TW200920397A - Live attenuated mycoplasma strains - Google Patents

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200920397 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於微生物學及免疫學領域。更具體而言，本 發明係關於對抗細菌性病原體之新穎疫苗。 【先前技術】

Μ毁菌係屬於柔膜體綱（Mowies)之小原核生物體（〇. 2 0.3微米）’柔膜體綱之成員缺少細胞壁且具有小基因組大 小。柔膜體綱包括至少100種黴漿菌。黴漿菌屬係人類及 非人類動物以及植物中數種疾病之致病因子。 例如，在人類中，肺炎黴漿菌（M.户加請婦·此)係社區獲 得性肺炎（非肺炎球菌細菌性肺炎）之主要原因。另一人類 病原性黴漿菌-人型黴漿菌（M. 为與男性泌尿生殖道 及女性上泌尿生殖道之病理學病狀有關。已顯示人型黴漿 菌係非***性尿道炎、尿道***炎、***炎、子宮内 膜炎、***性疾病、宮頸炎、不育、產後敗血症、紅娘 荒廢、低出生體重及出生缺陷之原因。其他人類病原性徽 聚菌屬包括生殖器《菌（M.)(與關節炎、慢性 非***性尿道炎、慢性***性疾病、其他泌尿生殖感 染、不育及AIDS/HIV有Μ、 ^ ^ 有關）、發酵黴漿菌（Μ /___)(與關節炎、海灣戰爭綜合徵、纖維肌痛、慢 性疲勞綜合徵、狼瘡、侧/HIV、自身免疫疾病、似、 牛皮癖及硬皮病、克隆氏病（Cr〇hnis)及·、癌症、内分 泌蒼亂、多發性硬化；3播s、产士 Γ · ^關卜唾液黴漿菌（Μ —與_炎、τ而病症、眼及耳病症及感染、牙 134389.doc 200920397 銀炎及牙周病（包括蛀牙）有關）、未明黴漿菌（M Mcog⑴及穿透黴漿菌（似·•户與Ajds/HIV、泌 尿生殖感染及疾病、及自身免疫病症及疾病有關）、梨黴 聚菌（M. pz’rwm)(與泌尿生殖感染及疾病、及AIDS/HIV有 關）、咽黴漿菌（从/awc/wm)、嗜脂黴漿菌（从 、及頰黴衆菌（似·· 6wcc<3/e)(與酿縫及呼吸道疾 病有關）。 雞敗血性黴漿菌（M "cww)及滑膜黴漿菌（从 係造成家禽中重大疾病狀況之原因。例如，雞敗 血性黴漿菌與雞及火雞中之急性呼吸道疾病有關且其亦可 在獵鳥中引起上呼吸道疾病。另外，人們已將雞敗血性黴 漿菌視為導致北美洲家朱雀結膜炎之原因。對於滑膜黴漿 菌’家禽感染該細菌屬種會導致體重增加降低及產蛋量損 失。 、 在豬中，豬肺炎黴漿菌（似·办少叩”⑼所⑽/此）係黴激菌肺 炎之病原體，其由於體重增加降低及飼料轉化效率差而對 豬產業造成重大經濟損失。豬感染豬肺炎黴漿菌會造成久 咳、皮毛暗淡、生長阻滯及持續數週之外表湲亂。在受感 染動物中觀察到紫色至灰色癒合區域之特徵性損傷，尤其 在腹部頂端及心葉中。 、 牛黴漿菌（M. hvb)係存在於家養牛或集中飼養牛及奶 牛中之牛病原體。最經常報導之臨床表現係牛肺炎，此常 常伴隨關節炎’亦稱為肺炎_關節炎綜合徵。其病因學作 用亦與母牛及公牛之乳腺炎、耳炎、及繁殖疾病或病症有 134389.doc 200920397 關 用於預防及管理由徵辟结 由黴漿邊感染引起之疾病之有效策略係 藉由使用活減毒黴漿菌細菌菌株進行疫苗接種。—般而 言’活減毒疫苗之優點包括可將呈自然形式之傳染因子的 所有相關免疫原性決定因子裎 — 十提供至佰主免疫系統，以及由 於免疫劑具有可在疫苗接種 两妖裡佰主内繁殖之能力，故僅需較 少量免疫劑。 活減肯疫田菌株通常藉由在培養基中多次系列傳代毒性 菌株產生。儘官對抗某些黴聚菌屬種之活減毒疫苗菌株已 藉由系列傳代獲得’但此等菌株在分子層面上之定性通常 較差。吾人假定藉㈣列傳代所產生之減毒菌株具有使微 生物毒性較小但仍能複製之累積突變 '然而，對於減毒黴 漿菌株，導致減毒作用之突變結果（例如，表現圖式已在 減毒菌株中發生改變之蛋白質之認定）通常未知。 因此，業界需要已在蛋白質組學層面上經定性且在疫苗 調配物中安全且有效之新穎活減毒黴漿菌細菌。 【發明内容】 本發明係關於活減毒黴漿菌細菌，其比相同屬種野生型 黴漿菌細菌降低一或多種選自由下列組成之群之蛋白質表 現.丙酮酸脫氫酶、填酸丙酮酸水合酶、2_脫氧核糖_5_填 酸醛縮酶、及核糖體蛋白質L35。本發明之活減毒黴漿菌 細菌可屬於任何黴漿菌屬種。在具體非限制性實例性實施 例中，本發明提供與野生型雞敗血性黴漿菌細菌相比呈現 丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脫氧核糖_5_磷酸醛 134389.doc 200920397 縮酶、及核糖體蛋白質L35表現降低之活減毒雞敗血性黴 漿菌株。根據本發明之一些實施例，本發明之活減毒黴漿 菌細菌藉由蛋白質組學分析定性為一或多種上述蛋白質之 表現降低。 本發明亦提供包含本發明活減毒黴漿菌細菌之疫苗組合 物’以及為動物接種疫苗對抗黴漿菌感染之方法。 另外，本發明提供用於製造及/或鑑別減毒黴漿菌純系 之方法。根據本發明之該態樣，該等方法包含使初始黴漿 菌細菌群體經受減毒條件，分析個別純系與相同屬種野生 型黴漿菌細菌相比是否存在一或多種選自由下列組成之群 之蛋白質表現降低：丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合酶、 2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白質l35，及測試 該等純系之毒性。根據本發明該態樣之方法所製備之黴漿 菌純系與相同屬種野生型黴漿菌細菌相比將較佳呈現至少 一種上述蛋白質之表現降低及毒性降低。 【實施方式】 本發明係關於適於在疫苗調配物中使用之活減毒黴漿菌 細菌。與一或多種以下蛋白質：丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮 酸水合酶、2-脫氧核糖-5-構酸酿縮酶、及/或核糖體蛋白 質L3 5在相同屬種野生型黴漿菌細菌中之表現相比，本發 明之黴漿菌細菌呈現該等蛋白質表現降低。 黴漿菌屬種 本發明部分係基於以下驚人發現：藉由蛋白質組學分析 證實，新穎活減毒雞敗血性黴漿菌（均 134389.doc 200920397 疫苗菌株之諸如丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸 水合酶、2_脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白質L35 等蛋白質之含量降低。（參見本文實例3)。本發明係藉由使 用雞敗血性黴漿菌之工作實例例示；然而，由於所有黴漿 菌屬種中均存在丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合酶' 2_脫 氧核糖-5-磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白質L35，故該等蛋白 質之含量降低與細菌減毒作用相關之發現對於所有黴漿菌 屬種均適用。 例如’雞敗血性黴漿菌丙酮酸脫氫酶蛋白質（亦稱為 AcoA)之類似物尤其可見於豬肺炎黴漿菌232、豬肺炎黴漿 涵7448豬肺炎徵衆痛J菌株（M_ hyopneumoniae J)、徽衆 菌（M. florum)、山羊黴漿菌山羊亞種（Mycoplasma capricolum subsp. capricolum)、生殖器黴漿菌、運動黴漿 菌163K (MyC0plasma mobile 163K)、絲狀黴漿菌絲狀亞種 SC型（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC)、穿透徽 漿菌、肺炎黴漿菌、鼠肺炎黴漿菌（Myc〇plasma pulmonis)、及滑膜黴漿菌。 雞敗血性撤襞菌碌酸丙酿]酸水合酶蛋白質（亦稱為En〇) 之類似物尤其可見於豬肺炎黴漿菌232、豬肺炎黴漿菌 7448、緒肺炎黴漿菌j菌株、黴漿菌（M· fl〇rum)、山羊黴 漿菌山羊亞種、生殖器黴漿菌、運動黴漿菌163K、絲狀黴 漿菌絲狀亞種SC型、穿透黴漿菌、肺炎黴漿菌、鼠肺炎黴 聚菌、滑膜黴漿菌、洋蔥黃化病植原體（〇ni〇n yeU〇ws phytoplasma)、解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum)/微小 134389.doc -10- 200920397 脲原體（Ureaplasma parvum)、及紫菀黃化病叢枝病植原體 (Aster yellows witches-broom phytoplasma)- 雞敗血性撤聚函2 -脫氧核糖-5 _填酸酸縮酶蛋白質（亦稱 為DERA或DeoC)之類似物尤其可見於豬肺炎黴聚菌232、 豬肺炎黴漿菌7448、豬肺炎黴漿菌j菌株、黴漿菌（M. florum)、山羊黴漿菌山羊亞種、生殖器黴漿菌、運動徽漿 菌163K、絲狀徽漿菌絲狀亞種sc型、穿透黴漿菌、肺炎 黴漿菌、鼠肺炎黴漿菌、滑膜黴漿菌、及解脲脲原體/微 小脲原體。 雞敗血性黴漿菌核糖體蛋白質L35蛋白質（亦稱為RpmI) 之類似物尤其可見於豬肺炎黴漿菌232、豬肺炎黴漿菌 7448、豬肺炎黴漿菌j菌株、黴漿菌（M. fl〇rum)、生殖器 黴漿菌、肺炎黴漿菌、及鼠肺炎黴漿菌。 以上類似物列示意欲舉例說明且並非意欲詳盡無遺且 彼等熟習此項技術者應瞭解，雞敗血性黴漿菌Ac〇A、 、De〇C及/或RpmI之其他類似物可存在於除彼等上述 例示外之黴漿菌屬種中。 由於大夕數黴漿菌屬種表現丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸 夂&酶2_脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶及核糖體蛋白質L35之 处種形式，且由於該等蛋白質在各屬種中顯然起類似功 能丄故由此得出該等蛋白質之表現降低係減毒黴漿菌株之 確疋特徵，如藉由本文實例中所闡述之減毒雞敗血性黴漿 痛株所例示。 本發月之減母黴漿菌細菌可屬於任何黴漿菌屬種。在較 134389.doc 200920397 佳實施例令，诘主6 & 爾 田可源自動物病原性黴漿菌細菌。本 ==”動物病原性黴浆菌細菌”意指呈野生型非減 ''可在動物中感染並引起疾病及/或病之細菌。"動 Ιέ 7病及/或病包括動物中之不利物理表現以及僅僅 二且：學、顯微鏡方法及/或分子診斷學指示之疾病或 感染之臨床體徵。 動物病原性黴浆菌細菌包括人類及非人類病原性《菌 、、.田菌人類病原性徽衆菌細菌包括但不限於（例如）以下徽 衆菌屬種’、、田菌.生殖器黴衆菌、發酵黴衆菌、唾液徽浆 +菌、人,型黴㈣、肺炎黴㈣、未明黴漿菌、穿透黴衆 菌、梨黴漿菌、咽黴衆菌、嗜脂黴漿菌、及頰黴裂菌。非 人類病原性徽漿菌細菌包括（例如）禽鳥、豬、錦羊、牛、 山羊或犬病原性黴漿菌細菌。禽烏病原性黴衆菌細菌包括 但不限於(例如)以下黴衆菌屬種細菌：自溝黴漿菌(Μ. 山繼⑷、雞黴衆菌（Μ· gain讀聰）、雞敗血性黴漿菌、 吐緩雞徵衆菌（M. gaUopavonis)、嗜肝糖黴漿菌（m glyC〇philum)、惰性黴衆菌（M. iners)、衣阿華黴聚菌（m iowae)、生脂黴漿菌（M Up〇faciens)、火雞黴漿菌（μ meleagridis)、及滑膜黴疲菌。豬病原性黴聚菌細菌包括但 不限於（例如）以下黴聚菌屬種細菌：絮狀黴聚菌（M. flocculare)、豬肺炎黴漿菌（M.办印加“所⑽以幻、豬鼻黴漿 菌（M. hyorhinis)、及豬關節滑膜黴漿菌（M紗。 绵羊、牛、山羊或犬病原性黴漿菌細菌包括但不限於（例 如）以下黴聚菌屬種細菌：山羊黴敷菌山羊亞種、山羊黴 134389.doc 200920397 衆菌山羊肺炎亞種（M. capricolum subsp. capripneumoniae)、絲狀黴漿菌絲狀亞種LC型（M. mycoides subsp· mycoides LC)、絲狀黴漿菌山羊亞種（m. mycoides subsp. capri)、牛黴漿菌、牛眼黴漿菌（Μ· 、犬黴 聚菌（M. canis) '加利福尼亞磁漿_ _ (μ. californicu/w)、及 殊異徽毁菌（M. 。 降低黴漿菌蛋白質之表現 習此相關技藝之人士可使用例行分子生物學技術測定減 毒黴漿菌細菌是否降低野生型黴漿菌細菌細胞中正常表現 之一或多種蛋白質表現。與野生型細菌相比，測定減毒細 菌疋否降低特疋蛋白質（例如丙酮酸脫氫酶、攝酸丙酮酸 水合酶、2-脫氧核糖_5_鱗酸醛縮酶、核糖體蛋白質l35等） 表現之方法可藉由熟習此項技術者所習知之若干方法達 成。該方法實例包括（例如）基於抗體之定量方法，例如西 方墨點分析（Western b丨otting)、放射免疫分析（RIA)、及酶 ’其中使用可檢測並結合所關注

134389.doc 聯免疫吸附分析（ELISA)，其中, 蛋白質之抗體。另外，由於信使 映由其編碼之蛋白質的量，故基 於測定減毒黴漿菌細菌是否降低 *13- 200920397 法，將假定黴漿菌細菌係雞敗血性黴漿菌屬種，然而，熟 習此項技術者應瞭解該方法實例等同應用於所有黴漿菌屬 種，且可用於評定任何黴漿菌蛋白質之相對表現。 首先’使減毒雞敗金性黴漿菌細胞群體及野生型雞敗血 性黴漿菌細胞群體在基本相同條件下，於基本相同培養基 中生長。然後’使兩個細胞群體接受細胞破裂條件。使破 裂細胞（或其含蛋白質部分）同時進行SDS聚丙烯醢胺凝膠 電泳（SDS-PAGE)，然後使用會與雞敗血性黴漿菌磷酸丙 酮酸水合酶蛋白質結合之抗體（此等抗體可使用熟習此項 技術者所熟知之標準方法獲得）進行西方墨點分析。然後 施加經標記之第二抗體，提供與源自細胞之蛋白質的量成 正比之可量測信號。若由減毒雞敗血性黴漿菌株所呈現之 信號量小於由野生型雞敗血性黴漿菌株所呈現之信號量， 即可斷定與野生型菌株相比，減毒菌株降低磷酸丙酮酸水 合酶之表現。該方法實例之變化形式以及其替代形式係習 此相關技藝之人士顯而易見者。 本發明包括與野生型菌株中所觀察到之蛋白質（例如， 丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合酶、2_脫氧核糖_5_磷酸醛 縮酶、核糖體蛋白質L35等）表現相比呈現任何程度之蛋白 質表現降低之減毒黴漿菌細菌。在一些實施例中，減毒細 菌之蛋白質表現比野生型細菌降低至少約5%。作為實 例’若既定量野生型黴漿菌株呈現100個單位之特定蛋白 質表現且相同量候選減毒黴漿菌株呈現95個單位之該蛋白 質表現’即可斷定減毒菌株之蛋白質表現比 0 丁生型細菌降 I34389.doc -14- 200920397 低5%(在本文中其他部分闡述用於計算”表現降低百分比， 之額外實例）。在一些其他實施例中，減毒細菌之蛋白質 表現比野生型黴漿菌細菌降低至少約1 〇〇/〇、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、940/〇、 95°/。、96%、97%、98%或99%。在另外其他實施例中，與 野生型黴漿菌細菌相比，減毒黴漿菌株不表現蛋白質 (即，其表現降低1 00%)。 在本發明之一些實例性實施例中，該減毒細菌之一或多 種選自由下列組成之群之蛋白質表現比相同屬種野生型黴 衆菌細菌降低至少5% :丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合 酶、2-脫氧核糖_5_磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白質L35。 本文所用之與野生型菌株相比由減毒黴漿菌株所二％〜 特疋蛋白質之”表現降低百分比”可由下式計算：（A_ B)/AXl00 ;其中A=野生型黴漿菌株中蛋白質之相對表現 私度’且B-減毒菌株中蛋白質之相對表現程度。僅出於舉 [i。兒月之目的’若野生型黴漿菌株呈現0.2则個單位之蛋 白貝Y表現，且減毒黴漿菌株呈現0.1850個單位之蛋白 質"Y丨’表現，則溢命 、稱〜野生型菌株相比減毒菌株呈現 [(5〇〇 0.185〇)/0.25〇〇χ1〇〇]=2ό〇/。之蛋白質 表現降 :本文實例3中之表5提供與野生型雞敗血性黴聚菌株相 t對=雞敗血性黴㈣之實難減毒菌株所計算之表現降 -百分比之額外說明性實例。 疫苗組合物 134389.doc •15· 200920397 本發明亦包括包含本發 可接典t h /舌減t黴漿菌細菌及醫藥上 τ接又之載劑之疫苗組合 ^ 本文所用之表達，，本發明之 聚“菌"涵蓋本文其他部分閣述及/或主張之任 何活減t黴漿菌細菌。舉例 俜水、it — ” 而5，面樂上可接受之載劑可 ^ % r\i 。養基或緩衝劑》包含本發明減 毒磁漿囷、、.田菌之疫苗調配物 或（另一選摆1、 A 乂泌汙液形式或以凍乾形式 二)以冷;東形式製備。若冷來，則可添加甘油 或 類似試劑以增強冷来時之穩定性。 對動物進行疫苗接種之方法 二=包括為動物接種疫苗對抗黴毁菌感染之方法。 樣之方法包含向動物投與免疫學有效量之 包含本發明之活減舂 ^ 漿滴菌之疫苗組合物。本文所用 明之活減毒黴聚菌細菌”涵蓋本文其他部分闡 迷及/或主張之任何活滅表激將社 旦" 咸母喊聚函細菌。表達”免疫學有效 2在疫苗接種之動物中引起保護性含量抗體產生所 舄之疫苗組合物的量。疬# 疫田組合物可以任何業内已知之方 式投與給動物，該蓉 等方式包括經口、經鼻内、黏膜、局 :皮、及非經腸(例如，靜脈内、腹膜腔内、皮内、 皮下或肌内）途徑。亦可# u λ ^ 吏用無針遞送裝置達成投與。可 使用途徑之組合達成投與， 且隨後使用黏膜途徑投與等 使用非^腸途徑投與 如活！毒黴焚菌細菌係禽鳥病原性《菌細菌(例 、隹敗血性黴漿菌細菌） )之本1明實％例中，投與減毒細 係烏類，例如雞或火雞。當該動物係烏類 134389.doc 16 200920397 疫苗調配物以使調配物立即或最… 烏類之啤吸道黏膜接觸。因此 P戈取終可與 内、經口及/或經眼内投與給二調配物可(例如)經鼻 組合物可如上所述及β、、、\肖於禽鳥投與之疫苗 經鼻内投盘))戈二/以適於藉由喷霧(包括氣溶膠(用於 配又與))或在飲用水"用於經口投峨與之形式調 減溶勝投與之本發明疫苗組合物可藉由將活 減:黴漿固細菌納入小液體微粒中來調配。該等微粒可且 有=於㈣微米與約100微米之間之初始液滴尺寸。舉例 l 氣溶勝發生器（包括用於背負

式喷霧、孵化場喷霧及霧化対之市售㈣發生器）可生 成此等微粒D 製備減毒黴漿菌純系之方法 在本發明之另-態樣中’本發明提供用於鑑別幻或製 備減毒黴襞菌純系之方法。根據本發明該㈣之方法包含 使初始黴聚菌細菌群體經受減毒條件藉以製備推定減毒細 菌群體。然後，分析該推定減毒細菌群體之各純系與相同 屬種野生型《g細g相比是否存在—或多種選自由丙嗣 酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合酶、2_脫氧核糖_5_磷酸搭縮 酶、核糖體蛋白質L35組成之群之蛋白質表現降低。然後 測試經鑑別一或多種上述蛋白質表現降低之純系的毒性。 比相同屬種野生型黴漿菌細菌降低一或多種上述蛋白質表 現及降低毒性二者之純系被鑑別為減毒黴漿菌純系。 根據本發明之該態樣，”初始黴漿菌細菌群體"可係任何 134389.doc -17, 200920397 量之徽聚菌細菌。在一此音始点丨士 + 。實施例中，該等細g係野生型細 菌。或者，該等細菌可令右—此交#〜 寸囷j 3有或多種突變。然而，初始群 體中之細菌較佳係相同純系哎美 斤 矛及暴本上相同之純系，·即，該 等細菌較佳皆源自單親太溆难 疋尽μ漿鹵細菌細胞及/或具有相同 或基本相同之基因型及/或表型特徵。 本文所用之術語”減毒條株"咅4t 机 啤t條仵思指能夠將一或多個基因改 良（例如’核苦酸突變）引入徵婿益4 & & 、 交；^丨入娀槳卤細菌基因組t之任何條 件或條件組合。舉例而古，眚你丨w # σ實例性非限制性減毒條件包括 在培養基中傳代細菌、使用 风用j播入基因組之基因元件（例 如轉位子（例如可隨機插黴漿 + 佩求固基因組中之轉位子）)轉化 細菌、使細菌暴露於一或多種 、 Λ义裡孑變劑（例如，化學誘變劑 或紫外光）下等。當細菌細胞係藓 G诉精由在活體外傳代而經減 毒時’該等細胞可在活體外傳代任何次數，例如12、 17、18、19、2〇m24、25、26、27、28、 29、3m33、34、35、36、37、38、 更多次。 & 經受減毒條件後之初始黴漿菌細胞群體在本文中稱為推 定的減毒細菌群體。推定的減毒細菌群體之各純系可藉由 =準微生物學技術獲得，該等技術包括（例如）對細胞實施 續稀釋及將各細胞鋪板於合適培養基上。在獲得後，分 析：定的減毒細菌群體之各純系是否降低一或多種指定蛋 Γ表現。在本文中其他部分闌述用於測定減毒黴漿菌 ，田疋否降低一或多種蛋白質表現之方法，該等蛋白質在 134389.doc •18- 200920397 野生型黴衆菌細菌細胞中正常表現。舉例而言，實例性方 法包括基於RT-取之方^西方墨點分析等。

可藉由向易受野生型（未減毒）種類細菌感染之動物投與 、、工‘別已降低或多種蛋白質(例如，丙酮酸脫氫酶、磷 -文丙酮酉文水5酶、2-脫氧核糖_5_磷酸醛縮酶、核糖體蛋白 質L35)表現之各純系，纟測試該等純系之毒性。本文所用 之易 < 野生型黴聚菌系田菌感染之動物，,係在受到野生型徽 漿菌細g攻擊後顯示至少—種臨床症狀之動物。此等症狀 已為熟習此項技術者所習知。舉例而t，若推定的減毒雞 敗企性黴漿菌株降低（例如）丙鲖酸脫氫酶表現時，可向（例 如）火雞或雞（其-般易於受到野生型敗血性黴衆菌感染）投 與該菌株。舉例而言’家禽動物之雞敗血性黴漿菌感染之 ，床症狀包括急性呼吸道症狀、心包炎、肝周炎、肺泡 九、軋官肥厚、體重增加幅度下降、纖毛脫落 (deciliation)、異常杯狀細胞、毛細管擴張、淋巴細胞、衆 、”田胞及/或異嗜性白血球數增加，及在某些情形下產蛋量 下降。因此，當將推定的減毒雞敗血性黴漿菌株投與雞或 火雞時，若與已感染野生型雞敗血性黴漿菌株之火雞或雞 相比，會導致較少及/或較不嚴重之症狀時，即認為推定 的減毒雞敗血性黴漿菌株具有”降低之毒性"。任何程度之 症狀減輕皆表示推定的減毒菌株具有降低之毒性。在一些 實施例中’推定的減毒菌株將無毒性。 根據本發明，比相同屬種野生型黴漿菌細菌降低一或多 種選自由丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合酶、2_脫氧核糖- 134389.doc •19- 200920397 5-磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白質U5組成之群之蛋白質表 現且降低毒性之徽聚菌純系即為減毒黴聚菌純系。 、以下實例係對本發明方法及組合物加以說明而非加以限 定彼等熟習此項技術者參照本揭示内容將明瞭分子生物 學及化學巾-般遇狀各種條件及參數之其他適宜修改及 改變，該等適宜修改及改變皆在本發明精神及範圍内。 實例 實例1 活減毒雞敗血性黴漿菌株之世代 藉由在活體外多次傳代野生型雞敗血性黴漿菌株以肋可 生成新穎活減毒雞敗血性黴漿菌株。具體而言，向2〇毫升 改良Frey氏培養基（Frey等人，j F此心$ 29:2163_ 2171 (1968))(本文中亦稱為”MG培養基”）中接種〇1毫升野 生型雞敗企性嫉漿卤株R-980之接種物質。培育野生型細 胞直至培養基顏色變成亮黃色。隨後使用該等亮黃色培養 物再接種上述新鮮MG培養基。以該方式總共傳代培養物 47次。藉由對鳥群進行疫苗接種隨後使用野生型雞敗血性 Μ聚鹵攻擊來測s式所得函株之減毒作用。所有鳥類皆在攻 擊後兩週經屍體剖檢且觀察與黴漿菌有關之病狀。高傳代 菌株（χ+47)提供對抗與雞敗血性徽衆菌感染有關之臨床體 徵之保護。該稱為MGx+47之減毒雞敗血性黴漿菌株於 2007年6月19日存放於美國典型培養物保藏中心，ρ〇 ；Β〇χ 1549，Manassas，VA 20108中，且其被指定登錄號ΡΤΑ一 8485 ° 134389.doc -20· 200920397 實例2 雞中活減毒雞敗血性黴漿菌疫苗之安全性及效力評價 在該實例中’於雞中對實例1中所獲得之新穎雞敗血性 黴襞菌疫田菌株MGx+47之安全性及效力予以評價。 將71只SPF白來杭雞（white leghorn chicken)按以下分成7 表1 :研究設計

藉由粗噴霧投與用減毒菌株MGx+47以3.62χΐ〇7

CCU/mL/鳥對第2、3、4a、朴及4c組中之4週齡雞進行疫 田接種。使用〇,5毫升雞敗血性黴漿菌株R以7 74叫〇5 = CU/mL對第丨及3組中之7週齡雞進行氣管内攻擊。對 第1、2、3及5組中之9週齡雞實施屍體剖檢，並分別在 DPV(疫苗接種後天數）第7、14及21天對第4&、4bM組中 之雞實施屍體剖檢。針對平均體重增加、心包炎、肝周 火肺/包炎及氣管炎對該等雞實施評冑。結果匯總於表2 中〇 134389.doc 200920397 IS/nfeuoI Χί.ζ,^-Ίδς.ο"^·^ 喊/qm/nfeuoI x s · T 鄉球埤嚓 瓌 Μ9^^1!1'4Η体：<Ν< 氣管 (組織學） 嚴重氣管炎 正常 混合性氣管炎 正常 正常 正常 正常 肺泡炎分值(陽性平均值） 1_ 3.56 〇 in (Ν 〇 ο ο ο 肺泡炎 1 9/11 1_ 0/10 2/11 ON ο 0/11 0/10 ο 肝周炎 0/11 0/10 1_ 0/11 ON ο 0/11 0/10 ΟΝ ο 心包炎 0/11 0/10 1_ 0/11 C\ ο 0/11 Ί 0/10 ΟΝ ο 平均體重增加 (公斤/天） 0.016 0.018 1 . . 0.017 0.016 0.017 0.017 0.015 受到攻擊 Μ 經接種疫苗 Μ (Ν m in 134389.doc -22- 200920397 表3 :安全性表：來自各接種疫苗/未受到攻擊雞之經曱醛 固定之雞氣管之組織學報告（第4a、4b及4c組） 時間點 雞 纖毛 杯狀細胞/M 毛細管擴張 LC/PC PMN 厚度(微米） 7DPV 1 N - - - - 30 2 N - - - - 30 3 N - - - - 30 4 N - - + - 30 5 N - - - 30 6 N - + 30 7 N - - + - 30 8 N - - - - 30 9 N + - - 30 14DPV 1 N - - - - 50 2 N + - - 50 3 N - + - 50 4 N - - - - 50 5 N - - - - 50 6 N - - - - 50 7 N - - - - 50 8 N - 50 9 N - + - 50 10 N - - - - 50 11 N - - + - 50 21 DPV 1 N - - - - 50 2 N - - ++ - 110 3 N - - - - 50 4 N - - - 两 50 5 N - - - - 50 6 N - - + - 50 7 N - - - 50 8 N - - - 50 9 N - - - - 50 10 N - - - - 50 134389.doc -23 · 200920397 表4:效力表：來自各雞之經曱醛固定之雞氣管之組織學 報告 組 雞 纖毛 杯狀細胞/M 毛細管擴張 LC/PC PMN 厚度(微米） 未接種疫苗 :受到攻擊 1 - + ++ ++++ ++ 410 2 +/ - + - 90 3 N + - - - 50 4 - - ++++ ++++ - 420 5 N + + + - 60 1 6 - + ++++ ++++ +++ 400 7 - - ++++ ++++ - 440 8 - - ++++ ++++ ++++ 280 9 + - - - 40 10 - - ++++ ++++ - 260 11 - + ++++ ++++ +++ 450 接種疫苗且受到攻擊 1 - - ++ ++++ - 380 2 N - + + - 40 3 N - + + - 50 4 睡 - + +++ ++ 220 3 5 N - + + 60 6 N - + + • 60 7 N - - - - 50 8 N - - - - 50 9 N - + + - 50 10 +/- - + ++ - 140 未接種疫苗 ;未受到攻擊 1 N - + - 50 2 N - - + - 50 3 N - - - 50 5 4 N - - + - 50 5 N - - - - 50 6 N - - + - 50 7 N - - - - 50 8 N - + - 50 9 N - - - - 50 134389.doc -24- 200920397 安全性及效力表（表3及4)之關鍵： •所有”接種疫苗的’，烏類皆係藉由粗噴霧使用疫苗菌株 MGx+47以3.62x107CCU/mL/鳥進行疫苗接種； •所有，，受到攻擊的"鳥類皆使用0.5毫升雞敗血性黴漿菌 株R以7.74xl〇5CCU/mL經氣管内（IT)攻擊； •時間點（表3 ··安全性表中）=檢查雞時疫苗接種後之天 數，表示為#疫苗接種後天數（DPV); •纖毛："Ν” =正常纖毛；"_"=纖毛脫落； •杯狀細胞/Μ("-" =正常杯狀細胞；” + "=呼吸道表面上 有黏液）； •毛細官擴張沒有擴張或炎症；"+ ”=中等毛細管擴 張或炎症，”++” =嚴重毛細管擴張或炎症）； • LC/PC =淋巴細胞及漿細胞（”·" =無；„ + "=少；”++++,,= 大量）； • PMN=異嗜性白血球（"-"二無；"+ "=少；，,++++、大 量）。 第2組雞（接種疫苗但未受到攻擊）與第5組雞（未接種疫 田，未文到攻擊）之組織學分析基本上類似，此證實新生 成MGx+47疫苗菌株之安全性。（參見（例如）上表2)。 對於效力，與第1組雞（未接種疫苗且受到攻擊）相比， 第3組雞（接種疫苗且受到攻擊）顯示肺泡炎顯著減弱。（參 見（例如）表2及4)。另外，如表4所示，在纖毛、杯狀細 胞、毛細管擴張、淋巴細胞及漿細胞（Lc/pc)、異嗜性白 血球（PMN)及氣官厚度方面，第3組雞呈現較少之雞敗血 134389.doc -25- 200920397 性黴漿菌感染組織學體徵。（參見表4)。 因此，该實例證實MGx+47係安全且有效之活減毒雞敗 血性黴漿菌疫苗菌株。 實例3 MGx+47疫苗菌株之蛋白質組學定性 在努力於分子層面上更準確地定義MGx+47疫苗菌株（參 見實例1及2)之過程中，對該g株進行蛋白f組學分析。 在》亥實例中，自野生型雞敗血性黴漿菌株及自新 錳別出之疫苗菌株MGx+47分離總蛋白質。藉由二維聚丙 烯醯胺凝膠電泳隨後藉由電腦分析凝膠圖像分辨來自各菌 蛋白質（參見圖1)。鑑別在疫苗菌株中表現不同之蛋 白質斑點。自凝膠切除與野生型菌株相比在疫苗菌株中不 存在或以顯著降低程度表現之蛋白質斑點。 ，MGx+47疫苗菌株中鑑別出五個與野生型雞敗血性徽 ★ “相比以顯著降低程度表現之斑點。自凝膠切除每一該 等蛋白質關並對其進㈣㈣化。隨後使用基質輔助之 ^解吸/電離飛行時„譜（MALm·卿⑽）實施肽質量 :教^I將對於每—蛋^斑點所鑑別出之質譜與肽質 : 進仃比較以鑑別該等蛋白質及編碼其之對應基 为析之結果匯總於下表中： 134389.doc • 26 - 200920397 表5 : MGx+47蛋白質組學分析之匯總 基因 產物 功能 在野生型 MG中之表 現程度 在 MGx+47 中之表現 程度 表現降低 之百分比 acoA 丙酮酸 脫氫酶 為能量產生及轉 化所必需（克氏 循環（Kret/s Cycle)) 0.1872 0.0858 54.2% eno 磷酸丙 酮酸水 合酶 催化磷酸烯醇-丙酮酸形成 0.0683 0.0173 74.7% deoC 2-脫氧 核糖-5- 磷酸醛 縮酶 為核苷酸代謝所 必需 0.0525 0.0309 41.1% rpml 核糖體 蛋白質 L35 轉譯、核糖體結 構及生物來源 0.1171 0.0259 77.9% MGA—0621 推定蛋 白質 未知 0.4534 0.0835 81.6% 基因產物之表現降低亦可以術語”表現降低至幾分之一 表示。舉例而言，在表5中，可認為菌株MGx+47呈現 acod、、c/eoC、rpm/、及 MGA_0621 之表現分別降低至 ' 野生型 MG之 1/2.2、1/3.9、1/1.7、1/4.5 及 1/5.4。 - 如表5所示，鑑別出與野生型R-980菌株相比在活減毒 MGx+47疫苗菌株中具有顯著降低表現之五種基因產物： AcoA、Eno、DeoC、RmpI 及 MGA_0621(NCBI 登錄號為 NP_852784之經鑑別推定蛋白質）。重要的是，該等基因中 有三種（flcoj、eno及編碼與代謝/能量產生途徑有關 134389.doc -27- 200920397 之蛋白質。另外，Ac〇A、En〇、De〇c、及尺_之類似物 可見於大多數黴漿菌屬種中，此強烈表明一或多種該等基 因產物之下調可係使黴漿菌減毒之通用策略。 儘管已經由出於理解清楚之目的的舉例說明及實例詳細 地闡述了别述發明，但本發明並非限定於所揭示之具體實 施例，而是意欲涵蓋隨附申請專利範圍所定義之本發明精 神及範圍内之所有改變及修改。 本說明書中所提及之所有出版物及專利皆表示彼等熟習 本發明所涉及之技術者之熟練程度。所有出版物及專利均 以引用的方式併入本文中’其程度如同將每一個別出版物 或專利申請案特定地和個別地指示以引用方式併入本文 中。 【圖式簡單說明】 圖1係繪示減毒雞敗血性黴漿菌株MGx+47之蛋白質斑點 之二維（2-D)聚丙烯醯胺凝膠照片。編號為19、49、74、 、114、127、147、166、175及225之用圓圈圈出之斑 點對應於與野生型菌株r_980相比在MGx+47中上調之蛋白 質。編號為40、68、98、99、130、136及217之用圓圈圈 出之斑點對應於與野生型菌株R-980相比在MGx+47中下調 之蛋白質。 1343 B9.doc -28-

Claims (1)

1. 200920397 十、申請專利範圍： 1 · 種活減毒黴漿菌細菌，其比相同屬種 生型黴漿菌細菌降低一或多種選自由下列組成之群之蛋 白質表現：丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合酶、 A脫氧 核糖-5-磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白質l35。 2. 如請求項1之細菌，其中該細菌係源自動物病原性 菌細菌。 聚 3. 如凊求項2之細菌，其中該動物病原性黴漿菌細菌係人 類病原性黴漿菌細菌。 “ 4’如凊求項3之細菌，其中該人類病原性黴漿菌細菌係屬 於選自由下列組成之群之細菌屬種：生殖器黴漿菌(你 • um)發酵域滎菌（M 、唾液黴f菌 、人型黴漿菌（从厶⑽如））、肺炎黴漿菌 P仍〇叫、未明黴衆菌（Μ·⑻0州似）、穿透黴漿 Ρ州"_)、梨黴漿菌（从_謂）、咽黴漿菌（从 =__)、嗜脂黴聚菌（M咖咖㈣、及頻 . buccale)。 叫、似· 5.如請求項1之細菌 衆函細菌。 6 _如請求項5之細菌 原性黴漿菌細菌。 7_如請求項6之細菌 其中該細菌係源自非人類病原性 其中該非人類病原性細菌係禽鳥病 於選自由 其中该禽鳥病原性黴漿菌細菌係屬 , W、且成之細菌屬種：陰溝黴漿菌⑽ 、雞黴 再傲水固（从 …菌（M_ ga//mc^謂）、雞敗血性黴漿菌 134389.doc 200920397 (从加//卿…謂）、吐綬雞黴漿菌（M gall〇pav〇nis)、嗜 肝糖黴黎菌（Μ· glyCophilUm)、惰性黴漿菌（M. iners)、 衣阿華徽襞菌（M. i〇wae)、生脂黴漿菌（M. np〇faciens)、 火雞黴漿菌（M. meleagridis)、及滑膜黴漿菌（M 8. 如咕求項5之細菌，其中該非人類病原性細菌係豬病原 性黴漿菌細菌。 9. 如靖求項8之細菌，其中該豬病原性黴漿菌細菌係屬於 選自由下列組成之細菌屬種：絮狀黴漿菌（M. fl〇CCUlare)、緒肺炎黴漿菌（从、豬鼻黴 漿菌（Λ/.紗0咖他）、及豬關節滑膜黴漿菌（M hyosynoviae) ° 10. 如請求項5之細菌，其中該非人類病原性細菌係綿羊、 牛、山羊或犬病原性黴漿菌細菌。 11. 如請求項10之細菌，其中該綿羊、牛、山羊或犬病原性 黴漿菌細菌係屬於選自由下列組成之細菌屬種：山羊黴 漿菌山羊亞種（M. capric〇lum subsp capric〇lum)、山羊 徽榮菌山羊肺炎亞種（M. capric〇ium subsp capHpneumoniae)、絲狀黴漿菌絲狀亞種lc型％ mycoides subSp· myC〇ides LC)、絲狀黴漿菌山羊亞種（M mycoides subsp. capri)、牛黴漿菌（M j〇w幻、牛眼黴漿 菌（M. b0V0Culi)、犬黴漿菌（M. canis)、加利福尼亞黴漿 菌（M_ calif0rnicum)、及殊異黴漿 g (M dispar)。 12. 如請求項！之細菌，其中該細菌之該一或多種蛋白質表 134389.doc 200920397 現比該野生型細 如請求項2之細

   請求項1之細菌 ，兵〒該細闺之該一或多種蛋白質表 降低至少50%。 ，其中該細菌之該一或多種蛋白質表 降低至少75%。 ，其中該細菌降低丙酮酸脫氫酶之表 現。 、、員1之、”田囷，其中該細囷降低碟酸丙酮酸水合酶 之表現。 17·如π求項丨之細菌，其中該細菌降低2•脫氧核糖磷酸 路縮酶之表現。 18·如請求項i之細菌，其中該細菌降低核糖體蛋白質[μ之 表現。 19. 如凊求項！之細菌’其中該細菌降低丙酮酸脫氫酶、磷 酸丙酮酸水合酶、2_脫氧核糖_5_磷酸醛縮酶、及核糖體 蛋白質L3 5之表現。 20. —種疫苗組合物，其包含： (a) 活減毒黴漿菌細菌，其比相同屬種野生型黴漿菌細 菌降低一或多種選自由下列組成之群之蛋白質表 現：丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脫氧核 糖-5-磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白質L35 ;及 (b) 醫藥上可接受之載劑。 21. 如請求項20之疫苗組合物，其中該細菌之該一或多種蛋 白質表現比該野生型細菌降低至少25%。 134389.doc 200920397 22. 如請求項21之疫苗組合物，其中該細菌之該一或多種蛋 白質表現比該野生型細菌降低至少5 〇 〇/〇。 23. 如請求項22之疫苗組合物，其中該細菌之該一或多種蛋 白質表現比該野生型細菌降低至少7 5 %。 24. 如請求項20之疫苗組合物，其中該細菌降低丙酮酸脫氫 酶之表現。 25. 如請求項20之疫苗組合物，其中該細菌降低磷酸丙酮酸 水合酶之表現。 26. 如請求項20之疫苗組合物，其中該細菌降低2_脫氧核糖_ 5-磷酸醛縮酶之表現。 27·如請求項20之疫苗組合物，其中該細菌降低核糖體蛋白 質L35之表現。 28·如清求項20之疫苗組合物，其中該細菌降低丙酮酸脫氫 酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶、及 核糖體蛋白質L35之表現。 29. —種為動物接種疫苗對抗黴漿菌感染之方法，該方法包 括向動物投與免疫有效量之疫苗組合物，該疫苗組合物 包含一種活減毒黴漿菌細菌，其比相同屬種野生塑徽浆 菌細菌降低一或多種選自由下列組成之群之蛋白質表 現：丙酮酸脫氫酶、填酸丙酮酸水合酶、2_脫氧校糖5 磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白質L3 5。 30_如凊求項29之方法，其中該細菌之該一或多種蛋白質表 現比該野生型細菌降低至少25%。 3 1 ·如請求項30之方法，其中該細菌之該—或多種蛋白質表 134389.doc 200920397 現比該野生型細菌降低至少5〇0/〇。 32. 如請求項31之方法，其中該細菌之該一或多種蛋白質表 現比該野生型細菌降低至少7 5。/〇。 33. 如請求項29之方法’其中該細菌降低丙酮酸脫氫酶之表 現。 3 4.如請求項29之方法，其中該細菌降低磷酸丙酮酸水合酶 之表現。 35.如請求項29之方法，其中該細菌降低2_脫氧核糖_5_磷酸 路縮酶之表現。 3 6.如請求項29之方法’其中該細菌降低核糖體蛋白質l35 之表現。 37. 如凊求項29之方法，其中該細菌降低丙酮酸脫氫酶、磷 酸丙酮酸水合酶、2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶、及核糖體 蛋白質L35之表現。 38. —種鑑別減毒黴漿菌純系之方法，該方法包含： Ο)使初始黴漿菌細菌群體接受減毒條件，藉以製備推 定的減毒細菌群體；及 (b)分析該推定減毒細菌群體之各純系與相同屬種野生 型傲衆鹵細菌相比是否降低一或多種選自由下列組 成之群之蛋白質表現：丙酮酸脫氫酶、磷酸丙酮酸 水合酶、2-脫氧核糖_5_磷酸醛縮酶、及核糖體蛋白 質L35 ;及 (0測試（b)中所鑑別降低該一或多種蛋白質表現之純系 之毒性； 134389.doc 200920397 !1=目：屬種野生型黴敢菌細菌降低該-或多種蛋白 39. 如請求項38低母佳之徽聚菌純系即為減毒黴衆菌純系。 外傳代該初:彳=菌其中⑷之該等減毒條件包括在活體 ° <數漿痛細菌群體至少2次。 40. 如請求項39之方法，甘上 外傳代兮、/ ^中（a)之該等減毒條件包括在活體 k初始黴漿菌細菌群體至少5次。 41. 如請求項40之方法 外僖枝#、 、T ()之°玄荨減毒條件包括在活體 卜傳代•刀始黴㈣細㈣體至少1〇次。 42. 如請求項38之方法， ^ λ ^ Τ ()之該荨減毒條件包括使用隨 細菌群體。 干之轉位子來轉化該初始黴衆菌 43. 如請求項38之方法， （該4減毒條件包括使該初 群體暴露於化學誘變 44. :;:項38之方法，其中在(b)中藉由逆轉錄酶-聚合酶 ? = (RT—PCR)分析該衫減毒細菌群體之該等各純系 疋否降低該一或多種蛋白質表現。 45_如請求項38之方法， 在中稭由西方墨點分析法分 減毒細菌群體之該等各純系是否降低該 種蛋白質表現。 之方法，其中在⑷中測試⑻中所鑑別該等純 , 生’其係將一或多種該等純系投與易受該野生型 細菌感染之動物’並在投與該—或多種純系後， =動物所觀察到之臨床症狀與未投與該等純系之對 照動物之臨床症狀進行比較。 134389.doc 200920397 喷霧投藥法或 47.如請求項29之方法，其中藉由直接注射、 飲用水投藥法將該疫苗組合物投與該動物 134389.doc 200920397 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 134389.doc