粒子包含本文所描述之雙股siRNA分子中之一或多者(例如摻合物)、陽離子脂質、非陽離子脂質及抑制粒子聚集之結合脂質。
在某些實施例中，核酸-脂質粒子包含兩個不同之雙股siRNA分子。
在某些實施例中，核酸-脂質粒子包含三個不同之雙股siRNA分子。
在一些實施例中，本發明之siRNA完全封裝於核酸-脂質粒子中。就包含siRNA摻合物之調配物而言，存在於摻合物中之不同類型之siRNA種類(例如具有不同序列之siRNA化合物)可共封裝於同一粒子中，或存在於摻合物中之各類型之siRNA種類可封裝於分開之粒子中。siRNA摻合物可以相同、類似或不同濃度或莫耳比使用兩個、三個或更多個個別siRNA(各自具有獨特序列)之混合物在本文所描述之粒子中加以調配。在一個實施例中，siRNA之摻合物(對應於具有不同序列之複數個siRNA)係使用相同、類似或不同濃度或莫耳比之各siRNA種類加以調配，且不同類型之siRNA共封裝於同一粒子中。在另一實施例中，存在於摻合物中之各類型之siRNA種類以相同、類似或不同siRNA濃度或莫耳比封裝於不同粒子中，且因此形成之粒子(各含有不同之siRNA有效負荷)係分開投與(例如根據治療方案在不同時間)，或作為單一單元劑量(例如與醫藥學上可接受之載劑一起)組合並一起投與。本文所描述之粒子係血清-穩定的，對核酸酶降解具耐性，且對諸如人類之哺乳動物為實質上無毒的。
本發明之核酸-脂質粒子中之陽離子脂質可包含例如本文所描述之式I-III之一或多種陽離子脂質或任何其他陽離子脂質種類。在一個實施例中，陽離子脂質為二烷基脂質。在另一實施例中，陽離子脂質為三烷基脂質。在一個特定實施例中，陽離子脂質係選自由以下組成之群：1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15))、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧戊 環(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)、二亞油基甲基-3-二甲胺基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA)、4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-M-C3-DMA；化合物(7))、其鹽及其混合物。
在另一特定實施例中，陽離子脂質係選自由以下組成之群：1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15))、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(DLin-MP-DMA；化合物(8))、4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯)(化合物(7))、5-(二甲胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))、其鹽或其混合物。
在某些實施例中，陽離子脂質佔存在於粒子中之總脂質的約48mol%至約62mol%。
本發明之核酸-脂質粒子中之非陽離子脂質可包含例如一或多種陰離子脂質及/或中性脂質。在一些實施例中，非陽離子脂質包含以下中性脂質組分中之一者：(1)磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物；(2)膽固醇或其衍生物；或(3)磷脂。在某些較佳實施例中，磷脂包含二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)或其混合物。在一較佳實施例中，非陽離子脂質為DPPC與膽固醇之混合物。在一較佳實施例中，非陽離子脂質為DSPC與膽固醇之混合物。
在某些實施例中，非陽離子脂質包含磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其中磷脂佔存在於粒子中之總脂質的約7mol%至約17mol%，且膽固醇或其衍生物佔存在於粒子中之總脂質的約25mol%至約40mol%。
本發明之核酸-脂質粒子中之脂質結合物抑制粒子聚集且可包含例如本文所描述之脂質結合物中之一或多者。在一個特定實施例中，脂質結合物包含PEG-脂質結合物。PEG-脂質結合物之實例包括但不限於PEG-DAG結合物、PEG-DAA結合物及其混合物。在某些實施例中，PEG- 脂質結合物係選自由以下組成之群：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-神經醯胺(PEG-Cer)結合物及其混合物。在某些實施例中，PEG-脂質結合物為PEG-DAA結合物。在某些實施例中，脂質粒子中之PEG-DAA結合物可包含PEG-二癸氧基丙基(C10)結合物、PEG-二月桂基氧基丙基(C12)結合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)結合物、PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16)結合物、PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)結合物或其混合物。在某些實施例中，其中PEG-DAA結合物為PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)結合物。在另一實施例中，PEG-DAA結合物為化合物(66)(PEG-C-DMA)結合物。在另一實施例中，脂質結合物包含POZ-脂質結合物，諸如POZ-DAA結合物。
在某些實施例中，抑制粒子聚集之結合脂質佔存在於粒子中之總脂質的約0.5mol%至約3mol%。
在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1之總脂質：siRNA質量比。
在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約30nm至約150nm之中值直徑。
在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有電子緻密核心。
在一些實施例中，本發明提供核酸-脂質粒子，其包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約50mol%至約85mol%的一或多種陽離子脂質或其鹽；(c)佔存在於粒子中之總脂質的約13mol%至約49.5mol%的一或多種非陽離子脂質；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約0.5mol%至約2mol%的一或多種抑制粒子聚集之結合脂質。
在此實施例之一個態樣中，核酸-脂質粒子包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約52mol%至約62mol%的陽離子脂質或其鹽；(c)佔存在於粒子中之總脂質的約36mol%至約47mol%的磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約1mol%至約2mol%的PEG-脂質結合物。在一個特定實施例中，調配物為四組分系 統，其包含約1.4mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約57.1mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約7.1mol% DPPC(或DSPC)及約34.3mol%膽固醇(或其衍生物)。
在此實施例之另一態樣中，核酸-脂質粒子包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約56.5mol%至約66.5mol%的陽離子脂質或其鹽；(c)佔存在於粒子中之總脂質的約31.5mol%至約42.5mol%的膽固醇或其衍生物；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約1mol%至約2mol%的PEG-脂質結合物。在一個特定實施例中，調配物為三組分系統，其不含磷脂且包含約1.5mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約61.5mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽及約36.9mol%膽固醇(或其衍生物)。
其他調配物描述於PCT公開案第WO 09/127060號及已公開之美國專利申請公開案第US 2011/0071208 A1號中，該等公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在其他實施例中，本發明提供核酸-脂質粒子，其包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約2mol%至約50mol%的一或多種陽離子脂質或其鹽；(c)佔存在於粒子中之總脂質的約5mol%至約90mol%的一或多種非陽離子脂質；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約0.5mol%至約20mol%的一或多種抑制粒子聚集之結合脂質。
在此實施例之一個態樣中，核酸-脂質粒子包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約30mol%至約50mol%的陽離子脂質或其鹽；(c)佔存在於粒子中之總脂質的約47mol%至約69mol%的磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約1mol%至約3mol%的PEG-脂質結合物。在一個特定實施例中，調配物為四組分系統，其包含約2mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約40mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約10mol% DPPC(或DSPC)及 約48mol%膽固醇(或其衍生物)。
在其他實施例中，本發明提供核酸-脂質粒子，其包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約50mol%至約65mol%的一或多種陽離子脂質或其鹽；(c)佔存在於粒子中之總脂質的約25mol%至約45mol%的一或多種非陽離子脂質；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約5mol%至約10mol%的一或多種抑制粒子聚集之結合脂質。
在此實施例之一個態樣中，核酸-脂質粒子包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約50mol%至約60mol%的陽離子脂質或其鹽；(c)佔存在於粒子中之總脂質的約35mol%至約45mol%的磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約5mol%至約10mol%的PEG-脂質結合物。在某些情況下，調配物中之非陽離子脂質混合物包含：(i)佔存在於粒子中之總脂質的約5mol%至約10mol%的磷脂；及(ii)佔存在於粒子中之總脂質的約25mol%至約35mol%的膽固醇或其衍生物。在一個特定實施例中，調配物為四組分系統，其包含約7mol% PEG-脂質結合物(例如PEG750-C-DMA)、約54mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約7mol% DPPC(或DSPC)及約32mol%膽固醇(或其衍生物)。
在此實施例之另一態樣中，核酸-脂質粒子包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約55mol%至約65mol%的陽離子脂質或其鹽；(c)佔存在於粒子中之總脂質的約30mol%至約40mol%的膽固醇或其衍生物；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約5mol%至約10mol%的PEG-脂質結合物。在一個特定實施例中，調配物為三組分系統，其不含磷脂且包含約7mol% PEG-脂質結合物(例如PEG750-C-DMA)、約58mol%陽離子脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽及約35mol%膽固醇(或其衍生物)。
適用調配物之其他實施例描述於已公開之美國專利申請公開案第US 2011/0076335 A1號中，該公開案之揭示內容出於所有目的以全 文引用之方式併入本文中。
在本發明之某些實施例中，核酸-脂質粒子包含：(a)本文所描述(例如參見表A、B、C、D、E及/或F)之一或多個(例如摻合物)siRNA分子；(b)佔存在於粒子中之總脂質的約48mol%至約62mol%的陽離子脂質或其鹽；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其中磷脂佔存在於粒子中之總脂質的約7mol%至約17mol%，且其中膽固醇或其衍生物佔存在於粒子中之總脂質的約25mol%至約40mol%；及(d)佔存在於粒子中之總脂質的約0.5mol%至約3.0mol%的PEG-脂質結合物。本發明之此態樣的示例性脂質調配物A-Z包括在下文中。
示例性脂質調配物A包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.2%)、陽離子脂質(53.2%)、磷脂(9.3%)、膽固醇(36.4%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(1.2%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(53.2%)，磷脂為DPPC(9.3%)，且膽固醇以36.4%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物A之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物A之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物A之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物B，其包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(0.8%)、陽離子脂質(59.7%)、磷脂(14.2%)、膽 固醇(25.3%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(0.8%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(59.7%)，磷脂為DSPC(14.2%)，且膽固醇以25.3%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物B之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物B之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物B之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物C包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.9%)、陽離子脂質(52.5%)、磷脂(14.8%)、膽固醇(30.8%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(1.9%)，陽離子脂質為1,2-二-γ-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15))(52.5%)，磷脂為DSPC(14.8%)，且膽固醇以30.8%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物C之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物C之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物C之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。 在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物D包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(0.7%)、陽離子脂質(60.3%)、磷脂(8.4%)、膽固醇(30.5%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(0.7%)，陽離子脂質為3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(DLin-MP-DMA；化合物(8)(60.3%)，磷脂為DSPC(8.4%)，且膽固醇以30.5%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物D之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物D之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物D之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物E包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.8%)、陽離子脂質(52.1%)、磷脂(7.5%)、膽固醇(38.5%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化 合物(66))(1.8%)，陽離子脂質為4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯)(化合物(7))(52.1%)，磷脂為DPPC(7.5%)，且膽固醇以38.5%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物E之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物E之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物E之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性調配物F包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(0.9%)，陽離子脂質(57.1%)、磷脂(8.1%)、膽固醇(33.8%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(0.9%)，陽離子脂質為1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15))(57.1%)，磷脂為DSPC(8.1%)，且膽固醇以33.8%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物F之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物F之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物F之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、 10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物G包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.7%)、陽離子脂質(61.6%)、磷脂(11.2%)、膽固醇(25.5%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(1.7%)，陽離子脂質為1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15))(61.6%)，磷脂為DPPC(11.2%)，且膽固醇以25.5%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物G之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物G之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物G之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物H包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.1%)、陽離子脂質(55.0%)、磷脂(11.0%)、膽固醇(33.0%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(1.1%)，陽離子脂質為5-(二甲胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯 基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(55.0%)，磷脂為DSPC(11.0%)，且膽固醇以33.0%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物H之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物H之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物H之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物I包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(2.6%)、陽離子脂質(53.1%)、磷脂(9.4%)、膽固醇(35.0%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(2.6%)，陽離子脂質為5-(二甲胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(53.1%)，磷脂為DSPC(9.4%)，且膽固醇以35.0%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物I之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物I之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物I之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有 約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物J包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(0.6%)、陽離子脂質(59.4%)、磷脂(10.2%)、膽固醇(29.8%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(0.6%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(59.4%)，磷脂為DPPC(10.2%)，且膽固醇以29.8%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物J之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物J之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物J之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物K包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(0.5%)、陽離子脂質(56.7%)、磷脂(13.1%)、膽固醇(29.7%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(0.5%)，陽離子脂質為4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯)(化合物(7))(56.7%)，磷脂為DSPC(13.1%)，且膽固醇以29.7%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、 ±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物K之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物K之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物K之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物L包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(2.2%)、陽離子脂質(52.0%)、磷脂(9.7%)、膽固醇(36.2%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(2.2%)，陽離子脂質為1,2-二-γ-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15))(52.0%)，磷脂為DSPC(9.7%)，且膽固醇以36.2%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物L之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物L之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物L之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9：9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物M包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(2.7%)、陽離子脂質(58.4%)、磷脂(13.1%)、膽固醇(25.7%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(2.7%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(58.4%)，磷脂為DPPC(13.1%)，且膽固醇以25.7%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物M之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物M之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物M之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物N包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(3.0%)、陽離子脂質(53.3%)、磷脂(12.1%)、膽固醇(31.5%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(3.0%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(53.3%)，磷脂為DPPC(12.1%)，且膽固醇以31.5%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物N之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物 N之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物N之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物O包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.5%)、陽離子脂質(56.2%)、磷脂(7.8%)、膽固醇(34.7%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(1.5%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(56.2%)，磷脂為DPPC(7.8%)，且膽固醇以34.7%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物O之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物O之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物O之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物P包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(2.1%)、陽離子脂質(48.6%)、磷脂(15.5%)、膽固醇(33.8%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%) 內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(2.1%)，陽離子脂質為3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(DLin-MP-DMA；化合物(8))(48.6%)，磷脂為DSPC(15.5%)，且膽固醇以33.8%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物P之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物P之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物P之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物Q包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(2.5%)、陽離子脂質(57.9%)、磷脂(9.2%)、膽固醇(30.3%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(2.5%)，陽離子脂質為5-(二甲胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(57.9%)，磷脂為DSPC(9.2%)，且膽固醇以30.3%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物Q之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物Q之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物Q之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或 約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物R包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.6%)、陽離子脂質(54.6%)、磷脂(10.9%)、膽固醇(32.8%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(1.6%)，陽離子脂質為3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(化合物(8))(54.6%)，磷脂為DSPC(10.9%)，且膽固醇以32.8%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物R之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物R之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物R之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物S包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(2.9%)、陽離子脂質(49.6%)、磷脂(16.3%)、膽固醇(31.3%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化 合物(66))(2.9%)，陽離子脂質為5-(二甲胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(49.6%)，磷脂為DPPC(16.3%)，且膽固醇以31.3%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物S之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物S之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物S之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物T包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(0.7%)、陽離子脂質(50.5%)、磷脂(8.9%)、膽固醇(40.0%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(0.7%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(50.5%)，磷脂為DPPC(8.9%)，且膽固醇以40.0%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物T之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物T之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物T之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂 質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物U包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.0%)、陽離子脂質(51.4%)、磷脂(15.0%)、膽固醇(32.6%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(1.0%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(51.4%)，磷脂為DSPC(15.0%)，且膽固醇以32.6%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物U之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物U之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物U之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物V包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.3%)、陽離子脂質(60.0%)、磷脂(7.2%)、膽固醇(31.5%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(1.3%)，陽離子脂質為1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)(60.0%)，磷脂為DSPC(7.2%)，且膽固醇以31.5%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、 ±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物V之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物V之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物V之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物W包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(1.8%)、陽離子脂質(51.6%)、磷脂(8.4%)、膽固醇(38.3%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(1.8%)，陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)(51.6%)，磷脂為DSPC(8.4%)，且膽固醇以38.3%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物W之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物W之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物W之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子，在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物X包括以下組分(其中組分之百分比值為 莫耳百分比)：PEG-脂質(2.4%)、陽離子脂質(48.5%)、磷脂(10.0%)、膽固醇(39.2%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(2.4%)，陽離子脂質為1,2-二-γ-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15))(48.5%)，磷脂為DPPC(10.0%)，且膽固醇以39.2%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物X之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物X之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物X之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物Y包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(2.6%)、陽離子脂質(61.2%)、磷脂(7.1%)、膽固醇(29.2%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DMA(化合物(66))(2.6%)，陽離子脂質為5-(二甲胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(61.2%)，磷脂為DSPC(7.1%)，且膽固醇以29.2%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物Y之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物Y之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA 分子。在某些其他實施例中，基於調配物Y之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
示例性脂質調配物Z包括以下組分(其中組分之百分比值為莫耳百分比)：PEG-脂質(2.2%)、陽離子脂質(49.7%)、磷脂(12.1%)、膽固醇(36.0%)，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。舉例而言，在一個代表性實施例中，PEG-脂質為PEG-C-DOMG(化合物(67))(2.2%)，陽離子脂質為4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯)(化合物(7))(49.7%)，磷脂為DPPC(12.1%)，且膽固醇以36.0%存在，其中存在之脂質的實際量可在例如±5%(或例如±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%)內變化。因此，本發明之某些實施例提供一種基於調配物Z之核酸-脂質粒子，其包含本文所描述之一或多個siRNA分子。舉例而言，在某些實施例中，基於調配物Z之核酸脂質粒子可包含兩個不同之siRNA分子。在某些其他實施例中，基於調配物Z之核酸脂質粒子可包含三個不同之siRNA分子。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1或約5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1或15：1或其任何部分或其中之範圍的總脂質：siRNA質量比。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約9：1之總脂質：siRNA質量比(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率)。
因此，本發明之某些實施例提供一種本文所描述之核酸-脂質粒子，其中脂質如所描述調配成以下中之任一者：調配物A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、 Y或Z。
本發明亦提供包含核酸-脂質粒子及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明之核酸-脂質粒子適用於例如治療性遞送使一或多個HBV基因之表現沈默的siRNA。在一些實施例中，靶向HBV基因或轉錄物之不同區域(例如重疊及/或不重疊序列)的siRNA之摻合物係調配至相同或不同之核酸-脂質粒子中，且粒子係向需要此類治療之哺乳動物(例如人類)投與。在某些情況下，可向哺乳動物投與治療有效量之核酸-脂質粒子(例如用於治療人類之HBV及/或HDV感染)。
在某些實施例中，本發明提供一種用於藉由使細胞與本文所描述之核酸-脂質粒子接觸而將本文所描述之一或多個siRNA分子引入細胞的方法。
在某些實施例中，本發明提供一種方法，其用於藉由使細胞與本文所描述之核酸-脂質粒子在使siRNA進入細胞且使B型肝炎病毒基因在細胞內之表現沈默的條件下接觸而將使B型肝炎病毒基因之表現沈默之一或多個siRNA分子引入細胞。在某些實施例中，細胞係在哺乳動物(諸如人類)中。在某些實施例中，人類已經診斷患有B型肝炎病毒感染或B型肝炎病毒/D型肝炎病毒感染。在某些實施例中，B型肝炎病毒基因表現之沈默使哺乳動物中之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒粒子負荷相對於在不存在核酸-脂質粒子之情況下的B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒粒子負荷降低至少約50%(例如約55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%)。
在某些實施例中，本發明提供一種用於使B型肝炎病毒基因在細胞中之表現沈默的方法，該方法包括使包含經表現之B型肝炎病毒基因的細胞與本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)在使siRNA進入細胞且使B型肝炎病毒基因在細胞內之表現沈默的條件下接觸的步驟。在某些實施例中，細胞係在哺乳動物(諸如人類)中。在某些實施例中，人類已經診斷患有B型肝炎病毒感染或B型肝炎病毒/D型肝炎病毒感染。在某些實施例中，人類已經診斷患有由B型肝炎病毒感染或B型肝炎 病毒/D型肝炎病毒感染引起之肝病。在某些實施例中，B型肝炎病毒基因表現之沈默使哺乳動物中之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒粒子負荷相對於在不存在核酸-脂質粒子之情況下的B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒粒子負荷降低至少約50%(例如約55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%)。
在一些實施例中，本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)係藉由以下投藥途徑中之一者來投與：經口、鼻內、靜脈內、腹膜內、肌肉內、關節內、病灶內、氣管內、皮下及皮內。在特定實施例中，核酸-脂質粒子係全身投與，例如經由經腸或非經腸投藥途徑。
在某些態樣中，本發明提供用於使有需要之哺乳動物(例如人類)中之HBV基因表現沈默的方法，該方法包括向哺乳動物投與治療有效量之包含本文所描述之一或多個siRNA(例如表A、B、C、D、E及/或F中所示之一或多個siRNA)的核酸-脂質粒子。在一些實施例中，包含本文所描述之一或多個siRNA的核酸-脂質粒子之投與使HBV RNA含量相對於在不存在siRNA之情況下(例如緩衝液對照或不相關非HBV靶向siRNA對照)所偵測到的HBV RNA含量降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中之任何範圍)。在其他實施例中，相對於諸如緩衝液對照或不相關非HBV靶向siRNA對照之陰性對照，包含一或多個HBV-靶向siRNA之核酸-脂質粒子的投與使HBV RNA含量降低至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天或更多天(或其中之任何範圍)。
在其他態樣中，本發明提供用於使有需要之哺乳動物(例如人類)中之HBV基因表現沈默的方法，該方法包括向哺乳動物投與治療有效量之包含本文所描述之一或多個siRNA(例如描述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA)的核酸-脂質粒子。在一些實施例中，包含一或多個HBVsiRNA之核酸-脂質粒子的投與使HBV mRNA含量相對於在不存在siRNA 之情況下(例如緩衝液對照或不相關非HBV靶向siRNA對照)所偵測到的HBV mRNA含量降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中之任何範圍)。在其他實施例中，相對於諸如緩衝液對照或不相關非HBV靶向siRNA對照之陰性對照，包含一或多個HBV-靶向siRNA之核酸-脂質粒子的投與使HBV mRNA含量降低至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天或更多天(或其中之任何範圍)。
本發明之某些實施例提供一種本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)，其用於使B型肝炎病毒基因在哺乳動物(例如人類)中之細胞中之表現沈默。
本發明之某些實施例提供本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)用於製備用於使B型肝炎病毒基因在哺乳動物(例如人類)中之細胞中之表現沈默的藥劑的用途。
在其他態樣中，本發明提供用於治療、預防有需要之哺乳動物(例如人類)之HBV及/或HDV感染、降低發展HBV及/或HDV感染之風險或可能性(例如降低對HBV及/或HDV感染的敏感性)、延遲HBV及/或HDV感染之發作及/或改善與HBV及/或HDV感染相關之一或多種症狀的方法，該方法包括向哺乳動物投與治療有效量之包含靶向HBV基因表現之本文所描述(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述)之一或多個siRNA分子的核酸-脂質粒子。人類中與HBV及/或HDV感染相關之症狀的實例包括發熱、腹痛、尿色深、關節疼痛、食欲不振、噁心、嘔吐、虛弱、疲勞及皮膚發黃(黃疸)。
本發明之某些實施例提供一種用於治療哺乳動物之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染的方法，該方法包括向哺乳動物投與治療有效量之如本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)的步驟。
本發明之某些實施例提供一種核酸-脂質粒子或組合物(例 如醫藥組合物)，其用於治療哺乳動物(例如人類)之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染。
本發明之某些實施例提供核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)用於製備用於治療哺乳動物(例如人類)之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染的藥劑的用途。
本發明之某些實施例提供一種用於改善哺乳動物之與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀的方法，該方法包括向哺乳動物投與治療有效量之包含本文所描述(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述)之一或多個siRNA分子的本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)的步驟。在某些實施例中，粒子係經由全身途徑投與。在某些實施例中，核酸-脂質粒子之siRNA抑制B型肝炎病毒基因在哺乳動物中之表現。在某些實施例中，哺乳動物為人類。在某些實施例中，人類患有肝病。
本發明之某些實施例提供一種如本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)，其用於改善哺乳動物(例如人類)中與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀。
本發明之某些實施例提供如本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)用於製備用於改善哺乳動物(例如人類)中與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀的藥劑的用途。
本發明之某些實施例提供一種用於抑制HDV之複製及/或改善哺乳動物(例如人類)中HDV感染之一或多種症狀的方法，該方法包括向哺乳動物投與治療有效量之如本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)的步驟，其中核酸-脂質粒子或組合物抑制HBV表面抗原之合成。
本發明之某些實施例提供一種如本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)，其用於抑制HDV之複製及/或改善哺乳動物(例如人類)中HDV感染之一或多種症狀，其中核酸-脂質粒子或組合物抑制HBV表面抗原之合成。
本發明之某些實施例提供如本文所描述之核酸-脂質粒子或 組合物(例如醫藥組合物)用於製備用於抑制HDV複製及/或改善哺乳動物(例如人類)中HDV感染之一或多種症狀的藥劑的用途，其中核酸-脂質粒子或組合物抑制HBV表面抗原之合成。
本發明之某些實施例提供一種如本文所描述之核酸-脂質粒子或組合物(例如醫藥組合物)，其用於醫學治療。
在其他態樣中，本發明提供一種用於使有需要之哺乳動物(例如人類)(例如罹患HBV感染或HBV/HDV感染之人類)中之HBV及/或HDV失活的方法，該方法包括向哺乳動物投與治療有效量之包含本文所描述之靶向HBV基因表現之一或多個siRNA的核酸-脂質粒子。在一些實施例中，包含一或多個HBV-靶向siRNA之核酸-脂質粒子的投與使HBV蛋白含量(例如HBV表面抗原蛋白)相對於在不存在siRNA之情況下(例如緩衝液對照或不相關非HBV靶向siRNA對照)所偵測到的HBV蛋白含量降低、減少或減低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中之任何範圍)。
舉例而言，可使用分枝鏈DNA分析(QuantiGene®；Affymetrix)來量測HBV mRNA。分枝鏈DNA分析為一種夾心核酸雜交方法，其使用bDNA分子來擴增來自所捕獲之靶RNA的信號。
除其在出於治療目的而使HBV基因中之任一者之表現沈默方面的功效之外，本文所描述之siRNA亦適合用於研究及開發應用以及診斷、預防、預後、臨床及其他健康照護應用。作為非限制性實例，siRNA可用於目的在於測試HBV基因家族之特定成員是否具有作為治療靶標之潛能的靶標驗證研究。
產生siRNA分子
siRNA可以若干形式提供，包括例如以一或多個經分離之小-干擾RNA(siRNA)雙螺旋形式、以更長之雙股RNA(dsRNA)形式或以由DNA質體中之轉錄盒轉錄之siRNA或dsRNA形式提供。在一些實施例中，siRNA可以酶促方式或藉由部分/完全有機合成來製備，且可藉由活體外酶 促或有機合成引入經修飾之核糖核苷酸。在某些情況下，各股係以化學方式製備。合成RNA分子之方法為此項技術中已知的，例如如Verma及Eckstein(1998)中所描述或如本文所描述之化學合成方法。
用於分離RNA、合成RNA、雜交核酸、製備及篩選cDNA文庫及執行PCR之方法為此項技術中熟知的(參見例如Gubler及Hoffman,Gene,25：263-269(1983)；Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上)，PCR方法亦如此(參見美國專利第4,683,195及4,683,202號；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等人編，1990))。表現文庫亦為熟習此項技術者熟知的。揭示用於本發明中之一般方法的其他基礎文本包括Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版1989)；Kriegler,Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，1994)。此等參考文獻之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
較佳地，siRNA為化學合成的。包含本發明之siRNA分子的寡核苷酸可使用此項技術中已知之多種技術中之任一者，諸如以下文獻中所描述之彼等來合成：Usman等人，J.Am.Chem.Soc.,109：7845(1987)；Scaringe等人，Nucl.Acids Res.,18：5433(1990)；Wincott等人，Nucl.Acids Res.,23：2677-2684(1995)；及Wincott等人，Methods Mol.Bio.,74：59(1997)。寡核苷酸之合成利用常見之核酸保護及偶合基團，諸如在5’-末端之二甲氧基三苯甲基及在3’-末端之亞磷醯胺。作為非限制性實例，小規模合成可使用0.2μmol規模方案在Applied Biosystems合成器上進行。或者，可在來自Protogene(Palo Alto,CA)之96-孔板合成器上執行0.2μmol規模之合成。然而，更大或更小規模之合成亦在本發明範疇內。適合用於寡核苷酸合成之試劑、用於RNA脫保護之方法及用於RNA純化之方法為熟習此項技術者已知的。
siRNA分子可由兩個不同之寡核苷酸組裝，其中一個寡核苷酸包含siRNA之正義股而另一個包含siRNA之反義股。舉例而言，各股可分開合成且藉由在合成及/或脫保護之後雜交或連結而連接在一起。
含有治療性核酸之載體系統
A.脂質粒子
在某些態樣中，本發明提供脂質粒子，其包含一或多個siRNA分子(例如描述於表A、B、C、D、E及/或F中之一或多個siRNA分子)及陽離子(胺基)脂質或其鹽中之一或多者。在一些實施例中，本發明之脂質粒子進一步包含一或多種非陽離子脂質。在其他實施例中，脂質粒子進一步包含能夠降低或抑制粒子聚集之一或多種結合脂質。
本發明之脂質粒子較佳包含一或多個siRNA(例如描述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子)、陽離子脂質、非陽離子脂質及抑制粒子聚集之結合脂質。在一些實施例中，siRNA分子完全封裝於脂質粒子之脂質部分內，使得脂質粒子中之siRNA分子在水溶液中對核酸酶降解具耐性。在其他實施例中，本文所描述之脂質粒子對諸如人類之哺乳動物為實質上無毒的。本發明之脂質粒子典型地具有約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm或約70至約90nm之平均直徑。在某些實施例中，本發明之脂質粒子具有約30nm至約150nm之中值直徑。本發明之脂質粒子亦典型地具有約1：1至約100：1、約1：1至約50：1、約2：1至約25：1、約3：1至約20：1、約5：1至約15：1或約5：1至約10：1之脂質：核酸比率(例如脂質：siRNA比率)(質量/質量比)。在某些實施例中，核酸-脂質粒子具有約5：1至約15：1之脂質：siRNA質量比。
在較佳實施例中，本發明之脂質粒子為血清-穩定之核酸-脂質粒子，其包含一或多個siRNA分子(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述之siRNA分子)、陽離子脂質(例如如本文所闡述之一或多種式I-III之陽離子脂質或其鹽)、非陽離子脂質(例如一或多種磷脂與膽固醇之混合物)及抑制粒子聚集之結合脂質(例如一或多種PEG-脂質結合物)。脂質粒子可包含靶向本文所描述之基因中之一或多者的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個siRNA分子(例如描述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子)。核酸-脂質粒子及其製備方法描述於例如美國專利第5,753,613號；第5,785,992號；第5,705,385號；第5,976,567號；第5,981,501號；第6,110,745號；及第6,320,017號；及PCT公開案第WO 96/40964號中，該等專利之 揭示內容各自出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在本發明之核酸-脂質粒子中，一或多個siRNA分子(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述之siRNA分子)可完全封裝於粒子之脂質部分內，藉此防止siRNA發生核酸酶降解。在某些情況下，核酸-脂質粒子中之siRNA在粒子在37℃下暴露於核酸酶至少約20、30、45或60分鐘之後不實質上降解。在某些其他情況下，在將粒子在血清中在37℃下孵育至少約30、45或60分鐘或至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小時之後，核酸-脂質粒子中之siRNA不實質上降解。在其他實施例中，siRNA與粒子之脂質部分複合。本發明之調配物之益處之一在於核酸-脂質粒子組合物對諸如人類之哺乳動物為實質上無毒的。
術語「完全封裝」表明核酸-脂質粒子中之siRNA(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述之siRNA分子)在暴露於血清或將顯著降解游離DNA或RNA之核酸酶分析之後不顯著降解。在完全封裝系統中，在將通常降解100%之游離siRNA之處理中，較佳在粒子中小於約25%之siRNA降解，更佳小於約10%且最佳在粒子中小於約5%之siRNA降解。「完全封裝」亦表明核酸-脂質粒子為血清-穩定的，亦即在活體內投與後其不快速分解成其組成部分。
在核酸之情形下，完全封裝可藉由執行膜-不可滲透性螢光染料排除分析來測定，該分析使用當與核酸相關聯時具有增強之螢光的染料。諸如OliGreen®及RiboGreen®(Invitrogen Corp.；Carlsbad,CA)之特定染料可用於定量測定質體DNA、單股脫氧核糖核苷酸及/或單股或雙股核糖核苷酸。封裝係如下測定：將染料添加至脂質體調配物中，量測所得螢光，且將其與在添加少量非離子洗滌劑後所觀測到之螢光相比較。清潔劑-介導之脂質體雙層之破壞釋放封裝之核酸，從而允許其與膜-不可滲透性染料相互作用。核酸封裝可以E=(I o -I)/I o 來計算，其中I及I o 係指添加清潔劑之前及之後的螢光強度(參見Wheeler等人，Gene Ther.,6：271-281(1999))。
在其他實施例中，本發明提供一種核酸-脂質粒子組合物，其包含複數個核酸-脂質粒子。
在一些情況下，核酸-脂質粒子組合物包含完全封裝於粒子之脂質部分內的siRNA分子，使得約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(或任何其分數或其中之範圍)之粒子具有封裝於其中之siRNA。
在其他情況下，核酸-脂質粒子組合物包含完全封裝於粒子之脂質部分內的siRNA，使得約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(或其任何部分或其中之範圍)之所輸入之siRNA封裝於粒子中。
視本發明之脂質粒子的預期用途而定，組分之比例可變化，且特定調配物之遞送效率可使用例如內體釋放參數(ERP)分析來量測。
1.陽離子脂質
多種陽離子脂質或其鹽中之任一者可單獨或與一或多種其他陽離子脂質種類或非陽離子脂質種類組合用於本發明之脂質粒子中。陽離子脂質包括其(R)及/或(S)對映異構體。
在本發明之一個態樣中，陽離子脂質為二烷基脂質。舉例而言，二烷基脂質可包括包含兩個飽和或不飽和烷基鏈之脂質，其中各個烷基鏈可經取代或未經取代。在某些實施例中，兩個烷基鏈各自包含至少例 如8個碳原子、10個碳原子、12個碳原子、14個碳原子、16個碳原子、18個碳原子、20個碳原子、22個碳原子或24個碳原子。
在本發明之一個態樣中，陽離子脂質為三烷基脂質。舉例而言，三烷基脂質可包括包含三個飽和或不飽和烷基鏈之脂質，其中各個烷基鏈可經取代或未經取代。在某些實施例中，三個烷基鏈各自包含至少例如8個碳原子、10個碳原子、12個碳原子、14個碳原子、16個碳原子、18個碳原子、20個碳原子、22個碳原子或24個碳原子。
在一個態樣中，具有以下結構之式I之陽離子脂質或其鹽適合用於本發明中： 其中：R1及R2為相同或不同的且獨立地為氫(H)或視情況經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基，或R1與R2可連接以形成具有4至6個碳原子及1或2個選自由氮(N)、氧(O)及其混合物組成之群的雜原子的視情況經取代之雜環；R3不存在或為氫(H)或C1-C6烷基以提供四級胺；R4及R5為相同或不同的且獨立地為視情況經取代之C10-C24烷基、C10-C24烯基、C10-C24炔基或C10-C24醯基，其中R4及R5中之至少一者包含至少兩個不飽和位點；且n為0、1、2、3或4。
在一些實施例中，R1及R2獨立地為視情況經取代之C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。在一個較佳實施例中，R1及R2均為甲基。在其他較佳實施例中，n為1或2。在其他實施例中，當pH值高於陽離子脂質之pKa時R3不存在，且當pH值低於陽離子脂質之pKa時R3為氫，使得胺基頭部基團經質子化。在一替代實施例中，R3為視情況經取代之C1-C4烷基以提供四級胺。在其他實施例中，R4及R5獨立地為視情況經取代之 C12-C20或C14-C22烷基、C12-C20或C14-C22烯基、C12-C20或C14-C22炔基或C12-C20或C14-C22醯基，其中R4及R5中之至少一者包含至少兩個不飽和位點。
在某些實施例中，R4及R5獨立地選自由以下組成之群：十二碳二烯基部分、十四碳二烯基部分、十六碳二烯基部分、十八碳二烯基部分、二十碳二烯基部分、十二碳三烯部分、十四碳三烯基部分、十六碳三烯基部分、十八碳三烯基部分、二十碳三烯基部分、花生四烯基部分及二十二碳六烯基部分以及其醯基衍生物(例如亞油醯基，亞麻醯基、γ-亞麻醯基等)。在一些情況下，R4及R5中之一者包含分枝鏈烷基基團(例如植烷基部分)或其醯基衍生物(例如植醯基部分)。在某些情況下，十八碳二烯基部分為亞油基部分。在某些其他情況下，十八碳三烯基部分為亞油烯基部分或γ-亞油烯基部分。在某些實施例中，R4及R5均為亞油基部分、亞油烯基部分或γ-亞油烯基部分。在特定實施例中，式I之陽離子脂質為1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亞油基氧基-(N,N-二甲基)-丁基-4-胺(C2-DLinDMA)、1,2-二亞油醯氧基-(N,N-二甲基)-丁基-4-胺(C2-DLinDAP)或其混合物。
在一些實施例中，式I之陽離子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳結晶鹽)。在一個特定實施例中，式I之陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。
諸如DLinDMA及DLenDMA之陽離子脂質以及其他陽離子脂質之合成描述於美國專利公開案第20060083780號中，該專利公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。諸如C2-DLinDMA及C2-DLinDAP之陽離子脂質以及其他陽離子脂質之合成描述於國際專利申請案第WO2011/000106號中，該專利申請案出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在另一態樣中，具有以下結構之式II之陽離子脂質(或其鹽)適合用於本發明中： 其中R1及R2為相同或不同的且獨立地為視情況經取代之C12-C24烷基、C12-C24烯基、C12-C24炔基或C12-C24醯基；R3及R4為相同或不同的且獨立地為視情況經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基，或R3與R4可連接以形成具有4至6個碳原子及1或2個選自氮及氧之雜原子的視情況經取代之雜環；R5不存在或為氫(H)或C1-C6烷基以提供四級胺；m、n及p為相同或不同的且獨立地為0、1或2，前提條件為m、n及p不同時為0；q為0、1、2、3或4；且Y及Z為相同或不同的且獨立地為O、S或NH。在一較佳實施例中，q為2。
在一些實施例中，式II之陽離子脂質為2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-C2-DMA；「XTC2」或「C2K」)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲胺基丙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-C3-DMA；「C3K」)、2,2-二亞油基-4-(4-二甲胺基丁基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-C4-DMA；「C4K」)、2,2-二亞油基-5-二甲胺基甲基-[1,3]-二噁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亞油基-4-N-甲基哌嗪并-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-MPZ)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)、2,2-二油醯基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DO-K-DMA)、2,2-二硬脂醯基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DS-K-DMA)、2,2-二亞油基-4-N-嗎啉基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-MA)、2,2-二亞油基-4-三甲胺基-[1,3]-二氧戊環氯化物(DLin-K-TMA.Cl)、2,2-二亞油基-4,5-雙(二甲胺基甲基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K2-DMA)、2,2-二亞油基-4-甲基哌嗪-[1,3]-二氧戊環(D-Lin-K-N-甲基哌嗪)或其混合物。在較佳實施例中，式II之陽離子脂質為DLin-K-C2-DMA。
在一些實施例中，式II之陽離子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳結晶鹽)。在一個特定實施例中，式II之陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。
諸如DLin-K-DMA之陽離子脂質以及其他陽離子脂質之合 成描述於PCT公開案第WO 09/086558號中，該公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。諸如DLin-K-C2-DMA、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLin-K6-DMA、DLin-K-MPZ、DO-K-DMA、DS-K-DMA、DLin-K-MA、DLin-K-TMA.Cl、DLin-K2-DMA及D-Lin-K-N-甲基哌嗪之陽離子脂質以及其他陽離子脂質之合成描述於2009年10月9日申請之標題為「Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」之PCT申請案第PCT/US2009/060251號中，該申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在另一態樣中，具有以下結構之式III之陽離子脂質適合用於本發明中：
其中：R1及R2為相同或不同的且獨立地為視情況經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基，或R1與R2可連接以形成具有4至6個碳原子及1或2個選自由氮(N)、氧(O)及其混合物組成之群的雜原子的視情況經取代之雜環；R3不存在或為氫(H)或C1-C6烷基以提供四級胺；R4及R5不存在或存在且當存在時為相同或不同的且獨立地為視情況經取代之C1-C10烷基或C2-C10烯基；且n為0、1、2、3或4。
在一些實施例中，R1及R2獨立地為視情況經取代之C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。在一較佳實施例中，R1及R2均為甲基。在另一較佳實施例中，R4及R5均為丁基。在另一較佳實施例中，n為1。在其他實施例中，當pH值高於陽離子脂質之pKa時R3不存在，且當pH值低於陽離子脂質之pKa時R3為氫，使得胺基頭部基團經質子化。在一替代實施例中，R3為視情況經取代之C1-C4烷基以提供四級胺。在其他實施例中，R4及R5獨立地為視情況經取代之C2-C6或C2-C4烷基或C2-C6或C2-C4烯基。
在一替代實施例中，式III之陽離子脂質包含在胺基頭部基團與烷基鏈中之一者或兩者之間的酯鍵聯。在一些實施例中，式III之陽離 子脂質與一或多種陰離子形成鹽(較佳結晶鹽)。在一個特定實施例中，式III之陽離子脂質為其草酸鹽(例如半草酸鹽)，其較佳為結晶鹽。
雖然式III中之各個烷基鏈在位置6、9及12處含有順式雙鍵(亦即順，順，順-△6,△9,△12)，但在一替代實施例中，一個或兩個烷基鏈中之此等雙鍵中之一者、兩者或三者可呈反式組態。
在一尤佳實施例中，式III之陽離子脂質具有以下結構：
諸如γ-DLenDMA(15)之陽離子脂質以及其他陽離子脂質之合成描述於2009年7月1日申請之標題為「Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」之美國臨時申請案第61/222,462號中，該臨時申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
諸如DLin-M-C3-DMA(「MC3」)之陽離子脂質以及其他陽離子脂質(例如MC3之某些類似物)之合成描述於2009年6月10日申請之標題為「Novel Lipids and Compositions for the Delivery of Therapeutics」之美國臨時申請案第61/185,800號及2009年12月18日申請之標題為「Methods and Compositions for Delivery of Nucleic Acids」之美國臨時申請案第61/287,995號中，該等臨時申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
可包括於本發明之脂質粒子中之其他陽離子脂質或其鹽之實例包括但不限於陽離子脂質，諸如描述於WO2011/000106中之彼等，該專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中；以及陽離子脂質，諸如N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DSDMA)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、3-(N-(N’,N’-二甲胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、 N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙溴化銨(DMRIE)、三氟乙酸2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨(DOSPA)、雙十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲胺基-2-(膽固-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順，順-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(膽固-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順，順-9’,1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油基胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-二亞油基胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞油基胺甲醯氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-嗎啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫-3-二甲胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油基氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油基氧基-3-三甲胺基丙烷氯鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲胺基丙烷氯鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二油基胺甲醯氧基-3-二甲胺基丙烷(DO-C-DAP)、1,2-二肉豆蔻油醯基-3-二甲胺基丙烷(DMDAP)、1,2-二油醯基-3-三甲胺基丙烷氯化物(DOTAP.Cl)、二亞油基甲基-3-二甲胺基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA；亦稱為DLin-M-K-DMA或DLin-M-DMA)及其混合物。可包括於本發明之脂質粒子中之其他陽離子脂質或其鹽描述於美國專利公開案第20090023673號中，該專利公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
諸如CLinDMA之陽離子脂質以及其他陽離子脂質之合成描述於美國專利公開案第20060240554號中，該專利公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。諸如DLin-C-DAP、DLinDAC、DLinMA、DLinDAP、DLin-S-DMA、DLin-2-DMAP、DLinTMA.Cl、DLinTAP.Cl、DLinMPZ、DLinAP、DOAP及DLin-EG-DMA之陽離子脂質以及其他陽離子脂質之合成描述於PCT公開案第WO 09/086558號中，該 公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。諸如DO-C-DAP、DMDAP、DOTAP.Cl、DLin-M-C2-DMA之陽離子脂質以及其他陽離子脂質之合成描述於2009年10月9日申請之標題為「Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」之PCT申請案第PCT/US2009/060251號中，該申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。許多其他陽離子脂質及相關類似物之合成已描述於美國專利第5,208,036號；第5,264,618號；第5,279,833號；第5,283,185號；第5,753,613號；及第5,785,992號；及PCT公開案第WO 96/10390號中，該等專利之揭示內容各自出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。另外，可使用陽離子脂質之許多商業製劑，諸如LIPOFECTIN®(包括可購自Invitrogen之DOTMA及DOPE)；LIPOFECTAMINE®(包括可購自Invitrogen之DOSPA及DOPE)；及TRANSFECTAM®(包括可購自Promega Corp.之DOGS)。
在一些實施例中，陽離子脂質佔存在於粒子中之總脂質的約50mol%至約90mol%、約50mol%至約85mol%、約50mol%至約80mol%、約50mol%至約75mol%、約50mol%至約70mol%、約50mol%至約65mol%、約50mol%至約60mol%、約55mol%至約65mol%或約55mol%至約70mol%(或任何其分數或其中之範圍)。在特定實施例中，陽離子脂質佔存在於粒子中之總脂質的約50mol%、51mol%、52mol%、53mol%、54mol%、55mol%、56mol%、57mol%、58mol%、59mol%、60mol%、61mol%、62mol%、63mol%、64mol%或65mol%(或任何其分數)。
在其他實施例中，陽離子脂質佔存在於粒子中之總脂質的約2mol%至約60mol%、約5mol%至約50mol%、約10mol%至約50mol%、約20mol%至約50mol%、約20mol%至約40mol%、約30mol%至約40mol%或約40mol%(或任何其分數或其中之範圍)。
適合用於本發明之脂質粒子中之陽離子脂質的其他百分比及範圍描述於PCT公開案第WO 09/127060號、美國已公開申請案第US 2011/0071208號、PCT公開案第WO2011/000106號及美國已公開申請案第US 2011/0076335號中，該等申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之 方式併入本文中。
應瞭解，存在於本發明之脂質粒子中之陽離子脂質的百分比為目標量，且存在於調配物中之陽離子脂質的實際量可例如在±5mol%內變化。舉例而言，在一種示例性脂質粒子調配物中，陽離子脂質之目標量為57.1mol%，但陽離子脂質之實際量可為彼靶量之±5mol%、±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%，並且餘量之調配物由其他脂質組分組成(相加達至存在於粒子中之總脂肪物質的100mol%；然而，熟習此項技術者將瞭解，總mol%可因四捨五入而略微偏離100%，例如99.9mol%或100.1mol%)。
以下展示適合於包括在本發明中所用之脂質粒子中之陽離子脂質的其他實例：
N,N-二甲基-2,3-雙((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯氧基)丙-1-胺(5)
2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環-4-基)-N,N-二甲基乙胺(6)
4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯(7)
3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(8)
5-(二甲胺基)戊酸(Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-16-烯-11-基酯(53)
6-(二甲胺基)己酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(11)
5-(二甲胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(13)
5-(二甲胺基)戊酸12-癸基二十二-11-基酯(14)。
2.非陽離子脂質
用於本發明之脂質粒子中之非陽離子脂質可為能夠產生穩定複合物之多種中性不帶電荷脂質、兩性離子脂質或陰離子脂質中之任一者。
非陽離子脂質之非限制性實例包括磷脂，諸如卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、蛋鞘磷脂(ESM)、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、二鯨蠟基磷酸酯、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯甘油(POPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)，單甲基-磷脂醯乙醇胺、二甲基-磷脂醯乙醇胺、二反油醯基-磷脂醯乙醇胺(DEPE)、硬脂醯 基油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼及其混合物。亦可使用其他二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。此等脂質中之醯基較佳為衍生自具有C10-C24碳鏈之脂肪酸的醯基，例如月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基或油醯基。
非陽離子脂質之其他實例包括固醇，諸如膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物之非限制性實例包括極性類似物，諸如5α-膽甾烷醇、5β-糞甾烷醇、膽固醇基-(2'-羥基)-***、膽固醇基-(4'-羥基)-丁醚及6-酮膽甾烷醇；非極性類似物，諸如5α-膽甾烷、膽甾烯酮、5α-膽甾烷酮、5β-膽甾烷酮及癸酸膽固醇酯；及其混合物。在較佳實施例中，膽固醇衍生物為極性類似物，諸如膽固醇基-(4'-羥基)-丁醚。膽固醇基-(2'-羥基)-***之合成描述於PCT公開案第WO 09/127060號中，該公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，存在於脂質粒子中之非陽離子脂質包含一或多種磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物或由其組成。在其他實施例中，存在於脂質粒子中之非陽離子脂質包含一或多種磷脂或由其組成，例如不含膽固醇之脂質粒子調配物。在其他實施例中，存在於脂質粒子中之非陽離子脂質包含膽固醇或其衍生物或由其組成，例如不含磷脂之脂質粒子調配物。
適合用於本發明中之非陽離子脂質之其他實例包括不含磷之脂質諸如硬脂胺、十二胺、十六胺、乙醯基棕櫚酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、硬脂酸十六酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-硫酸月桂酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸醯胺、雙十八基二甲基溴化銨、神經醯胺、鞘磷脂及類似物。
在一些實施例中，非陽離子脂質佔存在於粒子中之總脂質的約10mol%至約60mol%、約20mol%至約55mol%、約20mol%至約45mol%、約20mol%至約40mol%、約25mol%至約50mol%、約25mol%至約45mol%、約30mol%至約50mol%、約30mol%至約45mol%、約30mol%至約40mol%、約35mol%至約45mol%、約37mol%至約45mol%或約35mol%、36mol%、37mol%、38mol%、39mol%、40mol%、41mol%、 42mol%、43mol%、44mol%或45mol%(或其任何部分或其中之範圍)。
在脂質粒子含有磷脂與膽固醇或膽固醇衍生物之混合物的實施例中，混合物可佔存在於粒子中之總脂質的至多約40mol%、45mol%、50mol%、55mol%或60mol%。
在一些實施例中，混合物中之磷脂組分可佔存在於粒子中之總脂質的約2mol%至約20mol%、約2mol%至約15mol%、約2mol%至約12mol%、約4mol%至約15mol%或約4mol%至約10mol%(或其任何部分或其中之範圍)。在某些實施例中，混合物中之磷脂組分佔存在於粒子中之總脂質的約5mol%至約17mol%、約7mol%至約17mol%、約7mol%至約15mol%、約8mol%至約15mol%或約8mol%、9mol%、10mol%、11mol%、12mol%、13mol%、14mol%或15mol%(或其任何部分或其中之範圍)。作為一非限制性實例，包含磷脂與膽固醇之混合物的脂質粒子調配物可包含約7mol%(或其任何部分)之磷脂，諸如DPPC或DSPC，例如在膽固醇或膽固醇衍生物佔存在於粒子中之總脂質的約34mol%(或其任何部分)的混合物中。作為另一非限制性實例，包含磷脂與膽固醇之混合物的脂質粒子調配物可包含約7mol%(或其任何部分)之磷脂，諸如DPPC或DSPC，例如在膽固醇或膽固醇衍生物佔存在於粒子中之總脂質的約32mol%(或其任何部分)的混合物中。
再舉一例，適合用於實踐本發明之脂質調配物具有約10：1之脂質與藥物(例如siRNA)比率(例如9.5：1至11：1或9.9：1至11：1或10：1至10.9：1之脂質：藥物比率)。在某些其他實施例中，適合用於實踐本發明之脂質調配物具有約9：1之脂質與藥物(例如siRNA)比率(例如8.5：1至10：1或8.9：1至10：1或9：1至9.9：1，包括9.1：1、9.2：1、9.3：1、9.4：1、9.5：1、9.6：1、9.7：1及9.8：1之脂質：藥物比率。
在其他實施例中，混合物中之膽固醇組分可佔存在於粒子中之總脂質的約25mol%至約45mol%、約25mol%至約40mol%、約30mol%至約45mol%、約30mol%至約40mol%、約27mol%至約37mol%、約25mol%至約30mol%或約35mol%至約40mol%(或其任何部分或其中之範圍)。在某些較佳實施例中，混合物中之膽固醇組分佔存在於粒子中之總脂 質的約25mol%至約35mol%、約27mol%至約35mol%、約29mol%至約35mol%、約30mol%至約35mol%、約30mol%至約34mol%、約31mol%至約33mol%或約30mol%、31mol%、32mol%、33mol%、34mol%或35mol%(或其任何部分或其中之範圍)。
在脂質粒子不含磷脂之實施例中，膽固醇或其衍生物可佔存在於粒子中之總脂質的至多約25mol%、30mol%、35mol%、40mol%、45mol%、50mol%、55mol%或60mol%。
在一些實施例中，不含磷脂之脂質粒子調配物中之膽固醇或其衍生物可佔存在於粒子中之總脂質的約25mol%至約45mol%、約25mol%至約40mol%、約30mol%至約45mol%、約30mol%至約40mol%、約31mol%至約39mol%、約32mol%至約38mol%、約33mol%至約37mol%、約35mol%至約45mol%、約30mol%至約35mol%、約35mol%至約40mol%或約30mol%、31mol%、32mol%、33mol%、34mol%、35mol%、36mol%、37mol%、38mol%、39mol%或40mol%(或其任何部分或其中之範圍)。作為一非限制性實例，脂質粒子調配物可包含佔存在於粒子中之總脂質的約37mol%(或其任何部分)的膽固醇。作為另一非限制性實例，脂質粒子調配物可包含佔存在於粒子中之總脂質的約35mol%(或其任何部分)的膽固醇。
在其他實施例中，非陽離子脂質佔存在於粒子中之總脂質的約5mol%至約90mol%、約10mol%至約85mol%、約20mol%至約80mol%、約10mol%(例如僅磷脂)或約60mol%(例如磷脂及膽固醇或其衍生物)(或其任何部分或其中之範圍)。
適合用於本發明之脂質粒子中之非陽離子脂質的其他百分比及範圍描述於PCT公開案第WO 09/127060號、美國已公開申請案第US 2011/0071208號、PCT公開案第WO2011/000106號及美國已公開申請案第US 2011/0076335號中，該等申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
應瞭解，存在於本發明之脂質粒子中之非陽離子脂質的百分比為目標量，且存在於調配物中之非陽離子脂質之實際量可例如在±5 mol%、±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%內變化。
3.脂質結合物
除陽離子及非陽離子脂質之外，本發明之脂質粒子可進一步包含脂質結合物。結合脂質為適用的，因為其防止粒子聚集。適合之結合脂質包括但不限於PEG-脂質結合物、POZ-脂質結合物、ATTA-脂質結合物、陽離子-聚合物-脂質結合物(CPL)及其混合物。在某些實施例中，粒子包含PEG-脂質結合物或ATTA-脂質結合物以及CPL。
在一較佳實施例中，脂質結合物為PEG-脂質。PEG-脂質之實例包括但不限於如例如PCT公開案第WO 05/026372號中所描述偶合至二烷氧基丙基之PEG(PEG-DAA)、如例如美國專利公開案第20030077829號及第2005008689號中所描述偶合至二醯基甘油之PEG(PEG-DAG)、偶合至諸如磷脂醯乙醇胺之磷脂之PEG(PEG-PE)、如例如美國專利第5,885,613號中所描述結合至神經醯胺之PEG、結合至膽固醇或其衍生物之PEG及其混合物。此等專利文件之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
適合用於本發明中之其他PEG-脂質包括但不限於mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn3-胺甲醯基甘油酯(PEG-C-DOMG)。PEG-C-DOMG之合成描述於PCT公開案第WO 09/086558號中，該公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。其他適合之PEG-脂質結合物包括但不限於1-[8’-(1,2-二肉豆蔻醯基-3-丙氧基)-甲醯胺基-3’,6’-二氧雜辛烷基]胺甲醯基-ω-甲基-聚(乙二醇)(2KPEG-DMG)。2KPEG-DMG之合成描述於美國專利第7,404,969號中，該專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
PEG為具有兩個末端羥基之乙烯PEG重複單元之線性、水溶性聚合物。PEG係藉由其分子量進行歸類；舉例而言，PEG 2000具有約2,000道爾頓(dalton)之平均分子量，而PEG 5000具有約5,000道爾頓之平均分子量。PEG可由Sigma Chemical Co.及其他公司商購獲得且包括但不限於以下物質：單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸 酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸丁二醯亞胺酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)以及含有末端羥基而非未端甲氧基之此類化合物(例如HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2等)。諸如描述於美國專利第6,774,180號及第7,053,150號中之彼等其他PEG(例如mPEG(20KDa)胺)亦適合用於製備本發明之PEG-脂質結合物。此等專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。此外，單甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH2COOH)尤其適合用於製備PEG-脂質結合物，包括例如PEG-DAA結合物。
本文所描述之PEG-脂質結合物之PEG部分可包含在約550道爾頓至約10,000道爾頓範圍內之平均分子量。在某些情況下，PEG部分具有約750道爾頓至約5,000道爾頓(例如約1,000道爾頓至約5,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約2,000道爾頓等)之平均分子量。在較佳實施例中，PEG部分具有約2,000道爾頓或約750道爾頓之平均分子量。
在某些情況下，PEG可視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。PEG可直接結合至脂質或可經由連接子部分鍵聯至脂質。可使用適合用於使PEG偶合至脂質之任何連接子部分，包括例如不含酯連接子部分及含酯連接子部分。在一較佳實施例中，連接子部分為不含酯連接子部分。如本文所用，術語「不含酯連接子部分」係指不含羧酸酯鍵(-OC(O)-)之連接子部分。適合之不含酯連接子部分包括但不限於醯胺基(-C(O)NH-)、胺基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、胺基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、丁二醯基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、丁二醯胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚、二硫化物以及其組合(諸如含有胺基甲酸酯連接子部分與醯胺基連接子部分之連接子)。在一較佳實施例中，使用胺基甲酸酯連接子來將PEG偶合至脂質。
在其他實施例中，使用含酯連接子部分來將PEG偶合至脂質。適合之含酯連接子部分包括例如碳酸酯(-OC(O)O-)、丁二醯基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其組合。
具有不同鏈長及飽和度之多種醯基鏈基團的磷脂醯乙醇胺可結合至PEG以形成脂質結合物。此類磷脂醯乙醇胺可商購獲得，或可使用熟習此項技術者已知之習知技術來分離或合成。含有碳鏈長度在C10至C20範圍內之飽和或不飽和脂肪酸的磷脂醯基-乙醇胺為較佳的。亦可使用具有單不飽和或雙不飽和脂肪酸及飽和及不飽和脂肪酸之混合物的磷脂醯乙醇胺。適合之磷脂醯乙醇胺包括但不限於二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)及二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)。
術語「ATTA」或「聚醯胺」包括但不限於描述於美國專利第6,320,017號及第6,586,559號中之化合物，該等專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。此等化合物包括具有以下化學式之化合物： 其中R為選自由氫、烷基及醯基組成之群的成員；R1為選自由氫及烷基組成之群的成員；或視情況，R及R1及與其結合之氮形成疊氮基部分；R2為選自以下之群的成員：氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之芳基及胺基酸之側鏈；R3為選自由以下組成之群的成員：氫、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、肼基、胺基及NR4R5，其中R4及R5獨立地為氫或烷基；n為4至80；m為2至6；p為1至4；且q為0或1。熟習此項技術者將顯而易見的是在本發明之化合物中可使用其他聚醯胺。
術語「二醯基甘油」或「DAG」包括具有2個脂肪醯基鏈R1及R2之化合物，該兩個烷基鏈均獨立地具有藉由酯鍵聯鍵結至甘油之1-位置及2-位置的2至30個碳。醯基可為飽和的或具有不同之不飽和度。適合之醯基包括但不限於月桂醯基(C12)、肉豆蔻醯基(C14)、棕櫚醯基(C16)、硬脂醯基(C18)及二十碳醯基(C20)。在較佳實施例中，R1及R2為相同的，亦即R1及R2均為肉豆蔻醯基(亦即二肉豆蔻醯基)、R1及R2均為硬脂醯基(亦即二硬脂醯基)等。二醯基甘油具有以下通式：
術語「二烷氧基丙基」或「DAA」包括具有2個烷基鏈R1及R2之化合物，該兩個烷基鏈均獨立地具有2至30個碳。烷基可為飽和的或具有不同之不飽和度。二烷氧基丙基具有以下通式：
在一較佳實施例中，PEG-脂質為具有以下化學式之PEG-DAA結合物： 其中R1及R2為獨立地選擇及為具有約10至約22個碳原子之長鏈烷基；PEG為聚乙二醇；且L為如上文所描述之不含酯連接子部分或含酯連接子部分。長鏈烷基可為飽和或不飽和的。適合之烷基包括但不限於癸基(C10)、月桂基(C12)、肉豆蔻基(C14)、棕櫚基(C16)、硬脂基(C18)及二十基(C20)。在較佳實施例中，R1及R2為相同的，亦即R1及R2均為肉豆蔻基(亦即二肉豆蔻基)、R1及R2均為硬脂基(亦即二硬脂基)等。
在以上式VII中，PEG具有在約550道爾頓至約10,000道爾頓範圍內之平均分子量。在某些情況下，PEG具有約750道爾頓至約5,000道爾頓(例如約1,000道爾頓至約5,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約2,000道爾頓 等)之平均分子量。在較佳實施例中，PEG具有約2,000道爾頓或約750道爾頓之平均分子量。PEG可視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在某些實施例中，末端羥基經甲氧基或甲基取代。
在一較佳實施例中，「L」為不含酯連接子部分。適合之不含酯連接子包括但不限於醯胺基連接子部分、胺基連接子部分、羰基連接子部分、胺基甲酸酯連接子部分、脲連接子部分、醚連接子部分、二硫化物連接子部分、丁二醯胺基連接子部分及其組合。在一較佳實施例中，不含酯連接子部分為胺基甲酸酯連接子部分(亦即PEG-C-DAA結合物)。在另一較佳實施例中，不含酯連接子部分為醯胺基連接子部分(亦即PEG-A-DAA結合物)。在另一較佳實施例中，不含酯連接子部分為丁二醯胺基連接子部分(亦即PEG-S-DAA結合物)。
在特定實施例中，PEG-脂質結合物係選自： (PEG-C-DMA)；及 (PEG-C-DOMG)。
PEG-DAA結合物係使用熟習此項技術者已知之標準技術及試劑而合成。應認識到，PEG-DAA結合物將含有各種醯胺、胺、醚、硫代、胺基甲酸酯及脲鍵聯。熟習此項技術者將認識到，用於形成此等鍵之方法及試劑為熟知的且可輕易獲得。參見例如March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY(Wiley 1992)；Larock,COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS(VCH 1989)；及Furniss,VOGEL’S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY,第5版(Longman 1989)。亦應瞭解，存在之任何官能基在合成PEG-DAA結合物中之不同點可能需要保護及脫保護。熟習此項技術者將認識到此類技術為熟知。參見例如Green及Wuts,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(Wiley 1991)。
較佳地，PEG-DAA結合物為PEG-二癸氧基丙基(C10)結合 物、PEG-二月桂基氧基丙基(C12)結合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)結合物、PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16)結合物或PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)結合物。在此等實施例中，PEG較佳具有約750或約2,000道爾頓之平均分子量。在一個尤佳實施例中，PEG-脂質結合物包含PEG2000-C-DMA，其中「2000」表示PEG之平均分子量，「C」表示胺基甲酸酯連接子部分，而「DMA」表示二肉豆蔻基氧基丙基。在另一尤佳實施例中，PEG-脂質結合物包含PEG750-C-DMA，其中「750」表示PEG之平均分子量，「C」表示胺基甲酸酯連接子部分，而「DMA」表示二肉豆蔻基氧基丙基。在特定實施例中，PEG之末端羥基經甲基取代。熟習此項技術者將容易瞭解，在本發明之PEG-DAA結合物中可使用其他二烷氧基丙基。
除前述內容之外，熟習此項技術者將輕易顯而易知的是，可使用其他親水性聚合物代替PEG。可代替PEG使用之適合聚合物之實例包括但不限於聚乙烯吡咯啶酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺及聚二甲基丙烯醯胺、聚乳酸、聚乙醇酸及衍生之纖維素，諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。
除前述組分之外，本發明之脂質粒子可進一步包含陽離子聚(乙二醇)(PEG)脂質或CPL(參見例如Chen等人，Bioconj.Chem.,11：433-437(2000)；美國專利第6,852,334號；PCT公開案第WO 00/62813號，該等參考文獻之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)。
適合之CPL包括式VIII之化合物：A-W-Y (VIII)，其中A、W及Y如下文所描述。
參考式VIII，「A」為脂質部分，諸如兩親性脂質、中性脂質或疏水性脂質，其充當脂質錨(lipid anchor)。適合之脂質實例包括但不限於二醯基甘油基、二烷基甘油基、N-N-二烷基胺基、1,2-二醯氧基-3-胺基丙烷及1,2-二烷基-3-胺基丙烷。
「W」為聚合物或寡聚物，諸如親水性聚合物或寡聚物。較佳地，親水性聚合物為非免疫原性或具有低固有免疫原性之生物相容性聚合物。或者，若與適當佐劑一起使用，則親水性聚合物可具弱抗原性。適 合之非免疫原性聚合物包括但不限於PEG、聚醯胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物及其組合。在一較佳實施例中，聚合物具有約250至約7,000道爾頓之分子量。
「Y」為聚陽離子部分。術語聚陽離子部分係指在所選pH值、較佳生理pH值下具有正電荷、較佳至少2個正電荷之化合物、衍生物或官能基。適合之聚陽離子部分包括鹼性胺基酸及其衍生物，諸如精胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、離胺酸及組胺酸；精胺；亞精胺；陽離子樹枝狀聚合物；聚胺；聚胺糖；及胺基多醣。聚陽離子部分之結構可為線性(諸如線性四離胺酸)、分枝或樹枝狀的。聚陽離子部分在所選pH值下具有約2至約15個正電荷、較佳約2至約12個正電荷且更佳約2至約8個正電荷。選擇採用何聚陽離子部分可藉由所需粒子應用之類型來確定。
聚陽離子部分上之電荷可圍繞整個粒子部分分佈，或者，其在粒子部分之一個特定區域中可為離散濃度之電荷密度，例如電荷尖峰。若電荷密度分佈於粒子上，則電荷密度可為相等分佈或不相等分佈。本發明涵蓋聚陽離子部分之電荷分佈之所有變化。
脂質「A」及非免疫原性聚合物「W」可藉由各種方法且較佳藉由共價連接而連接。可使用熟習此項技術者已知之方法將「A」及「W」共價連接。適合之鍵聯包括但不限於醯胺、胺、羧基、碳酸酯、胺基甲酸酯、酯及腙鍵聯。熟習此項技術者將顯而易見的是，「A」及「W」必須具有互補官能基以實現鍵聯。此兩個基團之反應(一者在脂質上而另一者在聚合物上)將提供所需鍵聯。舉例而言，當脂質為二醯基甘油且末端羥基例如經NHS及DCC活化以形成活性酯，且然後與含有胺基之聚合物，諸如與聚醯胺(參見例如美國專利第6,320,017號及第6,586,559號，該等專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)反應時，兩個基團之間將形成醯胺鍵。
在某些情況下，聚陽離子部分可具有所連接之配位體，諸如用於錯合鈣之靶向配位體或螯合部分。較佳地，在連接配位體之後，陽離子部分維持正電荷。在某些情況下，所連接之配位體具有正電荷。適合之配位體包括但不限於具有反應性官能基之化合物或裝置且包括脂質、兩親 性脂質、載體化合物、生物親和性化合物、生物材料、生物聚合物、生物醫學裝置、分析可偵測之化合物、治療活性化合物、酶、肽、蛋白質、抗體、免疫刺激物、放射性標記、螢光團、生物素、藥物、半抗原、DNA、RNA、多醣、脂質體、病毒體、膠束、免疫球蛋白、官能基、其他靶向部分或毒素。
在一些實施例中，脂質結合物(例如PEG-脂質)佔存在於粒子中之總脂質的約0.1mol%至約3mol%、約0.5mol%至約3mol%或約0.6mol%、0.7mol%、0.8mol%、0.9mol%、1.0mol%、1.1mol%、1.2mol%、1.3mol%、1.4mol%、1.5mol%、1.6mol%、1.7mol%、1.8mol%、1.9mol%、2.0mol%、2.1mol%、2.2mol%、2.3mol%、2.4mol%、2.5mol%、2.6mol%、2.7mol%、2.8mol%、2.9mol%或3mol%(或其任何部分或其中之範圍)。
在其他實施例中，脂質結合物(例如PEG-脂質)佔存在於粒子中之總脂質的約0mol%至約20mol%、約0.5mol%至約20mol%、約2mol%至約20mol%、約1.5mol%至約18mol%、約2mol%至約15mol%、約4mol%至約15mol%、約2mol%至約12mol%、約5mol%至約12mol%或約2mol%(或其任何部分或其中之範圍)。
在其他實施例中，脂質結合物(例如PEG-脂質)佔存在於粒子中之總脂質的約4mol%至約10mol%、約5mol%至約10mol%、約5mol%至約9mol%、約5mol%至約8mol%、約6mol%至約9mol%、約6mol%至約8mol%或約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%或10mol%(或其任何部分或其中之範圍)。
應瞭解，存在於本發明之脂質粒子中之脂質結合物的百分比為目標量，且存在於調配物中之脂質結合物之實際量可例如在±5mol%、±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%或±0.1mol%內變化。
適合用於本發明之脂質粒子中之脂質結合物的其他百分比及範圍描述於PCT公開案第WO 09/127060號、美國已公開申請案第US 2011/0071208號、PCT公開案第WO2011/000106號及美國已公開申請案第US 2011/0076335號中，該等申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之 方式併入本文中。
一般熟習此項技術者應瞭解，脂質結合物之濃度可視所採用之脂質結合物及脂質粒子變成融合性之速率而變化。
藉由控制脂質結合物之組成及濃度，可控制脂質結合物自脂質粒子中交換出來之速率且進而控制脂質粒子變成融合性之速率。舉例而言，當PEG-DAA結合物用作脂質結合物時，可例如藉由改變脂質結合物之濃度、藉由改變PEG之分子量或藉由改變PEG-DAA結合物上之烷基的鏈長度及飽和度來改變脂質粒子變成融合性之速率。此外，可使用包括例如pH值、溫度、離子強度等之其他變數來改變及/或控制脂質粒子變成融合性之速率。對熟習此項技術者而言，在閱讀本發明後，可用於控制脂質粒子變成融合性之速率的其他方法將變得顯而易見。另外，藉由控制脂質結合物之組成及濃度，可控制脂質粒度。
B.其他載體系統
適合用於本發明中之其他基於脂質之載體系統的非限制性實例包括脂質體複合物(lipoplex)(參見例如美國專利公開案第20030203865號；及Zhang等人，J.Control Release,100：165-180(2004))、pH值敏感性脂質體複合物(參見例如美國專利公開案第20020192275號)、可逆掩蔽脂質體複合物(參見例如美國專利公開案第20030180950號)、基於陽離子脂質之組合物(參見例如美國專利第6,756,054號；及美國專利公開案第20050234232號)、陽離子脂質體(參見例如美國專利公開案第20030229040號、第20020160038號及第20020012998號；美國專利第5,908,635號；及PCT公開案第WO 01/72283號)、陰離子脂質體(參見例如美國專利公開案第20030026831號)、pH值敏感性脂質體(參見例如美國專利公開案第20020192274號；及AU 2003210303)、抗體塗佈脂質體(參見例如美國專利公開案第20030108597號；及PCT公開案第WO 00/50008號)、細胞類型特異性脂質體(參見例如美國專利公開案第20030198664號)、含有核酸及肽之脂質體(參見例如美國專利第6,207,456號)、含有在可釋放親水性聚合物情況下衍生之脂質的脂質體(參見例如美國專利公開案第20030031704號)、脂質俘獲核酸(參見例如PCT公開案第WO 03/057190號及第WO 03/059322 號)、脂質封裝核酸(參見例如美國專利公開案第20030129221號；及美國專利第5,756,122號)、其他脂質體組合物(參見例如美國專利公開案第20030035829號及第20030072794號；及美國專利第6,200,599號)、脂質體及乳液之穩定混合物(參見例如EP1304160)、乳液組合物(參見例如美國專利第6,747,014號)及核酸微乳液(參見例如美國專利公開案第20050037086號)。
適合用於本發明中之基於聚合物之載體系統的實例包括但不限於陽離子聚合物-核酸複合物(亦即聚複合體)。為形成聚複合體，使核酸(例如siRNA分子，諸如描述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子)典型地與具有線性、分枝、星形或樹枝狀聚合結構之陽離子聚合物複合，從而使核酸縮合至能夠與細胞表面之陰離子蛋白多醣相互作用且藉由胞吞作用進入細胞的帶正電荷之粒子中。在一些實施例中，聚複合體包含核酸(例如siRNA分子，諸如描述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子)與諸如以下之陽離子聚合物複合：聚乙烯亞胺(PEI)(參見例如美國專利第6,013,240號；可作為活體內jetPEITM(一種線性形式之PEI)自Qbiogene,Inc.(Carlsbad,CA)商購獲得)、聚丙烯亞胺(PPI)、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚L-離胺酸(PLL)、二乙胺基乙基(DEAE)-葡聚糖、聚(β-胺基酯)(PAE)聚合物(參見例如Lynn等人，J.Am.Chem.Soc.,123：8155-8156(2001))、幾丁聚糖、聚醯胺基胺(PAMAM)樹枝狀聚合物(參見例如Kukowska-Latallo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93：4897-4902(1996))、卟啉(參見例如美國專利第6,620,805號)、聚乙烯醚(參見例如美國專利公開案第20040156909號)、多環脒陽離子(amidinium)(參見例如美國專利公開案第20030220289號)、其他聚合物(其包含伯胺、亞胺、胍及/或咪唑基)(參見例如美國專利第6,013,240號；PCT公開案第WO/9602655號；PCT公開案第WO95/21931號；Zhang等人，J.Control Release,100：165-180(2004)；及Tiera等人，Curr.Gene Ther.,6：59-71(2006))及其混合物。在其他實施例中，聚複合體包含如美國專利公開案第20060211643號、第20050222064號、第20030125281號及第20030185890號及PCT公開案第WO 03/066069號中所描述之陽離子聚合物-核酸複合物；如美國專利公開案第20040071654號中所描述之生物可降解 聚(β-胺基酯)聚合物-核酸複合物；如美國專利公開案第20040142475號中所描述之含有聚合物基質之微粒；如美國專利公開案第20030157030號中所描述之其他微粒組合物；如美國專利公開案第20050123600號中所描述之縮合核酸複合物；及如AU 2002358514及PCT公開案第WO 02/096551號中所描述之奈米膠囊及微膠囊組合物。
在某些情況下，siRNA可與環糊精或其聚合物複合。基於環糊精之載體系統之非限制性實例包括描述於美國專利公開案第20040087024號中之環糊精修飾聚合物-核酸複合物；描述於美國專利第6,509,323號、第6,884,789號及第7,091,192號中之線性環糊精共聚物-核酸複合物；及描述於美國專利第7,018,609號中之環糊精聚合物-複合劑-核酸複合物。在某些其他情況下，siRNA可與肽或多肽複合。基於蛋白質之載體系統之實例包括但不限於描述於PCT公開案第WO95/21931號中之陽離子寡肽-核酸複合物。
脂質粒子之製備
核酸(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述之siRNA)俘獲於粒子之脂質部分內且經保護以防止降解之本發明之核酸-脂質粒子可藉由此項技術中已知之任何方法來形成，該此項技術中已知之任何方法包括但不限於連續混合法、直接稀釋法及在線稀釋法。
在特定實施例中，陽離子脂質可包含單獨或與其他陽離子脂質組合的式I-III之脂質或其鹽。在其他實施例中，非陽離子脂質為蛋鞘磷脂(ESM)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、二棕櫚醯基-磷脂醯膽鹼(DPPC)、單甲基-磷脂醯乙醇胺、二甲基-磷脂醯乙醇胺、14：0 PE(1,2-二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE))、16：0 PE(1,2-二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE))、18：0 PE(1,2-二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE))、18：1 PE(1,2-二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE))、18：1反式PE(1,2-二反油醯基-磷脂醯乙醇胺(DEPE))、18：0-18：1 PE(1-硬脂醯基-2-油醯基磷脂醯乙醇胺(SOPE))、16：0-18：1 PE(1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE))、基於聚乙二醇之聚合物(例如PEG 2000、PEG 5000、PEG-修飾之二醯基甘油或PEG-修飾之二烷氧基丙 基)、膽固醇、其衍生物或其組合。
在某些實施例中，本發明提供經由連續混合法，例如包括以下之方法產生之核酸-脂質粒子：提供包含siRNA之水溶液於第一儲庫中，提供有機脂質溶液於第二儲庫中(其中存在於有機脂質溶液中之脂質溶解於有機溶劑，例如低級烷醇，諸如乙醇中)，且將水溶液與有機脂質溶液混合，使得有機脂質溶液與水溶液混合以便實質上即刻產生將siRNA封裝於脂質囊泡內之脂質囊泡(例如脂質體)。此方法及用於執行此方法之設備詳細描述於美國專利公開案第20040142025號中，該專利公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
將脂質及緩衝溶液連續引入混合環境中(諸如混合室中)之作用使得脂質溶液用緩衝溶液連續稀釋，藉此在混合後實質上即刻產生脂質囊泡。如本文所用，片語「用緩衝溶液連續稀釋脂質溶液」(及變化型式)通常意謂以足以實現囊泡產生之力在水合製程中足夠快速地稀釋脂質溶液。藉由將包含核酸之水溶液與有機脂質溶液混合，有機脂質溶液在緩衝溶液(亦即水溶液)存在下經歷連續逐步稀釋以產生核酸-脂質粒子。
使用連續混合法形成之核酸-脂質粒子典型地具有約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm、約70nm至約100nm、約80nm至約100nm、約90nm至約100nm、約70至約90nm、約80nm至約90nm、約70nm至約80nm、小於約20nm、110nm、100nm、90nm或80nm或約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm(或其任何部分或其中之範圍)之尺寸。因此形成之粒子不聚集且視情況經尺寸調節以達成均勻粒度。
在另一實施例中，本發明提供經由直接稀釋法產生之核酸-脂質粒子，該直接稀釋法包括形成脂質囊泡(例如脂質體)溶液，且即刻且直接地將脂質囊泡溶液引入含有受控制之量的稀釋緩衝液的收集容器中。在較佳態樣中，收集容器包括經組態以攪拌收集容器之內容物來促進稀釋之 一或多個元件。在一個態樣中，存在於收集容器中之稀釋緩衝液之量實質上等於向其中引入之脂質囊泡溶液之體積。作為一非限制性實例，脂質囊泡之45%乙醇溶液在引入含有相等體積之稀釋緩衝液之收集容器時將有利地產生更小之粒子。
在另一實施例中，本發明提供經由在線稀釋法產生之核酸-脂質粒子，其中含有稀釋緩衝液之第三儲集器流體聯接至第二混合區。在此實施例中，第一混合區中形成之脂質囊泡(例如脂質體)溶液即刻且直接與第二混合區中之稀釋緩衝液混合。在較佳態樣中，第二混合區包括T形連接器，該T形連接器經佈置使得脂質囊泡溶液與稀釋緩衝液流以相反180°流形式相遇；然而，可使用提供較小角度之連接器，例如約27°至約180°(例如約90°)。泵機構將可控制之緩衝液流遞送至第二混合區。在一個態樣中，提供至第二混合區之稀釋緩衝液之流速控制為實質上等於自第一混合區向其中引入之脂質囊泡溶液之流速。此實施例有利地允許對與第二混合區中之脂質囊泡溶液混合之稀釋緩衝液的流量，且因此亦對在整個第二混合製程中緩衝液中之脂質囊泡溶液之濃度的更多控制。對稀釋緩衝液流速之此類控制有利地允許在降低之濃度下形成小粒度。
此等方法及用於執行此等直接稀釋及在線稀釋法之設備詳細描述於美國專利公開案第20070042031號中，該專利公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
使用直接稀釋及在線稀釋法形成之核酸-脂質粒子典型地具有約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm、約70nm至約100nm、約80nm至約100nm、約90nm至約100nm、約70至約90nm、約80nm至約90nm、約70nm至約80nm、小於約120nm、110nm、100nm、90nm或80nm或約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm(或其任何部分或其中之範圍)之尺寸。因此形成之粒子不聚集且視情況經尺寸調節以達成均勻粒度。
若需要，則本發明之脂質粒子可藉由可用於調節脂質體尺寸之方法中之任一者來調節尺寸。可進行尺寸調節以達成所需尺寸範圍及相對窄之粒度分佈。
若干技術可用於將粒子之尺寸調節至所需尺寸。用於脂質體且同樣適用於本發明之粒子的一種調節尺寸之方法描述於美國專利第4,737,323號中，該專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。藉由浴槽或探針超音處理對粒子懸浮液進行超音處理使得尺寸逐漸減小至尺寸小於約50nm之粒子。均質化為依賴於剪切能量將較大粒子片段化成較小粒子之另一方法。在一典型均質化程序中，使粒子再循環穿過標準乳液均質器直至觀測到典型地在約60與約80nm之間的所選粒子尺寸。在兩種方法中，粒度分佈可藉由習知雷射束粒度鑑別或QELS來監測。
通過小孔隙聚碳酸酯膜或不對稱陶瓷膜擠出粒子亦為將粒子尺寸減小至相對明確界定之尺寸分佈的有效方法。典型地，使懸浮液循環穿過膜一或多次直至達成所需粒度分佈。可依次通過更小孔隙之膜擠出粒子，以達成尺寸之逐漸減小。
在一些實施例中，如例如美國專利申請案第09/744,103號中所描述將存在於粒子中之核酸(例如siRNA分子)預縮合，該專利申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在其他實施例中，該等方法可進一步包括添加適用於使用本發明組合物實現細胞之脂質體轉染的非脂質聚陽離子。適合之非脂質聚陽離子之實例包括溴化己二甲銨(以商標名POLYBRENE®出售，來自Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wisconsin,USA)或己二甲銨之其他鹽。其他適合之聚陽離子包括例如聚L-鳥胺酸、聚L-精胺酸、聚L-離胺酸、聚D-離胺酸、聚烯丙胺及聚乙烯亞胺之鹽。此等鹽較佳在已形成粒子之後添加。
在一些實施例中，所形成之核酸-脂質粒子中之核酸(例如siRNA)與脂質比率(質量/質量比)將在約0.01至約0.2、約0.05至約0.2、約0.02至約0.1、約0.03至約0.1或約0.01至約0.08範圍內。起始物質(輸入)之比率亦屬於此範圍內。在其他實施例中，粒子製備每10mg總脂質使用約400μg核酸，或核酸與脂質質量比為約0.01至約0.08，且更佳約0.04， 其對應於每50μg之核酸1.25mg之總脂質。在其他較佳實施例中，粒子具有約0.08之核酸：脂質質量比。
在其他實施例中，所形成之核酸-脂質粒子中之脂質與核酸(例如siRNA)比率(質量/質量比率)將在約1(1：1)至約100(100：1)、約5(5：1)至約100(100：1)、約1(1：1)至約50(50：1)、約2(2：1)至約50(50：1)、約3(3：1)至約50(50：1)、約4(4：1)至約50(50：1)、約5(5：1)至約50(50：1)、約1(1：1)至約25(25：1)、約2(2：1)至約25(25：1)、約3(3：1)至約25(25：1)、約4(4：1)至約25(25：1)、約5(5：1)至約25(25：1)、約5(5：1)至約20(20：1)、約5(5：1)至約15(15：1)、約5(5：1)至約10(10：1)或約5(5：1)、6(6：1)、7(7：1)、8(8：1)、9(9：1)、10(10：1)、11(11：1)、12(12：1)、13(13：1)、14(14：1)、15(15：1)、16(16：1)、17(17：1)、18(18：1)、19(19：1)、20(20：1)、21(21：1)、22(22：1)、23(23：1)、24(24：1)或25(25：1)或其任何部分或其中之範圍的範圍內。起始物質(輸入)之比率亦屬於此範圍內。
如先前所論述，結合脂質可進一步包括CPL。本文論述了多種用於製備脂質粒子-CPL(含CPL脂質粒子)之一般方法。兩種一般技術包括：「後-***」技術，亦即將CPL***至例如預先形成之脂質粒子中；及「標準」技術，其中CPL在例如脂質粒子形成步驟期間包括在脂質混合物中。後-***技術產生具有主要在脂質粒子雙層膜之外表面的CPL的脂質粒子，然而標準技術提供具有在內部與外部面上之CPL的脂質粒子。該方法尤其適合於由磷脂製成之囊泡(其可含有膽固醇)以及含有PEG-脂質(諸如PEG-DAA及PEG-DAG)之囊泡。製備脂質粒子-CPL之方法教示於例如美國專利第5,705,385號；第6,586,410號；第5,981,501號；第6,534,484號；及第6,852,334號；美國專利公開案第20020072121號；及PCT公開案第WO 00/62813號中，該等專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
套組
本發明亦提供呈套組形式之脂質粒子。在一些實施例中，套組包含容器，其經隔間化用於容納脂質粒子之各個元件(例如活性劑，諸如siRNA分子及粒子之個別脂質組分)。較佳地，套組包含容納本發明之脂質 粒子的容器(例如小瓶或安瓿)，其中粒子係藉由本文所闡述之方法中之一者而產生。在某些實施例中，套組可進一步包含內體膜去穩定劑(例如鈣離子)。套組典型地含有呈於醫藥學上可接受之載劑中之懸浮液形式或呈脫水形式之本發明之粒子組合物，以及用於其復水(若凍乾)及投與之說明書。
本發明之調配物可適合於優先靶向所關注之特定細胞、組織或器官。核酸-脂質粒子之優先靶向可藉由控制脂質粒子本身之組成來進行。在特定實施例中，本發明之套組包含此等脂質粒子，其中粒子以懸浮液形式或以脫水形式存在於容器中。
在某些情況下，可能需要具有連接至脂質粒子表面之靶向部分以進一步增強粒子之靶向作用。將靶向部分(例如抗體、蛋白質等)連接至脂質(諸如本發明之粒子中所用之彼等)之方法為熟習此項技術者已知的。
脂質粒子之投與
一經形成，本發明之脂質粒子即尤其適合用於將siRNA分子(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述之siRNA分子)引入細胞中。因此，本發明亦提供用於將siRNA分子引入細胞中之方法。在特定實施例中，siRNA分子係引入受感染細胞中。該方法可在活體外或活體內如下進行：首先如上文所描述形成粒子，且然後使粒子與細胞接觸足以發生siRNA至細胞之遞送的一段時間。
本發明之脂質粒子(例如核酸脂質粒子)可吸附至與其混合或接觸之幾乎任何細胞類型。一經吸附，粒子即可由細胞之一部分內吞、與細胞膜交換脂質或與細胞融合。粒子之siRNA部分之轉移或併入可經由此等通路中之任一者來進行。特定而言，當融合發生時，粒子膜整合至細胞膜中且粒子之內容物與細胞內流體組合。
本發明之脂質粒子(例如核酸-脂質粒子)可單獨或以與根據投藥途徑及標準醫藥實踐選擇之醫藥學上可接受之載劑(例如鹽水或磷酸鹽緩衝液)之混合物形式進行投與。一般而言，將採用普通緩衝鹽水(例如135-150mM NaCl)作為醫藥學上可接受之載劑。其他適合之載劑包括例如水、緩衝水、0.4%鹽水、0.3%甘胺酸及類似物，包括用於增強穩定性之醣蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。其他適合之載劑描述於例如 REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA，第17版(1985)中。如本文所用，「載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、媒劑、包衣、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑、緩衝液、載劑溶液、懸浮液、膠體及類似物。片語「醫藥學上可接受」係指分子實體及組合物在向人類投與時不產生過敏或類似不良反應。
醫藥學上可接受之載劑一般係在脂質粒子形成之後添加。因此，在形成脂質粒子之後，可將粒子稀釋至諸如普通緩衝鹽水之醫藥學上可接受之載劑中。
粒子在醫藥調配物中之濃度可廣泛地變化，亦即自小於約0.05重量%、通常等於或至少約2至5重量%至多達約10至90重量%，且將根據所選特定投與模式主要根據流體體積、黏度等加以選擇。舉例而言，可增加濃度以降低與治療相關之流體負荷。在患有動脈粥樣硬化相關充血性心臟衰竭或嚴重高血壓之患者中此可為尤其需要的。或者，可將由刺激性脂質組成之粒子稀釋至低濃度以減輕投與位點處之炎症。
本發明之醫藥組合物可藉由習知之熟知殺菌技術進行滅菌。水溶液可經包裝以供使用或在無菌條件下過濾且凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水溶液組合。組合物可按需要含有諸如以下之醫藥學上可接受之輔助物質以接近生理條件：pH值調節及緩衝劑、張力調節劑及類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣。另外，粒子懸浮液可包括脂質-保護劑，其防止脂質在儲存後發生自由基及脂質過氧化損害。親脂性自由基淬滅劑(諸如α生育酚)及水溶性鐵特異性螯合劑(諸如鐵草胺(ferrioxamine))為適合的。
在一些實施例中，本發明之脂質粒子尤其適用於用於治療性遞送一或多個siRNA分子(例如如表A、B、C、D、E及/或F中所描述之siRNA分子)的方法。特定而言，本發明之目標為提供用於藉由下調一或多個HBV基因之轉錄及/或轉譯或使其沈默來治療人類之HBV及/或HDV感染的活體內方法。
A.活體內投與
已使用諸如彼等描述於PCT公開案第WO 05/007196號、第WO 05/121348號、第WO 05/120152號及第WO 04/002453號中之核酸-脂質粒子達成用於活體內治療之全身遞送，例如經由諸如循環之身體系統將本文所描述之siRNA分子(諸如描述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA)向遠端靶細胞之遞送，該等公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。本發明亦提供完全封裝之脂質粒子，其防止siRNA在血清中發生核酸酶降解，為非免疫原性的，尺寸小，且適合用於重複給藥。另外，一或多個siRNA分子可於本發明之脂質粒子中單獨地或以與包含肽、多肽或小分子(諸如習知藥物)之脂質粒子組合(例如共投與)之形式投與。
對於活體內投與，可以此項技術中已知之任何方式，例如藉由注射、經口投與、吸入(例如鼻內或氣管內)、經皮施加或直腸投與來投與。投與可經由單一或分開之劑量來實現。醫藥組合物可非經腸(亦即關節內、靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內)投與。在一些實施例中，醫藥組合物係藉由快速注射(參見例如美國專利第5,286,634號)靜脈內或腹膜內投與。細胞內核酸遞送亦已論述於Straubringer等人，Methods Enzymol.,101：512(1983)；Mannino等人，Biotechniques,6：682(1988)；Nicolau等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,6：239(1989)；及Behr,Acc.Chem.Res.,26：274(1993)中。投與基於脂質之治療劑的其他方法描述於例如美國專利第3,993,754號；第4,145,410號；第4,235,871號；第4,224,179號；第4,522,803號；及第4,588,578號中。脂質粒子可藉由在疾病位點直接注射或藉由在疾病位點遠端之位點注射進行投與(參見例如Culver,HUMAN GENE THERAPY,MaryAnn Liebert,Inc.出版，New York.第70-71頁(1994))。上述參考文獻之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在本發明之脂質粒子係靜脈內投與的實施例中，在注射之後約8、12、24、36或48小時，粒子之總注射劑量之至少約5%、10%、15%、20%或25%存在於血漿中。在其他實施例中，在注射之後約8、12、24、36或48小時，脂質粒子之總注射劑量之超過約20%、30%、40%及多達約60%、70%或80%存在於血漿中。在某些情況下，在投與之後約1小時，超過約10%之複數個粒子存在於哺乳動物之血漿中。在某些其他情況下，在投與粒 子之後至少約1小時，可偵測脂質粒子之存在。在一些實施例中，在投與之後約8、12、24、36、48、60、72或96小時，在細胞中可偵測siRNA分子之存在。在其他實施例中，在投與之後約8、12、24、36、48、60、72或96小時，可偵測siRNA分子對諸如病毒或宿主序列之靶序列之表現的下調。在其他實施例中，siRNA分子對諸如病毒或宿主序列之靶序列之表現的下調優先在受感染細胞及/或能夠感染之細胞中發生。在其他實施例中，在投與之後約12、24、48、72或96小時，或約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26或28天時，可偵測在投與位點之近端或遠端的位點處之細胞中siRNA分子之存在或效應。在其他實施例中，本發明之脂質粒子係非經腸或腹膜內投與。
單獨或與其他適合之組分組合的本發明之組合物可製成要經由吸入(例如鼻內或氣管內)投與之氣霧劑調配物(亦即其可經「霧化」)(參見Brigham等人，Am.J.Sci.,298：278(1989))。氣霧劑調配物可放入加壓之可接受之推進劑中，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及類似物。
在某些實施例中，醫藥組合物可藉由鼻內噴霧、吸入及/或其他氣霧劑遞送媒劑遞送。用於經由鼻內氣霧劑噴霧將核酸組合物直接遞送至肺臟之方法已描述於例如美國專利第5,756,353號及第5,804,212號中。同樣地，使用鼻內微粒樹脂及溶血磷脂醯基-甘油化合物遞送藥物(美國專利5,725,871)亦為醫藥技術中熟知的。類似地，以聚四氟乙烯載體基質形式進行的經黏膜藥物遞送描述於美國專利第5,780,045號中。上述專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
適合用於諸如藉由關節內(關節中)、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、及皮下途徑進行非經腸投與的調配物包括水性及非水性、等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑及使得調配物與指定受體之血液等張的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。在本發明之實踐中，組合物較佳係例如藉由靜脈內輸注、經口、表面、腹膜內、膀胱內或鞘內投與。
一般而言，當靜脈內投與時，脂質粒子調配物係與適合之醫藥載劑一起調配。在本發明之組合物及方法中可採用許多醫藥學上可接受 之載劑。適合用於本發明中之調配物可見於例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA，第17版(1985)中。可使用多種水性載劑，例如水、緩衝水、0.4%鹽水、0.3%甘胺酸及類似物，且可包括用於增強穩定性之醣蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。一般而言，將採用普通緩衝鹽水(135-150mM NaCl)作為醫藥學上可接受之載劑，但其他適合之載劑亦將滿足需要。此等組合物可藉由習知脂質體滅菌技術(諸如過濾)進行滅菌。組合物可按需要含有諸如以下之醫藥學上可接受之輔助物質以接近生理條件：pH值調節及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑及類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。此等組合物可使用上文所提及之技術進行滅菌，或者其可在無菌條件下製備。所得水溶液可經包裝以供使用或在無菌條件下過濾且凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水溶液組合。
在某些應用中，本文所揭示之脂質粒子可經由向個體經口投與來遞送。粒子可併有賦形劑且以可攝取錠劑、***錠、片劑、膠囊、丸劑、糖錠、酏劑、洗口水、懸浮液、口腔噴霧、糖漿、薄片及類似物之形式使用(參見例如美國專利第5,641,515號、第5,580,579號及第5,792,451號，該等專利之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)。此等經口劑型亦可含有以下組分：黏合劑、明膠、賦形劑、潤滑劑及/或調味劑。當單位劑型為膠囊時，除上文所描述之物質外其亦可含有液體載劑。各種其他材料可以包衣形式存在或以其他方式改變劑量單位之物理形式。當然，製備任何單位劑型時所用之任何物質均應為醫藥學純的且以所採用之量為實質上無毒的。
典型地，此等經口調配物可含有至少約0.1%之脂質粒子或更多，不過粒子之百分比當然可變化且可適宜地在總調配物之重量或體積的約1%或2%與約60%或70%或更多之間。自然地，在各治療適用之組合物中可製備之粒子的量使得以化合物之任何給定單元劑量均將獲得適合之劑量。製備此類醫藥調配物之熟習此項技術者將考慮諸如溶解度、生物可用性、生物半衰期、投藥途徑、產品保質期以及其他藥理學考慮因素之因 素，且因此，可能需要多種劑量及治療方案。
適合用於經口投與之調配物可由以下各項組成：(a)液體溶液，諸如懸浮於諸如水、鹽水或PEG 400之稀釋劑中之有效量的經包裝之siRNA分子(例如描述於表A、B、C、D、E及/或F中之siRNA分子)；(b)膠囊、小袋或錠劑，其各自含有呈液體、固體、顆粒或明膠形式之預定量之siRNA分子；(c)於適當液體中之懸浮液；及(d)適合之乳液。錠劑形式可包括以下中之一或多者：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸鈣、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、微晶纖維素、明膠、膠體二氧化矽、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸及其他賦形劑、著色劑、填充劑、黏合劑、稀釋劑、緩衝劑、潤濕劑、防腐劑、調味劑、染料、崩解劑及醫藥學上相容之載劑。糖錠形式可包含於調味劑(例如蔗糖)中之siRNA分子，以及於諸如明膠及甘油或蔗糖之惰性基質中之包含治療劑的軟錠劑及除siRNA分子外含有此項技術中已知之載劑的***膠乳液、凝膠及類似物。
在其用途之另一實例中，脂質粒子可併入廣泛範圍之局部劑型中。舉例而言，含有核酸-脂質粒子之懸浮液可調配成凝膠、油、乳液、局部乳膏、糊劑、軟膏、洗劑、泡沫、摩絲及類似物之形式且以該等形式進行投與。
當製備本發明之脂質粒子之醫藥製劑時，較佳使用大量已經純化以減少或消除空粒子或具有與外表面相關聯之諸如siRNA之治療劑的粒子的粒子。
本發明之方法可在多種宿主中進行實踐。較佳宿主包括哺乳動物種類，諸如靈長類動物(例如人類及黑猩猩以及其他非人類靈長類動物)、犬、貓、馬、牛、綿羊、山羊、齧齒動物(例如大鼠及小鼠)、兔類動物及豬。
所投與之粒子的量將取決於siRNA分子與脂質之比率、所使用之特定siRNA、所處理之HBV菌株、患者之年齡、重量及狀況及臨床醫師之判斷，但一般將在每公斤體重約0.01與約50mg之間，較佳在約0.1與約5mg/kg體重之間，或每次投與(例如注射)約108-1010個粒子。
B.活體外投與
對於活體外應用，可向在培養物中生長之任何細胞遞送siRNA分子。在較佳實施例中，細胞為動物細胞，更佳哺乳動物細胞，且最佳人類細胞。
當在活體外進行時，細胞與脂質粒子之間的接觸係生物相容之培養基中進行。粒子之濃度視特定應用而廣泛地變化，但一般在約1μmol與約10mmol之間。用脂質粒子處理細胞一般在生理溫度(約37℃)下進行約1至48小時、較佳約2至4小時之時間。
在一組較佳實施例中，將脂質粒子懸浮液添加至60-80%匯合之塗鋪之細胞中，該等細胞之細胞密度為約103至約105個細胞/ml、更佳約2 x 104個細胞/ml。添加至細胞中之懸浮液之濃度較佳為約0.01至0.2μg/ml，更佳約0.1μg/ml。
在可能需要細胞之組織培養物的情況下，其為此項技術中熟知的。舉例而言，Freshney,Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss,New York(1994)；Kuchler等人，Biochemical Methods in Cell Culture and Virology,Dowden,Hutchinson and Ross,Inc.(1977)以及其中所引用之參考文獻提供了細胞培養之一般指導。培養之細胞系統常常將呈細胞單層之形式，不過為使用細胞懸浮液。
使用內體釋放參數(ERP)分析，可將本發明之核酸-脂質粒子之遞送效率最佳化。ERP分析詳細描述於美國專利公開案第20030077829號中，該公開案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。更特定而言，ERP分析之目的在於基於脂質粒子之各種陽離子脂質及協助脂質組分對內體膜之結合/吸收或融合/去穩定之相對作用來區分其作用。此分析允許定量測定脂質粒子之各組分如何影響遞送效率，藉此將脂質粒子最佳化。通常，ERP分析量測報告蛋白(例如螢光素酶、β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)等)之表現，且在一些情況下，針於表現質體最佳化之脂質粒子調配物將亦適合於封裝siRNA。在其他情況下，ERP分析可適合於量測在存在或不存在siRNA之情況下靶序列之轉錄或轉譯的下調。藉由比較各種脂質粒子各自之ERP，可輕易確定最佳化系統，例如在細胞中具有最大吸收之脂質粒子。
C.脂質粒子之偵測
在一些實施例中，在約1、2、3、4、5、6、7、8或更多個小時時在個體中可偵測本發明之脂質粒子。在其他實施例中，在投與粒子之後約8、12、24、48、60、72或96小時，或約6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25或28天時在個體中可偵測本發明之脂質粒子。在來自個體之細胞、組織或其他生物樣品中可偵測到粒子之存在。粒子可例如藉由直接偵測粒子、偵測siRNA序列、偵測所關注之靶序列(亦即藉由偵測所關注之序列的表現或降低之表現)、偵測由EBOV蛋白(例如干擾素)調節之化合物、偵測個體中之病毒負荷或其組合來進行偵測。
1.粒子之偵測
本發明之脂質粒子可使用此項技術中已知之任何方法來偵測。舉例而言，可使用此項技術中熟知之方法將標記直接或間接偶合至脂質粒子之組分。可使用多種標記，並且標記之選擇取決於所需敏感性、與脂質粒子組分結合之簡易性、穩定性要求及可用儀器及處置規定。適合之標記包括但不限於光譜標記，諸如螢光染料(例如螢光素及衍生物，諸如異硫氰酸螢光素(FITC)及Oregon GreenTM；羅丹明(rhodamine)及衍生物，諸如得克薩斯紅(Texas red)、異硫氰酸四羅丹明(TRITC)等、地高辛(digoxigenin)、生物素、藻紅蛋白、AMCA、CyDyesTM及類似物；放射性標記，諸如3H、125I、35S、14C、32P、33P等；酶，諸如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等；光譜比色標記，諸如膠態金或有色玻璃或塑膠珠粒，諸如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等。標記可使用此項技術中已知之任何手段來偵測。
2.核酸之偵測
核酸(例如siRNA分子)在本文中係藉由熟習此項技術者熟知之許多手段中之任一者來偵測及定量。核酸之偵測可藉由諸如南方分析(Southern analysis)、北方分析(Northern analysis)、凝膠電泳、PCR、放射性標記、閃爍計數及親和層析法之熟知方法來進行。亦可採用其他分析型生化方法，諸如分光光度法、射線照相術、電泳、毛細管電泳、高效液相層析法(HPLC)、薄層層析法(TLC)及高擴散層析法。
核酸雜交形式之選擇不為關鍵的。多種核酸雜交形式為熟習 此項技術者已知的。舉例而言，常見形式包括夾心分析及競爭或置換分析。雜交技術大體上描述於例如「Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach」,Hames及Higgins編，IRL Press(1985)中。
可通過使用使所偵測之靶核酸倍增的核酸擴增系統來增強雜交分析之敏感性。適合用於擴增用作分子探針之序列或用於產生用於後續亞選殖之核酸片段的活體外擴增技術為已知的。通過包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、Qβ-複製酶擴增及其他RNA聚合酶介導之技術(例如NASBATM)之此類活體外擴增方法足以指導技術人員之技術的實例可見於以下文獻中：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000)；及Ausubel等人，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY編，Current Protocols,Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.(2002)；以及美國專利第4,683,202號；PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications(Innis等人編)Academic Press Inc.San Diego,CA(1990)；Arnheim及Levinson(1990年10月1日),C&EN 36；The Journal Of NIH Research,3：81(1991)；Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：1173(1989)；Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：1874(1990)；Lomell等人，J.Clin.Chem.,35：1826(1989)；Landegren等人，Science,241：1077(1988)；Van Brunt,Biotechnology,8：291(1990)；Wu及Wallace,Gene,4：560(1989)；Barringer等人，Gene,89：117(1990)；及Sooknanan及Malek,Biotechnology,13：563(1995)。選殖活體外擴增之核酸的改良方法描述於美國專利第5,426,039號中。描述於此項技術中之其他方法為基於核酸序列之擴增(NASBATM，Cangene,Mississauga,Ontario)及Qβ-複製酶系統。此等系統可用於直接鑑別突變體，其中PCR或LCR引子經設計僅在存在選擇序列時延伸或連接。或者，通常可使用例如非特異性PCR引子及隨後探查指示突變之特定序列的靶區域之擴增來擴增選擇序列。上述參考文獻之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
用作探針(例如在活體外擴增方法中)、用作基因探針或作為抑制劑組分之核酸係典型地根據Beaucage等人，Tetrahedron Letts.,22：1859 1862(1981)描述之固相亞磷醯胺三酯方法，例如使用如Needham VanDevanter等人，Nucleic Acids Res.,12：6159(1984)中所描述之自動合成器來化學合成。在必要之情況下，典型地藉由天然丙烯醯胺凝膠電泳或藉由如Pearson等人，J.Chrom.,255：137 149(1983)中所描述之陰離子交換HPLC來執行聚核苷酸之純化。合成聚核苷酸之序列可使用Maxam及Gilbert(1980)在Grossman及Moldave(編)Academic Press,New York,Methods in Enzymology,65：499中之化學降解法進行驗證。
用於測定轉錄水準之替代手段為原位雜交。原位雜交分析為熟知的且大體上描述於Angerer等人，Methods Enzymol.,152：649(1987)中。在原位雜交分析中，將細胞固定於固體載體，典型地載玻片。若要探查DNA，則在熱量或鹼存在之情況下使細胞變性。然後在中等溫度下使細胞與雜交溶液接觸以允許經標記之特定探針退火。探針較佳經放射性同位素或螢光報告基因標記。
實例
本發明將通過特定實例更詳細地描述。以下實例係出於說明性目的而提供，且不旨在以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將輕易地識別多種可改變或修改以得到基本上相同之結果的非關鍵參數。
實例1.
HBV基因組序列(登錄號EU939600.1)經編輯以完全匹配所有候選siRNA。特定而言，經由電腦模擬連接以下四個序列區域，包括各序列區域之5'與3'末端上30bp之側接序列，其含有候選siRNA之靶位點：212至803、1062至1922、2237至2460及2783至2862。***六個突變(相對於EU939600.1，位置454 C>T；位置598 T>C；位置1206 A>C；位置1287 A>C；及位置1461 G>C)，以確保所有候選siRNA與此合成之共同HBV靶片段完全互補。合成之共同HBV靶片段係使用分別添加至5'及3'末端之限制酶位點XhoI及NotI來合成，以促進選殖至psiCHECK-2雙重螢光素酶載體中。XhoI/NotI選殖位點在PsiCHECK-2雙重螢光素酶載體上之海腎螢光素酶之終止密碼子與聚腺苷酸化信號之間。此質體縮寫為「psi-HBV」。
藉由量測雙重螢光素酶報告(DLR)分析系統(Promega, Madison,WI,USA)中海腎螢光素酶(RLuc)活性相對於螢光蟲螢光素酶(FLuc)活性之降低來測試候選HBV siRNA之基因沈默活性。在反轉染程序中使用HepG2細胞，並且在96孔板中之三個重複孔中將各候選物進行轉染。各孔含有：80ng與Lipofectamine 2000複合之psi-HBV；所指示濃度之調配於核酸-脂質粒子中之siRNA；及70,000個細胞。作為陽性對照，以與實驗樣品相同之劑量將具有針對RLuc之siRNA的核酸-脂質粒子進行轉染。在37℃/5% CO2下孵育24小時之後，移去培養基且將板在-80℃下冷凍>30min。
由雙重螢光素酶(R)報告套組，添加被動溶解緩衝液(1x濃縮)至各孔中且攪動1h。使用雙重螢光素酶(R)報告套組藉由發光偵測評估溶解產物中兩種螢光素酶之表現。計算RLuc/FLuc比率且針對經質體轉染但未接收核酸-脂質粒子之細胞進行正規化。
所報告之資料為兩次獨立分析之平均值(表A)。
與實驗樣品相同之劑量的靶向海腎螢光素酶基因之陽性對照siRNA分別產生7.7%、16.0%、35.8%、64.5%、84.0%之相較於陰性對照之平均%RLuc/FLuc值。
實例2.
在實例2情況下使用與實例1相同之實驗程序及報告質體，但使用所指示之濃度。實例2之資料顯示於表B中。
與實驗樣品相同之濃度的靶向海腎螢光素酶基因之陽性對照siRNA分別產生16.3%、45.9%、83.8%及89.6%的相較於陰性對照之平均%RLucFLuc值。
實例3.
在實例3中使用與實例2相同之實驗程序及報告質體，同時具有以下例外：所報告之資料(表C)為三次重複轉染之平均值。
與實驗樣品相同之劑量的靶向海腎螢光素酶基因之陽性對照siRNA分別產生7.9%、15.3%、46.6%及87.4%的相較於陰性對照之平均%RLucFLuc值。
實例4.
在實例4中使用與實例3相同之實驗程序及報告質體，但使用所指示之濃度。實例4之資料呈現於表D中，且為各所指示siRNA之三次重複轉染之平均值。
與實驗樣品相同之劑量的靶向海腎螢光素酶基因之陽性對照siRNA分別產生33%、68%、88%、91%的相較於陰性對照之平均%RLuc/FLuc值。
實例5.
使用經工程改造以按四環素反應性方式表現HBV之永生化哺乳動物細胞株來評估候選HBV siRNA之基因沈默型態。在HBV siRNA之轉染後，相較於未接收核酸-脂質粒子之細胞評估針對看家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)正規化之總HBV mRNA轉錄物的減少。
在第-8天接種細胞。在第0天，以所指示之濃度將調配於核酸-脂質粒子中之siRNA之轉染物添加至細胞中。使用兩次重複轉染板以允許在超過一個時間點進行評估。將細胞維持在37℃/5% CO2下。每2-5天將培養基換成新鮮培養基。在所指示之天數，經由移去培養基且添加QuantiGene 2.0(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)溶解工作試劑(LWR)+1% v/v之蛋白酶K(Epicenter,Madison,WI,USA)來收集細胞溶解產物，且遵循製造商之說明書進行加工。
HBV轉錄物及GAPDH mRNA之含量係藉由分枝鏈DNA(bDNA)分析(Quantigene 2.0，Affymetrix)進行定量。HBV轉錄物係使用針對HBx區之探針組來偵測，該HBx區為作為所有HBV RNA之組成部分的區域。執行溶解產物稀釋測試以測定在分析之偵測線性範圍內之適當稀釋因子。實例5之資料顯示於表E中。所顯示之資料為三個重複轉染孔之平均值。
資料展示基因沈默之程度，以及沈默效應之持續時間。
實例6.
本發明之某些實施例提供本文所描述之siRNA分子中之兩者的組合(例如呈於組合物或核酸-脂質粒子中之組合的形式，例如siRNA分子1m-80m中之兩者的組合)的用途。
實例7.
本發明之某些實施例提供本文所描述之siRNA分子中之三者的組合(例如呈於組合物或核酸-脂質粒子中之組合的形式，例如siRNA分子1m-80m中之三者的組合)的用途。雖然不旨在限於此等組合，但三個siRNA分子之某些組合包括以下各項。
舉例而言，siRNA 1m至15m之三者siRNA組合為：1m-2m-3m；1m-2m-4m；1m-2m-5m；1m-2m-6m；1m-2m-7m；1m-2m-8m；1m-2m-9m；1m-2m-10m；1m-2m-11m；1m-2m-12m；1m-2m-13m；1m-2m-14m；1m-2m-15m；1m-3m-4m；1m-3m-5m；1m-3m-6m；1m-3m-7m；1m-3m-8m；1m-3m-9m；1m-3m-10m；1m-3m-11m；1m-3m-12m；1m-3m-13m；1m-3m-14m；1m-3m-15m；1m-4m-5m；1m-4m-6m；1m-4m-7m；1m-4m-8m；1m-4m-9m；1m-4m-10m；1m-4m-11m；1m-4m-12m；1m-4m-13m；1m-4m-14m；1m-4m-15m；1m-5m-6m；1m-5m-7m；1m-5m-8m；1m-5m-9m；1m-5m-10m；1m-5m-11m；1m-5m-12m；1m-5m-13m；1m-5m-14m；1m-5m-15m；1m-6m-7m；1m-6m-8m；1m-6m-9m；1m-6m-10m；1m-6m-11m；1m-6m-12m；1m-6m-13m；1m-6m-14m；1m-6m-15m；1m-7m-8m；1m-7m-9m；1m-7m-10m；1m-7m-11m；1m-7m-12m；1m-7m-13m；1m-7m-14m；1m-7m-15m；1m-8m-9m；1m-8m-10m；1m-8m-11m；1m-8m-12m；1m-8m-13m；1m-8m-14m；1m-8m-15m；1m-9m-10m；1m-9m-11m；1m-9m-12m；1m-9m-13m；1m-9m-14m；1m-9m-15m；1m-10m-11m；1m-10m-12m；1m-10m-13m；1m-10m-14m；1m-10m-15m；1m-11m-12m；1m-11m-13m；1m-11m-14m；1m-11m-15m；1m-12m-13m；1m-12m-14m；1m-12m-15m；1m-13m-14m；1m-13m-15m；1m-14m-15m；2m-3m-4m；2m-3m-5m；2m-3m-6m；2m-3m-7m；2m-3m-8m；2m-3m-9m；2m-3m-10m；2m-3m-11m；2m-3m-12m；2m-3m-13m； 2m-3m-14m；2m-3m-15m；2m-4m-5m；2m-4m-6m；2m-4m-7m；2m-4m-8m；2m-4m-9m；2m-4m-10m；2m-4m-11m；2m-4m-12m；2m-4m-13m；2m-4m-14m；2m-4m-15m；2m-5m-6m；2m-5m-7m；2m-5m-8m；2m-5m-9m；2m-5m-10m；2m-5m-11m；2m-5m-12m；2m-5m-13m；2m-5m-14m；2m-5m-15m；2m-6m-7m；2m-6m-8m；2m-6m-9m；2m-6m-10m；2m-6m-11m；2m-6m-12m；2m-6m-13m；2m-6m-14m；2m-6m-15m；2m-7m-8m；2m-7m-9m；2m-7m-10m；2m-7m-11m；2m-7m-12m；2m-7m-13m；2m-7m-14m；2m-7m-15m；2m-8m-9m；2m-8m-10m；2m-8m-11m；2m-8m-12m；2m-8m-13m；2m-8m-14m；2m-8m-15m；2m-9m-10m；2m-9m-11m；2m-9m-12m；2m-9m-13m；2m-9m-14m；2m-9m-15m；21m-10m-11m；2m-10m-12m；2m-10m-13m；2m-10m-14m；2m-10m-15m；2m-11m-12m；2m-11m-13m；2m-11m-14m；2m-11m-15m；2m-12m-13m；2m-12m-14m；2m-12m-15m；2m-13m-14m；2m-13m-15m；2m-14m-15m；3m-4m-5m；3m-4m-6m；3m-4m-7m；3m-4m-8m；3m-4m-9m；3m-4m-10m；3m-4m-11m；3m-4m-12m；3m-4m-13m；3m-4m-14m；3m-4m-15m；3m-5m-6m；3m-5m-7m；3m-5m-8m；3m-5m-9m；3m-5m-10m；3m-5m-11m；3m-5m-12m；3m-5m-13m；3m-5m-14m；3m-5m-15m；3m-6m-7m；3m-6m-8m；3m-6m-9m；3m-6m-10m；3m-6m-11m；3m-6m-12m；3m-6m-13m；3m-6m-14m；3m-6m-15m；3m-7m-8m；3m-7m-9m；3m-7m-10m；3m-7m-11m；3m-7m-12m；3m-7m-13m；3m-7m-14m；3m-7m-15m；3m-8m-9m；3m-8m-10m；3m-8m-11m；3m-8m-12m；3m-8m-13m；3m-8m-14m；3m-8m-15m；3m-9m-10m；3m-9m-11m；3m-9m-12m；3m-9m-13m；3m-9m-14m；3m-9m-15m；3m-10m-11m；3m-10m-12m；3m-10m-13m；3m-10m-14m；3m-10m-15m；3m-11m-12m；3m-11m-13m；3m-11m-14m；3m-11m-15m；3m-12m-13m；3m-12m-14m；3m-12m-15m；3m-13m-14m；3m-13m-15m；3m-14m-15m；4m-5m-6m；4m-5m-7m；4m-5m-8m；4m-5m-9m；4m-5m-10m；4m-5m-11m；4m-5m-12m；4m-5m-13m；4m-5m-14m；4m-5m-15m；4m-6m-7m；4m-6m-8m；4m-6m-9m；4m-6m-10m；4m-6m-11m；4m-6m-12m；4m-6m-13m；4m-6m-14m； 4m-6m-15m；4m-7m-8m；4m-7m-9m；4m-7m-10m；4m-7m-11m；4m-7m-12m；4m-7m-13m；4m-7m-14m；4m-7m-15m；4m-8m-9m；4m-8m-10m；4m-8m-11m；4m-8m-12m；4m-8m-13m；4m-8m-14m；4m-8m-15m；4m-9m-10m；4m-9m-11m；4m-9m-12m；4m-9m-13m；4m-9m-14m；4m-9m-15m；4m-10m-11m；4m-10m-12m；4m-10m-13m；4m-10m-14m；4m-10m-15m；4m-11m-12m；4m-11m-13m；4m-11m-14m；4m-11m-15m；4m-12m-13m；4m-12m-14m；4m-12m-15m；4m-13m-14m；4m-13m-15m；4m-14m-15m；5m-6m-7m；5m-6m-8m；5m-6m-9m；5m-6m-10m；5m-6m-11m；5m-6m-12m；5m-6m-13m；5m-6m-14m；5m-6m-15m；5m-7m-8m；5m-7m-9m；5m-7m-10m；5m-7m-11m；5m-7m-12m；5m-7m-13m；5m-7m-14m；5m-7m-15m；5m-8m-9m；5m-8m-10m；5m-8m-11m；5m-8m-12m；5m-8m-13m；5m-8m-14m；5m-8m-15m；5m-9m-10m；5m-9m-11m；5m-9m-12m；5m-9m-13m；5m-9m-14m；5m-9m-15m；5m-10m-11m；5m-10m-12m；5m-10m-13m；5m-10m-14m；5m-10m-15m；5m-11m-12m；5m-11m-13m；5m-11m-14m；5m-11m-15m；5m-12m-13m；5m-12m-14m；5m-12m-15m；5m-13m-14m；5m-13m-15m；5m-14m-15m；6m-7m-8m；6m-7m-9m；6m-7m-10m；6m-7m-11m；6m-7m-12m；6m-7m-13m；6m-7m-14m；6m-7m-15m；6m-8m-9m；6m-8m-10m；6m-8m-11m；6m-8m-12m；6m-8m-13m；6m-8m-14m；6m-8m-15m；6m-9m-10m；6m-9m-11m；6m-9m-12m；6m-9m-13m；6m-9m-14m；6m-9m-15m；6m-10m-11m；6m-10m-12m；6m-10m-13m；6m-10m-14m；6m-10m-15m；6m-11m-12m；6m-11m-13m；6m-11m-14m；6m-11m-15m；6m-12m-13m；6m-12m-14m；6m-12m-15m；6m-13m-14m；6m-13m-15m；6m-14m-15m；7m-8m-9m；7m-8m-10m；7m-8m-11m；7m-8m-12m；7m-8m-13m；7m-8m-14m；7m-8m-15m；7m-9m-10m；7m-9m-11m；7m-9m-12m；7m-9m-13m；7m-9m-14m；7m-9m-15m；7m-10m-11m；7m-10m-12m；7m-10m-13m；7m-10m-14m；7m-10m-15m；7m-11m-12m；7m-11m-13m；7m-11m-14m；7m-11m-15m；7m-12m-13m；7m-12m-14m；7m-12m-15m；7m-13m-14m；7m-13m-15m； 7m-14m-15m；8m-9m-10m；8m-9m-11m；8m-9m-12m；8m-9m-13m；8m-9m-14m；8m-9m-15m；8m-10m-11m；8m-10m-12m；8m-10m-13m；8m-10m-14m；8m-10m-15m；8m-11m-12m；8m-11m-13m；8m-11m-14m；8m-11m-15m；8m-12m-13m；8m-12m-14m；8m-12m-15m；8m-13m-14m；8m-13m-15m；8m-14m-15m；9m-10m-11m；9m-10m-12m；9m-10m-13m；9m-10m-14m；9m-10m-15m；9m-11m-12m；9m-11m-13m；9m-11m-14m；9m-11m-15m；9m-12m-13m；9m-12m-14m；9m-12m-15m；9m-13m-14m；9m-13m-15m；9m-14m-15m；10m-11m-12m；10m-11m-13m；10m-11m-14m；10m-11m-15m；10m-12m-13m；10m-12m-14m；10m-12m-15m；10m-13m-14m；10m-13m-15m；10m-14m-15m；11m-12m-13m；11m-12m-14m；11m-12m-15m；11m-13m-14m；11m-13m-15m；11m-14m-15m；12m-13m-14m；12m-13m-15m；12m-14m-15m；及13m-14m-15m。
三個不同siRNA之其他組合包括例如1m-10m-20m；1m-10m-30m；1m-10m-40m；1m-10m-50m；1m-10m-60m；10m-20m-30m；10m-20m-40m；10m-20m-50m；10m-20m-60m；20m-30m-40m；20m-30m-50m；20m-30m-60m；30m-40m-50m；30m-40m-60m；40m-50m-60m；1m-11m-21m；1m-11m-31m；1m-11m-41m；1m-11m-51m；1m-11m-61m；11m-21m-31m；11m-21m-41m；11m-21m-51m；11m-21m-61m；21m-31m-41m；21m-31m-51m；21m-31m-61m；31m-41m-51m；31m-41m-61m；41m-51m-61m；2m-12m-22m；2m-12m-32m；2m-12m-42m；2m-12m-52m；2m-12m-62m；12m-22m-32m；12m-22m-42m；12m-22m-52m；12m-22m-62m；22m-32m-42m；22m-32m-52m；22m-32m-62m；32m-42m-52m；32m-42m-62m；42m-52m-62m。
三個不同siRNA之其他組合包括例如67m-68m-69m、67m-68m-73m、67m-69m-71m、67m-70m-73m、67m-71m-73m、67m-72m-73m、68m-69m-70m、68m-69m-73m、68m-70m-72m、68m-71m-73m；68m-72m-73m、69m-70m-71m、69m-70m-73m、69m-71m-73m、69m-72m-73m、70m-71m-72m、70m-71m-73m、 70m-72m-73m、71m-72m-73m。
實例8.
活體內，第二代一式三份siRNA HBV調配物ARB-1740之有效性達到第一代一式三份siRNA HBV調配物ARB-1467之10倍，從而在水動力注射HBV小鼠模型中在單次0.3mg/kg劑量之後7天產生2.5log10血清HBsAg降低。活性之持續時間亦得以改良，其中在給藥後超過4週發生減退至<1log10 HBsAg降低，其為在此模型中ARB-1467所觀測之結果的兩倍長。免疫組織化學分析揭示ARB-1740介導之肝臟HBV核心抗原之抑制持續>35天。其抗病毒劑藥物活性亦包括抑制血清HBV DNA(2.9log10)及HBeAg(>2log10)以及肝臟HBsAg、HBV DNA(各1.5log10)及HBV RNA(>1log10)。ARB-1740展示全基因型活性，並且在代表4個基因型(A-D)之12個臨床分離物(包括5個NUC-抗性株)中針對細胞外HBV rcDNA及HBsAg具有亞萘莫耳活體外EC50效能。
概括地說，使用活體外及活體內模型來表徵ARB-1740，其為具有全基因型活性及使得外周血與肝臟中之HBsAg及其他病毒標記物減少的充分理解之作用機制之第二代RNAi治療劑。相較於當前處於第2發展階段之第一代RNAi產物，ARB-1740之活性之效能及持續時間已得以改良，從而允許在較低藥物劑量下之較大功效。
實例9.
使用B型肝炎病毒(HBV)之水動力注射(HDI)小鼠模型來評估使用脂質奈米粒子(LNP)遞送之個別HBV靶向siRNA之抗HBV效應。
經由水動力注射(HDI)向NOD.CB17-Prkdc scid/J小鼠投與pHBV1.3，其為一種帶有HBV基因組之1.3倍過長拷貝的質體，該拷貝當表現時產生包括HBV DNA之B型肝炎病毒粒子以及其他HBV產物(根據Guidotti,L.等人，Journal of Virology,1995,69(10)：6158-6169)。
在水動力注射之後，在第0天將動物用單次0.3mg/kg劑量之不同的LNP調配之HBV靶向siRNA候選物或用鹽水處理(n=5)。給藥前、給藥後4及14天收集動物血清。使用酶聯免疫吸附分析(GS HBsAg EIA 3.0,Bio-Rad)藉由評估彙集之血清樣品(各組1個彙集物)的血清HBV表面抗 原(HBsAg)來測定各個處理之抗HBV效應。用鹽水處理之動物充當陰性對照，且在第4天及第14天分別產生81.9%及57.8%給藥前基線之血清HBsAg含量。
呈現於表F中之結果係以相對於在處理之前所測定之基線含量的血清HBsAg%來表示。資料證實諸如1m、73m及80m之siRNA比其他siRNA候選物更有效且持久。
實例10.
在此實例中使用描述於實例9中之HDI HBV小鼠模型來評估LNP調配之HBV靶向siRNA摻合物的抗HBV效應。如上文所描述，彙集之血清HBsAg含量係使用ELISA分析來量測，以測定siRNA摻合物之抗HBV效應。
表G顯示以給藥前含量百分比(佔基線之百分比)表示之各處理組的彙集之血清HBsAg。資料展示響應於用抗HBV siRNA摻合物處理對血清HBsAg之抑制作用的程度及持續時間，其中發現諸如71m/21m、68m/72m/73m及68m/73m之組合為三種最有效之摻合物組合。
實例11
在此實例中，在人類全血細胞培養模型中測定各種HBV靶向siRNA組合之相對免疫刺激作用。
將在脂質奈米粒子轉染試劑中調配之測試物品加以稀釋，以在來自8個健康供體之人類全血樣品中得到600nM siRNA之最終藥物濃度，其中各濃度之測試物品在三個重複培養孔中加以分析。將全血培養物與測試物品一起在濕潤腔室中在37℃(5% CO2)下連續孵育24小時。根據製 造商之方案使用Luminex多重珠粒陣列系統(Milliplex Map Kit,EMD Millipore)評估所收集之培養物上清液之IL-6含量。於Luminex 100/200儀器上捕獲資料且用xPonent 3.1軟體使用對標準曲線之羅吉斯5-參數加權擬合(logistic 5-parameter weighted fit)進行分析。值係報告為相對於使用PBS之陰性對照處理的倍數變化。
呈現於表H中之資料證實一些摻合物組合具有較小免疫刺激作用。
<110> 加拿大商帕提瓦生物療法股份有限公司
<120> 用於使B型肝炎病毒基因表現沈默之組合物及方法
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<212> DNA
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<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
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<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
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<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
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<220>
<221> 經修飾之鹼基
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<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
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<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
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<221> 經修飾之鹼基
<222> (9)..(9)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (13)..(13)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<400> 141
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (5)..(5)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (16)..(16)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (20)..(20)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (21)..(21)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 142
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (18)..(18)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (20)..(20)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (21)..(21)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 143
<210> 144
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (3)..(3)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (4)..(4)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (21)..(21)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 144
<210> 145
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (13)..(13)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<400> 145
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (13)..(13)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (20)..(20)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (21)..(21)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 146
<210> 147
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (3)..(3)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (14)..(14)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (21)..(21)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 147
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (4)..(4)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<400> 148
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (4)..(4)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (16)..(16)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (18)..(18)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (20)..(20)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 149
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (14)..(14)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (18)..(18)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (20)..(20)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 150
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (3)..(3)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (4)..(4)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (13)..(13)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<400> 151
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (11)..(11)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (13)..(13)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (20)..(20)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (21)..(21)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 152
<210> 153
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<400> 153
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (9)..(9)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<400> 154
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (3)..(3)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (13)..(13)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (20)..(20)
<223> 解鎖核鹼基類似物(UNA)
<400> 155
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<223> 組合之DNA/RNA分子之描述：合成之寡核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (9)..(9)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<220>
<221> 經修飾之鹼基
<222> (13)..(13)
<223> 2’OMe修飾之核苷酸
<400> 156

Claims (77)

  1. 一種核酸分子，其選自以下中之任一者：SEQ ID NO：1-16、33-69及107-119以及132、134、136、138、140、142、144及146-151。
  2. 一種核酸分子，其選自以下中之任一者：SEQ ID NO：17-32、70-106及120-131以及133、135、141、143、145及151-156。
  3. 一種雙股siRNA分子，其選擇siRNA 1m-80m中之任一者。
  4. 一種組合物，其包含如申請專利範圍第3項之雙股siRNA分子。
  5. 如申請專利範圍第4項之組合物，其包含選自siRNA 1m-80m中之任何兩者的兩個不同之雙股siRNA分子。
  6. 如申請專利範圍第5項之組合物，其中該兩個不同之雙股siRNA分子之組合係選自實例6中所描述之組合中之任一者。
  7. 如申請專利範圍第4項之組合物，其包含選自siRNA 1m-80m中之任何三者的三個不同之雙股siRNA分子。
  8. 如申請專利範圍第7項之組合物，其中該三個不同之雙股siRNA分子之組合係選自實例7中所描述之組合中之任一者。
  9. 如申請專利範圍第4項至第8項中任一項之組合物，其中該組合物為包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
  10. 如申請專利範圍第4項至第9項中任一項之組合物，其中該siRNA使B型肝炎病毒基因之表現沈默。
  11. 一種核酸-脂質粒子，其包含：(a)一或多個選自如申請專利範圍第3項之雙股siRNA分子的雙股siRNA分子；(b)陽離子脂質；及(c)非陽離子脂質。
  12. 如申請專利範圍第11項之核酸-脂質粒子，其中該陽離子脂質係選自由以下組成之群：1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA；化合物(15))、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(DLin-MP-DMA；化合物(8))、4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19- 基酯)(化合物(7))、5-(二甲胺基)戊酸(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))、其鹽及其混合物。
  13. 如申請專利範圍第11項至第12項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該非陽離子脂質為膽固醇或其衍生物。
  14. 如申請專利範圍第11項至第12項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該非陽離子脂質為磷脂。
  15. 如申請專利範圍第11項至第12項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該非陽離子脂質為磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物。
  16. 如申請專利範圍第14項或第15項之核酸-脂質粒子，其中該磷脂係選自由以下組成之群：二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及其混合物。
  17. 如申請專利範圍第16項之核酸-脂質粒子，其中該磷脂為DPPC。
  18. 如申請專利範圍第16項之核酸-脂質粒子，其中該磷脂為DSPC。
  19. 如申請專利範圍第11項至第18項中任一項之核酸-脂質粒子，其進一步包含抑制粒子聚集之結合脂質。
  20. 如申請專利範圍第19項之核酸-脂質粒子，其中該抑制粒子聚集之結合脂質為聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。
  21. 如申請專利範圍第20項之核酸-脂質粒子，其中該PEG-脂質結合物係選自由以下組成之群：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-神經醯胺(PEG-Cer)結合物及其混合物。
  22. 如申請專利範圍第21項之核酸-脂質粒子，其中該PEG-脂質結合物為PEG-DAA結合物。
  23. 如申請專利範圍第22項之核酸-脂質粒子，其中該PEG-DAA結合物係選自由以下組成之群：PEG-二癸氧基丙基(C10)結合物、PEG-二月桂基氧基丙基(C12)結合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)結合物、PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16)結合物、PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)結合物及其混合物。
  24. 如申請專利範圍第11項至第23項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該siRNA完全封裝於該粒子中。
  25. 如申請專利範圍第11項至第24項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該粒子具有約5：1至約15：1之總脂質：siRNA質量比。
  26. 如申請專利範圍第11項至第25項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該粒子具有約30nm至約150nm之中值直徑。
  27. 如申請專利範圍第11項至第26項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該粒子具有一電子緻密核心。
  28. 如申請專利範圍第11項至第27項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該陽離子脂質佔存在於該粒子中之總脂質的約48mol%至約62mol%。
  29. 如申請專利範圍第15項至第28項中任一項之核酸-脂質粒子，其包含磷脂及膽固醇或膽固醇衍生物，其中該磷脂佔存在於該粒子中之總脂質的約7mol%至約17mol%，且該膽固醇或其衍生物佔存在於該粒子中之總脂質的約25mol%至約40mol%。
  30. 如申請專利範圍第19項至第29項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該抑制粒子聚集之結合脂質佔存在於該粒子中之總脂質的約0.5mol%至約3mol%。
  31. 如申請專利範圍第11項至第30項中任一項之核酸-脂質粒子，其中該等脂質如所描述調配成以下中之任一者：調配物A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y或Z。
  32. 如申請專利範圍第11項至第31項中任一項之核酸-脂質粒子，其包含選自siRNA 1m-80m中之任何兩者的兩個不同之雙股siRNA分子。
  33. 如申請專利範圍第32項之核酸-脂質粒子，其中該兩個不同之雙股siRNA分子之組合係選自實例6中所描述之組合中之任一者。
  34. 如申請專利範圍第11項至第31項中任一項之核酸-脂質粒子，其包含選自siRNA 1m-80m中之任何三者的三個不同之雙股siRNA分子。
  35. 如申請專利範圍第34項之核酸-脂質粒子，其中該三個不同之雙股siRNA分子之組合係選自實例7中所描述之組合中之任一者。
  36. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子及醫藥學上可接受之載劑。
  37. 一種用於使B型肝炎病毒基因在細胞中之表現沈默的方法，該方法包 括使包含經表現之B型肝炎病毒基因的細胞與如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物在使該siRNA進入該細胞且使該B型肝炎病毒基因在該細胞內之表現沈默的條件下接觸的步驟。
  38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該細胞係在哺乳動物中。
  39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該細胞係藉由經由全身途徑向該哺乳動物投與該粒子而接觸。
  40. 如申請專利範圍第38項或第39項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該人類已經診斷患有由B型肝炎病毒感染或B型肝炎病毒/D型肝炎病毒感染引起之肝病。
  42. 如申請專利範圍第37項至第41項中任一項之方法，其中該B型肝炎病毒基因表現之沈默使得該哺乳動物中之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒粒子負荷相對於在不存在該核酸-脂質粒子之情況下的B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒粒子負荷降低至少約50%。
  43. 如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物，其用於使B型肝炎病毒基因在哺乳動物(例如人類)中之細胞中之表現沈默。
  44. 一種如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物的用途，其用於製備用於使B型肝炎病毒基因在哺乳動物(例如人類)中之細胞中之表現沈默的藥劑。
  45. 一種用於改善哺乳動物之與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀的方法，該方法包括向該哺乳動物投與治療有效量之如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物的步驟。
  46. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該粒子係經由全身途徑投與。
  47. 如申請專利範圍第45項至第46項中任一項之方法，其中該核酸-脂質粒子之該siRNA抑制B型肝炎病毒基因在該哺乳動物中之表現。
  48. 如申請專利範圍第45項至第47項中任一項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該人類患有肝病。
  50. 如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物，其用於改善哺乳動物(例如人類)之與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀。
  51. 一種如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物的用途，其用於製備用於改善哺乳動物(例如人類)之與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀的藥劑。
  52. 一種用於治療哺乳動物之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染的方法，該方法包括向該哺乳動物投與治療有效量之如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物的步驟。
  53. 如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物，其用於治療哺乳動物(例如人類)之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染。
  54. 一種如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物的用途，其用於製備用於治療哺乳動物(例如人類)之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染的藥劑。
  55. 如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物，其用於醫學治療。
  56. 一種用於使B型肝炎病毒基因在細胞中之表現沈默的方法，該方法包括使包含經表現之B型肝炎病毒基因的細胞與如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物在使該siRNA進入該細胞且使該B型肝炎病毒基因在該細胞內之表現沈默的條件下接觸的步驟。
  57. 如申請專利範圍第56項之方法，其中該細胞係在哺乳動物中。
  58. 如申請專利範圍第57項之方法，其中該細胞係藉由經由全身途徑向該哺乳動物投與該組合物而接觸。
  59. 如申請專利範圍第57項或第58項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  60. 如申請專利範圍第59項之方法，其中該人類已經診斷患有由B型肝炎病毒感染或B型肝炎病毒/D型肝炎病毒感染引起之肝病。
  61. 如申請專利範圍第56項至第60項中任一項之方法，其中該B型肝炎 病毒基因表現之沈默使得該哺乳動物中之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒粒子負荷相對於在不存在該核酸-脂質粒子之情況下的B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒粒子負荷降低至少約50%。
  62. 如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物，其用於使B型肝炎病毒基因在哺乳動物(例如人類)中之細胞中之表現沈默。
  63. 一種如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物的用途，其用於製備用於使B型肝炎病毒基因在哺乳動物(例如人類)中之細胞中之表現沈默的藥劑。
  64. 一種用於改善哺乳動物之與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀的方法，該方法包括向該哺乳動物投與治療有效量之如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物的步驟。
  65. 如申請專利範圍第64項之方法，其中該組合物係經由全身途徑投與。
  66. 如申請專利範圍第64項至第65項中任一項之方法，其中該組合物之該siRNA抑制B型肝炎病毒基因在該哺乳動物中之表現。
  67. 如申請專利範圍第64項至第66項中任一項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  68. 如申請專利範圍第67項之方法，其中該人類患有肝病。
  69. 如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物，其用於改善哺乳動物(例如人類)之與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀。
  70. 一種如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物的用途，其用於製備用於改善哺乳動物(例如人類)之與B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染相關之一或多種症狀的藥劑。
  71. 一種用於治療哺乳動物之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染的方法，該方法包括向該哺乳動物投與治療有效量之如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物的步驟。
  72. 如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物，其用於治療哺乳動物(例如人類)之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病毒感染。
  73. 一種如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物的用途，其用於製備用於治療哺乳動物(例如人類)之B型肝炎病毒及/或D型肝炎病 毒感染的藥劑。
  74. 如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物，其用於醫學治療。
  75. 一種用於抑制D型肝炎病毒複製及/或改善哺乳動物(例如人類)中之D型肝炎病毒感染之一或多種症狀的方法，該方法包括向該哺乳動物投與治療有效量之如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物、如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物的步驟，其中該核酸-脂質粒子或組合物抑制B型肝炎病毒表面抗原之合成。
  76. 如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物、如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物，其用於抑制D型肝炎病毒複製及/或改善哺乳動物(例如人類)中之D型肝炎病毒感染之一或多種症狀，其中該核酸-脂質粒子或組合物抑制B型肝炎病毒表面抗原之合成。
  77. 一種如申請專利範圍第4項至第10項中任一項之組合物、如申請專利範圍第11項至第35項中任一項之核酸-脂質粒子或如申請專利範圍第36項之醫藥組合物的用途，其用於製備用於抑制D型肝炎病毒複製及/或改善哺乳動物(例如人類)中之D型肝炎病毒感染之一或多種症狀的藥劑，其中該核酸-脂質粒子或組合物抑制B型肝炎病毒表面抗原之合成。
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