TW200846367A - Antagonist OX40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases - Google Patents

Antagonist OX40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases Download PDF

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Salah-Eddine Lamhamedi-Cherradi
Zhengbin Yao
Sanjaya Singh
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Description

200846367 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本文提供與人類0X40多肽、0X40多肽片段或其他0X40 抗原決定基免疫特異性結合之抗體。本發明亦係針對與人 類0X40多肽、0X40多肽片段或0X40抗原決定基免疫特異 性結合之人類化抗體。亦提供編碼與0X40多肽、0X40多 肽片段或0X40抗原決定基免疫特異性結合之抗體的經分 離核酸。本發明進一步提供包含編碼與人類0X40多肽、 • ΟΧ4Θ多肽片段或0X40抗原決定基免疫特異性結合之抗體 之核酸的載體及宿主細胞以及製備該等抗體之方法。亦提 供使用本文所提供之抗0X40抗體來抑制0X40生物活性及/ 或治療或預防0X40介導之疾病的方法。 【先前技術】 免疫系統保護身體抵禦外來病原體入侵，此係一種需要 對外部藥劑之免疫激活與對自身組織之耐受性達成平衡的 功能。由例如病毒病原體引起之急性感染誘發兩種類型長 ® 期記憶：體液免疫，其中B-淋巴細胞（B細胞）產生抗體以 預防由此等外來病原體引起之感染；及細胞免疫，其中由 特定抗原激活之T-淋巴細胞（T細胞）殺死受感染細胞且亦產 生細胞激素。T細胞主要在細胞介導之免疫中起作用，且 包含約70%之淋巴細胞。大部分T細胞為CD4+ ’’輔助” T細 胞且主要涉及B細胞及巨嗤細胞之激活。CD8 + T細胞或細 胞毒性T-淋巴細胞（CTL)涉及細胞介導之細胞毒性反應且 佔T細胞群體之約35%。T細胞可分成三種不同群體：純真 129377.doc 200846367 細胞、效應細胞及記憶細胞。在抗原存在下純真τ細胞得 以激活且成為效應細胞。主要组織相容性複合體I類（MHc I類）分子在此效應反應中起主要作用，其係向Τ細胞受體 π呈遞’’入侵病原體之抗原，繼而τ細胞受體識別病原體且 攻擊該等病原體。 多種受體-配位體相互作用涉及針對外來抗原之免疫反 應的誘發、建立及調節。激活對抗原之CD4+或CD8+T細胞 反應需要至少兩種信號。第一種信號係藉由與抗原呈遞細 ⑩ 胞（APC)表面上的主要組織相容性（MHC)I類或II類分子結 合之抗原經由T細胞受體（TCR)來傳遞。第二種信號包含存 在於APC表面上之配位體與T細胞表面上之第二受體分子 的結合。此弟一種彳§號稱為協同刺激，且Ape配位體通常 稱為協同刺激分子（Lenschow等人，^聽 14:233 (1996))。協同刺激信號轉導分子包括免疫球蛋白超 家族成員、腫瘤壞死因子受體（TNFR)超家族成員及細胞激 _ 素受體（评論參見 Croft，C少?〇灸/即 Growi/z jpacior 14:265 (2003) ; Kroczek等人，/ C/h /所顧㈣/ ι16:9〇6 (2005))。組合之兩種信號激活τ細胞，繼而τ細胞分泌細 胞激素且增殖。 協同刺激分子之一實例為TNFR超家族之一成員〇X4〇受 體（CD 134)，其為膜結合的且主要在激活之cd4+ T細胞上 (亦即’在發炎位點上）表現（paterson等人，j所則乃〇/ 24:1281 (1987))。其配位體（〇X4〇L)為屬於TNF家族之II型 膜蛋白且在諸如激活之B細胞、樹突狀細胞及内皮細胞之 129377.doc 200846367 抗原呈遞細胞上表現（Stuber等人，Immunity 2:507 (1995) ; Weinberg 等人 ’《/ /mm㈣〇/ 162:1818 (1999); Nohara等人，J 7所166:2108 (2001) ; Malmstrom 等 人，J /mm 而 166··6972 (2001))。經由 0X40 受體（在下文 中為”0X40”）之信號轉導協同刺激效應Τ細胞且引起Τ細胞 增殖（Weinberg，/ 152:4712 (1994);評論參見
Watts，乂"卵心v /所所關0/ 23:23 (2005))。0X40之研究表 明，其主要作用係指示在初次免疫反應中積聚之效應T細 胞的數目且因此控制隨後發育且存活之記憶τ細胞的數目 (評論參見 Croft，Qy/ofne Growi/z Factor 14: 265 (2003)) 〇 大量活體外研究已說明，0X40提供協同刺激信號，使 得τ細胞增殖及細胞激素產生得以增強（Baum PR等人， EMBO J，1994 ; Akiba Η等人，Biochem. Biophysic Res， 1998)。已表明在某些情況下，OX40/OX40L相互作用可能 在Th2細胞發育過程中起優先作用（Ohshima等人，β/οοθ 92:333 8 (1998) ; Flynn等人，/ 細 Med 188:297 (1998)) 〇 當免疫激活過度或不受控制時，病理性過敏症、哮喘、發 炎、自體免疫及其他相關疾病可能發生。在該等情況下， T細胞之激活及分化起重要作用。因為0X40用以增強免疫 反應，所以其可能加重自體免疫及發炎疾病。0X40-0X40L之相互作用涉及若干疾病模型之發病原理。大量證 據表明，OX40-OX40L相互作用在過敏症、哮喘及與自體 免疫及發炎有關之疾病中起重要作用，該等疾病包括多發 129377.doc 200846367
性硬化症、類風濕性關節炎、發炎性腸病、移植物抗宿主 疾病、實驗性自體免疫性腦脊髓炎（EAE)、實驗性利什曼 病（experimental leishmaniasis)、膠原蛋白誘發性關節炎、 結腸炎（諸如，潰瘍性結腸炎）、接觸性過敏性反應、糖尿 病、克羅恩氏病（Crohis Disease)及格雷氏病（Grave、 Disease)(Arestides ^ A » Eur J Immunol 32:2874 (2002)； Jember等人，J Med 193:387 (2001) ; Kroczek等人，J C//w /mm㈣〇/ 116:906 (2005) ; Pakala等人，五wr J Immunol 34:3039 (2004) ； Xiaoyan^ A J Clin Exp Immunol 143:110 (2006) ; Weinberg 等人，J 152:4712 (1994) ; Weinberg等人，Med 2:183 (1996) ; Malstrom 專 k、J Immunol 166:6972 (2001) ; Higgins 等人， 162:486 (1999) ; Akiba等人，J 五xp Med 191:375 (2000) ; Stuber等人，GaWraeniero/ogy 1 15:1205 (1998); Tsukada^ A » Blood 95:2434 (2000) ; Yoshioka等人，心r J /mm沉30:2815 (2000) ; Stuber等人，J C7z>z /wveW 3 0:594 (2000) ； Bossowski 等人，J Pediatr Endocrinol
Meia厶 18:1365 (2005);評論參見 Watts，/mm關〇/ 23:23 (2005)) 〇 目前，自體免疫及發炎疾病之.療法包括長期投與單獨類 固醇或與細胞毒性藥物及/或生物製劑組合之類固醇。目 前，針對包括類風濕性關節炎、克羅恩氏病及發炎性腸病 之大量疾病建議抗TNF-α之抗體。此外，臨床評估中一種 新的實驗療法為針對類風濕性關節炎之融合蛋白CTLA4- 129377.doc 200846367
Ig(可溶形式之細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4)。儘管存在 此等替代療法’但大部分免疫抑制療法引起嚴重副作用， 包括患者之免疫功能不全狀態。理想地，Τ細胞介導之疾 病的治療將靶向引起疾病之[抗原特異性]細胞，而不傷害 Τ細胞庫之其餘細胞（Weinberg，23:102 (2002))。因此，對自體免疫及發炎疾病之替代療法存在強 烈需要。 除此等方法外，已研製多種促效劑抗0X40抗體，其刺 激受體以增加T細胞數目。首先公開之抗0X40單株抗體 (mAb)MRC OX-40為鑑別受體為激活大鼠CD4+ T細胞上之 細胞表面抗原的小鼠抗體（Paterson等人，Mo/ /mm㈣〇/ 24:1281 (1987))。此抗體在刺激T細胞增殖檢定中具有適 度作用。其後，已產生多種促效劑抗0X40 mAb且其用以 促進免疫反應（Weatherill 等人，Ce// /mmwno/ 209:63
(2001) ; Banal_Pakala等人，TVai Med 7:907 (2001) ; De Smedt等人，J 168:661 (2002) ; Pan等人，Mo/ TTzer 6:528 (2002) ; Curti等人，101:568 (2003); Nakae等人，/Voc TVa" dead 5W 100:5986 (2003);
Lustgarten^ A 5 Eur J Immunol 34:752 (2004) ； So等人，J Immunol 172:4292 (2004) ; Koga等人，Cancer Sci 95:411 (2004) ； Lanthrop 等人，J Immunol 172:6735 (2004)；
Polymenidou 等人，Proc Natl Acad Sci USA 101 Suppl 2:14670 (2004) ; Lustgarten等人，J /mmwno/ 173:4510 (2004) ； Valzasina 等人，Blood 105:2845 (2005) ； Cuadros 129377.doc -10- 200846367 專 k，Int J Cancer 116:934 (2005) ; Sharma 等人， Geronio/ 41:78 (2006))。然而，在先前提及之自體免疫及 發炎疾病中，刺激T細胞群體並非所需結果。 一療法係經由使用抗OX40L抗體來阻斷OX40-OX40L信 號轉導。大量靶向OX40L之mAb已產生且經測試以闡明 0X40信號轉導路徑、其對其他路徑之影響及0X40在各種 疾病中之作用（參見例如Blazar等人，5/ood 101:3741 (2003) ; Ukyo等人，/mm關o/ogj； 109:226 (2003) ; Wang等 人，Tissue Antigens 64:566 (2004) ； Chou^ A ? J Immunol 174:436 (2005))。抑制0X40信號之其他方法包括使用抗 0X40免疫毒素、OX40-IgG融合蛋白及0X40脂質體 (Weinberg等人，Med 2:193 (1996) ; Higgins等人，《7 /m爪㈣〇/ 162:486 (1999) ; Satake等人，价 Res Commun 270:1041 (2000) ; Taylor等人，J" 72:522 (2002) ; Boot 等人，沿 Λα Γ/ζπ 7:R604 (2005)) 〇 靶向配位體之替代方法係研製一種針對0X40受體 (CD134)之療法。已嘗試產生拮抗劑抗0X40抗體。Stuber 及同事使用多株兔抗小鼠0X40抗體來抑制0X40與OX40L 之間的相互作用（J Med 183:979 (1996))。Imura等人產 生抗小鼠0X40抗體13 1及3 1 5 ’該等抗體抑制CD4+ T細胞 與血管内皮細胞之黏著及T細胞之增殖（藉由〇χ4〇路徑介 導之過程）。Weinberg揭示之抗人類0X40抗體展示消耗激 活之CD4+ T細胞之能力；然而，其依賴於抗體與諸如蓖麻 129377.doc -11· 200846367 毒素-A鏈之毒性分子之接合（美國專利第5,759,546號）。所 揭示之其他抗0X40抗體並無功能活性，諸如市售L106。 因此，需要靶向人類0X40之具有干擾0X40路徑之能力 的實際功能拮抗劑抗體。此抗體具有治療目前具有巨大未 滿足之需要之過多疾病的潛能。本發明解決此未滿足之醫 學需要。 【發明内容】 在一態樣中，本發明係關於針對人類〇Χ4〇受體（CD134) 之拮抗劑抗體及其片段。另一實施例包括拮抗劑抗體之胺 基酸序列及編碼抗體之核酸。 本發明亦包括來源於該等抗體之輕鏈及/或重鏈可變區 之抗原結合區（CDR)。本發明之抗體可為重組抗體。本發 明之抗體可為單株抗體，且單株抗體可為人類抗體、嵌合 抗體或人類化抗體。 本發明包括一種抗體，其包含：重鏈可變區（VH)，其包 含具有胺基酸序列SEQIDNO:17之VHCDRl、具有胺基酸 序列SEQ ID NO:18之VH CDR2及/或具有胺基酸序列SEQ 1〇]^〇:19之¥110〇113;及/或輕鏈可變區（乂1^)，其包含具 有胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··12、15或61之VL CDR1、具有胺 基酸序列SEQ ID ΝΟ:13之VL CDR2及/或具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 14或16之VL CDR3。在一實施例中，抗體包含 具有選自SEQ ID NO: 17、18或19之胺基酸序列之兩個VH CDR及 /或具有選自 SEQ ID NO:12、13、14、15、16 或 61 之胺基酸序列之兩個VL CDR。 129377.doc -12- 200846367 本發明包括一種抗體，其包含：重鏈可變區（VH)，其包 含具有胺基酸序列SEQ ID NO:17之VH CDR1、具有胺基酸 序列SEQ ID NO:18之VH CDR2及具有胺基酸序列SEQ ID >10:19之¥11€0113;及/或輕鏈可變區（¥1〇，其包含具有胺 基酸序列SEQ ID NO:12之VL CDR1、具有胺基酸序列SEQ ID NO:13之VL CDR2及具有胺基酸序列SEQ ID NO:14之 VL CDR3。 本發明包括一種抗體，其包含：重鏈可變區（VH)，其包 含具有胺基酸序列SEQIDN0:17之VHCDR1、具有胺基酸 序列8£()10 1^0:18之¥«[€0112及具有胺基酸序列8£()10 ]^0:19之¥11€0113;及/或輕鏈可變區（¥1^)，其包含具有胺 基酸序列SEQ ID NO:12之VL CDR1、具有胺基酸序列SEQ ID NO:13之VL CDR2及具有胺基酸序列SEQ ID NO:16之 VL CDR3的胺基酸序歹ij。 本發明包括一種抗體，其包含’·重鏈可變區（VH)，其包 含具有胺基酸序列SEQIDN0:17之VHCDR1、具有胺基酸 序列SEQIDNO··18之VHCDR2及具有胺基酸序列SEQID 1^0:19之¥11〇0113;及/或輕鏈可變區（¥1^)，其包含具有胺 基酸序列SEQ ID NO:15之VL CDR1、具有胺基酸序列SEQ ID NO:13之VL CDR2及具有胺基酸序列SEQ ID ΝΟ·14之 VL CDR3 〇 本發明包括一種抗體，其包含：重鏈可變區（VH)，其包 含具有胺基酸序列8£(5山>^0:17之¥110〇111、具有胺基酸 序列8£()1〇1^〇:18之¥110〇112及具有胺基酸序列8玉(^1〇 129377.doc -13 - 200846367 抖0:19之¥11€0113;及/或輕鏈可變區(^1)，其包含具有胺 基酸序列SEQ ID NO:15之VL CDR1、具有胺基酸序列SEQ ID NO:13之VL CDR2及具有胺基酸序列SEQ ID NO:16之 VL CDR3 〇 本發明包括一種抗體，其包含：重鏈可變區（VH)，其具 有SEQ ID NO:10或11中之任一者中所描繪的胺基酸序列； 及/或輕鏈可變區（VL)，其具有SEQ ID NO:7、8或9中之任 一者中所描繪的胺基酸序列。 • 本發明包括一種抗體，其包含：重鏈可變區（VH)，其藉 由核酸序列SEQ ID NO: 25、26或27中之任一者編碼；及/ 或輕鏈可變區（VL)，其藉由核酸序列SEQ ID NO:20、21、 22、23或24中之任一者編碼。 本發明包括一種抗體，其包含：具有SEQ ID NO: 10中所 描繪之胺基酸序列的VH及具有SEQ ID NO:7或8中之任一 者所描繪的胺基酸序列之VL ;具有SEQ ID ΝΟ·.11中所描 繪之胺基酸序列的VH及SEQ ID ΝΟ:9中所描繪之VL ;藉 ^ 由核酸序列SEQ ID ΝΟ:25編碼之VH及藉由核酸序列SEQ ID NO:20或21編碼之VL;藉由核酸序列SEQ ID NO:26編 碼之VH及藉由核酸序列SEQ ID NO:22、23或24編碼之 VL;或藉由核酸序列SEQ ID NO:27編碼之VH及藉由核酸 序列SEQ ID NO:22、23或24編碼之VL。 本發明包括一種抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 10中所 描繪之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO:7中所描繪之胺基 酸序列。 129377.doc -14· 200846367 本發明包括一種抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 10中所 描繪之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO:8中所描繪之胺基 酸序列。 本發明包括一種抗體，其中VH包含SEQ ID ΝΟ:11中所 描繪之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO:9中所描繪之胺基 酸序列。 本發明包括一種抗體，其中VH藉由在嚴格條件下與編 碼胺基酸序列SEQ ID NO:1〇、11、17、18或19之核苦酸序 列的互補序列雜交之核苷酸序列編碼；且/或VL藉由在嚴 格條件下與編碼胺基酸序列SEQ ID NO:7、8、9、12、 13、14、15、16或61之核苷酸序列的互補序列雜交之核苷 酸序列編碼。 本發明包括一種抗體，其中VH藉由在嚴格條件下與如 SEQ ID NO:25、26或27中之任一者中所描繪之核苷酸序列 的互補序列雜交之核苷酸序列編碼；且/或VL藉由在嚴格 條件下與如SEQ ID NO: 20、21、22、23或24中之任一者中 所描緣之核苷酸序列的互補序列雜交之核苷酸序列編碼。 本發明包括一種經分離拮抗劑抗體，其以約lxl(rU至約 lxHTuM、ΙχΙΟ’11 至約 ΐχΐ(τΐ〇Μ、1χ1〇·ιο 至約 1χΐ〇-9Μ、 χίο 9至約ΙχΙΟ-8 Μ、lxUT8至約1χ10.7 Μ之間的解離常數與 人類0X40抗原決定基特異性結合。 /、 本發明包括對SEQ ID ΝΟ:7中所述序列具有至少序 列一致性之VL序列及對SEQ ID ΝΟ:1〇中所述序列具有" 少95%序列一致性之VH序列。 129377.doc 15 200846367 本發明包括對SEQ ID NO:8中所述序列具有至少95%序 列一致性之VL序列及對SEQ ID N〇:10中所述序列具有至. 少95%序列一致性之VH序列。 本發明包括對SEQ ID N0:9中所述序列具有至少95%序 列一致性之VL序列及對SEQ ID 11中所述序列具有至 少95%序列一致性之VH序列。 本發明亦包括-種抗體分子，其包含··重鏈可變區’其 包含 SEQ ID N0:17(CDR-H1)、SEQ iD NO:18(CDR-H2)及 _ SEQ ID NO:19(CDR-H3);及/或輕键可變區，其包含SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:15 或 SEQ ID N〇:61(CDR_L1)、SEQ ID NO:13(CDR-L2)及 SEQ ID NO:l4或 SEQ ID N0:16(CDR-L3)。 本發明包括本發明抗體之人類抗原結合抗體片段，包括 (但不限於）Fab、Fab’及 F(ab’）2、Fd、單鏈 Fv(scFv)、單鏈 抗體、二硫化物連接之Fv(sdFv)、雙功能抗體、三功能抗 體或微型抗體。本發明亦包括包含VL域或VH域之單域抗 體。 本發明包括單株抗體A10(TH)hu336F及其變異體之人類 化序列。編碼此等變異體之核酸包括SEq ID NO 20-27。 A10(TH)hu336F包含包括SEQ ID NO:9之輕鏈可變區及包 括SEQ ID NO: 11之重鏈可變區。可變重鏈區可進一步包含 來自恒定區之CHI、CH2及CH3域之至少一域。重鏈恒定 區可為IgG抗體，其中lgG抗體為IgGi抗體、IgG2抗體、 IgG3抗體或igG4抗體。 129377.doc -16- 200846367 本發明之抗體可包含任何合適構架之可變域序列，其限 制條件為與0X40之結合活性實質上保留。舉例而言，在 一些實施例中，本發明之抗體包含人類亞群⑴重鏈構架一 致序列。在此等抗體之一實施例中，構架一致序列包含位 置71、73及/或78上之取代。在此等抗體之一些實施例 中位置71為A，73為T且/或78為A。在一實施例中，此 等抗體包含 huMAbADS-SdiERCEPTIN' Genentech，Inc·，
South San Francisco，CA，USA)(亦在美國專利第 6,407,213 號及第 5,821，337 號及 Lee 等人，j· m〇i Bi〇1 (2〇〇4)， 340(5):1073-93中提及）之重鏈可變域構架序列。在一實施 例中，此等抗體進一步包含人類κΙ輕鏈構架一致序列。在 例中’抗體包含圖12B中所示之亞群VI之IGHV1 -46(Gene Bank寄存編號X92343)與生殖系 lGHJ4(Gene Bank 寄存編號J00256)的組合（IGHV1-46序列）。在一實施例 中’構架序列包含位置69上之取代。在一些實施例中，位 置69為L。為vL鏈選擇之人類模板為圖12A中所示之 IGKV4_1(Gene Bank寄存編號ZO〇〇23)與生殖系J模板 IGHJl(Gene Bank 寄存編號 j〇〇242)之組合（IGKV4-1 序 列）。 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中構 架序列包含序列 SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47及 / 或48 °在一實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其 中構架序列包含序列SEQ ID NO:49、50、51及/或52。 129377.doc -17- 200846367 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中構 架序列包含序列SEQ ID NO: 57、58、59及/或60。在一實 施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中構架序列包 含序列 SEQ ID NO:5 3、54、55及/或 60。 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中構 架序列包含序列 SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47及 / 或 48，且 HVR HI、H2 及 H3序列分別為 SEQ ID ΝΟ··17、18 及/或19。在一實施倒中，本發明之抗體包含輕鏈可變 域’其中構架序列包含序列SEQ ID NO:49、50、5 1及/或 52，且 HVR LI、L2 及 L3序列分別為 SEQ ID ΝΟ··12、13及 / 或16 〇 在一實施例中，本發明之抗體包含重鏈可變域，其中構 架序列包含序列SEQ ID ΝΟ:57、58、59及/或60，且HVR HI、Η2及Η3序列分別為SEQ ID ΝΟ:17、18及/或19。在一 實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變域，其中構架序列 包含序列 SEQ ID ΝΟ:53、54、55 及/或 56，且 HVR LI、L2 及L3序列分別為SEqidn〇:12、13及/或16。 本發明包括進一步包含可偵測標籤之抗〇Χ4〇抗體。本 杂明進一步包括一種偵測活體内或樣品中0X40之方法。 該方法包含使ΟΧ40抗體與受檢者或自受檢者獲得之樣品 接觸。 本發明包括進一步包含標記之抗體。 本發明包括進一步包含細胞毒素或免疫毒素之上述抗 129377.doc -18- 200846367 0X40抗體及其在治療下述疾病或病狀中之用途。 本發明亦包括結合與抗體A1 〇(TH)hu336F相同之抗原決 定基之抗體。 本發明包括包含編碼本發明抗體之核苦酸序列的經分離 核酸分子。 本發明包括包含本發明之核酸分子之載體。 本發明包括包含本發明之載體之宿主細胞。 本發明包括產生本發明之抗體之融合瘤。 本發明包括編碼本發明抗體之經分離核酸分子，其中核 苦酸序列包含SEQ ID NO:20、21、22、23或24中之任一 者。 本备明包括編碼包含胺基酸序列SEq ID NO:7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18 或 19 之本發明抗體 的經分離核酸分子。 本發明包括經分離核酸分子，其包含編碼SEQ m N〇:l〇、11、17、18或19中之任一者所述或藉由核酸序列 SEQ ID Ν〇··25、26或27編碼之重鏈可變區胺基酸序列 及/或編碼 SEQ ID NO:7、8、9、12、13、14、15 或 16 中之 任一者所述或藉由核酸序列SEQ ID NO:20、21、22、23或 24編碼之輕鏈可變區（VL)胺基酸序列之核酸序列。 本發明包括包含本發明之抗體以及生理學上可接受之载 劑、稀釋劑、賦形劑或穩定劑之組合物。 本發明包括一種用於產生本發明抗體之方法，其包含在 適於產生抗體之情況下培養本發明之細胞且分離抗體。 129377.doc -19- 200846367 本發明之另一態樣為抗OX40拮抗劑抗體用於治療發炎 及自體免疫疾病之用途。 本發明包括一種藉由抑制患者中IgE抗體產生來預防病 症之方法’其包含向患者投與有效量之本發明抗體。病症 包括（但不限於）哮喘（諸如過敏性哮喘）、過敏性鼻炎、異 位性皮炎、移植排斥反應及動脈粥樣硬化。 本發明包括一種抑制患者中IgE抗體產生之方法，其包 含向患者投與本發明之拮抗劑抗〇χ4〇抗體。IgE抗體產生 之” 了預防支乳官氣喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎、過 敏反應、蓴麻疹及異位性皮炎。 本發明包括一種治療患者中OX-40介導之病症之方法， 其包含向患者投與有效量之本發明之抗體或抗原結合片 段，其中該抗體或其抗原結合片段阻斷〇X4〇L與〇χ4〇之 結合且/或抑制一或多種與OX40L與0X40之結合有關的功 能。 本發明包括一種治療罹患哮喘症狀之受檢者之方法，其 包含向受檢者（例如，有需要之受檢者）投與有效減輕哮喘 症狀之量的本發明抗體。 本發明之抗體可藉由一或多種途徑來投與，包括靜脈 内腹膜内、吸入、肌肉内、皮下及經口途徑。本發明包 括將治療有效量之本發明抗體傳遞至患者的吸入裝置。 本發明包括一種減輕哺乳動物中哮喘嚴重程度之方法， 其包含向哺乳動物投與治療有效量之具有以下特徵之至少 一特徵的抗0X40抗體：以約1Χ1010至約1x10丨2 Μ之間的Κι 129377.doc -20 - 200846367 ”類〇X40結合之能力；抑制一或多種與結合〇χ4〇受體 有關之功能及抑制OX40L與該受體結合的能力。 在某些實施例中，抗體以約ixlO-12至約ΙχΙΟ-Η Μ、1χ 10 至約 1x10 ίο Μ、1χ1〇·ι〇至約 1χΐ0.9 Μ、1χ1〇.9至約 10 Μ、1x10-8至約1χ1〇_7 間的解離常數與人類㈣ 結合。 本發明包括一種減輕哺乳動物中哮喘嚴重程度之方法， 其包含向哺乳動物投與有效量之抗體，其中該抗體包含以 下性質中之至少一種：（a)以約1χ1〇-12至約1χ1〇·8 Μ之間的 KD與人類〇χ4〇結合；抑制一或多種與結合〇χ4〇有關之 功能；及（c)抑制〇X4〇l與0X40之結合。 本兔明之抗體亦可用於治療（但不限於）：過敏症、哮 "而、異位性皮炎、多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮 癬、發炎性腸病、移植物抗宿主疾病、實驗性自體免疫性 腦脊髄炎（ΕΑΕ)、自體免疫性神經病（諸如古立安-白瑞 (Guillain-Ban^))、自體免疫性葡萄膜炎（urehis)、自體免 疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少、重症肌無力、 膠原蛋白誘發性關節炎、結腸炎（諸如潰瘍性結腸炎）、接 觸性過敏性反應、糖尿病、克羅恩氏病及格雷氏病。 本發明之抗體亦可用於治療肉狀瘤病、實驗性利什曼 病、惡性貧血、顳動脈炎（temporal artertis)、抗磷脂症候 群、金管炎（諸如韋格納肉芽腫）、貝西氏病（Behcet，s disease)、疱疹樣皮炎、尋常天疱瘡、白斑病、原發性膽 汁性肝硬化、自體免疫性肝炎、橋本氏曱狀腺炎、自體免 129377.doc -21 - 200846367 疫性印巢炎及***、腎上腺之自體免疫性疾病、全身性 :斑狼瘡、硬皮病、皮肌炎、多發性肌炎(polymysitis)、 肌炎、脊椎關節病（諸如強直性脊椎炎）、菜特氏症候群 (p’s Sy牆·)、修格蘭氏症候群（Sj〇gre 及其他疾病。 y 本發明包括本發明抗體用於製備藥劑之用途。 病或病症 本發明包括本發明抗體用於治療0 x 4 0相關疾 之用途。
个發明包括本發明抗體用於偵測OX40之用途。 本發明包括在一容器中包含 ^ w 3 f貝疋里之本發明抗體且在另 容器中包含緩衝劑的套組。 量之本發明組合物且在 本發明包括在一容器中包含預定 另一容器中包含緩衝劑的套組。 本發明包括包含本發明抗體之醫學裝置。 本發明包括包含本發明組合物之醫學裝置 【實施方式】 ~ 本發明並不限於本文所述之特定方法、方案、細胞株、 載體或試劑，因為其可變化。此外，本文所用之術語係僅 為達成描述特定實施例之目的且不欲限制本發明之料。 除非上下文另外清楚規定，否則如本文及隨附申請專利範 圍所用之單數形式"一"及"該"包括複數提及，例如提及"宿 主細胞”包括複數個該等宿主細胞。除非另外定義，否則 本文所用t所有技術及科學術語及任何首字母縮寫均具有 與本發明領域中-般技術者通常理解相同之含義。雖然類 129377.doc -22- 200846367 似或專效於本文、 方法及材料的任何方法及} 用於實施本發明，伯士 7万去及材枓均可 料。 仁本文中描述例示性方法、裝置及材 引：=:二之程度上本文所提及之全部專利及公開案以 用太^开人本文’以達成描述及揭示其中所報導之可 用於本發明之蛋白、 缺 _載體K細胞及方法的目的。 ’、、'、而，不應將本文解釋為認可本發明無先於先前發明 不内容的權利。 5·1定義 整個本申請案中所用之術語應與一般技術者之普通及典 型含義結合 '然而’申請者希望以下術語具有如下定義之 特定定義。 關於抗體鏈多肽序列之短語”實質上一致，，可視作展示對 多考夕肽序列至少70%或80%或90%或95%序列一致性的抗 體鏈。關於核酸序列之此術語可視作展示對參考核酸序列 至少約85%或90°/。或95%或97%序列一致性之核苷酸序列。 應理解，術語”一致性”或”同源性”意謂在將序列及必要 時引入之缺口對準以實現對整個序列之最大百分比一致性 而不考慮將任何保守取代作為序列一致性之部分後，候選 序列中與其所比較之相應序列的殘基一致之胺基酸殘基百 分比。Ν或C末端擴展及***均不應理解為減少一致性或 同源性。對準之方法及電腦程式在此項技術中熟知。可使 用序列分析軟體量測序列一致性。 術語π抗體”以最廣泛之意義使用，包括免疫球蛋白分子 129377.doc -23- 200846367 及免疫球蛋白分子之免疫有效部分(亦即含有 特異性結合之抗原結合位點之分子 =全長單株抗體)、多株抗體及多特異性抗 :特/、性抗體)。抗體(Ab)及免疫球蛋白⑽
構特徵之醣蛋白。雖然抗體展示對特^標乾之結合= 性’但免疫球蛋白包括抗體及缺乏標乾特異性之其他類抗 體分子。天然抗體及免疫球蛋白通常為由兩個相同刚 鏈及兩個相同重（H)鏈構成之約丨5Q，_道爾_ait〇n)之里 四聚體聽蛋白。各重鏈在—末端具有可變域（％)，其後或 多個恒定域。各輕鏈在-末端具有可變域㈤及在其另: 末端具有恆定域。此外’術語"抗體，，(Ab)或"單株抗體" (mAb)意謂包括完整分子以及能夠與蛋白特異性結合之抗 體片段（諸如，Fab及F(ab，）2片段）。Fab及F(ab,)2片段缺2 完整抗體之Fc片段，明顯更快地離開動物或植物之循環， 且可具有比完整抗體少的非特異性組織結合（贸讣〗等人，7 iVwc/ iWW 24:316 (1983))。 如本文所用之”抗0X40抗體，，意謂以一方式與人類〇χ4〇 結合致使該0X40與其配位體ΟΧ4〇配位體之結合受到抑制 或實質上減少之抗體。 如本文所用之術語’’0X40介導之病症”包括與過敏症、哮 喘及與自體免疫及發炎有關之疾病有關的病狀，其包括多 發性硬化症、類風濕性關節炎、發炎性腸病、移植物抗宿 主疾病、貫驗性自體免疫性腦脊髓炎（ΕΑΕ)、實驗性利什 曼病、膠原蛋白誘發性關節炎、結腸炎（諸如潰瘍性結腸 129377.doc •24- 200846367 炎）、接觸性過敏性反應、搪尿病、克羅恩氏病及格雷氏 病。諸如肉狀瘤病、自體免疫性眼部疾病、自體免疫性葡 萄膜炎、異位性皮炎、重症肌無力、自體免疫性神經病 (諸如古立安-白瑞）、自體免疫性葡萄膜炎、自體免疫性溶 血性貧血、惡性貧血、自體免疫性血小板減少、顯動脈 炎、抗磷脂症候群、血管炎（諸如韋格納肉芽腫）、貝西氏 病、牛皮癖、疮療樣皮炎、尋常天范瘡、白斑病、原發性 膽汁性肝硬化、自體免疫性肝炎、橋本氏甲狀腺炎、自體 疫性印巢炎及***'腎上腺之自體免疫性疾病、全身 性紅斑狼瘡、硬皮病、皮肌炎、多發性肌炎、皮肌炎、脊 椎關節病（諸如強直性脊椎炎）、萊特氏症候群及修格蘭氏 症候群之其他病狀亦涵蓋於此術語之範_内。 在抗體可變域之上下文中，術語"可變"係指可變域之某 些部分之序列在抗體間廣泛不同且用於各特定抗體對其特 定標靶之結合及特異性的事實。然而，可變性在整個抗體 Φ 可變域中並非均勻分布。在輕鏈可變域及重鏈可變域中， 其均集中於三個稱為互補判定區（CDR)之區段中，亦稱為 高變區。可變域之更高保守部分稱為構架（FR)。如此項技 術中已知，描繪抗體高變區之胺基酸位置/邊界可視上下 文及此項技術已知之各種定義而變化。可變域内之一些位 置可視作雜高變位置，此係因為在一組標準下可認為此等 位置在高變區之内，而在另一組標準下認為此等位置在高 變區之外。此等位置中之一或多者亦可在擴展之高變區; 發現。本發明提供在此等雜高變位置中包含修飾之抗體。 129377.doc -25- 200846367 天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個藉由形成環連接之 三個CDR連接的FR區，大部分採用β片狀構型，且在某些 狀況下形成β片狀結構之部分。各鏈中之Cdr藉由FR區緊 密結合在一起，且與來自另一鏈之CDR一起促進抗體之標 靶結合位點之形成（參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda，Md. (1987))。除非另外指示，否則如本文所用 之免疫球蛋白胺基酸殘基之編號係根據
Kabat等人之免疫 球蛋白胺基酸殘基編號系統進行。 術居抗體片段"係指全長抗體之一部分，一般指標乾結 合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab，、F(ab，）2及 Fv片段。短語抗體之”抗原結合片段”為具有與全長抗體相 同之定性生物活性的化合物。舉例而言，抗〇χ4〇抗體之 抗原結合片段為以一方式可與ΟΧ40受體結合以致預防該 分子具有與0X40配位體結合之能力或實質上減少該分子 之忐力的抗體。如本文所用，關於抗體之”功能片段”係指 Fv、Fab^F(ab’）2片段。”Fv”片段為含有完全標靶識別及 結合位點之最小抗體片段。此區由一重鏈可變域及一輕鏈 可變域以緊密非共價結合之二聚體組成（VH-VL二聚體）。 在此構型中，各可變域之三個CDR相互作用以確定vH_vL 二聚體表面上之標靶結合位點。六個CDR共同向抗體賦予 標乾結合特異性。然而，甚至單個可變域（或僅包含三個 對標靶具特異性之CDR的Fv之一半）亦具有識別且結合標 把之能力’儘管親和力比整個結合位點低。”單鏈Fv"或 129377.doc -26- 200846367 "sFv"抗體片段包含抗體之^^及^域，其中此等域存在於 單一多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步包含在^與％ 域之間的多肽連接子，該多肽連接子使sFv能夠形成標乾 結合所需之結構。
Fab片段含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域（CH1)。 Fab’片段因在重鏈CH1域之羧基末端添加包括一或多個來 自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的數個殘基而與Fab片段不同。 藉由在F(ab，)2胃蛋白酶消化產物之鉸鏈半胱胺酸處***雙 _ 硫鍵來產生F(ab，）片段。抗體片段之其他化學偶合為一般 技術者所知。 如本文所用之術語"單株抗體”係指自一群實質上同類之 抗體獲得之抗體，亦即構成此群體之個別抗體除可少量存 在之可能天然存在之突變外均相同。單株抗體具有高度特 異性’其針對單個標純點。此外，與通f包括針對不同 決定子（抗原決定基）之不同抗體的習知（多株）抗體製劑相 比’各單株抗體針對標乾上之單個決定子。除特異性外， 單株抗體亦由於其可藉由融合瘤培養物來合成、未受其他 免疫球蛋白污染而為有利的。修飾語"單株"表明自實質上 同類抗體群體獲得之抗體的特徵，且不應理解為需要藉由 任何特定方法產生抗體。舉例而言，可使用熟知之技術自 *囷體抗體庫分離供本發明使用之單株抗體。待根據本發 明使用之親本單株抗體可藉由首先由等人，淑㈣ 25=95(1975)料之融合財μ備，或可藉由重組方法 製備。 129377.doc -27- 200846367 如本文所用之術語”嵌合"抗體係指具有來源於非人類免 疫球蛋白（諸如，大鼠或小鼠抗體）之可變序列及通常選自 人類免疫球蛋白模板之人類免疫球蛋白恆定區的抗體。 ’’人類化”形式之非人類（例如，鼠科）抗體為含有來源於 非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合免疫球蛋白、其免疫 球蛋白鏈或片段（諸如Fv、Fab、Fab，、F(ab，）2或抗體之其 他標把結合子序列）。一般而言，人類化抗體包含至少一 個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全 # IHE对應於非人類免疫球蛋白之彼等CDR區且全部或 貝貝上全部FR區為人類免疫球蛋白一致序列之彼等 區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區（Fc)(通常為所 選人類免疫球蛋白模板之免疫球蛋白恆定區）之至少一部 分。 如本文所用之”人類抗體，，包括具有人類免疫球蛋白之胺 基酸序列之抗體且包括自人類免疫球蛋白庫分離或自針對 一或多個人類免疫球蛋白轉殖基因且不表現内源性免疫球 蛋白之動物分離的抗體，如下文及（例如）Kucherlapati等人 之美國專利第5,939,598號中所述。 術語”細胞”、”細胞株”及”細胞培養物”包括子代。亦應 瞭解，所有子代之DNA内含物可能因蓄意突變或偶然突變 而不準確相同。包括與針對最初轉型細胞進行篩檢具有相 同功能或生物性質的變異子代。用於本發明之”宿主細胞，， 一般為原核或真核宿主。 細胞生物體經DNA”轉型，，意謂將DNA引入生物體中以使 129377.doc -28 - 200846367 DNA可作為染色體外元件或藉由染色體整合而複製。细胞 生物體經DNA”轉染"係指藉由細胞或生物豸吸收膽八（例 如，表現載體），而無論實際上是否表現任何編碼序列。 術語，，經轉染之宿主細胞"及"轉型”係指其中引入職之細 胞。該細胞稱為"宿主細胞，，且其可為原核或真核。典型原 核宿主細胞包括各種大腸桿菌（£. c〇/〇菌株。典型真核宿 主細胞為哺乳動物，諸如中國倉鼠_巢或人類來源之細
胞。引人之DNA序列可來自與宿主細胞相同之物種或與宿 主細胞不同之物種，或其可為含有一些外源職及一些同 源DNA之雜DNA序列。 術語”載體”意謂含有與能夠實現叫^八在合適宿主中的表 現之合適控㈣列可操作地連接之DNA序歹㈣而八構築 體。該控制序列包括實現轉錄之啟動子、控制該轉錄之可 選操縱序列（〇Ρ_〇Γ叫職ee)、、編碼合適mRNA核糖體結 合位點之序列及控制轉錄及轉譯終止之序列。載體可 體、嗟菌體顆粒或僅為潛在基因組***物。一旦轉型至合 適宿主中’載體即可獨立於宿主基因組複製且起作用，或 可在一些情況下整合至基因組自身中。在本說明書中， ”質體"及"載體”有時可交替使用，此係因4質體為最常使 用之載體形式。然#，本發明意欲包括如此項技術中已知 提供等效功能且為此項技術中已知之其他形式載體。 、用於達成治療目的之”哺乳動物t，係指任何動⑯，其分類 為包括人類、家畜、非人類靈長類動物及動物園、運動或 玩貝動物（諸如犬、馬、貓、牛等）之哺乳動物。 129377.doc -29- 200846367 詞語”標記"在用於本文時係指可偵測之化合物或組合 物其可與为子或蛋白（例如，抗體)直接或間接接合。標 記自身可經偵測(例如，放射性同位素標記或螢光標記)或 在酶性標記之狀況下，其可催化可偵測之受質化合物或組 合物之化學改變。 如本文所用之”固相"意謂本發明之抗體可黏著之非水性 基質。本文所涵蓋之固相之實例包括部分或完全由玻璃 (例如，受控微孔玻璃）、多醣（例如，瓊脂糖）、聚丙烯醯 胺、聚苯乙烯、聚乙歸醇及聚矽氧形成之彼等固相。在某 些貝方也例中’視上下文而定，固相可包含檢定盤之孔；在 其他實施例中，其為純化管柱（例如，親和層析管柱）。 5.2免疫原 兩種形式之0X40受體用作免疫原以產生本發明之抗 0X40抗體：（1)一種為可溶形式之人類〇Χ4〇受體，其表現 為包含人類Fcyl及藉由核苷酸殘基1〇5至627編碼之胞外域 的融合蛋白；及（2)第二種為基於細胞之免疫原，其包含在 穩定轉染之小鼠纖維母細胞L-細胞之表面上表現的全長 0X40。可溶性〇χ4〇受體或其片段可用作用於產生本發明 抗體之免疫原。所得拮抗劑抗體係針對〇Χ4〇且能夠抑制 OX40L與0X40相互作用，藉此中和受體活性。免疫原較 佳為多肽且可為跨膜分子。免疫原可重組產生或使用合成 方法來製備。免疫原亦可自天然來源分離。 免疫原可包含0X40之胞外域。或者，表現包含胞外域 之跨膜蛋白之細胞可用作免疫原。該等細胞可來源於天然 129377.doc -30- 200846367 來源（例如，τ細胞株），或可為已藉自重組技術轉型以在 表面上表現受體之細胞。可用於產生抗體之其他免疫原及 其形式為熟習此項技術者顯而易ι。用全細胞免疫原免疫 諸如齧齒動物之宿主動物在此項技術中熟知。 或者，可根據熟習此項技術者熟知之方法將編碼〇χ4〇 之基因或cDNA選殖至質體或其他表現載體中且在大量表 現系統中之任一者中表現。熟知選殖及表現〇χ4〇及用於 0X40之核酸序列的方法（參見例如美國專利第5,821，332號 及等5,759,546號）。由於遺傳密碼之簡併性，可產生編碼 0X40多肽之大量核苷酸序列。可藉由基於可能密碼子選 擇來選擇組合而改變核苦酸序列。根據如應用於編碼天然 存在之0X40多肽之核苷酸序列的標準三聯體遺傳密碼進 行此等組合，且將考慮所有該等變化。此等多肽中之任一 者均可用於動物之免疫以產生與0X40結合之抗體。 免疫原0X40多肽在有益時可表現為具有與諸如免疫球 蛋白Fc區之另一多肽融合之〇χ4〇多肽的融合蛋白。例 如，藉由允許融合蛋白分離且藉由親和層析法純化，融合 多肽通常有助於蛋白純化。可藉由培養經編碼包括與蛋白 魏基及/或胺基末端連接之融合區段之蛋白的融合核酸序 列轉型之重組細胞產生融合蛋白。融合區段可包括（但不 限於）免疫球蛋白Fc區、麩胱甘肽-s_轉移酶、卜半乳糖苦 酶、能夠與二價金屬離子結合之聚組胺酸區段及麥芽糖結 合蛋白。 在本發明中，重組0X40用以免疫小鼠以產生拮抗劑抗 129377.doc -31 - 200846367
體。重組0X40可自大量來源購得（參見例如R & D
Systems，Minneapolis，MN·，PeproTeeh，Inc·，NJ&San〇fi Bio-Industries，Inc·，Tervose，PA·)。例示性多肽包含全部 或一部分之SEQ ID N0.1及其變異體。 5.3抗體產生 本發明之抗體可藉由此項技術中已知之任何合適方法產 生。本發明之抗體可包含多株抗體。製備多株抗體之方法 為熟習技工所知（Hadow 等人，Antibodies: a Laboratory
Manual’ Cold spring Karbor Laboratory Press，第 2 版 (1988)，其以全文引用的方式併入本文）。 舉例而言，可向包括（但不限於）兔、小鼠、大鼠等之各 種宿主動物投與如上所述之免疫原以誘發含有對抗原具特 異性之多株抗體之血清的產生。投與免疫原可能需要一或 多次注射免疫劑及必要時佐劑。各種佐劑可用以增加免疫 反應，視佰主物種而定，且包括（但不限於）弗氏 (FreuncTS)(完全及不完全）、礦物凝膠（諸如氫氧化鋁）、表 面活性物質（諸如溶血卵磷脂、複合多元醇（plur〇nic polyol)、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔螺血藍蛋白、二硝 基苯酚）及潛在有用之人類佐劑（諸如BCG(卡介苗，bacille Calmette-Guerin)及短棒狀桿菌（c〇rynebacterium parvum))。可採用之佐劑之其他實例包括MpL_TDM佐劑 (單磷醯脂質A、合成海藻糖二黴菌酸脂（^加^^ trehalose dic〇ryn〇myC〇late))。免疫方案在此項技術中熟知 且可藉由在所選動物宿主中引起免疫反應之任何方法執 129377.doc -32- 200846367 行。佐劑在此項技術中亦為吾人熟知。 通常，藉由多次皮下或腹膜内注射或經肌肉内或經靜脈 内將免疫原（具有或不具有佐劑）注射至哺乳動物中。免疫 原可包括0X40多肽、融合蛋白或其變異體。視多肽性質 (亦即，％疏水性、％親水性、穩定性、淨電荷、等電點 等）而定，其可適用於使免疫原與已知在經免疫之哺乳動 物中具免疫原性之蛋白接合。該接合包括藉由將化學官能 基有效衍生至待接合之免疫原及免疫原性蛋白以致形成共 _ 價鍵而達成之化學接合，或經由基於融合蛋白之方法或熟 習技工已知之其他方法。該等免疫原性蛋白之實例包括 (但不限於）匙孔螺血藍蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、牛 甲狀腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑及混雜T輔助肽。如 上所述’各種佐劑可用以增加免疫反應。 本發明之抗體可包含單株抗體。單株抗體為識別單個抗 原位點之抗體。其相同特異性使得單株抗體比通常含有識 _ 別夕個不同抗原位點之抗體的多株抗體適用。可使用融合 瘤技術（諸如Kohler等人，256:495 (1975);美國專 利弟 4,376，11〇號；Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版 (1988)及 Harnmerling 等人，Monoclonal Antibodies and T_ Cell Hybridomas，Elsevier(1981)所述之彼等技術）、重組 DNA方法或技工已知之其他方法製備單株抗體。可用於產 生單株抗體之方法之其他實例包括（但不限於）人類B細胞 融合瘤技術（Kosbor 等人，/所所關o/ogj； Tbday 4:72 (1983); 129377.doc -33 - 200846367
Cole等人，Proc 夕cz· 80:2026 (1983))及 EBV 融合瘤技術（Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第 77-96 頁，Alan R. Liss (1985))。該等抗體可 為任何免疫球蛋白類，包括IgG、igM、IgE、IgA、IgD及 其任何亞類。產生本發明mAb之融合瘤可在活體外或活體 内培養。 在融合瘤模型中，諸如小鼠、人類化小鼠、具有人類免 疫系統之小鼠、倉.鼠、兔、駱駝或任何其他適合宿主動物 之宿主經免疫以引出產生或能夠產生與周於免疫之蛋白特 異性結合之抗體的淋巴細胞。或者，可使淋巴細胞在活體 外免疫。接著’使用諸如聚乙二醇之合適融合劑將淋巴細 胞與骨魏瘤細胞融合以形成融合瘤細胞（G〇ding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic
Press ，第 59-103頁（1986))。 一般而言，在製備產生抗體之融合瘤時，若需要人類來 源之細胞，則使用外周血淋巴細胞C，PBL”），或若需要非 人類哺乳動物來源’則使用脾細胞或淋巴結細胞。接著， 使用諸如聚乙二醇之合適融合劑將淋巴細胞與永生細胞株 融合以形成融合瘤細胞（Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，Aeademic press，第 59_1〇3 頁 (1986))。永生細胞株通常為轉型哺乳動物細胞，尤其齧齒 動物、牛或人類來源之骨髓瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠 月知瘤細胞株。融合瘤細胞可在較佳含有一或多種抑制未 融合之永生細胞生長或存活之物質的合適培養基中培養。 129377.doc -34- 200846367 舉例而言，若親本細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基 轉移酶（HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常將包 括預防缺少HGPRT之細胞生長之物質次黃嘌吟、胺基蝶呤 (aminopterin)及胸苦（"HAT培養基”）。 較佳之永生細胞株為有效融合、支持藉由所選之產生抗 體之細胞穩定高含量產生抗體及對諸如HAT培養基之培養 基敏感的彼等細胞株。此等骨髓瘤細胞株為鼠科骨髓瘤細 胞株，諸如來源於自 Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.美國申請案號獲得之MOPC-21及 MPC-11小鼠腫瘤的彼等細胞株及自American Type Culture Collection，Rockville，Md. USA獲得之 SP2/0 或 X63-Ag8-653細胞。關於人類單株抗體之產生，亦已描述人類骨髓 瘤及小鼠-人類雜合骨髓:瘤細胞株（Kozbor，J /mmwo/ 133:3001 (1984) ; Brodeur 等人，Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications，Marcel Dekker, Inc，第51-63頁（1987))。亦可使用小鼠骨髓瘤細胞株NSO (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK)。 關於針對0X40之單株抗體之產生，檢定融合瘤細胞生 長之培養基。藉由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異 性可藉由免疫沈澱或藉由活體外結合檢定（諸如，放射免 疫檢定（RIA)或酶聯免疫吸附劑檢定（ELISA))來測定。該 等技術在此項技術中已知且在技工技能内。例如，單株抗 體對0X40之結合親和力可藉由Scatchard分析來測定 129377.doc -35· 200846367 (Munson等人107:220 (l98〇))。 在鑑別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體 之融合瘤細胞後，該等純系可藉由限制稀釋程序來次選殖 且藉由標準方法生長（Goding，Monoclonal Antibodies, Principles and Practice， Aeademic press ，第 59-1〇3 頁 (1986))達成此目的之合適培養基包括（例如）達爾伯克改 良伊格爾培養基（DulbeCC〇，s Modified £agle，s Medium， DMEM)或RPMI_1640培養基。此外，融合瘤細胞可在活體 •内作為動物中之腹水腫瘤生長。 藉由諸如蛋白A-填脂糖、經麟灰石層析法、凝膠排阻層 析法、凝膠電泳、透析或親和層析法之習知免疫球蛋白純 化程序，將亞純系分泌之單株抗體自培養基、腹水流體或 血清適當脫離或分離。 此項技術中存在多種用於產生單株抗體之方法且因此， 本發明並不限於其在融合瘤中之唯一產生。舉例而言，單 • 株抗體可藉由重組DNA方法（諸如，美國專利第4,816,567 號中所述之彼等方法）來製備。融合瘤細胞充當該A之 來源。一旦分離，即可將DNA置放於表現載體中，接著將 表現载體轉染至諸如大腸桿菌細胞、NS〇細胞、猿。〇§細 胞、t國倉鼠印巢（CH0)細胞或不另外產生免疫球蛋白之 骨髓瘤細胞的宿主細胞中，以達成單株抗體在重組宿主細 胞中之合成。例如，亦可藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域之 、編碼序列替代同源鼠科序列（美國專利第4,816,567號，· Mornson等人，pr〇c細，义㈤以⑽」8ι:685ΐ (1984))或 129377.doc -36 - 200846367 藉由使非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列與免疫球 蛋白編碼序列共價連接來修飾DNA。該非免疫球蛋白多肤 可替代本發明抗體之恒定域’或可替代本發明抗體之一抗 原結合位點的可變域以產生嵌合二價抗體。 抗體可為單價抗體。用於製備單價抗體之方法在此項技 術中熟知。舉例而言，一種方法包含免疫球蛋白輕鍵及經 修飾之重鏈的重組表現。一般，在Fc區中任一點截短重^ ㈣止重鏈交聯。或者，有關半胱胺酸殘基經另一胺基酸 殘基替代或刪除以防止交聯。 可藉由已知技術產生識別特異性抗原決定基之抗體片 段。傳統上，經由蛋白水解消化完整抗體來獲得此等片段 (參見例如M〇rimoto等人，/价—㈣出叩如 24:107 (1992); Brennan等人，229:81 (1985))。舉 例而言，可藉由蛋白水解***免疫球蛋白分子，使用諸^ 木瓜蛋白酶（以產生Fab片段）或胃蛋白酶（以產生？（讣，）2片 φ 段）之酶來產生本發明之及F(ab，）2片段。F(ab，）2片段含 有可變區、輕鏈恆定區及重鏈之CH1區域。然而，目前可 藉由重組宿主細胞直接產生此等片段。舉例而言，抗體片 ^又可自抗體嗟|g體庫分離。或者，F(ab’)2_SH片段可自大 腸桿菌中直接回收且經化學偶合以形成F(ab，）2片段（Caner 等人，价〇/7^/^〇/〇灯10:163 (1992))。根據另一方法， F(aV)2片段可自重組宿主細胞培養物中直接分離。用於產 生抗體片段之其他技術對於熟習此項技術者而言為顯而易 見的。在其他實施例中，所選擇之抗體為單鏈Fv片段 129377.doc -37- 200846367 (Fv)(PCT專利申請案 w〇 93/16185)。 對於包括抗體在人類中之活體内用途及活體外偵測檢定 之一些用途’可能較佳使用嵌合抗體、人類化抗體或人類 抗體。嵌合抗體為其中不同部分之抗體來源於不同動物物 種之分子’諸如具有來源於鼠科單株抗體之可變區及人類 免疫球蛋白恆定區的抗體。用於產生嵌合抗體之方法在此 項技術中已知。例如，參見M〇rrison，Sc/ence 229:1202 (1985)，〇i 等人，价4:214 (1986) ; Gillies 等 J Immunol Methods 125:191 (1989);美國專利第 5,807,715號、第4,816,567號及第4,816397號，其均以全文 引用的方式併入本文。 人類化抗體經設計以具有比來源於動物之單株抗體大的 與人類免疫球蛋白之同源性。人類化為用於製備嵌合抗體 的技術’其中實質上少於完整人類可變域已經來自非人類 物種之相應序列替代。人類化抗體為在非人類物種中產生 之與所需抗原結合的抗體分子，其具有一或多個來自非人 類物種之互補判定區（CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之 構架（FR)區。通常，用來自CDR供體抗體之相應殘基替代 人類構架區中之構架殘基以改變、較佳改良抗原結合。此 等構架替代藉由此項技術中熟知之方法鑑別，例如藉由使 CDR與構架殘基之相互作用模型化以鑑別抗原結合之重要 構架殘基及序列比較以鑑別特定位置上之異常構架殘基。 例如，參見美國專利第5,585,089號；Riechmann等人， 332:323 (1988)，其均以全文引用的方式併入本 129377.doc -38- 200846367 文。可使用此項技術中已知之多種技術將抗體人類化，該 等技術包括（例如）CDR移植（EP 239,400 ; PCT公開案WO 91/09967 ;美國專利第5,225,539號、第5,530，101號及第 5,585,089號）、膠合或表面重塑（£? 592，106;£? 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991) ； Studnicka等 人，Protein Engineering 7:805 (1994); Roguska 等人， Proc dead 91:969 (1994))及鏈改組（美國專利 第 5,565,332號）。 一般而言，人類化抗體具有自非人類來源引入其中之一 或多個胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常被稱為 ”輸入’’殘基，其通常自”輸入”可變域獲得。人類化基本上 可遵循Winter及合作者之方法（j〇nes等人，321:522
(1986) ; Riechmann等人 ’ e 332:323 (1988) ; Verhoeyen 等人’ Sc — ce 239:1534 (1988))藉由用非人類CDR或CDR 序列替代人類抗體之相應序列來執行。因此，該等”人類 化抗體為肷合抗體（美國專利第4,816,567號），其中實質 上少於完整人類可變域已經來自非人類物種之相應序列所 替代。實際上，人類化抗體通常為其中一些CDR殘基及可 能一些FR殘基經來自齧齒動物抗體之類似位點之殘基替代 的人類抗體。 進一步重要的是，人類化抗體保留對抗原之較高親和力 及其他有利生物性質。為實現此目標，根據一較佳方法， 藉由使用親本序列及人類化序列之三維模型來分析親本序 列及各種概念性人類化產物的方法來製備人類化抗體。三 129377.doc -39- 200846367 維免疫球蛋白模型普遍可得且為熟習此項技術者所孰采。 :=且展現所選候選免疫球蛋白序列之可能三㈣ ^结構的電㈣式。此㈣現之檢驗允許分㈣些殘基在 蛋白序：功能中之可能作用，亦即分析影響候 2嗖K白序列能力之殘基，亦即分析影響候選免疫球 蛋白與其抗原結合之能力的殘基。以此方式，可自接受者 =入序列選擇且組合FR殘基，以便最大化所需抗體特
仏’諸如增加對餘抗原之親和力’儘管咖殘基直接且 幾乎實質上影響抗原結合。 在裝備人類化抗料待用之人_鏈及重鏈可變域的選 擇對降低抗原性而言為重要的。根據所謂"最適”方法，針 對已知之人類可變域序列的整個庫篩檢非人類抗體之可變 或序歹J #著，將與非人類親本抗體之序列最接近之人類 序列視為人類化抗體之人類FR(sims等人，J加㈣⑽/
Mol Biol 196:901 151:2296 (1993) ; Chothia 等人 (1987)) 〇 另-方法使用纟源於具有特定亞群之輕鍵或重鍵之所有 人類抗體的-致序狀特定構架。同_構架可用於若干不 同人類化抗體（Carter等人， 89.4285 (1992)，Presta等人，j /所賺⑽，151·2623 (1993))。 本發明之抗體可包含任何合適之人類或人類—纟輕鍵或重 鏈構架序列，其限制條件為抗體展示所需生物特徵（例 如，所需結合親和力）。在一些實施例中，在人類及/或人 類一致非高變區序列内存在一或多個（諸如2、3、4、5、 129377.doc •40- 200846367 、7、8、9個或更多個）其他修飾。在一實施例中，本發 明之抗體包含至少一部分（或全部）人類輕鏈構架序列。在 一實施例中，本發明之抗體包含至少一部分（或全部）人類 重鏈構架序列。在一實施例中，本發明之抗體包含至少一 部分（或全部）人類亞群I構架一致序列。在一些實施例中， 本务明之抗體包含人類亞群III重鏈構架一致序列。在一實 %例中，本發明抗體之構架一致序列包含位置7 1、乃及/ 或78上之替代。在此等抗體之一些實施例中，位置7 i為 A，73為T且/或78為A。 完全人類抗體對於人類患者之治療而言尤其合乎需要。 可藉由此項技術中已知之多種方法（包括上述嗤菌體呈現 方法），使用來源於人類免疫球蛋白序列之抗體庫來製備 人類抗體。亦參見美國專利第4,444,887號及第4,716，111 號；及 PCT 公開案 wo 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及 WO 91/10741 ;其各自以全文引用的方式併入本文。 等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體 (Cole等人 ’ Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，
Alan R· Riss (1985);及 Boemer 等人，j /所所關〇/ 147:86 (1991)) 〇 亦可使用不能表現功能内源性免疫球蛋白但可表現人類 免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠來產生人類抗體。舉例而 言，可隨機或藉由同源重組將人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白 基因複合物引入小鼠胚胎幹細胞中。或者，除人類重鍵及 129377.doc -41 - 200846367 輕鏈基因外，亦可將人類可變區、恆定區及多變區引入小 鼠胚胎幹細胞中。可在藉由同源重組引入人類免疫球蛋白 基因座之情況下分別或同時致使小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋 白基因無功能。詳言之，JH區之純合子缺失防止内源性抗 體產生。將經修飾之胚胎幹細胞擴大且微注射至胚囊中以 產生嵌合小鼠。接著，使嵌合小鼠繁殖以產生表現人類抗 體之純合子後代。例如，參見Jakobovitis等人， dead [/以 90:2551 (1993) ; Jakobovitis等人，TVahre 362:255 (1993) ; Bruggermann等人，k //^彷狀〇/ 7:33 (1993) ; Duchosal等人，355:258 (1992) 〇 以正常方式使轉殖基因小鼠經所選抗原（例如，全部或 一部分本發明之多肽）免疫。使用習知融合瘤技術，可自 經免疫之轉殖基因小鼠獲得針對抗原之單株抗體。轉殖基 因小鼠所懷有之人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化期 間重排，且隨後進行類別轉換及體細胞突變。因此，使用 此技術，可能產生治療上有用之IgG、IgA、IgM及IgE抗 體。關於用於產生人類抗體之此技術的概述，參見 Lonberg等人，Int Rev Immunol 13:65-93 (1995) ° 關於用於 產生人類抗體及人類單株抗體之此技術及用於產生該等抗 體之方案的詳細討論，參見例如PCT公開案W〇 98/24893 ； WO 92/01047 ； WO 96/34096 ； WO 96/33735 ; 歐洲專利第0 598 877號；美國專利第5,413,923號；第 5,625，126 號；第 5,633,425 號；第 5,569,825 號；第 5,661，016 號；第 5,545,806 號；第 5,814,318 號；第 129377.doc -42- 200846367 5,885,793 號；第 5,916,771號；及第 5,939,598號，此等專 利以全文引用的方式併入本文。此外，諸如Abgenix， Inc.(Freemont，Calif·)、Genpharm(San Jose，Calif·)及 Medarex，Inc.(Princeton，N.L)之公司可使用類似於上述技 術之技術著手提供針對所選抗原之人類抗體。 亦可藉由使移植人類外周血白血球、脾細胞或骨髓之小 鼠免疫（例如XTL之Trioma技術）來製備人類mAbs。可使用 稱為π導引選擇’’之技術來產生識別一個所選抗原決定基之 _ 完全人類抗體。在此方法中5使周一種所選非人類單株抗 體（例如小鼠抗體）以引導選擇識別相同抗原決定基之完全 人類抗體（Jespers 等人，12:899 (1988))。 此外，使用熟習此項技術者熟知之技術，本發明多肽之 抗體隨後可用以產生’’模擬π本發明多肽的抗個體基因型 (anti-idiotype)抗體（參見例如Greenspan等人，J 7:437 (1989) ; Nissinoff，J /mm關〇/ 147:2429 (1991))。舉 _ 例而言，結合且競爭抑制多肽多聚化及/或本發明多肽與 配位體結合的抗體可用於產生抗個體基因型抗體，其，，模 擬”該多肽多聚化及/或結合域，且因此結合且中和多肽及/ 或其配位體。該等中和性抗個體基因型抗體或該等抗個體 基因型抗體之Fab片段可用於中和多肽配位體之治療方 案。舉例而言，該等抗個體基因型抗體可用於結合本發明 之多肽及/或結合其配位體/受體，且藉此阻斷其生物、、舌 性。 本發明之抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體為對於 129377.doc -43- 200846367
之 面 至少兩個不同抗原具結合特異性之單株抗體較佳為人 或人類化抗體。在本發明中，一種結合特異性可針 0X40，另一者可針對任何其他抗原，較佳針對細胞表 蛋白、受體、受體次單元、組織特異性抗原、病毒衍生' 蛋白、病毒編碼之包膜蛋白、細菌衍生之蛋白或細 蛋白等。 、 又 用於製備雙特異性抗體之方法為眾所周知。傳統上，錐 特異性抗體之重組產生係基於兩條重鏈具有不同特異性^ 兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共同表現（Milsiein等人· 偏講305:537 (削））。由於免疫球蛋白重鏈及輕ϋ機 分配，所以此等融合瘤（四重融合瘤（quadr〇mas))產生十個 不同抗體分子之可能混合物，其中僅一個抗體分子具有正 確之雙特異性結構。該正確分子之純化通常藉由親和層析 步驟實現。類似程序揭示於WO 93/08829及Traunecker等 人，五M50 J 10:3 655(1991)中。 具有所需結合特異性（抗體_抗原結合位點）之抗體可變域 可與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳與包含至少部分之 鉸鏈、CH2及CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定域進行融合。 其可具有第一重鏈怪定區（CH1)，該第一重鏈恆定區含有 存在於至少一種融合中之輕鏈結合所需之位點。將編碼免 疫球蛋白重鏈融合及必要時免疫球蛋白輕鏈之DNA***單 獨表現载體中，且共同轉型至合適宿主生物體中。關於產 生雙特異性抗體之進一步詳情，參見例如Suresh等人， Mei/z h Enzym 121:210 (1986) 〇 129377.doc -44- 200846367 本發明亦涵盍雜接合物抗體。雜接合物抗體由兩個共價 連接之抗體構成。例如，已建議該等抗體使免疫系統細胞 靶向不需之細胞（美國專利第4,676,980號）。預期可使用合 成蛋白化學中已知之方法（包括涉及交聯劑之彼等方法）， 於活體外製備該等抗體。舉例而言，免疫毒素可使用二硫 化物父換反應或藉由形成硫酯鍵來建構。用於達成此目的 之合適試劑之實例包括亞胺硫醇酯及曱基_4_巯基丁醯亞胺 酯及（例如）美國專利第4,676,980號中揭示之彼等試劑。 此外’可產生0X40之單域抗體。此技術之實例已描述 於關於來源於駱駝重鏈ig之抗體之wo 9425591以及描述自 化囟體庫分離單域完全人類抗體的US 20030130496中。 亦可產生其中重鏈與輕鏈Fv區經連接之單肽鏈結合分 子。單鏈抗體（"scFv”）及其建構方法描述於美國專利第 4,946,778號中。或者，可藉由類似方式建構且表現Fab。 所有完全及部分人類抗體之免疫原性均比完全鼠科mAb免 疫原性小，且片段及單鏈抗體亦具有較小免疫原性。 抗體或抗體片段可自使用McCafferty等人，We 3 48:5 52(1990)中所述之技術產生的抗體嗟菌體庫分離。
Clarkson 等人，352:624(1991)及 Marks 等人，J Mo/ 扪W 222:581(1991)描述使用噬菌體庫分別分離鼠科及人類 抗體。隨後公開案描述藉由鏈改組產生高度親和力（nM範 圍）人類抗體（Marks等人，5/o/rec/mo/〇 幻；ι〇··779 (1992))， 以及將組合感染及活體内再組合作為用於建構極大噬菌體 庫之策略（Waterhouse等人，ycz•心及〜21:2265 129377.doc -45- 200846367 (1993))。因此，此等技術為傳統上用於分離單株抗體之單 株抗體融合瘤技術的可行性替代方法。 例如，亦可藉由用人類重鏈及輕鏈恒定域之編碼序列替 代同源鼠科序列來修飾DNA(美國專利第4,816,567號； Morrison等人，/Voc iVa，/8 1:685 1 (1 984))。 另一替代方法為使用電融合而非化學融合以形成融合 瘤。此技術完全建立。不使用融合，亦可使用（例如）愛潑 斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus)或轉型基因使B細胞轉 型以使其永生。參見例如"Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity，’’ Zurawaki等人，Monoclonal Antibodies，Kennett 等人編，Plenum Press，第19-33頁（1980)。可藉由用由真 核生物或原核生物系統表現之0X40蛋白、融合蛋白或其 片段使齧齒動物（例如，小鼠、大鼠、倉鼠及豚鼠）免疫來 培養抗0X40 mAb。其他動物可用於使（例如）非人類靈長 類動物、表現免疫球蛋白之轉殖基因小鼠及移植人類B淋 巴細胞之嚴重聯合免疫缺陷（SCID)小鼠免疫。如較早所述 (K0hler等人，256:495 (1975))，可藉由習知程序藉 由使來自免疫動物之B淋巴細胞與骨腾瘤細胞（例如， Sp2/0及NSO)融合來產生融合瘤。此外，可藉由在噬菌體 呈現系統中篩檢來自人類B淋巴細胞之重組單鏈Fv或Fab庫 來產生抗0X40抗體。mAb對0X40之特異性可藉由 ELIS A、西方免疫墨點法或其他免疫化學技術測試。抗體 對CD4+ T細胞激活之抑制活性可藉由增殖、細胞激素釋放 129377.doc -46- 200846367 及細胞凋亡檢定來評估。藉由限制稀釋法選殖陽性孔中之 融合瘤。純化抗體以藉由上述檢定表徵對人類〇χ4〇之特 異性。 5.4拮抗劑抗〇Χ4〇抗體之鑑別 本發明提供抑制且中和0X40作用之拮抗劑單株抗體。 詳言之，本發明之抗體結合〇Χ4〇且抑制〇χ4〇之激活。本 發明之抗體包括稱為Α10及Β66之抗體，且揭示此等鼠科 抗體之人類化抗體。本發明亦包括結合與此等抗體中之一 者（例如，單株抗體A10(TH)hu336F)相同之抗原決定基的 抗體。 使用以下各技術篩檢候選抗〇Χ4〇抗體：螢光微量檢 疋技術（FMAT)(Applied Biosystem，CA); (2)酶聯免疫吸附 劑檢定（ELISA)及（3)流式細胞儀免疫檢定。為表徵所選抗 體而執行之檢定包括：（l)Hut-78檢定；（2)純真CD4+ T細 胞檢定；（3)TH1、TH2及TH17病狀；（4)TCR激活之純真 CD4+ T細胞方案；（5)細胞凋亡檢定；及（6)交叉反應性測 試。實驗詳情描述於實例中。 本發明之抗體包括（但不限於）多株抗體、單株抗體、單 價抗體、雙特異性抗體、雜接合物抗體、多特異性抗體、 人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、單域抗 體、Fab片段、F(ab’）片段、藉由Fab表現庫產生之片段、 抗個體基因型（抗Id)抗體（包括（例如）本發明抗體之抗1〇1抗 體）及以上任一者之抗原決定基結合片段。 本發明之免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何顧 129377.doc -47- 200846367 型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD ' IgA及 IgY)、類別（例 如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2)或亞類。抗 體可為本發明之抗原結合抗體片段且包括（但不限於）Fab、 Fab’及F(abf)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫化物 連接之Fv(sdFv)及包含VL或VH域之單域抗體。包括單鏈 抗體之抗原結合抗體片段可包含單獨或與以下區域之整體 或一部分組合之可變區：鉸鏈區、CHI、CH2及CH3域。 本發明中亦包括包含可變區與鉸鏈區、CHI、CH2及CH3 域之任何組合的抗原結合片段。本發明之抗體可來自任何 動物來源，包括鳥及哺乳動物。抗體較佳來自人類、非人 類靈長類動物、齧齒動物（例如，小鼠及大鼠）、驢、綿 羊、兔、山羊、豚鼠、路駿、馬或小雞。 本發明之抗體可為單特異性抗體、雙特異性抗體、三特 異性抗體或具有較大多特異性之抗體。多特異性抗體可對 不同0X40抗原決定基具特異性或可對〇χ4〇以及異源抗原 決定基（諸如，異源多肽或固體支撐材料）具特異性。參見 例如 PCT 公開案 WO 93/17715 ; WO 92/08802 ; WO 91/00360 ; WO 92/05793 ; Tutt等人，//__/ 147:60 (1991);美國專利第4,474,893號；第4,714,681號；第 4,925,648 號；第 5,573,920號；第 5,601，819號；Kostelny 等 人，/ 148:1 547 (1992) 〇 本發明之抗體可根據其識別或特異性結合之〇χ4〇抗原 決定基或部分來描述或表示。抗原決定基或多肽部分可如 本文所述來表示，（例如）藉由Ν末端及C末端位置、藉由鄰 129377.doc -48- 200846367 接胺基酸殘基大小或表及圖中所列。
本發明之抗體亦可根據其交叉反應性來描述或表示。本 發明亦包括結合與0X40具有至少95%、至少90%、至少 85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少 60/〇、至少55%及至少5〇%一致性（如使用此項技術中已知 且本文描述之方法計算）的〇χ4〇多肽之抗體。抗〇χ4〇抗體 亦可以小於約1〇·7 Μ、小於約1〇_6 Μ或小於約10·5 μ之KD 與其他蛋白結合，諸如來自除抗0X40抗體針對之種類外 - 之種類的抗0X40抗體。 在特定實施例中，本發明之抗體可與人類〇χ4〇之其他 哺礼動物同源物及其相應抗原決定基交叉反應。在一特定 貫施例中，上述交又反應性係相對於任何單個特定抗原或 免疫原性多肽或本文揭示之特定抗原及/或免疫原性多肽 的組合。 本發明進一步包括結合藉由在嚴格雜交條件下與編碼 Φ 0X40之聚核苷酸雜交之聚核苷酸編碼的多肽之抗體。本 發明之抗體亦可根據其對本發明之多肽之結合親和力來描 述或表示。較佳結合親和力包括具有10-8至1〇·〗5 Μ、1〇·8 至Η)·12 Μ、_1()，至1().12社平衡解離常數 或KD的彼等結合親和力。本發明亦提供如藉由此項技術中 已知用於測定競爭性結合的任何方法（例如，本文所述之 免疫檢所測定之競爭性抑制抗體與本發明之抗原決定 基結合的抗體。在較佳實施例中，抗體競爭性抑制與抗原 決定基之結合至少95%、至少9G%、至少85%、至少8〇%、 129377.doc -49- 200846367 至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。 5.5載體及宿主細胞 在另一態樣中，本發明提供編碼如本文所揭示之抗體之 經分離核酸序列、包含編碼本發明抗體之核苷酸序列的載 體構築體、包含該載體之宿主細胞及用於產生抗體之重組 技術。 為重組產生抗體，將編碼抗體之核酸分離且***可複製 載體中以用於進一步選殖（DNA擴增）或用於表現。編碼抗 體之DNA易於分離且使用習知程序（例如；藉由使周能夠 與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探 針）定序。用於選殖及轉型之標準技術可用於製備表現本 發明抗體之細胞株。 5·5·1載體 可利用多種載體。載體組件一般包括（但不限於）以下各 物之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基 因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。含有編碼本發 明抗體之核苷酸序列的重組表現載體可使用熟知技術來製 備。表現載體可包括與合適的轉錄或轉譯調節核苷酸序列 (諸如，來源於哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因之彼 等核苷酸序列）可操作地連接之核苷酸序列。調節序列之 實例包括轉譯啟動子、操縱基因（〇perat〇r)、增強子、 mRNA核糖體結合位點及/或控制轉錄及轉譯起始及終止之 其他合適序列。當調節序列在功能上與合適多肽之核苷酸 序列有關時，核苷酸序列”可操作地連接”。因此，若啟動 129377.doc •50- 200846367 子核苷酸序㈣料適核㈣序狀㈣，縣啟動子核 苦酸序列與（例如）抗體重鏈序列可操作地連接。用於表現 本《月抗體之適用表現載體的實例可見於以引用的方式併 入本文之申請案wo 04/070011。 此外，與抗體重鏈及/或輕鏈序列非天然相關之編碼合 適信號肽的序列可併人表現載體巾。舉例而言，用於信號 肽之核苷酸序列（分泌前導序列）可與多肤序列同框融合以 便將抗體分泌至周質間隙或培養基中。在所欲宿主細胞中 起作用之信號肽增強合適抗體之胞外分泌。信號肽可在細 胞分泌抗體之後自多肽***。熟知該等分泌信號之實例， 且其包括（例如）美國專利第5,698,435號、第5,698,417號及 第6,204,023號中所述之彼等分泌信號。 5 · 5 · 2宿主細胞 適用於本發明之宿主細胞為原核生物、酵母或高等真核 細胞且包括（但不限於）微生物，諸如經含有抗體編碼序列 之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型 的細菌（例如，大腸桿菌、枯草桿菌（反;經含有 抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉型之酵母（例如，酵 母（Saccharomyces)、畢赤酵母（Pichia));經含有抗體編碼 序列之重組病毒表現載體（例如，桿狀病毒（Bacul〇virus)) 感染之昆蟲細胞系統；經含有抗體編碼序列之重組病毒表 現載體（例如，花椰菜嵌紋病毒（caulifl〇wer m〇saic virus) ’ CaMV，煙草嵌紋病毒（tobacco mosaic virus)， TMV)感染或經含有抗體編碼序列之重組質體表現載體（例 129377.doc -51 · 200846367 如，Ti質體）轉型的植物細胞系統；或懷有含有來源於哺乳 動物細胞基因組（例如，金屬硫蛋白啟動子）或來源於哺乳 動物病毒（例如，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動 子）之啟動子的重組表現構築體之哺乳動物細胞系統（例 如，COS、CHO、BHK、293、3T3細胞）。 適用作本發明中宿主細胞之原核生物包括革蘭氏陰性 (gram negative)或革蘭氏陽性（gram positive)生物體，諸如 大腸桿菌、枯草桿菌、腸桿菌、伊文氏桿菌 (五rirbk)、克雷伯氏桿菌、變形桿菌 、沙門氏菌（Sa/mo似/M)、沙雷氏菌（SerraHa)及 志贺桿菌以及桿菌屬、假單胞菌（Pseudomonas) 及鏈黴菌（Streptomyces)。一較佳大腸桿菌選殖宿主為大 腸桿菌294(ATCC 31，446)，儘管諸如大腸桿菌B、大腸桿 菌 X1776(ATCC 31，537)及大腸桿菌 W3110(ATCC 27,325)之 其他菌株亦適合。此等實例為例示性而非限制性。 用於原核生物宿主細胞之表現載體一般包含一或多個表 現型可選標記基因。表現型可選標記基因為（例如）編碼給 與抗生素抗性或提供自養需求之蛋白的基因。適用於原核 生物宿主細胞之表現載體的實例包括來源於市售質體之彼 等表現載體，諸如 pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals， Uppsala，Sweden) - pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wisconsin.，USA)及 pET(Novagen，Madison，Wisconsin， USA)以及pRSE丁（Invitrogen Corporation，Carlsbad，California， USA)系列之載體（Studier，J Mo/ 5zo/ 219:37 (1991); I29377.doc -52- 200846367
Schoepfer，124:83 (1993))。通常用於重組原核生物 宿主細胞表現載體之啟動子序列包括T7(Rosenberg等人， Gene 56:125 (1987))、β-内醯胺酶（青黴素酶，penicillinase)、 乳糖啟動子系統（Chang等人，275:615 (1978); Goeddel等人，281:544 (1979))、色胺酸（trp)啟動子 系統（Goeddel 等人，8:4057 (1980))及 tac啟 動子（Sambrook 等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory (1990))。 適闬於本發明之酵母或絲狀真菌包括彼等來自酵母屬、 畢赤酵母屬、放線菌屬、刻魯維拉菌屬 (尺、裂殖酵母屬、念 珠菌屬、木黴菌屬、紅黴屬 之真菌及諸如紅黴屬、青黴菌（户、 彎頸黴菌（7b/义及麴菌O^pergzV/w)之絲狀真菌。 酵母载體通常含有來自2μ酵母質體之複製起點序列、自主 複製序列（ARS)、啟動子區、用於聚腺苷酸化之序列、用 於轉錄終止之序列及可選標記基因。用於酵母載體之合適 啟動子序列包括金屬硫蛋白、3-填酸甘油酸激酶（Hitzeman 等人，《/仏〇/ C/zem 25 5:2073 (1980))或其他糖解酶（Holland 等人，沿oc/zem 17:4900 (1978))(諸如，烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激 酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸 激酶、構酸丙糠異構酶、鱗酸葡萄糖異構酶及葡萄糖激 酶）之啟動子。用於酵母表現之其他合適載體及啟動子進 129377.doc -53- 200846367 一步描述於Fleer等人，Gene 107:285(1991)中。用於酵母 及酵母轉型方案之其他合適啟動子及載體在此項技術中熟 知。熟知酵母轉型方案。一個該方案藉由Hinnen等人， 〜ocTVai/AWSd 75:1929(1978)描述。Himien方案針對選 擇培養基中之Trp+轉化子進行選擇。 甫乳動物或昆蟲宿主細胞培養物系統亦可用以表現重組 抗體。原則上，無論來自脊椎動物或無脊椎動物培養物， _ 任何高等真核細胞培養物均可使用。無脊椎動物細胞之實 H匕治禮物及昆蟲細胞（Luckow等人，价o/rec/mo/og；； 6:47 ( 1988)，Miller 等人，Genetics Engineering，Setlow 等人 編，第 8卷’第 277-9 頁，Plenam Publishing (1986) ; Mseda 等人，Α/α⑶re 315:592 (1985))。舉例而言，桿狀病毒系統 可用於產生異源蛋白。在一昆蟲系統中，苜蓿丫紋夜蛾核 多角體病毒（Autographa calif0rnica nuclear p〇lyhedr〇sis
Virus ’ AcNPV)可用作載體以表現外源基因。病毒在草地 φ 黏蟲（办介叹如油）細胞中生長。抗體編碼序列可 個別選殖至病毒之非基本區（例如，多角體蛋白基因）中且 置放於AcNPV啟動子（例如，多角體蛋白啟動子）控制之 下。已鑑別之其他宿主包括伊蚊（义以叫、黑腹果蠅 (Drosophila melanogaste〇及家篡（B〇mbyx 卿^、。多楂用 於轉染之病毒株公開可得，例如AcNpv之[I變異體及家 蠶NPV之Bm-5病毒株，且該等病毒可用作本文中根據本發 明之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。此外，棉花、玉 米馬鈴冑λ豆、矮牵牛、番％及煙草之植物細胞培養 1293 77.doc -54- 200846367 物亦用作宿主。 脊椎動物細胞以及脊椎動物細胞在培養物（組織培養物） :之繁殖已成為一種常規程序。參見Tissue Culture，KmSe 等人編，Academic Press (1973)。適用之哺乳動物宿主細 胞株之實例為猴腎；人類胚胎腎細胞株；幼倉鼠腎細胞； 中國倉鼠印巢細胞/-DHFRCCHO, Urlaub等人，Proc C/M 77:4216 (1980));小鼠塞特利氏細胞；人類 ?呂’員癌細胞(HELA);犬科動物腎細胞；人類肺細胞； _ 人類肝細胞；小鼠***腫瘤；及NS0細胞。 宿主細胞經上述載體轉型以產生抗體，且將其在適當時 經改質之習知營養培養基中培養以誘發啟動子、轉錄及轉 澤控制序列、選擇轉化子或擴增編碼所需序列之基因。通 常使用之啟動子序列及增強子序列來源於多形瘤病毒、腺 病毒2、猿猴病毒40(SV40)及人類細胞巨大病毒（CMV)。 來源於SV40病毒基因組之DNA序列可用以提供其他遺傳 春 7G件以在哺乳動物宿主細胞中表現結構基因序列，例如 SV40起點、早期及晚期啟動子、增強子、剪接及聚腺苦酸 化位點。病毒早期及晚期啟動子尤其適用，此係因為兩者 易於以片段形式自病毒基因組獲得，其亦可含有病毒複製 起點。用於哺乳動物宿主細胞之例示性表現載體可購得。 用以產生本發明抗體之宿主細胞可在多種培養基中培 養。諸如Ham’s FlO(Sigma)、最低必需培養基（MEM， Sigma)、RPMM64〇(Sigma)及達爾伯克改良伊袼爾培養基 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)，Sigma)之 129377.doc -55- 200846367
市cr ia養基適於培養宿主細胞。此外，Ham等人，从e A 58·44 (1979)，Barnes等人，ha/ 5z.oc/zem 102:255 (198〇)及美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第 4,560,655 號、第 5，122,469 號、第 5,712，i63 號或第 6,048,728號中所述之任何培養基均可用作宿主細胞之培養 基。此等培養基中之任一者均可在必要時補充激素及/或 其他生長因子（諸如，胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因 子）、鹽（諸如，X-氣化物，其中χ為鈉、鈣、鎂及磷酸 鹽）、緩衝劑（諸如，HEPES)、核苦酸（諸如，腺苦及胸 苷）、抗生素（諸如，GENTAMYCINtM藥物）、微量元素（定 義為通常以在微莫耳範圍内之最終濃度存在的無機化合 物）及葡萄糖或等效能量來源。亦可包括熟習此項技術者 已知之合適濃度的任何其他必需補充劑。培養條件（諸 如 Λ度、PH值及其類似條件）為先前所選宿主細胞之表 現所用之條件，且對一般技術者而言顯而易見。 5 · 6編碼抗艘之聚核苷酸 本發明進一步提供包含編碼本發明抗體及其片段之核苷 酸序列的聚核苷酸或核酸（例如，DNA)。例示性聚核苷酸 包括編碼包含本文所述之一或多個胺基酸序列之抗體鏈的 彼等聚核苷酸。本發明亦涵蓋在嚴格或較低嚴格性雜交條 件下與編碼本發明抗體之聚核苷酸雜交的聚核苦酸。 可獲得聚核苷酸，且藉由此項技術中已知之任何方法測 定聚核苷酸之核苷酸序列。舉例而言，若已知抗體之核苷 酸序列，則編碼抗體之聚核苷酸可自化學合成之寡核苷酸 129377.doc -56- 200846367 組 裝（例如，如KUtmeier等人，扪心以吻㈣ΐ7· um)中所述)，簡言之’此過程包含合成含有編碼抗體之 序列部分的重疊募核㈣，㈣且連接彼等募核普酸，且 接著藉由PCR擴增經連接之募核苦酸。 或者，編碼抗體之聚核苦酸可自來自合適來源之核酸產 生。若含有編碼特定抗體之核酸之純系不可得，但已知抗 體分子序列，則可藉由PCR擴增使用可與序列3，及5，末端
雜交之合成引子或藉由選殖使用對特定基因序列具特異性 之募核苷酸探針以（例如）自eDNA庫鑑別編碼抗體之cDna 純系，在化學上合成或自合適來源（例如，抗體cDna庫， 或自表現抗體之任何組織或細胞產生之cDNA庫，或核 酸，較佳自表現抗體之任何組織或細胞分離之p〇ly A+ RNA，諸如經選擇以表現本發明抗體之融合瘤細胞）獲得 編碼免疫球蛋白之核酸。接著，可使用此項技術中熟知之 任何方法將藉由PCR產生之擴增核酸選殖至可複製選殖載 體中。
一旦確定抗體之核苷酸序列及相應胺基酸序列，即可使 用此項技術中熟知之用於操作核苷酸序列之方法（例如， 重組DNA技術、定點突變、PCR等，參見例如均以全文引 用的方式併入本文之Sambrook等人，Molecular Cloning，A
Laboratory Manual ’ 弟 2版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory (1990) ’ Ausubel等人編 ’ Current Protocols in Molecular
Biology，John Wiley & Sons(1998)中所述之技術）操縱抗體 之核皆酸序列以產生具有不同胺基酸序列之抗體，例如產 129377.doc -57- 200846367 生胺基酸替代、缺失及/或***。 在一特定實施例[可藉由熟知之方法檢查重鍵及/或 輕鏈可變域之胺基酸序列以鐘別CDR序列，例如與其他重 鏈及輕鏈可變區之已知胺基酸序列進行比較以確定具有序 列高變性之區域。如上所述，使用常規重組dna技術，可 將一或多個CDR***構架區内，例如***人類構架區中， 以將非人類抗體人類化。構架區可為天然存在或一致構架 區，且較佳為人類構架區（關於人類構架區之清單，參見 例如 Chothia等人，5/0/ 278·· 457 (1998))。較佳地； 藉由構架區與CDR組合產生之聚核苷酸編碼與本發明多狀 特異性結合之抗體。較佳地，如上文所討論，可在構架區 内進行一或多個胺基酸替代，且該等胺基酸替代較佳改良 抗體與其抗原之結合。此外，該等方法可用以進行參與鍵 内雙硫鍵之一或多個可變區半胱胺酸殘基的胺基酸替代或 缺失，以產生缺乏一或多個鏈内雙硫鍵之抗體分子。對聚 核苷酸之其他改變涵蓋於本發明内且在此項技術之技能 内。 此外，可使用為藉由將來自具有合適抗原特異性之小鼠 抗體分子之基因與來自具有合適生物活性之人類抗體分+ 之基因剪接於一起來產生”嵌合抗體’’而發展之技術 (Morrison 等人，iVac TVa" dead Scz’ 81:851 (1984); Neuberger 等人，TVaiwre 312:604 (1984) ; 丁akeda等人， 314:452 (1985))。如上所述，嵌合抗體為其中不同 部分來源於不同動物物種之分子，諸如具有來源於氣科 129377.doc -58· 200846367 mAb之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的彼等抗體，例如 人類化抗體。 或者，為產生單鏈抗體而描述之技術（美國專利第 4,946,778號；Bird，Sc — ce 242:423 (1988) ; Huston等人， 戶⑽ dcW 6W ί/α 85:5879 (1988);及 Ward 等人， 334:544 (1989))可經調適以產生單鏈抗體。經由胺 基酸橋連接Fv區之重鏈與輕鏈片段，從而產生單鏈多肽， 藉此形成單鏈抗體。亦可使用用於組裝大腸桿菌中之功能 1 v η τ又之技術（Skerra等人，242:1038 (1988))。 5.7產生抗〇χ4〇抗體之方法 藉由此項技術中已知之用於合成抗體之任何方法，尤其 藉由化學合成或較佳藉由重組表現技術，可產生本發明之 抗體。 本發明抗體或其片段、衍生物或類似物（例如，本發明 抗體之重鏈或輕鏈或本發明之單鏈抗體）的重組表現需要 馨 建構含有編碼抗體或抗體片段之聚核苷酸的表現載體。一 旦獲得編碼抗體分子之聚核苷酸，即可藉由重組DNA技術 產生用於產生抗體之載體。建構含有抗體編碼序列及合適 轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括（例如）活 體外重組DN A技術、合成技術及活體内遺傳重組。 藉由習知技術將表現載體轉移至宿主細胞中且接著藉由 習知技術培養經轉染之細胞以產生本發明之抗體。在本發 明之一態樣中’編碼重鏈及輕鏈之載體可在宿主細胞中共 同表現以表現整個免疫球蛋白分子，如下詳述。 129377.doc -59- 200846367 多種宿主-表現載體系統可用以表現如上所述之本發明 之抗體分子。雖然戎等侣主-表現系統代表可藉以產生所 關庄之編碼序列且隨後對其進行純化之載具（VAicle)，但 亦代表在經合適核苷酸編碼序列轉型或轉染時可原位表現 本發明之抗體分子的細胞。諸如大腸桿菌之細菌細胞及真 核細胞通常用於表現重組抗體分子，尤其用於表現完整重 組抗體分子。舉例而[諸如CH〇之哺乳動物細胞與諸如 來自人類細胞巨大病毒之主要即刻早期基因啟動子元件之 - 載體的結合為抗體之有效表現系統（Foeeking等人， 45:101 (1986) ; Cockett等人，⑼ 8:2 则》。 此外，可選擇調節插人序列之表現或以所需特定方式修 飾且加工基因產物之宿主細胞株。蛋白產物之該等修飾 (例如，糖基化）及加工（例如，***）對蛋白功能而言可為 重要的。*目宿主細胞具有用於轉譯後加工及修飾蛋白及 基因產物之特徵及特定機制。可選擇合適細胞株或宿主系 φ 、统以確保正確修錦且加工所表現之外源蛋白。為此，可使 用具有用於正確加工初級轉錄物、糖基化及磷酸化基因產 物之、、’田胞機制的真核宿主細胞。該等哺乳動物宿主細胞包 括（但不限於）CHO、⑽、293、3Τ3或骨髓瘤細胞。 、對於長期、南產率產生重組蛋白而言，穩定表現為較佳 ' ° 了工程化穩定表現抗體分子之細胞株。勝 於使用含有病毒複製起點之表現載體，宿主細胞可經藉由 二適表現控制元件（例如，啟動子、增強子、序列、轉錄 子 t腺苦酸化位點等）控制之DNA及可選標記物轉 129377.doc -60· 200846367 型。在引入外源DNA之後，可使工程化細胞在富集培養基 中生長一至兩天，且接著將其轉換至選擇性培養基中。重 組質體中之可選標記物給與選擇抗性且允許細胞將質體穩 定整合至其染色體中且生長以形成變異區，隨後可選殖變 異區且將其擴大為細胞株。此方法可有利地用以工程化表 現抗體分子之細胞株。該等工程化細胞株可尤其適用於篩 檢及評估與抗體分子直接或間接相互作用之化合物。
可使用大量選擇系統，其包括（但不限於）單純疱疹病毒 • 胸苷激酶（Wigler等人，Ce// 11:223 (1977))、次黃嘌呤-鳥 σ票吟石粦酸核糖轉移酶（Szybalska等人，尸roc dead 5W C/M 48:202 (1992))及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（Lowy等人， Ce// 22:817 (1980))，其基因可分別用於tk、hgprt或aprt細 胞。抗代謝物抗性亦可用作以下基因之選擇基礎：dhfr， 其給與甲胺嗓σ令（methotrexate)抗性（Wigler等人，尸roc Natl Acad Sci USA ΊΊ35Ί ·，專 k，Proc Natl
Acad Sci USA 78:1 527 (198 1)) ; gpt，其給與黴酚酸 (mycophenolic acid)抗性（Mulligan 等人，Proc JVa" dead Sci 78:2072 (1981)) ; neo，其給與胺基糖苷 G-418抗
性（Wu等人，出3:87 (1991));及 hygro，其給與潮 黴素（hygromycin)抗性（Santerre 等人，Gene 3 0:147 (1984))。重組DNA技術中通常已知之方法可通常應用於選 擇所需重組純系，且該等方法描述於（例如）Ausubel等人 編，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993) ； Kriegler，Gene Transfer and Expression，A 129377.doc -61 - 200846367
Laboratory Manual，Stockton Press (1990);及第 12 及 13 章，Dracopoli 等人編，Current Protocols in Human
Genetics，John Wiley & Sons (1994) ; Colberre-Garapin等 人，/ MW仏oi 150·· 1(1981)中，其均以全文引用的方式併 入本文。 抗體分子之表現程度可藉由載體擴增來增加（關於評述， 參見 Bebbington等人，"The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells，" DNA Cloning，第 3卷，Academic Press (1987))。當表現抗體之載體系統中的標記物可擴增時，宿 主細胞培養物中所存在之抑制劑含量增加將增加標記基因 副本的數目。因為擴增區與抗體基因有關，所以抗體之產 生亦增加（Crouse等人，Mo/ Ce// 5沁/ 3:257 (1983))。 宿主細胞可經本發明之兩個表現載體共同轉染，第一載 體編碼來源於重鏈之多肽且第二載體編碼來源於輕鏈之多 肽。兩個載體可含有使重鏈及輕鏈多肽能夠同等表現之相 同可選標記物。或者，可使用編碼且能夠表現重鏈及輕鏈 多肽之單個載體。在該等情況下，輕鏈應置放於重鏈之前 以避免無毒性之重鏈過量（pr〇udf〇〇t，322:52 (1986) ； Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)) 〇 重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。 一旦本發明之抗體分子藉由動物產生、化學合成或重組 表現，即可藉由此項技術中已知之用於純化免疫球蛋白分 子之任何方法將其純化，例如藉由層析法（例如，離子交 129377.doc •62- 200846367 換層析、親和層析，尤其藉由針對蛋白A後特定抗原之親 和層析，及尺寸排阻層析法）、離心、差異溶解度或藉由 用於純化蛋白之任何其他標準技術。此外，本發明之抗體 或其片段可與本文所述或此項技術中另外已知之異源多狀 序列融合以促進純化。 本發明涵蓋與多肽重組融合或化學接合（包括共價及非 共價接合)之抗體。為便於純化，可使用本發明之融合或 接合抗體。例如，參見以全文引用的方式併入之PCT公開 彔化3“ Ep 439 〇95 ;如請則等人，7卿讓,7 心"39:91 (1994);美國專利第5,474,981號；㈤等人， 户⑽ iw aw 89:1428 (1992) ; Feii 等人 j /卿㈣〇/ 146:2446 (1991) ° 此外，本發明之抗體或其片段可與諸如肽之標記物序列 融合以促進純化。在較佳實施例中，標記物胺基酸序列為 六聚組胺酸肽，諸如pQE載體中所提供之標籤（qiagen，
Inc·，9259 Eton Avemie，ChatsWorth，Calif·，91311)，其中 多種可購得。如Gentz等人，々Μ 86.821 (1989)中所述’舉例而言，六聚組胺酸提供融合蛋 白之便利純化。可用於純化之其他肽標籤包括（但不限於） 對應於來源於流感血球凝集素蛋白之抗原決定基之” h A，，標 籤（Wilson等人，Ce// 37:767 (1984))及”flag，，標籤。 5 · 8抗想純化 當使用重組技術時，抗體可在周質間隙中於細胞内產生 或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞内產生，則作為第 】29377.doc -63- 200846367 一步驟，可例如藉由離心或超濾來移除宿主細胞或溶胞片 丰又之微粒碎片。Carter等人，价o/rec/mo/o幻；10:163 (1992) 描述用於將分泌至大腸桿菌之周質間隙之抗體分離的程 序。簡言之，在乙酸鈉（pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟 (PMSF)之存在下經約3〇分鐘使細胞漿狀物溶解。細胞碎片 可藉由離心移除。在抗體分泌至培養基中之情況下，一般 首先使用市售蛋白濃縮過濾器（例如，Amicon或Millipore Pelhcon超濾單元）來濃縮來自該等表現系統之上清液。在 _ 1士何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制 蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。 由細胞製備之抗體組合物可使用（例如）羥磷灰石層析 法、凝膠電泳法、透析及親和層析來純化，其中親和層析 為較佳純化技術。蛋白A作為親和配位體之適宜性視存在 於抗體中之任何免疫球蛋白F c域的種類及同型而定。蛋白 A可用於純化基於人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈之抗體 • (Llndmark等人，J 价仏 62:1 (1983))。對所有小 既同型及人類IgG3推薦蛋白G(Guss等人，五5:1567 (19 8 6))。親和配位體所連接之基質最通常為瓊脂糖，但可 用其他基質。與可用瓊脂糖達成之流動速率及加工時間相 比，機械穩定性基質（諸如，受控微孔玻璃或聚（苯乙烯二 乙稀基）苯）允許更快之流動速率及更短之加工時間。在抗 體包含CH3域之情況下，Bakerbcmd ABXTM樹脂（J· τ· Baker; Phillipsburg，N.J·)適用於純化。視待回收之抗體而 定’亦可利用其他用於蛋白純化之技術，諸如離子交換管 129377.doc -64 - 200846367 柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層 析、陰離子或陽離子交換樹脂（諸如，聚天冬胺酸管柱）上 進行之肝素SEPHAROSEtm層析的層析法、層析聚焦、 SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。在任何初步純化步驟後，可使 包含所關注抗體及污染物之混合物經受使用？11值在約2·5_ 4.5之間的溶離緩衝劑較佳在低鹽濃度（例如，約to.μ 鹽）下進行之低pH值疏水性相互作用層析法。 5.9醫藥調配物 _ 藉由將具有所需純度之多肽與此項技術中通常採甩之 可選"醫藥學上可接受”之載劑、賦形劑或穩定劑（均稱為 ”賦形劑”，亦即緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等張劑 (iS〇t〇nifier)、非離子型清潔劑、抗氧化劑及其他混雜添加 劑）混合而以凍乾調配物或水溶液之形式來製備多狀或抗 體之治療調配物以供儲存。參見Remingt〇n，s pharmaeeutkai nces弟1 6版，Osol編（1980)。該等添加劑在所用劑量 _ 及濃度下對接受者必須無毒。 緩衝劑有助於保持pH值在接近生理條件之範圍内。其較 佳以約2 mM至約5〇 mM範圍内之濃度存在。供本發明使用 之合適緩衝劑包括有機酸及無機酸及其鹽，諸如擰檬酸鹽 緩衝劑（例如，檸檬酸一鈉-擰檬酸二鈉混合物、擰檬酸-檸 檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等）、丁二酸 鹽緩衝劑（例如，丁二酸-丁二酸一鈉混合物、丁二酸-氫氧 化鈉混合物、丁二酸-丁二酸二鈉混合物等）、酒石酸鹽緩 衝A](例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸_酒石酸奸混 129377.doc -65- 200846367 合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等）、反丁烯二酸鹽緩衝劑 (例如，反丁烯二酸-反丁烯二酸一鈉混合物等）、反丁烯二 酸鹽緩衝劑（例如，反丁烯二酸-反丁烯二酸一鈉混合物、 反丁烯一酸-反丁烯二酸二鈉混合物、反丁晞二酸一鈉-反 丁烯二酸二鈉混合物等）、葡糖酸鹽緩衝劑（例如，葡糖酸_ 葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖 酸鉀混合物等）、乙二酸鹽缓衝劑(例如，乙二酸-乙二酸鈉
混=物、乙二酸-氫氧化鈉混合物、乙二酸_乙二酸鉀混合 物等）、乳酸鹽緩衝劑（例如，乳酸_乳酸鈉混合物、乳酸_ 氫氧化鈉混合物、乳酸_乳酸針混合物等）及乙酸鹽緩衝劑 (例如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等）。 此外，可提及碟酸鹽緩衝齊j、組胺酸緩衝劑及2 M b 諸如Tris。 κ、一 g M vmy0(w/v)範 圍台内之量添加。供本發明使用之合適防腐劑包括苯齡、节 醇、間曱盼、對羥基苯曱酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯 化十八基二甲基节基銨、鹵化苯甲烴銨(benz—· hallde)(例如，氯化物、溴化物及碘化物）、氯化六經季銨 0-_h〇nium chl〇ride)及對經基笨甲酸烧基醋（諸如， 對經基Μ酸甲a旨或對减苯甲酸㈣）、兒茶紛、間苯 一齡、環己醇及3-戊醇。可添加等張劑（有時稱為”穩定 ^以確保本發明之液體組合物之等張性，且其包括多声 :糖=佳三經基或更高經基糖醇，諸如甘油、赤藻糖 拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。 129377.doc -66- 200846367 穩定劑係指一大類賦形劑，其在功能上可在膨化劑至溶 解治療劑或有助於預防變性或與容器壁黏著之添加劑的範 圍内。典型穩定劑可為多羥基糖醇（以上列舉）；胺基酸， 諸如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、 組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L_白胺酸、2_苯基丙胺酸、麩 胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水 蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半 乳糖醇、甘油及其類似物，包括諸如肌醇之環多元醇；聚 _ 乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，諸如脲、麵胱甘 肽、硫辛酸（thioctic acid)、硫代乙醇酸鈉、硫代甘油、心 單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量多肽（亦即個殘 基）；蛋白，諸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或 免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮單醣， 諸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣，諸如乳糖、麥 芽糖、蔗糖；及三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如葡聚 Φ 糖。穩定劑可在每重量份之活性蛋白0·1至10,000重量之範 圍内存在。 可添加非離子界面活性劑或清潔劑（亦稱為"濕潤劑以 有助於溶解治療劑以及保護治療蛋白免於攪動誘發之聚 集，其亦允許調配物暴露於表面所壓之剪應力而不會引起 蛋白變性。合適之非離子界面活性劑包括聚山梨醇酯 (20、80等）、泊洛沙姆（poly〇xamer)(184、188等）、複合多 元醇（Pluronic polyol)、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單醚 (TWEEN®-20、TWEEN®-80等）。非離子界面活性劑可在 129377.doc -67- 200846367 約0.05 mg/ml至约】A 7 t · mg m ’ 較佳約 0.07 mg/ml至約 ο 2 mg/ml之範圍内存在。 其他混雜賦形劑包 ,,ρητΛ. 7化Μ (例如，澱粉）、螯合劑（例 如，DTA)、抗氧化劑 (如抗晨血酸、甲硫胺酸、維生 素Ε)及/、溶劑。如所治療之 % t 八# 一 、寺適應症所需，本文之調配 IS 種以上活性化合物，較佳具有不會不利地彼 此於曰之互補活性的活性化合物。舉例而言，可能需要進 一步提供免疫抑制劑。續耸公
剑°亥寻刀子以有效達成所欲目的之量 適當地組合存在。亦可將活性成儉包埋於（例如）藉由聚結 (c〇asc_lon)技術或藉由界面聚合而製備之微膠囊（例 如’分別㈣甲基纖維素或明膠_微#囊及聚（甲基丙稀酸 "旨)微膠囊)中，包埋於膠狀藥物傳遞系統(例如，脂質 體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊）中或 包埋於***液中。該等技術揭示於Remingt〇n，s
Pharmaceutical Sciences，第 16版，0sal編（198〇)中。 用於活體内投藥之調配物必須無菌。此易於（例如）藉由 經由無菌過濾膜過濾來實現。可製備持續釋放製劑。持續 釋放製劑之合適實例包括含抗體之固體疏水性聚合物之半 透性基質’該等基質呈成形物件之形式，例如薄膜或微膠 囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚（2_ 羥乙基-曱基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸交酯（美國專 利弟3,773,919號）、L -麵胺酸與乙基-麵胺酸g旨之丘聚 物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸·乙醇酸 共聚物（諸如，LUPRON DEPOTtm)(由乳酸-乙醇酸共聚物 129377.doc -68- 200846367 與乙酸亮丙瑞林（leupr〇lide acetate)構成之可注射微球體） 及聚經基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳 酉文β乙醇酸之聚合物使分子能夠經100天釋放，但某些水凝 膠歷日令較短時間釋放蛋白。當經囊封之抗體長時間保留在 體内日守’由於暴露於37〇c下之水分，故其可能變性或聚 集’從而導致生物活性之損失及免疫原性可能之改變。 視所涉及之機制而定，可設計合理策略以穩定化。舉例 傷 而"’若發現聚集機制為經由硫基-二硫化物互換之分子 |曰J S-S现形成5則可藉由改質巯基殘基、自酸性溶液凍 乾、控制水分含量、使用合適添加劑且研製特定聚合物基 貝組合物來達成穩定化。有效治療特定病症或病狀之治療 多肽、抗體或其片段之量將視病症或病狀之性質而定，且 可精由標準臨床技術來測定。在可能情況下，需要測定劑 量反應曲線且在人類中測試之前，首先在活體外且接著在 適用之動物模型系統中測定本發明之醫藥組合物。 •、在—較佳實施例中，藉由皮下㈣投與治療多肽、抗體 或其片段之水溶液。各劑量可在每公斤體重約〇·5叩至約 50 之範圍内，或更佳在每公斤體重約3盹至約3〇吨之 土：投藥之給藥時程可自一月一次至每天一次變化，視 大里^床因素而疋’包括疾病類型、疾病嚴重程度及受檢 者對治療劑之敏感性。 沉υχ4〇抗體之診斷用途 本發明之抗體包括經改質衍生 貝1 丁生物’亦即使任何類型之 I29377.doc -69- 200846367 分子與抗體共價連接，使得共價連接不會干擾與0X40之 結合。舉例而言，並非為了限制，抗體衍生物包括（例如） 經生物素化、HRP或任何其他可偵測部分改質之抗體。
本發明之抗體可用以（例如（但不限於））純化或偵測 0X40，包括活體外及活體内診斷方法。舉例而言，抗體 在用於定性及定量量測生物樣品中〇Χ4〇含量之免疫檢定 中得到應用。例如，參見Harlow等人，Antib〇dies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ^ 第2版（198 8) ’其以全文引用的方式併入本文。 如下文更詳細討論，本發明之抗體可單獨或與其他組合 物組合使用。抗體可進一步在N末端或(：末端與異源多肽 重組融合，或與多肽或其他組合物化學接合（包括共價及 非共價接合）。舉例而言，本發明之抗體可與在偵測檢定 中用作標記之分子重組融合或接合。 +赞明進一步涵盍與診斷劑接合之抗體或其片段。抗體 可用於診斷上以(例如)偵測所關注標靶在特定細胞 或血清中之表現；或作為臨床測試程序之部分監測免疫反 應之發展或進展以（例如）測定所給治療方案之功效。 由使抗體與可制物質偶合來促進偵測。可㈣ 二 例包括各種酶、輔基、榮光材料、發光材料、生物發光二 料、放射性材料、使用各種正電子發射 * 子發射金屬及非放射性順磁性金屬粒子。；二物：正電 抗體（或其片段）直接偶合或接合，或使 之技術經由中㈣（諸如，此項技術中已知之連接了子）= 129377.doc •70· 200846367 偶合或接合。酿許 姆^ C之實例包括螢光素酶（例如，螢光蟲 螢光素酶及細gj罄止 , ^ 螢光素酶；美國專利第4,737,456號）、螢 、2 3 - 知 ’ ， 氣酞嗪二_、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化 物酶(’如’辣根過氧化物酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β_半 m酶n殿粉酶、溶菌酶、聽類氧化酶（例如，葡 ，糖乳化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖冬磷酸脫氫酶）、雜 環氧化酶（諸如，尿酸酶及黃嗓呤氧化酶）、乳過氧化物 酶、微過氧化物酶及其類似物。 π々、k啤穴抗體接合之技術描述於0，Sullivan等人， Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," Methods in Enzymology, Langone等人編，第147-66頁，press (1981)中。 關於根據本發明可與抗體接合用作診斷劑之金屬離子參見 例如美國專利第4,741，9⑽號。合適酶之實例包括辣根過氧 化物酶、鹼性磷酸酶、β_半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶，·合 適輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生 蛋白/生物素，合適螢光材料之實例包括繳酮 (imibelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明 (rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、二甲胺基磺萘醯氯或 藻紅素；發光材料之實例包括魯米諾（lumin〇l);生物發光 材料之實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白 (aequorin);且合適放射性材料之實例包括I25〗、、mIn 或 99Tc 有時，標記與抗體間接接合。熟習技工知道用於實現此 129377.doc •71 - 200846367 目的之各種技術。舉例而言，抗體可與生物素接合且以上 所提及之三大類標記中之任-者均可與抗生蛋白二合，或 反之亦然。生物素選擇性地與抗生蛋白結合且因此Y以此 間接方式可使標記與抗體接合。或者，為實現標記與抗體 之間接接合，使抗體與小半抗原(例如，地高辛(dig〇xin” 接合且使以上提及之不同類型標記之一者與抗半抗原抗體 (例如，抗i也高辛抗體）接合。因此，可實現標記與抗體之 間接接合。
在本發明之另一實施例中，抗體不必經標記且其存在可 使用與該抗體結合之標記抗體來偵測。 本發明之抗體可用於任何已知之檢定方法中，諸如競爭 性結合檢定、直接及間接夾心式檢定及免疫沈澱檢定。參 見 Zola，Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques， 第 147-158 頁，CRC Press (1987)。 只兄爭性結合檢定依賴於標記標準物與測試樣品競爭與極 少量之抗體結合的能力。測試樣品中標靶之量與結合抗體 之標準物之量成反比。為便於測定結合之標準物之量，抗 體般在贶子之兩或之後不 >谷解。因此，可便利地將鱼抗 體結合之標準物及測試樣品自仍未結合之標準物及測試樣 品分離。 夾心式檢定包含使用兩種抗體，各抗體能夠與不同免疫 原性部分或抗原決定基或待彳貞測之蛋白結合。在夾心式檢 定中’待分析之測試樣品藉由固定於固體支撑物上之第一 抗體結合’且此後笫一抗體與測試樣品結合，因此形成不 129377.doc -72- 200846367 溶性三部分複合物。參見例如美國專利第4,376，110號。第 一抗體自身可經可彳貞測部分標記（直接失心式檢定），或可 使用經可偵測部分標記之抗免疫球蛋白抗體來量測（間接 夾心式檢定）。舉例而言，一種類型夾心式檢定為Elis A檢 定’在此狀況下可偵測部分為酶。 抗體可與尤其適用於免疫檢定或純化標靶抗原之固體支 撐物連接。該等固體支撐物包括（但不限於）玻璃、纖維 素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氣乙烯或聚丙烯。 _ 牡此過程中5使周此項技術中熟知之方法將抗體固定於諸 如SEPHADEX™樹脂或濾紙之固體支撐物上。使經固定之 抗體與含有待純化之標靶之樣品接觸，且此後用合適之溶 劑洗滌該支撐物，該溶劑移除樣品中除待純化之與固定抗 體結合之標靶外的實質上全部材料。最後，用另一合適溶 劑（諸如，甘胺酸緩衝劑）洗滌支撐物，使標靶自抗體釋 放。 # 與〇X40特異性結合之標記抗體及其衍生物及類似物可 用於達成診斷之目的以偵測、診斷或監測與〇χ4〇異常表 現及/或活性有關的疾病、病症及/或病狀。本發明提供對 0X40異常表現之偵測’其包含：（幻使用對〇χ钧具特異性 之或夕種本發明之抗體檢定個體細胞或體液中〇χ4〇之 表現；及(b)將基因表現含量與標準基因表現含量相比，其 中與標準表現含量相比經檢定之〇χ4〇表現含量增加或減 少表明異常表現。 抗體可用於们則樣品（例如，體液或組織樣品）中〇测之 129377.doc -73- 200846367 存在及/或含量。偵測方法可包含使樣品與〇X4〇抗體接觸 且測定與樣品結合之抗體之量。對於免疫組織化學，樣品 可為新鮮或冷束之樣品，或（例如）可包埋於石纖中且用諸 如福馬林（formalin)之防腐劑固定。 本發明提供用於診斷病症之診斷檢定，其包含：（a)使用 或夕種本發明之抗體檢定個體細胞或體液中Οχ# 〇之表 現；及（b)將基因表現含量與標準基因表現含量相比，其中 與標準表現含量相比經檢定之基因表現含量增加或減少表 明特定病症。 使用熟習此項技術者已知之傳統免疫組織學方法，本發 明之抗體可用於檢定生物樣品中之蛋白含量（例如參^ Jaikanen等人，y Ce"价 〇/ 1〇1:976 (1985);以仏⑽如等 人，JCW/历0/ 105:3087 (1987))。可用於偵測蛋白基因表 現之其他基於抗體之方法包括免疫檢定，諸如酶聯免疫吸 附劑檢定（EUSA)及放射性免疫檢定（RIA)。合適之抗體檢
定標記在此項技術中已知且包括酶標記，諸如葡萄糖氧： 酶，放射性同位素，諸如埃（131j、125j、⑴ , 丄”石反（C)、硫 (S)、氣（H)、銦（mIn、⑴In)及鍀（99Tc);發光標記，諸 如魯米諾；及螢光標記，諸如發光素、若丹明及生物素。 可使用免疫閃爍法定位放射性同位素結合之同位素 μ 广务明之一態樣為賴測及診斷與動物、較佳哺乳動物且 取佳人類中0X40異常表現有關的疾病或病症。在一 例中，診斷包含·· a)向受檢者投與（例如，非經腸 = 腹膜内）有效量之與〇X4〇特異性結合 ^ δ己分子；b)在投 129377.doc -74- 200846367 樂之後等待允許標記分子優先集中於受檢者中多肽表現之 位點處（及允許未結合之標記分子清除至背景含量）的一段 時間間隔；G)測定f景含量；及叫貞測受檢者中之標記分 子，使得偵測到超過背景含量之標記分子表明受檢者患有 與0X40異常表現有關之特定疾病或病症。背景含量可藉 由各種方法來測定，包括將所偵測之標記分子之量與先前 針對特定系統測定之標準值比較。 此項技術中應瞭解’受檢者體形及所用成像系統將決定 產生診斷學影像所需之成像部分之量。在放射性同位素部 分之狀況下，對於人類受檢者而言，所注射之放射性的量 通常在約5至20毫居里（millicuries：rTc之範圍内。接著， 標記抗體或抗體段將優先積聚在含有特定蛋白之細胞位 置處。活體内成像描述於Burehid等人，"“咖咖職。恤心 of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments."第 13 章，
Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer,
Burchiel 等人編，]VlassonPublishing(1982)中。 視包括所用標記類型及投藥模式之若干變數而定，投藥 後允許標記分子優先集中於受檢者中位點處及未結合之標 記分子清除至背景含量的時間間隔為6至48小時、6至24小 時或6至12小時。在另一實施例中，投藥後之時間間隔為5 至20天或5至10天。 在一實施例中，藉由（例如）在初診後一個月、初診後六 個月、初診後一年等重複用於診斷疾病或病症之方法來進 行疾病或病症之監測。 129377.doc •75- 200846367 可使用此項技術已知之用於活體内掃描之方法在患者中 债測標記分子之存在。此等方法視所用標記類型而定。熟 習技工能夠確定用於偵測特定標記之合適方法。可用於本 發明之診斷方法之方法及裝置包括（但不限於）電腦斷層攝 影法（ct)、諸如正電子發射斷層攝影法（ρΕτ)之全身掃 描、磁共振成像（MRI)及超音波掃描。 在一特定實施例中，分子係經放射性同位素標記且使用 放射反應性外科手術儀器在患者中偵測（美國專利第 5,441，050號）。在另一實施例中，分子係經螢光化合物標 記且使用螢光反應性掃描儀器在患者中偵測。在另一實施 例中，分子係經正電子發射金屬標記且使用正電子發射斷 層攝影法在患者中偵測。在另一實施例中，分子係經順磁 性標記來標記且使用磁共振成像（MRI)在患者中偵測。 在另一態樣中，本發明提供一種用於診斷患者發展由未 调節之細胞激素表現引起之疾病的傾向之方法。某些患者 細胞、組織或體液中增加之0X40量可表明患者易患某些 疾病。在一實施例中，該方法包含收集已知具有低含量或 正常含量之0X40之受檢者的細胞、組織或體液樣品，針 對組織中0X40之存在分析組織或體液，且基於組織或體 液中0X40之表現含量來預測患者對某些疾病之傾向。在 另一實施例中，該方法包含自患者收集已知含有確定含量 之0X40之細胞、組織或體液樣品，分析組織或體液之 0X40量，且基於與針對正常細胞、組織或體液所建立之 確定或測試含量相比0X40量之變化，預測患者對某些疾 129377.doc -76 - 200846367 ==。〇加之#含量可為基於文獻值之已知量， =由量測正常細胞'組織或體液中之量預先測定。特 及早：某些組織或體液中之0X40含量允許特定且 發明之：二:病發生之前谓測患者中之疾病。可使用本 在較佳Γ疾病包括(但不限於)本文所述之疾病。 例中，組織或體液為外周血、外周血白血球、 '體組織，諸如肺或皮膚生物檢體及組織。
:發明之抗體可提供於套組中，亦即預定量之雜用 =;診斷學檢定之說明的封裝組合。在抗體經酶標記之 =下，#組可包括酶所需之受質及辅因子(例如，提供 可摘測發色團或螢光團之受質前驅體)。料，可包括其 他添加劑’諸如穩定劑、緩衝劑（例如，阻斷緩_或溶 解緩衝，及其類似物。各種試劑之相對量可廣泛變化以 &供實質上使檢定靈敏度最佳之試劑溶液中之濃度。試劑 ^其可以乾燥粉末形式提供，通常束乾粉末，包括一旦: 溶解即提供具有合適濃度之試劑溶液的賦形劑。^ 5.11抗0X40抗趙之治療用途 預期本發明之抗體可用以治療哺乳動物。在一實施例 中’向非人類哺乳動物投與抗體以達成(例如)獲得臨床前 資料之㈣。待治療之例示性非人類哺乳動物包括非人類 靈長類動物…貓、齧齒動物及其中執行臨床前研究之 其他哺乳動物。該等哺乳動物可為針對待用抗體治療之疾 病所建立之動物模型或可用以研究所關注抗體之毒性。在 此等實施例之每一者中，可對哺乳動物執行劑量擴大研 129377. doc -77- 200846367 究。 無淪與治療劑部分接合與否，單獨或與細胞毒素因子組 合投與的抗體均可用作治療劑。本發明係針對基於抗體之 療法’其包含向動物、哺乳動物或人類投與本發明之抗體 以m療0X40介導之疾病、病症或病狀。動物或受檢者可 為需要特定治療之動物，諸如已診斷出患有特定病症（例 如，關於0X40之病症）的動物。針對〇X4〇之抗體適用於對 抗動物（包括（但不限於）牛、豬、馬、雞、貓、犬、非人類 瓜長類動物專）以及人類之過敏症、哮喘、自體免疫及發 炎疾病。舉例而言，藉由投與治療可接受劑量之一或多種 本發明抗體或本發明抗體之混合物或與不同來源之其他抗 體之組合，可減輕或消除所治療之哺乳動物中自體免疫或 發炎疾病症狀。 本發明之治療化合物包括（但不限於）本發明之抗體（包括 如本文所述之其片段、類似物及衍生物）及如下所述之編 碼本發明抗體之核酸（包括如本文所述之其片段、類似物 及衍生物及抗個體基因型抗體）。本發明之抗體可用於治 療、抑制或預防與0X40異常表現及/或活性有關之疾病、 病症或病狀，包括（但不限於）本文所述之疾病、病症或病 狀中之任一或多者。與0X40異常表現及/或活性有關之疾 病、病症或病狀的治療及/或預防包括（但不限於）減輕與彼 等疾病、病症或病狀有關之至少一種症狀。本發明之抗體 可提供於如此項技術中已知或如本文所述之醫藥學上可接 受之組合物中。 1293 77.doc -78- 200846367 本發明之抗0X40抗體可用於治療多種疾病。本發明提 供一種用於預防或治療哺乳動物中〇Χ4〇介導之疾病的方 法。該方法包含向哺乳動物投與預防或治療疾病量之抗 0X40抗體。抗OX40抗體與OX40結合且調節細胞激素及細 胞受體表現，從而產生非疾病病況之細胞激素含量特徵。 0X40信號轉導與多種疾病有關，諸如過敏症、哮喘或與 自體免疫及發炎有關之疾病，其包括多發性硬化症、類風 濕性關節《、發炎性腸病、移植物抗宿主疾病、實驗性自 體免疫性腦脊髓炎(EAE)、實驗性利什曼病、膠原蛋白誘 發性關節炎、結腸炎（諸如潰癌性結腸炎）、接觸性過敏性 反應、糖尿病、克羅恩氏病及格雷氏病。 本發明之抗體亦可用於預防及治療其他疾病，包括肉狀 瘤病:自體免疫性眼部疾病、自體免疫性葡萄膜炎、異位 性皮炎、重症肌益力、白赫Λ … 自體免疫性神經病（諸如古立安_ 瑞)：自體免疫性葡萄膜炎、自體免疫性溶灰性貧血、惡 性貝jk、自體免疫性血 、 、 ^ ^… 】板減少、顳動脈炎、抗磷脂症候 療樣皮炎、尋常天癌瘡、白牙:）貝西氏病、牛皮癬、范 自體免疫性肝炎、_本^㈣、原發性膽汁性肝硬化、 ***、腎上腺之Π =腺炎、自體免觸巢炎及 皮病、皮肌炎、多發性肌又火、^病、、全身性紅斑狼瘡、硬 強直性脊椎炎）、萊 肌火、脊椎關節病（諸如 疾病。 、氏症候群、修格蘭氏症候群及其他 用於宿主受檢者 〜療劑車父佳在該受檢者體内幾乎不引 129377.doc -79- 200846367 起對藥劑之免疫原性反應。在一實施例中，本發明提供該 藥劑。舉例而言，在一實施例中，本發明提供一種人類化 抗體’與包含重鏈及輕鏈可變區之抗體相比，該人類化抗 體在宿主受檢者體内以實質上減少之程度引起及/或期望 引起人類抗小鼠抗體反應（HAMA)。在另一實例中，本發 明提供引起及/或期望引起最低或無人類抗小鼠抗體反應 (HAMA)的人類化抗體。在一實例中，本發明之抗體以臨 床可接受之程度或以小於臨床可接受之程度引起抗小鼠抗 體反應。
有效治療、抑制及預防與OX40異常表現及/或活性有關 之疾病或病症的抗體之量可藉由標準臨床技術來確定。劑 量視待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、抗體係 出於預防或治療之目的而投與、先前療法、患者之臨床病 史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體可以與 疾病相符之治療方案投與’例如經_至數天投與單次或數 次劑量以改善疾病病況’或經延長之時間投與週期劑量以 預防過敏症或哮喘。此外’活體外檢定視情況可用於幫助 鐘別最佳劑量範圍。用於調配物中之精確劑量亦視投藥途 控及疾病或病症之嚴重程度而定，且應根據醫師之判斷及 :患者之情況來決定。有效劑量可自來源於活體外或動物 杈型測試系統之劑量反應曲線而推知。 對於抗體’向患者投與之劑量通常為每公斤患者體重 .1 mg至150 mg。向患者投與之劑量較佳在每公斤患者體 重（MmgW〇mg之間，更佳每公斤患者體重…至⑺ 129377.doc 200846367 mg。一般而言，由於對外源多肽之免疫反應，人類抗體在 人=具有比來自其他物種之抗體長的半衰期。因此，較 =劑夏之人類抗體及較少頻率之投藥通常為可能的。此 外，可藉由修飾(諸如’脂化)來增強抗體之吸收及組織滲 (J如’參入腦中），藉此減少本發明抗體之投藥劑量及 ::、。對於經數天或更長時間之重複投藥而言，視病狀而 疋持績治療直至出現對疾病症狀之所需抑制。然而，苴
:::方案亦可適用。此療法之進程易於藉由習知技術及 ::測。關於抗心1或抗1CAM-1抗體之例示性給荜 乃木揭示於WO 94/04188中。 可為組合物形式之本發明抗體應以符合優良醫學實踐之 : = :、給藥及投與。在此情況下考慮之因素包括所 。、、疋病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨 :病狀、病症起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投羊‘ 二及：業醫師已知之其他因素。待投與之抗體組合= 二療有效量’’將受該等考慮因素影響，且為預防、 斤而之取低！。抗體不必但視情況與一或 =推預防或治療所討論之病症的藥劑一起調配。 ^十/、他樂劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量 症或治療類型及以上 ^ 所“之其他因素而定。此等藥劑— 用又二t所用相同之劑量及投藥途徑來使用或為迄今所 用劑量之約1至99%。 所 本發明之抗體可鱼iπ 血 了…、他早株或嵌合抗體或淋巴介質或造 、 =如1L_2、IL-3、IL_7及IFN-γ)組合而有利地 129377.doc *81 - 200846367 用例如，其用以增加與抗體相互作用之效應細胞之數 目或活性。 本發明之抗體可單獨或與諸如消炎療法、免疫抑制藥 物、免疫療法、化學療法、支氣管擴張藥、抗IgE分子、 抗、、且織胺或抗白二稀之其他類型治療組合投與。 在一較佳態樣中，抗體實質上經純化（例如，實質上不 :限制其作用或產生不良副作用的物質）。已知各種傳遞 系統且其可用於投與本發明之抗體，包括注射，例如封入 知質體、微粒、微膠囊、能夠表現化合物之重組細胞、受 體’丨導之内飲作用（參見例如Wu等人，5ζ·〇/ CTzem 262: 4429 (1987))、作為反轉錄病毒之部分的核酸結構或直他 載體等中。 ~ 可以任何可接受之方式向哺乳動物投與抗0X40抗體。 引入方法包括（但不限於）非經腸、皮下、腹膜内、肺内、 鼻内、硬膜外、吸人及經口途徑，且對於免疫抑制治療必 要時為病灶内投藥。非經腸輸液包括肌肉Θ、皮内、靜脈
内：動脈内或腹膜内投藥。抗體或組合物可藉由任何便利 途徑來投與，例如藉由輸液或快速注射，#由經由上皮或 黏膜皮膚外膜（例如，口腔黏膜、直腸及腸黏膜等）吸收來 投與’且可與其他生物活性劑—起投與。投藥可為全身性 或局Ί外’可能需要藉由任何合適途徑（包括心室内 及勒内注射）將本發明之治療抗體或組合物引入中樞神經 系統中’ w室内注射可藉由例如與貯器（諸如，◦麵叮猶 器）連接之心室内導管而推動。此外，抗體適合藉由脈衝 129377.doc -82 - 200846367 :液來投與，尤其降低劑量之抗體。較佳藉 而定。 ’部分地視短暫或長期投藥 化::：用肺部投藥，例如使用吸入器或喷霧器以及與霧 者 调配。抗體亦可以乾燥粉末組合物形式投與至患 =中（參見例如美國專利第6,5 14,496號）。
入特定實施例中，可能需要將本發明之治療抗體或組 :局4投與至需要治療之區域；此可藉由（例如，而非 :了:艮制)局部輸液、局部塗敷、藉由注射、藉助於導 吕藉助於栓劑或藉助於植入物來達成，該植入物為多 孔無孔或旋膠狀材料，包括膜（諸如矽橡膠⑷心叫膜） 或、戴維較佳地，當投與本發明之抗體時，必須慎重使用 蛋白不吸收之材料。 在另一實施例中，抗體可在微脂粒、尤其脂質體中傳遞 (參見 Langer，Sdewe 249:1527 (1990) ; Treat 等人， posomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,
Lopez-Berestem 等人編，第 353_365 頁（1989) ; L〇Pez-Berestein，如上，第317_27頁；一般參見上文）。 在另一實施例中，抗體可在受控釋放系統中傳遞。在一 實施例中，可使用泵（參見Langer，心249:1527 (1990) , Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987) i
Buchwald等人，以88:507 (1980) ; Saudek等人，iV J Med 321:574 (1989))。在另一實施例中，可使用聚 合材料（參見 Medical Applications of Controlled Release， 129377.doc -83- 200846367
Langer 等人編，CRC Press (1974) ; Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance， Smolen等人編，wiley (1984) ; Ranger等人，j Sc/ Macromo/ C/zem 23:61 (1983);亦參見 Levy等人， 心㈣ce 228:190 (1985) ; During等人，』聰 25:35 1 (1989) , Howard等人，J 71:105 (1989))。在另 一貝％例中，受控釋放系統可與治療標革巴鄰近置放。
本發明亦提供醫藥組合物。該等組合物包含治療有效量 之抗體及生理學上可接受之載劑。在一特定實施例中，術 扣生理+上可接文”意謂經聯邦或州政府之管理機構批准 或列於美國藥典（U.S· Pharmacopeia)或其他用於動物且更 尤其人類之公認藥典中。術語，，載劑”係指與治療劑一起投 與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。該等生理學載劑可為 無菌液體，諸如水及油，包括石;由、動物、植物或合成來 源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似 物。當靜脈内投與醫藥組合物時，水為較佳載劑。生理食 鹽水溶液及右旋糖及甘油水溶液亦可用作液體載劑，尤其 用於可注射溶液。合適之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖： 乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、妙執 ,.v 夕牙稻殺、麵粉、白堊、矽膠、硬 脂酸鈉:單硬脂酸甘油醋、滑石、氯化納、脫脂乳粉、甘 油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，組合物 亦可含有少量濕潤劑或乳化劑或阳值緩衝劑。此等組合物
可採用溶液、懸浮液、、、右 A 士 礼液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑、 持續釋放調配物及其類似物 、以物之形式。組合物可與諸如甘油 129377.doc -84- 200846367 三酸酯之傳統黏合劑及載劑一起調配為栓劑。經口調配物 可包括標準載劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬 脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適載劑之實例描 述於 E. W. Martin之"Remington,s Pharmacemical 中。該等組合物將含有有效量之較佳呈純化形式之抗體以 及合適量之載劑以便提供適當投與至患者之形式。調配物 應適合投藥模式。
在-個實施射，職合物根才康常規程序調配為適於靜 脈内投與人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈内投藥之組 合物為滅菌等張水性緩衝劑中之溶液。需要時，組合物亦 可包括溶解劑及局部麻醉劑諸如利多卡因⑴卿…㈣以減 輕注射位點之疼痛。-般而言，該等成份分別或混合在一 :以單位劑型提供’例如，以乾燥之來乾散劑或無水濃縮 物於諸如安親或藥囊（saehette)之表明活性劑量之密閉容器 :。在組合物欲藉由輸液投與之情況，其可以含有滅菌醫 樂級水或生理食鹽水的輸液瓶配製。在組合物藉由注射投 與之情況，可提供滅菌注射用水或生理食鹽水之安瓿以便 各成份可在投藥之前混合。 殺士發明亦提供一種醫藥包裝或套組，其包含裝有本發明 = 且合物之—或多種成份的-或多個容器。視情況該 可聯結一個通告，以管控醫藥或生物製品製造、 銷售之政府機構指定的形式’該通告反映該機構批 准製&、使用或銷售用於人類投藥。 此外，本發明之抗體可與多種效應分子接合，諸如異源 129377.doc -85- 200846367 多肽、藥物、放射性核苷酸或毒素。參見例如pct公開案 WO 92/08495 ; WO 91/14438 ; WO 89/12624 ;美國專利第
5,314,995號；及丑？ 396,387。抗體或其片段可接合於治療 劑部分，諸如細胞毒素（例如細胞生長抑制劑或殺細胞 劑）、治療劑、或放射活性金屬離子（例如α-發射體，諸如 213Bi)。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害之任何藥 劑。實例包括紫杉醇（paclitaxol)、細胞遲緩素B(cytocha-lasin B)、短桿菌素 D(gramicidin D)、溴乙鍵：（ethidium bromide)、吐根素（emetine)、絲裂黴素（mitomycin)、依託 泊普（etoposide)、特諾波賽（tenoposide)、長春新驗 (vincristine)、長春驗（vinblastine)、秋水仙驗（colchicin)、 阿黴素（doxorubicin)、道諾黴素（daunorubicin)、二經基炭 痤菌素二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽酉昆（mito-xantrone)、米拉黴素（mithramycin)、放線菌素 D(actino-mycin D)、1-脫氫睪固酮（l-dehydrotestosterone)、糖皮質 激素（glucocorticoid)、普魯卡因（procaine)、丁卡因（tetra-caine)、利多卡因、普萘洛爾（propranolol)及嘌吟黴素 (puromycin)及其類似物或同系物。治療劑包括（但不限於） 抗代謝物（例如，甲胺嗓呤、6·疏基嗓呤（6-mercapto-purine)、6-硫代鳥嗓呤（6-thioguanine)、阿糖胞苦（cytara-bine)、5-氟尿 口密 σ定（5-fluorouracil)、達卡巴嗪（decarba-zine))、烧基化劑（例如二氯曱二乙胺（mechlorethamine)、 σ塞替派（thioepa)、苯丁酸氮芬（chlorambucil)、美法侖 (melphalan)、亞硝脲氮芬（earmustine)(BSNU)及洛莫司汀 129377.doc -86- 200846367 (lomustine)(CCNU)、環填醯胺（cyclothosphamide)、白消 安（busulfan)、二溴甘露糖醇（dibromomannitol)、鏈脲菌素 (streptozotocin)、絲裂黴素C及順-二氣二胺鉑（II)(DDP)順 鉑）、蒽環黴素（anthracyclines)(例如道諾黴素（原為柔紅黴 素（daunomycin))及阿黴素）、抗生素（例如，放線菌素D(原 為放線菌素（actinomycin))、博來黴素（bleomycin)、米拉黴 素（mithramycin)及安麯黴素（anthramycin)(AMC))及抗有絲 ***劑（例如長春新驗及長春驗）。 熟知使該治療劑部分與抗體接合之技術，參見例如 Arnon等人，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting
Of Drugs In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Reisfeld等人（編），第 243-56 頁，Alan R· Liss (1985) ; Hellstrom 等人，"Antibodies For Drug Delivery"，Controlled Drug Delivery，第 2版，Robinson等 人編，第 623-53 頁，Marcel Dekker (1987) ; Thorpe， ,fAntibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," Monoclonal Antibodies f84: Biological And Clinical Applications，Pinchera 等人編，第 475-506 頁 (1985) ； ”Analysis，Results，And Future Prospective Of The
Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,11 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy，Baldwin等人編，第 303-16 頁，Academic Press (1985);及 Thorpe 等人，62:1 19 (1982)。或 者，抗體可與第二抗體接合以形成抗體雜接合物。例如， 129377.doc •87· 200846367 參見美國專利第4,676,980號。
本發明之接合物可用於調節所給定之生物反應，不應將 治療劑或藥物部分視為限於傳統化學治療劑。舉例而言， 藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白或多肽。該等蛋白 可包括（例如）毒素，諸如相思子毒素（abrin)、篦麻毒素 A(ricm A)、綠膿桿菌外毒素(^印如瓜抓心6乂(^〇乂111)或白 侯毋素（diphtheria toxin);諸如腫瘤壞死因子、干擾 素、β_干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組 織纖維蛋白溶酶原活化因子、細胞〉周亡劑之蛋白，例如 TNF α TNF-β、AIM I(參見國際公開案第 w〇 97/33899 號）AIM II(麥見國際公開案第w〇 97/34川號）、化配 位體（Takahashi 等人，μ ⑽⑽仏 6:1567 (1994))、 vEGI(參見國際公開案第w〇 99/231〇5號）；血栓性劑，·抗 血管生成劑，例如血管抑制素或内皮生長抑素；或生物反 應調節劑，諸如淋巴介質、介白素](，，ιιμ")、介白素· 2( IL-2 )、彳白素_6(”IL_6”）、顆粒球巨嗟細胞群落刺激因 子（GM-CSF )、顆粒球細胞群落刺激因子（’，g_cw)或其 3.1 α丞於杬體之基因療法 在本發明之另—態樣中，投與包含編碼抗體或其功能衍 生物之序列的核酸以藉由基因療法治療、抑制或預防與 0X40異常表現及/或活性有 、"" .有關之疾病或病症。基因療法係 精向受檢者投與經表現或可表現之核酸而執行之療 法。在本發明之此實施例中，核酸產生介導治療作用之其 129377.doc -88- 200846367 經編碼蛋白。根據本發明可使用可得之用於基因療法的任 何方法。例示性方法在下文描述。 關於基因療法方法之綜合評論，參見Goldspiel等人， C/h/ca/ 12:488 (1993) ; Wu等人，別0仏以叩少 3:87 (1991) ； Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573 (1993) ； Mulligan, Science 260:926 (1993) ； Morgan 專人 ’ Ann Rev Biochem 62:191 (1993) ； May, TIBTECH 1 1:155 (1993) 〇 馨 在一悲樣中’化合物包含編碼抗體之核酸序列，該等核 酸序列為在合適宿主中表現抗體或其片段或嵌合蛋白或重 鏈或輕鏈之表現載體之部分。詳言之，該等核酸序列具有 與抗體編碼區可操作地連接之啟動子，該啟動子具有誘導 性或組成性及視情況組織特異性。 在另一特定實施例中，使用核酸分子，其中抗體編碼序 列及任何其他所需序列藉由促進基因組中所需位點處之同 _ 源重組之區側接，因此提供抗體編碼性核酸之染色體内表 現（Koller等人，尸咖 jcW 仏· 86:8932 (1989); Zijlstra等人，342:435 (1989))。在特定實施例中， 經表現之抗體分子為單鏈抗體；或者，核酸序列包括編碼 抗體之重鏈及輕鏈或其片段之序列。 核酸可直接傳遞至患者中，在此狀況下，患者直接暴露 於核酸或載運核酸之載體；或間接傳遞至患者中，在此狀 況下，首先在活體外將細胞用核酸轉型，接著移植至患者 中此兩種方法分別稱為活體内或離體基因療法。 129377.doc •89· 200846367 在一特定實施例中，直接於活體内投與核酸序列，其中 其經表現以產生編碼產物。此可藉由此項技術中已知之多 種方法中的任一者來實現，舉例而言，將其建構為合適核 酸表現載體之部分且投與該表現載體以便其在細胞内，例 如使用缺P曰或減毋反轉錄病毒或其他病毒載體進行减染 (參見美國專利第4,980,286號），或直接注射裸〇1^八，或使 用微粒轟擊（例如，基因搶；Biolistic，Dup〇nt)，或塗佈脂 質或細胞-表面受體或轉染劑，封入脂質體、微粒或微膠 囊中’或將其與已知進入核之肽連接投與，將其與經受受 體介導之内飲作用的配位體連接投與（參見例如Wu等人，j 扔〇/ C/zem 262:4429 (1987))(其可用於靶向特異性表現受體 之細胞類型）等。在另一實施例中，可形成核酸_配位體複 合物’其中配位體包含融合病毒肽以破壞内體，從而使核 酸避免溶酶體降解。在另一實施例中，藉由靶向特定受 體’可在活體内輕向核酸以使細胞特定吸收及表現（例 如，參見 PCT公開案 W0 92/06180、wo 92/22635、WO 92/20316、WO 93/14188、WO 93/20221)。或者，藉由同 源重組，可將核酸引入細胞内且併入宿主細胞DNA内以表 現（Koller 等人，iV〇c #如/ Scz* 仍』86:8932 (1989); Zijlstra等人，伽㈣ 342:435 (1989)) 〇 在一特定實施例中，使用含有編碼本發明抗體之核酸序 列的病毒載體。例如，可使用反轉錄病毒載體（參見MiUer 等人，MeM 217:581 (1993))。此等反轉錄病毒载 體含有正確封裝病毒基因組且整合至宿主細胞Dn a中所需 129377.doc -90- 200846367 的組件。將編碼待詩基因療法之抗體的核酸序列選殖至 一或多個載體中，該或該等載體促進將基因傳遞至患者 中。關於反轉錄病毒載體之更多料可見於β。^等人， 忍祕㈣外6:291 (1994)’其描述反轉錄病毒載體將_基 因傳遞至造血幹細胞以製造對化學療法更具抗性之幹細胞 的用途。說明反轉錄病毒載體在基因療法中之用途的其他 參考文獻為：Clowes等人，j 93:644 (1994广
Kiem等人，83:1467 (1994); Salmons等人，丑謂⑽
Ge批以以印；；4:129 (1993) ; &Gr〇ssman等人，办以
Gew ㈣d Dev 3:1 10 (1993)。 腺病毒亦可用於本發明。在本發明中，腺病毒為尤其具 吸引力之用於將抗體傳遞至呼吸道上皮細胞的載具。腺病 毒天然感染呼吸道上皮細胞。基於腺病毒之傳遞系統的其 他標革巴為肝、中樞神經系統、内皮細胞及肌肉。腺病毒具 有月b夠感染非***細胞之優點。Kozarsky等人，Cwrr Ga Dev 3:499(1993)提供對基於腺病毒之基因療法的評 論。Bout等人，Gwe 5:3 (1994)證明腺病 毒載體將基因傳送至恒河猴（rhesus monkey)呼吸道上皮細 胞之用迷。腺病毒在基因療法中之用途的其他情況可見於 Rosenfeld等人，Sck加e 252:431 (1991); R0senfeld等人，
Ce// 68:143 (1992) ; Mastrangeli 等人，j c/k J>2Ve以 91:225 (1993) ; PCT 公開案 WO 94/12649 ; Wang 等人，
Ge似772以叩少2:775 (1995)。亦已提議將腺相關病毒（AAV) 用於基因療法（Walsh等人，Proe Soe Exp 5ζ·ο/ Afed 204:289 129377.doc -91 - 200846367 (1993);美國專利第5,436，146號；第6,632,67G號；及第 6,642,051號）。 基因療法之另一方法包含藉由諸如電穿孔、脂質轉染、 磷酸鈣介導之轉染或病毒感染之方法將基因轉移至組織培 養物中之細胞。通常，轉移方法包括可選標記物轉移至細 胞。接著，將細胞選擇性置放以分離已吸收且表現經轉移 之基因的彼等細胞。接著，將彼等細胞傳遞至患者。 在此實施例中，在活體内投與所得重組細胞之前將核酸 引入細胞中。該引入可藉由此項技術中已知之任何方法進 行，包括（但不限於）轉染、電穿孔、微注射、經含有核酸 序列之病毒或嗤la體載體感染、細胞融合、染色體介導之 基因轉移、微細胞介導之基因轉移、球形質體融合等。用 於將外源基因引入細胞中之多種技術在此項技術中已知 (參見例如Loeffler專人，Mei/z 五217:599 (1993); Cohen等人，217:618 (1993) ; Cline， φ 以以29:69 (1985))且可根據本發明使用，其限制條件為不 破壞接受細胞之必需發育及生理機能。該技術應使核酸穩 定轉移至細胞，以便可藉由細胞來表現核酸且較佳可藉由 其細胞子代遺傳及表現。 可藉由此項技術中已知之各種方法將所得重組細胞傳遞 至患者。重組血細胞（例如，造血幹細胞或祖細胞）較佳經 靜脈内4又與。預想使用之細胞的量視所需效應、患者狀雜 專而疋且可精由熟習此項技術者來確定。 可引入核酸以達成基因療法之目的之細胞涵蓋任何所需 129377.doc -92- 200846367 之可用細胞類型，且包括（但不限於）上皮細胞、内皮細 胞、角質細胞、纖維母細胞、肌細胞、肝細胞；血細胞， 諸如τ淋巴細胞、仏淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中 性白血球、嗜伊紅血球、巨核細胞、粒細胞；各種幹細胞 或祖細胞，尤其造血幹細胞或祖細胞，例如自骨髓、臍帶 血、外周血、胎肝等獲得之彼等細胞。 在一實施例中，用於基因療法之細胞與患者自體同源。 將、、扁碼本务明抗體之核酸序列引入細胞中以便其可藉由細 胞或其子代表現，且接著活體内投與重組細胞以達成治療 作用。在一特定實施例中，使用幹細胞或祖細胞。可根據 本發明之此實施例潛在使用可分離且在活體外供養之任何 幹、、、田胞及/或祖細胞（參見例如pCτ公開案w〇 94/0 8 5 9 8 ;
Stemple等人，Ce" 71:973 (1992); Rheinwald，Mei/2 Ce// b 21A:229 (1980) ; Pittelkow 等人，C/zWe /Voe 61:771 (1986)) 〇 6.實例 除非另外特定指示，否則本發明可進一步藉由其較佳實 施例之以下實例來說明，儘管應瞭解包括此等實例僅為達 成例示之目的且不欲限制本發明之範疇。 實例1 :人類OX4〇/FC免疫原之製備 將兩種形式之0X40受體用作免疫原以產生本發明之拮 抗劑抗0X40抗體。第一種為可溶形式之人類〇χ4〇受體， 其表現為包含人類Fcyl及藉由SEQ ID ΝΟ:1之核苦酸殘基 105至627編碼之胞外域的融合蛋白。第二種形式為基於細 129377.doc -93- 200846367 胞之免疫原，其包含在穩定轉染之小鼠纖維母細胞L-細胞 表面上表現之全長0X40。 自分離自TCR-激活之人類CD4 T細胞之0X40 cDNA純系 選殖可溶形式之0X40。用以產生0X40 cDNA純系之兩個 引子為：（1)有義引子，其具有含有Hindlll位點之核苷酸 序列 cccaagctttaccccagcaacgaccggtgctgc(SEQ ID NO:3)，及 (2)反義引子，其具有含有與人類FcYl同框之Xhol位點之核 苷酸序列 cgcctcgaggacctccacgggccgggtgg(SEQ ID NO:4)。 ® 將所得540 bp PCR片段次選殖至市售載體中，該市售載體 在5’末端含有分泌信號肽序列且在3’末端含有人類FcYl序 列（鉸鏈及恆定區CH2及CH3)。該構築體之組成藉由定序 來確認。 對於瞬時表現，根據製造商之方案，藉由Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)將 OX40/Fcyl DNA轉染至 293T-細胞（Invitrogen，Carlsbad，CA)中。在轉染後 72 小 $ 時，收集來自經轉染之細胞之培養物上清液以進行純化。 亦在293T-細胞株中建立OX40/FcYl之穩定表現。為證實表 現，藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析培養物上清液。將經分離之蛋白轉移至硝酸纖 維素膜且用辣根過氧化物酶（HRP)接合之小鼠抗人類 IgG(Fc)單株抗體（Sigma，St· Louis，MO)或多株羊抗0X40 抗體（R & D Systems，Minneapolis，MN)摘測，用 HRP-驢抗 羊 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove， PA)偵測。在膜上使用增強之化學發光偵測（Pierce， 129377.doc -94- 200846367
Rockford，IL)來鑑別免疫反應性蛋白。用在磷酸鹽緩衝生 理食鹽水（PBS)中平衡之蛋白·Α親和管柱（Invitrogen， Carlsbad，C A)純化〇X40/Fcyl。將細胞培養物上清液施加 於管柱後，用約20管柱體積之PBS、接著SCC緩衝洗滌液 (0·05 Μ檸檬酸鈉、〇·5 Μ氯化鈉，pH 6,0)洗滌樹脂以移除 未結合之蛋白。使用0·05 Μ檸檬酸鈉、0·15 Μ氯化鈉（pH 3.0)溶離0X40融合蛋白，接著在PBS(pH 7.0)中透析。藉 由SDS-PAGE分析來自親和管柱之含有〇X4〇/Fcyl的溶離 份。藉由庫馬斯藍（Coomassie Blue)染色來分析蛋白之純 度且如上所述，藉由西方免疫墨點法使用羊抗人類 IgG(Fe)抗體（Sigma，St Louis，MO)及羊抗人類0X40抗體（R & D Systems，Minneapolis，MN)分析蛋白之身份。 使用自TCR激活之人類CD4 T細胞選殖之全長人類0X40 cDNA建構第二種形式之免疫原。所用之兩個引子為具有 核苷酸序列 caccatgtgcgtgggggctcggcggctggg(SEQ ID NO:5) 及 gatcttggccagggtggagtgggcgtcggcc(SEQ ID NO:6)之 0X40 特異性引子。將所得PCR產物直接選殖至市售載體中且穩 定轉染至小鼠L纖維母細胞中以表現高含量之0X40。在投 與之前，用 6800 Grays 使用 GammaCell 1000 Elite 模型 A(MDS Nordion，Ottawa Canada)照射基於細胞之免疫原L-細胞以抑制免疫原增殖。 實例2 :抗0X40 MAb之產生 將約20 pg可溶性OX40/Fcyl免疫原與弗氏佐劑（Freund’s adjuvant)(l:l)組合且以三次皮下注射、接著一次腹膜内注 129377.doc -95- 200846367 射（無佐劑）以7天間隔投與至兩隻六週大八/了小鼠（11&1*比11， Houston，Tex·)。在最後注射後3天，根據如下所述之Groth 及 Scheidegger方法（J Immunol Methods，1980)將免疫小鼠 之脾細胞與鼠科骨髓瘤SP2/0細胞融合。 對於基於細胞之免疫原，藉由三次在PBS中之皮下注 射、接著一次腹膜内注射以7天間隔向六週大A/J小鼠 (Harlan，Houston，Tex.)投與 3xl06個 γ照射之 0X40-穩定轉 染之L-細胞。在最後注射後3天，如下所述將免疫小鼠之 脾細胞與鼠科骨髓瘤SP2/0細胞融合。 在導致抗0X40 mAb產生之融合中，自免疫小鼠之脾製 備單細胞懸浮液且將其用於使用合適融合劑聚乙二醇 (M.W. 1450)(Kodak，Rochester，NY)及 5% 二甲亞砜（Sigma，
St Louis，MO)與永生Sp2/0骨髓瘤細胞（以1:1之比率）融合 以形成融合瘤細胞（Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，Academic Press ’ 第 59-103 頁 (1986))。10天後，在較佳含有次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷 (HAT)(—種抑制未融合之永生細胞生長或存活的物質）之 合適DMEM培養完全培養基（Invitrogen，Carlsbad，CA)中培 養融合瘤細胞株。自2次融合實驗獲得24,000個較佳之永 生細胞株，該等細胞株有效融合、支持抗體之穩定高含量 產生且對HAT培養基敏感。 實例3 ··拮抗劑抗OX-40抗體之篩檢 關於針對0X40之單株抗體（mAb)之產生，檢定融合瘤細 胞生長之培養基。融合瘤細胞所產生之mAb之結合特異性 129377.doc -96· 200846367 藉由三種不同方法來測定：FMAT、ELISA及流式細胞儀 免疫檢定。 A· FMAT薛檢 使用FMAT方法，分泌小鼠抗人類0X40 mAb之220個融 合瘤細胞株藉由其與0X40瞬時轉染之L-細胞強烈反應而 不與模擬未經轉染之L-細胞強烈反應來鑑別。使用 FMAT，採用巨共焦掃描平台來篩檢抗0X40融合瘤上清液 以反映且定量96孔微量滴定盤格式中之細胞數目及螢光。 將表現0X40抗原之L-細胞用5 μΐ抗0X40融合瘤上清液培 育且用在篩檢緩衝劑中稀釋至0·125 pg/ml之Cy-5接合之羊 抗小鼠 IgG-Fcy 抗體（Jackson Laboratories，PA)作螢光標 記。在培育2小時後，使用FMAT 8100 HTS系統（Applied Biosystem，CA)掃描培養盤。下表1中之結果說明純系B24 及B39具有與陽性對照可比較之活性。 ELISA 篩檢 在 4°C 下，將聚氯乙稀96 孔盤（Nunc，Roskilde，Denmark) 用OX40/Fcyl (每孔5 ng)或人類Fcyl (每孔25 ng)作為篩檢對 照塗佈隔夜，接著用PBS中之2% BSA培育1小時以阻斷非 特異性結合。添加約50 μΐ融合瘤上清液且培育1小時。用 0.05% TWEEN®-PBS洗滌4次後，在室溫下添加約〇·2 μ§ HRP-羊抗小鼠 IgG Fcy(Jackson ImmunoResearch Laboratories， PA)歷時1小時，以偵測結合之抗0X40抗體之存在。將ι〇〇 μΐ 1 mM TMB(Sigma)新製備之受質溶液添加至各孔中歷時 30分鐘’且措由添加50 ml 0·2 M H2SO4來中止反庳，且使 129377.doc -97- 200846367 用微定量盤式讀取器（Molecular Devices，CA)在450 nm下 對培養盤讀數。根據FMAT及ELISA，認為24,000個孔中 220個孔為陽性。代表資料報導於表1中。 表1
FL1(平均螢光） 螢光細胞數目 〇〇450 純系#B24 5560 39 3.4 純系#B39 7665.3 44 3.6 陰性對照物 "〇 ❹ NA 陽性對照物 5028.5 41 NA C ·流式細胞儀篩檢 藉由FMAT及ELISA選擇之220個陽性融合瘤亦藉由流式 細胞儀使用0X40穩定轉染之L-細胞來測試，該等細胞係 使用5 μΐ抗0X40融合瘤上清液染色且藉由FITC接合之羊抗 小鼠 IgG-Fcy抗體（Jackson Laboratories，ΡΑ)作螢光標記。 表2中呈現之資料對應於使用抗0X40融合瘤上清液染色之 全部0X40轉染之L-細胞的百分比。 表2 純系#B2 °/〇螢光細胞 純系#Β17 %螢光細胞 純系#Β36 %螢光細胞 純系#Β37 %螢光細胞 L-細胞 0·82 0.7 0.9 0.4 OX40LL·細胞 30.4 03 15.0 32.7 根據表1及2中所鑑別之220個抗0X40 mAb，抗0X40 ⑩ _____ mAb純系 B2、B24、B3 6、B3 7及 B39顯示與 OX40L L-細胞 陽性結合，但不與未經轉染之L-細胞陽性結合。排除B-17，此係因為其未顯示與OX40L L-細胞結合。 實例4 :拮抗劑抗0X40 MAb之初始表徵 129377.doc -98- 200846367 在鑑別產生對人類0X40具特異性之抗體之220個融合瘤 後，將純系藉由限制稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長 (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press，第59-103頁（1986))。藉由習知純化程序 使用蛋白A-瓊脂糖，自培養基純化藉由次純系分泌之220 個抗 0X40 mAb。 A.細胞株製備 使用特定細胞株及剛分離之人類純真CD4+ T細胞來檢 ⑩ 查OX40協同刺激對人類CD4+ T細胞發育之影響以表徵220 個抗0X40 mAb黏合劑。此等細胞株包括：（1)0X40轉染之 人類Hut-78白血病CD4+ T細胞株，（2)OX40L轉染之L纖維 母細胞小鼠L-細胞及其親本細胞株（由Dr. Yong-Jun Liu， M.D· Anderson Cancer Center，Houston，TX提供），（3)人類 純真CE>4+ T細胞，及（4)在人類iL-4及GM-CSF存在下培養 且自分離之CD 14+單核細胞分化之人類樹突狀細胞（DC)。 φ 自健康成年個體收集之血液的白血球層部份充當藉由磁損 耗而分離之人類純真T細胞（CD4+、CD45RA+、CD45RO-及CD 14-表現型）之來源；充當藉由細胞分類而分離之 CDUc+樹突狀細胞（DC)之來源；或充當分化成不成熟DC 之分離CD14 +單核細胞之來源。 B·功能檢定 1· Hut-78檢定 在經照射（68〇〇 cGray)之OX40L轉染的L-細胞或未經轉 染之L細胞存在下，在96孔盤中將0X40轉染之人類Hut-78 129377.doc •99- 200846367 白 jk 病 CD4+ T細胞用 5 pg/rnl抗 CD3(OKT3，BD Bioscences， CA)及 1 pg/ml抗 CD28 mAb(CD28.2，BDBioscences，CA)致 敏48小時，其中OX40-Hut78細胞/L-細胞為4:1比率。在檢 定開始時添加實例3中所鑑別之220個抗OX4〇 mAb以篩檢 定義為CD4+ T細胞細胞激素釋放的抑制作用之拮抗活性。 使用同一方案重複檢定三次。表3中概述之實驗為三個代 表性抗0X40 mAb(B66、B76及B86)之實例且說明與在未經 轉染之L-細胞存在下激活之T細胞（產生22 pg/ml之IL-2及 70 pg/ml之IL-13)相比，在OX40L轉染之細胞存在下激活 之T細胞產生多至少10倍之IL-2(138 pg/ml)及IL-13(620 pg/ml)。將經純化之抗0X40 mAb B66及B76添加至細胞培 養物中會以劑量反應方式阻斷Hut-78 CD4+ T細胞株之細胞 激素產生。在最高濃度下，純系B66抑制88%之IL-2及92% 之IL· 13細胞激素產生（表3)。所測試之220個抗0X40 mAb 中，10個純系顯示選擇IL-2及IL-13細胞激素產生之超過 60%抑制作用（資料未顯示）。 129377.doc 100· 200846367
(N ^r> oo v〇 CN l〇 s 1—( SrT m r-H m vd G On K (N v〇 们 ΓΛ (N Ό 00 (N Ο 00 m Ch rn 〇 CN VO Os CN r-H m 〇\ m (N CN CN 赛 + 令, gg v〇 OO CN t-H (N On v〇 T—H o v〇 r—< ro r-H O 00 cn ON cn r-H 〇 (N MD Os 宕 to r—H 卜 r—4 Λ〇 rn (N in m tn ON T-H PQ β i—H S H r-H ON ΓΟ m o oo m ON 〇 (N ΛΟ 宕 00 2 WO rn CN r—ί 卜 o oo m os rn o (N VO ^Τ) 0X40 Hut78+ + L-細胞 〇 (N o l> 00 r—Η 0X40 Hut-78+ (N (M 卜 oo o ο ♦ 4 1 x> < 1, 1 tn d¥, 129377.doc -101 - 200846367 C.純真CD4+ T細胞檢定 為阻斷0X40對Τ細胞增殖及細胞激素產生之協同刺激， 在功能上篩檢220個抗0X40 mAb抑制細胞激素產生、增殖 及誘發人類CD4+ T細胞之細胞凋亡的能力。使用市售純真 CD4+ T細胞分離套組（Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，自來 自健康成年志願者之人類血液之白血球層（Gulf Coast Regional Blood Center，Houston，TX)分離純真人類 CD4+ Τ 細胞。在經照射之OX40L轉染的L-細胞或親本L-細胞存在 _ 下，將經分離之純真人類CD4+ T細胞用5 gg/mL抗 CD3(OKT3，BD Biosciences，CA)及 1 pg/ml抗 CD28 mAb (CD28.2，BD Biosciences，CA)激活，其中 L-細胞/純真 CD4+ T細胞為1:4比率。培養七天後，與在L-細胞存在下 致敏之彼等純真CD4+ T細胞相比，在OX40L轉染物存在下 激活之純真CD4+ T細胞產生多至少10倍之IL-2及IL-13(圖 2)。使用來自 R & D Systems(Minneapolis，MN)之ELISA-套 組量測細胞激素產生之含量。如圖3所示，在0X40協同刺 ® 激存在下，細胞亦增殖更多。對於圖2及3 :空心正方形代 表純真CD4 ;空心三角形代表在對照L-細胞下之純真 CD4+ ;實心三角形代表在純真CD4 +及OX40L L·細胞下之 B66 ;實心正方形代表在純真CD4+及OX4〇L L-細胞下之 2C4(同型對照物）；且實心圓代表在純真CD4+及OX40L L-細胞下之G3-519不相干mAb對照物。 如與2C4或G3-519對照物相比，將抗0X40 mAb B66添加 至培養物中會以劑量依賴性方式在致敏之CD4+ T細胞中抑 I29377.doc -102- 200846367 制細胞激素釋放（圖2)、細胞增殖（圖3)且誘發細胞凋亡（表 4) 〇 表4 細胞凋亡細胞 (%) 存活之抑制^~ (%)— 純真CD4+ T-細胞+L-細胞 21.9 22^^— 純真CD4+ T-細胞+OX40L L-細胞 11.0 11 ^^^ 純真 CD4+ T-細胞 +OX40L L-細胞 +B66(20 ug/ml) 37,9 38 〜 純真 CD4+ T-細胞 +OX40L L-細▲ +ai〇(^20 us/ml) 32.3 32 純真 CD4+ T-細胞 +OX40L L-細胞 +ic:G3- 519(20 1L7 12 ^~~ 實例5 :所選拮抗劑抗0X40 MAB之進一步表徵
細胞激素可控制產生由其細胞激素產生概況確定之T細 胞子集之純真CD4+ T細胞的分化。IL-12推動Thl細胞之分 化，Thl細胞主要產生IFN-γ及IL-2且負責控制細胞介導之 免疫及前發炎性反應。IL-4使純真CD4+ T細胞偏向Th2細 胞，Th2細胞主要產生IL-4及IL-5且負責控制體液免疫及消 炎反應。測試選自初始表徵之兩個抗0X40 mAb A10及B66 在Thl及Th2細胞中阻斷增殖、存活及細胞激素釋放之能 力。為此，首先將其轉變為包含鼠科親本抗體之可變區及 人類恆定區之嵌合形式。所有商業抗體及細胞激素均購自 BD Biosciences，CA 〇 A. Thl檢定 使用以上實例4(B)(2)中所述之套組，自人類血液之白血 球層分離人類純真CD4+ T細胞。使用5 pg/ml抗CD3 (OKT3)、1 pg/ml抗 CD28(CD28.2)及 10 pg/ml抗 IL-4 中和抗 129377.doc -103 - 200846367 體（MP4-25D2)，在補充有50 ng/ml IL-12細胞激素之培養 基中將細胞致敏7天以誘發Thl細胞激素產生概況。在經照 射之OX40L轉染的L-細胞或親本L-細胞存在下，用抗CD3 及抗CD28 mAb培養細胞，其中L-細胞/純真CD4+ T細胞為 1:4比率。如藉由對膜聯蛋白（annexin)染色呈陽性之CD4+ 細胞的數目減少所示，0X40協同刺激會增加Thl效應細胞 之存活（表5)。在經照射之L-細胞的共培養開始時添加嵌合 抗0X40 mAb B66會抑制此存活。0X40協同刺激亦增加 IFN-γ產生且添加B66會以劑量依賴性方式抑制其產生（表 6) 〇 表5
Thl存活(％) 純真CD4+ T-細胞+ L-細胞 52.6 純真CD4+T·細胞+ OX40LL-細胞 65.9 純真CD4+ T-細胞+ OX40L L-細胞+ Β66(0·2 pg/ml) 58.4 純真CD4+ Τ'細胞 + OX40L L'細胞 + B66(2 pg/ml) 55.9 純真CD4+ T-細胞 + OX40LL-細胞 + B66(20 pg/ml) 53.2 表6
IFN-γ 濃度(pg/ml) SD(n:3) Thl細胞 10280.2 123.0 Thl細胞+L-細胞 10934.4 267.7 Th 1細胞+OX40L L-細胞 33040.4 237.5 Thl 細胞+OX40LL-細胞+B66(0.2 pg/ml) 17148.3 234.6 Thl 細胞+OX40L L-細胞+B66(2 pg/ml) 11049.3 141.7 Thl 細胞+OX40L L-細胞+B66(20 |ig/ml) 11540.6 51.6 B. Th2檢定 如上所述來分離人類純真CD4+ T細胞。使用5 pg/ml抗 CD3、1 gg/ml抗CD28及10 pg/ml抗IFN-γ中和抗體，在補 129377.doc -104- 200846367 充有50 ng/ml IL-4細胞激素之培養基中將細胞致敏7天以 誘發Th2細胞激素產生概況。在經照射之OX40L轉染的L-細胞或親本L-細胞存在下，用抗CD3及抗CD28 mAb培養 細胞，其中L-細胞/純真CD4+ T細胞為1:4比率。如藉由對 膜聯蛋白染色呈陽性之CD4+細胞的數目減少所示，0X40 協同刺激會增加Th2效應細胞之存活（圖4)。在經照射之L-細胞共培養開始時添加抗0X40 mAb A10及B66會以劑量依 賴性方式抑制此存活（圖4)，以及Th2細胞之增殖（圖5)及 IL-2(圖6A)及IL-13(圖6B)之細胞激素產生。 C. Thl7檢定 藉由IL-23的存在致敏之T細胞之獨特子集特徵為產生 IL-1 7且極為重要地涉及某些慢性發炎疾病之發病原理。 近來之資料已證實Thl7細胞代表CD4+ T細胞之完全獨立譜 系，其早先自Thl及Th2譜系分出且由控制Thl及Th2細胞 發育之細胞激素及信號轉導路徑拮抗。將Thl 7 T細胞致敏 以研究0X40協同刺激之作用及拮抗性抗0X40 mAb抑制 Thl7分化之能力。 如實例4(B)(2)中所述，自白血球層分離純真CD4+ T細 胞。在 100 ng/ml IL-23 細胞激素（R & D，Minneapolis， MN)、各為 20 ng/ml 之 hIL-6 及 liTGFpi、5 pg/ml預塗佈之 抗 CD3(OKT3，BD Biosciences, CA)、1 pg/ml 可溶性抗 CD28(CD28.2)、各為 10 pg/ml 之抗 IL4(MP4-25D2)及抗 IFN-y(B27)存在下，將此等細胞致敏7天。洗滌經致敏之 細胞且在經照射之OX40L轉染的L-細胞或親本L-細胞存在 129377.doc -105- 200846367 下，用抗CD3及抗CD28 mAb次培養另外3天，其中L-細胞/ 純真CD4+ T細胞為k4比率。如與在缺乏OX40L協同刺激 之情況下培養之相同細胞相比，藉由經由OX40L-L_細胞 誘發0X40協同刺激，Thl7細胞增殖4倍。抗0X40 mAb A10及B66以劑量依賴性方式抑制Thl7增殖（表7)。 表7 CMP平均值 (n：3) ±SD Thl 7細胞+L-細胞 18092 2592.6 TM7細胞+OX40LL·細胞 66035.7 2106.2 TM7細胞+OX40LL-細胞+同型對照物(20 pg/ml) 70176.7 3080.8 TM7細胞+OX40LL-細胞+A10(0.2 pg/ml) 70176.7 7622.6 Thl7細胞+OX40L L-細胞+A10(2 pg/ml) 40347.7 8059.5 Thl7細胞十OX40LL-細胞+A10(20 pg/ml) 17456.7 563.9 Thl7細胞+OX40LL-細胞+B66(0.2 pg/ml) 46735.3 10667.1 Thl7細胞+OX40L L-細胞+B66(2 pg/ml) 31658.0 5492.6 丁1117細胞+〇又401^-細胞+866(2(^8/1111) 18336.3 956.4
表8資料證實OX40L顯著增強Th-17存活（68%對84%)。此 增強之存活由抗0X40 mAb A10及B 66以劑量依賴性方式抑 制（表8)。 • 表8
Th-17 存活(％) Thl 7細胞+L-細胞 68.4 丁1117細胞+(^401^-細胞 84.3 Thl7細胞+OX40T丄-細胞+同型對照物(20㈣1111) 84.3 Thl7細胞+OX40LL-細胞+A10(0.2 80.7 Thl7細胞+OX40LL·細胞+A10(2 呢/ml) 72.3 Thl 7細胞+OX40L L-細胞+Α10(20 ^/ιη1) 70.7 ΤΜ7細胞+OX40L L-細胞+Β66(0.2 吨/ml) 77.0 11117細胞+〇又401^-細胞+：666(2呢/1111) 74.1 1〇117細胞+〇\401^-細胞+866(20^18/1111) 67.3 藉由評估蛋白生存素（Survivin ’其為細胞凋亡之抑制劑 129377.doc -106- 200846367 及0X40蛋白之潛在標靶）之細胞内表現，發現OX40刺激會 增強其表現。此增強之表現由抗0X40 mAb A10及B66以劑 量依賴性方式抑制（表9)。 表9 生存素表現__ TM7細胞+L-細胞 19.2__ Thl7細胞+OX40L L-細胞 49.0 Thl7細胞+OX40L L-細胞+同型對照物(20 pg/ml) 45.4 Thl7細胞+OX40L L-細胞+Α10(0·2 gg/ml) 34.3 TM7 細胞+OX40LL-細胞+A10(2 pg/ml) 22.8 _一 Thl7細胞+OX40L L-細胞十A10(20 gg/ml) 15.4 ___ Thl7細胞+OX40L L-細胞+B66(0.2 pg/ml) 45.2 Thl7細胞+OX40LL-細胞+B66(2 pg/ml) 28.3 __ Thl7細胞+OX40L L-細胞+B66(20 pg/ml) 20.3
在致敏純真CD4+ T細胞7天後’與Thl致敏細胞相比’ ΤΗ 17細胞顯示顯著較高含量之IL_17。在Th 17與經照射之 OX40L轉染的L-細胞或親本L-細胞另外共培養後’與Thl 致敏細胞相比，了七1 7細胞在0X40協同刺激存在下產生顯 著含量之IL-17。與同型對照物G3_519(IC)相比，此IL17產 生由欲合之抗0X40 mAb A10及B 66以劑量依賴性方式抑制 (表 10) 〇 表10 ΤΗ-17 TH-1 _ IL-17濃度 (pg/ml) SD (n：3) IL-17濃度 (pg/ml) _ SD (n:3) CD4+細胞+L·細胞 409.7 41.1 .29.8 5.4 CD4+細胞/OX40L L·細胞 2264.1 40.8 20.5 4.7 CD4+細胞/OX40L L· 細胞+IC(20 lug/ml) 2032.7 90.0 56.1 10.7 CD4+細胞/OX40L卜細胞+A10 (0 2 iig/ml) 2054.6 254.0 41.4 8.4 CD4+細胞/OX40L L-細胞+Α1ϋ(2 μ^/ιηΐ) ___ 1795.1 304.6 39.3 9.4 129377.doc -107 - 200846367 CD4+細胞/OX40L L-細胞+A10 (20 pg/ml) 1059.9 448.6 54,1 5.7 CD4+ 細胞 /OX40L L-細胞 +B66 (0·2 pg/ml) 2296.3 56.8 56,6 5.8 CD4+細胞/OX40L L-細胞+B66(2 pg/ml) 1144.0 224.5 63.1 3.7 CD4+ 細胞 /OX40L L-細胞 +B66 (20 蜱苣/]111) 1069.5 224.5 71.5 6.9 D. L106比較 使用實例4(B)(2)中之相同方案，將抗0X40 mAb A10及 B66在0X40協同刺激存在下抑制細胞激素IL-2及IL-13自激 活之人類CD4+ T細胞釋放的能力與商業抗0X40抗體 L1 06(BD Bioscience，San Jose，CA)相比。藉由 L1 06抑制細 胞激素產生在統計學上並未與對照抗體不同（參見圖7)。因 此，該抗體似乎無功能（亦即，無促效或拮抗活性）。 實例6 :抗0X40 MAB之人類化 圖14 A-D中描繪鼠科mAb A10及B66之重鏈可變區（VH) 及輕鏈可變區（VL)之核酸序列。圖12提供與所選人類輕鏈 模板相比之鼠科抗體252-B66及252-A10的輕鏈可變區之胺 基酸序列（來源於DNA序列）。兩種抗體均充當0X40拮抗劑 且相互競爭。將此等序列與在公開資料庫中可得之人類抗 體生殖系序列相比。當對模板作出決定時使用若干標準， 包括總長、構架内之類似CDR位置、整體同源性、CDR大 小等。如圖12A及B中所描繪之A10及B66 mAb重鏈及輕鏈 序列與各別人類模板序列之間的序列對準所示，所有此等 標準合起來為選擇最佳人類模板提供結果。將噬菌體載體 中之嵌合Fab建構為對照物，其將鼠科A10可變區及人類κ 鏈之恆定區及人類IgG之CH1部分組合。 129377.doc -108- 200846367 在此狀況下，一種以上人類構架模板用以設計此抗體。 為VH鏈選擇之人類模板為亞群vl2IGHVl_46(Ge此仏此 寄存編號X92343)與生殖系IGHJ4(Gene Bank寄存編號 J00256)之組合（參見圖12B)。為％鏈選擇之人類模板為 IGKV4-l(Gene Bank寄存編號z〇〇〇23)與生殖系j模板 IGHJ1 (Gene Bank寄存編號JO〇242)之組合（參見圖12A)。圖 12B提供鼠科抗體之重鏈可變區之胺基酸序列（來源 序列）、其與所選人類生殖系模板之對準及A1〇(TH)hu336F 之人類化可變區的序列。根據Kabat之方法，將胺基酸序 列編號。將來自A10之鼠科Cdr移植至人類可變構架上。 在此序列中’構架中胺基酸殘基之總數為8 7 ;人類與鼠科 構架之間不同的胺基酸殘基之總數為2 1，且鼠科殘基未保 留在人類化重鏈之構架中。 雖然序列比較顯示鼠科抗體B66僅關於可變序列中之4個 胺基酸與A10不同，但以上實例4中所討論之功能分析說明 B66具有更鬲〇χ4〇結合及拮抗劑活性。B66中之兩個胺基 酸改變位於第一個CDR中且為自小鼠生殖系序列產生之改 變。推斷此等改變可能引起B66之活性增強。然而，當將 來自此等抗體之CDR移植至人類可變構架上時，B66分泌 不佳且因此較不適於進一步發展。因此，選擇B66之 CDRL1及A1 0之CDRL2及CDRL3以將其移植至人類可變模 板上以製備人類化抗OX4〇拮抗劑。藉由此方法，人類化 A10分子之結合親和力及拮抗劑活性相對於親本鼠科抗體 有所增加。 129377.doc -109- 200846367 Α·藉由BiaCore進行抗0X40 Fab動力學分析 圖13顯示與初始鼠科分子相比，所得分子之0X40結合 活性。亦使CDRL1突變以反映A10之初始CDRL1序列。由 B66之CDRL1置換A10之CDRL1會引起1人類化1 A10分子 A10(TH)hu336F之結合活性增加。圖15顯示人類化純系 A10(TH)hu336F、鼠科A10及其嵌合形式完全同等競爭 0X40。 實例7 : A10(TH)HU336F之人類化變異體之表徵 使用結合ELIS A、基於細胞之結合檢定及證明拮抗活性 之其他功能檢定來篩檢人類化A10候選者A10(TH)hu336F 之六個變異體。使6個人類化A10中之兩個變異體A10-D及 F經受六種功能檢定。 將上述人類化可變區選殖至哺乳動物表現載體中以使人 類化可變區在表現時與人類恆定區同框融合。亦將其他人 類化候選者選殖至哺乳動物表現載體中以產生用於測試之 全抗體。此等其他候選者包括具有初始A10 CDRL1之人類 化A10 VL區（A & D)、Kabat編號34自天冬醯胺酸（N)變化 至組胺酸（H)之人類化A10 VL區（B & E)(此變異體中CDR-L1 包含胺基酸序列 KASQTVDYDGDSYMH(SEQ ID NO:61))及在序列號70(A10 L70)(Kabat編號69)上含有鼠科 白胺酸（L)之另一人類化VH區。抗體以表11顯示之組合在 哺乳動物細胞中表現。表12顯示相應Biacore資料。此等人 類化候選者之可變區以及鼠科可變區之核酸序列呈現於圖 14中。 129377.doc -110- 200846367 表11 全抗體名稱 κ可變候選者 重鏈可變候選者 A AIOLC(SH)， A10 L70 B A10 LC (SN) A10L70 C A10LC (TH)hu336 A10L70 D AIOLC(SH)， A10人類化 E A10LC (SN) A10人類化 F AiOLC (TH) hu336 A10人類化 表12 樣品 KD [nM] ka[MAsA] SE(ka) kd[sA] SE㈣ A 1.38 1.31 e5 452 1.79 e-4 7.44 e-7 0.257 Β 0.94 1.70 e5 355 1.56 e-4 6.50 e-7 0.524 C 1.44 1.16 e5 483 1.51 e-4 8.28 e-7 0.352 D 1.21 1.40 e5 508 1.70 e-4 8.55 e-7 0319 E 1.25 1.51 e5 391 1.91 e-4 8.48 e-7 0.395 F U2 1.41 e5 474 1.58 e-4 7.53 e-7 0.267
A· TCR激活之純真CD4+ T細胞檢定 根據以上實例4(B)(2)中所述之相同方案，激活純真人類 CD4+ Τ細胞。培養七天後，與在L-細胞存在下致敏之彼等 純真CD4+ Τ細胞相比，在OX40L存在下激活之純真CD4+ Τ 細胞產生多至少10倍之IL-2、IL-5及IL-13且顯著更多地增 • 殖（圖8)。 如與同型對照物相比，人類化變異體A10-D及A10-F以 與鼠科親本及嵌合形式之Α10相同之程度抑制細胞激素釋 放（IL-2/IL-5/IL-13)及 CD4+T細胞增殖。 Β.致敏之1\細胞檢定 測試人類化變異體A10-D及A10-F之拮抗活性；在經照 射之OX40L轉染的L-細胞或親本L-細胞存在下抑制Thl致 敏T細胞、Th2致敏T細胞及Th 17細胞的增殖及細胞激素釋 129377.doc -111 - 200846367 放（參見實例5中之方案）。 在Thl條件下，如與同型對照物相比，人類化變異體 A10-D及A10-F以與嵌合（CC-A10)及親本小鼠（M-AlO)mAb 相同之程度抑制IL-2、IL-5、IL-13細胞激素產生及細胞增 殖（圖9)。 在Th2條件下，人類化變異體A10-D及A10-F顯示藉由抑 制激活之CD4+ T細胞之增殖及細胞激素釋放（IL-2、IL-5及 IL-13)對該等細胞產生拮抗效應。（圖10) 亦將人類化變異體A10 D及A10-F與其嵌合及小鼠抗 0X40 mAb並行測試以比較其對Thl7細胞增殖、IL-17細胞 激素產生及細胞凋亡之拮抗劑活性。結果展示於表13中。 表13 增殖 (CPM)土SD IL-17 (pg/ml)土SD GM-CSF (pg/ml)土SD Thl7+L-細胞 23997+1715 14±9 3191290 ΤΜ7+ΟΧ40Ι^ί-細胞 167684±581 858±205 19411246 Thl7+OX40L-L-細胞+A10-D(0.3 pg/ml) 87715±10048 313±76 1730±187 TM7+OX40L-L·細胞+A10-D(3 pg/ml) 11486±1901 107±49 533±120 Thl7+OX40L-L-細胞+A10-D(30 pg/ml) 12365±3514 184±214 4101312 Thl7+OX40L-L-細胞+A10-F(0.3 pg/ml) 65957+18160 240±37 1414±240 Thl7+OX40L-L-細胞+AHKF(3 pg/ml) 10376±2628 152±26 455±108 Thl7+OX40L-L·細胞+A10-F(30 pg/ml) 9380±2673 106±33 203±63 Thl7+OX40L-L-細胞+CC-A10(0.3 pg/ml) 94905115869 278±46 1743±303 Th 17+OX40L-L-細胞+CC-A10(3 pg/ml) 17566+1636 135+55 626±224 Thl7+OX40L-L-細胞+CC-A10(30 pg/ml) 9029±2090 125±58 235±125 Thl7+OX40L-L-細胞+M-A10(0.3 pg/ml) 106682±8066 373+99 1550+695 Thn+OX^L-L-細胞+M-A10(3 μ^πιΐ) 18797+4807 88±9 253±23 Thl7+OX40L-L-細胞+M-A10(30 pg/ml) 6934±997 97±48 40±16 Thl7+OX40L-L-細胞+IC(0.3 pg/ml) 168442+21659 8661218 1937±131 TM7+OX40L-L-細胞+IC(3 pg/ml) 151481±3176 862±371 1861±295 Thl7+OX40L-L·細胞+IC(30 pg/ml) 149621+6010 918±259 1575±229
經由藉由流式細胞儀及膜聯蛋白-V染色鑑別細胞凋亡之 129377.doc •112- 200846367 細胞，表12中呈現之資料證明如與同型對照物G3-519治療 (1C)相比，〇X40L顯著減少Thl7細胞凋亡，而人類化變異 體A10-D及A10-F以劑量依賴性方式增加細胞凋亡（表14)。 表14 TH17 存活(％) Th 17+L-細胞 20.4 TM7+OX40L-L· 細胞 39.2 ΤΜ7+ΟΧ40Ι^-細胞+A10-D(0.3 pg/ml) 49.6 ΤΜ7+ΟΧ40Ι^-細胞+A10-D(3 pg/ml) 18.0 Thl7+OX40L-L·細胞+A10-D(30 pg/ml) 22.3 Thl7+OX40L-L-細胞+IC(0.3，g/ml) 46.6 Thl7+OX40L-L-細胞+IC(3 hg/ml) 47.1 Thl7+OX40L心細胞+IC(30 pg/ml) 44.8
C. Th2/TSLP-DC 自來自健康成年志願者之人類血液之白血球層分離 CDllc+樹突狀細胞（DC)。藉由陰性免疫選擇使用對抗譜系 標 I己物 CD3(OKT3) 、 CD14(M5E2) 、 CD15(HB78) 、 CD20 (L27)、CD56(B159)及 CD235a(10F7MN)之 mAb 混合物，自 PBMC獲得DC富集之群體。使此群體通過羊抗小鼠IgG塗 佈之磁性珠粒（M-450; Miltenyi Biotec; CA)以移除結合之 細胞。藉由FACS Aria，使用別藻藍蛋白（allophycocuanin， APC)標記之抗 CDllc(B-ly6)、FITC 標記之 mAb 0019(出619)與€05 6^€八以16.2)之混合物及八？0〇77標記 之CD4(RPA-T4)來分離CDllc+譜系與CD4+細胞以達到 >99%之純度。在含有2%人類AB血清之Yssel培養基 (Gemini Bio-Products，Woodland，CA)中培養 CDllc+ DC。 在 15 ng/ml TSLP(藉由 Dr. Yun-Jun Liu，M.D. Anderson 129377.doc -113- 200846367
Cancer Center慷慨贈與之重組人類TSLP)存在下，將細胞 以每200 ml培養基2x105個細胞之密度接種於平底96孔盤 中，歷時24小時。 使用CD4+ T細胞分離套組II(Miltenyi Biotec，CA)、接著 細胞分類來分離同種異體CD4+ CD45RA+純真T細胞（純度 >99%)(作為CD4+ CD45RA+ CD45RO-CD25·部份）。將細胞 與經洗滌之TSLP刺激之骨髓樹突狀細胞（mDC)(DC/T細胞 比率：1:5)在圓底96孔培養盤中共培養7天。藉由mDC刺激 一週期（7天）後，收集且洗滌致敏CD4+ T細胞。 為偵測培養物上清液中之細胞激素產生，將T細胞用盤 結合之5 pg/ml抗CD3及1 pg/ml可溶性抗CD28以106個細胞/ 毫升之濃度再刺激48小時。藉由ELISA量測IL-5、IL-13及 TNF-α之含量。如與同型對照抗體相比，在人類化變異體 A10-F存在下經TSLP激活之骨髓DC致敏之Th2細胞中細胞 增殖及細胞激素產生受到抑制（表1 5)。
表15 增殖(CPM)土 SD IL-5 (pg/ml)土SD IL-13 (pg/ml)土SD TNF· a(pg/ml)±SD Th2 2745131 0 0 0 Th2+TSLP-DC 195546±17034 2188+560 5107±934 456+50 Th2+TSLP-DC+A10-F(0.12 μβ/πι1) 95335±13716 2109±811 1973+289 174+14 Th2+TSLP-DC+A10-F(6 μ^ιπΐ) 70750±19116 509±93 1943±68 95±8 Th2+TSLP-DC+A10-F(60 pg/ml) 56792+2993 384±133 1728+243 93+75 Th2+ TSLP-DC +IC(0.12 μ/ml) 191760±11838 32711652 534111184 543+59 Th2+ TSLP-DC +IC-F(6 pg/ml) 211124±16370 1885+281 4887±673 392±36 Th2+ TSLP-DC +IC(12 μ§/ηιΙ) 213641±14303 2261±116 5632±356 471+75 對於細胞内細胞激素產生，將經致敏之CD4+ T細胞用50 ng/ml之PMA加2 pg/ml之離子黴素（ionomycin)刺激6小時。 129377.doc -114- 200846367 在最後2小時期間，添加10 pg/ml佈雷菲德菌素A (brefeldin A)(eBioscience，San Diego，CA)。使用固定及滲 透缓衝劑（eBioscience，CA)，用針對IL-2及IL-13之PE標記 之mAb與FITC標記之抗IFN-γ或抗TNF-ot的組合對細胞染 色。如與同型對照抗體相比，在人類化變異體A10-F存在 下經TSLP激活之骨髓DC致敏之Th2細胞中IL-2、IL-13及 TNF-a細胞激素產生受到抑制（表16)。 表16
2 3 9 7 7 6 5 3 6 11 11 11 535449 IL-2 %螢光細胞 IL-13 %螢光細胞 TNF-α %螢光細胞 Th2 ΝΑ ΝΑ ΝΑ Th2+TSLP - DC 71 11 44 Th2+TSLP-DC +A10-F(0.12 pg/ml) 63 10 31 Th2+ TSLP-DC +A10-F(6，g/ml) 57 5 30 Th2+ TSLP-DC +A10-F(60 pg/ml) 57 5 28
Th2+ TSLP-DC +IC(0.12 pg/ml) Th2+ TSLP-DC +IC(6 pg/rnl) Th2+ TSLP-DC +IC(12 ug/ml) 如經膜聯蛋白染色之CD4+細胞數目減少及具有細胞内 生存素蛋白表現之CD4+細胞數目增加所示，0X40協同刺 激會增加經致敏之Th2細胞的存活。然而，將人類化變異 體A1 0-F添加至細胞培養物中會誘發細胞凋亡顯著增加及 生存素較低表現（表17)。 表17
Th2
Th2+TSLP-DC
Th2+ TSLP-DC +A10-F(0.12 pg/ml) Th2+ TSLP-DC +A10-F(6 pg/ml) Th2+ TSLP-DC +A10-F(60 Hg/ml) Th2+ TSLP-DC +IC(0.12 μδ/ιη1) Th2+ TSLP-DC +IOF(6 pg/ml) Th2+ TSLP-DC +IC(12 ug/ml) 膜聯蛋白染色(％) ΝΑ 12 4 9 5 2 2 3 4 4 4 11 11 11 生存素(％) ΝΑ 90 867670 0 6 0 9 8 9 129377.doc -115 - 200846367 D. Thl/LPS-DC方案 為分析T細胞偏向Thl概況，將純真CD4 T細胞與來源於 同種異體單核細胞之經LPS刺激之DC共培養24小時。藉由 此項技術中熟知之標準方案，自人類PBMC產生DC。收集 低密度卩81^1(1：且使用€014微珠粒及八111:〇1^〇8設備（]^1川©11}^ Biotec，Auburn，CA)陽性選擇CD14+細胞。為誘發DC分 化，於37°C、5% C02下在完全培養基（rpmI-10% FBS)、 500 IU/ml人類 rGM-CSF(R & D Systems，MN)及 400 IU / ml • 人類rIL-4(R & D Systems，MN)中培養106個細胞/毫升之 CD14 +單核細胞。在第2天或第3天，DC培養物接收其他劑 量之GM_CSF及IL-4。在第5天，藉由平緩分注來收集未黏 著之 DC 且將其用 1 pg/ml 之 LPS(Sigma-Aldrich，MO)再培 養。收集LPS激活之DC，洗滌且用於致敏純真CD4 T細胞 至偏向Th-Ι之T細胞。以1:4之DC/T細胞比率在96孔盤中培 育細胞。亦測試人類化變異體A10-D及A10-F之拮抗活 性；及在LPS激活之DC存在下抑制Thl致敏之T細胞增殖及 籲 細胞激素產生的能力。如與同型對照物相比，人類化變異 體A10-D及A10-F以與嵌合（CC-A10)及小鼠（M-A10)變異 mAb相同之程度抑制IL-2、IFN-γ及TNF-α細胞激素產生及 細胞增殖（圖11)。細胞增殖及IFN1及TNF_a細胞激素產生 之抑制並非全部，此係因為LPS激活之DC可提供除0X40 以外的其他協同刺激信號。 E.交叉反應性檢定 根據公開之文獻，認為人類與小鼠0X40蛋白之間具有 129377.doc -116- 200846367 低共享同源性。與此相符，如與同型對照物（IC:2C4)相 比，ELISA平台中嵌合A10及B66未顯示針對小鼠0X40蛋 白之任何交叉反應性（表18 ) ° 表18 小鼠 0X40 Fei (ng/ml) 人類0X40 Fc丨 (ng/ml) OD450 0 3.9 62.5 250 0 3.9 62.5 250 B66 0.134 0.034 0.039 0.045 0.02 1.225 2.859 3.377 A10 0.025 0.04 0.035 0.035 0.019 1.308 2.586 2.832 IC(2C4) 0.035 0.046 0.078 0.294 0.02 0.031 0.027 0.031 抗小鼠OX40Ab 0.051 2.486 4.0 4.0 0.026 0.047 0.046 0.083 因此，在臨床前動物模型裝置中使用流式細胞儀染色來 測試抗0X40 mAb以測定其是否與猴0X40蛋白交叉反應。 使用 CD4微珠粒（Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，自怪河猴 及食蟹猴（Cynomolgus Monkey)之全部血液及人類白血球 層分離全部CD4+ T細胞。使用5 gg/ml預塗佈之抗CD3 mAb(SP34，能夠與人類及兩種猴物種恆河猴及食蟹猴CD3 蛋白交叉反應）及1 pg/ml可溶性抗CD28 mAb(CD28.2，能 夠與人類及兩種猴物種恆河猴及食蟹猴CD28蛋白交叉反 應）將經分離之CD4+ T細胞激活，歷時2天。使用與猴及人 類CD4(L200)及CD25(M-A251)蛋白交叉反應之抗體，使細 胞經受表面染色。對於0X40細胞表面表現，使用與PE接 合之人類化A10-F 0X40 mAb。資料分析顯示，A10-F易於 識別人類、恆河猴及食蟹猴之激活CD4T細胞（表19)。 表 19 _______ 所識別之激活CD4+ T-細胞％ 人類 70 食蟹猴 88 恆河猴 75 129377.doc -117- 200846367 實例8 :抗原決定基定位 使用兩種抗原決定基定位之標準方法酵母表面呈現及嵌 合分子建構，定位A10(TH)hu336F結合之0X40抗原決定 基。在酵母表面呈現中，0X40之胞外域以能夠分泌且在 酵母表面上呈現之蛋白融合形式在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中表現。0X40表現載體之隨機突變使得0X40 突變蛋白庫在酵母表面上表現。表現無法結合0X40之蛋 白（如藉由C末端標籤之存在所測定）的突變體可使用螢光 • 抗體來染色且藉由FACS分離。將突變表現質體自所救出 之酵母中分離且定序以確定哪些胺基酸殘基為A10 (TH)hu336F-OX40 結合所需。 第二種抗原決定基定位方法依賴於觀測到 A10(TH)hu336F與人類而非鼠科0X40結合。建構嵌合 0X40分子，其人類0X40區經鼠科0X40之同源區置換。嵌 合分子在哺乳動物細胞表面上表現且與榮光標記之 A10(TH)hu336F的結合藉由FACS來監測。0X40結合抗原 ^ 決定基藉由分析A10(TH)hu336F結合需要人類0X40之哪些 區來確定。 使用至多常規實驗，熟習此項技術者將識別或能夠確定 本文所述之本發明之特定實施例的多個等效物。該等等效 物意欲涵蓋於以下申請專利範圍中。 【圖式簡單說明】 圖1A描繪人類0X40 cDNA(寄存編號NM—004295)之核酸 序列。 129377.doc -118- 200846367 圖1B描繪人類〇χ4〇蛋白（寄存編號NM一0033 18)之胺基酸 序列。 圖2描緣小鼠抗0X40 mAb B66對藉由活體外激活之純真 人類CD4+ T細胞產生il-2(2A)及IL-13(2B)之抑制作用。 圖3描繪小鼠抗OX4〇 mAb B66對活體外激活之純真人類 CD4+ T細胞增殖之抑制作用。 圖4描繪嵌合抗〇χ4〇 mAb A10及B66對活體外致敏人類 Th2細胞之細胞凋亡作用。 圖5描繪嵌合抗〇χ4〇 mAb A10及B66對活體外致敏人類 Th2細胞增殖之抑制作用。空心方塊代表純真CD4 ;空心 三角形代表在對照L-細胞下之純真CD4+ ;實心三角形代 表在純真CD4 +及OX4〇L L-細胞下之B66 ;實心方塊代表在 純真CD4+及OX40L L-細胞下之2C4(IC);且實心圓代表在 純真CD4十及OX40L-L-細胞下之A10。 圖6描繪嵌合抗0X40 mAb A10及B66對藉由活體外致敏 人類Th2細胞產生IL2(6A)及IL-13(6B)之抑制作用。空心方 塊代表純真CD4 ;空心三角形代表在對照L-細胞下之純真 CD4+ ;實心三角形代表在純真CD4 +及OX40L L-細胞下之 B66 ;實心方塊代表在純真CD4+及OX40L L'細胞下之 2C4(IC);且實心圓代表在純真CD4 +及OX40L-L'細胞下之 A10。 圖7 :顯示嵌合抗0X40 mAb B66及商業抗0X40 mAb L106對藉由活體外激活之純真人類CD4+ T細胞產生IL-2及 IL-13之抑制作用之比較的表。 129377.doc -119- 200846367 圖8 :顯示人類化、嵌合及小鼠抗0X40 mAb A10對活體 外激活之純真人類CD4+ τ細胞之增殖以及其產生IL_2、 IL-5及IL-13之抑制作用的表。 圖9 ·顯不人類化、嵌合及小鼠抗0X40 mAb A10對活體 外致敏人類Thi細胞之增殖以及其產生^、IL 5&IL_13 之抑制作用的表。 圖10 ··顯示人類化、嵌合及小鼠抗〇X40 mAb A10對活 體外致敏人類Th2細胞之增殖以及其產生IL_2、IL_5& IL_ 13之抑制作用的表。 圖11 :顯示使用同種異體TSLP激活之骨髓樹突狀細 胞’人類化、嵌合及小鼠抗〇X4〇 mAb A10對活體外致敏 人類Th2細胞之增殖以及其產生比_2、IL-5及IL-13之抑制 作用的表。 圖12A描繪如與人類模板IGKV4-1/IGKJ1相比，鼠科抗 體A10及B66之可變輕鏈胺基酸序列及所得Ai〇(TH)hu336F 人類化序列。上標數字表明根據Kabat之胺基酸位置。 圖12B描繪如與人類模板^Ηνΐ·46/Ι〇ΗΜ相比，鼠科抗 體Α10之可變重鏈胺基酸序列及所得A1〇(TH)hu336F人類 化序列。上標數字表明根據Kabat之胺基酸位置。 圖13描繪如與親本鼠科抗體Α10(·)及其嵌合形式（▲)相 比，人類化純系A10(TH)hn336F(·)之較高結合活性。 圖14描繪鼠科及人類化抗0X40可變區之核酸序列：A) 輕鏈κ可變252-A10 ; B)輕鏈κ可變252-B66 ; C)人類化輕鏈 可變Al〇(SN)、全抗體B及E ; D)人類化輕鏈可變 129377.doc -120- 200846367 A10(SH)、全抗體A及D ; E)人類化輕鏈可變A10(TH)liu336、 全抗體C及F ; F)重鏈可變252-A10 ; G)重鏈可變 Α10(ΊΓΗ)1ηι336、全抗體D-F ; Η)重鏈可變 A10 L70、全抗 體 A-C 〇 圖15顯示人類化純系A10(TH)hu336F(_)、鼠科Α10(·)及 其嵌合形式（▲)完全同等競爭0X40。 圖16Α、Β及17Α、Β描繪用於實施本發明之具有如下序 列標識符之例示性受體人類一致構架序列： 可變重鏈（VH) —致構架（圖16Α、Β);人類VH亞群I 一致 構架減去Kabat CDR(SEQ ID ΝΟ:30);人類VH亞群I一致構 架減去擴展之高變區（SEQ ID NO:31-33);人類VH亞群II 一致構架減去Kabat CDR(SEQ ID NO:34);人類VH亞群II 一致構架減去擴展之高變區（SEQ ID NO:35-37);人類VH 亞群II 一致構架減去擴展之人類VH亞群III 一致構架減去 Kabat CDR(SEQ ID NO:3 8);人類VH亞群III一致構架減去 擴展之高變區（SEQ ID NO:39-41);人類VH受體構架減去 Kabat CDR(SEQ ID ΝΟ··42);人類VH受體構架減去擴展之 高變區（SEQ ID NO:43-44);人類VH受體2構架減去Kabat CDR(SEQ ID NO:45);人類VH受體2構架減去擴展之高變 區（SEQ ID ΝΟ··46-48);可變輕鏈（VL)—致構架（圖17A、 Β);人類VL κ亞群I一致構架（SEQ ID NO:49);人類VL κ 亞群II 一致構架（SEQ ID NO:50);人類VL κ亞群III 一致構 架（SEQ ID NO:51);人類 VL κ亞群 IV— 致構架（SEQ ID NO:52)。 129377.doc -121 - 200846367 圖18描繪huMAb4D5-8輕鍵及重鍵之構架區序列。上標/ 粗體數字表明根據Kabat之胺基酸位置。 圖19描繪huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之修飾/變異構架區序 列。上標/粗體數字表明根據Kabat之胺基酸位置。
129377.doc -122-

Claims (1)

  1. 200846367 十、申請專利範圍： 1 · 一種分離之拮抗劑抗體，其與人類0X40抗原決定基 (epitope)特異性結合，該抗體包含： a. 重鏈可變區（VH)，其包含： i. 具有胺基酸序列SEQ ID N0:17之VH CDR1 ; ϋ. 具有胺基酸序列8£()10^0:18之¥11€0112;及/或 iii. 具有胺基酸序列SEQIDNO:19之VHCDR3;及/或 b. 輕鏈可變區（VL)，其包含： φ i. 具有胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··12、15或61之VL CDR1 ； ii· 具有胺基酸序列SEQ ID NO:13之VL CDR2 ;及/或 iii. 具有胺基酸序列SEQIDNO:14或16之VLCDR3。 2.如請求項1之抗體，其中該抗體包含： a·重鏈可變區（VH)，其包含： i. 具有胺基酸序列SEQ ID N0:17之VH CDR1 ; ii. 具有胺基酸序列8£()1〇1^〇:18之¥110〇112;及 • iii.具有胺基酸序列8£〇10 1^0:19之¥11€0113;及/或 b.輕鏈可變區（VL)，其包含： i. 具有胺基酸序列SEQIDN0:12之VLCDR1; ii. 具有胺基酸序列8£卩10>10:13之¥1^€0112;及 iii. 具有胺基酸序列8£卩10 1^0:14之¥1^€0113。 3·如請求項1之抗體，其中該抗體包含： a·重鏈可變區（VH)，其包含： 1. 具有胺基酸序列SEQ ID N0:17之VH CDR1 ; 129377.doc 200846367 ii. 具有胺基酸序列SEQ ID NO:18之VH CDR2 ;及 iii. 具有胺基酸序列SEQ ID NO:19之VH CDR3 ;及/或 b.輕鏈可變區（VL)，其包含： 1. 具有胺基酸序列SEQ ID NChl2之VL CDR1 ; ii. 具有胺基列SEQ ID NChl3之VL CDR2 ;及 iii. 具有胺基酸序酸序列SEQ ID NO:16之VL CDR3。 4. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含： a. 重鏈可變區（VH)，其包含： • i. 具有胺基酸序列SEQIDN0:17之VHCDR1; ii. 具有胺基酸序列SEQIDNO··18之VHCDR2;及 iii. 具有胺基酸序列SEQ ID NO:19之VH CDR3 ;及/或 b, 輕鏈可變區（VL)，其包含： i. 具有胺基酸序列SEQ ID NO:15之VL CDR1 ; ii. 具有胺基酸序列8£〇10>10:13之¥1^〇0112;及 iii. 具有胺基酸序列SEQ ID NO:14之VL CDR3。 5. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含： ® a,重鏈可變區(VH)，其包含： i. 具有胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··17之VH CDR1 ; ii. 具有胺基酸序列SEQ ID NO:18之VH CDR2 ;及 iii. 具有胺基酸序列SEQ ID NO:19之VH CDR3 ;及/或 b.輕鏈可變區（VL)，其包含： i. 具有胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··15之VL CDR1 ; ii. 具有胺基酸序列SEQ ID NO:13之VL CDR2 ;及 具有胺基酸序列8丑(^10 1^0:16之〜乙00113。 129377.doc 200846367 6·如請求項1之抗體，其中該抗體包含： a·具有SEQ ID ΝΟ:10或11中之任一者所示胺基酸序列 的重鏈可變區（VH);及/或 b·具有SEQ ID ΝΟ:7、8或9中之任一者所示胺基酸序 列的輕鏈可變區（VL)。 7·如請求項1之抗體，其中該抗體包含： a·由核酸序列SEQ ID ΝΟ:25、26或27中之任一者所編 碼之重鏈可變區（VH);及/或 • b·由核酸序列SEQ ID NO20、21、22、23或24中之任 一者所編碼之輕鏈可變區（VL)。 8·如請求項6之抗體，其中該抗體包含： a·具有SEQ ID NO: 10中所示胺基酸序列的VH及具有 SEQIDNO:7或8中之任一者所示胺基酸序列的VL;或 b. 具有SEQ ID ΝΟ:11中所示胺基酸序列的VH及具有 SEQ ID ΝΟ··9中所示胺基酸序列的VL。 9. 如請求項7之抗體，其中該抗體包含： a·由核酸序列SEQ ID NOJ5所編碼之VH及由核酸序列 8丑〇10 1^0:20或21所編碼之¥1^; b·由核酸序列SEQ ID ΝΟ··26所編碼之VH及由核酸序列 SEQ ID ΝΟ··22、23 或 24所編碼之VL ;或 c. 由核酸序列SEQ ID ΝΟ:27所編碼之VH及由核酸序列 SEQ ID ΝΟ:22、23 或24所編碼之 VL。 10. 如請求項8之抗體，其中該VH包含SEQ ID ΝΟΗΟ中所示 之胺基酸序列且該VL包含SEQ ID ΝΟ··7中所示之胺基酸 129377.doc 200846367 序列。 Π·如請求項8之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO:1〇中所示 之胺基酸序列且該VL包含SEQ ID N〇:8中所示之胺基酸 序列。 12.如請求項8之抗體，其中該vh包含SEQ ID ΝΟ:11中所示 之胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO:9中所示之胺基酸 序列。 13·如請求項1、2、3、4、5、6、7、8或9之抗體，其進一 步包含恆定區。 14·如請求項13之抗體，其進一步包含抗體恆定區，該抗體 恨定區包含CHI、CH2或CH3域。 15·如請求項14之抗體，其中該恆定區係來自IgG抗體。 16,如請求項15之抗體，其中該IgG抗體為IgG1抗體、IgG2 抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。 17·如晴求項1、2、3、4、5、6、7、8或9之抗體，其中該 抗體為人類抗體。 18·如請求項i、2、3、4、5、6、7、8或9之抗體，其中該 抗體為嵌合抗體、人類化抗體、單株抗體或重組抗體。 19·如請求項1、2、3、4、5、6、7、8或9之抗體，其中該 抗體為Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、單鏈Fv、單鏈抗體、二 硫化物連接之Fv、單域抗體、抗原結合片段、雙功能抗 體（diabody)、三功能抗體（triabody)或微型抗體（minibo-dy)。 2 0.如睛求項1、2、3、4、5、6、7、8或9之抗體，其進〆 129377.doc 200846367 步包含標記。 儿如請求項^^〜^卜卜❻仏抗體其進一 步包含細胞毒素或免疫毒素。 22. —種分離之核酸分子，其包含編碼如請求項}之抗體之 核皆酸序列。 23. —種載體，其包含如請求項22之核酸分子。 24· —種宿主細胞，其包含如請求項23之載體。 25· —種組合物，其包含如請求項j、2、3、$、$、6、7、8 或9之抗體以及生理學上可接香夕哉 予工」接又之載劑、稀釋劑、賦形 劑及穩定劑中之至少一者。 26. —種治療患者〇χ_40所介導之病症之方法，其包含向該 患者投與有效量之如請求項！、2、3、4、5、6、7、8或 9甲任-項之抗體’其中該抗體阻斷收飢與似4〇之結 合及/或抑制一或多種與〇χ飢及〇χ4〇結合有關之功 厶匕 Λ 月6 D 27. 如請求項26之方法，其中該〇χ4()所介導之病症為發炎或 自體免疫疾病。 28. 如請求項27之方法，苴φ呤成产从 八中。亥疾病為過敏症、哮喘或與自 體免疫及發炎有關之疾病諸如 闲濤如多發性硬化症、類風濕 性關節炎、發炎性腸病、移栢 移植物抗佰主疾病、實驗性自 體免疫性腦脊髓炎（EaE)、自护 ’目體免疫性神經病、自體免 疫性葡萄膜炎、自體免疫性滚 又注/合血性負血、自體免疫性血 小板減少、重症肌無力、實 貝驗险利什曼病（experimental leishmaniasis)、膠原蛋白讀 篇^〖生關郎炎、結腸炎（諸如潰 129377.doc 200846367 瘍性結腸炎）、接觸性過敏性反應、糖尿病、克羅恩氏病 (Crohn’s Disease)、格雷氏病（Grave’s Disease)、肉狀瘤 病、惡性貧血、顳動脈炎、抗磷脂症候群、血管炎（諸如 韋格納肉芽腫（Wegener’s granulomatosis))、貝西氏病 (Behcet’s disease)、疱疹樣皮炎、尋常天疱瘡、白斑 病、原發性膽汁性肝硬化、自體免疫性肝炎、橋本氏 (Hashimoto’s)甲狀腺炎、自體免疫性***及***、 腎上腺之自體免疫疾病、全身性紅斑狼瘡、硬皮病、皮 ⑩ 肌炎、多發性肌炎、皮肌炎、脊椎關節病（諸如強直性脊 椎炎）、萊特氏症候群（Reiter’s Syndrome)或修格蘭氏症 候群（Sjogren’s syndrome)。 29·如請求項27之方法，其中該疾病為過敏症、哮喘或與自 體免疫及發炎有關之疾病，諸如多發性硬化症、類風濕 性關節炎、發炎性腸病、移植物抗宿主疾病、實驗性自 體免疫性腦脊髓炎（EAE)、實驗性利什曼病、膠原蛋白 鲁 誘發性關節炎、結腸炎（諸如潰瘍性結腸炎）、接觸性過 敏性反應、糖尿病、克羅恩氏病或格雷氏病。 30. 如請求項26之方法，其中該抗體投與該患者經由一或多 種途徑，包括靜脈内、腹膜内、吸入、肌肉内、皮下及 經口途徑。 31. —種藉由抑制患者之IgE抗體產生來治療病症之方法， 其包含向該患者投與有效量之如請求項丨、2、3、4、 5、6、7、8或9中任一項之抗體。 32. 如請求項31之方法，其中該病症為支氣管氣喘、過敏性 129377.doc 200846367 鼻炎、過敏性皮炎、過敏反應、蓴痲疹或異位性皮炎。 3 3 · —種用於減輕哺乳動物哮喘嚴重程度之方法，其包含向 该哺乳動物投與有效量之如請求項1、2、3、4、5、6、 7、8或9中任一項之抗體，其中該抗體包含至少一種以 下f生貝·（a)以約1x10 10 μ至約ΐχι〇]2 M之間的Kd與人類 0X40結合；（b)抑制一或多種與結合〇χ4〇有關之功能； 及（c)抑制OX40L與0X40之結合。
    34.如明求項33之方法，其中該抗體以約1χ1〇-η至約ΐχι〇-η M ixio 至約1\1〇10]^、ΐχίο·1。至約 1χ1〇·9Μ、1χ1〇-9 至、力1x10 Μ、或ΙχΙΟ 8至約1χ1〇-7 Μ之間的Kd與人類 0X40結合。 種產生抗體之方法，#包含如請求項24之細胞在適於 產生该抗體之情況下培養及分離該抗體。 36. —種融合瘤，其產生如請求項〗、2、345 m 或9之抗體。 6、7、8或9中任一項之 η 、 3 7 · —種如請求項丨、2 抗體之用途，其係用於製備藥劑 38. -種如請求項^、^、^、卜⑻中任—項之 抗體之用途，其係用於治療〇χ4〇相關疾病或病症。、 认如請求項38之用途，其中該疾病為過敏症、哮喘或與自 發炎有關之疾病，諸如多發性硬化症、類風濕 關即火、魚炎性腸病、移植物抗宿主疾病、實驗性自 體免疫性腦脊髓炎(ΕΑΕ)、自體免疫性神經病 疫性葡萄膜炎、自體m容血性貧血、自體免疫性血 129377.doc 200846367 小板減少、重症肌無力、實驗性利什曼病、膠原蛋白誘 發性關節炎、結腸炎（諸如潰瘍性結腸炎）、接觸性過敏 性反應、糖尿病、克羅恩氏病、格雷氏病、肉狀瘤病、 惡性貧血、顳動脈炎、抗磷脂症候群、血管炎（諸如韋柊 納肉芽腫）、貝西氏病、疱疹樣皮炎、尋常天疱瘡、2 =
    病、原發性膽汁性肝硬化、自體免疫性肝炎、橋本氏曱 狀腺炎、自體免疫性_巢炎及***、腎上腺之自體免 疫疾病、全身性紅斑狼瘡、硬皮病、皮肌炎、多發性肌 炎、皮肌炎、脊椎關節病（諸如強直性脊椎炎）、萊特氏 症候群或修格蘭氏症候群。 、
    40.如請求項39之用途，其中該疾病為過敏症、哮喘或與自 體免疫及發炎有關之疾病’諸如多發性硬化症、類咸渴 性關節炎、發炎性腸病、移植物抗宿主疾病、實驗性自 體免疫性腦脊髄炎_)、實驗性利什曼病、膠原蛋白 誘發性關節炎、結腸炎(諸如潰癌性結腸炎)、接觸性過 敏性反應、糖尿病或克羅恩氏病。 41 · 一種如請求項1、2、3、4 途，其係用於偵測0X40。 6、7、δ或9之抗體之用 42· —種用於偵測樣品中之〇χ4〇之方法 如請求項20之抗體接觸。 其包含使該樣品與 43. 一種套組，其包含預定量之如請求項丨、2 6、7、8或9之抗體在一容器中 中0 以及緩衝劑 、3、4、5、 在另一容器 44· 一種套組， 其包含預定量之如請求項 25之組合物在一容 129377.doc 200846367 器中以及緩衝劑在另一容器中。 45. —種醫學裝置，其包含如請求項1、2、3、 7、8或9之抗體。 46·如請求項45之醫學裝置，其為一種吸入裝置。 47. —種醫學裝置，其包含如請求項25之組合物。 48. 如請求項47之醫學裝置，其為一種吸入裝置。
    129377.doc
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