TW201229058A - Single unit ion exchange chromatography antibody purification - Google Patents

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201229058 m 六、發明說明： 【^"明戶斤屬軒々貝】 本發明有關於一種以單一單元純化抗體之方法及有關 於可以用於此方法之設備。 【先前4^:名好；3 用於製藥應用中以細胞培養產生之單株抗體之純化， 係一牽涉到大量步驟的過程。該等抗體基本上要沒有任何 潛在之有害汙染物，如蛋白質及DNA，其源自於產生抗體 之細胞、培養基成分如胰島素、PEG醚類及消泡劑，以及 任何潛在出現的傳染性物質，如病毒和病原性蛋白顆粒。 ， 用於自會產生這些蛋白質之細胞培養中純化抗體的典 型方法被描述於BioPharm International June 1，2005，‘‘下游 ' 加工單株抗體：從高稀釋到高純度”。 因抗體由細胞產生，如融合瘤細胞或轉型宿主細胞(如 中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、小鼠骨髓瘤衍生之NS0細胞、幼 倉鼠腎細胞及人類視網膜衍生之PER.C6®細胞），特定細胞 物質將必須從細胞培養液中移除，較佳為在純化過程之早 期。過程的此部分在此被稱為“淨化”。隨後，或做為淨化 步驟之一部份，抗體被粗純化至至少約80%，通常伴隨著 一結合加洗脫之色層分析法步驟(在IgG之例，通常使用固 定的蛋白質A)。此步驟，在此稱為“擷取”，不僅導致初步 相當純化的抗體，亦可能導致量的相當程度減少及因此產 物濃度的減少。用於擷取的另擇方法如膨脹床吸附技術 (EBA) ’ 2相液體分離(使用如聚乙二醇）或以溶致鹽（如硫酸 201229058 銨）之分段沈澱。 在淨化和擷取後，抗體被進—步純化。一般而言，在 擷取後至少需要2色層分析步驟以有效移除殘餘的雜質。搁 取之後之色層分析步驟通常被稱為中間純化步驟，而最終 色層分析步驟一般而言被稱為精鍊步驟。一般而言這些步 驟各以單-單元操作在批次料下進行，且這些步驟中至 少一步驟是在結合加洗脫模式下進行。此外，各色層分析 步驟就如pH値、傳導性等方面需要特定負載條件。因此， 在各色層分析步驟前需要進行額外的處理以調整負載至所 需條件。所有提及的這些都使得過程勞心費時。在這些步 驟過程中一般而言被實質上移除的雜質係在過程中衍生的 汙染物，如宿主細胞蛋白質、宿主細胞核酸、培養基成份(若 有）、蛋白質A(若有）、内毒素(若有），及微生物(若有）。近 期專利公開案中已描述了許多此等純化抗體的方法。 WO 2010/062244。該發明有關於用於分離及純化蛋白 質如單株抗體之水狀二相萃取增強沉澱方法。接著進一步 純化抗體被分述於兩種選擇中：（1)在結合及洗脫模式下之 陽離子交換色層分析法，接著在流通模式下之陰離子交 換，或(2)首先在流通模式下多重模態色層分析法，接著在 流通模式下陰離子交換。 WO 2010/048183。該發明有關於藉由在酸性pH下連續 離子交換及HIC色層分析法來移除抗體之HCP。 WO 2009/138484。該發明發明說明及申請專利範圍首 先閱讀起來不甚清楚。此發明有關於自一混合物中純化抗 4 201229058 體，其藉由擷取抗體至蛋白質A(衍生的）管柱上並接著自此 官柱釋放該等抗體。此後者的含抗體物質可被進一步純 化，舉例而言，藉由連續陰離子色層分析法及陽離子色層 分析法。 EP 2 027 921。該發明有關於基於聚合一級胺之用於膜 離子交換色層分析法之介質，以及其等在純化，舉例而言， 抗體，方面之用途。 WO 2005/044856有關於自一抗體製備物中移除高分子 量聚集體，其使用一羥基磷灰石樹脂選擇性地與陰離子交 換色層分析法組合。 , W〇2008A45351描述了隨後的皆在流通模式下的陰離 子交換色層分析法及陽離子交換色層分析法。 上述方法的缺點為，製備時間長，高可變成本(例如， 由於結合加洗脫步驟本質上需要大管柱容量，因此需要大 量的昂貴樹脂）及高固定成本（由於人力成本）。 C發明内容;3 本發明之一具體實施例，可達到非常有效移除細胞培 養所產生之抗體之殘餘雜質，其藉由使用串行，内聯(in_line) 之陰離子父換色層分析法(aex)及陽離子交換色層分析法 (CEX)，兩者皆在流通模式下，且較佳地以—單一單元操作 來運作。因此，在AEX色層分析步驟後及CEX色層分析步 驟前内聯混合適合的緩衝液，以用來依用於CEX色層分析 法之pH及傳導性調整正確的條件。 根據本發明之又一具體實施例，可達到非常有效移除 201229058 細胞培養所產生之抗體之殘餘雜質，其藉由使用串行，内 聯陽離子交換色層分析法(CEX)及陰離子交換色層分析法 (AEX)，兩者皆在流通模式下，且較佳地以一單一單元操作 來運作。因此’在CEX色層分析步驟後及ΑΕχ色層分析步 驟前内聯混合適合的緩衝液，以絲依用於ΑΕχ色層分析 法之pH及傳導性調整正確的條件。 此新顆方法之優點為，相當程度地減少了操作時間及 人力®此降低了操作成本。此外，需要較小的（因此較不 貴的）色層分析衫，因為所有單元操作都在流通模式下， 其僅需要足夠結合雜質之容量，而非結合產物。 因此可S義本發明為—種從產生自_生物反應器之 細胞培養液中純化抗體的方法，其至少包含中間純化及精 鍊之步驟，其中該新_化步驟包含結合的串行内聯之 AEX及CEX色層分析法。此可由兩個可選擇方法之一來進 行⑴陰離子交換(織）色層分析法產出做為流通過部分的 一分離混合物，接著串行内聯陽離子交換(CEX)色層分析法 產出做為机通過部分的一經純化之抗體製備物，或⑺陽離 子交換(CEX)色層分析法產出做為流通過部分的 一分離混 :物’接者串打内聯陰離子交換(Α Ε χ)色層分析法產出做為 抓通過部分的-域化之抗難備物，且其巾從這兩個可 選擇方法之-導致的該經純化之抗體製備物係經至少一進 一步純化步驟。 ，她観/⑷351亦描述了接續的陰離子交換色層分析 法及陽離子父換色層分析法，皆以流賴式錄意次序。 6 201229058 然而，其揭露内容與本發明不同，即在於為第二分離步驟 而準備的來自第一分離步驟之分離混合物的調節係在離線 式（off-line)下進行的。令人驚異的是，根據本發明，兩者 色層分析步驟之整合可被如此優異地達成’即兩者離子交 換流程可互為調整且同時間可準確進行用於第二色層分析 步驟之緩衝液條件的調整，因此達成聚集體完全清除。 在本發明内文中，“分離混合物”指的是依據本發明來 自第一離子交換步驟之溶液，而“經純化之抗體製備物，’指 的是依據本發明來自第二離子交換步驟之溶液。意在本申 請案全文中遵守此術語。 在第一離子交換色層分析步驟之前，一般而言由生物 反應器產生的細胞培養液會被淨化（亦即’沒有任何細胞物 質，如整個細胞及細胞碎片）。 又，在第一離子交換色層分析步驟之前，可添加一調 節溶液至細胞培養液或含抗體溶液，以確保第一離子交換 步驟在pH及傳導性方面的最佳條件。 依據本發明方法之一特定具體實施例中，牽涉到以— 單一單元操作來進行之結合的AEX及CEX之色層分析法。 在此“流通過部分”意指被裝載之含抗體部分的至少— 部分’其以實質上與洗脫液相同之速度離開色層分析管 柱。此部分在洗脫期間係實質上不停留在管桎上。因此選 擇了讓雜質而非抗體結合至陰離子交換物質及陽離子交換 物質的條件。 使用接續的色層分析法以陰離子交換及陽離子交換交 201229058 互作用色層分析》去來從$白質混合物中分離蛋白質，已被 揭露’舉例而言’如前述之w〇2009/138484。其中兩個離 子父換步驟為兩個獨立的步驟進行。 已發現’就大規模製造的目的而言，本發明方法（以流 通模式）提供了較前述揭露之以結合及洗脫所欲抗體的方 法更快速的分離法。 有利的是’含抗體之分離混合物係被以足量溶液補 充’以調整pH及傳導性，供在本發明第二離子交換色層分 析步驟有最佳成果。 令人驚異的是，發現在進入第二離子交換步驟前以内 聯調節液體可達到非常優異的分離結耒。 當AEX色層分析法為第一步驟’一般而言，在稍微鹼 性pH及低傳導性下進行ΑΕχ。我們發現，CEX在流通模式 下，於稍微酸性條件及低傳導性下，有最佳結果。所以， 因此在將進行CEX色層分析法前，來自ΑΕχ色層分析法之 流通產物係被以酸性溶液内聯補充，該酸性溶液降低至 所欲値並調節或維持最佳傳導性。任何可造成充分pH降低 及傳導性調整的溶液或緩衝液可用於為此。較佳地，pH値 被校正至至少約3.5，更佳地至至少約4，更佳地至至少約 5。較佳地’ pH値被校正至最高pH値約7。傳導性較佳地被 維持在或校正至至少約2mS，且最高約1〇mS。較佳地該 溶液含有一酸性成份，其僅需要少量的補充而使產物之稀 釋最小化》該酸性成份可選自於化合物如檸檬酸(或其二氫 鈉或氫二鈉或鉀鹽）、磷酸（或其二氫鈉或氫二鈉或鉀鹽）、 201229058 醋酸、氫氯酸、硫酸。 較佳地，在此财以足hpH及料性難溶液補充 該分離混合物係該單一單元操作的一部分，舉例而言，在 Εχ色層刀析步驟則藉由在此過程流中内聯混合所提及的 酸性溶液(舉例而言，在一混合室中）。 ‘足量酸性紐，’在此是指前述溶液足夠至能導致吸附 大部分相關雜質至啦物質，但其量係夠低而不會導致連 接產物。就各純化過程，酸性成份最佳的量及較佳的種類 必須個別建立。 另擇地，ΑΕΧ及CEX之次序可被改變。在此例，程序 .以CEX色層分析法單元開始，而來自此CEx色層分析法 i 之含抗體驗舰pH及料性之前懸錢在此流通模式 CEX單元中會進行最錢化…般而言此會是在韻酸性 PH及低傳導性。接續的ΑΕχ步驟必須在用於特定步驟的最 佳純化條件下進行。較佳地’ ρΗ値被校正至最高約9，更佳 地至最高約9.5。較佳地，ΡΗ値被校正至至少約ρΗ7。傳導 性較佳地被維持在或校正至至少約2mS，且最高約1〇瓜§。 —般而言此會是在稍微鹼性pH及低傳導性。為此，在cEX 後及ΑΕΧ色層分析法前的含抗體溶液係被以足量溶液内聯 補充，以調整pH及傳導性而在ΑΕΧ有最佳成果。因此，在 實際應用中該來自C EX色層分析法之流通產物係被以一鹼 性溶液内聯補充，以增加分離混合物之？11至所欲値並調整 或維持AEX色層分析法單元操作之最佳傳導性。任何可造 成充分pH降低及傳導性調整的溶液或緩衝液可用於為此β 201229058 較佳地，雜液切—祕切 使產物之稀釋最小化。此類 、僅&要夕量的補充而 鈉或氫氧化鉀，（或其1鈉p份的某些例子為氫氧化 胺甲烧，但任何其他在本技:戈卸參他甲基) 在此被使用。 5中的已知驗性成份都可 皇二色層分析法可在-aex單元中進行， 塊材樹脂之傳統填充床式管柱、一含單 適色層分析介質的徑向管柱、-吸 附膜=凡，或任何其他在本技術領域中的已 Π能作用為陰離子交換劑，子交換色層X 在AEX官柱中，色層分析材料可 π著的微粒支持材料。膜型陰離子交換二^ =成，該支持材料是讓強或弱陽離子配體附著的= 多薄片的形式。該支捭鉍钮 ^ 卞古㈣“ 成為有機材料或無機材料 2有機及無機材料之混合物。適合的有機材料為璦脂糖為 2介質及W丙稀酸醋。適合的無機材料為二氧化石夕， :金屬卿式陰離子交換劑之組成可為含纖配 體之親水性聚_1合㈣AEX配體係基於，舉例而古， 四級胺類。適合的弱概配體«於，舉例㈣，一級。、 -級或_級胺類或任何其他在本技術領域令的已知適合的 配體。 依據本發明⑽色層分析法可在一 CEX單元中進行， 其㈣實施例可為—含樹脂之傳統管柱一基於單塊材料 之5柱、—含合適色層分析介質的徑向管柱、-吸附膜單 10 201229058 元，或任何其他在本技術領域中的已知具適當配體能作用 為陽離子交換㈣之騎子交換色層分躲I置。在⑽ 管柱中’色層分析材料可作為讓CEX配體附相微粒支持 材料。膜型色層分料置由-支騎料所構成，該支持材 料是讓CEX配體附著的—或多薄片的形式。該支持材料之 組成可為有機材料或無機材料或有機及無機材料之混合 物。適合的有機支持㈣之組成可為，舉例而言，親水性 碳水化合物(如交聯_糖，纖維素或㈣聚糖)或合成共聚 物材料(如聚(院天冬醯胺)(p〇ly(alkylaspartamide))，甲基丙 烯酸-2-¾基乙缺二甲基丙_伸乙§旨之共聚物，或酿化 多胺）。適合的無機支持材料為，舉例而言，二氧化石夕、陶 究及金屬冑形式CEX之組成可為含cex配體之親水性 聚醚礙。適合的CEX配體之例子為，顧、羧酸、次膊酸 或任何其他在本技術領域巾的已知功用為強或弱適合陽離 子交換劑的配體。 可依本發明之方法被純化之抗體為，具等電位pH値6.0 或更问’較佳地7.0或更高，更佳地7 5或更高之抗體。這些 抗體可為G、八或]^麵免疫球蛋白。該等抗體可為人類， 或非人類(如喷齒動物）或嵌合體(舉例而言“人纟貞化的，，)抗 體’或可為上述免疫球蛋白之子單元 ，或可為雜交蛋白， 其由免疫球蛋白部分及一源自於或相同於另一蛋白質 (非免疫球蛋白)之部分所構成。 7人驚異的是’來自結合的AEX及CEX色層分析法的 抗體物質通常具有非常高的純度(指蛋白質含量），其為至少 201229058 98%，較佳地至少99%，更佳地至少99 9%，甚至更佳地至 少 99.99%。 本發明陰離子交換色層分析步驟較佳地在中性或微驗 性pH進行。其會移除負電雜質如DNA、宿主細胞蛋白質、 蛋白質A(若有）、病毒(若有）、蛋白膠培養基成份如胰島素 及類胰島素生長因子(若有）。 在陽離子交換色層分析步驟期間，主要留下的大型分 子雜質（主要為產物聚集體)利用以下性質會被移除，即應用 正確的pH及傳導性條件，#產物流經時雜f會結合至色層 分析裝置。 接著’（高度）經純化之抗體製備物，一般而言，將被以 超濾及濾洗處理，以移除所有殘餘之低分子量雜質，以最 終配方緩衝液取代緩衝液並調整所欲最終產物之濃度。 再者，經純化之抗體製備物，一般而言，將被處理亦 為了確保完全移除潛在存在的傳染性物f，如病毒和/或病 原性蛋白顆粒。 本發明亦有關於-種單一操作單元，包含被串行連接 的陰離子交換色層分析法部分(ΑΕχ)及一陽離子交換色 層分析法部分(CEX)兩者。此單—操作單元進—步包含一在 第離子父換色層分析法部分之上游端之進口以及一在第 二離子交換色層分析法部分之下游端之出口。此單一操作 單元亦包含H㈣-料賴&層分析法部分及在該第 二離子交換色層分析法之間的連結，其進—步包含一進口 以供應調節溶液至分離混合物。 12 201229058 據此，本發明之一具體實施例係有關於一單—操作單 元，其可被使用於本發明之方法中，包含被依序串行連= 的一陰離子交換色層分析法部分及一陽離子交換色層分析 法部分兩者，其中該陰離子交換色層分析法部分之出口被 連接至該陽離子交換色層分析法部分之進口，其中該單元 包含在該陰離子交換色層分析法部分上游端之—進口以及 在該陽離子交換色層分析法部分下游端之一出口，且其中 該單元亦包含在該陰離子交換色層分析法部分及該陽離子 交換色層分析法部分之間之一進口以供應酸性調節溶液至 該分離混合物。 本發明之另一具體實施例係有關於一單一操作單元， 其可被使用於本發明之方法中，包含被依序串行連接的一 陽離子交換色層分析法部分及一陰離子交換色層分析法部 分兩者，其中該陽離子交換色層分析法部分之出口被連接 至該陰離子交換色層分析法部分之進口，其中該單元包含 在該陽離子交換色層分析法部分上游端之一進口以及在該 陰離子交換色層分析法部分下游端之一出口，且其中該單 元亦包含在該陽離子交換色層分析法部分及該陰離子交換 色層分析法部分之間之一進口以供應鹼性調節溶液至該分 離混合物。 本發明之程序期間之液體流可藉由任何市面上可得之 雙果色層分析系統來建立’舉例而言，Akta explQrer _，BK)PR〇CESS(GE)，任何雙糾pLC系統或任何符合 第1或2圖的圖而量身定做的I置。這些色層分㈣置多數 13 201229058 即，管柱或臈）。在簡 該第一離子交換單元 被設計為操作一單一色層分析單元（亦 單修改下，可製做一額外連結以放置 在泵A後及該混合室前。 第1圖及第2圖顯示了基本配置。兩個色層分析裂置之 串行内聯連結加上如第认2圖中顯示位置的—選擇性的前 置過濾器，可能會導致建立不良的壓力。因此，在某此= 況下此圖必須包括額外的技術修改(舉例而言，在他:: 後之額外泵及在AEX單元前之減壓裝置）。 "

係適用於舰步驟最佳操作之調節及沖洗、:。緩衝液A 含有-酸性溶液且其混合比例，，裝栽物 。緩衝液B 作CEX步驟的最佳條件。可使用固藉衝夜A”需得為操 -反饋迴路基於，舉例而言 =流，或可藉 混合比例。MC係1擇性混合室，复^自動控制以執行 態混合器。 /、D含有任何類型的靜 L=裝載物

PA=泵 A PB=泵 B AEX=陰離子交換單元 CEX= ^離子交換單元 pH=pH感應器 σ=傳導性感應器 14 201229058 PF=選擇性前置過濾器 第2圖為一包含―陪μ ^

離子交換色層分析法私^換色層分析糾分及一陰 係適用於CEX步驟最佳 的早—㈣單元。緩衝液A

八古AH 3 周節及沖洗緩衝液。緩衝液B =:=，合比例，，裝栽物/緩衝⑽ 作=最佳條件。可使用固定體積混合流，或可藉 一反饋迴路基於，舉你丨而_ 而S，PH値輪出來自動控制以執行 混&比例。MC係1擇性混合室，其可含有任何類型的靜 態混合器。 L=裝載物

PA=泵 A PB=泵 B AEX=陰離子交換單元 CEX= 離子交換單元 pH=pH感應器 σ=傳導性感應器 PF=選擇性前置過濾器 t；實施方式;j 實施例 材料與方法： 所有實驗皆使用哺乳動物細胞株所製造之IgG1來進 行。 利用XD培養來進行培養’（見Genetic Engineering &

Biotechnology News，Apr 1 2010 Vol. 30, No. 7)，使用化學 15 201229058 限定培養基，其後將收穫物稀釋，藉由一個三步驟之深床 過濾濾器系列 ZetaPlus 10M02P、ZetaPlus 60ZA05 及 SterAssure PSA020(皆來自 Cuno(3M))來移除細胞。 此經淨化之收穫物含有約4.0g/L之IgG並被分裝貯存在 -20°C。在做蛋白質A純化前將其解凍並平衡至室溫。 首先’使用MabSelect(GE)以標準程序（裝載經淨化之收 穫物，第一次以20mMTris+ 150mMNaCl洗滌，第二次以 100 mM醋酸鈉緩衝液於ρΗ5·5洗滌，並以lOOmM醋酸緩衝 液ρΗ3·0洗脫）以標準蛋白質A色層分析法來進行初始純化。 在MabSelect洗脫後，收集洗脫之最高峰(eluted peak) 並保持在pH3.5—小時。之後，使用2M Tris pH 9.0將樣本中 和至pH7.4並遽過0.22μιη。 將因此所得的物質進行3系列的實驗：1.建立用於在流 通模式下之ΑΕΧ色層分析法之HCP移除性能（實驗1)。2.建 立在流通模式下使用CEX色層分析法之最佳條件（實驗2)。 3.結合最佳化之ΑΕΧ及CEX條件兩者於一單一單元操作實 驗(實例1)。 用ELIZA以多株抗-PerC6 HCP測量HCP。用尺寸篩除 色層分析法(ΗΡ-SEC)依照標準程序來測定單體IgG及聚集 體濃度。 實驗1 建立為達在流通模式下陰離子交換色層分析法良好表 現之條件 使用所述預先純化之IgG於醋酸Tris緩衝液進行在流通 16 201229058 模式下之AEX色層分析法。測試下列AEX介質：Mustang Q 錢幣型（0.35ml)(Pall)、Sartobind Q 膠囊型（1ml)及 ChromaSorb膠囊型（〇.〇8ml)(Millipore)(皆為膜吸附劑）。 在流通模式下使用一AKTA explorer於40床容積/小時 跑所有AEX介質。以去礦質水稀釋該等樣本直到最終傳導 性為5mS。調節及洗滌緩衝液為i〇〇mM醋酸TrispH7.4。裝 載於各AEX介質的產物量為i.5glgG/mL膜床容積。 於色層分析步驟之前及之後測量HCP ^起始物質含有 3305 ng/mg之IgG。於所述Mustang Q、Sartobind Q及 Chromasorb膜，經洗脫的物質分別含有39、57及71 ng/mg 之IgG。這些結果清楚顯示，所有經測試之aex色層分析介 : 質，在所利用的條件下有效的移除了 HCP。 實驗2 建立為達在流通模式下CEX色層分析法移除聚集體之 條件 在這些實驗中，預先純化之IgG被調整至pH 8_0並稀釋 至傳導性為2 mS。使用一裝滿16 cm床長p〇ros 50HS (Applied Biosystems)之 VLll(Millip〇re)管柱於一人KTA explorer上。洗滌及平衡緩衝液為5〇 mM Tris hci pH 7.4， 於流速5.35ml/min。在洗滌後，產物被以相似的流速裝載。 在裝載期間，以一第二泵，在該管柱前内聯混合5〇mM NaH：2P〇4(緩衝液B)溶液，以在進入該管柱前調整pH及傳導 性。在維持整體流過管柱的流不變下，測試不同的產物流 及緩衝液B之固定比例。在UV信號穩定後，取各比例的流 17 201229058 通樣本。 表1.使用不同容積比例之含緩衝液B之内聯混合5〇 mM NaH^PCXt溶液以Poros 50HS之聚集體清除度。 %緩衝液B pH 傳導性(mS) 聚集體(％) Ig〇(g/L) 0% 7.96 1.94 3.29 1.33 17.5% 7.68 2.58 3.24 1.29 22.5% 7.47 2.72 2.52 1.28 27.5% 7.18 2.89 1.82 1.20 37.5% 6.83 3.00 0.16 0.98 42.5% 6.68 3.08 0.00 0.96 這些樣本的分析結果(顯示於表1)清楚顯示，當pH降至 夠低則流通中不再含聚集體，但仍含IgG。 實例1 於最佳化之AEX及CEX條件於一單一單元操作中純化IgG。 如第10中圖所描繪，使用一 AkTA explorer將一 AEX單 元及一CEX早元串行搞合内聯。就AEX，使用Sartobind Q 膠囊型（lmL)，而就CEX，使用一裝滿16cm床長P〇r〇s 50HS (Applied Biosystems)之VLll(Millipore)管柱。為 了調節，在 裝載產物之前使用50mM Tris HC1緩衝液ρΗ7·4，傳導性 4_0mS(緩衝液Α)。同時，在AEX膜之後及CEX樹脂之前， 將緩衝液8以27.5%容積比例混合内聯。緩衝液8含5〇111]^ NaH2P〇4。流過0ΈΧ单元之總流為5.35mL/min 〇 在此實驗中，預先純化之IgG被去礦質水稀釋至傳導性 18 201229058 為2.98mS。藉由以相似於緩衝液八之流泵送IgG來起始預先 純化之IgG之裝載，同時停止泵送緩衝液a。緩衝液B被維 持在27.5%容積比例之流。裝載含196812〇之602.51111^量。 在裝載完成後，將流轉換回緩衝液A，以從系統中回收所有 產物（洗滌）。在洗滌後’藉由經泵A添加2M NaCl來提餾 (strip)AEX-CEX單元’並停止泵b。分別收集提餾物。在整 個過程期間，流過CEX之流為5.35ml/min。總時間（包括調 節、洗滌及提餾）少於3小時。分析裝載物及流通物兩者之 IgG聚集體比例，及HCP含量及蛋白質（產物)含量(A28〇)。起 始材料中HCP濃度為2697 ng/mg IgG，而在流通物加上洗滌 部分中HCP濃度為$47 ng/mg IgG。在裝載物(起始材料）中 聚集體量為3.66%，而在流通物加上洗滌部分中為〇〇〇%， 顯示聚集體完整清除。提餾物含30.4%聚集體。無計算從流 通物加上洗滌部分中回收之總產物，但在先前進行的類似 運作中’其在流通物加上洗滌部分中為約86%而在流通物 加上洗滌部分加上提餾物中為約92%。 實例2 於最佳化之CEX及AEX條件於一單一單元操作中純化igG。 如第20中圖所描繪，使用一 AKTA explorer將一 CEX單 元及一AEX單元串行耦合内聯。就CEX，使用一裝滿16 cm 床長Poros 50HS(Applied Biosystems)之VLll(Millipore)管 柱’而就AEX，使用Sartobind Q膠囊型（imL)。為了調節， 在裝載產物之前使用50mM Tris-醋酸緩衝液pH 6.6，傳導性 4.0mS(緩衝液A)。同時，在AEX膜之後及CEX樹脂之前， 19 201229058 將緩衝液B以20%容積比例内聯混合。緩衝液B含200mM Tris pH 9.0。流過AEX單元之總流為5.4mL/min。 在此實驗中，預先純化之IgG pH被調整至6.6而非7.4， 且接著被以去礦質水稀釋至傳導性為4mS。藉由以相似於 緩衝液A之流泵送IgG來起始被調整至pH6.6且預先純化之 IgG之裝載，同時停止緩衝液A流。緩衝液B被維持在20% 容積比例之流。裝載含1.5g IgG之600mL量。在裝載完成 後，將流轉換回緩衝液A，以從系統中回收所有產物（洗 務）。在洗蘇後，藉由經栗A添加2M NaCl來提館AEX-CEX 單元，並停止泵B。分別收集提餾物。在整個過程期間，流 過AEX之流為5.4ml/min。總時間（包括調節、洗滌及提餾) 少於3小時。分析裝·載物及流通物兩者之IgG聚集體比例， 及HCP含量及蛋白質（產物)含量(A280)。 所使用之縮寫 A280 (光)於280nm之吸收値 AEX 陰離子交換 CEX 陽離子交換 CHO細胞 中國倉鼠卵巢細胞 EBA 膨脹床吸附技術 HCP 宿主細胞蛋白質 HPLC 高壓液體色層分析法 IgG 免疫球蛋白G LoD 檢出極限 TFF 切向流過濾 20 201229058

Tris 參(羥甲基)胺曱烷 【圖式簡舉明】 第1圖為一包含-陰離子交換色M八、 離子交換色層分析法部分兩者的單析法部分及〜陽

係適用於AEX步驟最佳操作之調=早凡。緩衝液A 含有-酸性溶液且其混合比例"裝載.緩衝狀，需^夜Β 作CEX步驟的最佳條件。可使用固定體積混合流，二為操 一反饋迴路基於，舉例而言，ΡΗ値輪出來自動控制;J藉 混合比例。MC係—選擇性混合 乂執行 態混合器。 ，、了含有任何類型的靜 第2圖為-包含—陽離子交換色層、 離子交換色層分析法部分者 J7 及—陰 刀兩者的早—操作單元。 係適用而步驟最佳操作之調節及沖洗緩衝液。緩= 含有-驗性☆獻其現合比例,，裝栽物/緩衝液 作處步驟的最佳條件。可使用固定體積混合流$ -反饋迴路基於，舉例而言，pH値輸出來自動控制以= 混合比例。竭-選擇性混合室，其可含有任何類型:: 態混合器。 -【主要元件符鍊說明】

L...裝載物 PA...泵 A AEX...陰離子交換單元 CEX…陽離子交換單元 pH...PH感應器 σ...傳導性感應器 PF...選擇性前置過濾器 A，Β…缓衝液 21

Claims (1)

1. 201229058 七、申請專利範圍： 1. 一種從產生自一生物反應器之細胞培養液中純化抗體 的方法，其至少包含中間純化及精鍊之步驟，其中該新 穎純化步驟包含結合的串行内聯AEX及CEX色層分析 法。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中先進行該陰離子交 換(AEX)色層分析步驟，產生做為流通過部分的一分離 混合物，接著串行内聯陽離子交換（CEX)色層分析步 驟，產生做為流通過部分的一經純化之抗體製備物，及 其中該經純化之抗體製品係進一步經至少一純化步驟。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中先進行該陽離子交 換(CEX)色層分析步驟，產生做為流通過部分的一分離 混合物，接著串行内聯陰離子交換(AEX)色層分析步 驟，產生做為流通過部分的一經純化之抗體製備物，及 其中該經純化之抗體製品係進一步經至少一純化步驟。 4. 如申請專利範圍第1至3項任一項之方法，其中該串行内 聯AEX及CEX色層分析步驟係以單一單元操作來進行。 5. 如申請專利範圍第1至4項任一項之方法，其中在第二離 子交換步驟前之該分離混合物係被以足量溶液補充，以 調整pH値及傳導性以達在第二離子交換色層分析步驟 之最佳表現。 6. 如申請專利範圍第2項之方法，其中在CEX色層分析法 前之該分離混合物係被以足量酸性溶液補充。 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中在CEX色層分析法 22 201229058 前之該分離混合物係被以足量溶液補充，該溶液包括擰 檬酸（或其二氫鈉或氫二鈉或鉀鹽）、磷酸(或其二氫鈉或 氫二鈉或鉀鹽）、醋酸、氫氯酸或硫酸。 8. 如申請專利範圍第3項之方法，其中在AEX色層分析法 前之該分離混合物係被以足量驗性溶液補充。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中在AEX色層分析法 前之該分離混合物係被以足量溶液補充，該溶液包括氫 氧化鈉或氩氧化鉀，（或其二氫鈉或氫二鈉或卸鹽）或參 (羥甲）胺甲烷。 10. —種單一操作單元，其可被使用於如申請專利範圍第2 項之方法中，包含被串行連接的一陰離子交換色層分析 法部分及一陽離子交換色層分析法部分兩者，其中該陰 離子交換色層分析法部分之出口被連接至該陽離子交 換色層分析法部分之進口，其中該單元包含在該陰離子 交換色層分析法部分上游端之一進口以及在該陽離子 交換色層分析法部分下游端之一出口，且其中該單元亦 包含在該陰離子交換色層分析法部分及該陽離子交換 色層分析法部分之間之一進口。 11. 一種單一操作單元，其可被使用於如申請專利範圍第3 項之方法中，包含被串行連接的一陽離子交換色層分析 法部分及一陰離子交換色層分析法部分兩者，其中該陽 離子交換色層分析法部分之出口被連接至該陰離子交 換色層分析法部分之進口，其中該單元包含在該陽離子 交換色層分析法部分上游端之一進口以及在該陰離子 23 201229058 交換色層分析法部分下游端之一出口，且其中該單元亦 包含在該陽離子交換色層分析法部分及該陰離子交換 色層分析法部分之間之一進口。 24