KR20130131352A - 단일 유닛 이온 교환 크로마토그래피 항체 정제 - Google Patents

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KR20130131352A
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디데릭 레인더 크레머
마리케 이본느 도르스트
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은 적어도 중간 정제 단계 및 폴리싱(polishing) 단계를 포함하는, 생물반응기 내에서 생성된 단백질 혼합물로부터 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 중간 정제 및 폴리싱 단계는 관류(flow-through) 모드의 인-라인 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 및 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 단계를 어느 한 순서로 포함한다. 추가로, 본 발명은 연속적으로 연결되어 있는 음이온 교환 크로마토그래피 부분 및 양이온 교환 크로마토그래피 부분 둘다를 어느 한 순서로 포함하는 단일 작업 유닛(unit)에 관한 것으로서, 상기 유닛은 제1 이온 교환 크로마토그래피 부분의 업스트림 단부에 위치하는 입구 및 제2 이온 교환 크로마토그래피 부분의 다운스트림 단부에 위치하는 출구를 포함하고, 상기 유닛은 또한 제1 이온 교환 크로마토그래피 부분과 제2 이온 교환 크로마토그래피 부분 사이의 입구를 포함한다.

Description

단일 유닛 이온 교환 크로마토그래피 항체 정제{SINGLE UNIT ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY ANTIBODY PURIFICATION}
본 발명은 항체의 단일 유닛 정제 방법 및 이 방법에서 사용될 수 있는 장치에 관한 것이다.
약학적 용도에 사용되는 세포 배양에 의해 생성된 단일클론 항체의 정제는 많은 수의 단계를 포함하는 공정이다. 상기 항체는 모든 잠재적으로 유해한 오염물질들, 예컨대, 상기 항체를 생성하는 세포로부터 유래된 단백질 및 DNA, 배지 성분, 예컨대, 인슐린, PEG 에테르 및 소포제뿐만 아니라, 임의의 잠재적으로 존재하는 감염 물질, 예컨대, 바이러스 및 프리온을 본질적으로 갖지 않아야 한다.
이들 단백질들을 생성하는 세포의 배양물로부터 항체를 정제하는 전형적인 공정은 문헌(BioPharm International June 1, 2005, "Downstream Processing of Monoclonal Antibodies: from High Dilution to High Purity")에 기재되어 있다.
항체는 세포, 예컨대, 하이브리도마 세포 또는 형질전환된 숙주 세포(예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 마우스 골수종 유래의 NS0 세포, 새끼 햄스터 신장 세포 및 인간 망막 유래의 PER.C6® 세포)에 의해 생성되기 때문에, 미립자 세포 물질은 바람직하게는 정제 공정의 초기에서 세포 배양액으로부터 제거되어야 할 것이다. 상기 공정의 이 일부는 본원에서 "정화"로서 표시된다. 후속적으로 또는 정화 단계의 일부로서, 항체는 통상적으로 결합 플러스 용출 크로마토그래피 단계(IgG의 경우 고정된 단백질 A를 종종 사용함)에 의해 약 80% 이상까지 대략적으로 정제된다. 본원에서 "포획"으로서 표시되는 이 단계는 항체를 먼저 상당히 정제할 뿐만 아니라 부피를 상당히 감소시켜 생성물을 농축시킬 수도 있다. 대안적인 포획 방법은 예를 들면, 팽창된 층 흡착(EBA), (예를 들면, 폴리에틸렌글리콜을 사용한) 2-상 액체 분리 또는 이액(lyotropic) 염(예컨대, 황산암모늄)을 사용한 분획화된 침전이다.
정화 및 포획 후, 항체는 추가로 정제된다. 일반적으로, 포획 후 잔류 불순물을 충분히 제거하기 위해 2개 이상의 크로마토그래피 단계가 필요하다. 포획 후 크로마토그래피 단계는 종종 중간 정제 단계로 지칭되고, 최종 크로마토그래피 단계는 일반적으로 폴리싱(polishing) 단계로 지칭된다. 이들 단계들 각각은 일반적으로 배치 모드로 단일 유닛 작업으로서 수행되고, 이들 단계들 중 하나 이상은 결합 플러스 용출 모드로 수행된다. 또한, 각각의 크로마토그래피 단계는 예를 들면, pH, 전도도 등에 대하여 특정 적재(loading) 조건을 필요로 한다. 따라서, 필요한 조건에 맞게 적재를 조절하기 위해 각각의 크로마토그래피 단계 전에 추가의 조작이 수행되어야 한다. 언급된 이들 모두가 상기 공정을 정교하고 시간 소모적인 공정이 되게 한다. 이들 단계들 동안 일반적으로 실질적으로 제거되는 불순물은 공정 유래의 오염물질, 예컨대, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 핵산, 배양 배지 성분(존재하는 경우), 단백질 A(존재하는 경우), 내독소(존재하는 경우) 및 미생물(존재하는 경우)이다. 항체의 이러한 정제를 위한 많은 방법들이 최근 특허 공보에 기재되었다.
국제 특허출원 공보 제WO 2010/062244호에 기재된 발명은 단백질, 예컨대, 단일클론 항체의 단리 및 정제를 위한 수성 2-상 추출 증강된 침전 공정에 관한 것이다. 항체의 후속 추가 정제를 위한 2종의 대안이 기재되어 있다: (1) 결합 및 용출 모드의 양이온 교환 크로마토그래피 후, 관류(flow-through) 모드의 음이온 교환, 또는 (2) 관류 모드의 제1 다중모드 크로마토그래피 후, 관류 모드의 음이온 교환.
국제 특허출원 공보 제WO 2010/048183호에 기재된 발명은 산 pH에서의 연속적인 이온 교환 및 HIC 크로마토그래피에 의한 항체로부터의 HCP의 제거에 관한 것이다.
국제 특허출원 공보 제WO 2009/138484호에 기재된 발명은 상기 공보를 처음 읽었을 때 명세서 및 특허청구범위로부터 분명하지 않다. 상기 발명은 단백질 A(유도체) 컬럼 상에서의 항체의 포획 및 이 컬럼으로부터의 항체의 후속 방출에 의한 혼합물로부터의 항체의 정제에 관한 것이다. 이 후자 항체 함유 물질은 예를 들면, 연속적인 음이온 크로마토그래피 및 양이온 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.
유럽 특허 제2 027 921호에 기재된 발명은 중합체성 일차 아민을 기제로 한 막 이온 교환 크로마토그래피용 매질, 및 예를 들면, 항체의 정제에 있어서 그의 용도에 관한 것이다.
국제 특허출원 공보 제WO 2005/044856호는 임의적으로 음이온 교환 크로마토그래피와 함께 하이드록시아파타이트 수지를 사용하여 항체 제제로부터 고분자량 응집체를 제거하는 것에 관한 것이다.
국제 특허출원 공보 제WO 2008/145351호는 둘다 관류 모드로 수행되는 후속 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 기술한다.
전술된 방법들의 단점은 긴 작업 시간, (예를 들면, 결합 플러스 용출 단계를 위해 본질적으로 요구되는 많은 컬럼 용적 및 이로 인해 필요한 많은 양의 값비싼 수지의 필요성으로 인해) 높은 변동 비용 및 (인건비로 인한) 높은 고정 비용이다.
본 발명의 한 실시양태에 따라, 세포 배양에 의해 생성된 항체로부터의 잔류 불순물의 매우 효율적인 제거는 둘다 관류 모드로 수행되고 바람직하게는 하나의 단일 유닛 작업으로서 작동하는 연속적인 인-라인(in-line) 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 및 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)의 이용에 의해 달성될 수 있다. 따라서, AEX 크로마토그래피 단계 후 및 CEX 크로마토그래피 단계 전에 적합한 완충제의 인-라인 혼합을 이용하여 CEX 크로마토그래피를 위한 pH 및 전도도에 대해 정확한 조건을 조절한다.
본 발명의 추가 실시양태에 따라, 세포 배양에 의해 생성된 항체로부터의 잔류 불순물의 매우 효율적인 제거는 둘다 관류 모드로 수행되고 바람직하게는 하나의 단일 유닛 작업으로서 작동하는 연속적인 인-라인 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 및 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피의 이용에 의해 달성될 수 있다. 따라서, CEX 크로마토그래피 단계 후 및 AEX 크로마토그래피 단계 전에 적합한 완충제의 인-라인 혼합을 이용하여 AEX 크로마토그래피를 위한 pH 및 전도도에 대해 정확한 조건을 조절한다.
이 신규 방법의 장점은 작업 시간 및 노동력의 상당한 감소 및 이로 인한 보다 낮은 작업 비용이다. 또한, 모든 유닛들이 불순물에 대해서만 충분한 결합 성능을 필요로 하고 생성물에 대해서는 충분한 결합 성능을 필요로 하지 않는 관류 모드로 작동하기 때문에, 보다 작은 (및 이로 인한 보다 덜 비싼) 크로마토그래피 유닛이 필요하다.
따라서, 본 발명은 적어도 중간 정제 단계 및 폴리싱 단계를 포함하는, 생물반응기 내에서 생성된 세포 배양액으로부터 항체를 정제하는 방법으로서 정의될 수 있고, 이때 신규 정제 단계는 조합된 연속적인 인-라인 AEX 및 CEX 크로마토그래피를 포함한다. 이것은 2종의 대안적인 방식 중 하나, 즉 (1) 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 단계를 먼저 수행하여 분리 혼합물을 관류(flow-through) 분획으로서 생성시킨 후, 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 단계를 연속적으로 인-라인으로 수행하여 정제된 항체 제제를 관류 분획으로서 생성시키는 방식, 또는 (2) 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 단계를 먼저 수행하여 분리 혼합물을 관류 분획으로서 생성시킨 후, 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 단계를 연속적으로 인-라인으로 수행하여 정제된 항체 제제를 관류 분획으로서 생성시키는 방식으로 수행될 수 있고, 이들 대안적인 방식들 중 어느 하나로부터 발생된 정제된 항체 제제를 하나 이상의 추가 정제 단계로 처리한다.
국제 특허출원 공보 제WO 2008/145351호에는 둘다 관류 모드로 임의의 순서로 작동되는 후속 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피도 기재되어 있다. 그러나, 이의 개시내용은 제2 분리 단계용 분리 혼합물을 준비하기 위한 제1 분리 단계로부터의 분리 혼합물의 컨디셔닝(conditioning)이 오프-라인(off-line)으로 수행된다는 점에서 본 발명과 상이하다. 놀랍게도, 본 발명에 따라, 이온 교환 공정 유동 둘다가 상호 조정될 수 있고 동시에 응집체의 완전한 제거가 달성될 정도로 제2 크로마토그래피 단계를 위한 완충제 조건의 조절이 정확히 수행될 수 있을 정도로 상기 두 크로마토그래피 공정의 통합이 잘 수행될 수 있었다.
도 1 및 도 2는 음이온 교환 크로마토그래피 부분 및 양이온 교환 크로마토그래피 부분 둘다를 포함하는 단일 작업 유닛을 보여준다.
본 발명의 내용에 있어서, "분리 혼합물"은 본 발명에 따른 제1 이온 교환 단계로부터 발생된 용액이고, "정제된 항체 제제"는 본 발명에 따른 제2 이온 교환 단계로부터 발생된 용액이다. 본원 전체에 걸쳐 이 용어법을 고수하고자 한다.
제1 이온 교환 크로마토그래피 단계 전, 생물반응기 내에서 생성된 세포 배양액은 일반적으로 정화될 것이다(즉, 모든 세포 물질들, 예컨대, 전체 세포 및 세포 잔해(debris)를 갖지 않을 것이다).
또한, 제1 이온 교환 크로마토그래피 단계 전, 이 제1 이온 교환 단계를 위한 pH 및 전도도의 면에서 최적 조건을 보장하기 위해 컨디셔닝 용액을 세포 배양액 또는 항체 함유 용액에 첨가할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 AEX 및 CEX를 이용하는 조합된 크로마토그래피가 단일 유닛 작업으로서 수행된다는 것을 포함한다.
본원에서 "관류 분획"은 용출 유체와 실질적으로 동일한 속도로 크로마토그래피 컬럼을 떠나는 적재된 항체 함유 분획의 적어도 일부를 의미한다. 이 분획은 용출 동안 컬럼 상에서 실질적으로 보유되지 않는다. 따라서, 조건은 항체가 아니라 불순물이 음이온 교환 물질 및 양이온 교환 물질에 결합되도록 선택된다.
음이온 교환 및 양이온 교환 상호작용 크로마토그래피에 의한 단백질 혼합물의 후속 크로마토그래피를 이용한 단백질의 분리는 예를 들면, 상기 논의된 바와 같은 국제 특허출원 공보 제WO 2009/138484호에 개시되어 있다. 여기서 2개의 이온 교환 단계가 2개의 분리된 단계로서 수행되었다.
대규모 제조를 목적으로 하는 경우, (관류 모드를 이용하는) 본 발명에 따른 방법은 원하는 항체의 결합 및 용출을 이용하는 종래 개시된 방법보다 훨씬 더 빠른 분리를 제공한다는 것을 발견하였다.
유리하게는, 본 발명에 따른 제2 이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 최적 성능을 위해 pH 및 전도도를 조절하기 위해 항체를 함유하는 분리 혼합물은 적절한 양의 용액으로 보충된다.
놀랍게도, 매우 우수한 분리 결과가 제2 이온 교환 단계로 들어가기 전 유체의 인-라인 컨디셔닝에 의해 달성될 수 있다는 것을 발견하였다.
AEX 크로마토그래피가 제1 단계인 경우, 일반적으로, AEX는 약한 알칼리성 pH 및 낮은 전도도에서 수행된다. 본 발명자들은 CEX를 관류 모드로 수행하는 것이 낮은 전도도의 약한 산성 조건에서 가장 우수하다는 것을 발견하였다. 따라서, AEX 크로마토그래피로부터의 관류 생성물은 CEX 크로마토그래피로 처리되기 전에 pH를 원하는 값까지 감소시키고 최적 전도도를 조절하거나 유지하는 산성 용액으로 인-라인으로 보충된다. pH를 적절히 감소시키고 전도도를 조절할 임의의 용액 또는 완충제가 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, pH는 약 3.5 이상의 값, 보다 바람직하게는 약 4 이상의 값, 보다 바람직하게는 약 5 이상의 값으로 보정된다. 바람직하게는, pH는 약 7의 최대 pH 값으로 보정된다. 전도도는 바람직하게는 약 2 mS 이상에서 유지되거나 약 2 mS 이상으로 보정되고, 최대치는 약 10 mS이다. 바람직하게는, 상기 용액은 소량이 보충될 것을 필요로 하는 산성 성분을 함유하므로 생성물을 최소한으로 희석시킨다. 상기 산성 성분은 시트르산(또는 이의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 인산(또는 이의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 아세트산, 염산, 황산과 같은 화합물들로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 이 경우 분리 혼합물을 적절한 양의 pH 및 전도도 조절 용액으로 보충하는 것은 예를 들면, CEX 크로마토그래피 단계 전 공정 스트림(예를 들면, 혼합 챔버) 내에서의 전술된 산성 용액의 인-라인 혼합에 의한 단일 유닛 작업의 일부이다.
본원에서 "적절한 양의 산성 용액"은 관련 불순물들의 대다수가 CEX 물질에 흡착되게 하기에 충분하지만 생성물의 결합을 야기하지 않을 정도로 충분히 적은 양의 전술된 용액을 의미한다. 각각의 정제 공정에 대해, 산성 성분의 최적 양 및 바람직한 유형이 확립되어야 한다.
대안적으로, AEX 및 CEX의 순서가 바뀔 수 있다. 이 경우, 공정은 CEX 크로마토그래피 유닛으로 시작하고, 이 CEX 크로마토그래피로부터의 항체 함유 용액은 최적 정제가 이 CEX 유닛에서 관류 모드로 일어날 정도의 pH 및 전도도에서 미리 컨디셔닝되어야 한다. 일반적으로, 이것은 약한 산성 pH 및 낮은 전도도일 것이다. 후속 AEX 단계는 그 특정 단계에 대한 최적 정제 조건에서 수행되어야 한다. 바람직하게는, pH는 최대 약 9의 값, 보다 바람직하게는 최대 약 9.5의 값으로 보정된다. 바람직하게는, pH는 약 7 이상의 pH 값으로 보정된다. 전도도는 바람직하게는 약 2 mS 이상에서 유지되거나 약 2 mS 이상으로 보정되고, 최대치는 약 10 mS이다. 일반적으로, 이것은 약한 알칼리성 pH 및 낮은 전도도일 것이다. 이를 위해, 최적 AEX 성능을 위해 pH 및 전도도를 조절하기 위해 CEX 크로마토그래피 후 및 AEX 크로마토그래피 전에 항체 함유 용액을 적절한 양의 용액으로 인-라인으로 보충한다. 그러므로, 실제로 CEX 크로마토그래피로부터의 관류 생성물을 알칼리성 용액으로 인-라인으로 보충하여 분리 혼합물의 pH를 원하는 값까지 증가시키고 AEX 크로마토그래피 유닛의 작업을 위한 최적 전도도를 조절하거나 유지한다. pH를 적절히 감소시키고 전도도를 조절할 임의의 용액 또는 완충제가 이를 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 용액은 소량이 보충될 것을 필요로 하는 알칼리성 성분을 함유하므로 생성물을 최소한으로 희석시킨다. 이러한 알칼리성 성분의 몇몇 예는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨(또는 이의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 및 트라이스(하이드록시메틸)아미노메탄이지만, 당업계에서 공지된 임의의 다른 알칼리성 성분이 이를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 AEX 크로마토그래피는 수지를 함유하는 고전적인 팩킹된 층 컬럼, 단일체(monolith) 물질을 함유하는 컬럼, 적합한 크로마토그래피 매질을 함유하는 방사형 컬럼, 흡착 막 유닛, 또는 적절한 매질 및 음이온 교환제로서 작용하는 리간드를 갖는 당업계에서 공지된 임의의 다른 음이온 교환 크로마토그래피 장치에 의해 구현될 수 있는 AEX 유닛에서 일어날 수 있다. AEX 컬럼에서, 크로마토그래피 물질은 강한 또는 약한 양이온성 리간드가 부착되어 있는 미립자 지지체 물질로서 존재할 수 있다. 막 유형의 음이온 교환제는 강한 또는 약한 양이온성 리간드가 부착되어 있는 하나 이상의 시트 형태의 지지체 물질로 구성된다. 상기 지지체 물질은 유기 물질, 무기 물질, 또는 유기 물질과 무기 물질의 혼합물로 구성될 수 있다. 적합한 유기 물질은 아가로스 기제 매질 및 메타크릴레이트이다. 적합한 무기 물질은 실리카, 세라믹 및 금속이다. 막 형태의 음이온 교환제는 AEX 리간드를 함유하는 친수성 폴리에테르설폰으로 구성될 수 있다. 적합한 강한 AEX 리간드는 예를 들면, 사차 아민 기를 기제로 한 리간드이다. 적합한 약한 AEX 리간드는 예를 들면, 일차, 이차 또는 삼차 아민 기를 기제로 한 리간드이거나 당업계에서 공지된 임의의 다른 적합한 리간드이다.
본 발명에 따른 CEX 크로마토그래피는 수지를 함유하는 고전적인 컬럼, 단일체 물질을 기제로 한 컬럼, 적합한 크로마토그래피 매질을 함유하는 방사형 컬럼, 흡착 막 유닛, 또는 양이온 교환 물질로서 작용하는 적합한 리간드를 갖는 당업계에서 공지된 임의의 다른 양이온 교환 크로마토그래피 장치에 의해 구현될 수 있는 CEX 유닛에서 일어날 수 있다. CEX 컬럼에서, 크로마토그래피 물질은 CEX 리간드가 부착되어 있는 미립자 지지체 물질로서 존재할 수 있다. 막 유사 크로마토그래피 장치는 CEX 리간드가 부착되어 있는 하나 이상의 시트 형태의 지지체 물질로 구성된다. 상기 지지체 물질은 유기 물질, 무기 물질, 또는 유기 물질과 무기 물질의 혼합물로 구성될 수 있다. 적합한 유기 지지체 물질은 예를 들면, 친수성 탄수화물(예컨대, 가교연결된 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란) 또는 합성 공중합체 물질(예컨대, 폴리(알킬아스파르트아마이드), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트와 에틸렌 다이메타크릴레이트의 공중합체, 또는 아실화된 폴리아민)로 구성된다. 적합한 무기 지지체 물질은 예를 들면, 실리카, 세라믹 및 금속이다. 막 형태의 CEX는 CEX 리간드를 함유하는 친수성 폴리에테르설폰으로 구성될 수 있다. CEX 리간드의 적합한 예는 설폰산, 카복실산, 포스핀산, 또는 강한 또는 약한 양이온 교환제로서 작용하는 것으로 당업계에서 공지된 임의의 다른 리간드이다.
본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 항체는 6.0 이상, 바람직하게는 7.0 이상, 보다 바람직하게는 7.5 이상의 등전 pH를 갖는 항체이다. 이들 항체는 G, A 또는 M 클래스 중 어느 하나의 면역글로불린일 수 있다. 항체는 인간, 비-인간(예컨대, 설치류) 또는 키메라(예를 들면, "인간화된") 항체일 수 있거나, 전술된 면역글로불린의 서브유닛일 수 있거나, 면역글로불린 부분 및 또 다른(비-면역글로불린) 단백질로부터 유도되거나 또 다른(비-면역글로불린) 단백질과 동일한 부분으로 구성된 하이브리드 단백질일 수 있다.
놀랍게도, 조합된 AEX 및 CEX 크로마토그래피로부터 발생된 항체 물질은 일반적으로 98% 이상, 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.9% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 99.99% 이상의 초고 순도(단백질 함량을 지칭함)를 가질 것이다.
본 발명에 따른 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 바람직하게는 중성 또는 약한 알칼리성 pH에서 수행된다. 상기 단계는 음으로 하전된 불순물, 예컨대, DNA, 숙주 세포 단백질, 단백질 A(존재하는 경우), 바이러스(존재하는 경우), 단백질성 배지 성분, 예컨대, 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자(존재하는 경우)를 제거할 것이다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계 동안, 주요 잔류 큰 분자 불순물(주로 생성물 응집체)은 pH 및 전도도의 정확한 조건을 적용하였을 때 이들이 크로마토그래피 장치에 결합하는 반면, 생성물이 관류한다는 성질의 이용을 통해 제거될 것이다.
후속적으로, 모든 잔류 저분자량 불순물을 제거하고 완충제를 최종 제제화 완충제로 교체하고 원하는 최종 생성물 농도를 조절하기 위해 (고도로) 정제된 항체 제제는 일반적으로 한외여과 및 정용여과에 의해 처리되어야 할 것이다.
나아가, 정제된 항체 제제는 일반적으로 잠재적으로 존재하는 감염 물질, 예컨대, 바이러스 및/또는 프리온의 완전한 제거를 보장하도록 처리되어야 할 것이다.
또한, 본 발명은 연속적으로 연결된 음이온 교환 크로마토그래피 부분(AEX) 및 양이온 교환 크로마토그래피 부분(CEX) 둘다를 포함하는 단일 작업 유닛에 관한 것이다. 이 단일 작업 유닛은 제1 이온 교환 크로마토그래피 부분의 업스트림 단부에 위치하는 입구 및 제2 이온 교환 크로마토그래피 부분의 다운스트림 단부에 위치하는 출구를 추가로 포함한다. 이 단일 작업 유닛은 컨디셔닝 용액을 분리 혼합물에 공급하기 위한 입구를 추가로 포함하는, 제1 이온 교환 크로마토그래피 부분과 제2 이온 교환 크로마토그래피 부분 사이의 연결부도 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피 부분 및 양이온 교환 크로마토그래피 부분 둘다(이 순서로 연속적으로 연결되어 있음)를 포함하는, 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 단일 작업 유닛에 관한 것으로서, 이때 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 출구는 양이온 교환 크로마토그래피 부분의 입구에 연결되어 있고, 상기 유닛은 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 업스트림 단부에 위치하는 입구 및 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분의 다운스트림 단부에 위치하는 출구를 포함하고, 또한 상기 유닛은 산성 컨디셔닝 용액을 분리 혼합물에 공급하기 위한 입구를 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분과 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분 사이에서 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 부분 및 음이온 교환 크로마토그래피 부분 둘다(이 순서로 연속적으로 연결되어 있음)를 포함하는, 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 단일 작업 유닛에 관한 것으로서, 이때 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분의 출구는 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 입구에 연결되어 있고, 상기 유닛은 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분의 업스트림 단부에 위치하는 입구 및 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 다운스트림 단부에 위치하는 출구를 포함하고, 또한 상기 유닛은 알칼리성 컨디셔닝 용액을 분리 혼합물에 공급하기 위한 입구를 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분과 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분 사이에서 포함한다.
본 발명에 따른 공정 동안 액체 유동은 상업적으로 입수가능한 임의의 이중 펌프 크로마토그래피 시스템, 예를 들면, 악타 익스플로러(AKTA explorer)(GE), 바이오프로세스(BIOPROCESS)(GE), 임의의 이중 펌프 HPLC 시스템, 또는 도 1 또는 도 2의 도면에 따르는 임의의 맞춤 장치에 의해 확립될 수 있다. 이들 크로마토그래피 장치들의 대다수는 단일 크로마토그래피 유닛(즉, 컬럼 또는 막)을 작동하도록 디자인된다. 단순한 개조를 이용하여 추가의 연결을 만들어 제1 이온 교환 유닛을 펌프 A 뒤 및 혼합 챔버 앞에 배치할 수 있다.
도 1 및 도 2는 기본 구조를 나타낸다. 도 1 및 도 2에 나타낸 위치에서 2개의 크로마토그래피 장치 플러스 임의적 예비필터의 연속적인 인-라인 연결은 바람직하지 못한 압력 구축을 야기할 수 있다. 따라서, 일부 조건 하에서 추가의 기술적 개조(예를 들면, AEX 유닛 앞의 추가의 펌프 및 AEX 유닛 뒤의 압력 감소 장치)가 이 도면에 포함되어야 할 수 있다.
도 1은 음이온 교환 크로마토그래피 부분 및 양이온 교환 크로마토그래피 부분 둘다를 포함하는 단일 작업 유닛을 보여준다. 완충제 A는 AEX 단계의 최적 작업에 적합한 컨디셔닝 및 세척 완충제이다. 완충제 B는 CEX 단계의 작업을 위한 최적 조건을 수득하는 데에 필요한 적재/완충제 A에 대한 비로 혼합된다. 혼합 비는 고정된 체적 혼합 유량을 이용함으로써 달성될 수 있거나, 예를 들면, pH 출력데이터에 근거한 피드 백 루프(feed back loop)에 의해 자동적으로 조절될 수 있다. MC는 임의의 유형의 정적 혼합기를 함유할 수 있는 임의적 혼합 챔버이다.
L = 적재
PA = 펌프 A
PB = 펌프 B
AEX = 음이온 교환 유닛
CEX = 양이온 교환 유닛
pH = pH 센서
σ = 전도도 센서
PF = 임의적 예비필터
도 2는 양이온 교환 크로마토그래피 부분 및 음이온 교환 크로마토그래피 부분 둘다를 포함하는 단일 작업 유닛을 보여준다. 완충제 A는 CEX 단계의 최적 작업에 적합한 컨디셔닝 및 세척 완충제이다. 완충제 B는 AEX 단계의 작업을 위한 최적 조건을 수득하는 데에 필요한 적재/완충제 A에 대한 비로 혼합된다. 혼합 비는 고정된 체적 혼합 유량을 이용함으로써 달성될 수 있거나, 예를 들면, pH 출력데이터에 근거한 피드 백 루프에 의해 자동적으로 조절될 수 있다. MC는 임의의 유형의 정적 혼합기를 함유할 수 있는 임의적 혼합 챔버이다.
L = 적재
PA = 펌프 A
PB = 펌프 B
AEX = 음이온 교환 유닛
CEX = 양이온 교환 유닛
pH = pH 센서
σ = 전도도 센서
PF = 임의적 예비필터
실시예
재료 및 방법:
포유동물 세포주에 의해 생성된 IgG1을 사용하여 모든 실험을 수행하였다.
화학적으로 정의된 배지를 사용하여 XD® 배양(문헌(Genetic Engineering & Biotechnology, Apr 1, 2010, Vol. 30, No. 7) 참조)을 적용하여 배양을 수행한 후 회수물을 희석하였고, 세포를 3 단계 심층 여과 필터 트레인 제타플러스(ZetaPlus) 10M02P, 제타플러스 60ZA05 및 스터어슈어(SterAssure) PSA020(모두 쿠노(Cuno)(3M) 제품)로 제거하였다.
이 정화된 회수물은 약 4.0 g/ℓ의 IgG를 함유하였고 분취물 형태로 -20℃에서 저장되었다. 이것을 해동하여 단백질 A 정제 전에 실온으로 평형화하였다.
표준 단백질 A 크로마토그래피에 의한 제1 초기 정제를 표준 절차(정화된 회수물 적재, 20 mM Tris + 150 mM NaCl을 사용한 제1 세척, 100 mM 아세트산나트륨 완충제(pH 5.5)를 사용한 제2 세척, 및 100 mM 아세테이트 완충제(pH 3.0)를 사용한 용출)로 맵셀렉트(MabSelect)(GE)를 사용하여 수행하였다.
맵셀렉트 용출 후, 용출된 피크를 모아 pH 3.5에서 1시간 동안 유지하였다. 그 후, 2 M Tris(pH 9.0)를 사용하여 샘플을 pH 7.4로 중화시켰고 0.22 ㎛ 상에서 여과하였다.
이로써 수득된 물질을 사용하여 3개의 일련의 실험을 수행하였다: 1. 관류 모드의 AEX 크로마토그래피에 대한 HCP 제거 성능을 확립하는 것(실험 1), 2. 관류 모드의 CEX 크로마토그래피를 이용하여 최적 조건을 확립하는 것(실험 2), 및 3. 하나의 단일 유닛 작업 실험에서 최적화된 AEX 조건과 CEX 조건을 조합하는 것(실시예 1).
다중클론 항-PerC6 HCP를 사용한 ELISA로 HCP를 측정하였다. 단량체 IgG 및 응집체 농도를 표준 절차에 따른 크기 배제 크로마토그래피(HP-SEC)로 측정하였다.
실험 1
관류 모드의 음이온 교환 크로마토그래피의 우수한 성능을 위한 조건의 확립
아세테이트 Tris 완충제 중의 상기 언급된 예비정제된 IgG를 사용하여 AEX 크로마토그래피를 관류 모드로 수행하였다. 하기 AEX 매질을 시험하였다: 무스탕(Mustang) Q 코인(coin)(0.35 ㎖)(폴(Pall)), 사르토바인드(Sartobind) Q 캡슐(1 ㎖) 및 크로마소르브(ChromaSorb) 캡슐(0.08 ㎖)(밀리포어(Millipore))(모두 막 흡착제).
40 층 부피/hr에서 악타 익스플로러를 이용하여 모든 AEX 매질을 관류 모드로 흐르게 하였다. 샘플을 탈염수로 5 mS의 최종 전도도까지 희석하였다. 컨디셔닝 및 세척 완충제는 100 mM 아세테이트 Tris(pH 7.4)이었다. 각각의 AEX 매질 상에 적재된 생성물의 양은 1.5 g IgG/㎖(막 층 부피)이었다.
크로마토그래피 단계 전 및 후에 HCP를 측정하였다. 출발 물질은 3305 ng/mg의 IgG를 함유하였다. 용출된 물질은 언급된 무스탕 Q, 사르토바인드 Q 및 크로마소르브 막에 대해 각각 39 ng/mg, 57 ng/mg 및 71 ng/mg의 IgG를 함유하였다. 이들 결과는 모든 시험된 AEX 크로마토그래피 매질이 적용된 조건 하에서 HCP를 충분히 제거하였다는 것을 명확히 보여주었다.
실험 2
관류 모드의 CEX 크로마토그래피를 이용한 응집체 제거를 위한 조건의 확립
이들 실험들의 경우, 예비정제된 IgG를 pH 8.0까지 조절하고 2 mS의 전도도까지 희석하였다. 16 cm 층 길이 포로스(Poros) 50HS(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))로 충전된 VL11(밀리포어) 컬럼을 악타 익스플로러 상에서 사용하였다. 세척 및 평형화 완충제는 5.35 ㎖/분의 유속에서 50 mM Tris HCl(pH 7.4)이었다. 세척 후, 생성물을 유사한 유속으로 적재하였다. 적재하는 동안, 컬럼으로 들어가기 전에 pH 및 전도도를 조절하기 위해 제2 펌프를 이용하여 50 mM의 NaH2PO4(완충제 B) 용액을 인-라인으로 혼합하였다. 컬럼 상에서의 전체 유동을 일정하게 유지하면서 상이한 고정된 비의 생성물 유동 및 완충제 B를 시험하였다. UV 신호가 안정화된 후, 관류의 샘플을 각각의 비에서 채취하였다.
[표 1]
50 mM NaH2PO4 함유 완충제 B의 상이한 부피 비의 인-라인 혼합을 이용하는 포로스 50HS에 의한 응집체 제거
Figure pct00001
이들 샘플들에 대한 분석 결과(표 1에 나타냄)는 pH가 충분히 감소될 때 관류물이 응집체를 더 이상 함유하지 않는 반면 IgG를 여전히 함유한다는 것을 명확히 보여준다.
실시예 1
하나의 단일 유닛 작업에서 최적화된 AEX 및 CEX 조건에서의 IgG의 정제
악타 익스플로러를 이용하여 도 1의 도면에 도시된 바와 같이 AEX 유닛 및 CEX 유닛을 연속적으로 인-라인으로 커플링시켰다. AEX를 위해 사르토바인드 Q 캡슐(1 ㎖)을 이용하였고, CEX를 위해 16 cm 층 길이 포로스 50HS(어플라이드 바이오시스템스)로 충전된 VL11(밀리포어) 컬럼을 이용하였다. 생성물 적재 전에 50 mM Tris HCl 완충제(pH 7.4)를 컨디셔닝하기 위해, 전도도 4.0 mS를 인가하였다(완충제 A). 동시에, AEX 막 뒤 및 CEX 수지 앞에서 27.5% 부피 비로 완충제 B를 인-라인으로 혼합하였다. 완충제 B는 50 mM NaH2PO4을 함유하였다. CEX 유닛 상에서의 전체 유속은 5.35 ㎖/분이었다.
이 실험을 위해, 예비정제된 IgG를 탈염수로 2.98 mS의 전도도까지 희석하였다. 완충제 A 펌핑이 정지된 동안 IgG를 완충제 A와 유사한 유속으로 펌핑함으로써 예비정제된 IgG의 적재를 시작하였다. 완충제 B는 27.5% 부피 비의 유동으로 유지되었다. 1.96 g의 IgG를 함유하는 602.5 ㎖의 양을 적재하였다. 적재를 완료한 후, 시스템으로부터 모든 생성물들을 회수하기 위해 유동을 완충제 A로 다시 전환시켰다(세척). 세척 후, 펌프 A를 통해 2 M NaCl을 첨가함으로써 AEX-CEX 유닛을 스트립핑하였고 펌프 B를 정지시켰다. 스트립을 별도로 수집하였다. 전체 실시 동안 CEX 상에서의 유속은 5.35 ㎖/분이었다. (컨디셔닝, 세척 및 스트립핑을 포함하는) 총 시간은 3시간 미만이었다. IgG 응집체 비, 및 HCP 함량 및 단백질(생성물) 함량(A280)에 대해 적재물 및 관류물 둘다를 분석하였다. HCP 농도는 출발 물질에서 2697 ng/mg IgG이었고 관류물 플러스 세척 분획에서 ≤47 ng/mg IgG이었다. 응집체의 양은 적재물(출발 물질)에서 3.66%이었고 관류물 플러스 세척물에서 0.00%이었는데, 이것은 완전한 응집체 제거를 보여준다. 스트립은 30.4%의 응집체를 함유하였다. 관류물 플러스 세척물에서의 전체 생성물 회수는 평가되지 않았지만, 이전에 수행된 비교가능한 실시에서 상기 전체 생성물 회수는 관류물 플러스 세척물에서 약 86%이었고 관류물 플러스 세척물 플러스 스트립에서 92%이었다.
실시예 2
하나의 단일 유닛 작업에서 최적화된 CEX 및 AEX 조건에서의 IgG의 정제
악타 익스플로러를 이용하여 도 2의 도면에 도시된 바와 같이 CEX 유닛 및 AEX 유닛을 연속적으로 인-라인으로 커플링시켰다. CEX를 위해 16 cm 층 길이 포로스 50HS(어플라이드 바이오시스템스)로 충전된 VL11(밀리포어) 컬럼을 이용하였고, AEX 유닛을 위해 사르토바인드 Q 캡슐(1 ㎖)을 이용하였다. 생성물 적재 전에 50 mM Tris-아세테이트 완충제(pH 6.6)를 컨디셔닝하기 위해, 전도도 4.0 mS를 인가하였다(완충제 A). 동시에, AEX 막 뒤 및 CEX 수지 앞에서 20% 부피 비로 완충제 B를 인-라인으로 혼합하였다. 완충제 B는 200 mM Tris(pH 9.0)를 함유하였다. AEX 유닛 상에서의 전체 유속은 5.4 ㎖/hr이었다.
이 실험을 위해, 예비정제된 IgG의 pH를 7.4 대신에 6.6으로 조절한 후 탈염수로 4 mS의 전도도까지 희석하였다. 완충제 A 유동이 정지된 동안 IgG를 완충제 A와 유사한 유속으로 펌핑함으로써 상기 pH 6.6 조절된 예비정제된 IgG의 적재를 시작하였다. 완충제 B는 20% 부피 비의 유동으로 유지되었다. 1.5 g의 IgG를 함유하는 600 ㎖의 양을 적재하였다. 적재를 완료한 후, 시스템으로부터 모든 생성물들을 회수하기 위해 유동을 완충제 A로 다시 전환시켰다(세척). 세척 후, 펌프 A를 통해 2 M NaCl을 첨가함으로써 CEX-AEX 유닛을 스트립핑하였고 펌프 B를 정지시켰다. 스트립을 별도로 수집하였다. 전체 실시 동안 AEX 상에서의 유속은 5.4 ㎖/분이었다. (컨디셔닝, 세척 및 스트립핑을 포함하는) 총 시간은 3시간 미만이었다. IgG 응집체 비, 및 HCP 함량 및 단백질(생성물) 함량(A280)에 대해 적재물 및 관류물 둘다를 분석하였다.
사용된 약어
Figure pct00002

Claims (11)

  1. 적어도 중간 정제 단계 및 폴리싱(polishing) 단계를 포함하는, 생물반응기 내에서 생성된 세포 배양액으로부터 항체를 정제하는 방법으로서, 신규 정제 단계는 조합된 연속적인 인-라인 음이온 교환(AEX) 및 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 단계를 먼저 수행하여 분리 혼합물을 관류(flow-through) 분획으로서 생성시킨 후, 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 단계를 연속적으로 인-라인으로 수행하여 정제된 항체 제제를 관류 분획으로서 생성시키고, 상기 정제된 항체 제제를 하나 이상의 추가 정제 단계로 처리하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 단계를 먼저 수행하여 분리 혼합물을 관류 분획으로서 생성시킨 후, 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 단계를 연속적으로 인-라인으로 수행하여 정제된 항체 제제를 관류 분획으로서 생성시키고, 상기 정제된 항체 제제를 하나 이상의 추가 정제 단계로 처리하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    연속적인 인-라인 AEX 및 CEX 크로마토그래피 단계가 단일 유닛(unit) 작업으로서 수행되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 최적 성능을 위해 pH 및 전도도를 조절하기 위해 제2 이온 교환 단계 전에 분리 혼합물이 적절한 양의 용액으로 보충되는, 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    CEX 크로마토그래피 전에 분리 혼합물이 적절한 양의 산성 용액으로 보충되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    CEX 크로마토그래피 전에 분리 혼합물이 시트르산(또는 이의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 인산(또는 이의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 아세트산, 염산 또는 황산을 함유하는 적절한 양의 용액으로 보충되는, 방법.
  8. 제3항에 있어서,
    AEX 크로마토그래피 전에 분리 혼합물이 적절한 양의 알칼리성 용액으로 보충되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    AEX 크로마토그래피 전에 분리 혼합물이 수산화나트륨 또는 수산화칼륨(또는 이의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염) 또는 트라이스(하이드록시메틸)아미노메탄을 함유하는 적절한 양의 용액으로 보충되는, 방법.
  10. 연속적으로 연결되어 있는 음이온 교환 크로마토그래피 부분 및 양이온 교환 크로마토그래피 부분 둘다를 포함하는, 제2항에 따른 방법에서 사용될 수 있는 단일 작업 유닛으로서,
    상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 출구가 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분의 입구에 연결되어 있고,
    상기 유닛이, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 업스트림 단부에 위치하는 입구 및 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분의 다운스트림 단부에 위치하는 출구를 포함하고,
    상기 유닛이 또한 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분과 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분 사이의 입구를 포함하는, 단일 작업 유닛.
  11. 연속적으로 연결되어 있는 양이온 교환 크로마토그래피 부분 및 음이온 교환 크로마토그래피 부분 둘다를 포함하는, 제3항에 따른 방법에서 사용될 수 있는 단일 작업 유닛으로서,
    상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분의 출구가 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 입구에 연결되어 있고,
    상기 유닛이, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분의 업스트림 단부에 위치하는 입구 및 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 다운스트림 단부에 위치하는 출구를 포함하고,
    상기 유닛이 또한 상기 양이온 교환 크로마토그래피 부분과 상기 음이온 교환 크로마토그래피 부분 사이의 입구를 포함하는, 단일 작업 유닛.
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