RU2473682C2

RU2473682C2 - Живая аттенуированная бактерия mycoplasma, вакцина содержащая ее и способ идентификации такой бактерии

Info

Publication number: RU2473682C2
Application number: RU2010110447/10A
Authority: RU
Inventors: Махеш КУМАР; Мухаммад Аюб ХАН
Original assignee: ВАЙЕТ ЭлЭлСи
Priority date: 2007-09-11
Filing date: 2008-09-12
Publication date: 2013-01-27
Also published as: BRPI0816686A2; WO2009036241A1; CL2008002709A1; TW200920397A; CN101820902A; US20120045476A1; AR068419A1; MX2010002867A; KR20100072019A; JP2012501624A; CO6270237A2; AU2008298749A1; RU2010110447A; EP2209489A1; CA2699367A1; US20090068231A1; ZA201002515B

Abstract

Представленная группа изобретений относится к области микробиологии и касается живой аттенуированной бактерии Mycoplasma, способа ее идентификации и вакцины, содержащей такую бактерию. Представленная бактерия Mycoplasma проявляет пониженную по меньшей мере на 25% экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35. Вакцина, включающая такой штамм, применима для вакцинации животных против инфекции, вызванной бактериями Mycoplasma. Способ идентификации клонов такой бактерии включает: помещение исходной популяции бактерий Mycoplasma в аттенуирующие условия, с получением предположительно аттенуированной бактериальной популяции; анализ отдельных клонов предположительно аттенуированной бактериальной популяции в отношении пониженной экспрессии одного или более чем одного из вышеуказанных белков и тестирование клонов, идентифицированных, как имеющие пониженную по меньшей мере на 25% экспрессию указанного одного или более чем одного белка, в отношении вирулентности. Представленные изобретения помогают выработать стратегию аттенуирвания бактерий Mycoplasma и могут быть использованы для профилактики заболеваний, вызванных такой бактерией. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 3 пр.

Description

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к областям микробиологии и иммунологии. Более конкретно изобретение относится к новым вакцинам против бактериальных патогенов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Микоплазмы представляют собой мелкие прокариотические микроорганизмы (0,2-0,3 мкм), принадлежащие к классу Mollicutes, члены которого лишены клеточной стенки и имеют геном маленького размера. Mollicutes включают по меньшей мере 100 видов Mycoplasma. Виды Mycoplasma представляют собой возбудителей некоторых заболеваний человека и животных, не являющихся человеком, а также растений.

У людей, например, M. pneumoniae представляет собой основную причину внебольничной пневмонии (непневмококковой бактериальной пневмонии). Другую патогенную для человека микоплазму, M. hominis, связывают с патологическими состояниями мочеполового тракта мужчин и верхнего отдела мочеполового тракта женщин. M. hominis признали причиной негонококкового уретрита, уретропростатита, вагинита, эндометрита, воспалительного заболевания органов таза, цервицита, бесплодия, послеродовой септицемии, выкидышей, низкой массы тела при рождении и пороков развития. Другие патогенные для человека виды Mycoplasma включают M. genitalium (вовлечена в артрит, хронический негонококковый уретрит, хроническое воспалительное заболевание органов таза, другие урогенитальные инфекции, бесплодие и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД)/вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)), M. fermentans (вовлечена в артрит, синдром войны в Персидском заливе, фибромиалгию, синдром хронической усталости, волчанку, СПИД/ВИЧ, аутоиммунные заболевания, боковой амиотрофический склероз (ALS), псориаз и склеродерму, болезнь Крона и синдром раздраженного кишечника (IBS), рак, эндокринные расстройства, рассеянный склероз и диабет), M. salivarium (вовлечена в артрит, расстройства височно-нижнечелюстного сустава (TMJ), расстройства и инфекции глаз и ушей, гингивит и заболевания периодонта, включая полости), M. incognitus и M. penetrans (вовлечены в СПИД/ВИЧ, урогенитальные инфекции и заболевания и аутоиммунные расстройства и заболевания), M. pirum (вовлечена в урогенитальные инфекции и заболевания и СПИД/ВИЧ), M. faucium, M. lipophilum и M. buccale (вовлечены в заболевания десневых борозд и дыхательных путей).

M. gallisepticum и M. synoviae ответственны за существенные болезненные состояния домашней птицы. M. gallisepticum, например, связывают с острым респираторным заболеванием куриц и индюков, а также она может вызывать заболевание верхних дыхательных путей охотничье-промысловых птиц. Кроме этого признано, что M. gallisepticum представляет собой причину конъюнктивита мексиканских чечевиц в Северной Америке. Что касается M. synoviae, то заражение домашней птицы этим видом ведет к уменьшению прироста массы тела и потере производства яиц.

У свиней M. hyopneumoniae представляет собой этиологический агент микоплазменной пневмонии, вызывающей существенные экономические потери в свиноводстве вследствие уменьшенного прироста массы и низкой эффективности кормления. Заражение свиней M. hyopneumoniae вызывает хронический кашель, потускнение шерстного покрова, замедление роста и болезненный вид, длящиеся несколько недель. У зараженных животных наблюдали характерные поражения в виде участков уплотнения от пурпурного до серого цвета, особенно в вентральной верхушечной и кардиальной долях.

M. bovis представляет собой бычий патоген закрытого или интенсивно разводимого мясного и молочного крупного рогатого скота. Наиболее часто описываемое клиническое проявление представляет собой пневмонию телят, которая часто сопровождается артритом, и также известно как пневмоартритический синдром. Ее этиологическую роль также связывают с маститом, отитом и репродуктивным заболеванием и расстройствами коров и быков.

Эффективная стратегия предупреждения и лечения заболеваний, вызываемых микоплазменной инфекцией, представляет собой вакцинацию живыми аттенуированными штаммами бактерий Mycoplasma. Преимущества живых аттенуированных вакцин в общем включают представление всех релевантных иммуногенных детерминант инфекционного агента в их естественной форме иммунной системе хозяина и необходимость сравнительно небольших количеств иммунизирующего агента в соответствии со способностью агента к размножению в вакцинированном хозяине.

Живые аттенуированные вакцинные штаммы часто создают серийным многократным пассированием вирулентного штамма в средах. Хотя живые аттенуированные вакцинные штаммы против некоторых видов Mycoplasma были получены серийным пассированием, такие штаммы в большинстве случаев недостаточно охарактеризованы на молекулярном уровне. Предполагают, что аттенуированные штаммы, полученные серийным пассированием, аккумулировали мутации, которые приводят микроорганизмы в менее вирулентное состояние, но сохраняют способность к репликации. Что касается аттенуированных штаммов Mycoplasma, то последствия мутаций, которые приводят к аттенуации (например, идентичность белков, картину экспрессии которых изменили в аттенуированном штамме), однако, обычно неизвестны.

Таким образом, существует необходимость создания новых живых аттенуированных бактерий Mycoplasma, которые охарактеризованы на белковом уровне и которые безопасны и эффективны в вакцинных композициях.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к живым аттенуированным бактериям Mycoplasma, которые проявляют пониженную экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35, относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида. Живые аттенуированные бактерии Mycoplasma по изобретению могут быть любого из видов Mycoplasma. В конкретном неограничивающем типичном воплощении, согласно изобретению, предложен живой аттенуированный штамм M. gallisepticum, который проявляет пониженную экспрессию пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35, относительно бактерий M. gallisepticum дикого типа. Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения живые аттенуированные бактерии Mycoplasma по изобретению характеризуют с помощью белкового анализа как имеющие пониженную экспрессию одного или более чем одного из вышеупомянутых белков.

Согласно настоящему изобретению также предложены вакцинные композиции, содержащие живые аттенуированные бактерии Mycoplasma по изобретению, а также способы вакцинации животного против инфекции Mycoplasma.

В дополнение, согласно настоящему изобретению предложены способы создания и/или идентификации аттенуированных клонов Mycoplasma. Согласно этому аспекту изобретения способы включают помещение исходной популяции бактерий Mycoplasma в аттенуирующие условия, анализ отдельных клонов в отношении пониженной экспрессии одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35, относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида, и тестирование клонов в отношении вирулентности. Клоны Mycoplasma, созданные способами по этому аспекту изобретения, предпочтительно будут проявлять пониженную экспрессию по меньшей мере одного из вышеупомянутых белков и пониженную вирулентность относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида.

На Фиг.1 представлена фотография “двумерного” (2-D) полиакриламидного геля, показывающего белковые пятна аттенуированного штамма M. gallisepticum MGx+47. Обведенные пятна с номерами 19, 49, 74, 108, 114, 127, 147, 166, 175 и 225 соответствуют белкам, которые позитивно регулируются в MGx+47 относительно штамма дикого типа R-980. Обведенные пятна с номерами 40, 68, 98, 99, 130, 136 и 217 соответствуют белкам, которые отрицательно регулируются в MGx+47 относительно штамма дикого типа R-980.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к живым аттенуированным бактериям Mycoplasma, подходящим для применения в вакцинных композициях. Бактерии Mycoplasma по настоящему исследованию проявляют пониженную экспрессию одного или более чем одного из следующих белков: пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и/или рибосомального белка L35, относительно экспрессии этих белков в бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида.

ВИДЫ МИКОПЛАЗМ

Настоящее изобретение основано частично на неожиданном открытии нового живого аттенуированного вакцинного штамма Mycoplasma gallisepticum, который в белковом анализе продемонстрировал пониженные уровни белков, таких как пируватдегидрогеназа, фосфопируватгидратаза, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолаза и рибосомальный белок L35 (см. Пример 3 здесь). Изобретение проиллюстрировано рабочими примерами с использованием Mycoplasma gallisepticum; однако открытие того, что пониженные уровни пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35 коррелируют с бактериальной аттенуацией, применимо ко всем видам Mycoplasma вследствие сохранения этих белков между видами Mycoplasma.

Например, гомологи белка пируватдегидрогеназы M. gallisepticum (также известного как АсоА) находят, в частности, в M. hyopneumoniae 232, M. hyopneumoniae 7448, M. hyopneumoniae J, M. florum, Mycoplasma capricolum subsp.capricolum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma mobile 163K, Mycoplasma mycoides subsp.mycoides SC, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma pulmonis и Mycoplasma synoviae.

Гомологи белка фосфопируватгидратазы M. gallisepticum (также известного как Еnо) находят, в частности, в M. hyopneumoniae 232, M. hyopneumoniae 7448, M. hyopneumoniae J, M. florum, Mycoplasma capricolum subsp.capricolum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma mobile 163K, Mycoplasma mycoides subsp.mycoides SC, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma pulmonis, Mycoplasma synoviae, Onion yellows phytoplasma, Ureaplasma urealyticum/parvum и Aster yellows witches-broom phytoplasma.

Гомологи белка 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы M. gallisepticum (также известного как DERA или DeoC) находят, в частности, в M. hyopneumoniae 232, M. hyopneumoniae 7448, M. hyopneumoniae J, M. florum, Mycoplasma capricolum subsp.capricolum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma mobile 163K, Mycoplasma mycoides subsp.mycoides SC, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma pulmonis, Mycoplasma synoviae и Ureaplasma urealyticum/parvum.

Гомологи рибосомального белка L35 M. gallisepticum (также известного как Rpml) находят, в частности, в M. hyopneumoniae 232, M. hyopneumoniae 7448, M. hyopneumoniae J, M. florum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumonia и Mycoplasma pulmonis.

Вышеприведенные перечни гомологов предназначены для иллюстрации и не являются исчерпывающими, и специалистам в данной области понятно, что существуют дополнительные гомологи AcoA, Eno, DeoC и/или Rpml в M. gallisepticum в дополнение к перечисленным выше.

Поскольку большинство видов Mycoplasma экспрессирует вариант пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35 и поскольку эти белки, очевидно, обеспечивают гомологичные функции между видами, следовательно, пониженная экспрессия этих белков представляет собой определяющую характеристику аттенуированных штаммов Mycoplasma, как показано на примере аттенуированного штамма M. gallisepticum, описанного в Примерах здесь.

Аттенуированные бактерии Mycoplasma по настоящему изобретению могут быть любого из видов Mycoplasma. В предпочтительном воплощении аттенуированные бактерии имеют происхождение из патогенных для животных бактерий Mycoplasma. Использованный здесь термин “патогенная для животных бактерия Mycoplasma” обозначает бактерию, которая в диком виде, неаттенуированном состоянии может заражать и вызывать заболевание и/или расстройство у животного. “Заболевание и/или расстройство у животного” включает неблагоприятные физические проявления у животного, а также клинические признаки заболевания или заражения, показанные только с помощью гистологической, микроскопической и/или молекулярной диагностики.

Патогенные для животных бактерии Mycoplasma включают патогенные и непатогенные для человека бактерии Mycoplasma. Патогенные для человека бактерии Mycoplasma включают, например, бактерии видов Mycoplasma: M. genitalium, M. fermentans, M. salivarium, M. hominis, M. pneumonia, M. incognitus, M. penetrans, M. pirum, M. faucium, M. lipophilum и M. buccale, но не ограничены ими. Непатогенные для человека бактерии Mycoplasma включают, например, патогенные для птиц, свиней, овец, коров, коз или собак бактерии Mycoplasma. Патогенные для птиц бактерии Mycoplasma включают, например, бактерии видов Mycoplasma: M. cloacale, M. gallinarum, M. gallisepticum, M. gallopavonis, M. glycophilum, M. iners, M. iowae, M. lipofaciens, M. meleagridis и M. synoviae, но не ограничены ими. Патогенные для свиней бактерии Mycoplasma включают, например, бактерии видов Mycoplasma: M. flocculare, M. hyopneumoniae, M. hyorhinis и M. hyosynoviae, но не ограничены ими. Патогенные для овец, коров, коз или собак бактерии Mycoplasma включают, например, бактерии видов Mycoplasma: M. capricolum subsp. capricolum, M. capricolum subsp. capripneumoniae, M. mycoides subsp. mycoides LC, M. mycoides subsp. capri, M. bovis, M. bovoculi, M. canis, M. californicum и M. dispar, но не ограничены ими.

ПОНИЖЕННАЯ ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ МИКОПЛАЗМ

Специалист в данной области сможет определить, используя стандартные молекулярно-биологические методы, проявляет ли аттенуированная бактерия Mycoplasma пониженную экспрессию одного или более чем одного белка, который в норме экспрессируют бактериальные клетки Mycoplasma дикого типа. Определение того, проявляет ли аттенуированная бактерия пониженную экспрессию определенного белка (например, пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы, рибосомального белка L35 и так далее) относительно бактерии дикого типа, можно выполнить с помощью нескольких способов, известных в данной области. Типичные способы включают, например, основанные на антителах количественные способы, такие как вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализы (RIA) и твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), в которых используют антитело, выявляющее и связывающее интересующий белок. В дополнение, поскольку уровни матричной РНК (мРНК) обычно отражают количество белка, кодируемого с нее, основанные на нуклеиновых кислотах количественные способы также можно использовать для определения, проявляет ли аттенуированная бактерия Mycoplasma пониженную экспрессию одного или более чем одного белка. Например, количественные способы, основанные на полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR), можно использовать для измерения количества мРНК, соответствующей определенному интересующему белку. Многочисленные основанные на нуклеиновых кислотах количественные способы хорошо известны в данной области.

Нижеследующее представляет собой неограничивающий типичный способ, который можно использовать для определения, проявляет ли аттенуированная бактерия Mycoplasma пониженную экспрессию, например, фосфопируватгидратазы. Для целей этого иллюстративного способа предполагают, что бактерия Mycoplasma относится к виду M. gallisepticum, однако, специалистам в данной области понятно, что этот типичный способ можно применить в равной степени ко всем видам Mycoplasma и можно использовать для оценки относительной экспрессии любого белка Mycoplasma.

Сначала популяцию аттенуированных клеток M. gallisepticum и популяцию клеток M. gallisepticum дикого типа выращивают в по существу идентичных условиях на по существу одинаковой культуральной среде. Далее эти две популяции клеток помещают в условия, разрушающие клетки. Разрушенные клетки (или их содержащие белок фракции) параллельно подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), а затем вестерн-блоттингу, используя антитело, которое связывает белок фосфопируватгидратазу M. gallisepticum (такие антитела можно получить, используя стандартные способы, хорошо известные в данной области). Затем меченое вторичное антитело используют, чтобы обеспечить измеримый сигнал, который пропорционален количеству белка, извлеченному из клеток. Если величина сигнала, показанного аттенуированным штаммом M. gallisepticum, меньше величины сигнала, показанного штаммом M. gallisepticum дикого типа, то можно сделать вывод о том, что аттенуированный штамм проявляет пониженную экспрессию фосфопируватгидратазы относительно штамма дикого типа. Вариации этого типичного способа, а также его альтернативы будут очевидны для специалистов в данной области.

Настоящее изобретение включает аттенуированные бактерии Mycoplasma, которые проявляют любую степень снижения экспрессии белка (например, пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы, рибосомального белка L35 и так далее) по сравнению с экспрессией этого белка, наблюдаемой в штамме дикого типа. В некоторых воплощениях аттенуированная бактерия проявляет по меньшей мере приблизительно на 5% меньшую экспрессию белка относительно бактерии дикого типа. В качестве примера: если данное количество штамма Mycoplasma дикого типа проявляет 100 единиц экспрессии определенного белка, а такое же количество аттенуированного штамма-кандидата Mycoplasma того же вида проявляет 95 единиц экспрессии белка, то делают вывод о том, что аттенуированный штамм проявляет на 5% меньшую экспрессию белка относительно бактерии дикого типа (дополнительные примеры вычисления “процента уменьшения экспрессии” изложены далее здесь). В некоторых других воплощениях аттенуированная бактерия проявляет по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньшую экспрессию белка относительно бактерии Mycoplasma дикого типа. В других воплощениях аттенуированный штамм Mycoplasma не проявляет экспрессию (то есть, проявляет на 100% меньшую экспрессию) белка относительно бактерии Mycoplasma дикого типа.

В некоторых типичных воплощениях настоящего изобретения аттенуированные бактерии проявляют по меньшей мере на 5% меньшую экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35, относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида.

Использованный здесь термин “процент уменьшения экспрессии” определенного белка, показанный аттенуированным штаммом Mycoplasma относительно штамма дикого типа, вычисляют по следующей формуле: (A-B)/A×100; где A=относительный уровень экспрессии белка в штамме Mycoplasma дикого типа; и B=относительный уровень экспрессии белка в аттенуированном штамме. Только с целью иллюстрации, если штамм Mycoplasma дикого типа проявляет 0,2500 единиц экспрессии белка “Y”, а аттенуированный штамм Mycoplasma проявляет 0,1850 единиц экспрессии белка “Y”, то говорят, что аттенуированный штамм проявляет на [(0,2500-0,1850)/0,2500×100]=26% меньшую экспрессию белка “Y” относительно штамма дикого типа. В таблице 5 в Примере 3 здесь представлены дополнительные иллюстративные примеры процента уменьшения экспрессии, вычисленного для типичного аттенуированного штамма M.gallisepticum относительно штамма M.gallisepticum дикого типа.

ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ

Настоящее изобретение также включает вакцинные композиции, содержащие живую аттенуированную бактерию Mycoplasma по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Использованное здесь выражение “живая аттенуированная бактерия Mycoplasma по изобретению” охватывает любую живую аттенуированную бактерию Mycoplasma, описанную и/или заявленную здесь. Фармацевтически приемлемым носителем могут быть, например, вода, стабилизатор, консервант, культуральная среда или буфер. Вакцинные композиции, содержащие аттенуированные бактерии Mycoplasma по изобретению, можно приготовить в форме суспензии, или в лиофилизированной форме, или альтернативно в замороженной форме. Если форма замороженная, можно добавлять глицерин или другие подобные агенты для увеличения стабильности при заморозке.

СПОСОБЫ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНОГО

Настоящее изобретение также включает способы вакцинации животного против инфекции Mycoplasma. Способы по этому аспекту изобретения включают введение животному иммунологически эффективного количества вакцинной композиции, содержащей живую аттенуированную бактерию Mycoplasma по изобретению. Использованное здесь выражение “живая аттенуированная бактерия Mycoplasma по изобретению” охватывает любую живую аттенуированную бактерию Mycoplasma, описанную и/или заявленную здесь. Выражение “иммунологически эффективное количество” означает такое количество вакцинной композиции, которое необходимо для вызова продукции защитных уровней антител у вакцинированного животного.

Вакцинную композицию можно вводить животному любым способом, известным в данной области, включая пероральный, интраназальный, через слизистые оболочки, местный, трансдермальный и парентеральный (например, внутривенный, внутрибрюшинный, внутрикожный, подкожный или внутримышечный) пути. Введение также можно выполнять, используя безыгольные устройства для доставки. Введение также можно выполнять, используя комбинацию путей, например, первое введение, используя парентеральный путь, а следующее введение, используя путь введения через слизистые оболочки и так далее.

В воплощениях по изобретению, где живая аттенуированная бактерия Mycoplasma представляет собой бактерию Mycoplasma, патогенную для птиц, например бактерию M. gallisepticum, животное, которому вводят аттенуированную бактерию, предпочтительно представляет собой птицу, например курицу или индюка. Если животное представляет собой птицу, вакцинные композиции по изобретению можно вводить так, что композиции немедленно или со временем входят в контакт со слизистыми оболочками дыхательных путей птицы. Таким образом, вакцинные композиции можно вводить птицам, например, интраназально, перорально и/или в глаза. Вакцинные композиции для введения птицам можно изготавливать, как описано выше и/или в форме, подходящей для введения распылением, включая аэрозоль (для интраназального введения), или в питьевой воде (для перорального введения).

Вакцинные композиции по настоящему изобретению, которые вводят распылением или аэрозолем, можно изготовить путем включения живых аттенуированных бактерий Mycoplasma в маленькие частицы жидкости. Частицы могут иметь исходный размер капель от примерно 10 мкм до примерно 100 мкм. Такие частицы можно создать с помощью, например, обычного распылителя или аэрозольных генераторов, включая имеющиеся в продаже распылители для “ранцевого” распыления (knapsack spray), “инкубаторного” распыления (hatchery spray) и “пульверизаторного” распыления (atomist spray).

СПОСОБЫ СОЗДАНИЯ АТТЕНУИРОВАННЫХ КЛОНОВ МИКОПЛАЗМ

В другом аспекте настоящего изобретения, согласно изобретению, предложены способы идентификации и/или создания аттенуированных клонов Mycoplasma. Способы по этому аспекту изобретения включают помещение исходной популяции бактерий Mycoplasma в аттенуирующие условия, создание посредством этого предположительно аттенуированной бактериальной популяции. Затем отдельные клоны предположительно аттенуированной бактериальной популяции анализируют в отношении пониженной экспрессии одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы, рибосомального белка L35, относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида. Клоны, которые идентифицируют как имеющие пониженную экспрессию одного или более чем одного из вышеупомянутых белков, затем тестируют в отношении вирулентности. Клоны, которые проявляют и пониженную экспрессию одного или более чем одного из вышеупомянутых белков, и пониженную вирулентность относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида, идентифицируют как аттенуированные клоны Mycoplasma.

Согласно этому аспекту изобретения “исходная популяция бактерий Mycoplasma” может представлять собой любое количество бактерий Mycoplasma. Бактерии в некоторых воплощениях представляют собой бактерии дикого типа. В качестве альтернативы бактерии могут содержать одну или более чем одну мутацию. Предпочтительно, однако, бактерии в исходной популяции являются клонально-идентичными или по существу клонально идентичными; то есть предпочтительно все бактерии имеют происхождение из одной родительской бактериальной клетки Mycoplasma и/или они имеют идентичные или по существу идентичные генотипические и/или фенотипические характеристики.

Использованный здесь термин “аттенуирующие условия” означает любое условие или комбинацию условий, которое(ая) имеет возможность вносить одно или более чем одно генетическое изменение (например, нуклеотидные мутации) в геном бактерии Mycoplasma. Типичные неограничивающие аттенуирующие условия включают, например, пассирование бактерий в культуре, трансформацию бактерий встраиваемым в геном генетическим элементом, таким как транспозон (например, транспозон, который случайным образом встраивается в геном Mycoplasma), воздействие на бактерий одним или более чем одним мутагеном (например, химическими мутагенами или ультрафиолетовым излучением) и так далее. Если бактериальные клетки аттенуируют пассированием in vitro, клетки можно пассировать любое количество раз, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 или более раз in vitro.

Исходную популяцию клеток Mycoplasma после воздействия аттенуирующих условий называют здесь предположительно аттенуированной бактериальной популяцией. Отдельные клоны предположительно аттенуированной бактериальной популяции можно получить стандартными микробиологическими методами, включая, например, серийное разведение клеток и выделение отдельных клеток на подходящих средах. Полученные отдельные клоны предположительно аттенуированной бактериальной популяции анализируют в отношении пониженной экспрессии одного или более чем одного конкретного белка. Способы определения того, проявляет ли аттенуированная бактерия Mycoplasma пониженную экспрессию одного или более чем одного белка, который в норме экспрессируют бактериальные клетки Mycoplasma дикого типа, описаны здесь. Типичные способы включают, например, способы, основанные на RT-PCR, вестерн-блоттинг и так далее.

Отдельные клоны, которые идентифицируют как имеющие пониженную экспрессию одного или более чем одного белка (например, пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы, рибосомального белка L35), можно тестировать в отношении вирулентности путем введения этих клонов животному, которое восприимчиво к заражению вариантом бактерии дикого типа (неаттенуированным). Использованный здесь термин “животное, которое восприимчиво к заражению бактерией Mycoplasma дикого типа” представляет собой животное, которое показывает по меньшей мере один клинический симптом после заражения бактерией Mycoplasma дикого типа. Такие симптомы известны специалистам в данной области. Например, в случае предположительно аттенуированного штамма M. gallisepticum, который проявляет пониженную экспрессию, например, пируватдегидрогеназы, штамм можно вводить, например, индюкам или курицам (которые в норме восприимчивы к заражению M. gallisepticum дикого типа). Клинические симптомы заражения домашней птицы M. gallisepticum включают, например, острые респираторные симптомы, перикардит, перигепатит, воспаление воздушных мешков, утолщение трахеи, понижение прироста массы тела, децилиация, аномальные бокаловидные клетки, расширение капилляров, увеличенное количество лимфоцитов, плазматических клеток и/или гетерофилов и в некоторых случаях понижение яйценоскости. Таким образом, если предположительно аттенуированный штамм M. gallisepticum при введении курице или индюку приводит к меньшему количеству и/или менее тяжелым симптомам по сравнению с индюком или курицей, которых заразили штаммом M. gallisepticum дикого типа, то предположительно аттенуированный штамм M. gallisepticum считают имеющим “пониженную вирулентность”. Любая степень уменьшения симптомов будет определять предположительно аттенуированный штамм как имеющий пониженную вирулентность. В некоторых воплощениях предположительно аттенуированный штамм будет авирулентным.

Согласно настоящему изобретению клон Mycoplasma, который проявляет пониженную экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35, и который проявляет пониженную вирулентность относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида, представляет собой аттенуированный клон Mycoplasma.

Следующие примеры способа и композиций по настоящему изобретению являются иллюстративными, но не ограничивающими. Другие подходящие модификации и адаптации многообразия условий и параметров, в норме встречающихся в молекулярной биологии и химии, которые очевидны специалистам в данной области с учетом настоящего описания, находятся в пределах сущности и объема данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

СОЗДАНИЕ ЖИВОГО АТТЕНУИРОВАННОГО ШТАММА M. GALLISEPTICUM

Новый живой аттенуированный штамм Mycoplasma gallisepticum создали многократным пассированием штамма M. gallisepticum дикого типа R980 in vitro. В частности 0,1 мл посевного материала штамма M. gallisepticum дикого типа R980 вносили в 20 мл модифицированной среды Фрея (Frey et al., Am. J. Vet. Res. 29:2163-2171 (1968)) (также названной здесь “культуральная среда MG”). Клетки дикого типа выращивали до тех пор, пока цвет среды не изменился на ярко-желтый. Ярко-желтые культуры затем использовали для пересева на свежие культуральные среды MG, как описано выше. Культуру пассировали таким образом в общей сложности 47 раз. Полученный штамм тестировали в отношении аттенуации путем вакцинирования групп птиц и последующего их заражения M. gallisepticum дикого типа. Всех птиц вскрывали через две недели после заражения и наблюдали патологии, связанные с микоплазмой. Многократно пассированный штамм (x+47) обеспечил защиту от клинических признаков, связанных с заражением Mycoplasma gallisepticum. Этот аттенуированный штамм M. gallisepticum, обозначенный MGx+47 (также названный "MG-P48"), депонировали в Американской коллекции типовых культур, P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, 19 июня 2007, и ему был присвоен регистрационный номер РТА-8485.

ПРИМЕР 2

ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ЖИВОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ M. GALLISEPTICUM У КУРИЦ

В этом примере безопасность и эффективность нового вакцинного штамма M. gallisepticum MGx+47, полученного в Примере 1, оценивали у куриц.

Семьдесят одну свободную от патогенных микробов (SPF) белую курицу леггорн разделили на семь групп следующим образом:

Таблица 1
План исследования
Группа	# Куриц	Вакцинированные	Зараженные
1	11	Нет	Да
2	10	Да	Нет
3	11	Да	Да
4а	10	Да	Нет
4б	11	Да	Нет
4в	9	Да	Нет
5	9	Нет	Нет

Куриц в группах 2, 3, 4а, 4б и 4в вакцинировали аттенуированным штаммом MGx+47 в количестве 3,62×10⁷ CCU/мл/птица, введенным грубым распылением в возрасте 4 недель. Куриц в группах 1 и 3 заражали интратрахеально (IT) в возрасте 7 недель 0,5 мл штамма Mycoplasma gallisepticum R в количестве 7,74×10⁵ CCU/мл. На курицах из групп 1, 2, 3 и 5 аутопсию выполняли в возрасте 9 недель, а на курицах из групп 4а, 4б и 4в аутопсию выполняли на 7, 14 и 21 день после вакцинации (DPV), соответственно. У куриц оценивали средний прирост массы тела, перикардит, перигепатит, воспаление воздушных мешков и трахеит. Результаты обобщены в таблице 2.

Таблица 3
Таблица безопасности: Гистологический отчет по фиксированным в формалине трахеям куриц от отдельных вакцинированных/незараженных куриц (Группы 4а, 4б и 4в)
Момент времени	Курица	Реснички	Бокаловидные клетки/М	Расширение капилляров	LC/PC	PMN	Толщина (микроны)
	1	N	-	-	-	-	30
	2	N	-	-	-	-	30
	3	N	-	-	-	-	30
	4	N	-	-	+	-	30
7	5	N	-	-	-	-	30
DPV	6	N	-	-	+	-	30
	7	N	-	-	+	-	30
	8	N	-	-	-	-	30
	9	N	+	-	-	-	30
	1	N	-	-	-	-	50
	2	N	+	-	-	-	50
	3	N	-	-	+	-	50
	4	N	-	-	-	-	50
14	5	N	-	-	-	-	50
DPV	6	N	-	-	-	-	50
	7	N	-	-	-	-	50
	8	N	-	-	-	-	50
	9	N	-	-	+	-	50
	10	N	-	-	-	-	50
	11	N	-	-	+	-	50
	1	N	-	-	-	-	50
	2	N	-	-	++	-	110
	3	N	-	-	-	-	50
	4	N	-	-	-	-	50
21	5	N	-	-	-	-	50
DPV	6	N	-	-	+	-	50
	7	N	-	-	-	-	50
	8	N	-	-	-	-	50
	9	N	-	-	-	-	50
	10	N	-	-	-	-	50

Таблица 4
Таблица эффективности: Гистологический отчет по фиксированным в формалине трахеям куриц от отдельных куриц
Группа	Курица	Реснички	Бокаловидные клетки/М		Расширение капилляров		LC/PC	PMN	Толщина (микроны)
1	Невакцинированные; Зараженные
	1	-	+		++		++++	++	410
	2	+/-	-		-		+	-	90
	3	N	+		-		-	-	50
	4	-	-		++++		++++	-	420
	5	N	+		+		+	-	60
	6	-	+		++++		++++	+++	400
	7	-	-		++++		++++	-	440
	8	-	-		++++		++++	++++	280
	9	-	+		-		-	-	40
	10	-	-		++++		++++	-	260
	11	-	+		++++		++++	+++	450

	Вакцинированные и зараженные
	1	-	-	++		++++		-	380
	2	N	-	+		+		-	40
	3	N	-	+		+		-	50
	4	-	-	+		+++		++	220
3	5	N	-	+		+		-	60
	6	N	-	+		+		-	60
	7	N	-	-		-		-	50
	8	N	-	-		-		-	50
	9	N	-	+		+		-	50
	10	+/-	-	+		++		-	140
	Невакцинированные; Незараженные
	1	N	-	-		+		-	50
	2	N	-	-		+		-	50
	3	N	-	-		-		-	50
5	4	N	-	-		+		-	50
	5	N	-	-		-		-	50
	6	N	-	-		+		-	50
	7	N	-	-		-		-	50
	8	N	-	-		+		-	50
	9	N	-	-		-		-	50

КЛЮЧ К ТАБЛИЦАМ БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ (ТАБЛИЦЫ 3 и 4):

- Всех “вакцинированных” птиц вакцинировали грубым распылением вакцинного штамма MGx+47 в количестве 3,62×10⁷ CCU/мл/птица.

- Всех “зараженных” птиц заражали интратрахеально (IT) 0,5 мл штамма Mycoplasma gallisepticum R в количестве 7,74×10⁵ CCU/мл.

- Момент времени (в Таблице 3: Таблица безопасности) означает количество дней после вакцинации, когда обследовали куриц, выражено как # дней после вакцинации (DPV).

- Реснички: “N”=нормальные реснички; “-”=децилиация.

- Бокаловидные клетки/М (“-”=нормальные бокаловидные клетки; “+”=слизь на дыхательной поверхности).

- Расширение капилляров (“-”=нет расширения или воспаления; “+”=умеренное расширение или воспаление капилляров; “++”=тяжелое расширение или воспаление капилляров).

- LC/PC=лимфоциты и плазматические клетки (“-”=нет; “+”=незначительное количество; “++++”=многочисленные).

- PMN=гетерофилы=полиморфноядерные нейтрофилы (“-”=нет; “+”=незначительное количество; “++++”=многочисленные).

Гистологическое исследование 2 группы куриц (вакцинированных, но не зараженных) было по существу похоже на гистологическое исследование 5 группы куриц (невакцинированных, незараженных), показывая безопасность нового созданного вакцинного штамма MGx+47 (см., например, Таблицу 2 выше).

Что касается эффективности, 3 группа куриц (вакцинированных и зараженных) показала значительное уменьшение воспаления воздушных мешков по сравнению с 1 группой куриц (невакцинированных и зараженных). (См., например, Таблицы 2 и 4). В дополнение, как показано в Таблице 4, 3 группа куриц показала меньшее количество гистологических признаков заражения M. gallisepticum относительно ресничек, бокаловидных клеток, расширения капилляров, лимфоцитов и плазматических клеток (LC/PC), гетерофилов (PMN) и толщины трахеи (см. Таблицу 4).

Таким образом, этот Пример показывает, что MGx+47 представляет собой безопасный и эффективный живой аттенуированный вакцинный штамм M. gallisepticum.

ПРИМЕР 3

БЕЛКОВАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИННОГО ШТАММА MGx+47

При попытке более точно охарактеризовать вакцинный штамм MGx+47 (см. Примеры 1 и 2) на молекулярном уровне проводили белковый анализ этого штамма.

В этом Примере из штамма M. gallisepticum дикого типа R-980 и из нового идентифицированного вакцинного штамма MGx+47 выделяли общий белок. Белки каждого штамма разделяли двумерным электрофорезом в полиакриламидном геле, а затем компьютерным анализом изображений геля (см. Фиг.1). Идентифицировали белковые пятна, которые характерно экспрессировал вакцинный штамм. Белковые пятна, которые отсутствовали или которые были экспрессированы в значительно более низких уровнях в вакцинном штамме по сравнению со штаммом дикого типа, вырезали из геля.

Идентифицировали пять пятен, которые были экспрессированы в значительно более низких уровнях в вакцинном штамме MGx+47 по сравнению с M. gallisepticum дикого типа. Каждое из этих белковых пятен вырезали из геля и гидролизовали ферментами. Затем проводили массовое картирование пептидов, используя времяпролетную масс-спектрометрию с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы (MALDI-TOF MS). Масс-спектры, определенные для каждого белкового пятна, сравнивали с базой данных масс пептидов, чтобы идентифицировать белки и соответствующие гены, которые их кодируют. Результаты этого анализа обобщены в Таблице 5.

Таблица 5
Результаты белкового анализа MGx+47
Ген	Продукт	Функция	Уровень экспрессии в MG дикого типа	Уровень экспрессии в MGx+47	Процент снижения экспрессии
асоА	Пируватдегидрогеназа	Необходим для получения и преобразования энергии (цикл Кребса)	0,1872	0,0858	54,2%
eno	Фосфопируватгидратаза	Катализирует образование фосфоенолпирувата	0,0683	0,0173	74,7%
deoC	2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолаза	Необходим для метаболизма нуклеотидов	0,0525	0,0309	41,1%
rpml	Рибосомальный белок L35	Трансляция, структура и биогенез рибосом	0,1171	0,0259	77,9%
MGA_0621	Гипотетический белок	Неизвестна	0,4534	0,0835	81,6%

Снижение экспрессии генных продуктов также можно выразить в показателях “кратное снижение экспрессии”. Например, в Таблице 5 про штамм MGx+47 можно сказать, что он проявляет 2,2-, 3,9-, 1,7-, 4,5- и 5,4-кратное снижение экспрессии acoA, eno, deoC, rpml и MGA_0621, соответственно, относительно MG дикого типа.

Как указано в Таблице 5, определили, что пять генных продуктов имели значительно пониженную экспрессию в живом аттенуированном вакцинном штамме MGx+47 по сравнению со штаммом дикого типа R-980: AcoA, Eno, DeoC, Rpml и MGA_0621 (гипотетический белок, идентифицированный под регистрационным номером NCBI NP_852784). Важно, что три из этих генов (асоА, eno и deoC) кодируют белки, вовлеченные в метаболические/энергетические пути. В дополнение, гомологи AcoA, Eno, DeoC и Rpml обнаружены у большинства видов Mycoplasma, что решительно означает, что отрицательная регуляция одного или более чем одного из этих генных продуктов может быть основной стратегией аттенуирования Mycoplasma.

Хотя вышеизложенное изобретение описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров в целях ясности понимания, это изобретение не ограничено конкретными раскрытыми воплощениями, а предназначено для рассмотрения всех изменений и модификаций, которые находятся в пределах сущности и объема изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

Все публикации и патенты, упомянутые в этом описании, служат признаком уровня квалификации специалистов в данной области, к которой относится это изобретение. Все публикации и патенты включены сюда посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждую отдельную публикацию или патентную заявку специально и отдельно указали для включения посредством ссылки.

Claims

1. Живая аттенуированная бактерия Mycoplasma для получения вакцины против инфекции Mycoplasma у животных, которая проявляет пониженную по меньшей мере на 25% экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы (АсоА), фосфопируватгидратазы (Еnо), 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы (DERA или DeoC) и рибосомального белка L35 (Rpml), относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида.

2. Бактерия по п.1, где указанная бактерия:
(1) имеет происхождение из патогенной для животных бактерии Mycoplasma;
(2) имеет происхождение из непатогенной для человека бактерии Mycoplasma;
(3) проявляет по меньшей мере на 50% меньшую или по меньшей мере на 75% меньшую экспрессию указанного одного или более чем одного белка относительно указанной бактерии дикого типа;
(4) проявляет пониженную экспрессию пируватдегидрогеназы;
(5) проявляет пониженную экспрессию фосфопируватгидратазы;
(6) проявляет пониженную экспрессию 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы;
(7) проявляет пониженную экспрессию рибосомального белка L35; или
(8) проявляет пониженную экспрессию пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35.

3. Бактерия по п.2, где указанная патогенная для животных бактерия Mycoplasma представляет собой патогенную для человека бактерию Mycoplasma.

4. Бактерия но п.3, где указанная патогенная для человека бактерия Mycoplasma представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из M.genitalium, M.fermentans, M.salivarium, M.hominis, M.pneumonia, M.incognitus, M.penetrans, M.pirum, M.faucium, M.lipophilum и M.buccale.

5. Бактерия по п.2, где указанная непатогенная для человека бактерия представляет собой патогенную для птиц бактерию Mycoplasma, патогенную для свиней бактерию Mycoplasma или патогенную для овец, коров, коз или собак бактерию Mycoplasma.

6. Бактерия по п.5, где указанная патогенная для птиц бактерия Mycoplasma представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из M.cloacale, M.gallinarum, M.gallisepticum, M.gallopavonis, M.glycophilum, M.iners, M.iowae, M.lipofaciens, M.meleagridis и M.synoviae.

7. Бактерия по п.5, где указанная патогенная для овец, коров, коз или собак бактерия Mycoplasma представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из M.capricolum subsp.capricolum, M.capricolum subsp.capripneumoniae, M.mycoides subsp.mycoides LC, M.mycoides subsp.capri, M.bowis, M.bovoculi, M.canis, M.californicuin и M.dispar.

8. Вакцинная композиция для вакцинации животных против инфекции Mycoplasma, содержащая:
(а) живую аттенуированную бактерию Mycoplasma, которая проявляет пониженную по меньшей мере на 25% экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы (AсоА), фосфопируватгидратазы (Еnо), 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы (DERA или DeoC) и рибосомального белка L35 (Rpml), относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида, и
(б) фармацевтически приемлемый носитель.

9. Вакцинная композиция по п.8, где указанная бактерия:
(1) проявляет по меньшей мере на 50% меньшую или по меньшей мере на 75% меньшую экспрессию указанного одного или более чем одного белка относительно указанной бактерии дикого типа;
(2) проявляет пониженную экспрессию пируватдегидрогеназы;
(3) проявляет пониженную экспрессию фосфопируватгидратазы;
(4) проявляет пониженную экспрессию 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы;
(5) проявляет пониженную экспрессию рибосомального белка L35; или
(6) проявляет пониженную экспрессию пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35.

10. Вакцинная композиция, содержащая живую аттенуированную бактерию Mycoplasma, имеющую пониженную по меньшей мере на 25% экспрессию одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы (АсоА), фосфопируватгидратазы (Еnо), 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы (DERA или DeoC) и рибосомального белка L35 (Rpml), относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида, для применения в вакцинации животного против инфекции Mycoplasma.

11. Вакцинная композиция по п.10, где указанная бактерия:
(1) проявляет по меньшей мере на 50% меньшую или по меньшей мере на 75% меньшую экспрессию указанного одного или более чем одного белка относительно указанной бактерии дикого типа;
(2) проявляет пониженную экспрессию пируватдегидрогеназы;
(3) проявляет пониженную экспрессию фосфопируватгидратазы;
(4) проявляет пониженную экспрессию 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы;
(5) проявляет пониженную экспрессию рибосомального белка L35; или
(6) проявляет пониженную экспрессию пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35.

12. Вакцинная композиция по п.10, где указанную вакцинную композицию вводят указанному животному прямой инъекцией, распылением или с питьевой водой.

13. Способ идентификации клонов живой аттенуированной бактерии Mycoplasma, как она определена по п.1, включающий:
(а) помещение исходной популяции бактерий Mycoplasma в аттенуирующие условия, создание посредством этого предположительно аттенуированной бактериальной популяции, и
(б) анализ отдельных клонов указанной предположительно аттенуированной бактериальной популяции в отношении пониженной экспрессии одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из пируватдегидрогеназы, фосфопируватгидратазы, 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы и рибосомального белка L35, относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида, и
(в) тестирование клонов, идентифицированных в (б) как имеющие пониженную по меньшей мере на 25% экспрессию указанного одного или более чем одного белка, в отношении вирулентности,
где клон Mycoplasma, который проявляет пониженную по меньшей мере на 25% экспрессию указанного одного или более чем одного белка и пониженную вирулентность относительно бактерии Mycoplasma дикого типа того же вида, представляет собой клон живой аттенуированной бактерии Mycoplasma.

14. Способ по п.13, где указанные аттенуирующие условия в (а) включают:
(1) пассирование указанной исходной популяции бактерий Mycoplasma по меньшей мере 2 раза in vitro, по меньшей мере 5 раз in vitro или по меньшей мере 10 раз in vitro;
(2) трансформацию указанной исходной популяции бактерий Mycoplasma транспозоном, который случайным образом встраивается в геном Mycoplasma; или
(3) воздействие на указанную исходную популяцию бактерий Mycoplasma химическим мутагеном или ультрафиолетовым излучением.

15. Способ по п.13, где указанные отдельные клоны указанной предположительно аттенуированной бактериальной популяции анализируют в (б) в отношении пониженной экспрессии указанного одного или более чем одного белка посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR) или посредством вестерн-блоттинга.

16. Способ по п.13, где указанные клоны, идентифицированные в (б), тестируют в отношении вирулентности в (в) путем введения одного или более чем одного из указанных клонов животному, восприимчивому к заражению указанной бактерией Mycoplasma дикого типа, и сравнения клинических симптомов, наблюдаемых у указанных животных после введения указанного одного или более чем одного клона, с клиническими симптомами контрольных животных, которым не вводили указанные клоны.