TW200904984A

TW200904984A - New micro-organisms for the production of 1,2-propanediol obtained by a combination of evolution and rational design

Info

Publication number: TW200904984A
Application number: TW097110003A
Authority: TW
Inventors: Philippe Soucaille; Francois Voelker; Rainer Figge
Original assignee: Metabolic Explorer Sa
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2009-02-01
Also published as: WO2008116852A1; BRPI0808972B1; CA2679989C; CN101641446A; EP2109681B1; ES2525796T3; DK2109681T3; US8298807B2; CA2679989A1; JP2010521958A; IL200705A0; US20100285547A1; BRPI0808972A2; MX2009010229A; EP2109681A1; JP5570821B2; KR101528943B1; KR20100015810A; AR066196A1

Description

200904984 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明涉及一種組合演化以及合理設計供用於製備一微生物以製造1，2_丙二醇（ij-propanedioi)的新方法，藉此而得到的微生物以及其用於製造丨，2_丙二醇的用途。【先前技術】 l，2-丙二醇或丙二醇(pr〇pyleneglyc〇l)，一種 0 二醇，疋一種被廣為使用的化學品。它是不飽和聚酯樹酯❻〇1%以沉 resins)、液怨清潔劑、冷卻劑、用於飛機的抗凍劑以及防凍液的一個成分。丙二醇從1993_1994開始被越來越多地用作為種乙晞仿生物(其被認為較丙稀衍生物更為具有毒性）的替代物。 / 15 人丨，2-丙二醇目前是由使用氧化丙烯(pr〇Pylene oxide)水合作用（消耗大量的水)的化學方法所製造。氧化丙烯可以是 =兩種方法任—種所製造，一者使用表氯醇 (啊hi吻drin) ’而另一者使用氫過氧化物(hydr—de)。 =種途#使用高毒性的物質。此外，氫過氧化物途徑產生副 2〇物诸如丁醇以及苯基乙醇。為了讓製造丙稀是有利〜制:種有關於這些副產物的用途必須被找出。化學途徑通造出消旋丨，2_丙二醇，而兩種立體異構物陣，丙二醇 /及(β1，2-丙二醇的每一者對於特定應用來說是有利益的 (例如用於^化學品以及藥學產品的手性起始原料）。用於製造1,2-丙二醇之化學方法的缺點使得生物合成 6 200904984 變成一種具吸引力的替代法。兩種途徑的特徵在於由微生物從糖類天然製造1，2-丙二醇。在第一個途徑’ 6-去氧糖(6-deoxy sugars)(例如L-鼠李糖或L-海藻糖）被切成二羥丙酮磷酸（dihydroxyacetone 5 phosphate)以及(S)-乳酸醛(lactaldehyde)，其可以進一步被還原成(S)-l，2-丙一醇(Badia et al，1985)。這個途徑在五⑺"是有功能的’但疋卻因為去氧六碳糖之升高的費用而無法產生一種經濟上可行的方法。第二個途徑是常見糖(common sugars)(例如葡萄糖或木 10 糖）經由糖解途徑接著曱基乙二醛(methylglyoxal)途徑的代謝。二羥丙酮磷酸被轉換成能夠被還原成乳酸醛或羥丙酮 (acetol)的曱基乙二醛。這兩種化合物可以接著歷經一個產生 1，2-丙二醇的第二個還原反應。這個途徑是丙二醇的天然生產者所使用’ s者如楔狀桿菌（C/⑽π•出麵烈) 15 以及嗜熱糖解嗜熱厭氧桿菌（rb腳⑽經〇6沉你如rmwaeckrofyto/m)。楔狀桿菌已被用於在磷酸限定的條件下以1,58 gd的濃度(titer)來製造L2—丙二醇(Tmn Din and Gottschalk，1985)。嗜熱糖解嗜熱厭氧桿菌亦已被研究有關於製造 1,2-丙一醇（camer〇n and c〇〇ney, 1986, 2〇 Sanchez-Rivem et al，1987)。所獲得的最佳成果是一為 9 g/1 的濃度以及一從葡萄糖而來的2,2 g/g產量。然而，因為缺乏可供利用的这傳工具，利用這些微生物所獲得的成果增進可能是有限的。 7 200904984 先前技藝

Cameron等人(1998)已研究使用s⑺㈣制於代謝工程的—個平台以供為將糖類轉換成U·丙二醇。他們的理論分析顯示··實際產物產率的上限(考量f量均衡以及用於生 5 長的⑥讀造)隨著培養條件而明顯有別。在厭氧條件下，醋酸將如同-副產物被生成以再循環還原的辅因子且每莫耳葡萄糖的最佳生產率被限定為丄莫耳的u_丙二醇(〇,42 氧條件下’翻子的制環是域用氧作為最終屯子又肢_(terminal electron acceptor)的啤吸鏈所確保且它可 10 以不生成副產物地來製造出1，2-丙二醇。在這些條件下，產，可=達到最佳1.42 mol/mol (〇,6 g/g)。考量12-丙二醇的最大'/辰度，Cameron等人探討它在產物以及副產物毒性上的依賴性。1,2-丙二醇較1，3-丙二醇是明顯地較不具有毒性的且五.c〇/z•展現出一為〇.5 h·1的具有100的的丨，2_丙二醇之 15 殘餘生長率(residual growth ate)。生長抑制比較可能是因為田1J產物醋酸(被知曉為南度生長抑制的）。發展用於製造具有尚/辰度與產量之1,2-丙二醇的厭氧方法必須滿足醋酸問題。將酉a 轉換成丙酮已被提議，其是較低抑制性並且易於從現址(Z>2如W)被移除。 20 為了要獲得使用簡單碳源的1,2-丙二醇生產者，一些有關於五· 之遺傳修飾的研究已由Cameron的團隊 (Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and

Cameron，2000)以及 Bennett 的團隊（Huang et ai，1999, Berrios-Riveraetal，2003)來進行。這些研究一方面依靠一或 8 200904984 多種從一羥丙酮填酸到1，2_丙二醇的途徑中的酵素活性的表現以及另一方面依靠宿主菌株中的NADH移除以及碳消耗途徑。由Cameron的團隊所獲得的最佳結果是在厭氧培養瓶培養中以0.2 g/g的葡萄糖消耗量而製造14 g/1的丙二 5 醇^外推到一嚴氧饋料-批次發酵槽（anaerobic fed-batch fermenter)’以從0.19 g/g葡萄糖量來製造4,5 g/1的丨,2_丙二醇，遠遠超過Cameron等人的理論評估。這些結果是在缺少編碼乳酸去氫酶(W々A)之基因的菌株中利用五⑺"的曱基乙二醛合成酶基因（mgs) ’仄co"的甘油去氫酶基因以及 1〇 [ co/z·的丨，2_丙二醇氧化還原基因(/wcO)的過度表現而被獲得。利用相同方法但具有較低濃度以及產量之所獲得的結^ 亦被描述在專利案US 6,087，140、us 6,303,352以及W0 98/37204。

Bennett的團隊也使用一缺乏的五⑺"宿主菌株以 15 過度表現丙輞丁醇梭囷（C/osM必麵βπίοό吻的所识基因以及〖滅W抑八基因。培養瓶培養在厭氧條件下給、予—為丨以1的濃度以及-為0.12 g/g的產量而微好氧典: 給予一濃度為1.4 g/Ι帶有一產量為〇13 g/g。 -種獲得製造1，2 -丙二醇之菌制替代法是指引—“起 20 始菌株(initial strain)，，演化朝向一狀態，其中“演化菌株 (evolved strain)，，以較佳的特性來製造所欲的化合物這:方法是以微生物的自然演化為主，該微生物首先受到兩個基因 (切l4以及一個涉及甲基乙二醛轉換成乳酸的基因）的弱化 (attenuation)所修飾。弱化編碼有關三碳糖磷酸異構酶之'中以 9 200904984 基因的目的在於從甘油醛-3-磷酸 (glyceraldehyde-3-phosphate, GA3P)以及二 |里丙 _ 石粦酸 (DHAP)(它們通常由此酵素所轉換）開始來分開兩個代謝分支。從DHAP到1,2-丙二醇的途徑將是消耗還原輔因子 (NADH)的“還原性分支(reducing branch)”，而從GA3P到醋酸的代謝將是製造NADH以及供用於細胞生長之能量的“氧化性分支(oxidative branch)”。在缺少一功能性妒L4基因的狀況下，細胞的代謝是被“鎖定的(locked)，，且菌株的生長，1,2-丙二醇的製造以及醋酸的製造是被緊密地結合。在一適當生長培養基的選擇性壓力下，此起始菌株將演化到一種狀態，其中由該菌株製造的1,2-丙二醇被增進。此獲得微生物之一 “演化的菌株’’以供製造1,2-丙二醇的步驟被描述於專利申請案W0 2005/073364。此演化方法以及發酵的後續步驟在厭氧條件下是優先地被施行。此技術無異是一個超越其它先前技術的增進。一為1.8 g/Ι的1，2-丙二醇濃度被獲得，具有消耗每公克葡萄糖為〇·35公克的產量，接近cameron等人的理論結果。本發明之目的為一 1，2-丙一醇生產者的增進，透過演化菌株的演化以及隨後的合理遺傳工程。一個特別的特色為在演化負菌株你fA minus strain)中重建一功能性和a基因。這些修飾導致1，2-丙二醇的一增進製造。【發明内容】本發明涉及一種新方法，組合演化及合理設計以供製備 10 200904984 用於從-碳源製造1，2_丙二賴微生物。該方法包含 -於選㈣力下將-起始菌株生長在—適t生長培養基中《亥起始細菌菌株含有卬Μ基因的弱化表現以及至少涉及將甲基乙二醛轉換成乳酸的基因（諸如g/0A、 «織、你B)的弱化表現，以促使該起始菌株的演化， -接著選擇並且分離具有一增進之丨，2_丙二醇生產率（增加達至少20%)的演化菌株曰 _繼而在該演化菌株中重建一功能性中Ζ·Α基因。在本發_-财面，麵要的财物之合成是透過刪除編碼有關涉及從丙_酸(/顯）、甲酸⑽Α，柳）、乙酉台㈣紐)合成乳酸_素而被弱化。在本發明的另一個太而，子

妝J，敗云虱崦沽性被降低以重新指引一部分可用沾叶油

不論是使用一與磷酸烯醇

—個方面，糖 200904984 丙酮酸(PEP)無關之糖輸入(像是由gdp所編碼者），或是提供更多PEP給糖-璘酸轉移酶系統。這是藉著去除消耗pEp 的途徑(像是丙_酸激酶，由刃以及砂汗基因所編碼)和/ 或藉著促進PEP的合成(例如藉著過度表現編碼有關pEp合成酶的ρ；λ^Α基因）而被獲得。此外，對於將丙酮酸轉換成乙醯基-coA的酵素來說，耐受在厭氧條件下被發現為高濃度 NADH是有用的。這可以藉著在/;^基因的一個特定突變而被獲得。有利地，副產物醋酸的合成是透過弱化從、 ροχΒ的一或數者而被避免。 10 15 本發明亦有關於一種用於以一取住化屋量，在好氧、微好氧或厭氧條件下，使職生長在—含有―簡單碳源之適當 ^長培養基的五·⑺"的演化或選擇性地遺傳修飾菌株來^ 造1，2-丙二醇的方法。此外，本發明有關於一種用於以一田佳化產量，在厭氧條件下，使用被生長在—含有—簡= 雜破源之適當生長培養基的丙町醇梭㈣演化或選 ^遺傳修飾的菌株來製造丨,2丙二醇的方法。根據此方衣造的1，2-丙二醇接著被回收並且選擇性地被純化。本發明的詳細說明請專利範圍如此處所用的下列術語可以被用來解釋申以及說明書。術語‘菌株(strain)，表示一物種(spedes)的遺傳變 (genetlc variant)。因而術語‘微生物的菌株，二生物之-物種的遺傳變異體。被給予任何菌株的特性亦= 20 200904984 於對應微生物或反之亦然。根據本發明術語‘培養(culture)，、‘生長(gr〇wth)，以及‘發酵(fermentation)’被交替地使用以表示細菌在一含有一簡單碳源之適當生長培養基中的生長。 5 術語‘碳源(carbon source)’根據本發明表示任何可以被那些習於該技藝者所使用以供支持微生物的正常生長，且其可以是六碳糖、五碳糖、單醣、雙醣、寡糖、澱粉或其衍生物、半纖維素、甘油以及其組合之碳的來源。術語‘適當的生長培養基(appropriate gr〇wth medium)，根 l〇據本發明表示一種具有適於微生物生長之已知分子組成物且被設計以促使所欲演化的培養基。根據本發明的演化法是一種用於製備演化微生物（表現增進之製造特性）的方法，並且包含有下列步驟： a) 修飾一微生物以獲得一帶有一“鎖定，，代謝的起始菌株， 15 其中當起始菌株的細胞被生長在一適當培養基上時，哕演化只採取所欲方向， ~ b) 令上面所獲得的起始菌株在該適當培養基上生長以使它凟化，其中該起始菌株是被生長在好氧、微_好氧或厭氧條件下 20 c)選擇可以在那些特定條件下生長的‘‘演化菌株，，，表現有關所欲化合物的製造特性。 & 此演化法已廣泛地被描述在相同申請人的專利申請案 2004/076659(於 17/02/2004 提出申請），以"及 w〇 2005/073364(於 12/01/2005 提出申請）中。 200904984

術浯選擇(selection)，根據本發明表示一種方法，复有被、准持在培養機巾的微生物H株是那些在選擇壓力下表現-較佳適應性(fitness)者。典型地，最適應失得比它們的競爭者快並且接著被選出。—個在—族鮮中= 微生物的—特定演化的簡單方法是在-個連續拉養中生長該族群，其中緩慢生長的菌株最終從培養物中被^提這不是用於選擇的唯—實例，且其它由該領域知的選擇方法可以被施I 10 15 20 術語‘分離(isolation)，表示一個方法，其中一表現特傳修飾的獨立g株從一表現不同遺傳特徵的菌株族群中被分離。這是由在演化顧之後減生㈣量並且將它塗培養孤上以分離單一菌落而被完成。術語‘m醇生產率，意指—個以g/1/h表示的產它是如下列而被計算出：在垮養基令^^ 農度(g/D/用^^直造所需時間、此外，一以g/g/h表示的特定生產率，考慮生物質量的數量地可以如下列而被計算出： μ-» 農唐 rg/lv在培 g 中所製造_^4^1^^&^££^1}^_於此-造所需時I (h) 生物質量的展度是透過利用一讀取例如600 nm的分光光度計來測量發酵肉汁的吸光值或透過在乾燥一預定體積之發酵肉汁之後，測量細胞乾重而被決定。 14 200904984 所生成的1，2-丙二醇數量是由高效液相層析法 lc) 根據該技If作步驟的狀態而利用-適宜管柱來被測量。 ,在月中，馮化菌株是因為下列特徵而被選出：一個立:加的葡萄糖攝取逮率㈣也她)以及一增進的1，2·丙二醇生產率纟現這些特徵的_株接著被分離，並且有利地彼此比較，以鑑定出最佳的生產者。 X g/1/h表示的葡萄糖攝取速率是如下列而被計算出：鱼祐f物近边起_^_萄糖濃度(g/i)/生遂耗所雹日吝問化）特疋的葡萄糖攝取速率可以如同上述般透過考慮培養基中的生物質量濃度而被計算出。葡1 糖攝取速率以及u丙二醇生產率是緊密地被連結。若葡萄糖的消耗增加，從葡萄糖代謝而來的產相同比例增加。在選擇以及分離之後，最―化8株呈現—高於起始菌株的攝取大約20〇/〇的葡萄糖攝取，較佳地高於大約3〇%或更高，更佳地高於50%。增加的1，2-丙二醇生產率是高於起始菌株的生產率大約20%，較佳地高於大約30%或更高，更佳地大約高於5〇%。矽/A基因編碼酵素‘三碳糖磷酸異構酶，，其催化DHAp 以及GA3P的轉換(參見第1圖）。弱化此基因的目的在於建造細胞的代謝以使得演化可以朝向最有效率的丨，2_丙二醇製造。術語弱化一基因的表現(attenuation 〇f the eXpressi〇n 0f a gene)’根據本發明表示部分或完全抑制一基因的表現，其 200904984 接著被說是‘弱化的(attenuated) ’。此表現的抑制可以是抑制 (inhibition)該基因的表現、抑制該基因的一活化機制、刪除基因表現所需的啟動子區域之全部或部分，或刪除該基因的標碼區域。較佳地，一基因的弱化基本上是那個基因的完全刪除，該基因可以是由一個有助於鑑定、分離以及純化根據本發明之菌株的選擇標記基因所取代。一基因較佳地是由如同在 Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) “〇ne_step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645中所述的同源性重組技術所不活化。其他方法在下面被描述。術語‘表現(expression)’意指一引起產生對應蛋白質，基因產物之基因序列的轉錄以及轉譯。術語‘在演化菌株中重建一功能性卬Ζ·Α基因，表示在透過引入一功能性妒/A基因的演化步驟之後，經選定的演化菌株被修飾；這可以藉由經同源性重組以一野生型功能性複本取代該基因的弱化複本，因此將三碳糖填酸異構酶活性修復到類似於在起始菌株中被測量到的活性，或是藉由引入一功能性卬/Α基因到一不同的染色體基因座上或藉由引入一功能性妒/Α基因到一質體上而被達成。此修復能夠透過部分地回收GA3P到DHAP以藉著三碳糖磷酸異構酶作用供製造1，2-丙二醇，允許葡萄糖的〗，2_丙二醇製造的產量大於1 莫耳/莫耳。弱化至少一涉及將曱基乙二醛(2_側氧丙醛)轉換成乳酸 16 200904984 的基因表現的目的在於抑制將曱基乙二醛轉換成乳酸，故出現的甲基乙二醛主要地被細胞機械用於合成丨，2_丙二醇。涉及將甲基乙二醛轉換成乳酸的基因特別是： _ 一個編碼乙二醛酶(glyoxalase)的基因，例如編碼乙二醛 5 10 15 酶1(催化從曱基乙二醛到乳酸麩胱甘肽的合成）的基因； _編碼一乳酸醛去氫酶的i/WA以及基因（催化從(Q 乳酸醛到(¾乳酸的合成）。 ^些基因的-或多個的表現在起始_株巾是有利地被弱化(或該基因是完全地被删除）。較佳地沙A基因被刪除。一個額外的修飾是有利地使得起始菌株抑制天然葡萄糖發酵途徑，其消耗還原等效物像是NADH並因此與1孓丙二醇生合成途徑競爭。 ’_ 特別地’弱化編碼有關乳酸去氫酶(催化從两铜酸到乳酸的合成)之慰基因表現，以及編碼有關醇屬去氮酶化從乙醯基·〇>Α到乙醇的合成）的基因祕E的表現是有 66 。類似地’強職生減㈣晴錢_合如從酸來製造乙醯基_C〇A从NADH是可行的。料以化基因冰A以及冰B (編碼有關丙晴甲酸解離酶)的現而被達成。兄弱化至少一編碼有關涉及恩納杜道夫途徑之酵素因^/以及油，也被應用於預㈣萄糖直接代謝成甘ς -3-磷酸以及丙酮酸(可以繞過丨，2_丙二醇合成途秤）。’終 200904984 ^在厭氧或微好氧條件下，用於還原前驅物成為1,2-丙二醇之NADH❸可利用性是有利地被提高。這是透過減少對一缓®文循壞的抑制（由通用調節劑Arac (global regulator Arac，由wcA基因所編碼）所媒介）而被獲得。細胞中的 5 NADH漠度也可以透過不活化NADH去氫酶II (由基因祕所編碼）而被提高。因此，較佳地，至少一選自以及的基因讓其表現被弱化。杈佳地，5亥起始菌株是選自於由細菌、酵母菌以及真菌所構成的群組。 1〇更佳地’該起始菌株是選自於由腸内桿菌科 (Enterobacteriaceae)、有芽胞桿菌科(Bacillaceae)、梭菌科 (Clostridiaceae)，鏈絲菌科(Streptomycetaceae)以及棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)所構成的群組。在本發_ -祕實施财，該絲g株為大腸桿菌或 15 丙酮丁醇梭菌。易於被獲得的演關株’以及諸如透過前述方法而被獲 ' 得的演化菌株，亦為本發明的一個標的。在此演化菌株中，修飾特定基因的表現是有利的，亦即增加或弱化基因表現。這些修飾允許增進〗，2_丙二醇製造 20 果。 -^ 為了要獲得感興趣之基因的過度表現，習於該技蓺人士知晚不同的方法，例如： ~ 以一較強的啟動子取代内源性啟動子 _將一帶有該感興趣之基因的表現載體引入微生物 200904984 _將感興趣之基因的額外複本引入染色體。習於該技藝人士知曉用於將DNA引人—細菌菌株的一些技術。-被偏好陳術為f穿孔，其為料習於該技所熟知。 β 為了要獲得-基因表現的弱化，不_方法是f於該技藝人士所熟知，並且在下面被描述。在本發明的一特定實施例中，該演化菌株是透過弱化甘油醛3磷酸去氫酶(GAPDH)活性而被修飾，以減少往醣解 (glycolysis)的較低部分的流動並且重新指引它朝向DHAp以及最終1，2_丙二醇的合成（參見第丨圖）。這降低的活性可能特別是由弱化基因的表現而被獲得。術語‘弱化一酵素的活性(attenuation of the expression of a enzyme)’意指降低感興趣之酵素的活性，相較於一演化菌株在任何修飾之前被觀察到的活性。習於該技藝人士知曉一些方法來獲得這個結果，而且例如： - 將一突變引入基因’降低此基因的表現水準，或所編碼之蛋白質的活性水準。 ' 以一低強度的啟動子取代該基因的天然啟動子，造成— 較低的表現 - 使用去穩定對應信使RNA以及蛋白質的元素(dement) - 若完全不表現是所欲的，刪除該基因。有利地在該演化菌株中’糖輸入的效率增加。強烈弱化即基因的表現導致碳流入GAPDH降低達超過5〇%，這將造成每莫耳輸入的葡萄糖合成少於1莫耳的碌酸稀醇丙 19 200904984 酮酸(PEP)，。糖-填酸轉移酶系統（sugar_ph〇sph〇transferase system)通常確保簡單糖輸入細胞是偶合到給予葡萄糖磷酸的磷酸化反應。此反應所需的磷酸是由pEp成為丙酮酸的轉換所提供’因此透過降低通過甘油醛_3_磷酸的流動來降低所生成的PEP數量會降低糖輸入。在本發明的 10 15 忖疋I她例中，糖可以是由一獨立於磷酸婦醇丙酮酸可利用性的糖輸人系統運送人微生物内。由基因㈣p所編碼的半乳糖_ f子同向運輸蛋自（gaiaetQse_pr〇t〇n SymP〇_(不涉及磷酸化)可以被採用。在此例中，輸入的葡萄糖必須受到葡萄糖激酶(由班基因所編碼)所鱗酸化。為工促’至少一選自於_以及g从的基因表現被提同只、、，果PTS變成非必要的且可以透過弱化至少一選自於、户“或.的基因表現而被去除。、代謝^3 4权實施例中’m的效率是透過增加

酮酸，在本發明的修飾菌株中的PEP數I 二^有各^成—較低數量的葡萄糖被運送到細胞内。存在有各種不同可在—微性的方法。特別地，—種方法3^料~加PEP可利用佳地，至少一選自 '反應PEP—丙酮酸。較酸激酶酵素)的表現是 = ^ 的基因(編碼有關兩酮另-個方法是>力續得這個結果。合成酶的活性；：二可利用性以透峨稀醇两綱酸酸合成酶所催化）個;酸〜PEP (由磷酸晞醇_ k個酵素疋由基因所編碼。因此， 20 200904984 較佳地在該微生物中基因的表現被提高。兩種修飾可以同時存在於微生物中。特別是在厭氧或微好氧條件下，丙酮酸去氫酶複合體 (pyruvate dehydrogenase complex，卩〇0)(將丙_ 酸轉換成乙 5 醯基-coA)對於NADH的抑制具有低的敏感性。術語‘低的敏感性(low sensitivity)’是參考一未經修飾的酵素的敏感性而被定義，像是在WO 2005/073364中所敎示的。特別地，此種特徵可以透過將一個特定突變引入/;^基因（編碼有關 PDC的次單位硫辛胺去氫酶)造成在該酵素的蛋白質序列之 1〇丙胺酸55被一纈胺酸所取代。在本發明的另一個特定實施例中，副產物醋酸的合成是被避免的。在完全好氧條件下，還原的辅因子NADH較佳地疋利用氧作為最終電子受體而經由呼吸鏈被氧化成 NAD+。因此，一副產物(例如醋酸）的合成是不被禁止的。 15 較佳的是避免此醋酸合成以最佳化1，2-丙二醇的製造。為了要避免醋酸的製造，至少一涉及醋酸合成的基因的活性有利地要被弱化。優先地，至少一選自於此从，尸如以及；70ΧΒ的基因的表現要被弱化，這些所有基因編碼有關涉及不同醋酸生合成途徑（參見第1圖）。 20 本發明之另一主體是一用於製備1，2-丙二醇的方法，其中一諸如前述的演化菌株被生長在一適當的生長培養基(含有一碳源）中’並且接著所製造的丨，2_丙二醇被回收。製造 1,2-丙二醇是在好氧，微好氧或厭氧條件下被施行。有關於根據本發明之微生物的培養條件(發酵)可以由那 200904984 一。！於:緖藝者所易於定義。特別地，細菌在介於2。。。與下被發酵，較佳地介於25。。與4crc，以及更佳在大約37^丁醇梭菌來說在大約3rc以及對於方· W來說 ?"(batch process)' 、菌株可以被用來在好氧’微好氧或厭氧條件下製造 1，2-丙二醇。 f好乳條件下’表示氧藉著溶解氣體於液相中而被提供。這可以透過⑴喷灑含有氧的氣體(例如空氣)成為液相或⑺震盪含有料基的容㈣將被包含在· 條件取代厭氧 1!Ι:ΪΓ 氧作為一電子受體的存在會促進菌株 15 20 ==YTP形式的能量以供細胞處理的能力。因此該囷株讓其一般代謝被增進。微·好氧料蚊義為培祕件，料缸分比如^含有介於（U以及·氧，以氮加足相G%的氣^ 之/Wi合物)被溶解成液相。巧條=被定義騎養·，其巾沒有氧被提供至培養土。嚴可缝條件是透射[躲㈣(像技)到培中以移除微1的其它氣體。確酸可以被用做為—電 = 透過菌株增進ATP生成並且增進其代謝。乂菌株的培養，在演化法以及用於製造丨义步驟期間，是在發酵槽中利用—具有適用於所肠菌的t 22 200904984 套組組成物之培養基(含有至少一碳源)來進行。特別地’一用於五.CO"的礦物質生長培養基可以因此具有相同或類似於 M9 培養基(Anderson，1946，Proc. *SW.以以 32:120-128)，M63 培養基(Miller，1992; A Short Course in 5 Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacterial, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, New York)或一諸如那些由 Schaefer 等人(1999, 270:88-96)所界定之培養基，並且特別是在下面被命名為MPG之基本培養基的 10 組成物： K2HP〇4 1.4 g/1 氮基三醋酸(Nitrilo Triacetic Acid) 0.2 g/1 ~〜微量元素溶液* 10ml/l (NH4)2S〇4 1 g/1 ' NaCl 0.2 g/1 NaHC03 0.2 g/1 MgS04 0.2 g/1 葡萄糖 20 至 100 g/1 NaN〇3 ------- -------------- 0.424 g/1 口塞胺(thiamine) ------ ---— 10 mg/1 FeS〇4, 7H2〇 -------- ---—. 50 mg/1 __酵母菌萃取物 — 4 g/1 培養基的pH以氬氣化納調整至7.4。 23 200904984 *崴擰檬酸 4,37 g/L，MnS04 3 g/L，CaCl2

1 g/L ’ C〇Cl2, 2H20 0.1 g/L ’ ZnS〇4, 7H2〇 0.10 g/L，CuSCJ 5H20 10 mg/L，H3B〇3 10 mg/L，Na2Mo〇4 8.31 mg/L。在本發明的一特定實施例中’該方法是使用一五⑶" 的演化菌株，在一含有一簡單碳源（可以是：***糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖)的生長培養基中被施行。一特別被偏好的簡單碳源為葡萄糖。在本發明的另一特定實施例中，該方法是使用丙_丁醇 10 15 梭菌的演化菌株，在一含有一簡單或一複雜碳源的生長培養基中被施行。用於丙酮丁醇梭菌的生長培養基可因此是具有與梭菌生長培養基(Clostridial Growth Medium, CGM)(Wiesenborn et al.，Appl. Environm. Microbiol.，54:2717-2722)或由 M〇n〇t 等人（APPl· Environm. Microbi〇1·，44: 1318七2 句或

Vasconcelos 等人(J.Bacteri〇i” 176: 1443_145〇)所給予的一二物質生長培養基相同或類似的組成物。 κ 、用:丙酮Τ醇㈣培養的碳源可以是—簡單或，源。簡，碳源可以是***糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、、捕麥芽糖、藉、糖或木糖。一特別被偏好的簡單萄糖。複雜韻可以是㈣或半纖維素。—制好= 雜碳源是澱粉。甸丨的歿 k先地回收的1>2_丙二醇被進一步純化。習於該人士知曉用於时並且純化所生產之m醇的方法。^ 200904984 些方法是慣用的方法。 +f、、本發明是如上，如下以及在有關於五.co//的實施例中被描述。因此有關於根據本發明的起始以及演化菌株之可以被弱化、刪除或過度表現的基因主要地使用£•⑺"的基因命名 5 而被界定H此命名具有—根據本發明之更為通常的意思，並且含括在其它微生物内的對應基因。利用五·⑶"基因的GenBank參考資料，那些習於該技藝者可以決定在五⑺" 以外的其它生物之相同基因。鑑定同源性序列以及它們的同源性百分比的意思對那 10 些白於5亥技藝者來說為已知的，並且尤其包括可以在網站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ L利用在那個網站上所指明之預設參數來被使用的blast程式。所獲得的序列可以使用例如程式 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalwA 利用這些網站上所指明的預設參數來被運用（排列）。 15 PFAM資料庫(排列以及隱藏性馬可夫模型的蛋白質家族資料庫（protein families database of alignments and hidden

Markov models bttp://www.sanger.ac，uk/Software/Pfam/))气一個蛋白質序列排列的大型收集。每個PFAM可以顯現多重排列，觀看蛋白質領域’評估生物之中的分布，或得到其他資 20 料庫的進入權力並且顯現已知的蛋白質結構。 COGs (蛋白質直向同源群組的群聚(Clusters of orthologous groups of proteins) iittp.//www.ncbi.nlm.nih,gov/COG/)异诱過比較衍生白 66 個完全被定序的染色體(代表4 4個主要的系統發育系）的蛋白 25 200904984 質序列而被獲得。各個COG是從至少3個發育系來被界定，可以鑑定出古老的保守領域(ancient conserved domains)。參考文獻依照内文中的引用順序 5 10 15 20 1. Badia J, Ros J, Aguilar J (1985), J. Bacteriol. 161: 435-437. 2. Tran Din K and Gottschalk G (1985), Arch. Microbiol. 142: 87-92. 3. Cameron DC and Cooney CL (1986), Bio/Technology, 4: 651-654 4. Sanchez-Rivera F, Cameron DC, Cooney CL (1987), Biotechnol. Lett. 9:449-454 5. Altaras NE and Cameron DC (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65:1180-1185 6. Cameron DC, Altaras NE, Hoffman ML, Shaw AJ (1998), Biotechnol. Prog. 14:116-125 7. Altaras NE and Cameron DC (2000), Biotechnol. Prog. 16: 940-946 8. Huang K, Rudolph FB, Bennett GN (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 3244-3247 9. Berrios-Rivera SJ, San KY, Bennett GN (2003), J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 34-40 10. Datsenko KA and Wanner BL (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645

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Environ. Microbiol. 44: 1318-1324 16. Vasconcelos I, Girbal L, Soucaille P (1994), J. Bacteriol. 176: 1443-1450 15 20 【實施方式】實施例下列實施例顯示： 1- 建構一個經修飾的五,co//菌株MG1655 ΑρβΑΒ, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, A arc A, Andh 2- 演化該起始菌株 3- 在該選定的演化菌株重建中/A基因 4- 弱化gapA基因；刪除基因pykA以及pykF ;過度表現ppsA基因 27

200904984 5_ 刪除基因 ackA-Pta，P〇xB 6- 在好氧條件下比較數個所獲得的菌株有關丨，2_丙二醇製造 7- 在利用最佳菌株的饋料-批次培養基中製造ι，2_丙二 5 醇實施例1 :建構一個能夠朝向增進1，2_丙二醇製造演化之經修飾的 E. coli 菌株 MGU55 Ipd*，/UpiA，句jflAB， AadhE, AldhA, Agio A, AaldA, AaldB, Aedd, i〇 AarcA, Andh '· a)建構一個經修飾的五.C0//菌株MG1655 ΑρβΑΒ, AadhE, ldhA::km, JgloA, AaldA, AaldB, Aedd 氣黴素抗性卡匣（chloramphenicol resistance cassette)是根據操作步驟1在菌株£. C£?// MG1655 /〆*，」妒M， 15 dadhE，ldhA::km，/igloA，ΛαΙώί，/ialdB，/iedd::cm 中被去除 (參見 W02005073364)。才呆作步驟1 :去除抗性卡g 氣黴素和/或康黴素(kanamycin)抗性卡匣是根據下列技 2〇術而被去除。帶有作用在氣黴素和/或康黴素抗性卡匣的F RT 位址的FLP重組酶(reconibinase)之質體pCP20是透過電穿孔被引入該菌株。在42。(：下連續培養之後，抗生素抗性卡匣的喪失是利用表1中所給予的寡核苷酸透過PCR分析而被查驗。 28 200904984 紐在菌株中被建立的修_存在是表丨中所給予的寡核苷酸而被查驗。所獲得的菌株被命名為五c〇// MG1655 /pd*， dpflAB, dadhE，IdhA::km，/igloA，zialdA, daldB, dedd。表1 ··用於查驗一抗性卡匣之***或一抗性卡匣之喪失的寡核苷酸區域名稱募聚物名稱序列辨識編號與染色體區域的同源性 0/A基因 cdh N°1 參見 W02005073364 (刪除） YIIQ N°2 P/7AB基因 pflABF N°3 參見 W02005073364 pflABR N°4 α^Ε基因 ychGf N°5 參見 W02005073364 adhECr N°6 /c/AA基因 hsIJC N°7 參見 W02005073364 (卡£***） ldhAC2 N°8 g/oA基因 NemACd N°9 參見 W02005073364 Rnt Cr N°10 α/ί/Α基因 Ydc F C f N°ll 參見 W02005073364 gapCCr N°12 α/ί/Β基因 aldB C f N°13 參見 W02005073364 YiaYCr N°14 eiW基因 Eda d N°15 參見 W02005073364 Zwf r N°16 29 200904984 /办A基因 ldhAF N°17 1439724 至 1439743 (刪除） ldhAR N°18 1441029 至 1441007 arcA基因 arcAF NM9 4638292 至 4638273 arcAR N°20 4636854 至 4636874 /7心基因 ndhF N°21 1 164722 至 1164742 ndhR N°22 1167197 至 1167177 tpiA基因 YIIQ N°2 4109599 至 4109580 (重建） tpiA R N°23 4108953 至 4108973 gapA啟動子 yeaAF N"24 1860259-1860287 (Ptrcl6-gapA) gapAR N°25 1861068-1861040 /?>^A基因 pykAF N°26 1935338 至 1935360 pykAR N°27 1937425 至 1937401 /?_yA：F 基因 pykFF N°28 1753371 至 1753392 pykFR N°29 1755518 至 1755495 flcA：A-/^a 基因 B2295 N°30 2410900 至 2410919 YfcCR Nc31 2415164 至 2415145 /7〇Λ：Β基因 poxBF N°32 908475 至 908495 poxBR N°33 910375 至 910352 b)建構一個經修飾菌株 Ε· co/i MG1655 φ(/ΆρίΑ，/ίρβΑβ， AadhE, ldhA：：cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd 坤為了要去除康徵素抗性卡匣並且去活化/^//^基因，氯 =抗[生卡E疋根據操作步驟2刪除涉及的大部份基因地被***基因。 30 5 200904984 操ii步驟2 :引入一供重組的PCR產物並且選擇該重組體 (recombinant) 在表2中被選定以及給予之供用於取代一個基因或一 5 個基因間區域的寡核苷酸被用來放大質體pKX>3的氯黴素抗性卡1Ε或質體pKD4的康徽素抗性卡匣(Datsenko, Κ.Α. & Wanner, B.L. (2000))。所獲得的PCR產物接著藉著電穿孔被引入帶有質體PKD46的受體菌株(其中所表現的系統λ Red (γ，β，exo)非常偏好同源性重組）。抗生素_抗性轉形株接著被 ίο 選出且抗性卡匣的選擇是利用表1中所給予的適當寡核苷酸透過PCR分析而被查驗。該菌株的其它修飾是利用表1中所給予的寡核苷酸來被查驗。所生成的函株被命名為五.m// MG1655 dtpiA，Jp/ΪΑΒ，/iadhE，dgloA，dcddA, dcddB，dedd。 15 200904984 表2:用於透過以一 PCR產物的重組在菌株凡co/z· MGl 655中取代一染色體區域的寡核苷酸區域名稱寡聚物名稱序列辨識編號與染色體區域的同源性 W/zA基因 DldhAF N°34 1440865-1440786 DldhAR N°35 1439878-1439958 arcA基因 DarcAF N°36 4637868-4637791 DarcAR N〇37 4637167-4637245 WA基因 DndhF N°38 1165071-1165149 DndhR N〇39 1166607-1166528 ίρζ·Α基因 tpiA::kmF N°40 4109264-4109195 (重建） tpiA::kmR N°41 4109109-4109193 ga/7A啟動子 Ptrc-gapAF N〇42 1860478-1860536 (Ptrcl 6-gapA) Ptrc-gapAR N〇43 1860762-1860800 基因 DpykAF N〇44 1935756-1935836 DpykAR N〇45 1937055-1937135 基因 DpykFF N°46 1753689-1753766 DpykFR N547 1755129-1755051 基因 DackAF N°48 2411494-2411573 DptaR N°49 2414906-2414830 基因 DpoxBF N°50 908557-908635 DpoxBR N°51 910262-910180 C)建構一個經修飾的菌株五.MG1655 基因arc」在菌株[co" MG1655中是使用操作步驟2 中所描述的技術以表2中所給予的募核苦酸透過***一康黴素抗生素抗性卡匣並且刪除所涉及的大部份基因而被不活化。所生成的菌株被命名為五.C0//MG1655」ard...im。 d)建構一個經修飾的五·⑶"菌株MG1655 //?</% J印H， 32 200904984

ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, JaldA, AaldB, Aedd, AarcA 以一康黴素抗性卡匣在菌株凡cWMG1655 zlp/IAB，ZladhE，/UdA:.cm，ZlghA, ZlaldA,」aldB, dedd 中取代基因wad的基因刪除是透過利用噬菌體pi的轉導技術來被施行。叠丑步驟3 :利用噬菌體P1的轉導以供刪除一基因透過一抗性卡匣(康黴素或氯黴素)在受體凡⑺"菌株中取代基因的選定基因之刪除是藉著利用噬菌體P1的轉導技術來被施行。操作步驟為兩步驟，⑴在帶有一單一基因被删除的菌株MG1665上製備噬菌體溶解物以及(…藉此噬菌體溶解物轉導該受體菌株。蓋蓳_體溶解物的製備將 10 mL 的 LB + Cm 30 pg/ml +葡萄糖 0.2¾ + CaCl2 5mM接種100 μΐ之培養過夜的菌株mg1665(帶有一單一基因被刪除）。 - 於37°C下以震盪培養歷時30分鐘。 _加入1⑻μΐ之噬菌體溶解物pi (在野生型菌株MG1665 上製備)(大約1χ109噬菌體/ml)。 '於37 C下震盪歷時3小時直到所有細胞被溶解。 -加入200 μΐ之氯仿，並且渦旋(v〇rtexing)。 -於45GGg離心歷時1G分鐘以去除細胞殘餘物。 _將上清液轉移到一個無菌試管並且加入2〇〇μ1氯仿。 33 200904984 將溶解物儲存於4。〇。轉導將5 ml之五c〇"受體菌姓 5 10 15 20 ^ ι^ΛΑ 的過夜培養物(在LB培養基甲）以碓心1500 g離心歷時1〇八將細胞小丸懸浮於2.5 ml ^ 4 mM。的％S04 10 mM, CaCl2 5 - 對照組試管：100 μΐ細胞 100 μΐ ^有—單―基因被刪除的菌株 I、、、 MG1655的噪菌體pi _ 的細胞，〇μ1帶有一單一基因被刪除的囷株MG1655的嗟菌體pi。 -不需震i地在3G°C下培養歷時3()分鐘。 -在每個試管中加人⑽μ1的檸樣酸納，並且渴旋。 - 加入1 mL的LB。 -於37°C下震盪培養歷時1小時。 _在以70〇〇rpm離心試管歷時3分鐘後塗佈於平盤上LB+

Cm 30 pg/ml。 - 於37 C下培養過夜。抗生素-抗性轉形株接著被選出並且刪除的***是利用在表1中所給予的適當寡核苷酸透過一 pCR分析來被查驗。所生成的囷株被命名為五MG1655 /pj*, J印L4, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, Jard-km o 34 200904984 e) 建構一經修飾的五.cW菌株MG1655 基因《必是以表2中所給予的寡核苷酸使用操作步驟2 中所述的技術透過***一康黴素抗生素抗性卡g並且刪除所涉及的大部份基因而被不活化。所生成的菌株被命名為 5 E. coli }AG\655> /indh::km。 f) 建構一菌株五•⑼以 MG1655 ί/κ/*，zfp/LiB，如仇e, AldhA, AgloA, AaldA, JaldB, Aedd, AarcA, Andh 透過一康黴素抗性卡匣在菌株五.co/z· MG1655 /pi/*, i〇 AtpiA, ΑρβΑΒ, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, 中取代基因的基因的刪除是如前面使用以在操作步驟3中所述的噬菌體P1之轉導技術來被施行。所生成的菌株被命名為五.cW MG1655 ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AarcA, 15 」ndh::km。康黴素抗性卡匣接著根據操作步驟1而被消除。所獲得的菌振梭命名爲 E. coli MG1655 lpd*，/itpiA, ZipflAB, /ladhE, ZlldhA, /igloA, /ialdA, /laldB，Aedd, AarcA，/indh。在各個步驟中，先前在菌株中所建立的修飾的存在是使 2〇用表1中所給予的寡核苷酸來被查驗。實施例2:經修飾的菌株五· cW MGI655 lpd%却/L45, dadhE，AldhA::cm，AgloA，AaldA，AaldB, Jedd 於微好氧條件下在連續培養裝置(chemostat culture) 35 200904984 中的演化以及演化的生理特性：為了要朝向增進的1，2-丙二醇製造演化，菌株五⑺" MG1655 lpd*, AtpiA, ΑρβΑΒ, AadhE, MdhA::cm, AgloA, Ζία/^，zie而呈連續培養地(一側於厭氧條件下且另一

側於微好氧條件(1%氧)下)被培養在諸如前述的培養基MpG (具有過量葡萄糖(從起始20 g/1若葡萄糖逐漸耗盡則加入)) 中。狐度被设定於37°C且pH透過加入鹼而被調整到6 5。菌株在連續培養裝置中的演化接著是生物f量濃度的增加偶合產物濃度(1，2-丙二醇以及副產物醋酸)的上升，超過數 10 15 週(從4週间至6週）。這表示菌株表現的增進。當培養在這，條件下顺-从奴進—步濃度上相觀，演化被完成0 ⑽一 Ϊ::化之錢之後㈣株特性被評估。表相立純株的罢“ “析中被評估，使用被用於連續培養裝，中的相同培養基MPG。在這些純株之中，― ^ =::的有：二醇專一性生產率，結果被報?=表=:件的最佳純株上所獲得的 36 200904984 表4 :於厭氧條件下在演化之後所獲得的最佳演化菌株與起始菌株的比較菌株 £· co，i MG1655 ㈣* AtpiA ApflAB AadhE AldhA:;cm Agio A Aald^ AaldB Aedd 演化之前的起始菌株 (在2天的培養之後所測得的表現）最佳演化純株（在2 天的培養之後所測得的表現）葡萄糖專一性消耗率 (g葡萄糖/g生物質量/h) 0.12 0.21 (+75%) 1，2-丙二醇專一性生產率 (g 1,2-丙二醇/g生物質量 /h) 0.02 0.07 (+250%) 1,2-丙二醇+羥基丙酮專一性生產率(g 1,2-丙二醇+經基丙酮/g生物質量/h) 0.04 0.08 (+ 100%) 表5 :於微好氧條和菌株與起始菌卜下在演化之後所獲得的最佳演化株的比較菌株五· w/ί MG1655 lpd* AtpiA ApflAB AadhE AldhA::cm Agio A Aald^ AaldB Aedd 演化之前的起始菌株 (在2天的培養之後所測得的表現）最佳演化純株（在2 天的培養之後所測得的表現）葡萄糖專一性消耗率 (g葡萄糖/g生物質量/h) 0.10 0.22 (+120%) 1,2-丙二醇專一性生產率 (g 1,2-丙二醇/g生物質量 /h) 0.01 0.08 (+700%) 1,2-丙二醇+羥基丙酮專一性生產率(g 1，2-丙二醇+輕基丙酮/g生物質量/h) 0.04 0.08 (+ 100%) 5 10 15 20 200904984 過-萃取物的培養基上被培養超來二= = ==終培— 實施例3 :在選出的&⑽演化菌株MG1655㈣*，抑⑷

ApflAB, AadhE, AldhA::cm, JgloA, AaldA, AaldB, Jedd中重建fpiA基因 a)建構一經修飾的菌株五· c<?// MG1655卬一康黴素抗生素抗性卡匣以表2中所給予的寡核苷酸根據在刼作步驟2中所描述的技術而被***基因毕/A上游。所生成的菌株被命名為五.CC(/Z.MG1655 /pzHm。接著基因扣A進入演化菌株五.co/z.MG1655 /#*,ζί中L4, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AarcA, 如办的重建是使用操作步驟3中所述之利用噬菌體pi的轉導技術而被施行。所生成的菌株被命名為演化五.MG1655 AtpiArc::km, ΑρβΑΒ, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, dedd, /iarcA，/indh。康黴素以及氣黴素抗性卡匣接著根據操作步驟2來被消除。所得到的菌株被命名為‘演化五.cW矽z_Arc’。先前在菌株中被建立的修飾的存在是使用表1中所給 38 200904984 予的券核苦酸來被查驗。實施例4 : ‘演化五· C0//^f*Arc，的修飾：弱化々中a基因；删除基因pjA：A以及砂处；利用一載艎 pJBI37-PgapA-jjpsA 過复表現pPsA 基苗 a)以合成的短Ρί#τ16啟動子取代天然啟動子以合成的短Pircl6啟動子（序列辨識編號52 :

gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtggaa)取代天然 g印A

啟動子到卤株‘演化五· CW中/Arc’中是透過以FRT-CmR-FRT 以及一經工程化的啟動子取代公叩八序列上游的225 pb而被做出。所用的技術被描述於利用表2中所給予之寡核苷酸的操作步驟2。所生成的菌株被命名為‘演化五.c〇"少z.Arc， Ptrc\6-gapA::cm。氯黴素抗性卡匣接著根據操作步驟丨而被去除。所獲得的囷株被命名為演化五· c〇H扣Arc，Pirc 16-gapA。 b)刪除仰灸入基因基因烈ΑΑ是透過***一康黴素抗生素抗性卡匣並且以表2中所給予的寡核苷酸利用操作步驟2中所描述的技術刪除大部分涉及的基因而被不活化。所生成的菌株被命名為决也 E. coli tpiArc Ptrc\6-gapAdpykA::km ° 康徽素抗性卡匣接著根據操作步驟1而被去除。所獲得的囷株被命名為凉化五c〇"中，朽少女a。 39 200904984 C)刪除基因基因仍4F是透過***一康黴素抗生素抗性卡匣並且以表2中所給予的寡核苷酸利用操作步驟2中所描述的技術刪除大部分涉及的基因。所生成的菌株被命名為‘演化五⑺^· tpiArc' Ptrc\6-gapAApykA /ipykF::km。如前，康黴素抗性卡匣接著根據操作步驟丨而被去除。所獲得的菌株被命名為‘演化五.⑺"卬ζ·Αιό， ίο d)引入一表現載體外^到菌株中為了要增加磷酸烯醇丙酮酸的製造，外λ^基因從質體 PJB137使用炉啟動子而被表現。有關於質體 pJB137-PgapA-ppsA 的建構’基因卯^從五 MG1655 的染色體DNA使用下列寡核苷酸而被PCr擴增： 15 i. gaPA-卯sAF由65個鹼基所構成(序列辨識編號53)

ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC 具有 -一個與基因(1785136至1782758)的序列 (1785106至Π85136)( —網站上的參考序列 2〇 http://genolist. pasteur.fr/Colihn同源的區域（大寫字母），以及 -一個與啟動子（1860794-1860761)同源的區域 (小寫字母） 2. ppsAR，由43個鹼基所構成(序列辨識編號54) 40 200904984

aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC 具有 -一個與基因(1785136-1782758)的區域的序列 (1782758-1782780)同源的區域(大寫字母） -一個限制位址i^>u/III(晝有底線的字母）同時仄<%>//基因的啟動子區域是使用下列寡核苷酸而被擴增： 1. gapA-ppsAR，由65個驗基所構成(序列辨識編號55) GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg ίο 具有 -一個與基因仲d (1785136-1782758)的序列 (1785106-1785136)同源的區域(大寫字母），以及 -一個與坪/?A啟動子（1860794-1860761)同源的區域 (小寫字母）。 15 2. gapAF，由33個驗基所構成(序列辨識編號56) ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc 具有 -一個與gopA啟動子（1860639-1860661)同源的區域 (小寫字母） -一個限制位址(畫有底線的字母）兩個片段隨後使用寡核苷酸ppsAR以及gapAF而被融合(Horton et al. 1989 Gene 77:61-68)。PCR 所擴增的片段以限制酵素初>2ί/ΙΙΙ與》SVwfll剪切並且被轉殖到載體pjB137 (EMBL寄存編號：U75326)的中以給予載體 20 200904984 pJB137-PgapA-ppsA。重組型質體是由DNA定序來被確認。質體pJB137-PgapA-ppsA被引入菌株‘演化五.—/ tpiAnc’ Ptrcl6-gapAL，/IpykA，JpykF 中。所獲得的囷株被命名為‘演化cW ip/Jrc’, 5 Ptrc\6-gapA, dpykA, dpykF，（pJB137-PgapA-ppsA)。在各個步驟，先前在菌株中所建立的修飾的存在可以使用表1中所給予的寡核苷酸來查驗。實施例5 :建構一能夠沒有醋酸作為副產物地製造丨,2_丙二 ίο 醇的菌株‘演化五· co/ί· (piArc’ Pireie-gflpA，

JpykA, ApykF, AackA-pta, ApoxB (pJB 13 7-Pgap A -ppsA ) a) 建構一經修飾的菌株五.cWMG1655AackA -pta::cm • 基因以及/?加是透過***一氯徽素抗生素抗性卡 15 匣並且以表2中所給予的寡核苷酸利用操作步驟2中所描述的技術刪除大部分涉及的基因而被不活化。所生成的菌株被命名為五.co/z’ MG1655 。 b) 建構一菌株‘演化五.印/Arc’ 客apA, 20 ApykF^ A ackA-pta 在卤株‘演化五· 和Arc’ /7rcl6-《a/>A，4pj；A:A, 中刪除基因ac々A以及是使用先前以如同操作步驟3中所述的嗤菌體Ρ1的轉導技術而被施行。所生成的函株被命名為4演化五.co/z· ip/Jrc’ Pircl 42 200904984

ZipykA, ZipykF, /iackA-pta::cm。如前，氯黴素抗性卡匣接著根據操作步驟1而被去除。所獲得的菌株被命名為‘演化五.CO"矽/jrc，/>的7 dpykA ZipykF，/iackA-pta。 C)建構一經修飾的菌株‘演化凡 ApykA, JpykF, AackA-pta, ApoxB (pJB137-PgapA-ppsA) 基因；?i?xB是透過***一氯黴素抗生素抗性卡匣並且以表2中所給予的寡核苷酸利用操作步驟2中所描述的技術刪 ίο 除大部分涉及的基因而被不活化。所生成的菌株被命名為‘演化五_ co/z·印L4rc’

ApykA, ApykF, AackA-pta, ApoxB::cm ° 如前’氯黴素抗性卡匣接著根據操作步驟1而被去除。所獲得的菌株被命名為演化五· eo// 15 ApykA, ApykF, AackA-pta, ApoxB ° 質體pJB137-PgapA-ppsA被引入菌株演化五.co/z·印 Ptrc\6-gapA，/ipykA，JpykF，/iackA-pta，ApoxB。所獲得的菌株被命名為演化 E. coli tpiArc Pircl6-gapA，ZipykA，/IpyJcF， AackA-pta, ApoxB (pJB137-PgapA-ppsA) ° 2〇在各個步驟，先前在菌株中所建立的修飾的存在可以使用表1中所給予的寡核苷酸來查驗。實施例6 :不同演化菌株在好氧條件下用於ι，2-丙二醇製造的比較 43 200904984 如同實施例4中所述般而被獲得的菌株以及對照組菌株（對照組1 :在厭氧條件下演化的MG1655 lpd* ζίρ/ΪΑΒ ΛαΜΕzlldhA::Cm ZigbA dald/laldB dedd 以反驚搏、組 2 :在微好氧條件下演化的MG1655 lpd*zi^L4办 5 10 」!dhA::Cm」gbA/lahUaIdB」edd)在好氡條件下於基本培養基(補充有酵母菌萃取物以及葡萄糖作為碳源）中被培養在一錐形瓶分析中。培養是在34。〇下被施行且pH是透過以 MOPS來緩衝鱗基而被_。在培養終點，㈣肉汁中的 1，2-丙二醇’ 及殘餘㈣較透過HpLc而被且i,2-丙二醇相對於葡萄糖以*认丙二醇+丙嗣醇相對於葡萄糖的產量被計算出。最佳菌株接著被選出以供样饋料-批次培養。菌株 1，2-丙二醇濃度(g/1) 丙酌醇度(g/ι) 對照組1 1.88 ----- 2.1 對照組2 0.7 --—~ 3.56 ‘漠化 E, coli tpiArc’ Ptrc\6'gapAy (pJB13 7-PgapA-ppsA) (從對照組1所建立） 0.14 1.84 — ‘漠化 E. coli tpiArc’ Ptrc\6-gapA, (pJB 13 7-PgapA -ppsA) (從對照組2所建立） 3.71 3.85 1，2-丙二醇產量 (g/g葡萄糖） —'— 0.16 0.06 ~~ — 0.03 0.20 1，2-丙二醇+ 丙酮醇產量 (g/g葡萄糖） 0.34 0.37 0.41 0.41 44 200904984 實施例7:利用最佳菌株在饋料-批次培養中製造1ν2_丙二醇在先前實驗中被選出的最佳菌株被培養在一個使用一饋料-批次操作步驟的21發酵槽。培養溫度被維持恆定在37°C下且pH使用一 ΝΗ4ΟΗ溶液被固定性地調整到介於6.5與8的數值。在批次相期間檀拌速率被維持在介於200與300 rpm而在饋料-批次相的終點被提高到1000 rpm。溶氧濃度是透過使用一氣體控制器而被維持在介於30與40%飽和度的數值。當最佳濃度到達一介於3與5的數值，饋料-批次是以一起始流速介於〇 3與〇 5 ml/h來被起始，且流速逐漸增加到介於2.5與3.5 ml/h。此時，流速被維持恆定歷時24到48小時。饋料培養基是以基本培養基(含有濃度介於300與500 gA的葡萄糖)為主。【圖式簡單說明】第1圖描述在醣的1,2-丙二醇製造系統的發展中，主要代謝的遺傳工程。【主要元件符號說明】無 45 200904984 序列表 <110> METABOLIC EXPLORER <120> i用於製造由演化及合理設計組合得到的ΐ，2·丙二醇之新穎微生物 <130> D24916 <150> PCT/IB2007/001680 <151> 2007-03-23 <160> 56 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211> 20 <212> PWA <213> ‘人工的 <220> <223〉寡核苷酸 <400> 1 ggtgatgata gttatcgccg }>> Λ > 01643 11 Ti 11 1 <2<2<2<2 2 20 ΠΜΔ 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 2 cgtgccatcg acagcagtcc 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 3 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30 <210〉 4 <211> 30 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400〉 4 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta <210> 5 <211> 22 <212> DNA 如〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 5 ggctcattgc accaccatcc ag 30 200904984 <210> 6 <2il> 24 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400〉 6 gaaaagacgc gctgacaata cgcc <210> 7 <211> 20 <212> mk <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 7

gccatcagca ggcttagccg <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 8 gggtattgtg gcatgtttaa ccg <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 9 gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g

<210> 10 <211> 31 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 10 gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g > > > > 0 1^3 ΊΑ 11 n t—I <2<2<2<2 11 31

DNA 人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 11 tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g <210> 12 <211> 31 200904984 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 12 31 40 cacgatgacg accattcatg cctatactgg c <210> 13 <211> 40 <212〉 <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 13 catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc

<210> 14 <211> 31 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 14 tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g 31

<210> 15 <211〉 24 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 15 ccccggaatc agaggaatag tccc 24

<210> 16 <211> 29 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 16 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400〉 17 gccatcagca ggcttagcgc 20

<210> 18 <211> 23 <212〉 DNA <213>人工的 3 200904984 <220> <223>寡核苷酸 <400> 18 gggtattgtg gcatgtttaa ccg <210〉 19 <211> 20 <212> ΠΝΑ <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 19 cgacaattgg attcaccacg

<210> 20 <211> 21 <212> MA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 20 gcggtattga aaggttggtg c

<210> 21 <211> 21 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 21 ccgtgagaag aatcgcgatc g <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 22

gcgtagtcgt gtaagtatcg c <210> 23 <211> 21 <212> DNA 人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 23 catttccggt ggtgcgattg c 的 ah 2429ΓΝΛ 寡核苷酸 <210> <211> <212> <213> <220> <223> 200904984 <400〉 24 gccacagccg gaatcatact tggtttggg <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 25 cgtcaacacc aacttcgtcc catttcagg <210> 26 <211> 23 <212> 廳 <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400〉 26 ggcaattacc ctcgacgtac egg

<210> 27 <211> 25 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 27 ccgatggatg atctgttaga ggegg <210> 28 <2!1> 22 <212> DNA. <213>人工的 <220〉 <223>寡核苷酸 <400> 28 gcgtaacctt ttccctggaa eg <210> 29 <211〉 24 <212> DNA d1%人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 29 gcgttgctgg agcaacctgc cage

<210> 30 <211> 20 <212> DNA <213>人工的 <220> <223〉寡核苷酸 <400> 30 gcatgggtaa aettaaggeg <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 31 taatcaccaa cgtatcgggc <210〉 32 <211> 21 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400〉 32 cgcggcttgg tcgggtaacg g 200904984

<210> 33 <211> 24 <212> DNA <213>人工的 <220〉 <223>寡核苷酸 <400> 33

tcgggctatt taaccgttag tgcc <210> 34 <211> 100 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 34 gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcticg <210> 35 <211> 101 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 35 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g <210> 36 <211> 98 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 36 ccccgcacat tcttatcgtt gaagacgagt tggtaacacg caacacgttg aaaagtattt 200904984 tcgaagcgga aggctatgtg taggctggag ctgcttcg <210> 37 <211> 99 <212> im 心3〉人工的 <220> <223〉寡核苷酸 <400> 37 ccagatcacc gcagaagcga taaccttcac cgtgaat£2t ggcgatgatt tccggcgtat ccggcgtaga ttcgaaatgc atatgaatat cctccttag <210> 38 <211> 99 <212> ΠΝΑ <2i3>人工的 <220〉 <223>寡核苷酸 <400> 38 ctctcacaaa ttcgctcaaa taataaacaa taaactctgt tttttgatct cacccggtaa agtcgcctat cttttcagct gtaggctgga gctgcttcg !>>>> 012 3 II* 1A «1 ΤΑ <2<2<2<2 的 OA工 3910Γ)ΝΛα <220〉 <223>寡核苷酸 <400〉 39

gcaacttcaa acgcggacgg ataacgcggt taatactccc caccagcatc attaatccgg ttttaaagta accatgcagc catatgaata tcctccttag <210> 40 <211> 124 <212> DNA 人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 40 ggSgctgacc ttcgctgttg aaccgattaa gctggcgcta tctgaatcgc ttgaaggttt gaataaatga tcacactggc tcaccttcgg gtgggccttt ctgccatatg aatatcctcc ttag <210> 41 <211> 106 <212> ΠΝΑ <2I3>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 41 gcgaataaag gaagatggcc gccccgcagg gcagcaggtc tgtgaaacag tatagagatt catcggcaca aaggctttgc tttttgtgta ggctggagct gcttcg 60200904984 <210> 42 <211> 100 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 42 agtcatatat tccaccagct atttgttagt gaataaaagc cacacattat tcgagccgga tgattaatag tcaacagctc tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 43 <211> 79 <212> WA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <40Q> 43 60 79 gctcacatta cgtgactgat tctaacaaaa cattaacacc aactggcaaa attttgtccc atatgaatat cctccttag <210> 44 <211> 101 <212> DNA <213>人工的 <220> <223〉寡核苷酸 <400> 44 60 101 cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g <210> 45 <211> 101 <212> ΠΝΑ 人工的 <220> <2M> *核苷酸 <400> 45 60 101 cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g <210> 46 <211> 98 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 46 60 cccatccttc tcaacttaaa gactaagact gtcatgaaaa agaccaaaat tgtttgcacc atcggaccga aaaccgaatg taggctggag ctgcttcg <210> 47 <211> 99 <212> DNA <9·Π>人工的 8 98 200904984 <220> <223>寡核苷酸 <400> 47 ggacgtgaac agatgcggtg ttagtagtgc cgctcggtac cagtgcacca gaaaccataa ctacaacgtc acctttgtgc atatgaatat cctccttag <210> 48 <211> 100 <212> IM β13〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 48 cgagtaagtt agtactggtt ctgaactgcg gtagttcttc actgaaattt gccatcatcg atgcagtaaa tggtg.aagag tgtaggcigg agctgcttcg <210> 49 <211> 97 <212〉酿 <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 49 gctgctgtgc agactgaatc gcagtcagcg cgatggtgta gacgatatcg tcaaccagtg cgccacggga caggtcgcat atgaatatcc tccttag 6Qi 99 60 100 60 97 <210> 50 <211> 99 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400〉 50 ccttagccag tttgttttcg ccagttcgat cacttcatca ccgcgtccgc tgatgattgc gcgcagcata tacaggctgc atatgaatat cctccttag 60 99 <210〉 51 <211> 102 <212> 脆 <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 51 60 cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc atctgggga® tcacaggcga ctctctgaac ggtgtaggct ggagctgctt eg <210〉 52 <211> 41 <212> mA <213> 人工的 <220> <223> 合成的啓動子 <400〉 52 9 102 200904984 41 gagctgttga cgattaatca tccggctcga ataatgtgtg g <210〉 53 <211> 65 <212〉 DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 53 ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgtcc aacaatggct cgtcaccgct 60 ggtgc 65 <210> 54 . <211> 43 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 54 aatcgcaagc ttgaatccgg ttatttcttc agttcagcca ggc 43 <210> 55 <211> 65 <212> 腿 <213>人工的 <220〉 <223>寡核苷酸 <400> 55 gcaccagcgg tgacgagcca ttgttggaca tatattccac cagctatttg ttagtgaata 60 aaagg 65 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 56

33 DNA 人工的寡核苷酸 56 acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33 10

Claims

200904984 200904984 15 20 2. 3. 4. 5. 、申請專利範圍： 1· 一種供製備微生物的-演化菌株用於從丙二醇的方法，該方法包含有：衣、M 於透擇壓力下將—起始s株生長在-適當生長培養基中’该起始細SS株含有扣A基因的弱化表現以及至少-涉及將曱基乙二_換成乳酸的基因的弱化，現，以促使該起始菌株的演化，並且分離具有—增加之I2丙二醇生產率的次化囷株如： = = 基因。 =酸的嫩mm 與α/泥以及它們的組合。 g/〇A aldA 項:方法，其中該起始菌株進化表現〜:、自二下：成:群組的基因的弱如申請專利範圍第,至3項的方法二^广。 —步包含有至少-選自於阶始菌株進因的弱化表現。所構成之群組的基如申請專職㈣丨至4項#_ 化菌株是根據其丨，2丙二醇生 >方法，其中該演產率增加達至少20%，而被選定^且目八 =起始菌株的生專利範圍第〗至5項令任_者:離方: 始囷株是選自於由細菌，酵母去，其中該起固以及真固所構成的群組。 46 200904984 7. 如申請專利範圍第6項的方法，其中該起始菌株是選自於下列所構成的群組：腸内桿菌科、有芽胞桿菌科、梭菌科，鏈絲菌科以及棒狀桿菌科。 8. 如申請專利範圍第7項的方法，其中該起始菌株是大腸 5 桿菌或丙酮丁醇梭菌。 9. 一種經由根據申請專利範圍第1至8項任一者的方法而被獲得的微生物之演化菌株。 10. 如申請專利範圍第9項的演化菌株，其中該甘油酸3石舞酸去氫酶活性被弱化。 ίο 11.如申請專利範圍第10項的演化菌株，其中gcpA基因的表現被弱化。 12.如申請專利範圍第9至11項任一者的演化菌株，其中糖 _ 輸入的效率被增加。 • 13.如申請專利範圍第12項的演化菌株，其中獨立於礙酸稀 15 醇丙酮酸的一糖輸入系統被使用。 14. 如申請專利範圍第13項的演化菌株，其中至少一選自於 gfl/P與g/A：的基因的表現被增加。 15. 如申請專利範圍第12項任一者的演化菌株，其中糖-填酸轉移酶系統的效率是透過增加代謝物磷酸烯醇丙酮酸的 20 可利用性而被增進。 16. 如申請專利範圍第15項的演化菌株，其中至少一丙酮酸激酶的活性被弱化。 17. 如申請專利範圍第16項的演化菌株，其中至少一自於以及；的基因的表現被弱化。 200904984 專利耗圍第15至17項任一者的演化菌株，1中 %夂稀醇丙酮酸合成酶活性被增加。，、中 9. 她圍第18項任—者的演化菌株，其中基因的表現被增加。 ’、ΡΡ^Α 20.如申請專利範圍第好將丙酮酸代謝:=9項任一者的演化菌株’其中偏 §&基-(：：0入的酵素相較於未經修德έΛ 21 士由^^NADH之抑制具有—較低的敏感性。、 -、心圍第2〇項的演化菌株，其中㈣基因具有則夂55被一绩胺酸所取代的點突變。' 以如申請專利範圍第9至21項任一者的演化菌株， V-涉及醋酸合成的酵素之活性被弱化。 '、 23·如申請專利範圍項的演化菌株，其中至少一選自於 adA，以及ρ〇χΒ的基因表現被弱化。、 15 20 :種用於製備丙二醇的方法’其中根據申請專利範圍第1至23項任一者的一演化菌株被生長在含有一碳源的適當生長培養基中，且所製造的1,2-丙二醇被回收。 25. 如申請專利範圍第24項的方法，其中大腸桿菌的一演化菌株被生長在含有一簡單碳源的適當生長培養基中，且所製造的1，2-丙二醇被回收。 26. 如申請專利範圍第24項的方法，其中丙_丁醇梭菌的一演化菌株被生長在含有一簡單或複雜碳源的適當生長培養基中’且所製造的1,2-丙二醇被回收。 27. 如申請專利範圍第24至26項任一者的方法，其中回收的1，2-丙二醇被進一步純化。 48