TW201446248A - 治療非小細胞肺癌之表皮生長因子受體（ｅｇｆｒ）ｔ７９０ｍ抑制劑與ｅｇｆｒ抑制劑之組合 - Google Patents

治療非小細胞肺癌之表皮生長因子受體（ｅｇｆｒ）ｔ７９０ｍ抑制劑與ｅｇｆｒ抑制劑之組合 Download PDF

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Abstract

本發明關於一種藉由投予與低劑量panHER抑制劑組合之表皮生長因子受體(EGFR)T790M抑制劑之組合來治療非小細胞肺癌之方法。本發明亦關於一種藉由投予與EGFR抑制劑組合之不可逆式EGFR T790M抑制劑之組合來治療非小細胞肺癌之方法。

Description

治療非小細胞肺癌之表皮生長因子受體(EGFR)T790M抑制劑與EGFR抑制劑之組合
本發明關於一種藉由投予與低劑量panHER抑制劑組合之EGFR T790M抑制劑之組合來治療非小細胞肺癌之方法。本發明亦關於一種藉由投予與EGFR抑制劑組合之不可逆式EGFR T790M抑制劑之組合來治療非小細胞肺癌之方法。
非小細胞肺癌為全世界癌症死亡的首要原因，每年診斷出的新病例估計有140萬。在最常見的非小細胞肺癌形式之肺腺癌中，窩藏表皮生長因子受體(EGFR)突變之病患構成整個族群的10-30%之間。EGFR抑制劑可對這部分的病患最有效，諸如埃羅替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)(Paez等人之Science 2004；Lynch等人之NEJM 2004；Pao等人之PNAS 2004)。與該等抑制劑之良好反應相關聯的最常見之活化突變為外顯子19內的缺失 (例如，E746-A750)及活化環中的點突變(外顯子21，特別為L858R)。迄今而仍以較低程度鑑定之額外的體細胞突變包括點突變：在外顯子20中的G719S、G719C、G719A、L861和小***(Shigematsu等人之JNCI 2005；Fukuoka等人之JCO 2003；Kris等人之JAMA 2003；及Shepherd等人之NEJM 2004)。
雖然該等劑可有效治療EGFR突變子群，但最初反應的病患大部分發展出抗性。在約50%之病患中觀察到的抗性之主要機制歸因於第二突變(T790M)，此突變發生在看門基因蘇胺酸殘基上(Kosaka等人之CCR 2006；Balak等人之CCR 2006；及Engelman等人之Science 2007)。
治療非小細胞肺癌之改進療法包含許多不滿足的醫學要求且必需鑑定新穎的組合方案以改進治療結果。
下文所述之每個具體實例可與本文所述之任何其他的具體實例組合，其與所組合之具體實例不一致。此外，本文所述之每個具體實例展望本文所述之化合物的醫藥學上可接受之鹽於其範圍內。因此，短語〝或其/彼等之醫藥學上可接受之鹽〞蘊涵在本文所述之所有化合物的說明中。
本文所述的一些具體實例關於一種治療非小細胞肺癌之方法，其包含將有效量的不可逆式EGFR T790M抑制劑與有效量的EGFR抑制劑組合投予需要其之病患。
在本發明方法之進一步的具體實例中，不可逆式EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，不可逆式EGFR T790M抑制劑為N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙-2-烯醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之特定的具體實例中，不可逆式EGFR T790M抑制劑為N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}胺基)環丁基]-N-甲基丙-2-烯醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，不可逆式EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼(icotinib)、凡狄太尼(vandetanib)、拉帕替尼(lapatinib)、奈若替尼(neratinib)、阿法替尼(afatinib)、皮利替尼(pelitinib)、達康替尼(dacomitinib)、卡奈替尼(canertinib)、西妥昔單抗 (cetuximab)和帕尼圖單抗(panitumumab)，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼、拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、阿法替尼和達康替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之特定的具體實例中，EGFR抑制劑為吉非替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，EGFR抑制劑為埃羅替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，EGFR抑制劑為阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，EGFR抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，EGFR抑制劑為可逆式EGFR抑制劑。
在本發明方法之進一步的具體實例中，可逆式EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼和拉帕替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，可逆式EGFR抑制劑為吉非替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，可逆式EGFR抑制劑為埃羅替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之額外的具體實例中，EGFR抑制劑為不可逆式EGFR抑制劑。
在本發明方法的具體實例中，不可逆式EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，不可逆式EGFR抑制劑為阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，不可逆式EGFR抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
本發明的一些具體實例關於一種治療非小細胞肺癌之方法，其包含將有效量的EGFR T790M抑制劑與panHER抑制劑組合投予需要其之病患，其中panHER抑制劑係根據非標準的臨床給藥方案(dosing regimen)投予。
在本發明方法之進一步的具體實例中，非標準的臨床給藥方案為非標準的臨床劑量或非標準的給藥時程。
在本發明方法的一些具體實例中，非標準的臨床給藥方案為低劑量的panHER抑制劑。
在本發明方法的具體實例中，非標準的臨床給藥方案為間歇性給藥方案。
在本發明方法之進一步的具體實例中，EGFR T790M抑制劑係選自由下列者所組成之群組：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙-2-烯醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之額外的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}胺基)環丁基]-N-甲基丙-2-烯醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：拉帕替尼、奈若替尼、阿法 替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之特定的具體實例中，panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，panHER抑制劑為阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，panHER抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，panHER抑制劑為不可逆式EGFR抑制劑。
在本發明方法之特定的具體實例中，不可逆式panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，不可逆式panHER抑制劑為阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，不可逆式panHER抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
本發明之特定的具體實例關於一種治療非小細胞肺癌之方法，其包含將協同量的EGFR T790M抑制劑與EGFR抑制劑之組合投予需要其之病患。
在本發明方法的一些具體實例中，EGFR T790M抑制 劑係選自由下列者所組成之群組：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙-2-烯醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之特定的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}胺基)環丁基]-N-甲基丙-2-烯醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之進一步的具體實例中，EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼、拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮 利替尼、達康替尼、卡奈替尼、西妥昔單抗和帕尼圖單抗，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼、拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之特定的具體實例中，EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、阿法替尼和達康替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，EGFR抑制劑為吉非替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，EGFR抑制劑為埃羅替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，EGFR抑制劑為panHER抑制劑。
在本發明方法之進一步的具體實例中，panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的一些具體實例中，panHER抑制劑為 阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之額外的具體實例中，panHER抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之額外的具體實例中，panHER抑制劑為不可逆式EGFR抑制劑。
在本發明方法的一些具體實例中，不可逆式panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法的具體實例中，不可逆式panHER抑制劑為阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明方法之特定的具體實例中，不可逆式panHER抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
本發明的一些具體實例關於下列者之協同組合：(a)EGFR T790M抑制劑；及(b)EGFR抑制劑，其中組份(a)及組份(b)具有協同作用。
在本發明組合的一些具體實例中，EGFR T790M抑制劑係選自由下列者所組成之群組：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合之進一步的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之 鹽。
在本發明組合的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙-2-烯醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合之額外的具體實例中，EGFR T790M抑制劑為N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}胺基)環丁基]-N-甲基丙-2-烯醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的一些具體實例中，EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的一些具體實例中，EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼、拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼、卡奈替尼、西妥昔單抗和帕尼圖單抗，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的具體實例中，EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼、拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的具體實例中，EGFR抑制劑係選自由 下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、阿法替尼和達康替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合之特定的具體實例中，EGFR抑制劑為吉非替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合之進一步的具體實例中，EGFR抑制劑為埃羅替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的一些具體實例中，EGFR抑制劑為panHER抑制劑。
在本發明組合之進一步的具體實例中，panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合之額外的具體實例中，panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的具體實例中，panHER抑制劑為阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的一些具體實例中，panHER抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的具體實例中，panHER抑制劑為不可逆式EGFR抑制劑。
在本發明組合之額外的具體實例中，不可逆式panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：奈若替 尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的一些具體實例中，不可逆式panHER抑制劑為阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
在本發明組合的具體實例中，不可逆式panHER抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
圖1顯示在RPC9殖株3和殖株6中經Sanger定序鑑定之C>T EGFR T790M突變，所示之百分比代表相對於總EGFR對偶基因的經castPCR定量之EGFR T790M對偶基因。
圖2顯示以各種濃度的達康替尼(圖2A)或埃羅替尼(圖2B)處理之PC9及RPC9殖株3和6在細胞存活檢定法中的劑量反應曲線。
圖3顯示在RPC9殖株6細胞存活檢定法中的劑量反應曲線。圖3A顯示單獨及組合的化合物A(〝化合物A〞)及達康替尼(〝daco〞)之劑量反應曲線。圖3B顯示單獨及組合的化合物A及埃羅替尼(〝erlo〞)之劑量反應曲線。圖3C顯示作為單一劑及與達康替尼和埃羅替尼組合的化合物A在選擇之濃度下的抑制百分比。
圖4顯示在RPC9殖株6細胞存活檢定法中的劑量反應曲線。圖4A顯示單獨及組合的化合物B(〝化合物B〞)及達康替尼(〝daco〞)之劑量反應曲線。圖4B顯 示單獨及組合的化合物B及埃羅替尼(〝erlo〞)之劑量反應曲線。圖4C顯示作為單一劑及與達康替尼和埃羅替尼組合的化合物B在選擇之濃度下的抑制百分比。
圖5顯示在RPC9殖株6細胞存活檢定法中的劑量反應曲線。圖5A顯示單獨及與達康替尼(〝daco〞)組合的化合物A(〝化合物A〞)之劑量反應曲線。圖5B顯示單獨及與吉非替尼(〝gefi〞)組合的化合物A之劑量反應曲線。圖5C顯示單獨及與阿法替尼(〝afat〞)組合的化合物A之劑量反應曲線。圖5D顯示作為單一劑及與達康替尼、吉非替尼和阿法替尼組合的化合物A在選擇之濃度下的抑制百分比。
圖6顯示在RPC9殖株6細胞存活檢定法中的劑量反應曲線。圖6A顯示單獨及與達康替尼(〝daco〞)組合的化合物B(〝化合物B〞)之劑量反應曲線。圖6B顯示單獨及與吉非替尼(〝gefi〞)組合的化合物B之劑量反應曲線。圖6C顯示單獨及與阿法替尼(〝afat〞)組合的化合物B之劑量反應曲線。圖6D顯示作為單一劑及與達康替尼、吉非替尼和阿法替尼組合的化合物B在選擇之濃度下的抑制百分比。
圖7顯示在RPC9殖株6細胞中的EGFR、AKT和ERK之磷酸化程度的西方免疫墨點法(Western immunoblot)。包括GAPDH作為蛋白載入對照物。圖7A顯示以DMSO、達康替尼、化合物A或達康替尼+化合物A(〝化合物A〞)的組合處理之RPC9殖株6細胞。圖 7B顯示以DMSO、埃羅替尼、化合物A或埃羅替尼+化合物A(〝化合物A〞)的組合處理之RPC9殖株6細胞。
圖8顯示基於以DMSO、達康替尼、化合物A或達康替尼(〝daco〞)+化合物A(〝化合物A〞)的組合處理之RPC9殖株6細胞的西方免疫墨點法之譜帶(圖7A)的比重測定法結果。pEGFR Y1068(圖8A)、pAKT S473(圖8B)及pERK T202/Y204(圖8C)之抑制係藉由與DMSO對照物比較而測定。
圖9顯示基於以DMSO、埃羅替尼、化合物A或埃羅替尼(〝erlo〞)+化合物A(〝化合物A〞)的組合處理之RPC9殖株6細胞的西方免疫墨點法之譜帶(圖7B)的比重測定法結果。pEGFR Y1068(圖9A)、pAKT S473(圖9B)及pERK T202/Y204(圖9C)之抑制係藉由與DMSO對照物比較而測定。
圖10顯示在RPC9殖株6細胞中的EGFR、AKT和ERK之磷酸化程度的西方免疫墨點法。包括GAPDH作為蛋白載入對照物。圖10A顯示以DMSO、達康替尼、化合物B或達康替尼+化合物B(〝化合物B〞)的組合處理之RPC9殖株6細胞。圖10B顯示以DMSO、埃羅替尼、化合物B或埃羅替尼+化合物B(〝化合物B〞)的組合處理之RPC9殖株6細胞。
圖11顯示基於以DMSO、達康替尼、化合物B或達康替尼(〝daco〞)+化合物B(〝化合物B〞)的組合處理之RPC9殖株6細胞的西方免疫墨點法之譜帶(圖 10A)的比重測定法結果。pEGFR Y1068(圖11A)、pAKT S473(圖11B)及pERK T202/Y204(圖11C)之抑制係藉由與DMSO對照物比較而測定。
圖12顯示基於以DMSO、埃羅替尼、化合物B或埃羅替尼(〝erlo〞)+化合物B(〝化合物B〞)的組合處理之RPC9殖株6細胞的西方免疫墨點法之譜帶(圖10B)的比重測定法結果。pEGFR Y1068(圖12A)、pAKT S473(圖12B)及pERK T202/Y204(圖12C)之抑制係藉由與DMSO對照物比較而測定。
圖13係以圖表示帶有RPC9殖株6腫瘤之SCID小鼠的異種移植模式的結果，將小鼠隨機於每日且經口以媒劑、達康替尼、化合物A或達康替尼(〝daco〞)+化合物A(〝化合物A〞)處理。圖13A係以圖表示腫瘤體積，其於每週測量3次且以平均值及平均值的標準誤差之圖表示。圖13B係以圖表示每組體重，其於每日記錄且變化百分比係以平均值及平均值的標準誤差之圖表示。
圖14係以圖表示帶有RPC9殖株6腫瘤之SCID小鼠的異種移植模式的結果，將小鼠隨機於每日且經口以媒劑、達康替尼、化合物B或達康替尼(〝daco〞)+化合物B(〝化合物B〞)處理。圖14A係以圖表示腫瘤體積，其於每週測量3次且以平均值及平均值的標準誤差之圖表示。圖14B係以圖表示每組體重，其於每日記錄且變化百分比係以平均值及平均值的標準誤差之圖表示。
圖15係以圖表示帶有RPC9殖株6腫瘤之SCID小鼠 的異種移植模式的結果，將小鼠隨機於每日且經口以媒劑、達康替尼、化合物B或達康替尼(〝daco〞)+化合物B(〝化合物B〞)處理。圖15A係以圖表示單一劑處理組之腫瘤體積。圖15B係以圖表示組合處理組之腫瘤體積。
圖16係以圖表示帶有RPC9殖株6腫瘤之SCID小鼠的異種移植模式的結果，將小鼠隨機於每日且經口以媒劑、埃羅替尼、化合物A或埃羅替尼(〝erlo〞)+化合物A(〝化合物A〞)處理。圖16A係以圖表示腫瘤體積，其於每週測量3次且以平均值及平均值的標準誤差之圖表示。圖16B係以圖表示每組體重，其於每日記錄且變化百分比係以平均值及平均值的標準誤差之圖表示。
本發明的詳細說明
人類表皮生長因子受體之成員/受體之表皮生長因子受體(HER/EGFR)家族包括EGFR/HER-1、HER2/neu/erbB-2、HER3/erbB-3及HER4/erbB-4。
EGFR抑制劑有效地抑制EGFR之常見的活化突變(L858R和delE746-A750)。常見的活化突變亦稱為單突變體或單突變形式。EGFR抑制劑的實例包括吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼、拉帕替尼、奈若替尼，阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼。EGFR之單殖株抗體抑制劑亦為如本發明所定義之EGFR抑制劑，諸 如西妥昔單抗和帕尼圖單抗。
EGFR抑制劑可為可逆式或不可逆式抑制劑。EFGR分子之酪胺酸激酶功能域的可逆式抑制劑附著至受體且定期自受體脫離。吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼和拉帕替尼為可逆式EGFR抑制劑的實例。EFGR分子之酪胺酸激酶功能域的不可逆式抑制劑係不可逆地結合至EGFR。奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼為不可逆式EGFR抑制劑的實例。
EGFR抑制劑為HER家族之至少一種成員的抑制劑。吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼和凡狄太尼為選擇性EGFR/HER-1酪胺酸激酶抑制劑(TKI)。西妥昔單抗和帕尼圖單抗為專一於EGFR/HER-1之單殖株抗體。
pan-HER抑制劑為阻斷HER家族之多樣成員的劑。拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈替尼為pan-HER抑制劑的實例。拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼和皮利替尼抑制HER家族之EGFR和HER2成員。達康替尼和卡奈替尼抑制HER家族之EGFR、HER2和HER4成員。
EGFR T790M抑制劑有效地抑制常見的活化突變(L858R和delE746-A750)及看門基因突變(T790M)。本發明的EGFR T790M抑制劑優先抑制EGFR之雙突變形式(L858R/T790M和delE746-A750/T790M)更勝於單突變體(L858R和delE746-A750)。EGFR T790M抑制劑的實例包括Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、 WZ4002、CO-1686和TAS-2913。
EGFR T790M抑制劑可能為可逆式或不可逆式抑制劑。Go6976、PKC412和AP26113為可逆式EGFR T790M抑制劑的實例。HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913為不可逆式EGFR T790M抑制劑的實例。
本發明的EGFR T790M抑制劑亦包括1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮(〝化合物A〞)、N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙-2-烯醯胺(〝化合物B〞)、N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}胺基)環丁基]-N-甲基丙-2-烯醯胺(〝化合物C〞)、及1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮(〝化合物D〞)，或彼等之醫藥上可接受之鹽。化合物A、化合物B、化合物C及化合物D為不可逆式EGFR T790M抑制劑的實例。
在本文可使用以下縮寫：Ac(乙醯基)；APCI(原子壓力化學電離)；Boc(第三丁氧基羰基)；Boc2O(二碳酸二-第三丁酯)；BrettPhos鈀環(氯[2-(二環己膦基)-3,6-二甲氧基-2’,4’,6’-三異丙基-1,1’-聯苯][2-(2-胺基乙基)苯基]鈀(II))；DCC(1,3-二環己基碳化二 醯亞胺)；DCM(二氯甲烷)；Deoxo-Fluor®(三氟化雙(2-甲氧基乙基)胺基硫)；DIAD(偶氮二羧酸二異丙酯)；DIEA(二異丙基乙胺)；DIPEA(N,N-二異丙基乙胺)；DMAP(4-二甲基胺基吡啶)；DMEM(經杜貝可氏改質之伊格爾氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium))；DMF(二甲基甲醯胺)；DMSO(二甲亞碸)；DPPA(疊氮化磷酸二苯酯(diphenyl phosphorazidate))；EGTA([亞乙基雙(氧基亞乙基氮基)]四乙酸)；eq(當量)；Et(乙基)；EtOH(乙醇)；EtOAc(乙酸乙酯)；Et2O(二***)；FBS(胎牛血清)；HATU(六氟磷酸2-(7-氮雜-1H-苯並***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓)；HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌乙烷磺酸)；HMDS(雙(三甲基矽基)胺，其亦稱為六甲基二矽氮烷或六甲基二矽氧烷)；HOAc(乙酸)；HPLC(高性能液相層析術)；iPr(異丙基)；iPrMgCl(氯化異丙基鎂)；iPrOH(異丙醇)；KHMDS(雙(三甲基矽基)胺化鉀)；LAH(氫化鋰鋁)；LCMS(液相層析術-質譜術)；LiHMDS(雙(三甲基矽基)胺化鋰)；Me(甲基)；MeOH(甲醇)；MeCN(乙腈)；MTBE(甲基第三丁醚)；N(標準)；N/A(未取得)；NaHMDS(雙(三甲基矽基)胺化鈉)；N/D(未測定)；NIS(N-碘琥珀醯亞胺)；NMM(N-甲基嗎啉)；NMR(核磁共振)；Pd2(dba)3(參(二亞苯甲基丙酮)二鈀(0))；PG(保護基)；Ph(苯基)；PhI(OAc)2(二乙酸碘苯)； PMSF(苯基甲基磺醯氟)；psi(磅/平方英吋)；Rf(滯留因子)；RPMI(羅斯威爾派克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute))；rt(室溫)；sat.(飽和)；SCX(強陽離子交換)；SEM(2-(三甲基矽基)乙氧基甲基)；SEM-Cl(2-(三甲基矽基)乙氧基甲基氯)；SFC(超臨界流體層析術)；TBAF(氟化四丁基銨)；TBDPS(第三丁基二苯基矽基)；TBS(第三丁基二甲基矽基)；t-BuXPhos鈀環(氯[2-二-第三丁膦基)-2’,4’,6’-三異丙基-1,1’-聯苯][2-(2-胺基乙基)苯基)]鈀(II)；TFA(三氟乙酸鹽)；THF(四氫呋喃)；TLC(薄層層析術)；甲苯(甲基苯)；甲苯磺醯基(對-甲苯磺醯基)；及Xantphos(4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯並哌喃)。
一些具體實例關於本文所述化合物的醫藥學上可接受之鹽。本文所述化合物的醫藥學上可接受之鹽包括其酸加成鹽及鹼加成鹽。
一些具體實例亦關於本文所述化合物的醫藥學上可接受之酸加成鹽。適合的酸加成鹽係自形成無毒性鹽之酸所形成。適合的酸加成鹽(亦即含有藥理上可接受之陰離子的鹽)的非限制實例包括但不限於乙酸鹽、酸式檸檬酸鹽、己二酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環己胺磺酸鹽、乙二磺酸鹽、乙磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸 鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、六氟磷酸鹽、海苯酸鹽(hibenzate)、鹽酸鹽/氯化物、氫溴酸鹽/溴化物、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、乳清酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、焦麩胺酸鹽、葡糖二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、丹寧酸鹽、酒石酸鹽、對-甲苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽和羥萘甲酸鹽(xinofoate salt)。
額外的具體實例關於本文所述化合物的鹼加成鹽。 適合的鹼加成鹽係自形成無毒性鹽之鹼所形成。適合的鹼式鹽的非限制實例包括鋁、精胺酸、本乍生(benzathine)、鈣、膽鹼、二乙胺、二乙醇胺、甘胺酸、賴胺酸、鎂、葡甲胺、乙醇胺、鉀、鈉、胺基丁三醇(tromethamine)和鋅鹽。
本質上為鹼性的本文所述化合物能夠與各種無機酸及有機酸形成各種廣泛的鹽。可用於製備本文所述之此等鹼性化合物的醫藥學上可接受之酸加成鹽的酸為那些形成無毒性酸加成鹽的酸，例如含有藥理學可接受之陰離子的鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖 醛酸鹽、葡糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽[亦即1,1’-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸)]鹽。 包括鹼性部分(諸如胺基)的本文所述化合物可與除了上述酸以外的各種胺基酸形成醫藥學上可接受之鹽。
可用作為試劑以製備本文所述化合物在本質上為酸性之那些化合物的醫藥上可接受之鹼式鹽的化學鹼為那些與此等化合物形成無毒性鹼式鹽的鹼。此等無毒性鹼式鹽包括但不限於那些自此等藥理上可接受之陽離子(諸如鹼金屬陽離子(例如，鉀和鈉)及鹼土金屬陽離子(例如，鈣和鎂))所衍生之鹽、銨或水溶性胺加成鹽(諸如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)和低碳烷醇銨)、及醫藥上可接受之有機胺的其他鹼式鹽。
本文所述具體實例的化合物包括本文所述化合物的所有立體異構物(例如，順式和反式異構物)及所有光學異構物(例如，R和S鏡像異構物)，以及此等異構物的消旋性混合物、非鏡像異構物混合物及其他混合物。雖然將所有的立體異構物涵蓋在吾等的申請專利範圍之範疇內，但是熟諳此項技術者將認知特定的立體異構物可能較佳。
在一些具體實例中，本文所述化合物可以數種互變異構物形式存在，包括烯醇與亞胺形式，及酮與烯胺形式，及其幾何異構物和混合物。所有的此等互變異構形式皆包括在本發明具體實例之範疇內。互變異構物係以互變異構物組於溶液中的混合物存在。在固體形式中，通常以一種 互變異構物佔優勢。即使可能以一種互變異構物說明，但是本發明的具體實例包括本發明化合物的所有互變異構物。
本發明的具體實例亦包括本文所述化合物之阻轉異構物。阻轉異構物係指可分離成旋轉受阻之異構物的化合物。
亦可形成酸及鹼之半鹽，例如半硫酸鹽和半鈣鹽。
關於適合的鹽之審閱，參見Stahl和Wermuth之Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection,and Use(Wiley-VCH,2002)。用於製造本文所述化合物的醫藥上可接受之鹽的方法為熟諳此項技術者所知。
在本文所使用之術語〝溶劑合物〞說明一種包含本文所述化合物及一或多種醫藥上可接受之溶劑分子(例如，乙醇)的分子複合物。
本文所述化合物亦可以非溶劑化及溶劑化形式存在。因此，一些具體實例關於本文所述化合物之水合物及溶劑合物。
含有一或多個不對稱碳原子的本文所述化合物可以二或更多種立體異構物存在。在本文所述化合物含有烯基或伸烯基時，順式/反式(或Z/E)幾何異構物是可能的。在結構異構物可經由低能阻礙互相轉換時，可發生互變異構現象(〝互變異構現象(tautomerism)〞)。這在含有例如亞胺基、酮基或肟基的本文所述化合物中可以質子互變異構現象的形式呈現，或在含有芳族部分的化合物中可以 又稱為價互變異構現象的形式呈現。單一化合物可能展現一種類型以上的異構現象。
在本發明的具體實例之範疇內包括本文所述化合物(包括展現一種類型以上的異構現象之化合物)的所有立體異構物、幾何異構物及互變異構物形式，及其一或多種混合物。亦包括其中相對離子具有光學活性之酸加成鹽或鹼式鹽，例如d-乳酸鹽或l-離胺酸；或為消旋物，例如dl-酒石酸鹽或dl-精胺酸。
順式/反式異構物可藉由那些熟諳此項技術者所熟知的習知技術來分離，例如以層析術及分步結晶法。
用於製備/分離個別的鏡像異構物之習知技術包括自適合的光學純前驅物之掌性合成或使用例如掌性高壓液相層析術(HPLC)進行消旋物(或鹽或衍生物之消旋物)解析。
另一選擇地，可將消旋物(或消旋性前驅物)與適合的光學活性化合物(例如，醇，或在本文所述化合物含有酸性或鹼性部分之情況下的鹼或酸，諸如1-苯乙胺或酒石酸)反應。所得非鏡像異構性混合物可藉由層析術及/或分步結晶法來分離，及非鏡像異構物中之一或二者係以熟諳此項技術者所熟知的方式轉換成對應之純鏡像異構物。
如本文所使用之術語〝治療(treating)〞意指逆轉、減輕、抑制此術語適用之病症或病狀或此等病症或病狀的一或多種徵候的進展，或預防病症或病狀或此等病症或病狀之一或多種徵候，除非另有其他指示。如本文所使 用之術語〝治療(treatment)〞係指如上文剛定義之〝治療(treating)〞的該治療之行為，除非另有其他指示。
欲根據本發明治療之病患包括任何溫血動物，諸如但不限於人類、猴或其他低目靈長類動物、馬、狗、兔、天竺鼠或小鼠。例如，病患為人類。那些熟諳醫學技術者能夠輕易地鑑定受非小細胞肺癌折磨及需要治療的個別病患。
術語〝加成性〞意指兩種化合物或靶定之劑的組合結果為單獨的各劑之總和。所使用之術語〝協同性〞或〝協同的〞意指兩種劑的組合結果大於各劑一起之總和。〝協同量〞為導致協同效果的兩種劑之組合量。
該效果的最優範圍及該效果的各組份之絕對劑量範圍可藉由將不同的w/w比率範圍及劑量之組份投予需要治療之病患而明確地測量，以測定一或兩種組份之間的協同交互作用。對人類病患進行臨床研究的複雜性及成本使得以此測試形式用作為協同性的主要模式變得不切實際。然而，試管內模式或活體內模式的協同性觀察可預測在人類及其他種類中的效果，且為了測量協同效果而有如本文所述之試管內模式或活體內模式的存在，並且亦可使用此等研究的結果應用於藥物動力學/藥效動力學的方法來預測有效劑量與血漿濃度比率範圍，及在人類及其他種類中必需的絕對劑量與血漿濃度。
在具體實例中，本發明方法關於一種治療非小細胞肺癌之方法，其包含將有效量的EGFR T790M抑制劑與 panHER抑制劑之組合投予需要其之病患，其中panHER抑制劑係根據非標準的臨床給藥方案投予，其量足以達成協同效果。在此具體實例中，本發明方法關於靶定之治療劑的協同組合，尤其為EGFR T790M抑制劑與panHER抑制劑。
在具體實例中，本發明方法關於一種治療非小細胞肺癌之方法，其包含將有效量的EGFR T790M抑制劑與低劑量panHER抑制劑之組合投予需要其之病患，其量足以達成協同效果。在此具體實例中，本發明方法關於靶定之治療劑的協同組合，尤其為EGFR T790M抑制劑與panHER抑制劑。
在另一具體實例中，本發明方法關於一種治療非小細胞肺癌之方法，其包含將有效量的不可逆式EGFR T790M抑制劑與有效量的EGFR抑制劑之組合投予需要其之病患，其量足以達成協同效果。在此具體實例中，本發明方法關於靶定之治療劑的協同組合，尤其為不可逆式EGFR T790M抑制劑與EGFR抑制劑。
如本文所使用之〝有效〞量係指在本發明的組合中足以預防或抑制腫瘤細胞生長或癌症轉移進展之物質、劑、化合物或組成物的量。劑量及投予方案的治療或藥理有效性亦可以在經歷特定腫瘤之病患中誘發、增強、維持或延長緩解的能力予以特徵化。
如本文所使用之〝非標準的臨床給藥方案〞係指投予有效抑制EGFR之單突變形式(L858R和delE746-A750) 的物質、劑、化合物或組成物之方案，但是其不同於典型地用於臨床設定中的量或劑量。〝非標準的臨床給藥方案〞包括〝非標準的臨床劑量〞或〝非標準的給藥時程〞。
如本文所使用之〝低劑量〞係指有效抑制EGFR之單突變形式(L858R和delE746-A750)的物質、劑、化合物或組成物之量或劑量，但是其為比典型地用於臨床設定中的量或劑量更低的量或劑量。
那些熟諳此項技術者能夠根據已知的方法測定在本發明之組合中用於投予病患時的各化合物之適當的量或劑量，該測定係考慮以下的因素：諸如年齡、重量、一般的健康、所投予之化合物、投予途徑、需要治療之非小細胞肺癌的性質和進展、及其他存在的藥劑。
本發明方法的實施可經由各種投予方案來完成。可將本發明之組合的化合物間歇、並行或依序投予。若必要時，可進行重複的投予方案以達成所欲的癌細胞減少或縮減。在具體實例中，可將本發明之組合的化合物以間歇性給藥方案投予。
本發明之組合的化合物投予可以能夠遞送化合物至作用位置的任何方法來實現。該等方法包括經口途徑、十二指腸內途徑、非經腸注射(包括靜脈內、皮下、肌肉內、血管內或灌注)、局部及直腸投予。
本發明之方法或組合的化合物可在投予前調配。調配較佳地適合於特別的投予模式。該等化合物可以此項技術 中已知的醫藥上可接受之載劑調配且可以此項技術中已知的各種廣泛的劑型投予。在製造本發明的醫藥組成物時，通常將活性成份與醫藥上可接受之載劑混合，或以載劑稀釋，或包封在載劑內。此等載劑包括但不限於固體稀釋劑或填充劑、賦形劑、無菌水性介質及各種無毒性有機溶劑。單位劑型或醫藥組成物包括錠劑、膠囊(諸如明膠膠囊)、丸劑、散劑、粒劑、水性和非水性口服溶液和懸浮液、菱形錠、***錠、硬糖錠、噴霧劑、乳霜、藥膏、栓劑、果凍膠、凝膠、糊劑、乳液、軟膏、可注射溶液、酏劑、糖漿及包裝在適合於細分成個別劑量之容器中的非經腸溶液。
非經腸調配物包括醫藥上可接受之水性或非水性溶液、分散液、懸浮液、乳液及用於其之製備的無菌粉末。載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇)、植物油及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。流動性可藉由使用包膜(諸如卵磷脂)、介面活性劑或維持適當的粒子大小來維持。例示的非經腸投予形式包括本發明化合物在無菌水溶液(例如，水性丙二醇或右旋糖水溶液)中的溶液或懸浮液。若必要時，可將此等劑量形式經適當地緩衝。
另外，以製錠目的而常使用潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石。類似型式的固體組成物亦可用於軟質及硬質填充之明膠膠囊中。因此，較佳的材料包括乳糖或牛奶糖及高分子量聚乙二醇。當希望以水性懸浮液及酏 劑經口投予時，可將其中的活性化合物與各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料及若必要的乳化劑或懸浮劑一起與稀釋劑(諸如水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合)組合。
製備各種具有特定量的活性化合物之醫藥組成物的方法為那些熟諳此項技術者所知或顯而易見。例如，參見Easter,Pa.的Mack Publishing Company之第15版Remington's Pharmaceutical Sciences(1975)。
本發明亦關於一種包含本發明之組合的治療劑及投予治療劑之書面指示的套組。在一個具體實例中，書面指示擬訂及限定治療劑的投予模式，例如同時或依序投予本發明的治療劑。
以下提供的實施例及製法進一步例證及例示本文所述之化合物及製備此等化合物之方法。本文所述之具體實例的範疇不以任何方式受到以下實施例及製法的限制。在以下的實施例中，具有單一掌性中心的分子係以消旋性混合物存在，除非另有其他註釋。具有二或更多個掌性中心的那些分子係以非鏡像異構物之消旋性混合物存在，除非另有其他註釋。單一鏡像異構物/非鏡像異構物可藉由那些熟諳此項技術者已知的方法獲得。
在所示之實施例中，鹽形式係在以HPLC為基準之層析純化期間由於移動相添加劑而偶爾分離。在該等例子中，將鹽(諸如甲酸鹽、三氟乙酸鹽和乙酸鹽)分離且不進一步處理而測試。應認知一般熟諳此項技術者能夠以標準的方法(諸如使用離子交換管柱，或使用溫和的水性鹼 進行簡單的鹼性萃取)實現自由鹼形式。
本文所述之化合物通常可以化學技術中已知的方法製備，特別依照納入本文的說明。用於製造本文所述化合物之特定方法經提供作為具體實例的進一步特性，且在下文提供之反應流程及實驗章節中予以例證。
實施例 實施例1：1-{(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基胺基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯啶-1-基}丙烯酮三氟乙酸鹽(亦稱為〝1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮三氟乙酸鹽〞及〝1-((3R,4R)-3-(((5-氯-2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-4-甲氧基吡咯啶-1-基)丙-2-烯-1-酮三氟乙酸鹽〞)(〝化合物A〞之三氟乙酸鹽)之製法
步驟1：(3S,4R)-1-苯甲基-4-甲氧基-吡咯啶-3-羧酸甲 酯之製法
將N-(甲氧基甲基)-N-(三甲基矽基甲基)-苯甲胺(204公克，2當量)逐滴添加至0℃在2-Me-THF(600毫升)及TFA(6.7毫升)中的(E)-3-甲氧基-丙烯酸甲酯(50公克，430.6毫莫耳)之溶液中。在添加之後，容許反應溫熱至室溫且攪拌2小時。將反應轉移至分液漏斗中且以飽和NaHCO3、飽和NaCl清洗，接著經Na2SO4乾燥且移除溶劑，留下成為黃色油的粗製消旋性產物，將其在SiO2上(10%-35%EtOAc/庚烷)純化，得到成為黃色油的消旋性反式產物(82.7公克)。以掌性-SFC(Chiralpak AD-H 4.6×250毫米管柱，具有0.1%二乙胺之4%MeOH，140巴，3.0毫升/分鐘)分離鏡像異構物，得到所欲單一異構物產物，其係與已知的標準物比較而證實(34公克，31.7%之產率)。比旋光度[α]D 27=+23.8°(C=1.3，MeOH)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 2.55-2.63(m，2H)2.69(dd，J=9.95，6.42Hz，1H)2.82-2.88(m，1H)2.90-2.96(m，1H)3.23(s，3H)3.51-3.63(m，2H)3.66(s， 3H)4.07-4.12(m，1H)7.22-7.39(m，5H)。(C14H19NO3)之m/z(APCI+)為250.0(M+H)+。
步驟2：(3S,4R)-4-甲氧基-吡咯啶-1,3-二羧酸1-第三丁酯3-甲酯之製法
將乙醇(500毫升)中的(3S,4R)-1-苯甲基-4-甲氧基-吡咯啶-3-羧酸甲酯(35公克，140.4毫莫耳)之溶液以氮氣沖洗，接著添加Pd(OH)2(2公克，0.1當量)且將混合物在約15psi下於氫氣氛圍下(經由氫氣球)攪拌隔夜。接著將反應經由矽藻土過濾且將二碳酸二-第三丁酯(30.9公克，1當量)以攪拌緩慢地添加至所得濾液中。在1小時之後，將反應濃縮且將粗製材料經由以2體積之10%EtOAc/庚烷及接著以1：1之EtOAc/庚烷溶析之短的二氧化矽管柱純化，直到產物完全溶析為止。將產物部分合併且濃縮，得到成為透明油的標題化合物(35.81公克，98%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 1.39(s，9H)3.17(br.s.，1H)3.23-3.28(m， 4H)3.35-3.53(m，3H)3.65(s，3H)4.06(d，J=4.78Hz，1H)。減去Boc的產物(C7H13NO3)之m/z(APCI+)為160.1(M+H)+。比旋光度：[a]D=-12.5度(C=0.87，MeOH)。
步驟3：(3R,4R)-3-羥甲基-4-甲氧基-吡咯啶-1-羧酸第三丁酯之製法
將硼氫化鋰(12.7公克，4當量)分批添加至THF(600毫升)中的(3S,4R)-4-甲氧基-吡咯啶-1,3-二羧酸1-第三丁酯3-甲酯(35.81公克，138.1毫莫耳)之溶液中，接著將反應加熱至60℃經4小時。將反應在0℃以水中止且以EtOAc萃取。將有機層以飽和NaCl清洗且經Na2SO4乾燥。移除溶劑且將殘餘物經由SiO2塞管(3：1之EtOAc/庚烷)純化，得到成為透明油的標題化合物(29.35公克，92%之產率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 1.46(s，9H)2.37-2.47(m，1H)3.19(dd，J=11.08，5.29Hz，1H)3.33(d，J=4.03Hz，4H)3.50- 3.66(m，4H)3.77-3.83(m，1H)。減去Boc的產物(C6H13NO2)之m/z(APCI+)為132.2(M+H)+。比旋光度：[a]D=+9.3度(C=0.86，MeOH)。
步驟4：(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基胺基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯啶-1-羧酸第三丁酯之製法
方法A：(使用微波加熱)
將第三丁醇鉀(25%w/w於甲苯中，1.6毫升，3.5毫莫耳)添加至微波小瓶中在1,4-二噁烷(15毫升)中的2,4,5-三氯-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(904毫克，4.1毫莫耳)及(3R,4R)-3-羥甲基-4-甲氧基-吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(940毫克，4.1毫莫耳)之溶液中。將所得溶液在周圍溫度下攪拌15分鐘。LCMS顯示定量形成的(3R,4R)-3-(2,5-二氯-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基)-4-甲氧基-吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。將1-甲基-1H-吡唑-4-基胺(474毫克，4.9毫莫耳)及t-BuXPhos鈀環(110毫克，0.04莫耳當量)添加至此所得反應溶液中。 將反應混合物攪拌且使用正常吸收等級之微波加熱至100℃經45分鐘。將反應混合物經由矽藻土過濾且將濾液蒸發，得到深色殘餘物。將粗製材料經由以庚烷中的0%-100%EtOAc之梯度溶析的快速層析術純化，得到標題化合物(1.78公克，76%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 11.50(br.s.，1H)9.06(s，1H)7.85(s，1H)7.52(s，1H)7.05(d，J=2.27Hz，1H)4.30-4.53(m，2H)3.86-3.96(m，1H)3.80(s，3H)3.55-3.68(m，1H)3.43-3.53(m，1H)3.24-3.31(m，3H)2.71(br.s.，1H)1.39(br.s.，9H)。減去Boc的產物C16H20ClN7O2之m/z(APCI+)為378.1(M+H)+，具有Cl同位素圖案。
方法B：使用熱加熱
將第三丁醇鉀(25%w/w於甲苯中，80毫升，167毫莫耳)添加至圓底燒瓶中在1,4-二噁烷(100毫升)中的2,4,5-三氯-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(9.28公克，41.7毫莫耳)及(3R,4R)-3-羥甲基-4-甲氧基-吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(9.65公克，41.7毫莫耳)之溶液中。將所得反應溶液在周圍溫度下攪拌30分鐘。LCMS顯示定量形成的(3R,4R)-3-(2,5-二氯-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基)-4-甲氧基-吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。將1-甲基-1H-吡唑-4-基胺(4.86公克，50.1毫莫耳)及t-BuXPhos鈀環(1.1公克，1.67毫莫耳，0.04莫耳當量)添加至所得反 應溶液中。將反應混合物攪拌且在油浴中加熱至90℃經1小時。接著將反應混合物經由矽藻土過濾且將濾液蒸發，以移除揮發物，得到深色膠，接著將其溶解在乙酸乙酯(300毫升)中且經由矽膠塞管過濾。將濾液蒸發且將殘餘物經由以庚烷中的0%-100%EtOAc之梯度溶析的快速層析術純化，得到標題化合物(12.4公克，62%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 11.51(br.s.，1H)9.07(s，1H)7.86(s，1H)7.52(s，1H)7.06(d，J=2.20Hz，1H)4.31-4.54(m，2H)3.92(br.s.，1H)3.80(s，3H)3.55-3.68(m，1H)3.44-3,55(m，1H)3.30(d，J=18.34Hz，3H)2.72(br.s.，1H)1.39(br.s.，9H)。C21H28ClN7O4之m/z(APCI+)為378.2(M+H)+，具有Cl同位素圖案。
步驟5：[5-氯-4-((3R,4R)-4-甲氧基-吡咯啶-3-基甲氧基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-2-基]-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-胺三氟乙酸鹽之製法
將TFA(10.1毫升，208毫莫耳)添加至0℃在DCM (60毫升)中的(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基胺基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(12.40公克，26毫莫耳)之溶液中且將所得溶液在周圍溫度下攪拌2.5小時。移除揮發物且將***(150毫升)添加至殘餘物中。將所得懸浮液攪拌2小時，接著過濾，以供給淺粉紅色固體。將其以***(30毫升)清洗且乾燥，得到成為TFA鹽的標題化合物(15.69公克，定量)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 11.56(br.s.，1H)9.09(s，3H)7.85(s，1H)7.54(s，1H)7.09(d，J=2.32Hz，1H)4.48(d，J=6.48Hz，2H)4.11(br.s.，1H)3.81(s，3H)3.46-3.60(m，1H)3.35-3.45(m，2H)3.32(s，3H)3.15(dq，J=12.01，6.02Hz，1H)2.88(m，J=6.42，6.42Hz，1H)。母體分子C16H20ClN7O2之m/z(APCI+)為378.2(M+H)+，具有Cl同位素圖案。
步驟6：1-{(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基胺基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯啶-1-基}丙烯酮三氟乙酸鹽之製法
將[5-氯-4-((3R,4R)-4-甲氧基-吡咯啶-3-基甲氧基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-2-基]-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-胺(15.0公克(2TFA鹽)，24.7毫莫耳)、乙酸乙酯(200毫升)與飽和水性NaHCO3(100毫升)之混合物在0℃攪拌10分鐘。逐滴添加丙烯醯氯(2.3毫升，29毫莫耳，1.1莫耳當量)且將所得混合物在周圍溫度下攪拌30分鐘。添加乙酸乙酯(150毫升)且將有機層分離。將水層以乙酸乙酯(150毫升)萃取，將合併的有機層經Na2SO4乾燥且蒸發，得到固體，將其以SFC(ZymorSPHER HAP 5μ 21.2×150毫米管柱，以CO2中的35%EtOH溶析，在120巴下，64毫升/分鐘之流速)純化，得到成為灰白色固體的標題化合物(8.3公克，78%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 11.51(s，1H)9.07(s，1H)7.86(s，1H)7.52(s，1H)7.05(s，1H)6.59(ddd，J=16.75，10.27，1.34Hz，1H)6.14(dd，J=16.75，2.32Hz，1H)5.68(dt，J=10.27，2.32Hz，1H)4.44(d，J=6.24Hz，2H)3.82-4.09(m，2H)3.80(s，3H)3.57-3.76(m，2H)3.47- 3.54(m，1H)3.31(d，J=4.65Hz，3H)2.67-2.92(m，1H)。母體分子C19H22ClN7O3之m/z(APCI+)為431.9(M+H)+，具有Cl同位素圖案。
替代實施例1：1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮(亦稱為〝1-((3R,4R)-3-(((5-氯-2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-4-甲氧基吡咯啶-1-基)丙-2-烯-1-酮〞)(〝化合物A〞)之製法
步驟1：(3,4-反式)-1-苯甲基-4-甲氧基吡咯啶-3-羧酸甲酯之製法
將反式-3-甲氧基丙烯酸甲酯(500毫升，540公克，4.65莫耳)與苯甲基甲氧基甲基三甲基矽基胺(595毫升，552.1公克，2.3莫耳)在氮氛圍下以磁攪拌混合。將TFA(2.7毫升，4.14公克，36.3毫莫耳)添加至此混合物中，其導致在30秒內放熱至約95℃。接著將所得混合物在回流下加熱1小時(注意：在開始時，回流溫度為約104℃，並在1小時之後，其下降至約90℃)。以此規模進行三批加上另一批使用325毫升苯甲基甲氧基甲基三甲基矽基胺化合物。將該等批組中之二者合併且倒入2N HCl(5公升)中。將混合物以EtOAc(3公升和2公升)萃取。在冰上冷卻，水層係藉由添加50%NaOH(水性)而來到pH 9。將水層以EtOAc(2.5公升，1.5公升和1公升)萃取。將合併的有機層以食鹽水(3公升)清洗且經Na2SO4乾燥。剩餘的批組進行相同的整理。將所有的有機層過濾且將濾液在真空中濃縮，得到粗製標題化合物(消旋性-反式，1640公克)。在以減壓(bulb-to-bulb)蒸餾(0.1毫巴，100℃-145℃)分批純化之後，分離出成為黃色油的標題化合物(69%之總產率)。
步驟2：(3,4-反式)-4-甲氧基吡咯啶-3-羧酸甲酯之製法
將(3,4-反式)-1-苯甲基-4-甲氧基吡咯啶-3-羧酸甲酯(463.3公克，1858毫莫耳)溶解在iPrOH(2公升)中。將20%Pd(OH)2/C(50公克，37%水分，Aldrich)添加至此溶液中且將混合物劇烈攪拌。施加11.8巴之H2壓力且進行數次再填充，直到1H-NMR顯示完全轉化為止。將混合物經由矽藻土過濾且將矽藻土以iPrOH沖洗。將濾液在真空中濃縮，得到成為深黃色液體的標題化合物(266公克，90%之產率)。以原樣子用於下一步驟中。
步驟3：(2R,3R)-2,3-雙(苯甲氧基)-3-羧基丙酸(3R,4S)-3-甲氧基-4-(甲氧基羰基)吡咯錠之製法
將乙醇(1公升)中的(3,4-反式)-4-甲氧基吡咯啶-3-羧酸甲酯(480公克，2.84莫耳)之溶液添加至乙醇(5 公升)中的O,O-二苯甲醯基-L-酒石酸(1公斤，2.79莫耳)之溫溶液中。接種澄清溶液且容許經隔夜結晶。將所得固體分離且以乙醇清洗。將此富含之材料自乙醇再結晶5次(2次5公升，4公升，3.5公升和3公升)，以供給216公克(15%之產率)鹽，其具有98%之鏡像異構物過量(使用以下條件，Rt 12.18分鐘)。
掌性純度測定：
樣品製備：將5毫克鹽與DCM(1.5毫升)及2N NaOH(0.2毫升)混合。將DCM層乾燥且以氣相層析術分析。
管柱：Agilent Cyclosil B；30公尺×250公分×0.25公分
溫度：90℃(0分鐘)至5℃/分鐘至180℃(4分鐘)。總運作時間22分鐘。
注射溫度：250℃
偵測器：250℃；FID
注射體積：1.0微升
分流比：25：1
管柱流速：2.2毫升/分鐘(H2)
步驟4：(3S,4R)-4-甲氧基吡咯啶-1,3-二羧酸1-第三丁基3-甲酯之製法
將DCM及飽和NaHCO3中的(2R,3R)-2,3-雙(苯甲氧基)-3-羧基丙酸(3R,4S)-3-甲氧基-4-(甲氧基羰基)吡咯錠(216公克，420毫莫耳)之混合物以機械攪拌且分批添加Boc2O(119公克，546毫莫耳)。將混合物在室溫下攪拌隔夜且將層分離。將水相以DCM萃取且將合併的有機層以食鹽水清洗，乾燥且濃縮。此供給與33%Boc2O混合的138公克粗製標題產物(85%之產率)。直接用於下一步驟中。
步驟5：(3R,4R)-3-(羥甲基)-4-甲氧基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯之製法
將(3S,4R)-4-甲氧基吡咯啶-1,3-二羧酸1-第三丁基 3-甲酯(138公克，含有Boc2O，約2：1，~0.35莫耳)溶解在2公升THF中。將溶液以機械攪拌且冷卻至-78℃。經30分鐘逐滴添加氫化鋰鋁溶液(在THF中的2.4M，200毫升，0.5莫耳)，維持溫度低於-70℃。接著容許溫度上升至-30℃。緩慢地添加酒石酸鈉鉀四水合物飽和溶液(水性，100毫升)，以中止反應。將固體材料經由Na2SO4床濾出。將濾液在真空中濃縮，得到成為幾乎無色漿液的標題化合物(66公克，0.28莫耳，~80%之產率)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：ppm 3.80(q，J=5.1Hz，1H)，3.62(d，J=6.2Hz，2H)，3.56(m，1H)，3.52(d，J=7.4Hz，1H)，3.40-3.30(m，1H)，3.36(s，3H)，2.42(m，1H)，1.46(s，9H)。C11H21NO4之m/z(GCMS)為231.2(M)+。C11H21NO4之m/z(APCI+)為132.0(M+H)+。比旋光度：[a]D=+11.6度(c 0.77，MeOH)。掌性純度測定方法：Chiralpak AD-H 21.2×250mm 5u管柱，其以12%MeOH：88%CO2之移動相溶析，在35℃下且保持至120巴。62毫升/分鐘之流速。3.36分鐘之Rt。
步驟6：(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯之製法
將第三戊醇鉀(25%w/w於甲苯中，80毫升，167毫莫耳)添加至圓底燒瓶中的1,4-二噁烷(100毫升)中的2,4,5-三氯-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(9.28公克，41.7毫莫耳)及(3R,4R)-3-(羥甲基)-4-甲氧基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(9.65公克，41.7毫莫耳)之溶液中。將所得反應溶液在周圍溫度下攪拌30分鐘。LCMS顯示定量形成的中間物(3R,4R)-3-{[(2,5-二氯-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]甲基}-4-甲氧基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。將1-甲基-1H-吡唑-4-基胺(4.86公克，50.1毫莫耳)、t-BuXPhos鈀環(1.1公克，1.67毫莫耳，0.04莫耳當量)添加至上述反應溶液中，且將反應混合物在油浴中攪拌及加熱至90℃經1小時。LCMS顯示反應完成。將反應混合物經由矽藻土過濾且將矽藻土以乙酸乙酯(200毫升)清洗。將合併的濾液蒸發，以移除揮發物，得到深色殘餘物。將此殘餘物溶解在乙酸乙酯(300毫升)中且經由矽膠塞管過濾。將濾液蒸發且將殘餘物經由以庚烷中的0-100%EtOAc之梯度溶析的快速層析術純化，得到標題化合物(12.4公克，62%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 11.51(br.s.，1H)9.07(s，1H)7.86 (s，1H)7.52(s，1H)7.06(d，J=2.20Hz，1H)4.31-4.54(m，2H)3.92(br.s.，1H)3.80(s，3H)3.55-3.68(m，1H)3.44-3.55(m，1H)3.30(d，J=18.34Hz，3H)2.72(br.s.，1H)1.39(br.s.，9H)。C21H28ClN7O4之m/z(APCI+)為378.2(M+H)+，具有Cl同位素圖案。旋光度：[a]d=-8.3度(c=0.24，MeOH)。
步驟7：(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯錠三氟乙酸鹽之製法
將TFA(10.1毫升，208毫莫耳)添加至水浴中在DCM(60毫升)中的(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(12.40公克，26毫莫耳)之溶液中且將所得溶液在周圍溫度下攪拌2.5小時。移除揮發物，得到殘餘物，將***(150毫升)添加至其中。將所得懸浮液攪拌2小時且以過濾收集淺粉紅色固體，以***(30毫升)清洗且乾燥，得到標題產物 (15.69公克，100%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 11.56(br.s.，1H)9.09(s，3H)7.85(s，1H)7.54(s，1H)7.09(d，J=2.32Hz，1H)4.48(d，J=6.48Hz，2H)4.11(br.s.，1H)3.81(s，3H)3.46-3.60(m，1H)3.35-3.45(m，2H)3.32(s，3H)3.15(dq，J=12.01，6.02Hz，1H)2.88(m，J=6.42，6.42Hz，1H)。母體分子C16H20ClN7O2之m/z(APCI+)為378.2(M+H)+，具有Cl同位素圖案。旋光度：[a]d=-4.1度(c=0.24，MeOH)。
步驟8：1-{(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基胺基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮之製法
將(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯錠三氟乙酸鹽(15.0公克，24.7毫莫耳)、乙酸乙酯(200毫升)與飽和水性NaHCO3(100毫升)之混合物在0℃攪拌10分鐘。逐滴添加丙烯醯氯(2.3毫升，29毫 莫耳，1.1莫耳當量)且將所得混合物在周圍溫度下攪拌30分鐘。添加乙酸乙酯(150毫升)且將有機層分離；將水層以乙酸乙酯(150毫升)萃取，將合併的有機層經Na2SO4乾燥且蒸發，得到固體，將其經由以乙酸乙酯中的0-50%乙醇之梯度溶析的快速層析術純化，得到白色固體。接著將此固體以使用熱膠的光加熱而自乙醇(1公克粗製物以10毫升乙醇)再結晶且以晶種接種。在冷卻時，以過濾收集白色晶體且以乙醇(1公克粗製物以3毫升乙醇)清洗，得到成為白色固體的標題化合物(7.47公克，70%)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 11.50(br.s.，1H)9.06(s，1H)7.85(s，1H)7.51(s，1H)7.04(d，J=2.32Hz，1H)6.58(ddd，J=16.78，10.30，1.16Hz，1H)6.13(dd，J=16.81，2.38Hz，1H)5.67(dt，J=10.33，2.23Hz，1H)4.43(d，J=6.24Hz，2H)3.95-4.05(m，1H)3.68-3.85(m，4H)3.56-3.66(m，2H)3.44-3.53(m，1H)3.30(d，J=4.65Hz，3H)2.68-2.90(m，1H)。母體分子C19H22ClN7O3之m/z(APCI+)為432.1(M+H)+，具有Cl同位素圖案。掌性純度測定：Whelk-O1(R,R)4.6×250毫米管柱，30%EtOH，在140巴，3毫升/分鐘。Rt=~8.8分鐘，峰1，>99%ee。旋光度：[a]D22=-3.1度(c 0.14，EtOH)。 元素分析：理論值：C，52.84；H，5.13；Cl，8.21；N，22.70。實測值：C，52.45；H，5.38；Cl，7.91；N，22.02。
實施例2：N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙-2-烯醯胺(〝化合物B〞)之製法
步驟1：2,4-二氯-5-碘-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶之製法
將N-碘琥珀醯亞胺(62.8公克，279毫莫耳，1.05當量)以使得內溫維持在低於50℃之速率添加至DMF(266毫升，1.0M)中的2,4-二氯-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(50.0公克，266毫莫耳，1.00當量)之溶液中。將反應混合物劇烈攪拌且在周圍溫度浴中經1.5小時冷卻。將反應混合物以冰水(1.5公升)稀釋且將所得沉澱物以過濾分離。將沉澱物以冰水(2×500毫升)清洗且在真空中於45℃下 經36小時乾燥，得到成為灰白色固體的標題化合物(81.5公克，98%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 13.09(br.s.，1H)，7.95(s，1H)。C6H2Cl2IN3之m/z(APCI+)為313.9(M+H)+。
步驟2：2,4-二氯-5-碘-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶之製法
將2-(三甲基矽基)乙氧基甲基氯(59.5毫升，337毫莫耳，1.30當量)以逐滴方式經5分鐘添加至THF(600毫升)中的2,4-二氯-5-碘-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(81.4公克，259毫莫耳，1.00當量)及二異丙基乙胺(105毫升，596毫莫耳，2.30當量)之冷卻(0℃)溶液中。容許反應混合物在0℃攪拌3小時。在此時將反應混合物過濾且將濾液在真空中濃縮。將所得濃油以EtOAc(400毫升)稀釋，依序以飽和水性NH4Cl(2×200毫升)及食鹽水(2×200毫升)清洗，經Na2SO4乾燥且在真空中濃縮。將所得材料溶解在最少量的DCM(50毫升)中且以庚烷(200毫升)稀釋。將此溶液濃縮至150 毫升總體積，其加速標題化合物濕磨。將此混合物過濾，得到標題化合物(84.1公克)，將濾液濃縮且經由以庚烷中的0-15%EtOAc之梯度溶析的快速層析術進一步純化，以提供額外部分的標題化合物(26.5公克)。將該兩部分合併，得到成為灰白色固體的所欲產物(110.6公克)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ ppm 7.50(s，1H)，5.57(s，2H)，3.61(t，J=8.0Hz，2H)，0.95(t，J=8.0Hz，2H)，0.01(s，9H)。C12H16Cl2IN3OSi之m/z(APCI+)為444.0(M+H)+。
步驟3：2,4-二氯-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶之製法
將i-PrMgCl溶液(47.3毫升，94.6毫莫耳，1.40當量，1.00M THF)以逐滴方式經4分鐘添加至THF(350毫升)中的2,4-二氯-5-碘-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(30.0公克，68.0毫莫耳，1.00當量)之冷卻(-78℃)溶液中。將反應混合物在-78℃下攪拌2小時且接著以THF(100毫升)中的 ZnBr2(24.7公克，110毫莫耳，1.62當量，在130℃下乾燥)之新鮮製備溶液以逐滴方式處理15分鐘。將混合物在-78℃下再攪拌1小時，接著溫熱至周圍溫度且再攪拌0.5小時。在此時將反應混合物以Pd(PPh3)4(3.94公克，3.38毫莫耳，0.05當量)及2-碘吡啶(10.8毫升，101莫耳，1.50當量)處理且加熱至65℃經10小時。在冷卻至周圍溫度時，將反應混合物濃縮至~200毫升體積，以水(600毫升)、飽和水性酒石酸鈉鉀(100毫升)和EtOAc(400毫升)稀釋。將層分離且將水層以EtOAc(4×300毫升)萃取。將合併的有機物以食鹽水(300毫升)清洗，乾燥(Na2SO4)且在真空中濃縮。將所得油經由以庚烷中的0-30%EtOAc之梯度溶析的快速層析術純化，以提供成為油的標題化合物(23.5公克，87%之產率)，其在靜置時轉化成淺褐色固體。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ ppm 8.76-8.63(m，1H)，7.83-7.77(m，1H)，7.74(s，1H)，7.67(d，J=7.8Hz，1H)，7.35-7.29(m，1H)，5.68(s，2H)，3.61(dd，J=7.6，8.9Hz，2H)，1.03-0.92(m，2H)，-0.01(s，9H)。C17H20Cl2N4OSi之m/z(APCI+)為395.1(M+H)+。
步驟4：(反式-3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}環丁基)-胺甲酸第三丁酯之製法
將THF(1.0公升)中的(順式-3-羥基環丁基)胺甲酸第三丁酯(62.0公克，330毫莫耳，1.00當量)及4-硝基苯甲酸(60.8公克，360毫莫耳，1.10當量)之冷卻(0℃)溶液依序以PPh3(130公克，490莫耳，1.48當量)及偶氮二羧酸二乙酯(86.3公克，490毫莫耳，1.48當量)處理。在添加之後，將反應混合物回流4天，冷卻至周圍溫度且在真空中濃縮。將殘餘物自i-PrOH再結晶，得到白色固體(63公克)。
將K2CO3(51.6公克，370毫莫耳)添加至MeOH(1.0公升)及H2O(200毫升)中的上述所獲得的4-硝基苯甲酸酯(63公克)之溶液中。將所得混合物回流2小時，冷卻至周圍溫度且過濾。將濾液在真空中濃縮且分溶在EtOAc與水性10%Na2CO3之間。將所得有機層以食鹽水清洗且濃縮，以供給白色固體(31.0公克)。
將TBSCl(91.0公克，600毫莫耳，1.50當量)添加至吡啶(1.0公升)中的上述所獲得的醇(75.0公克，400毫莫耳，1.00當量)之溶液中。將反應混合物在周圍溫度 下攪拌2小時且接著在真空中濃縮。將所得殘餘物經由以石油醚中的0-10%EtOAc之梯度溶析的快速層析術純化，以提供成為白色固體的標題化合物(111公克，92%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 7.13(d，1H)4.38-4.47(m，1H)3.90(br.s.，1H)2.00-2.16(m，4H)1.36(s，9H)0.81-0.89(m，9H)-0.01-0.01(m，6H)。C10H23NOSi之m/z(APCI+)為202.1(M-Boc+H)+。
步驟5：(反式-3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}環丁基)-甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將NaH(在油中的60%分散液，22.2公克，550毫莫耳，1.50當量)分批添加至THF(1.0公升)中的(反式-3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}環丁基)胺甲酸第三丁酯(111公克，370毫莫耳，1.00當量)之溶液中。在添加之後，將反應混合物再攪拌0.5小時，冷卻(0℃) 且以甲基碘(38.2毫升，615毫莫耳，1.66當量)以逐滴方式處理。在周圍溫度下再5小時之後，將反應混合物在真空中濃縮且將所得殘餘物經由以石油醚中的10%EtOAc溶析之快速層析術純化，以提供成為油的標題化合物(97.5公克，84%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 4.64(br.s.，1H)4.29-4.37(m，1H)2.73(s，3H)2.31-2.43(m，2H)1.97-2.08(m，2H)1.37(s，9H)0.86(s，9H)-0.01-0.05(m，6H)。C11H25NOSi之m/z(APCI+)為216.2(M-Boc+H)+。
步驟6：(反式-3-羥基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將TBAF(930毫升，930毫莫耳，1.55當量，在THF中的1M)添加至THF(1.0公升)中的(反式-3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯(195公克，600毫莫耳，1.00當量)之溶液中。將反應混合物在周圍溫度下攪拌3小時且接著在真空中濃 縮。將所得殘餘物分溶在EtOAc(1.0公升)與飽和水性NH4Cl(500毫升)之間。將所得有機層在真空中濃縮且將所得殘餘物經由以石油醚中的10%EtOAc溶析之快速層析術純化，以提供成為白色固體的標題化合物(88公克，76%之產率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ ppm 4.78(s，1H)，4.41-4.38(m，1H)，2.82(s，3H)，2.41-2.38(m，2H)，2.23-2.20(m，2H)，1.47(s，9H)。C10H18NO3之m/z(ESI+)為146.1(M-tBu+H)+。
步驟7：甲基{反式-3-[(2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯之製法
將雙(三甲基矽基)胺化鉀(12.4公克，62.3毫莫耳，1.12當量)分三批添加至THF(100毫升)中的(反 式-3-羥基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯(12.9公克，64.0毫莫耳，1.15當量)之冷卻溶液中。在添加之後，容許烷醇化物溶液經0.5小時溫熱至周圍溫度。將2,4-二氯-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(22.0公克，55.6毫莫耳，1.00當量)及THF(300毫升)裝入另一燒瓶中且冷卻(0℃)。將此溶液以經由導管的烷醇化物溶液處理5分鐘且接著在0℃再攪拌0.5小時。接著將反應混合物以食鹽水(100毫升)、水(200毫升)和EtOAc(600毫升)稀釋。將層分離且將水層以EtOAc(4×200毫升)萃取。接著將合併的有機層以食鹽水(200毫升)清洗，乾燥(Na2SO4)且在真空中濃縮。以未進一步純化的所得黏性油(31.0公克)用於下一步驟中。
將1-甲基-1H-吡唑-4-胺(7.57公克，77.9毫莫耳，1.40當量)、Pd2dba3(2.68公克，2.78毫莫耳，0.05當量)、4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯並哌喃(3.25公克，5.56毫莫耳，0.10當量)及Cs2CO3(45.8公克，139毫莫耳，2.5當量)添加至1,4-二噁烷(300毫升)中的上述所獲得的油(31.0公克)之溶液中。接著將反應混合物以氮氣流沖洗20分鐘且在105℃下以劇烈攪拌加熱10小時。在冷卻至周圍溫度時，將反應混合物以EtOAc(500毫升)稀釋，經由矽藻土過濾且在真空中濃縮。將所得殘餘物經由以庚烷中的0-80%EtOAc之梯度溶析的快速層析術純化，以提供成為橘色泡沫的標題化合物(25.6 公克，74%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 9.17(s，1H)，8.56(d，J=4.3Hz，1H)，8.14(d，J=7.9Hz，1H)，7.93(br.s.，1H)，7.87-7.79(m，1H)，7.69(s，1H)，7.55(s，1H)，7.23(dd，J=5.0,7.2Hz，1H)，5.57(br.s.，2H)，5.47(br.s.，1H)，4.84-4.66(m，1H)，3.82(s，3 H)，3.63-3.53(m，2H)，2.84(s，3 H)，2.75-2.62(m，2H)，2.47-2.34(m，2H)，1.38(s，9H)，0.86(t，J=8.0Hz，2H)，-0.11(s，9H)。C31H44N8O4Si之m/z(APCI+)為621.3(M+H)+。
步驟8：3-氯-N-甲基-N-{反式-3-[(2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]環丁基}丙醯胺之製法
將TFA(70.0毫升，914毫莫耳，22.7當量)以逐滴方式添加至MeCN(600毫升)中的甲基{反式-3-[(2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯(25.0公克，40.3毫莫耳，1.00當量)之冷卻(0℃)溶液中。將反應混合物在0℃攪拌且接著容許溫熱至周圍溫度隔夜。接著將反應混合物冷卻(0℃)，以水性NaOH調整至pH=8且將相分離。將水相以EtOAc(3×300毫升)萃取且將合併的有機相以食鹽水(2×200毫升)清洗，乾燥(Na2SO4)且在真空中濃縮。將所得殘餘物經由以DCM中的2-7%MeOH之梯度溶析的快速層析術部分純化，以提供成為黃色膠的4-{[反式-3-(甲基胺基)環丁基]氧基}-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-吡啶-2-基-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-2-胺，將其直接用於下一步驟中。
將3-氯丙醯氯(8.25毫升，86.4毫莫耳，1.51當量)以逐滴方式添加至DCM(500毫升)中的4-{[反式-3-(甲基胺基)環丁基]氧基}-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-吡啶-2-基-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-2-胺及DIPEA(16.0毫升，91.9毫莫耳，1.61當量)之溶液中且接著在周圍溫度下攪拌1小時。接著將反應混合物以H2O(2×100毫升)和食鹽水(100毫升)清洗，乾燥(Na2SO4)且在真空中濃縮。將所得膠以MTBE(250毫升)濕磨，將固體過濾且在真空 中乾燥，得到成為黃色固體的標題化合物(24.0公克，68.9%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm 9.10-9.25(m，1H)8.51-8.61(m，1H)8.10-8.25(m，1H)7.92-8.05(m，1H)7.82-7.91(m，1H)7.67-7.76(m，1H)7.47-7.60(m，1H)7.17-7.30(m，1H)5.55-5.64(m，2H)5.40-5.54(m，1H)4.63-5.31(m，1H)3.83(s，3 H)3.74-3.81(m，2H)3.53-3.66(m，2H)2.92-3.08(m，3H)2.81-2.89(m，2H)2.58-2.79(m，2H)2.29-2.46(m，2H)0.75-0.93(m，2H)-0.10(s，9H)。C29H39ClN8O3Si之m/z(APCI+)為611.2(M+H)+。
步驟9：N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙-2-烯醯胺之製法
將HCl溶液(250毫升，4M於1,4-二噁烷中)添加至DCM/iPrOH(9：1，250毫升)中的3-氯-N-甲基-N-{反式-3-[(2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-(吡啶- 2-基)-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]環丁基}丙醯胺(24.0公克，39.2毫莫耳，1.00當量)之溶液中。將反應混合物在周圍溫度下攪拌隔夜，在真空中濃縮，以供給3-氯-N-[反式-3-({7-(羥甲基)-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-吡啶-2-基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]-N-甲基丙醯胺，其以未進一步純化而用於下一步驟中。
將來自先前步驟的中間物溶解在1,4-二噁烷(80毫升)及濃縮水性NH4OH(50毫升)中。將反應混合物在周圍溫度下攪拌3小時且接著在真空中濃縮。將殘餘物以MTBE(100毫升)濕磨，將固體過濾且在真空中乾燥，得到成為黃色固體的3-氯-N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-吡啶-2-基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙醯胺，其以未進一步純化而用於下一步驟中。
將K2CO3(21.4公克，155毫莫耳，3.95當量)添加至EtOH(400毫升)中的3-氯-N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-5-吡啶-2-基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)環丁基]丙醯胺之溶液中且將反應混合物在周圍溫度下攪拌隔夜。將反應混合物過濾，以移除無機鹽，在真空中濃縮且溶解在EtOAc(100毫升)中。添加MTBE(200毫升)，以沉澱粗製產物，以過濾收集。將濾液濃縮且經由以DCM中的2-7%MeOH之梯度溶析的快速層析術純化，以提供額外部分的粗製產物。將 合併的粗製材料經由使用以H2O(0.225%HCOOH)中的5%MeCN至H2O(0.225%HCOOH)中的25%MeCN之梯度溶析的YMC-Actus Triact C18(150毫米×30毫米×5微米)管柱之反相層析術純化，得到成為黃色固體的標題化合物之甲酸鹽(7.14公克，經3個步驟的37%)。
將飽和水性NaHCO3(100毫升)及EtOAc(200毫升)依序添加至H2O(200毫升)中的標題化合物之甲酸鹽(5.14公克)的溶液中。將層分離且將水層以EtOAc(8×100毫升)萃取。將合併的有機物乾燥(Na2SO4)且在真空中濃縮，得到成為非晶形固體的標題化合物。將一部分的此非晶形固體(~3公克)溶解在最少量的EtOH/EtOAc(~1：1，~120毫升)中，在真空中濃縮至~10毫升體積且以EtOAc(40毫升)稀釋。將此溶液以~5毫克結晶產物接種且容許在周圍溫度下攪拌隔夜。將結晶瓶冷卻(0℃)1小時，以促使進一步結晶。以過濾收集產物且在真空中乾燥，得到含有EtOAc(0.038當量)及EtOH(0.03當量)之成為白色結晶材料的標題化合物(2.63公克)。mp=204.9℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6，30℃)δ ppm 11.65(s，1H)，8.93(s，1H)，8.54(d，J=3.9Hz，1H)，8.14(d，J=8.1Hz，1H)，7.86(s，1H)，7.82(t,J=7.3Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.52(s，1H)，7.20(ddd，J=1.0,4.9，7.4Hz，1H)，6.71(br.s.，1H)，6.08(br.s.，1H)，5.66(br.s.，1H)，5.53(br.s.，1H)，5.31-4.79(m， 1H)，3.82(s，3 H)，3.15-2.93(m，3 H)，2.76(br.s.，2H)，2.46(br.s.，2H)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6，80℃)δ ppm 11.41(br.s.，1H)，8.59(s，1H)，8.55-8.52(m，1H)，8.13(d，J=8.1Hz，1H)，7.84(s，1H)，7.80(dt，J=1.9,7.7Hz，1H)，7.55(s，1H)，7.50(s，1H)，7.18(ddd，J=1.0，4.8，7.4Hz，1H)，6.66(dd，J=10.6，16.8Hz，1H)，6.05(dd，J=2.3，16.8Hz，1H)，5.63(dd，J=2.3，10.5Hz，1H)，5.59-5.53(m，1H)，5.00(t，J=8.0Hz，1H)，3.82(s，3H)，3.04(s，3H)，2.82-2.71(m，2H)，2.55-2.45(m，2H)。C23H24N8O2之m/z(APCI+)為445.2(M+H)+。元素分析：實測值：C，61.96；H，5.50；N，24.93。C23H24N8O2+0.038EtOAc+0.030當量EtOH需要C，62.06；H，5.49；N，24.95。
實施例3：N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}胺基)環丁基]-N-甲基丙-2-烯醯胺(〝化合物C〞)
步驟1：甲基{順式-3-[1-甲基-1-(三甲基矽基)乙氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯之製法
將TBSCl(12.7公克，84毫莫耳，1.50當量)添加至吡啶(150毫升)中的(順式-3-羥基環丁基)胺甲酸第三丁酯(10.5公克，56毫莫耳，1.00當量)之溶液中。在添加之後，將混合物在周圍溫度下攪拌3小時。TLC(石油醚/EtOAc=3/1)顯示起始材料完全消耗。將反應混合物濃縮且將殘餘物以EtOAc(3×100毫升)萃取。將合併的有機層濃縮，得到成為油的粗製物{順式-3-[1-甲基-1-(三甲基矽基)乙氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯，其以 未進一步純化而用於下一步驟中。
將粗製物{順式-3-[1-甲基-1-(三甲基矽基)乙氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯在THF(300毫升)中稀釋，以NaH(60%，3.36公克，84毫莫耳，1.50當量)分批處理且在室溫下攪拌30分鐘。將混合物冷卻至0℃且以甲基碘(23.9公克，168毫莫耳，3.0當量)以逐滴方式處理。在添加之後，將反應混合物在周圍溫度下攪拌5小時。TLC(石油醚/EtOAc=10/1)顯示起始材料已完全消耗。將反應混合物濃縮且經由矽膠層析術(石油醚/EtOAc=10/1)純化，得到成為油的標題化合物(18公克，100%)。
步驟2：(順式-3-羥基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將TBAF(22.0公克，84毫莫耳，1.50當量)分批添加至THF(200毫升)中的甲基{順式-3-[1-甲基-1-(三甲基矽基)乙氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯(18公克，56毫莫耳，1.0當量)之溶液中。在添加之後，將混合物在 周圍溫度下攪拌3小時。TLC(石油醚：EtOAc=2：1)顯示起始材料完全消耗。將反應混合物濃縮且將殘餘物以管柱層析術(石油醚：EtOAc=2：1)純化，以供給成為白色固體的標題化合物(8.9公克，79%之產率)。
步驟3：(反式-3-胺基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將MsCl(14.1公克，0.123莫耳，1.38當量)以逐滴方式經30分鐘添加至DCM(300毫升)中的(順式-3-羥基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯(18.0公克，0.089莫耳，1.0當量)及三乙胺(37毫升，0.267莫耳，3.0當量)之劇烈攪拌的冷卻(-30℃)溶液中。接著容許反應混合物溫熱至周圍溫度且攪拌1小時。將反應混合物以水(100毫升)和DCM(200毫升)稀釋。將有機相分離，以水(2×100毫升)、飽和水性NH4Cl(3×100毫升)和食鹽水(100毫升)清洗，經無水Na2SO4乾燥且濃縮，得到成為黃色固體的粗製物順式-甲烷磺酸-3-[(第三丁氧基羰基)(甲基)胺基]環丁酯，其以未進一步純化而用 於下一步驟中。
將上述所獲得的粗製物順式-甲烷磺酸-3-[(第三丁氧基羰基)(甲基)胺基]環丁酯溶解在DMF(250毫升)中且以NaN3(28.77公克，0.44莫耳，5當量)處理。接著將所得混合物加熱至70℃且攪拌隔夜。在冷卻之後，將水(1500毫升)及EtOAc(300毫升)添加至反應混合物中。將相分離且將水層以EtOAc(3×300毫升)萃取。將合併的有機相以飽和水性NaHCO3(2×100毫升)、水(2×200毫升)和食鹽水(100毫升)清洗，經無水Na2SO4乾燥且蒸發，得到粗製物(反式-3-疊氮基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯，將其直接用於下一步驟中。
將MeOH中的飽和NH3(200毫升)經由注射器添加至氫氛圍下在MeOH(100毫升)中的上述粗製物(反式-3-疊氮基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯與Pd/C(2.5公克)之混合物中。將所得混合物在周圍溫度下攪拌36小時。將反應混合物過濾且將濾液在減壓下濃縮。將此粗製材料以從1/10至1/1之EtOAc/石油醚的管柱層析術純化，以供給成為黃色液體的標題化合物(13.6公克，經3個步驟的76.4%之產率)。
步驟4：2,4,5-三氯-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶之製法
將N-氯琥珀醯亞胺(44.5公克，332毫莫耳，1.05當量)在周圍溫度添加至DMF(1800毫升)中的如實施例2，步驟1中所製備之2,4-二氯-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(100.0公克，316毫莫耳，1.0當量)的溶液中。接著將所得混合物在80℃下攪拌3小時。接著將反應混合物冷卻至周圍溫度且倒入冰水(3公升)中。收集所形成的白色沉澱物且在真空中乾燥，得到成為灰色固體的標題化合物(99.7公克，90%之產率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ ppm=7.35(s，1H)，5.58(s，2H)，3.60-3.49(m，2H)，1.00-0.89(m，2H)，-0.02(s，9H)。C12H16Cl3N3OSi之m/z(APCI+)為352.0(M+H)+。
步驟5：1,3-二甲基-1H-吡唑-4-胺之製法
將MeOH(15毫升)中的1,3-二甲基-1H-吡唑-4-胺鹽酸鹽(800毫克)之溶液以氫氧化物樹脂(Bio Rad AG 1-X2樹脂，目錄#143-1255)處理，直到獲得pH~8為止。將混合物攪拌15分鐘。將樹脂濾除且以數份MeOH清洗。將濾液在減壓下濃縮，得到標題化合物(615.3毫克，94%之產率)。此材料係以未進一步純化而使用。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm=6.89(s，1H)3.57(s，3H)3.54(br.s.，2H)1.96(s，3H)。C5H9N3之m/z(APCI+)為112.1(M+H)+。
步驟6：{反式-3-[(2,5-二氯-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)胺基]環丁基}甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將MeCN(21.0毫升，0.2M)中的(反式-3-胺基環 丁基)甲基胺甲酸第三丁酯(1020毫克，5.1毫莫耳，1.2當量)、2,4,5-三氯-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(1500毫克，4.253毫莫耳，1.0當量)與DIPEA(2.12毫升，12.8毫莫耳，3.0當量)之混合物在80℃下加熱5.5小時。將反應混合物以水稀釋且以EtOAc萃取。將有機層經Na2SO4乾燥且濃縮。將殘餘物經由快速層析術(在庚烷中的10至30%EtOAc)純化，得到成為透明膠的標題化合物(2.22公克，100%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm=7.54(s，1H)7.05(d，J=5.99Hz，1H)5.40(s，2H)4.74(br.s.，1H)4.41-4.54(m，1H)3.45-3.54(m，2H)2.83(s，3H)2.52-2.63(m，2H)2.28-2.42(m，2H)1.40(s，9H)0.78-0.89(m，2H)-0.08(s，9H)。C22H35Cl2N5O3Si之m/z(APCI+)為516.2(M+H)+。
步驟7：{反式-3-[(5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)胺基]環丁基}甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將Pd2(dba)3(393毫克，0.425毫莫耳，0.1當量)、Xantphos(259毫克，0.425毫莫耳，0.1當量)及Cs2CO3(4160毫克，12.8毫莫耳，3.0當量)裝入含有1,3-二甲基-1H-吡唑-4-胺(567毫克，5.10毫莫耳，1.2當量)及{反式-3-[(2,5-二氯-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)胺基]環丁基}甲基胺甲酸第三丁酯(2197毫克，4.253毫莫耳，1.00當量)之燒瓶中。添加1,4-二噁烷(42毫升，0.1M)且將混合物加熱至105℃經18小時。將反應冷卻至室溫且經由矽藻土墊過濾。將濾液濃縮且將殘餘物經由快速層析術(在庚烷中的40-60%EtOAc)純化，得到成為泡沫的標題化合物(1950毫克，78%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ ppm=8.03(s，1H)7.87(s，1H)7.10(s，1H)6.33(d，J=6.24Hz，1H)5.35(s，2H)4.67(br.s.，1H)4.55(br.s.，1H)3.68-3.75(m，3H)3.45-3.53 (m，2H)2.85(s，3H)2.52-2.60(m，2H)2.29-2.38(m，2H)2.12(s，3H)1.40(s，9H)0.78-0.88(m，2H)-0.10(s，9H)。C27H43ClN8O3Si之m/z(APCI+)為591.3(M+H)+。
步驟8：N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}胺基)環丁基]-N-甲基丙-2-烯醯胺之製法
將TFA(31毫升)添加至DCM(42毫升)中的{反式-3-[(5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)胺基]環丁基}甲基胺甲酸第三丁酯(1950毫克，3.30毫莫耳，1.0當量)之冷卻(0℃)溶液中。容許反應混合物來到室溫且再攪拌16小時。接著將反應混合物以甲苯(30毫升)稀釋且濃縮至乾燥。將所得粗製殘餘物溶解在1,4-二噁烷(20毫升)和濃縮水性NH4OH(20毫 升)中且在周圍溫度下攪拌3小時。接著將反應混合物蒸發至乾燥。將所得粗製固體分溶在EtOAc(140毫升)與飽和水性Na2CO3(140毫升)之間且以丙烯醯氯(0.420毫升，5.19毫莫耳，1.58當量)劇烈攪拌處理1小時。在此時將層分離且將水層以EtOAc(50毫升)萃取。將合併的有機層乾燥(Na2SO4)，以甲苯(30毫升)稀釋且蒸發至乾燥。將所得固體以使用ZymorSpher HAP 150×21.2毫米管柱，以20-40%EtOH @ 4%/分鐘，140巴，55毫升/分鐘之SFC純化，以供給成為灰色粉末的標題化合物(950毫克，69%之產率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6，26℃)δ ppm=11.16(br.s.，1H)，7.80(br.s.，1H)，7.77(s，1H)，6.88(d，J=2.4Hz，1H)，6.74(dd，J=10.5，16.7Hz，1H)，6.32(br.s.，1H)，6.07(d，J=15.9Hz，1H)，5.66(d，J=10.4Hz，1H)，5.30-4.75(m，1H)，4.59(br.s.，1H)，3.71(s，3H)，3.15-2.88(m，3H)，2.62(br.s.，2H)，2.40(br.s.，2H)，2.08(s，3H)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6，80℃)δ ppm=10.93(br.s.，1H)，7.73(s，1H)，7.41(br.s.，1H)，6.82(d，J=2.2Hz，1H)，6.68(dd，J=10.5,16.9Hz，1H)，6.16(d，J=5.9Hz，1H)，6.05(dd，J=2.4,16.8Hz，1H)，5.63(dd，J=2.4，10.5Hz，1H)，4.94(t，J=8.0Hz，1H)，4.60(dd，J=4.0，8.7Hz，1H)，3.72(s，3H)，3.04(s，3H)，2.72-2.57(m，2H)，2.41 (ddd，J=4.5，8.9，13.6Hz，2H)，2.10(s，3H)。C19H23ClN8O3之m/z(APCI+)為415.1(M+H)+。
實施例4：1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮(〝化合物D〞)之製法
以類似於實施例1的方式製備，以3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-胺取代1-甲基-1H-吡唑-4-胺及其他的非關鍵性取代。
重要的中間物之實驗程序 製法1：3-(羥甲基)-4-(甲氧基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯之製法
步驟1：(2E)-4-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丁-2-烯酸乙酯之製法
將DIEA(2.75毫升，16.6毫莫耳)及LiCl(5.54公克，129毫莫耳)添加至CH3CN(40毫升)中的第三丁基二甲基矽氧基乙醛(3.22公克，18.5毫莫耳)及膦醯基乙酸二乙基甲酯(4.66公克，22.2毫莫耳)之溶液中且將混合物在室溫下攪拌24小時。將混合物以水(50毫升)中止且以EtOAc(50毫升)萃取。將有機層經MgSO4乾燥且濃縮。將殘餘物經由以25%EtOAc/庚烷溶析之快速層析術純化，得到成為無色油的標題化合物(3.27公克，72%之產率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 6.91(dt，J=15.42，3.49Hz，1H)6.01(dt，J=15.61，2.27Hz，1H)4.25(dd，J=3.27，2.27Hz，2H)4.12(q，J=7.22Hz，2H)1.21(t，J=7.18Hz，3H)0.84(s，9 H) 0.00(s，6 H)。
步驟2：反式-1-苯甲基-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-3-羧酸乙酯之製法
將TFA(0.280毫升，3.64毫莫耳)在0℃下添加至CH2Cl2(30毫升)中的(2E)-4-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丁-2-烯酸乙酯(3.27公克，13.4毫莫耳)及N-苯甲基-1-甲氧基-N-((三甲基矽基)甲基)甲胺(4.14公克，17.5毫莫耳)之溶液中。將反應在室溫下攪拌隔夜。將混合物以水(50毫升)中止且以EtOAc(2×50毫升)萃取。將合併的有機層經MgSO4乾燥且濃縮。將殘餘物經由以20%EtOAc/庚烷溶析之快速層析術純化，得到成為淡黃色油的標題化合物(2.61公克，53%之產率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 7.08-7.41(m，5H)，4.10(q，J=7.13Hz，2H)，3.42-3.73(m，4H)，2.37-2.90(m，6H)，1.22(t，J=7.05Hz， 3H)，0.84(s，9H)，0.00(d，J=1.26Hz，6H)。
步驟3：反式-3-乙基-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1,3-二羧酸-1-第三丁酯之製法
將Pd(OH)2(300毫克)及Boc2O(1.90公克，8.61毫莫耳)添加至EtOH(40毫升)中的反式-1-苯甲基-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-3-羧酸乙酯(反式混合物)(3.25公克，8.61毫莫耳)之溶液中。將混合物在H2(50psi，50℃)下攪拌隔夜。將混合物經由矽藻土過濾且將濾液濃縮。將殘餘物經由以5%-10%EtOAc/庚烷溶析之快速層析術純化，得到成為無色油的標題化合物(3.08公克，92%之產率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 4.13-4.25(m，2H)3.65(m，5H)3.14-3.29(m，1H)2.84-3.00(m，1H)2.47-2.70(m，1H)1.46(s，9H)1.27(td，J=7.11，2.64Hz，3 H)0.85-0.92(m，9H)0.05(s，6 H)。
步驟4：反式-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯之製法
將LiBH4(911毫克，39.7毫莫耳)添加至THF(25毫升)中的反式-3-乙基-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1,3-二羧酸-1-第三丁酯(3.08公克，7.95毫莫耳)之溶液中。將混合物加熱至回流經3小時。將反應混合物冷卻至室溫，接著以水(15毫升)中止且在室溫下攪拌1小時。將混合物以水(60毫升)稀釋且以乙酸乙酯(2×80毫升)萃取。將合併的有機層以食鹽水清洗，經Na2SO4乾燥且在真空中濃縮，得到無色油。將粗製產物經由以30%EtOAc/庚烷溶析之快速層析術純化，得到成為無色油的標題化合物(2.34公克，86%之產率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 3.73(m，1H)，3.61(m，2H)，3.52(m，2H)，3.45(m， 1H)，2.90-3.09(m，2H)，2.04-2.32(m，2H)，1.46(s，9H)，0.92(s，9H)，0.10(d，J=1.01Hz，6H)。
步驟5：反式-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-(甲氧基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯之製法
將碘化四丁基銨(0.110公克，0.28毫莫耳)、50%水性NaOH(20毫升)及硫酸二甲酯(0.325毫升，3.41毫莫耳)添加至CH2Cl2(20毫升)中的反式-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(0.982公克，2.84毫莫耳)之溶液中。將反應在室溫下攪拌隔夜。TLC顯示剩餘一些起始材料，所以將額外的硫酸二甲酯(0.150毫升)添加至反應混合物中且在室溫下攪拌3小時。將水性NH3OH(30毫升)添加至反應混合物中且在室溫下攪拌1小時。將混合物以水(20毫升)稀釋且以CH2Cl2(2×30毫升)萃取。將有 機層經MgSO4乾燥且濃縮。將殘餘物經由以10%EtOAc/庚烷溶析之快速層析術純化，得到成為無色油的標題化合物(451毫克，44%之產率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ ppm 3.60-3.70(m，1H)，3.55(br.s.，2H)，3.37-3.48(m，1H)，3.34(m，4H)，3.05-3.23(m，2H)，2.22-2.40(m，1H)，2.07-2.21(m，1H)，1.43-1.49(m，9H)，0.89(s，9H)，0.05(s，6H)。
步驟6：反式-3-(羥甲基)-4-(甲氧基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯之製法
將TBAF(1.0M於THF中，2.45毫升，2.45毫莫耳)添加至THF(5毫升)中的反式-3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-(甲氧基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(290毫克，0.81毫莫耳)之溶液中。將混合物在室溫下攪拌1小時。將混合物以水中止且以EtOAc萃取。將有機層經MgSO4乾燥且濃縮。以未純化之粗製產物用於後續步驟中。
製法2：(反式-3-胺基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯之製法
步驟1：3-亞甲基環丁烷羧酸之製法
將氫氧化鉀(264公克，4.7莫耳)添加至乙醇(500毫升)及水(500毫升)中的3-亞甲基環丁烷甲腈(110公克，1.18莫耳)之溶液中且將所得混合物回流隔夜。在減壓下移除乙醇，接著將溶液冷卻至低於10℃且以濃縮HCl酸化至pH 1。將混合物以EtOAc(2×500毫升)萃取，將合併的有機萃取物經無水硫酸鈉乾燥且在真空下濃縮，以供給成為黃色油的標題化合物(132公克，100%之產率)。
步驟2：(3-亞甲基環丁基)胺甲酸第三丁酯之製法
將DPPA(574公克，1.41莫耳)逐滴添加至第三丁醇(1公升)中的3-亞甲基環丁烷羧酸(132公克，1.17莫耳)及Et3N(178公克，1.76莫耳)之溶液中且將所得混合物回流隔夜。接著將混合物以水(100毫升)中止。在移除第三丁醇之後，將殘餘物以飽和NH4Cl(500毫升)處理且收集所得固體沉澱物，以飽和NH4Cl和飽和NaHCO3清洗，得到成為白色固體的標題化合物(165公克，77%之產率)。
步驟3：(3-酮環丁基)胺甲酸第三丁酯之製法
將O3在-78℃下起泡添加至CH2Cl2(1000毫升)及MeOH(1000毫升)中的(3-亞甲基環丁基)胺甲酸第三丁酯(165公克，0.91莫耳)之溶液中，直到溶液轉變成藍色為止。TLC(石油醚：EtOAc=10：1)顯示起始材料完全消耗。接著將氮氣起泡通過反應，以移除過量O3， 接著將混合物以Me2S(200毫升)中止且攪拌1小時。將溶液濃縮，得到殘餘物，將其以飽和NaHCO3和水清洗，得到成為白色固體的標題化合物(118公克，70%之產率)。
步驟4：(順式-3-羥基環丁基)胺甲酸第三丁酯之製法
將THF中的三-第二丁基硼酸氫鋰溶液(648毫升，1M)經1.5小時逐滴添加至-72℃下在THF(2000毫升)中的(3-酮環丁基)胺甲酸第三丁酯(100公克，54毫莫耳)之溶液中。容許所得溶液溫熱至室溫且再攪拌1小時。TLC(石油醚：EtOAc=2：1)顯示起始材料完全消耗。將反應以水性NH4Cl中止。將水(1000毫升)及EtOAc(2000毫升)添加至混合物中。將有機層分離，經MgSO4乾燥且濃縮，得到粗製材料，將其以從10：1至1：2之石油醚：EtOAc的管柱層析術純化，以供給成為白色固體的標題化合物(62公克，61%之產率)。
步驟5：{順式-3-[1-甲基-1-(三甲基矽基)乙氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯之製法
將TBSCl(159公克，1.056莫耳)添加至吡啶(1公升)中的(順式-3-羥基環丁基)胺甲酸第三丁酯(62公克，0.33莫耳)之溶液中。在添加之後，將混合物在周圍溫度下攪拌隔夜。TLC(石油醚：EtOAc=2：1)顯示起始材料完全消耗。接著將反應濃縮，以EtOAc(1公升)稀釋，將有機層分離且以水(3×300毫升)和食鹽水(200毫升)清洗，經MgSO4乾燥，過濾且濃縮至乾燥，得到粗製標題化合物(108公克)，其以未進一步純化而直接用於下一步驟中。
步驟6：甲基{順式-3-[1-甲基-1-(三甲基矽基)乙氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯之製法
將NaH(60%於油中，39.6公克，0.99莫耳)分批添加至THF(1公升)中的粗製物{順式-3-[1-甲基-1-(三甲 基矽基)乙氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯(108公克)之溶液中且將所得混合物在室溫下攪拌30分鐘。接著將混合物冷卻至0℃且逐滴添加碘甲烷(140.58公克，0.99莫耳)。在添加之後，將混合物從0℃攪拌至室溫隔夜。將混合物以飽和NH4Cl中止，添加水(200毫升)且以EtOAc萃取。將有機層以食鹽水清洗，經Na2SO4乾燥，接著蒸發，得到粗製產物，將其經由矽膠層析術純化，得到成為油的標題化合物(68.9公克，87%之產率)。
步驟7：(順式-3-羥基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將TBAF(62公克，0.24莫耳)分批添加至吡啶(800毫升)中的甲基{順式-3-[1-甲基-1-(三甲基矽基)乙氧基]環丁基}胺甲酸第三丁酯(68.9公克，0.217莫耳)之溶液中。在添加之後，將混合物在室溫下攪拌2小時。將混合物蒸發至乾燥，將殘餘物溶解在1000毫升乙酸乙酯中且以濃縮NH4Cl(3×200毫升)清洗。將有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮，得到粗製產物，將其以從1/20至1/5之EtOAc/石油醚的管柱層析術純化，以供給成為白色固體的標題化合物(26.3公克，60%之產率)。
步驟8：順式-甲烷磺酸3-[(第三丁氧基羰基)(甲基)胺基]環丁酯之製法
將三乙胺(4.14毫升，29.79毫莫耳)添加至CH2Cl2(30毫升)中的(順式-3-羥基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯(2.0公克，9.93毫莫耳)之溶液中且將所得混合物在劇烈攪拌時冷卻至-30℃。經10分鐘期間逐滴添加甲磺醯氯(1.36公克，11.91毫莫耳)。接著容許混合物溫熱至室溫且攪拌1小時，直到TLC分析(MeOH/CH2Cl2=1/15)顯示反應完成為止。接著將反應混合物以水(2×10毫升)、水性NH4Cl(10毫升)、食鹽水(10毫升)清洗，經無水Na2SO4乾燥且濃縮，得到成為黃色固體的標題化合物(2.5公克，91%之產率)，將其直接用於下一步驟中。
步驟9：(反式-3-疊氮基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將順式甲烷磺酸-3-[(第三丁氧基羰基)(甲基)胺基]環丁酯(2.5公克，8.94毫莫耳)溶解在DMF(25毫升)中且添加NaN3(2.84公克，43.69毫莫耳)。接著將所得混合物加熱至70℃且攪拌隔夜。在冷卻之後，添加水(150毫升)且將混合物以EtOAc(3×50毫升)萃取。將合併的有機相以水(3×20毫升)和食鹽水(20毫升)清洗，經無水Na2SO4乾燥，接著在真空中濃縮，得到成為黃色液體的標題化合物(1.8公克，89%之產率)，其以未進一步純化而使用。
步驟10：(反式-3-胺基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯之製法
將NH3(克)/MeOH(飽和，50毫升)經由注射器添加至氫氛圍(氫氣球)下在MeOH(5毫升)中的(反式-3-疊氮基環丁基)甲基胺甲酸第三丁酯(1.8公克，7.95毫莫耳)與Pd/C(200毫克)之混合物中。將所得混合物 在室溫下攪拌3小時，直到TLC分析(EtOAc：石油醚=1：2)顯示反應完成為止。將Pd/C濾除，將所得溶液濃縮且在真空中乾燥，以供給粗製標題化合物(1.6公克)，其以未進一步純化而用於以下步驟中。
生物實施例 實施例5：pEGFR Y1068 ELISA檢定法
為了描述EGFR T790M抑制劑在具有不同的EGFR突變狀況之細胞中的效果，在具有野生型EGFR或EGFR雙突變體(L858R+T790M、EGFR delE746-A750+T790M)之細胞中測定在Tyr1068的EGFR之磷酸化抑制作用。在Y1068的EGFR之磷酸化係藉由PathScan®磷酸化-EGF受體(Try1068)夾心式ELISA套組(#7240,Cell Signaling Technology®,Danvers,MA)測量。PathScan®磷酸化-EGF受體(Try1068)夾心式ELISA套組為固相夾心式酵素連結之免疫吸附檢定法(ELISA)，其偵測磷酸化-EGF受體 (Tyr1068)蛋白之內源含量。在此檢定中評估以下的細胞株：A549(EGFR野生型，內源)、NCI-H1975(EGFR L858R+T790M，內源)、NIH3T3/EGFR_野生型、NIH3T3/EGFR L858R+T790M和PC9-DRH(EGFR delE746-A750+T790M)。NIH/3T3親代細胞、A549及NCI-H1975細胞係購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(Manassas,VA)。所有的細胞係根據ATCC建議進行培養。A549細胞係在以10%FBS(Sigma,St Louis,MO)及1%Penn/Strep(Invitrogen)補充的RPMI培養基(Invitrogen，Carlsbad)中生長。NCI-H1975細胞係在以10%FBS(Sigma)及1%Penn/Strep(Invitrogen)補充的RPMI(Invitrogen)中生長。 NIH/3T3細胞係在以10%新生小牛血清(Invitrogen)補充的DMEM(Invitrogen)中生長，及NIH3T3/EGFR突變體細胞在具有5微克/毫升之嘌呤黴素(Invitrogen)的完全培養基中生長。PC9-DRH細胞係如實施例6中所述方式產生及培養。具有各種EGFR構體的細胞質體(pLPCX)係由GenScript(Piscataway,NJ)製得，及表現該等構體之NIH/3T3細胞的穩定池係在輝瑞拉霍亞(Pfizer La Jolla)製得。將在完全培養基中的細胞覆蓋(50微升/槽孔)在經組織培養物處理之透明微量滴定盤(#3595,Corning Inc,Corning,NY)的底部且容許在37℃，5%CO2下經隔夜附著。將細胞以下列濃度接種：(A549：40,000/槽孔，NCI-H1975：40,000/槽孔， NIH3T3：20,000/槽孔，PC9-DRH：50,000/槽孔)。次日，在96槽孔透明V形底的0.5毫升聚丙烯阻斷盤(#3956,Corning,Inc)中準備化合物稀釋盤。各化合物不對所有的細胞株進行評估。將所評估的各化合物製備成DMSO儲備溶液(10mM)。各盤上的化合物係以11-點連續稀釋曲線(1：3稀釋)重複測試。將化合物處理液(50微升)自化合物稀釋盤添加至細胞盤中。化合物最高濃度為1或10μM(最終濃度)，具有0.3%之DMSO(#D-5879,Sigma)最終濃度。接著將盤在37℃，5%CO2下培育2小時。關於NIH3T3/野生型檢定，在化合物處理之前，將細胞經24小時血清饑餓；細胞係如所述在無血清培養基中處理且接著以EGF(100毫微克/毫升，Calbiochem/EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)刺激10分鐘。關於A549/野生型檢定，在化合物處理之前，將細胞覆蓋在全血清(10%)培養基中24小時；細胞係如所述在全血清培養基中處理且接著以EGF(40毫微克/毫升/饑餓培養基，Invitrogen)刺激10分鐘。在培育即將結束之前製備冰冷的溶胞緩衝液(在純水中的1x細胞溶解緩衝液(#9803,Cell Signaling Technology)、1mM原釩酸鈉(Na3VO4,#96508,Sigma)、1mM苯基甲烷磺醯氟(PMSF,52332,CalBiochem/EMD Chemicals)、完全小型無EDTA蛋白酶抑制劑混合錠劑(1個錠劑/10毫升，#11836170001,Roche,Indianapolis,IN)及PhosSTOP磷酸酶抑制劑混合錠劑(1個錠劑/10毫升，#04906837001, Roche))。在2小時結束時，輕輕抖掉培養基且將細胞以PBS中冰冷的1mM Na3VO4(100微升/槽孔，Invitrogen)清洗一次。接著輕輕抖掉清洗液且將冰冷的溶胞緩衝液(50微升/槽孔)添加至細胞中。將盤在4℃下震盪20-30分鐘，使細胞完全溶解。將樣品稀釋劑(50微升/槽孔)添加至ELISA盤中，且將溶胞產物(50微升)稀釋至ELISA盤之各槽孔中的樣品稀釋劑中。將盤密封且在4℃下以震盪培育隔夜。次日，將槽孔以1x清洗緩衝液清洗四次；在最後清洗之後以無絨紙包裹盤，隨後將Add偵測抗體(綠色，100微升/槽孔)添加至各槽孔中且在37℃培育1小時。在培育之後，將槽孔如所述方式清洗。將連結HRP之二級抗體(紅色，100微升/槽孔)添加至各槽孔中且在37℃培育30分鐘。在培育之後，將槽孔如所述方式清洗。將TMB受質(100微升/槽孔)添加至各槽孔中且將盤在37℃培育10分鐘或在最高的室溫下培育30分鐘。在培育結束時，將終止溶液(100微升/槽孔)添加至各槽孔中且將盤溫和地震盪數秒鐘。 在添加終止溶液之後30分鐘內，在偵測吸光度之PerkinElmer EnVision Excite Multilabel讀取器方法上或在偵測吸光度之Molecular Devices SpectraMax384讀取器上讀取在450奈米下的吸光度。數據係使用Microsoft Excel中的四參數擬合來分析。
將測試之化合物的pEGFR Y1068 ELISA檢定之結果列示於表2中。在表2中所示之T790M_L858R的pEGFR ELISA IC50數據為3T3細胞株之數據，除非另有其他指示。
實施例6：RPC9和PC9-DRH細胞的產生及特徵化 步驟1：自PC9細胞產生RPC9細胞
在PC9親代細胞中，將EGFR delE746-A750突變對偶基因擴增且不可偵測出野生型EGFR對偶基因。利用PC9親代細胞細胞產生RPC9細胞。將PC9細胞在以10%熱失活之FBS補充之RPMI 1640培養基中在37℃，5%CO2下培育。為了產生EGFR抑制劑抗性細胞株，將PC9細胞最初以0.5nM達康替尼處理。一旦細胞生長至90%之融合度時，使細胞***且將藥物濃度升級2倍。在以此處理6週之後，PC9細胞能夠在2nM達康替尼中生長。產生單一細胞殖株且選擇10個進一步特徵化。將那些抗性細胞維持在含有2μM埃羅替尼之生長培養基中且將抗性PC9稱為RPC9。
步驟2：CastPCR分析
基因組DNA係使用Qiagen DNA小型套組依照製造商指示自RPC9細胞之殖株萃取而來且依照製造商(ABI)的擬定接受castPCR(引子組：Hs00000106_wt和Hs00000105)。數據係經由ABI突變偵測器軟體分析。
步驟3：細胞存活率IC50測定
將每一槽孔3000個RPC9細胞接種在96槽孔盤(Corning)的重複槽孔中的90微升生長培養基中。在24小時之後，將細胞以達康替尼或埃羅替尼在10微升生長培養基中以3倍稀釋的11點滴定方式處理。最高的最終濃度為10μM。在處理72小時之後，細胞係經由依照製造商指示的CTG檢定(Promega)進行分析。
步驟4：帶有EGFR T790M突變之RPC9細胞的特徵化
在步驟1中產生的10個殖株中，Sanger定序鑑定在EGFR外顯子20中的C>T突變，其對應於臨床相關的T790M突變。將代表性殖株、RPC9殖株3和殖株6之序列顯示於圖1中。經由castPCR的進一步確認顯示在RPC9殖株3和6中分別有10.2%及11.9%之帶有EGFR T790M突變之EGFR對偶基因(圖1)。PC9細胞對達康替尼(圖2A)非常敏感。即使最低濃度(0.17nM)的達康替尼亦顯出96%之PC9細胞存活率(圖2A)。不可能 根據劑量反應曲線計算出IC50。RPC9殖株3和6係以73和64nM之IC50而更具有抗性(圖2A)。當RPC9殖株3和6以埃羅替尼處理時，RPC9殖株3和6在細胞存活檢定中顯示與PC9細胞相比而增加200倍以上的IC50(圖2B)。
因此，產生帶有EGFR T790M突變及對EGFR抑制劑(諸如達康替尼和埃羅替尼)具有抗性之RPC9細胞。RPC9細胞含有單突變體(EGFR delE746-A750)及雙突變體(EGFR delE746-A750和T790M)EGFR對偶基因二者之混合物，因為EGFR T790M對偶基因構成RPC9細胞中約10%之總EGFR對偶基因。
步驟5：PC9-DRH細胞的產生及特徵化
除了RPC9細胞以外，亦產生PC9-DRH細胞(DRH=對達康替尼高抗性的T790M)。對2nM達康替尼具有高抗性之RPC9細胞池在8週內以濃度從2nM增加至2μM之達康替尼進一步挑戰，如步驟1中所述。將PC9-DRH細胞維持在含有2μM達康替尼之生長培養基中，如步驟1中所述。分析PC9-DRH細胞，如步驟2、3和4中所述。PC9-DRH細胞含有70%的彼等之EGFR對偶基因成為雙突變體EGFR delE746-A750和T790M。與RPC9細胞相似，PC9-DRH細胞對達康替尼(IC50=1,651nM)、埃羅替尼(IC50>10,000nM)及吉非替尼(IC50>10,000nM)具有抗性。當用於如實施例5中所述之pEGFR Y1068 ELISA檢定中時，自生長培養基移出2μM達康替尼且容許細胞生長36小時，隨後用於ELISA檢定中。
實施例7：利用單獨或與達康替尼或埃羅替尼組合之EGFR T790M抑制劑的RPC9細胞存活率
將每一槽孔3000個如實施例6所製備的RPC9細胞接種在96槽孔盤(Corning)的重複槽孔中的90微升生長培養基中。在24小時之後，將細胞以EGFR T790M抑制劑、化合物A、化合物B、化合物C或化合物D中之一者與或不與4nM達康替尼或300nM埃羅替尼在10微升生長培養基中以3倍稀釋的11點滴定方式處理。最高的最終濃度為10μM之化合物A、化合物B、化合物C或化合物D。在處理72小時之後，細胞係經由依照製造商指示的CTG檢定(Promega)進行分析。
來自達康替尼和埃羅替尼之標準的臨床給藥方案之穩定態的無血漿濃度分別為4nM和300nM。在該等濃度下，達康替尼和埃羅替尼完全抑制PC9親代細胞存活率(圖2A和2B)。沒有任一藥物在相同的濃度下顯著地抑制RPC9細胞存活率(圖2A和2B)。
以化合物A與達康替尼或埃羅替尼之組合可能抑制在RPC9殖株6細胞中的存活率(圖3A和3B)。化合物A之存活率IC50在與4nM達康替尼組合時為17nM及在與300nM埃羅替尼組合時為15nM(表3)。組合的化合物A與單獨的化合物A處理相比之存活率IC50降低11 倍。同樣地，當RPC9殖株6細胞以化合物B處理時，達康替尼和埃羅替尼亦使RPC9殖株6對化合物B敏感(圖4A和4B)。化合物B之存活率IC50在與達康替尼組合時為4nM及在與埃羅替尼組合時為5nM(表3)。與單獨的化合物B處理相比的存活率IC50降低9.5倍和7.6倍。重要的是經預測對化合物A的人類暴露量為190nM，以此濃度的化合物A單獨抑制約40%之細胞存活率。當與達康替尼或埃羅替尼組合時，相同濃度的化合物A達到最大的抑制(83%)(圖3A和3B)。同樣地，對化合物B的人類暴露量為90nM，以此濃度的化合物B單獨達成64%之抑制。組合可能進一步達成至多84%之抑制(圖4A和4B)。因此，與達康替尼或埃羅替尼之組合提高化合物A和化合物B之存活率效果。除了化合物A和化合物B以外，化合物C和化合物D與臨床相關濃度的達康替尼和埃羅替尼亦具有協同效果(表3)。
結論為專一地靶定單突變體形式的EGFR之化合物(諸如達康替尼和埃羅替尼)使用彼等之臨床相關濃度使化合物(諸如化合物A、化合物B、化合物C和化合物 D)在帶有雙突變體及單突變體形式二者的EGFR之臨床相關模式中可能優先抑制雙突變體形式的EGFR。
實施例8：利用單獨或與達康替尼、吉非替尼或阿法替尼組合之EGFR T790M抑制劑的RPC9殖株6細胞存活率
使用實施例7之方法，將細胞以EGFR T790M抑制劑、化合物A或化合物B中之一與或不與4nM達康替尼、20nM吉非替尼或20nM阿法替尼處理。
來自達康替尼之標準的臨床給藥方案之穩定態的無血漿濃度為4nM。來自吉非替尼和阿法替尼之標準的臨床給藥方案之穩定態的無血漿濃度為20nM。
以化合物A與達康替尼、吉非替尼或阿法替尼之組合可能抑制在RPC9殖株6細胞中的存活率(圖5A、5B和5C)。同樣地，當RPC9殖株6細胞以化合物B處理時，達康替尼、吉非替尼或阿法替尼亦使RPC9殖株6對化合物B敏感(圖6A、6B和6C)。因此，化合物A和化合物B之各者與臨床相關濃度的達康替尼、吉非替尼和阿法替尼具有協同效果(圖5和6)。與實施例7中的討論相似，當分別與吉非替尼及阿法替尼組合時，化合物A之存活率IC50降低19倍和14倍。當分別與吉非替尼及阿法替尼組合時，化合物B之IC50降低10倍和8倍。
結論為專一地靶定單突變體形式的EGFR之化合物(諸如達康替尼、吉非替尼或阿法替尼)使用彼等之臨床相關濃度使化合物(諸如化合物A和化合物B)在帶有雙 突變體及單突變體形式二者的EGFR之臨床相關模式中可能優先抑制雙突變體形式的EGFR。
實施例9：在對偶基因混合模式中的EGFR T790M抑制劑與達康替尼或埃羅替尼之組合 方法
細胞培養物：如實施例6中所述產生及次選殖RPC9殖株6細胞。將細胞在具有10%FBS之RPMI中培養且維持在選擇之壓力下(2nM達康替尼)。移除用於實驗之選擇壓力，將細胞覆蓋在10公分盤上且經隔夜培育(37℃，5%CO2)，以達成用於處理的70-80%融合率。
處理：將達康替尼、埃羅替尼、化合物A和化合物B溶解在100%DMSO中。達康替尼(4nM)和埃羅替尼(300nM)係以來自標準的臨床給藥方案的彼等之無血漿暴露量使用。化合物A和化合物B分別以從低於標的調節IC50值開始及至多經預測之各化合物的臨床無血漿暴露量之範圍使用。將細胞以達康替尼或埃羅替尼處理及/或以化合物A或化合物B滴定處理，或以對照物(DMSO)處理。施予6小時處理；在培育期結束時，收集細胞沉澱物且冷凍，直到準備分析為止。
免疫墨點：將細胞沉澱物以1mM Na3VO4、1mM PMSF、1mM NaF、1mM β-甘油磷酸鹽、蛋白酶抑制劑混合物(Roche,Indianapolis，IN)及磷酸酶抑制劑混合物(Roche)補充之溶胞緩衝液(150mM NaCl、1.5mM MgCl2、50mM HEPES、10%甘油、1mM EGTA、1%Triton® X-100、0.5%NP-40)處理。細胞溶解物的蛋白質濃度係使用BCA Protein Assay(Pierce/Thermo Fisher Scientific，Rockford,IL)按照製造商指示來測定。將蛋白質(10微克)以SDS-PAGE分解且轉移至硝化纖維素薄膜(Bio-Rad CriterionTM System,Hercules,CA)上。墨點係以初級抗體探測，以偵測關注之蛋白質。EGFR、pEGFR Y1068、AKT、pAKT S473、ERK和pERK T202/204抗體係購自Cell Signaling Technology,Inc(Danvers,MA)。GAPDH抗體係購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。在以二級抗體培育之後，將薄膜以化學發光(Pierce/Thermo Fisher Scientific)顯現且比重測定法係在FluorChem Q Imaging System(ProteinSimple,Santa Clara,CA)上進行。
結果
以達康替尼及化合物A二者處理之細胞顯出降低的pEGFR信號，其與在兩個最低劑量下的組合相對於單一劑療法而更大的效果一致(以達康替尼的77%之抑制，以10nM化合物A的24%之抑制相對於以達康替尼+10nM化合物A的91%之抑制；以30nM化合物A的21%之抑制相對於以達康替尼+30nM化合物A的99%之抑制)(圖7A，8A)。該等組合在最低劑量下顯出比相加的pERK信號抑制更大(以達康替尼的34%之抑制，以10 nM化合物A的27%之抑制相對於以達康替尼+10nM化合物A的100%之抑制)；及在接著最高劑量下顯出相加效果(以達康替尼的34%之抑制，以30nM化合物A的64%之抑制相對於以達康替尼+30nM化合物A的99%之抑制)(圖7A，8C)。越高劑量的單一劑療法導致越大的pEGFR和pERK信號抑制；相加性計算受到檢定中所觀察之最大抑制的限制。相對之下，pAKT之抑制在最低濃度下似乎為相加值(以達康替尼的37%之抑制，以10nM化合物A的22%之抑制相對於以達康替尼+10nM化合物A的64%之抑制)；但是達不到大於60-65%之抑制，即使在較高的劑量下(圖7A，8B)。
以埃羅替尼及化合物A二者處理之細胞顯出在三個最低濃度的化合物A下降低的pEGFR信號比單一劑療法的相加效果更大(以埃羅替尼的61%之抑制，以10nM化合物A的41%之抑制相對於以埃羅替尼+10nM化合物A的86%之抑制；以30nM化合物A的27%之抑制相對於以埃羅替尼+30nM化合物A的91%之抑制；以100nM化合物A的16%之抑制相對於以埃羅替尼+100nM化合物A的95%之抑制)(圖7B，9A)。該等處理在兩個最低劑量下顯出比相加的pERK信號抑制更大(以埃羅替尼的31%之抑制，以10nM化合物A的38%之抑制相對於以埃羅替尼+10nM化合物A的100%之抑制；以30nM化合物A的54%之抑制相對於以埃羅替尼+30nM化合物A的100%之抑制；圖7B，9C)。越高劑量的單一劑療法導致 越大的pEGFR和pERK信號抑制；相加性計算受到檢定中所觀察之最大抑制的限制。相對之下，pAKT之抑制在最低濃度的化合物A下似乎大於相加值(以埃羅替尼的18%之抑制，以10nM化合物A的3%之抑制相對於以埃羅替尼+10nM化合物A的48%之抑制；圖7B，9B)；及在接著最高劑量下為相加值(以埃羅替尼的18%之抑制，以30nM化合物A的31%之抑制相對於以埃羅替尼+30nM化合物A的49%之抑制；圖7B，9B)，但是達不到大於50%之抑制，即使在較高的劑量下。
以達康替尼及化合物B二者處理之細胞顯出在兩個最低劑量的化合物B下降低的pEGFR信號比單一劑療法的相加效果更大(以達康替尼的54%之抑制，以3nM化合物B的46%之抑制相對於以達康替尼+3nM化合物B的81%之抑制；以10nM化合物B的17%之抑制相對於以達康替尼+10nM化合物B的90%之抑制)，及在接著最高劑量下顯出相加值(以達康替尼的54%之抑制，以30nM化合物B的33%之抑制相對於以達康替尼+30nM化合物B的90%之抑制)(圖10A，11A)。該等相同的細胞在最低劑量下顯出相加的pERK信號抑制(以達康替尼的57%之抑制，以3nM化合物B的55%之抑制相對於以達康替尼+3nM化合物B的100%之抑制；圖10A，11C)。越高劑量的單一劑療法導致越大的pEGFR及pERK信號抑制；相加性計算受到檢定中所觀察之最大抑制的限制。相對之下，pAKT之抑制達不到大於72%之抑制，即使在 較高的劑量下，且達不到部分或大於相加的結果(圖10A，11B)。
以埃羅替尼及化合物B二者處理之細胞顯出在所有濃度的化合物B下降低的pEGFR信號比單一劑療法的相加效應更大(以埃羅替尼的12%之抑制，以3nM化合物B的2%之抑制相對於以埃羅替尼+3nM化合物B的74%之抑制；以10nM化合物B的8%之抑制相對於以埃羅替尼+10nM化合物B的66%之抑制；以30nM化合物B的22%之抑制相對於以埃羅替尼+30nM化合物B的82%之抑制；以100nM化合物B的60%之抑制相對於以埃羅替尼+10nM化合物B的84%之抑制)(圖10B，12A)。該等處理在最低劑量的化合物B下顯出比相加的pERK信號抑制更大(以埃羅替尼的41%之抑制，以3nM化合物B的39%之抑制相對於以埃羅替尼+3nM化合物B的99%之抑制；圖10B，12C)。越高劑量的單一劑療法導致越大的pEGFR及pERK信號抑制；相加性計算受到檢定中所觀察之最大抑制的限制。相對之下，pAKT之抑制在最低濃度的化合物B下似乎大於相加值(以埃羅替尼的29%之抑制，以3nM化合物B的15%之抑制相對於以埃羅替尼+3nM化合物B的54%之抑制)；但是達不到大於62%之抑制，即使在較高的劑量下(圖10B，12B)。
實施例10：在RPC9殖株6(達康替尼及埃羅替尼抗性)異種移植模式中的EGFR T790M抑制劑與達康替尼或埃羅 替尼之組合 背景：
RPC9殖株6細胞係如實施例6所述從PC9親代細胞產生。PC9親代細胞含有EGFR delE746-A750且對達康替尼和埃羅替尼的處理敏感。RPC9殖株6細胞株為以達康替尼(〝daco〞)之劑量遞增處理所產生的經選擇之抗性殖株中之一。RPC9殖株6細胞含有約10%之EGFR delE746-A750和T790M及90%之EGFR delE746-A750對偶基因。因此，在試管內檢定法中，RPC9殖株6係由於EGFR delE746-A750及T790M對偶基因而對達康替尼/埃羅替單一劑處理具有抗性，以及由於EGFR delE746-A750對偶基因而對化合物A(〝化合物A〞)和化合物B(〝化合物B〞)單一劑處理具有抗性。化合物A或化合物B與臨床相關濃度的達康替尼或埃羅替尼之組合係經由EGFR信號路徑的協同抑制而對細胞存活率產生協同效果。因此，進行活體內動物研究以評估化合物A或化合物B與達康替尼或埃羅替尼之組合是否能在RPC9殖株6異種移植模式中產生協同抗腫瘤效果。
方法：
4-至6-週齡之SCID米色雌性小鼠係自Charles River lab獲得且保存在輝瑞拉霍亞(Pfizer La Jolla)動物設施之加壓通風的籠具中。所有的研究係經輝瑞機構動物護理及使用委員會(Pfizer Institutional Animal Care and Use Committees)批准。腫瘤係藉由皮下注射以重組的基底膜(Matrigel,BD Biosciences)經1：1(v/v)懸浮之5×106 RPC9殖株6細胞而建立。關於腫瘤生長抑制(TGI)研究，選擇且任意安排具有經建立~300立方毫米之腫瘤的小鼠，接著以作為單一劑或與達康替尼或埃羅替尼組合之EGFR T790M抑制劑使用指示之劑量及方案處理。腫瘤尺寸係以遊標卡尺測量及腫瘤體積係使用π/6×較大直徑×(較小直徑)2之公式計算。腫瘤生長抑制百分比(TGI%)係以100×(1-△T/△C)計算。腫瘤消退百分比係以100×(1-△T/起始腫瘤大小)計算。
化合物A係在0.5%Methocel/pH 7.4的20mM Tris緩衝液中調配成噴霧乾燥之分散懸浮液。化合物B係以0.5%Methocel當場調配成乳酸鹽溶液。達康替尼係調配成pH 4.5之0.1M乳酸溶液。埃羅替尼係調配成40%Captisol®。所有的藥物經調配且以10毫升/公斤之濃度給藥。帶有腫瘤之小鼠經口及每日投予指示之治療；每日記錄體重及健康觀察。
結果： 研究I：化合物A與達康替尼之組合
在此研究中，將帶有RPC9殖株6腫瘤之小鼠任意安排且以單一劑之化合物A或達康替尼，或化合物A與達康替尼之組合治療。5毫克/公斤之達康替尼在小鼠血漿中得到4nM之平均未結合藥物濃度，其符合來自45毫克/ 公斤/天之臨床劑量的平均臨床暴露量。體重變化百分比繪製於圖13B中且表明此研究的所有劑量組有良好的耐受性，具有少於10%之體重損失。化合物A係以500毫克/公斤、200毫克/公斤和50毫克/公斤作為單一劑或與5毫克/公斤之達康替尼組合給藥，如圖13A所示。在研究的第39天，當媒劑組的腫瘤大小到達平均1200立方毫米時，達康替尼的單一劑治療產生腫瘤生長停滯及化合物A的單一劑治療產生劑量依賴性腫瘤生長抑制，如圖13A和表4中所例證。所有劑量範圍的化合物A與達康替尼之組合產生完全的腫瘤消退，如表4中所例證。
為了進一步評定對腫瘤消退的組合效果，使200毫克/公斤和50毫克/公斤之化合物A的單一及組合治療組中的小鼠繼續接受治療，直到研究的第61天為止。計算腫瘤生長抑制和腫瘤消退且例證於表4中。結果表明(1)化合物A與達康替尼以二者的劑量範圍之組合產生完全的腫瘤消退，(2)在200毫克/公斤和50毫克/公斤之化合物A的單一劑治療組中的腫瘤係以劑量依賴性方式進展，其呈現可能由EGFR delE746-A750對偶基因驅動之試管內抗性，及(3)在達康替尼的單一劑治療組中之腫瘤亦有進展，其呈現在此RPC9殖株6異種移植模式中可能由EGFR delE746-A750和T790M對偶基因驅動之試管內抗性。
使治療期進一步延伸以評定單一劑治療及組合治療的活體內抗性。使達康替尼的單一劑治療組繼續進行且在腫 瘤大小到達1200立方毫米以上時的第74天終止。同樣地，使200毫克/公斤之化合物A的單一劑治療組繼續進行且在腫瘤大小到達1400立方毫米以上時的第95天終止。因此，在達康替尼或化合物A的單一劑治療組中的腫瘤繼續進展且證明活體內抗性與試管內特徵相似。達康替尼與50毫克/公斤組之化合物A的組合能夠達成100%之TGI，而且達康替尼與200毫克/公斤之化合物A的組合維持腫瘤消退，直到在第120天的研究結束為止，如圖13A和表4中所示。
研究II：化合物B與達康替尼之組合
在此研究中，將帶有RPC9殖株6腫瘤之小鼠任意安排且以單一劑之化合物B或達康替尼，或化合物B與達康替尼之組合治療。達康替尼係以5毫克/公斤和1.5毫克/公斤給藥。化合物B係以50毫克/公斤、15毫克/公斤和 5毫克/公斤給藥，如圖14A中所示。體重變化百分比繪製於圖14B中且表明此研究的所有劑量組有良好的耐受性，具有少於10%之體重損失。在研究的第36天，當媒劑組的腫瘤大小到達平均1000立方毫米時，達康替尼的單一劑治療產生劑量依賴性腫瘤生長抑制，如圖15A中所例證。以5毫克/公斤和15毫克/公斤之化合物B的單一劑治療係由於極低的劑量而沒有顯著的有效性，而以50毫克/公斤之化合物B的單一劑治療得到47%之TGI，如圖15A中所示。化合物B與達康替尼之組合產生劑量依賴性腫瘤消退，如圖15B中所示。計算腫瘤生長抑制及消退且例證於表5中。
研究III：化合物A與埃羅替尼之組合
在此研究中，將帶有RPC9殖株6腫瘤之小鼠任意安排且以單一劑之化合物A或埃羅替尼，或化合物A與埃 羅替尼之組合治療。25毫克/公斤之埃羅替尼在小鼠血漿中得到300nM之平均未結合藥物濃度，其符合平均臨床暴露量。體重變化百分比繪製於圖16B中且表明此研究的所有劑量組有良好的耐受性，具有少於10%之體重損失。化合物A係以400毫克/公斤、200毫克/公斤和50毫克/公斤作為單一劑或與25毫克/公斤之埃羅替尼組合給藥，如圖16A中所示。在研究的第45天，當媒劑組的腫瘤大小到達1500立方毫米以上時，埃羅替尼的單一劑治療產生51%之腫瘤生長抑制及化合物A的單一劑治療產生劑量依賴性腫瘤生長抑制，如圖16A和表6中所例證。所有劑量範圍的化合物A與埃羅替尼之組合產生腫瘤消退，如表6中所例證。
為了進一步評定對腫瘤消退的組合效果，使200毫克/公斤和50毫克/公斤之化合物A的單一及組合治療組中的小鼠繼續接受治療，直到研究的第73天為止。計算腫瘤生長抑制和腫瘤消退且例證於表6中。與達康替尼組合的研究I之結果相似，來自此研究的結果亦表明化合物A與埃羅替尼之組合以二者的劑量範圍產生腫瘤消退，而化合物A或埃羅替尼之單一劑治療組中的腫瘤繼續進展，表明以del或del/T790M對偶基因驅動活體內抗性。
因此，結論為化合物A與達康替尼或埃羅替尼之組合達成協同抗腫瘤活性，以誘發抗性RPC9殖株6異種移植模式中的腫瘤消退。
結論：
當以化合物A、化合物B、達康替尼或埃羅替尼作為單一劑療法治療時，帶有EGFR delE746-A750和EGFR delE746-A750/T790M對偶基因二者之RPC9殖株6異種移植模式顯出腫瘤進展。當以高劑量的化合物A與臨床相關劑量的達康替尼或埃羅替尼作為組合療法治療時，該模式顯示完全消退，以及當以低劑量的化合物B與達康替尼組合治療時，該模式證明劑量依賴性腫瘤消退。因此，目前的臨床前動物研究成功地證明EGFR T790M選擇性抑制劑與達康替尼或埃羅替尼的組合策略為以可能的臨床上可轉譯之策略為基準之機制，以開發在原發性及後天性EGFR突變二者之NSCLC病患中的EGFR T790M臨床候選物。

Claims (27)

  1. 一種與表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑組合之不可逆式EGFR T790M抑制劑於製備藥劑之用途，該藥劑係用於治療病患的非小細胞肺癌。
  2. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該不可逆式EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項之用途，其中該EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、伊克替尼(icotinib)、凡狄太尼(vandetanib)、拉帕替尼(lapatinib)、奈若替尼(neratinib)、阿法替尼(afatinib)、皮利替尼(pelitinib)、達康替尼(dacomitinib)、卡奈替尼(canertinib)、西妥昔單抗(cetuximab)和帕尼圖單抗(panitumumab)，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  4. 根據申請專利範圍第1或2項之用途，其中該EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、阿法替尼和達康替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  5. 根據申請專利範圍第1或2項之用途，其中該EGFR抑制劑為埃羅替尼或其醫藥上可接受之鹽。
  6. 根據申請專利範圍第1或2項之用途，其中該EGFR抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
  7. 一種與panHER抑制劑組合之EGFR T790M抑制劑於製備藥劑之用途，該藥劑係用於治療病患的非小細胞肺癌，其中該panHER抑制劑係根據非標準的臨床給藥方案(dosing regimen)投予。
  8. 根據申請專利範圍第7項之用途，其中該非標準的臨床給藥方案為非標準的臨床劑量或非標準的給藥時程。
  9. 根據申請專利範圍第7項之用途，其中該非標準的臨床給藥方案為低劑量的panHER抑制劑。
  10. 根據申請專利範圍第7項之用途，其中該非標準的臨床給藥方案為間歇性給藥方案。
  11. 根據申請專利範圍第7-10項中任一項之用途，其中該EGFR T790M抑制劑係選自由下列者所組成之群組：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  12. 根據申請專利範圍第7-10項中任一項之用途，其中該EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
  13. 根據申請專利範圍第7-10項中任一項之用途，其中該panHER抑制劑係選自由下列者所組成之群組：拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼和卡奈 替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  14. 根據申請專利範圍第7-10項中任一項之用途，其中該panHER抑制劑為阿法替尼或其醫藥上可接受之鹽。
  15. 根據申請專利範圍第7-10項中任一項之用途，其中該panHER抑制劑為達康替尼或其醫藥上可接受之鹽。
  16. 一種與EGFR抑制劑組合之EGFR T790M抑制劑於製備藥劑之用途，該藥劑用於治療病患的非小細胞肺癌。
  17. 根據申請專利範圍第16項之用途，其中該EGFR T790M抑制劑係選自由下列者所組成之群組：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  18. 根據申請專利範圍第16項之用途，其中該EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
  19. 根據申請專利範圍第16-18項中任一項之用途，其中該EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼、拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼、卡奈替尼、西妥昔單抗和帕尼圖單抗，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  20. 根據申請專利範圍第16-18項中任一項之用途，其中該EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替 尼、埃羅替尼、阿法替尼和達康替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  21. 根據申請專利範圍第16-18項中任一項之用途，其中該EGFR抑制劑為埃羅替尼或其醫藥上可接受之鹽。
  22. 一種下列者之協同組合：(a)EGFR T790M抑制劑；及(b)EGFR抑制劑，其中該組份(a)及該組份(b)具有協同作用。
  23. 根據申請專利範圍第22項之組合，其中該EGFR T790M抑制劑係選自由下列者所組成之群組：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  24. 根據申請專利範圍第22項之組合，其中該EGFR T790M抑制劑為1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯啶-1-基}丙-2-烯-1-酮或其醫藥上可接受之鹽。
  25. 根據申請專利範圍第22-24項中任一項之組合，其中該EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替尼、埃羅替尼、伊克替尼、凡狄太尼、拉帕替尼、奈若替尼、阿法替尼、皮利替尼、達康替尼、卡奈替尼、西妥昔單抗和帕尼圖單抗，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  26. 根據申請專利範圍第22-24項中任一項之組合，其中該EGFR抑制劑係選自由下列者所組成之群組：吉非替 尼、埃羅替尼、阿法替尼和達康替尼，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  27. 根據申請專利範圍第22-24項中任一項之組合，其中該EGFR抑制劑為埃羅替尼或其醫藥上可接受之鹽。
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