TW200904984A - New micro-organisms for the production of 1,2-propanediol obtained by a combination of evolution and rational design - Google Patents
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Description
200904984 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明涉及一種組合演化以及合理設計供用於製備一 微生物以製造1,2_丙二醇(ij-propanedioi)的新方法,藉此而 得到的微生物以及其用於製造丨,2_丙二醇的用途。 【先前技術】 l,2-丙二醇或丙二醇(pr〇pyleneglyc〇l),一種 0 二醇, 疋一種被廣為使用的化學品。它是不飽和聚酯樹酯❻〇1%以沉 resins)、液怨清潔劑、冷卻劑、用於飛機的抗凍劑以及防凍 液的一個成分。丙二醇從1993_1994開始被越來越多地用作 為種乙晞仿生物(其被認為較丙稀衍生物更為具有毒性)的 替代物。 / 15 人丨,2-丙二醇目前是由使用氧化丙烯(pr〇Pylene oxide)水 合作用(消耗大量的水)的化學方法所製造。氧化丙烯可以是 =兩種方法任—種所製造,一者使用表氯醇 (啊hi吻drin) ’而另一者使用氫過氧化物(hydr—de)。 =種途#使用高毒性的物質。此外,氫過氧化物途徑產生副 2〇 物诸如丁醇以及苯基乙醇。為了讓製造丙稀是有利 〜制:種有關於這些副產物的用途必須被找出。化學途徑通 造出消旋丨,2_丙二醇,而兩種立體異構物陣,丙二醇 /及(β1,2-丙二醇的每一者對於特定應用來說是有利益的 (例如用於^化學品以及藥學產品的手性起始原料)。 用於製造1,2-丙二醇之化學方法的缺點使得生物合成 6 200904984 變成一種具吸引力的替代法。兩種途徑的特徵在於由微生物 從糖類天然製造1,2-丙二醇。 在第一個途徑’ 6-去氧糖(6-deoxy sugars)(例如L-鼠李 糖或L-海藻糖)被切成二羥丙酮磷酸(dihydroxyacetone 5 phosphate)以及(S)-乳酸醛(lactaldehyde),其可以進一步被還 原成(S)-l,2-丙一醇(Badia et al,1985)。這個途徑在五⑺"是 有功能的’但疋卻因為去氧六碳糖之升高的費用而無法產生 一種經濟上可行的方法。 第二個途徑是常見糖(common sugars)(例如葡萄糖或木 10 糖)經由糖解途徑接著曱基乙二醛(methylglyoxal)途徑的代 謝。二羥丙酮磷酸被轉換成能夠被還原成乳酸醛或羥丙酮 (acetol)的曱基乙二醛。這兩種化合物可以接著歷經一個產生 1,2-丙二醇的第二個還原反應。這個途徑是丙二醇 的天然生產者所使用’ s者如楔狀桿菌(C/⑽π•出麵烈) 15 以及嗜熱糖解嗜熱厭氧桿菌(rb腳⑽經〇6沉你 如rmwaeckrofyto/m)。楔狀桿菌已被用於在磷酸限定的條 件下以1,58 gd的濃度(titer)來製造L2—丙二醇(Tmn Din and Gottschalk,1985)。嗜熱糖解嗜熱厭氧桿菌亦已被研究有關 於製造 1,2-丙一醇(camer〇n and c〇〇ney, 1986, 2〇 Sanchez-Rivem et al,1987)。所獲得的最佳成果是一為 9 g/1 的濃度以及一從葡萄糖而來的2,2 g/g產量。然而,因為缺 乏可供利用的这傳工具,利用這些微生物所獲得的成果增進 可能是有限的。 7 200904984 先前技藝
Cameron等人(1998)已研究使用s⑺㈣制於代謝工 程的—個平台以供為將糖類轉換成U·丙二醇。他們的理論 分析顯示··實際產物產率的上限(考量f量均衡以及用於生 5 長的⑥讀造)隨著培養條件而明顯有別。在厭氧條件下, 醋酸將如同-副產物被生成以再循環還原的辅因子且每莫 耳葡萄糖的最佳生產率被限定為丄莫耳的u_丙二醇(〇,42 氧條件下’翻子的制環是域用氧作為最終 屯子又肢_(terminal electron acceptor)的啤吸鏈所確保且它可 10 以不生成副產物地來製造出1,2-丙二醇。在這些條件下,產 ,可=達到最佳1.42 mol/mol (〇,6 g/g)。考量12-丙二醇的 最大'/辰度,Cameron等人探討它在產物以及副產物毒性上的 依賴性。1,2-丙二醇較1,3-丙二醇是明顯地較不具有毒性的 且五.c〇/z•展現出一為〇.5 h·1的具有100的的丨,2_丙二醇之 15 殘餘生長率(residual growth ate)。生長抑制比較可能是因為 田1J產物醋酸(被知曉為南度生長抑制的)。發展用於製造具有 尚/辰度與產量之1,2-丙二醇的厭氧方法必須滿足醋酸問題。 將酉a 轉換成丙酮已被提議,其是較低抑制性並且易於從現 址(Z>2如W)被移除。 20 為了要獲得使用簡單碳源的1,2-丙二醇生產者,一些有 關於五· 之遺傳修飾的研究已由Cameron的團隊 (Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and
Cameron,2000)以及 Bennett 的團隊(Huang et ai,1999, Berrios-Riveraetal,2003)來進行。這些研究一方面依靠一或 8 200904984 多種從一羥丙酮填酸到1,2_丙二醇的途徑中的酵素活性的表 現以及另一方面依靠宿主菌株中的NADH移除以及碳消耗 途徑。由Cameron的團隊所獲得的最佳結果是在厭氧培養瓶 培養中以0.2 g/g的葡萄糖消耗量而製造14 g/1的丙二 5 醇^外推到一嚴氧饋料-批次發酵槽(anaerobic fed-batch fermenter)’以從0.19 g/g葡萄糖量來製造4,5 g/1的丨,2_丙二 醇,遠遠超過Cameron等人的理論評估。這些結果是在缺少 編碼乳酸去氫酶(W々A)之基因的菌株中利用五⑺"的曱基乙 二醛合成酶基因(mgs) ’仄co"的甘油去氫酶基因以及 1〇 [ co/z·的丨,2_丙二醇氧化還原基因(/wcO)的過度表現而被獲 得。利用相同方法但具有較低濃度以及產量之所獲得的結^ 亦被描述在專利案US 6,087,140、us 6,303,352以及W0 98/37204。
Bennett的團隊也使用一缺乏的五⑺"宿主菌株以 15 過度表現丙輞丁醇梭囷(C/osM必麵βπίοό吻的所识 基因以及〖滅W抑八基因。培養瓶培養在厭氧條件下給 、 予—為丨以1的濃度以及-為0.12 g/g的產量而微好氧典: 給予一濃度為1.4 g/Ι帶有一產量為〇13 g/g。 -種獲得製造1,2 -丙二醇之菌制替代法是指引—“起 20 始菌株(initial strain),,演化朝向一狀態,其中“演化菌株 (evolved strain),,以較佳的特性來製造所欲的化合物這:方 法是以微生物的自然演化為主,該微生物首先受到兩個基因 (切l4以及一個涉及甲基乙二醛轉換成乳酸的基因)的弱化 (attenuation)所修飾。弱化編碼有關三碳糖磷酸異構酶之'中以 9 200904984 基因的目的在於從甘油醛-3-磷酸 (glyceraldehyde-3-phosphate, GA3P)以及二 |里丙 _ 石粦酸 (DHAP)(它們通常由此酵素所轉換)開始來分開兩個代謝分 支。從DHAP到1,2-丙二醇的途徑將是消耗還原輔因子 (NADH)的“還原性分支(reducing branch)”,而從GA3P到醋 酸的代謝將是製造NADH以及供用於細胞生長之能量的“氧 化性分支(oxidative branch)”。在缺少一功能性妒L4基因的狀 況下,細胞的代謝是被“鎖定的(locked),,且菌株的生長,1,2-丙二醇的製造以及醋酸的製造是被緊密地結合。在一適當生 長培養基的選擇性壓力下,此起始菌株將演化到一種狀態, 其中由該菌株製造的1,2-丙二醇被增進。此獲得微生物之一 “演化的菌株’’以供製造1,2-丙二醇的步驟被描述於專利申請 案W0 2005/073364。此演化方法以及發酵的後續步驟在厭 氧條件下是優先地被施行。此技術無異是一個超越其它先前 技術的增進。一為1.8 g/Ι的1,2-丙二醇濃度被獲得,具有消 耗每公克葡萄糖為〇·35公克的產量,接近cameron等人的 理論結果。 本發明之目的為一 1,2-丙一醇生產者的增進,透過演化 菌株的演化以及隨後的合理遺傳工程。一個特別的特色為在 演化負菌株你fA minus strain)中重建一功能性和a基因。這 些修飾導致1,2-丙二醇的一增進製造。 【發明内容】 本發明涉及一種新方法,組合演化及合理設計以供製備 10 200904984 用於從-碳源製造1,2_丙二賴微生物。該方法包含 -於選㈣力下將-起始菌株生長在—適t生長培養基 中《亥起始細菌菌株含有卬Μ基因的弱化表現以及至少 涉及將甲基乙二醛轉換成乳酸的基因(諸如g/0A、 «織、你B)的弱化表現,以促使該起始菌株的演化, -接著選擇並且分離具有一增進之丨,2_丙二醇生產率(增 加達至少20%)的演化菌株 曰 _繼而在該演化菌株中重建一功能性中Ζ·Α基因。 在本發_-财面,麵要的财物之合成是透過刪 除編碼有關涉及從丙_酸(/顯)、甲酸⑽Α,柳)、乙酉台 ㈣紐)合成乳酸_素而被弱化。在本發明的另一個太而,子
妝J,敗云虱崦沽性被降低以重新指引一部分可用沾叶油
不論是使用一與磷酸烯醇
—個方面,糖 200904984 丙酮酸(PEP)無關之糖輸入(像是由gdp所編碼者),或是提 供更多PEP給糖-璘酸轉移酶系統。這是藉著去除消耗pEp 的途徑(像是丙_酸激酶,由刃以及砂汗基因所編碼)和/ 或藉著促進PEP的合成(例如藉著過度表現編碼有關pEp合 成酶的ρ;λ^Α基因)而被獲得。此外,對於將丙酮酸轉換成乙 醯基-coA的酵素來說,耐受在厭氧條件下被發現為高濃度 NADH是有用的。這可以藉著在/;^基因的一個特定突變而 被獲得。有利地,副產物醋酸的合成是透過弱化從、 ροχΒ的一或數者而被避免。 10 15 本發明亦有關於一種用於以一取住化屋量,在好氧、微 好氧或厭氧條件下,使職生長在—含有―簡單碳源之適當 ^長培養基的五·⑺"的演化或選擇性地遺傳修飾菌株來^ 造1,2-丙二醇的方法。此外,本發明有關於一種用於以一田 佳化產量,在厭氧條件下,使用被生長在—含有—簡= 雜破源之適當生長培養基的丙町醇梭㈣演化或選 ^遺傳修飾的菌株來製造丨,2丙二醇的方法。根據此方 衣造的1,2-丙二醇接著被回收並且選擇性地被純化。 本發明的詳細說明 請專利範圍 如此處所用的下列術語可以被用來解釋申 以及說明書。 術語‘菌株(strain),表示一物種(spedes)的遺傳變 (genetlc variant)。因而術語‘微生物的菌株, 二 生物之-物種的遺傳變異體。被給予任何菌株的特性亦= 20 200904984 於對應微生物或反之亦然。 根據本發明術語‘培養(culture),、‘生長(gr〇wth),以及‘發 酵(fermentation)’被交替地使用以表示細菌在一含有一簡單 碳源之適當生長培養基中的生長。 5 術語‘碳源(carbon source)’根據本發明表示任何可以被 那些習於該技藝者所使用以供支持微生物的正常生長,且其 可以是六碳糖、五碳糖、單醣、雙醣、寡糖、澱粉或其衍生 物、半纖維素、甘油以及其組合之碳的來源。 術語‘適當的生長培養基(appropriate gr〇wth medium),根 l〇 據本發明表示一種具有適於微生物生長之已知分子組成物 且被設計以促使所欲演化的培養基。 根據本發明的演化法是一種用於製備演化微生物(表現 增進之製造特性)的方法,並且包含有下列步驟: a) 修飾一微生物以獲得一帶有一“鎖定,,代謝的起始菌株, 15 其中當起始菌株的細胞被生長在一適當培養基上時,哕 演化只採取所欲方向, ~ b) 令上面所獲得的起始菌株在該適當培養基上生長以使它 凟化,其中該起始菌株是被生長在好氧、微_好氧或厭氧 條件下 20 c)選擇可以在那些特定條件下生長的‘‘演化菌株,,,表現有 關所欲化合物的製造特性。 & 此演化法已廣泛地被描述在相同申請人的專利申請案 2004/076659(於 17/02/2004 提出申請),以"及 w〇 2005/073364(於 12/01/2005 提出申請)中。 200904984
術浯選擇(selection),根據本發明表示一種方法,复 有被、准持在培養機巾的微生物H株是那些在選擇壓力 下表現-較佳適應性(fitness)者。典型地,最適應失 得比它們的競爭者快並且接著被選出。—個在—族鮮中= 微生物的—特定演化的簡單方法是在-個連續拉養中 生長該族群,其中緩慢生長的菌株最終從培養物中被^提 這不是用於選擇的唯—實例,且其它由該領域 知的選擇方法可以被施I 10 15 20 術語‘分離(isolation),表示一個方法,其中一表現特 傳修飾的獨立g株從一表現不同遺傳特徵的菌株族群中被 分離。這是由在演化顧之後減生㈣量並且將它塗 培養孤上以分離單一菌落而被完成。 術語‘m醇生產率,意指—個以g/1/h表示的產 它是如下列而被計算出: 在垮養基令^^ 農度(g/D/用^^直 造所需時間、 此外,一以g/g/h表示的特定生產率,考慮生物質量的 數量地可以如下列而被計算出: μ-» 農唐 rg/lv在培 g 中所製造_^4^1^^&^££^1}^_於此-造所需時I (h) 生物質量的展度是透過利用一讀取例如600 nm的分光 光度計來測量發酵肉汁的吸光值或透過在乾燥一預定體積 之發酵肉汁之後,測量細胞乾重而被決定。 14 200904984 所生成的1,2-丙二醇數量是由高效液相層析法 lc) 根據該技If作步驟的狀態而利用-適宜管柱來被測量。 ,在月中,馮化菌株是因為下列特徵而被選出:一個 立:加的葡萄糖攝取逮率㈣也她)以及一增進的1,2·丙二 醇生產率纟現這些特徵的_株接著被分離,並且有利地彼 此比較,以鑑定出最佳的生產者。 X g/1/h表示的葡萄糖攝取速率是如下列而被計算出: 鱼祐f物近边起_^_萄糖濃度(g/i)/生遂耗所雹日吝問化) 特疋的葡萄糖攝取速率可以如同上述般透過考慮培 養基中的生物質量濃度而被計算出。 葡1 糖攝取速率以及u丙二醇生產率是緊密地被連 結。若葡萄糖的消耗增加,從葡萄糖代謝而來的產 相同比例增加。 在選擇以及分離之後,最―化8株呈現—高於起始 菌株的攝取大約20〇/〇的葡萄糖攝取,較佳地高於大約3〇%或 更高,更佳地高於50%。 增加的1,2-丙二醇生產率是高於起始菌株的生產率大 約20%,較佳地高於大約30%或更高,更佳地大約高於5〇%。 矽/A基因編碼酵素‘三碳糖磷酸異構酶,,其催化DHAp 以及GA3P的轉換(參見第1圖)。弱化此基因的目的在於建 造細胞的代謝以使得演化可以朝向最有效率的丨,2_丙二醇製 造。 術語弱化一基因的表現(attenuation 〇f the eXpressi〇n 0f a gene)’根據本發明表示部分或完全抑制一基因的表現,其 200904984 接著被說是‘弱化的(attenuated) ’。此表現的抑制可以是抑制 (inhibition)該基因的表現、抑制該基因的一活化機制、刪除 基因表現所需的啟動子區域之全部或部分,或刪除該基因的 標碼區域。較佳地,一基因的弱化基本上是那個基因的完全 刪除,該基因可以是由一個有助於鑑定、分離以及純化根據 本發明之菌株的選擇標記基因所取代。一基因較佳地是由如 同在 Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) “〇ne_step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645中所述的同源性重組技術所不活化。其他方法 在下面被描述。 術語‘表現(expression)’意指一引起產生對應蛋白質,基 因產物之基因序列的轉錄以及轉譯。 術語‘在演化菌株中重建一功能性卬Ζ·Α基因,表示在透 過引入一功能性妒/A基因的演化步驟之後,經選定的演化 菌株被修飾;這可以藉由經同源性重組以一野生型功能性複 本取代該基因的弱化複本,因此將三碳糖填酸異構酶活性修 復到類似於在起始菌株中被測量到的活性,或是藉由引入一 功能性卬/Α基因到一不同的染色體基因座上或藉由引入一 功能性妒/Α基因到一質體上而被達成。此修復能夠透過部 分地回收GA3P到DHAP以藉著三碳糖磷酸異構酶作用供製 造1,2-丙二醇,允許葡萄糖的〗,2_丙二醇製造的產量大於1 莫耳/莫耳。 弱化至少一涉及將曱基乙二醛(2_側氧丙醛)轉換成乳酸 16 200904984 的基因表現的目的在於抑制將曱基乙二醛轉換成乳酸,故出 現的甲基乙二醛主要地被細胞機械用於合成丨,2_丙二醇。 涉及將甲基乙二醛轉換成乳酸的基因特別是: _ 一個編碼乙二醛酶(glyoxalase)的基因,例如編碼乙二醛 5 10 15 酶1(催化從曱基乙二醛到乳酸麩胱甘肽的合成)的 基因; _編碼一乳酸醛去氫酶的i/WA以及基因(催化從(Q 乳酸醛到(¾乳酸的合成)。 ^些基因的-或多個的表現在起始_株巾是有利地被 弱化(或該基因是完全地被删除)。較佳地沙A基因被刪除。 一個額外的修飾是有利地使得起始菌株抑制天然葡萄 糖發酵途徑,其消耗還原等效物像是NADH並因此與1孓 丙二醇生合成途徑競爭。 ’_ 特別地’弱化編碼有關乳酸去氫酶(催化從两铜酸到乳 酸的合成)之慰基因表現,以及編碼有關醇屬去氮酶 化從乙醯基·〇>Α到乙醇的合成)的基因祕E的表現是有 66 。 類似地’強職生減㈣晴錢_合如從 酸來製造乙醯基_C〇A从NADH是可行的。料以 化基因冰A以及冰B (編碼有關丙晴甲酸解離酶)的現 而被達成。 兄 弱化至少一編碼有關涉及恩納杜道夫途徑之酵素 因^/以及油,也被應用於預㈣萄糖直接代謝成甘ς -3-磷酸以及丙酮酸(可以繞過丨,2_丙二醇合成途秤)。’終 200904984 ^在厭氧或微好氧條件下,用於還原前驅物成為1,2-丙二 醇之NADH❸可利用性是有利地被提高。這是透過減少對 一缓®文循壞的抑制(由通用調節劑Arac (global regulator Arac,由wcA基因所編碼)所媒介)而被獲得。細胞中的 5 NADH漠度也可以透過不活化NADH去氫酶II (由基因祕 所編碼)而被提高。因此,較佳地,至少一選自以及 的基因讓其表現被弱化。 杈佳地,5亥起始菌株是選自於由細菌、酵母菌以及真菌 所構成的群組。 1〇 更佳地’該起始菌株是選自於由腸内桿菌科 (Enterobacteriaceae)、有芽胞桿菌科(Bacillaceae)、梭菌科 (Clostridiaceae),鏈絲菌科(Streptomycetaceae)以及棒狀桿菌 科(Corynebacteriaceae)所構成的群組。 在本發_ -祕實施财,該絲g株為大腸桿菌或 15 丙酮丁醇梭菌。 易於被獲得的演關株’以及諸如透過前述方法而被獲 ' 得的演化菌株,亦為本發明的一個標的。 在此演化菌株中,修飾特定基因的表現是有利的,亦即 增加或弱化基因表現。這些修飾允許增進〗,2_丙二醇製造 20 果。 -^ 為了要獲得感興趣之基因的過度表現,習於該技蓺人士 知晚不同的方法,例如: ~ 以一較強的啟動子取代内源性啟動子 _將一帶有該感興趣之基因的表現載體引入微生物 200904984 _將感興趣之基因的額外複本引入染色體。 習於該技藝人士知曉用於將DNA引人—細菌菌株的一 些技術。-被偏好陳術為f穿孔,其為料習於該技 所熟知。 β 為了要獲得-基因表現的弱化,不_方法是f於該技 藝人士所熟知,並且在下面被描述。 在本發明的一特定實施例中,該演化菌株是透過弱化甘 油醛3磷酸去氫酶(GAPDH)活性而被修飾,以減少往醣解 (glycolysis)的較低部分的流動並且重新指引它朝向DHAp以 及最終1,2_丙二醇的合成(參見第丨圖)。這降低的活性可能 特別是由弱化基因的表現而被獲得。 術語‘弱化一酵素的活性(attenuation of the expression of a enzyme)’意指降低感興趣之酵素的活性,相較於一演化菌 株在任何修飾之前被觀察到的活性。習於該技藝人士知曉一 些方法來獲得這個結果,而且例如: - 將一突變引入基因’降低此基因的表現水準,或所編碼 之蛋白質的活性水準。 ' 以一低強度的啟動子取代該基因的天然啟動子,造成— 較低的表現 - 使用去穩定對應信使RNA以及蛋白質的元素(dement) - 若完全不表現是所欲的,刪除該基因。 有利地在該演化菌株中’糖輸入的效率增加。強烈弱化 即基因的表現導致碳流入GAPDH降低達超過5〇%,這 將造成每莫耳輸入的葡萄糖合成少於1莫耳的碌酸稀醇丙 19 200904984 酮酸(PEP),。糖-填酸轉移酶系統(sugar_ph〇sph〇transferase system)通常確保簡單糖輸入細胞是偶合到給予葡萄糖磷 酸的磷酸化反應。此反應所需的磷酸是由pEp成為丙酮酸的 轉換所提供’因此透過降低通過甘油醛_3_磷酸的流動來降低 所生成的PEP數量會降低糖輸入。 在本發明的 10 15 忖疋I她例中,糖可以是由一獨立於磷酸 婦醇丙酮酸可利用性的糖輸人系統運送人微生物内。由基因 ㈣p所編碼的半乳糖_ f子同向運輸蛋自(gaiaetQse_pr〇t〇n SymP〇_(不涉及磷酸化)可以被採用。在此例中,輸入的葡 萄糖必須受到葡萄糖激酶(由班基因所編碼)所鱗酸化。為 工促’至少一選自於_以及g从的基因表現被提 同只、、,果PTS變成非必要的且可以透過弱化至少一選自於 、户“或.的基因表現而被去除。 、 代謝^3 4权實施例中’m的效率是透過增加
酮酸,在本發明的修飾菌株中的PEP數I 二^有各^成—較低數量的葡萄糖被運送到細胞内。 存在有各種不同可在—微 性的方法。特別地,—種方法3^料~加PEP可利用 佳地,至少一選自 '反應PEP—丙酮酸。較 酸激酶酵素)的表現是 = ^ 的基因(編碼有關兩酮 另-個方法是>力續得這個結果。 合成酶的活性;:二可利用性以透峨稀醇两綱酸 酸合成酶所催化)個;酸〜PEP (由磷酸晞醇_ k個酵素疋由基因所編碼。因此, 20 200904984 較佳地在該微生物中基因的表現被提高。兩種修飾可 以同時存在於微生物中。 特別是在厭氧或微好氧條件下,丙酮酸去氫酶複合體 (pyruvate dehydrogenase complex,卩〇0)(將丙_ 酸轉換成乙 5 醯基-coA)對於NADH的抑制具有低的敏感性。術語‘低的敏 感性(low sensitivity)’是參考一未經修飾的酵素的敏感性而 被定義,像是在WO 2005/073364中所敎示的。特別地,此 種特徵可以透過將一個特定突變引入/;^基因(編碼有關 PDC的次單位硫辛胺去氫酶)造成在該酵素的蛋白質序列之 1〇 丙胺酸55被一纈胺酸所取代。 在本發明的另一個特定實施例中,副產物醋酸的合成是 被避免的。在完全好氧條件下,還原的辅因子NADH較佳 地疋利用氧作為最終電子受體而經由呼吸鏈被氧化成 NAD+。因此,一副產物(例如醋酸)的合成是不被禁止的。 15 較佳的是避免此醋酸合成以最佳化1,2-丙二醇的製造。 為了要避免醋酸的製造,至少一涉及醋酸合成的基因的 活性有利地要被弱化。優先地,至少一選自於此从,尸如以 及;70ΧΒ的基因的表現要被弱化,這些所有基因編碼有關涉 及不同醋酸生合成途徑(參見第1圖)。 20 本發明之另一主體是一用於製備1,2-丙二醇的方法,其 中一諸如前述的演化菌株被生長在一適當的生長培養基(含 有一碳源)中’並且接著所製造的丨,2_丙二醇被回收。製造 1,2-丙二醇是在好氧,微好氧或厭氧條件下被施行。 有關於根據本發明之微生物的培養條件(發酵)可以由那 200904984 一。!於:緖藝者所易於定義。特別地,細菌在介於2。。。與 下被發酵,較佳地介於25。。與4crc,以及更佳 在大約37^丁醇梭菌來說在大約3rc以及對於方· W來說 ?"(batch process)' 、菌株可以被用來在好氧’微好氧或厭氧條件下製造 1,2-丙二醇。 f好乳條件下’表示氧藉著溶解氣體於液相中而被提供 。這可以透過⑴喷灑含有氧的氣體(例如空氣)成為 液相或⑺震盪含有料基的容㈣將被包含在· 條件取代厭氧 1!Ι:ΪΓ 氧作為一電子受體的存在會促進菌株 15 20 ==YTP形式的能量以供細胞處理的能力。因此該 囷株讓其一般代謝被增進。 微·好氧料蚊義為培祕件,料缸分比 如^含有介於(U以及·氧,以氮加足相G%的氣^ 之/Wi合物)被溶解成液相。 巧條=被定義騎養·,其巾沒有氧被提供至培養 土。嚴可缝條件是透射[躲㈣(像技)到培 中以移除微1的其它氣體。確酸可以被用做為—電 = 透過菌株增進ATP生成並且增進其代謝。 乂 菌株的培養,在演化法以及用於製造丨义 步驟期間,是在發酵槽中利用—具有適用於所肠菌的t 22 200904984 套組組成物之培養基(含有至少一碳源)來進行。特別地’一 用於五.CO"的礦物質生長培養基可以因此具有相同或類似 於 M9 培養基(Anderson,1946,Proc. *SW.以以 32:120-128),M63 培養基(Miller,1992; A Short Course in 5 Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacterial, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York)或一諸如那 些由 Schaefer 等人(1999, 270:88-96)所界定之 培養基,並且特別是在下面被命名為MPG之基本培養基的 10 組成物: K2HP〇4 1.4 g/1 氮基三醋酸(Nitrilo Triacetic Acid) 0.2 g/1 ~〜 微量元素溶液* 10ml/l (NH4)2S〇4 1 g/1 ' NaCl 0.2 g/1 NaHC03 0.2 g/1 MgS04 0.2 g/1 葡萄糖 20 至 100 g/1 NaN〇3 ------- -------------- 0.424 g/1 口塞胺(thiamine) ------ ---— 10 mg/1 FeS〇4, 7H2〇 -------- ---—. 50 mg/1 __酵母菌萃取物 — 4 g/1 培養基的pH以氬氣化納調整至7.4。 23 200904984 *崴擰檬酸 4,37 g/L,MnS04 3 g/L,CaCl2
1 g/L ’ C〇Cl2, 2H20 0.1 g/L ’ ZnS〇4, 7H2〇 0.10 g/L,CuSCJ 5H20 10 mg/L,H3B〇3 10 mg/L,Na2Mo〇4 8.31 mg/L。 在本發明的一特定實施例中’該方法是使用一五⑶" 的演化菌株,在一含有一簡單碳源(可以是:***糖、果 糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖)的生長 培養基中被施行。一特別被偏好的簡單碳源為葡萄糖。 在本發明的另一特定實施例中,該方法是使用丙_丁醇 10 15 梭菌的演化菌株,在一含有一簡單或一複雜碳源的生長培養 基中被施行。 用於丙酮丁醇梭菌的生長培養基可因此是具有與梭菌 生長培養基(Clostridial Growth Medium, CGM)(Wiesenborn et al.,Appl. Environm. Microbiol.,54:2717-2722)或由 M〇n〇t 等人(APPl· Environm. Microbi〇1·,44: 1318七2 句或
Vasconcelos 等人(J.Bacteri〇i” 176: 1443_145〇)所給予的一二 物質生長培養基相同或類似的組成物。 κ 、用:丙酮Τ醇㈣培養的碳源可以是—簡單或 ,源。簡,碳源可以是***糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、、 捕麥芽糖、藉、糖或木糖。一特別被偏好的簡單 萄糖。複雜韻可以是㈣或半纖維素。—制好= 雜碳源是澱粉。 甸丨的歿 k先地回收的1>2_丙二醇被進一步純化。習於該 人士知曉用於时並且純化所生產之m醇的方法。^ 200904984 些方法是慣用的方法。 +f、、本發明是如上,如下以及在有關於五.co//的實施例中被 描述。因此有關於根據本發明的起始以及演化菌株之可以被 弱化、刪除或過度表現的基因主要地使用£•⑺"的基因命名 5 而被界定H此命名具有—根據本發明之更為通常的意 思,並且含括在其它微生物内的對應基因。利用五·⑶"基因 的GenBank參考資料,那些習於該技藝者可以決定在五⑺" 以外的其它生物之相同基因。 鑑定同源性序列以及它們的同源性百分比的意思對那 10 些白於5亥技藝者來說為已知的,並且尤其包括可以在網站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ L利用在那個網站上所 指明之預設參數來被使用的blast程式。所獲得的序列可 以使用例如程式 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalwA 利用這些網站上所指明的預設參數來被運用(排列)。 15 PFAM資料庫(排列以及隱藏性馬可夫模型的蛋白質家 族資料庫(protein families database of alignments and hidden
Markov models bttp://www.sanger.ac,uk/Software/Pfam/))气一 個蛋白質序列排列的大型收集。每個PFAM可以顯現多重排 列,觀看蛋白質領域’評估生物之中的分布,或得到其他資 20 料庫的進入權力並且顯現已知的蛋白質結構。 COGs (蛋白質直向同源群組的群聚(Clusters of orthologous groups of proteins) iittp.//www.ncbi.nlm.nih,gov/COG/)异诱過比較衍生白 66 個 完全被定序的染色體(代表4 4個主要的系統發育系)的蛋白 25 200904984 質序列而被獲得。各個COG是從至少3個發育系來被界定, 可以鑑定出古老的保守領域(ancient conserved domains)。 參考文獻依照内文中的引用順序 5 10 15 20 1. Badia J, Ros J, Aguilar J (1985), J. Bacteriol. 161: 435-437. 2. Tran Din K and Gottschalk G (1985), Arch. Microbiol. 142: 87-92. 3. Cameron DC and Cooney CL (1986), Bio/Technology, 4: 651-654 4. Sanchez-Rivera F, Cameron DC, Cooney CL (1987), Biotechnol. Lett. 9:449-454 5. Altaras NE and Cameron DC (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65:1180-1185 6. Cameron DC, Altaras NE, Hoffman ML, Shaw AJ (1998), Biotechnol. Prog. 14:116-125 7. Altaras NE and Cameron DC (2000), Biotechnol. Prog. 16: 940-946 8. Huang K, Rudolph FB, Bennett GN (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 3244-3247 9. Berrios-Rivera SJ, San KY, Bennett GN (2003), J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 34-40 10. Datsenko KA and Wanner BL (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645
11. Anderson EH (1946), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 26 200904984 32:120-128 12. Miller (1992), A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 5 Cold Spring Harbor, New York 13. Schaefer U, Boos W, Takors R, Weuster-Botz D (1999), Anal. Biochem. 270: 88-96 14. Wiesenborn DP, Rudolph RB, Papoutsakis ET (1987), Appl. Environ. Microbiol., 54: 2717-2722 ίο 15.Monot F, Martin JR, Petitdemange H, Gay R (1982), Appl
Environ. Microbiol. 44: 1318-1324 16. Vasconcelos I, Girbal L, Soucaille P (1994), J. Bacteriol. 176: 1443-1450 15 20 【實施方式】 實施例 下列實施例顯示: 1- 建構一個經修飾的五,co//菌株MG1655 ΑρβΑΒ, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, A arc A, Andh 2- 演化該起始菌株 3- 在該選定的演化菌株重建中/A基因 4- 弱化gapA基因;刪除基因pykA以及pykF ;過度 表現ppsA基因 27
200904984 5_ 刪除基因 ackA-Pta,P〇xB 6- 在好氧條件下比較數個所獲得的菌株有關丨,2_丙二 醇製造 7- 在利用最佳菌株的饋料-批次培養基中製造ι,2_丙二 5 醇 實施例1 :建構一個能夠朝向增進1,2_丙二醇製造演化之經 修飾的 E. coli 菌株 MGU55 Ipd*,/UpiA,句jflAB, AadhE, AldhA, Agio A, AaldA, AaldB, Aedd, i〇 AarcA, Andh '· a)建構一個經修飾的五.C0//菌株MG1655 ΑρβΑΒ, AadhE, ldhA::km, JgloA, AaldA, AaldB, Aedd 氣黴素抗性卡匣(chloramphenicol resistance cassette)是 根據操作步驟1在菌株£. C£?// MG1655 /〆*,」妒M, 15 dadhE,ldhA::km,/igloA,ΛαΙώί,/ialdB,/iedd::cm 中被去除 (參見 W02005073364)。 才呆作步驟1 :去除抗性卡g 氣黴素和/或康黴素(kanamycin)抗性卡匣是根據下列技 2〇 術而被去除。帶有作用在氣黴素和/或康黴素抗性卡匣的F RT 位址的FLP重組酶(reconibinase)之質體pCP20是透過電穿孔 被引入該菌株。在42。(:下連續培養之後,抗生素抗性卡匣 的喪失是利用表1中所給予的寡核苷酸透過PCR分析而被 查驗。 28 200904984 紐在菌株中被建立的修_存在是表丨中所給 予的寡核苷酸而被查驗。 所獲得的菌株被命名為五c〇// MG1655 /pd*, dpflAB, dadhE,IdhA::km,/igloA,zialdA, daldB, dedd。 表1 ··用於查驗一抗性卡匣之***或一抗性卡匣之喪失的寡核苷酸 區域名稱 募聚物名稱 序列辨識編號 與染色體區域 的同源性 0/A基因 cdh N°1 參見 W02005073364 (刪除) YIIQ N°2 P/7AB基因 pflABF N°3 參見 W02005073364 pflABR N°4 α^Ε基因 ychGf N°5 參見 W02005073364 adhECr N°6 /c/AA基因 hsIJC N°7 參見 W02005073364 (卡£***) ldhAC2 N°8 g/oA基因 NemACd N°9 參見 W02005073364 Rnt Cr N°10 α/ί/Α基因 Ydc F C f N°ll 參見 W02005073364 gapCCr N°12 α/ί/Β基因 aldB C f N°13 參見 W02005073364 YiaYCr N°14 eiW基因 Eda d N°15 參見 W02005073364 Zwf r N°16 29 200904984 /办A基因 ldhAF N°17 1439724 至 1439743 (刪除) ldhAR N°18 1441029 至 1441007 arcA基因 arcAF NM9 4638292 至 4638273 arcAR N°20 4636854 至 4636874 /7心基因 ndhF N°21 1 164722 至 1164742 ndhR N°22 1167197 至 1167177 tpiA基因 YIIQ N°2 4109599 至 4109580 (重建) tpiA R N°23 4108953 至 4108973 gapA啟動子 yeaAF N"24 1860259-1860287 (Ptrcl6-gapA) gapAR N°25 1861068-1861040 /?>^A基因 pykAF N°26 1935338 至 1935360 pykAR N°27 1937425 至 1937401 /?_yA:F 基因 pykFF N°28 1753371 至 1753392 pykFR N°29 1755518 至 1755495 flcA:A-/^a 基因 B2295 N°30 2410900 至 2410919 YfcCR Nc31 2415164 至 2415145 /7〇Λ:Β基因 poxBF N°32 908475 至 908495 poxBR N°33 910375 至 910352 b)建構一個經修飾菌株 Ε· co/i MG1655 φ(/ΆρίΑ,/ίρβΑβ, AadhE, ldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd 坤為了要去除康徵素抗性卡匣並且去活化/^//^基因,氯 =抗[生卡E疋根據操作步驟2刪除涉及的大部份基因地 被***基因。 30 5 200904984 操ii步驟2 :引入一供重組的PCR產物並且選擇該重組體 (recombinant) 在表2中被選定以及給予之供用於取代一個基因或一 5 個基因間區域的寡核苷酸被用來放大質體pKX>3的氯黴素抗 性卡1Ε或質體pKD4的康徽素抗性卡匣(Datsenko, Κ.Α. & Wanner, B.L. (2000))。所獲得的PCR產物接著藉著電穿孔被 引入帶有質體PKD46的受體菌株(其中所表現的系統λ Red (γ,β,exo)非常偏好同源性重組)。抗生素_抗性轉形株接著被 ίο 選出且抗性卡匣的選擇是利用表1中所給予的適當寡核苷 酸透過PCR分析而被查驗。 該菌株的其它修飾是利用表1中所給予的寡核苷酸來 被查驗。 所生成的函株被命名為五.m// MG1655 dtpiA,Jp/ΪΑΒ,/iadhE,dgloA,dcddA, dcddB,dedd。 15 200904984 表2:用於透過以一 PCR產物的重組在菌株凡co/z· MGl 655中取 代一染色體區域的寡核苷酸 區域名稱 寡聚物名稱 序列辨識編號 與染色體區域 的同源性 W/zA基因 DldhAF N°34 1440865-1440786 DldhAR N°35 1439878-1439958 arcA基因 DarcAF N°36 4637868-4637791 DarcAR N〇37 4637167-4637245 WA基因 DndhF N°38 1165071-1165149 DndhR N〇39 1166607-1166528 ίρζ·Α基因 tpiA::kmF N°40 4109264-4109195 (重建) tpiA::kmR N°41 4109109-4109193 ga/7A啟動子 Ptrc-gapAF N〇42 1860478-1860536 (Ptrcl 6-gapA) Ptrc-gapAR N〇43 1860762-1860800 基因 DpykAF N〇44 1935756-1935836 DpykAR N〇45 1937055-1937135 基因 DpykFF N°46 1753689-1753766 DpykFR N547 1755129-1755051 基因 DackAF N°48 2411494-2411573 DptaR N°49 2414906-2414830 基因 DpoxBF N°50 908557-908635 DpoxBR N°51 910262-910180 C)建構一個經修飾的菌株五.MG1655 基因arc」在菌株[co" MG1655中是使用操作步驟2 中所描述的技術以表2中所給予的募核苦酸透過***一康 黴素抗生素抗性卡匣並且刪除所涉及的大部份基因而被不 活化。所生成的菌株被命名為五.C0//MG1655」ard...im。 d)建構一個經修飾的五·⑶"菌株MG1655 //?</% J印H, 32 200904984
ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, JaldA, AaldB, Aedd, AarcA 以一康黴素抗性卡匣在菌株凡cWMG1655 zlp/IAB,ZladhE,/UdA:.cm,ZlghA, ZlaldA,」aldB, dedd 中取代 基因wad的基因刪除是透過利用噬菌體pi的轉導技術來 被施行。 叠丑步驟3 :利用噬菌體P1的轉導以供刪除一基因 透過一抗性卡匣(康黴素或氯黴素)在受體凡⑺"菌株中 取代基因的選定基因之刪除是藉著利用噬菌體P1的轉導技 術來被施行。操作步驟為兩步驟,⑴在帶有一單一基因被删 除的菌株MG1665上製備噬菌體溶解物以及(…藉此噬菌體 溶解物轉導該受體菌株。 蓋蓳_體溶解物的製備 將 10 mL 的 LB + Cm 30 pg/ml +葡萄糖 0.2¾ + CaCl2 5mM接種100 μΐ之培養過夜的菌株mg1665(帶有一單 一基因被刪除)。 - 於37°C下以震盪培養歷時30分鐘。 _加入1⑻μΐ之噬菌體溶解物pi (在野生型菌株MG1665 上製備)(大約1χ109噬菌體/ml)。 '於37 C下震盪歷時3小時直到所有細胞被溶解。 -加入200 μΐ之氯仿,並且渦旋(v〇rtexing)。 -於45GGg離心歷時1G分鐘以去除細胞殘餘物。 _將上清液轉移到一個無菌試管並且加入2〇〇μ1氯仿。 33 200904984 將溶解物儲存於4。〇。 轉導 將5 ml之五c〇"受體菌姓 5 10 15 20 ^ ι^ΛΑ 的過夜培養物(在LB培養基 甲)以碓心1500 g離心歷時1〇八 將細胞小丸懸浮於2.5 ml ^ 4 mM。 的 %S04 10 mM, CaCl2 5 - 對照組試管:100 μΐ細胞 100 μΐ ^有—單―基因被刪除的菌株 I、、 、 MG1655的噪菌體pi _ 的細胞,〇μ1帶有一單一基因被刪 除的囷株MG1655的嗟菌體pi。 -不需震i地在3G°C下培養歷時3()分鐘。 -在每個試管中加人⑽μ1的檸樣酸納,並且渴旋。 - 加入1 mL的LB。 -於37°C下震盪培養歷時1小時。 _在以70〇〇rpm離心試管歷時3分鐘後塗佈於平盤上LB+
Cm 30 pg/ml。 - 於37 C下培養過夜。 抗生素-抗性轉形株接著被選出並且刪除的***是利用 在表1中所給予的適當寡核苷酸透過一 pCR分析來被查驗。 所生成的囷株被命名為五MG1655 /pj*, J印L4, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, Jard-km o 34 200904984 e) 建構一經修飾的五.cW菌株MG1655 基因《必是以表2中所給予的寡核苷酸使用操作步驟2 中所述的技術透過***一康黴素抗生素抗性卡g並且刪除 所涉及的大部份基因而被不活化。所生成的菌株被命名為 5 E. coli }AG\655> /indh::km。 f) 建構一菌株五•⑼以 MG1655 ί/κ/*,zfp/LiB,如仇e, AldhA, AgloA, AaldA, JaldB, Aedd, AarcA, Andh 透過一康黴素抗性卡匣在菌株五.co/z· MG1655 /pi/*, i〇 AtpiA, ΑρβΑΒ, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, 中取代基因的基因的刪除是如前面使用以在操作 步驟3中所述的噬菌體P1之轉導技術來被施行。 所生成的菌株被命名為五.cW MG1655 ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AarcA, 15 」ndh::km。 康黴素抗性卡匣接著根據操作步驟1而被消除。所獲得 的菌振梭命名爲 E. coli MG1655 lpd*,/itpiA, ZipflAB, /ladhE, ZlldhA, /igloA, /ialdA, /laldB,Aedd, AarcA,/indh。 在各個步驟中,先前在菌株中所建立的修飾的存在是使 2〇 用表1中所給予的寡核苷酸來被查驗。 實施例2:經修飾的菌株五· cW MGI655 lpd%却/L45, dadhE,AldhA::cm,AgloA,AaldA,AaldB, Jedd 於 微好氧條件下在連續培養裝置(chemostat culture) 35 200904984 中的演化以及演化的生理特性: 為了要朝向增進的1,2-丙二醇製造演化,菌株五⑺" MG1655 lpd*, AtpiA, ΑρβΑΒ, AadhE, MdhA::cm, AgloA, Ζία/^,zie而呈連續培養地(一側於厭氧條件下且另一
側於微好氧條件(1%氧)下)被培養在諸如前述的培養基MpG (具有過量葡萄糖(從起始20 g/1若葡萄糖逐漸耗盡則加入)) 中。狐度被设定於37°C且pH透過加入鹼而被調整到6 5。 菌株在連續培養裝置中的演化接著是生物f量濃度的增加 偶合產物濃度(1,2-丙二醇以及副產物醋酸)的上升,超過數 10 15 週(從4週间至6週)。這表示菌株表現的增進。當培養在這 ,條件下顺-从奴進—步濃度上相觀,演化被完 成0 ⑽一 Ϊ::化之錢之後㈣株特性被評估。表相立純株的 罢“ “析中被評估,使用被用於連續培養裝 ,中的相同培養基MPG。在這些純株之中,― ^ =::的有:二醇專一性生產率, 結果被報?=表=:件的最佳純株上所獲得的 36 200904984 表4 :於厭氧條件下在演化之後所獲得的最佳演化菌 株與起始菌株的比較 菌株 £· co,i MG1655 ㈣* AtpiA ApflAB AadhE AldhA:;cm Agio A Aald^ AaldB Aedd 演化之前的起始菌株 (在2天的培養之後所 測得的表現) 最佳演化純株(在2 天的培養之後所測得 的表現) 葡萄糖專一性消耗率 (g葡萄糖/g生物質量/h) 0.12 0.21 (+75%) 1,2-丙二醇專一性生產率 (g 1,2-丙二醇/g生物質量 /h) 0.02 0.07 (+250%) 1,2-丙二醇+羥基丙酮專一 性生產率(g 1,2-丙二醇+經 基丙酮/g生物質量/h) 0.04 0.08 (+ 100%) 表5 :於微好氧條和 菌株與起始菌 卜下在演化之後所獲得的最佳演化 株的比較 菌株五· w/ί MG1655 lpd* AtpiA ApflAB AadhE AldhA::cm Agio A Aald^ AaldB Aedd 演化之前的起始菌株 (在2天的培養之後所 測得的表現) 最佳演化純株(在2 天的培養之後所測得 的表現) 葡萄糖專一性消耗率 (g葡萄糖/g生物質量/h) 0.10 0.22 (+120%) 1,2-丙二醇專一性生產率 (g 1,2-丙二醇/g生物質量 /h) 0.01 0.08 (+700%) 1,2-丙二醇+羥基丙酮專一 性生產率(g 1,2-丙二醇+輕 基丙酮/g生物質量/h) 0.04 0.08 (+ 100%) 5 10 15 20 200904984 過-萃取物的培養基上被培養超 來二= = ==終培— 實施例3 :在選出的&⑽演化菌株MG1655㈣*,抑⑷
ApflAB, AadhE, AldhA::cm, JgloA, AaldA, AaldB, Jedd中重建fpiA基因 a)建構一經修飾的菌株五· c<?// MG1655卬 一康黴素抗生素抗性卡匣以表2中所給予的寡核苷酸 根據在刼作步驟2中所描述的技術而被***基因毕/A上 游。所生成的菌株被命名為五.CC(/Z.MG1655 /pzHm。 接著基因扣A進入演化菌株五.co/z.MG1655 /#*,ζί中L4, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AarcA, 如办的重建是使用操作步驟3中所述之利用噬菌體pi的轉 導技術而被施行。 所生成的菌株被命名為演化五.MG1655 AtpiArc::km, ΑρβΑΒ, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, dedd, /iarcA,/indh。 康黴素以及氣黴素抗性卡匣接著根據操作步驟2來被 消除。所得到的菌株被命名為‘演化五.cW矽z_Arc’。 先前在菌株中被建立的修飾的存在是使用表1中所給 38 200904984 予的券核苦酸來被查驗。 實施例4 : ‘演化五· C0//^f*Arc,的修飾:弱化々中a基因;删 除基因pjA:A以及砂处;利用一載艎 pJBI37-PgapA-jjpsA 過复表現pPsA 基苗 a)以合成的短Ρί#τ16啟動子取代天然啟動子 以合成的短Pircl6啟動子(序列辨識編號52 :
gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtggaa)取代天然 g印A
啟動子到卤株‘演化五· CW中/Arc’中是透過以FRT-CmR-FRT 以及一經工程化的啟動子取代公叩八序列上游的225 pb而被 做出。 所用的技術被描述於利用表2中所給予之寡核苷酸的操作 步驟2。所生成的菌株被命名為‘演化五.c〇"少z.Arc, Ptrc\6-gapA::cm。 氯黴素抗性卡匣接著根據操作步驟丨而被去除。所獲得 的囷株被命名為演化五· c〇H扣Arc,Pirc 16-gapA。 b)刪除仰灸入基因 基因烈ΑΑ是透過***一康黴素抗生素抗性卡匣並且以 表2中所給予的寡核苷酸利用操作步驟2中所描述的技術刪 除大部分涉及的基因而被不活化。所生成的菌株被命名為 决也 E. coli tpiArc Ptrc\6-gapAdpykA::km ° 康徽素抗性卡匣接著根據操作步驟1而被去除。所獲得 的囷株被命名為凉化五c〇"中,朽少女a。 39 200904984 C)刪除基因 基因仍4F是透過***一康黴素抗生素抗性卡匣並且以 表2中所給予的寡核苷酸利用操作步驟2中所描述的技術刪 除大部分涉及的基因。所生成的菌株被命名為‘演化五⑺^· tpiArc' Ptrc\6-gapAApykA /ipykF::km。 如前,康黴素抗性卡匣接著根據操作步驟丨而被去除。 所獲得的菌株被命名為‘演化五.⑺"卬ζ·Αιό, ίο d)引入一表現載體外^到菌株中 為了要增加磷酸烯醇丙酮酸的製造,外λ^基因從質體 PJB137使用炉啟動子而被表現。有關於質體 pJB137-PgapA-ppsA 的建構’基因卯^從五 MG1655 的染色體DNA使用下列寡核苷酸而被PCr擴增: 15 i. gaPA-卯sAF由65個鹼基所構成(序列辨識編號53)
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC 具有 -一個與基因(1785136至1782758)的序列 (1785106至Π85136)( —網站上的參考序列 2〇 http://genolist. pasteur.fr/Colihn同源的區域(大寫 字母),以及 -一個與啟動子(1860794-1860761)同源的區域 (小寫字母) 2. ppsAR,由43個鹼基所構成(序列辨識編號54) 40 200904984
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC 具有 -一個與基因(1785136-1782758)的區域的序列 (1782758-1782780)同源的區域(大寫字母) -一個限制位址i^>u/III(晝有底線的字母) 同時仄<%>//基因的啟動子區域是使用下列 寡核苷酸而被擴增: 1. gapA-ppsAR,由65個驗基所構成(序列辨識編號55) GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg ίο 具有 -一個與基因仲d (1785136-1782758)的序列 (1785106-1785136)同源的區域(大寫字母),以及 -一個與坪/?A啟動子(1860794-1860761)同源的區域 (小寫字母)。 15 2. gapAF,由33個驗基所構成(序列辨識編號56) ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc 具有 -一個與gopA啟動子(1860639-1860661)同源的區域 (小寫字母) -一個限制位址(畫有底線的字母) 兩個片段隨後使用寡核苷酸ppsAR以及gapAF而被融 合(Horton et al. 1989 Gene 77:61-68)。PCR 所擴增的片段以 限制酵素初>2ί/ΙΙΙ與》SVwfll剪切並且被轉殖到載體pjB137 (EMBL寄存編號:U75326)的中以給予載體 20 200904984 pJB137-PgapA-ppsA。重組型質體是由DNA定序來被確認。 質體pJB137-PgapA-ppsA被引入菌株‘演化五.—/ tpiAnc’ Ptrcl6-gapAL,/IpykA,JpykF 中。 所獲得的囷株被命名為‘演化cW ip/Jrc’, 5 Ptrc\6-gapA, dpykA, dpykF,(pJB137-PgapA-ppsA)。 在各個步驟,先前在菌株中所建立的修飾的存在可以使 用表1中所給予的寡核苷酸來查驗。 實施例5 :建構一能夠沒有醋酸作為副產物地製造丨,2_丙二 ίο 醇的菌株‘演化五· co/ί· (piArc’ Pireie-gflpA,
JpykA, ApykF, AackA-pta, ApoxB (pJB 13 7-Pgap A -ppsA ) a) 建構一經修飾的菌株五.cWMG1655AackA -pta::cm • 基因以及/?加是透過***一氯徽素抗生素抗性卡 15 匣並且以表2中所給予的寡核苷酸利用操作步驟2中所描述 的技術刪除大部分涉及的基因而被不活化。所生成的菌株被 命名為五.co/z’ MG1655 。 b) 建構一菌株‘演化五.印/Arc’ 客apA, 20 ApykF^ A ackA-pta 在卤株‘演化五· 和Arc’ /7rcl6-《a/>A,4pj;A:A, 中刪除基因ac々A以及是使用先前以如同操作步驟3中 所述的嗤菌體Ρ1的轉導技術而被施行。 所生成的函株被命名為4演化五.co/z· ip/Jrc’ Pircl 42 200904984
ZipykA, ZipykF, /iackA-pta::cm。 如前,氯黴素抗性卡匣接著根據操作步驟1而被去除。 所獲得的菌株被命名為‘演化五.CO"矽/jrc,/>的7 dpykA ZipykF,/iackA-pta。 C)建構一經修飾的菌株‘演化凡 ApykA, JpykF, AackA-pta, ApoxB (pJB137-PgapA-ppsA) 基因;?i?xB是透過***一氯黴素抗生素抗性卡匣並且以 表2中所給予的寡核苷酸利用操作步驟2中所描述的技術刪 ίο 除大部分涉及的基因而被不活化。 所生成的菌株被命名為‘演化五_ co/z·印L4rc’
ApykA, ApykF, AackA-pta, ApoxB::cm ° 如前’氯黴素抗性卡匣接著根據操作步驟1而被去除。 所獲得的菌株被命名為演化五· eo// 15 ApykA, ApykF, AackA-pta, ApoxB ° 質體pJB137-PgapA-ppsA被引入菌株演化五.co/z·印 Ptrc\6-gapA,/ipykA,JpykF,/iackA-pta,ApoxB。所獲得的菌 株被命名為演化 E. coli tpiArc Pircl6-gapA,ZipykA,/IpyJcF, AackA-pta, ApoxB (pJB137-PgapA-ppsA) ° 2〇 在各個步驟,先前在菌株中所建立的修飾的存在可以使 用表1中所給予的寡核苷酸來查驗。 實施例6 :不同演化菌株在好氧條件下用於ι,2-丙二醇製造 的比較 43 200904984 如同實施例4中所述般而被獲得的菌株以及對照組菌 株(對照組1 :在厭氧條件下演化的MG1655 lpd* ζίρ/ΪΑΒ ΛαΜΕzlldhA::Cm ZigbA dald/laldB dedd 以反驚搏、組 2 :在微好氧條件下演化的MG1655 lpd*zi^L4办 5 10 」!dhA::Cm」gbA/lahUaIdB」edd)在好氡條件下於基本培養 基(補充有酵母菌萃取物以及葡萄糖作為碳源)中被培養在一 錐形瓶分析中。培養是在34。〇下被施行且pH是透過以 MOPS來緩衝鱗基而被_。在培養終點,㈣肉汁中的 1,2-丙二醇’ 及殘餘㈣較透過HpLc而被 且i,2-丙二醇相對於葡萄糖以*认丙二醇+丙嗣醇相對於 葡萄糖的產量被計算出。最佳菌株接著被選出以供样 饋料-批次培養。 菌株 1,2-丙二醇 濃度(g/1) 丙酌醇 度(g/ι) 對照組1 1.88 ----- 2.1 對照組2 0.7 --—~ 3.56 ‘漠化 E, coli tpiArc’ Ptrc\6'gapAy (pJB13 7-PgapA-ppsA) (從對照組1所建立) 0.14 1.84 — ‘漠化 E. coli tpiArc’ Ptrc\6-gapA, (pJB 13 7-PgapA -ppsA) (從對照組2所建立) 3.71 3.85 1,2-丙二醇 產量 (g/g葡萄 糖) —'— 0.16 0.06 ~~ — 0.03 0.20 1,2-丙二醇+ 丙酮醇產量 (g/g葡萄糖) 0.34 0.37 0.41 0.41 44 200904984 實施例7:利用最佳菌株在饋料-批次培養中製造1ν2_丙二醇 在先前實驗中被選出的最佳菌株被培養在一個使用一 饋料-批次操作步驟的21發酵槽。 培養溫度被維持恆定在37°C下且pH使用一 ΝΗ4ΟΗ溶 液被固定性地調整到介於6.5與8的數值。在批次相期間檀 拌速率被維持在介於200與300 rpm而在饋料-批次相的終點 被提高到1000 rpm。溶氧濃度是透過使用一氣體控制器而被 維持在介於30與40%飽和度的數值。當最佳濃度到達一介 於3與5的數值,饋料-批次是以一起始流速介於〇 3與〇 5 ml/h來被起始,且流速逐漸增加到介於2.5與3.5 ml/h。此 時,流速被維持恆定歷時24到48小時。饋料培養基是以基 本培養基(含有濃度介於300與500 gA的葡萄糖)為主。 【圖式簡單說明】 第1圖描述在醣的1,2-丙二醇製造系統的發展中,主要 代謝的遺傳工程。 【主要元件符號說明】 無 45 200904984 序列表 <110> METABOLIC EXPLORER <120> i用於製造由演化及合理設計組合得到的ΐ,2·丙二醇之新穎微生物 <130> D24916 <150> PCT/IB2007/001680 <151> 2007-03-23 <160> 56 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211> 20 <212> PWA <213> ‘人工的 <220> <223〉寡核苷酸 <400> 1 ggtgatgata gttatcgccg }>> Λ > 01643 11 Ti 11 1 <2<2<2<2 2 20 ΠΜΔ 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 2 cgtgccatcg acagcagtcc 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 3 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30 <210〉 4 <211> 30 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400〉 4 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta <210> 5 <211> 22 <212> DNA 如〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 5 ggctcattgc accaccatcc ag 30 200904984 <210> 6 <2il> 24 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400〉 6 gaaaagacgc gctgacaata cgcc <210> 7 <211> 20 <212> mk <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 7
gccatcagca ggcttagccg <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 8 gggtattgtg gcatgtttaa ccg <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 9 gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g
<210> 10 <211> 31 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 10 gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g > > > > 0 1^3 ΊΑ 11 n t—I <2<2<2<2 11 31
DNA 人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 11 tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g <210> 12 <211> 31 200904984 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 12 31 40 cacgatgacg accattcatg cctatactgg c <210> 13 <211> 40 <212〉 <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 13 catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc
<210> 14 <211> 31 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 14 tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g 31
<210> 15 <211〉 24 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 15 ccccggaatc agaggaatag tccc 24
<210> 16 <211> 29 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 16 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400〉 17 gccatcagca ggcttagcgc 20
<210> 18 <211> 23 <212〉 DNA <213>人工的 3 200904984 <220> <223>寡核苷酸 <400> 18 gggtattgtg gcatgtttaa ccg <210〉 19 <211> 20 <212> ΠΝΑ <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 19 cgacaattgg attcaccacg
<210> 20 <211> 21 <212> MA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 20 gcggtattga aaggttggtg c
<210> 21 <211> 21 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 21 ccgtgagaag aatcgcgatc g <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 22
gcgtagtcgt gtaagtatcg c <210> 23 <211> 21 <212> DNA 人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 23 catttccggt ggtgcgattg c 的 ah 2429ΓΝΛ 寡核苷酸 <210> <211> <212> <213> <220> <223> 200904984 <400〉 24 gccacagccg gaatcatact tggtttggg <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 25 cgtcaacacc aacttcgtcc catttcagg <210> 26 <211> 23 <212> 廳 <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400〉 26 ggcaattacc ctcgacgtac egg
<210> 27 <211> 25 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 27 ccgatggatg atctgttaga ggegg <210> 28 <2!1> 22 <212> DNA. <213>人工的 <220〉 <223>寡核苷酸 <400> 28 gcgtaacctt ttccctggaa eg <210> 29 <211〉 24 <212> DNA d1%人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 29 gcgttgctgg agcaacctgc cage
<210> 30 <211> 20 <212> DNA <213>人工的 <220> <223〉寡核苷酸 <400> 30 gcatgggtaa aettaaggeg <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 31 taatcaccaa cgtatcgggc <210〉 32 <211> 21 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400〉 32 cgcggcttgg tcgggtaacg g 200904984
<210> 33 <211> 24 <212> DNA <213>人工的 <220〉 <223>寡核苷酸 <400> 33
tcgggctatt taaccgttag tgcc <210> 34 <211> 100 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 34 gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcticg <210> 35 <211> 101 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 35 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g <210> 36 <211> 98 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 36 ccccgcacat tcttatcgtt gaagacgagt tggtaacacg caacacgttg aaaagtattt 200904984 tcgaagcgga aggctatgtg taggctggag ctgcttcg <210> 37 <211> 99 <212> im 心3〉人工的 <220> <223〉寡核苷酸 <400> 37 ccagatcacc gcagaagcga taaccttcac cgtgaat£2t ggcgatgatt tccggcgtat ccggcgtaga ttcgaaatgc atatgaatat cctccttag <210> 38 <211> 99 <212> ΠΝΑ <2i3>人工的 <220〉 <223>寡核苷酸 <400> 38 ctctcacaaa ttcgctcaaa taataaacaa taaactctgt tttttgatct cacccggtaa agtcgcctat cttttcagct gtaggctgga gctgcttcg !>>>> 012 3 II* 1A «1 ΤΑ <2<2<2<2 的 OA工 3910Γ)ΝΛα <220〉 <223>寡核苷酸 <400〉 39
gcaacttcaa acgcggacgg ataacgcggt taatactccc caccagcatc attaatccgg ttttaaagta accatgcagc catatgaata tcctccttag <210> 40 <211> 124 <212> DNA 人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 40 ggSgctgacc ttcgctgttg aaccgattaa gctggcgcta tctgaatcgc ttgaaggttt gaataaatga tcacactggc tcaccttcgg gtgggccttt ctgccatatg aatatcctcc ttag <210> 41 <211> 106 <212> ΠΝΑ <2I3>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 41 gcgaataaag gaagatggcc gccccgcagg gcagcaggtc tgtgaaacag tatagagatt catcggcaca aaggctttgc tttttgtgta ggctggagct gcttcg 60200904984 <210> 42 <211> 100 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 42 agtcatatat tccaccagct atttgttagt gaataaaagc cacacattat tcgagccgga tgattaatag tcaacagctc tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 43 <211> 79 <212> WA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <40Q> 43 60 79 gctcacatta cgtgactgat tctaacaaaa cattaacacc aactggcaaa attttgtccc atatgaatat cctccttag <210> 44 <211> 101 <212> DNA <213>人工的 <220> <223〉寡核苷酸 <400> 44 60 101 cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g <210> 45 <211> 101 <212> ΠΝΑ 人工的 <220> <2M> *核苷酸 <400> 45 60 101 cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g <210> 46 <211> 98 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 46 60 cccatccttc tcaacttaaa gactaagact gtcatgaaaa agaccaaaat tgtttgcacc atcggaccga aaaccgaatg taggctggag ctgcttcg <210> 47 <211> 99 <212> DNA <9·Π>人工的 8 98 200904984 <220> <223>寡核苷酸 <400> 47 ggacgtgaac agatgcggtg ttagtagtgc cgctcggtac cagtgcacca gaaaccataa ctacaacgtc acctttgtgc atatgaatat cctccttag <210> 48 <211> 100 <212> IM β13〉人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 48 cgagtaagtt agtactggtt ctgaactgcg gtagttcttc actgaaattt gccatcatcg atgcagtaaa tggtg.aagag tgtaggcigg agctgcttcg <210> 49 <211> 97 <212〉酿 <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400> 49 gctgctgtgc agactgaatc gcagtcagcg cgatggtgta gacgatatcg tcaaccagtg cgccacggga caggtcgcat atgaatatcc tccttag 6Qi 99 60 100 60 97 <210> 50 <211> 99 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400〉 50 ccttagccag tttgttttcg ccagttcgat cacttcatca ccgcgtccgc tgatgattgc gcgcagcata tacaggctgc atatgaatat cctccttag 60 99 <210〉 51 <211> 102 <212> 脆 <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 51 60 cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc atctgggga® tcacaggcga ctctctgaac ggtgtaggct ggagctgctt eg <210〉 52 <211> 41 <212> mA <213> 人工的 <220> <223> 合成的啓動子 <400〉 52 9 102 200904984 41 gagctgttga cgattaatca tccggctcga ataatgtgtg g <210〉 53 <211> 65 <212〉 DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 53 ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgtcc aacaatggct cgtcaccgct 60 ggtgc 65 <210> 54 . <211> 43 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 寡核苷酸 <400> 54 aatcgcaagc ttgaatccgg ttatttcttc agttcagcca ggc 43 <210> 55 <211> 65 <212> 腿 <213>人工的 <220〉 <223>寡核苷酸 <400> 55 gcaccagcgg tgacgagcca ttgttggaca tatattccac cagctatttg ttagtgaata 60 aaagg 65 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 56
33 DNA 人工的 寡核苷酸 56 acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33 10
Claims (1)
- 200904984 200904984 15 20 2. 3. 4. 5. 、申請專利範圍: 1· 一種供製備微生物的-演化菌株用於從 丙二醇的方法,該方法包含有: 衣、M 於透擇壓力下將—起始s株生長在-適當生長培養 基中’该起始細SS株含有扣A基因的弱化表現以 及至少-涉及將曱基乙二_換成乳酸的基因的弱 化,現,以促使該起始菌株的演化, 並且分離具有—增加之I2丙二醇生產率 的次化囷株 如: = = 基因。 =酸的嫩mm 與α/泥以及它們的組合。 g/〇A aldA 項:方法,其中該起始菌株進 化表現〜:、自二下:成:群組的基因的弱 如申請專利範圍第,至3項的方法二^广。 —步包含有至少-選自於阶始菌株進 因的弱化表現。 所構成之群組的基 如申請專職㈣丨至4項#_ 化菌株是根據其丨,2丙二醇生 >方法,其中該演 產率增加達至少20%,而被選定^且目八 =起始菌株的生 專利範圍第〗至5項令任_者:離方: 始囷株是選自於由細菌,酵母去,其中該起 固以及真固所構成的群組。 46 200904984 7. 如申請專利範圍第6項的方法,其中該起始菌株是選自 於下列所構成的群組:腸内桿菌科、有芽胞桿菌科、梭 菌科,鏈絲菌科以及棒狀桿菌科。 8. 如申請專利範圍第7項的方法,其中該起始菌株是大腸 5 桿菌或丙酮丁醇梭菌。 9. 一種經由根據申請專利範圍第1至8項任一者的方法而 被獲得的微生物之演化菌株。 10. 如申請專利範圍第9項的演化菌株,其中該甘油酸3石舞 酸去氫酶活性被弱化。 ίο 11.如申請專利範圍第10項的演化菌株,其中gcpA基因的 表現被弱化。 12.如申請專利範圍第9至11項任一者的演化菌株,其中糖 _ 輸入的效率被增加。 • 13.如申請專利範圍第12項的演化菌株,其中獨立於礙酸稀 15 醇丙酮酸的一糖輸入系統被使用。 14. 如申請專利範圍第13項的演化菌株,其中至少一選自於 gfl/P與g/A:的基因的表現被增加。 15. 如申請專利範圍第12項任一者的演化菌株,其中糖-填酸 轉移酶系統的效率是透過增加代謝物磷酸烯醇丙酮酸的 20 可利用性而被增進。 16. 如申請專利範圍第15項的演化菌株,其中至少一丙酮酸 激酶的活性被弱化。 17. 如申請專利範圍第16項的演化菌株,其中至少一自於 以及;的基因的表現被弱化。 200904984 專利耗圍第15至17項任一者的演化菌株,1中 %夂稀醇丙酮酸合成酶活性被增加。 ,、中 9. 她圍第18項任—者的演化菌株,其中 基因的表現被增加。 ’、ΡΡ^Α 20.如申請專利範圍第 好將丙酮酸代謝:=9項任一者的演化菌株’其中偏 §&基-(::0入的酵素相較於未經修德έΛ 21 士由^^NADH之抑制具有—較低的敏感性。 、 -、心圍第2〇項的演化菌株,其中㈣基因具有 則夂55被一绩胺酸所取代的點突變。' 以如申請專利範圍第9至21項任一者的演化菌株, V-涉及醋酸合成的酵素之活性被弱化。 '、 23·如申請專利範圍項的演化菌株,其中至少一選自於 adA,以及ρ〇χΒ的基因表現被弱化。 、 15 20 :種用於製備丙二醇的方法’其中根據申請專利範圍 第1至23項任一者的一演化菌株被生長在含有一碳源的 適當生長培養基中,且所製造的1,2-丙二醇被回收。 25. 如申請專利範圍第24項的方法,其中大腸桿菌的一演化 菌株被生長在含有一簡單碳源的適當生長培養基中,且 所製造的1,2-丙二醇被回收。 26. 如申請專利範圍第24項的方法,其中丙_丁醇梭菌的一 演化菌株被生長在含有一簡單或複雜碳源的適當生長培 養基中’且所製造的1,2-丙二醇被回收。 27. 如申請專利範圍第24至26項任一者的方法,其中回收 的1,2-丙二醇被進一步純化。 48
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EP2721167A1 (en) | 2011-06-15 | 2014-04-23 | B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG | New means and methods for producing propanediol |
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