TW201416438A - 牛樟芝菌絲體發酵培養基及其培養方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭露一種牛樟芝菌絲體發酵培養基及應用此牛樟芝發酵培養基的培養方法。其中，牛樟芝菌絲體發酵培養基包含葡萄柚果皮烘乾粉末、蕎麥粉末以及純水。葡萄柚果皮烘乾粉末之重量百分比可為1至17，蕎麥粉末之重量百分比可為30至69，而純水之重量百分比可為30至60。更進一步地說，葡萄柚果皮烘乾粉末係用以作為牛樟芝的粗三□表現量之誘導劑。應用牛樟芝菌絲體發酵培養基的培養方法包含先提供一牛樟芝種菌，再將該牛樟芝種菌接種至前述包含葡萄柚果皮烘乾粉末、蕎麥粉末以及純水之牛樟芝發酵培養基中進行發酵培養以生成牛樟芝菌絲體。

Description

牛樟芝菌絲體發酵培養基及其培養方法

本發明是有關於一種牛樟芝菌絲體培養基及牛樟芝菌絲體培養方法，且特別是有關於一種提升牛樟芝菌絲體粗三萜產量之培養基及使用提升牛樟芝菌絲體粗三萜產量之培養基之牛樟芝菌絲體培養方法。

牛樟芝(Antrodia camphorata)，被坊間稱之為「抗癌靈藥」，其具有提升免疫力和保肝等功能，然而牛樟芝生長緩慢，且僅生長於在台灣保育類植物-牛樟木的中空壁上，截至目前為止，大多數的牛樟芝都是由野外採收而來，因此其價格居高不下。成熟的牛樟芝之生理構造主要分為子實體以及菌絲體，而所謂的菌絲體就類似植物的根部；而子實體就是類似植物的株或果實。菌絲體通常以深層培養發酵液(將醣類、澱粉類溶於水中)，將菌種植於其中，約需6天便能生產完畢，從準備到收成的整個過程，約需20來天。野生的牛樟芝子實體必須生長於樟木上，經過3至5年的成長，最後長成「子實體」，也就是成熟的牛樟芝。以往野生牛樟芝採集不易，大多係以砍伐野生之樟樹來採集貼附於其上之牛樟芝子實體，因此學術上以及業界多以嘗試以人工之方式培育牛樟芝子實體為主。人工培育之牛樟芝子實體需要以木屑、米糠作為培養基，所需成長時間約100天，從準備到收成需要近一年之久。

牛樟芝最具有營養成分的部份為其子實體，然其子實 體大多為野生，即便以人工培育，其所需之培育時間長，因此培育之效果亦不彰。牛樟芝含有許多有效成分，自古以來便作為藥物應用。目前由相關研究發現，成熟之牛樟芝含豐富的多醣體、三萜類、固醇類等等，而且在成熟牛樟芝中，除了可以使免疫力增強，疾病康復力增強等作用外，更對腫瘤有預防及改善的效果。牛樟芝含有許多生理活性成分，如多醣體(polysaccharides)的β-葡聚醣、三萜類化合物(triterpenoids)、固醇類(steroids)、超氧歧化酶(superoxide dismutase；SOD)、腺苷(adenosine)等，其中以多醣體的β-D-葡聚醣和三萜類化合物被視為最重要的生理活性成份，故目前學術上亦或健康食品界中，對於牛樟芝的生理活性成份之研究大多以多以多醣體、三萜類為主。

萜類(terpene)化合物是由碳氫化合物或脂質代謝而產生的，以異戊二烯為單體，分子組成通式為(C₅H₈)n，隨著分子中碳環數目增加，氫原子比例就相對減少，萜類是普遍存在於植物界的化合物，在動物界為數較少，萜類的主要分類法是根據分子中包含異戊二烯單體數目來進行分類，將含有兩個異戊二烯稱為單萜(monoterpene)；含有三個異戊二烯單體稱為倍半萜(sesquiterpene)；含有四個異戊二烯單體稱為雙萜(dieterpene)；含有六個異戊二烯單體就稱之為三萜(triterpene)。更進一步地說，中藥中常用的人參、甘草、地榆等均含三萜，乃因三萜類之藥理作用在臨床上效果非常顯著；三萜類化合物更具有降低肝障礙、抗血小板凝集、抗膽鹼等生理作用。

然而，野生牛樟芝子實體所蘊藏之三萜類較人工培養之牛樟芝菌絲體還來的豐富的多，使得最具營養以及醫藥 價值之三萜類始終難以大量取得或生產，因而讓無論是野生或人工培育之牛樟芝子實體，其價格依舊高居不下。

因此，為解決上述之問題，本發明以蕎麥作為固態培養基進行培養，並藉由誘導劑之添加而提升了人工培育牛樟芝菌絲體的粗三萜產量。

本發明之一態樣是在提供一種牛樟芝菌絲體發酵培養基，其包含葡萄柚果皮烘乾粉末、蕎麥粉末以及純水。其中，葡萄柚果皮烘乾粉末之重量百分比可為1至17，蕎麥粉末之重量百分比可為30至69，而水之重量百分比可為30至60。更進一步地說，葡萄柚果皮烘乾粉末係用以作為牛樟芝的粗三萜表現量之誘導劑。

依據本發明之一實施例，前述之牛樟芝菌絲體發酵培養基，其中蕎麥粉末之重量百分比可為50至55，葡萄柚果皮烘乾粉末之重量百分比可為5至10，而水之重量百分比可為35至45。

依據本發明之一實施例，前述之牛樟芝菌絲體發酵培養基，其中蕎麥粉末之重量百分比可為52.5，葡萄柚果皮烘乾粉末之重量百分比可為7.5，而水之重量百分比可為40。

本發明之另一態樣在於提供一種培養牛樟芝菌絲體之方法，此方法包含：其一，先提供一牛樟芝種菌；其二，再將一牛樟芝種菌接種至前述之牛樟芝菌絲體發酵培養基中進行發酵培養以生成牛樟芝菌絲體。

前述培養牛樟芝菌絲體之方法，其中牛樟芝種菌所屬之菌種為Antrodia cinnamomea，其來源係取自食品工業發展研究所生物資源中心，且菌種之編號為BCRC 35396。

依據本發明之一或多個實施例，培養牛樟芝菌絲體之方法為在16℃至37℃培養25至35天。一實施例中，可在25℃之環境中發酵培養30天。

依據本發明之一實施例，牛樟芝菌絲體發酵培養基為一固態培養基，而固態培養基係置於一錐形瓶中以供培養。除此之外，前述之固態培養基更可為一平板固態培養基，且其可置於一培養皿中培養。

藉此，本發明利用牛樟芝菌絲體進行固態培養，藉由誘導劑的添加，誘導牛樟芝菌絲體改變代謝路徑，生產三萜類化合物，進而提升牛樟芝菌絲體中三萜類產量。更進一步地說，此發明實施例之技術手段可提供牛樟芝相關之保健食品進行開發的參考依據。

請參照第1圖，係繪示本發明之牛樟芝菌絲體培養方法流程圖。

步驟100，先提供一牛樟芝種菌。本發明實施例所使用之牛樟芝種菌為Antrodia cinnamomea，其來源係取自食品工業發展研究所生物資源中心，菌種編號為BCRC 35396。

步驟200，將此牛樟芝種菌接種至本發明實施例之牛樟芝菌絲體發酵培養基中，進行一發酵培養以生成牛樟芝 菌絲體。

牛樟芝菌絲體發酵培養基為一固態培養基或平板固態培養基，包含葡萄柚果皮烘乾粉末、蕎麥粉末以及純水。葡萄柚果皮烘乾粉末之重量百分比可為1至17，蕎麥粉末之重量百分比可為30至69，而純水之重量百分比可為30至60。發酵培養之條件可為在16℃至37℃亦之環境中，於錐形瓶或培養皿中發酵培養30天。

茲以下列試驗例詳細說明本發明，然本發明不侷限於下列試驗例揭示之內容。下列試驗例所述之粗三萜為經萃取後之三萜類化合物。

試驗例1 牛樟芝種菌的製備

本實驗牛樟芝種菌所採用的液態培養基為食品工業發展研究所提供之配方：2%麥精(Malt extract)、2%葡萄糖(Glucose)、0.1%蛋白腖(Peptone)，並且利用0.1 N氯化氫(HCl)和0.1 N氫氧化鈉(NaOH)將pH值調至約5；並以此比例混合於蒸餾水中。接著，以矽膠塞將錐形瓶瓶口塞緊，並放入滅菌釜中滅菌20分鐘〔操作壓力為1.2千克/平方公分(Kg/cm²)，溫度為120℃〕。基礎培養基經滅菌後，將活化後的牛樟芝菌絲體培養皿，切成6個每塊單位面積0.5 cm×0.5 cm單位的菌絲塊，以白金鉤將菌絲塊接種入液態基礎培養基中，並置於25℃、100每分鐘轉數(rpm)的培養箱中培養10天作為牛樟芝種菌。

試驗例2 以平板固態培養之牛樟芝生長曲線

平板固態培養以培養皿進行培養，且培養皿之材質可為塑膠或玻璃。平板固態培養基的配方包含28 g的蕎麥及40%的水。首先，將蕎麥以粉碎機打成粉末狀製成蕎麥粉末，並加入蒸餾水揉成麵糰狀。將配好的平板式培養基放入滅菌釜中滅菌20分鐘(操作壓力為1.2 Kg/cm²，溫度為120℃)。接著，將前述培養10天的液態牛樟芝種菌，利用滅過菌的均質機粉碎，並將牛樟芝種菌濃度之10%接種至平板式固態培養基。培養第15、20、25、30天取樣，收集菌絲體並放入烘箱烘乾，測量菌絲體之菌重。利用粉碎機將烘乾的菌絲體粉碎以利保存，並進行粗三萜產率及產量的分析。所謂產率，即粗三萜於單位菌絲體中之含量比例。

由於固態發酵的菌絲體生長較為緩慢，初期仍看不出任何明顯之變化，故此實驗為從培養第15天開始取樣，每5天取樣一次，並培養至第30天。

由於本實驗採用平板固態培養基進行培養，利用平板固態培養基有別於傳統上使用錐形瓶之固態培養，平板固態培養好處是取樣時可以將菌絲體與基質分離，故非常簡單即可測得菌絲體之菌重。

請參閱第2圖，其繪示不同時間對牛樟芝固態發酵菌絲體菌重的影響之曲線圖。由第2圖得知，菌絲體的菌重於第30天時為最高，菌重為3.86 g，在培養至第25天之後，菌絲體可視為進入指數生長期。

試驗例3 胞內粗三萜產率及產量之測定

取牛樟芝乾菌絲100 mg，加入50%乙醇3 ml，並在超音波震盪內萃取30分鐘，萃取完後以8000 rpm離心5分鐘，過濾萃取液，將殘渣再加入50%乙醇3 ml，並在超音波震盪內萃取30分鐘，萃取完後以8000 rpm離心5分鐘，過濾萃取液，收集濾液共6 ml減壓濃縮至乾燥，將乾燥物以3 ml蒸餾水回溶，並再加入3 ml氯仿在超音波震盪內萃取30分鐘，取下層液體後加入3 ml的5% NaHCO₃，並在超音波震盪內萃取30分鐘，之後調整液體pH至2.5到3之間，取下層液體減壓濃縮至乾燥，加入2 ml飽和乙醇，在波長245 nm下測其吸光值。

請參閱第3圖及下列表一，其中第3圖係繪示培養不同時間對牛樟芝固態發酵菌絲體粗三萜產量影響之曲線圖。如第3圖及下列表一所示，當牛樟芝菌絲體在培養第20天之後，粗三萜產率持續增高，此現象是因為三萜類化合物為二次代謝產物，當菌絲體逐漸老化時，會開始釋放三萜類化合物，而二次代謝產物往往對於菌絲體本身具有毒性，故這些二次代謝產物亦促進年輕的菌絲體逐漸老化，並迫使之代謝出更多二次代謝產物。據此，當培養的天數越久，三萜類化合物就會越多。因此菌絲體在培養第30天時粗三萜產率最高，為9.66 mg/g乾燥重量(Dry Weight,DW)。

將粗三萜產率換算成粗三萜產量(粗三萜產率×菌種=粗三萜產量)即可得知，在培養第30天的菌絲體，由於其 粗三萜的產率很高，故產量仍為最高。原因乃因牛樟芝菌絲體培養到第30天時，菌絲體開始老化，故釋放出三萜類化合物，粗三萜產量為37.27 mg。

試驗例4 平板固態培養添加誘導粗三萜表現量之不同誘導劑

請參照第4圖及下列表二，其中第4圖係繪示不同誘導劑對牛樟芝固態發酵菌絲體菌重以及粗三萜之影響之長條圖。平板固態培養以玻璃培養皿進行培養，其培養基的配方為：28 g的蕎麥、2 g的誘導劑以及40%的水。待測誘導劑種類分別為：葡萄柚果皮烘乾粉末、檸檬果皮烘乾粉末、柳丁果皮烘乾粉末及橘子果皮烘乾粉末。

前述之平板固態培養共分為5組，分別為：取自試驗例1之條件下培養之牛樟芝菌絲體(未添加誘導劑)的控制組、添加葡萄柚果皮烘乾粉末之葡萄柚組、添加檸檬果皮烘乾粉末之檸檬組、添加柳丁果皮烘乾粉末之柳丁組、添加橘子果皮烘乾粉末之橘子組。

在如前述試驗例2及試驗例3所測定之粗三萜產率最佳天數進行取樣，收集牛樟芝菌絲體並放入烘箱烘乾，測量牛樟芝菌絲體之乾燥重量(DW)。利用粉碎機將烘乾的牛樟芝菌絲體打碎，並利用打碎的牛樟芝菌絲體進行粗三萜產率分析。

由第4圖所示，牛樟芝菌絲體總重量，檸檬組為最高，為4.29 g，其次依序是控制組的3.86 g、橘子組的3.24 g、柳丁組的2.9 g、而葡萄柚組的菌重是最低的，僅有2.8 g。然而，葡萄柚組的牛樟芝菌絲體在培養到第30天時，其粗三萜產率最高，為36.16 mg/g DW，而控制組的粗三萜產率則為9.66 mg/g DW，故葡萄柚組之牛樟芝菌絲體培養到第30天時，其粗三萜產率為控制組的3.74倍。

若將粗三萜產率換算成產量，葡萄柚組的粗三萜產量為最高，其值為101.82 mg，而控制組則為37.27 mg，故葡萄柚組的菌絲體培養到第30天的粗三萜產量為控制組的2.73倍。

由第4圖以及下列表二所示，葡萄柚組的菌重雖然少，但粗三萜產率為最高。由於菌絲體受到葡萄柚誘導劑的誘導而產出大量粗三萜，而三萜類為二次代謝產物；二次代謝產物往往對於菌絲體本身具有毒性，故這些三萜類化合物亦促進年輕的菌逐漸老化，並迫使之代謝出更多的三萜類化合物，藉此提高粗三萜產率。

檸檬組的菌重雖然為最高，但其粗三萜於單位菌絲體之產率並不顯著，是因為檸檬誘導劑雖些微影響牛樟芝菌絲體三萜類化合物的代謝路徑，然其改變仍不如葡萄柚組來得明顯。檸檬組之菌絲體僅只代謝出小量的三萜類化合 物，而這些小量的二次代謝產物不足以讓菌絲體老化或死亡，因此不產生更多的粗三萜。

同樣地，柳丁誘導劑也改變了牛樟芝菌絲體的三萜代謝路徑，使得其菌絲體代謝出三萜類化合物，其誘導效果較檸檬組來得佳，故菌重相較檸檬組少。柳丁組之粗三萜產率相較檸檬組高，而柳丁誘導劑雖然影響牛樟芝菌絲體的三萜代謝路徑，但仍不如葡萄柚組的改變來得明顯。

橘子組的情形與檸檬組之結果近似，皆只些許影響牛樟芝菌絲體三萜的代謝路徑，其菌絲體皆只代謝出小量的三萜類化合物，而這些小量的二次代謝產物不足以讓菌絲體老化或死亡，故與葡萄柚組和柳丁組相比，菌重較重，但粗三萜產率卻較少。

相較之下，未添加誘導劑的控制組，雖然菌重比葡萄柚組、柳丁組及橘子組來的高，但其粗三萜產率都遠比具有誘導劑的組別還要低，因此證明控制組的菌絲體尚未老化，粗三萜含量依舊稀少。

綜上所述，誘導牛樟芝菌絲體改變其三萜代謝路徑效果最顯著者為葡萄柚組，其次依序分別是：柳丁組、檸檬組以及橘子組。

由此可知，以葡萄柚為誘導劑，對於改變牛樟芝菌絲體的三萜代謝路徑的成效是顯著的，因此以下之試驗例皆係以葡萄柚果皮烘乾粉末作為誘導劑。

試驗例5 平板式固態培養誘導式培養基之誘導劑誘導牛樟芝粗三萜產率之最佳濃度測定

請參照第5圖及下列表三，其中第5圖係繪示葡萄柚果皮粉末誘導劑之添加量影響牛樟芝固態發酵菌絲體菌重以及粗三萜表現量之長條圖。平板式固態誘導式培養基以培養皿進行培養，且培養皿可為塑膠或者玻璃，平板式固態誘導式培養基的配方為28 g的蕎麥、0.5 g、1 g、2 g、4 g或8 g的誘導劑以及重量百分比40的水。依照前述試驗例3之第3圖所顯示之粗三萜產率最佳天數為30天，因此30天時取樣，並收集牛樟芝菌絲體並放入烘箱烘乾以及測量菌絲體乾重。接著，利用粉碎機將烘乾的發酵物打碎進行粗三萜產率以及產量的分析。

如前述試驗例4，以葡萄柚果皮為誘導劑，對於改變牛樟芝菌絲體的三萜代謝路徑的成效是顯著的，因此以下試驗例以葡萄柚果皮烘乾粉末作為誘導劑，藉以探討多少 濃度的誘導劑最有利於牛樟芝菌絲體影響其三萜代謝路徑，使其在培養至第30天的三萜類化合物產率及產量最高。

由第5圖及下列表三可以得知，當葡萄柚誘導劑為8 g時，牛樟芝菌絲體之菌重為最重，為6.04 g，其次依序為添加1 g誘導劑的5.30 g、添加0.5 g誘導劑的5.15 g、控制組的3.86 g、添加4 g誘導劑的3.06 g以及添加2 g誘導劑的2.82 g。

添加4 g葡萄柚誘導劑的牛樟芝菌絲體，其粗三萜產率是最高的，為47.10 mg/g DW，而控制組僅只有9.66 mg/g DW；添加4 g葡萄柚誘導劑的牛樟芝菌絲體在培養至第30天時的粗三萜產率為控制組的4.88倍。其次之粗三萜產率由多到少依序為添加2 g誘導劑的36.16 mg/g DW、添加8 g誘導劑的27.74 mg/g DW、添加1 g誘導劑的15.48 mg/g DW以及添加0.5 g誘導劑的4.27 mg/g DW。

由於添加8 g葡萄柚誘導劑的牛樟芝菌絲體菌重為最高，因此換算成粗三萜產量後，添加8 g葡萄柚誘導劑的粗三萜產量為最高。添加8 g葡萄柚誘導劑的粗三萜產量為167.47 mg，而控制組僅只有37.27 mg，故添加8 g葡萄柚果皮烘乾粉末作為誘導劑培養至第30天的牛樟芝菌絲體粗三萜產量為控制組的4.49倍。

由第5圖以及表三得知，當葡萄柚果皮烘乾粉末作為誘導劑，並添加0.5 g時，牛樟芝菌絲體之菌重比控制組重，但粗三萜產率較控制差距不大，因此添加葡萄柚誘導劑雖然有助於菌絲體的生長和三萜類化合物的代謝，但因誘導劑添加的量過少，而使得被添加誘導劑之培養基所培養的牛樟芝菌絲體之培養初期，其被誘導之粗三萜表現量過低，使牛樟芝菌絲體不進入老化、催熟之階段，而無法表現更大量的粗三萜。

當誘導劑添加量增加到1 g時，粗三萜產率明顯比控制組高，其產率為15.48 mg/g DW。從量測到的菌重數據中得知，添加1 g葡萄柚誘導劑的菌重也比控制組重，為5.3 g，而控制組則為3.86 g，因此得知葡萄柚誘導劑增加到1 g時，誘導劑添加量已經足以讓代謝路徑發生變化，因此可以代謝出比控制組更多的三萜類化合物，但菌重依然比控制組重，此現象是因為藉誘導劑而誘導之的粗三萜 之量還不足以毒害其他牛樟芝菌絲體迫使其菌重下降。換句話說，牛樟芝菌絲體部分，不全然進入老化、催熟之階段，因此無法藉由大量的催熟以及老化表現出更大量的粗三萜。

誘導劑之添加量增加到2 g時，粗三萜產率更顯著的上升，其產率上升至36.16 mg/g DW，且菌重明顯的下降至2.8 g。藉此推斷，葡萄柚誘導劑添加量增加到2 g時，因為誘導劑改變牛樟芝菌絲體之三萜代謝路徑的效果又更加顯著，粗三萜產率皆比添加0.5 g誘導劑、1 g誘導劑來得高。誘導劑添加量增加到2 g，其菌重相對少，乃係因為牛樟芝菌絲體受到誘導劑而誘導出來的粗三萜類化合物較多，粗三萜屬二次代謝產物，而二次代謝產物往往對於菌體本身具有毒性，故此條件下所誘導並表現出之粗三萜足以讓牛樟芝菌絲體的年輕菌絲體催熟、老化及死亡，而產生更多的粗三萜。

當誘導劑添加量增加到4 g時，粗三萜產率又比前述添加0.5g、1g、2g誘導劑之培養條件都還要多，其產率上升至47.10 mg/g DW，是控制組的4.88倍，且其菌重與添加2 g誘導劑的菌絲體相差不遠，故可得知葡萄柚果皮烘乾粉末誘導劑添加量增加到4 g時，4g誘導劑改變牛樟芝菌絲體之三萜代謝路徑的效果較添加2 g誘導劑更為顯著。此條件所培養出之牛樟芝菌絲體，其整體菌重與添加0.5 g及1 g誘導劑相比較少，是因為牛樟芝菌絲體受到誘導劑而誘導出來的粗三萜產率較高，使牛樟芝菌絲體的年輕菌絲體快速催熟並老化死亡。藉此使牛樟芝菌絲體代謝出更多的粗三萜。

更進一步地使誘導劑之添加量增加到8 g時，粗三萜於單位菌絲體之產率反而比添加4 g誘導劑還要少，僅有27.74 mg/g DW，而菌重卻比添加4 g誘導劑多，為6.04 g，因此若添加過多的誘導劑，反而會嚴重影響牛樟芝菌絲體的生長速率。

更進一步地說，縱然誘導劑可以改變牛樟芝的代謝路徑，進而讓牛樟芝菌絲體之菌重和粗三萜於單位菌絲體之產率都增加，但當誘導劑在培養基中的比例過高時，會嚴重破壞原本培養基的配方。8 g之誘導劑的添加換算為相對培養基之重量百分比更高達22.2%，使得培養基當中的碳源及氮源(來自於蕎麥粉末)的比例驟然下降，而讓菌絲體之生長速度減緩，所以雖然牛樟芝菌絲體培養到了第30天，牛樟芝菌絲體仍處於生長期而尚未老化，因此其菌重比添加4 g誘導劑還重，粗三萜產率卻較低。

添加8g誘導劑之培養基所培養之牛樟芝菌絲體之總菌重換算成其粗三萜之整體產量，其產量為167.47mg。然而，整體而言，添加8g誘導劑所培養之牛樟芝菌絲體之粗三萜產率反而比添加4 g誘導劑還要低。

綜上所述，添加4 g葡萄柚烘乾粉末作為誘導劑，其所產生之粗三萜產率為最高，但若以其整體菌重將粗三萜於單位菌絲體之含量(產率)換算為粗三萜之產量，則是以添加8 g葡萄柚烘乾粉末作為誘導劑之誘導效果最為顯著。

試驗例6 固態培養之牛樟芝菌絲體與野生牛樟芝子實體三萜類化合物比較

先前有研究指出，利用牛樟芝子實體分離的10種化合物：5種麥角甾烷三萜類(ergostanes)：牛樟芝酸(antcins)C、牛樟芝酸K、樟菇酸(zhankuic acids)A、樟菇酸B、樟菇酸C、4種羊毛甾烷三萜類(lanostanes)：硫絢孔菌酸(sulphurenic acid)、去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)、齒孔酸(eburicoic acid)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)，和1種單苯基類(monophenyl)：4,7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯並二氧雜環戊烯(4,7-dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole)當標準成分，可比較天然牛樟芝子實體和人工培養菌絲體的成分差異。其中，天然牛樟芝子實體，可檢測出上述10種三萜類化合物(粗三萜)。然而，天然、人工固態或液態培養之菌絲體，只能產生上述4種羊毛甾烷三萜類和1種單苯基類化合物，無法產生5種麥角甾烷三萜類，係因牛樟芝產生麥角甾烷三萜類與子實體形成有關，而與子實體生長的基質無關(Chang et al.2011.Differentiation of mycelia andbasidiomes of Antrodia cinnamomea using certain chemical components.Taiwan J For Sci 26(2)：125-33)。

第6a-6c圖分別為野生牛樟芝子實體、蕎麥平板式固態培養和添加4 g/plate葡萄柚果皮粉末並以蕎麥為基質的平板式固態培養之三萜類化合物HPLC圖譜。請同時參照下列表四。由第6a圖以及下列表四得知，野生牛樟芝子實體可檢測出上述10種三萜類。

第6b圖的HPLC圖譜，是單純以蕎麥作為基質平板式固態培養(未添加誘導劑)所能夠偵測到的三萜類化合物，圖中以及下列表四顯示前述野生牛樟芝子實體含有的10種三萜類於第6b圖的HPLC圖譜中，因三萜類含量過太低，僅能夠偵測到4種，其餘6種三萜類化合物無法檢出。

由第6c圖的HPLC圖譜以及下列表四明顯得知，透過單位培養基添加4 g(4g/plate)之葡萄柚果皮粉末的蕎麥平板式固態培養，三萜類種類大量增加，含量也大幅的提升，因此證明本發明之此種培養方式確實可大幅提升牛樟芝有效三萜類成份。而且這10種三萜類實質上除了硫絢孔菌酸之外皆可偵測到，尤其是代表牛樟芝子實體形成有關的5種麥角甾烷三萜類均存在HPLC圖譜中。因此可以證明，葡萄柚果皮粉末添加的牛樟芝平板式固態培養，在短時間(30天)所得到的三萜類化合物與野生牛樟芝子實體實質上相同。換句話說，此培養方式之牛樟芝菌絲體可得到與野生牛樟芝子實體成分含量極為接近的功效。

由上述本發明實施方式可知，應用本發明具有下列優點：本發明選擇配合牛樟芝的固態培養，是因為其優於使用液態培養，而其好處為：

1.固態發酵的基質通常是天然物質，例如：穀類、大豆、農業的生物量、固體廢棄物等，而無需使用化學合成之溶劑而更為環保。

2.固態培養之基質床攪拌非常困難，某些產物的活性對剪應力非常敏感，一般培養之環境以靜態為佳，而固態培養之方式乃屬於靜態環境之培養，不會因為液態培養時，其流動之環境而造成實驗之誤差及或增加其他之變因。

3.因為細菌的生長與培養環境之含水量高度相關，因此含水量較液態培養低之固態發酵較不易受到細菌之污染，而造成實驗上之誤差或準確度。

4.固態發酵的填充容積比液態深層發酵高，因為固態發酵水含量低。

5.牛樟芝菌絲體從固態培養中取得之產率較自液態 培養中取得的高，使得牛樟芝菌絲體的回收成本低。

6.使用固態培養只需使用要少量的溶劑。

7.發酵培養過後的殘餘物處理極簡易；發酵殘餘物的水含量很低，可將之乾燥做為動物飼料或肥料，使得整個實驗流程不會增加多餘的實驗廢料而更環保。

8.固態基質的表面積大，可促進熱傳導與氧氣和二氧化碳的氣體交換。

此外，本發明更使用平板式之固態培養，是因為當蕎麥粉與水混合後，可以揉成麵糰狀，其緻密度高，牛樟芝菌絲體不易往下生長，而只能長在基質表面上，因此牛樟芝的菌絲體在取樣時很容易就可將菌絲體與基質分離，故分析其生理活性時可以分析到完整的菌絲體，而非菌絲體與基質的混合物。

本發明利用前述之牛樟芝菌絲體進行平板固態培養，並結合誘導劑(葡萄柚果皮烘乾粉末)的添加，使得牛樟芝菌絲體之代謝路徑改變而大量生產三萜類化合物，進而提升牛樟芝菌絲體中粗三萜的產量。藉此，無需再自天然且數量稀少的牛樟芝子實體當中萃取具有諸多營養價值的粗三萜，而只需以人工的方式培養牛樟芝菌絲體，並且以前述添加誘導劑的方式即可適當的獲得高產量之粗三萜，且以人工誘導方式獲得之粗三萜藉由第6a-6c圖及表四的HPLC分析之資訊可得知其主成份與天然的牛樟芝子實體相同。更進一步地說，此發明未來可望提供牛樟芝相關之保健食品或相關中醫藥品進行開發的參考依據。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限 定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

100‧‧‧步驟

200‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖係繪示本發明之另一態樣之牛樟芝菌絲體培養方法流程圖。

第2圖係繪示不同培養時間之牛樟芝固態發酵菌絲體的菌重變化曲線圖。

第3圖係繪示不同培養時間之牛樟芝固態發酵菌絲體粗三萜產量變化之曲線圖。

第4圖係繪示不同誘導劑影響牛樟芝固態發酵菌絲體菌重以及粗三萜產率、產量之之長條圖。

第5圖係繪示葡萄柚果皮烘乾粉末誘導劑之添加量影響牛樟芝固態發酵菌絲體菌重以及粗三萜產量、產率之長條圖。

第6a圖為野生牛樟芝子實體的粗三萜HPLC圖譜。

第6b圖為蕎麥平板固態培養至第30天的牛樟芝菌絲體之粗三萜HPLC圖譜。

第6c圖為添加4 g葡萄柚誘導劑於蕎麥平板固態培養至第30天的牛樟芝菌絲體之粗三萜HPLC圖譜。

100‧‧‧步驟

200‧‧‧步驟

Claims (13)

1. 一種牛樟芝菌絲體發酵培養基，其包含：重量百分比1至17之葡萄柚果皮烘乾粉末，作為誘導牛樟芝菌絲體的粗三萜表現量之誘導劑；重量百分比30至69之蕎麥粉末；以及重量百分比30至60之水。
2. 如請求項1之牛樟芝菌絲體發酵培養基，其中該蕎麥粉末之重量百分比為50至55。
3. 如請求項1之牛樟芝菌絲體發酵培養基，其中該葡萄柚果皮烘乾粉末之重量百分比為5至10。
4. 如請求項1之牛樟芝菌絲體發酵培養基，其中該水之重量百分比為35至45。
5. 如請求項1之牛樟芝菌絲體發酵培養基，其中該蕎麥粉末之重量百分比為52.5。
6. 如請求項1之牛樟芝菌絲體發酵培養基，其中該葡萄柚果皮烘乾粉末之重量百分比為7.5。
7. 如請求項1之牛樟芝菌絲體發酵培養基，其中該水之重量百分比為40。
8. 一種培養牛樟芝菌絲體之方法，包含：提供一牛樟芝種菌；以及接種該牛樟芝種菌至請求項1所述之該牛樟芝菌絲體發酵培養基中，進行一發酵培養以生成牛樟芝菌絲體。
9. 如請求項8之培養牛樟芝菌絲體之方法，其中該牛樟芝種菌所屬之一菌種係為Antrodia cinnamomea。
10. 如請求項8之培養牛樟芝菌絲體之方法，其中該發酵培養為在16℃至37℃之環境中發酵培養25至35天。
11. 如請求項8之培養牛樟芝菌絲體之方法，其中該發酵培養為在25℃之環境中發酵培養25至35天。
12. 如請求項8之培養牛樟芝菌絲體之方法，其中該發酵培養為在16℃至37℃之環境中發酵培養30天。
13. 如請求項8之培養牛樟芝菌絲體之方法，其中該發酵培養為在25℃之環境中發酵培養30天。