TW200906439A

TW200906439A - Molecules and methods for modulating proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9)

Info

Publication number: TW200906439A
Application number: TW097113356A
Authority: TW
Inventors: Dmitri Mikhailov; David Langdon Yowe; Tony Fleming
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2007-04-13
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2009-02-16
Also published as: AU2008237940A1; GT200900264A; WO2008125623A3; PE20090145A1; IL201194A0; AR066042A1; US20100233177A1; EA200901376A1; CO6231040A2; WO2008125623A2; ECSP099688A; JP2010523135A; MA31304B1; MX2009010957A; CN101679527A; EP2137218A2; TN2009000410A1; ZA200906489B; CA2681428A1; KR20100019440A

Description

200906439 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於抗原結合分子，由彼等分子結合之抗原決定基及使用該等分子之方法。【先前技術】蛋白原轉化酶枯草桿菌素/第9型克新（PCSK9)(亦稱為神經細胞凋亡調控轉化酶丨或NARC_丨）絲胺酸蛋白酶之蛋白酶κ分泌枯草桿菌素樣子家族的一員等人， 2003 Arc. Biochem. Biophys. 420:55-67)。人類 PCSK9 為主要表現於腎臟、肝臟及腸之分泌蛋白。其具有三個功能部位·抑制性如功能部位（胺基酸卜丨52 ;包括胺基酸卜3 〇處之信號序列），絲胺酸蛋白酶功能部位（胺基酸153_448)及長度為21 0個殘基之富含半胱胺酸殘基之c_末端功能部位（胺基西欠449 692)。PCSK9係以酶原形式合成，其經歷内質網中前功能部位與催化功能部位之間的自身催化裂解。前功能部位在裂解後保持與成熟蛋白質結合，且分泌複合物。富含半胱胺酸之功能部位可與其他弗林（Furin)/克新/枯草桿菌素樣絲胺酸蛋白酶的P-(加工）功能部位起類似作用，其似乎對摺疊及調控活化蛋白酶為必要的。PCSK9突變與血衆中異常含量之低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c)有關（H〇rt〇n等人 ’ 2006 Trends. Biochem· Sci. 32(2):71-77)。【發明内容】本發明係關於PCSK9抗原決定基、PCSK9結合分子及使用該等分子之方法。PCSK9結合分子與PCSK9相互作用且 130427.doc 200906439 調節PCSK9功能。PCSK9結合分子可用於增加LDL-受體 (LDL-R)含量及降低膽固醇含量。在多個態樣中，本發明提供調節（例如，抑制）PCSK9之一或多種生物功能的PCSK9結合分子。舉例而言，PCSK9結合分子可抑制PCSK9之蛋白水解活性（例如，PCSK9前功能部位之蛋白水解）及/或PCSK9與PCSK9受體之間的相互作用（例如，PCSK9與LDL-R之結合）。PCSK9以後轉錄方式下調LDL-R。因此，抑制PCSK9使得LDL-R含量增加。活體内 LDL-R含量增加使得LDL-R介導之LDL-c攝取增加。因此，干擾LDL-R之PCSK9調控的結合分子最終降低循環LDL-c 含量。 PCSK9結合分子包括（例如）與PCSK9(例如，在PCSK9特定功能部位或抗原決定基内，諸如催化功能部位或富含半胱胺酸之功能部位内）結合之抗體及包括該等抗體之抗原結合部分的多肽。PCSK9結合分子亦包括結合部分並非源自抗體之分子，例如源自具有免疫球蛋白樣摺疊之多肽之 PCSK9結合分子，且該等分子中抗原結合部分經工程化以經隨機化、選擇及親和力突變與PCSK9結合。因此在一態樣中，本發明特徵為包括與PCSK9結合（例如特異性結合）之抗體的抗原結合部分之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與人類PCSK9 (SEQ ID ΝΟ:1)催化功能部位内，在以下各者中之一者内或與其重疊（例如包含以下各者中之一者之全部或一部分或由其全部或一部分組成）之抗原決定基結合：（a) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸166-177(亦 130427.doc 200906439 即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基： YRADEYQPPDGG (SEQ ID NO:4)) ; (b) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸1 87-202(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基： TSIQSDHREIEGRVMV (SEQ ID NO:5)) ; (c) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸206-2 19(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：ENVPEEDGTRFHRQ (SEQ ID NO:6));⑷ SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸23 1-246(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：AGWSGRDAGVAKGAS (SEQ ID NO:7)); (e) SEQ ID ΝΟ:1 f : 之胺基酸277-283(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：VQPVGPL (SEQ ID NO:8)) ; (f) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸336-349(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基： VGATNAQDQPVTLG (SEQ ID NO:9)) ; (g) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸3 6 8 - 3 8 3 (亦即 > 在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：IIGASSDCSTCFVSQS(SEQIDNO:10));或（h)SEQID ΝΟ:1之胺基酸426-439(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：EAWFPEDQRVLTPN(SEQIDNO:ll))。舉例而言，抗原結合部分與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 166-171、169-174或172-1 77内之抗原決定基結合；抗原結合部分與 SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 1 87-1 93、191-196、194-199 或197-202内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸206-21 1、209-214、212-217、215-219内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID NO: 1之胺基酸 231-23 7、23 5-240、23 8-243、24 1-246内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID NO: 1之胺基酸277-282或279-283 130427.doc 200906439 内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID NO: 1之胺基酸336-34 1、339-343、34 1-346或344-349内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸368-374、 3 72-3 77、375-380或3 78-3 83内之抗原決定基結合；抗原結合部分與 SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 426-43 1、429-434，432-437 或435-439内之抗原決定基結合。在另一態樣中，本發明特徵為經分離PCSK9結合分子，其包含與PCSK9結合（例如，特異性結合）之抗體的抗原結合部分，其中該抗原結合部分與人類pCSK9富含半胱胺酸之功能部位内，在以下各者中之一者内或與其重疊的抗原決定基結合：（a) SEQ ID NO: 1之胺基酸443-500 ; (b)胺基酸 557-590;或（c)胺基酸 636-678。在多個實施例中，抗原結合部分與以下各者中之一者内或與其重疊之人類PCSK9抗原決定基特異性結合：（a) SEQ ID NO: 1之胺基酸443-45 8(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基·· ALPPSTHGAGWQLFCR (SEQ ID NO:12)); (b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸459-476(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：TVWSAHSGPTRMATAIAR (SEQ ID NO: 13)) ; (c) SEQ ID NO: 1之胺基酸 486-500(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：CSSFSRSGKRRGERM (SEQ ID NO:14)); (d) SEQ ID N〇:l 之胺基酸 557-573(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基： HVLTGCSSHWEVEDLG (SEQ ID NO： 15))； (e) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸577-590(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決 130427.doc 200906439 定基：PVLRPRGQPNQCVG (SEQ ID NO:16)) ; (f) SEQ ID NO:l之胺基酸636-645(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：SALPGTSHVL (SEQ ID NO:17)) ; (g) SEQ ID NO:l之胺基酸659-677(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：RDVSTTGSTSEEAVTAVAI (SEQ ID NO:18))。舉例而言，抗原結合部分與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 443-449、447-452、45 0-45 5、453-458内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID NO:1之胺基酸459-465、463-468、 466-471、469-474或472-476内之抗原決定基結合；抗原結合部分與 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 486-491、489-494、492-497 或495-500内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 557-563、561-566、564-569、567-572 或 569-573内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 577-582、580-585、583-588 或 586-590 内之抗原決定基結合；抗原結合部分與SEQ ID NO: 1之胺基酸 63 6-643或640-645内之抗原決定基結合；抗原結合部分與 SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 659-665、663-668、665-670、668-673 或67 1-677内之抗原決定基結合。在另一態樣中，本發明特徵為經分離PCSK9結合分子，其包括與PCSK9結合（例如，特異性結合）之抗體的抗原結合部分，其中該抗原結合部分與人類PCSK9前功能部位内，在SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸89-134内或與其重疊之抗原決定基結合。在多個實施例中，抗原結合部分與以下各者中之一者内 130427.doc 200906439 或與其重疊之人類PCSK9抗原決定基特異性結合：（a) SEQ ID NO: 1之胺基酸89-1 0 1 (亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：SQSERTARRLQAQ (SEQ ID NO:2));或（b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸106-134(亦即，在以下序列内或與其重疊之抗原決定基：GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA (SEQ ID NO:3))。舉例而言，抗原結合部分與SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸1 23- 1 3 1内之抗原決定基特異性結合。舉例而言，抗原結合部分與SEQ ID NO: 1之胺基酸 89-94、92-97或95-101内之抗原決定基結合；抗原結合部分與 SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 106-111、109-114、112-117、 115-120、118-123、121-126、124-129或 127-134 内之抗原決定基結合。在一特定實施例中，抗原結合部分與人類PCSK9前功能部位内，在SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸101-107(胺基酸 QAARRGY)内或與其重疊之抗原決定基特異性結合。在另一實施例中，抗原結合部分與人類PCSK9前功能部位内，在SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸123-132(胺基酸 LVKMSGDLLE)内或與其重疊之抗原決定基特異性結合。此等胺基酸在PCSK9前功能部位之胺基酸106-134 (SEQ ID NO:3 ; GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA)内。

在另一實施例中，抗原結合部分與PCSK9在SEQ ID NO: 1 之胺基酸101-132内特異性結合（亦即，與SEQ ID NO:2内之抗原決定基、SEQ ID NO:3内之抗原決定基或與SEQ ID NO: 2及3重疊之抗原決定基（亦即，包括至少一個來自SEQ ID 130427.doc 11 200906439 NO:2及SEQIDNO:3之胺基酸）結合）。在另一實施例中，抗原結合部分與PCSK9在SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸1(H-132内特異性結合且包含至少一個來自SEQ ID NO:2之胺基酸（例如，麩胺麩胺）及至少一個來自SEQ ID Ν 0:3之胺基酸（例如，甘胺酸及/或酷·胺酸）。在另一實施例中，抗原結合部分與PCSK9在SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸1 0 1 -1 32内特異性結合且包含至少一個來自SEQ ID NO:2之胺基酸（例如，麩胺麩胺）及至少一個來自SEQ ID Ν 0:3之胺基酸（例如，甘胺酸及/或赂胺酸）。在另一實施例中，抗原結合部分與PCSK9在與至少一個來自SEQ ID NO:2之胺基酸（例如，麩胺麩胺）及至少一個來自SEQ ID NO:3之胺基酸（例如，甘胺酸及/或酪胺酸）重疊的抗原決定基處特異性結合。在另一態樣中，本發明特徵為經分離PCSK9結合分子，其與前述PCSK9結合分子中之任一者交叉競爭結合。因此，該等交又競爭結合分子可（例如）藉由與空間上最接近之抗原決定基結合而干擾（例如，抗體或包含所結合抗體之抗原結合部分的其他PCSK9結合分子）與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸101-107或123-132之結合。在多個實施例中，PCSK9結合分子（例如，與在催化功能部位内、在富含半胱胺酸之功能部位内或在前功能部位内之抗原決定基結合之PCSK9結合分子）與非人類靈長類動物（例如，食蟹猴或恆河猴）之PCSK9交叉反應。在多個實施例中，抗原結合部分與°齧齒動物物種之PCSK9(例如，鼠科 130427.doc -12- 200906439 動物PCSK9、大IPCSK9)交又反應。在多個實施例中，抗原結合部分與線性抗原決定基結合。在多個實施例中，抗原結合部分與非線性抗原決定基結合。在一貝例中’抗原結合部分與包括以下線性抗原決定基之每一者的至少一部分或由其組成之非線性抗原決定基結合：⑷SEQIDNO:l之胺基酸89-l0l;及⑼SEQIDNO: 1之胺基酸1 06- 1 34。在另一實例中，抗原結合部分與包括以下線性抗原決定基之每一者的至少一部分或由其組成之非線性抗原決疋基結合.（a) SEQ ID NO: 1之胺基酸 166-177 ;及（b) SEQ ID NO: 1之胺基酸 443-458。在另一實例中，抗原結合部分與包括以下線性抗原決定基中之兩者或三者的至少一部分或由其組成之非線性抗原決定基結合：（a) SEQ ID NO: 1 之胺基酸 187-202 ; (b) SEQ ID NO: 1 之胺基酸 231-246 ;及（c) SEQ ID NO: 1 之胺基酸 368-383。在另一實例中’抗原結合部分與包括以下線性抗原決定基之每一者的至少一部分或由其組成之非線性抗原決定基結合：（a) SEQ ID NO: 1之胺基酸206-219 ;及（b) SEQ ID NO: 1之胺基酸277-283。在另一實例中，抗原結合部分與包括以下線性抗原決定基之每一者的至少一部分或由其組成之非線性抗原決定基結合：（a) SEQ ID NO: 1之胺基酸 3 3 6-3 49 ;及（b) SEQ ID NO: 1之胺基酸 426-439 ° 在另一實例中，抗原結合部分與包括以下線性抗原決定基中之兩者或三者的至少一部分或由其組成之非線性抗原決定基結合：（a) SEQ ID NO: 1 之胺基酸 459-476 ; (b) SEQ ID NO: 1 130427.doc -13- 200906439 之胺基酸 486-500 ;及（c) SEQ ID NO: 1 之胺基酸 557-573。在另一實例中，抗原結合部分與包括以下線性抗原決定基中兩者或三者的至少一部分或由其組成之非線性抗原決定基結合：（3)8£(^1〇1^〇:1之胺基酸577-590;(13)8丑(5 1〇1^〇: 1之胺基酸 636-645 ;及（c) SEQ ID NO: 1之胺基酸 659-677。

在一特定實施例中，抗原結合部分與包含（a) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸101-107 ;及（b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 1 23-1 32之全部或一部分的非線性抗原決定基（例如，構形抗原決定基）結合。在多個實施例中，PCSK9結合分子之結合效力與PCSK9 之特定功能部位或抗原決定基内之結合位置有關。在多個實施例中，PCSK9結合分子之抗原結合部分以等於或小於 10 nM、1 nM、0.5 nM、0.25 nM 或 0.1 nM之解離常數（KD)與PCSK9結合。在多個實施例中，PCSK9結合分子之抗原結合部分以等於或小於0.3 nM之KD與非人類靈長類動物（例如，食蟹猴黑猩猩）的PCSK9結合。 ' / 在多個實施例中，抗原結合部分以等於或小於〇·5 nM之 KD與小鼠PCSK9結合。抗體可為敌合（例如人源化）抗體或人類抗體或擬人化抗在一實施例中分。抗原結合部分為人類抗體之抗原結合部多株抗體之抗原結合部抗原結合部分可為單株抗體或 130427.doc •14· 200906439 分。 PCSK9結合分子包括（例如）抗體之Fab片段、Fab1片段、 F(ab')2 或 Fv 片段。在一實施例中，PCSK9結合分子為人類抗體。在一實施例中，PCSK9結合分子包括單鏈Fv。 -在一實施例中，PCSK9結合分子包括雙功能抗體（例如，單鏈雙功能抗體或具有兩條多肽鏈之雙功能抗體）。在一些實施例中，抗體之抗原結合部分係源自以下同型中之一者的抗體：IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施例中，抗體之抗原結合部分係源自IgA或IgE同型之抗體。 PCSK9結合分子（例如，與在催化功能部位内、在富含半胱胺酸之功能部位内或在前功能部位内之抗原決定基結合之PCSK9結合分子）可展現眾多生物活性中之一或多種。在多個實施例中，PCSK9結合分子抑制PCSK9與PCSK9配位體結合。在一些實施例中，PCSK9結合分子抑制pH 7-8下與 PCSK9酉己位體之結合。在一些實施例中，PCSK9結合分子抑制低於p Η 7之p Η值（例如p Η 5 - 7)下的結合。舉例而言， PCSK9結合分子相對於對照（例如相對於不存在PCSK9結合分子下PCSK9與PCSK9配位體之結合）抑制至少5%、10%、 15%、25%或 50°/。之結合。舉例而言，PCSK9結合分子可抑制PCSK9與低密度脂蛋白受體（LDL-R)結合（例如，PCSK9結合分子抑制PCSK9與 1^1^-11在？117及更低？聰，例如？115-7下結合）。 PCSK9前功能部位係自成熟PCSK9多肽裂解且保持與成 130427.doc -15 - 200906439 熟PCSK9多肽非共價締合。在一實施例中，PCSK9結合分子與PCSK9前功能部位競爭結合催化功能部位或富含半胱胺酸之功能部位（或反之亦然）且抑制PCSK9之生物活性。在一些實施例中，PCSK9結合分子抑制PCSK9之蛋白水解活性（例如，PCSK9前功能部位或另一 PCSK9受質之蛋白水解）。舉例而言，PCSK9結合分子相對於對照（例如相對於不存在PCSK9結合分子下的PCSK9蛋白水解活性）抑制至少 5%、10°/。、15°/9、25%或 50°/。之活性。在一些實施例中，P C S K 9結合分子抑制細胞（例如’肝細胞）上LDL-R受PCSK9影響而減少（例如，LDL-R受PCSK9影響而降解）。舉例而言，PCSK9結合分子相對於對照（例如相對於不存在PCSK9結合分子下LDL-R受PCSK9影響而減少）抑制至少5%、10%、15%、25%或50%之LDL-R減少。在此等實施例中，LDL-R含量增加表明PCSK9結合分子抑制 LDL-R受PCSK9影響而減少。在某些實施例中，PCSK9結合分子當與細胞（例如肝細胞）在存在PCSK9的條件下接觸時，相對於不存在PCSK9結合分子之狀況下肝細胞的LDL-c攝取增加肝細胞的LDL-c攝取。舉例而言，PCSK9結合分子相對於對照（例如相對於不存在PCSK9結合分子下的結合）增加至少5°/。、1 0%、1 5%、 25%或5 0%之LDL-c攝取。 PCSK9結合分子在LDL-c存在下可與PCSK9結合且/或其在血清存在下（例如，在至少1%、5%、10°/。、25°/。、50%血清存在下）可與PCSK9結合。 I30427.doc -16 - 200906439 本發明特徵亦為非抗體PCSK9結合分子。非抗體PCSK9 結合分子包括PCSK9結合功能部位，其具有源自諸如以下各者中之—者的非抗體多肽之免疫球蛋白樣（Ig-樣）摺疊之胺基知'序列：細胞黏合素（tenascin)、N-鈣黏素、E-鈣黏素、 ICAM、机聯蛋白（titin)、GCSF-受體、細胞素受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓鞘膜黏附分子P〇、CD8、CD4、 CD2、第I類MHC、T-細胞抗原受體、VCAM-1之CD1、C2 及I組功能部位、肌凝蛋白結合蛋白ctj組免疫球蛋白功能部位、肌凝蛋白結合蛋白]«之ί組免疫球蛋白功能部位、端素蛋白（telokin)之I組免疫球蛋白功能部位、NCAM、顫搐蛋白（twitchin)、神經膠質蛋白、生長激素受體、紅血球生成素叉體、泌乳素受體、干擾素γ受體、β-半乳糖苷酶/葡萄糖醛酸酶、β_葡萄糖醛酸酶、轉麵胺醯胺酶、丁_細胞抗原受體、超氧化歧化酶、組織因子功能部位、細胞色素F、綠色螢光蛋白、GroEL或索馬甜（thaumatin)。一般而言，pCSK9 結合功能部位之胺基酸序列相對於免疫球蛋白樣摺疊之胺基酸序列有所改變，使得PCSK9結合功能部位與1>(：：§尺9特異性結合（亦即，其中免疫球蛋白樣摺疊不與pcSK9特異性結合）。在多個實施例中，PCSK9結合功能部位之胺基酸序列與纖維網蛋白、細胞素受體或鈣黏素之免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序列至少60%—致（例如，至少65〇/〇、75〇/〇 ' 8〇%、85〇/。或90%—致）。在多個實施例中，PCSK9結合功能部位之胺基酸序列與 130427.doc 17 200906439 以下各者中之一者之免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序列至少 60%、65%、75%、80%、85°/。或 90%—致：細胞黏合素、 N-!弓黏素、E-名弓黏素、ICAM、肌聯蛋白、GCSF-受體、細胞素受體、糖苦酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓稍膜黏附分子P0、CD8、CD4、CD2、第I類MHC、T-細胞抗原受體、 VCAM-1之CD1、C2及I組功能部位、肌凝蛋白結合蛋白C 之I組免疫球蛋白功能部位、肌凝蛋白結合蛋白Η之I組免疫球蛋白功能部位、端素蛋白之I組免疫球蛋白功能部位、 NCAM、顫搐蛋白、神經膝質蛋白、生長激素受體、紅i 球生成素受體、泌乳素受體、干擾素γ受體、β-半乳糖苷酶/ 葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、轉麩胺醯胺酶、Τ-細胞抗原受體、超氧化歧化酶、組織因子功能部位、細胞色素F、綠色螢光蛋白、GroEL或索馬甜。在多個實施例中，PCSK9結合功能部位以等於或小於1 0 nM(例如，1 nM、0.5 nM、0.1 nM)之 KD與 PCSK9結合。在一些實施例中，Ig樣摺疊為纖維網蛋白之Ig樣摺疊，例如III型纖維網蛋白之Ig樣摺疊（例如，纖維網蛋白III之模組10的Ig樣摺疊）。

本發明亦提供對應於PCSK9抗原性抗原決定基之肽。在一態樣中，本發明特徵為由與以下胺基酸序列中之一者至少90% —致之胺基酸序列組成之肽：YRADEYQPPDGG (SEQ ID NO:4) ； TSIQSDHREIEGRVMV (SEQ ID N0:5)； ENVPEEDGTRFHRQ (SEQ ID NO:6) ； AGVVSGRDAGVAKGAS (SEQ ID NO:7) ； VQPVGPL (SEQ ID NO:8) ； VGATNAQDQPVTLG 130427.doc •18- 200906439 (SEQ ID NO:9) ； IIGASSDCSTCFVSQS (SEQ ID NO:10)； EAWFPEDQRVLTPN (SEQ ID NO: 11) ； ALPPSTHGAGWQLFCR (SEQ ID NO:12) ； TVWSAHSGPTRMATAIAR (SEQ ID NO:13) ； CSSFSRSGKRRGERM (SEQ ID NO:14)； HVLTGCSSHWEVEDLGT (SEQ ID NO: 15) ； PVLRPRGQPNQCVG (SEQ ID NO:16) ； SALPGTSHVL (SEQ ID NO:17)； RDVSTTGSTSEEAVTAVAI (SEQ ID NO: 18) ； SQSERTARRLQAQ (SEQ ID NO:2);或 GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA (SEQ ID NO:3)。在另一態樣中，本發明提供當將組合物投與動物時引發與PCSK9特異性結合之抗體的組合物。組合物包括（例如）以下肽中之一者：YRADEYQPPDGG (SEQ ID NO:4); TSIQSDHREIEGRVMV (SEQ ID NO:5) ； ENVPEEDGTRFHRQ (SEQ ID NO:6) ； AGVVSGRDAGVAKGAS (SEQ ID NO:7)； VQPVGPL (SEQ ID NO:8) ； VGATNAQDQPVTLG (SEQ ID NO:9) ； IIGASSDCSTCFVSQS (SEQ ID NO:10)； EAWFPEDQRVLTPN (SEQ ID NO: 11) ； ALPPSTHGAGWQLFCR (SEQ ID NO: 12) ； TVWS AHSGPTRMATAIAR (SEQ ID NO:13) ； CSSFSRSGKRRGERM (SEQ ID NO:14)； HVLTGCSSHWEVEDLGT (SEQ ID NO: 15) ； PVLRPRGQPNQCVG (SEQ ID NO:16) ； SALPGTSHVL (SEQ ID NO:17)； RDVSTTGSTSEEAVTAVAI (SEQ ID NO: 18) ； SQSERTARRLQAQ (SEQ ID NO:2) ; GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA (SEQ ID NO:3);其具有少於5個胺基酸變化之肽；或其片 130427.doc •19- 200906439 段（例如’含有5、6、7、8、9、1 0、11或1 2個胺基酸之片段）。肽可經修飾（例如’藉由與載體蛋白偶合）以增加抗原性。本發明特徵亦為包括本文所述之PCSK9結合分子的醫藥組合物。組合物包括（例如）PCSK9結合分子及醫藥學上可接受之載劑。本發明特徵亦為使用本文所述之pCSK9結合分子之方法。舉例而言’在一態樣中，本發明特徵為增加細胞（例如，肝細胞）上LDL-R含量之方法。該方法包括使肝細胞與 PCSK9結合分子（例如，包括與PCSK9特異性結合之抗體的抗原結合部分之PCSK9結合分子）接觸，藉此減少P(：SK9對 LDL-R之下調且增力口肝細胞上之LDL-R含量。在另一態樣中，本發明特徵為增加細胞（例如，肝細胞）之LDL-R攝取之方法。該方法包括使肝細胞與pCSK9結合分子（例如，包括與PCSK9特異性結合之抗體的抗原結合部分之PCSK9結合分子）接觸’藉此減少PCSK9對LDL-R之下調且增加肝細胞之LDL-c攝取。在另一態樣中’本發明特徵為調節個體PCSK9活性之方法。該方法包括向個體投與調節PCSK9生物活性之PCSK9 結合分子（例如，包括與PCSK9特異性結合之抗體之抗原結合部分的PCSK9結合分子）。PCSK9結合分子展現以下活性中之一或多者：（a)抑制PCSK9與LDL-R結合；（b)抑制PCSK9 之蛋白水解活性；（c)抑制肝細胞上LDL-R的PCSK9依賴性 130427.doc •20· 200906439 /1、· 及（d)抑制肝細胞中LDL-R受PCSK9影響而降解。、 L樣中，本發明特徵為減少個體血漿膽固醇之方盥^方去包括以有效減少個體血漿膽固醇之量向個體投 7 本文所述之PCSK9結合分子的醫藥組合物。該量可為有放減少LDL_C2f。個體之血裝肌<農度可相對於投 ^组合物之前的血聚LDL_e減少至少5%，（例如血漿[動 ^ V至/ 1G%、15%或2Q%)。在—些實施例中，個體亦文使用第二降膽固醇劑（諸如，士他汁抑療法。 " 在多個實施例中，個體患有脂質失調症或處於脂質失調，之⑽切列如’高脂質血症’第工型、第㈣、第m型、弟1或第V型局脂質血症、繼發性高甘油三酉旨血症、高膽黃瘤病、膽固醇乙醯基轉移酶缺乏）。舉例而言， “…膽固醇血症或處於高膽固醇血症之風險中個體患有動脈粥樣硬化或處於動 J τ水文1匕^風險中；個體心有心血S’病症或處於心血管病症之風險中。在-些實施例中’個體具墙抑制素不耐性體在服用士他；丁抑制素藥物時經受不良副對士他汀抑制素療法具抗性(例如，士他汁:= 起個體膽固醇減少）。 ’、屠法不引在-些實施财，個體總血漿膽_含之前為200 mg/dl或更高。仅-、組合物在-些實施例中’個體血聚LD “含為160 mg/dl或更高。〃、、、'且合物之前 130427.doc -21 - 200906439 在一些實施例中，組合物係經靜脈内投與。在一些實施例中，PSCK9結合分子可用於製備供治療與高膽固醇含量有關之疾病用的藥物。在下文之隨附圖式及描述中闡明本發明一或多個實施例之細節。本發明之其他特徵、目標及優勢自描述及圖式且 . 自申請專利範圍將變得顯而易見。【實施方式】本發明提供與PCSK9結合之分子（"PCSK9結合分子"），尤 ( 其與人類PCSK9結合且調節其功能之人類抗體及其部分。本文亦提供PCSK9之抗原決定基及結合此等抗原決定基之藥劑。人類PCSK9(hPCSK9)之全長序列係見於Genbank®寄存編號 GI:1 19627065，gb|EAX06660.1 下且在表 1 中展示為 SEQ ID NO: 1。編碼hPCSK9之mRNA序列係見於寄存編號 GI:3 1317306，NM—174936 下。表1.人類PCSK9胺基睃序列 Λ.

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAK ' DPWRLPGTYVWLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLP

HVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLIiDTSIQSDHREIEGRVMVTDFEN • VPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGWSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQL νΟΡνΌΡΙΛΛΠ^ΡΙ^σΥεκνϋ^ΝΑΑΟΟΙΙΙ^ΑΚΑαννίνΤΑΑαΝΡΙ^ΌΑζ^ΥεΡΑΞΑΡΕνίΤναΑΤΝΑΟϋΟΡ • VTLGTLGTNFGRCVDLFAPGED 工 IGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQR LIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAIARCAPDEEL LSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQAKCSVHTAPPAEASMGTRVHC HQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQ VTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCWRSRDVSTTGSTSEEAVTAVAICCRSRHLAQASQE LQ (SEQ ID NO:1) -22- 130427.doc 200906439 信號肽、前功能部位、催化功能部位及c-末端富含半胱胺酸之功能部位在SEQ ID NO: 1線性序列中之位置展示於圖1中。人類PCSK9係在N533處經N-糖基化。其在Y53處且在催化（蛋白酶）功能部位中經硫酸化。hPCSK9在人類血漿中之濃度範圍為 50-600 ng/ml (Lagace等人 ’ 2006 J. Clin. Inv. 1 16(1 1):2995-3 005)。hPCSK9中之某些突變與升高及降低之LDL-c血漿含量有關（Horton等人，2006 Trends. Biochem. Sci. 32(2):71-77)。以下突變與升高之LDL-c 有關：S127R、F216L、D374Y、N425S及 R496W。以下突變與降低之LDL-c有關：R46L、ΔΙ197、G106R、Y142X、L253F、 A443T及 C679X。預測之黑猩獲PCSK9胺基酸序列見於Genbank®寄存編號 GI:1 14556790，XP—001154126;及寄存編號 GI:114556788, XP_5 13430下。小鼠PCSK9之胺基酸序列見於寄存編號 GI:23956352, NP_705793下。大鼠PCSK9胺基酸序列見於寄存編號GI:77020250, NP_954862下。hPCSK9胺基酸序列與黑猩猩？。8尺9 98.7%—致，與大鼠？匚8〖9 79.5°/〇—致，且與小鼠？匚8〖9 78.9%—致。 hPCSK9之抗原性抗原決定基之胺基酸序列及其在SEQ IDNO:l之hPCSK9序列内之位置列於表2中。 130427.doc -23- 200906439 表2. hPCSK9之抗原性抗原決定基 # 胺基酸序列 SEQ ID NO: 功能部位位置 1 SQSERTARRLQAQ 2 Pro 89-101 2 GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA 3 Fro 106-134 3 YRADEYQPPDGG 4 Cat 166-177 4 TSIQSDHREIEGRVMV 5 Cat 187-202 5 ENVPEEDGTRFHRQ 6 Cat 206-219 6 VOVVSGRD \C.\ \KGAS 7 Cat 231-246 7 VQPVGPI 8 Cat 277-283 8 VG \1\ \QI)gF\ 1LG 9 Cat 336-349 9 IKiASSIX’Sm'VSQS 10 C at 36S-3S3 10 EAWFPEDQRVLTPN 11 Cat 426-439 11 ALPPSTHGAGWQLFCR 12 cat/crd 443-458 12 TVWSAHSGPTRMATAIAR 13 Crd 459-476 13 CSSFSRSGKRRGERM 14 Crd 486-500 14 HVLTGCSSHWEVEDLGT 15 Crd 557-573 15 PVLRPRGQPNQCVG 16 Crd 577-590 16 SALPGTSHVL 17 Crd 636-645 17 RDVSTTGSTSEEAVTAVAI 18 C'rd 659-(-.77

Pro =前功能部位，cat=催化功能部位，crd=富含半胱胺酸之功能部位圖2為人類hPCSK9之三維結構模型的描繪。以下線性抗原決定基組在三維模型中最接近：前功能部位中之區1 (SEQ ID NO 2及SEQ ID NO 3);催化功能部位及催化/富含半胱胺酸之功能部位中之區2 (SEQ ID NO 4及SEQ ID NO 12);催化功能部位中之區3 (SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7 及SEQ ID NO 10);催化功能部位中之區4 (SEQ ID NO 6及 SEQ ID NO 8);催化功能部位中之區5 (SEQ ID NO 9及SEQ ID NO 11);富含半胱胺酸之功能部位中之區6 (SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14及SEQ ID NO 15);及富含半胱胺酸之功能部位中之區 7 (SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17及 SEQ ID NO 18)。 130427.doc •24- 200906439 此等抗原決定基組中之胺基酸殘基形成非線性抗原決定基。本文所用之術語，，抗體”係指完整抗體或其抗原結合片段 (亦即，抗原結合部分或單鏈（亦即，輕鏈或重鏈）。完整抗體為包含經二硫鍵相互連接之至少兩條重（H)鏈及至少兩條輕（L)鏈的糖蛋白。各重鏈包含重鏈可變區（本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含3個域，〇ηι、cH2 及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（本文中縮寫為及輕鏈恆疋區。輕鏈恆定區包含一個域。可將Vh& Vl區進一步細分為稱為互補判定區（CDR)之高變區，其間散布有較為保守的稱為構架區（FR)之區。各Vh及％包含自胺基末端至羧基末端按以下順序排列之三個CDR及四個FR : FRi、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用的結合功能部位。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與包括免疫系統之多種細胞（例如效應細胞）及典型補體系統之第一組份（c丨q)的宿主組織或因子結合。本文所用之術語抗體之”抗原結合部分”係指完整抗體中保持與給定抗原（例如，hpcSK9)特異性結合之能力的一或多個片段。抗體之抗原結合功能可由完整抗體之片段執行包涵於術语抗體之π抗原結合部分”内之結合片段的實例包括Fab片段，其為由VL、VH、cL及CH1域組成之單價片 •k ’ F(ab)2片段，其為包含在鉸鏈區由雙硫橋連接之兩個Fab 片段（一般一個來自重鏈且一個來自輕鏈）的二價片段；由 VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體之單臂之^及Vh域組成 130427.doc • 25- 200906439 的Fv片段；由Vh域組成之單域抗體（dAb)片段等人， 1989 Nature 341:544-546);及經分離互補判定區（CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個功能部位（¥^及由獨立基因編碼，但可使用重組法以人工肽連接子將其接合，該連接子使該兩個結構能夠製成火及VH區㈣以形成單價分子之單蛋白鏈（稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如Bird等人，1988

Scze’ 242:423-426;及 Huston等人，1988 Proc. Natl. Acad. SC1. 85:5879-5883)。該等單鏈抗體包括抗體之一或多個”抗原結合部分"。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知的習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來就效用對該等片段進行篩檢。抗原結合部分亦可併入單功能部位抗體、最大抗體、微型抗體、胞内抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv中（例如參見，H〇mnger及Huds〇n， 2005, Nature Biotechnology，23, 9, 1 126_1136)。抗體之抗原結合部分可移植至基於多肽（諸如第m型纖維網蛋白（Fn3)) 之支架中（參見美國專利第6,703」99號，其描述纖維網蛋白多肽單抗）。抗原結合部分可併入包含一對串聯Fv區段 (Vh-CH1-Vh-CH1)之單鏈分子中，該等區段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區（Zapata等人，1995 Pr〇tein Eng 8(10):1057-1062 ;及美國專利第 5,641，87〇號）。本文所用之”經分離？(：8尺9結合分子”係指大體上不含對除PCSK9之外的抗原具有抗原特異性之分子的結合分子 130427.doc • 26 - 200906439 (例如，特異性結合hPcSK9之經分離抗體大體上不含特異性結合除hPCSK9之外之抗原的抗體）。然而，特異性結合 hPCSK9之經分離結合分子可對其他抗原（諸如來自其他物種之PCSK9分子）具有交又反應性。若結合分子大體上不含細胞物質則其經”純化，，。本文所用之術語”單株抗體組合物"係指具有單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組合物顯示對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。

本文所用之術語”人類抗體”意欲包括具有構架區及CDR 區均鹤自人類來源序列之可變區的抗體。此外，若抗體 3有1·互疋區’則該恆定區亦係源自該等人類序列（例如人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變形式)。本發明之人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定點突變誘發或藉由活體内體引入之突變）。钬而 A 士士一而，如本文所用之術語”人類抗體，，不欲包括源自另：哺乳動物物種(諸如小鼠)生殖系之C D R序列已移植至人類構架序列上的抗體。竿==株抗體"係指顯示單-結合特異性且具有構。°皆係源自人類序列之可變區的抗體。在一實也j中人類單株抗體係由的融合瘤產生，、水生化細胞融合之B細胞座生，该B細胞係獲自查条如，呈又自轉殖基因非人類動物（例 '、 3人類重鏈轉殖基因及φ- β絲姑* η 的轉殖基因小氣)。口及輕鏈轉殖基因之基因體本文所用之術語"重組人類抗體"包括藉由重組方式製 I30427.doc •27· 200906439 備、表現、產峰式分齡：，任何人類抗體’諸如自針對人類蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物(例如小鼠w 之：：備之融合瘤分離之抗體；自經轉型以表現人類抗體之伯主細胞（例如轉染瘤）分離之抗體；自重組、組合體庫分離之抗體；及藉由涉及所有或-部分人類免疫球；白基因序列與另-DNA序列拼接之任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有構架區與

R區係源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體可經受活體外突變（或當使用針對人類1§序列之轉殖基因動物時，則經受活體内體細胞突變）且因此重組抗體之Vh& Vl區之胺基酸序列為儘管係源自人類生殖系^及Vl序列且與人類生殖系 vH及VL序列相關但可能不天然存在於人類之人類抗體生殖系譜系内的序列。本文所用之π同型"係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別（例如 IgM、IgE、諸如 igGl或 IgG4 之 IgG)。短語”識別抗原之抗體”或”對抗原具有特異性之抗體”在本文中與術語”與抗原特異性結合之抗體”互換使用。如本文所用，”與PCSK9特異性結合”之PCSK9結合分子 (例如’抗體或其抗原結合部分）意指以lxlO·7 Μ或更低之KD 與PCSK9結合之PCSK9結合分子。’’與抗原交又反應"之 PCSK9結合分子（例如，抗體）意指以1χ10_6 Μ或更低之KD 與抗原結合之PCSK9結合分子。與給定抗原"不交叉反應" 之PCSK9結合分子（例如，抗體）意指不與給定抗原可偵測地 130427.doc -28- 200906439 結合或以1 X 1〇-5 Μ或更高之KD與給定抗原結合的PCSK9結合分子。在某些實施例中，該等不與抗原交又反應之抗體在標準結合檢定中展示與此等蛋白質基本上不可痛測之結合。如本文所用之術語”高親和力當提及IgG抗體時，表明該抗體對靶抗原具有ΙΟ·9 Μ或更低之KD。如本文所用之術語"在特定胺基酸殘基内或與其重疊之抗原決定基”係指包含所有或一部分該等殘基、由其組成或與其重疊之抗原。術語”抗原決定基”（6口^0口6/311化611泌（16161'11111^1^)係指抗原上與本發明之PCSK9結合分子特異性結合之部位。抗原決定基可自蛋白質的鄰接胺基酸或三級摺疊併接之非鄰接胺基酸形成。自鄰接胺基酸形成之抗原決定基在暴露於變性溶劑後通常得以保留，而由三級摺疊形成之抗原決定基在以變性溶劑處理後通常丟失。抗原決定基通常在單一空間構型中包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或15個胺基酸。測定抗原決定基之空間構型之方法包括此項技術中及本文所述之技術，例如x_射線晶體學及2維核磁共振（參見’例如施h Mo/ecw/以仏0沁取，漭66卷，G. Ε· Morris，編（1996))。本發明亦涵蓋與本文所述之PCSK9結合分子結合（亦即’識別）同一抗原決定基之PCSK9結合分子。與同一抗原決定基結合之PCSK9結合分子可由其與參照PCSK9結合分子以統計學顯著之方式交又競爭（亦即，競爭性抑制參照 130427.doc -29- 200906439 PCSK9結合分子結合）靶抗原的能力力口以鑑別。例如若 PCSK9結合分子與相同或結構上類似之抗原決定基（例如，重疊抗原決定基）或空間上接近之抗原決定基（當結合時引起抗體之間的位阻）結合時，則可發生競爭性抑制。可使用常規檢定測定競爭性抑制，其中所測試之PCSK9 結合分子抑制參照PCSK9結合分子與共同抗原之特異性結合。已知眾多類型之競爭性結合檢定，例如：固相直接或間接放射免疫檢定（RIA)、固相直接或間接酶免疫檢定 (EIA)、夾層競爭檢定（參見Stahli等人，/π 五9:242 (1 983));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(參見 Kirkland等人，/· 137:3614 (1986));固相直接標記檢定、固相直接標記夾層檢定（參見Harlow及 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1 98 8));使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見 Morel 等人，Mo/, /mwwwo/. 25(1):7 (1988));固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Cheung等人，176:546 (1990));及直接標記 RIA (Moldenhauer 等人，J. Immunol. 32:77 (1 990))。通常，該檢定涉及使用與攜帶未標記之測試PCSK9結合分子及經標記參照PCSK9結合分子中任一者之固體表面或細胞結合的純化抗原。競爭性抑制係藉由測定在測試PCSK9結合分子存在下與固體表面或細胞結合之標記的量來量測。一般而言，測試PCSK9結合分子係以過量存在。一般而言，當競爭性PCSK9結合分子以過量存在時，其將抑制參照PCSK9結合分子與共同抗原之 130427.doc -30- 200906439 特異性結合達至少 5 0 - 5 5 %、5 5 - 6 0 %、6 0 - 6 5 %、6 5 - 7 0 %、 70-75%或更高。

其他技術包括（例如）抗原決定基定位法，諸如抗原晶體：PCSK9結合分子複合物之X射線分析，其提供抗原決定基之原子解析。其他方法監測PCSK9結合分子與抗原片段或抗原之突變變體的結合，其中通常將由於抗原序列内胺基酸殘基之修飾引起的結合缺失視為抗原決定基組份之指示。此外，亦可使用用於抗原決定基定位之計算組合方法。此等方法依賴於所關注之PCSK9結合分子自組合嗟菌體呈現肽庫親和力分離特異性短肽之能力。接著認為肽引起對應於用於篩選肽庫之PCSK9結合分子的抗原決定基之界疋。對於抗原決定基定位而言，亦已開發已展示定位構型不連續抗原決定基之計算演算法。如本文所用之術語”個體"包括任何人類動物或非人類動物。術語”非人類動物，，包括所有非人類脊椎動物，例如哺乳㈣及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物1齒動物、豕兔'•羊、犬、貓、馬、牛、鳥、兩栖類動物、爬行動 •〜’W上压㈣肥战玍物體〔_ 真核細胞，例如，諸^显I祕、又…、 ,▲ 諸如畢赤酵母⑺咖啦酵母的細胞、昆虫虫細胞、堵如中國合q 组 11鼠_桌細胞（CHG)或人類物細胞）中較佳之笫满工始匕心再礼動經，，最優化||。最優切^㈣核相序列取1交化核甘酸序列麵τ叙a & 汴U厶工％化以編碼與由最初 I30427.doc 200906439 起始核苷酸序列（其亦稱為”母”序列）編碼之胺基酸序列相同或幾乎相同之胺基酸序列。本文所用之術語”擬人化抗體π意謂結合同一抗原決定基但序列不同之抗體。實例技術包括由Kalobios的擬人化技術製造之擬人化抗體，其中抗原結合區之序列係藉由（例如）突變而非保守性胺基酸置換產生（例如參見WO 2004/ 072266 ' WO 2005/069970)。本發明之多個態樣在以下子部分中進一步詳細描述。此項技術中已知評估分子與多種物種之PCSK9且尤其與 PCSK9之抗原決定基結合之能力的標準檢定，包括（例如译1^18八及西方墨點法。？08反9結合分子是否與？081<：9之特異性抗原決定基結合的判定可採用肽抗原決定基競爭檢定。舉例而言，將PCSK9結合分子與對應於所關注PCSK9 抗原決定基之肽一起在肽飽和濃度下培育。例如藉由 Biacore®分析測試經預培育之PCSK9結合分子與經固定之 PCSK9之結合。藉由與肽預培育抑制PCSK9結合表明PCSK9 結合分子與肽抗原決定基（例如參見，美國專利公開案 20070072797)。亦可藉由此項技術中已知之標準檢定（諸如藉由Biacore®分析）評定結合動力學。評估PCSK9結合分子對PCSK9功能特性之作用的檢定在下文中進一步詳細描述。因此，如根據此項技術中已知及本文所述之方法所測定，”抑制”此等PCSK9功能特性（例如，生物化學、細胞、生理或其他生物活性或其類似特性）中之一或多者的 130427.doc -32- 200906439 PCSK9結合分子將理解為引起特定功能特性相對於不存在結合分子下（例如，當存在具有不相關特性之對照分子時）所見者統計學上顯著之減少。抑制PCSK9活性之PCSK9結合分子實現所量測參數至少5%的統計學上顯著之減少。在某些實施例中，抗體或其他PCSK9結合分子可引起所選擇功能特性相較於對照至少1 0%、20°/。、30%或50%之減少。在一些實施例中，PCSK9抑制係藉由量測LDL-R含量測定。在PCSK9結合分子存在下LDL-R含量之增加表明PCSK9 結合分子抑制PCSK9。抗體本文所述之抗PCSK9抗體包括人類單株抗體。在一些實施例中，與PCSK9結合之抗體之抗原結合部分（例如，VH及 VL鏈Γ經混合及匹配”以形成其他抗-PCSK9結合分子。該等 "經混合及匹配”之抗體之結合可使用前述結合檢定（例如， ELISA)測試。當選擇VH與特定Vl序列混合及匹配時，通常選擇所置換之與VL之對中的VH結構上類似的VH。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長重鏈序列一般經結構上類似之全長重鏈序列置換。同樣，來自特定VH/VL對之VL 序列應經結構類似之VL序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列應經結構上類似之全長輕鏈序列置換。此情形中結構類似性之鑑別為此項技術中熟知之方法。在其他態樣中，本發明提供包含多種組合之一或多種 PCSK9-結合抗體之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3之抗 130427.doc -33- 200906439 體。假定此等抗體中之每一者可與PCSK9結合且抗原結合特異性主要由CDR1、2及3區提供，則VhCDRI、2及3序列與VL CDR1、2及3序列可”經混合及匹配”（亦即，來自不同抗體之CDR可經混合及匹配）。該等”經混合及匹配”抗體之 PCSK9結合可使用本文所述之結合檢定（例如，elisA)測试。當VH CDR序列經混合及匹配時，來自特定序列之 CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之cdr序列置換。同樣’當VL CDR序列經混合及匹配時，來自特定^^序列之CDR 1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之cdr 序列置換。此情形中結構類似性之鑑別為此項技術中熟知之方法。如本文所用，若抗體之可變區或全長鏈係獲自使用人類生殖系免疫球蛋白基因作為序列源之系統，則人類抗體包含為特定生殖系序列之”產物”或”源自”特定生殖系序列之重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。在一此類系統中，人類抗體係產生於攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠體内。轉殖基因小鼠經所關注之抗原（例如，本文所述之 hPCSK9的抗原&定基)免《。或者，域抗體係藉由提供呈現於噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫且以所關注抗原 (例如，本文所述之hPCSK9或hPCSK9抗原決定基）篩選該庫而鑑別。為人類生殖系免疫球蛋白序列之”產物"或”源自"人類生殖系免疫球蛋白序列的人類抗體可諸如藉由將該人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列= 130427.doc -34- 200906439 較/選擇序列最接近（亦即最大一致性百分比）該人類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。為特定人類生殖系免疫球蛋白序列之”產物"或"源自"特定人類生殖系免疫球蛋白序列的人類抗體與該生殖系編碼序列相比較可含有胺基酸差異，此係歸因於（例如）天然存在之體細胞突變 2人工疋點犬變。然而，所選擇人類抗體之胺基酸序列通㊉與人類生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列至少 9G/。致’且含有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列（例如，鼠科動物生殖系序列）相比較時鑑別該人類抗體為人類抗體的胺基酸殘基。在某些狀況下，人類抗體之胺基酸序列可與生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列至少嶋、70%、80%、9〇%或至少95%，或甚至至少、 97%、98% 或 99%—致。兩序列之間的-致性百分比為該等序列共用之相同位置數的函數（亦即一致性％一致位置數/位置總數χ ι 〇〇)，此情形考慮為達成兩序列之最優比對所需要引入的空位數及各空位之長度。使用已併入ALIGN程式（2〇版）中之Ε. Μ，” 及 W. Miller (1988 C0mput. Appl. Biosci·，4:u_17, 1988)演算法，利用ΡΑΜ!20重量殘基表、空位長度扣分12及空位扣分4來比較序列且測定兩胺基酸序列之間的一致性百分比。通常，源自特定人類生殖系序列之人類抗體的^或火與人類生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列相比將呈現不超過10個胺基酸差異。在某些狀況下，人類抗體之Vh 或VL與生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列相比可 130427.doc -35- 200906439 呈現不超過5，或甚至不超過4、3、2或丨個胺基酸差異。駱駝科動物抗體自駱駝及單峰駱駝（雙綮愿及罩犖腐（C仏/⑽办owa办咖ο)家族成員，包括諸如美洲駝種（羊 miLarna paccos、、大羊駝认ama giama)及小羊駝 W⑶尽仙））之新世界成員獲得之抗體蛋白質已針對尺寸、結構複雜性及對人類個體之抗原性判別特性。此哺乳動物家鉍中天然發現之某些IgG抗體缺乏輕鏈，且因此在結構上明顯不同於來自其他動物之抗體典型具有之兩條重鏈及兩條 fe鏈之四鏈四級結構。參見WO 94/04678。可藉由基因工程獲得鑑別為vHH之小型單個可變功能部位的駱駝科動物抗體之區域，以產生對標靶具有高親和力之小蛋白質，從而形成稱為”駱駝科動物奈米抗體”之源自抗體之低分子量蛋白質。參見美國專利第5,759,8〇8號；亦參見 Stijlemans 等人，2〇〇4 j m〇1 Chem 279: 1256 1261 ;

Dumoulin等人，2003 Nature 424: 783-788 ; Pleschberger等人，2003 Bi〇C〇njugate Chem 14: 44〇_448 ; c〇rtez_Retam〇z〇等人，2002 Int. J. Cancer 89: 456-62 ;及 Lauwereys 等人， 1998 EMBO J· 17: 35 12-3520。駱駝科動物抗體及抗體片段之基因工程處理庫可（例如）購自比利時Ghent市之Ablynx 藥廠。如同其他非人類源抗體，駱駝科動物抗體之胺基酸序列可經重組改變以獲得更接近類似於人類序列之序列，亦即該奈米抗體可經，，人源化”。因此，可進一步減少駱駝科動物抗體對人類之天然低抗原性。 130427.doc -36- 200906439 路乾科動物奈米抗體的分子量約為人類IgG分子之十分之一’且蛋白質具有僅數奈米之物理直徑。小尺寸所引起之一結果為駱駝科動物奈米抗體能夠與較大抗體蛋白質功月&上所沒有之抗原部位結合，亦即駱駝科動物奈米抗體適用作偵測會被傳統免疫技術判為隱性之抗原的試劑且適用作可能之治療劑。因此，小尺寸所引起之另一結果為駱駝科動物奈米抗體可因與標靶蛋白質之槽或狹窄裂口中之特異部位結合而抑制，且因此其能力可以比傳統抗體更接近類似傳統低分子量藥物之功能。低刀子I及緊役之尺寸進一步使路馬它科動物奈米抗體極具熱穩定，可穩定對抗極端pH值及蛋白水解消化且抗原性車又弱。另一結果為駱轮科動物奈米抗體易於自循環系統移入組織中，且甚至可跨越血腦障壁且可治療影響神經組織的病症。奈米抗體可進一步促進藥物傳遞跨越血腦障壁。 >見2004年8月19日公開之美國專利公開案第 5虎。此等特徵與人體内之低抗原性組合顯示其具有巨大治療潛力。此外，此等分子可充分表現於諸如大腸桿菌化 c〇/z·)之原核細胞中。因此，本發明之特徵為對PCSK9具有高親和力之駱駝科動物抗體或駱駝科動物奈米抗體。在本文之某些實施例中，駱駝科動物抗體或奈米抗體係在駱駝科動物體内天然產生，亦即係由駱駝科動物在使用本文針對其他抗體所述之技術以PCSK9或其肽片段免疫後產生。或者，使抗_p(：SK9 駱駝科動物奈米抗體工程化，亦即藉由使用淘選程序以本 130427.doc -37- 200906439 文所述之PCSK9或PCSK9抗原決定基作為標靶（例如）自呈現適當突變之駱騎科動物奈米抗體蛋白質之嗤菌體庫選擇而製得。工程化奈米抗體可進一步藉由基因工程化而定製以使在接受個體體内之半衰期由45分鐘增加至2個星期。雙功能抗體雙功能抗體為二價、雙特異性分子，其中^^及Vl功能部位係表現於單一多肽鏈上’由太短而不允許同一鏈上的兩個功能部位之間配對的連接子連接。Vh& Vl功能部位與另一鏈之互補功能部位配對，藉此產生兩個抗原結合部位（例如參見，Holliger等人，1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ; Poljak等人 ’ 1994 Structure 2:1121-1123)。可藉由在同一細胞内以結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL構型）或VlA-Vhb及Vlb_Vha(Vl-Vh構型）表現兩條多狀鍵來製造雙功能抗體。其中多數可在細菌内表現為可溶形式。單鏈雙功能抗體（scDb)係藉由以具有約1 5個胺基酸殘基之連接子連接兩條形成雙功能抗體之多肽鏈而製得（參見 Holliger 及 Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30 , Wu 專人，1996 Immunotechnology, 2(1 ):2 1-3 6)。scDb可以可溶、活性單體形式表現於細菌中（參見 Holliger及 Winter，1997 Cancer Immunol. Immunother.， 45(34). 128-30 ’ Wu 荨人，1996 Immunotechnology, 2(1):21-36, Pluckthun及 Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105 ; Ridgway等人 ’ 1996 Protein Eng., 9(7):617-21)。雙功能抗體可與Fc融合以產生，，二-雙功能抗體”（參見Lu 130427.doc -38- 200906439 等人，2004 J. Biol. Chem.，279(4):2856-65)。經工程化及修飾之抗體可使用具有一或多個VH及/或VL序列之抗體作為起始物質使經修飾之抗體工程化來製備本發明之抗體，該經修飾之抗體可具有與起始抗體相比經改變之特性。可藉由修飾一或兩個可變區（亦即及/或VL)内（例如一或多個CDR區内及/或一或多個構架區内）之一或多個殘基使抗體工程化。另外或其他，抗體可藉由修飾恆定區内之殘基（例如）而工程化以改變該抗體之效應功能。可進行之一種類型之可變區工程化為Cdr移植。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈CDR内的胺基酸殘基與乾抗原相互作用。出於此原因，個別抗體之間CDR内之胺基酸序列比CDR外之序列差異大。由於CDR序列負責大部分抗體_ 抗原相互作用，因此可能藉由建構表現載體（該等表現載體包括來自特疋天然產生之抗體並移植至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列上的CDR序列）來表現模擬特定天然產生之抗體之特性的重組抗體（例如參見Riechmann，l 等人，1998 Nature 332:323-327; Jones等人，i986 Nature

321:522-525, Queen等人 ’ 1989 Proc, Natl. Acad。參見 u S A 86:10029-10033 ;美國專利第5,225,539號；及美國專利第 5,530,101、5,585,089、5,693,762及 6,1 80,370號）。可自包括生殖糸抗體基因序列之公開DNA資料庫或已出版之文獻獲得構架序列。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於"VBase”人類生殖系序列 130427.doc -39- 200906439 資料庫（可在網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase獲得）以及 Kabat 專人，1991 Sequences of Proteins 〇f

Immunological Interest，第 5版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第 91-3242號；Tomlinson 等人，1992 J. Mol. Biol. 227:776-798 ;及 Cox等人，1994 Eur. J Immunol. 24:827-836中’以上各者之内容均以引用的方式清楚地併入本文中。 VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可移植至序列與衍生構架序列之生殖系免疫球蛋白基因中所見的序列一致之構架區上’或CDR序列可移植至與生殖系序列相比含有一或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現在某些狀況下，使構架區内之殘基突變對維持或增強抗體之抗原結合能力而言係有益的（例如參見美國專利第5,5 3 〇，丨〇 j 號、第 5,585,089號、第 5,693,762號及第6,18〇,37〇號）。 CDR亦可移植至除免疫球蛋白功能部位以外之多肽構架區中。適當支架形成構型上穩定之構架，該等構架呈現移植殘基使得其形成定位表面且與所關注之標靶結合（例如，PCSK9)。舉例而言，CDR可移植至構架區係基於纖維網蛋白、錨蛋白、脂質運載蛋白、新制癌菌素、細胞色素b、 cpi鋅指蛋白、PST1、捲曲螺旋、laci_Di、z功能部位或坦達米沙（tendramisat)的支架上（例如參見’ ^^^⑶及uMen, 1997 Current Opinion in Structural Bi〇1〇gy，7, 463 469)。另類型之可¥區修飾為使^及/或cdri、cdr2^ 或CDR3區内之胺基酸殘基突變以藉此改良所關注抗體之 130427.doc -40- 200906439 一或多種結合特性（例如親和力）’稱為”親和力成熟"。可進行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變，且可以如本文中所述之活體外或活體内檢定來評估對抗體結合或其他受關注功能特性之影響。可引入保守性修飾。該等犬fe可為胺基酸取代、增加或缺失。此外，通常C 〇 R區内不超過1、2、3、4或5個殘基改變。本發明之工程化抗體包括已對VH及/或VL内之構架殘基進行修飾（例如）以改良抗體特性之彼等工程化抗體。通常進 f 行該等構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基"逆向突變（backmutate)'，成相應生殖系序列。更特定言之，已經受體細胞突變之抗體可含有與產生該抗體之生殖系序列不同的構架殘基。該等殘基可藉由將該等抗體構架序列與產生該抗體之生殖系序列相比較來鑑別。為使構架區序列回復其生殖系組態，可藉由（例如）定點突變誘發或PCR介導之突變誘發使體細胞突 ^ 變”逆向突變，，成生殖系序列。該等”經逆向突變，，之抗體亦意欲為本發明所涵蓋。另一類型之構架修飾包含使構架區内，或甚至在一或多個CDR區内之一或多個殘基突變以移除τ細胞抗原決定基’藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為,,去免疫,，，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第 20030153043號中。除構架區或CDR區内所作之修飾以外，或作為其替代，本發明之抗體可經工程化以包括Fc區内之修飾，通常以改 130427.doc -41 - 200906439 支/抗體之$夕種功能特性，諸如血清半衰期、補體固定又體、、’α σ及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可經化學修偷（存丨上 ^飾（例如’可將一或多個化學部分連接至抗體上）或經修飾以改變立輔_甘& 又支其糖基化，再改變該抗體之一或多種功能特性。

在Λ施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得該鉸鏈區中之半耽胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法進一步 4田述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。cm鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以（例如）促進輕鏈及重鍵之組裝或增加或降低該抗體之穩定性。在另實鉍例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短該抗體之生物半衰期。更特定言之，將—或多種胺基酸突變引入 Fc叙鏈片奴之CH2-CH3功能部位界面區使得該抗體所具有的葡萄球菌蛋白A(SPA)結合相對於原生Fc鉸鏈功能部位 SpA結合削弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。在另一實施例中，該抗體經修飾以增加其生物半衰期。多種方法為可能的。舉例而言，美國專利第6,277,375號描述IgG中增加其活體内半衰期之以下突變：T252L、T254S、 T25 6F °或者’為增加生物半衰期，該抗體可在cm區或CL 區内改變以含有取自IgG之Fc區之CH2功能部位的兩個環之補救受體結合抗原決定基，如presta等人之美國專利第 5,869,046號及第6,121,022號中所述。在其他實施例中’ F c區係藉由以不同胺基酸殘基置換至 130427.doc • 42· 200906439 少一個胺基酸殘基而改變以改變抗體之效應功能。舉例而言’一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換使得該抗體對效應配位體之親和力改變但保留母抗體之抗原結合能力。親和力經改變之效應配位體可為（例如）Fc受體或補體之 C1組份。此方法進一步詳細描述於winter等人之美國專利第 5,624,821 號及第 5,648,260號中。在另一實施例中，可以不同胺基酸殘基置換選自胺基酸殘基之一或多種胺基酸殘基使得抗體具有改變之Clq結合及/或減弱或消除之補體依賴性細胞毒性（CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6，194,551號中。在另一實施例中’一或多個胺基酸殘基經改變以藉此改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於B〇dmer等人之 W0 94/29351 中。在另一實施例中，修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毋性（ADCC)之能力及/或藉由修飾一或多個胺基酸來增加抗體對Fq受體之親和力。此方法進一步描述於presta 之wo 00/42072中。此外，已定位人類ig(H上F^Ri、 FcyRII、FqRin及FcRn之結合部位且已描述結合改良之變體（見 Shields，R.L.等人 ’ 2001 J· Biol· Chen 276:6591_ 6604)= 在另—實施例中，抗體之糖基化經修飾。舉例而言，可製備去糖基化（aglycoslated)之抗體（亦即缺乏糖基化之抗體）糖基化可經改變以（例如）增加抗體對抗原之親和力。可藉由(例如)改變抗體序列内之一或多個糖基化部位來完 130427.doc -43 - 200906439 成該等碳水化合物修飾。舉例而纟，可進行一或多個胺基酸取代’其消除-或多個可變區構架糖基化部位以藉此消除彼位點處之糖基化。該去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。該方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第 5,714,350號及第 6,350,861 號中。另外或其他，可製備糖基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基量減少之低岩藻糖基化抗冑或二分⑽心結構增加之抗體。已證實該等經改變之糖基化模式增加抗體之 ADCC活性。該等碳水化合物修飾可藉由（例如）使抗體在糖基化方式改變之宿主細胞中表現來完成。糖基化方式改變之細胞已在此項技術中加以描述且可用作表現本發明之重組抗體之宿主細胞以藉此產生糖基化改變之抗體。舉例而言，Hang等人之EP U76，195描述具有經功能性破壞之 FUT8基因的細胞株，該基因編碼岩藻糖基轉移酶使得在該細胞株中表現之抗體展示低岩藻糖基化。Presta之pct公開案'\¥0 03/035835描述變體（^0細胞株、1^〇13細胞，其使岩藻糖連接於Asn(297)-鍵聯之碳水化合物上之能力降低，亦引起在彼宿主細胞中表現之抗體低岩藻糖基化（亦參見

Shields, R.L.等人，2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。

Umana等人之W〇 99/54342描述經工程化以表現糖蛋白-改質糖基轉移酶（例如β(1，4)-Ν乙醯基葡糖胺轉移酶m (GnTIII))的細胞株’使得在工程化細胞株内表現之抗體展示二分GlcNac結構增加，其使得抗體之ADCC活性增加（亦參見 Umana等人，1999 Nat. Biotech. 17:176-180)。 130427.doc -44- 200906439 本發明所涵蓋之本文抗體的另一修飾為聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以（例如）增加抗體之生物（例如血清衰期。為使抗體聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇（PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物在—或多個 PEG部分與抗體或抗體片段連接的條件下反應。聚乙二醇化寸藉由與反應性peg分子（或類似之反應性水溶性聚合物）之酿化反應或烧基化反應來進行。如本文所用之術注聚乙二醇”意欲涵蓋已用於使其他蛋白質衍生化之任何形式之PEG，諸如單（C1-C10)烷氧基聚乙二醇或單（C1_C10) 芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-順丁稀二醯亞胺。在某些實施例中’待聚乙二醇化之抗體為去糖基化抗體。使蛋白質聚乙一醇化之方法為此項技術中已知且可應用於本發明之抗體。例如參見Nishimura等人之EP 0 154 3 16或Ishikawa等人之EP 0 401 384。此外’可藉由在本發明之PCSK9結合多肽的任何部分引入非天然胺基酸來完成聚乙二醇化。某些非天然胺基酸可藉由 Deiters等人 ’ J Am Chem Soc 125:11782-11783，2003 ;

Wang及 Schultz，Science 301:964-967, 2003 ; Wang 等人， Science 292:498-500， 2001 ; Zhang 等人，Science 303:371_373，2004或美國專利第7,083,970號中所述之技術引入。簡言之，此等表現系統中有一些涉及定點突變誘發以將無義密碼子（諸如琥ί白TAG)引入編碼本發明多狀之開放閱讀框中。接著將該等表現載體引入可利用對所引入之無義密碼子具有特異性且裝填有所選非天然胺基酸之 130427.doc -45 · 200906439 tRNA的宿主中。有益於使部分與本發明多肽結合之目的之特定非天然胺基酸包括彼等具有乙块及叠氮基側鍵之非天然胺基酸。接著含有此等新穎胺基酸之多肽可在蛋白質的此荨所選部位聚乙二醇化。 ' 使抗體工程化之方法如上文所述’抗-PCSK9抗體可用於藉由修飾全長重鍵及/ 或輕鏈序列、VhA/或Vl序列，或與其連接之惶定區而產生新抗-PCSK9抗體。舉例而言，抗體之—或多個咖區可盘已知構架區及/或其他CDR重組式組合以產生經重祖式工程化之新抗-PCSK9抗體。其他類型之修飾包括先前部分中所述之修飾。工程化方法之起始物質為一或多個％及，或& 序列，或其-或多個CDR區。為產生工程化抗體，並非必需實際上製備(亦即表現為蛋白質)具有—或 VL序列，或其-或多個CDR區的抗體。相反地，該列中所含有之資訊用作產生原自度王郝目初始序列之"第二代，的起始物質，且随德”笛_ & , 所。 ^弟—代序列得以製備且表現為蛋白負。標準分子生物學技術可用以製備及表現經改變之抗體序列。由經改變抗體序列編 T N、狗竭之抗體為保 PCSK9抗體之功能特性中之一種、 ▲:之抗特性包括（但不限於）與PCSK9特異性結合:制自== 解、抑制LDL_R結合、抑制LD 身催化4 特性可使用此Μ Μ 部解。經改變抗體之功能 J 1之用此項技術中可田如，ELISA)評定。用及/或本文所述之標準檢定⑼ I30427.doc -46 - 200906439 在使本發明抗體工程化之某些實施例中，可沿所有或部分抗-PCSK9抗體編碼序列隨機或選擇性引入突變且可如本文所述篩選所得經修飾抗-PCSK9抗體之結合活性及/或其他功能特性（例如，抑制自身催化裂解、抑制LDL-R結合、抑制LDL-R降解）。此項技術中已描述突變方法。舉例而言， Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和突變誘發、合成接合組裝或其組合產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之W0 03/074679描述使用計算篩選法使抗體之生理化學特性最優化的方法。非抗體PCSK9結合分子本發明進一步提供展現抗體之功能特性但其構架及抗原結合部分源自其他多肽（例如，除彼等由抗體基因編碼或由抗體基因活體内重組產生之多肽以外的多肽）的PCSK9結合分子。此等結合分子之抗原結合功能部位（例如，PCSK9 結合功能部位）係經由直接評估法產生。參見美國專利第 7,1 1 5,396號。具有與抗體之可變功能部位類似之整體摺疊 (”免疫球蛋白樣"摺疊）的分子為適當的支架蛋白。適於產生抗原結合分子之支架蛋白包括纖維網蛋白或纖維網蛋白二聚體、細胞黏合素、N-妈黏素、E-妈黏素、ICAM、肌聯蛋白、GCSF-受體、細胞素受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓鞘膜黏附分子P〇、CD8、CD4、CD2、第I類MHC、 T-細胞抗原受體、VCAM-1之CD1、C2及I組功能部位、肌凝蛋白結合蛋白C之I組免疫球蛋白功能部位、肌凝蛋白結合蛋白Η之I組免疫球蛋白功能部位、端素蛋白之I組免疫球 I30427.doc -47 - 200906439 蛋白功能部位、NCAM、室貝搐蛋白、神經膠質蛋白、激素受體 '紅血球生成素受I#、、，' ±，又 ^ m素受體、干擾素浅 β-半乳糖苷酶/葡萄糖醛酸酶、β β-葡萄糖盤酸酶、轉麵胺醯胺酶、Τ-細胞抗原受體、超、虱化歧化酶、組織因子功能

位、細胞色素F、綠色榮光蛋白、Gr〇EL及索馬甜。° 非抗體結合分子之抗原結合功能部位(例如，免疫球蛋白樣摺疊）可具有小於1GkD或大於75kD之分子質量（例如介於之間的分子質量）。用於產生抗原結合功能部位之蛋白質為天然存在之哺乳動物蛋白質(例如，人類蛋白質)’且抗原結合功能部位相較於產生其之蛋白質的免疫球蛋白樣摺疊包括至多50%(例如，至多34%、25%、2〇%或叫突變胺基酸。具有免疫球蛋白樣摺疊之功能部位一般由 50-1 50個胺基酸（例如，4〇_6〇個胺基酸）組成。為產生非抗體結合分子’產生純系庫，其中形成抗原結合表面之支架i白質d (例士口，位置及結構與抗體可變功能 4位免疫球蛋白摺疊的CDR類似之區）中的序列經隨機化。測s式庫純系與所關注抗原（例如，hpcsK9)之特異性結合及其他功能（例如，抑制PCSK9之生物活性）。所選擇純系可用作進一步隨機化及選擇以產生對抗原具有較高親和力之衍生物的基礎。例如使用纖維網蛋白m之第1〇模組（i〇Fn3)作為支架產生面親和力結合分子。為在殘基23_29、52_55及7δ_87處的三個CDR樣10FN3環中之每一者建構庫。為建構各庫，藉由募核苦酸合成使與各CDR樣區重疊之DNA區段編碼序列隨機 130427.doc •48 200906439 化。產生可選10Fn3庫之技術描述於美國專利第6,818,418號及弟7，1 15,396號；Roberts及Szostak，1997PI·oc.Natl.Acad· Sci USA 94:12297 ;美國專利第6,261，804號；美國專利第 6,258,558號；及 Szostak 等人 WO 98/3 1 700 中。非抗體結合分子可以二聚體或多聚體形式產生以增加對革巴抗原之親和力。舉例而言，抗原結合功能部位表現為與形成Fc-Fc二聚體之抗體恆定區的融合物。例如參見美國專利第7，1 1 5,396號。編碼本發明抗體之核酸分子本發明之另一態樣係關於編碼本發明之PCSK9結合分子的核S欠分子。核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解產物中’或可為部分純化或大體上純形式的核酸。當藉由標準技術（包括鹼性/SDS處理、CsCl條帶化、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術）純化核酸使其與其他細胞組份或其他污染物（例如，其他細胞核酸或蛋白質）分開時該核酸”經分離”或"呈現為大體上純”。參見F. Ausubel 等人編 1987 Current Prot〇c〇ls in M〇lecular Bi〇i〇gy，

Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本發明之核酸可為（例如）DNA或RNA，且可能含有或可能不含有内含子序列。在一實施例中，核酸為cDNA分子。核酸可存在於諸如噬菌體呈現載體之載體中，或存在於重組質體載體中。本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於融合瘤（例如，如下文進一步描述之由攜帶人類免疫球蛋白基 130427.doc -49- 200906439 因之轉殖基因小鼠製備的融合瘤）表現之抗體而言，編碼由融〇瘤製得之抗體之輕鏈及重鏈的cDN A可經由標準PCR 擴增或cDNA選殖技術獲得。對於由免疫球蛋白基因庫（例如使用噬菌體呈現技術）獲得之抗體而言，編碼抗體之核酸可自作為該庫之成員的多個噬菌體純系回收。一旦獲得編碼VH&VL區段之DNA片段，此等〇>^片段即可進一步經由標準重組DNA技術處理（例如）使可變區基因轉化為全長抗體鏈基因，轉化為Fab片段基因或轉化為scFv 基口在此等處理中，將編碼VL或νΗ之DNA片段操作性連接至另DN A分子或連接至編碼另一蛋白質之片段（諸如抗體怪定區或可撓性連接子）。如此情形中所用之術語”操作性連接"意謂兩個DNA片段以功能方式接合，例如使得由 «亥兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同才匡，或使得蛋白質在所要啟動子控制下表現。可藉由將編碼V η之D N a操作性連接至另一編碼重鏈恆定區（CHI CH2及CH3)之DNA分子來將編碼Vh區之經分離 DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈悝定區基因之序列在此項技術中為已知的（例如參見Kabat等人1991㈣此咖 of Proteins 〇f Immun〇I〇gical 化化“以，第五版 u Department of Health _ Human 8_心5, nih 出版號 9 1 -3242)且包涵此等區域之DNA片段可藉由標準pcR擴增獲得。該重鏈恆定區可為igGI、IgG2、igG3、邮4、

IgE、IgM或IgD恆定區。對於Fab片段重鏈基因而言，可將、扇馬VH之DNA操作性連接至另一僅編碼重鍵c出怪定區之 130427.doc -50- 200906439 DN A分子。可藉由將編碼VL之DNA操作性連接至另一編碼輕鏈恆定區CL之DNA分子來將編碼vL區之經分離DNa轉化為全長輕鏈基因（以及轉化為Fab輕鏈基因）。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知（例如參見Kabat等人，1991

Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版， U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。為產生scFv基因，使編碼Vh2dna片段及編碼VL之DNA 片段與另一編碼可橈性連接子（例如編碼胺基酸序列 (Gly4-Ser)3)之片段操作性連接，使得vh&Vl序列可表現為 VL及VH區由可撓性連接子連接之連續單鏈蛋白質（例如參見 Bird等人 ’ 1988 Science 242:423-426 ; Huston等人，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 ; McCafferty 等人，1990 Nature 348:552-554)。單株抗體之產生可藉由多種技術（包括習知單株抗體法，例如Kohler及 Milstein之標準體細胞雜交技術（丨975

Nature，256:495))或使用庫呈現法（諸如噬菌體呈現）製造單株抗體（mAbp 用於製備融合瘤之動物系統為鼠科動物系統。小鼠體内 RJ虫合瘤之產生為經充分確定之程序。分離經免疫脾細胞以供融合之免疫方案及技術為此項技術中已知的。亦已知融合搭配物（例如，鼠科動物骨髓瘤細胞）及融合程序。 130427.doc •51 - 200906439 =發明之嵌合抗體或人源化抗體可基於如上文所述製備之鼠科動物單株抗體的序列製備。編碼重鍵及輕鍵免疫球蛋白之職可使用標準分子生物學技術由所關注之鼠科動物融合瘤獲得且經工程化以含有非鼠科動物(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言’為形成嵌合抗冑，可使用此項技術中已知之方法使氣科動物可變區與人類惶定區連接 ⑴士 > ^Cabilly等人之美國專利第4,816,567號）。為產生人源化U，可使用此項技術中已知之方法將鼠科動物咖區***人類構架中。例如參見美國專利第5,225,539號及美國專利第5,530，1()1號；第5,585,〇89號；第5,693,762號及第 6,180,370號。在某-實施例中’本發明之抗體為人類單株抗體。該等針對PCSK9之人類單株抗體可使用攜帶人類免疫系統而非小鼠系統之部分的轉殖基因或轉染色體小鼠產生。此等轉殖基因及轉染色則、&包括在本文中分別稱為Hu·小鼠及KM小鼠，且在本文中統稱為I，人類Ig小鼠，，之小鼠。

HuMAb m〇Use®(Medarex，Inc.)含有編碼未重新排列人類重鏈（μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因小基因座（minil〇cus)，以及使内源κ鏈基因座失活之靶向突變（例如參見 Lonberg等人，1994 Nature 368(6474):

856-859)。因&，小鼠展現降低之小wgM^K表現，且回應於免疫作用，所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因可經受類別轉換及體細胞突變以產生高親和力單株人類 IgGK(L〇nberg，N，等人，1994,前述；評論於 L〇nberg，N 130427.doc -52- 200906439 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 ； Lonberg，N.及 Huszar，D·，1995 Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 ;及 Harding，F.及 Lonberg, N.，1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:53 6-546)。以下文獻中進一步描述HuMAb小鼠之製備及使用及此等小鼠所攜帶之染色體修飾：Taylor， L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295 ； Chen, J.等人，1993 International Immunology 5:647-656 ; Tuaillon 等人，1993 Proc. Natl. Acad. Sci. US A 94:3 720-3 724 ； Choi 等人，1993 Nature Genetics 4:117-123 ; Chen，J.等人，1993 EMBO J. 12:821-830 ; Tuaillon等人，1994 J. Immunol. 152:2912-2920 ; Taylor, L.等人，1994 International Immunology 579-591 ;及Fishwild, D.等人，1996 Nature Biotechnology 14:845-85 1 ’所有該等文獻之内容均以引用的方式特定地以全文形式併入本文中。另外參見Lonberg及

Kay之美國專利第 5,545,806號、第 5,569,825號、第 5,625，126 號、第 5,633,425 號、第 5,789,650號、第 5,877,397號、第 5,661，016號、第 5,814,318號、第 5,874,299號及第 5,770,429 號；Surani等人之美國專利第5,545,807號；Lonberg及Kay 之PCT公開案第WO 92 1039 18號、第WO 93/1 2227號、第WO 94/255 85 號、第 WO 97 1 1 3852號、第 WO 98/24884號及第 WO 99/45962號；及 Korman 等人之 PCT公開案第 WO 01/14424 號。在另一實施例中’本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如攜帶 130427.doc -53 - 200906439 人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠產生。在本文中稱為’’KM小鼠”之該等小鼠係詳細描述於W⑽Μ則中。

7另外’表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉殖基因動物系統在此項技術中可用且可用以產生本發明之抗仍收體舉例而5，可使用稱為Xen〇m〇use⑧(八^⑶氏—）之替代轉殖基因系、统。該等小鼠描述於例如i等人之美國專利第 5,939,598號；第 6，G75，18m ;第6，1 14,598 號；第 6，150,584 號及第 6，162,963 號。 /此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統在此項技術中可用且可用以開發本發明之抗hTSLl^^ 體。舉例而言’可使用稱為”TC小鼠"之攜帶人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體之小鼠；該等小鼠描述於 Tomizuka等人，2000 Pr〇c. Natl. Acad· Sci. USA 97:722-727 中。此外’攜帶人類重鍵及輕鏈轉染色體之牛已於此項技術中加以描述（Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20:8 89-894)且可用於產生本發明之抗_PCSK9抗體。亦可使用篩選人類免疫球蛋白基因庫之噬菌體呈現方法來製備本發明之人類單株抗體。此項技術中確立該分離人類抗體之嗟_體呈現法。例如參見：Ladner等人之美國專利第 5,223,409號；第 5,403,484號；及第 5,571，698號；Dower 等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號； ]^(^&[[61^等人之美國專利第5,969，108號及第6，172，197 號；及Griffiths美國專利第5,885,793號；第6,521,404號； 130427.doc •54- 200906439 第 6,544,73 1 號；第 6,555,3 13 號；第 6,582,9i5 號及第，，1號可針對與全長PCSK9之結合或與PCSK9之特疋抗原決定基之結合來篩選庫。本發明之人類單株抗體亦可使用已重組有人類免疫細胞以便在免疫後產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。該等小鼠描述於（例如）Wilson等人之美國專利第5,476,996號及弟 5,698,767號中。人類Ig小鼠體内人類單株抗體之產生 f 1 表現於原核細胞（例如，大腸桿菌）或真核細胞（例如，哺乳動物細胞，例如HEK293細胞）中之純化重組人類PCSK9 可用作抗原。蛋白質可與諸如匙孔螺血氰蛋白（Κ[ η)之載體結合。使用HuMab轉殖基因小鼠之HCo7、HCo 1 2及HCo 1 7品系及轉殖基因轉染色體小鼠之KM品系製備pcsK9之完全人類單株抗體’該等小鼠品系各自表現人類抗體基因。在此 ,等小鼠品系之每一者中，内源小鼠κ輕鏈基因可如chen等人’ 1993 EMBO J. 12:8 1 1-820所述經純合式中斷且内源小鼠重鏈基因可如WO 011 091 87之實例1所述經純合式中斷。如

Fishwild等人，1996 Nature Biotechnology 14:845-85 1 所述’此等小鼠品系之每一者攜帶人類κ輕鏈轉殖基因 KCo5。如美國專利第5,545,806號；第5,625,825號；及第 5,545,807號所述，11(：〇7品系攜帶11(：〇7人類重鏈轉殖基因。如WO 01/09187之實例2所述，HCol2品系攜帶HCol2人類重鏈轉殖基因。HCo 1 7品系攜帶HCo 1 7人類重鏈轉殖基因。 130427.doc -55- 200906439 如WO 02/43478所述，KNM品系含有SC20轉染色體。為產生針對PCSK9之完全人類單株抗體，將HuMab小鼠及KM小鼠以純化重組PCSK9、PCSK9片段或其結合物（例如，PCSK9-KLH)作為抗原進行免疫。以下文獻中描述 HuMab小鼠之一般免疫流程：Lonberg，N,等人，1994 Nature 368(6474): 856-859 ; Fishwild, D 等人，1996 Nature Biotechnology 14:845-851 及 WO 98/24884。小鼠在第一次輸注抗原時為6 -1 6週齡。使用抗原之經純化重組製劑（5 - 5 〇 Mg)使HuMab小鼠及KM小鼠腹腔内、皮下（Sc)或經足墊注射來免疫。使轉殖基因小鼠在腹腔内（IP)、皮下（Sc)或經足墊（FP)以完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant)或Ribi佐劑中之抗原免疫兩次’隨後3 - 2 1天以完全弗氏佐劑或r丨b i佐劑中之抗原進行IP、Sc或FP免疫（總共至多11次免疫）。由眼後採血來監測免疫反應。藉由ELISA篩選血漿，且將具有足夠抗 -PCSK9人類免疫球蛋白力價之小鼠用於融合。將小鼠以抗原靜脈内加強免疫’ 3天及2天後將其處死且移除脾臟。通常’各抗原進行1 0-3 5次融合。將若干打小鼠以各抗原免疫。總共82隻HC〇7、HC〇12、HC〇17及KM小鼠品系之小鼠以PCSK9免疫。可如？丨吐\¥叫，0.等人，1996所述藉由虹18八測試來自經免疫小鼠之也清以選擇產生與PCSK9結合之抗體的HuMab 或KM小鼠。簡言之，將微量滴定板用經純化之重組 PCSK9 ’以PBS中之1-2 pg /m卜每孔50 μΐ塗覆，在4°C下培 130427.doc -56- 200906439 育隔夜接著以每孔200 μΐ PBS/Tween(0.0 5%)中之5%雞血清阻斷。將來自PCSK9-免疫小鼠之血漿稀釋物添加至各孔中且在環境溫度下培育1-2小時。將培養板以PBS/Tween洗滌，且接著以與辣根過氧化物酶（HRP)結合之山羊抗人類 IgG Fc多株抗體在室溫下培育1小時。洗滌後，將培養板以 ABTS受質（Sigma，A-1 88 8，0.22 mg/ml)顯影且由分光光度計在OD 415-495下分析。將顯影為最高抗-PCSK9抗體力價之小鼠脾細胞用於融合。進行融合且藉由ELISA測試融合瘤上清液之抗-PCSK9活性。基於標準方案將分離自HuMab小鼠及KM小鼠之小鼠脾細胞以PEG融合至小鼠骨髓瘤細胞株。接著針對抗原特異性抗體之產生篩選所得融合瘤。使來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞的單細胞懸浮液以50% PEG(Sigma)與1/4數目之 SP2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞（ATCC，CRL 1581)融合。將細胞以每孔約1 X 1 05個塗覆於平底微量滴定板中，隨後在含有 10%胎牛血清、10% P388D 1(ATCC，CRL TIB-63)改良性培養基、DMEM 中之 3-5% Origen® (IGEN)(Mediatech，CRL 10013，含有高葡萄糖，L-麩胺麩胺及丙酮酸鈉）加5 mM HEPES、0.055 mM 2-巯基乙醇、50 pg/ml慶大黴素 (gentamycin)及 lxHAT(Sigma，CRL P-7185)之選擇性培養基中培育約2週。1-2週後，在以HT置換HAT之培養基中培養細胞。接著將個別孔藉由£1^18八針對人類抗氺匚81<：9單株1§0 抗體進行篩選。一旦發生大範圍雜交瘤生長，則一般在 10-14日後監測培養基。再塗、再次篩選分泌抗體之雜交 130427.doc -57- 200906439 瘤，且若其對於人類1gG、抗-PCSK9單株抗體仍為陽性，則可藉由限制稀釋將其次選殖至少兩次。接著活體外培養穩定次純系，以在組織培養基内產生少量抗體供進一步表徵。製造人類單株抗體之融合瘤之產生為產生製造本發明之人類單株抗體之融合瘤，可將來自經免疫小鼠之脾細胞及/或淋巴結細胞分離且融合至適當永生化細胞株（諸如小鼠骨髓瘤細胞株）。接著針對抗原特異生抗體之產生來篩選所得融合瘤。舉例而言，可以5〇% peg 將來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與1/6數

目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞（ATcc，CRL 1580)融合。將細胞以約2><145塗於平底微量滴定板内，隨後在含有20%胎純系血清、18% ”653"改良性培養基、5%

Origen®(IGEN)、4 mM L-麩胺麵胺、1 丙酮酸鈉、5 mM HEPES、0.055 mM 2-巯基乙醇、50單位/毫升盤尼西林 (penicillin)、50 pg/ml鏈黴素、50 μ§/ηι1 慶大黴素及 1χΗΑΤ (Sigma ;融合24小時後添加HAT)之選擇性培養基内培養兩週。約兩週後，在以HT替代hat之培養基中培養細胞。接著將個別孔藉由ELISA針對人類單株抗IgM及IgG抗體進行篩選。一旦發生大範圍雜交瘤生長，則通常在1〇_14日後觀察培養基.。分泌抗體之融合瘤可經再塗，再篩選，且若對於人類IgG仍為陽性，則可以限制稀釋將其次選殖至少兩次。接著活體外培養穩定次純系，以在組織培養基内產生少量抗體供表徵。 130427.doc -58- 200906439 為純化人類單株抗體，可使所選擇之雜交瘤於兩公升旋轉k瓶内生長以供單株抗體純化。可將上清液過遽，且濃縮 IW後以蛋白質 A_瓊脂糖（pharmacia，piscat_y，NJ.) ，行親和力層析。可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查經溶離之IgG以確保純度。可將緩衝溶液交換至觸中，且可使用1.43 >肖光係、數由㈤則測定濃度。可將單株抗體製成等分試樣且儲存於_8〇°c下。製造單株抗體之轉染瘤的產生本發明之抗體亦可使用（例如）此項技術中熟知之重組 DNA技術及基因轉染方法之组合在宿主細胞轉染瘤中製造 (例如 M〇rrison，1985 Science 229:1202) 〇舉例而言，為表現該等抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA可經由標準分子生物學技術（例如’ PCR擴增或⑽八選殖’使用表現所關注抗體之融合瘤）獲得，且該等DNA可***表現載體中使得基因與轉錄及轉譯控制序列操作性連接。在此情形中，術語”操作性連接” 意指將抗體基因接合至載體内使得載體内之轉錄及轉譯控制序列起到其預期的調控抗體基因之轉錄及轉譯之作用。選擇表現載體及表現控制序列以與所用表現宿主細胞相容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可***單獨载體中，或更通常兩種基因可***同一表現載體中。該等抗體基因係藉由標準方法（例如抗體基因片段與載體上之互補限制部位的連接，或若不存在限制部位則為平端連接）***表現栽體中。可使用本文所述之抗體的輕鏈及重鏈可變區產生任 130427.doc -59- 200906439 何抗體同型之全長抗體基因，此係藉由將其***已編碼所要同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區的表現載體中，以便將 VH區段操作性連接至載體内之cH區段且將Vl區段操作性連接至載體内之CL區段而完成。另外或其他，重組表現载體可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之信號肽。抗體鏈基因可選殖至載體中使得信號肽與抗體鏈基因之胺基末端同框連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽（亦即來自非免疫球蛋白蛋白質的信號肽）。

除杬體鏈基因之外，本發明之重組表現載體攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中表現之調控序列。術語"調控序列" 思奴包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯的啟動子、強化子及其他表現控制要素（例如多聚腺苷酸化信號）。例如在

Goeddel (Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzym〇l〇gy 185, Academic press，Dieg〇, 中描述該等調控序列m項技術者將理解，表現載體之設計，包括調控序列之選擇，可視諸如待轉型宿主細胞之選擇、所需蛋白貝之表現1等而定。哺乳動物宿主細胞表現之調控序列包括指導哺乳動物細胞内高蛋白質表現量之病毒要素’諸如源自巨細胞病毒(CMV)、猿病毒40(simian virus 4〇)(SV40)、腺病毒（例如腺病毒主要晚_ _ 夕瘤病母之啟動子及/或強化子。或者，可使用非病毒性調控序列，諸如泛去& ^ 7丄、π 乏素啟動子或Ρ-血球蛋白啟動子。此外，调控元素包含來自不同來 U术源之序列，諸如SRa啟動子系統，其含有來自SV40早坤魴备2 — 千，月啟動子之序列及第1型人類T細胞白 130427.doc -60- 200906439 血病病毒之長末端重複序列（Takebe等人，1988 Mq丨eeii

Biol. 8:466-472)。除抗體鏈基因及調控序列之外，本發明之重組表現載體可攜帶其他序列，諸如調控載體在宿主細胞中複製之序列 (例如’複製起點）及可選擇之標記基因。該可選擇之標記基因促進已引入载體之宿主細胞的選擇（例如參見均為Axei 等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第 5,179,0 17號）。舉例而言，通常可選擇之標記基因賦予已引入載體之宿主細胞對諸如G418、濕黴素（hygr〇mycin)或曱胺喋呤之藥物的抗性。可選擇之標記基因包括二氳葉酸還原酶（DHFR)基因（用於dhfr_宿主細胞中之p胺喋呤選擇/擴增）及neo基因（用於G418選擇）。對於輕鏈及重鏈之表現而言，經由標準技術將編碼重鏈及粒鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。多種形式之術語"轉染”意欲涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。理論上可使本發明之抗體在原核或真核宿主細胞中表現。抗體在真核細胞（尤其哺乳動物宿主細胞）中之表現得以論述，此係由於該等真核細胞且尤其哺乳動物細胞比原核細胞更有可能組裝及分泌經適當摺疊及具免疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對於產生高產量之活性抗體而言為無效的（B〇ss及w〇〇d，1985

Immunology Today 6:12-13)。用於表現本發明之重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中 130427.doc -61- 200906439 國倉鼠印巢（Chinese Hamster Ovary)(CHO細胞）（包括 dhfr-CHO細胞，Urlaub及 Chasin，1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中所述，與DH FR可選擇之標記一起使用，例如如Kaufman及Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621 中所述）、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。尤其對於 NSO骨髓瘤細胞使用而言，另一表現系統為WO 87/04462、 WO 89/01036及EP 338,841所示之GS基因表現系統。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞時，藉由將宿主細胞培養足以允許抗體在宿主細胞内表現或抗體分泌至宿主細胞所生長之培養基内的時段來製造抗體。抗體可使用標準蛋白質純化方法自培養基重新獲得。雙特異性分子在另一態樣中，本發明之特徵為包含本發明之PCSK9結合分子（例如，抗-PCSK9抗體或其片段）的雙特異性分子。本發明之PCSK9結合分子可衍生或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質（例如，受體之另一抗體或配位體）以產生與至少兩個不同結合部位或靶分子結合之雙特異性分子。實際上，本發明之PCSK9結合分子可衍生或連接至一個以上其他功能分子以產生結合兩個以上不同結合部位及 /或靶分子之多特異性分子；如本文所用之術語'’雙特異性分子''亦意欲涵蓋該等多特異性分子。為產生本發明之雙特異性分子，可使本發明之抗體與諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物之一或多個其他結合分子功能性連接（例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式）以便 130427.doc -62- 200906439 產生雙特異性分子。因此，本發明包括包含至少性及對第二靶抗原決定基之第子。 —對PCSK9之第一結合特異一結合特異性的雙特異性分在一實施例中，本發明之譬牲 s ^ 月之又特異性分子包含作為結合特異物之至少一個抗體或豆抗，、机體片段’包括（例如）Fab、Fab'、 F(ab')2、Fv或單鏈Fv。抗體亦± 抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段（諸如Fv)戋如

^义々Ladner等人美國專利第 4,946,778號（其内容係以引用方六 1扣万式明確併入）所述之單鏈構築體。本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法使組份結合特異物結合而製備。舉例而言，雙特異性分子之各結合特異物可單獨產生且接著彼此結合。當結合特異物為蛋白貝或肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。父聯劑之實例包括蛋白質Α、碳化二醯亞胺、Ν_琥珀醯亞胺基-s-乙醯基-硫代乙酸酯（SATA)、5,5，_二硫雙（2_硝基笨甲酸）（DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺（〇pDM)、N_ 琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（81>1：^)及4_(]^_順丁烯二醯亞胺甲基）環己烷_丨_曱酸磺基琥珀醯亞胺酯（磺基 -SMCC)(例如參見 Karpovsky 等人，1984 J. Exp. Med. 160.1686 ’ Liu專人 ’ 1985 Proc, Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括以下文獻中所述之方法：Pauius， 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132 ; Brennan等人，1985 Science 229:81-83);及 Glennie等人，1987 J. Immunol. 139: 130427.doc -63 - 200906439 2367-2375)。結合劑為SATA及磺基_SMCC，其均可購自 Pierce Chemical Co，(R〇ckford，IL)。當結合特異物為抗體時，其可經由兩重鏈之C末端鉸鏈區之氫硫基鍵結結合。在一特定實施例中，鉸鏈區在結合之前經修飾以含有奇數個氫硫基殘基，例如1個。或者，兩個結合特異物可在同一載體中編碼且在同一宿主細胞中表現及組裝。若雙特異性分子為mAbxmAb、 mAbxFab、FabxF(ab')2或配位體xFab融合蛋白，則此方法尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子的單鏈分子，或包含兩個結合決定子的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法係描述於（例如）美國專利第 5,260,203^ ； f 5,455,030¾ ； ^ 4,881,175^ ； ^ 5,1 32,405 號；第 5,091，513 號；第 5,476,786號；第 5,013,653 號；第 5,258,498號；及第 5,482,858號。雙特異性分子與其特異性標靶之結合可經由（例如）酶聯免疫吸附檢定（ELISA)、放射免疫檢定（REA)、FACS分析、生物檢定（例如生長抑制）或西方墨點檢定來證實。此等檢定中之每一者一般藉由使用對所關注之複合物具有特異性的經標記試劑（例如抗體）來偵測尤其受關注之蛋白質_抗體複合物的存在。功能檢定 PCSK9、、Ό合分子之功能特徵可在活體外及活體内測試。舉例而5 ’可測試結合分子抑制PCSK9與LDL-R之相互作 130427.doc -64- 200906439 用、抑制對LDL-R之PCSK9-依賴性作用（例如，LDL-R介導之LDL-c攝取）、抑制PCSK9蛋白水解活性及減少活體内 LDL-c之能力。 PCSK9與LDL-R之結合可使用Biacore®藉由使LDL-R固定至固體支撐物且偵測可溶性PCSK9與LDL-R之結合而偵測。或者，PCSK9可經固定，且可偵測LDL-R結合。 ?08尺-9/1^1^-11結合亦可藉由丑1^8八（例如，藉由偵測？匸81<：9 與經固定LDL-R之結合）或藉由螢光共振能量傳遞法 (FRET)分析。為進行FRET，可偵測溶液中經螢光團標記之 PCSK9與LDL-R之結合（例如參見，美國專利第5,631，169 號）。已藉由共免疫沈澱偵測PCSK9與LDL-R之結合（Lagace等人，2006 J. Clin. Inv. 116(11):2995-3005)。為以此方式檢驗PCSK9-LDL-R結合，可將HepG2細胞在固醇耗盡之培養基中培養18小時。在0.1 mM氯奎存在下將經純化之PCSK9 添加至培養基中且將細胞培育1小時。將細胞於溫和清潔劑 (1%毛地黃皂苷（digitonin)w/vol)中溶解。將 PCSK9 或LDL-R 自細胞溶解產物免疫沈澱，藉由SDS-PAGE分離且進行免疫印跡以分別偵測共免疫沈澱之LDL-R或PCSK9的存在 (Lagace等人，2006 J. Clin. Inv. 1 16(1 1):2995-3005)。此等檢定可使用以較高活性與LDL-R結合之PCSK9的突變形式進行（例如，hPCSK9 D374Y)(Lagace 等人，2006，上述）。肝細胞表現細胞表面上之LDL-R。向經培養之肝細胞（例如，HepG2細胞、ATCC、HB-8065)中添加經純化之PCSK9 130427.doc •65- 200906439 使LDL-R表現以劑量依賴性方式及時間依賴性方法減少 (Lagace等人，2006 J. Clin, Inv. 1 16(1 1):2995-3005)。可測試PCSK9結合分子增加肝細胞LDL-R含量的能力。舉例而言’將HepG2細胞於固醇耗盡培養基（補充有1〇〇 u/mi盤尼西林、100 pg/ml硫酸鏈黴素及1 g/l葡萄糖、5%(體積/體積）新生牛脂蛋白缺乏血清（NCLPDS)、1 0 μΜ康白丁鈉（sodium compactin)及50 μΜ曱羥戊酸鈉之DMEM)中培養18小時以誘導LDL-R表現。向培養基中添加經純化之PCSK9(5 pg/ml)。測定在PCSK9添加後〇、0.5、1、2及4小時收集之細胞中的 LDL-R 含量（Lagace 等人，2006 J. Clin. Inv. 1 16(1 1):2995-3 005)。可藉由流式細胞計數、FRET、免疫印跡或其他方式測定LDL-R含量。細胞（例如，HepG2細胞）之LDL-c攝取可如Stephan及 Yurachek所述使用螢光標記之LDL-c、DiI-LDL(3,3'-二-十八烧基吲哚羰花青低密度脂蛋白）量測（1993 J. Lipid Res. 34:325-330)。簡言之，在37°C下將細胞在培養物中與 DiI-LDL(每毫升20-100 pg蛋白質）一起培育2小時。將細胞洗滌、溶解且使用光譜螢光計定量内化Dii_LDL之濃度。可量測與PCSK9結合劑接觸之細胞中之LDL-c攝取（在細胞培養物中存在Dil-LDL之前及/或期間）。可使用合成肽受質活體外量測PCSK9蛋白水解活性。例如參見 Seidah 等人，2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(3):928-933。在一例示性方法中，將經純化之pcsK9在 37°C下與50 μΜ Suc-RPFHLLVY-MCA(4-曱基香豆素-7-酿 130427.doc -66- 200906439 胺）一起在 25 mM Tris/Mes pH 7.4 + 2.5 mM CaCl2及 0.5% SDS中培育3-1 8小時。使用產物之螢光及基質輔助雷射解吸附離子化飛行時間分析偵測裂解產物（Seidah等人，2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，100(3):928-933 ; Basak等人， 2002 FEBS Lett. 5 14:333-339)。此檢定可用於偵測 PCSK9 結合分子存在下裂解效率之差異。在肝臟中過度表現人類PCSK9之轉殖基因小鼠具有相對於非轉殖基因小鼠含量增加之血漿LDL-c(Lagace等人， 2006 J. Clin. Inv. 1 16(11):2995-3005)。亦參見Maxwell及 Breslow，2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:7100，其描述使用腺病毒載體在小鼠體内過度表現PCSK9。已產生 PCSK9·/—小鼠（Rashid 等人，2005 ?1'〇<:.仏11.八。3(13(^· 102(5):53 74-53 79)。此等小鼠可經基因改造以表現hPcsK9 轉殖基因。可在此等模型中之任一者中或在未經基因改造之動物體内測試PC SK9結合分子清除或減少總膽固醇及/或 LDL-c之能力。自血·滎清除LDL之動力學可藉由將動物注射[!25巧_標記之LDL，在注射後〇、5、1〇、15及3〇分鐘獲得血液樣本且定量樣本中之[125I]_LDL而測定（Rashid等人，2〇〇5 Pr〇c

Natl· Acad· Sci. 102(5):5374-5379) °PCSK9-/·小鼠體内之 LDL清除速率相對於野生型小鼠增加（Rashid等人，2005上述）。投與PCSK9結合分子之動物體内之ldl清除增加表明該藥劑抑制活體内PCSK9活性。桌膽固醇、血漿甘油三酯或Ldl-c回應於PCSK9結合 130427.doc •67· 200906439 分子治療之減少指示PCKS9結合分子之治療功效。膽固醇及脂質概況可使用市售套組藉由比色分析、氣液層析或酶方式測定。醫藥組合物在另-態樣中，本發明提供—種含有本發明之— 組WK9結合分子（例如，單株抗體或其抗原結合部分）連同醫樂學上可接受之載劑_起調配的組合物(例如醫藥组八物）。該等組合物可包括一種咬— ° ί

£ V 不同）結合分子。舉例而士，種或兩種以上例5本發明之醫藥組合物可包含一組與把抗原上之不同抗原決定基結合或具有體或藥劑。饲，古性的抗本發明之醫藥組合物亦可組合投與。舉例而言，組合療法;藥劑膽固醇劑組合之抗_PCSK9抗體。可用於组種-他降劑的實例以下更詳細描述於關於本發明之中之治療分中。 4知明之樂劑之用途的部如本文所用之，，醫藥學上可接受容之任何及所有溶劑、分散介質、生理學上相菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類=卞、抗細菌劑及抗真靜脈内投與、肌肉内投與 "栽劑。該載劑應適於投與或表皮投與（例如藉由 :與、非經腸投與、脊椎活性化合物可塗有# 3项注）。視投藥途徑而定， J 1有保護化合物免受及其他自然條件之作用的材料。匕使化“勿失活之酸本發明之醫華仆八札_ “"包括-或多種醫藥學上可接受之 I30427.doc -68- 200906439 鹽。"醫藥學上可接受之鹽，，係指保留母化合物之所要生物活性且並不賦予任何不當毒理學效應之鹽（例如參見Berge, S.M等人，1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括源自以下各物之鹽：無毒無機酸’諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫漠酸、氣碘酸、亞磷酸及其類似物；以及無毒有機酸，諸如脂族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族磺酸及芳族磺酸，及其類似物。鹼加成鹽包括源自以下各物之鹽：驗土金屬’諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物；以及無毒有機胺，諸如N，N'-二苄基乙二胺、N-曱基葡糖胺、氣普魯卡因（chloroprocaine)、膽驗、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及其類似物。本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫納、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；油溶性抗氧化劑，諸如棕摘酸抗壞血自旨、丁基化經基茴香喊（BHA)、丁基化經基甲苯（BHT)、卵鱗脂、沒食子酸丙酯、α_生育酚及其類似物；及金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。可用於本發明之醫藥組合物中之合適水性及非水性载劑的實例包括水、乙醇、多元醇（諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物）及其合適混合物、植物油（諸如橄禮油）及可注射之有機酯（諸如油酸乙酯）。可（例如）藉由使用塗覆材料 130427.doc -69- 200906439 (諸如卵私脂)、在分散液之狀況下藉使用界面活性劑來維持適當流動性/、斤要粒徑及藉由二等組合物亦可含有佐劑’諸如劑及分散劑。可經由前述滅菌程序及㈣礼化舰真菌劑(例如，酸酯、氯;醇各=: :二=似物)來確保防止微生物存在。亦： = :::，諸如糖、氯化納及其類似物。此二射醫料式之延長吸收可藉由包括如單硬脂酸紹及明勝)來達成。收之城堵醫樂學上可接受之載劑包括無菌水性溶液或分散液，及用於即時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。該等用於醫藥活性物質之介質及藥劑的用途為此項技術中： ★除非任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容，否則預期其在本發明醫藥組合物中使用。補充性活性化合物亦了併入5亥專組合物中。 β療”'且口物通常在製造及儲存條件下必須為無菌且穩定的。該組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或其他適於以it構。載劑可為溶劑或分散介f，含有 (例士）水6酉子、多兀醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二類似物）及其合適混合物。可（例如）藉由使用諸如印件月曰之、上層’藉由保持所要粒徑（在分散液之狀況下），及藉由使用界m剧來保持適當流動性。在許多狀況下，組合物中可$ 4壬笙，寻張劑，例如糖、多元醇（諸如甘露糖醇、山4糖醇)或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在該 130427.doc -70. 200906439 組合物中包括延遲吸收達成。之藥劑（例如單硬脂酸鹽及明膠）來

…菌可注射溶液可藉由將活性化合物以所要量在適當溶劑中與一種或一组F ,_、 ^ ' 斤列舉之成份合併（若需要）隨後進行滅囷微過滤來製储。—加_二一 +表1甭叙而言，分散液係藉由將活性化 :物併入無菌媒劑中來製備’該無菌媒劑含有驗性分散介 =及來自上文所列舉之彼等成份的所要其他成份。在用於 j備：菌可庄射洛液之無菌粉末的狀況下，製備方法為真 :乾刼及冷凍乾燥(凍乾)’其產生活性成份加上來自其先前經無菌過濾之溶液的任何另外所要成份的粉末。可與載劑材料组人以$ 4 以產生早一劑型之活性成份的量應視所治療之個體及特定招蕴婼> 〇〇技梁杈式而&。可與載劑材料組合以 f生早:劑型之活性成份之量將一般為產生治療效應之組 σ物之里。—般而言’以100%計’此量將為約0.01%至約成份’約〇.1%至約7()%，或約W活性成份與醫樂學上可接受之載劑組合。調整給藥方案以提供最佳所要反應（例如治療反應）。舉 :而言，可投與單次劑量’可隨時間投與分成若干次之劑，旦或可如治療情形之緊急狀態所指示按比例減少或增加背J 1將非I腸組合物調配成易於投與且劑量均一之單位劑型為尤其有利的。如本文所用之單位劑型係指適用作用於待治療個體之單-劑量的物理離散單位；各單位含有經计异以產生所要治療效應之預定量的與所要醫藥載劑缔合之活性化合物。本發明之單位劑型之規格由活性化合物： 130427.doc •71 - 200906439 獨特特徵及待達成之特定治療效應，及在混配該活性化合、用於療個體之敏感性的技術中之固有限制規定且直接視上述因素而定。 ί 為了投與抗體，劑量在每公斤宿主體重約〇〇〇〇1至1〇〇 w ’且更通常0·01至5 mg之範圍内。舉例而言，劑量可為每公斤體重0.3 mg、每公斤體重i mg、每公斤體重3叫、 ^公斤體重5 mg或每公斤體重1〇 mg，或在每公斤⑽叫範圍内。例示性治療方案需要每週投藥-次，#兩週投藥 2 ’每三週投藥一次，每四週投藥一次，每月投藥一次，母一個月投藥一次或每三至六個月投藥一次。本發明之 CSK9'.、a合分子之給藥方案包括每公斤體重靜脈内投與ί mg或3 mg，其中該抗體係使用以下給藥時程中之一者給予’每四週6次劑量’隨後每三個月；每三週；每公斤體重 3 mg—次，隨後每三週每公斤體重丨在些方法中，同時投與兩種或兩種以上具有不同結合特異性之結合分子（例如單株抗體），在該狀況下，所投與之各抗體之劑罝處於指定範圍内。pcSK9結合分子一般分多人才又與。單一劑置之間的時間間隔可為（例如）一週、一個月—個月或一年。如藉由量測患者pcSK9結合分子之血液含量所指示’時間間隔亦可不規則。在一些方法中，調整劑量以實現NSW結合分子之血聚濃度為約^000 Hg/ml且在一些方法中為約25_3〇〇 gg/mi。或者’ PCSK9結合分子可以持續釋放調配物之形式投與，在該狀況下，需要之投藥頻率較低。劑量及頻率視 130427.doc -72- 200906439 PCSK9結合分子在患者體内之半衰期而變化。—般而古， =體展示最長半衰期，隨後為人源化抗體、擬人化抗豆、肷合抗體及非人類抗體。投藥之劑量及頻率可視治療為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，歷經較長時树對不頻繁之時間間隔投與相對較低之劑量。一此患者在其餘生t持續接受治療。在治療性應时，有時需: 相對較短之時間間隔下相減緩或終止或直至串者展二二:心直至疾病進程得以且1思者展不疾病症狀部分或完全改善。直後，可向患者投與預防性方案。 ” 本發明之醫藥組合物中活性成份之實際劑量含 ^獲得有效達成_定患者、組合物及投藥模式之療反應，而對串去主、 α 含量庫η:、有^的活性成份之量。所選劑量勺/夕種樂物動力學因素而定，該等藥物動力學因素 :·二:二，發'之特定組合物或其酿、鹽或醯胺的活、、Λ、* 又条日寸間，所用特定化合物之***速率. 化二::續%間’與所用特定組合物組合使用的其他藥物、及/或材料；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀 I::康狀況及先前醫療病史…學技術中所熟知:類狀4月PCSK9結合分子之，，治療有效劑量π可導致疾病症 :欲重程度減輕(例如，血浆膽固醇減少或 = ::狀減輕)、無疾病症狀時期之頻率及持續時間增= 止由於疾病折磨引起之損傷或傷殘。 θ力戍防本^明組合物可藉由―或多種投藥途徑使用此項技術中 130427.doc -73 - 200906439 已知之多種方法中的—或多投藥途徑及/或投藥模式：：。如熟練技工將瞭解’ —合分子之投藥果而變化。本發明腹膜内、皮下、脊椎啖 '肌肉内、皮内、 ,. 隹或〃、非經腸投藥途徑（例如藉由-、主射或輸注）。如本文所用之短狂（Η鞛由庄射 A Mj ^ 4-m a ^ s ° A腸投與”意謂除經腸投藥及局料㈣外，通常藉由㈣之投_心限於)靜脈内、肌肉内、動脈内、勒内、囊内。内、皮内、腹膜内、經氣管心醎下、蛛網膜下、脊椎内、硬膜、關節内、囊貪稚内、硬胰外及腦幹内注射及輸注。或者，本發明之PCSK9結合分子可藉由諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑之非經腸途徑，例如鼻内、經口、經***、經直腸、舌下或局部投與。 j活性化合物可與將保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備’該等載劑諸如控制釋放調配物’包括植入物、經皮貼片及微囊化傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。該等調配物之許多製備方法均已取得專利或通常為熟習此項技術者已知。例如參見， Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems > J. R. Robinson編，Marcel Dekker，Inc·，New York，1978。可使用此項技術中已知之醫藥裝置投與治療組合物。舉例而言’在一實施例中’本發明之治療組合物可使用無針皮下注射裝置投與’諸如美國專利第5,399,1 63號；第 5,383,85 1 號；第 5,3 12,335號；第 5,064,413號；第 4,941，88〇 130427. doc -74- 200906439 號；第4,79G，824號或第4,596,556號所示之裝置。適用於本發明之熟知植入物及模組的實例包括：美國專利第 4,487,603號’其展示_種用於以控制速率分配藥物之可植入式微輸注泵；美國專利第4,偏，194號，其展示—種用於經由皮膚投與藥物之治療裝置；美國專利第4,447,233號，、其展不一種用於以精確輸注速率傳遞藥物之藥物輸注泵；吳國專利第4,447,224號’其展示—種用於㈣藥物傳遞之可變流速可植人式輸注設備；美國專利第4,439，196號，其展示-種具有多腔隔室之滲透性藥物傳遞系統；及美國專利第4,475，196號，其展示—種渗透性藥物傳遞系統。此等專利以引用的方式併入本文中。多種其他該等植入物、傳遞系統及模組為熟習此項技術者已知。在某些實施例中，可調配本發明之pcsK9結合分子以確保在活體内適當分布。舉例而言，血腦障壁(bbb)排除許多高親水性化合物。為確保本發明之治療化合物跨過bbb(若需要），可將該等化合物(例如)調配於脂質體中。就製造脂質體之方法而t，例如參見美國專利第4,522,8u號、第 5’374,548唬及第5,399,331號。脂質體可包含經選擇性傳輸至特定細胞《器官從而增@乾向藥物#遞之一或多個部分 (例如參見 V. V，Ranade，1989 j. CUn Pharmac〇i 29:685)。例示性靶向部分包括葉酸鹽或生物素(例如參見l〇w等人之

美國專利第5,416,016號）；甘露糖苷（Umezawa等人，1988 Biochem. Biophys. Res· C〇mmun 153:1〇38);抗體（pG B1〇eman等人’ 1995 FEBS Leu 357:i4〇 ; m 〇職丨5等人， 130427.doc •75- 200906439 1995 Antimicrob, Agents Chernother. 39:180);界面活性劑蛋白 A受體（Briscoe等人，1995 Am. J. Physiol. 1233:134); pl20(Schreier等人，1994 J. Biol. Chem. 269:9090);亦參見 K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. K i 11 i ο η，I · J · F i dl e r，1 9 9 4 I mm u η o m e t h o d s 4:2 7 3。本發明之用途及方法本文所述之PCSK9結合分子具有活體外及活體内治療效用。舉例而言’此等分子可投與至培養物中（例如活體外或活體内），或個體體内（例如活體内）之細胞中以治療、預防或診斷多種病症。PCSK9結合分子尤其適於治療具有问膽固醇或與咼膽固醇有關之病況，例如脂質失調症 (例如，高脂質血症，第】型、第„型、第ΙΠ型、第IV型或第 V型馬脂質血症、繼發性高甘油三a旨血症、高膽固醇血症、黃瘤病、膽固醇乙醯基轉移酶缺乏）或處於高膽固醇或上述 ^高膽固醇有關之病況的風險中之人類患者。pcsK9結合分子亦適於治療患有動脈硬化性病症（例b，動脈粥樣硬化)、冠狀動脈疾病、心血管疾病之人類患者及處於此等病 =風險中之患者，例如由於存在一或多種風險因細如，面血壓、吸煙、糖尿病、肥胖或高同型半胱胺酸血症）。當PCSK9結合分子與另一藥劑一起投與時，兩者可以任可順序連續投與或同時投與。一竑 —貫轭例申，將PCSK9 、-口 5刀子投與亦接受第二藥劑如， ^ 政π共 —降膽固醇劑）治療豆。降膽固醇劑包括包括士他汀添丨丨、玖缺 η 卩制素、膽汁酸錯隔 "J於馱、纖維酸衍生物及長鏈1 一緩酸。士他汀抑制 130427.doc -76 - 200906439 素藉由阻斷膽固醇生物合成中之關鍵酶HMGCoA來抑制膽固醇合成。士他>丁抑制素之實例為洛伐他汀（l〇vastatin)、普伐他汀（pravastatin)、阿托伐他汀（atorvastatin)、西立伐他汀（cerivastatin)、氟伐他丁（fluvastatin)及斯伐他汀 (simvastatin)。膽汁酸錯隔劑中斷膽汁酸自腸至肝臟之再循環。此等藥劑之實例為消膽胺及鹽酸考來替潑（c〇lestip〇i hydrochloride)。纖維酸衍生物之實例為安妥明（cl〇fibrate)

及吉非羅齊（gemfibrozil)。長鏈α，ω_二羧酸描述於（例如）Bisgaier 等人，1998，J. Lipid Res. 39:17_3〇 ; w〇 98/30530 ;美國專利第 4,689,344號；WO 99/001 16 ;美國專利第5,756,344號；美國專利第3,773,946號；美國專利第 4,689,344號；美目#利第4,689,344號；美_專利第 4,689,344號；及美國專利第3,93M2^);趟（例如參見美國專利第4,711，896號；美國專利第5,756,544號；美國專利第6,506,799號）。長鏈醇之峨酸鹽（美國專利第4,613,別號）及嗤烧二酮衍生物（美國專利第4,287,2〇〇號）亦可用於降低膽固醇含量。 ' 4穴』反王励冋結果（例如，膽固醇之減少大於兩種藥劑組合使用所預期之減少）。在一些實施例中’ PCSK9、结合分子與士他汀抑制素之組合療法產生協同結果（例如，膽固醇之協同減少）。在—些個體中’此可能允s午實現所要膀同随人旦★丄从 |戈腊固知含里之士他汀抑制素劑量減少。 PCSK9結合分子適用於對另一降膽固醇劑治療具不耐性 130427.doc •77· 200906439 之個體，或另-降膽固醇劑治療已產生之結果不足之個體 G彳如 '.、工士他汀抑制素治療所經歷之減少不體）。本文所述之PCSK9結合分子可投與具有高膽固醇之個體 (例如，總血漿膽固醇含量w00mg/dl或更高之人類個體， LDL-C含量為1 60 mg/d丨或更高之人類個體）。入$ 一實施例中，本發明之結合分子可用於偵測pcsK92 3里。此可（例如）藉由使樣本（諸如活體外樣本）及對照樣本與PCSK9結合分子在允許結合分子與pcsK9之間形成複合物的條件下接觸來完成。偵測樣本及對照物中分子^ PCSK9之間所形成的任何複合物且將其進行比較。舉例而 a，可使用本發明之組合物來進行此項技術中熟知的標準偵測方法，諸如ELISA及流式細胞計數檢定。因此在一態樣中，本發明進一步提供偵測樣本中 PCSK9(例如，hPCSK9)之存在或量測pcSK9之量的方法，該等方法包含使樣本及對照樣本與本發明2PCSK9結合分子（例如，抗體）在允許抗體或其部分與pcSK9之間形成複合物的條件下接觸。接著偵測複合物之形成，其中樣本與對照樣本之間複合物形成之差異指示樣本中存在PCSK9。由本發明組合物及使用說明書組成之套組亦在本發明範疇内。該套組可進一步含有至少一種另外試劑，或本發明之一或多種額外抗體（例如，具有與靶抗原上不同於第_抗體之抗原決定基結合之互補活性的抗體）。套組通常包括指示忒套組之内容物的預期用途之標籤。術語標籤包括提供 130427.doc 78· 200906439 於该套組上或與其一起提供任何文字或記錄材料。或以另外方式伴隨該套組的本發明已加以充分描述，豆，、由下實例及申請專利範 ^明’ β等實例為說明性的且不欲進—步限制本發明。熟習此項技術者僅使料規實驗即可瞭解或能發現本文中所述之特定程序的諸各 ;省夕均4物。該等均等物在本發明及申請專利範圍之範疇内。本 “ 令〒#累全文引用之包括授權專利及公開專利申請牵之4 > 士系之所有參考文獻的内容因此以引用的方式併入。實例實例1·藉由噬菌體呈現產生人類抗體對於針對hPCSK9之抗體的產生而言，進行M〇rph〇Sys HuCAL GOLD®唾菌體呈現庫之選擇。HuCAL G〇LD⑨為基於HuCAL®概念之Fab庫，其中所有六個cdr為多樣化的，且其採用CysDisplayTM技術將Fab片段連接至噬菌體表面 (Knappik等人，2000 J. Mol. Biol. 296:57-86 ; Krebs等人， 2001 J Immunol. Methods 254:67-84 ; Rauchenberger等人， 2003 J Biol Chem. 278(40):3 8194-3 8205 ； WO 01/05950, Lohning, 200 1) ° 嗔粒援救（Phagemid rescue)、噬菌體擴增及純化使HuCAL GOLD®庫在含有34 μ§/ιη1氯黴素及1%葡萄糠（2 xYT-CG)之2xYT培養基中擴增。在以〇,5之〇〇600_的超噬菌體輔助噬菌體感染後（37°C下30分鐘，無震盪；37°C下30分鐘，以25 0 rpm震盪）’將細胞旋轉沈降（4120 g ; 5 min ; 4°C)， I30427.doc -79- 200906439 再懸浮於2 x YT/34 pg/ml氯黴素/5〇 μ§/ιη1康黴素 (kanamycinVO.25 mM IPTG中且在22。〇下生長隔夜。將噬菌體自上清液PEG-沈澱兩次，再懸浮於pBS/2〇%甘油中且儲存於-80°C下。在兩輪淘選之間如下進行噬菌體擴增：將對數生長中期大腸桿菌TG1細胞以經溶離之噬菌體感染且塗至補充有葡萄糖及34 pg/ml氯徽素之LB瓊脂（LB_CG培養板）上。在 30°C下培育隔夜之後，將TG1菌落刮離瓊脂培養板且將其用於接種2XYT-CG直至達到0.5之〇D ，曰、天★如从从〜nm，且添加超噬菌體輔助噬菌體以如上文所述進行感染。以 HuCAL GOLD® 淘選為選擇識別hPCSK9之抗體’應用兩種不同淘選策略。總體上，將HuCAL GOLD®噬菌體-抗體分為包含不同vh主導基因組合之4個集合（集合1 : VH1/5 λκ，集合2 : VH3 λκ，集合3 : VH2/4/6 λκ，集合4 : VH1-6 λκ)。使此等集合個別經受三輪對於直接塗覆至Maxisorp培養板上之人類 hPCSK9的固相淘選及另外三輪對於經結合生物素之 hPCSK9的溶液淘選。第一淘選變化形式為針對hPCSK9之固相淘選：在4。(：下將Maxisorp培養板（F96 Nunc-免疫培養板）之2個孔各自塗覆3 00 μΐ 5 Hg/ml hPCSK9隔夜。將經塗覆之孔以350 μΐ PBS 洗滌2次且在室溫下在微量滴定培養板震盪器上以350 μΐ 5% MPBS阻斷2小時。對於每一次淘選而言，將約1〇13 HuCAL GOLD®噬菌體-抗體以等體積之PBST/5% ΜΡ在室溫 130427.doc -80- 200906439 下阻斷2小時。阻斷後，將經塗覆之孔以350 μΐ PBS洗務2 次。將300 μ1經預阻斷之HuCAL(}〇LD®噬菌體-抗體添加至各經塗覆之孔中且將其在室溫下在震盪器上培養2小時。藉由添加五-人350 μΐ PBS/0,05% Tween進行洗滌，隨後再以 PBS 洗滌四次。以每孔 3〇〇JilK1〇mMTris/HcipH8*22〇 mM DTT進行噬菌體自培養板之溶離歷時1 〇分鐘。將噬菌體溶離物添加至14 m丨大腸桿菌TG1中，將其在”它下在2YT培養基中生長至〇 6_〇 8之〇〇6⑼且在下在塑膠4 g中無震盪培育45分鐘以供噬菌體感染。在Μ⑼ rpm下離心1〇分鐘後，將細菌離心塊各自再懸浮於 ^ 2 XYT培養基中，塗於2xYT_CG瓊脂培養板上且在3〇它下培育隔夜。接著自培養㈣離菌落且如上文所述進㈣菌體援救及擴私。根據第一輪之方案對直接塗覆之hpcsK9進行第二及第三輪g]相淘選’但在絲程序中嚴格性增加。第二淘選變化形式為針對經結合生物素人類hPCSK9之溶液淘選：對於溶液淘選而言，使用與办― M-280(Dynai)偶合之經結合生物素，應用以下方案：在4°C下將試管以1 5州於pBs中之牛血清白蛋白阻斷隔夜。將· μ1抗生蛋白鏈菌素塗覆之磁 = Dynabeads M_28〇(Dynal)以 2〇〇 μι pBs 洗蘇丨次且再懸浮於 200 μΐ ixchemiblocker(稀釋於 lxPBS 中）中。在 4。〇下，在預阻斷之s式官中進行珠粒的阻斷隔夜。將用於各淘選條件之稀釋於_ μΐ PBS中的耗體與5⑽μ1 2xChemibi。如、/ 〇_ 1 /〇 Tween在室溫下混合j小時（旋轉器）。進行兩次嗟菌體 130427.doc -81 - 200906439

之預吸附··將50 μΙ經阻斷之抗生蛋白鏈菌素磁珠粒添加至經阻斷之嗟g體中且在室溫下在旋轉器上培育3()分鐘。經由磁性裝置（Dynal MPC_E)分離珠粒後，將噬菌體上清= (約1 ml)轉移至新的經阻斷之試管中且對5〇經阻斷之珠粒重複預吸附30分鐘。接著，將2〇〇 „“經結合生物素之 hPCSK9添加至新的經阻斷之15…試管中的經阻斷之噬菌體中且在室溫下在旋轉器上培育丨小時。將1〇〇…經阻斷之抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒添加至各淘選噬菌體集合中且在室溫下在旋轉器上培育1〇分鐘。將與經結合生物素之 hPCSK9結合的噬菌體固定至磁性珠粒上且以磁性粒子分離器（Dynal MPC-E)收集。隨後使用旋轉器將珠粒於 PBS/0.05% Tween中洗滌7次’隨後再以PBS洗滌3次。藉由向各試管中添加300 μ1於1〇 Tris/HCl pH8中之20 mM DTT來進行噬菌體自Dynabead之溶離歷時l〇分鐘。藉由磁性粒子分離器移除Dynabead且將上清液添加至生長至 0.6 0,8之〇D600nm的14 ml大腸桿菌TG-1培養物中。隨後將珠粒以200 μΐ PBS洗滌1次，且將PBS連同另外移除之噬菌體添加至14 ml大腸桿菌丁①丨培養物中。對噬菌體感染而言，將培養物在50 ml塑膠試管中在37°C下無震盪培育45分鐘。在5000 rpm下離心1〇分鐘後，將細菌離心塊各自再懸浮於 5〇〇 μΐ 2χΥΤ培養基中，塗於2xYT-CG瓊脂培養板上且在 3〇 C下培育隔夜。接著自培養板刮離菌落且如上文所述進行噬菌體援救及擴增。根據第一輪之方案對經結合生物素之hPCSK9進行第二 130427.doc •82· 200906439 及第三輪溶液淘選，其中例外為洗務程序中之嚴格性增力口。可溶性Fab片段之次選殖及表現將所選HuCAL GOLD® °蜜粒之Fab編碼***物次選殖至表現載體pMORPH®X9—Fab_FH中以促進可溶性Fab之迅速及有效表現。出於此目的，將所選純系之質體DNA經;Thl及五coRI消化，藉此切除Fab-編碼***物（ompA-VLCL及 phoA-Fd)，且選殖至經Xbal/EcoRI消化之表現載體 pMORPH®X9_Fab—FH中。由此載體表現之Fab攜帶兩個用於偵測及純化之C末端標記（分別為FLAGTM& 6xHis)。

HuCAL GOLD® Fab抗體在大腸桿菌中之微表現使用在將所選擇之Fab次選殖至pMORPH®X9_Fab_FH表現載體後獲得之對氣黴素具有抗性之單一菌落來培育每孔含有100 μΐ 2xYT-CG培養基之無菌96孔微量滴定板之各孔且在37°C下生長隔夜。將5 μΐ各大腸桿菌TG-1培養物轉移至經每孔補充有34 pg/ml氣黴素及0.1%葡萄糖的1〇〇 μΐ 2χΥΤ 培養基預填充之新鮮、無菌96-孔微量滴定板中。將微量滴定板在30°C下在微板震盪器上以400 rpm震盪下培養直至培養物略顯混濁（約2-4小時），且〇D6qd nm為約0.5。向此等表現培養板中每孔添加20 μΐ補充有34 pg/ml氯黴素及3 mM IPTG(異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷）之2xYT培養基（最終濃度為0.5 mM IPTG)，將該等微量滴定板以透氣性膠帶密封，且將培養板在30°C下以400 rpm震盪下培育隔夜。全細胞溶解產物（BEL萃取物）之產生：將細菌細胞離心塊 130427.doc ' 83 - 200906439 在乾冰上冷康且接著再懸浮於含有1 mg/ml溶菌酶、2 mM MgCl2及benzonase之PBS中且在震盪器上培育1小時。藉由添加1 °/。最終濃度B S A來阻斷溶解產物且將清潔溶解產物添加至經適當塗覆之ELISA培養板中以評定與PCSK9之結合。將BEL萃取物用於藉由ELISA進行之結合分析。酶聯免疫吸附檢定(ELISA)技術在4°C下將於PBS中之5 pg/ml人類重組hPCSK9塗覆於384 孔Maxisorp培養板（Nunc-免疫培養板）隔夜。塗覆後，將孔以PBS/0.05% Tween(PBS-T)洗滌一次且以PBS洗滌2次。隨後，將孔以含有2% BSA之PBS-T在室溫下阻斷2小時。平行地將15 μΐ BEL萃取物及15 μΐ含有2% BSA之PBS-T在室溫下培育2小時。將經阻斷之Maxisorp培養板以PBS-T洗；：條3 次，隨後將10 μΐ經阻斷之BEL萃取物添加至孔中且將其在室溫下培育1小時。為偵測初級Fab抗體，應用以下二次抗體：鹼性磷酸酶（AP)結合之AffiniPure F(ab')2片段、山羊抗人類、山羊抗小鼠或山羊抗綿羊IgG(Jackson Immuno Research)。為债測AP-結合物，根據製造商說明書使用如 AttoPhos(Roche)之螢光受質。在所有培育步驟之間，將微量滴定板之孔以PBS-T洗滌3次且在最後與二次抗體一起培育之後洗滌3次。可使用Thermo Multiskan培養板讀取器量測榮光。

HuCAL GOLD® Fab抗體在大腸桿菌中之表現及純化由pMORPH®X9_Fab—FH編碼之Fab片段在TG-1細胞中之表現係在震盪器燒瓶培養物中使用750 ml補充有34 pg/ml 130427.doc -84- 200906439 氣黴素之2χΥΤ培養基進行。將培養物在30°C下震盪直至〇D600nm達到0.5。藉由在30°C下添加〇·75 mM IPTG誘導表現歷時20小時。使用溶菌酶及藉由Ni-NTA層析（Qiagen， Hilden, Germany)分離之Fab片段使細胞破裂。可藉由UV-分光光度計（Krebs 等人 J Immunol Methods 254，67-84 (2001))測定蛋白質濃度。實例2 :藉由LCDR3及HCDR2序列盒平行交換使所選擇之抗-PCSK9 Fab親和力成熟用於親和力成熟之Fab庫的產生為了增加所鑑別抗PCSK9抗體之親和力及抑制活性，使 Fab純系經歷親和力成熟。出於此目的，藉由序列盒突變誘發使用三核苷酸引導之突變誘發使CDR區最優化（Virnekas 等人Nucleic Acids Res 22, 5600-5607，1994)。以下段落簡要描述可用於成熟庫選殖及Fab最優化之方案。將來自表現載體pMORPH®X9—Fab_FH之Fab片段選殖至噬粒載體pMORPH®25中（美國專利6,753，136號）。平行應用兩種不同策略以使母Fab之親和力及功效最優化。產生噬菌體抗體Fab庫，其中6個所選擇之突變候選物 (”母"純系）中之LCDR3係由個別輕鏈CDR3序列之譜系置換。平行地，各母純系之HCDR2區經個別重鏈CDR2序列之譜系置換。親和力成熟庫係經由標準選殖程序及多樣化純系至電感文態大腸桿菌τοριορ細胞（Invitr〇gen)之轉型而產生。如實例1所述製備Fab呈現噬菌體。可建立對應於各庫之成熟集合且在隨後選擇過程中保持獨立。 130427.doc -85- 200906439 成熟淘選策略分別如實例1針對經結合生物素之hPCSK9的溶液淘選所述，使用4個抗體集合對溶液中之經結合生物素之重組 hPCSK9進行3輪淘選。藉由按淘選輪次減少經結合生物素之抗原，藉由延長洗條步驟及藉由添加未結合生物素之抗原來增加選擇嚴格性以供解離速率（off-rate)選擇。用於偵測細菌溶解產物中hPCSK9結合Fab之基於電化學發光（BioVeri)之結合分析大腸桿菌溶解產物（BEL萃取物）中最優化Fab抗體與 hPCSK9 之結合係以 BioVeris M-SERIES® 384 分析儀 (BioVeris，Europe, Witney, Oxforfshire, UK)來分析。將 BEL 萃取物稀釋於檢定緩衝液（PBS/0.05% Tween 20/0.5% BSA) 中用於BioVeris篩檢。使經結合生物素之hPCSK9與抗生蛋白鏈菌素塗覆之順磁性珠粒偶合，將抗人類（Fab)'2(Dianova) 使用 BV-tagTM(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire, UK)以釕標記。將此二次抗體添加至與hPCSK9偶合之珠粒中，隨後以BioVeris M-SERIES® 3 84分析儀進行量測。對來自 BioVeris篩檢之採樣數（hits)進行序列分析以鑑別Fab純系。將所選擇之Fab抗體次選殖為IgGl格式。使用溶液平衡滴定（SET)來測定皮莫耳親和力對於KD測定而言，使用Fab之單體部份（至少90%單體含量，藉由分析 SEC 分析；Superdex75,Amersham Pharmacia)。溶液中基於電化學發光（ECL)之親和力測定及數據評估可基本上如Haenel等人，2005所述進行。使恆定量之Fab與溶 130427.doc -86- 200906439 液中不同濃度（連續3n稀釋）之重組hPCSK9平衡。添加與順磁性珠粒（M-280 Streptavidin，Dynal)偶合之經結合生物素之 hPCSK9及 BV-tagTM(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire， UK)標記之抗人類（Fab)’2(Dianova)且將混合物培育30分鐘。隨後，經由ECL偵測使用M-SERIES® 384分析儀 (BioVeris Europe)定量未經結合之Fab的濃度。基本上如上文所述進行溶液中另一物種（例如，黑猩猩或食蟹猴）之PCSK9的親和力測定，以黑猩猩或食蟹猴PCSK9 置換人類PCSK9。為偵測游離Fab，使用與順磁性珠粒偶合之經結合生物素之hPCSK9。根據Haenel等人來計算親和力 (2005 Anal Biochem 339，182-184)。實例3.藉由噬菌體呈現產生抗-PCSK9Fab 使用以下噬菌體呈現技術產生抗PCSK9 Fab。將經純化之人類PCSK9以PE04生物素（Pierce, 213 29)使用製造商方案使用20:1莫耳比之生物素：PCSK9來標記。低莫耳比確保所標記蛋白質的有限修飾且PE04連接子之選擇使生物素部分與蛋白質分離且增強經結合生物素之蛋白質之總體親水性。使用經結合生物素之人類PCSK9來塗覆Dynal M280抗生蛋白鏈菌素珠粒，且使用標準淘選技術對Morphosys Hucal庫進行3輪淘選。在三輪迭代淘選後，將經彙集之第3 輪質體DNA純化且以限制酶EcoRI及Xbal消化。藉由瓊脂糖凝膠電泳分離質體DNA且將含有兩個基因區段（免疫球蛋白重鏈（VH/CH)及輕鏈（VL/CL))之1.5 kB***物切除且純化。將此1.5 kB片段（Fab***物）次選殖至]viorphosys表現載 130427.doc -87- 200906439

體pMORPHX9—FH中且轉型為電感受態TG-1細胞。揀選個別菌落且製備母板（master plate)。使自母板接種之子板 (Daughter plate)再生長於低葡萄糖介質中且藉由在IPTG存在下培養隔夜誘導Fab表現。將細胞離心塊冷凍，以溶菌酶溶解且藉由ELISA在經中性鏈親和素塗覆之孔（陰性對照僅有中性鏈親和素）上塗覆有PEO-經結合生物素PCSK9之培養板上評估經清潔溶解產物。按照將母板再劃線於瓊脂培養板且揀選3個個別菌落進行再測試來對ELIS A陽性進行再測試。亦製備來自PCSK9純系之質體DNA用於DNA定序。在以IPTG誘導之公升規模之培養物中製備來自獨特純系之Fab蛋白質且接著連續藉由IMAC及尺寸排外層析法純化。藉由與SDS-PAGE偶聯之Bradford檢定測定蛋白質濃度。實例4 : PCSK9競爭性ELISA 使用以NHS-PE04-生物素（Pierce, 2 1329)標記之經純化之人類PCSK9來塗覆經中性鏈親和素塗覆之Nunc Maxisorp 培養板。以BSA阻斷非特異性結合之後，將經PCSK9塗覆之孔首先以飽和濃度之抗人類PCSK9 Fab(陽性對照Fab)或僅以緩衝液培育。陽性對照Fab(或單獨緩衝液）結合之後，向單獨緩衝液及抗人類PCSK9 Fab處理之孔中皆添加替代抗人類PCSK9 Fab(測試Fab)。培育及洗滌步驟之後，使用過氧化酶結合之山羊抗人類輕鏈抗體與3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺（TMB)受質之混合物偵測與結合培養板之人類PCSK9 結合的抗體片段。與單獨陽性對照Fab相比，競爭人類 PCSK9上之類似或重疊結合部位的Fab未能弓|發額夕卜結合 130427.doc -88- 200906439 信號（亦即’人類PCSK9上之類似或重疊邹位的競爭結合）。或者’獨立於陽性對照Fab結合之Fab展示如由增加iTMB 受質轉化程度反映的增加之結合信號（亦即，Fab與人類 PCSK9之非競爭性結合）。使帛此策< ’基於成員阻斷彼此與人類PCSK9結合之能力將Fab分組。以！ - 作為陽性對照Fab之初始特徵化將抗體分為兩組：受m抑制 (組1)或不受H1抑制（組2)。其他結合競爭實驗表明各組内之 Fab抑制彼組其他成員之結合。自此等研究看出依據不與 1 組1或組2 Fab競爭來鑑別第三組Fab(組3)。將Fab分組用作測定何種抗-PCSK9 Fab表現結合親和力、中斷hpcSK9/ LDL-R之能力及對HepG2細胞之作用的特徵之指導。接著使用諸如DXMS之生物物理技術如實例4所說明將人類pcSK9 上具有所要活體外特性之Fab的精確結合部位（諸如H丨）定位。實例5 :抗-PCSK9 Fab之功能分析在此實例中，檢驗HL·抗-PCSK9 Fab之功能特性，包括結 ^ -：合親和力，中斷hPCSK9/LDL-R之能力及對HepG2細胞之作用。 1.結合親和力在25°C下在T100儀器上進行Biacore結合檢定。將 HBS-P+Ca(10 mM HEPES，150 mM NaC卜 pH 7.4 , 0.005% P-20 , 2 mM CaCl2)用作電泳緩衝液。對於固定而言，在即將使用前將1^€8反9以3〇4§/1!11^稀釋至？115.5乙酸鹽緩衝液中。按照標準胺偶合方案將約200 RU hPCSK9固定於CM5 130427.doc -89- 200906439 感應晶片（S系列）上。將Fab溶液（0 - 20 nM，稀釋於電泳缓衝液中）以30 μΐ/min之流動速率注射於PCSK9及參照表面 (空白胺偶合）上。以60秒注射1 mM NaOH及1 M NaCl使 PCSK9表面再生。使用BIAevluation軟體進行所有數據分析。首先以來自參照細胞之結合曲線，隨後以來自空白電泳緩衝液之結合曲線對結合曲線進行雙參照校正。接著，將數據以1:1結合模型全局分析以求出結合常數尺D(nM)、締合常數（A：a，Ι/Ms)及解離速率常數（&d，1/s)。經測定Hl-Fab展現3.23>cl05(l/Ms)之ka，3.41χl0-3(l/s)之幻及1·05χ10_8 Μ之尺D(圖3)。 2. Η1-抗-PCSK9 Fab 中斷hPCSK9/LDL-R之能力如下進行PCSK9/LDL-R FRET中斷檢定以評定P^U-Fab中斷hPCSK9/LDL-R相互作用之能力。將LDL-R胞外域（Ala 22-Arg 788)(R&D Systems)以銪穴狀化合物（LDL-R-Eu) (Perkin Elmer)標記且將PCSK9純化蛋白質以Alexa Fluor 647 (PCSK9-Alexa)(Invitrogen)標記。檢定緩衝液由 20 mM HEPES (pH 7.0)、150 mM Naa、2 mM CaCl2、0.1% Tween 20及1 mg/ml BSA組成。將Fab與PCSK9-Alexa—起在室溫下預培育30分鐘，隨後添加LDL-R-Eu。PCSK9-ALexa及 LDL-R-Eu之最終濃度分別為8 nM及1 nM。培育2小時後，將培養板在Envision (Perkin Elmer)上以下列設定讀取：在330 nm下激發且在620 nm及665 nm下發射，激發與讀取之間延遲100 pS。在圖4中正規化且報導665 nm下之讀數與620 nm 130427.doc -90- 200906439 下之讀數的比率。如圖4A中所示’ Hl-Fab中斷hPCSK9/LDL-R相互作用。 3，對HepG2細胞之作用使用流式細胞儀量測LDL攝取。將HepG2細胞（ATCC)保持於含有10%(體積）胎牛血清（FBS)之DMEM中。在以 PCSK9 Ab處理前夜，將細胞接種於％孔經朦原蛋白塗覆之 96孔板（BD Biosciences)。將200 nM PCSK9蛋白質與指定濃度之抗-PCSK9 Fab—起預培育30分鐘，隨後添加至細胞中。 PCSK9及Fab處理3小時後’將dil-LDL (Intracel)直接添加至各孔中’直至最終濃度為5pg/ml，且在37°C下5%C02下再培育1小時。將細胞胰蛋白酶化，採集且藉由流式細胞儀 (LSRII，BD Biosciences)量測 dil-LDL陽性細胞。使用 FlowJo 5.7.2軟體分析幾何平均數，將其針對緩衝液對照物正規化且報導於圖4中。亦使用流式細胞儀量測表面LDL(囷4B)。將HepG2細胞姨蛋白酶化’接種於膠原蛋白塗覆之培養板中且在3 7 °C下以 5°/〇 C〇2培育隔夜以允許LDL-R表現恢復。第二天，將pcSK9 蛋白及PCSK9 Fab預混合3 0分鐘，隨後與細胞一起培育4小時。將細胞以（Invitrogen)收集且以驢血清（jackson Immunoresearch Laboratories)阻斷，隨後以家兔抗-人類 LDL-R多株抗體（Fitzgerald)且隨後以APC'结合之驢抗-家兔 IgG抗體（Jackson Immunoresearch Laboratories)染色。洗滌後，將細胞以2%三聚曱醛固定且在BD LSR-II血細胞計數器上進行流式細胞計數分析。使用FlowJo 5.7.2軟體計算幾 130427.doc -91 - 200906439 何平均數之平均值且報導於圖4中。如圖中所示，Hl-Fab使得表面1^[_11含量增加（圖4B)及 Hep2細胞之LDL-攝取增加（圖4〇。實例6 :抗原決定基定位在此實例中，如下使用氘交換質譜分析（DXMS)測定由 Η1 -Fab識別之抗原決定基。 A.材料

蛋白質稀釋劑（H2〇或DsO)為20 mM磷酸鈉（pH 73)以及 150 mM NaCM。中止溶液為於水中之〇·5%(體積）三氟乙酸 (TFA)。所有其他化學物質係購自叫咖，且帆㈣溶劑係購自Fisher Scientific。蛋白質：製備Fab培育物且使其在下培育至少2小時。 B·溶液氫/氘（WD)交換以與文獻中所述類似之設定及類似之方式進行自動h/d 交換質譜分析實驗（Anal. Chem. 2006, 78, 1005_1〇14)。簡言之，將LEAP Technologies Pal HTS液體處理器（LEAp Technologies，Carrboro, NC)用於液體處理操作。藉由製造商編碼之書寫於LEAP外殼内之自動化腳本控制液體處理器。自動儀器容納於保持在下之冷衫内。將用於樣本心增I极、稀、m及战态塔盤中，隨後開始實驗工序。亦將6_埠注射閥及洗務台安置於液體處理器軌道’且分別便於樣本注人層析系統及針筒洗務。層析系統由兩個額外閥、酶柱、逆相截齒 v 又W，慮芯組成，且將分析管柱容納於内部建構之獨立腔主甲且由珀耳帖 130427.doc -92- 200906439 (peltier)堆疊保持於2它下。圖5中說明連接至閥之經固定胃蛋白酶之流體連接及配件、逆相截留濾芯及分析管柱。將閥及官柱組態以便允許線内蛋白質消化、肽脫鹽及逆相層析，隨後將樣本引入質譜儀之電噴霧離子化（ESI)源。操作所需之流體液流係由兩個獨立Agilent HPLC系統（Agilent 1100, Palo Alto, CA)提供。第—HPLC 系（載入泵）以 125 ML/min傳遞於水中之0.05%(體積）三氟乙酸（TFA)。圖5A中說明载入階段之閥位置。在此階段，將樣本自樣本環穿過 I 固疋月蛋白酶濾芯（2 mmx2〇 mm ’由 Pr〇f Virgil w〇〇ds 〇f UCSD友情提供）轉移至逆相截留濾芯（1 mmx8 mm , Michrom Bi〇resources Inc，Auburn，CA)。隨後，切換輔助閥2使得第二HPLC泵（梯度泵）將梯度穿過逆相截留濾芯及分析管柱傳遞至輔助閥3。在此位置將經固定之酶濾芯分離為尾棄物。使輔助閥3程式化以將流體分流為廢棄物歷時預牯4又用於使裝載於截留濾芯上之樣本脫鹽（圖$b)。脫鹽期之/，切換閥以使來自梯度栗之流到達質譜儀之離子源 (在牙過載留濾芯及分析管柱之後，圖5c卜梯度泵以 Μ η、’Λ 55刀釦傳遞0至40%移動相β之梯度（移動相八=水中之0.2 /〇甲酸，乙腈中之〇·2%甲酸)。質譜分析在以V模式操作之QTof副ma GI〇bai (伽⑽，副f〇rd, ^A)上進行液相層析電噴霧離子化聯合質譜分析 S)進行兩種數據依賴性切換實驗以收集 ” 〇虞。曰以達成鑑別線上蛋白水解產生之肽序列之目的。 I30427.doc •93 · 200906439 出於氛化程度測定之目的進行之採集為單獨ms(經_ 400-1 500之 5 s掃描）。 D ·互補氫/氛（h/d)交換實驗使蛋白質（hPCSK9及其前功能部位pD)經受若干締合交換（〇n-exchange)及解離交換（〇ff_exchange)條件，其中預期之淨結果為任何潛在抗原決定基由相對於保護實驗（下文所述）中對照物的氘化程度增加及相對於In_D2〇實驗（下文所述）中對照物的氘化程度降低之標記。氘化（即以氘交換蛋白質上之醯胺氫）為探測蛋白質之結構及功能尤其適用之工具，因為以氣標記不改變經標記蛋白質的結構或功能。氘為氫之同位素，其具有兩倍於氫之質5 ’在® 6中以星號表示。此與將新的部分附於蛋白質上所存在之官能基的其他標記方法形成鮮明對比。 1 ·保護實驗在保護實驗中’藉由將蛋白質在於d2〇中之2〇讀磷酸鈉 (pH 7·3)以及150 mMNaC1中培育隔夜來製備氘化蛋白質溶液。在對照實驗中，將氛化蛋白質以H2〇稀釋且在不同解離交換時段（例如，5分鐘）後添加中止溶液。此後如上文所述以胃蛋白酶線上消化且進行LCMS。藉由以等莫耳量之㈣溶=(未氛化，參見示意圖6,右搁）稀釋氣化蛋白質溶液且支口月15刀|里形成蛋白質（氘化）:Fab複合物從而進行蛋白質Tab複合物之解離交換。形成複合物後，如下文所述處理樣本以供對照。圖6之左攔說明保護實驗之實驗工序，其以氘化順9起 130427.doc -94- 200906439 始 ”氖化”意言胃已藉由將蛋白質在氖緩衝液中培育若干小 :了之時段使蛋白質之酿胺氫經乱置換。如圖6之左欄的第二 :斤說明’Fab與氖化PCSK9蛋白質上其抗原決^基之結合字阻斷抗原決定基區域周圍的部分pcsK9表…面之阻 =亦減少溶劑接近’其對發生氯/氣交換而言為關鍵的。在圖6之左攔的第三列， 5月在未爪化緩衝液中培育氘化 PCSK9/Fab複合物的作用。如圖6所示，溶劑可接近區域之mu上的氣化程度迅速牛低，因為可自由地發生H/D交換。相比較而言，覆蓋表面之阻斷作用所引起的至抗原決定基區域之溶劑接近 d引起Η/D交m此使得抗原決定基區域中之多數氛化得以保存。。可，由將蛋白質Fab複合物切成含有酶之較小片且以質 °曰儀夏測各片段之氛化程度來沿蛋白質序列定位增加程度 2化（標記抗原rn)。此係可能的，因為氣比氫重故氣化^起質量改變。將自片段收集之資訊結合在一起允許導出氘在整個蛋白質序列上之分布。 2 對照因為整個蛋白質序列上之気化程度產生極大變化係歸因於蛋白質結構’及所引起的溶劑可接近性之變化以及對不问胺基酸之間形成的醯胺鍵觀測到之Η/D交換速率差显，所以不可能僅由存在抗原決定基之保護實驗（由圖6之左欄描述)中觀測到的升高之氘化程度來推斷。幸運地，差異實驗中消除氣化程度之天然變化。差異實驗由在㈣存在及不存 130427.doc '95- 200906439 在（對照實驗，圖6之φ攔、π — ^ 之中攔）下汛化程度之量測及氘化差異之計算組成。所觀測到之氛化程度差異純粹歸因於Fab之作用且較大值將指示抗原決定基之存在及位置。 3. In-D2〇實驗此外，可進行圖6右欄中所說明之互補差異實驗（亦即，㈣20實驗）且❹與針對左欄實驗提出之類似推論推導出預期結果。右襴實驗中觀測到之氖化差異之主要差異的標誌應與左攔相反且因此彼此為潛在抗原決定基之存在及位置以及結果之驗證提供互補證據。在典型In-D2〇實驗（參見示意圖6，巾欄及右搁）中，將蛋白質（對照）或蛋白質：Fab複合物稀釋於WO緩衝液中。在固疋之、帝口乂換時段之後，將混合物進一步以Η"緩衝液稀釋以引起解離交換且最終以中止緩衝液中止。混合後，如上文所述將經中止之溶液完全自動地蛋白水解，分離且藉由 LCMS分析。在實驗中使用不同〇2〇培育期（例如’ 45 〇以使對照（單獨蛋白質）與蛋白質：Fab樣本之間所觀測的氘化差異最優化。樣本與對照之間的平均氘化改變係按照樣本與對照之氘攝取量之間的差異計算，其中氘攝取量係如下文在數據處理項下所述測定。 E.數據處理使用 MassLynx(Waters，Milford，MA)將聯合 MS採集縮減為峰清單且使用 Mascot(Matrix Sciences, London, UK)針對蛋白質序列進行搜尋。手動驗證由資料庫搜尋返回之可能肽序列鑑別清單。使用MassLynx產生經驗證前驅離子質量 130427.doc -96· 200906439 的單離子層析圖。在整個層析峰範圍内，對各前驅物之同位素分布的質譜求和，校平且定中心以測定氘攝取量。遵循以下程序將氣攝取量分配至蛋白質序列之各殘基。向殘基分配覆蓋該等殘基之肽的正規化氘攝取。若一個以上狀覆蓋同一殘基’則使用覆蓋彼殘基之所有肽的標準化氛攝取平均值。藉由將所觀測之氘化程度除以彼肽中之胺基酸數來計算各肽之標準化氘攝取。 F.結果

圖7中展示對hPCSK9及hpcsK9:H1_Fab複合物進行之保 4實驗及In-DzO實驗中所觀測之平均氘化改變，其為 hPCSK9殘基編號（包括前功能部位，因為實驗未覆蓋富含胱胺駄之功能部位故將其排除在外）之函數。圖7中亦展示顯示潛在抗原決定基之預期行為之區域的胺基酸序列。 :7A展示保護實驗之氘化的改變。氘化改變係定義為圖6 所况明之實驗（左攔’存在Fab)及其對照（中搁，無叫的氛化私度之間的差異。將氛化改變緣製為在PCSK9序列之胺基酸^基4 G至4 2 〇 (以前功能部位開始且排除富含半耽胺酸 t· F位）的殘基編號範圍内每個殘基之平均質量轉 ^ 之氘化改變值（表示為每個殘基之正質量轉移）指示抗原决疋基。殘基123_132之區域（在曲線中註釋之序列）在 :方面突出且因此認為其覆蓋抗原決定基之全部或一部 130427.doc -97- 200906439 基123-132 LVKMSGDLLE片段展示如自實驗設計（圖6)預期的抗原決定基之氘化程度的預期變化。hpcsK9晶體結構中之區域123-132(LVKMSGDLLE)(參見圖8)覆蓋螺旋及環之一部分且作為潛在抗原決定基有物理意義因為其呈* 1 N度可接近性。自圖7所示之數據並非立即顯而易見的為第二區域跨度内之殘基101-107(QAARRGY)(參見圖8)，其為亦展示圖了中之氘化程度的預期互補行為（此將為潛在抗原決定基之特徵）之較大區域的子區段。此表明用於將相對於所觀測之肽之氘化的氘化程度改變再定位至初級序列上之方法具有巨大校平作用，此為所要的，因為量測中觀測到之起伏相當大。另一方面’此氘含量之非定域作用使得自圖7中繪成曲線之數據難以偵測抗原決定基中之殘基1 〇 1 _ 1 〇 7所覆蓋之區域的可能參與。然而’經觀測覆蓋較大區域之肽的詳細檢測使得所觀測之多數交換係歸因於更短之區域丨0丨_丨0 7。此外’重要的是注意在晶體結構中此較短區域空間上位於區域123-132之相鄰右側’此表明兩個片段皆形成 hPCSK9上之Hl-Fab的非線性抗原決定基。重要地，圖7之數據所暗示之2個胺基酸片段形成η 1 -Fab之非線性抗原決定基’此與對hPCSK9之抗原性抗原決定基（表2)預測之SEQ ID NO 2及3胺基酸序列相關。【圖式簡單說明】圖1為人類PCSK9之示意圖，其指示信號肽、前功能部 130427.doc -98- 200906439 位、催化功能部位及c-末端（富含半胱胺酸）功能部位在線性序列中之位置。圖2為人類PCSK9之三維結構模型的描繪。數字指示表2 所列之抗原決定基的位置。圖3描繪Hl-Fab與hPCSK9結合之Biacore結合親和力研究之結果。真耳測試（sensogram)(鋸齒狀黑線）為Hl-Fab在 0.78、1.56、3.12、6.25及 12.5 nM濃度下之結合曲線。1:1 全局擬合（平滑黑線）給出以下結合參數：Kd=3.41xl〇-3(i/s)，

Ka=3.23xl05(l/Ms)&KD=1.05xl(T8(M)。圖4A-C說明Hl-Fab可（4A)中斷hPCSK9/LDL-R相互作用且使（4B)表面LDL-R含量增加及（4C)HepG2細胞的LDL攝取增加。圖5A_C描繪自動化氘交換質譜分析（DXMS)系統之流體連接流程。圖5 A、5B及5C中分別說明該實驗之載入/線内蛋白水解階段、脫鹽階段及分離階段的閥位置。圖ό為描繪互補氫/氘（h/d)交換實驗（亦即，保護、對照及 In-DA實驗）及預期結果之示意圖。圖7A-B描繪對hPCSK9及hPCSK9:Hl-Fab複合物進行之 (A)保濩實驗及（B)in_D2〇實驗所觀測之氘化改變與hpcSK9 殘基編號之函數。圖8描繪具有預測形成非線性抗原決定基之兩個胺基酸片段（亦即，胺基酸殘基101-107 (QAARRGY)及123-132 (LVKMSGDLLE))之hPCSK9晶體結構草圖。 130427.doc -99-

Claims

200906439 十、申請專利範圍： 1. —種經分離之蛋白原轉化酶枯草桿菌素（subtilisin)/第9 型克新（kexin)多肽（PCSK9)結合分子，其包含與PCSK9特異性結合之抗體的抗原結合部分，其中該抗原結合部分與人類PCSK9(SEQIDNO:l)催化功能部位内，在以下各者中之一者内或與以下各者中之一者重疊之抗原決定基結合： (a) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 166-177 ; Γ (b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 187-202 ; (c) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 206-219 ; (d) SEQ ID NO:l 之胺基酸23 1-246 ; (e) SEQ ID NO:l 之胺基酸 277-283 ; (f) SEQ ID NO:l 之胺基酸 336-349 ; (g) SEQ ID NO:l 之胺基酸 368-383 ;或 (h) SEQ ID NO:l 之胺基酸 426-439。 2. 一種經分離之PCSK9結合分子，其包含與PCSK9特異性結合之抗體的抗原結合部分，其中該抗原結合部分與人類 PCSK9富含半胱胺酸之功能部位内’在以下各者中之一者内或與以下各者中之一者重疊之抗原決定基結合： (a) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 443-500 ; (b) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 557-590 ;或 (c) SEQ ID NO: 1之胺基酸 636-678。 3. —種經分離之PCSK9結合分子，其包含與PCSK9特異性結合之抗體的抗原結合部分，其中該抗原結合部分與人類 130427.doc 200906439 PCSK9前功能部位内，在8£〇101^0:1之胺基酸89-134内或與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸89-134重疊之抗原決定基結合。 4. 如請求項1-3中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與非人類靈長類動物之PCSK9交叉反應。 5. 如請求項1-3中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與嚅齒動物物種之PCSK9交叉反應。 6. 如請求項1-3中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與線性抗原決定基結合。 7. 如請求項1-3中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與非線性抗原決定基結合。 8. 如請求項7之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與由以下線性抗原決定基之每一者的至少一部分組成之非線性抗原決定基結合： (a) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 89-101 ;及 (b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 106-134。 9. 如請求項7之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與由以下線性抗原決定基之每一者的至少一部分組成之非線性抗原決定基結合： (a) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 166-177 ;及 (b) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 443-458。 10. 如請求項7之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與由以下線性抗原決定基中之兩者或三者的至少一部分組成之非線性抗原決定基結合： 130427.doc 200906439 (a) SEQ ID NO: 1之胺基酸 187-202 ; 〇)8丑(^10>^0:1之胺基酸23 1-246;及 (c) SEQ ID NO:l 之胺基酸 368-383。 11·如請求項7之PCSK9結合分子’其中該抗原結合部分與由以下線性抗原決定基之每一者的至少—部分組成之非線性抗原決定基結合： (a) SEQIDNO:l之胺基酸206-219;及 (b) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 277-283。 12. 如請求項7之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與由以下線性抗原決定基之每一者的至少一部分組成之非線性抗原決定基結合： (&)8丑卩1〇>^0:1之胺基酸33 6-349;及 (b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸426-439。 13. 如請求項7之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與由以下線性抗原決定基中之兩者或三者的至少一部分組成之非線性抗原決定基結合： (a) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 459-476 ; (b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 486-500 ;及 (c) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 557-573。 14. 如請求項7之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與由以下線性抗原決定基中之兩者或三者的至少一部分組成之非線性抗原決定基結合： (a) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 577-590 ; (b) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 636-645 ;及 I30427.doc 200906439 (c) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 659-677。 1 5 ·如請求項2之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與在以下各者中之一者内或與以下各者中之一者重疊之人類 PCSK9抗原決定基特異性結合： (a) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 443-458 ; (b) SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 459-476 ; (c) SEQIDNO:l之胺基酸486-5 00; (d) SEQ ID NO: 1之胺基酸 557-573 ; (e) SEQ ID ΝΟ··1之胺基酸 577-590 ; (f) SEQIDNO__l 之胺基酸 636-645;或 (g) SEQ ID NO:1之胺基酸 659-677。 1 6.如請求項3之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與在以下各者中之一者内或與以下各者中之一者重疊之人類 PCSK9抗原決定基特異性結合： (3)8£〇10>^0:1之胺基酸89-101;或 (b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 106-134。 1 7.如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與PCSK9結合之解離常數（KD)等於或小於10 nM。 1 8.如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與PCSK9結合之解離常數（KD)等於或小於1 nM。 19. 如請求項18之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與 PCSK9結合之KD等於或小於0.5 nM。 20. 如請求項19之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與人類PCSK9結合之KD等於或小於0.1 nM。 130427.doc 200906439 21. 如請求項18之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與非人類靈長類動物之PCSK9結合之KD等於或小於0.3 nM。 22. 如請求項18之PCSK9結合分子，其中其抗原結合部分與小鼠PCSK9結合之KD等於或小於0.5 nM。 23 .如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分為人類抗體之抗原結合部分。 24.如請求項23之PCSK9結合分子，其中該抗體為人源化抗體或擬人化抗體。 25 .如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分為單株抗體之抗原結合部分。 26. 如請求項23之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分為多株抗體之抗原結合部分。 27. 如請求項1-26中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子為寂合抗體。 2 8.如請求項1-26中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子包含該抗體之Fab片段、FalV片段、F(ab’）2或Fv 片段。 29.如請求項1-26中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子包含單鍵Fv。 3 0.如請求項1-26中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子包含雙功能抗體。 3 1 ·如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分係源自以下同型中之一者的抗體：IgGl、IgG2、 IgG3 或 IgG4。 130427.doc 200906439 3 2.如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子抑制PCSK9與PCSK9配位體之結合。 3 3.如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子抑制PCSK9與低密度脂蛋白受體（LDL-R)之結合。 3 4.如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子抑制PCSK9之蛋白水解活性。 3 5.如請求項34之PCSK9結合分子，其中該PCSK9結合分子抑制PCSK9前功能部位之蛋白水解。 3 6.如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子抑制肝細胞上LDL-R受PCSK9影響而減少。 3 7.如請求項36之PCSK9結合分子，其中該PCSK9結合分子抑制肝細胞上LDL-R受PCSK9影響而降解。 3 8.如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子當在存在PCSK9之條件下與肝細胞接觸時，相對於不存在PCSK9結合分子下肝細胞對低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c)之攝取時，增加肝細胞對LDL-c之攝取。 3 9.如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子在LDL-C存在下與PCSK9結合。 40. 如前述請求項中任一項之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子在血清存在下與PCSK9結合。 41. 一種包含PCSK9結合功能部位之PCSK9結合分子，其中該 PCSK9結合功能部位之胺基酸序列與纖維網蛋白、細胞素受體或鈣黏素之免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序列至少 130427.doc 200906439 75%—致，且其中該PCSK9結合功能部位之胺基酸序列相對於免疫球蛋白樣摺疊之胺基酸序列已經改變，使得該 PCSK9結合功能部位與PCSK9特異性結合。 42. 如請求項41之PCSK9結合分子，其中該PCSK9結合功能部位與PCSK9結合之KD等於或小於10 nM。 43. 如請求項41之PCSK9結合分子，其中該PCSK9結合功能部位與PCSK9結合之KD等於或小於1 nM。 44. 如請求項41之PCSK9結合分子，其中該Ig樣摺疊為纖維網蛋白之Ig樣摺疊。 45. 如請求項44之PCSK9結合分子，其中該Ig樣摺疊為第III 型纖維網蛋白之I g樣摺疊。 46. —種醫藥組合物，其包含如請求項1-45中任一項之PCSK9 結合分子。 47. —種增加肝細胞上LDL-R含量之方法，該方法包含使該肝細胞與PCSK9結合分子接觸。 48. —種增加肝細胞對LDL-c之攝取的方法，該方法包含使該肝細胞與PCSK9結合分子接觸，藉此減少PCSK9對LDL-R 之下調且增加肝細胞對LDL-c之攝取。 49. 一種肽，其係由與以下胺基酸序列中之一者至少90%—致的胺基酸序列組成： YRADEYQPPDGG (SEQ ID NO:4)； TSIQSDHREIEGRVMV (SEQ ID NO:5)； ENVPEEDGTRFHRQ (SEQ ID NO:6)； AGVVSGRDAGVAKGAS (SEQ ID NO:7)； 130427.doc 200906439 VQPVGPL (SEQ ID NO:8)； VGATNAQDQPVTLG (SEQ ID NO:9)； IIGASSDCSTCFVSQS (SEQ ID NO:10)； EAWFPEDQRVLTPN (SEQ ID NO:ll)； ALPPSTHGAGWQLFCR (SEQ ID NO:12)； TVWSAHSGPTRMATAIAR (SEQ ID NO:13)； CSSFSRSGKRRGERM (SEQ ID NO:14)； HVLTGCSSHWEVEDLG (SEQ ID NO:15)； PVLRPRGQPNQCVG (SEQ ID NO:16)； SALPGTSHVL (SEQ ID NO:17)； RDVSTTGSTSEEAVTAVAI (SEQ ID NO: 18)； SQSERTARRLQAQ (SEQ ID NO:2);或 GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA (SEQ ID NO:3)。 5 0. —種調節個體PCSK9活性之方法，該方法包含向該個體投與調節PCSK9生物活性之PCSK9結合分子，其中該PCSK9 結合分子展示以下活性中之一或多者： (a) 抑制PCSK9與LDL-R結合， (b) 抑制PCSK9之蛋白水解活性， (c) 抑制肝細胞上LDL-R受PCSK9影響而減少，及 (d) 抑制肝細胞中LDL-R受PCSK9影響而降解。 5 1 · —種減少個體血漿膽固醇之方法，該方法包含向該個體投與有效減少該個體血漿膽固醇之量的如請求項46之組合物。 52.如請求項5 1之方法，其中該用量有效減少LDL-c。 130427.doc 200906439 53· 月求項52之方法，其中該個體之血漿既濃度相對於投與該組合物之前的血漿LDL-c減少至少5%。 54. 如明求項5】之方法，其中該個體亦接受第二降膽固醇劑的治療。 55. 如β求項54之方法，其中該第二降膽固醇劑為士他汀抑制素（statin)。 56. t Γ求項5 1之方法，其中該個體患有脂質失調症或處於脂質失調症之風險中。 57 士 :求項56之方法，其中該個體患有高膽固醇血症或處於南膽固醇血症之風險中。 °月求項5 1之方法，其中該個體患有動脈粥樣硬化或處於動脈粥樣硬化之風險中。 ~ 59.如凊：項51之方法’其中該個體患有心血管病症或處於心血管病症之風險中。士明求項5 1之方法，其中該個體具士他汀抑制素不耐性。 61. 如請求項51之方法，其中該個體對士他汀抑制素治療复 62. 如請求項5丨之方法，其中該個體之總血漿膽固醇含量在投與該組合物之前為200 mg/dl或更高。 63. 如請求項51之方法，其中該個體之血漿ldL_c含量在_與該組合物之前為160 mg/dl或更高。〜 64. 如請求項5丨之方法，其中該組合物係經靜脈内投與。 65· 一種經分離之PCSK9結合分子，其包含與PCSK9特異性έ 合之抗體的抗原結合部分’其中該抗原結合部分盘 " ，、人_ 130427.doc 〇 200906439 PCSK9前功能部位内，在以下各者中之一者内或與以下各者中之一者重疊之抗原決定基結合： (a) SEQIDNO:l 之胺基酸 101-107;或 (b) SEQ ID NO:6之胺基酸 123-132。 66. 如請求項65之經分離之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與人類PCSK9前功能部位内，在SEQIDNO:l之胺基酸101-107内或與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸101-107重疊之抗原決定基特異性結合。 67. 如請求項65之經分離之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與人類PCSK9前功能部位内，在SEQIDNO:l之胺基酸123-132内或與SEQ ID ΝΟ··1之胺基酸123-132重疊之抗原決定基特異性結合。 68. —種經分離之PCSK9結合分子，其與結合人類PCSK9前功能部位内，在以下各者中之一者内或與以下各者中之一者重疊之抗原決定基的PCSK9結合分子交叉競爭結合 PCSK9 ： (a) SEQIDNO:l 之胺基酸 101-107;或 (b) SEQ ID NO:6之胺基酸 123-132。 69. 如請求項65-67中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與非線性抗原決定基結合。 70. 如請求項69之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與包含以下線性抗原決定基中之每一者之全部或至少一部分的非線性抗原決定基結合： (a) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 101-107 ;及 130427.doc -10- 200906439 (b) SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸 123-132。 71. —種經分離之PCSK9結合分子，其包含與PCSK9特異性結合之抗體的抗原結合部分，其中該抗原結合部分在SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸101-132内結合。 72. 如請求項71之經分離之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分在SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸101-132内結合且包含至少一個來自SEQ ID ΝΟ·_2之胺基酸及至少一個來自SEQ ID NO:3之胺基酸。 73. —種經分離之PCSK9結合分子，其包含與PCSK9特異性結合之抗體的抗原結合部分，其中該抗原結合部分與已與至少一個來自SEQ ID NO:2之胺基酸及至少一個來自SEQ ID NO:3之胺基酸重疊的抗原決定基結合。 74. —種經分離之PCSK9結合分子，其包含與PCSK9特異性結合之抗體的抗原結合部分，其中該抗原結合部分與選自由SEQ ID NO:2内之抗原決定基、SEQ ID NO:3内之抗原決定基或與至少一個來自SEQ ID NO:2之胺基酸及至少一個來自SEQ ID NO:3之胺基酸重疊的抗原決定基組成之群的抗原決定基結合。 75. 如請求項73或74之經分離之PCSK9結合分子，其中SEQ ID NO:2之胺基酸為麩胺麩胺。 76. 如請求項73或74之經分離之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分與至少兩個來自SEQ ID NO:3之胺基酸重疊。 77. 如請求項76之經分離PCSK9結合分子，其中該等胺基酸為甘胺酸及酪胺酸。 130427.doc • 11 - 200906439 78. 如請求項65-67及69-77中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗體為人類抗體、人源化抗體、擬人化抗體或嵌合抗體。 79. 如請求項65-67及69-77中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分為單株抗體或多株抗體之抗原結合部 . 分。 - 80.如請求項65-77中任一項之PCSK9結合分子，其中該 PCSK9結合分子包含該抗體之Fab片段、單鏈Fv、Fab'片 (’ 段、F(ab’）2、雙功能抗體或Fv片段。 81. 如請求項65-67及69-77中任一項之PCSK9結合分子，其中該抗原結合部分係源自以下同型中之一者的抗體： IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4。 82. —種如前述請求項中任一項之PSCK9結合分子之用途，其係用於製備供治療與高膽固醇含量有關之疾病的藥物。 130427.doc -12-