TW200907059A - Recombinant expression vector elements (rEVEs) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells - Google Patents

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200907059 九、發明說明： 本申印案主張2007年3月30曰申請之美國臨時申請案第 60/921，141號之優先權。 【先前技術】 使用核酸載體分子用於在不同及廣泛種類之真核或原核 宿主細胞内表現重組蛋白之多種系統係可用的。使用何種 載體/宿主細胞對之決定通常視何種系統提供呈最佳適於 其所欲用途之形式之所要重組基因產物的最高產率而定。 舉例而言，若諸如糖基化作用之轉譯後修飾對所要重組蛋 白之需要（例如，就抗原性、活性、構形等等而言）係關鍵 的，則真核宿主細胞系統將為所要的，因為原核細胞在特 徵上缺乏轉譯後糖基化活性。亦重要的為，載體/宿主細 胞對不僅產生呈所要形式之經表現基因產物，而且所要經 表現基因產物之分子可易於自產生其之細胞分離。 由於涉及開發欲用於人類療法之重組蛋白的成本逐步升 咼’仍需不斷努力以增加該重組蛋白之表現量，尤其在使 用真核佰主細胞之系統中之表現量。已表徵各種順式及反 式作用調節元件’其具有可改良所要重組基因產物之表現 效率及/或總產率之核苷酸序列（DNA或RNA)。該等調節元 件包括（但不限於）高度有效啟動子、轉錄強化子序列（參 見’例如 ’ Dillon及 Grosveld之評論，TVe«心 Genei” 9: 134 (1993))、基因座控制區（LCR ;參見，例如，Grosveld 等人，CW/, 5/: 975 (1987))、基質或支架連接區（Mar、 SAR ;參見’例如，美國專利第7，129,〇62號；B〇de等人， 130056.doc 200907059 /«ί. 389-454 (1995); Bode等人，〇ίί 五Gene 五xprewi⑽，6: 115-138 (1996));隔離 子元件（參見，例如 ’ Kellum等人 ’ Ce//, <54: 941 (1991); 及内部核糖體進入位點（IRES ;參見，例如，McBratney等 人之評論，C町.0ρ·„. CW/ 出0/·, 5: 961 (1993))。隨後發 現該等元件之一些核酸序列擁有可影響表現之特定子序 列。 f

儘管對於在可影響重組蛋白於各種類型之宿主細胞内之 表現的各種序列及其他因素之瞭解有進展，但仍需要改良 重組蛋白之產率，尤其在當該等重組蛋白欲用於治療或其 他特殊應用時。 【發明内容】 本發明提供經分離之核酸分子（聚核苷酸分子），其包含 增加重組蛋白之表現的核苷酸鹼基序列。該等核酸分子在 本文中稱為重組表現載體元件（rEVE)。與不存在rEVE之表 現量相比，rEVE於表現載體上之存在增加一或多種重組蛋 白之表現量，該或該等重組蛋白係由一或多個駐留於表現 載體上之功能基因來編碼。無論rEVE位於編碼所關注之重 組蛋白之基因的5’、3,亦或5,及3,(例如側接)，重組蛋白之 表現量之該rEVE介導之增加均係可能的。無論編碼於分離 相應基因上亦或編碼於表現載體上存在之單一多順反子美 :上’表現載體上存在之rEVE可增加一或多種重組蛋白二 ^見舌REVE可用以使用穩定表現系統及瞬間表現***來 增加重組蛋白之表現量。 元术 i30056.doc 200907059 在一實施例中，本發明提供經分離之rEVE聚核苷酸分 子，其包含選自由以下各者組成之群的核苷酸鹼基序列： SEQ ID NO:l(”ARMr’）之鹼基序歹ij 、SEQ ID NO:2 ("ARM2”）之鹼基序列及前述序列之任一者的增加表現部 分，其中當rEVE聚核苷酸作為編碼所關注之重組蛋白之重 組基因存在於相同表現載體上時，重組蛋白之表現量與不 存在rEVE之表現量相比係增加的。 本發明之較佳rEVE分子包括2329鹼基對（bp)之rEVE核酸 分子，其具有SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸鹼基序列；及2422 bp 之rEVE核酸分子，其具有SEQ ID NO:2之核苷酸鹼基序 列。 SEQ ID NO:2之序列之3'末端區含有對rEVE介導之蛋白 表現增加而言關鍵之序列。該等較佳SEQ ID NO:2之3’末 端區序列包括SEQ ID NO:2之鹼基462-2422之序列及SEQ ID NO:2之鹼基1087-2422之序列。 包含本文中所述之核苷酸鹼基序列之一或多者的分離之 rEVE核酸分子可具有多種形式中之任一者，包括（而不限 於）直鏈核酸分子、質體、真核病毒分子、原核病毒（噬菌 體）分子、人工染色體及重組染色體。 在一較佳實施例中，本發明提供包含至少一種本文中所 述之rEVE之表現載體。與在載運缺乏rEVE之相同表現載 體之宿主細胞中的表現量相比，該含rEVE之表現載體在適 當宿主細胞中提供至少一個編碼於表現載體上之重組蛋白 的增加（提高）之表現量。適用於本發明之表現載體包括任 130056.doc 200907059 何核酸載體分子’其可經工程化以在適當（同源）宿主細胞 中編碼及表現—或多種重組蛋白。該等表現載體包括（而 不限於)真核質體載體、真核病毒載體、原核質體、噬菌 體載體、穿梭載體（例如在真核及原核細胞中複製之載 體）迷如、染色體（mini-chromosome)及各種人工染色體。 較佳地，表現載體為質體表現載體，更佳為穩定整合至真 核宿主細胞基因組中之質體表現載體，且甚至更佳為藉由 非同源重組穩定整合至宿主細胞基因組中之質體表現載 體。 在另一實施例中，本發明提供宿主細胞，其含有包含本 文中所述之rEVE及指導至少一種重組蛋白於宿主細胞内之 表現之重組基因的表現載體。宿主細胞可為真核或原核宿 主細胞。適用於本發明之較佳真核宿主細胞包括（而不限 於）哺乳動物宿主細胞' 植物宿主細胞、真菌宿主細胞、 真核藻類宿主細胞、原生動物宿主細胞、昆蟲宿主細胞及 魚宿主細胞。更佳地，適用於本發明之宿主細胞為哺乳動 物宿主細胞’包括（但不限於）中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞、 COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髓瘤細胞、人類 胚腎（HEK 293)細胞、嬰兒倉鼠腎（BHK)細胞、海拉細胞 (HeLa cell)、人類B細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3 細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞及MDCK細胞。尤佳的為 CHO細胞，其可經標準曱胺嗓呤處理方案處理以擴增嵌入 宿主細胞中之表現載體上之重組基因的複本數量。可在本 發明中用作宿主細胞之真菌細胞包括（而不限於）子囊菌細 130056.doc 200907059 他，識如麴菌屬{Aspergillus、、鏈孢黴屬QNeufospora)，反 酵母細胞，尤其為選自由以下各者組成之群之屬的酵母： 酵母菌屬（Saccharomyces)、畢赤酵母屬[Pichia、、漢森酵 母屬{Hansenula)、裂殖酵母屬（JSchizosaccharomyces)、刻 魯維拉菌屬[Kluyveromyces)、耶羅維亞酵母屬〈Yarr〇wia〉 及念球者邊（Ca«山·ί/α)。可根據本發明充當用於表現重組蛋 白之宿主細胞的較佳酵母物種包括（但不限於）騣濟摩母 {Saccharomyces cerevisiae)、多形漢森酵母（Jiansenula polymorpha)、乳酸刻魯維拉菌[Kluyveromyces lactis、、甲 醇酵母{Pichia pastoris)、 粟酒裂殖酵母 {Schizosaccharomyces pombe)反耶羅維亞解脂酵母 (nrrow/fl /z>o/y"ca)。可根據本發明用於表現重組蛋白之 原核宿主細胞包括（而不限於）乂廣择苈（仏 coif)、腸道沙門氏菌{Salmonella enterica) t缸清变雙美 後，志賀桿菌種{Shigella species)、產玻珀酸沃廉菌 (Wollinella succinogenes')、普通變形桿菌〈pr〇teus vulgaris、、雷特格氏變形桿菌QProteus mirabilis)、遲緩愛 德華氏菌{Edwardsiella tarda)、 弗氏檸檬酸桿菌 {Citrobacter freundii)、巴氏桿菌種{Pasteurella species、、 嗜血桿菌種{Haemophilus species)、假單’胞菌種 [Pseudomonas species、、桿菌種{Bacillus species)、葡萄球 菌種{Staphyloccocus species)反鏈球菌種{Streptococcus •specz_e«s)。可根據本發明用作表現重組蛋白之宿主細胞之 其他細胞包括原生動物細胞，諸如錐蟲類宿主场:够办分f 130056.doc -10- 200907059 原蟲（Leishmania tarentolae) ’瓦爽氣氣秀麗引桿線虫 (^Caenorhaditis elegayts)^^ 細 ° 如本文中所述之rEVE聚核苷酸、包含一或多個本文中 所述之rEVE之載體及包含包括一或多個如本文中所述之 rEVE之該等載體的宿主細胞可用於與所關注之重組蛋白之 表現有關.的多種方法中。 在一實施例中，本發明提供增加所關注之重組蛋白於宿 主細胞中之表現的方法，其包含以下步驟：將重組表現载 體嵌入宿主細胞中，該重組表現載體包含本文中所述之 rEVE及編碼所關注之重組蛋白且指導所關注之重組蛋白於 相主細胞中之合成的重組基因；及在促進重組蛋白表現之 條件下培養宿主細胞。 在另一實施例中’本發明提供產生抗甲胺喋呤之宿主細 胞之方法，該等宿主細胞在不存在曱胺喋呤（"ΜΤχ")時， 亦即在不存在用於藉由曱胺喋呤之存在所提供之重組蛋白 的提高表現之選擇性壓力時，以增加量穩定（與瞬間對比） 表現重組蛋白。該方法包含以下步驟：將表現載體嵌入宿 主細胞令，該表現載體包含編碼所關注之重組蛋白之重組 基因 '本文中所述之rEVE及編碼二氫葉酸還原酶 (DHFR")之基因；在曱胺喋呤存在下使宿主細胞生長以選 擇表現所關注之重組蛋白之抗曱胺喋呤之宿主細胞；及分 離抗甲胺喋呤之宿主細胞，纟中抗甲胺喋呤之宿主細胞以 比曱胺嗓呤敏感性宿主細胞之彼者更高之量來表現所關注 蛋白’且其中當在存在或不存在曱胺蝶呤下生長 130056.doc 200907059 時’抗甲胺喋呤之宿主細胞穩定表現升高含量之所關注之 重組蛋白。在一尤佳實施例中，用於該方法中之rEVE包含 SEQ ID NO:2之序列或其增加表現部分’當作為編碼所關 注之重組蛋白之基因存在於相同表現載體上時，其增加重 組蛋白於宿主細胞中之表現量。 在另一實施例中’本發明提供在用於擴增重組蛋白表現 之DHFR-曱胺喋呤程序中產生對甲胺喋呤之存在具有增加 或改良適應性之彳S主細胞群體的方法，其包含以下步驟： 將表現載體嵌入宿主細胞中’該表現載體包含編碼所關注 之重組蛋白之基因、本文中所述之rEVE及DHFR基因，其 中與載運缺乏rEVE序列之表現載體之宿主細胞群體相比， 含有表現載體之宿主細胞群體適應更好，亦即，在曱胺嗓 呤存在下’具有更高存活性及/或更高生長速率。 在另一實施例中，本發明提供增加重組蛋白於使用 DHFR-曱胺喋呤程序獲得之宿主細胞中之擴增（升高）表現 的方法，其包含以下步驟：將表現載體嵌入宿主細胞中， s亥表現載體包含編碼所關注之重組蛋白之重組基因、本文 中所述之rEVE及DHFR基因；在曱胺喋呤存在下使宿主細 胞生長以選擇表現所關注之重組蛋白之抗曱胺喋吟之宿主 細胞；及分離抗甲胺喋呤之宿主細胞，其中經分離之抗甲 胺嗓呤宿主細胞在甲胺喋呤存在下，以比含有缺乏rEVE之 相同表現載體之抗曱胺喋呤宿主細胞的彼者更高之量表現 重組蛋白。 儘管諸如5 nM至10 μΜ之更低及更高濃度亦可成功用於 130056.doc -12- 200907059 該等方法中以選擇所關注之重組蛋白之擴增表現，但甲胺 喋呤可方便地以20 nM至500 nM之範圍用於本文中所述之 方法中。 在另一實施例中，本發明提供減少、大體上抑制或基本 上休止重組蛋白自表現載體表現之方法。該等方法使用包 含rEVE之一或多個片段之表現載體，該rEVE提供比使用 包含SEQ ID N0.1或SEQ ID NO:2之序列之rEV£所提供更 r

低量之特定重組基因產物的表現。該等片段具有SEQ NO:2之特定截短變異體，其包括SEq ID N〇:2之鹼基卜 1〇86或SEQ ID NO:2之鹼基1_46丨之核苷酸鹼基序列。具有 由SEQ ID NO:2之鹼基1-461組成之戴短ARM2序列的核酸 分子尤其適用於抑制或大體上休止重組蛋白自宿主細胞中 之載體分子之表現。該等發現亦指示：SEQ ID 之核 苦酸驗基462-M22之序列及SEq m N〇:2之核苷酸鹼基 i 087-2422之序列對最大rEVE介導之重組蛋白表現之增加 而言最佳。 表現可藉由一或多種本文中所述之rEVE分子來增加之 重組蛋白可為任何蛋白（包括肽、多肽及寡聚蛋白），其功 能基因可經工程化至用於在適當宿主細胞中表現之核酸載 體分子中。該等蛋白包括（而不限於）可溶性蛋白、膜蛋 白、結構蛋白（亦即，向細胞、組織或器官提供結構或支 撐之蛋白）、核糖體蛋白、酶、酶原、抗體分子、細胞表 面受體蛋白、轉錄調節蛋白、轉譯調節蛋白、染色質蛋白 (例如組蛋白）、激素、細胞週期調節蛋白、G蛋白、 130056.doc •13- 200907059 活性肽、免疫調節蛋白（例如介白素、細胞激素）、血液組 分蛋白、離子閘蛋白、熱休克蛋白、二氫葉酸還原酶、抗 生素抗性蛋白、其功能片段、其含抗原決定基之片段，及 其組合。 含有本文中所述之rEVE之序列或其部分的核酸分子亦 可作為核酸探針用於藉由核酸雜交來識別其他核酸分子中 之rEVE序列之存在，或作為適用於各種聚合酶鏈反應 (PCR)程序中之引子來源，例如可用於操縱、識別、產生 或擴增本文中所述之rEVE序列。 諸如 ARM1(SEQ ID ΝΟ:1)及 ARM2(SEQ ID NO:2)之彼等 序列之REVE序列可包含一或多個基質連接區（MAR)序 列。MAR序列可在rEVE序列内以叢集形式出現，包括在 rEVE序歹之5’及/或3’末端區處呈叢集形式。如本文中所述 之rEVE聚核苷酸為MAR序列之適合來源。因此，本發明 提供適用於增加核酸分子中之MAR序列之組合物及方法， 該等方法包含將含有一或多個MAR序列的本文中所述之 rEVE或本文中所述之rEVE之一部分嵌入核酸分子中。 本文中所述之核苷酸鹼基序列亦用以提供其互補序列。 本文中所述之DNA分子及核苷酸鹼基序列亦提供相應RNA 分子及鹼基序列，其中胸腺嘧啶（T)係由尿嘧啶（U)及與其 互補之核酸序列置換。 【實施方式】 本發明基於以下發現：一或多種包含SEQ ID ΝΟ:1 :之 核苷酸序列： 130056.doc •14· 200907059 aattgaattcgttccctttagtgagggttaattccgcggccgcgtcgacagctctagagggagt gccaggataggctccaaagctacacagagaatccctgtttcaaaaaaccaaaaaaaaaaaaa taaaaaataaaaaataaaaagtagggtacagatctaaatagacaattctcaatagaggaatcta aaatgcctgaaagacaaataagaaagtgttcaacatccttagccatcagggaaatgcaaatca aaacaactctgagatactatcttactcctgtcataatggccaaattcaaaaacactaatgacagt tcatgttggagagaatgtggagaaagaggagcacttctccactgctggtgggagtgccaactt ggacagccactttggaaatcagtatggctactcctcaagaaaatggaaatcagtttaccacaa gatccagcaattccactcaggcatatacccaaaagaaccgcattcatacaagcaatatctgttc aacgatgttcatagcagctctatttgtaacagccagaaactggaagcagcctagttgcacctca accaaagaaatggatagagaaaatatggtacatttatgcaatggagtactactcagcggaaaa gtacaatggaatcttgaaatttgcaagaaaatggatggaactagaagaaacctttctgagcaag gtaactcaatcacaaaaagacaaacatgatatgtaatcactcatatgtggattttagacacagtg taaaggattaccagcctacaatccacactgccaaagaacctaataaacaaggaggaccctaa gggagacatacatggtcccctggagatggggaatgggtcaagatatgctgagcaaagtggg aacatgggaagaggggggaaggagctaggaaattgagaaagggagaaaaggagggatgc agaggacataagggagcagaaacattgactcagggaatgaatcgaagataacaagccatgg agatatcataatagagggagacattttgggtatacagagaaatcaggcacttgggaaatgtctg gaaatctacaaagtataacaccaggtaacaatctaagcaacagaggagaggctaccttaaatg tcctaccctgatagtgagattgatgactaacttatatgccatgttatagccttcatccagcagctg gtggaagtagaagcagacacccataactaatcacggaactgaactggaacccagattcagag aaggatgagtgaagggcacagaggtccagaccaggctggtgaaacccacaaaaacagttga actgaatatcggtgaactcttgctccccagactgatagctggaataccagcatgggactgatcc agactccaggaacatgagttcctgtgaggaaacctcggaaatctaagggacctcctgtagaa gttcagtacttatccctagcataggtgtggactgagggagcccattccatatagaggaatactc 130056.doc -15- 200907059 tctggagccaacacacatgggggtgggcataggccctttcccaaagcatacaatagactcgg atgacaccctatggaaggcctcatcatccagggggagcagaaaggatatgtgatagacagg gtttcagttgggagccgggtagtgggaggggagaattggtggaagaaggaaaccgggattg tcatgtaaatcaatgctgtttctaattcaaataagaaagttgaaaaaaaagaaaactgatacttat . tgcaccatgtaatgttatgaaatggcatttgctgttaagatgagcagtctatctgctaatctccct agctggcttgtgaacttgttatatggacaaagctggtctcaaattcaaagatatttgcgtatgtct gtctcctgagtgttgagagtacaagtatgtaccaccaatccctttgattatacaattacatttgaa aacagtttgagatttaattataactatgcaatcaattcaaaataataaatttaaatctcatatttgtct r ' ttaggtggaaatctgttaatatacatcatgattatatattttaatttattatatgttttctaggacaaa atatactaaaatgaaatctaaggctctaaacatacaaaactgtatgcatagatacatcacgatca tataatttccatgacatgctattcgggaatataatgatctacctgcagtaatgattaatttggaaat gctgaatacaactgcttctcttttgaaaatacaaattccttacatttgtaatctatttaattttaaagg ttgtaccccagaaagtagtgaattcttaa， 或SEQ ID N〇:2之核苷酸序列的分離之核酸分子（聚核苷酸 分子）： aagaatatgctcaatgtaatacccatggcaggcattcaatgtttgtctgtcttcatattgaagata ί aacagatgtatatcatatacaaaaatatttaatgtgaagttgtccatgtgttcaggatctatatact ttcaaaaatctttttccatattcttttcttaatcctcctgaagtgtagaccattatactggaaaaccg tcactattgtacaggataggagcctttgactctgagaggatcccatacattgattgtattttcaaa tatattttggctgcttttctccatgtgatatttggcaatctggagaggcatttgctcctggaaattta 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cccaagaatattttcaatgtcttctttggaagctccttggtaaatgcactttctttcactcatttatg aggtctgtgcacatcacagtcaataaaggcctgcagtattgaatcagccatacagacataattc ataacatttttctatttctcatgaatcaaatattgttattgctgtacataaaataatgaatcaaagtat aggtctaga， 可經工程化至表現載體分子中，以增加一或多種重組蛋 白自存在於表現載體分子上之一或多個基因之表現。 包含SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2之核苷酸序列之經分 離的聚核苷酸分子在本文中係指重組表現載體元件 (rEVE)。本發明之rEVE亦包括（但不限於）包含SEQ ID NO:l("ARMΓ’）或SEQIDNO:2("ARM2")中所示之序列之增 加表現部分的聚核苦酸分子。來自ARM2 SEQ ID NO:2之 3'末端區之序列，諸如具有SEQ ID NO:2之鹼基462-2422及 SEQ ID NO:2之鹼基1087-2422之序列的彼等序列，尤其適 用於提供所關注之重組蛋白之增加表現。本文中所述之 rEVE可與當前可用以增加重組蛋白於宿主細胞中之產生的 其他控制序列、調節子及程序組合使用。 為更清楚描述本發明，定義以下術語： 如本文中所使用及理解，術語"抗體"或"抗體分子"廣泛 係指包含4個多肽鏈，即2個重（H)鏈及2個輕（L)鏈之任何免 疫球蛋白（Ig)分子，或其任何功能片段、突變體、變異體 或衍生物，其保留Ig分子之基本抗原決定基結合特徵。該 等突變體、變異體或衍生物抗體在此項技術中為已知的且 包括下文所討論之非限制性實施例。 在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區（VH)及重鏈恆定 130056.doc -18- 200907059 區。重鏈恆定區包含3個域，即CHI、CH2及CH3。各輕鏈 包含輕鏈可變區（VL)及輕鏈恆定區。輕鏈悝定區包含一個 域（CL)。VH及VL區域可另外再分成具有高變性之區域， 稱為互補判定區（CDR)，其經更保守之區域（稱為框架區 (FR))間隔開。各VH及VL包含3個CDR及4個FR，其按以下 順序自胺基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類 型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及 IgY)，類別（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2)或子類。 術語"抗體"及"抗體分子"亦涵蓋保留特異結合於抗原之 能力的抗體之一或多個片段。已展示抗體之抗原結合功能 可藉由全長抗體之片段來執行。該等抗體實施例亦可為雙 特異（bispecific)、雙重特異性（dual specific)或多重特異 性；其與兩種或兩種以上不同抗原特異性結合。涵蓋於術 語'’抗體”内之結合片段之實例包括：Fab片段，亦即由 VL、VH、CL及CH1域組成之單價（1個結合位點）片段； F(ab')2片段，亦即包含2個藉由在鉸鏈區處之二硫鍵連接 之Fab片段的二價（2個結合位點）片段；由VH及CH1域組成 之Fd片段；由抗體之單臂之VL及VH域組成的Fv片段；單 域抗體（dAb)(Ward等人，544-546 (1989); Winter等人，PCT publication WO 90/05144 A1，其以引用 之方式併入本文），其包含單一可變域；雙重可變域（DVD) 抗體（參見，例如PCT公開案第WO 2007/02471 5號）；及經 分離之互補判定區（CDR)。此外，儘管Fv片段之2個域，即 130056.doc •19· 200907059 VL·及VH係由分離基因編碼，但可使用重組方法，藉由合 成連接子來連接其，該合成連接子能使其成為單一蛋白質 鏈’其中VL及VH區域配對以形成單價分子（稱為單鏈 Fv(scFv)，參見，例如，Bird 等人2^2: 423_426 (1988) ; Huston 等人，仏·以以 5879-5883 (1988))。該等單鏈抗體係由術語"抗體”及”抗體 分子”所涵蓋。雙功能抗體亦由術語"抗體"及，，抗體分子，，所 涵蓋。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH及VL 域在單一多肽鏈上表現’但其使用太短以致於不能允許在 相同鏈上2個域之間的配對之連接子，進而迫使域與另一 鏈之互補域配對且產生2個抗原結合位點（參見，例如， Holhger#X ^ Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) ; Poljak等人，汾rwciwre, 2: 1121-1123 (1994))。術 語”抗體”及”抗體分子"亦涵蓋雙重可變域免疫球蛋白分 子’諸如DVD-IGTM(Abbott Laboratories)雙重可變域免疫 球蛋白分子（參見例如’ PCT公開案第W0 2007/024715 號）。 如本文中所使用，"載體"係指能夠充當用於外來聚核苦 酸於宿主細胞中遺傳轉移、表現或複製之媒劑之任何遺傳 元件。舉例而言’載體可為人工染色體或質體，且可能能 夠穩定整合至宿主細胞基因組中，或其可以獨立遺傳元件 (例如離合染色小體、質體）形式存在。載體可以單—聚核 苷酸或以兩種或兩種以上經分離之聚核苷酸形式存在。當 存在於宿主細胞中時，載體可為單一複本載體或多複本載 130056.doc -20- 200907059 體。適用於本發明之較佳載體為表現載體分子，其中一或 多個功能基因可以適當定向嵌入載體分子中且接近駐留於 表現載體分子中之表現控制元件，以便當載體分子駐留於 適當（同源）宿主細胞中時’指導一或多種蛋白質之表現。

表現載體可包括（而不限於）真核質體載體、真核病毒載 體、原核質體、噬菌體載體、穿梭載體（例如可在真核及 原核細胞中複製之載體）、迷你染色體及各種人工染色體 (例如，細菌人工染色體（BAC)、酵母人工染色體（YAC))。 較佳地，用於本發明中之表現載體為質體，更佳為穩定整 合至宿主細胞基因組中之質體表現載體’且甚至更佳為藉 由非同源重組穩定整合至宿主細胞基因組中之質體表現載 體。"穿梭載體'，（或雙功能載體）係指可在生物體之超過一 個物種中複製之任何載體。舉例而言，可在切捧磨 (Escherichia coli乂Ε· c〇u)反釀酒酵母、Sacchar〇_as 咖W*)(&⑽中複製之穿梭載體可藉由將來自 乂料磨質體之序列與來自酵母㈣體之序列連接來建 構。 表現系統包含表現載體及將表現編碼於表現載體上之重 ’’且蛋白之適“同源)伯主細胞。表現系統可為穩定表現系 統或瞬間表現系統。在穩定袁 人一 穩疋表現糸、统中’表現載體穩定整 合至佰主細胞基因組中，岑 續稷製且如實地傳遞至兩個 呢此夠當在適當條件下培養時， Ik π表現重組蛋白。在瞬間表 、 保留於兩個子細胞中且最後二’現载體分子不 失’或在生長細胞培養物中 130056.doc 21 200907059 減少’使得重組蛋白自培養物之表現將最後停止或太低以 致不適用於大多數生產目的。下文用於實例中之表現載體 為穿梭載體類型，當嵌入(例如藉由轉型)至乂轉磨細胞 中時’其可複製成相對較高之複本數量，且其亦可嵌入 (例如藉由轉染）至且穩定維持於中國倉鼠即巢（ch〇)細胞 中，以獲侍所關注之其編碼基因產物之穩定表現（尺叫加抓 等人 ’ Ce//. ‘/·, 5: 175〇_1759 (198〇))或其可瞬間 維持於HEK 293細胞中（Durocher等人，胸办心义， 川：E9)。因此，本文中所述irEVE聚核苷酸分子可用以 增加所關注之重組蛋白於穩定及瞬間表現系統中之表現。 可用於本發明中之示範性真核載體包括（但不限於）病毒 及非病毒載體。病毒載體包括（而不限於）逆轉錄病毒載體 (包括慢病毒載體）；腺病毒載體，包括其複製勝任、複製 不足及無活力形式，腺病毒相關性病毒（AAV)載體；狼病 毋40(SV-40)載體；牛乳頭狀瘤病毒載體；埃_巴二氏病毒 載體（Epstein-Barr virus vector);疱疹病毒載體、牛痘病 母載體’莫洛尼鼠白企病病毒載體（M〇l〇ney murine leukemia virus vect〇r);哈維鼠肉瘤病毒載體（Harvey mudne sarcoma virus vector)、鼠類乳腺腫瘤病毒載體及勞 氏肉瘤病毒載體（Rous sarcoma virus vectors)。桿狀病毒載 體為熟知的且適於在昆蟲細胞中表現。 適合於在真核或原核細胞中表現之多種載體在此項技術 中係熟知的且許多為市售的。商業來源包括（而不限 於）Stratagene(La Jolla, California)、Invitrogen(Carlsbad, 130056.doc -22- 200907059

California) 、 Promega(Madison, Wisconsin)及 Sigma Aldnch(St· Louis, Missouri)。許多载體序列可經由 GenBank得到，且涉及載體之額外資訊可經由 BioSource Center在互聯網路上得到。 載體分子通常包含至少一個複製起源且亦可包含用於 ”標記”或"可選擇標記"之基因’當將載體嵌入宿主細胞中 時，其可藉由標記基因來識別或選擇。該等適用標記可 (不限於）賦予對抗生素之抗性；提供給予選擇性生長優點 之功能，其優於缺乏該等功能之細胞；或提供易識別擁有 載體（例如染色遺傳（colorigenic)系統）之細胞之方式。該等 標記在此項技術中係熟知的，且用於載體分子中之適當可 選擇標記之選擇將視使用何種宿主細胞及含有載體之宿主 細胞之何種性質為需要的而定。 術語"功能基因構築體"、"功能基因，，及"基因”係指含有 -或多種蛋白質之編碼序列的聚核苷酸，該編碼序列可操 作地連接於啟動子序列及其他可能的轉錄調節序列以指導 編碼序列向訊息RNA(mRNA)中之適當轉錄，且其亦包含 多種轉譯調節序列之任何序列，該序列對指導爪讀向所 欲宿主細胞中之所要蛋白中之適當轉譯而言可為必需或所 要的。在mRNA中通當豐亚絲— 吊而要轉#起始岔碼子（例如ATG)及 減體結合位點，以使轉譯在原核及真核細胞中發生。視 宿主細胞而定亦可伟_ + # L ± 之，、他轉澤調節序列包括（但不限 於）RNA匆接位點及多聚腺嘌呤位點。 本文中使用術語'•重組體”來描述經改變或操縱之核酸、 130056.doc •23- 200907059 自天然存在之環境分離之核酸、經轉染或經操縱以含有外 生核酸之宿主細胞、或經由分離之dna操縱及宿主細胞之 轉型而非天然地表現之蛋白質。”重組體，，為特別涵蓋已使 ，用遺傳工程技術活體外建構之跳分子之術語，使用術語 "重組’’作為形容詞來描述分子、構築體、載體、細胞、蛋 白質、多肽或聚核苷酸係特別排除天然存在之該等分子、 構築體、載體、細胞、蛋白質、多肽或聚核苷酸。特別為 本發明之目的，I，重組蛋白”為由一種在表現蛋白質之前已 藉由併入至少一個非天然存在之遺傳元件所操縱之宿主細 胞表現之蛋白質。一種蛋白質，其編碼序列已由人工併入 宿主細胞（例如藉由包括該蛋白質之編碼序列之表現載體 轉染）使之能夠表現該蛋白質，一旦由該宿主細胞表現， 即為"重組蛋白”。 宿主細胞”係指可喪入載體分子之任何細胞，亦即任何 真核或原核細胞。根據本發明，較佳宿主細胞為真核或原 核細胞’包括（但不限於）動物細胞（例如哺乳動物、鳥及魚 宿主細胞）、植物細胞（包括真核藻類細胞），真菌細胞、細 菌細胞及原生動物細胞。適用於本發明之宿主細胞可為任 何遺傳構築體，但較佳為單倍體或二倍體細胞。適用於本 發明之較佳哺乳動物宿主細胞包括（但不限於）中國倉鼠卵 巢（CHO)細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨 髓瘤細胞、人類胚腎（HEK 293)細胞、嬰兒倉鼠腎（BHK)細 胞、海拉細胞、人類B細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、 3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞及MDCK細胞。較佳昆 130056.doc -24- 200907059 蟲細胞為Sf9。可在本發明中用作宿主細胞之真菌細胞包 括（但不限於）子囊菌細胞，諸如趨磨省、鐽孢黴肩，及酵 母細m，尤其以Ύ各屬之酵母..酵母菌屬、畢赤酵母屬、 漢森酵母屬、裂殖酵母屬、刻魯維拉菌屬、耶羅維亞酵母 屬及念珠磨屬。可用作表現重組蛋白之宿主細胞之尤佳酵 母％亀蜘煃％釀酒酵母、多形漢森酵母、乳酸刻魯維拉 菌、甲醇酵母、粟酒裂殖酵母反耶羅維亞解脂酵母a 5在 本發明中用作宿主細胞之較佳原核細胞包括（但不限於）乂 腸桿菌、腸道沙門氏菌t址清墊赘幕德_ '志賀桿菌種、產 琥珀酸沃廉菌、普通變形桿菌、雷特格氏變形桿菌、遲緩 愛德華氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、巴氏桿菌種、嗜血桿菌 種、假單胞菌種、桿菌種、葡萄球菌種反鏈球菌種。^馬 根據本發明用於表現重組蛋白之適用宿主細胞之其他細胞 包括原生動物細胞，諸如錐蟲類宿主琳蜴矜分I眾邊，及 線蟲錐蟲芳羞分续邁之細胞。各種表現載體可適用於上 述細胞中。 存在將載體分子嵌入細胞中之多種方式及方案，包括 (但不限於）轉型，轉染，細胞或原生質體融合，使用化學 處理（例如原生質體之聚乙二醇處理、鈣處理、轉染劑， 諸如可購自 invitr〇gen(Carlsbad，california)iLIp〇FECTi_ 及LIPOFECTAMINE®轉染試劑），使用各種類型之脂質 體，使用機械裝置（例如，經核酸塗佈之微珠），使用電荷 (例如電穿孔），及其組合。確定用以將本文中所述之特定 載體分子嵌入所要宿主細胞中之特定方案及/或方式係在 i30056.d〇( •25· 200907059 熟習此項技術者之技術水平内。 自一载體或其他核酸分子”轉移核酸序列資訊„至另—者 中^方法在本發明中非限制性的，且包括此項技術中已知 之多種遺傳工程化或重組核酸技術之任一者。尤佳之轉移 技術包括(但不限於)限制消化及連接技術、聚合酶鏈反庫 (pcR)方案（利用料或隨機序列引子）、同源重組技術（利 用具有同源性之聚料酸區）及非同源重組（例如隨機嵌入） :術⑽含有特定序列之核酸分子亦可(例如)使用自動核酸 口成為來合成’且將所得核酸產物隨後藉由上述方法中之 任一者併入另一核酸分子中。 使用遺傳工程化技術必然需要在如藉由從業者由所要細 胞=特定細胞狀態之要求而確定之多種特定條件下，使重 組宿主細胞（例如轉染物、轉型體）生長。舉例而言，宿主 細胞可擁有(如藉由其遺傳排列所決定)某些營養需求或對 物理(例> 溫度)及/或化學(例如抗生素)條彳之特定抗性或 敏感性。另外，特定培養條件可為調節所要基因之表現 (u使用可誘導啟動子）或引發特定細胞狀態（例如酵母細 $孢子$成）所必需q該等變化條件及滿足該等條 件之要求為熟習此項技術者所理解及瞭解。 在使用標準二氫葉酸還原酶（卿R)_甲㈣吟（Μτχ)擴 增程序擴增（提高）重組蛋白在宿主細胞中之表現的情況 下WI定性”及”穩定表;見”係指當在不存在曱胺蝶吟 下生長時，亦即，不存在藉由用於擴增裎序之甲胺喋呤之 存在所提供的用於提高表現之選擇壓力時，細胞培㈣繼 130056.doc •26· 200907059 續以擴增(提高)量來表現重組蛋白之能力。因此，一旦分 離’穩定轉染物宿主細胞即可在存在或缺少甲胺喋呤下表 現所關注之重組蛋白。 在使用標準二氫葉酸還原酶（DHFR)_甲胺嗓呤（Μτχ)擴 增程序擴增重組蛋白在宿主細胞中之表現的情況下，對甲 胺嗓吟存在之”增強適應性，，或"改良適應性”係指與在甲胺 喋呤存在下載運缺乏rEVE之表現載體之宿主細胞培養物的 存活性及/或生長速率相比，在甲胺喋呤存在下載運包含 本文中所述之rEVE之表現載體的宿主細胞培養物存活性更 问及/或生長逮率更高。宿主細胞群體之”存活性"係指宿主 細胞群體在選擇性壓力（例如甲胺喋呤）存在下生長及繁殖 之能力。 序列同源性”為該領域中之從業者所熟悉之概念。為測 定2個胺基酸序列或2個核酸之同源性百分比，將序列比對 以達最佳比較目的（例如，間隙可引入第一胺基酸之序列 或核酸序列中以用於與第二比較胺基酸或核酸序列之最佳 比對）匕後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基 酸殘基或核普酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之 相應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在彼 ，位置處為同源的（亦即’如本文中所使用，胺基酸或核酸 同原ί±相田於胺基酸或核酸„ 一致性"）。核酸序列同源性 可以2個序列之間的一致性程度來判定。同源性可使用此 項技術中已知之電腦程式，諸如gcg程式包中提供之GAP 軟體來測定。參見，Needle_及Wunsch，J. Mo/.灿/·， 130056.doc -27- 200907059 48: 443-453 (1970) 〇 田包含一或多個指定要素或步 … 合物或方法係開放式 、文中所述之組 的，但在組合物或:二了指：要素或步驟為必要 驟。亦應瞭解，為避免 \亦叮添加其他要素或步 或步驟時，所述任何έ 夕悃才曰疋要素 尸定要音❹心 ' 法亦描述"基本上由相同

曰立〜"、且成"之相應的更限制性組合物或方法， 其意謂組合物或方法包括 曰疋之必需要素或步驟且亦可包 括不會本質上影響組入 ^ °或方法之基本及新穎特徵之額外 要素，或步驟。亦應瞭解’當"包含"一或多個指定要素或步 驟或基本上由—或多個指定要素或步驟組成"時，本文中 斤述之任何、，且口物或方法亦描述"由指定要素或步驟組成" 以排除任何其他未指定要素或步驟之相應的更限制性及封 端（Cl〇Se-ended)組合物或方法。在本文中所揭示之任何組 合物或方法中’任何指定必需要素❹驟之已知或所揭示 等價物可取代彼元素或步驟。 亦應瞭解，選自由·.組成之群"之要素或步驟係指緊接 者的清單中之要素或步驟之—或多者，包括所列要素或步 驟之任何兩個或兩個以上者之組合。 除非另外指示，否則其他術語之含義將自上下文明白或 將理解為與藉由熟習此項技術者所理解及使用的相同。 熟習此項技術者亦應瞭解，如本文中所述之核酸序列 (核苷酸驗基序列）提供DNA、RNA及其互補序列。 本發明之重組表現載體元件（rEVE)首先自側接存在於經 130056.doc 28- 200907059 轉染DUXB 11 CHO細胞系之細胞中之表現載體的整合位點 之任一側之染色體組DNA區分離，該細胞系自存在於表現 載體上之基因表現格外高含量之抗IL-12抗體分子。 DUXB 11 CHO染色體組DNA之該等侧接區之選殖及定序揭 示 SEQ ID ΝΟ:1 及 SEQ ID NO:2之序列。SEQ ID ΝΟ:1 之 2329鹼基序列在本文中亦稱為'’八尺1^1”，且8£(5 10>^0:2之 2422鹼基序列稱為"ARM2"。側接ARM1 DNA序列經展示 位於整合表現載體之重鏈基因之轉錄方向的上游，且側接 ARM2 DNA序列經展示位於整合表現載體之輕鏈基因之轉 錄方向的下游（參見下文實例部分）。 將含ARM1及含ARM2之DNA分子單獨且以組合形式嵌 入表現載體中，以測定其存在是否會影響各種重組蛋白於 含有表現載體之宿主細胞中之表現量。與不存在該等序列 下獲得之製造量相比，含ARM1及含ARM2之DNA提供重 組蛋白於宿主細胞中之增加表現量（參見下文實例）。因 此，含ARM1及含ARM2之核酸分子為重組表現載體元件 之實例（rEVE)。通常，用ARM1聚核苷酸獲得之增加製造 量比用ARM2聚核苷酸或用ARM1及ARM2聚核苷酸之組合 獲得之彼者稍微更低。 在其中ARM 1及ARM2之任一者或兩者已用於建構用於 製造本發明所關注之重組蛋白之表現載體的所有情況下， 使用ARM1及/或ARM2表現強化子元件之蛋白質表現量更 大。直接觀察到，超過不具有ARM強化子之對照表現系統 的大於2倍、大於3倍、大於4倍、大於5倍、大於6倍、大 130056.doc -29- 200907059 於9倍、大於10倍、大於13倍、大於16倍及大於“倍的重 組蛋白產物之增加的比較表現量。（參見下文實例）^此 外，使用具有ARM1或ARM2或ARM1及ARM2兩者之表現 載體獲得之高表現量在經轉染宿主細胞中隨時間穩定地維 持。 ARM1及ARM2序列擁有相對富集基質/支架連接區之序 歹J的區域（MAR/SAR ;參見例如，Michalowski等人， ⑹7，说 12795-12804 (1999); Tikhonov等人， P/㈣ CW/，72: 2490-264(2000)美國專利第 7，129,062 號；Bode等人，/价.及ev 7<52上 389-454 (1995);

Bode 專人，Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 6.. ]Λ5-138 (1996))。在ARM1之狀況下，MAR序列基元尤其集中 於序列之3’末端區中，而在ARM2之狀況下，MAR基元之 叢集出現在序列之5,及3’末端區中，較少MAR基元位於序 列之中間區中。缺失分析表明ARM2核酸之大致1260鹼基 對3'末端區含有對aRM2增加之蛋白表現活性而言關鍵之 序列（參見下文實例6)。 本發明之rEVE分子包括彼等核酸分子，其包含ARM1及 ARM2序列之表現增加部分或片段。arm 1及ARM2序列之 該等表現增加部分為彼等：當作為編碼所關注之重組蛋白 之基因存在於相同表現載體上時’與不存在ARM1或 ARM2序列之該等部分或片段時獲得之表現量相比，其增 加重組蛋白於含有表現載體之宿主細胞中之表現量。 本文中所述之rEVE可單獨使用或與任何其他調節元件 130056.doc •30- 200907059 或表現增加系統組合使 用以用於增加所要重組蛋白於宿 主細胞中之製造量。兮望 °亥專其他序列及系統可包括（而不限 於）使用調節啟動+ 1^庄丨 勳子^控制或最佳化編碼所關注之重组蛋 白之基因的轉錄]吏用指導重組蛋白自宿主細胞分泌之产 號序列及使用基因擴增方法，諸如二氫葉酸還原酶 _FR)_甲㈣呤（Μτχ)擴增方案或麵醯胺酸合成酶方 案:在卿R‘MTX擴增程序中，就對增加濃度之Τ胺嗓吟 之抗性而言來選擇載運包含用於DHFR之基因之表現載體 的宿主細胞（參見例如，Kaufman, R j，h

Engineering： Principles and methods(^ ^ j.k. Setlow) » 第 9卷’第 155 頁（Plenum Publishing，New Y〇rk，1987))。通 常，當對甲胺喋呤之抗性水平增加時，存在重組基因之複 本數量之伴隨擴增連同自該擴增基因之重組蛋白表現量之 相應擴增（升南）。

SEQ ID NO:uSEq ID N〇:2之核酸序列係自得自 DUXBll CHO細胞系之DNA分子來識別。多種方法之任一 者可用以製造包含SEQ ID NO:l、SEq m n〇:2之核苷酸 序列或該等序列之任一者之部分的核酸分子。該等方法包 括（而不限於）將一或多個包含該等序列之rEVE DNΑ分子 選殖出DUXB11 CHO細胞之染色體組DNA，產生包含該等 序列之聚核苦酸之固相核酸合成方案，重組核酸技術，聚 合酶鏈反應（PCR)方案’自動核酸合成器，及其組合。本 文中所述之rEVE聚核苷酸分子亦可自經用戶設計（cust〇m designed)之核酸分子的商品供應商購買。製造或合成rEvE I30056.doc -31， 200907059 =法非限雜的，且熟習此項技術者可決定何種方法或 方法之組合最適於製造本文中所述之特定^ 本文中所述之rEVE可嵌入乒τ目讲邮 夕 表現载體中以增加多種蛋白 貝(包括肽、多肽及寡聚蛋白)之任—者自宿主細胞中之表 現栽體的表現。倘若核㈣編碼序列為已 分子上得到，則所關注之蛋白質的編： 個功能基因可使用此項技術中可用之多種方法中之任 者來肷入表現载體中。編碼序列可操作地連接於啟動 子，該啟動子將在需要其表現之宿主細胞類型中起作用。 額外轉錄及轉譯序列亦可經工程化至載體中，以用於所要 蛋白質於宿主細胞中之適當表現。 廣大種類之蛋白質(包括肽、多肽、寡聚蛋白)之任一者 自適田伯主細胞中之表現載體的表現可藉由—或多種本文 中所述之_來增加，該或該等侧包括(但不限於)可溶 ϋ蛋白、膜蛋白、結構蛋白（亦即向細胞、組織或器官提 t、、。構或支撐之蛋白）、核糖體蛋白、酶、酶原、各種抗 體分子(包括㈣限於)TNF-oc之抗體，諸如阿達木單抗； 選擇素之抗體；免疫調節蛋白之抗體，諸如仄_13之抗 體，又重可變域免疫球蛋白分子諸如雙重可 變域免疫球蛋白分子；細胞表面受體之抗體）' 細胞表面 受體蛋白、轉錄調節蛋白、轉譯調節蛋白、染色質蛋白、 激素、細胞週期調節蛋白、G蛋白、神經活性肽、免疫調 節蛋白(例如介白素、細胞激素、淋巴介質）、血液組分蛋 白離子問蛋白、熱休克蛋白、二氫葉酸還原sim 130056.doc 200907059 抗性蛋白、前述蛋白質之任一者之功 之任一者之含抗原決定基片段，及其組合。述蛋白質 所關注之重組蛋白可藉由轉錄及轉譯編碼 在於本文中所述之表現載體分子上之基因來製造"：存 文中所述之彼等的表現載體上之基因之該轉匕本 用無細胞之轉錄/轉譯系統或使 '、澤可使 w田佰主細胞來進行， 該宿主細胞含有表現載體分子且具有為自存在於表現載體 分子上之基因產生所關注之重組蛋白所必需的適 錄及轉譯機構。 w 基質連接區（MAR)(亦稱為支架連接區（Sar))最初係識別 為染色體DNA之片段’其結合以製備似乎形成真核生物核 中之支架或基質之核蛋白。據信MAR駐留於染色質環中， 該等染色質環連接於核基質且界定或限定染色質之個別結 構單元。MAR已與一些強化子序列有關且/或與可在染色 質中發生之許多過程有關聯，該等過程包括轉錄、轉殖基 因表現、轉殖基因重排、重組、複製及轉染之穩定化（參 見例如，Michalowski等人，价此六㈣/价乂 3S: ι2795_128〇4 (1999); Zhong等人，/Voc. Λ^α". [/α， 1 1970-1 1975 (1999) ; Tikhonov等人，7T?e 尸/㈣？ CW/, 72: 249-264 (2000) ; Zhou等人，Ge«e，277: 139-144 (2001);

Sumer 等人，Genome Research, 13: 1737-1743 (2003)；美 國專利第 7,129,062號；Bode等人，/«ί. C_yίο/., /62J: 389-454 (1995) ; Bode 等人，Crit· Rev. Eukaryotic Gene 五xpre以z.o/7，<5: 1 15-138 (1996))。ARM1(SEQ ID NO:l)及 130056.doc -33- 200907059 ARM2(SEQ ID NO:2)擁有多種MAR元件，其似乎主要以叢 集形式位於3·及/或5'末端區中。ARM1在3'末端區中含有一 群MAR元件。在ARM2之狀況下，可發現MAR元件貫穿該 rEV£序列之長度，MAR基元之叢集位於5’及3'末端區中。 顯然，載運ARM1及ARM2序列之載體及其他核酸分子為 MAR元件及MAR元件之叢集的適宜來源。因此，ARM1、 ARM2及其含MAR之部分可用以使用此項技術中可用於重 組核酸序列資訊或另外將核酸序列資訊轉移至核酸分子中 之各種方法之任一者，來增加MAR元件於所關注核酸分子 中之數量。 包含本文中所述之rEVE之序列或其部分的核酸分子亦 可用於此項技術中已知之多種程序中，以在其他核酸分子 中操縱、識別、製造或擴增rEVE序列。該等程序可包括 (而不限於）使用rEVE或其部分作為此項技術中已知之各種 核酸雜父方法之任一者中的探針，或作為此項技術中已知 之各種聚合酶鏈反應（PCR)程序之任一者中的引子。 本文中所述之rEVE聚核苷酸分子可用於製造所關注之 重組蛋…法中。較佳土也，製造所目注之重組蛋白的該 方法包含如本文中所述之重組表現載體，纟包含—或多個 編碼所關注之重組蛋白之重組基因及至少_種本文中所述 之rEVE聚核«分子，及將重組表現載體上存在之—或多 個重組基因轉錄及轉譯以產生所關注之重組蛋白。一或多 個重組基因自表現載體之轉錄及轉 ,^ 得# #又佳在包含表現載體 之宿主細胞中進行’且在促進所 汀關/主之重組蛋白之表現的 130056.doc 34- 200907059 條件下培養。rEVE聚核芽酸分子可用以增加一或多種所關 注之重組蛋白自宿主細胞中之表現載體的表現量，無論經 瞬間表現（例如在經轉染之cos* HEK 293宿主細胞中）亦 或經穩定表現（例如在經轉染之CH〇宿主細胞中）。一或多 個重組基因自載運如本文中所述之rEVE之表現載體的轉錄 及轉譯亦可使用此項技術中可用之活體外無細胞之轉錄/ 轉澤系統來進行。 本文中所述之rEVE聚核苷酸分子可用於製備宿主細 胞’當表現量已使用卿R_f胺嗓吟擴增程序來擴增（提 高）時，該宿主細胞穩定（與瞬間對比）表現高含量之重組蛋 白。該等宿主細胞為抗甲胺#吟（抗Μτχ)細胞，其不僅當 在甲胺嗓吟存在下生長時，而且當在不存在甲胺嗓呤時生 長時，亦#，當不存在用於藉由甲胺嗓呤之存在所提供之 增加表現的選擇壓力下生長時，繼續表現高含量之重組蛋 白。在一較佳實施例中，產生抗曱胺嗓吟宿主細胞之該方 法包含之步驟為： 將表現載體嵌入宿主細胞中，該表現載體包含： 編碼所關注之重組蛋白之重組基因、 rEVE或其表現增加部分，及 二氫葉酸還原酶（DHFR)基因， 以選擇表現所關注 及 在曱胺嗓吟存在下使宿主細胞生長 之重組蛋白之抗曱胺喋呤宿主細胞 分離抗甲胺嗓呤宿主細胞； 具肀經分離之抗甲胺喋 130056.doc -35- 200907059

主細胞更高量表現所關注之重 呤宿主細胞當在存在或不存在 現高含量之重組蛋白。較佳地 SEQ ID NO:2或其表現增加部 ID NO:2。 組蛋白’且其中該抗曱胺喋 曱胺喋呤下生長時，穩定表 ，rEVE 包含 SEQ ID ΝΟ:1、 分。更佳地，rEVE包含SEQ

本文中所述之rEVE聚核苦酸分子亦可用於改良表現重 組蛋白之宿主細胞群體適應在曱胺喋呤存在下之生長能力 的方法中。在一較佳實施例中，該方法包含： 將表現載體嵌入宿主細胞中，該表現載體包含： .編碼所關注之蛋白質之重組基因、 .重組表現載體元件（rEVE)聚核苷酸分子，其包含選 自由以下各者組成之群的序列：seq id NO」、 SEQ ID N0:2、SEQ ID N〇:1之一部分、seq ⑴ NO:2之一部分，及其組合，及 •二氫葉酸還原酶（DHFR)基因， 其中當在甲胺“存在下生長時，與載運缺乏制ve聚核 苷酸分子之表現載體之宿主細胞群體相比，含有表現載體 之宿主細胞群體具有更高存活性及/或更高生長速率。 本文中所述之rEVE聚核苷酸分子亦可用以使用dhfr_甲 胺喋呤擴增程序來增加重組蛋白於宿主細胞中之表現擴增 (升高）。在一較佳實施例中，該方法包含： 將表現載體嵌入宿主細胞中，該表現載體包含： •編碼所關注之重組蛋白之重組基因、 _ rEVE聚核苷酸分子’其包含選自由以下各者組成 130056.doc •36- 200907059

之群的序列：SEQ ID ΝΟ··1、SEQ ID N〇:2、SEQ ID N〇:l之一部分、SEQ ID NO:2之一部分，及其組 合，及 •二氫葉酸還原酶（DHFR)基因， 在甲胺喋呤存在下使宿主細胞生長，以選擇表現所關注 之重组蛋白之抗曱胺喋呤宿主細胞，及 分離抗甲胺喋呤宿主細胞， 其中經分離之抗甲胺喋呤宿主細胞在甲胺喋呤存在下以 比含有缺乏該rEVE聚核苷酸分子之表現載體之抗曱胺喋呤 宿主細胞更高量表現所關注之重組蛋白。 在使用用於所要重組蛋白之擴增表現之甲胺嗓呤選擇的 本文中所述方法中，甲胺喋呤可在2〇 〇1^至5〇〇 nM之範圍 内使用。然而，有利地，熟習此項技術者認識到，更低及 更鬲之曱胺喋呤濃度（諸如5 nM至1〇 4河）亦可成功用於擴 增表現之甲胺喋呤選擇中（參見例如，Kaufman，R.j.， Methods in EnZym〇l〇gy，第 185卷：537 566 (199〇))。 本發明亦提供減少、大體上抑制或基本上休止重組蛋白 自表現载體之表現的方法。該方法可使用包含本文中所述 之rEVE序列之一或多個片段的表現載體，該等片段提供比 使用王長rEVE序列所提供的更低量之特定重組基因產物之 表現。忒減少表現或抑制表現之rEVE衍生序列包括arm2 之序列之截短變異體’其具有SEQ ID N〇:2之鹼基11〇86 或SEQ ID NO.2之驗基1-461之驗基序列。顯然，自該等2 種變異體缺失之3,末端序％區之存在對重組蛋白〇介 130056.doc -37· 200907059 導之增加表現而言係極其需要的。具有SEQ ID NO:2之鹼 基1 -46 1之ARM2截短序列的核酸分子尤其適用於抑制或大 體上休止重組.蛋白自宿主細胞中之表現載體之表現。該等 方法可在許多情況下得以使用，該等情況包括（而不限 於），當存在重組蛋白之表現可對宿主細胞有毒性之擔心 時，或當某表現量可存在所要蛋白質之純化或分離之問題 時，諸如存在蛋白質凝集。 因此，SEQ ID NO:2之鹼基462-2422之序列及SEQ ID NO :2之鹼基1087-2422之序列對最大ARM2 rEVE介導之重 組蛋白表現增加而言為最佳的。因此，尤其適用於增加重 組蛋白之表現的rEVE聚核苷酸包含SEQ ID NO:2之鹼基 462-2422之序列及/或SEQ ID NO:2之鹼基1087-2422之序 列。 本發明之額外實施例及特徵將由以下非限制性實例而明 白。 實例 實例1. ARM 1及ARM2重組表現載體元件（rEVE)之選殖及 序列分析。 研究載運經穩定整合之表現載體的DUX Bll CHO細胞 系之產生，以確定於表現載體上編碼之重組抗IL-1 2.抗體 之格外高含量表現的可能基礎，宿主CHO細胞經該表現載 體轉染。在該研究中，將側接經整合之表現載體的染色體 組DNA區域選殖且定序。簡言之，用Xbal消化來自宿主細 胞之染色體組DNA，且使用基本上如藉由Reynaud等人（·/. 130056.doc -38- 200907059

Mo/· 5/〇/.，740: 481-504 (1980))所述之 BioGel A-50 管柱純 化具有大致5千驗基（kb)之平均尺寸的片段。藉由將片段選 殖至拉目達（X)DASH® 選殖載體（Stratagene，La Jolla, California)中來製備純化染色體組片段之文庫。將文庫擴 增且使用GIGAPACK®包裝萃取物（Stratagene)來包裝，且 根據製造商方案轉導至XLl-Blue MRA或XLl-Blue MRA(P2) 乂靡#磨細胞中。隨後，根據Stratagene方案， 就抗IL-12抗體之重鏈可變區（VH)之編碼序列而言，用探針 來篩選文庫。XDASH純系#21中之14.5 kb Xbal片段含有用 於抗體表現载體之嵌入位點連同側接染色體組序列。該等 側接染色體組區係指定為ARM1及ARM2。ARM1及ARM2 區域之序列分別經測定為SEQ ID ΝΟ:1及SEQ ID NO:2之 彼序列。關於CHO細胞基因組中之抗體表現載體之嵌入位 點，ARM1位於嵌入位點之上游且為5’至抗體重鏈之載體 基因之轉錄方向，ARM2位於嵌入位點之下游且為3'至抗 體輕鏈之載體基因之轉錄方向。 SEQ ID ΝΟ:1及SEQ ID NO:2相對CHO表現序列標記 (EST)資料庫之BLAST分析未能揭示任何相關編碼序列， 暗示ARM1及ARM2 rEVE序列不含任何CHO編碼序歹ij。 rEVE序歹ij之BLAST分析亦相對小鼠基因組序列來進行。 未識別到與ARM1序列同源之小鼠染色體組序列。然而， ARM2序歹ij似乎與不含有已知編碼序歹U之小鼠染色體14上 之高度保存區域有關。 使用載體NTI序列分析程式（Invitrogen)，亦就基質連接 130056.doc -39- 200907059 區（MAR)元件之各種代表性（亦即並非全部）核苷酸序列基 元之樣本的存在來篩選ARM1(SEQ ID N0.1)及ARM2(SEQ ID NO:2)之序列（參見例如，Michalowski等人， 12795-12804 (1999))。藉由電腦程式筛 選之特定MAR DNA序列基元展示於表1中（互補鏈序列未 列出）。 表1.代表性基質連接區（MAR)元件之核苷酸序列基元

MAR元件 所篩選之MAR序列基元* A-盒 AATAAAYAA(SEQ ID NO:3)(允許2個錯配） T-盒 TTWTWTTWTT(SEQ ID NO:4)(允許 1個錯配） MRS TAWAWWWNNAWWRTAANNWWG (SEQ ID NO:5) (允許2個錯配，但3'末端為G)或 TAWAWWW(SEQ ID NO:5之鹼基1-7)(MRS之第一部 分，無錯配）+ AWWRTAANNWWG(SEQ ID NO:5之 鹼基10-21)(MRS之第二部分，允許1個錯配，但3'末 端為G)，其中第一及第二MRS部分經計數具有至多 4個介入鹼基(Nm)或至多3個重疊鹼基 ARS WTTTATRTTTW(SEQ ID NO:6)(允許 1個錯配） BUR AATATATTT(SEQ ID NO:7)(允許 1 個錯配） 彎曲 AAAANNNNNNNAAAANNNNNNNAAAA(SEQ ID NO: 8) 或 TTTAAA(SEQ ID NO:9) 90% AT W20(SEQ ID NO:10)(允許2個錯配） 扭結 TANNNTGNNNCA(SEQ ID NO:l 1) ^ TANNNCANN NTG(SEQIDNO:12)4 TGNNNTANNNCA(SEQ ID NO:13)*CANNNTANN NTG(SEQ ID NO:14)(不允許錯配） 拓撲異構 酶II結合_ GTNWAYATTNATNNR(SEQ ID NO:15)(允許 2個錯 配，但不在位置4-9中’亦即，WAYATT(SEQ ID 130056.doc 40· 200907059 位點 ΝΟ:15之鹼基4-9))保守 TG-富集 CAAAACA(SEQ ID NO: 16) DNA退繞 基元 AATATT(SEQIDNO:17)4AATATATT(SEQIDNO: 18)

*互補鏈序列未列出；縮寫：γ=Τ或C ; W=A或T ; Ν=Α、τ、G或 C ; R=G 或 A 如下文表2中所示，在ARM1 DNA序列（SEQ ID ΝΟ:1)或 其互補鏈序列中識別至少4 1個MAR元件序列，且在ARM2 DNA序列（SEQ ID NO:2)或其互補鏈序列中識別至少114個 M A R元件序列。 表2. ARM1及ARM2 DNA序列中之MAR序列位置 MAR元件 在ARM1序列（SEQ ID ΝΟ:1之鹼基）中 之位置* 在ARM2序列（SEQ ID NO:2之 驗基）中之位置* A-盒 7 9 0 0 2 12 2 2 2 2 6 7 2 0 6 8 5 4 6 8 18 9 3 2 7 0 3 8 7 8 8 9 9 0 0 2 1 11 0/^ 52-60, 69-77, 79-87, 244-252 (互補），340-348 (互補），446-454 (互補），481-489 (互補）， 484-492 (互補），627-635, 631-639, 664-672 (互補），734-742, 737-745, 741-749, 811-819 (互 補），821-829， 833-841, 840-848, 907-915 (互補），925_933 (互補），942-950 (互補），1104-1112 (互補），1186-1194 (互 補），1186-1213 (叢集，互補）， 1262-1270 (互補），1391-1399, 1409-1417， 1413-1421, 1421-1429, 1441-1449 (互補），1531-1539 (互補），1711-1719 (互 補），1715-1723 (互補），1740-1748, 1810-1818, 1817-1825, 1844-1852, 1848-1856, 1862- 130056.doc 41 200907059 1870, 2036-2044 (互補），2040-2048 (互補），2052-2060, 2100-2108 (互補），2107-2115 (互 補），2113-2121， 2118-2126, 2122-2130，2191-2199 (互補）， 2261-2269 (互補），2287-2295 T-盒 114-145 (叢集）， 1740-1752 (叢集）， 2000-2011 (叢集)， 2062-2087 (叢集） 483-492, 631-640, 734-743, 806-815, 925-934, 1198-1207, 1843-1852 MRS 130-151, 1969-1989, 2054-2074, 2266-2286 77-97, 401-421, 752-772, 1197-1213 ARS 121-131, 2062-2072, 2079-2089, 2126-2136, 2257-2267 1443-1453 BUR 1877-1885, 2005-2013, 2063-2071, 2098-2106 (互補）， 2281-2289 77-85, 255-263, 723-731, 1412-1420 彎曲 106-131，2011-2016， 2293-2298 437-442, 466-471, 530-535, 616-621, 627-632, 2151-2156 90% AT 106-125, 126-145 64-83，64-90 (叢集），243-263 (叢集），400-420, 613-645 (叢 集），698-717, 722-774 (叢集）， 805-845 (叢集），1185-1214 (叢 集），1407-1431 (叢集），2104-2136 (叢集） 扭結 860-871, 1761-1772 439-450, 671-682, 1124-1135, 1503-1514, 1967-1978, 2020-2031, 2058-2069 拓撲異構 酶II結合 位點 598-612, 1365-1382, 2042-2056 (互補） 720-734, 819-833 (互補）， 1251-1265，1407-1421 (互補）， 1415-1429 (互補），1418-1432, 1434-1448 (互補），1758-1775, 1981-1995, 2202-2216 (互補） 130056.doc -42- 200907059 TG-富集 252-258 (互補） 928-936, 1842-1848 (互補） DNA退繞 基元 1880-1885, 2021-2026, 2064-2069, 2066-2071 284-289, 415-420, 788-793, 789-794, 825-830, 826-831, 909-914, 1121-1126, 1421-1426, 1440-1446, 2208-2213, 2209-2214 *ARM1 序列（SEQ ID NO: 1)或 ARM2 序列（SEQ ID NO:2); ”互補”=互補鏈序列；"叢集”=特定序列中之指 定MAR元件之超過一個複本 表2中之ARM 1及ARM2之MAR序列分析（包括互補鏈分 析）的結果指示，各種MAR主要在ARMl(SEQIDNO:l)之3' 末端部分中叢集且在ARM2(SEQ ID NO:2)之5'部分及3’部 分中叢集。ARM1具有比ARM2更少之該等MAR位點。此 外，ARM1中之大多數MAR序列在序列之3'區中，而ARM2 之5'及3'區係由MAR序列群集（populated)。 實例2.用於研究ARM 1及ARM2 rEVE對重組蛋白之表現量 之影響的通用方案。 用於表現研究之細胞 DUXB11 CHO細胞系為二氫葉酸還原酶（DHFR-)表現不 足之 CHO細胞系（參見，Urlaub, G.及 Chasin, L_A.，Proc. t/.叉儿，77: 4216-4220 (1980))。該細胞系 之DHFR—表型允許使用標準二氫葉酸還原酶-曱胺喋呤系 統（DHFR-MTX)方案以擴增已轉染至該等細胞中之表現載 體之複本數量（參見例如’ Kaufman, R.J.，in Genetic Engineering: Principles and Methods(編者 J.K. Setlow)， 第 9卷，第 155 頁（Plenum Publishing, New York, 1987))。 130056.doc -43- 200907059 含有ARM1及ARM2 rEVE序列之表現載體 圖1提供質體表現載體pA205之示意圖。圖2提供質體表 現載體pA205Genomic之示意圖，其中編碼阿達木單抗之 重鏈及輕鏈之基因係由ARM 1及ARM2側接，以致ARM 1序 列位於阿達木單抗之重鏈基因的上游且ARM2序列位於阿 達木單抗之輕鏈基因的下游。圖3提供質體表現載體 ρΑ205Α1之示意圖，其中ARM1序列位於阿達木單抗之重 鏈基因的上游。圖4提供質體表現載體pA205A2之示意 圖，其中ARM2序列位於阿達木單抗之輕鏈基因的下游。 圖5提供質體表現載體pCHOEL246GGhum之示意圖，該 質體表現載體含有人類抗EL-選擇素抗體之重鏈及輕鏈之 基因。圖6提供質體表現載體pA-Gen-EL-選擇素之示意 圖，其中編碼抗EL-選擇素抗體之重鏈及輕鏈之基因係由 ARM1及ARM2序列側接，以致ARM1序列位於抗體重鏈基 因之上游且ARM2序列位於抗體輕鏈基因之下游。 圖7提供質體表現載體pA205-eGFP之示意圖，該質體表 現載體含有增強綠色螢光蛋白質（eGFP)之基因。圖8提供 質體表現載體pA205G-eGFP之示意圖，其中編碼增強綠色 螢光蛋白質之基因係由ARM1及ARM2序列側接’以致 ARM1序列位於eGFP基因之上游且ARM2序列位於eGFP基 因之下游。 圖9提供質體表現載體pA205A2-Spe-trunc之示意圖，該 質體表現載體基本上與圖4中所示之表現載體pA205A2相 同，除ARM2序列已經截短之ARM2變異體”A2(bp 1- 130056.doc -44- 200907059 1086)”置換外，該截短之ARM2變異體係由於ARM2 DNA 經限制性核酸内切酶*S>e/消化而具有SEQ ID NO:2之鹼基 1-1086之核酸鹼基序列。圖10提供質體表現載體pA205A2-Swa-trunc之示意圖，該質體表現載體基本上與圖4中所示 之表現載體pA205A2相同，除ARM2序列已經截短之ARM2 變異體”八2〇?1-461)”置換外，該戴短之八11]\12變異體係由 於ARM2 DNA經限制性核酸内切酶Swd消化而具有SEQ ID NO:2之鹼基1-461之核酸鹼基序列。 培養基 αΜΕΜ為最低必需培養基，α培養基（GIBCO®， Invitrogen, Carlsbad, California) » 細胞生長及轉染 每次轉染，用各自於10 ml補充有5%透析FBS及H/T (GIBCO)之oc MEM中的 ΙχΙΟ6個 B3.2親本DUXB11 CHO細胞 將3個10 cm組織培養板接種。18小時（18 h)後，根據 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel, F.V., Brent, R., Moore, D.M., Kingston, R.E., Seidman, J.G., Smith, J.A.及 K. Struhl編），（Wiley Interscience，New York, 1 990))中所述之磷酸鈣轉染方案（具有下文所指示之若干修 改）將該等細胞轉染。藉由抽吸自培養板移除生長培養 基，且將9 m丨之Ham氏F12培養基（Invitr〇gen)添加至各培 養板中。在轉染之前’在37。〇下，將培養板培養2小時。 磷酸鈣轉染方案 將75微克（75 Mg)DNA溶於5〇 ml錐形管中之1.35 ml水 130056.doc -45- 200907059 中。添加150微升（150 μΐ)之2.5 M CaCl2，且將該DNA-鈣 混合物逐滴添加至50 ml錐形管中之1.5 ml之2X HeBES(HEPES緩衝鹽水）中。用微量吸管使HeBES鼓泡， 同時用Pasteur微量吸管添加DNA-舞混合物。藉由渦旋5秒 來混合混合物且在室溫下將其培養20分鐘。將1毫升（1 ml)DNA-鈣混合物均勻分布於具有貼壁細胞之各培養ϋπ· 上，使其生長且備用於在如上所述之F12培養基中之轉 染，且隨後在37 °C下將培養物培養4小時。培養後，抽吸 培養板，且將2 ml於F12培養基中之10 %二甲亞砜（DMSO) 添加至各培養板中（DMSO休克處理）。DMSO休克持續1分 鐘，之後，藉由將5 ml PBS(磷酸鹽緩衝鹽水）添加至各培 養板中來稀釋DMSO。抽吸培養板且在PBS中洗滌2次以 上。添加10 ml之aMEM/5% FBS/HT，且在37°C下將培養 板培養隔仪。 經轉染細胞於96孔培養板中之接種與甲胺喋呤（MTX)擴增 第二天，如下將細胞接種至96孔培養板中：藉由胰蛋白 酶消化收穫來自全部1 〇 cm培養板之細胞，且於αΜΕΜ/5% FBS中以2000個細胞/ml之密度再懸浮。以10 ml/板來接種 96孔培養板，100 μΐ/孔。1週後，2週後且再次在其後5天 改變96孔培養板上之培養基。所用培養基aMEM/5% FBS 對表現DHFR之細胞有選擇性。 最後一次培養基改變後2天，1:40稀釋培養物上清液且 使用對人類IgG γ鏈有特異性之ELIS Α來測試，以偵測阿達 木單抗或抗EL-選擇素抗體之表現。以2.0 ml/孔之 130056.doc -46- 200907059 αΜΕΜ/5°/〇 FBS，將得到最高ELISA信號之純系自其96孔培 養板轉移至12孔培養板中。當長滿（大致2-5天後）時，再次 檢定該等物質，且將純系分離至相同培養基+20 nM MTX 中用於擴增。最初在於12孔組織培養板中之（xMEM/5% FBS及20 nM MTX中選擇細胞。在該MTX含量下之初始選 擇後，經1 8天之平均時期，將該等細胞傳遞於含有20 nM MTX之生長培養基中最少2次以上。隨後，將細胞系擴增 至100 nM MTX。在該培養期期間，培養物之阿達木單抗 (人類抗TNF-ct抗體）或抗EL-選擇素生產力增加。在100 nM MTX含量下選擇之後，經1 8天之平均時期，將細胞系傳遞 於含有100 nM MTX之生長培養基中最少2次以上。當有指 示時，將細胞系進一步擴增至500 nM MTX。在500 nM MTX含量下選擇之後，經18天之平均時期，將細胞系傳遞 於含有500 nM MTX之生長培養基中最少2次以上。 載運包含ARM1核酸序列（SEQ ID NO:l)、ARM2核酸序 列（SEQ ID NO:2)或ARM1及ARM2序列之組合之表現載體 的經轉染CHO細胞之培養物在甲胺喋呤存在下，與經缺乏 該等rEVE序列之相同表現載體轉染之CHO細胞相比，適應 更好，亦即，具有更高存活性及/或更高生長速率。 實例3. ARM1及ARM2序列對經轉染CHO細胞中之抗TNF-a 之表現量的影響。 在該研究中，檢查ARM1及ARM2序列對經穩定轉染之 CHO細胞中之人類抗TNF-a抗體（阿達木單抗）之表現的影 130056.doc 47- 200907059 響。在經表現載體pA205(無ARM序列）、pA205Genomic(含 有 ARM1 及 ARM2)、ρΑ205Α1(含有 ARM1)或 pA205A2(含有 ARM2)穩定轉染之CHO細胞中，比較阿達木單抗之表現 量。表3展示，阿達木單抗於具有來自在指定擴增量（曱胺 喋呤”MTX”之濃度）下之各載體轉染的前3個產生純系之貼 壁培養物中之平均產生量。 表3 ·經穩定轉染之CHO細胞中之阿達木單抗表現量 載體 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM MTX pA205 1.57 pg/ml 4.20 pg/ml 5.53 pg/ml p A205Genomic 4.60 pg/ml 1 4.80 pg/ml 11—- — 21.03 pg/ml ρΑ205Α1 3.13 pg/ml 9.90 pg/ml 17.3 pg/ml pA205A2 4.53 pg/ml 24.23 μβ/πι1 20.8 pg/ml 表3中之數據指示，與經缺乏ARM序列之載體（pA205)轉 染之細胞中所見相比，單獨或呈組合之ARM1及ARM2序 列增加阿達木單抗之表現量。總之，單獨的ARM2 (p205A2)相對於所有其他轉染物而言提供最大量之增加表 現，而單獨的ARMl(p205Al)提供最少之表現增加量。數

據展示，具有ARM1序列（SEQ ID ΝΟ:1)或ARM2序列（SEQ ID NO:2)之分離核酸分子為代表性重組表現載體元件 (r£VE)，其當散入表現載體中時可增力口由表現載體編石馬且 自表現載體表現之重組蛋白之表現。 亦在不存在曱胺°禁吟擴增時，在懸浮液培養物中1週及4 週後，比較阿達木單抗藉由上述載體轉染之個別純系的表 現量。結果展示於表4中。 130056.doc -48- 200907059 表4.在不存在甲胺嗓吟時1週及4週後’在經穩定轉染之 CHO細胞之個別純系的懸浮液培養物中之阿達木單抗表 現量

載體 純系# 1週 (pg/ml) ------- 4週 (Hg/ml) pA205 19-3 10.8 ~~~------_ 8.1 pA205Genomic 7-5 52.6 〜——~~ 46.0 14-6 19.9 --—--- 16.8 ρΑ205Α1 1-4 15.5 ~—--— 6.9 4-2 27.8 —" ---- 15,3 6-3 76.8 -------- 43.6 3-7 17.3 〜---- 12,6 pA205A2 13-1 97.7 〜 ———-— 107.8 9-7 63.7 64.9 7-2 42.3 ------- 60.2 5-3 180.4 153.0 ~ 表4中之數 據展示，將 ARM2併入； — 不具有ARM1 (PA205A2)之PA205中增強所增加阿達木單抗表現量隨時 間之穩定性。詳言之，在 兩者或ARM1(PA2〇5A1)單獨存在時，最初在培養物中觀察 到阿達木單抗之增加的表現量’但彼含量可經大約數週快 速下降至低得夕之含罝(參見表4)。相反，在八鹽2單獨存 在:（pA2G5A2)表現阿達木單抗之細胞之培養物中，阿達 木單抗之增加的表現晋太4w呈 里在4種培養物之3種中穩定地維持4 週之時期。因此，ARiuo-r從^ 可穩疋地維持阿達木單抗於經轉 染CHO細胞之懸浮液拉羞 履培養物中之表現量的顯著升高。 130056.doc -49- 200907059 實例4. ARM1及ARM2序列對經轉染CHO細胞中之抗EL-選 擇素抗體之表現量的影響。 在該研究中，檢查ARM1及ARM2序列對人類抗EL-選擇 素抗體（結合E-及L-選擇素）於經穩定轉染之CHO細胞中之 表現的影響。在經表現載體pCHOEL246GGhum(無ARM序 列）或經表現載體pA-Gen-EL-選擇素（含有ARM1及ARM2) 穩定轉染之CHO細胞中比較該抗選擇素抗體之表現量。表 5展示，抗選擇素抗體於具有來自在指定擴增量（甲胺喋呤 "MTX"之濃度）下之各載體轉染的前3個產生純系之貼壁培 養物中之平均產生量。 表5.經穩定轉染之CHO細胞中之抗EL-選擇素抗體的表現量 載體 0 nMMTX 20ηΜΜΓΧ 100 nMMTX 500 nMMTX pCHOEL246GGhum 7.93 μ^ιηΐ 15.47 μ^ηιΐ 17.27 μ^ΓηΙ 22.30 pg/ml pA-Gen-EL-選擇素 6·27 pg/ml 19.87 pg/ml 26.63 pg/ml 44.13 μ^ιπΐ 表5中之數據展示，ARM1及ARM2序列（pAGen-EL-選擇 素）在增加抗EL-選擇素抗體於經穩定轉染之CHO細胞之經 曱胺喋呤擴增培養物中之表現量上係有效的。 實例5. ARM1及ARM2序列對增強綠色螢光蛋白（eGFP)於 經轉染之CHO細胞中之表現量的影響。 如上所述，將含有編碼增強綠色螢光蛋白（eGFP)之基因 構築體轉染至CHO細胞中，例外的為，細胞與pCDNA3.1 -hygro共轉染以提供用於穩定轉染物之可選擇標記，亦即 濕黴素抗性。表現載體peGFP提供eGFP在CMV啟動子之轉 錄控制下之表現的正對照。質體pA205-eGFP含有不具有 130056.doc -50- 200907059 ARM1或ARM2序列之pA205表現載體上之eGFP基因（圖 7)。質體pA205Gen-eGFP(圖8)含有側接編碼eGFP之基因的 ARM1及ARM2。在該等質體之任一者中不存在DHFR選擇 基因。因此，不採取DHFR-曱胺喋呤擴增步驟。用濃度為 400 pg/ml之濕黴素選擇轉染物歷時2週，必要時分離，且 隨後藉由FACS分選以測定表現量。細胞最初分選成各類 型載體之池，且使表現細胞再生長2週，且隨後再分選。 表6.經穩定轉染之CHO細胞中之eGFP的表現量 載體 平均螢光單位 peGFP(正對照） 239.03 pA205-eGFP 17.36 pA205Gen-EGFP 104.86 表6中之數據指示，與經相同但缺乏ARM序列之eGFP表 現載體（pA205-eGFP)轉染之細胞中的表現量相比，ARM1 及ARM2序列在顯著增加eGFP於經轉染CHO細胞中之表現 量上係有效的。 實例6 : ARM2之缺失突變異體對阿達木單抗於經轉染CHO 細胞中之表現量的影響。 在pA205A2載體中，將ARM2序列（SEQ ID NO:2)之3’末 端區截斷成Spel***位點（在SEQ ID NO:2之鹼基1086處）或 Swal***位點（在SEQ ID NO:2之鹼基461處）以分別產生 pA205A2-Spe-trunc(含有 SEQ ID NO:2 之鹼基 1-1086 之序 列）及 pA205A2-Swa-trunc(含有 SEQ ID NO:2 之驗基 1-461 之 序列）。將所得質體轉染至如上所述之CHO細胞中且擴增 130056.doc 51 200907059 至20 nM MTX。表7展示，在具有來自在各擴增量下之各 轉染的前3個產生純系之貼壁培養物中之平均表現量。 表7.經穩定轉染之CHO細胞中之阿達木單抗的表現量 載體 0 nM MTX 20 nM MTX pA205 1 80 pg/ml 1.57 pg/ml pA205A2 6.1 0 pg/ml 15.73 pg/ml pA205A2-Spe- trunc 3.57 pg/ml 3.00 pg/ml pA205 A2-Swa-trunc 0.83 pg/ml 0.90 pg/ml 表7中之數據展示，與經ρΑ205Α2載體轉染之CHO細胞 相比，經含有ARM2 DNA之5’末端1086鹼基對之表現載體 pA205 A2-Spe-trunc轉染之CHO細胞以更低之增加表現量來 產生阿達木單抗。驚人地，經含有ARM2 DNA之5’末端461 驗基對之表現載體pA205A2-Swa-trunc轉染的細胞，以比 經不含有ARM序列之pA205轉染之細胞甚至更低的表現量 來產生阿達木單抗。表7中之數據指示，自ARM2 DNA之3' 末端缺失之區域對重組蛋白於宿主細胞中之增加表現尤其 重要。另外，ARM2 DNA之相對較小（亦即，461鹼基對）5' 末端片段之單獨存在，實際上似乎減少重組基因產物於轉 染宿主細胞中之表現，且可尤其適用於大體上減少或休止 重組基因產物之表現。當（例如）在某些培養條件下，基因 產物於宿主細胞中之表現將有毒性或另外非所要時，可需 要該應用。 實例7·來自前述研究之個別轉染物之表現量。 130056.doc -52- 200907059

下文所示之表提供藉由在 純系來產生的重組蛋白之表 月IJ述研究中產生 現量。 表8.經pA205轉染之CHO細胞中之阿達木單抗的表現量 pA205純系# 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM MTX 500 nM MTX 1 3.9 10.4 15.4 14.1 2 2.8 6.2 12.9 8.2 3 2.50 4.2 10.1 2.9 4 2.1 3.8 4.2 1.5 5 1.7 2.7 2.9 0.3 6 1.4 2.2 2.6 7 1.4 1.7 2 8 1.3 1.6 1.7 9 1.3 1.6 1.4 10 1.2 1.6 1.4 11 1.10 1.4 1 12 1.10 1.3 0.8 13 1 1.3 0.5 14 1.00 1.3 0 15 0.9 1.2 16 0.90 1.2 17 0.9 1.1 18 0.9 1.1 19 0.9 1.01 20 0.9 0.9 21 0.80 0.8 22 0.8 0.8 130056.doc -53- 200907059 23 0.8 0.7 24 0.70 0.7 25 0.70 0.6 26 0.7 0.6 27 0.7 0.3 28 0.5 0.1 29 0.50 0.09 30 0.50 0.08 31 0.5 0.07 32 0.5 0 33 0.5 0 34 0.4 0 35 0.4 0 36 0.40 0 37 0.40 0 38 0.40 0 39 0.40 0 40 0.4 0 41 0.4 0 42 0.3 0 43 0.3 44 0.30 45 0.3 46 0.3 47 0.2 48 0.20 49 0.2 50 0.2 130056.doc -54- 200907059 f 51 0.1 52 0.1 53 0.1 54 0.1 55 0.10 56 0.10 57 0.10 58 0.1 59 0.08 60 0.05 61 0.05 62 0.03 63 0.03 64 0.03 65 0.02 66 0.01 67 0.01 68 0.01 69 0.01 70 0.01 71 0.009 72 0.007 73 0.007 74 0.007 75 0.006 76 0 77 0 78 0 130056.doc -55- 200907059 表9.經pA20 5 Genomic轉染之CHO細胞中之阿達木單抗的表 現量 pA205Genomic 純系# 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM MTX 500 nM MTX 1 9.3 19.1 61.0 40.6 2 6.9 16.5 59.7 40.2 3 6.5 15.1 52.0 28.6 4 5.70 13.6 36.0 23.9 5 5.6 13.2 25.9 6 4.6 10.7 20.7 7 4.3 10.3 19.6 8 4.1 9.8 17.6 9 4.10 9.7 16.3 10 4.00 9.5 15.6 11 3.9 8.9 11.4 12 3.6 7.6 9.3 13 3.5 6.9 8.1 14 3.4 6.4 8 15 3.3 6 5.9 16 2.9 4.5 0.1 17 2.9 3.1 0.04 18 2.70 2.5 19 2.60 2.4 20 2.5 1.6 21 2.4 1.4 22 2.2 1.1 23 2.2 0.05 130056.doc -56- 200907059 /' \ 24 2.2 0 25 2.20 0 26 2 27 2 28 1.90 29 1.90 30 1.8 31 1.80 32 1.7 33 1.7 34 1.6 35 1.6 36 1.6 37 1.50 38 1.4 39 1.4 40 1.40 41 1.3 42 1.3 43 1.30 44 1.30 45 1.2 46 1.1 47 1.1 48 1.1 49 1 50 1.00 51 0.80 130056.doc -57 - 200907059 f 52 0.7 53 0.7 54 0.7 55 0.6 56 0.60 57 0.5 58 0.5 59 0.5 60 0.5 61 0.5 62 0.5 63 0.4 64 0.4 65 0.4 66 0.3 67 0.3 68 0.3 69 0.3 70 0.2 71 0.2 72 0.2 73 0.2 74 0.20 75 0.1 76 0.1 77 0.04 78 0 130056.doc -58- 200907059 表10.經ρΑ205Α1轉染之CHO細胞中之阿達木單抗的表現量 ρΑ205Α1 純系# 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM MTX 1 4.50 11.5 18.9 2 2.50 9.2 17.4 3 2.40 9 15.6 4 2.10 7.4 11.4 5 2.00 6.9 10.8 6 2.00 5.8 10.6 7 1.90 5.6 8.6 8 1.40 5.4 7.8 9 1.40 5.3 7.1 10 1.20 4.8 5.9 11 1.20 4.2 5.5 12 0.90 3.6 3.2 13 0.80 2.7 0.6 14 0.70 1.8 0.5 15 0.50 1.3 16 0.40 0.6 17 0.30 0.6 18 0.07 0.05 19 0.00 0.03 20 0.00 0 130056.doc -59- 200907059 表11.經pA205A2轉染之CHO細胞中之阿達木單抗的表現量 pA205A2純系 # 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM MTX 1 9.4 32.4 26.8 2 6.0 21.5 17.9 3 4.80 21.2 17.7 4 4.60 19.1 15 5 4.20 18.6 13.2 6 3.70 16.6 12 7 3.50 13.9 7.6 8 3.50 13.4 6.5 9 3.20 12.3 5.2 10 3.0 11.4 4.8 11 2.8 11.2 4.6 12 2.7 10.4 4.2 13 2.60 9.6 2.6 14 2.60 9.4 2 15 2.50 9.2 1.6 16 2.5 8.5 0.01 17 2.40 7.5 18 2.4 6.7 19 2.30 5.3 20 2.30 5 21 2.3 4.9 22 2.3 4.8 23 2.20 4.2 24 1.90 3.6 25 1.8 2.6 130056.doc -60- 200907059 f / 26 1.8 2.4 27 1.70 2.3 28 1.6 1.8 29 1.5 1.6 30 1.40 1.5 31 0.8 1.2 32 0.8 1.1 33 0.7 0.8 34 0.6 0.7 35 0.6 0.3 36 0.5 0.3 37 0.5 0.05 38 0.40 0 39 0.3 0 40 0.2 0 41 0.1 42 0.1 43 0.07 44 0.05 45 0.05 46 0.00 47 0 130056.doc -61 - 200907059 表12.經pA205A2-Spe-trunc轉染之CHO細胞中之阿達木單 抗的表現量 pA205 A2-Spe-trunc、純系 # 0 nM MTX 20 nM MTX 1 5.5 4.7 2 3.1 2.3 3 2.1 2.0 4 2 2.0 5 1.3 1.9 6 1.2 1.8 7 1.1 1.4 8 1.1 1.2 9 1 1.0 10 0.9 0.8 11 0.9 0.4 12 0.9 0.2 13 0.8 0 14 0.7 0 15 0.7 0 16 0.7 17 0.6 18 0.5 19 0.4 20 0.4 21 0.4 22 0.4 23 0.4 24 0.3 25 0.2 26 0.2 130056.doc -62- 200907059 表1 3 ·經pA205 A2-Swa-trunc轉染之CHO細胞中之阿達木單 抗的表現量 pA205 A2-Swa-trunc純系# 0 nM MTX 20 nM MTX 1 1.1 1.1 2 0.7 0.8 3 0.7 0.8 4 0.6 0.7 5 0.6 0.5 6 0.5 0.4 7 0.5 0.4 8 0.4 0.4 9 0.4 0.4 10 0.3 0.4 11 0.3 0.4 12 0.3 0.2 13 0.3 0.05 14 0.3 0 15 0.3 0 16 0.3 0 17 0.3 18 0.2 19 0.2 20 0.2 21 0.2 22 0.2 23 0.2 24 0.1 25 0.1 26 0.1 27 0.08 28 0 130056.doc -63 - 200907059 表14·經pCHOEL246GGhum轉染之CHO細胞中之抗EL-選擇 抗體的表現量 pCHOEL246GGhum 純系# 0 nM MTX 20 nM MTX ΙΟΟηΜΜΤΧ 500 nM MTX 1 14.4 24.4 22.9 32.8 2 5.5 11.7 15.4 20.2 3 3.9 10.3 13.5 13.9 4 2.3 8.5 9.8 10.5 5 2.3 7.1 8.5 8.2 6 2.3 6.7 6.2 7.7 7 1.7 6.5 5.4 7.4 8 1.6 5.8 4.4 5.4 9 1.6 4.9 4.0 5.2 10 1.6 3.7 3.6 5.0 11 1.6 3.6 2.2 3.3 12 1.5 3.2 2.0 1.3 13 1.4 2.3 1.8 14 1.4 2.3 1.4 15 1.4 2.2 16 1.3 2.0 17 1.2 1.8 18 1.1 1.3 19 1.1 0.8 20 0.9 21 0.8 22 0.5 23 0.4 24 0.3 25 0.2 I30056.doc -64- 200907059 表15.經pA-Gen-EL-選擇素轉染之CHO細胞中之抗EL-選擇 素抗體的表現量 pA-Gen-EL- 選擇素純系# OnMMTX 20 nM MTX 100 nM MTX 500 nM MTX 1 9.1 30.5 30.0 62.5 2 5.6 15.0 27.1 35.5 3 4.1 14.1 22.8 34.4 4 3.4 13.4 22.6 31.3 5 3.4 13.4 19.4 30.1 6 3.2 9.6 16.3 29.9 7 3.2 6.4 13.0 26.9 8 3.1 6.2 12.8 25.1 9 2.9 5.7 12.6 19.9 10 2.8 5.6 12.1 17.9 11 2.8 5.2 11.7 14.4 12 2.7 5.1 9.0 12.5 13 2.3 4.5 8.1 8.6 14 2.1 4.5 7.9 3.3 15 2.0 4.4 6.5 2.8 16 1.8 4.1 6.4 0.7 17 1.8 4.0 5.7 18 1.6 3.9 19 1.6 3.8 20 1.4 3.4 21 1.3 3.4 22 1.1 3.3 23 1.1 2.7 24 1.1 2.6 25 1.0 2.6 26 1.0 2.4 130056.doc -65- 200907059 27 0.9 2.3 28 0.9 2.1 29 0.8 30 0.8 31 0.7 32 0.6 33 0.2 34 0.1 實例8.抗IL-13抗體之表現之增加。 該研究展示，與經缺乏rEVE之表現轉染之細胞相比， 人化抗IL-1 3抗體於培養物中之經穩定轉染哺乳動物細胞 中rEVE介導之表現增加。 使用標準方法，將編碼具有人類IgGyl同型之人化抗IL-1 3单株抗體之重鍵及輕鍵的DNA分子（參見美國弟 1 1/899,8 19號，其以引用之方式併入本文）嵌入表現載體質 體pBJ(—種DHFR-MTX可擴增表現質體）中’以產生表現 質體pBJ-13C5.5(親本表現質體）。隨後將包含ARM2序列 (SEQ ID NO:2)之rEVE聚核苷酸嵌入質體pBJ-13C5.5中， 以產生含rEVE之表現質體pA2-13C5.5(ARM2 rEVE表現質 體）。 按照先前實例中所述之通用轉染方案，用親本表現質體 PBJ-13C5.5 或含 ARM2 之 rEVE 表現質體 pA2-13C5.5 轉染 CHO細胞，以獲得經穩定轉染之CHO細胞。轉染後24小 時，將來自各轉染之細胞接種至48個96孔培養板中（200個 細胞/孔）。就人類IgG之表現而言，藉由ELISA篩選個別孔 之培養基。在經ARM2 rEVE表現質體轉染之細胞之培養物 130056.doc -66 - 200907059 (孔）中，光學密度比經親本表現質體轉染之細胞稍微更 高。與經親本質體PBJ-13C5.5轉染之細胞之每培養板平均 68個群落相比，當細胞經ARM2 rEVE質體pA2-13C5.5轉染 時，每培養板平均74個群落（孔）在選擇過程中存活。隨後 使來自各轉染之1 5個穩定轉染之純系經受DHFR-甲胺喋呤 (MTX)擴增。 擴增之前，自ARM2 rEVE質體轉染純系獲得之抗IL-13 抗體之平均表現量比自親本質體轉染純系之平均表現量高 兩倍。隨後，藉由2種方案中之任一者擴增抗體表現。使 用用於如上文實例2中所述之DHFR-MTX擴增之基本方 案，首先使純系在20 nM MTX之濃度下經受選擇，接著進 一步在100 nM MTX下選擇。在另一擴增方案中，直接在 100 nM MTX下選擇純系，而無中間MTX濃度下之介入選 擇。下文表16展示，在含有指定量之擴增（甲胺喋呤 ”MTX”之濃度）之培養基中的2次繼代後，在具有來自各轉 染之前3個產生之純系的培養物中之抗IL-1 3抗體之平均產 生量。 表16.經轉染之CHO細胞中之人化抗IL-13抗體含量 表現載體 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM MTX pBJ-13C5.5 2.63 pg/ml 2.00 pg/ml 3.04 pg/ml pBJ-13C5.5 2.63 pg/ml N.A. 1 _72 pg/ml pA2-13C5.5 4.35 pg/ml 5.85 pg/ml 14.94 pg/ml pA2-13C5.5 4.35 pg/ml N.A. 14.33 pg/ml N.A. =不適用，不為擴增方案之部分 130056.doc -67- 200907059 表16中之數據清楚展示，與自載運缺乏ARM2 rEVE DNA之親本表現質體之轉染物獲得的表現量相比，ARM2 rEVE將人化抗IL-13抗體之表現量增加大約3倍至5倍。另 外，當在100 nM MTX之擴增量下生長時，ARM2 rEVE表 現質體轉染物之一個次純系以高達95 μg/ml之含量及21 ·74 pg/細胞/天之比生產率表現人化抗IL-13抗體。 當在MTX選擇下生長時，藉由經ARM2 rEVE表現質體 轉染之純系的抗IL-1 3抗體之擴增的表現量易於維持歷時 至少3週。 實例9. ARM1及ARM2 rEVE聚核苷酸分子對阿達木單抗於 瞬間表現系統中之表現的影響。 該研究經設計以確定rEVE聚核苷酸分子是否將增加重 組蛋白於瞬間表現系統中之表現量。 用表現質體載體 pA205、pA205Genomic、ρΑ205Α1、 pA205A2_、pA205A2-Spec-trunc及 pA205A2-Swa-trunc轉染 HEK 293細胞。根據公開條件（Durocher等人， dcz·心: E9)用與聚伸乙基亞胺複合之質體DNA轉 染在 Freestyle 293 表現培養基（GIBCO®，Invitrogen， Carlsbad, CA)中培養之HEK293細胞。不執行用於載體整 合之選擇。轉染後，將細胞培養7天，且如上所述測試培 養物上清液之等分試樣的阿達木單抗濃度。3次轉染之結 果展示於表1 7中。對第3次轉染而言，一式三份來測試表 現量。 130056.doc -68- 200907059 表17.經轉染HEK 293細胞中之阿達木單抗的表現量* 轉染 pA205 pA205 Genomic ρΑ205Α1 pA205A2 pA205A2- Spe-trunc pA205A2- Swa-trunc 1 2.1 5.4 5.4 3.3 2 5.3 20.3 20.3 9.9 3 4.3 11.9 11.9 10.2 2.2 1.2 4.1 15.7 15.7 2.3 1.3 3.0 14.2 14.2 2.3 1.0 阿達木單抗之Mg/ml 表17中之結果展示，當ARM 1及ARM2序列分離地 (ρΑ205Α1、pA205A2)或以組合开》式（pA205Genomic)存在 於表現質體載體上時，其可增加阿達木單抗於HEK 293細 胞中之表現量。在該HEK 293瞬間表現系統中，ARM 1賦 予比ARM2更大程度之阿達木單抗表現增加。相反，在 CHO穩定表現系統中（參見上文實例3)，ARM2賦予比 ARM 1更大程度之阿達木單抗表現增加。如在CHO穩定表 現系統（上文實例6)中所見，ARM2之增加效應亦在經載運 Spel-或Swal-截短ARM2序列之表現質體載體轉染之HEK 293細胞中明顯降低，包括表現降低至在經pA205對照（無 ARM序列）質體表現載體轉染之細胞中所見以下之程度。 上文引用之所有專利、申請案及公開案係以引用之方式 併入本文。 本文中所述之本發明之其他變化及實施例現將為熟習此 項技術者所明白，且本發明之所有該等變體及替代性實施 例意欲涵蓋於上述描述及下文的申請專利範圍中。 130056.doc -69- 200907059 【圖式簡單說明】 ，展示用以表現免疫球蛋白重鏈及κ輕鍵之質體表現載 體ΡΑ205之不意圖，該等免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈在中國倉 _(CH〇)細胞之穩定轉染物中形成活性人類抗跡以 IgGl分子（”阿達木單抗（心‘，"）。缩寫："強 (麵就ER)”係指細胞巨大病毒（⑽）之中間早期基因強 化子；，，継NO啟動子，，係指腺病毒之主要晚期啟動子； f ”阿達木單抗重鏈"係指阿達木單抗之柳重鏈之編碼區； "SV40 Poly A"係指猴病毒4〇多聚腺嗓呤位點；”胃泌素終 止子"係指人類胃泌素基因之轉錄終止信號；"sv4〇啟動子” 為狼病毒40啟動子；” DHFR，，係指小鼠二氯葉酸還原酶基 因’ TK Poly A”係指單純祕病毒胸苦激酶基因之多聚腺 嗓呤位點；"阿達木單抗輕鏈"係指阿達木單抗之κ輕鏈之 編碼區；，警，係指在杨料中起作用之質體C〇lE1原核 之複製起源；”P(BLA)，，係指β·⑽胺酶基因（安比西林 (amPiCilHn)抗性基因）之原核啟動子且小箭㈣示轉錄方 向’ "AW安比西林抗性'，）係指β·内醯胺酶之編碼區。箭 頭指示轉錄方向（5'至3。 圖2為質體表現載體pA2〇5Gen〇mic之示意圖其中具有 SEQ ID NQ:1之核㈣驗基序列之ARMi(”Ai”）核酸嵌入表 現載體pA2G5(g| 1)中腺病毒主要晚期啟動子及阿達木單抗 柳重鍵編碼區上游處，且具有SEQ ID NO:2之核苦酸驗 基序列之ARM2(”A2")核酸喪入阿達木單抗K輕鏈編碼區之 下游中。關於其他縮寫，參見上文圖i之描述。 I30056.doc -70- 200907059 圖3為質體表現載體ρΑ205Α1之示意圖，其中具有SEQ ID ΝΟ:1之序列之ARMl(”Aln)核酸嵌入表現載體pA205(圖 1)中adeno啟動子及阿達木單抗IgG 1重鏈編碼區上游處。 關於其他縮寫，參見上文圖1之描述。 圖4為質體表現載體pA205A2之示意圖，其中具有SEQ ID NO:2之核苷酸鹼基序列之ARM2(nA2”）核酸嵌入阿達木 單抗κ輕鏈編碼區之下游中。關於其他縮寫，參見上文圖1 之描述。 圖5為用以表現免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈之質體表現載體 pCHOEL246GGhum之示意圖，該等免疫球蛋白重鏈及κ輕 鏈在中國倉鼠卵巢（CHO)細胞之穩定轉染物中形成活性人 類抗EL-選擇素IgGl分子。’’抗EL-選擇素重鏈”係指人類抗 EL-選擇素IgGl抗體之重鏈之編碼區；”抗EL-選擇素輕鏈” 係指人類抗EL-選擇素IgGl抗體之κ輕鏈之編碼區。關於其 他縮寫，參見上文圖1之描述。 圖6為質體表現載體pA-Gen-EL-選擇素之示意圖’其中 具有SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸鹼基序列之ARM1(’’A1")核酸嵌 入表現載體pCHOEL246GGhum(圖5)中抗EL-選擇素IgGl重 鍵編碼區上游處’且具有SEQ ID NO:2之核杳酸驗基序列 之ARM2(”A2”）核酸嵌入抗EL-選擇素κ輕鏈編碼區之下游 中。關於其他縮寫，參見上文圖1之描述。 圖7為用以在CHO細胞之穩定轉染物中表現增強綠色螢 光蛋白（eGFP)的質體表現載體pA205-eGFP之示意圖。 eGFP編碼區（"EGFP")嵌入pA205(圖1)中腺病毒主要晚期啟 130056.doc -71 - 200907059 動子（"ADENO啟動子”）之下游處，輕鏈編碼區、近端啟動 子及近端強化子及重鏈編碼區已自該PA205缺失。關於其 他縮寫，參見上文圖1之描述。 圖8為質體表現載體pA205G-eGFP之示意圖，其中具有 SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸鹼基序列之ARM1("A1”）核酸嵌入表 現載體pA205-eGFP(圖7)中eGFP編碼區（nEGFP”）之上游 處，且具有SEQ ID NO:2之核苷酸鹼基序列之ARM2(”A2”） 核酸嵌入eGFP編碼序列之下游中。關於其他縮寫，參見上 文圖1之描述。 圖9為質體表現載體pA205 A2-Spe-trunc之示意圖，除 ARM2(SEQ ID NO:2)已經截短 ARM2 變異體 ”A2(bp 1-1086)"置換外，該質體表現載體基本上與圖4中所示之表 現載體PA205A2相同，該截短ARM2變異體由於ARM2核酸 經限制性核酸内切酶处e/之消化而具有SEQ ID NO:2之鹼 基1-1 086之核苷酸鹼基序列。關於其他縮寫，參見上文圖 1之描述。 圖10為質體表現載體pA205A2-Swa-trunc之示意圖，除 ARM2(SEQ ID NO:2)已經截短 ARM2變異體"A2(bp 1-461)" 置換外，該質體表現載體基本上與圖4中所示之表現載體 PA205A2相同，該截短ARM2變異體由於ARM2核酸經限制 性核酸内切酶之消化而具有SEQ ID NO:2之驗基1 -461 之核苷酸鹼基序列。關於其他縮寫，參見上文圖1之描 述。 130056.doc -72- 200907059 序列表 <11〇>美商亞培公司 <120>可增加重組蛋白於宿主細胞内表現之重組表現載體元件(REVE)

<130> ABT-107.1 US <140 097111615 <141> 2008/03/28 <150> US 60/921,141 <151> 2007-03-30 <160〉18 <170> Patentln version 3.5 <210> I <211> 2329 <212> DNA <213>申國倉鼠 <400> 1 aattgaattc gttcccttta gtgagggtta attccecggc cgcgtcgaca gctctagagg 60 gagtgccagg ataggctcca aagctacaca gagaatccct gtttcaaaaa accaaaaaaa 120 aaaaaataaa aaataaaaaa taaaaagtag ggtacagatc taaatagaca attctcaata 180 gaggaatcta aaatgcctga aagacaaata agaaagtgtt caacatcctt agccatcagg 240 gaaatgcaaa tcaaaacaac tctgagatac tatcttactc ctgtcataat ggccaaattc 300 aaaaacacta atgacagttc atgttggaga gaatgtggag aaagaggagc acttctccac 360 tgctggtggg agtgccaact tggacagcca ctttggaaat cagtatggct actcctcaag 420 aaaatggaaa tcagtttacc acaagatcca gcaattccac tcaggcatat acccaaaaga 480 accgcattca tacaagcaat atctgttcaa cgatgttcat agcagctcta tttgtaacag 540 ccagaaactg gaagcagcct agttgcacct caaccaaaga aatggataga gaaaatatgg 600 tacatttatg caatggagta ctactcagcg gaaaagtaca atggaatctt gaaatttgca 660 agaaaatgga tggaactaga agaaaccttt ctgagcaagg taactcaatc acaaaaagac 720 aaacatgata tgtaatcact catatgtgga ttttagacac agtgtaaagg attaccagcc 780 tacaatccac actgccaaag aacctaataa acaaggagga ccctaaggga gacatacatg 840 gtcccctgga gatggggaat gggtcaagat atgctgagca aagtgggaac aigggaagag 900 gggggaagga gctaggaaat tgagaaaggg agaaaaggag ggatgcagag gacataaggg 960 agcagaaaca ttgactcagg gaatgaatcg aagataacaa gccatggaga latcataata 1020 gagggagaca ttttgggtat acagagaaat caggcacttg ggaaatgtct ggaaatctac 1080 aaagtataac acca£gtaac aatctaagca acagaggaga ggctacctta aatgtcctac 1140 cctgatagtg agattgatga ctaacttata tgccatgtta tagccttcat ccagcagctg 1200 gtggaagtag aagcagacac ccataactaa tcacggaact gaactggaac ccagattcag 1260 agaaggatga gtgaagggca cagaggtcca gaccaggctg gtgaaaccca caaaaacagt 1320 tgaactgaat atcggtgaac tcttgctccc cagactgata gctggaatac cagcatg£ga 1380 ctgatccaga ctccaggaac atgagttcct gtgaggaaac ctcggaaatc taagggacct 1440 cctgtagaag ttcagtactt atccctagca taggtgtgga ctgagggagc ccattccata 1500 tagaggaata ctctctggag ccaacacaca tgggggtggg cataggccct ttcccaaagc 1560 130056.doc f 200907059 atacaataga ctcggatgac accctatgga aggcctcatc atccaggggg agcagaaagg atatgtgata gacagggtti cagttgggag ccgggtagtg ggaggggaga attggtggaa gaaggaaacc gggattgtca tgtaaatcaa tgctgtttct aattcaaata agaaagttga aaaaaaagaa aactgatact tattgcacca tgtaatgtta tgaaatggca tttgctgtta agatgagcag tctatctgct aaictcccta gctggcttgt gaacitgtta tatggacaaa gctggtctca aattcaaaga tatttgcgta tgtctgtctc ctgagtgttg agagtacaag tatgtaccac caatcccttt gattatacaa ttacatttga aaacagtttg agatttaatt ataactatgc aatcaattca aaataataaa utaaatctc atatttgtct ttaggtggaa atctgttaat atacatcatg attatatatt ttaatttatt atatgttttc taggacaaaa tatactaaaa tgaaatctaa ggctctaaac atacaaaact gtatgcaiag atacatcacg atcatataat ttccatgaca tgctattcgg gaatataatg aictacctgc agtaatgatt aatttggaaa tgctgaatac aactgcttct cttttgaaaa tacaaattcc ttacatttgt aatctattta attttaaagg ttgtacccca gaaagtagtg aattcttaa <210> 2 <211> 2422 <212> DNA <213>中國倉鼠 <400> 2 aagaatatgc tcaatgtaat acccatggca ggcattcaat gtttgtctgt cttcatattg aagataaaca gatgtatatc atatacaaaa atatttaatg tgaagttgtc catgtgttca ggatctatat actttcaaaa atctttttcc atattctttt cttaatcclc ctgaagtgta gaccattata ctggaaaacc gtcactattg tacaggatag gagcctttga ctctgagagg atcccataca ttgatt£tat tttcaaatat attitggctg cltttctcca tgtgatattt ggcaatctgg agaggcattt gctcctggaa atttatcaat gltgacaatg ttgtttacat gttttaagta actattttgc taccaaggaa actgcttcac tccctttcac atataaaact cataaaatat tgaaaggctc caataagttt aaatcattct gtattgctca tggagattta aatttcagtg ctaatttttt attagcactt taatttagaa ggcaccaggt ttctacaaga tttaaaatta ttggagcatt tcaaaatttt ataagctttc cagtaaggtt gtggctatga ttcittgctt gtaaagtaaa gtgcaattta aagttaattt aaataattta actgctgcag acat11 tagg agaattgttt gtatttcaaa ctgaaattea gggtagacaa ttagaataat tttacaaaga ggaaatattt ttctaataat aaattagtaa ctctaactta tattaaaatt taagtcctca ttgctttcaa tattttaaca accctattgt attatttttc ttataaatat ttgaatttat aatgatcaaa gaatttcttt gatacaagtg tetaaatgat taccatcaaa ctgttggtag gagcttgtta tatatgtgtt ttaccttatg ttttttgata cttcatttgt tactgtactg tgatcgaglt aattccctac tgaaactaaa aatgetatea catagtttta gcatcatctg ttggggaaat ggctatttta actactctga gatgagaaat tcaacaccat tcactaacaa tatagggaaa clagtgttgg tagattgttg agtgcttata catatatctt gtcccatggt taactataag ttggtgtctg ttgctgccac ccagtatgga aacacattat gttttttctt tttttttttt tatagccatg agaaagacca aaattetata cttgaaaaac 130056.doc 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2]00 2160 2220 2280 2329 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 -2- 1260 1320 200907059 cgtttatatt gaatgtgtat tcctttcacg tccaccttag attcaactcc taagtcaatt tatggtaaag catagatcat ctgci igaca acagt i tgga tgatgatct t ggaaaaaatg ccttattata tgatacaatg gaattaatga tatgagctga ataaatatat caatattcaa atgacatact aatatttatg tctaagagaa tgtgttcaaa gtagatgaaa gtgccttcac ttgaaaattc atctgagtta aaacagatag ttgcttcggt tttagttatt tcagaggtat tcaagttgac aactaagaat agccgtcaca gatacatatc aattatggac ccaaattcta ttgaatgtca gctacatatt cttatagaaa ataggaacct agatgaggcc gtgttcttgg aatgaatttt caacacattg tatgagggtt ttattgtggt tttggttgti gttttacttt cctttttttc catagacaaa tugtcccat gtacccacaa ggtgaccagt ggtgacaagc ctactccagg agtcctggtg aataaagatt atacaagau gtagagactc atcaaaacaa taagaaaaag agaatacata gggcagaaat ttctcatttt ctcagctatg gtatcctatt tcactcttgt actattctac tcactagaag tcagtgacta ccataactca gtggctgtgc cctagatcaa aggaaacatt atttcaaggc atgaatgtca gccacacctt catagtg£gt tactutaat ttgtttagta agaatagaca ccctactttg gttaggaaac ataaacttac aagacattca ttggtttttc tttactaaat taaatcatta agaaaatcgt aattatcaga gtttaaatgg catgaaacat agaaatactc atttgctgcc ctgatttatt ticccaagaa tattttcaat gtcttctttg gaagctcctt ggtaaatgca ctttctttca ctcatttatg aggtctgtgc acatcacagt caataaaggc ctgcagtatt gaatcagcca tacagacata attcataaca tttttctatt tctcatgaat caaatattgt tattgctgta cataaaataa tgaatcaaag tataggtcta ga <210> 3 <211> 9 <212> DNA <213>未知 <220> <223〉MAR 元件 <220> <221> misc feature <222> (7)..(7) <223> y 為 t 或 c <400> 3 aataaayaa <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213>未知 <220> <223> _元件 <220> <221> misc feature <222> (3)..(3) <223> w 為 a 或 t <220〉 130056.doc 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2422 10200907059 f

K <221> misc feature <222> (5)..(5) ^ <223> w為a或t <220> <221> misc feature <222> (8).:(8) <223> w為a或i <400> 4 ttwtwttwtt <2】0> 5 <211> 21 <212> DNA <213> 未知 <220> <223> MAR元件 <220> <221> misc feature <222> (3)..(3) <223> w為a或i <220> <221> misc feature <222> (5)..(7) <223> w爲a或t <220> <221> misc feature <222> (8)..(9) <223> n為a， t， g或 <220> <221> raise feature <222> (11)7.(12) <223> w為a或t <220> <221> misc feature <222> (13)7.(13) <223> r為g或a <220> <221> misc feature <222〉 (17)7.(18) <223〉 n為a, t，g或 <220> <221> misc feature <222> (19)7.(20) <223> w為a或t <400> 5 tawawwwnna wwriaannww <210> 6 <211> 11 <212> DNA <213> ϋ口 <220> <223> MAR元件 <220> <221> misc feature <222> (l).T(l) <223> W為a或t 21 130056.doc 4- 2 00907059 <220> <221> <222> <223> <220> <22 ]> <222> <223> mi sc_feature (7)..(7) r為g或a misc_feature (11).,(11) w為a或t <400> 6 wtttatrttt w <210> <211> <212> <213>

7 9 DNA <220> , <223> MAR 元件 <400〉 7 aatatattt <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213>未知 <220> , <223> MAR 元件 <220> <221〉 misc一feature <222> (5)..(11)<223> n 為 a, t，g，或 c <220> <221> misc_feature <222> (16)..(22) <223> n 為 a， t, g，或 c <400> S aaaannnnnn naaaannnnn nnaaaa <210〉 <211> <212> <213> NA^ 9 6 DN未 <220> 1 <223> MAR/C 件 <400〉 9 tttaaa <210> 10 <211> 20 <2I2> DNA <213>未知 <220> , <223> MAR 元件 <220〉 <221> <222> <223> misc feature (1).7(20) w為a或t 130056.doc 200907059 <400> 10 <2ΐο> η <211> 12 <212> DNA <213>未知 <220> <223> MAR 元件 <220> <221> mi sc_feature <222> (3)..(5) <223> η 為 a，t，g，或 c <220> <22]> misc—feature <222> (8)..(10) <223> η 為 a，t，g，或 c <400> 11 tannntgnnn ca <210> 12 <211> 12 <212> DNA <213>未知 <220> <223> _元件 <220> <221> misc feature <222> (3)..(5) <223> η 為 a，I，g，或 c <220> <22]> misc feature <222> (8)..(10) <223> η 為 a，t，g，或 c <400> 12 tannncannn tg <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213>未知 MAR元件 <220〉 <223> <220> <221> misc_feature <222〉 （3)..(5) <223> η 為 a，t，g > 或 c <220> <221> misc_feature <222〉 （8)..(10) <223> η 為 a, t， g，或 c <400> 13 tgnnntannn ca <210> 14 <21I> 12 130056.doc 200907059 ./ \ A知1515g未 > > > Λ 0 12 3 2 2 2 2 < < < < <220> <223> MAR元件 <220> <221> misc feature <222> (3)..(3) <223> n 為 a，t，g， <220> <221 > misc feature <222> (4)..(4) <223> w為a或t <220> <221> misc feature <222> (6)..(6) <223> y爲t或c <220> <221> misc feature <222> (10)7.(10) <223> η a, tg， <220> <221> misc feature <222〉 (13)7.(14) <223> n 為 a，t，g， <220> <22 )> misc feature <222> (15)..(15) <223> r爲S或a <400> 15 ginwayaltn atnnr <210> 16 <211> 7 <212> DNA <213> ‘知 <220> <223> MAR元件 <400> 16 caaaaca <212> DNA <213> <220> <223> MAR元件 <220> <221> misc feature <222> (3)..(5) <223> n為 a, t, g, <220> <221> misc feature <222> (S)； :(10) <223> n為 a，t，g， <400> 14 cannntannn tg 130056.doc 200907059 <210> 17 <211> 6 <212> DNA <213>未知 <220> , <223> _元件 <400> 17 aatat t <210> 18 <211> 8 <212> DNA <213>未知 <220> <223> MAR序列基元 <400> 18 aatatatl / 130056.doc

Claims (1)

1. 200907059 十、申請專利範圍： 1. 一種分離之重組表現載體元件（rEVE)聚核苷酸分子，其 包含一個選自由以下組成之群的核苷酸鹼基序列：卯卩 m n〇:i之核芽酸鹼基序列、SEQ m Ν〇··2之核芽醆鹼基 序列、與任何前述序列互補之序列、任何前述序列之表 現增加部分及其組合。 2.如請求们之分離^rEVE聚㈣酸分子，其中該必⑼ 核皆酸分子包含選自由以下組成之群的SEQ ID N〇:2序 列之表現增加部分：SEQ ID N〇:2之鹼基462_2422之序 列及SEQ ID NO:2之鹼基1087-2422之序列。 3. 一種重组載體，其包含如請求項1或2中任-項之_聚 核苷酸分子。 A 4. 如請求項3之重組載體，其中該重組載體為重組表現載 體0 6. 5.如凊求項4之重組表現載體’其係選自由以下组成之 =重組質體表現載體、重組真核病毒表現載體、重組 :體表現_、重組酵母迷㈣色體表現載體、重& 二t工染色體表現載體及重組酵母表現質體載體。 。月·>、項4之重組表現載體，豆中兮舌》主 一七夕， 戟篮/、中5亥重組表現載體包含 夕個編碼_或多種重組蛋白之功能重組基因。 月求項6之重組表現載體，豆中拎... # ^ ό , 取體/、中該一或多種重組蛋白 :選自由以下組成之群··可溶性蛋白 白、核糖體蛋白、臨„ 疋曰、·、口構蛋 蛋白、Mu 鉍原、抗體分子、細胞表面受體 蛋白、轉錄調節蛋白、韓筋 又菔 轉澤凋卽蛋白、_色質蛋白、激 130056.doc 200907059 素、細胞週期調節蛋白、G蛋白、神經活性肽、免疫調 節蛋白、血液組分蛋白、離子閘（gate)蛋白、熱休克蛋 白、二氫葉酸還原酶（DHFR)、抗生素抗性蛋白、前述蛋 白質之任一者之功能片段、前述蛋白質之任一者之含抗 原決定基（epitope)片段，及其組合。 8. 如請求項7之重組表現載體，其中該抗體分子係選自由 以下組成之群：抗TNF-α抗體、抗EL -選擇素抗體及抗 IL-13抗體。 9. 如請求項8之重組表現載體，其中該抗TNF-a抗體為阿達 木單抗（adalimumab)。 10·如請求項4-9中任一項之重組表現載體，其中該重組表現 載體包含編碼一風葉酸還原酶之基因之至少一個複本 (copy) 〇 11. 一種宿主細胞’其包含如請求項3-10中任一項之載體。 12. 如請求項11之宿主細胞’其中該宿主細胞為真核宿主細 胞或原核宿主細胞。 13. 如請求項12之宿主細胞，其中該宿主細胞為一種選自由 以下組成之群的真核宿主細胞：哺乳動物宿主細胞、昆 **伯主細胞、植物宿主細胞、真囷伯主細胞、真核藻類 宿主細胞、線蟲宿主細胞、原生動物宿主細胞及魚宿主 細胞。 14. 如請求項Π之真核宿主細胞，其中該真核宿主細胞為哺 乳動物宿主細胞。 15. 如請求項14之哺乳動物宿主細胞，其中該哺乳動物宿主 130056.doc 200907059 細胞係選自由以下組成之群：中國倉鼠卵巢（CHO)細 胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髓瘤細 胞、人類胚腎（HEK 293)細胞、嬰兒倉鼠腎（BHK)細胞、 海拉細胞（HeLa cell)、人類B細胞、CV-1/EBNA細胞、L 細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞及MDCK細 胞。 16 ·如請求項1 5之哺乳動物宿主細胞，其中該哺乳動物宿主 細胞為CHO細胞。 1 7.如請求項1 3之真核宿主細胞，其中該真核宿主細胞為真 菌宿主細胞。 18.如請求項17之真菌宿主細胞，其中該真菌宿主細胞係選 自由以下組成之群：#窗/# (AperW/Zw·?)、鍵癌潑屬 {Neurospora)、酵母菌屬 kSaccharomyces') ' 畢赤酵母屬 {Pichia)、漢森酵母屬（jjansenuia、、裂殖酵母屬 {Schizosaccharomyces、、刻魯維拉菌屬、Kiuyver〇_ myces、、耶羅維亞酵母屬（jarr〇wic^反念珠菌屬 (Candida)。 1 9.如睛求項1 8之摩#磨vf宿主細胞，其為鹱酒摩母（& cerevWae)宿主細胞。 2〇·如請求項13之真核宿主細胞，其中該真核宿主細胞為原 生動物宿主細胞。 21.如晴求項20之原生動物宿主細胞’其中該原生動物宿主 ㈣概爲撕場利什曼原蟲认eishmania tarent〇lae)宿芏細 胞。 130056.doc 200907059 22. —種製造所關注之重組蛋白之方法，其包含轉錄及轉譯 存在於如請求項4-1 〇中任一項之重組表現載體上之一或 多個編碼該所關注之重組蛋白的基因。 23·如a青求項22之方法’其中該轉錄及轉譯發生在無細胞之 轉錄/轉譯系統中或在宿主細胞中。 24. 如請求項23之方法，其中該轉錄及轉譯發生在宿主細胞 中。 25. 如請求項24之方法，其中該宿主細胞為CHO宿主細胞。 26· —種製造穩定表現高量所關注之重組蛋白的宿主細胞之 方法’其包含： 將如請求項1 〇之重組表現載體嵌入宿主細胞中， 使S亥專伯主細胞在甲胺嗓呤（meth〇trexate)存在下生 長’以選擇表現該所關注之重組蛋白的抗曱胺嗓吟之宿 主細胞，及 分離該抗甲胺嗓呤之宿主細胞， 其中該分離之抗曱胺喋呤之宿主細胞表現該所關注之重 組蛋白之量高於甲胺喋呤敏感性宿主細胞，且其中該抗 甲胺喋呤之宿主細胞在甲胺喋呤存在或不存在下生長 時’穩疋表現高量之該重組蛋白。 27. 如請求項26之方法，其中該甲胺喋呤係以5 nM至 範圍内之濃度存在。 H 28. 如蜗求項26之方法，其中該宿主細胞為CH〇宿主細胞。 29. —種用於擴增重組表現載體上編碼所關注之重組蛋白於 相主細胞中表現之二氫葉酸還原酶（DHFR)-甲胺喋呤方 130056.doc 200907059 法，其中該重組表現載體包含編碼該所關注之重組蛋白 之基因及編碼DHFR之基因，其改良在於該重組表現载 體亦包含如請求項i或2之rEVE聚核苷酸分子，其中含有 忒表現載體之宿主細胞在甲胺喋呤存在下生長以選擇且 產生抗甲胺喋呤之宿主細胞，該抗甲胺喋呤之宿主細胞 在甲胺嗓吟存在或不存在下生|日寺，以擴增量穩定表現 該所關注之重組蛋白。 30. 31. 32. 如》月求項29之方法，其中該甲胺嗓吟係以$ nM至1 〇 範圍内之濃度存在。 如明求項29之方法，其中該宿主細胞為CH〇宿主細胞。 一種改良或增強表現重組蛋白之宿主細胞群體適應在甲 胺喋呤存在下生長能力的方法，#包含之步驟為： 將一種重組表現載體嵌入宿主細胞中，該重組表現載 體包含： 編碼所關注之重組蛋白之重組基因、 重組表現載體元件（rEVE)聚核苷酸分子，其包含一 述自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID N〇:2、SEQ ID ΝΟ:1之一部分、SEQ m N〇:2之一 部分，及其組合，及 二氫葉酸還原酶（DHFR)基因； 其中/甲胺嗓吟存在下生長時’與攜帶缺乏該rEVE聚核 ▲-刀子之相同重組表現載體之宿主細胞群體相比，含 有^重組表現載體之宿主細胞群體具有更高存活性及/或 更高生長速率。 130056.doc 200907059 33. 如請求項32之方法’其中該甲胺喋呤係以5 至1 〇 μΜ 範圍内之濃度存在。 34. 如凊求項32之方法，其中該宿主細胞為ch〇宿主細胞。 35. —種製造表現高量重組蛋白之抗曱胺喋呤之宿主細胞的 方法，其包含： 將一種重組表現載體嵌入宿主細胞中，該重組表現載 體包含： 編竭所關注之重組蛋白之重組基因、 重組表現載體元件（rEVE)聚核苷酸分子，其包含一 個選自由以下組成之群的序列·· SEQ ID NO: 1、SEQ ID N〇:2、SEQ ID ΝΟ:1 之一部分、SEQ ID NO:2之一 部分，及其組合，及 二氫葉酸還原酶（DHFR)基因； 使该等宿主細胞在曱胺喋呤存在下生長，以選擇表現 δ亥所關注之重組蛋白之抗甲胺喋呤之宿主細胞；及 分離該抗甲胺喋呤之宿主細胞； 其中及分離之抗甲胺喋呤之宿主細胞在甲胺喋呤存在下 表現β玄所關注之重組蛋白之量高於含有缺乏rEVE序列之 表現載體的抗甲胺喋呤之宿主細胞。 3 6.如請求項3 5之古、. 万/去’其中該曱胺喋呤係以5 nM至10 μΜ 範圍内之濃度存在。 3 7.如請求項3 5之方牛 , 二上 乃/¾•’其中該宿主細胞為CHO宿主細胞。 38. —種增加存在於楚 # &弟一核酸分子中基質連接區（MAR)序列 之數量的方法，甘— 其包含將第二核酸分子嵌入該第一核酸 130056.doc 200907059 分子中，該第二核酸分子包含一個選自由以下組成之群 的核苷酸序列：SEQ ID NO : 1、包含至少一個MAR序列 之SEQ ID ΝΟ:1之一部分、SEQ ID N〇:2、包含至少一個 MAR序列之SEQ ID NO:2之一部分，及其組合。 39. 如請求項38之方法，其中該第一核酸分子係選自由以下 組成之群：載體分子、真核細胞染色體、真核病毒基因 組、原核細胞染色體、原核病毒基因組、酵母人工染色 體及細菌人工染色體。 40. 如請求項39之方法，其中該第一核酸為載體分子。 41. 如請求項40之方法，其中該載體分子為重組表現載體分 子0 42. 如請求項41之方法，其中該重組表現載體包含一或多個 功能基因。 43. 如請求項42之方法，其中該一或多個功能基因編碼一或 多種選自由以下組成之群的蛋白質：可溶性蛋白、膜蛋 白、結構蛋白、核糖體蛋白、酶、酶原 '抗體分子、細 胞表面受體蛋白、轉錄調節蛋白、轉譯調節蛋白、染色 質蛋白 '激素、細胞週期調節蛋白、G蛋白、神經活性 肽、免疫調節蛋白、血液組分蛋白、離子閘蛋白、熱休 克蛋白、二氫葉酸還原酶（DHFR)、抗生素抗性蛋白、前 述蛋白質之任一者之功能片段、前述蛋白質之任 含抗原決定基片段，及其組合。 如°月求項43之重組表現載體’其中該抗體分子係選自由 以下組成之群：抗™1^抗體、抗EL•選擇素抗體或抗 130056.doc 200907059 IL-13抗體。 45.如請求項44之重組表現載體，其中該抗TNF_a抗體為& 達木單抗。 46·種減少、大體上抑制或基本上休止（silencing)重組蛋 白自表現載體表現的方法，其包含： 將 種核酸分子嵌入一種包含一或多個編碼一或多種 重組蛋白之重組基因的表現載體中，該核酸分子包含 SEQ ΙΟ N0:2之鹼基1-461之核苷酸鹼基序列或SEQ ID N0:2之鹼基丨_1〇86之核苷酸鹼基序列。 47·如請求項46之方法，其另外包含： 將該表現載體嵌入宿主細胞中。 130056.doc