TW201420607A - 介白素－２融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

概言之，本發明係關於免疫球蛋白與介白素-2(IL-2)之融合蛋白。另外，本發明係關於編碼該等融合蛋白之多核苷酸以及包含該等多核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於產生本發明之融合蛋白之方法及使用其治療疾病之方法。

Description

介白素-2融合蛋白及其用途
概言之，本發明係關於免疫球蛋白與介白素-2(IL-2)之融合蛋白。另外，本發明係關於編碼該等融合蛋白之多核苷酸以及包含該等多核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於產生本發明之融合蛋白之方法及使用其治療疾病之方法。
調節T細胞(Treg)代表對於維持自身耐受性甚為重要之特定亞群之T淋巴細胞。具有阻抑功能之該等CD4+CD25hi細胞可藉由轉錄因子FOXP3以及其他細胞標記(例如CD127lo、CTLA-4+、LAP、CD39+、PD-1+、GARP等)之細胞內表現與效應T細胞相區分。FOXP3對於Treg分化及功能甚為重要，且FOXP3基因缺陷及突變在皮屑小鼠及患有免疫失調多內分泌病變、腸病變、X-染色體連鎖症候群(IPEX)之患者二者中導致因Treg缺陷或功能缺失而自身耐受性衰弱及患上自體免疫疾病。
1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化症及許多其他疾病中之自體免疫反應與Treg之缺陷相關。來自動物模型之數據支持假設：自體免疫反應係由Treg之控制對自身之破壞性免疫反應之失效促進。1型糖尿病係在胰臟中之β細胞所產生之大多數胰島素破壞後發生之自體免疫疾病。1型糖尿病之頻率為US人口之約0.3%，且其發生率在美國、歐洲且具體而言斯堪地那維亞(Scandinavia，幾乎1%)繼續增 加，且預期在下一個二十年內翻番。
細胞因子IL-2在Treg以及效應T細胞(Teff)二者之活化及功能中起主要作用。IL-2產生中之缺陷或反應性之缺失優先導致Treg功能之損失及自體免疫之機率之增加。由於Treg以高於Teff之含量組成型表現高親和力IL-2受體，故與Teff細胞相比，低劑量之IL-2優先支持Treg之維持。
由於IL-2對活體外及活體內活化Treg之優先效應，低劑量、長壽命IL-2療法之潛力可似乎在自體免疫疾病方面具有較高成功前景。利用IL-2(Proleukin®)之200個患者、雙盲、安慰劑對照1型糖尿病臨床試驗係經設定在2013年末開始。利用每日低劑量Proleukin®之當前臨床試驗改善慢性移植物抗宿主疾病(GVHD)及C型肝炎病毒誘導之脈管炎之一些體徵及症狀(Koreth等人，New Engl J Med 365,2055-2066(2011)、Saadoun等人，New Engl J Med 365,2067-2077(2011))。在兩個研究中，低劑量Proleukin®誘導Treg病增加Treg：Teff比率。然而，Proleukin®之差PK性質使其對於維持IL-2在人類中之較低一致含量為次最佳的。臨床試驗中所測試之其他方法係Treg之離體個性化擴增、接著再輸注，但此方法不太理想且代表一組具有挑戰性之品質控制問題。
因此，重新確立天然調節T細胞(Treg)介導之佔主導地位之免疫耐受性的新治療方法將極大增強治療患有以下疾病之患者之能力：自體免疫疾病，例如1型糖尿病、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、克隆氏病(Crohn’s disease)以及其他自體免疫疾病；及基於免疫之促發炎性疾病，例如慢性移植物抗宿主疾病、氣喘、肺纖維化、慢性阻塞性肺病、諸如動脈粥樣硬化等心血管疾病及移植排斥反應(實體器官及骨髓二者)。
本發明之IL-2融合蛋白優先活化Treg，從而使平衡向較高 Treg：Teff比率傾斜，並減少自體免疫反應。其具有長壽命，從而允許便利給藥方案，且缺乏效應功能，從而減少潛在副效應及效力損害。
在一態樣中，本發明提供融合蛋白，其包含(i)包含修飾之免疫球蛋白分子，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比該修飾降低免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力，及(ii)兩個介白素-2(IL-2)分子。
在一實施例中，該免疫球蛋白分子係IgG類免疫球蛋白分子、具體而言IgG1亞類免疫球蛋白分子。在一實施例中，該免疫球蛋白分子係人類免疫球蛋白分子。在一實施例中，該免疫球蛋白分子能夠特異性結合至抗原。在一實施例中，該免疫球蛋白分子係單株抗體。在一實施例中，該免疫球蛋白分子不能特異性結合至抗原。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含基於人類Vh3-23種系序列之重鏈可變區序列。在特定實施例中，該免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：9之重鏈可變區序列。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含基於人類Vk3-20種系序列之輕鏈可變區序列。在特定實施例中，該免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：11之輕鏈可變區序列。在甚至更特定實施例中，該免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：9之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：11之輕鏈可變區序列。在一實施例中，該免疫球蛋白分子不能特異性結合至抗原，且包含基於人類Vh3-23種系序列之重鏈可變區序列及基於人類Vk3-20種系序列之輕鏈可變區序列。
在一實施例中，該Fc受體係Fcγ受體、具體而言人類Fcγ受體。在一實施例中，該Fc受體係活化Fc受體。在一實施例中，該Fc受體係選自由FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)組成之群。在特定實施例中，該Fc受體係FcγRIIIa、具體而言人類FcγRIIIa。在一實施例中，該修飾降低免疫球蛋白分子之效應功 能。在特定實施例中，該效應功能係抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在一實施例中，該修飾係在該免疫球蛋白分子之Fc區、具體而言CH2區中。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含於免疫球蛋白重鏈之329位(EU編號)處之胺基酸取代。在特定實施例中，該胺基酸取代係P329G。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含於免疫球蛋白重鏈之234位及235位(EU編號)處之胺基酸取代。在特定實施例中，該等胺基酸取代係L234A及L235A(LALA)。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含於免疫球蛋白重鏈之234位、235位及329位(EU編號)處之胺基酸取代。在具體實施例中，該免疫球蛋白分子包含於免疫球蛋白重鏈中之胺基酸取代L234A、L235A及P329G(EU編號)。
在一實施例中，該等IL-2分子係野生型IL-2分子。在一實施例中，該等IL-2分子包含與天然存在之自然IL-2相比不改變該等IL-2分子對IL-2受體之結合親和力之胺基酸突變。在一實施例中，該等IL-2分子包含於與人類IL-2之殘基125相應之位置處之胺基酸突變。在更特定實施例中，該胺基酸突變係胺基酸取代C125A。在一實施例中，該等IL-2分子係人類IL-2分子。在特定實施例中，該等IL-2分子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之序列、具體而言SEQ ID NO：3之序列。在一實施例中，該等IL-2分子具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之序列、具體而言SEQ ID NO：3之序列。在一實施例中，該等IL-2分子係各自於其N端胺基酸並視情況藉助肽連接體融合至該免疫球蛋白分子之一免疫球蛋白重鏈之C端胺基酸。
在特定實施例中，該融合蛋白包含SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19之多肽序列。在特定實施例中，該融合蛋白包含SEQ ID NO：19之免疫球蛋白輕鏈及SEQ ID NO：17之免疫球蛋白重鏈-IL-2融合多肽。在一實施例中，該融合蛋白基本上係由以下組成：包含修飾之免疫球蛋白分子，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比該修飾降低免 疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力，兩個介白素-2(IL-2)分子，及視情況一或多個肽連接體。在一實施例中，該融合蛋白基本上係由兩個SEQ ID NO：19之免疫球蛋白輕鏈及兩個SEQ ID NO：17之免疫球蛋白重鏈-IL-2融合多肽組成。
本發明進一步提供編碼本發明融合蛋白之多核苷酸。進一步提供載體、具體而言表現載體，其包含本發明之多核苷酸。在另一態樣中，本發明提供包含本發明之多核苷酸或載體之宿主細胞。本發明亦提供產生本發明融合蛋白之方法，該方法包含以下步驟：(i)在適於表現融合蛋白之條件下培養本發明宿主細胞，及(i)回收融合蛋白。亦提供融合蛋白，其包含(i)包含修飾之免疫球蛋白分子，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比該修飾降低免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力；及(ii)兩個介白素-2(IL-2)分子，其係藉由該方法產生。
在一態樣中，本發明提供包含本發明融合蛋白及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。亦提供本發明之融合蛋白或醫藥組合物用作醫藥病用於治療或預防自體免疫疾病(特定而言1型糖尿病、多發性硬化症(MS)、全身性紅斑狼瘡(SLE)或克隆氏病、最特定而言1型糖尿病)或移植物抗宿主疾病或移植排斥反應。進一步提供本發明融合蛋白用於製造用以治療有需要之個體之疾病之醫藥的用途，及治療個體之疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之包含本發明之呈醫藥上可接受之形式之融合蛋白的組合物。在一實施例中，該疾病係自體免疫疾病。在更特定實施例中，該自體免疫疾病係1型糖尿病、多發性硬化症(MS)、全身性紅斑狼瘡(SLE)或克隆氏病。在甚至更特定實施例中，該自體免疫疾病係1型糖尿病。在另一實施例中，該疾病係移植排斥反應或移植物抗宿主疾病。在一實施例中，該個體係哺乳動物、具體而言人類。
進一步提供本發明之用於活體外或活體內選擇性活化調節T細胞之融合蛋白。在一實施例中，該活化包含誘導調節T細胞之增殖及/或誘導調節T細胞中之IL-2受體信號傳導、具體而言STAT5之磷酸化。在一實施例中，該用途係在活體外，且該融合蛋白係以約1ng/mL或更小、具體而言約0.1ng/mL或更小之濃度使用。在另一實施例中，該用途係在活體內，且該融合蛋白係以約20μg/kg體重或更小、具體而言約12μg/kg體重或更小、更具體而言約6μg/kg體重或更小之劑量使用。
本發明亦提供活體外或活體內選擇性活化調節T細胞之方法，該方法包含使該等調節T細胞與本發明之融合蛋白接觸。在一實施例中，該活化包含誘導調節T細胞之增殖及/或誘導調節T細胞中之IL-2受體信號傳導、具體而言STAT5之磷酸化。在一實施例中，該方法係在活體外，且該融合蛋白係以約1ng/mL或更小、具體而言約0.1ng/mL或更小之濃度使用。在另一實施例中，該方法係在活體內，且該融合蛋白係以約20μg/kg體重或更小、具體而言約12μg/kg體重或更小、更具體而言約6μg/kg體重或更小之劑量使用。
圖1. DP47GS IgG-IL-2融合蛋白之純化(參見SEQ ID NO 13、15、19)。(A)蛋白質A親和層析步驟之溶析曲線。(B)粒徑排阻層析步驟之溶析曲線。產率4mg/L。(C)終產物之分析型毛細管電泳SDS(Caliper)。觀測到以下帶：非還原型-在111kDa下7.5%面積、在174kDa下92.5%面積；還原型-在29kDa下23.6%面積、在67kDa下23.5%面積、在82kDa下52.9%面積。該產物含有約7.5%「半IgG」。(D)終產物之分析型粒徑排阻層析，於TSKgel G3000 SW XL管柱上(91%單體含量)。
圖2. DP47GS IgG-(IL-2)2融合蛋白之純化(參見SEQ ID NO 17、 19)。(A)蛋白質A親和層析步驟之溶析曲線。(B)粒徑排阻層析步驟之溶析曲線。產率13mg/L。(C)終產物之分析型毛細管電泳SDS(Caliper)。觀測到以下帶：非還原型-在172.5kDa下2.3%面積、在185kDa下97.7%面積；還原型-在27.3kDa下18.3%面積、在29.2kDa下0.6%面積、在78.3kDa下81.1%面積。(D)終產物之分析型粒徑排阻層析，於Superdex 200管柱上(100%單體含量)。
圖3. 表現於CD4+ Treg亞群、NK細胞亞群及NKT細胞上之CD25(IL-2RA)及CD122(IL-2RB)。使用細胞表面標記界定CD4+ Treg亞群、NKT細胞及NK細胞。為使針對CD25及CD122之染色最佳化，不實施細胞內FOXP3染色。(A、B)三種調節CD4+ T細胞(Treg)群體：純真(CD45RA+、CD25+；點線)、記憶(CD45RA-、CD25+；實線)及經活化(CD45RA-、CD25hi；虛線)。(C、D)NKT(點線)、CD56bright NK細胞(虛線)、CD56intermediate NK細胞(實線)。灰色：同種型對照。
圖4. 於CD4+及CD8+習用T細胞亞群上之CD25(IL-2RA)及CD122(IL-2RB)表現。使用細胞表面標記界定純真(CD45RA+；點線)及記憶(CD45RA-；實線)習用CD4+ T細胞(A、B)、記憶習用CD8+ T細胞(CD45RA-；實線)及CD45RA+ CD8 T細胞(純真與TEMRA亞群之組合；TEMRA係指已回復至表現CD45RA之效應記憶細胞；點線)(C、D)。灰色：同種型對照。
圖5. 人類周邊血液細胞亞群中之pSTAT5a因應DP47GS IgG-IL-2之誘導。在分開時間處針對各種劑量之DP47GS IgG-IL-2對STAT5a磷酸化之誘導之效應評估三種不同人類供體(C4至C6)。顯示CD4+ Treg亞群之結果：經活化、記憶及純真Treg；習用CD4+記憶T效應細胞；CD56bright NK細胞；CD8+記憶T效應細胞；CD4+純真T效應細胞；NK細胞；NKT細胞；及CD8+純真T效應+CD45RA+記憶細胞。
圖6. 人類周邊血液細胞亞群中之pSTAT5a因應DP47GS IgG-(IL- 2)2之誘導。在分開時間處針對各種劑量之DP47GS IgG-(IL-2)2免疫偶聯物對STAT5a磷酸化之誘導之效應評估五種不同人類供體(N1、N2、C4至C6)。顯示CD4+ Treg亞群之結果：經活化、記憶及純真Treg；習用CD4+記憶T效應細胞；CD56bright NK細胞；CD8+記憶T效應細胞；CD4+純真T效應細胞；NK細胞；NKT細胞；及CD8+純真T效應+CD45RA+記憶細胞。
圖7. 人類周邊血液細胞亞群中之pSTAT5a之誘導：DP47GS IgG-IL-2與DP47GS IgG-(IL-2)2之比較。將每一細胞亞群之結果正規化至每一亞群之最大觀測效應，且Treg之大約EC50係呈現於表2中。(A)DP47GS IgG-IL-2之正規化結果，(B)DP47GS IgG-(IL-2)2之正規化結果。
圖8. 三種供體中之Treg亞群敏感性之詳細檢查，比較DP47GS IgG-IL-2與DP47GS IgG-(IL-2)2。圖表代表三種供體之pSTAT5a MFI之平均值±SD。(A)總CD3+、CD4+、FoxP3+ Treg。(B)經活化Treg。(C)記憶Treg。(D)純真Treg。
圖9. DP47GS IgG-IL2在食蟹猴中具有劑量依賴性效應，增加調節T細胞。全血CD4+ CD25+ FOXP3+調節T細胞(Tregs)在治療後第7天之變化係顯示為(A)絕對Treg細胞數/mm3全血及(B)Treg之倍數變化。所有數據係表示為平均值±SD。空心條：DP47GS IgG-IL-2(n=6)；陰影條：媒劑(n=3)。
圖10. DP47GS IgG-IL-2於食蟹猴中之時間及對Treg之低劑量效應。(A)在利用2μg/kg或6μg/kg DP47GS IgG-IL-2給藥後Treg倍數增加之時間依賴性變化(n=4及6，分別)。(B)在利用2μg/kg或6μg/kg DP47GS IgG-IL-2給藥後血液中之Treg絕對計數之時間依賴性變化(n=4及6，分別)。所有數據係顯示為平均值±SD。
圖11. 單一劑量Proleukin®刺激食蟹猴中之瞬時劑量依賴性Treg 反應。(A)在利用3×104IU/kg至3×105IU/kg Proleukin®進行單一劑量治療後周邊血液Treg數之變化。(B)在利用3×104IU/kg至3×105IU/kg Proleukin®進行單一劑量治療Treg pSTAT5a之變化。數據係顯示為平均值±SD。
圖12. 在食蟹猴中之Treg誘導中，低劑量DP47GS IgG-IL-2比高劑量Proleukin®更有效。利用低劑量DP47GS IgG-IL-2或高劑量Proleukin®治療正常健康之食蟹猴(n=5之群組)，且在第10天測試調節T細胞之變化。在第0天及第7天，以16,800IU/kg(12μg/kg)之劑量SC給予DP47GS IgG-IL-2。每週3次(MWF)SC給予Proleukin®治療(200,000IU/kg)，總共5個劑量。結果係顯示為(A)總Treg/mm3血液之變化、(B)Treg之倍數增加及(C)Treg與習用CD4+ FOXP3-細胞之比率之變化的平均值±SD。空心條繪示IL-2治療，且陰影條繪示媒劑對照。
圖13. 作為活體內DP47GS IgG-IL-2 Treg活化之敏感性生物標記之離體全血經磷酸化STAT5。向健康食蟹猴(n=5)活體內投與單一低劑量之DP47GS IgG-IL-2(12μg/kg)後一天及3天，收集全血並立即在不刺激經磷酸化STAT5(pSTAT5a)之情況下測試。在治療前第0天自每一猴采血，且量測pSTAT5a之量(陰影條)並使用其個別地用於評估評估治療後之倍數變化(空心條)。顯示(A)第1天及第3天Treg pSTAT5a之倍數變化、(B)習用CD4+ CD45-記憶T細胞中pSTAT5a之倍數變化及(C)純真T細胞pSTAT5a之倍數變化。數據係顯示為平均值±SD。
圖14. 作為活體內低劑量DP47GS IgG-IL-2 Treg活化之敏感性生物標記之離體全血pSTAT5a。向健康食蟹猴活體內投與單一低劑量之DP47GS IgG-IL-2後1天至7天，收集全血並立即在不刺激pSTAT5a之情況下測試。在治療前第0天自每一猴采血用於pSTAT5a之未經刺激含量，並與治療後pSTAT5a之變化相比較。(A)利用2μg/kg之 DP47GS IgG-IL-2(n=4)治療之前及之後之Treg pSTAT5a。(B)利用6μg/kg之DP47GS IgG-IL-2(n=6)治療之前及之後之Treg pSTAT5a。數據係顯示為平均值±SD。
圖15. 離體食蟹猴全血Ki-67用作DP47GS IgG-IL-2誘導之T細胞活體內增殖之標記。亦針對細胞內標記Ki-67之變化離體監測如圖14中所闡述利用2μg/kg及6μg/kg之DP47GS IgG-IL-2治療之食蟹猴，以評估活體內增殖程度。在治療前第0天量化細胞週期(Ki-67+)中之細胞正常穩態百分比，且然後在接下來7天至11天內每天監測。顯示(A)Treg之% Ki-67+、(B)習用CD4+CD45-記憶/效應T細胞之% Ki-67+及(C)純真CD4+CD45RA+ T細胞之% Ki-67+。數據係顯示為平均值±SD。
圖16. DP47GS IgG-(IL-2)2於純真健康食蟹猴中之時間及對Treg之低劑量效應。(A)6μg/kgDP47 IgG-(IL-2)2後Treg絕對數之時間依賴性變化。(B)治療後Treg pSTAT5a之時間依賴性變化，(C)Treg之倍數增加之時間依賴性變化，及(D)來自經DP47Gs IgG-IL-2治療猴(空心條，2μg/kg至36μg/kg)與經DP47GS IgG-(IL-2)2治療(陰影條，6μg/kg)之Treg之倍數變化之比較。所有數據係顯示為平均值±SD(n=4至6)。
圖17. 極低劑量DP47GS IgG-(IL-2)2於純真健康食蟹猴中之時間及對Treg之劑量依賴性效應。(A)在投與0.7μg/kg及2μg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2後Treg倍數增加之時間依賴性變化。(B)在治療前第0天及治療後第1天至第4天所量測之Treg pSTAT5a之時間依賴性變化，(C)Teff/mem細胞pSTAT5a之時間依賴性變化。所有數據係顯示為平均值±SD(在0.7μg/kg下n=3且在2μg/kg下n=8)。
圖18. DP47GS IgG-IL-2與DP47GS IgG-(IL-2)2之劑量依賴性比較及其增加全血食蟹猴Treg之能力。所有數據係表示為平均值±SD (n=3至6)。
圖19. 高劑量IL-2在食蟹猴中誘導嗜酸性球增多症。在所有利用Proleukin®或IL-2之免疫偶聯物之測試中監測血液嗜酸性球計數之變化。在利用高劑量Proleukin®(2×105IU/kg，每週3次，持續2週)或較高劑量之DP47GS IgG-IL-2治療後7天至14天檢測嗜酸性球增多症。基線嗜酸性球計數係左邊之陰影條，且在6μg/kg之DP47GS IgG-(IL-2)2後之彼等係右邊之陰影條。(A)來自每一劑量群組中之每一動物之嗜酸性球計數及(B)僅來自治療後嗜酸性球增加之彼等之嗜酸性球計數。數據係顯示為平均值±SD。
圖20. 與Proleukin®相比DP47GS IgG-IL-2具有增強之PK性質。向NOD小鼠經腹膜內(IP)(A)或經皮下(SC)(B)注射所示劑量之DP47GS IgG-IL-2或Proleukin®。藉由基於mAb之捕獲分析在所示時間處評估血清樣品中之人類IL-2，且每一分析之檢測極限係顯示為橫跨每一圖表之水平線。
圖21. 在利用Proleukin®、DP47GS IgG-IL-2及DP47GS IgG-(IL-2)2治療後，CD25及FOXP3二者在鼠類Treg中皆增加。利用Proleukin®(20,000IU/小鼠及100,000IU/小鼠，n=3)、DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2(60IU/小鼠、300IU/小鼠或1,500IU/小鼠，n=3)治療BALB/c小鼠，包括經媒劑治療之小鼠作為未經刺激之對照(n=4)。治療後24小時，針對CD25及FOXP3含量評估脾Treg。針對所有三種IL2分子觀測(A)細胞表面CD25之劑量依賴性變化及(B)細胞內FOXP3之劑量依賴性變化。媒劑小鼠之平均值MFI對於CD25而言為4,900，且對於FOXP3而言為1,566。數據係表示為平均值±SD(n=3)。
圖22. 利用DP47GS IgG-IL-2之活體內治療阻抑鼠類綿羊紅血球遲髮型超敏(DTH)。顯示利用媒劑(100%反應)、IgG-IL-2(4,000IU/小 鼠)或作為陽性對照之小鼠CTLA-4-Ig(200μg/小鼠)治療之個別小鼠之所有數據。(A)NOD小鼠及(B)C57BL/6小鼠之結果。四種DTH反應之日量級係顯示為與未經免疫之小鼠相比之爪重量變化(△爪重量)。數據係顯示為平均值±SD。
圖23. 利用DP47GS IgG-IL-2(4,000IU/小鼠)之活體內治療阻抑對(A)免疫作用後21天之C57BL/6小鼠及(B)免疫作用後7天之NOD小鼠中之KLH之鼠類IgG抗體反應。數據係顯示為平均值±SD。
定義
除非下文另有定義，否則本文所用之術語具有業內通用含義。
本文所用之術語「融合蛋白」係指包含免疫球蛋白分子及IL-2分子之融合多肽分子，其中融合蛋白之組份藉由肽鍵、直接或藉助肽連接體彼此連接。為清晰起見，融合蛋白之免疫球蛋白組份之個別肽鏈可藉由(例如)二硫鍵非共價連接。
「經稠合」係指藉由肽鍵、直接或經由一或多個肽連接體連接之組份。
「特異性結合」意指該結合對抗原具有選擇性且可區別於不期望或非特異性相互作用。免疫球蛋白結合至特異性抗原之能力可藉助酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟知之其他技術(例如表面電漿子共振(SPR)技術(於BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002)))來量測。在一實施例中，免疫球蛋白與不相關蛋白質之結合程度小於免疫球蛋白與抗原之結合之約10%，如藉由(例如)SPR所量測。在某些實施例中，結合至抗原之免疫球蛋白具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至 10-13M)之解離常數(KD)。
「親和力」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間之非共價相互作用的總強度。除非另有所述，否則本文所用之「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體與抗原)之間之1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(KD)表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別為koff及kon)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由業內已知之常用方法(包括本文中所闡述之彼等)量測親和力。用於量測親和力之具體方法係表面電漿子共振(SPR)。
「減少之結合」(例如至Fc受體之減少之結合)係指針對各別相互作用之親和力之降低，如藉由(例如)SPR來量測。為清晰起見，該術語亦包括親和力減少至零(或低於分析方法之檢測極限)，即，相互作用之完全廢止。相反地，「增加之結合」係指針對各別相互作用之結合親和力之增加。
本文所用之術語「抗原決定簇」與「抗原」同義，且係指多肽大分子上抗體結合以形成抗體-抗原複合物之位點(例如胺基酸之鄰近段或由非鄰近胺基酸之不同區構成之構象組態)。有用抗原決定簇可發現於(例如)細胞表面上、游離於血液血清中及/或細胞外基質(ECM)中。
本文所用之術語「單鏈」係指包含藉由肽鍵線性連接之胺基酸單體之分子。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用，且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其呈現期望抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結 合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、雙鏈抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及單結構域抗體。
術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體結構之蛋白質。例如，IgG類免疫球蛋白係約150,000道爾頓(dalton)之異源四聚體糖蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條輕鏈及兩條重鏈構成。自N端至C端，每一免疫球蛋白重鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)、接著三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3，亦稱為重鏈恆定區)。類似地，自N端至C端，每一免疫球蛋白輕鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)、接著恆定輕鏈(CL)結構域(亦稱為輕鏈恆定區)。可將免疫球蛋白之重鏈指定為5個種類中之一者，稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可進一步分為亞類，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及α2(IgA2)。基於免疫球蛋白之恆定結構域之胺基酸序列，可將該免疫球蛋白之輕鏈指定為兩個類型中之一者，稱為卡帕(κ)及蘭布達(λ)。免疫球蛋白基本上係由經由免疫球蛋白鉸鏈區連接之兩個Fab分子及Fc結構域組成。
本文所用之「Fab片段」係指包含輕鏈之VL結構域及恆定結構域(CL)以及重鏈之VH結構域及第一恆定結構域(CH1)之免疫球蛋白片段。
抗體或免疫球蛋白之「種類」係指重鏈所擁有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5個主要種類之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類中之若干種可進一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ、
術語「可變區」或「可變結構域」係指免疫球蛋白或抗體重鏈 或輕鏈中通常參與使免疫球蛋白或抗體與抗原結合之結構域。然而，本發明融合蛋白中所包含之免疫球蛋白可包含不賦予抗原結合特異性之可變區。免疫球蛋白或抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別係VH及VL)通常具有類似結構，其中每一結構域皆包含4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。例如參見Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。
本文所用之術語「超變區」或「HVR」係指免疫球蛋白或抗體可變結構域中序列具有超變性及/或形成結構上經界定之環(「超變環」)之區域中之每一者。通常，自然四鏈抗體包含6個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3).HVR通常包含來自超變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。實例性超變環發生在胺基酸殘基26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)及96至101(H3)處(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196,901-917(1987))。實例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)發生在胺基酸殘基L1之24至34、L2之50至56、L3之89至97、H1之31至35B、H2之50至65及H3之95至102處(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中之CDR1外，CDR通常包含形成超變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸抗原之殘基。SDR係含於CDR中稱為縮短-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之區內。實例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)發生在基酸殘基L1之31至34、L2之50至55、L3之89至96、H1之31至35B、H2之50至58及H3之95至102處(參見Almagro及 Fransson,Front.Biosci.13,1619-1633(2008))。除非另有所述，否則在本文中根據Kabat等人(參見上文，稱為「Kabat編號」)對HVR殘基及可變結構域中之其他殘基(例如FR殘基)編號。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常係由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「人類免疫球蛋白」係擁有與由人類或人類細胞產生或源自利用人類免疫球蛋白譜或其他人類免疫球蛋白編碼序列之非人類來源之免疫球蛋白之胺基酸序列相對應之胺基酸序列者。人類免疫球蛋白之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化免疫球蛋白。
本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體之群體獲得之抗體，即，包含該群體之個別抗體係相同的及/或結合相同表位，可能變體抗體(例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑產生期間產生，該等變體通常少量存在)除外。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示抗體特性係獲得自實質上同源抗體群，且不應理解為需要藉由任一具體方法產生抗體。例如，欲依照本發明使用之單株抗體可藉由各種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分之轉基因動物之方法，該等方法及製造單株抗體之其他實例性方法係闡述於本文中。
術語「Fc區域」在本文中係用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分之C端區。該術語包括自然序列Fc區及變體Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3結構域。人類IgG Fc區之「CH2結構域」常自約231位處之胺基酸殘基延伸至約340位處之胺基酸殘基。在 一實施例中，碳水化合物鏈係附接至CH2結構域。CH2結構域在本文中可係自然序列CH2結構域或變體CH2結構域。「CH3結構域」包含Fc區中之C端至CH2結構域之殘基段(即，自IgG之約341位處之胺基酸殘基至約447位處之胺基酸殘基)。CH3區在本文中可係自然序列CH3結構域或變體CH3結構域(例如，具有引入其一鏈中之「隆凸」(「凸起」)及引入其另一鏈中之「腔」(「孔洞」)之CH3結構域；參見美國專利第5,821,333號，以引用的方式明確併入本文中)。該等變體CH3結構域可用於促進本文中所闡述之兩個不相同免疫球蛋白重鏈之異源二聚體。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自重鏈之Cys226或自Pro230延伸至羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非在本文中另有說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU索引)進行，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所闡述。
術語「效應功能」係指歸因於免疫球蛋白之Fc區之彼等生物活性，其隨免疫球蛋白同種型而不同。免疫球蛋白效應功能之實例包含：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、藉由抗原呈遞細胞進行之免疫複合物介導之抗原攝取、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。
「活化Fc受體」係在由免疫球蛋白之Fc區接合後引發刺激受體攜帶細胞實施效應功能之信號傳導事件的Fc受體。活化Fc受體包含FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)。具體活化Fc受體係人類FcγRIIIa(參見UniProt登錄號P08637(141版本))。
除非另有所述，否則本文所用之術語「介白素-2」或「IL-2」係指來自任一脊椎動物來源之任一自然IL-2，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未經處理IL-2以及在細胞處理中產生之任一形式的IL-2。該術語亦涵蓋天然存在之IL-2變體，例如剪接變體或對偶基因變體。實例性人類IL-2之胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：1中。未經處理人類IL-2另外包含具有N端20個胺基酸信號肽，該N端20個胺基酸信號肽不存在於成熟IL-2分子中。
「天然IL-2」(亦稱為「野生型IL-2」)意指天然存在之IL-2。自然人類IL-2分子之序列係顯示於SEQ ID NO：1中。出於本發明之目的，術語野生型亦涵蓋包含一或多個與天然存在之自然IL-2相比不改變IL-2受體結合之胺基酸突變(例如與人類IL-2之殘基125相應之位置處之半胱胺酸至丙胺酸之取代)之IL-2形式。在一些實施例中，出於本發明之目的，野生型IL-2包含胺基酸取代C125A(參見SEQ ID NO：3)。
除非另有所述，否則本文所用之術語「CD25」或「IL-2受體α」係指來自任一脊椎動物來源之任一自然CD25，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未經處理CD25以及在細胞處理中產生之任一形式的CD25。該術語亦涵蓋CD25之天然存在之變體，例如，剪接變體或對偶基因變體。在某些實施例中，CD25係人類CD25。實例性人類CD25之胺基酸序列(具有信號序列Avi標籤及His標籤)係顯示於SEQ ID NO：25中。
本文所用之術語「高親和力IL-2受體」係指異源三聚體形式之IL-2受體，其由受體γ-亞單位(亦稱為常用細胞因子受體γ-亞單位γc或CD132)、受體β-亞單位(亦稱為CD122或p70)及受體α-亞單位(亦稱為 CD25或p55)組成。相比之下，術語「中間親和力IL-2受體」或「IL-2受體βγ」係指僅包括γ-亞單位及β-亞單位而無α-亞單位之IL-2受體(關於綜述，例如參見Olejniczak及Kasprzak,Med Sci Monit 14,RA179-189(2008))之IL-2受體。實例性人類CD122及CD132(融合至具有His標籤之Fc區)之胺基酸序列係分別顯示於SEQ ID NO 21及23中。
「調節T細胞」或「Treg細胞」意指可阻抑其他T細胞之反應之特殊類型之CD4+ T細胞。Treg細胞之特徵在於CD4、IL-2受體之α-亞單位(CD25)及轉錄因子叉頭框P3(FOXP3)之表現(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))，且在誘導及維持對於抗原(包含由腫瘤表現之彼等)之周邊自身耐受性中起關鍵作用。
「Treg細胞之選擇性活化」意指基本上不相伴活化其他T細胞亞群(例如CD4+ T輔助細胞、CD8+細胞毒性T細胞、NK T細胞)或天然殺手(NK)細胞之Treg細胞活化。鑑別及區分該等細胞類型之方法係闡述於實例中。活化可包括IL-2受體信號傳導之誘導(如藉由(例如)經磷酸化STAT5a之檢測來量測)、增殖之誘導(如藉由(例如)Ki-67之檢測來量測)及/或活化標記(例如CD25)之表現之上調。
術語「肽連接體」係指包含一或多個胺基酸(通常約2個至20個胺基酸)之肽。肽連接體為業內所已知或係闡述於本文中。適宜的非免疫原性連接肽包括(例如)(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽連接體。「n」通常係介於1與10之間、通常介於2與4之間之數字。
術語「修飾」係指肽骨架(例如胺基酸序列)之任一操作或多肽之轉譯後修飾(例如糖基化)。
「凸起至孔洞中修飾」係指CH3結構域中之介於兩條免疫球蛋白重鏈之間之界面內之修飾，其中i)在一條重鏈之CH3結構域中，胺基酸殘基係經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替代，從而在一條重鏈之CH3結構域中之界面內生成隆凸(「凸起」)，該隆凸可定位於另一重 鏈之CH3結構域中之界面內之腔(「孔洞」)中，且ii)在另一重鏈之CH3結構域中，胺基酸殘基係經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替代，從而在第二CH3結構域中之界面內生成腔(「孔洞」)，第一CH3結構域中之界面內之隆凸(「凸起」)可定位於其中。在一實施例中，「凸起至孔洞中修飾」包含在抗體重鏈中之一者中之胺基酸取代T366W及視情況胺基酸取代S354C，以及在抗體重鏈中之另一者中之胺基酸取代T366S、L368A、Y407V及視情況Y349C。凸起至孔洞中技術係闡述於(例如)US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「凸起」)且在第二多肽之界面中引入相應腔(「孔洞」)，以使得該隆凸可位於該腔中，以促進異源二聚體形成並防止同源二聚體形成。藉由使用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替代來自第一多肽界面之較小胺基酸側鏈來構築隆凸。藉由使用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替代較大胺基酸側鏈來在第二多肽界面中產生大小與隆凸相同或類似之補償性腔。分別在S354位及Y349位引入兩個半胱胺酸殘基導致在Fc區中形成介於兩條抗體重鏈之間之二硫橋，從而進一步穩定二聚體(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
胺基酸「取代」係指多肽中一胺基酸經另一胺基酸之替代。在一實施例中，胺基酸係經具有類似結構及/或化學性質之另一胺基酸替代，例如保守胺基酸替代。「保守」胺基酸取代可基於所涉及殘基在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性方面之類似性進行。例如，非極性(疏水)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；帶正電荷(鹼性)胺基酸之包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶 負電荷(酸性)之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。非保守取代將需要將該等種類中之一者之成員替換為另一種類。例如，胺基酸取代亦可導致用具有不同結構及/或化學性質之另一胺基酸替代一胺基酸，例如用來自不同群組(例如鹼性)之另一胺基酸替代來自一群組(例如極性)之胺基酸。可使用業內熟知之基因或化學方法生成胺基酸取代。基因方法可包括定點誘變、PCR、基因合成及諸如此類。預期亦可使用藉由除基因改造外之方法來改變胺基酸之側鏈基團的方法，例如化學修飾。在本文中可使用各種名稱來指示相同胺基酸取代。例如，免疫球蛋白重鏈之329位之脯胺酸至甘胺酸之取代可指示為329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
關於參考多肽序列，「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在比對序列並引入間隔(gap)(若需要)以達到最大序列一致性百分比後候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比目的之比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包含在所正比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2來生成。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech公司設計，且原始碼已與使用者文件一起歸檔於美國版權局(U.S.Copyright Office)Washington D.C.,20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自原始碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)。所有序列比較參數皆係由ALIGN-2程式設定且不改變。在使用 ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形中，給定胺基酸序列A相對於(to)給定胺基酸序列B、與(with)其或對(against)其之胺基酸序列一致性%(或者，可表達為相對於給定胺基酸序列B、與其或對其具有或包含之一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)係如下來計算：100乘以分數X/Y
其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另外明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值皆係如前面緊接段落中所述使用ALIGN-2電腦程式來獲得。
「多核苷酸」或「核酸」在本文中可互換使用，係指任何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA。該等核苷酸可係去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應納入聚合物中之任何受質。多核苷酸可包含經修飾核苷酸(例如經甲基化核苷酸)及其類似物。核苷酸之序列可雜有非核苷酸組份。多核苷酸可包含合成後進行之修飾，例如至標記之偶聯。
具有與本發明參考核苷酸序列至少(例如)95%「一致」之核苷酸序列的核酸或多核苷酸欲指，除去按參考核苷酸序列之每100個核苷酸計該多核苷酸序列可包括至多5處點突變外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多有5%核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或可將數量為至多為參考序列全部核苷酸之5%之核苷酸***參考序列中。參考序列之該等變化可發生在參考核苷酸序列之5’或3’端位置或彼等末端位置間之任何地方，其個別地散 佈於參考序列中之殘基中或散佈於參考序列內之一或多個鄰近基團中。作為實際情況，可使用已知電腦程式(例如上文針對多肽所論述者(例如ALIGN-2))按慣例確定任一具體多核苷酸序列與本發明核苷酸序列是否為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
本文所用之術語「載體」係指能夠傳送其所連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構形式之載體以及納入引入其之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作連接之核酸之表現。該等載體在本文中係稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源性核酸之細胞(包含該等細胞之子代)。宿主細胞包括「轉化體」及「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及與傳代數量無關之自其衍生之子代。子代與親代細胞之核酸含量可能並不完全相同，但可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於原始轉化細胞中之具有相同功能或生物活性的突變子代。宿主細胞係可用於生成本發明融合蛋白之任一類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，舉例而言，例如哺乳動物培養細胞(例如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞)、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞，且亦包括包含於轉基因動物、轉基因植物或培養植物或動物組織內之細胞。
藥劑之「有效量」係指在投與該藥劑之細胞或組織中產生生理學變化所需之量。
藥劑(例如，醫藥組合物)之「治療有效量」係指在所需時間內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。例如，治療有效量之藥劑會消除、降低、延遲、最小化或防止疾病之不良效應。
「個體」或「受試者」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。較佳地，該個體或受試者係人類。
術語「醫藥組合物」係指如下製劑：其呈現形式允許其中所含活性成份之生物活性有效，且不含對投與該調配物之受試者具有不可接受毒性的其他組份。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥組合物中除活性成份外對受試者無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
本文所用之「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「treat」或「treating」)係指試圖改變所治療個體之疾病之自然過程的臨床干預，且可出於預防性目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。
「自體免疫疾病」係指由個體之自身組織引起並針對其之非惡性疾病或病症。自體免疫疾病或病症之實例包括(但不限於)發炎性反應，例如發炎性皮膚疾病，包括牛皮癬及皮膚炎(例如異位性皮膚炎)；與發炎性腸疾病相關之反應(例如克隆氏病(Crohn’s disease)及潰瘍性結腸炎)；皮膚炎；過敏病狀，例如濕疹及氣喘；類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡(SLE)(包括(但不限於)狼瘡腎炎、皮膚狼瘡)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發性硬化症及青少年型糖尿病。
本發明之融合蛋白
本發明提供用於本文中所闡述之治療方法之具有特別有利性質之新穎免疫球蛋白-IL-2融合蛋白。
在第一態樣中，本發明提供融合蛋白，其包含(i)包含修飾之免疫球蛋白分子，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比該修飾降低免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力，及(ii)兩個介白素-2(IL-2)分子。
在一實施例中，該融合蛋白基本上係由以下組成：包含修飾之免疫球蛋白分子，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比該修飾降低免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力，兩個介白素-2(IL-2)分子，及視情況一或多個肽連接體。
如實例受所顯示，令人驚奇地，與包含單一IL-2分子之相應融合蛋白相比，包含兩個IL-2分子之融合蛋白提供極大改良之效力及調節T細胞之選擇性活化。
在一實施例中，該免疫球蛋白分子係IgG類免疫球蛋白分子、具體而言IgG1亞類免疫球蛋白分子。在一實施例中，該免疫球蛋白分子係人類免疫球蛋白分子，即，其包含完全人類可變及恆定區。實例性人類IgG1恆定區之序列係顯示於SEQ ID NO：8中。IgG類免疫球蛋白分子包含(i)兩條免疫球蛋白輕鏈，每一者自N端至C端包含輕鏈可變結構域(VL)及輕鏈恆定結構域(CL)；及(ii)兩條免疫球蛋白重鏈，每一者自N端至C端包含重鏈可變結構域(VH)、重鏈恆定結構域(CH)1、免疫球蛋白鉸鏈區、CH2結構域及CH3結構域。後面兩個結構域形成免疫球蛋白分子之Fc區之一部分。兩條重鏈在Fc區中二聚化。
在本發明融合蛋白之一實施例中，該兩個IL-2分子各自於其N端胺基酸處並視情況藉助肽連接體融合至該免疫球蛋白分子之一免疫球蛋白重鏈之C端胺基酸。免疫球蛋白重鏈之兩個(相同)IL-2分子之融合允許簡單產生融合蛋白，從而避免形成不期望副產物並消除對促進 不相同重鏈之異源二聚體化之修飾(例如凸起至孔洞中修飾)之需求。
IL-2分子與免疫球蛋白分子之融合提供有利藥物動力學性質，包括與游離(未經稠合)IL-2相比長血清半衰期(歸因於藉助與FcRn之結合之再循環及遠大於腎過濾之臨限值之分子大小)。此外，免疫球蛋白分子之存在亦使得能夠藉由(例如)蛋白質A親和層析簡單純化融合蛋白。同時，然而，免疫球蛋白分子、特定而言免疫球蛋白分子之Fc區之存在可導致融合蛋白對表現Fc受體之細胞而非攜帶IL-2受體之較佳細胞之不期望靶向。另外，Fc受體之接合可導致(促發炎性)細胞因子之釋放及除調節T細胞以外之各種免疫細胞之不期望活化。因此，本發明融合蛋白中所包含之該免疫球蛋白分子包含修飾，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比，該修飾降低免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力。在特定實施例中，該Fc受體係Fcγ受體、具體而言人類Fcγ受體。可容易地藉由(例如)ELISA或藉由表面電漿子共振(SPR)使用標準設備(例如BIAcore儀器(GE Healthcare))來測定對Fc受體之結合親和力，且Fc受體(例如)可藉由重組表現獲得。量測結合親和力之特定說明性且實例性實施例係闡述於下文中。根據一實施例，藉由表面電漿子共振使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)在25℃下使用固定於CM5晶片上之配體(Fc受體)來量測對Fc受體之結合親和力。簡言之，根據供應商說明書，使用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5,GE Healthcare)。使用10mM乙酸鈉(pH 5.5)將重組配體稀釋至0.5μg/ml至30μg/ml，然後以10μl/min之流速注射以達成大約100個至5000個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射配體之後，注射1M乙醇胺以封阻未反應基團。對於動力學量測，在25℃下以大約30μl/min至50μl/min之流速將抗體之3倍至5倍連續稀釋液(範圍在約0.01nM至300nM之間)注射於HBS-EP+(GE Healthcare，10 mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%表面活性劑P20，pH 7.4)中。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE ® T100評價軟體1.1.1版本)藉由同時擬合締合感測圖及解離感測圖來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)係計算為比率koff/kon。例如參見Chen等人，J.Mol Biol 293,865-881(1999)。或者，可使用已知表現具體Fc受體之細胞系(例如表現FcγIIIa受體之NK細胞)來評價對Fc受體具有結合親和力之抗體。
在一實施例中，該修飾包含一或多個降低免疫球蛋白對Fc受體之結合親和力之胺基酸突變。在一實施例中，胺基酸突變係胺基酸取代。通常，相同之一或多個胺基酸突變存在於兩條免疫球蛋白重鏈中之每一者中。在一實施例中，該胺基酸突變將免疫球蛋白對Fc受體之結合親和力減小至至多1/2、至多1/5或至多1/10。在存在一個以上減小免疫球蛋白對Fc受體之結合親和力之胺基酸突變之實施例中，該等胺基酸突變之組合可將免疫球蛋白對Fc受體之結合親和力減小至至多1/10、至多1/20或甚至至多1/50。在一實施例中，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比，該免疫球蛋白分子呈現對Fc受體之結合親和力之小於20%、具體而言小於10%、更具體而言小於5%。
在一實施例中，該Fc受體係活化Fc受體。在特定實施例中，該Fc受體係選自由FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)組成之群。在一具體實施例中，Fc受體系Fcγ受體、更特定而言FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa受體。較佳地，對該等受體中之每一者之結合親和力有所減小。在甚至更特定實施例中，該Fc受體係FcγIIIa、具體而言人類FcγIIIa。在一些實施例中，對補體組份之結合親和力、特定而言對C1q之結合親和力亦有所減小。在一實施例中，對新生Fc受體(FcRn)之結合親和力並不減小。當該免疫球蛋白分子呈現該免疫球蛋白分子之未經修飾形式對FcRn之結合親和力之大於約 70%時，達成與FcRn之實質上類似結合(即，該免疫球蛋白分子對該受體之結合親和力之保留)。本發明融合蛋白中所包含之免疫球蛋白分子可呈現該親和力之大於約80%且甚至大於約90%。
在一實施例中，降低免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力之該修飾係在免疫球蛋白分子之Fc區、具體而言CH2區中。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含於免疫球蛋白重鏈之329位(EU編號)處之胺基酸取代。在一更特定實施例中，該胺基酸取代係P329A或P329G、具體而言P329G。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含於免疫球蛋白重鏈之234位及235位(EU編號)處之胺基酸取代。在特定實施例中，該等胺基酸取代係L234A及L235A(LALA)。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含於抗體重鏈之329位(EU編號)處之胺基酸取代及於選自免疫球蛋白重鏈之228位、233位、234位、235位、297位及331位之位置處之另一胺基酸取代。在一更特定實施例中，該另一胺基酸取代係S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在具體實施例中，該免疫球蛋白分子包含於免疫球蛋白重鏈之P329、L234及L235(EU編號)之位置處之胺基酸取代。在一更具體實施例中，該免疫球蛋白分子包含於免疫球蛋白重鏈中之胺基酸取代L234A、L235A及P329G(LALA P329G)。具體而言，胺基酸取代之此組合有效地廢止人類IgG類免疫球蛋白之Fcγ受體結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所闡述，以引用的方式全文併入本文中。PCT公開案第WO 2012/130831號亦闡述製備該經修飾免疫球蛋白之方法及測定其性質(例如Fc受體結合或效應功能)之方法。
在免疫球蛋白重鏈中包含修飾之免疫球蛋白可藉由胺基酸缺失、取代、***或修飾並使用業內熟知之基因或化學方法製得。基因方法可包括編碼DNA序列之位點特異性誘變、PCR、基因合成及諸如此類。可藉由(例如)測序來驗證正確之核苷酸變化。
與相應的未經修飾免疫球蛋白或抗體相比，包含減小Fc受體結合之修飾之免疫球蛋白或抗體通常具有減小之效應功能、具體而言減小之ADCC。因此，在一實施例中，降低免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力之該修飾減小免疫球蛋白分子之效應功能。在特定實施例中，該效應功能係抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在一實施例中，ADCC係減小至藉由不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子誘導之ADCC之小於20%。免疫球蛋白或抗體之效應功能可藉由業內已知方法量測。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析之實例係闡述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。或者，可採用非放射性分析方法(例如參見用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於該等分析之有用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，所關注分子之ADCC活性可在(例如)諸如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中所揭示者等動物模型中活體內評估。在一些實施例中，免疫球蛋白分子與補體組份、特定而言C1q之結合亦有所減小。因此，補體依賴性細胞毒性(CDC)亦可有所減小。可實施C1q結合分析以確定免疫球蛋白是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。例如參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可實施CDC分析(例如參見Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；及Cragg及Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
除上文及PCT公開案第WO 2012/130831號中所闡述之免疫球蛋白 分子以外，具有減小之Fc受體結合及/或效應功能之免疫球蛋白亦包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代之彼等(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括於胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩種或更多者處具有取代之Fc突變體，包括具有殘基265及297至丙胺酸之取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與IgG1免疫球蛋白相比，IgG4亞類免疫球蛋白呈現對Fc受體之減小之結合親和力及減小之效應功能。因此，在一些實施例中，本發明融合蛋白中所包含之該免疫球蛋白分子係IgG4亞類免疫球蛋白、具體而言人類IgG4亞類免疫球蛋白。在一實施例中，該IgG4亞類免疫球蛋白包含Fc區中於位置S228處之胺基酸取代、特定而言胺基酸取代S228P。為進一步減小其對Fc受體之結合親和力及/或其效應功能，在一實施例中，該IgG4亞類免疫球蛋白包含於位置L235處之胺基酸取代、特定而言胺基酸取代L235E。在另一實施例中，該IgG4亞類免疫球蛋白包含於位置P329處之胺基酸取代、特定而言胺基酸取代P329G。在具體實施例中，該IgG4亞類免疫球蛋白包含於位置S228、L235及P329處之胺基酸取代、特定而言胺基酸取代S228P、L235E及P329G。該等經修飾IgG4亞類免疫球蛋白及其Fcγ受體結合性質係闡述於PCT公開案第WO 2012/130831號中，以引用的方式全文併入本文中。
在一實施例中，該免疫球蛋白分子能夠特異性結合至抗原。在一實施例中，該免疫球蛋白分子係單株抗體。在一實施例中，該免疫球蛋白分子不能特異性結合至抗原、具體而言不能夠特異性結合至人類抗原。可藉由(例如)本文中所闡述之ELISA或表面電漿子共振確定此一免疫球蛋白分子與抗原之特異性結合之不存在(即，可區別於非特異性相互作用之任何結合之不存在)。此一免疫球蛋白分子尤其可 用於(例如)增強融合蛋白之血清半衰期，其中不期望靶向具體組織。
在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含基於人類Vh3-23種系序列之重鏈可變區序列。在特定實施例中，該免疫球蛋白分子包含與SEQ ID NO：9之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之重鏈可變區序列。在一實施例中，該免疫球蛋白分子包含基於人類Vk3-20種系序列之輕鏈可變區序列。在特定實施例中，該免疫球蛋白分子包含與SEQ ID NO：11之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之輕鏈可變區序列。在甚至更特定實施例中，該免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：9之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：11之輕鏈可變區序列。包含該等可變區序列之免疫球蛋白分子不能夠特異性結合至抗原、具體而言人類抗原。其缺乏與正常組織以及PBMC之結合，不具有多反應性，且藉由成像顯示無非特異性活體內累積(數據未顯示)。該等可變區序列完全基於人類種系序列，重鏈CDR3(其中已引入GSG序列以生成非結合免疫球蛋白)除外。
在一實施例中，該等IL-2分子係野生型IL-2分子。在一實施例中，該等IL-2分子係人類IL-2分子。在特定實施例中，該等IL-2分子包含SEQ ID NO：1之序列(自然人類IL-2)。
在一實施例中，該IL-2分子包含於與人類IL-2之殘基125相應之位置處之胺基酸取代。在一實施例中，該等胺基酸取代係C125A。在特定實施例中，該IL-2分子包含SEQ ID NO：3之序列(具有胺基酸取代C125A之人類IL-2)。或者，位置125處之半胱胺酸可經另一中性胺基酸(例如絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸)替代，從而分別得到C125S IL-2、C125A IL-2、C125T IL-2或C125V IL-2，如美國專利第4,518,584號中所述。如其中所述，亦可缺失IL-2之N端丙胺酸殘基，從而得到諸如des-A1 C125S或des-A1 C125A等突變。或者或連同一起，IL-2分子可包括如下突變：通常存在於野生型人類IL-2之104位處之甲硫胺酸係 經諸如丙胺酸等中性胺基酸替代(參見美國專利第5,206,344號)。人類IL-2中之該等修飾可提供其他優點，例如增加之表現或穩定性。
本發明融合蛋白中所包含之IL-2分子亦可係未經糖基化之IL-2分子。例如，當融合蛋白表現於諸如CHO或HEK細胞等哺乳動物細胞中時，消除IL-2分子之O-糖基化位點會產生更均質產物。因此，在某些實施例中，IL-2分子包含消除IL-2在與人類IL-2之殘基3相應之位置處之O-糖基化位點的修飾。在一實施例中，該修飾(其消除IL-2在與人類IL-2之殘基3相應之位置處之O-糖基化位點)係胺基酸取代。實例性胺基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K及T3P。在特定實施例中，該修飾係胺基酸取代T3A。
在一實施例中，當藉由SPR在25℃下量測時，該融合蛋白能夠以小於10nM、具體而言小於3nM之親和常數(KD)結合至IL-2 βγ受體。在特定實施例中，該IL-2 βγ受體係人類IL-2 βγ受體。在一實施例中，當藉由SPR在25℃下量測時，該融合蛋白能夠以小於100nM、具體而言小於20nM之親和常數(KD)結合至IL-2 α受體。在特定實施例中，該IL-2 α受體係人類IL-2 α受體。藉由SPR量測對IL-2 βγ或IL-2 α受體之結合親和力之方法係闡述於本文中。根據一實施例，藉由表面電漿子共振使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)在25℃下使用固定於CM5晶片上之IL-2受體來量測結合親和力(KD)。簡言之，根據供應商說明書，使用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5,GE Healthcare)。使用10mM乙酸鈉(pH 5.5)將重組IL-2受體稀釋至0.5μg/ml至30μg/ml，然後以10μl/分鐘之流速注射以達成大約200至1000(對於IL-2R α)或500至3000(對於IL-2R βγ異源二聚體)反應單位(RU)之偶合蛋白。注射IL-2受體之後，注射1M乙醇胺以封阻未反應基團。對於動力學量測，在25℃下以大約30μl/min之流速將 融合蛋白之3倍至5倍連續稀釋液(範圍在約3nM至300nM之間)注射於HBS-EP+(GE Healthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%表面活性劑P20，pH 7.4)中。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE ® T100評價軟體1.1.1版本)藉由同時擬合締合感測圖及解離感測圖來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)係計算為比率koff/kon。例如參見Chen等人，J.Mol Biol 293,865-881(1999)。
在具體態樣中，本發明提供融合蛋白，其包含(i)IgG1亞類免疫球蛋白分子，其包含於免疫球蛋白重鏈中之胺基酸取代L234A、L235A及P329G(EU編號)；(ii)兩個介白素-2(IL-2)分子，各自於其N端胺基酸處藉助肽連接體融合至一免疫球蛋白重鏈之C端胺基酸。在一實施例中，該免疫球蛋白分子及該等IL-2分子係人類的。在特定實施例中，該免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：9之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：11之輕鏈可變區序列。在又一特定實施例中，該等IL-2分子各自包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在甚至更特定實施例中，該融合蛋白包含與SEQ ID NO：17之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之多肽序列，及與SEQ ID NO：19之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之多肽序列。
如實例中所顯示，本發明融合蛋白可用於選擇性活化調節T細胞(即，基本上不相伴活化其他T細胞亞群及/或NK細胞)。因此，具體而言，本發明提供用於活體外或活體內選擇性活化調節T細胞之融合蛋白。在一實施例中，該用途包含使調節T細胞與該融合蛋白活體外或活體內接觸。在一實施例中，該用途進一步包含使其他(非調節)T細胞與該融合蛋白接觸。在一實施例中，該用途係在活體外，且該融合蛋白係以約1ng/mL或更小、具體而言約0.1ng/mL或更小之濃度使 用。在另一實施例中，該用途係在活體內，且該融合蛋白係以約20μg/kg體重或更小、具體而言約12μg/kg體重或更小、更具體而言約6μg/kg體重或更小之劑量(其中「體重」係指投與融合蛋白之個體之體重)使用。
本發明亦提供活體外或活體內選擇性活化調節T細胞之方法，該方法包含使該等調節T細胞與本發明融合蛋白接觸。在一實施例中，該方法進一步包含使其他(非調節)T細胞與該融合蛋白接觸。在一實施例中，該活化包含增殖之誘導及/或IL-2受體信號傳導之誘導。在一實施例中，該方法係在活體外，且該融合蛋白係以約1ng/mL或更小、具體而言約0.1ng/mL或更小之濃度使用。在另一實施例中，該方法係在活體內，且該融合蛋白係以約20μg/kg體重或更小、具體而言約12μg/kg體重或更小、更具體而言約6μg/kg體重或更小之劑量(其中「體重」係指投與融合蛋白之個體之體重)使用。
根據前述段落中所闡述之用途或方法之某些實施例，該活化包含調節T細胞之增殖之誘導及/或調節T細胞中之IL-2受體信號傳導之誘導。增殖之誘導可藉由(例如)細胞內增殖標記Ki-67之檢測量測，如實例中所闡述。在一實施例中，與非活化調節T細胞之增殖相比，藉由本發明融合蛋白活化之調節T細胞之增殖增加至至少約1.5倍、至少約2倍或至少約3倍。在一實施例中，與不與該融合蛋白接觸之相應細胞之增殖相比，與本發明融合蛋白接觸之其他(非調節)T細胞及/或NK細胞之增殖增加至小於約1.5倍、小於約1.2倍或小於約1.1倍。IL-2受體信號傳導之誘導可藉由(例如)磷酸化STAT5之檢測量測，如實例中所闡述。在一實施例中，與非活化調節T細胞中之IL-2受體信號傳導相比，藉由本發明融合蛋白活化之調節T細胞中之IL-2受體信號傳導增加至至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍或至少約5倍。在一實施例中，與不與該融合蛋白接觸之相應細胞中之IL-2受體信號傳導相 比，與本發明融合蛋白接觸之其他(非調節)T細胞及/或NK細胞中之IL-2受體信號傳導增加至小於約1.5倍或小於約1.2倍或小於約1.1倍。
多核苷酸
本發明進一步提供編碼本文中所闡述之融合之多核苷酸或其片段。
本發明多核苷酸包括與SEQ ID NO 2、4、5、6、7、10、12、18及20中所闡釋之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%一致且包括其功能片段或變體之彼等。
編碼本發明融合蛋白之多核苷酸可表現為編碼整個融合蛋白之單一多核苷酸或表現為多個(例如，兩個或更多個)共表現之多核苷酸。藉由共表現之多核苷酸編碼之多肽可藉助(例如)二硫鍵或其他方式締合，以形成功能融合蛋白。例如，免疫球蛋白之輕鏈部分可由與免疫球蛋白之重鏈部分分開之多核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合，以形成免疫球蛋白。
在一實施例中，本發明係關於編碼免疫球蛋白分子與兩個IL-2分子之融合蛋白之多核苷酸或其片段，其中該多核苷酸包含編碼SEQ ID NO 9或11中所顯示之可變區序列之序列。在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫球蛋白分子與兩個IL-2分子之融合蛋白之多核苷酸或其片段，其中該多核苷酸包含編碼SEQ ID NO 17或19中所顯示之多肽序列之序列。在另一實施例中，本發明進一步係關於編碼免疫球蛋白分子與兩個IL-2分子之融合蛋白之多核苷酸或其片段，其中該多核苷酸包含與SEQ ID NO 2、4、5、6、7、10、12、18或20中所顯示之核酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫球蛋白分子與兩個IL-2分子之融合蛋白之多核苷酸或其片段，其中該多核苷酸包含SEQ ID NO2、4、5、6、7、10、12、18或20中所顯示之核酸序列。 在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫球蛋白分子與兩個IL-2分子之融合蛋白之多核苷酸或其片段，其中該多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO 9或11之胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之可變區序列之序列。在另一實施例中，本發明係關於編碼免疫球蛋白分子與兩個IL-2分子之融合蛋白之多核苷酸或其片段，其中該多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO 17或19之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽序列之序列。本發明涵蓋編碼免疫球蛋白分子與兩個IL-2分子之融合蛋白之多核苷酸或其片段，其中該多核苷酸包含編碼具有保守胺基酸取代之SEQ ID NO 9或11之可變區序列之序列。本發明亦涵蓋編碼免疫球蛋白分子與兩個IL-2分子之融合蛋白之多核苷酸或其片段，其中該多核苷酸包含編碼具有保守胺基酸取代之SEQ ID NO 17或19之多肽序列之序列。
在某些實施例中，多核苷酸或核酸係DNA。在其他實施例中，本發明之多核苷酸係(例如)呈信使RNA(mRNA)形式之RNA。本發明之RNA可為單鏈或雙鏈。
重組方法
本發明融合蛋白可藉由(例如)固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組產生來獲得。對於重組產生，將一或多個如(例如)上文所闡述編碼該融合蛋白(片段)之多核苷酸係經分離並***至一或多個載體中，用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。可易於使用習用程序分離該多核苷酸並對其測序。在一實施例中，提供包含本發明之多核苷酸中之一或多者之載體、較佳地表現載體。可使用熟習此項技術者熟知之方法構築表現載體，該等表現載體含有融合蛋白(片段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號。該等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。例如參見闡述於以下文獻中 之技術：Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)。表現載體可為質粒、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現卡匣，在該表現卡匣中，編碼融合蛋白(片段)之多核苷酸(即編碼區)係經選殖與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作締合。本文中所用之「編碼區」係由轉譯成胺基酸之密碼子組成之核酸部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)並不轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區之一部分(若存在)，但任一側翼序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5’及3’非轉譯區及諸如此類)並非編碼區之一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單一多核苷酸構築體中(例如位於單一載體上)或分開多核苷酸構築體中(例如位於分開(不同)載體上)。此外，任一載體皆可含有單一編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一或多個多肽，該一或多個多肽以後轉譯或共轉譯方式經由蛋白水解裂解分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼異源性編碼區，該等異源性編碼區融合或不融合至編碼本發明之融合蛋白(片段)或其變體或衍生物之多核苷酸。異源性編碼區包括(但不限於)特殊元件或模體，例如分泌信號肽或異源性功能結構域。可操作締合係如下情形：以與基因產物之表現處於調節序列之影響或控制下之方式使用於基因產物之編碼區(例如多肽)與一或多個調節序列進行締合。兩個DNA片段(例如多肽編碼區及與其有關之啟動子)在以下情形下為「可操作締合」：誘導啟動子功能會引起編碼期望基因產物之mRNA之轉錄，且兩個DNA片段間之連接性質並不干擾表現調節序列引導基因產物表現之能力或干擾DNA模板轉錄之能力。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸之 轉錄，則啟動子區與該核酸可操作地締合。啟動子可為僅在預定細胞中引導DNA之實質性轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子外，其他轉錄控制元件(例如增強子、操作子、抑制子及轉錄終止子信號)可與多核苷酸可操作地締合以引導細胞特異性轉錄。適宜啟動子及其他轉錄控制區係揭示於本文中。各種轉錄控制區為熟習此項技術者所熟知。該等轉錄控制區包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，例如(但不限於)來自巨細胞病毒(例如即早期啟動子，與內含子-A連結)、猿猴病毒40(例如早期啟動子)及反轉錄病毒(例如Rous肉瘤病毒)之啟動子及增強子區段。其他轉錄控制區包括衍生自脊椎動物基因之彼等(例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔â-球蛋白)以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列。其他適宜轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導型啟動子(例如啟動子誘導型四環素)。類似地，各種轉譯控制元件為熟習此項技術者所熟知。該等轉譯控制元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子及衍生自病毒系統之元件(尤其內核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，例如複製起點及/或染色體整合元件(例如反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)或腺相關病毒(AAV)反轉末端重複序列(ITR))。
本發明之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌或信號肽(其引導由本發明之多核苷酸編碼之多肽之分泌)之其他編碼區締合。例如，若期望分泌該融合物，則可將編碼信號序列之DNA置於編碼本發明融合蛋白之核酸或其片段之上游。根據信號假說，由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，一旦橫跨粗糙內質網中輸出生長蛋白鏈，則該信號肽或分泌前導序列自成熟蛋白質裂解。熟習此項技術者應瞭解，由脊椎動物細胞分泌之多肽通常具有融合至多肽之N端之信號肽，該信號肽係自經轉譯多肽裂解而產生分泌或「成熟」形 式之多肽。在某些實施例中，使用自然信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或彼序列之功能衍生物，該功能衍生物保留引導與其操作締合之多肽之分泌之能力。或者，可使用異源性哺乳動物信號肽或其功能衍生物。例如，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶之前導序列取代。實例性分泌信號肽之胺基酸及多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO 39至47中。
在編碼多核苷酸之融合蛋白(片段)之內部或末端處可包括編碼短蛋白質序列之DNA，該短蛋白質序列可用於促進後續純化(例如組胺酸標籤)或有助於標記融合蛋白。
在又一實施例中，提供包含一或多個本發明多核苷酸之宿主細胞。在某些實施例中，提供包含一或多個本發明載體之宿主細胞。多核苷酸及載體可單獨或組合納入本文所述分別與多核苷酸及載體有關之特徵中之任一者。在一該實施例中，包含載體(例如已經該載體轉化或轉染)之宿主細胞包含編碼本發明融合蛋白(之一部分)之多核苷酸。本文所用之術語「宿主細胞」係指可經改造以生成本發明融合蛋白或其片段之任一類細胞系統。適於複製融合蛋白並支持其表現之宿主細胞為業內所熟知。該等細胞可視需要經具體表現載體轉染或轉導，且可生長大量含有載體之載體用於接種大規模發酵罐，以獲得足量用於臨床應用之融合蛋白。適宜宿主細胞包括原核微生物(例如大腸桿菌(E.coli))或各種真核細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或諸如此類)。例如，多肽可在細菌中產生，具體而言在不需要糖基化時。表現之後，可以可溶性部分形式自細菌細胞漿液分離多肽且可進一步純化。除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)係用於多肽編碼載體之適宜選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已「經人類化」從而產生具有部分地或完全人類糖基化模式之多肽之真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)及Li等 人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。用於表現(經糖基化)多肽之適宜宿主細胞亦係衍生自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可連同昆蟲細胞一起使用、具體而言用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞之諸多桿狀病毒菌株。植物細胞培養物亦可用作宿主。例如參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述用於在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係經SV40(COS-7)轉化之猴腎CV1細胞系；人類胎腎細胞系(293或293T細胞，如(例如)Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠賽特利氏(sertoli)細胞(TM4細胞，如(例如)Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人類宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、水牛大鼠肝細胞(BRL 3A)、人類肺細胞(W138)、人類肝細胞(Hep G2)、小鼠***腫瘤細胞(MMT 060562)、TRI細胞(如(例如)Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5細胞及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適於蛋白質產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，例如參見Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255頁至第268頁(2003)。宿主細胞包括培養細胞(舉例而言，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞)，但亦包括包含於轉基因動物、轉基因植物或培養植物或動物組織內之細胞。在一實施例中，宿 主細胞係真核細胞、較佳哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。
業內已知在該等系統中表現外來基因之標準技術。表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽之細胞可經改造以亦表現免疫球蛋白鏈中之另一者，以使得所表現產物係具有重鏈及輕鏈二者之免疫球蛋白。
在一實施例中，提供產生本發明融合蛋白之方法，其中該方法包含在適於表現融合蛋白之條件下培養如本文所提供包含編碼該融合蛋白之多核苷酸之宿主細胞及自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該融合蛋白。
在本發明之融合蛋白中，該等組份(免疫球蛋白分子及IL-2分子)係以遺傳方式彼此融合。融合蛋白可經設計，以使得其組份直接地或藉助連接體序列間接地彼此融合。連接體之組成及長度可依照業內熟知方法測定且可測試其效力。亦可包括其他序列以納入裂解位點以分離融合蛋白之個別組份(若需要)，例如內肽酶識別序列。
在某些實施例中，本發明融合蛋白包含至少一個能夠結合至抗原之免疫球蛋白可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段之一部分並衍生自其。產生多株抗體及單株抗體之方法為業內所熟知(例如參見Harlow及Lane，「Antibodies,a laboratory manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成來構築，可以重組方式產生(例如，如美國專利第4,186,567號中所述)或可藉由(例如)篩選包含可變重鏈及可變輕鏈之組合文庫獲得(例如參見頒予McCafferty之美國專利第5,969,108號)。
任何動物物種之免疫球蛋白可用於本發明。用於本發明之非限制性免疫球蛋白可為鼠類、靈長類或人類來源。若融合蛋白意欲用於人類用途，則可使用嵌合形式之免疫球蛋白，其中免疫球蛋白之恆定 區係來自人類。人類化或完全人類形式之免疫球蛋白亦可依照業內熟知之方法來製備(例如參見頒予Winter之美國專利第5,565,332號)。可藉由各種方法來達成人類化，包括(但不限於)(a)將非人類(例如，供體抗體)CDR接枝於保留或不保留關鍵性框架殘基之人類(例如接受者抗體)框架及恆定區(例如對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能甚為重要之彼等)，(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用甚為關鍵之殘基)接枝於人類框架及恆定區上，或(c)移植整個非人類可變結構域，但使用人類樣部分藉由替代表面殘基將其「覆蓋」。人類化抗體及其製備方法係綜述於(例如)Almagro及Fransson，Front Biosci 13,1619-1633(2008)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332,323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人，Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36,25-34(2005)(闡述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)及Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(闡述FR改組之「導向選擇」方式)。本發明之具體免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。可使用業內已知之各種技術產生人類抗體及人類可變區。人類抗體係概述於van Dijk及van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人類可變區可形成藉由融合瘤方法製得之人類單株抗體之一部分並衍生自其(例如參 見Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51頁至第63頁(Marcel Dekker公司，New York,1987))。亦可藉由以下方式來製備人類抗體及人類可變區：向已經修飾而因應抗原性激發產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體之轉基因動物投與免疫原(例如參見Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變區序列來生成人類抗體及人類可變區(例如參見Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)；及McCafferty等人，Nature 348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式之抗體片段。
在某些實施例中，根據(例如)PCT公開案WO 2012/020006(參見與親和力成熟相關之實例)或美國專利申請公開案第2004/0132066號(其全部內容以引用的方式併入本文中)中所揭示之方法，改造本發明融合蛋白中所包含之免疫球蛋白以具有增強之結合親和力。可藉助酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟知之其他技術(例如表面電漿子共振技術(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002)))量測本發明之融合蛋白結合至特異性抗原決定簇之能力。可使用競爭分析鑑別與參考抗體競爭結合至具體抗原之抗體。在某些實施例中，此一競爭抗體結合至參考抗體所結合之相同表位(例如線性或構象表位)。定位抗體所結合之表位之詳細實例性方法才提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。在實例性競爭分析中，在如下溶液中培育固定化抗原：其包含結合至抗原之第一經標記抗體及第二未經標記抗體(測試其與第一抗體競爭結合至抗原之能力)。第二抗體可存在於融合瘤上 清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但並不包含第二未經標記抗體之溶液中培育固定化抗原。在允許第一抗體與抗原結合之條件下培育之後，去除過量之未經結合抗體，且量測與固定化抗原締合之標記之量。若與固定化抗原締合之標記之量相對於對照樣品在測試樣品中實質上減少，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合至抗原。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,NY)。
可藉由業內已知之技術來純化如本文所述製得之融合蛋白，例如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、粒徑排阻層析及諸如此類。用於純化具體蛋白質之實際條件將部分地取決於諸如靜電荷、疏水性、親水性等因素，且將為熟習此項技術者易知。對於親和層析純化，可使用融合蛋白所結合之抗體、配體、受體或抗原。例如，對於本發明之融合蛋白之親和層析純化，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可基本上如實例中所述使用依序蛋白質A或G親和層析及粒徑排阻層析來分離融合蛋白。可藉由各種熟知分析方法中之任一者來測定融合蛋白之純度，包括凝膠電泳、高壓液相層析及諸如此類。例如，如實例中所述表現之融合蛋白係顯示為完整的並經適當組裝，如藉由還原型或非還原型SDS-PAGE所證實(例如參見圖2)。
組合物、調配物及投與途徑
在又一態樣中，本發明提供(例如)用於下文治療方法中之任一者之醫藥組合物，其包含本文所提供融合蛋白中之任一者。在一實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之融合蛋白中之任一者及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含本文所提供融合蛋白中之任一者及至少一種其他治療劑(例如，如下所述)。
進一步提供產生本發明之呈適於活體內投與之形式之融合蛋白之方法，該方法包含(a)獲得本發明之融合蛋白，及(b)將融合蛋白 與至少一種醫藥上可接受之載劑調配在一起，藉此將融合蛋白之製劑調配用於活體內投與。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種溶解或分散於醫藥上可接受之載劑中之融合蛋白。片語「醫藥或藥理學上可接受」係指如下分子實體及組合物：當視需要向諸如人類等動物投與時，在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒，即不產生不良、過敏或其他不適反應。根據本揭示內容熟習此項技術者將已知含有至少一種融合蛋白及視情況其他活性成份之醫藥組合物之製備，如藉由Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing公司，1990(以引用的方式併入本文中)所例示。另外，對於動物(例如，人類)投與，應理解，製劑應符合FDA Office of Biological Standards或其他國家中之相應當局所需之滅菌性、發熱性、一般安全性及純度標準。較佳組合物係凍乾之調配物或水溶液。本文所用之術語「醫藥上可接受之載劑」包括如熟習此項技術者已知之任一及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料、該等類似材料及其組合(例如參見Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing公司，1990，第1289頁至第1329頁，其以引用的方式併入本文中)。除任何與活性成份不相容之習用載劑外，本發明涵蓋其於治療或醫藥組合物中之用途。
視組合物欲以固體、液體還是氣溶膠形式投與、及組合物是否需要滅菌來以注射形式用於該等投與途徑而定，組合物可包含不同類型之載劑。本發明之融合蛋白(及任一其他治療劑)可以熟習此項技術者已知之以下方式投與：經靜脈內、經皮內、經動脈內、經腹膜內、 經病灶內、經顱內、經關節內、經***內、經脾內、經腎內、經胸膜內、經氣管內、經鼻內、經玻璃體內、經***內、經直腸內、經瘤內、經肌內、經腹膜內、經皮下、經結膜下、經囊內、經黏膜、經心包內、經臍內、經眼內、經口、局部(topically、locally)、藉由吸入(例如氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續輸注、直接浸浴靶細胞之局部灌注、經由導管、經由灌洗、於乳霜中、於脂質組合物(例如脂質體)中或藉由其他方法或前述方法之任一組合(例如參見Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing公司，1990，其以引用的方式併入本文中)。非經腸投與、具體而言靜脈內注射最常用於投與諸如本發明之融合蛋白等多肽分子。
非經腸組合物包括經設計用於藉由注射投與之彼等，例如皮下、真皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌內、鞘內或腹膜內注射。對於注射，本發明之融合蛋白可調配於水溶液中，較佳調配於諸如漢克氏溶液(Hanks’solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理鹽水緩衝劑等生理相容性緩衝劑中。該溶液可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑等調配劑。或者，融合蛋白可呈粉末形式，在使用前使用適宜媒劑(例如滅菌無熱原水)構成。藉由將所需量之本發明融合蛋白與(視需要)下文列示之各種其他成份一起納入適當溶劑中來製備滅菌可注射溶液。可易於藉由(例如)藉助滅菌過濾膜進行過濾來達成滅菌性。通常，分散液係藉由將各種經滅菌活性成份納入含有基本分散介質及/或其他成份之滅菌媒劑中來製備。在用於製備滅菌可注射溶液、懸浮液或乳液之滅菌粉末之情形下，較佳製備方法為真空乾燥或冷凍乾燥技術，其自先前經滅菌過濾之液體介質產生活性成份及任何其他期望成份之粉末。液體介質若需要應經適當緩衝且液體稀釋劑首先在注射之前使用足夠鹽水或葡萄糖調節為等滲。組合物在製造及存儲條件下必須穩定，且必須防止受到諸如細菌及真菌等微生物之污染 作用。應瞭解，內毒素污染應保持最小在安全量，例如小於0.5ng/mg蛋白質。適宜醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、葡聚糖或諸如此類。視情況，懸浮液亦可含有適宜穩定劑或增加該等化合物之溶解度之試劑，從而允許製備高濃度溶液。另外，該等活性化合物之懸浮液可製備成適宜之油性注射懸浮液。適宜之親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或三甘油酯)或脂質體。
活性成份可裝入分別(例如)藉由凝聚技術或藉由界面聚合製得之微膠囊中，例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，該等系統呈膠狀藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或***液形式。該等技術係揭示於Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing公司，1990)中。可製備緩釋製劑。緩釋製劑之適宜實例包括含有多肽之固 體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質係呈成形物件形式，例如膜或微膠囊。在具體實施例中，可藉由在組合物中使用延遲吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來長效吸收可注射組合物。
除先前所闡述組合物外，融合蛋白亦可調配成儲積製劑。該等長效調配物可藉由植入(例如，經皮下或經肌內)或藉由肌內注射投與。因此，例如，可用適宜聚合或疏水性材料(例如作為存於可接受油中之乳液)或離子交換樹脂調配融合蛋白，或調配為微溶衍生物(例如，微溶鹽)。
可藉助習用混合、溶解、乳化、囊封、包埋或凍乾過程來製造包含本發明融合蛋白之醫藥組合物。可以習用方式使用一或多種生理上可接受且有利於將蛋白質處理成可用於醫藥之製劑的載劑、稀釋劑、賦形劑或輔助劑調配醫藥組合物。適當調配物取決於所選投與途徑。
可將融合蛋白調配成游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥上可接受之鹽係實質上保留游離酸或鹼之生物活性之鹽。該等鹽包括酸加成鹽，例如使用蛋白組合物之游離胺基形成之彼等，或使用無機酸(例如，鹽酸或磷酸)或有機酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸)形成者。使用游離羧基形成之鹽亦可衍生自諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵等無機鹼；或諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)等有機鹼。醫藥鹽往往較相應游離鹼形式更可溶於水性及其他質子溶劑中。
治療方法及組合物
本文所提供融合蛋白中之任一者可用於治療方法。
為用於治療方法中，將以與良好醫學實踐一致之方式來調配、給藥及投與本發明之融合蛋白。在此上下文中需考慮之因素包括所治療之具體病症、所治療之具體哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症 起因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師已知之其他因素。
在一態樣中，提供用作醫藥之本發明融合蛋白。在其他態樣中，提供用於治療疾病之本發明融合蛋白。在某些實施例中，提供用於治療方法之本發明融合蛋白。在一實施例中，本發明提供本文所述用於治療有需要之個體之疾病之融合蛋白。在某些實施例中，本發明提供在治療患有疾病之個體之方法中使用之融合蛋白，該方法包含向該個體投與治療有效量之融合蛋白。在某些實施例中，欲治療之疾病係自體免疫疾病。實例性自體免疫疾病包括1型糖尿病、牛皮癬、氣喘、類風濕性關節炎、克隆氏病、全身性紅斑狼瘡(SLE)及多發性硬化症。在一實施例中，該疾病係移植排斥反應或移植物抗宿主疾病。在具體實施例中，該疾病係選自由1型糖尿病、克隆氏病、SLE及多發性硬化症組成之群。在一更具體實施例中，該疾病係1型糖尿病。在另一具體實施例中，該疾病係多發性硬化症。在其他實施例中，該疾病係氣喘、肺纖維化或阻塞性肺病。在再其他實施例中，該疾病係心血管疾病、具體而言動脈粥樣硬化。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑(例如，若該欲治療疾病係自體免疫疾病，則為免疫阻抑劑)。根據上述實施例中之任一者，「個體」係哺乳動物，較佳係人類。
在又一態樣中，本發明提供本發明之融合蛋白用於製造或製備用以治療有需要之個體之疾病之醫藥之用途。在一實施例中，該醫藥係用於治療疾病之方法，該方法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之醫藥。在某些實施例中，欲治療之疾病係自體免疫疾病。在一實施例中，該疾病係移植排斥反應或移植物抗宿主疾病。在具體實施例中，該疾病係選自由1型糖尿病、克隆氏病、SLE及多發性硬化症組成之群。在一更具體實施例中，該疾病係1型糖尿病。在另一具體實 施例中，該疾病係多發性硬化症。在其他實施例中，該疾病係氣喘、肺纖維化或阻塞性肺病。在再其他實施例中，該疾病係心血管疾病、具體而言動脈粥樣硬化。在一實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑(例如，若該欲治療疾病係自體免疫疾病，則為免疫阻抑劑)。根據上述實施例中之任一者，「個體」可係哺乳動物，較佳係人類。
在又一態樣中，本發明提供治療個體之疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本發明融合蛋白。在一實施例中，向該個體投與組合物，該組合物包含呈醫藥上可接受之形式之本發明融合蛋白。在某些實施例中，欲治療之疾病係自體免疫疾病。在一實施例中，該疾病係移植排斥反應或移植物抗宿主疾病。在具體實施例中，該疾病係選自1型糖尿病、克隆氏病、SLE及多發性硬化症之群。在一更具體實施例中，該疾病係1型糖尿病。在另一具體實施例中，該疾病係多發性硬化症。在其他實施例中，該疾病係氣喘、肺纖維化或阻塞性肺病。在再其他實施例中，該疾病係心血管疾病、具體而言動脈粥樣硬化。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑(例如，若該欲治療疾病係自體免疫疾病，則為免疫阻抑劑)。根據上述實施例中之任一者，「個體」可係哺乳動物，較佳係人類。
在一些實施例中，向細胞投與有效量之本發明融合蛋白。在其他實施例中，向個體投與治療有效量之本發明融合蛋白用於治療疾病。
為預防或治療疾病，本發明之融合蛋白之適當劑量(當單獨或與一或多種其他治療劑組合使用時)將取決於欲治療疾病之類型、投與途徑、患者之體重、融合蛋白類型、疾病之嚴重性及病程、投與融合蛋白係用於預防目的還是治療目的、先前或同時之治療干預、患者之 臨床史及對融合蛋白之反應及主治醫師之決定。在任一情形下，負責投與之執業醫師將決定組合物中活性成份之濃度及用於個別受試者之適當劑量。本文涵蓋各種給藥方案，包括(但不限於)單一投與或在各個時間點多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
融合蛋白適於向患者一次性地或經一系列治療投與。視疾病之類型及嚴重性而定，無論(例如)藉由一或多次分開投與還是藉由連續輸注，向患者投與之初始候選劑量可為約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)。視上文所提及之因素而定，一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更多之範圍內。對於經若干天或更長時間之重複投與，視病狀而定，治療通常持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。融合蛋白之一實例性劑量可在約0.005mg/kg至約10mg/kg之範圍內。在其他非限制性實例中，劑量亦可包含約1μg/kg體重、約5μg/kg體重、約10μg/kg體重、約50μg/kg體重、約100μg/kg體重、約200μg/kg體重、約350μg/kg體重、約500μg/kg體重、約1mg/kg體重、約5mg/kg體重、約10mg/kg體重、約50mg/kg體重、約100mg/kg體重、約200mg/kg體重、約350mg/kg體重、約500mg/kg體重至約1000mg/kg體重或更多及其中衍生之任一範圍。在來自本文所列示數值之衍生範圍之非限制性實例中，基於上文所闡述數值，可投與約5mg/kg體重至約100mg/kg體重、約5μg/kg體重至約500mg/kg體重等之範圍。因此，可向患者投與一或多個約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任一組合)之劑量。可間歇性地投與該等劑量，例如每週或每三週(例如，以使得患者接受約兩個至約二十個或(例如)約六個劑量之融合蛋白)。可先投與較高負荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其它劑量方案。可藉由習用技術及分析容易地監測此療法之進展。
本發明融合蛋白通常將以可有效地達成預期目的之量使用。為 用於治療或預防疾病病狀，以治療有效量投與或施加本發明之融合蛋白或其醫藥組合物。治療有效量之確定為熟習此項技術者所熟知，尤其可根據本文所提供之詳細揭示內容確定。
對於全身性投與，最初可自活體外分析(例如細胞培養物分析)來估計治療有效劑量。然後可將劑量調配用於動物模型中以達成循環濃度範圍，該循環濃度範圍包含在細胞培養物中測定之IC50。該資訊可用於更準確地確定用於人類之劑量。
亦可自活體內數據(例如，動物模型)使用業內熟知之技術來估計初始劑量。熟習此項技術者可容易地基於動物數據來最佳化對人類之投與。
可個別地調節劑量量及間隔，以提供足以維持治療效應之融合蛋白之血漿含量。用於藉由注射投與之常用患者劑量係在約0.1mg/kg/天至50mg/kg/天、通常約0.5mg/kg/天至1mg/kg/天之範圍內。可藉由每天投與多個劑量來達成治療有效之血漿含量。可(例如)藉由HPLC來量測血漿含量。
在局部投與或選擇性攝取之情形下，融合蛋白之有效局部濃度可與血漿濃度無關。熟習此項技術者將能夠無需過多實驗即最佳化治療有效之局部劑量。
本文所闡述之治療有效劑量之融合蛋白通常將提供治療益處，而不引起實質毒性。可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序確定融合蛋白之毒性及治療效力。可使用細胞培養物分析及動物研究來測定LD50(對50%群體致死之劑量)及ED50(對50%群體治療有效之劑量)。毒性與治療效應之間之劑量比率為治療指數，其可表示為比率LD50/ED50。呈現大治療指數之融合蛋白較佳。在一實施例中，本發明融合蛋白呈現高治療指數。自細胞培養物分析及動物研究獲得之數據可用於調配適用於人類之劑量範圍。該劑量較佳地在具有極低毒性 或無毒性之循環濃度(包括ED50)之範圍內。該劑量可視例如以下之各種要素在此範圍內有所變化：所採用劑量、所利用投與途徑、個體之狀況及諸如此類。鑒於患者之狀況，個別醫師可選擇確切調配物、投與途徑及劑量(例如參見Fingl等人，1975，The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁，其以引用的方式全文併入本文中)。
使用本發明之融合蛋白治療患者之主治醫師將知曉因毒性、器官功能障礙及諸如此類而終止、間斷或調節投與之方式及時間。相反地，若臨床反應不夠(排除毒性)，則主治醫師亦將知曉將治療調節至更高程度。在所關注病症之管控中所投與劑量之量級應隨欲治療病狀之嚴重性、投與途徑及諸如此類而變。例如，病狀之嚴重性可部分地藉由標準預測評估方法來評估。此外，該劑量且(可能)劑量頻率亦將根據個體患者之年齡、體重及反應而變。
其他藥劑及治療
本發明融合蛋白可與一或多種其他藥劑組合投與用於療法。例如，本發明融合蛋白可與至少一種其他治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋經投與以治療需要該治療之個體之症狀或疾病之任一藥劑。該其他治療劑可包含適用於所治療具體適應症之任一活性成份，較佳具有不會不利地彼此影響之互補活性之彼等。在某些實施例中，其他治療劑係自體免疫劑。
該等其他藥劑適於以對預期目的有效之量以組合形式存在。該等其他藥劑之有效量取決於所用融合蛋白之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素。通常以與本文所述相同之劑量及投與途徑或以本文所述劑量之約1%至99%或以經驗/臨床確定為適當之任一劑量及任一途徑來使用融合蛋白。
上文所述之該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑係包括於相同或分開組合物中)及分開投與(在此情形下，本發明之 融合蛋白之投與可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行)。
製品
在本發明之另一態樣中，提供含有用於治療、預防及/或診斷上文所闡述病症之材料之製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可自各種材料(例如玻璃或塑膠)形成。該容器容納自身或與另一組合物組合以有效治療、預防及/或診斷病狀之組合物，且可具有滅菌存取埠(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係本發明融合蛋白。標記或包裝插頁指示該組合物係用於治療所選病狀。另外，該製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之融合蛋白；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含包裝插頁，該包裝插頁指示該組合物可用於治療具體病狀。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度考慮所期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。
重組DNA技術
使用標準方法來操作DNA，如Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所闡述。根據製造商說明書使用分子生物學試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊係於以下文獻中給出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案第91-3242號。
DNA測序
藉由雙鏈測序來測定DNA序列。
基因合成
所需之期望基因區段係藉由PCR使用適當模板來生成，或藉由Geneart AG(Regensburg，德國)、自合成寡核苷酸及PCR產物藉由自動基因合成來合成。在無確切基因序列可用之情形下，基於來自最近同源物之序列來設計寡核苷酸引物，且藉由RT-PCR自源自適當組織之RNA來分離基因。將側接有單一限制性內切酶裂解位點之基因區段選殖至標準選殖/測序載體中。自轉化細菌純化質粒DNA並藉由UV光譜法測定濃度。藉由DNA測序來證實亞選殖基因片段之DNA序列。使用適宜限制性位點來設計基因區段以允許亞選殖至各別表現載體中。所有構築體係經設計具有編碼前導肽之5’末端DNA序列，該前導肽靶向在真核細胞中分泌之蛋白質。SEQ ID NO 39至47給出實例性前導肽及編碼其之多核苷酸序列。
IL-2R βγ亞單位-Fc融合物及IL-2R α亞單位Fc融合物之製備
為研究IL-2受體結合親和力，生成允許表現異源二聚體IL-2受體之工具。將IL-2受體之β-亞單位融合至Fc分子，使用「凸起至孔洞中」技術改造該Fc分子以異源二聚化(Fc(孔洞))(參見SEQ ID NO 21及22(人類)、SEQ ID NO 27及28(小鼠)及SEQ ID NO 33及34(食蟹猴))(Merchant等人，Nat Biotech.16,677-681(1998))。然後將IL-2受體之γ-亞單位融合至Fc(凸起)變體(參見SEQ ID NO 23及24(人類)、SEQ ID NO 29及30(小鼠)及SEQ ID NO 35及36(食蟹猴))，使該Fc(凸 起)變體與Fc(孔洞)異源二聚化。然後使用此異源二聚體Fc-融合蛋白作為受質來分析IL-2/IL-2受體相互作用。IL-2R α-亞單位係表現為具有AcTev裂解位點及Avi His標籤之單體鏈(SEQ ID NO 25及26(人類)、SEQ ID NO 31及32(小鼠)及SEQ ID NO 37及38(食蟹猴))。使各別IL-2R亞單位在具有血清(對於IL-2R βγ亞單位構築體)及無血清(對於α亞單位構築體)之HEK EBNA 293細胞中瞬時表現。在蛋白質A(GE Healthcare)上、隨後使用粒徑排阻層析(GE Healthcare,Superdex 200)來純化IL-2R βγ亞單位構築體。經由His標籤在NiNTA管柱(Qiagen)上、隨後使用粒徑排阻層析(GE Healthcare,Superdex 75)來純化IL-2R α亞單位。各種受體構築體之c胺基酸及相應核苷酸序列係於SEQ ID NO 21至38給出。
融合蛋白之製備
藉由基因合成及/或經典分子生物學技術生成DNA序列，並在MPSV啟動子之控制下且在合成polyA位點之上游將其亞選殖至哺乳動物表現載體中，每一載體攜帶EBV OriP序列。藉由使用磷酸鈣轉染共轉染指數生長之HEK293-EBNA細胞與哺乳動物表現載體來產生應用於下文實例中之融合蛋白。或者，藉由聚乙烯亞胺(PEI)使用各別表現載體來轉染在懸浮液中生長之HEK293細胞。或者，使用經穩定轉染之CHO細胞庫或CHO細胞純系用於無血清培養基中之產生。隨後，自上清液純化融合蛋白。簡言之，藉由利用在20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 7.5)中平衡之蛋白質A(HiTrap ProtA,GE Healthcare)之一個親和步驟來純化融合蛋白。裝載上清液之後，首先使用20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 7.5)洗滌管柱，且隨後使用13.3mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、500mM氯化鈉(pH 5.45)洗滌。使用20mM檸檬酸鈉、100mM氯化鈉、100mM甘胺酸(pH 3)溶析融合蛋白。中和該等部分並彙集，且藉由粒徑排阻層析(HiLoad 16/60 Superdex 200,GE Healthcare)在最終調配物緩衝液：20mM組胺酸、140mM NaCl(pH 6.0)中純化。藉由使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數量測280nm下之光學密度(OD)來測定經純化蛋白質樣品中之蛋白質濃度。藉由SDS-PAGE在存在及不存在還原劑(5mM 1,4-二硫蘇糖醇)之情況下分析融合蛋白之純度及分子量，並使用考馬斯藍(Coomassie blue)(SimpleBlueTM SafeStain,Invitrogen)染色。根據製造商說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)(4%至20% Tris-甘胺酸凝膠或3%至12% Bis-Tris)。或者，藉由CE-SDS分析在存在及不存在還原劑之情況下並根據製造商說明書使用Caliper LabChip GXII系統(Caliper Lifescience)分析分子之純度及分子量。在25℃下使用Superdex 200 10/300GL分析型粒徑排阻管柱(GE Healthcare)於2mM MOPS、150mM NaCl、0.02% NaN3(pH 7.3)電泳緩衝液中分析融合蛋白樣品之聚集體含量。或者，在25℃下使用TSKgel G3000 SW XL分析型粒徑排阻管柱(Tosoh)於25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3(pH 6.7)電泳緩衝液中分析抗體樣品之聚集體含量。
DP47GS IgG-IL-2及DP47GS IgG-(IL-2)2構築體之純化及表徵之結果係顯示於圖1及2中。
對IL-2受體之親和力
在以下條件下使用重組IL-2R βγ異源二聚體藉由表面電漿子共振(SPR)測定融合蛋白對人類、鼠類及食蟹猴IL-2R βγ異源二聚體之親和力：配體：固定化於CM5晶片上之人類、鼠類及食蟹猴IL-2R β凸起γ孔洞異源二聚體，分析物：DP47GS IgG-IL-2(參見SEQ ID NO 13、15及19)或DP47GS IgG-(IL-2)2(參見SEQ ID NO 17及19)，溫度：25℃，緩衝液：HBS-EP，分析物濃度：300nM低至3.7nM(1：3稀釋)，流速：30μl/min，締合：180s，解離：300s，再生：60s 3M MgCl2，擬合：1：1結合，RI≠0，Rmax=總體。亦在以下條件下使用重組單體IL-2R α-亞單位藉由表面電漿子共振(SPR)測定融合蛋白對人類、鼠類及食蟹猴IL-2R α-亞單位之親和力：配體：固定化於CM5晶片上之人類、鼠類及食蟹猴IL-2R α-亞單位，分析物：DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2，溫度：25℃，緩衝液：HBS-EP，分析物濃度100nM低至3.1nM(1：3稀釋)，流速：30μl/min，締合：60s，解離：180s，再生：無，擬合：1：1結合，RI=0，Rmax=總體。
使用IL-2R βγ異源二聚體或IL-2R α亞單位之動力學分析之結果係於表1中給出。
人類IL-2對人類IL 2R βγ異源二聚體之親和力係闡述為約1nM，而融合蛋白皆具有介於2nM與3nM之間之略微較低親和力。對鼠類IL-2R之親和力較人類及食蟹猴IL-2R弱若干倍。
IL-2受體於免疫細胞上之表現
高親和力三聚體IL-2受體係由α(IL-2RA CD25)、β(IL-2RB CD122)及γ(IL-2RG CD132)鏈構成，且具有約10pM之KD。單獨CD25對IL-2僅具有低親和力(KD為約10nM)。在不存在IL-2RA之情況下於一些細胞類型上表現之IL-2RB/IL-2RG二聚體亦結合IL-2，但以中間親和力(KD為約1nM)結合。經由IL-2受體之信號傳導係藉由IL-2RB及IL-2RG鏈介導。自晶體結構分析，IL-2RA似乎不接觸IL-2RB或IL-2RG。已提出，三聚體受體之協同性之基礎係當CD25在細胞表面捕獲IL-2用於呈遞至IL-2RB及IL-2RG或或者在IL-2構象中發生CD25誘 導之改變、從而穩定該複合體時熵減少。在FOXP3+調節CD4+ T細胞中，與受體之β及γ鏈相比，存在大量化學計量過量之IL-2RA，此支持如下假設：α鏈之二聚體或甚至較大複合體有助於IL-2之結合。亦有證據證明一細胞上之CD25可以高親和力細胞間相互作用將IL-2呈遞至另一細胞上之IL-2RB/IL-2RG二聚體，該相互作用強調三條鏈間之獨特關係構成高親和力IL-2受體。
藉由FACS測定CD4+ Treg亞群、NK細胞亞群及NKT細胞以及CD4+及CD8+習用T細胞亞群上所表現之CD25(IL-2RA)及CD122(IL-2RB)(圖3及4)。使用細胞表面標記界定CD4+ Treg亞群、NKT細胞及NK細胞(圖3)。為使針對CD25及CD122之染色最佳化，不實施細胞內FoxP3染色。簡言之，使用健康志願者提供之150μl血液，在室溫下並在黑暗中將螢光抗體培育45min(在開始時及20min後進行渦旋)。利用BD溶解緩衝液(BD FACS溶解溶液，349202)將紅血球溶解9分鐘，且洗滌(2ml of PBS+0.1% BSA)並固定(1% PFA)剩餘細胞。於LSRFortessa細胞分析器(Becton Dickinson)上分析細胞，且使用FloJo軟體(TreeStar)分析數據。使用對TCRαβ-FITC(IP26,BioLegend)、CD4-Alexa Fluor 700(RPA-T4,BioLegend)、CD127-PE/CY7(ebioRDR5,Ebioscience)、CD45RA-Pacific Blue(HI100,BioLegend)、CD25-APC(2A3,M-A251,BD Biosciences)及CD122-PE(TU27,BioLegend)具有特異性之抗體鑑別Treg亞群。在分開管中利用對TCRαβ-FITC、CD4-Alexa Fluor 700、CD8-PE/CY7(HTT8a,BioLegend)、CD56-Pacific Blue(HCD56,BioLegend)、CD25-APC及CD122-PE具有特異性之抗體對NK及NKT細胞染色。在基於FSC/SSC選通淋巴細胞及排除雙聯體(doublet)後，純真Treg係鑑別為TCRαβ+、CD4+、CD127-、CD25+、CD45RA+，記憶Treg係鑑別為TCRαβ+、CD4+、CD127-、CD25+、CD45RA-，且經活化Treg係鑑別為TCRαβ+ CD4+、CD127-、CD25high、CD45RA-。NK細胞係鑑別為TCRαβ-、CD56+，且經活化NK細胞係鑑別為TCRαβ-、CD56bright。NKT細胞係鑑別為TCRαβ+、CD56+。使用偶聯至APC及PE之同種型對照以估計分別針對CD25及CD122之背景螢光。
類似地，使用細胞表面標記界定純真及記憶習用CD4+ T細胞(圖4A及4B)、記憶習用CD8+ T細胞及CD45RA+ CD8 T細胞(純真與TEMRA亞群之組合；TEMRA係指已回復至表現CD45RA之效應記憶細胞)(圖4C及4D)。如上文所闡述實施染色及分析。使用上文所闡述之相同管表徵CD4+ Treg，CD4+習用純真T細胞係鑑別為TCRαβ+、CD4+、CD127+、CD25-/+、CD45RA+，且CD4+習用記憶T細胞係鑑別為TCRαβ+、CD4+、CD127+、CD25-/+、CD45RA-。使用TCRαβ-FITC、CD8-Alexa Fluor 700(HTT8a,BioLegend)、CD28-PE/CY7(CD28.2,BioLegend)、CD45RA-Pacific Blue、CD25-APC及CD122-PE界定CD8 T細胞。CD8+記憶T細胞係鑑別為TCRαβ+、CD8+、CD45RA-。CD8+純真及TEMRA(TEMRA係指已回復至表現CD45RA T細胞之效應記憶細胞)係鑑別為TCRαβ+、CD8+、CD45RA+。不使用CD28 CD8+區分純真T細胞與CD8+ TEMRA T細胞，此乃因CD28標記不包括於上文所闡述之pSTAT5a分析中(參見圖5)。
在圖3及4中，顯示IL-2RA及IL-2RB對人類周邊血液中之T細胞、NK細胞及NKT細胞之亞群之細胞特異性表現(IL-2RG在造血細胞上具有基本上無處不在之表現，此乃因其與大量細胞因子受體配對)。最高含量之IL-2RA係存在於三種調節CD4+ T細胞(Treg)群體上：純真(CD45RA+、CD25+)、記憶(CD45RA-、CD25+)及經活化(CD45RA-、CD25hi)(圖3A)。平均地，相比於Treg，習用記憶CD4+ T細胞表現少至大約1/10之CD25(圖4A)。CD25於純真CD4+ T細胞上之表現在供體之間顯著不同，但總少於於記憶CD4+ T細胞上所觀測者(圖4A)。 CD25於NK、NKT及CD8 T細胞上之表現極低或不可檢測，CD56bright NK細胞除外(圖3C及4C)。CD56bright NK及CD56+ NK細胞表現最高含量之IL-2RB(圖3D)，為任一T細胞亞群(包括NKT細胞)之大約10倍(圖3B、3D、4B、4D)。
人類周邊血液細胞亞群中之pSTAT5a之誘導
在三聚體IL-2R之IL-2誘導之寡聚合後，分別與IL-2RB及IL-2RG之細胞內結構域締合之JAK1及JAK3細胞質蛋白質酪胺酸激酶被活化。該等激酶使某些充當STAT5a及STAT5b之停泊位點之IL-2RB酪胺酸殘基磷酸化，進而使STAT5a及STAT5b磷酸化。若干信號傳導路徑之IL-2誘導之活化最終導致有助於與IL-2/IL-2R路徑相關之各種功能之靶基因之轉錄。由於各種細胞類型表現不同含量之IL-2受體IL-2RA及IL-2RB分子(圖3及4)，故為瞭解由高及中間親和力受體之各種組合所介導之對IL-2之整合信號傳導反應，藉由多色流式細胞術量測個別細胞內之pSTAT5a含量。
在人類CD4+ Treg亞群、純真及記憶習用CD4+ T細胞、記憶習用CD8+ T細胞、CD45RA+ CD8 T細胞、NKT細胞及NK細胞中評估各種劑量之DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2對STAT5a磷酸化之誘導之效應(圖5及6)。在單一管中針對每一劑量表徵所有亞群。簡言之，將來自健康志願者之血液抽取至肝素化管中。將各種濃度之DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2添加至500μl血液中，並在37℃下培育。30分鐘後，在37℃下使用預升溫溶解/固定緩衝液(Becton Dickinson #558049)將血液溶解並固定10分鐘，用含有0.2% BSA之PBS洗滌2×，接著於冰上利用-20℃預冷卻甲醇(Sigma，生物科技等級編號494437)透化20分鐘。然後用含有0.2% BSA之PBS將該等細胞徹底洗滌4×，然後使用一組螢光抗體實施FACS染色，以區分不同淋巴細胞及NK細胞子群及pSTAT5a狀態。所利用之抗體係抗CD4-Alexa Fluor 700(純系RPA-T4)、CD3-PerCP/Cy5.5(UCHT1)、CD45RA-PE/Cy7(HI100)、CD8-Brilliant Violet 605(RPA-T8)、CD56-Brilliant Violet 421(HCD56)、FOXP3-PE(259D)(所有來自BioLegend)、CD25-APC(純系M-A251及2A3)及pSTAT5a-Alexa Fluor 488(pY694)(Becton Dickinson)。使用LSRFortessa細胞分析器(Becton Dickinson)獲取樣品，且使用FloJo軟體(TreeStar)分析數據。於淋巴細胞上選通及排除雙聯體後，Treg係界定為CD3+、CD4+、FOXP3+，並細分為CD45-FOXP3hi(經活化Treg)、CD3+、CD4+、CD45RA-、FOXP3+(記憶Treg)及CD3+、CD4+、CD45+、FOXP3+(純真Treg)。習用CD4+ T細胞係界定為CD3+、CD4+、CD45RA+(純真)及CD3+、CD4+、CD45RA-(記憶)。CD8 T細胞係界定為CD3+、CD8+、CD45RA-(記憶)及CD3+、CD8+、CD45RA+。NKT細胞係界定為CD3+、CD56+，且NK細胞係界定為CD3-、CD56bright(經活化NK細胞)或CD3-、CD56+(NK細胞)。在所有細胞亞群中在所有劑量下量化細胞內pSTAT5a含量。
圖5顯示DP47GS IgG-IL-2免疫偶聯物對來自三種個別供體之人類周邊血液中之T細胞、NK細胞及NK T細胞之劑量反應，該三種個別供體各自於不同天進行測試。對DP47GS IgG-IL-2之反應性之層級在所有三種供體中係相同的，且與使用重組人類IL-2(Proleukin®)時所觀測者(數據未顯示)相同。所有三種Treg群體(即經活化(CD45RA-、CD25hi)、記憶(CD45RA-、CD25+)及純真(CD45RA+、CD25+))在0.1ng/ml濃度之DP47GS IgG-IL-2下增加pSTAT5a含量，而其他細胞群體需要大於1ng/ml(CD56bright NK及記憶CD4+ T細胞)或10-100ng/ml(記憶CD8+ T細胞、CD56+ NK細胞、純真CD4+ T細胞、NKT細胞及CD45RA+ CD8 T細胞)之DP47 IgG-IL-2，以產生可檢測之pSTAT5a增加。對於由對DP47GS IgG-IL-2展示高敏感性之Treg群體所產生之較詳細劑量反應亦參見圖8。應注意，與於T細胞亞群上表現之IL-2RB 相比，IL-2RB於具有中間含量之CD56之NK細胞上之高表現(圖3D)不足以允許Treg樣IL-2敏感性。總體而言，經活化、記憶及純真Treg亞群對DP47GS IgG-IL-2顯示最高敏感性，而CD56bright NK細胞及CD4+習用記憶T效應細胞之敏感性小至1/20至1/50。在針對pSTAT5a增加分析之其他細胞亞群中，CD8+記憶T效應細胞、CD4+純真T效應細胞、NKT細胞、「靜止」NK細胞(針對CD56之染色呈陽性但不鮮明)及CD8+純真T效應+ CD45RA+記憶細胞對IgG-IL-2免疫偶聯物相對不敏感。
圖6顯示DP47GS IgG-(IL-2)2對來自之人類周邊血液中之T細胞、NK細胞及NK T細胞之劑量反應，該五種個別供體各自於不同天進行測試。如針對DP47GS IgG-IL-2所觀測(圖5)，三種Treg亞群係對DP47GS IgG-(IL-2)2誘導之pSTAT5a最敏感之細胞(圖6及8)，且在所有五種供體中發現針對其他細胞亞群之類似層級劑量反應。
為較容易地比較DP47GS IgG-IL-2與DP47GS IgG-(IL-2)2，使pSTAT5a值正規化(圖7)。為使MFI正規化，自所有每一經選通亞群之經刺激MFI值減去對彼細胞亞群具有特異性之未經刺激pSTAT5a MFI值。使所得值除以由彼亞群在劑量反應中獲得之最高pSTAT5a MFI值。基於達到針對彼亞群所觀測到之最大pSTAT5a MFI之50%所需之IL-2融合蛋白之量估計EC50。如圖7中所顯示，DP47GS IgG-(IL2)2免疫偶聯物在組成型表現CD25之細胞中產生對pSTAT5a之較強效誘導，此潛在地係歸因於免疫偶聯物對高親和力IL-2受體之增加之親合力。經觀測當直接比較DP47GS IgG-(IL-2)2與DP47GS IgG-IL-2時，pSTAT5a活化之EC50在Treg中低至1/5至1/9。表2概述在不同細胞亞群中藉由DP47GS IgG-IL-2與DP47GS IgG-(IL-2)2達成之pSTAT5a活化之代表性EC50值及倍數差異。
表2. 在不同細胞亞群中藉由DP47GS IgG-IL-2與DP47GS IgG-
甚至在極其有限之濃度下，與DP47GS IgG-IL-2相比，DP47GS IgG-(IL-2)2產生較高含量之pSTAT5a(圖8)。對於此實驗，在同一天針對在有限濃度之IL-2下對DP47 IgG-IL-2及DP47 IgG-(IL-2)2之2倍劑量調整之反應個別測試來自三個健康志願者之血液。圖8中之圖表代表三種供體之pSTAT5a MFI之平均值±SD。除三種個別檢查之Treg亞群以外(圖8B-D)，施加門以評估總CD3+ CD4+ FoxP3+ Treg中之pSTAT5a(圖8A)。結果清楚地指示Treg之DP47GS IgG-(IL-2)2活化之效能之5至倍10倍增加，儘管每分子之IgG僅2倍IL-2增加。如上文所闡述實施多色流式細胞術(參見圖5)。
與DP47GS IgG-IL-2相比，CD4+習用記憶T細胞亦響應較低(1/7)濃度之DP47GS IgG-(IL-2)2。儘管當比較DP47GS IgG-(IL-2)2與DP47 IgG-IL-2時CD56brightNK細胞及CD56+ NK細胞之EC50值較低，但僅分別降低至1/3及1/4。此可能歸因於該等細胞對用於IL-2介導信號傳導之中間親和力IL-2受體之依賴。Treg與NK細胞之ED50之此差異偏移(differential shift)將對Treg活化之偏好增加若干倍。
食蟹猴周邊血液細胞亞群中之pSTAT5a之誘導
如人類周邊血液中所觀測到，在經IL-2(Proleukin®)刺激之食蟹 猴周邊血液中之Treg亞群中存在pSTAT5a之優先及類似之劑量依賴性誘導(數據未顯示)。在三種Treg亞群中DP47GS IgG-(IL-2)2及DP47GS IgG-IL-2誘導pSTAT5a之能力之直接比較中，達到pSTAT5a之最大含量之50%需要少至1/2至1/8之DP47GS IgG-(IL-2)2。表3概述在不同食蟹猴Treg亞群中藉由DP47GS IgG-IL-2與DP47GS IgG-(IL-2)2達成之pSTAT5a活化之EC50值，結果與利用人類周邊血液所見之彼等驚人類似(表2)。
與人類全血類似，細胞表面及細胞內標記係用於鑑別來自正常健康之食蟹猴之全血中之調節T細胞亞群及習用T細胞。在同一天自三隻健康食蟹猴於肝素鈉管中收集血液樣品，且將各種濃度之DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2添加至500μl血液中並在37℃下培育。在37℃下10min後，利用預升溫BD溶解/固定緩衝液(BD Biosciences)溶解並固定樣品。洗滌後，於冰上利用1mL甲醇使細胞透化30min。將樣品洗滌3次，並在4℃下利用一組FOXP3-Alexa Fluor® 647(純系：259D，BioLegend)、CD4-V500(純系：L200，BD Biosciences)、CD45RA-V450(純系：5H9，BD Biosciences)、CD25-PE(純系：4E3，eBioscience)、pSTAT5a-Alexa Fluor® 488(純系：47，BD Biosciences)及Ki-67-PerCP-Cy5.5(純系：B56，BD Biosciences)染色1小時。藉由LSRFortessa細胞分析器(Becton Dickinson)獲取所有樣品，且然後利用FlowJo軟體(Tree star公司，Ashland，USA)分析。
食蟹猴中之Treg數之誘導
利用DP47GS IgG-IL-2活體內治療之食蟹猴動物具有劑量依賴性Treg絕對數增加以及給藥後7天高於基線之倍數增加(分別圖9A及9B)。在所有測試中使用兩種性別且年齡在3歲至6歲範圍內之正常健康食蟹猴，且不止一次不使用任何動物。當在麻醉下時，於側背上SC注射各種劑量之DP47GS IgG-IL-2(n=4至6)或媒劑(n=3)。個別劑量之DP47GS IgG-IL-2係基於體重，且經調配用於在含有0.5%滅菌正常食蟹猴血清之滅菌PBS pH 7.2之媒劑中注射。在治療後各時間處收集血液樣品，並利用Advia自動化血液化分析器以及上文所闡述之細胞表面及細胞內標記(表3之實驗程序)針對血液變化(CBC及分類)進行測試。在圖9中在治療後第7天全血CD4+ CD25+ FOXP3+調節T細胞之變化係顯示為絕對細胞數/mm3全血(圖9A)及Treg倍數變化(圖9B)；所有數據係表示為平均值±SD。在較高劑量之25μg/kg及36μg/kg DP47GS IgG-IL-2下，觀測到分別近3倍(111%至255%之範圍，n=6)及4倍(110%至470%之範圍，n=6)之平均Treg增加。DP47GS IgG-IL-2(12μg/kg、6μg/kg及2μg/kg)之SC劑量之進一步減少繼續相應產生減少之Treg數變化及倍數變化。不希望受理論限制，在12μg/kg DP47GS IgG-IL2劑量情況下Treg之約2倍增加(在67%至133%之範圍內，n=6)大約代表Treg之期望增加。人類中之Treg數之範圍較大(20個至90個Treg/mm3血液；CD4+ T細胞之4%至10%)，且合理地假設個體內由IL-2誘導之Treg增加將導致功能阻抑之總體增加。然而，可不期望在一持續時間內增加Treg數高於此細胞群體之正常範圍，但主要增強該等細胞之功能。
當評價較低劑量之DP47GS IgG-IL-2(2-6μg/kg)時，更頻繁收集血液樣品以鑑別在DP47GS IgG-IL-2投與後檢測Treg變化之最優時間(圖10)。儘管在7天內存在Treg變化，但最大刺激發生在第4天，早於利用較高劑量之DP47GS IgG-IL-2所量測者(第7天，圖9)。
當藉由刺激Treg及其他IL-2反應性細胞中之pSTAT5a所使用之IL-2活性單位直接比較(數據未顯示)時，Proleukin®及DP47GS IgG-IL-2在人類及食蟹猴全血分析中在活體外相當。利用人類中之已知短半衰期之Proleukin®，在食蟹猴中進行單一劑量研究以評估活體內Treg誘導及活化。Proleukin®產生藉由絕對數之倍數變化以及pSTAT5a活化量測之Treg之劑量及時間依賴性變化。儘管Treg數之增加係名義上的(圖11A：10%至40%)，但在治療後一天Treg pSTAT5a之Proleukin誘導之增加係實質性的且劑量依賴性的(圖11B)。
DP47GS IgG-IL-2在食蟹猴中誘導活體內Treg增加之能力與Proleukin®之比較係顯示於圖12中。利用低劑量之DP47GS IgG-IL-2或高劑量之Proleukin®治療正常健康之食蟹猴(n=5之群組)，且在第10天測試調節T細胞變化。在第0天及第7天，以16.800IU/kg之劑量(於圖9中所顯示之12μg/kg劑量)SC給予DP47 IgG-IL-2。基於其中向給予1型糖尿病患者Proleukin®(4.5×106IU/人，3次/週)並顯示其增加Treg之公開著作及圖11中之單一劑量數據，SC給予Proleukin® 3次/週(M,W,F)，總共5個劑量，各自在200,000IU/kg(4.5×106IU/人之食蟹猴當量)下。在圖12中結果係顯示為總Treg變化/mm3血液(圖12A)、Treg數之倍數增加(圖12B)及Treg與習用CD4+ FOXP3-細胞之比率變化(圖12C)之平均值±SD。
儘管經10天時期投與小至近1/30之DP47GS IgG-IL-2活性，相比於Proleukin® DP47GS IgG-IL-2誘導Treg數之較大增加(圖12A，p=0.06)。與Proleukin®相比，在利用DP47GS IgG-IL-2給藥之猴中Treg 數高於基線之倍數增加(圖12B)及Treg相對於習用CD4 T細胞之增加(圖12C)亦較大(分別p=0.0011且p=0.016)。在人類中，常使用調節CD4 T細胞(通常界定為FoxP3+或藉由表面標記之組合界定)與非調節CD4 T細胞(稱為習用或效應細胞)之比率來界定經過一段時間Treg在患者中之功能含量。
食蟹猴周邊血液細胞亞群對低劑量DP47GS IgG-IL-2治療之活體內反應
低劑量IL-2治療之活體內細胞特異性係關鍵參數。已測定，可藉由量測在向食蟹猴或小鼠給藥後各時間處獲取之血液中之離體pSTAT5a含量來敏感地監測藉由DP47GS IgG-IL-2或Proleukin®誘導之活體內細胞活化。亦可離體檢查可活體外監測之所有細胞群體之活體內反應(圖5至7)。
在向健康食蟹猴(n=5)活體內投與單一低劑量之DP47GS IgG-IL-2(12μg/kg)後1天及3天，收集全血，並針對上文所闡述之STAT5a磷酸化進行測試(表3之實驗程序)。在治療前0天自每一隻猴采血，且量測STAT5a磷酸化之量，並個別地用於評估治療後之倍數變化。在第1天及第3天Treg中之pSTAT5a之倍數變化係顯示於圖13A中，習用CD4+ CD45RA-記憶T細胞中之pSTAT5a之倍數變化係顯示於圖13B中，且習用CD4+ CD45RA+純真T細胞中之pSTAT5a之倍數變化係在圖13C中。結果清楚顯示，單一低劑量(12μg/kg)之DP47GS IgG-IL-2後1天及3天所獲得之食蟹猴血液顯示與記憶及純真CD4+ T細胞相比Treg細胞中之優先pSTAT5a增加(圖13A至C)。在產生持續活體內Treg活化狀態方面單一低劑量DP47GS IgG-IL-2明確優於單一高劑量Proleukin®(圖11B)。
使用STAT5a之磷酸化作為Treg活化之活體內生物標記之初始研究在利用單一劑量Proleukin®僅1天時(圖11B)以及利用低劑量(12 μg/kg)DP47GS IgG-IL-2 1及3天時發現最大pSTAT5a(圖13A)。與其他取樣時間組合之DP47GS IgG-IL-2之進一步劑量調整顯示活體內pSTAT5a信號可維持4天，然後在7天時降回至正常(圖14A、14B)。2μg/kg(14A,n=4)及6μg/kg(14B,n=6)劑量二者之pSTAT5a信號之MFI(平均螢光強度)說明發生小於最大pSTAT5a信號傳導(參見圖16B)。甚至該等極低劑量之DP47GS IgG-IL-2提供Treg之持續活體內信號傳導且優於Proleukin®(圖11B)。該等結果支持如下假設：極低含量之長壽命IL-2(即，DP47GS IgG-IL-2，而非Proleukin®)可活體內長時間刺激Treg，從而降低重建佔主導地位之自身耐受性並改良疾病預後所需之治療頻率。低劑量IL-2治療後周邊血液中之Treg細胞之增加可反映體內該等細胞之分佈變化，而非該等細胞之實際增加。為證實活體內Treg增加至少部分地歸因於IL-2治療對細胞***之誘導，評估增殖Ki-67之細胞內標記。Ki-67係在G1、S、G2及有絲***期間於細胞核中可檢測到但處於細胞週期之G0期之靜止細胞不存在之蛋白質。亦針對上文所闡述細胞內標記Ki-67之離體變化(表3之實驗程序)監測上文所闡述利用2μg/kg及6μg/kg DP47GS IgG-IL-2治療之食蟹猴(圖14)，以評估活體內增殖程度。將在第0天處於細胞週期之細胞(Ki-67+)之百分比與治療後1天至11天時細胞Ki-67+之百分比相比。Ki-67+ Treg係顯示於圖15A中，習用CD4+ CDRA45-記憶T細胞係於圖15B中，且習用純真CD4+ CD45RA+ T細胞係於圖15C中。單一低劑量之DP47GS IgG-IL-2(6μg/kg)後1天至7天所獲得之食蟹猴血細胞顯示與純真習用CD4+ T細胞相比Treg中之優先Ki-67增加(圖15A與15C)。不同於純真T細胞，DP47GS IgG-IL-2(6μg/kg)能夠刺激習用記憶CD4+ T細胞之增殖(圖15B)。在DP47GS IgG-IL-2之最低劑量(2μg/kg)下，與6μg/kg劑量相比細胞週期及增殖中存在最小活化。
在人類及食蟹猴全血分析中，總體而言，DP47GS IgG-(IL-2)2之 活體外活性在Treg上之效力為DP47GS IgG-IL-2之大約6倍(表1及3)。因此，相比於所測試之DP47GS IgG-IL-2之最高劑量(36μg/kg)，給予食蟹猴之第一劑量少至1/6。以6μg/kg(n=4)投與之DP47GS IgG-(IL-2)2產生循環Treg中之較大增加(圖16A)、Treg中之顯著且長效pSTAT5a(其在1週時返回至正常)(圖16B)及Treg數之近3倍增加(圖16C)。將藉由DP47GS IgG-IL-2誘導之倍數增加(來自圖9，空心條)與6μg/kg劑量之DP47GS IgG-(IL-2)2(陰影條)相比(圖16D)。與人類及食蟹猴全血分析類似，每分子之IgG，DP47GS IgG-(IL-2)2呈現經增強超過其2倍IL-2增加之活體內效能。
向食蟹猴給予其他劑量之DP47GS IgG-(IL-2)2以評估其在極低劑量(2μg/kg及0.7μg/kg)下之活體內效應(圖17)。儘管2μg/kg產生中等倍數變化(46%之平均值，在20%至70%之範圍內，n=8)，但0.7μg/kg劑量對T細胞數具有極少效應(16%之平均增加，n=3)(圖17A)。兩個低劑量刺激Treg中之pSTAT5a增加(圖17B，各自n=3)，而對Teff/mem細胞pSTAT5a具有極少效應(圖17C，各自n=3)。
IL-2療法之首要效應及其增加食蟹猴中之Treg之能力係呈現於圖18中。兩種形式之長壽命IgG-IL-2係Treg之強效誘導物，該等誘導物可利用pSTAT5a作為活化之生物標記追蹤且在此圖中以循環Treg數之倍數增加來活體內追蹤。藉由在IgG之C端倍增IL-2分子達成增強之效能的DP47GS IgG-(IL-2)2具有優於DP47GS IgG-IL-2之劑量依賴性優越性。
當以1×106IU/人至4.5×106IU/人之劑量每日給予時，人類中之Proleukin®刺激嗜酸性球增多症。在食蟹猴中，在利用Proleukin®或單一劑量之DP47GS IgG-IL-2重複治療後可見嗜酸性球之類似增加(圖19)。圖19A中之結果代表每一所測試動物(n=5至6)，不論嗜酸性球數為正常的或升高。圖19B中之數據僅代表產生治療相關之升高之血液 嗜酸性球的猴。數據係顯示為平均值±SD。空心條係經DP47GS IgG-IL-2治療，且右邊之陰影條係來自圖16之經6μg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2治療之猴。結果之概述係顯示於下表4中。儘管25μg/kg DP47GS IgG-IL-2及6μg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2對於Treg等效，但其對嗜酸性球之效應顯著不同，分別為50%反應者與0%反應者。
小鼠中之DP47GS IgG-IL-2之藥物動力學性質
在小鼠中開始功能研究之前，將DP47GS IgG-IL-2之藥物動力學(PK)性質與Proleukin®之彼等相比(圖20)。
向NOD小鼠IP(圖20A)或SC(圖20B)注射所示劑量之存於含有0.5%小鼠血清之PBS中之DP47GS IgG-IL-2或Proleukin®，並在注射後各時間處采血。DP47GS IgG-IL-2之劑量係概述於表4中。使用小鼠抗人類IL-2 mAb(BD Pharmingen，目錄編號555051，純系5344.111)塗覆96孔板以捕獲IL-2來評估血清樣品中之人類IL-2。使用經生物素化小鼠抗人類IL-2 mAb(BD Pharmingen，目錄編號555040，純系B33-2)檢測IL-2。使用銪偶聯鏈黴抗生物素使結合可視化。
如先前所闡述，Proleukin®被快速清除。相比之下，DP47GS IgG-IL-2被清除得更快。來自比較DP47GS IgG-IL-2在正常小鼠及 NOD-scid CD25KO小鼠中之PK之結果支持如下假設：驅動DP47GS IgG-IL-2之活體內清除之主要組份係高親和力IL-2受體(數據未顯示)。
利用IgG-IL-2治療後Treg之FOXP3及CD25 MFI增加
為比較免疫偶聯物DP47GS IgG-IL-2及DP47GS IgG-(IL-2)2以及重組人類IL-2(Proleukin®)活體內刺激FoxP3+ Treg細胞之能力，向小鼠經皮下注射Proleukin®、DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2，且針對在24小時內之先前確定之最優時間處CD25及FOXP3之表現之變化監測Treg(圖21)。
向年幼健康BALB/c小鼠(n=3/治療群組，n=4/媒劑對照隊列)經皮下注射Proleukin®(20,000IU或100,000IU)、DP47GS IgG-IL-2(60IU、300IU或1,500IU)或DP47GS IgG-(IL-2)2(60IU、300IU或1,500IU)。於100μl含有0.5%經滅菌過濾小鼠血清之滅菌PBS pH 7.2中遞送劑量。24小時後，使小鼠安樂死並切下脾。脾細胞之單一細胞懸浮液係於1ml L-15培養基中生成，並儲存於冰上，直至進一步加工為止。將單一細胞懸浮液之經過濾等份試樣(40μl)轉移至FACS管中，並用2ml FACS緩衝液(600×g,5min)洗滌。然後將樣品與針對以下細胞表面抗原之螢光染料偶聯之抗體一起培育：CD4(純系RM4-5、螢光染料 A700)、CD25(eBio7D4、Af488)、CD44(IM7、e605)、CD62L(MEL-14、PE)、ICOS(C398.4A、PE/Cy7)、CD103(2E7、APC)。在4℃下於100μl FACS緩衝液(PBS pH 7.2+0.2% BSA)中將染色實施30min。細胞表面染色後，用4ml FACS緩衝液(600×g,5min)洗滌樣品，然後進行細胞內染色(根據eBioscience細胞內染色方案)。簡言之，將樣品再懸浮於200μl固定/破膜緩衝液(eBioscience編號00-5521)中，並在4℃下培育1h。將1ml之1×破膜緩衝液(eBioscience編號00-8333)添加至樣品中，然後添加3ml FACS緩衝液並洗滌(600×g,5min)。在4℃下，於100μl 1×破膜緩衝液中將細胞內抗原Ki-67(B56,PerCP Cy5.5)及FOXP3(FJK-16S,e450)染色1h。用4ml FACS緩衝液(600×g，5min，兩次)洗滌樣品，且於BD Fortessa分析器上獲取數據並使用FlowJo軟體(Tree Star公司)進行分析。根據淋巴細胞門內之單體(singlet)，Treg係界定為CD4+ FOXP3+；自此群體，針對所有樣品計算CD25及FOXP3平均螢光強度(MFI)。
如圖21中所顯示，與100,000IU之Proleukin®相比，300IU之DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2誘導CD25之類似上調，而1,500IU甚至更強效(圖21A)。與Proleukin®相比，刺激細胞內FOXP3之能力顯示針對兩種IL-2免疫偶聯物之類似增強能力。在所有治療群組中，數據係顯示為平均值±SD。先前研究已顯示IL-2治療後72小時FOXP3及CD25含量返回至基線。
利用DP47GS IgG-IL-2之活體內治療阻抑小鼠中之免疫反應
在圖21中所顯示之彼等之前之初步研究中，觀測到4,000IU DP47GS IgG-IL-2劑量活化活體內小鼠FOXP3+調節T細胞；然後使用此劑量評估其阻抑小鼠中之經典T依賴性免疫反應(即遲髮型超敏(圖22)及IgG抗KLH反應(圖23))之能力。
利用綿羊紅血球(srbc)對NOD小鼠及C57BL/6小鼠(n=7)進行IV免 疫，並3天後於單一後足中利用srbc濃注攻擊以誘導遲髮型超敏(DTH)反應。攻擊後一天，利用CO2使小鼠安樂死，且切下各爪並稱重。DTH反應之量級係顯示為與未經免疫之小鼠相比之爪重量變化(△爪重量)。在srbc免疫作用前3天及當天以4,000IU/小鼠SC給予DP47GS IgG-IL-2，且媒劑係滅菌PBS pH 7.2。統計顯著性係得自GraphPad Prism中之曼-懷特尼測試。
在綿羊紅血球免疫作用前3天及當天給藥DP47GS IgG-IL-2在NOD小鼠中(圖22A；p=0.0023)以51%且在C57BL/6小鼠(圖22B；p=0.002)中以38%阻抑對綿羊血細胞攻擊之後續遲髮型超敏反應。作為陽性對照免疫阻抑劑之小鼠CTLA-4-Ig將DTH反應抑制至與DP47GS IgG-IL-2類似之含量。
DP47GS IgG-IL-2在C57BL/6(78%抑制，p=0.0007，圖23A)及NOD(67%抑制，p=0.004，圖23B)小鼠中亦能夠阻抑KLH特異性IgG反應。對於此實驗，用100μg不含製造商(Stellar)所推薦之佐劑之人類疫苗級KLH對健康年幼C57BL/6小鼠(n=7-10)及NOD小鼠(n=13-14)進行IP免疫利。DP47GS IgG-IL-2治療係由1次(NOD)或2次(C57BL/6)利用4,000IU/小鼠之每週治療(在免疫作用當天SC起始)組成。免疫作用後7天(NOD)及21天(C57BL/6)，收集血液，且藉由ELISA量測血清KLH特異性IgG反應。
DP47GS IgG-IL-2阻抑活體內免疫反應之能力支持如下假設：藉由低劑量IL-2誘導之調節T細胞活化產生介導免疫反應之減少之功能性調節T細胞。
***
儘管出於清晰理解之目的藉由圖解說明及實例方式相當詳細地闡述前述發明，但說明及實例不應理解為限制本發明之範圍。本文所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容明確地以引用的方式全文併入 本文中。
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<400> 31
<210> 32
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類IL-2R α亞單位+Avi標簽+His標簽
<400> 32
<210> 33
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴IL-2R-β-Fc(凸起)融合蛋白+Avi標簽
<400> 33
<210> 34
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴IL-2R-β-Fc(凸起)融合蛋白+Avi標簽
<400> 34
<210> 35
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴IL-2R-γ-Fc(孔洞)融合蛋白
<400> 35
<210> 36
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴IL-2R-γ-Fc(孔洞)融合蛋白
<400> 36
<210> 37
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴IL-2R α亞單位+Avi標簽+His標簽
<400> 37
<210> 38
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴IL-2R α亞單位+Avi標簽+His標簽
<400> 38
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 39
<210> 40
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 40
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 41
<210> 42
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 42
<210> 43
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 43
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 44
<210> 45
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 45
<210> 46
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 46
<210> 47
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前導序列
<400> 47

Claims (49)

  1. 一種融合蛋白，其包含(i)包含修飾之免疫球蛋白分子，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比該修飾降低該免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力，及(ii)兩個介白素-2(IL-2)分子。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子係IgG類免疫球蛋白分子、具體而言IgG1亞類免疫球蛋白分子。
  3. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子係人類免疫球蛋白分子。
  4. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子不能特異性結合至抗原。
  5. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子包含基於人類Vh3-23種系序列之重鏈可變區序列。
  6. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：9之該重鏈可變區序列。
  7. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子包含基於人類Vk3-20種系序列之輕鏈可變區序列。
  8. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO：11之該輕鏈可變區序列。
  9. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該Fc受體係Fcγ受體、具體而言人類Fcγ受體。
  10. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該Fc受體係活化Fc受體。
  11. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該Fc受體係選自由FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)組成之群。
  12. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該Fc受體係FcγRIIIa、具體而言 人類FcγRIIIa。
  13. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子包含於該等免疫球蛋白重鏈之329位(EU編號)處之胺基酸取代。
  14. 如請求項13之融合蛋白，其中該胺基酸取代係P329G。
  15. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子包含於該等免疫球蛋白重鏈之234位及235位(EU編號)處之胺基酸取代。
  16. 如請求項15之融合蛋白，其中該等胺基酸取代係L234A及L235A(LALA)。
  17. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該免疫球蛋白分子包含於該等免疫球蛋白重鏈中之該等胺基酸取代L234A、L235A及P329G(EU編號)。
  18. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該等IL-2分子係野生型IL-2分子。
  19. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該等IL-2分子係人類IL-2分子。
  20. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該等IL-2分子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之序列、具體而言SEQ ID NO：3之序列。
  21. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該等IL-2分子係各自於其N端胺基酸處視情況藉助肽連接體融合至該免疫球蛋白分子之該等免疫球蛋白重鏈中之一者之C端胺基酸。
  22. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19之多肽序列。
  23. 一種多核苷酸，其編碼如前述請求項中任一項之融合蛋白。
  24. 一種載體，其具體而言為表現載體，其包含如請求項23之多核苷酸。
  25. 一種宿主細胞，其包含如請求項23之多核苷酸或如請求項24之載體。
  26. 一種產生如請求項1至22中任一項之融合蛋白之方法，其包含如下步驟：(i)在適於表現該融合蛋白之條件下培養如請求項25之宿主細胞，及(ii)回收該融合蛋白。
  27. 一種融合蛋白，其包含(i)包含修飾之免疫球蛋白分子，與不具有該修飾之相應免疫球蛋白分子相比該修飾降低該免疫球蛋白分子對Fc受體之結合親和力，及(ii)兩個介白素-2(IL-2)分子，其係藉由如請求項38之方法產生。
  28. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至22或27中任一項之融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
  29. 如請求項1、2或27中任一項之融合蛋白，其用作醫藥。
  30. 如請求項28之醫藥組合物，其用作醫藥。
  31. 如請求項1、2或27中任一項之融合蛋白，其用於治療或預防自體免疫疾病。
  32. 如請求項28之醫藥組合物，其用於治療或預防自體免疫疾病。
  33. 如請求項31之融合蛋白，其中該自體免疫疾病係選自1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、克隆氏病(Crohn’s disease)及多發性硬化症之群。
  34. 如請求項32之醫藥組合物，其中該自體免疫疾病係選自1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、克隆氏病及多發性硬化症之群。
  35. 如請求項1、2或27中任一項之融合蛋白，其用於治療或預防移植排斥反應或移植物抗宿主疾病。
  36. 如請求項28之醫藥組合物，其用於治療或預防移植排斥反應或移植物抗宿主疾病。
  37. 一種如請求項1至22或27中任一項之融合蛋白的用途，其用於製造用以治療有需要之個體之疾病之醫藥。
  38. 如請求項37之用途，其中該疾病係自體免疫疾病。
  39. 如請求項38之用途，其中該自體免疫疾病係選自1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、克隆氏病及多發性硬化症之群。
  40. 如請求項37之用途，其中該疾病係移植排斥反應或移植物抗宿主疾病。
  41. 如請求項37至40中任一項之用途，其中該個體係哺乳動物、具體而言人類。
  42. 如請求項1、2或27中任一項之融合蛋白，其用於活體外或活體內選擇性活化調節T細胞。
  43. 如請求項42之融合蛋白，其中該活化包含調節T細胞之增殖之誘導及/或調節T細胞中之IL-2受體信號傳導之誘導。
  44. 如請求項42之融合蛋白，其中該用途係在活體外，且該融合蛋白係以約1ng/mL或更小、具體而言約0.1ng/mL或更小之濃度使用。
  45. 如請求項42之融合蛋白，其中該用途係在活體內，且該融合蛋白係以約20μg/kg體重或更小、具體而言約12μg/kg體重或更小、更具體而言約6μg/kg體重或更小之劑量使用。
  46. 一種活體外或活體內選擇性活化調節T細胞之方法，其包含使該等調節T細胞與如請求項1至22或27中任一項之融合蛋白接觸。
  47. 如請求項46之方法，其中該活化包含調節T細胞之增殖之誘導及/或調節T細胞中之IL-2受體信號傳導之誘導。
  48. 如請求項46或47之方法，其中該方法係在活體外，且該融合蛋白係以約1ng/mL或更小、具體而言約0.1ng/mL或更小之濃度使用。
  49. 如請求項46或47之方法，其中該方法係在活體內，且該融合蛋白係以約20μg/kg體重或更小、具體而言約12μg/kg體重或更小、更具體而言約6μg/kg體重或更小之劑量使用。
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