ES2366100T3 - Inmunoliposomas dirigidos mediante un fragmento de anticuerpo para la administración sistémica de genes. - Google Patents

Inmunoliposomas dirigidos mediante un fragmento de anticuerpo para la administración sistémica de genes. Download PDF

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Abstract

Constructo para la expresión génica aumentada en células de mamíferos, que comprende, de 5' a 3' (a) las secuencias aumentadoras del adenovirus 5 (Ad5) humano presentes en las unidades cartográficas 0 a 1 del Ad5; (b) un promotor de citomegalovirus (CMV); (c) un sitio de clonación múltiple para la inserción del gen que se debe expresar; y (d) una secuencia poli A de SV40; en el que el extremo 3' del constructo está truncado de manera que, comparado con una secuencia genómica adenoviral de plásmido de citomegalovirus de tipo silvestre, las unidades cartográficas adenovirales 9 a 16 están eliminadas.

Description

Antecedentes de la invención
La presente invención proporciona un constructo para la expresión génica aumentada en células de mamíferos y liposomas (es decir, “inmunoliposomas) que comprenden el constructo, que incluyen liposomas dirigidos mediante un fragmento de anticuerpo etiquetados con lípido, y procedimientos para la transfección in vitro utilizando los inmunoliposomas. Se dan a conocer asimismo procedimientos para la administración génica sistémica in vivo. Los liposomas de la presente invención son de utilidad para la administración dirigida de genes y la expresión génica eficaz después de la administración sistémica. La especificidad de los sistemas de administración es consecuencia de los fragmentos de anticuerpo de direccionamiento.
Un agente terapéutico anticanceroso ideal contra el cáncer sería uno que se dirigiese selectivamente a una senda celular responsable del fenotipo tumoral y que no fuese tóxico para las células normales. Aunque los tratamientos antitumorales que implican terapia génica son sustancialmente prometedores, se han de resolver múltiples problemas antes de que su potencial se pueda realizar. Quizás el primero de entre los temas asociados a los tratamientos con macromoléculas es el de la administración eficaz de las moléculas terapéuticas a los lugares del organismo en los que se necesitan. Se ha probado una multiplicidad de sistemas de administración (“vectores”) que incluyen virus y liposomas. El vehículo ideal sería uno que se pudiese administrar sistémicamente (a diferencia de localmente) y que se dirigiese a continuación selectivamente a las células tumorales en sus ubicaciones en el organismo.
La efectividad que hace atractivos a los virus como vectores de administración es también su principal inconveniente. En consecuencia, se ha prestado mucha atención a los vectores no víricos para la administración de terapias moleculares. La estrategia mediante liposomas ofrece múltiples ventajas sobre los procedimientos víricos para la administración de genes. Lo más significativo, ya que los liposomas no son agentes infecciosos capaces de autorreplicación, es que no presentan riesgo de transmisión a otros individuos. El ataque a las células tumorales mediante liposomas se puede alcanzar modificando los liposomas de modo que administren su contenido selectivamente a las células tumorales. En la actualidad existe una base de conocimientos significativa sobre las moléculas específicas que residen en la superficie exterior de ciertas células cancerosas. Tales moléculas de la superficie celular se pueden utilizar como dianas para dirigir liposomas a las células tumorales, debido a que las moléculas que residen en el exterior de las células tumorales difieren de las de las células normales.
Las publicaciones y otros materiales utilizados en la presente memoria sirven para ilustrar la presente invención o para proporcionar detalles adicionales relativos a la práctica de la presente invención.
Las estrategias de terapia génica somática utilizan sistemas de vectores víricos o no víricos. Muchos vectores víricos permiten una elevada eficacia de transferencia génica pero son deficientes en ciertos aspectos [Ledley F.D., et al., Hum. Gene. Ther. 6:1129-1144 (1995)]. Los vectores de transferencia génica no víricos evitan algunos de los problemas asociados con la utilización de vectores víricos. Se ha progresado hacia el desarrollo de formulaciones farmacéuticas no víricas de genes destinadas a la terapia humana in vivo, en particular los sistemas de transferencia génica mediante liposomas catiónicos [Massing U, et al., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 35:87-90 (1997)]. Las características de los liposomas catiónicos que los hacen versátiles y atractivos para la administración de ADN incluyen: simplicidad de preparación; capacidad para acomplejar grandes cantidades de ADN; versatilidad de utilización con cualquier tipo y tamaño de ADN o ARN; capacidad para transfectar múltiples tipos de células, que incluyen las células que no se dividen; y la falta de inmunogenicidad o biopeligrosidad [Felgner P.L., et al., Ann.NY Acad. Sci., 772:126-139 (1995); Lewis J.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3176-3181 (1996)]. Más importante desde la perspectiva de la terapia antineoplásica humana, los liposomas catiónicos han demostrado ser seguros y eficaces para la administración de genes in vivo (Aoki K., et al., Cancer Res., 55:3810-3816 (1997); Thierry A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9742-9746 (1997)]. En la actualidad se están llevando a cabo más de treinta ensayos clínicos utilizando liposomas catiónicos destinados a la terapia génica [Zhang W., et al., Adv. Pharmacology 32:289333 (1997); RAC Comittee Report: Human Gene Therapy Protocols-Diciembre 1998] y ya se encuentran en el mercado liposomas para la administración de pequeñas moléculas terapéuticas (p.ej. agentes antifúngicos y terapéuticos convencionales) [Allen T.M. et al., Drugs, 54 suple.4:8-14 (1997)].
La eficacia de transfección de los liposomas catiónicos se puede incrementar dramáticamente cuando son portadores de un ligando que es reconocido por un receptor de la superficie celular. La endocitosis mediada por receptores consiste en una senda de internalización muy eficaz presente en la superficie de las células eucarióticas [Cristiano R.J. et al., Cancer Gene Ther., 3:49-57 (1996); Cheng P.W., Hum. Gene Ther., 7:275-282 (1996)]. La presencia de un ligando en un liposoma facilita la entrada del ADN en las células mediante primero la unión del ligando a su receptor, en la superficie celular, seguido de la internalización del complejo unido. Se ha examinado la capacidad de múltiples ligandos, que incluyen la transferrina y el folato con el fin de determinar su capacidad de dirigir liposomas, [Lee R.J. et al., J. Biol. Chem., 271:8481-8487 (1996)]. Los niveles de los receptores de transferrina (TfR) son elevados en múltiples tipos de células cancerosas que incluyen las de cáncer de próstata, incluso en las líneas celulares de próstata derivadas de metástasis de ganglio linfático y médula ósea [Keer H.N., et al., J. Urol. 143:381-385 (1990); Chakal-Roy M., et al., J. Clin. Invest. 84:43-50 (1989); Rossi M.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6197-6201 (1992); Grayhack J.T., et al., J. Urol. 121:295-299 (1979)].
Los niveles elevados de TfR se correlacionan también con la capacidad proliferativa o agresiva de las células tumorales [Elliot R.L., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 698:159-166 (1993)]. Por consiguiente, los niveles de TfR se consideran de utilidad como marcadores prognósticos y el TfR es una diana potencial para la administración de fármacos en la terapia de las células malignas [Miyamoto T., et al., Int. J. Oral Maxillofac. Surg., 23:430-433 (1994); Thorstensen K., et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., 215:113-120 (1993)]. En nuestro laboratorio, se han preparado liposomas catiónicos acomplejados con transferrina con una eficacia de transfección en SCCHN de las células tumorales comprendida entre el 60 y el 70%, en comparación con solamente entre un 5 y 20% mediante liposomas catiónicos sin ligando [Xu, L., et al., Hum. Gene Ther., 8:467-475 (1997)].
Además de la utilización de ligandos que son reconocidos por los receptores de las células tumorales, se puede unir anticuerpos específicos a la superficie de los liposomas [Allen, T.M. et al., Stealth Liposomes, págs. 233-244 (1995)] lo que permite dirigirlos a antígenos tumorales de superficie (incluidos, pero sin ser limitante, los receptores) [Allen, T.M., Biochem. Biophys. Acta, 1237:99-108 (1995)]. Dichos “inmunoliposomas”, especialmente los inmunoliposomas estabilizados estéricamente, pueden administrar fármacos terapéuticos a poblaciones celulares diana específicas [Allen, T.M. et al., Stealth Liposomes, págs. 233-244 (1995)]. Park, et al., [Park, J.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1327-1331 (1995)] descubrieron que los fragmentos Fab del anticuerpo monoclonal (Mab) anti-HER-2 conjugados a liposomas se podían unir específicamente a las células de la línea tumoral de mama SK-BR-3 que sobreexpresan HER-2. Se descubrió que los inmunoliposomas se internalizaban eficazmente mediante endocitosis mediada por receptores a través de la senda de los pozos recubiertos y también posiblemente mediante la fusión de membranas. Además, el anclaje de los fragmentos Fab anti-HER-2 amplifica su efecto inhibidor. Los inmunoliposomas anti-HER-2 cargados con doxorrubiicina también mostraron un efecto citotóxico significativo y específico contra las células diana in vitro e in vivo [Park, J.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1327-1331 (1995)]. Además, Suzuki et al., [Suzuki, S., et al., Br. J. Cancer, 76:83-89 (1997)] utilizaron inmunoliposomas conjugados a anticuerpos monoclonales contra el receptor de la transferrina con el fin de administrar doxorrubiicina más eficazmente a células humanas de leucemia in vitro. Huwyler et al., [Huwyler, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14164-14169 (1996)] utilizaron inmunoliposomas con anticuerpo monoclonal anti-TfR para administrar daunomicina a células de glioma (RT2) de rata in vivo. Dicho inmunoliposoma PEGilado produjo una concentración inferior de fármaco en las células y tejidos normales. Tales estudios demostraron la utilidad de los inmunoliposomas para la administración de fármacos dirigida a lo tumores. Se deberá advertir que los complejos de inmunoliposomas utilizados por Sozuki et al., y Huwyler et al., difieren de los de la invención descrita en la presente memoria en la que son liposomas aniónicos y en la que los procedimientos utilizados por Suzuki et al., y Huwyler et al., no pueden administrar ácidos nucleicos.
El documento WO 99/25320 da a conocer la administración génica de liposomas dirigida, y el documento WO 00/15649 da a conocer procedimientos para la inhibición de la proliferación celular del músculo liso y la prevención de la restenosis con un vector que expresa RB21p130. Ambos documentos pueden citarse según el Artículo 54(3) EPC.
Hamada K et al dan a conocer la transferencia mediada por adenovirus del ARN antisentido de HPV 16 E6/E7 a las células cancerosas de cuello uterino humanas (Gynecologic Oncology, vol. 63, nº 2, 1996, páginas 219-227).
Zhang W et al dan a conocer una transferencia génica de eficiencia elevada y una expresión de nivel elevado de la p53 de tipo natural en las células del cáncer de pulmón humanas mediadas por adenovirus recombinante (Database Medline US National Library of Medicine (NLM), Bethesda, MD, US; marzo de 1994 (03-1994) nº de acceso de la base de datos XP002437978 NLM76212378 y Cancer Gene Therapy, vol. 1, nº 1, marzo de 1994, páginas 5-13.
Hamada K et al dan a conocer la inhibición del crecimiento de las células cancerosas de cuello uterino con la p53 de adenovirus recombinante in vitro (Gynecologic Oncology, vol. 60, nº 3, 1996, páginas 373-379).
Compagnon et al dan a conocer la administración génica aumentada y la expresión en las células de carcinoma hepatocelular humano mediante inmunoliposomas catiónicos (Journal of Liposome Research, vol. 7, nº 1, 1997, páginas 127-141).
Yoshida J et al dan a conocer la preparación simple y la caracterización de los liposomas catiónicos asociados con un anticuerpo monoclonal contra el antígeno asociado al glioma (inmunoliposomas) (Journal of Liposome Research, vol. 5, nº 4, 1995, páginas 981-995.
Kobatake et al dan a conocer un fluoroinmunoensayo basándose en los inmunoliposomas que contienen anticuerpo etiquetado con lípido modificado genéticamente (Analytical Chemistry vol. 69 nº 7, 1997, páginas 1295-1298).
Xu et al, Human Gene Therapy, vol. 8, 1997, 467-475 dan a conocer un plásmido de expresión para p53 que presenta un promotor de RSU y una señal poli A de SV40. Se realiza la administración in vivo con liposomas de transferrina.
Fragmentos de anticuerpo de cadena única
El progreso en la biotecnología ha permitido derivar dominios de reconocimiento específico de Mab [Poon R.Y., Biotechnology International: International Developments in the Biotechology Industry, págs.113-128(1997)]. La recombinación de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras y su integración en un polipéptido único proporciona la posibilidad de utilizar derivados de anticuerpos de cadena única (designados como scFb) con el fin de dirigir. Se han desarrollado vectores retrovíricos diseñados para desplegar scFv dirigido contra el antígeno carcinoembriónico, HER-2, CD34, antígeno asociado a melanomas y el receptor de la transferrina [Jiang A., et al., J. Virol., 72:10148-10156 (1998); Konishi H., et al., Hum. Gene Ther., 9:235-248 (1994); Martin F., et al., Hum. Gene Ther., 9:737-746 (1998)]. Se ha demostrado que tales virus dirigidos por scFv se dirigen, unen e infectan específicamente los tipos celulares que expresan el antígeno en particular. Además, por lo menos en el caso del antígeno carcinoembriónico, se demostró que scFv tenía la misma especificidad celular que el anticuerpo paternal [Nicholson I.C., Mol. Immunol., 34:1157-1165 (1997)].
La combinación de procedimientos de transferencia génica mediante liposomas catiónicos e inmunoliposomas parece ser un sistema prometedor para la administración génica dirigida.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un constructo para la expresión génica aumentada en las células de mamíferos, que comprende, de 5’ a 3’:
(a)
las secuencias aumentadoras del adenovirus 5 (Ad5) humano presentes en las unidades cartográficas 0 a 1 de Ad5;
(b)
un promotor de citomegalovirus (CMV);
(c)
un sitio de clonación múltiple para la inserción del gen que debe expresarse; y
(d)
una secuencia de poli A de SV40;
En el que el extremo 3’ del constructo puede estar truncado de manera que comparado con una secuencia genómica adenoviral de plásmido de citogemalovirus de tipo natural las unidades cartográficas adenovirales 9 a 16 son eliminadas.
La presente invención proporciona además un complejo de liposoma que comprende (i) un liposoma catiónico, (ii) un ligando dirigido a las células, y (iii) el constructo de la invención.
Además la presente invención proporciona un procedimiento para la expresión de un gen en un célula de mamífero in vitro que comprende poner en contacto el complejo de liposoma de la invención con una célula de mamífero, y el complejo de liposoma de la presente invención para su utilización como un medicamento.
Se han construido múltiples inmunoliposomas capaces de administrar sistémicamente ácidos nucleicos dirigidos a tumores, destinados a la terapia génica humana. Basándose en los datos que se dan en el Ejemplo a continuación, dichos complejos de inmunoliposomas y ADN que incorporan TfRscFv son capaces de producir un nivel de transfección que los mismos complejos de liposoma-ADN portadores de la molécula de Tf completa.
En un aspecto de la presente invención, se ha construido una proteína scFv con una etiqueta lipídica de manera que las células bacterianas añaden el lípido naturalmente para permitir la incorporación del scFv en los liposomas mientras que a la vez se evitan reacciones químicas que podrían inactivar el scFv.
Los scFv-inmunoliposomas etiquetados con lípido se preparan básicamente mediante dos procedimientos: un procedimiento de disolución de película lipídica y un procedimiento de anclaje directo. El procedimiento de disolución de película lipídica es una modificación del procedimiento de diálisis de detergente, que describieron Laukkanen
M.L. et al., [Laukkanen M.L., et al., Biochemistry, 33:11664-11670 (1994)] y de Kruif et al.,[de Kruif, et al., FEBS Lett., 399:232-236 (1996)] para liposomas neutrales o aniónicos. Este procedimiento es también adecuado para enganchar scFv etiquetado con lípido a liposomas catiónicos. En el procedimiento de disolución de película lipídica, se evaporan lípidos en cloroformo a presión reducida para obtener una película seca de lípido en un frasco de fondo redondo. A continuación, la película de lípido se disuelve con entre 0,5 y 4%, preferentemente 1%, de n-octil β-Dglucósido (OG) que contiene el scFv modificado con lípido y se agita en un Vórtex. Una vez diluido en agua estéril, la disolución se agita brevemente por sonicación para aclararla.
El segundo procedimiento para unir los anticuerpos etiquetados con lípido a los fragmentos de anticuerpo es el procedimiento de anclaje directo, específicamente útil para unir los 9 aminoácidos N-terminales de la lipoproteína de
E. coli a un scFv (lpp-scFv) u otro anticuerpo o fragmento, modificado con lípido y unir éstos a liposomas preformados. Para unir el scFv a liposomas preformados, el scFv modificado con lípido en 1% OG se añade a los liposomas preformados a la vez que se agita en un vórtex, en una proporción de volúmenes comprendida entre 1:3 y 1:10. La mezcla se agita en un vórtex durante entre aproximadamente 5 y 10 minutos para obtener una disolución transparente de scFv-inmunoliposomas. El resto del OG y el scFv no acomplejado se pueden eliminar mediante cromatografía, aunque no interferirán demasiado con su utilización posterior. Los experimentos de separación, es decir, ultracentrifugación con Centricon-100 (Amicon), flotación en Ficoll-400 [Shen D.F., et al., Biochem. Biophys. Acta 689:31-37 (1982)], o cromatografía en Sepharose CL-4B (Pharmacia), demostraron que virtualmente todas las moléculas de scFv etiquetadas con lípido añadidas se habían anclado a los liposomas catiónicos. Esta es una mejora sobre la muy inferior proporción de anclaje de Lpp-scFv a liposomas neutros o aniónicos. Por consiguiente, tales mejoras hacen innecesario incluir otra etapa de purificación con el fin de eliminar el scFv no unido.
Todo anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otros ligandos de péptido/proteína que se puedan modificar para que tengan una o más etiquetas lipídicas en la superficie son de utilidad en la presente invención. Otros procedimientos de modificación con lípido incluyen conjugar una cadena lipídica a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como se describe en Liposome Technology, 2nd Ed., Gregoriadis, G., Ed., CRC Press, Boca Ratón, FL. 1992.
En otro aspecto de la presente invención se añadió una cisteína al extremo C-terminal de la secuencia de scFv y la proteína se expresó en los cuerpos de inclusión de E. coli, se reconformó a continuación para producir scFv. La cisterna C-terminal proporcionó un grupo sulfidrilo libre para facilitar la conjugación del scFv a los liposomas. Se pueden utilizar dos estrategias en el procedimiento de conjugación. 1) El procedimiento de preenlace: La primera etapa consiste en conjugar el scFv-SH con el liposoma catiónico que contiene un grupo maleimidilo u otro grupo reactivo con sulfidrilo, para generar el scFv-liposoma. A continuación se añaden los ácidos nucleicos a los liposomas scFv para generar el complejo scFv-liposoma-ADN. Se designa preenlazado debido a que el scFv se une antes del acomplejamiento con el ADN. 2) Procedimiento de postenlace: Esta estrategia consiste en acomplejar inicialmente el liposoma catiónico con ácidos nucleicos con el fin de formar una estructura condensada. A continuación se une el scFv-SH sobre la superficie del complejo de ADN-liposoma para generar scFv-liposoma-ADN. Se designa postenlace debido a que el scFv es une después de acomplejar ADN. La estrategia postenlace asegura que el 100% del scFv enlazado se encuentra sobre la superficie del complejo, accesible a la unión con los receptores. Por consiguiente, dicho procedimiento puede hacer una mejor utilización del ligando scFv de dirección y una estructura interna del complejo mejor controlada.
El complejo de ácido nucleico-inmunoliposoma, independientemente de que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se encuentre unido a lípido o conjugado a un liposoma, se puede utilizar terapéuticamente. Preferentemente los complejos se unen a un lugar de interés, preferentemente a una célula que es una célula cancerosa, más preferentemente a una célula que expresa un receptor de transferrina. El agente director es el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que preferentemente se une al receptor de transferrina. El ácido nucleico es el agente terapéutico y es preferentemente una molécula de ADN y más preferentemente codifica una molécula silvestre de p53. Los complejos de ácido nucleico-inmunoliposoma, preferentemente en una composición terapéutica, se pueden administrar sistémicamente, preferentemente intravenosamente.
Breve descripción de los dibuojos
La Figura 1 muestra la construcción de etiqueta lipídica scFv TfR.
La Figura 2 muestra un análisis mediante transferencia Western de la expresión de p53 in vivo, en xenotransplantes tumorales, dirigida mediante scFV-liposomas, con administración sistémica.
La Figura 3 muestra los constructos de pCMVp53 y pCMVpRO.
La Figura 4 muestra la construcción p53-3'Ad.
La Figura 5 muestra la construcción de scFvTfR-cisteína provisto de una etiqueta His.
La Figura 6 muestra la construcción de scFvTfR-cisteína desprovisto de una etiqueta His.
La Figura 7 muestra la construcción de scFvTfR-cisteína provisto de una etiqueta de dominio de enlace a celulosa (CBD) y con una etiqueta-S.
La Figura 8 muestra un gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomassie Blue de proteína TfRscFv producida mediante el procedimiento de conjugación.
La Figura 9 muestra un análisis mediante transferencia Western de la expresión de p53 dirigida mediante TfRscFvliposomas construidos mediante el procedimiento de conjugación, in vivo en xenotransplantes de tumores, con administración sistémica.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a constructos, y liposomas que comprenden los constructos, y a procedimientos para la utilización de dichos liposomas. Se da a conocer una multiplicidad de formas de realización que comprenden inmunoliposomas con diferentes etiquetas y múltiples procedimientos mediante los que enlazar scFv a los liposomas. Los inmunoliposomas pueden incluir etiquetas lipídicas o pueden estar unidos a través de un grupo reductor, que en una forma de realización preferida es un sulfidrilo libre.
Las formas mutantes del gen supresor de tumores p53 se han asociado a más del 50% de los tumores humanos, que incluye entre el 15 y el 50% de los tumores de mama y entre el 25 y el 70% de los cánceres de próstata metastáticos. Las anormalidades del p53 se correlacionan también con una prognosis pobre en múltiples tipos de cánceres. Por consiguiente, la capacidad para administrar sistémicamente y dirigir terapia génica específicamente a los tumores con el fin de restablecer la función del wtp53 será una modalidad terapéutica importante en el tratamiento del cáncer. Así, los inmunoliposomas producidos mediante los procedimientos de la presente invención serán de utilidad como una nueva modalidad terapéutica contra el cáncer no solamente para restaurar la función del wtp53 sino también como vehículos de administración sistémica dirigida a los tumores para otros genes terapéuticos.
La invención se ilustra mediante los Ejemplos siguientes.
Ejemplo 1
Construcción y expresión de scFv etiquetado biosintéticamente con lípido
1. Construcción del vector de expresión para TfRscFv
Con el fin de construir el vector de expresión, se utilizó un vector pLP1 que comprende una secuencia de aminoácidos de unión entre el péptido señal de la lipoproteína de E. coli (ssLPP) y el lugar de clonación de scFv [de Kruif et al., FEBS Lett. 399:232-236 (1996)]. Dicho vector contiene tanto la secuencia de etiqueta para c-myc como la de His6 que se pueden utilizar para la purificación y detección del scFv expresado (Figura 1).
Se obtuvo un vector de expresión de plásmido, pDFH2T-vecOK, que comprende el fragmento de cadena única del anticuerpo 5E9 [Haynes et al., J. Immunol., 127:347-351(1981)] unido a una proteína de unión a ADN, que reconoce el receptor de transferrina humano (TfR). Dicho vector también comprende la secuencia de una proteína de unión a ADN y no existen lugares de enzima de restricción únicos flanqueando la secuencia de scFv en el pDFH2T-vecOK. Por consiguiente, se clonó el VH-conector-VkscFv mediante amplificación por PCR del fragmento deseado utilizando un cebador 5' (5' GGCCCATGGAGGTGCAGCTGGTGG 3') (SEC ID nº:1)) (RB551) que contiene un lugar NcoI y un cebador 3' (RB552) (5' CCGGAATTCGCGGCCGCTTTTATCTCCAGCTTGGTC 3' (SEC ID nº: 2)) que contiene un lugar NotI. La amplificación por PCR utilizando los cebadores RB551 y RB552 amplificó el scFv para TfR de pDFH2TvecOK desde la Met en la base 81 hasta la Lys en la base 821. El vector pLP1 también contiene la secuencia para el péptido de señal de la lipoproteína (ssLPP) de E. coli y los 9 aminoácidos N-terminales (LPP) de la lipoproteína de E. coli, tal como describen Laukkanen M.L., et al., [Laukkanen M.L. et al., Biochemistry, 33:11664-11670 (1994)] y de Kruif et al., [de Kruif, et al., FEBS Lett. 399:232-236 (1996)]. La inserción de dichas secuencias conducirá a la acilación con ácido graso de la señal expresada en el huésped E. coli y a su inserción en la membrana bacteriana. El vector tiene también una secuencia conectora de 10 aminoácidos no crítica, destinada a incrementar el espacio entre el lugar de la etiqueta lipídica y el scFv. La purificación del la secuencia scFv modificada con lípido de las membranas bacterianas produce una molécula activa que se puede unir o insertar en liposomas.
2. Expresión y purificación de TfRscFv
Se transformó el huésped E. coli de expresión SF110F' con el vector de expresión construido anteriormente. Aunque la célula huésped no es crítica, se prefiere que esté provista del represor lac expresado. Se seleccionaron múltiples colonias y se seleccionó la de mayor rendimiento en scFv. Se aisló el scFv (lpp-scFv) modificado con lípido de las membranas bacterianas utilizando Triton X-100 tal como describen de Kruif et al., [de Kruif et al., FEBS Lett., 399:232-236 (1996)]. Con el fin de purificar se resuspendió una sola colonia en 200 µl de LB conteniendo 5% de glucosa y los antibióticos adecuados. La mezcla se sembró en dos placas de agar LB de 90 mm que contenían 5% glucosa y los antibióticos adecuados y se dejó crecer durante la noche. Al día siguiente, se extrajeron las células de las placas y se utilizaron para inocular un total de 5 litros de LB que contenía 0,1% de glucosa y los antibióticos adecuados. Los cultivos de dejaron crecer a 25ºC, 200 rpm durante 6 horas hasta que la OD600 alcanzó entre 0,5 y 0,7. Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y se continuó la incubación de los cultivos durante la noche. Al día siguiente, se cosecharon los cultivos bacterianos mediante centrifugación y se procedió a su lisis en 200 ml de tampón de lisis a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se sonicaron a 28 vatios durante 5 minutos enfriadas en hielo. El tampón de lisis comprende 20 mM HEPES pH 7,4 a 7,9, 0,5 M NaCl, 10% glicerol y 0,1 mM PMSF. La única diferencia del protocolo citado incluye lavar y eluir las columnas de afinidad a metales en un tampón que contiene 20 mM HEPES pH comprendido entre 7,4 y 7,9, 0,5 M NaCl, 10% glicerol, 0,1 mM PMSF, 1% n-octil β-D-glucósido (OG) y con 10% glicerol que contiene 20 y 200 mM imidazol, respectivamente. Las muestras de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Lpp-scFv eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-c-myc 9E10, lo que confirmó que el scFv purificado mostraba una banda de un tamaño de aproximadamente 30 kDa.
Ejemplo 2
Preparación de inmunoliposomas de scFv etiquetado con lípido mediante un procedimiento de disolución de película de lípido
El presente ejemplo da a conocer con detalle el procedimiento de disolución de película lipídica destinado a la preparación de inmunoliposomas de scFv etiquetado con lípido. Se evaporaron a presión reducida 5 µmol lípidos (DOTAP/DOPE, proporción molar 1:1) en cloroformo para obtener una película de seca de lípido en un frasco de fondo redondo. Se añadió a la película de lípido 0,5 ml de 1% OG, 20 mM de HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4, que contienen el scFv modificado con lípido. Esto se incubó entre 10 y 20 minutos a temperatura ambiente y se agitó vórtex para disolver la membrana de lípido. Se añadieron a continuación 2 ml de agua para diluir la mezcla de scFvlípido. Se sonicó la mezcla brevemente para aclararla en un baño a 20ºC. El scFv-liposoma es una disolución transparente en la que queda una cantidad limitada del detergente OG. El OG y el scFv no acomplejados se pueden eliminar mediante cromatografía en Sepharose CL-4B o Sephacryl S500, aunque estos no interfieren demasiado con la siguiente utilización.
Ejemplo 3
Preparación de inmunoliposomas de scFv etiquetado con lípido mediante un procedimiento de anclaje directo
El presente ejemplo proporciona un procedimiento de anclaje directo para la preparación de inmunoliposomas de scFv etiquetado con lípido. A 10 ml de agua pura se le añaden 20 µmol de lípidos (LipA-H, ver a continuación la composición y proporciones) preparados como una capa seca de lípido en un frasco de fondo redondo y se sonica en un sonicador tipo baño durante entre 10 y 30 minutos a temperatura ambiente (LipA, B, C) o a 65ºC [LipD, E, G, H o una composición cualquiera de Colesterol (Chol)]. Los liposomas catiónicos preparados forman una disolución transparente, sus composiciones y proporciones son las siguientes:
LipA DOTAP/DOPE 1:1 proporción molar LipB DDAB/DOPE 1:1 proporción molar LipC DDAB/DOPE 1:2 proporción molar LipD DOTAP/Chol 1:1 proporción molar LipE DDAB/Chol 1:1 proporción molar LipG DOTAP/DOPE/Chol 2:1:1 proporción molar LipH DDAB/DOPE/Chol 2:1:1 proporción molar
Con el fin de unir el scFv a los liposomas preformados, el scFv modificado con lípido (lpp-scFv) en 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4, que contiene 1% OG se añade a los liposomas preformados a la vez que se agita en vórtex, en una proporción de volúmenes comprendida entre 1:3 y 1:10. La mezcla se agita en vórtex durante entre 1 y 5 minutos adicionales para obtener una disolución transparente de inmunoliposomas-scFv. El OG restante y el scFv no acomplejado se pueden eliminar mediante cromatografía, aunque no interfieren demasiado con su utilización posterior. Los experimentos de separación, es decir, ultracentrifugación mediante Centricon-100 (Amicon), flotación en Ficoll-400 [Shen D.F., et al., Biochem. Biophys. Acta, 689:31-37 (1982)] o cromatografía en Sepharose CL-4B (Pharmacia), demostraron que virtualmente todo el scFv etiquetado con lípido añadido se había unido o anclado a los liposomas catiónicos. Esto es contrario a la muy inferior proporción de lpp-scFv que se une a los liposomas neutros o aniónicos. Por consiguiente, no es necesaria una etapa de purificación adicional para eliminar el scFv no unido.
Ejemplo 4
Inmunorreactividad de los inmunoliposomas de scFv etiquetado con lípido demostrada mediante ELISA, FACS e inmunofluorescencia
Este ejemplo proporciona la caracterización de los inmunoliposomas anti TfR scFv con respecto a su capacidad para unirse a las células TfR(+). En estos estudios, las línea celulares DU145 de cáncer de próstata y JSQ-3 de carcinoma escamoso humano de cabeza y cuello sirvieron como células diana TfR+.
Se utilizó el ensayo celular indirecto mediante inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) con el fin de determinar la inmunorreactividad del Ipp-scFv antes y después de la unión a liposomas. Se fijaron células JSQ-3 confluentes en placas de 96 pocillos, con glutaraldehído 0,5% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. La placa se bloqueó con 5% suero bovino fetal (FBS) en PBS a 30ºC durante 30 minutos. Se añadió lpp-scFv, scFvinmunoliposomas y liposomas a los pocillos por duplicado y se incubó a 4ºC durante la noche. Después de tres lavados con PBS, se añadió anticuerpo monoclonal anti-c-myc a cada pocillo en 3% FBS en PBS y se incubó a 37ºC durante 60 minutos. Después de tres lavados con PBS, se añadió a cada pocillo IgG de cabra contra ratón marcada con HRP (Sigma), diluida en 3% FBS y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se lavó la placa tres veces con PBS y se añadió a cada pocillo 100 µl de sustrato OPD 0,4 mg/ml en tampón citrato fosfato (Sigma). Se detuvo el revelado de color mediante la adición a cada pocillo de 100 µl de 2 M ácido sulfúrico. Se leyó la placa a 490 nm en un lector de placas de ELISA (Molecular Devices Corp.). El ELISA celular indirecto demostró que el anti-TfR scFV retuvo su inmunorreactividad después de incorporado en el complejo de liposomas (Tabla 1).
TABLA 1
Unión de anti-Tfr scFv-liposomas a células JSQ-3*
Lip(A) solamente 0,142 + 0,036 scFv-LipA1 1,134 + 0,038 scFv-LipA2 1,386 + 0,004 Lpp-scFv 0,766 + 0,009
* ELISA, OD490, Media + SD scFv-LipA1: mediante el procedimiento de disolución de película de lípido scFv-LipA2: mediante el procedimiento de anclaje directo
10 Para el análisis mediante FACS, se incubó anti-TfR scFV-Lip(A) a 4ºC con células JSQ-3 y DU145, a continuación con IgG de oveja antiratón marcada con FITC, también a 4ºC. La incubación de las células JSQ-3 con el scFv-Lip(A) produjo un desplazamiento de la fluorescencia idéntico al observado con un anticuerpo anti-TfR lpp-scFv libre no unido, demostrando una cantidad significativa de unión a las células diana. Por el contrario, los liposomas no
15 dirigidos demostraron muy poca unión a las células. Se observaron resultados semejantes con la línea de células tumorales de próstata DU145. En este caso también, el complejo scFv-Lip(A) demostró una clara y sustancial unión a las células tumorales, en comparación con el Lip(A) no dirigido. Los datos de FACS se sumarizan en la Tabla 2, en la que el desplazamiento fluorescente se indica como el porcentaje de células que despliegan fluorescencia por enzima del nivel umbral (porcentaje de células positivas). En estos estudios, el nivel de unión a las células,
20 representado mediante el porcentaje de células positivas, también fue semejante al del scFv libre, no unido, indicación adicional de que la incorporación en complejos de liposomas no inactiva la actividad inmunológica del anti-TfR lpp-scFv. Se debe indicar que la preparación de liposomas utilizada en estos experimentos iniciales con DU145 fue la optimizada para células JSQ-3. Por consiguiente, la unión del complejo de liposomas dirigidos mediante scFv a las células tumorales de próstata se puede amplificar además mediante la utilización de complejos
25 de liposomas optimizados para este tipo de células.
TABLA 2
Análisis mediante FACS de la unión de los TfRscFv-liposomas a JSQ-3 y DU145 30 JSQ-3 DU145
Transfectado mediante % positivos Mediaa % positivos Mediaa
No transfectadas 3,46 4,07 2,22 3,40 Lip(A) 9,69 6,26 4,51 4,07 scFv-LipA1 86,38 19,8 50,19 12,40 scFv-LipA2 89,58 21,30 39,52 11,1 Lpp-scFv libre 85,09 21,30 78,09 18,40 HB21b 99,44 69,80 98,70 64,90
a: Media de la fluorescencia relativa
b: anticuerpo monoclonal paterno de anti-TfR scFv
La tinción indirecta de inmunofluorescencia mediante scFv-liposomas (en la que Lip(A) ha sido marcado con rhodamina-DOPE) y IgG antiratón marcada con FITC después del anticuerpo anti c-myc, confirmó la unión a las células JSQ-3 del complejo de liposomas dirigido mediante scFv. La concurrencia de fluorescencia roja y verde en
35 las células transfectadas demuestra que el anti-TfR scFv (indicado como fluorescencia verde mediante el anticuerpo anti-c-myc marcado con FITC) desde luego dirige al Lip(A) marcado con rodamina a las células. Además, el elevado nivel de unión celular del sistema scFv-Lip(A) queda demostrado mediante el elevado porcentaje de células fluorescentes doblemente positivas rojo/verde.
40 Ejemplo 5
Optimización de la transfección génica in vitro de las células diana mediante scFv-inmunoliposomas
Se determinó la eficacia de transfección in vitro del complejo anti-TfR scFv-Lip(A) en células JSQ-3 utilizando β
45 galactosidasa como gen trazador. En estos estudios el constructo de trazador utilizada contenía el gen de la βgalactosidasa bajo el control del promotor CMV (pCMVb), el mismo promotor utilizado en pCMVp53 (Figura 3). El nivel de expresión de β-Gal en las células transfectadas (que se correlaciona con la eficacia de transfección) se ensayó mediante el ensayo enzimático de β-galactosidasa [Xu L., et al., Hum. Gene Ther., 8:467-475 (1997)]. Tal como se muestra en la Tabla 3, la unión del anti-TfR scFv al Lip(A) produjo una duplicación de la actividad enzimática en las células transfectadas mediante scFv-Lip(A)-pCMVb, en comparación con los complejos de liposomas no dirigidos. También se encontró que este nivel de expresión fue virtualmente idéntico al observado cuando se utilizó la transferrina misma como ligando director (Tf-Lip(A)-pCMVb). Además, se demostró que este
5 incremento en la expresión génica fue dependiente de la dosis de ADN del gen trazador. La Tabla 4 muestra la optimización de la transfección mediante scFv-liposomas de las células JSQ-3.
TABLA 3
10 Transfección de las células JSQ-3 mediante anti-TfR scFv-liposomas*
ADN (µg/pocillo) Lip(A) solamente Tf-Lip(A) scFv-LipA1 scFv-LipA2
1,0 475 1031 997 1221 0,5 601 981 811 854 0,25 266 503 578 471 0,125 130 262 215 236
*miliunidades/mg proteína, equivalente de β-galactosidasa, ensayo enzimático de β-Gal scFv-LipA1: mediante el procedimiento de disolución de película de lípido scFv-LipA2: mediante el procedimiento de anclaje directo
TABLA 4 Optimización de la transfección mediante scFv-liposomas a JSQ-3* ADN/Lip Lip(A) (µg/nmol) solamente scFv-LipA1 scFv-LipA2 scFv-LipB scFv-LipD scFv-LipG
1/8 1,559 2,793 2,642 1,827 0,874 0,648 1/10 1,776 2,846 2,83 2,268 1,606 1,283 1/12 1,868 2,772 2,815 2,175 1,257 1,416 1/14 1,451 3,031 2,797 2,31 1,78 1,656
*ensayo enzimático de β-Gal, OD405 scFv-LipA1: mediante el procedimiento de disolución de película de lípido scFv-LipA2: mediante el procedimiento de anclaje directo
Ejemplo 6
20 La transfección génica de p53 mediante scFv-inmunoliposomas dirigida a células tumorales resulta en la sensibilización a los agentes terapéuticos
1. Transfección génica de wtp53 mediante anti-TfR scFv in vitro
25 La expresión de wtp53 exógeno en células tumorales JSQ-3 transfectadas mediante Lip(A)-p53-3'Ad dirigido por anti-Tfr-scFv se ensayó por cotransfección de un plásmido de expresión (pBP100) que comprende el gen trazador de luciferasa bajo el control de un promotor sensible a p53 [Chen L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:195-200 (1998)]. En consecuencia, cuanto mayor el nivel de expresión wtp53 exógeno (que representa la eficacia de transfección con scFv-Lip(A)-p53-3'Ad), mayor será el nivel de actividad de luciferasa. Dicha actividad enzimática de
30 luciferasa se expresa como unidades relativas de luz (RLU). Tal como se demostró anteriormente con el gen trazador de β-gal, la adición del anti-TfR-scFv como agente director al complejo de Lip(A)-p53-3'Ad resultó en un incremento significativo en la eficacia de transfección y en la expresión de proteína wtp53 (tal como se expresa mediante RLU de actividad luciferasa) sobre el complejo Lip(A)-p53-3'Ad no dirigido (Tabla 5). De nuevo, el nivel de expresión de p53 en las células transfectadas mediante scFv-Lip(A)-p53-3'Ad fue similar al observado cuando se
35 utilizó la transferrina misma como ligando director (LipT(A)-p53-3'Ad). Por consiguiente, dichos descubrimientos indican que la estrategia de anticuerpo de cadena única anti-TfR es un procedimiento de utilidad para dirigir los complejos de liposomas catiónicos y administrar un gen de wtp53 silvestre a las células tumorales.
TABLA 5 40 Expresión de p53 en células JSQ-3 in vitro mediada por diferentes liposomas
Transfectadas mediante: RLU* 2. El restablecimiento de p53 mediante anti-TfR-scFv-inmunoliposomas sensibilizó a las células tumorales a la citotoxicidad de Cisplatino (CDDP).
Medio
+p53-3'Ad + pBP100 158
Lip(A)
+p53-3'Ad + pBP100 4073
LipT(A)
+p53-3'Ad + pBP100 7566
scFv-Lip(A1)
+p53-3'Ad + pBP100 6441
*Unidades relativas de luz por pocillo
9
5 En el estudio de apoptosis inducida mediante p53, se transfectó la línea celular B16 de melanoma de ratón con anti-TfR scFv-inmunoliposomas acomplejados con ADN de los plásmidos p53-3'Ad (Figura 4) o a pCMVpRo (Figura 3) (scFv-Lip(A)-p53 y scFv-Lip(A)-pRo, respectivamente) en una dosis de 5 µg ADN/2 x 105 células en 2 conjuntos de placas de 6 pocillos. Con el fin de comparar, también se transfectaron liposomas de transferrina-ADN (LipT-p53 o LipT-pRo) a una dosis de 5 µg ADN/2 x 105 células. 24 horas más tarde, se añadió CDDP a un conjunto de placas a
10 una concentración final de 10 µM. Una vez transcurridas entre 24 y 48 horas desde la adición del fármaco, se recogieron tanto las células sueltas como las enganchadas para la tinción de apoptosis. Las células se tiñeron con el equipo Annexin V-FITC (Trevigen, Inc., Gaithesburg MD) según el protocolo del fabricante. La Annexina V es una lipocortina, una proteína natural de la sangre y un anticoagulante. Las células teñidas se analizaron mediante un citómetro FACStar (Becton and Dickinson). La Tabla 6 sumariza los resultados del análisis de apoptosis.
15 TABLA 6
Apoptosis de células B16 inducida mediante la restauración del gen p53 y CDDP*
24 horas 48 horas
Transfectado mediante -CDDP +CDDP -CDDP +CDDP
No transfectado 0,22 4,4 6,33 20,11 LipA-p53 15,9 26,7 15,02 26,52 scFv-LipA-p53 13,9 38,4 34,94 43,7 scFv-LipA-pRo 8,1 19,9 24,14 37,59 Tf-LipA-p53 22,4 29,5 34,47 31,7 Tf-LipA-pRo 14,1 12,6 14,00 25,34
*% de células apoptóticas (positivas a Annexina V-FITC)
20 Sin CDDP no se produjo incremento en el porcentaje de células apoptóticas inducido a las 24 horas mediante la adición de ligando scFv en comparación con la cantidad inducida mediante el complejo de liposomas solamente. Sin embargo, a las 48 horas, se produjo un incremento superior a dos veces en el porcentaje de células apoptóticas mediante la adición al lipoplex del scFv director. Con CDDP se produce un incremento significativo en células
25 apoptóticas (aproximadamente de 1,5 veces) incluso a las 24 horas, en comparación con los complejos de liposomas no dirigidos. Más significativamente, dicho incremento en células apoptóticas en combinación con CDDP es más pronunciado cuando se utiliza scFv al receptor de Tf como ligando director que cuando se utiliza la moléculas de Tf propiamente. Este incremento se correlaciona con la eficacia de transfección.
30 Ejemplo 7
Administración del gen wtp53 dirigida mediante scFv-inmunoliposomas y expresión in vivo con administración sistémica
35 Con el fin de examinar la capacidad de los liposomas que contienen anti-Tfr scFv para administrar wtp53 específicamente al tejido tumoral in vivo, se inyectó intravenosamente scFv-Lip(A)-p53-3’Ad (Figura 4) o Lip(A)-p533'Ad no dirigido (Figura 4) en ratones desnudos portadores de xenotransplantes de tumores JSQ-3 subcutáneos. Dos días después de la inyección, se extrajeron los tumores y se aislaron proteínas del hígado y de la piel, así como también del tumor, para análisis mediante transferencia Western [Xu L., et al., Hum. Gene Ther., 8:467-475 (1997)].
40 En cada carril se cargaron cantidades iguales de proteína (100 µg, tal como se determinó por concentración). Tal como se muestra en la Figura 2, el tumor del ratón tratado sistémicamente con el complejo scFv-Lip(A)-p53-3'Ad, marcado scFv-Lip(A)-p53 en la Figura 2, mostró una señal muy intensa de p53 así como también la banda inferior adicional indicativa de un elevado nivel de expresión de wtp53 exógeno, mientras que solamente la expresión inferior del p53 endógeno de ratón es evidente tanto en la piel como en el hígado. Por el contrario, tal como se
45 esperaría basándose en los resultados anteriores, es evidente un nivel significativamente inferior de expresión de p53 exógeno en el tumor aislado del ratón inyectado con Lip(A)-p53-3'Ad no dirigido, marcado Lip(A)-p53 en la Figura 2. Por consiguiente, los complejos de liposomas dirigidos mediante nuestro nuevo y único ligando anti-TfR Ipp-scFv claramente puede administrar genes exógenos selectivamente a los tumores humanos in vivo. Estos resultados demuestran el potencial de este nuevo modo de dirigir con eficacia los complejos de liposomas catiónicos
50 administrados sistémicamente, específicamente a los tumores in vivo.
Ejemplo 8
Construcción y purificación de TfRscFv con una cisteína 3' destinada a la utilización en los procedimientos 55 de conjugación
En ausencia de una etiqueta lipídica, se diseñó otro procedimiento para unir la proteína TfRscFv purificada al lipoplex. Esta estrategia comprende la conjugación de una proteína de péptido único a los liposomas catiónicos mediante un grupo reducible tal como un grupo sulfidrilo. En la forma de realización preferida se añade un residuo de cisteína al extremo 3' de la proteína TfRscFv. La reducción de dicha cisteína produce un grupo sulfidrilo libre capaz de ser conjugado a liposomas catiónicos, dirigiendo así el lipoplex a las células que expresan el receptor de transferrina. Mientras que los ejemplos siguientes utilizan cisteína como el grupo reducible es evidente que otros grupos reductores similares también podrían funcionar con este procedimiento.
1. Construcción
A. Construcción de un vector de expresión que comprende una cisteína 3' con una etiqueta de histidina para ser utilizado en el procedimiento de conjugación para producir inmunoliposomas TfRscFv
Tal como en el Ejemplo 1, el scFv VH-conector-Vk para el TfR se obtuvo a partir del vector de expresión de plásmido, pDFH2T-vecOK (descrito en el Ejemplo 1). Utilizando un cebador 5' (5'GGCCCATGGAGGTGC AGCTGGTGG 3' (SEC ID nº:3)) para la amplificación mediante PCR, se introdujo un lugar NcoI en el pDFH2TvecOK. La secuencia de nucleótidos para el residuo de cisteína así como el lugar de restricción NotI se introdujo utilizando un cebador 3'(5'GGCGCGGCCGCGCATTTTATCTCCAGCTTG 3' (SEC ID nº:4)). El producto de PCR se clonó en los lugares NcoI y NotI, del vector comercial pET26b(+) (Novagen). Este vector también comprende, 5' del lugar NcoI, la secuencia de señal guía de pelB. La presencia de dicha secuencia en el vector de expresión permite el transporte de la proteína al espacio periférico. Para asistir en la purificación de la proteína, el vector pET26b(+) también comprende un secuencia de etiqueta de histidina en posición 3' del lugar NotI (Figura 5).
B. Construcción de un vector de expresión que comprende una cisteína 3' sin etiqueta de histidina para su utilización en el procedimiento de conjugación destinado a producir inmunoliposomas TfRscFv.
Para su utilización como vehículo de administración terapéutica en humanos, es preferible que el TfRscFv se produzca sin la etiqueta de histidina. Por consiguiente, el constructo descrito en el Ejemplo 8, sección 1.A, se modificó para eliminar dicha etiqueta en el producto de proteína final. Para lograr esto, se utilizó el mismo cebador 5' que se describió anteriormente (Ejemplo 8, sección 1.A). Sin embargo, se utilizó un cebador 3' diferente. Además de la secuencia de nucleótidos del residuo de cisteína y del lugar de restricción NotI, dicho cebador (5' GGCGCGGCCGCTCAGCATTTTATCTCCAGCTTG 3' (SEC ID nº: 5)), introduce un codón de ADN de parada adyacente a la secuencia de cisteína y antes del lugar NotI (Figura 6). Por consiguiente, el producto de proteína de este constructo no contiene la etiqueta de His.
C. Construcción de un vector de expresión con una císteína 3' con una etiqueta S’-CBDTM destinada a ser utilizada en el procedimiento de conjugación para producir los inmunoliposomas TfRscFv
También se generó un tercer constructo alternativo que contiene un residuo de cisteína para unirse al lipoplex catiónico utilizando el procedimiento de conjugación. En este constructo (Figura 7), se utilizaron los dos mismos cebadores descritos anteriormente en el Ejemplo 8, sección 1.B. Por consiguiente, no existe etiqueta de His en el producto de proteína. Sin embargo, el producto de PCR de dichas reacciones se clonó en un vector diferente, pET37b(+) (Novagen). Este vector contiene una etiqueta de dominio de enlace a celulosa (CBDTM-tag) y una etiqueta-S, las dos en posición 5' de lugar NcoI en el vector. La secuencia de la etiqueta-CBD codifica un dominio de enlace a celulosa derivado de una celulasa microbiana. Por consiguiente, la presencia de dicha etiqueta permite la utilización de soportes a base de celulosa para la purificación del producto de proteína mediante afinidad con gran especificidad, eficacia y bajo coste. La presencia de la etiqueta S en este constructo permite detectar con facilidad el producto de proteína en transferencias Western y una fácil cuantificación enzimática de las cantidades de proteína.
2. Purificación del TfRscFv que contiene el residuo de cisteína
El huésped de expresión E. coli comercialmente disponible BL21(DE3), que contiene el represor expresado de lac., se transformó con el vector de expresión (se utilizaron los tres individualmente) descrito anteriormente en el ejemplo 8, sección 1. Se seleccionaron múltiples clones y se eligieron los que produjeron el mejor rendimiento de TfRscFv. La purificación de la proteína del constructo descrito anteriormente en el Ejemplo 8, sección 1.A, con la etiqueta de Histidina se describe detalladamente como un ejemplo, aunque se utiliza el mismo procedimiento con el fin de purificar la proteína TfRscFv que contiene cisteína a partir de los tres constructos descritos en el Ejemplo 8, sección
1. Se encontró que la mayoría de la proteína TfRscFv (aproximadamente el 90%) no era soluble sino que se encontraba comprendida en los cuerpos de inclusión. Por consiguiente, el TfRscFv que contiene el conector de cisteína se purificó a partir de los cuerpos de inclusión del modo siguiente. Se inoculó una sola colonia en 5 a 10 ml de medio LB que contenía 50 µg/ml de Kanamicina y se creció a 37ºC y 250 rpm hasta una OD600 comprendida entre 0,5 y 0,7 (4 a 5 horas). Se centrifugaron 30 ml del mini cultivo, se suspendieron en caldo LB, se añadió 1 l de LB que contenía 50 µg/ml de Kanamicina y se incubó a 37ºC y 250 rpm, hasta alcanzar una OD600 comprendida entre 0,5 y 0,7 (4 a 5 horas). Para inducir la expresión de la proteína TfRseFv, en ese momento se añadió al cultivo IPTG a una concentración final de 1 mM y se continuó la incubación durante 4 horas adicionales. Se determinó que este tiempo producía el máximo nivel de expresión de proteína. A continuación se cosecharon los cultivos bacterianos mediante centrifugación y se indujo la lisis en 100 ml de 20 mM Tris-HCl frío, pH 7,5, que contenía 100
5
15
25
35
45
55
µg/ml de lysozima, a 30ºC durante 15 minutos. Las muestras se sonicaron a 10 vatios durante 5 minutos (en explosiones de 30 segundos) con enfriamiento en hielo. Los cuerpos de inclusión se aislaron mediante centrifugación a 13.000 g durante 15 minutos. El precipitado resultante se lavó tres veces con tampón 20 mM Tris-HCl pH 7,5. La pureza y cantidad de los cuerpos de inclusión se determinó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS antes de la disolución.
Los cuerpos de inclusión aislados se disolvieron en 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 con 6 M guanidina-HCl y 200 mM NaCl (tampón 6 M GuHCl) y se centrifugó a 12.300 g durante 15 minutos para eliminar los residuos insolubles. Al sobrenadante se le añadió 2-mercaptoetanol hasta una concentración final en un exceso molar de aproximadamente 50 veces el de la concentración de proteína y se incubó la mezcla con rotación durante 1 hora a temperatura ambiente. La presencia de una concentración tan elevada de guanidina HCl y el agente reductor produjo una proteína totalmente desnaturalizada. La renaturalización de la proteína TfRscFv se logró mediante diálisis contra concentraciones decrecientes de guanidina-HCl a 4ºC en ausencia de 2-mercaptoetanol. La diálisis se realizó durante 24 horas cada una contra las siguientes concentraciones de guanidina-HCl en 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 y 200 mM NaCl: 6 M, 3 M, 2 M, 1 M y 0,5 M. La última diálisis fue contra tres cambios de 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 y 200 mM NaCl. La cuarta solución de diálisis (de 1M guanidina-HCl) contuvo también 2 mM glutatión (forma oxidada) y 500 mM L-arginina. Tales reactivos permiten que la proteína parcialmente renaturalizada forme los enlaces disulfuro adecuados para generar la conformación adecuada de la proteína. Con el fin de eliminar los agregados la disolución se aclaró mediante centrifugación a 13.000 g. La muestra se concentró a aproximadamente 1,5 veces utilizando un filtro centrífugo Centrplus (Amicon) a 3.000 g durante 90 minutos. SDS-PAGE demostró una sola banda del TfRscFv disuelto que contenía cisteína con un peso molecular comprendido entre aproximadamente 28 y 30 kDa, que solamente contenía un contaminante (Figura 8).
Ejemplo 9
Preparación de scFv-liposomas mediante el procedimiento de conjugación
1. Reducción del scFv
El TrRscFv purificado se redujo con DTT para obtener monómeros de scFv-SH tal como sigue: Al scFv en HBS (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) se le añadió 1 M DTT a una concentración final comprendida entre 1 y 50 mM. Después de rotar a temperatura ambiente durante entre 5 y 10 minutos, se desaló la proteína en una columna 10DG (Bio-Rad). El grupo SH libre se midió mediante ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB, reactivo de Ellman)
[G.L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959); P.W. Riddles, R.L. Blakeley, B. Zeruer, Methods Enzymol., 91:49-60 (1993)] y se calculó como la proporción molar -SH/proteína, o como el número de -SH libre por molécula de scFv (Tabla 7). Los resultados indican que el 1-10 mM DTT es adecuado para reducir el scFv.
TABLA 7
Reducción de TfRscFv
Concentración de DTT (mM) Proporción molar -SH/scFv
0 0,15 1 0,45 10 1,94 20 2,26 50 3,03
2.
Preparación de liposomas
En las siete formulaciones de liposomas descritas en el Ejemplo 3, se incluye 4-(p-maleimidofenil)butirato-DOPE (MPB-DOPE) (Avanti Polar Lipids) hasta una proporción molar de lípidos totales comprendida entre el 5 y el 8%. Los liposomas MPB se prepararon tal como se describió en el Ejemplo 3. También se pueden utilizar otros procedimientos de preparación de liposomas para producir los liposomas catiónicos. Por ejemplo, en la presente invención se utilizó con éxito el procedimiento de inyección de etanol modificado según describe Campbell M.J. (Biotechniques 18(6):1027-32 Junio 1995). En resumen, todos los lípidos se disolvieron en etanol y se mezclaron, se inyectaron agua pura agitada mediante vórtex a entre 50 y 60ºC con una jeringa Hamilton. La disolución se agitó mediante vórtex durante otros 10 a 15 minutos. La concentración final fue de entre 1 y 2 mM lípido total. El procedimiento de inyección de etanol es rápido, más fácil y más robusto. Se añadió 1 M HEPES, pH 7,5 (pH 7,0 a 8,0) hasta una concentración final comprendida entre 10 y 20 mM. Debido a que se ha descubierto que el grupo maleimido no es estable en una disolución acuosa de pH > 7, los liposomas se deben preparar en agua (pH 5 a 6,5). El pH se puede ajustar a entre 7,0 y 8,0 antes de enlazar al scFv-SH, mediante tampón 1 M HEPES, pH 7,0 a 8,0, para facilitar la reacción de post recubrimiento.
3.
Preparación de los complejos de scFv-liposoma-ADN
A. Procedimiento de preenlace
Se añadió scFv-SH a los liposomas-MPB a una proporción proteína/lípido (peso/peso) de 1/5 a 1/40, preferentemente de 1/10 a 1/20. La disolución se mezcló mediante una suave agitación rotativa durante 30 minutos a temperatura ambiente para generar scFv-Lip. El scFv-Lip se utilizó sin más purificación aunque se puede purificar mediante cromatografía en columnas de Sepharose CL-4B. El ADN de plásmido se diluyó en agua y se añadió al scFv-Lip en una proporción de ADN/lípido (µg/nmol) comprendida entre 1/6 y 1/20 preferentemente comprendida entre 1/10 y 1/14. La disolución se mezcló bien durante entre 5 y 15 minutos mediante inversiones repetidas para generar complejos scFv-Lip-ADN. El scFv-Lip-ADN se utilizó sin más purificación aunque se puede purificar mediante cromatografía de columna en Sepharose CL-4B. Se encontró entre el 80 y el 100% del scFv conjugado a los liposomas.
B. Procedimiento de postenlazamiento
Se diluyó el ADN de plásmido en agua y se añadió a los MPB-liposomas a una proporción ADN/lípido (µg/nmol) comprendida entre 1/6 y 1/20, preferentemente comprendida entre 1/10 y 1/14. La disolución se mezcló bien mediante inversiones repetidas durante entre 5 y 15 minutos para generar complejos MPB-Lip-ADN. A continuación se le añadió al complejo el scFv-SH en una proporción de proteína/lípido (peso/peso) comprendida entre 1/5 y 1/40, preferentemente comprendida entre 1/10 y 1/20. La disolución se mezcló mediante una agitación de rotación suave durante 30 minutos a temperatura ambiente, para producir el complejo final de scFv-Lip-ADN. El scFv-Lip-ADN se utilizó sin purificación aunque se puede purificar mediante cromatografía en columnas de Sepharose CL-4B. Se encontró entre el 80 y el 100% del scFv conjugado a los liposomas. 4. Para la inyección intravenosa, se añadió al scFv-Lip-ADN una disolución de 50% dextrosa hasta una concentración final del 5%.
Ejemplo 10
Inmunorreactividad de los TfRscFv-inmunoliposomas que contienen cisteína mediante ensayo ELISA
El presente ejemplo proporciona la caracterización de los anti-TfRscFv-inmunoliposomas producidos mediante el procedimiento de conjugación de la presente invención con respecto a su capacidad de unión a las células TfR(+) in vivo. En los presentes estudios se utilizó la línea de células de carcinoma escamoso de cabeza y cuello JSQ-3 que sirvió como célula diana TfR(+).
Tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 4, se utilizó el ensayo celular indirecto mediante inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) con el fin de determinar la inmunorreactividad del TfRscFv antes y después de la conjugación a los liposomas. Se fijaron con 0,5% glutaraldehído en PBS células JSQ-3 confluentes en placas 96 pocillos, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las placas se bloquearon con suero bovino fetal (FBS) al 5% en PBS a 30ºC durante 30 minutos. El TfRscFv solo que contiene cisteína, este TfRscFv conjugado a liposomas catiónicos (TfRscFv-inmunoliposomas) y liposomas no dirigidos se añadieron a las placas por triplicado. Se utilizó un anticuerpo monoclonal antirreceptor de la transferrina (Hb21, obtenido de David Fitzgerald, NIH) en una serie de pocillos como control positivo. La placa se incubó a 4ºC durante la noche. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS y se añadió a cada pocillo un anticuerpo monoclonal anti-His (Qiagen) (excepto a los que recibieron el control de anticuerpo positivo) en 3% FBS en PBS y se incubó a 37ºC durante 60 minutos. Después de 3 lavados con PBS, se añadió a cada pocillo IgG de cabra antiratón marcada con HRP (Sigma) diluida en 3% FBS y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. La placa se lavó tres veces con PBS y se añadió a cada pocillo 100 µl de sustrato 0,4 mg/ml OPD en tampón citrato fosfato (Sigma). El revelado de color se terminó mediante la adición de 100 µl de ácido sulfúrico 2 M a cada pocillo. La placa se leyó en un lector de placas ELISA (Molecular Devices Corp.) a 490 nm.
El ELISA celular indirecto claramente demuestra que el anti-TfRscFv que contiene cisteína C-terminal mantiene su inmunorreactividad. Los valores de OD490 aumentaron con el incremento en la cantidad de la proteína TfRscFv, incrementando desde 0,060 + 0,0035 con 0,6 µg de proteína, a 0,100 + 0,0038 a 1,5 µg y 0,132 + 0,0031 con 3 µg de TfRscFv. Además, esta proteína TfRscFv parece incluso tener una mayor capacidad de unión que el anticuerpo Hb21 anti-receptor de la transferrina utilizado como control positivo. La OD490 para la concentración más elevada de Hb21 (100 µl) fue de aproximadamente 2 a 4 veces inferior (0,033 + 0,0086).
El ensayo celular indirecto ELISA se realizó también después de que la misma proteína TfRscFv se incorporase mediante el procedimiento de conjugación de la presente invención (Ejemplo 9) en dos tipos de liposomas catiónicos diferentes (Lip(A) y Lip(B)) con el fin de demostrar la universalidad del presente procedimiento con liposomas catiónicos. Se utilizaron los dos procedimientos de conjugación mediante pre-y postenlace para la preparación de liposomas, detallados en el Ejemplo 9. tal como se muestra en la Tabla 8, la inmunorreactividad de la TfRscFv preparada mediante el procedimiento de conjugación no se pierde por la conjugación a una cualquiera de los dos composiciones de liposomas. Ello fue cierto tanto para los procedimientos de pre-como de postenlace utilizados con el fin de producir los complejos de inmunoliposomas. Los lipolplexes dirigidos mediante TfRscFv también demostraron unión a las células. Dicha unión fue significativamente superior que la de los liposomas sin el TfRscFv, lo que sugiere que dicha unión está mediada de hecho a través del enlace de TfRscFv al receptor de la transferrina en las células.
TABLA 8 Unión del los TfRscFv-inmunoliposomas preparados mediante el procedimiento de conjugación a células JSQ-3 in vitro*
Proporción ADN:Lípido OD490
Lip(B)-ADN 1:10 0,088 TfRscFv-Lip(A)-ADN mediante Pre-1:10 0,152 + 0,016 TfRscFv-Lip(A)-ADN mediante Pre-1:12 0,166 + 0,009 TfRscFv-Lip(A)-ADN mediante Post-1:12 0,168 + 0,006 TfRscFv-Lip(B)-ADN mediante Pre-1:12 0,139 + 0,012 TfRscFv solamente --0,235
*ELISA, OD490, Media + SD (lecturas por triplicado excepto para Lip(B)-ADN) Pre-= Procedimiento de conjugación mediante preenlace Post-= Procedimiento de conjugación mediante postenlace
10 Ejemplo 11
Transfección génica de células diana in vitro mediante inmunoliposomas conjugados a TfRscFv
Se determinó la eficacia de transfección in vitro del complejo TfRscFv-liposoma, preparado mediante el
15 procedimiento de conjugación, en células utilizando el plásmido pLuc, que comprende el gen de la luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor CMV como gen marcador. Con el fin de demostrar la universalidad de TfRscFv como ligando de direccionamiento, también en este caso, como en el Ejemplo 10, se conjugaron dos composiciones diferentes de liposomas (Lip(A) y Lip(B)) a la proteína TfRscFv. En este estudio se utilizaron las líneas de cáncer de mama humano MDA-MB-435 y la línea JSQ-3 de carcinoma de célula escamosa de cabeza y
20 cuello. La transfección in vitro se realizó en placas de 24 pocillos [Xu L., et al., Hum. Gene Ther. 10:2941-2952 (1999)]. Las disoluciones para la transfección se añadieron a las células en presencia de suero al 10%. 24 horas más tarde se lavaron las células y se indujo su lisis con el fin de medir la actividad de luciferasa y la concentración de proteína. Los resultados se expresaron como 103 unidades relativas de luz (RLU) por µg de proteína en el homogeneizado, tal como se indica en las Tablas 9A y 9B.
25 TABLA 9A
Transfección in vitro mediante inmunoliposomas conjugados a TfRscFv#
Actividad luciferasa (x 103 RLU/µg proteína)
MDA-MB-435
JSQ-3
LipA
106 377
Tf-LipA
284 640
scFv-LipA*
560 1160
scFv-LipA**
660 1210
scFv-LipA (1/10)@
- 1315
scFv-LipA(1/20)@
- 751
30
# Media de los duplicados
*Contiene 5% MPB-DOPE
**Contiene 7% MPB-DOPE
@Proporción de scFv/lípido (peso/peso)
35
TABLA 9B
Actividad de transfección in vitro de los complejos de TfRscFv conjugado a complejos de inmunoliposoma-ADN
40
preparados para la administración sistémica
Actividad de luciferasa (x 103 RLU/µg proteína)
MDA-MB-435
JSQ-3
scFv-LipA-pLuc (preenlazado)*
58,4 675
scFv-LipA-pLuc (preenlazado)**
45,6 513
scFv-LipB-pLuc (preenlazado)*
51,4 415
scFv-LipA-pLuc (postenlazado)*
58,1 856
scFv-LipA-pLuc (postenlazado)**
45,3 343
scFv-LipB-pLuc (postenlazado)*
47,2 237
*Contiene 5% MPB-DOPE **Contiene 7% MPB-DOPE
Los resultados demuestran que los TfRscFv-inmunoliposomas que contienen cisteína preparados mediante el procedimiento de conjugación tienen una actividad de transfección muy elevada in vitro, entre 3 y 6 veces superior a la de los liposomas no dirigidos y entre 2 y 3 veces superior a la de los liposomas dirigidos a transferrina. Ello fue cierto para las dos composiciones de liposomas y para las dos líneas celulares tumorales humanas. Por consiguiente, estos todavía retienen su inmunorreactividad y se pueden unir a sus receptores diana. Con base en la Tabla 9A, los scFv-liposomas también se pueden utilizar como agentes de transfección génica eficientes in vitro y son muchos más eficientes que los liposomas catiónicos comercialmente disponibles (DOTAP/DOPE Y DDAB/DOPE) y los transferrina-liposomas. Los TfRscFv-inmunoliposomas dados a conocer en la presente invención se pueden utilizar en un equipo de transfección génica in vitro de utilidad para transfectar células de mamífero provistas de receptores de transferrina.
TfRscFv es una molécula más pequeña que la transferrina misma. Por consiguiente, el complejo resultante es más compacto y más fácilmente admitido en las células generando una mayor eficacia de transfección. Estos resultados también son ventajosos para la utilización de los inmunoliposomas de TfRscFv de administración sistémica para uso en humanos. El menor tamaño permite un acceso superior a las células tumorales a través de los capilares pequeños. Más significativamente, el TfRscFv no es un producto de la sangre humana tal como lo es el la molécula de Tf. Por consiguiente, se evitan las preocupaciones y los problemas técnicos asociados con la utilización de la transferrina misma en la terapia humana.
Ejemplo 12
Expresión de p53 tipo silvestre mediante inmunoliposomas conjugados a TfRscFv en el modelo de xenotransplantes en ratones desnudos después de la administración sistémica
En el presente ejemplo se demuestra la capacidad del TfRscFv, producido mediante el procedimiento de conjugación de la presente invención, para dirigir un lipoplex portador del gen de p53 silvestre (wtp53) preferencialmente a células tumorales in vivo después de la administración sistémica. Para demostrar la universalidad del TfRscFv como ligando director, aquí también, tal como en el Ejemplo 10, se acomplejaron dos composiciones diferentes de liposoma (Lip(A) y Lip(B)) a la proteína TfRscFv que contiene cisteína mediante el procedimiento de conjugación. En este estudio solamente se utilizó el procedimiento de conjugación de preenlazado tal como se detalla en el Ejemplo 9. Se inocularon subcutáneamente 2,5 x 106 células MDA-MB-435 de cáncer de mama humana en un ratón hembra atímico desnudo de entre 4 y 6 semanas de edad. También se inocularon subcutáneamente en ratones hembra atímicos desnudos de entre 4 y 6 semanas de edad, 1,1 x 107 células DU145 de cáncer de próstata humano suspendidas en membrana basal de colágeno Matrigel® (Collaborative Biomedical Products) y se permitió que se desarrollasen los tumores. Los animales portadores de tumores comprendidos entre 50 y 200 mm3 se utilizaron en el estudio (1 animal/muestra ensayada). Se inyectaron intravenosamente por la vena de la cola de los animales inmunoliposomas conjugados a TfRscRv portadores del gen de wtp53, así como también Lip(B)-p53 no dirigido y ADN desnudo de wtp53. Como control adicional, también se inyectó en un ratón TfRscFvLip(A) conjugado portador de vector vacío en lugar del vector que contiene p53. Tal como se describe en el Ejemplo 7, aproximadamente 60 horas después de la inyección, se sacrificaron los animales y se extrajeron los tumores y el hígado. Se extrajo proteína de los tejidos y 100 µg de cada muestra (tal como se determinó mediante el ensayo de concentración de proteína) se fraccionó en un gel de poliacrilamida del 10% para el análisis mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal anti-p53. En los dos tipos de tumores el p53 endógeno del ratón y el p53 exógeno humano migran a la misma posición. Los resultados en este caso reflejan los descritos en el Ejemplo 7. Tal como se muestra en la Figura 9, los dos tumores DU145 y MDA-MB-435 de los animales inyectados intravenosamente con el lipoplex TfRscFv-Lip(A)-pCMVp53 o con el lipoplex TfRscFv-Lip(B)-pCMVp53 preparados mediante el procedimiento de conjugación desplegaron un elevado nivel de expresión del wtp53 exógeno, tal como indican la intensa señal de p53 y una banda inferior adicional, con mejor expresión en los tumores DU145. Mientras que parece que en los dos tipos de tumores la composición de Lip(A) resultó un poco mejor que la de Lip(B), los dos tipos de composiciones de liposomas funcionaron, demostrando la universalidad del procedimiento. Solamente la proteína p53 endógena resultó evidente en el hígado de los animales. Por el contrario, solamente la proteína p53 endógena fue evidente en el tumor extraído de los ratones inyectados con el conjugado TfRscFv-Lip(B) portador del vector vacío o el ADN de wtp53 desnudo. También se observó un incremento pequeño en la expresión de p53 en los tumores DU145 con Lip(B)-p53 no dirigido. Por consiguiente, los inmunoliposomas conjugados a TfRscFv administraron el gen de wtp53 preferentemente a los tumores, tal como se deseaba. También es significativo que esta dirección a los tumores fue evidente en dos tipos de tumores diferentes, indicando la utilidad general del procedimiento de la presente invención. Por consiguiente, el procedimiento de la presente invención descrito en los ejemplos anteriores genera una proteína TfRscFv que no solamente retiene la capacidad de unirse a los liposomas catiónicos sino que también es activa inmunológicamente conservando su capacidad para unirse al receptor de transferrina in vitro e in vivo, satisfaciendo así el objetivo de producir un liposoma dirigido específico a los tumores para la terapia génica.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110>
Xu, Liang Huang, Cheng-Cheng Alexander, William Tang, WenHua Chang, Ester H. Georgetown University SynerGene Therapeutics, Inc.
<120>
INMUNOLIPOSOMAS DIRIGIDOS MEDIANTE ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA DE GENES UN FRAGMENTO DE ANTICUERPO PARA LA
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ggcccatgga ggtgcagctg gtgg
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10
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15
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador <400> 5
ggcgcggccg ctcagcattt tatctccagc ttg
33

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Constructo para la expresión génica aumentada en células de mamíferos, que comprende, de 5’ a 3’
    (a)
    las secuencias aumentadoras del adenovirus 5 (Ad5) humano presentes en las unidades cartográficas 0 a 1 del Ad5;
    (b)
    un promotor de citomegalovirus (CMV);
    (c)
    un sitio de clonación múltiple para la inserción del gen que se debe expresar; y
    (d)
    una secuencia poli A de SV40;
    en el que el extremo 3’ del constructo está truncado de manera que, comparado con una secuencia genómica adenoviral de plásmido de citomegalovirus de tipo silvestre, las unidades cartográficas adenovirales 9 a 16 están eliminadas.
  2. 2.
    Constructo según la reivindicación 1, en el que dichas células de mamífero son células humanas.
  3. 3.
    Constructo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho gen codifica un p53 de tipo silvestre.
  4. 4.
    Complejo de liposoma que comprende (i) un liposoma catiónico, (ii) un ligando dirigido a las células, y (iii) el constructo según la reivindicación 1.
  5. 5.
    Complejo de liposoma según la reivindicación 4, en el que el ligando dirigido a las células es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
  6. 6.
    Complejo de liposoma según la reivindicación 5, en el que el fragmento de anticuerpo es una cadena única.
  7. 7.
    Complejo de liposoma según la reivindicación 5, en el que dichos anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprenden una etiqueta lipídica o molécula de cisteína terminal.
  8. 8.
    Complejo de liposoma según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un receptor de la transferrina.
  9. 9.
    Procedimiento de expresión de un gen en una célula de mamífero in vitro que comprende poner en contacto el complejo de liposoma según la reivindicación 4 con una célula de mamífero.
  10. 10.
    Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la célula de mamífero es una célula humana.
  11. 11.
    Complejo de liposoma según la reivindicación 4, para su utilización como un medicamento.
  12. 12.
    Utilización de un complejo de liposoma según la reivindicación 4 para la preparación de un medicamento para proporcionar una molécula terapéutica a un animal que lo necesite.
  13. 13.
    Utilización según la reivindicación 12, en la que el complejo de liposoma puede ser administrado sistémicamente.
  14. 14.
    Utilización según la reivindicación 12, en la que el complejo de liposoma puede ser administrado intravenosamente.
  15. 15.
    Utilización según la reivindicación 12, en la que el complejo de liposoma comprende un fragmento de anticuerpo de cadena única.
  16. 16.
    Utilización según la reivindicación 12, en la que el animal padece cáncer.
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