CN101668776A - 拮抗剂ox40抗体及其在炎性和自身免疫疾病的治疗中的用途 - Google Patents

拮抗剂ox40抗体及其在炎性和自身免疫疾病的治疗中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101668776A
CN101668776A CN200880013914A CN200880013914A CN101668776A CN 101668776 A CN101668776 A CN 101668776A CN 200880013914 A CN200880013914 A CN 200880013914A CN 200880013914 A CN200880013914 A CN 200880013914A CN 101668776 A CN101668776 A CN 101668776A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cell
seq
xaa
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880013914A
Other languages
English (en)
Inventor
萨拉赫-艾迪尼·拉姆哈迈迪-谢拉蒂
姚政彬
桑贾耶·辛格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39620235&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101668776(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of CN101668776A publication Critical patent/CN101668776A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及针对人OX40受体(CD134)的拮抗剂抗体及其片段，包括拮抗剂抗体的氨基酸序列以及编码该抗体的核酸。本发明还包括由所述抗体的轻链和/或重链可变区衍生的抗原结合区(CDR)。本发明的另一方面是抗－OX40拮抗剂抗体在炎性和自身免疫疾病的治疗中的用途。本发明还涉及拮抗剂抗体A10的人源化序列以及该抗体的结合位点的表位定位。

Description

拮抗剂OX40抗体及其在炎性和自身免疫疾病的治疗中的用途
1.技术领域
本发明提供了免疫特异性结合人OX40多肽、OX40多肽片段或OX40表位的抗体。本发明还涉及免疫特异性结合人OX40多肽、OX40多肽片段或OX40表位的人源化抗体。本发明还提供了编码免疫特异性结合OX40多肽、OX40多肽片段或OX40表位的抗体的分离核酸。本发明进一步提供了包含编码免疫特异性结合人OX40多肽、OX40多肽片段或OX40表位的抗体的核酸的载体和宿主细胞，以及制备该抗体的方法。还提供了使用本发明提供的抗-OX40抗体抑制OX40生物活性和/或治疗或预防OX-40介导的疾病的方法。
2.背景技术
我们的免疫***帮助我们的身体防御外来病原体，这是一项需要对外源物质的免疫激活和对自身组织的耐受之间进行平衡的功能。由病毒性病原体等引起的急性感染可导致两种类型的长期记忆：体液免疫，其中B-淋巴细胞(B-细胞)生成抗体以预防这些外来病原体引起的感染；以及细胞免疫，其中由特定抗原激活的T-淋巴细胞(T-细胞)杀死被感染的细胞，还可生成细胞因子。T-细胞主要在细胞-介导的免疫中发挥作用，并包含了约70％的淋巴细胞。T-细胞中大部分为CD4+“协助者”T-细胞，并主要参与B-细胞核巨噬细胞的激活。CD8+T-细胞或细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)参与细胞-介导的细胞毒性反应，并包含了约35％的T-细胞群。T-细胞可被分为三个不同的群：初始细胞、效应细胞和记忆细胞。初始T-细胞在抗原存在下被激活并成为效应细胞。主要组织相容性复合体I类(I类MHC)分子通过将入侵病原体的抗原“呈递”给T-细胞受体而在该效应应答中发挥主要的作用，该T-细胞受体进而识别并攻击所述病原体。
许多受体-配体相互作用参与到针对外来抗原的免疫应答的诱导、建立和调节中。至少两种信号是激活CD4+或CD8+T细胞对抗原的应答所必需的。第一种信号通过与抗原呈递细胞(APC)表面上的主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子结合的抗原经由T-细胞受体(TCR)传递。第二种信号涉及该APC表面上存在的配体与该T-细胞表面上的第二受体分子的结合。该第二信号被称为共刺激，且该APC配体常被称为共刺激分子(Lenschow等人，Annu Rev Immunol 14：233(1996))。共刺激信号分子包括免疫球蛋白超家族成员、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员以及细胞因子受体(参见综述Croft，Cytokine Growth Factor Rev 14：265(2003)；Kroczek等人，J Allergy ClinImmunol 116：906(2005))。这两种信号的组合激活T-细胞，该T-细胞随后分泌细胞因子并增殖。
共刺激分子的一个例子是OX40受体(CD 134)，它是TNFR超家族的一个成员，其与细胞膜结合并主要在激活的CD4+T-细胞上(即，在发炎位点)表达(Paterson等人，Mol Immunol 24：1281(1987))。OX40的配体(OX40L)是属于TNF家族的II型膜蛋白，并在抗原-呈递细胞(例如激活的B细胞、树突细胞以及内皮细胞)上表达(Stuber等人，Immunity 2：507(1995)；Weinberg等人，JImmunol 162：1818(1999)；Nohara等人，J Immunol 166：2108(2001)；Malmstrom等人，J Immunol 166：6972(2001))。通过OX40受体(以下称为“OX40)进行的信号转导是对效应T-细胞的共刺激，并引起了T-细胞的增殖(Weinberg，JImmunol 152：4712(1994)；参见综述Watts，Annu Rev Immunol 23：23(2005))。对OX40的研究暗示其主要的作用在于决定初次免疫反应中积累的效应T-细胞的数量，进而决定随后发育和存活的记忆T-细胞的数量(参见综述Croft，Cytokine Growth Factor Rev 14：265(2003))。
若干体外研究显示OX40提供了可导致增加的T-细胞增殖和细胞因子生成的共刺激信号(Baum PR等人，EMBO J，1994；Akiba H等人，Biochem.Biophysic Res，1998)。已经提示，在某些情况下，OX40/OX40L相互作用可在Th2细胞发育中具有优先作用(Ohshima等人，Blood 92：3338(1998)；Flynn等人，J Exp Med 188：297(1998))。当免疫激活过量或不受控制时，可发生病理性过敏、哮喘、炎症、自身免疫以及其它相关的疾病。在这些情况中，T-细胞的激活和分化具有重要的作用。由于OX40可增强免疫应答，它可加剧自身免疫和炎性疾病。OX40-OX40L相互作用已经与多种疾病模型的发病机理相关联。大量的证据暗示OX40-OX40L相互作用在过敏、哮喘以及与自身免疫和炎症相关的疾病中具有重要作用，该疾病包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性利什曼病、胶原诱导的关节炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病、克隆氏病和Grave病(Arestides等人，Eur J Immunol32：2874(2002)；Jember等人，J Exp Med 193：387(2001)；Kroczek等人，J AllergyClin Immunol 116：906(2005)；Pakala等人，Eur J Immunol 34：3039(2004)；Xiaoyan等人，CHn Exp Immunol 143：110(2006)；Weinberg等人，J Immunol152：4712(1994)；Weinberg等人，Nat Med 2：183(1996)；Malstrom等人，JImmunol 166：6972(2001)；Higgins等人，J Immunol 162：486(1999)；Akiba等人，J Exp Med 191：375(2000)；Stuber等人，Gastroenterology 115：1205(1998)；Tsukada等人，Blood 95：2434(2000)；Yoshioka等人，Eur J Immunol 30：2815(2000)；Stuber等人，Eur J Clin Invest 30：594(2000)；Bossowski等人，J PediatrEndocrinol Metab 18：1365(2005)；参见综述Watts，Annu Rev Immunol 23：23(2005))。
目前针对自身免疫和炎性疾病的疗法包括长期单独施用类固醇或将类固醇与细胞毒性药物和/或生物药物联用。针对TNF-α的抗体目前已被用于多种疾病，包括类风湿性关节炎、克隆氏病和炎性肠道疾病。此外，在临床评估中采用的一种新型实验疗法是针对类风湿性关节炎的融合蛋白CTLA4-Ig(可溶形式的细胞毒性T淋巴细胞相关联的抗原-4)。尽管具有这些选择，多数免疫抑制性疗法会引起严重的副作用，包括患者的免疫低下(immunocompromised)状态。理想情况下，对T-细胞-介导的疾病的治疗将靶向引起疾病的[抗原特异性]细胞，但不伤害其余T-细胞群体(Weinberg，TrendsImmunol 23：102(2002))。因此，对于自身免疫和炎性疾病的替代性疗法存在着强烈的需求。
除了这些方法外，已经开发了多种激动剂抗-OX40抗体，其可刺激受体以增加T-细胞群体。最先公开的抗-OX40单克隆抗体(mAb)，MRC OX-40，是一种小鼠抗体，其将受体识别为激活的大鼠CD4+T-细胞上的细胞表面抗原(Paterson等人，Mol Immunol 24：1281(1987))。该抗体在刺激T-细胞增殖的测定具有最轻微的作用。自此以后，已经生成了多种激动剂抗-OX40 mAb，并将其用于增强免疫应答(Weatherill等人，Cell Immunol 209：63(2001)；Banal-Pakala等人，Nat Med 7：907(2001)；De Smedt等人，J Immunol 168：661(2002)；Pan等人，Mol Ther 6：528(2002)；Curti等人，Blood 101：568(2003)；Nakae等人，Proc Natl Acad Sci USA 100：5986(2003)；Lustgarten等人，Eur J Immunol34：752(2004)；So等人，J Immunol 172：4292(2004)；Koga等人，Cancer Sci95：411(2004)；Lanthrop等人，J Immunol 172：6735(2004)；Polymenidou等人，Proc Natl Acad Sci USA 101 Suppl 2：14670(2004)；Lustgarten等人，J Immunol173：4510(2004)；Valzasina等人，Blood 105：2845(2005)；Cuadros等人，Int JCancer 116：934(2005)；Sharma等人，Exp Gerontol 41：78(2006))。然而，在前述的自身免疫和炎性疾病中，刺激T-细胞群体并非所希望的结果。
一种疗法是通过使用抗-OX40L抗体阻断OX40-OX40L信号转导。已生成一系列靶向OX40L的mAb，并进行测试以阐释OX40信号转导途径、它对其它途径的作用以及OX40在各种疾病中的作用(例如参见，Blazar等人，Blood101：3741(2003)；Ukyo等人，Immunology 109：226(2003)；Wang等人，TissueAntigens 64：566(2004)；Chou等人，J Immunol 174：436(2005))。其它抑制OX40信号的方法包括抗-OX40免疫毒素、OX40-IgG融合蛋白以及OX40脂质体的使用(Weinberg等人，Nat Med 2：193(1996)；Higgins等人，J Immunol 162：486(1999)；Satake等人，Biochem Biophys Res Commun 270：1041(2000)；Taylor等人，J Leukoc Biol 72：522(2002)；Boot等人，Arthritis Res Ther 7：R604(2005))。
靶向该配体的替代方法是开发针对OX40受体(CD 134)的疗法。人们已经尝试生成拮抗剂抗-OX40抗体。Stuber及其同事使用了多克隆兔抗-小鼠OX40抗体来抑制OX40和OX40L之间的相互作用(J Exp Med 183：979(1996))。Imura等人生成了抗-小鼠OX40抗体131和315，其抑制CD4+T-细胞与血管内皮细胞的粘附以及T-细胞的增殖(OX40途径介导的过程)。由Weinberg披露的抗-人OX40抗体显示了耗尽激活CD4+T-细胞的能力；然而，它依赖于抗体与毒性分子(例如蓖麻毒素-A链)的偶联(美国专利5,759,546)。披露的其它抗-OX抗体不具有功能活性，例如市售的L106。
因此，对于能够干扰OX40途径的靶向人OX40的真正功能性的拮抗剂抗体存在着需求。该种抗体将会有潜力治疗许多目前存在大量未满足的需求的疾病。本发明解决了这些未满足的医学需求。
3.发明综述
一方面，本发明涉及针对人OX40受体(CD 134)的拮抗剂抗体及其片段。另一个实施方案包括了拮抗剂抗体的氨基酸序列以及编码该抗体的核酸。
本发明还包括由所述抗体的轻链和/或重链可变区衍生的抗原结合区(CDR)。本发明的抗体可以是重组抗体。本发明的抗体可以是单克隆抗体，而单克隆抗体可以是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
本发明包括了包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的抗体，该VH包含：具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2、和/或具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VHCDR3；该VL包含：具有SEQ ID NO：12、15或61的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2、和/或具有SEQ ID NO：14或16的氨基酸序列的VL CDR3。在实施方案中，该抗体包含了具有选自SEQ IDNO：17、18或19的氨基酸序列的两个VH CDR和/或具有选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16或61的氨基酸序列的两个VL CDR。
本发明包括了包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的抗体，该VH包含：具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2、和具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VHCDR3；该VL包含：具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2、和具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VL CDR3。
本发明包括了包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的抗体，该VH包含：具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2、和具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VHCDR3；该VL包含：具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2、和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL CDR3。
本发明包括了包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的抗体，该VH包含：具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2、和具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VHCDR3；该VL包含：具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2、和具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VL CDR3。
本发明包括了包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的抗体，该VH包含：具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2、和具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VHCDR3；该VL包含：具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2；和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL CDR3。
本发明包括了抗体，该抗体包含：具有SEQ ID NO：10或11任意一个所示氨基酸序列的重链可变区(VH)和/或SEQ ID NO：7、8或9任意一个所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
本发明包括了抗体，该抗体包含了由SEQ ID NO：25、26或27任意一个核酸序列编码的重链可变区(VH)；和/或由SEQ ID NO：20、21、22、23或24任意一个核酸序列编码的轻链可变区(VL)。
本发明包括了抗体，该抗体包含了具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：7或8任意一个所示氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO：11所示氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：9所示的VL；由SEQ IDNO：25的核酸序列编码的VH和由SEQ ID NO：20或21的核酸序列编码的VL；由SEQ ID NO：26的核酸序列编码的VH和由SEQ ID NO：22、23或24的核酸序列编码的VL；或者由SEQ ID NO：27的核酸序列编码的VH和由SEQID NO：22、23或24的核酸序列编码的VL。
本发明包括了抗体，其中该VH包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，且该VL包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
本发明包括了抗体，其中该VH包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，且该VL包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
本发明包括了抗体，其中该VH包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，且该VL包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
本发明包括了抗体，其中该VH由在严格条件下与编码SEQ ID NO：10、11、17、18或19的氨基酸序列的核苷酸序列的补体杂交的核苷酸序列所编码；和/或VL由在严格条件下与编码SEQ ID NO：7、8、9、12、13、14、15、16或61的氨基酸序列的核苷酸序列的补体杂交的核苷酸序列所编码。
本发明包括了抗体，其中该VH由在严格条件下与SEQ ID NO：25、26或27任意一个所示的核苷酸序列的补体杂交的核苷酸序列所编码；和/或VL由在严格条件下与SEQ ID NO：20、21、22、23或24任意一个所示的核苷酸序列的补体杂交的核苷酸序列所编码。
本发明包括了分离的拮抗剂抗体，该抗体以介于约1×10-12至约1×10-11M、1×10-11至约1×10-10M、1×10-10至约1×10-9M、1×10-9至约1×10-8M、1×10-8至约1×10-7M的解离常数与人OX40表位特异性地结合。
本发明包括了与SEQ ID NO：7所示序列具有至少95％序列一致性的VL序列，以及与SEQ ID NO：10所示序列具有至少95％序列一致性的VH序列。
本发明包括了与SEQ ID NO：8所示序列具有至少95％序列一致性的VL序列，以及与SEQ ID NO：10所示序列具有至少95％序列一致性的VH序列。
本发明包括了与SEQ ID NO：9所示序列具有至少95％序列一致性的VL序列，以及与SEQ ID NO：11所示序列具有至少95％序列一致性的VH序列。
本发明还包括了抗体分子，其包含了包含SEQ ID NO：17(CDR-H1)、SEQID NO：18(CDR-H2)和SEQ ID NO：19(CDR-H3)的重链可变区和/或包含SEQID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：61(CDR-L1)；SEQ ID NO：13(CDR-L2)；和SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16(CDR-L3)的轻链可变区。
本发明包括了本发明抗体的人抗原-结合抗体片段，包括，但不限于，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)或微抗体。本发明还包括了包含VL或VH结构域的单结构域抗体。
本发明包括了单克隆抗体A10(TH)hu336F及其变体的人源化序列。编码这些变体的核酸包括SEQ ID NO 20-27。A10(TH)hu336F包含了包含SEQ IDNO：9的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的重链可变区。该重链可变区可进一步包含恒定区的CH1、CH2和CH3结构域中的至少一个结构域。该重链恒定区可以是IgG抗体，其中该IgG抗体为IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
只要基本保持对OX40的结合活性，本发明的抗体可包含任意合适的框架可变结构域序列。例如，在部分实施方案中，本发明的抗体包含了人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，该框架共有序列包含了在位置71、73和/78上的取代。在这些抗体的部分实施方案中，位置71为A、73为T和/或78为A。在一个实施方案中，这些抗体包含了huMAb4D5-8的重链可变结构域框架序列(
Figure A20088001391400211
Genentech，Inc.，South SanFrancisco，CA，USA)(还可参见美国专利6,407,213和5,821,337，以及Lee等人，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93)。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含了人κI轻链框架共有序列。在一个实施方案中，该抗体包含了图12B(IGHV1-46序列)中所示的亚组V1的IGHV1-46(Gene Bank录入号X92343)以及胚系IGHJ4(Gene Bank录入号J00256)的组合。在一个实施方案中，该框架序列包含了在位置69的取代。在部分实施方案中，该位置69为L。为VL链选择的人模板为图12A(IGKV4-1序列)中所示的IGKV4-1(Gene Bank录入号Z00023)以及胚系J模板IGHJ1(Gene Bank录入号J00242)的组合。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含了重链可变结构域，其中框架序列包含了SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和/或48的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含了轻链可变结构域，其中框架序列包含了SEQ ID NO：49、50、51和/或52的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含了重链可变结构域，其中框架序列包含了SEQ ID NO：57、58、59和/或60的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含了轻链可变结构域，其中框架序列包含了SEQ ID NO：53、54、55和/或60的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含了重链可变结构域，其中框架序列包含了SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和/或48的序列，且HVR H1、H2和H3序列分别为SEQ ID NO：17、18和/或19。在一个实施方案中，本发明的抗体包含了轻链可变结构域，其中框架序列包含了SEQ ID NO：49、50、51和/或52的序列，且HVR L1、L2和L3序列分别为SEQ ID NO：12、13和/或16。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含了重链可变结构域，其中框架序列包含了SEQ ID NO：57、58、59和/或60的序列，且HVR H1、H2和H3序列分别为SEQ ID NO：17、18和/或19。在一个实施方案中，本发明的抗体包含了轻链可变结构域，其中框架序列包含了SEQ ID NO：53、54、55和/或56的序列，且HVR L1、L2和L3序列分别为SEQ ID NO：12、13和/或16。
本发明包括了进一步包含了可检测标签的抗-OX40抗体。本发明进一步包括了在体内或样本中检测OX40的方法。该方法包括了将OX40抗体与个体或与从该个体获得的样本相接触。
本发明包括了进一步包含标记物的抗体。
本发明包括了进一步包含了细胞毒素或免疫毒素的上述抗-OX40抗体及其在治疗下述疾病或病症中的用途。
本发明还包括了与抗体A10(TH)hu336F结合相同表位的抗体。
本发明包括了分离的核酸分子，其包含了编码本发明的抗体的核苷酸序列。
本发明包括了包含本发明的核酸分子的载体。
本发明包括了包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明包括了生成本发明的抗体的杂交瘤。
本发明包括了编码本发明的抗体的分离的核酸分子，其中核苷酸序列包含了SEQ ID NO：20、21、22、23或24中的任意一个。
本发明包括了编码本发明的抗体的分离的核酸分子，该抗体包含SEQ IDNO：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19的氨基酸序列。
本发明包括了分离的核酸分子，其包含了编码如下区域的核酸序列：具有SEQ ID NO：10、11、17、18或19中任意一个所示的氨基酸序列或由SEQID NO：25、26或27的核酸序列编码的重链可变区(VH)；或具有SEQ ID NO：7、8、9、12、13、14、15或16中任意一个所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：20、21、22、23或24的核酸序列编码的轻链可变区(VL)。
本发明包括了组合物，其包含了本发明所主张的抗体，以及生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂。
本发明包括了生产本发明主张的抗体的方法，该方法包括在适于该抗体生成的条件下培养本发明的细胞，并分离该抗体。
本发明的另一方面是抗-OX40拮抗剂抗体在治疗炎性和自身免疫疾病中的用途。
本发明包括了通过抑制患者体内IgE抗体生成来预防病症的方法，该方法包括向该患者施用有效量的本发明所述的抗体。该病症包括但不限于，哮喘(例如过敏性哮喘)、过敏性鼻炎、异位性皮炎、移植排斥以及动脉粥样硬化。
本发明包括了在患者体内抑制IgE抗体生成的方法，该方法包括向该患者施用本发明主张的拮抗剂抗-OX40抗体。对IgE抗体生成的抑制可预防支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、过敏性反应、荨麻疹以及异位性皮炎。
本发明包括了在患者体内治疗OX-40-介导的病症的方法，该方法包括向该患者施用有效量的本发明主张的抗体或抗原-结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段阻断OX40L与OX40结合和/或抑制一种或多种与OX40L和OX40的结合相关的功能。
本发明包括了治疗患有哮喘症状的个体的方法，该方法包括向该个体(例如，有此需求的个体)施用减轻该哮喘症状的量的本发明主张的抗体。
本发明的抗体可通过一种或多种途径施用，包括静脉内、腹膜内、吸入、肌肉内、皮下和口服途径。本发明包括向患者递送治疗有效量的本发明主张的抗体的吸入装置。
本发明包括了减轻哺乳动物中哮喘的严重性的方法，该方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的具有至少一个如下特征的抗-OX40抗体：以介于约1×1010至约1×1012M之间的KD结合人OX40的能力；抑制一种或多种与结合OX40受体相关的功能以及抑制OX40L与所述受体结合的能力。
在某些实施方案中，该抗体以介于约1×10-12至约1×10-11M、1×10-11至约1×10-10M、1×10-10至约1×10-9M、1×10-9至约1×10-8M、1×10-8至约1×10-7M的解离常数结合人OX40。
本发明包括了减轻哺乳动物中哮喘的严重性的方法，该方法包括向该哺乳动物施用有效量的抗体，其中该抗体具有至少一个如下性质：(a)以介于约1×10-12至约1×10-8M之间的KD结合人OX40；(b)抑制一种或多种与结合OX40相关的功能；以及(c)抑制OX40L与OX40的结合。
本发明的抗体还可用于治疗(但不限于)过敏、哮喘、异位性皮炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎性肠道疾病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、自身免疫性神经疾病(例如Guillain-Barre)、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、重症肌无力、胶原诱导的关节炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病、克隆氏病和Grave病。
本发明的抗体还可用于治疗肉状瘤病、实验性利什曼病、恶性贫血、颞动脉炎、抗磷脂综合症、血管炎(例如Wegener肉芽肿病)、***、疱疹样皮炎、寻常天疱疮、白斑病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性***和***、肾上腺的自身免疫性疾病、***性红斑狼疮、硬皮病、皮肤肌炎、多发性肌炎、皮肤肌炎、脊椎关节病(例如强直性脊柱炎)、Reiter综合症、Sjogren综合症等。
本发明包括了本发明的抗体在药物制备中的用途。
本发明包括了本发明的抗体在治疗OX40相关的疾病或病症中的用途。
本发明包括了本发明的抗体在检测OX40中的用途。
本发明包括了试剂盒，其在容器中包含了预定量的本发明的抗体，并在单独的容器中包含了缓冲液。
本发明包括了试剂盒，其在一个容器中包含了预定量的本发明的组合物，并在单独的容器中包含了缓冲液。
本发明包括了包含本发明的抗体的医学装置。
本发明包括了包含本发明的组合物的医学装置。
4.附图说明
图1A显示了人OX40 cDNA(录入号NM 004295)的核酸序列。
图1B显示了人OX40蛋白(录入号NM_003318)的氨基酸序列。
图2显示了小鼠抗-OX40mAb B66对体外激活的初始人CD4+T-细胞生成IL-2(2A)和IL-13(2B)的抑制作用。
图3显示了小鼠抗-OX40mAb B66对体外激活的初始人CD4+T-细胞的增殖的抑制作用。
图4显示了嵌合抗-OX40mAb A10和B66对体外致敏(primed)的人Th2细胞的细胞凋亡作用。
图5显示了嵌合抗-OX40mAb A10和B66对体外致敏的人Th2细胞的增殖的抑制作用。空心方框代表初始CD4；空心三角代表初始CD4+与对照L-细胞；实心三角代表B66与初始CD4+和OX40L L-细胞；实心方框代表2C4(IC)与初始CD4+和OX40L L-细胞；实心圆圈代表A10与初始CD4+和OX40L-L-细胞。
图6显示了嵌合抗-OX40mAb A10和B66对体外致敏人Th2细胞生成IL2(6A)和IL-13(6B)的抑制作用。空心方框代表初始CD4；空心三角代表初始CD4+与对照L-细胞；实心三角代表B66与初始CD4+和OX40L L-细胞；实心方框代表2C4(IC)与初始CD4+和OX40L L-细胞；实心圆圈代表A10与初始CD4+和OX40L-L-细胞。
图7：该表显示了嵌合抗-OX40mAb B66和商业抗-OX40mAb L106对体外激活的初始人CD4+T-细胞生成IL-2和IL-13的抑制作用的比较。
图8：该表显示了人源化、嵌合和小鼠抗-OX40mAb A10对体外激活的初始人CD4+T-细胞的增殖的抑制作用以及对它们生成IL-2、IL-5和IL-13的抑制作用。
图9：该表显示了人源化、嵌合和小鼠抗-OX40mAb A10对体外致敏的人Th1细胞的增殖的抑制作用以及对它们生成IL-2、IL-5和IL-13的抑制作用。
图10：该表显示了人源化、嵌合和小鼠抗-OX40mAb A10对体外致敏的人Th2细胞的增殖的抑制作用以及对它们生成IL-2、IL-5和IL-13的抑制作用。
图11：该表显示了人源化、嵌合和小鼠抗-OX40mAb A10对体外致敏的人Th2细胞的增殖的抑制作用以及对它们在使用同种异体TSLP激活的骨髓树突细胞时生成IL-2、IL-5和IL-13的抑制作用。
图12A显示了鼠抗体A10和B66的轻链可变氨基酸序列与人模板IGKV4-1/IGKJ1的比较，以及所得的人源化序列A10(TH)hu336F。上标的数值表示根据Kabat的氨基酸位置。
图12B显示了鼠抗体A10的重链可变氨基酸序列与人模板IGHV1-46/IGHJ4的比较，以及所得的人源化序列A10(TH)hu336F。上标的数值表示根据Kabat的氨基酸位置。
图13显示了人源化克隆A10(TH)hu336F(■)相比亲代鼠抗体A10(●)及其嵌合形式(▲)具有更高的结合活性。
图14显示了抗-OX40的鼠和人源化可变区的核酸序列：A)轻链κ可变252-A10；B)轻链κ可变252-B66；C)人源化轻链可变A10(SN)，全抗体B和E；D)人源化轻链可变A10(SH)，全抗体A和D；E)人源化轻链可变A10(TH)hu336，全抗体C和F；F)重链可变252-A10；G)重链可变A10(TH)hu336，全抗体D-F；H)重链可变A10L70，全抗体A-C。
图15显示了人源化克隆A10(TH)hu336F(■)、鼠A10(●)及其嵌合形式(▲)对OX40的竞争相当。
图16A，B和17A，B显示了用于实施本发明的示例性接收者人共有框架序列，具有如下序列标识符：
可变重(VH)共有框架(图16A，B)人VH亚组I共有框架减去KabatCDR(SEQ ID NO：30)；人VH亚组I共有框架减去延伸的超变区(SEQ IDNO：31-33)；人VH亚组II共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：34)；人VH亚组II共有框架减去延伸的超变区(SEQ ID NO：35-37)；人VH亚组II共有框架减去延伸的人VH亚组III共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：38)；人VH亚组III共有框架减去延伸的超变区(SEQ ID NO：39-41)；人VH接收者框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：42)；人VH接收者框架减去延伸的超变区(SEQID NO：43-44)；人VH接收者2框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：45)；人VH接收者2框架减去延伸的超变区(SEQ ID NOs：46-48)；可变轻(VL)共有框架(图17A，B)；人VL κ亚组I共有框架(SEQ IDNO：49)；人VL κ亚组II共有框架(SEQID NO：50)；人VL κ亚组III共有框架(SEQ ID NO：51)；人VL κ亚组IV共有框架(SEQ ID NO：52)。
图18显示了huMAb4D5-8轻链和重链的框架区序列。上标/粗体的数值表示根据Kabat的氨基酸位置。
图19显示了huMAb4D5-8轻链和重链的修饰/变体框架区序列。上标/粗体的数值表示根据Kabat的氨基酸位置。
5.发明详述
本发明不限于本文所述的特定的方法、方案、细胞系、载体或试剂，因为它们可以变化。此外，本文所用的术语仅为了描述特定的实施方案，并非意在限制本发明的范围。本文和权利要求中所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数含义，除非上下文另行指明，例如，“一个宿主细胞”包括多个该种宿主细胞。除非另行说明，本文所用的技术和科学术语以及任何缩写具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。尽管可以使用与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料实施本发明，本文表述了示例性的方法、设备和材料。
本文提及的所有专利和公开物均以法律允许的程度在此引入作为参考，其目的在于描述和披露其中报道的可能用于本发明的蛋白、酶、载体、宿主细胞和方法。然而，本发明的任何内容均不应被解释为承认由于在先的发明而使本发明的发明日不早于该披露。
5.1定义
在整个本申请中所用的术语应被解释为对于本领域普通技术人员而言的一般和通常含义。然而，申请人希望赋予下文的术语如下特定的含义。
关于抗体链多肽序列的短语“基本一致”可被解释为抗体链显示了与参考多肽序列至少70％、或80％、或90％、或95％的序列一致性。关于核酸序列的该术语可被解释为核苷酸序列显示了与参考核酸序列至少约85％、或90％、或95％、或97％的序列一致性。
术语“一致性”或“同源性”应被解释为表示在对序列进行比对和(根据达到整个序列的最大百分比一致性的需要)引入间隙后，候选序列中的氨基酸残基和与之比较的相应序列的残基的一致性百分比，不将任意保守替换视作该序列一致性的一部分。N-或C-末端的延伸或者***均不应被视作减少了一致性或同源性。进行比对的方法和计算机程序已为本领域公知。序列一致性可通过序列分析软件进行测算。
术语“抗体”以其广泛的含义被使用，其包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，包含了免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)，并特别涵盖了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)为具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体显示了对特定靶标的结合特异性，免疫球蛋白包括了抗体和其它缺乏靶标特异性的抗体样分子。天然抗体和免疫球蛋白通常为由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后为数个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。此外，术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(mAb)意在包括完整的分子以及能够特异性结合蛋白的抗体片段(例如，Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺乏完整抗体的Fc片段，从动物或植物的循环中被更快地清除，与完整抗体相比，非特异性组织结合较少(Wahl等人，J Nucl Med 24：316(1983))。
本文所用的“抗-OX40抗体”表示结合人OX40的抗体，其结合的方式能够抑制或大大减少该OX40与其配体(OX40配体)的结合。
本文所用的术语“OX40-介导的病症”包括与过敏、哮喘以及与自身免疫和炎症相关的疾病，所述疾病包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性利什曼病、胶原诱导的关节炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病、克隆氏病和Grave病。其它的病症如肉状瘤病、自身免疫眼部疾病、自身免疫葡萄膜炎、异位性皮炎、重症肌无力、自身免疫性神经疾病(例如Guillain-Barre)、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性血小板减少、颞动脉炎、抗磷脂综合症、血管炎(例如Wegener肉芽肿病)、***、牛皮癣、疱疹样皮炎、寻常天疱疮、白斑病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性***和***、肾上腺的自身免疫性疾病、***性红斑狼疮、硬皮病、皮肤肌炎、多发性肌炎、皮肤肌炎、脊椎关节病(例如强直性脊柱炎)、Reiter综合症以及Sjogren综合症同样被包括在该术语的范围之内。
在关于抗体可变结构域中使用的术语“可变”指如下事实：该可变结构域的桌些部分可在不同抗体之间存在广泛的差异，并用于每个特定抗体对其特定靶标的结合和特异性。然而，该种可变性并不在抗体的可变结构域中均匀分布。它集中在轻链和重链可变结构域中三个被称为互补决定区(CDR)的片段(也被称为超变区)中。可变结构域中更为保守的部分被称为框架(FR)。如本领域所知，限定抗体超变区的氨基酸位置/边界可根据背景和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可被视作混合超变位置，因为这些位置在一种标准下可被看作超变区内的位置，而在一套不同的标准下则被看作是超变区以外的位置。这些位置中的一个或多个还可存在于延伸的超变区中。本发明提供了在这些混合超变位置具有修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含了四个FR区，大致呈β-折叠构型，由三个CDR连接，其形成环状连接，并在部分情况下形成β-折叠结构的一部分。每个链中的CDR通过FR区相邻地保持在一起，并与另一条链上的CDR一起形成抗体的靶标结合位点(参见Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1987))。除非另行指明，本文所用的对免疫球蛋白氨基酸残基的编号可参照Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号***进行。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常指靶标结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。短语抗体的“抗原结合片段”指与全长抗体具有相同的定性生物活性的化合物。例如，抗-OX40抗体的抗原结合片段是可以以下述方式结合OX40受体的化合物，所述结合方式可以防止或大大减少该种分子结合OX40配体的能力。本文关于抗体所用的“功能性片段”指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。“Fv”片段是包含完整靶标识别和结合位点的最小抗体片段。该区由紧密、非共价连接的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。它呈这样的构型：每个可变结构域中的三个CDR相互作用，从而在VH-VL二聚体的表面限定靶标结合位点。这六个CDR共同赋予了该抗体结合靶标的特异性。然而，即使单个的可变结构域(或仅包含三个对靶标具有特异性的CDR的半个Fv)也有识别和结合靶标的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含了抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般而言，该Fv多肽进一步包含该VH和VL结构域之间的多肽接头，该接头使得该sFv形成用于靶标结合的所需结构。
Fab片段包含了轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab′)片段可通过对F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸的二硫键裂解后生成。抗体片段的其它化学偶联已为本领域普通技术人员所知。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本同种的抗体群(即，组成该群的单个抗体除了极少量的可能的天然发生的突变外是相同的)获得的抗体。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单个靶标位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制备物不同，每个单克隆抗体针对靶标上的单个决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体的优点在于它们可通过杂交瘤培养合成，不受其它免疫球蛋白所污染。修饰语“单克隆”指抗体源于基本同种抗体群的特征，不应解释为需要通过任何特定的方法生成该抗体。例如，用于本发明的该单克隆抗体可通过公知技术从噬菌体抗体库分离。用于本发明的亲代单克隆抗体可通过首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法生成，或可通过重组方法生成。
本文所用的术语“嵌合”抗体指具有来自于非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和人免疫球蛋白恒定区(通常选自人免疫球蛋白模板)的抗体。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式为包含了来自于非人免疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它靶标-结合序列)。一般而言，人源化抗体将基本包含至少一个、通常为两个可变结构域的全部，其中全部或基本全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，而全部或基本全部FR区为人免疫球蛋白的共有序列。该人源化抗体还可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为所选的人免疫球蛋白模板的一部分免疫球蛋白恒定区。
本文所述的“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，以及包括从人免疫球蛋白库或从表达一种或多种人免疫球蛋白且不表达内源免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体，如下文描述，并可参见Kucherlapati等人的美国专利5,939,598。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括后代。还应当理解：由于有意的或无意的突变，并非所有的后代具有完全相同的DNA成分。其还包括从最初转化细胞中筛选的具有相同功能或生物属性的变体后代。在本发明中所用的“宿主细胞”通常为原核或真核宿主。
用DNA“转化”细胞有机体的指向有机体引入DNA，从而使该DNA作为染色体外元件或通过染色体整合可进行复制。用DNA“转染”细胞有机体指由细胞或有机体摄入DNA(例如，表达载体)，不管事实上是否有任何编码序列被表达。术语“转染的宿主细胞”和“转化的”指导入了DNA的细胞。该细胞被称为“宿主细胞”，它可以是原核细胞或真核细胞。典型的原核宿主细胞包括各种大肠杆菌菌株。典型的真核宿主细胞为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞或来自于人的细胞。导入的DNA序列可来自于与宿主细胞相同的物种或与宿主细胞不同的物种，或者它可以是杂交DNA序列，包含了部分外源和部分同源的DNA。
术语“载体”指DNA构建体，其包含了与能够使该DNA在合适宿主中表达的合适控制序列可操作地连接的DNA序列。该控制序列包含了实现转录的启动子、任选的控制该种转录的操作子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。该载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅为潜在的基因组***物。一旦转化进入合适的宿主，该载体可独立于宿主基因组复制和行使功能，或者在一些情况下，整合进入基因组本身。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可进行互换，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意在包括具有同等功能并且已为或正为本领域所知的载体的其它形式。
用于治疗的“哺乳动物”指被归类为哺乳动物的任意动物，包括人，家养或农场动物，非人灵长动物，以及动物园、运动或宠物类动物，例如狗、马、猫、牛等。
本文所用的词语“标记物”指可检测的化合物或组合物，其可直接或间接地与分子或蛋白(例如，抗体)偶联。该标记物可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在作为酶标记物时，可催化底物化合物或组合物的可检测的化学变化。
本文所用的“固相”指本发明的抗体可以附着的非水性基质。本文涵盖的固相的例子包括部分或完全由玻璃(例如，可控孔度玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇以及硅酮形成的固相。在一些实施方案中，根据上下文，该固相可包含测定平板的微孔；在其它情况下，它可以是纯化柱(例如，亲和纯化柱)。
5.2免疫原
OX40受体的两种形式可用作生成本发明的抗-OX40抗体的免疫原：(1)一种是作为融合蛋白表达的人OX40受体的可溶形式，该融合蛋白包含了人Fcγ1和核苷酸残基105至627编码的胞外结构域；和(2)另一种是基于细胞的免疫原，其包含了在稳定转染的小鼠纤维原细胞L-细胞表面表达的全长OX40。可溶性OX40受体或其片段可被用作用于生成本发明抗体的免疫原。所得拮抗剂抗体针对OX40，并能够抑制OX40L与OX40的相互作用，从而中和受体活性。优选地，该免疫原为多肽，并可以是跨膜分子。该免疫原可重组生成，或通过合成方法制备。该免疫原还可从天然来源分离。
免疫原可包含OX40的胞外结构域。可替代地，表达包含胞外结构域的跨膜蛋白的细胞可被用作免疫原。该种细胞可来自于天然来源(例如，T-细胞系)或可以是通过重组技术转化的在其表面表达受体的细胞。可用于生成抗体的其它免疫原及其形式将对本领域技术人员显而易见。用全细胞免疫原免疫宿主动物(例如啮齿动物)是本领域公知的。
可替代地，根据本领域技术人员公知的方法将编码OX40的基因或cDNA克隆进入质粒或其它载体，并在多种表达***中的任意一种中表达。克隆和表达OX40的方法以及OX40的核酸序列是众所周知的(例如，参见美国专利5,821,332和5,759,546)。由于遗传密码的简并性，可生成编码OX40多肽的多种核苷酸序列。人们可基于可能的密码子选择来选择组合从而改变核苷酸序列。这些组合可根据用于编码天然存在的OX40多肽的核苷酸序列的标准三联体遗传密码制备，且所有这样的变体均应考虑。这些多肽中的任意一种可用于免疫动物，以生成结合OX40的抗体。
免疫原OX40多肽可以(当有益时)表达为融合蛋白，该融合蛋白具有融合至另一多肽(例如免疫球蛋白Fc区)的OX40多肽。该融合的多肽通常帮助蛋白纯化，例如，通过允许该融合蛋白被分离和经亲和层析纯化。融合蛋白可通过培养由融合核酸序列转化的重组细胞生成，该融合核酸序列编码包含了连接至蛋白质羧基和/或氨基末端的融合片段的蛋白。融合片段可包括但不限于，免疫球蛋白Fc区、谷胱甘肽-S-转移酶、β-半乳糖苷酶、能够结合二价金属离子的多聚组氨酸片段以及麦芽糖结合蛋白。
在本发明中，重组OX40被用于免疫小鼠，以生成该拮抗剂抗体。重组OX40可从多个来源商业购得(参见，例如，R&D Systems，Minneapolis，MN.，PeproTech，Inc.，NJ，和Sanofi Bio-Industries，Inc.，Tervose，PA.)。示例性多肽包含SEQ ID NO：1及其变体的全部或部分。
5.3抗体生成
本发明的抗体可通过本领域已知的任意合适的方法生成。本发明的抗体可包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法已为本领域技术人员所知(Harlow等人，Antibodies：a Laboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory Press，第二版(1988))，其全文在此引入作为参考)。
例如，上述的免疫原可被施用至各种宿主动物(包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等)，以诱导含有特异性针对该抗原的多克隆抗体的血清的生成。该免疫原的施用可通过一次或多次注射免疫剂和(如果需要)佐剂来进行。依据宿主种类不同，各种佐剂可用于提高免疫应答，其包括但不限于，弗氏试剂(完全或不完全)、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚以及潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。其它的可供使用的佐剂的例子包括MPL-TDM佐剂(单磷酸类脂A，合成的海藻糖二霉菌酸脂)。免疫方案已为本领域公知，并可通过能诱发所选动物宿主的免疫应答的任意方法进行。佐剂已为本领域熟知。
典型地，通过多次皮下或腹膜内注射、或肌肉内或通过IV将免疫原(具有或不具有佐剂)注射至哺乳动物。该免疫原可包括OX40多肽、融合蛋白或其变体。根据多肽的性质(即，疏水性比例、亲水性比例、稳定性、净电荷、等电点等)，将免疫原与已知在该被免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白偶联可能是有用的。该种偶联包括通过将待偶联的免疫原和免疫原性蛋白活性衍化出化学官能团以形成共价键的化学偶联，或通过基于融合蛋白的方法、或其它本领域技术人员已知的其它方法。这些免疫原性蛋白的例子包括但不限于，匙孔血蓝蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺蛋白、大豆胰蛋白抑制剂和混杂T辅助肽。各种佐剂可用于增加上述的免疫应答。
本发明的抗体可包括单克隆抗体。单克隆抗体为识别单个抗原性位点的抗体。单克隆抗体的均一的特异性使得其比通常包含了识别多种不同抗原性位点的多克隆抗体更为有用得多。单克隆抗体可通过杂交瘤技术(例如参见Kohler等人，Nature 256：495(1975)；美国专利4,376,110；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版(1988)以及Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier(1981))、重组DNA方法或技术人员已知的其它方法进行制备。可用于制备单克隆抗体的方法的其它例子包括但不限于，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等人，Proc Natl Acad SciUSA 80：2026(1983))、以及EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，第77-96页，Alan R.Liss(1985))。这些抗体可以是任意免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任意亚类。生成本发明的mAb的杂交瘤可在体外或体内培养。
在杂交瘤模型中，宿主(例如小鼠、人源化小鼠、具有人免疫***的小鼠、仓鼠、兔、骆驼或任意其它合适的宿主动物)被免疫以诱发淋巴细胞，该淋巴细胞生成或能够生成特异性结合用于免疫的蛋白的抗体。可替代地，淋巴细胞可被体外免疫。然后，可通过使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤(Goding，Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice，Academic Press，第59-103页(1986))。
一般而言，在制备抗体生成杂交瘤时，如需要人源细胞，则使用外周血淋巴细胞(″PBL″)，或如需要非人哺乳动物源细胞，则可使用脾细胞或***细胞。然后，可通过使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系相融合，以形成杂交瘤(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，Academic Press，第59-103页(1986))。永生化细胞系通常为转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛或人源骨髓瘤细胞。典型地，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将该杂交瘤细胞培养于适当的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果该亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于该杂交瘤的培养基通常会包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(″HAT培养基″)，它们是阻止HGPRT-缺陷型细胞生长的物质。
优选的永生化细胞系为可有效融合、支持所选抗体生成细胞稳定高水平生成抗体、并对培养基(例如HAT培养基)敏感的细胞系。这些骨髓瘤细胞系包括鼠骨髓瘤细胞系，例如可由从美国加利福尼亚州San Diego的Salk InstituteCell Distribution Center获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤和从美国马萨诸塞州Rockville的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的SP2/0或X63-Ag8-653细胞衍生的细胞系。人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系也被描述用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J Immunol 133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc，第51-63页(1987))。还可使用小鼠杂交瘤细胞系NSO(European Collection of Cell Cultures，Salisbury，Wilshire，UK)。
可对生长杂交瘤细胞的培养基中针对OX40的单克隆抗体的生成进行分析。由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸收分析(ELISA)等体外结合试验进行检测。这些技术已为本领域所知，并在技术人员的技能范围之内。单克隆抗体与OX40的结合亲和性可以通过例如Scatchard分析(Munson等人，Anal Biochem107：220(1980))进行测定。
当鉴定出生成具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤后，将该克隆通过有限稀释法进行亚克隆并以标准方法培养(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press，第59-103页(1986))。用于该目的的合适的培养基包括，例如，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)或RPMI-1640培养基。此外，该杂交瘤细胞可作为腹水肿瘤在动物体内生长。
由该亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规的免疫球蛋白纯化技术(例如，蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)从该培养基、腹水液体或血清适当地分离。
在本领域中存在各种生成单克隆抗体的方法，因此，本发明不限于单一地通过杂交瘤生成。例如，单克隆抗体可通过重组DNA方法(例如描述于美国专利4,816,567)生成。杂交瘤细胞作为这些DNA的来源。一旦分离后，DNA可被放入表达载体，后者随后被转染进入宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、NSO细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者其它情况下不会生成免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，从而在该重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。DNA还可通过例如用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列来进行修饰(美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci USA 81：6851(1984))，或者通过将免疫球蛋白编码序列共价连接到非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列来进行修饰。这些非免疫球蛋白多肽可替换本发明抗体的恒定结构域，或可替换本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，从而生成嵌合双链抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法已为本领域公知。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达。该重链通常在Fc区的任意点上被截短，以防止重链交联。可替代地，相关的半胱氨酸残基被另一氨基酸残基替换或被删除，从而防止交联。
识别特定表位的抗体片段可通过已知技术生成。传统上，这些片段可通过完整抗体的蛋白水解消化得到(例如参见，Morimoto等人，J Biochem BiophysMethods 24：107(1992)；Brennan等人，Science 229：81(1985))。例如，可采用木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab′)2片段)等酶通过蛋白水解裂解免疫球蛋白分子获得本发明的Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段包含了可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域。然而，这些片段现在可通过重组宿主细胞直接生成。例如，该抗体片段可从抗体噬菌体库分离。可替代地，F(ab′)2-SH片段可直接从大肠杆菌回收，并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163(1992)。根据另一方法，可从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab′)2片段。生成抗体片段的其它技术将对技术人员显而易见。在其它实施方案中，所选的抗体为单链Fv片段(Fv)(PCT专利申请WO 93/16185)。
对于某些用途，包括抗体在人体的体内应用和体外检测分析，优选使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分来自不同动物种类，例如包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法在已为本领域所知。例如，参见Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，J ImmunolMethods 125：191(1989)；美国专利5,807,715、4,816,567和4,816397，其全文在此引用作为参考。
人源化抗体经设计后比来自动物的单克隆抗体对人免疫球蛋白具有更高的同源性。人源化是一种制备嵌合抗体的技术，其中远小于完整人可变结构域的序列被来自于非人物种的相应序列所替换。人源化抗体是在非人物种中生成的结合所需抗原的抗体分子，该抗体分子具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自于人免疫球蛋白分子的框架区(FR)。人框架区的框架残基通常可被来自CDR供体抗体的相应残基所替代从而改变，优选提高抗原结合。这些框架替换通过本领域公知的方法进行鉴定，例如，可通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，可通过序列比较鉴定在特定位点的不寻常框架残基。例如参见，美国专利5,585,089；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其全文在此引入作为参考。抗体可通过本领域已知的各种技术进行人源化，该技术包括，例如，CDR-嫁接(EP239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰或重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28：489(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7：805(1994)；Roguska等人，ProcNatl Acad Sci USA 91：969(1994))、以及链改组(美国专利5,565,332)。
一般而言，人源化抗体具有从非人来源导入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本上参照Winter及其合作者(Jones等人，Nature 321：522(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等人，Science239：1534(1988))的方法，通过以非人CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列后生成。相应地，该种“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中远小于完整的人可变结构域的序列被来自于非人物种的相应序列所替换。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其中一些CDR残基和可能部分FR残基被来自于啮齿动物抗体的类似位点所替换。
此外，重要的是人源化抗体保留更高的对抗原的亲和性以及其它有利的生物属性。为了实现该目标，根据优选的方法，人源化抗体可通过使用亲代和人源化序列的三维模型对该亲代序列和各种理论人源化产物的分析过程进行制备。三维免疫球蛋白模型已可商购获得，并为本领域技术人员所熟悉。已有计算机程序能够描绘和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。对这些显示的考察可允许对特定残基在该候选免疫球蛋白序列的功能中的作用进行分析，即，对影响该候选免疫球蛋白序列的能力的残基的分析，即，对影响该候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析。通过该方法，可选择FR残基并由接收序列和输入序列组合，从而将所需的抗体特征最大化，例如提高的对靶抗原的亲和性，尽管CDR残基才直接和最实质性地影响抗原结合。
选择用于制备人源化抗体的人(轻链和重链)可变结构域对于减少抗原性非常重要。根据所谓的“最适合(best-fit)”方法，可对整个已知的人可变结构域序列库筛选非人抗体的可变结构域的序列。然后，将最接近非人亲代抗体序列的人序列选为人源化抗体的人FR(Sims等人，J Immunol 151：2296(1993)；Chothia等人，J Mol Biol 196：901(1987))。
另一种方法采用了来自于特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于多个不同的人源化抗体(Carter等人，Proc NatlAcadSci USA 89：4285(1992)；Presta等人，J Immunol 151：2623(1993))。只要本发明的抗体显示所需的生物特征(例如，所需的结合亲和性)，该抗体可包含任意合适的人或人共有轻链或重链框架序列。在一些实施方案中，在该人和/或人共有非超变区序列中可存在一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多个)额外的修饰。在一个实施方案中，本发明的抗体包含了人轻链的框架序列的至少一部分(或全部)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含了人重链的框架序列的至少一部分(或全部)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含了人亚组I框架共有序列的至少一部分(或全部)。在部分实施方案中，本发明的抗体包含了人亚组III重链框架共有序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的框架共有序列包含了在位置71、73和/或78上的替换。在这些抗体的部分实施方案中，位置71为A，73为T和/或78为A。
完全的人抗体特别适用于治疗人类患者。人抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括采用来自人免疫球蛋白序列的抗体库进行上述的噬菌体展示方法。还可参见美国专利4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO96/3373和WO 91/10741；分别全文引入作为参考。Cole等人和Boerner等人的技术同样可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Riss(1985)；和Boerner等人，J Immunol 147：86(1991))。
人抗体还可采用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行制备。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或通过同源重组进入小鼠胚胎干细胞。可替代地，除人重链和轻链基因外，还可将人可变区、恒定区和多样区导入鼠胚胎干细胞。通过同源重组导入的人免疫球蛋白基因座可单独或同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因成为非功能性的。特别地，JH区的纯合删除防止了内源抗体的产生。扩增该修饰后的胚胎干细胞并将其微注射进入囊胚以生成嵌合小鼠。饲养该嵌合小鼠以生成表达人抗体的纯合后代。例如参见，Jakobovitis等人，Proc NatlAcad Sci USA 90：2551(1993)；Jakobovitis等人，Nature 362：255(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol 7：33(1993)；Duchosal等人，Nature 355：258(1992))。
转基因小鼠以选择的抗原(例如，本发明的多肽的全部或部分)通过常规方式进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可采用常规杂交瘤技术从免疫后的转基因小鼠获取。转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化时重排，随后进行类型转换和体细胞突变。因此，通过该种技术可生产治疗有效的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。制备人抗体的该种技术的综述可参见Lonberg等人，Int Rev Immunol 13：65-93(1995)。对用于生产人抗体和人单克隆抗体的该种技术以及生产这些抗体的方案的具体讨论可参见例如，PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利号0598877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；以及5,939,598，其全文在此引入作为参考。此外，可委托Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)、Genpharm(San Jose，Calif.)和Medarex，Inc.(Princeton，NJ.)等公司通过与上述类似的技术提供针对选定抗原的人抗体。
此外，人mAb还可通过对移植了人外周血白细胞、脾细胞或骨髓(例如，XTL的三源杂交瘤技术)的小鼠进行免疫后进行制备。识别选定表位的完全人抗体可通过称为“定向选择(guided selection)”的技术进行制备。在该方法中，采用选定的非人单克隆抗体(例如，小鼠抗体)引导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等人，Bio/Technology 12：899(1988))。
此外，通过本领域技术人员公知的技术可将针对本发明多肽的抗体随后用于生成“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体(例如参见，Greenspan等人，FASEB J 7：437(1989)；Nissinoff，J Immunol 147：2429(1991))。例如，结合和竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体结合的抗体可用于生成抗独特型抗体，其“模拟”多肽多聚化和/或结合结构域，并因此结合和中和多肽和/或其配体。这些中和性抗独特型抗体或这些抗独特型抗体的Fab片段可用于在治疗方案中中和多肽配体。例如，这些抗独特型抗体可被用于结合本发明多肽和/或结合其配体/受体，从而阻断其生物活性。
本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体为对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人或人源化抗体。在本发明中，其中一种结合特异性可针对OX40，另一种可针对任意其它抗原，并优选针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒衍生蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌衍生的蛋白、或细菌表面蛋白等。
制备双特异性抗体的方法已经众所周知。传统上，双特异性抗体的重组制备基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein等人，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)生成了十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。该正确分子的纯化通常可通过亲和层析步骤实现。类似的步骤披露于WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J10：3655(1991)。
具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。优选与免疫球蛋白重链恒定结构域(包含了至少部分铰链、CH2和CH3区)进行所述融合。它可具有至少一个融合中存在的轻链结合所必需的第一重链恒定区(CH1)。编码该免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)该免疫球蛋白轻链的DNA被***单独的表达载体，并共转化进入合适的宿主有机体。有关生成双特异性抗体的进一步细节可参见，例如Suresh等人，Meth In Enzym 121：210(1986)。
本发明还涵盖了异源偶联(heteroconjugate)抗体。异源偶联抗体由两个共价结合的抗体构成。该种抗体曾经被提出用于，例如，将免疫***细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)。据预期，该抗体可通过合成蛋白化学中已知的方法(包括涉及交联剂的方法)体外制备得到。例如，可通过二硫键交换反应或通过形成硫酯键构建免疫毒素。用于该目的的合适的试剂的例子包括亚胺硫醇盐和甲基-4-硫醇酪酸亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及披露于例如美国专利4,676,980的试剂。
此外，可生成针对OX40的单结构域抗体。这种技术的例子描述于WO9425591(描述了来自于骆驼科重链Ig的抗体)以及US20030130496(描述了单结构域完全人抗体从噬菌体库的分离)。
还可生成单肽链结合分子，其中重链和轻链Fv区连接。单链抗体(″scFv″)及其构建方法描述于美国专利号4,946,778。可替代地，Fab可通过类似的手段构建和表达。完全人抗体和部分人抗体的免疫原性全部均小于完全鼠mAb，且片段和单链抗体同样具有较低的免疫原性。
抗体或抗体片段可从以McCafferty等人，Nature 348：552(1990)所述的技术生成的抗体噬菌体库中分离得到。Clarkson等人，Nature 352：624(1991)和Marks等人，J Mol Biol 222：581(1991)分别描述了通过噬菌体库分离鼠和人抗体。后续的出版文献描述了通过链改组进行的高亲和性(nM范围)人抗体的制备(Marks等人，Bio/Technology 10：779(1992))，以及作为构建极大型噬菌体库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等人，Nuc Acids Res 21：2265(1993))。因此，这些技术可作为传统的分离单克隆抗体的单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代。
该DNA还可通过，例如，以人重-链和轻-链恒定结构域的编码序列替换同源鼠序列进行修饰(美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc Natl Acad SciUSA 81：6851(1984))。
另一种替代方法使用电融合而非化学融合来形成杂交瘤。该技术已经非常完善。除了融合外，还可使用，例如，Epstein Barr病毒或转化基因转化B细胞以使其永生。例如参见，″Continuously Proliferating人Cell LinesSynthesizing Antibody of Predetermined Specificity，″Zurawaki等人，收录于由Kennett等人所编的Monoclonal Antibodies中，Plenum Press，第19-33页(1980))。抗-OX40mAb可通过具有由真核或原核***表达的OX40蛋白、融合蛋白或其片段免疫啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)来形成。其它的动物也可被用于进行免疫，例如，非人灵长动物、表达免疫球蛋白的转基因小鼠、以及移植了人B淋巴细胞的严重联合免疫缺陷型(SCID)小鼠。如更早的描述(Kohler等人，Nature 256：495(1975))，杂交瘤可通过常规步骤将自经免疫的动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞(例如，Sp2/0和NSO)融合来生成。此外，抗-OX40抗体可通过对来自于噬菌体展示***中的人B淋巴细胞的重组单链Fv或Fab库的筛选得到。mAb对OX40的特异性可通过ELISA、Western免疫印迹或其它免疫化学技术测试。抗体对CD4+T细胞激活的抑制活性可通过增殖、细胞因子释放和凋亡测定进行评估。阳性孔中的杂交瘤可通过有限稀释进行克隆。对抗体进行纯化以通过上述测定来表征其对人OX40的特异性。
5.4拮抗剂抗-OX40抗体的鉴定
本发明提供了抑制和中和OX40的作用的拮抗剂单克隆抗体。特别地，本发明的抗体结合OX40并抑制OX40的活化。本发明的抗体包括命名为A10和B66的抗体，并披露了这些鼠抗体的人源化抗体。本发明还包括了与这些抗体之一结合相同表位(例如单克隆抗体A10(TH)hu336F的表位)的抗体。
候选抗-OX40抗体可通过如下方法筛选：(1)荧光微体积测定技术(FMAT)(Applied Biosystem，CA)，(2)酶联免疫吸附测定(ELISA)，以及(3)流式细胞计数免疫测定。用于表征所选的抗体的测定包括：(1)Hut-78测定；(2)初始CD4+T-细胞测定；(3)TH1、TH2和TH17条件；(4)TCR-活化的初始CD4+T-细胞方案；(5)凋亡测定，以及(6)交叉反应性测试。实验细节描述于实施例中。
本发明的抗体包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异源偶联抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表达库生成的片段、抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗-Id抗体)、以及任意上述抗体的表位-结合片段。
本发明的免疫球蛋白分子可以是任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类的免疫球蛋白分子。该抗体可以是本发明的抗原-结合抗体片段，并包括但不限于，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)以及包含VL或VH结构域的单结构域抗体。包括单链抗体在内的抗原-结合抗体片段可以仅单独包含可变区，或是同时包含铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的全部或部分。本发明还包括了包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合的抗原结合片段。本发明的抗体可来自任意的动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体来自于人、非人灵长动物、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。
本发明的抗体可具有单特异性、双特异性、三特异性或更大的多特异性。多特异性抗体可对OX40的不同表位具有特异性，或可能对OX40和异源表位(如异源多肽或固相支持材料)具有特异性。例如参见，PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人，J Immunol 147：60(1991)；美国专利4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人，J Immunol 148：1547(1992)。
本发明的抗体可通过它们识别或特异性结合的OX40的表位或部分进行描述或说明。该表位或多肽部分可通过本文所述的内容进行说明，例如，通过N-末端和C-末端的位置、连续氨基酸残基的大小，或列举于表和图中。
本发明的抗体还可通过它们的交叉反应性进行描述和说明。可结合与OX40具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％一致性(采用本领域已知的并在本文描述的方法计算)的OX40多肽的抗体同样包括在本发明内。抗-OX40抗体还可以以小于约10-7M、小于约10-6M、小于约10-5M的KD结合其它蛋白，例如来自于该抗-OX40抗体所针对的物种以外的物种的抗-OX40抗体。
在具体实施方案中，本发明的抗体可与人OX40的其它哺乳动物同源物及其相应的表位交叉反应。在具体实施方案中，上述交叉反应针对本文所述的任意单特异性抗原性或免疫原性多肽，或本文所述的特异性抗原性和/或免疫原性多肽的组合。
本发明还包括了结合多肽的抗体，所述多肽由在严格杂交条件下与编码OX40的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸编码。本发明的抗体还可通过其与本发明的多肽的结合亲和性进行描述或说明。优选的结合亲和性包括平衡解离常数或KD为10-8至10-15M、10-8至10-12M、10-8至10-10M或10-10至10-12M的结合亲和性。本发明还提供了下述抗体，通过本领域已知的测定竞争性结合的任何方法(例如，本文所述的免疫测定)测定，该抗体竞争性抑制抗体与本发明的表位结合。在优选的实施方案中，该抗体竞争性抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％的与该表位的结合。
5.5载体和宿主细胞
另一方面，本发明提供了编码本文所述抗体的分离的核酸序列、包含编码本发明抗体的核苷酸序列的载体构建体、包含该种载体的宿主细胞，以及制备该抗体的重组技术。
为了重组制备抗体，编码该抗体的核酸被分离并***可复制载体，以进行进一步克隆(DNA的扩增)或表达。编码该抗体的DNA可采用常规方法简单分离和测序(例如，可采用能够特异性结合编码该抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)。克隆和转化的标准技术可用于制备表达本发明抗体的细胞系。
5.5.1载体
有多种载体可供使用。载体的组分通常包括但不限于如下成分中的一种或多种：信号序列、复制起始点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。可通过公知技术制备包含了编码本发明抗体的核苷酸序列的重组表达载体。表达载体可包含与合适的转录或翻译调节核苷酸序列(例如来自于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的序列)可操作地连接的核苷酸序列。调节序列的例子包括转录启动子、操纵子、增强子、mRNA核糖体结合位点、和/或控制转录和翻译的启动和终止的其它合适序列。当调节序列与合适多肽的核苷酸序列功能性相关时，该核苷酸序列被“可操作地连接”。因此，如果启动子序列控制合适的核苷酸序列的转录，则该启动子核苷酸序列被可操作地连接至例如抗体重链序列。用于表达本发明的抗体的有用表达载体的例子可参见申请WO 04/070011，其内容在此引入作为参考。
此外，编码与抗体重链和/或轻链序列并非天然相关联的合适的信号肽的序列可被引入表达载体。例如，信号肽(分泌型前导肽)的核苷酸序列可被同框融合至多肽序列，由此抗体被分泌进入周质空间或进入培养基。能在目标宿主细胞中发挥作用的信号肽可增强合适抗体的胞外分泌。信号肽可在抗体从细胞分泌后从该多肽裂解。这些分泌型信号的例子是本领域公知的，并包括例如描述于美国专利号5,698,435、5,698,417和6,204,023的那些分泌型信号。
5.5.2宿主细胞
可用于本发明的宿主细胞为原核细胞、酵母或更高级的真核细胞，并包括但不限于微生物，例如用包含了抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞***；用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞***；或包含了带有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞***(例如，COS、CHO、BHK、293和3T3细胞)。
可用作本发明的宿主细胞的原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、肠杆菌(Enterbacter)、欧文氏菌(Erwinia)、克雷伯杆菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)、志贺氏菌(Shigella)以及杆状菌、假单胞菌和链霉菌。一种优选的大肠杆菌克隆宿主为E.coli 294(ATCC 31,446)，尽管其它的菌株如E.coli B、E.coli X1776(ATCC 31,537)和E.coli W3110(ATCC 27,325)同样适用。这些例子仅用于阐述，并非限制。
用于原核宿主细胞中的表达载体通常包含了一种或多种表型选择性标记基因。表型选择性标记基因为，例如，编码提供抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因。可用于原核宿主细胞的表达载体的例子包括由市售质粒如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pGEM1(PromegaBiotec，Madison，Wisconsin.，USA)以及pET(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)和pRSET(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，USA)系列载体(Studier，J Mol Biol 219：37(1991)；Schoepfer，Gene 124：83(1993))衍生的载体。常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括T7(Rosenberg等人，Gene 56：125(1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子***(Chang等人，Nature 275：615(1978)；Goeddel等人，Nature 281：544(1979))、色氨酸(trp)启动子***(Goeddel等人，Nucl Acids Res 8：4057(1980))以及tac启动子(Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory(1990))。
可用于本发明的酵母或丝状真菌包括来自酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、放线菌属(Actinomycetes)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、人体酵母菌属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、木霉菌属(Trichoderma)、链孢霉属(Neurospora)的酵母，以及丝状真菌如链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)。酵母载体通常包含来自于2μ酵母质粒的复制序列起始点，自主复制序列(ARS)、启动子区、聚腺苷酸化序列、转录终止序列以及选择性标记基因。用于酵母载体的合适的启动子包括但不限于，金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J Biol Chem 255：2073(1980))或其它糖分解酶(Holland等人，Biochem 17：4900(1978))的启动子，其它糖分解酶例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变旋酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶以及葡糖激酶。其它可用于酵母表达的合适载体和启动子进一步描述于Fleer等人，Gene 107：285(1991)中。用于酵母和酵母转化方案的其它合适启动子和载体已为本领域公知。酵母转化方案为本领域公知。一种这样的方案描述于Hinnen等人，Proc Natl Acad Sci 75：1929(1978)。Hinnen方案在选择性培养基中选择Trp+转化体。
哺乳动物或昆虫宿主细胞培养***也可被用于表达重组抗体。原则上，可使用任意更高级的真核细胞培养，而不管其为脊椎动物或无脊椎动物培养。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞(Luckow等人，Bio/Technology6：47(1988)；Miller等人，Genetics Engineering，Setlow等人编，第8卷，第277-9页，Plenam Publishing(1986)；Mseda等人，Nature 315：592(1985))。例如，杆状病毒***可被用于生产异源蛋白。在昆虫***中，可使用苜蓿尺蠖(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)作为载体以表达外源基因。该病毒生长在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。该抗体编码序列可被单独克隆到该病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并位于AcNPV启动子(例如该多角体蛋白启动子)的控制下。其它已被鉴定的宿主包括伊蚊属(Aedes)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和家蚕(Bombyx mori)。各种用于转染的病毒菌株可以公开获得，例如，AcNPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，且这些病毒可根据本发明被用作本文所述的病毒，特别是用于草地夜蛾细胞的转染。此外，棉花、玉米、土豆、大豆、牵牛花、西红柿和烟草等植物细胞培养物也可被用作宿主。
培养(组织培养)中的脊椎动物以及脊椎动物细胞的增殖已成为常规步骤。参见Tissue Culture，Kruse等人编，Academic Press(1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是猴肾细胞系；人胚胎肾细胞系；幼仓鼠肾细胞；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216(1980))；小鼠Sertoli细胞；人***细胞(HELA)；犬肾细胞；人肺细胞；人肝细胞；小鼠***肿瘤以及NSO细胞。
为制备抗体，用上述载体转化宿主细胞，并将所述细胞培养在常规营养培养基中，所述培养基经改良后适于诱导启动子、转录和翻译控制序列；选择转化体；或扩增编码所需序列的基因。常用的启动子序列和增强子序列来自于多瘤病毒、腺病毒2、猿病毒40(SV40)和人细胞巨化病毒(CMV)。来自于SV40病毒基因组的DNA序列可用于为结构基因序列在哺乳动物宿主细胞中的表达提供其它的遗传元件，例如，SV40起始区、早期和晚期启动子、增强子、剪接以及聚腺苷酸化位点。病毒早期和晚期启动子特别有用，因为它们都易于作为片段从病毒基因组中获得，所述片段还可包含病毒复制起始点。用于哺乳动物宿主细胞的示例性表达载体可从市场获得。
用于制备本发明的抗体的宿主细胞可在各种培养基中培养。市售的培养基，如Ham’s F10(Sigma)、最低必须培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Sigma)，适合培养宿主细胞。此外，在Ham等人，Meth Enzymol 58：44(1979)；Barnes等人，Anal Biochem102：255(1980)；和美国专利4,767,704、4,657,866、4,560,655、5,122,469、5,712,163或6,048,728中所述的任意培养基可用作宿主细胞的培养基。任意这些培养基可根据需要添加激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或者表皮生长因子)、盐类(例如氯化-X，其中X为钠、钙、镁和磷)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷酸和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)、以及葡萄糖或等量的能源。也可以以本领域技术人员已知的合适浓度包含任何其它必要的添加剂。培养的条件(例如温度、pH等)为之前选择用于表达的宿主细胞所用的条件，该条件对于本领域普通技术人员是显而易见的。
5.6编码抗体的多聚核苷酸
本发明进一步提供了包含编码本发明抗体及其片段的核苷酸序列的多聚核苷酸或核酸，例如DNA。示例性的多聚核苷酸包括编码抗体链的多聚核苷酸，所述抗体链包含一个或多个本文所述的氨基酸序列。本发明还包括了在严格或较低严格杂交条件下与编码本发明的抗体的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。
该多聚核苷酸可通过任何本领域已知的方法获得，且该多聚核苷酸的核苷酸序列可通过任何本领域已知的方法测定。例如，如果已知该抗体的核苷酸序列，编码该抗体的多聚核苷酸可通过化学合成的寡聚核苷酸进行装配(例如，如Kutmeier等人，Bio/Techniques 17：242(1994)所述)，其主要包括：包含编码该抗体的部分序列的重叠寡聚核苷酸的合成，这些寡聚核苷酸的退火和连接，以及通过PCR对连接的寡聚核苷酸进行扩增。
可替代地，编码抗体的多聚核苷酸可由适当来源的核酸生成。如果没有包含编码特定抗体的核酸的克隆，但已知抗体分子的序列，编码该免疫球蛋白的核酸可通过化学合成，或采用可与序列的3′和5′端杂交的合成引物通过PCR扩增从适当来源(例如，抗体cDNA库，或从任何表达该抗体的组织或细胞(例如经选定用于表达本发明的抗体的杂交瘤细胞)产生的cDNA库或分离得到的核酸，优选poly A+RNA)获取，或通过使用对特定基因序列具有特异性的寡聚核苷酸探针识别例如来自编码该抗体的cDNA库的cDNA从而进行克隆。然后可用本领域公知的任何技术将PCR生成的扩增核酸克隆进可复制的克隆载体。
当核苷酸序列和抗体的相应氨基酸被确定后，可采用本领域公知的处理核苷酸序列的方法(如重组DNA技术、定点突变、PCR等(例如，参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)以及Ausubel等人编，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1998)所述的技术，其全文在此引用作为参考))对该抗体的核苷酸序列进行操作，以生成具有不同氨基酸序列的抗体，例如形成氨基酸替换、删除、和/或***。
在具体实施方案中，重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列可通过公知的方法检查以确定CDR的序列，例如，可通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较，以确定高可变序列区。可采用常规重组DNA技术将一个或多个CDR***框架区，例如，***人框架区以将非人类抗体人源化，如前所述。该框架区可以是天然存在的或共有框架区，并优选人框架区(例如，人框架区的列表可参见Chothia等人，J Mol Biol 278：457(1998))。优选地，由该框架区和CDR的组合生成的多聚核苷酸编码能与本发明的多肽特异性结合的抗体。优选地，如前所述，在框架区内可进行一个或多个氨基酸替换，且优选地，该氨基酸替换能够提高抗体与其抗原的结合。此外，该类方法可用于对参与链间二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基进行氨基酸替换或删除，从而生成缺失一个或多个链间二硫键的抗体分子。其它对多聚核苷酸的改变在本发明和本领域的现有技术范围内。
此外，可采用通过拼接来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子基因和来自具有适当生物活性的人抗体分子基因生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci 81：851851(1984)；Neuberger等人，Nature312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314：452-454(1985))。如前所述，嵌合抗体是其中抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如包含了来自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，如人源化抗体。
可替代地，被描述用于生产单克隆抗体的技术(美国专利4,946,778；Bird，Science 242：423(1988)；Huston等人，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879(1988)；以及Ward等人，Nature 334：544(1989))可也被调整用于生产单链抗体。可通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段生成单链多肽来形成单链抗体。也可采用在大肠杆菌内组装功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science 242：1038(1988))。
5.7制备抗-OX40抗体的方法
本发明的抗体可通过任何本领域已知的用于抗体合成的方法制备，特别地，可通过化学合成制备，或者优选地，通过重组表达技术制备。
本发明的抗体或其片段、衍生物或类似物(例如，本发明抗体的重链或轻链或本发明的单链抗体)的重组表达需要构建表达载体，该表达载体包含编码该抗体或该抗体的片段的多聚核苷酸。一旦得到编码抗体分子的多聚核苷酸，可通过重组DNA技术制备用于生成该抗体的载体。构建的表达载体包含抗体编码序列以及合适的转录和翻译控制信号。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术、以及体内遗传重组。
将表达载体通过常规技术转入宿主细胞，然后以常规技术培养该转染细胞以制备本发明的抗体。在本发明的一个方面，如下文详述，同时编码重链和轻链的载体可在宿主细胞中共表达以表达完整免疫球蛋白分子。
如上所述，各种宿主表达载体***可被用于表达本发明的抗体分子。这些宿主表达***代表了可制备和后续纯化目标编码序列的运载体，还代表了在以适当核苷酸编码序列进行转化或转染后原位表达本发明抗体分子的细胞。细菌细胞如大肠杆菌以及真核细胞常用于重组抗体分子的表达，特别是用于完全重组抗体分子的表达。例如，结合来自人细胞巨化病毒的中间早期基因启动子元件等载体的哺乳动物细胞如CHO是一种有效的抗体表达***(Foecking等人，Gene 45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology 8：2(1990))。
此外，还可选择以所希望的特定形式调节***序列的表达，或修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对蛋白产物的这些修饰(例如，糖基化)和处理(例如，裂解)可对该蛋白的功能非常重要。不同的宿主细胞对蛋白和基因产物的转译后处理和修饰有不同的特性和特定的机制。可选择适当的细胞系或宿主***以确保表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为此，可使用具有正确处理基因产物的初级转录、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。该种哺乳动物宿主细胞包括，但不限于CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤细胞。
为了重组蛋白的长期高产量生成，稳定表达是优选的。例如，可通过工程改造得到稳定表达抗体分子的细胞系。宿主细胞可通过由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的DNA进行转化，而非使用包含病毒复制起始点的表达载体。在引入外源DNA后，允许工程改造后的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择性标记可对选择产生抗性并使细胞将该质粒稳定整合进入其染色体，并生长形成灶(foci)，所述灶随后被克隆并扩展入细胞系。该方法可有利地被用于工程改造表达抗体分子的细胞系。该种工程改造细胞系对筛选和评估直接或间接与抗体分子相互作用的化合物特别有用。
多种选择***可供使用，包括但不限于可分别应用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))、以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，Cell 22：817-17(1980))基因。同样，抗代谢物抗性可用作选择下列基因的基础：产生对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等人，Proc Natl Acad Sci USA 77：357(1980)；O′Hare等人，Proc NatlAcad Sci USA 78：1527(1981))；产生对麦考酚酸的抗性的gpt(Mulligan等人，Proc Natl Acad Sci USA 78：2072(1981))；产生对氨基糖苷G-418的抗性的neo(Wu等人，Biotherapy 3：87(1991))；以及产生对潮霉素的抗性的hygro(Santerre等人，Gene 30：147(1984))。可将重组DNA技术领域中公知的方法常规用于选择所需的重组克隆，且这些方法描述于，例如，Ausubel等人编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press(1990)；以及在Dracopoli等人编，Current Protocols in human Genetics，John Wiley&Sons(1994)的第12和13章；Colberre-Garapin等人，J Mol Biol 150：1(1981)，分别在此全文引入作为参考。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增得到提高(其综述参见Bebbington等人，“The use of vectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells，”DNA Cloning，第3卷，Academic Press(1987))。当表达抗体的载体***中的标记物可扩增时，宿主细胞培养中抑制剂水平的提升可提高标记物基因拷贝数。由于扩增区与抗体基因关联，因而抗体的产量也会得到提高(Crouse等人，Mol Cell Biol 3：257(1983))。
宿主细胞可被两个本发明的表达载体共转染，第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可包含相同的可选择标记物，其能使重链和轻链多肽同等表达。可替代地，可使用单个载体，该载体同时编码并能够表达重链和轻链多肽。在该种情况下，轻链应被放置在重链之前以防止过量的有毒游离重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc Natl Acad Sci USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
当本发明的抗体分子通过动物、化学合成或重组表达生成后，可通过本领域已知的任意免疫球蛋白分子纯化方法对其进行纯化，例如通过层析(例如，离子交换层析、亲和层析、特别是蛋白A后的特定抗原的亲和层析、分子排阻层析)、离心、微分溶出率，或通过任何其它蛋白纯化标准技术。此外，本发明的抗体或其片段可被融合至本文所述的或是本领域已知的其它异源多肽，以帮助纯化。
本发明包括了重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)至多肽的抗体。可使用本发明的融合或结合抗体以易于纯化。例如，参见PCT公开WO93/21232；EP 439,095；Naramura等人，Immunol Lett 39：91(1994)；美国专利5,474,981；Gillies等人，Proc Natl Acad Sci USA 89：1428(1992)；Fell等人，JImmunol 146：2446(1991)，其全文在此引入作为参考。
此外，本发明的抗体或其片段可被融合至标记序列，例如可连接至肽以促进纯化。在优选实施方案中，标记氨基酸序列为六组氨酸肽，例如在pQE载体中提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，这些标记氨基酸序列中的多数已上市销售。如Gentz等人，Proc NatlAcad Sci USA 86：821(1989)所述，例如，提供六组氨酸用于融和蛋白的快速纯化。其它可用于纯化的肽标签包括但不限于，对应于来自流感血红球凝集素蛋白的表位的“HA”标签(Wilson等人，Cell 31：161(1984))以及“flag”标签。
5.8抗体纯化
在使用重组技术时，该抗体可在胞内、周质空间生成，或直接分泌进入培养基。如果抗体在胞内生成，作为第一步，可通过例如离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或溶解片段)。Carter等人，Bio/Technology 10：163(1992)描述了分泌进入大肠杆菌周质空间的抗体的分离步骤。简单而言，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下经过约30分钟融化细胞糊(cellpaste)。离心去除细胞碎片。当抗体分泌进入培养基时，通常使用市售蛋白浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达***的上清液。可在任意前述步骤中包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解，且可包含抗生素以防止偶然污染物的生长。
可以采用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性依赖于抗体中存在的任意免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等人，JImmunol Meth 62：1(1983))。对于所有的小鼠同种型和人IgG3推荐蛋白G(Guss等人，EMBO J 5：1561(1986))。亲和配体连接的基质最通常为琼脂糖，但也可使用其它基质。机械稳定的基质如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可实现比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker；Phillipsburg，N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它的蛋白纯化技术，例如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶上的层析、在肝磷酯SEPHAROSETM上的层析、在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。在任意初步纯化步骤后，可使用pH介于约2.5-4.5的洗脱缓冲液对包含感兴趣的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，优选地在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
5.9药物制剂
可通过将具有所需纯度的多肽与任选的本领域常用的“药学可接受的”载体、赋形剂或稳定剂(其均被称为“赋形剂”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等张剂、非离子型清洁剂、抗氧化剂以及其它各种添加剂混合将该多肽或抗体的治疗性制剂制备为冻干制剂或水溶液进行贮存。参见Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol编(1980)。这些添加剂必须在所用的剂型和浓度下对接受者没有毒性。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们优选地以约2mM至约50mM的浓度范围存在。用于本发明的合适的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸盐缓冲剂(例如，延胡索酸-延胡索酸单钠混合物等)、延胡索酸盐缓冲剂(例如，延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲剂(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及醋酸盐缓冲剂(例如，醋酸-醋酸钠混合物、醋酸-氢氧化钠混合物等)。此外，还可涉及磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
可添加防腐剂以延缓微生物生长，并可以0.2％-1％(w/v)范围内的量添加。用于本发明的合适的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苄烷铵卤化物(例如，氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六甲季铵以及羟苯甲酸烷基酯如羟苯甲酸甲酯或羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可添加有时被作为“稳定剂”的等张剂以确保本发明的液体组合物的等张性，其包括多氢糖醇，优选三氢或更高的糖醇，例如丙三醇、赤藻糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨糖醇以及甘露糖醇。
稳定剂指一大类赋形剂，其从功能上可包括膨胀剂直至稳定治疗剂或帮助防止变性或粘附至容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多氢糖醇(上述列举)；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、丙三醇等，包括环多醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代丙三醇、α-单硫代丙三醇和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即，＜10残基)；蛋白，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，例如蜜三糖；以及多糖，例如葡萄聚糖。稳定剂可以活性蛋白重量的0.1-10000重量份数存在。
可添加非离子型表面活性剂或清洁剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解该治疗剂，同时保护治疗性蛋白避免搅拌诱发的聚集，这也允许该制剂暴露在剪切表面应力下而不引起蛋白变性。合适的非离子型表面活性剂包括多山醇酯(20、80等)、聚羟体(184、188等)、复合多元醇、聚氧乙烯山梨坦单醚(
Figure A20088001391400661
-20、
Figure A20088001391400662
-80等)。非离子型表面活性剂可以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml、优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
其它的各种赋形剂包括膨胀剂(例如，淀粉)、螯合剂(例如，EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)以及助溶剂。本文的制剂可针对待治疗的特定适应症的需要包含一种以上的活性化合物，优选彼此没有不良影响的具有互补活性的化合物。例如，可能需要进一步提供免疫抑制剂。这些分子可适当地以对预期目的有效的量组合存在。活性成分还可以被包埋在通过例如凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，用于胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊)或***液中。该类技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol编(1980)。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可通过例如无菌过滤膜进行过滤得以容易地实现。可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括，含有抗体的固体疏水聚合物的半透基质，该基质呈现有形物体的形式，例如，膜或微胶囊。缓释基质的例子包括水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸甲酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利3773919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、非降解乙烯-醋酸乙烯酯、可降解乳酸-羟基乙酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和多聚-D-(-)-3-羟丁酸。乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸等聚合物能够在100天中释放分子，某些水凝胶在较短的时间内释放蛋白。当包于胶囊内的抗体在身体内存留较长时间时，它们可能由于暴露在37℃的潮湿环境下而变性或聚集，从而导致生物活性的丧失以及可能的免疫原性改变。
可根据所涉及的机制设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫化物交换形成分子间S-S键，则可通过修饰硫氢基残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、使用适当的添加剂、和形成特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
在具体疾病或病症的治疗中有效的治疗性多肽、抗体或其片段的量将依赖于该疾病或病症的性质，并可通过标准临床技术测定。可能时，希望在进行人体测试之前先在体外、然后在有用的动物模型中测定本发明的药物组合物的剂量应答曲线。
在优选的实施方案中，可通过皮下注射施用治疗性的多肽、抗体或其片段的水溶液。每个剂量可在约0.5μg至约50μg每公斤体重范围内，或者更优选地，在约3μg至约30μg每公斤体重范围内。
进行皮下施用的给药方案可根据多种临床因素从每月一次到每天一次，所述临床因素包括疾病类型、疾病的严重性以及个体对治疗剂的敏感性。
5.10 抗-OX40抗体的诊断用途
本发明的抗体包括通过向抗体共价连接任意类型的分子而经修饰的衍生物，只要该种共价连接不影响与OX40的结合。例如但不限于，该抗体衍生物包括例如通过生物素化、HRP或任何其它可测部分修饰的抗体。
本发明的抗体可用于，例如但不限于，在体外和体内诊断方法中纯化或检测OX40。例如，该抗体在免疫测定中用于定性和定量测定生物样本中的OX40水平。例如，参见Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，第二版(1988)，在此全文引用作为参考。
如下文更为具体的讨论，本发明的抗体可单独使用或与其它组合物组合使用。抗体可被进一步重组融合至异源多肽的N或C末端，或者化学偶联(包括共价或非共价偶联)至多肽或其它组合物。例如，本发明的抗体可重组融合或偶联可在检测测定中用作标记物的分子。
本发明进一步包括偶联了诊断剂的抗体或其片段。该抗体可在诊断中用于，例如，检测感兴趣的靶标在特定细胞、组织或血清中的表达；或者监测免疫应答的形成或进展，作为临床测试步骤的一部分以例如检测给定治疗方案的效力。可通过将抗体结合至可测物质帮助检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层的正电子发射金属、以及非放射性顺磁性金属离子。该可测物质可通过本领域已知的技术直接或通过中间体(例如，本领域已知的接头)间接结合或偶联至抗体(或其片段)。酶标记的例子包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
将酶偶联至抗体的技术描述于O′Sullivan等人，“Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay”，收录于Methods in Enzymology中，Langone等人编，第147-66页，AcademicPress(1981)。例如，可偶联至抗体并用作本发明所述诊断剂的金属离子可参见美国专利4,741,900。合适的酶的例子包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或是乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸萤光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括荧光素酶、虫荧光素和发光蛋白质；合适的放射性材料的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
有时，标记物可与该抗体间接偶联。本领域技术人员将理解实现该目的的各种技术。例如，抗体可与生物素偶联，且上文所述的三大类标记物中的任意一种均可与亲和素偶联，反之亦然。生物素选择性结合亲和素，因此，该标记物可通过该间接方式偶联该抗体。可替代地，为了实现标记物与抗体的间接偶联，该抗体与小的半抗原(例如digloxin)偶联，而上述不同类型的标记物之一与抗-半抗原抗体(例如，抗digloxin抗体)偶联。因此，可以实现标记物与抗体的间接偶联。
在本发明的另一实施方案中，该抗体不需要被标记，且其存在可采用结合抗体的标记抗体进行检测。
本发明的抗体可用于任何已知的测定方法，例如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。参见Zola，Monoclonal Antibodies：AManual of Techniques，第147-158页，CRC Press(1987)。
竞争性结合测定依赖于标记的标准物与测试样本竞争性结合有限量的抗体的能力。测试样本中靶标的量与结合该抗体的标准物的量成反比例。为了帮助确定结合的标准物的量，抗体通常在竞争之前或之后是不可溶的。因此，与该抗体结合的标准物和测试样本可与未结合的标准物和测试样本中方便地分离出来。
夹心测定涉及两种抗体的使用，每种抗体能够结合不同的待检测的免疫原性部分、或表位、或蛋白。在夹心测定中，待分析的该测试样本首先被固定在固体支持物上的第一抗体结合，然后第二抗体结合该测试样本，从而形成不溶的三部分复合物。参见，例如，美国专利4,376,110。第二抗体本身可以用可测部分标记(直接夹心测定)，或可通过以可测部分标记的抗免疫球蛋白抗体进行测定(间接夹心测定)。例如，一种夹心测定的类型为ELISA测定，该测定中的可测部分为酶。
抗体可连接至固体支持物，这对于感兴趣的抗原的免疫测定或纯化特别有用。该种固体支持物包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。在本方法中，抗体通过本领域公知的方法被固定化在固体支持物如SEPHADEXTM树脂或滤纸上。固定后的抗体与含有待纯化靶标的样本相接触，然后用合适的溶剂洗涤该支持物，该溶剂能够基本去除样本中除了结合至该固定的抗体的待纯化靶标之外的所有物质。最后，用另一种合适的溶剂(例如甘氨酸缓冲液)洗涤该支持物，该溶剂将从该抗体上释放靶标。
特异性结合OX40的经标记的抗体及其衍生物和类似物可在诊断中用于检测、诊断或监测与OX40的异常表达和/或活性相关的疾病、紊乱和/或病症。本发明提供了对OX40的异常表达的检测，其包括(a)使用一种或多种本发明的特异性针对OX40的抗体测定个体的细胞或体液中的OX40表达；和(b)将该基因表达水平与标准基因表达水平相比较，由此，测得的OX40表达水平相对于标准表达水平的增加或减少表示有异常表达。
抗体可被用于检测样本(例如，体液或组织样本)中OX40的存在和/或水平。检测方法可包括将样本与OX40抗体相接触，并测量与该样本结合的抗体的量。对于免疫组织化学，样本可以是新鲜的或是冷冻的，或者可以包埋在石蜡中并以防腐剂如***进行固定。
本发明提供了用于诊断病症的诊断性测定，其包括(a)使用一种或多种本发明的抗体测定个体的细胞或体液中的OX40表达；和(b)将该基因表达水平与标准基因表达水平相比较，由此，测得的基因表达水平相对于该标准表达水平的增加或减少表示有特定的病症。
本发明的抗体可被用于采用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法测定生物样本中的蛋白质水平(例如，参见Jalkanen等人，J Cell Biol 101：976(1985)；Jalkanen等人，J Cell Biol 105：3087(1987))。其它可用于检测蛋白基因表达的基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸收分析(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。适用的抗体测定标记已为本领域所知并包括酶标记，例如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(131I，1251，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In，111In)、和锝(99Tc)；发光标记，例如鲁米诺；以及荧光标记，例如荧光素和罗丹明，以及生物素。放射性同位素结合的同位素可通过免疫闪烁成像法进行定位。
本发明的一个方面是检测和诊断动物(优选哺乳动物，最优选人)中与OX40异常表达相关的疾病或病症。在一个实施方案中，诊断包括：a)向个体施用(例如，肠胃外、皮下或腹膜施用)有效量的特异性结合OX40的经标记的分子；b)在施用后等待一段时间，以允许该经标记的分子在个体中表达该多肽的位点优先浓缩(并将未结合标记分子清除至背景水平)；c)测定背景水平；和d)测定个体中的经标记的分子，由此，测得经标记的分子在背景水平以上表明该个体患有与OX40异常表达相关的特定疾病或病症。背景水平可通过各种方法测定，包括，将测得的经标记的分子的量与之前测定的特定***的标准值相比较。
本领域中应能理解：个体的大小和所用的成像***将决定用于生成诊断性影像所需的成像部分的数量。对于放射性同位素部分，用于人类个体时，注射的放射活性的量通常在约5至20毫居里99Tc的范围内。然后该标记的抗体或抗体片段将优先聚集在细胞中包含特定蛋白的位置。体内成像描述于Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments.”，收录于Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer中第13章，Burchiel等人编，Masson Publishing(1982)。
根据多种变量(包括所用标记物的类型和施用的模式)，在施用后允许经标记的分子优先浓缩于个体内的位点以及未结合的经标记的分子被清除至背景水平的时间间隔为6至48小时、6至24小时、或6至12小时。在另一实施方案中，施用后的时间间隔为5至20天或5至10天。
在实施方案中，可通过重复诊断疾病或病症的方法来监测疾病或病症，例如在初次诊断一个月后、初次诊断六个月后、初次诊断一年后进行重复诊断。
可通过本领域已知的体内扫描的方法检测经标记的分子在患者体内的存在。该方法依赖于所用的标记物类型。技术人员将能够确定用于测定具体标记物的适当方法。可用于本发明的诊断方法的方法和仪器包括但不限于，计算机X射线断层成像(CT)、全身扫描例如正电子发射体层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)和超声检查。
在具体实施方案中，分子通过放射性同位素标记，并通过放射应答手术仪器(美国专利5,441,050)在患者体内检测。在另一实施方案中，分子以荧光化合物标记，并通过荧光应答扫描仪器在患者体内检测。在另一实施方案中，分子以正电子发射金属标记，并通过正电子发射断层显像在患者体内检测。在另一实施方案中，分子通过顺磁标记物进行标记，并通过磁共振成像(MRI)在患者体内检测。
另一方面，本发明提供了对患者形成由细胞因子的非调节表达引起的疾病的倾向的诊断方法。在某些患者细胞、组织或体液中OX40上升的量表示该患者易患某种疾病。在一个实施方案中，该方法包括从已知具有较低或正常OX40水平的患者采集细胞、组织或体液样本，分析该组织或体液中OX40的存在，并根据组织或体液中OX40的表达水平预测该患者罹患某种疾病的倾向。在另一实施方案中，方法包括从患者采集已知含有确定OX40水平的细胞、组织或体液样本，分析该组织或体液的OX40数量，并根据该OX40量相对于由正常细胞、组织或体液确定的或测得的水平的变化预测该患者罹患某种疾病的倾向。该确定的OX40水平可以是基于文献值的已知量，或者可通过测量正常细胞、组织或体液中的数量而实现测定。特别地，测定OX40在某些组织或体液中的水平可允许特异性地和早期地、优选在疾病发生之前对患者的疾病进行检测。可通过本发明进行诊断的疾病包括但不限于本文所述的疾病。在优选的实施方案中，组织或体液为外周血、外周血白血球、活检组织如肺或皮肤活体切片、以及组织。
本发明的抗体可在试剂盒中提供，即，将预定量的试剂与进行诊断测定的说明组合包装。当抗体以酶标记时，该试剂盒可包含底物和该酶所需的辅因子(例如，提供可测生色团或荧光团的底物前体)。此外，还可包含其它的添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲剂或溶解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可大范围变化，以在溶液中提供试剂浓度，其将对测定的敏感性充分优化。特别地，试剂可作为干粉提供，其通常是冻干的，包含赋形剂，该赋形剂在溶解时将提供具有合适浓度的试剂溶液。
5.11抗-OX40抗体的治疗用途
预期本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，例如，该抗体被施用至非人哺乳动物，以获得临床前数据。示例性的待治疗的非人哺乳动物包括非人灵长动物、狗、猫、啮齿动物和其它可进行临床前研究的哺乳动物。这些哺乳动物可以是为待用抗体进行治疗的疾病而建立的动物模型，或者可用于研究感兴趣的抗体的毒性。在这些实施方案的每一个中，可对哺乳动物进行剂量递增研究。
单独使用或与细胞毒性因子联合施用的抗体(其与治疗性部分偶联或未与之偶联)可被用作治疗剂。本发明涉及基于抗体的疗法，其涉及将本发明的抗体施用至动物、哺乳动物或人类用于治疗OX-40介导的疾病、紊乱或病症。动物或个体可以是需要特定治疗的动物，例如被诊断患有特定病症(例如，与OX40相关的病症)的动物。针对OX40的抗体可用于在哺乳动物中(包括但不限于牛、猪、马、鸡、猫、狗、非人灵长动物等，以及人)对抗过敏、哮喘、自身免疫性或炎性疾病。例如，通过使用治疗可接受的剂量的本发明的抗体，或者这些抗体的混合物，或者联合其它不同来源的抗体，可以减少或消除待治疗哺乳动物中的自身免疫或炎性疾病症状。
本发明的治疗性化合物包括但不限于，本发明的抗体(包括本文所述的它的片段、类似物和衍生物)和如下所述编码本发明抗体的核酸(包括本文所述的抗体的片段、类似物和衍生物以及抗独特型抗体)。本发明的抗体可用于治疗、抑制或预防与OX40的异常表达和/或活性相关的疾病、紊乱或病症，包括但不限于本文所述的疾病、紊乱或病症的任意一种或多种。与OX40的异常表达和/或活性相关的疾病、紊乱或病症的治疗和/或预防包括但不限于，减轻与该疾病、紊乱或病症相关的至少一种症状。本发明的抗体可提供在本领域已知的或是本文所述的药学可接受组合物中。
本发明的抗-OX40抗体可用于多种疾病的治疗。本发明提供了预防或治疗哺乳动物中OX40-介导的疾病的方法。该方法包括向该哺乳动物施用疾病预防或治疗量的抗-OX40抗体。该抗-OX40抗体结合OX40并调节细胞因子和细胞受体表达，从而导致非疾病状态的特征性细胞因子水平。OX40信号转导已与多种疾病产生联系，例如过敏、哮喘和与自身免疫和炎症相关的疾病，其包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性利什曼病、胶原诱导的关节炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病、克隆氏病和Grave病。
本发明的抗体还可用于预防或治疗其它疾病，包括肉状瘤病、自身免疫眼部疾病、自身免疫葡萄膜炎、异位性皮炎、重症肌无力、自身免疫性神经疾病(例如Guillain-Barre)、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性血小板减少、颞动脉炎、抗磷脂综合症、血管炎(例如Wegener肉芽肿病)、***、牛皮癣、疱疹样皮炎、寻常天疱疮、白斑病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性***和***、肾上腺的自身免疫性疾病、***性红斑狼疮、硬皮病、皮肤肌炎、多发性肌炎、皮肤肌炎、脊椎关节病(例如强直性脊柱炎)、Reiter综合症、Sjogren综合症等。
可用于宿主个体的治疗剂优选在所述个体中引发极少的或者不引发针对该治疗剂的免疫原性应答。在一个实施方案中，本发明提供了这样的药剂。例如，在一个实施方案中，和包含重链和轻链可变区的抗体相比，本发明提供了能够和/或预期能够在宿主个体中以显著降低的水平引发人抗-小鼠抗体应答(HAMA)的人源化抗体。在另一实施例中，本发明提供了引发和/或预期引发最小量或不引发人抗-小鼠抗体应答(HAMA)的人源化抗体。在一个实施例中，本发明的抗体引发了相当于或小于临床可接受水平的抗-小鼠抗体应答。
能够有效治疗、抑制和预防与OX40的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的抗体的量可通过标准临床技术测定。该剂量将取决于待治疗疾病的类型、该疾病的严重性和病程、抗体是否为预防或治疗目的施用、之前的疗法、患者的临床史以及对抗体的应答，以及主治医生的判断。抗体可以以与该疾病一致的治疗方案施用，例如，可在一至数天内单次或数次给药以改善疾病状态，或者在延长的时间内周期给药以预防过敏或哮喘。此外，可以可选地采用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中采用的确切的剂量将取决于施用的途径，以及疾病或病症的严重性，并且应当根据医生的判断和每位患者的情况决定。有效剂量可从来自体外或动物模型测试***获得的剂量-应答曲线外推得到。
对于抗体，向患者施用的剂量相对患者体重通常为0.1mg/kg至150mg/kg。优选地，向患者施用的剂量相对患者体重介于0.1mg/kg至20mg/kg，更优选介于1mg/kg至10mg/kg。一般而言，由于对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期长于来自其它物种的抗体。因此，采用更低剂量的人抗体和更小的施用频率是可能的。此外，可通过修饰(例如，脂化)增加抗体摄取和组织穿透力(例如，进入脑中)来减少本发明的抗体的施用剂量和频率。对于历经数天或更长时间的重复施用，根据病症，治疗可持续至对疾病症状达到所需的抑制。然而，也可使用其它的给药方案。该疗法的进程可通过常规的技术和测定容易地监测。对于抗-LFA-1或抗-ICAM-1抗体的示例性的给药方案披露于WO 94/04188。
可呈组合物形式的本发明的抗体应当以与良好医疗实践(good medicalpractice)一致的方式进行配制、给药和施用。在该种背景下考虑的因素包括被治疗的具体病症、被治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的诱因、药剂的递送位点、施用方法、施用方案以及医疗工作者已知的其它因素。待施用的抗体组合物的“治疗有效量”将由这些考量所决定，并且是预防、改善或治疗疾病或病症所需的最小量。该抗体无需、但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗有关病症的药剂配制。这些其它药剂的有效量取决于抗体在制剂中存在的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其它因素。它们通常以上文所用的相同的剂量和施用途径使用，或者约为上文采用剂量的1-99％。
本发明的抗体可以有利地与其它单克隆或嵌合抗体联用，或与淋巴因子或造血生长因子(例如，IL-2、IL-3、IL-7和IFN-γ)联用，这些因子例如可增加与该抗体相互作用的效应细胞的数量或活性。
本发明的抗体可单独施用，或与其它类型的治疗联合施用，例如与抗炎症疗法、免疫抑制药物、免疫疗法、化学疗法、支气管扩张剂、抗IgE分子、抗组胺或抗白细胞三烯联用。
在优选的方面，该抗体被基本纯化(例如，基本不含有限制其作用或产生不想要的副作用的物质)。已知各种递送***，并可将它们用于施用本发明的抗体，包括注射，例如封装在脂质体中、微颗粒、微胶囊、能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的胞吞作用(例如，参见Wu等人，J Biol Chem262：4429(1987))、构建作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸等。
抗-OX40抗体可以任意可接受的方式被施用至哺乳动物。递送的方法包括但不限于，肠胃外、皮下、腹腔内、肺内、鼻内、硬脑膜上和口服途径，且如果免疫抑制治疗需要，可进行病灶内施用。肠胃外灌输包括肌肉内、皮肤内、静脉内、动脉内或腹膜内施用。抗体或组合物可通过任何便捷的途径施用，例如灌输或大丸注射，经过上皮或皮肤粘膜(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部施用。此外，还希望将本发明的治疗性抗体或组合物通过任意合适的途径(包括室内注射和囊内注射)导入中枢神经***，室内注射可通过例如与贮器(例如Ommaya贮器)连接的室内导管进行辅助。此外，抗体适于通过脉冲灌输(pulseinfusion)施用，特别是伴随着抗体的下降剂量。优选地，剂量可通过注射给用，最优选通过静脉内或皮下注射给用，这部分取决于施用是短时的还是长期的。
也可通过，例如，吸入器或喷雾器的使用，并与烟雾化剂配制进行肺部施用。抗体还可以干粉组合物的形式施用至患者的肺中(参见，例如，美国专利6,514,496)。
在具体实施方案中，可能希望向需要治疗的区域局部施用本发明的治疗性抗体或组合物；这可通过(例如但非限制性的)局部灌输、局部应用、通过注射、通过导管方式、通过栓剂的方式、或通过植入物得以实现，所述植入物为多孔的、非多孔的或是凝胶状的材料，其包含膜，例如硅胶模或纤维。优选地，当施用本发明的抗体时，应注意使用不吸收蛋白的材料。
在另一实施方案中，抗体可在小囊中递送，特别是在脂质体中递送(参见，Langer，Science 249：1527(1990)；Treat等人，收录于Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer中，Lopez-Berestein等人编，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-27页；一般性地参见如上文献)。
在另一实施方案中，抗体可在控释***中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，Science 249：1527(1990)；Sefton，CRC Crit Ref Biomed Eng14：201(1987)；Buchwald等人，Surgery 88：507(1980)；Saudek等人，N Engl JMed 321：574(1989))。在另一实施方案中，可使用聚合材料(参见MedicalApplications of Controlled Release，Langer等人编，CRC Press(1974)；ControlledDrug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen等人编，Wiley(1984)；Ranger等人，J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23：61(1983)；还可参见Levy等人，Science 228：190(1985)；During等人，Ann Neurol 25：351(1989)；Howard等人，J Neurosurg 71：105(1989))。在另一实施方案中，控释***可被置于治疗靶标附近。
本发明还提供了药物组合物。这些组合物包含治疗有效量的该抗体和生理可接受的载体。在具体实施方案中，术语“生理可接受的”指被联邦或州政府的管理机构批准或者被美国药典或其它被普遍认可的药典中收录可用于动物、更具体地用于人。术语“载体”指与该治疗施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或云载体。这些生理载体可以是无菌液体，例如水和油，包括来自石油、动物、蔬菜或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物通过静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载体，特别适用于可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、干脱脂牛奶、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。根据需要，组合物还可包含极少量的润湿剂或乳化剂、或是pH缓冲剂。组合物可呈溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释剂型等形式。组合物可与传统结合剂和载体如甘油三酸酯配制为栓剂。口服剂型可包含标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的载体的例子描述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”。这些组合物将包含有效量的抗体(优选地呈纯化形式)以及适量的载体，从而提供正确施用至患者的形式。剂型应当适合施用的模式。
在一个实施方案中，可参照常规方法将组合物配制成适于静脉施用至人类的药物组合物。用于静脉内施用的组合物通常为无菌等张水性缓冲液中的溶液。根据需要，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)以缓解注射位点的疼痛。一般而言，成分可在单位剂型中单独提供也可混合在一起提供，例如，在密封容器(如标明了活性药剂量的安瓿或sachette)中作为冻干粉或无水浓缩物。当该组合物通过输注施用时，其可用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配。当组合物通过注射施用时，可提供安瓿的注射用无菌水或盐水，从而可在施用前混合这些成分。
本发明还提供了包含一个或多个容器的包装或试剂盒，所述容器填充了一种或多种本发明的药物组合物成分。这些容器任选地带有声明，该声明的形式由规范药物或生物产品的制造、使用和生产的政府机关制定，其内容反映了用于人体施用物品的生产、使用或销售的机关的批准。
此外，本发明的抗体还可偶联各种效应分子，例如异源多肽、药物、放射性核苷酸或毒素。例如参见，PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO89/12624；美国专利5,314,995；和EP 396,387。抗体或其片段可偶联至治疗性部分，例如细胞毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂、放射活性金属离子(例如，α-放射源如213Bi)。细胞毒素或细胞毒性药剂包括任何对细胞有害的药剂。例子包括，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啡啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BCNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C以及顺氯氨铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环(例如，道诺红菌素(之前为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D(之前为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、抗有丝***剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
用于将这些治疗性部分偶联至抗体的方法众所周知，例如，参见Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，收录于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Reisfeld等人(编)，第243-56页Alan R.Liss(1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For DrugDelivery”，收录于Controlled Drug Delivery，第二版，Robinson等人编，第623-53页Marcel Dekker(1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy：A Review，”收录于Monoclonal Antibodies′84：Biological AndClinical Applications，Pinchera等人编，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy″，收录于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection andTherapy，Baldwin等人，303-16页，Academic Press(1985)；以及Thorpe等人，Immunol Rev 62：119(1982)。可替代地，抗体可被结合至第二抗体，以形成异源偶联抗体(heteroconjugate)。例如参见，美国专利4,676,980。
本发明的偶联物可用于改变特定的生物应答，治疗剂或药物部分不应解释为仅限于经典化学治疗剂。例如，该药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽。这些蛋白可包括，例如，毒素，如相思子毒素、蓖麻毒素A、假单胞杆菌外毒素或白喉毒素；蛋白，例如肿瘤坏死因子，α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织型纤溶酶原激活剂、凋亡剂(例如，TNF-α、TNF-β)、AIM I(参见，国际专利公布WO 97/33899)、AIM II(参见，国际专利公布WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等人，Int Immunol，6：1567(1994))、VEGI(参见，国际专利公布WO 99/23105)；血栓形成剂；抗血管生成剂，例如血管他丁或内皮他丁；或生物应答调节剂，例如，淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)以及粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″))，或者其它的生长因子。
5.12基于抗体的基因疗法
在本发明的另一方面，包含编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸被通过基因疗法施用，以治疗、抑制或预防与OX40的异常表达和/或活性相关的疾病或病症。基因疗法指通过向个体施用表达的或可表达的核酸进行的疗法。在本发明的该实施方案中，核酸生成了它们编码的蛋白，该蛋白介导治疗性作用。现有的任意基因治疗方法均可用于本发明。以下描述示例性的方法。
基因治疗方法的一般综述可参见Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 12：488(1993)；Wu等人，Biotherapy 3：87(1991)；Tolstoshev，Ann Rev Pharmacol Toxicol32：573(1993)；Mulligan，Science 260：926(1993)；Morgan等人，Ann Rev Biochem62：191(1993)；May，TIBTECH 11：155(1993)。
一方面，所述化合物包含了编码抗体的核酸序列，所述核酸序列是在合适的宿主中表达所述抗体或其片段或嵌合蛋白或其重链或轻链的表达载体的一部分。特别地，这些核酸序列具有可操作地连接至抗体编码区的启动子，所述启动子是可诱导型或为组成型，并任选地具有组织特异性。
在另一具体实施方案中，所使用的核酸分子中抗体编码序列和任意其它目标序列被促进在基因组的所需位点上发生同源重组的区域所包夹，从而提供了抗体编码核酸的染色体内表达(Koller等人，Proc Natl AcadSci USA86：8932(1989)；Zijlstra等人，Nature 342：435(1989))。在具体实施方案中，表达的抗体分子为单链抗体；可替代地，核酸序列包含同时编码抗体的重链和轻链或其片段的序列。
核酸向患者的递送可以是直接的，此时患者直接暴露至该核酸或核酸-携带载体；也可以是间接的，此时首先在体外以核酸转化细胞，然后将细胞移植进入患者。这两种方法分别被称为体内或间接体内基因疗法。
在具体实施方案中，核酸序列被直接施用至体内，在体内该核酸序列将被表达以生成编码产物。这可通过本领域已知的多种方法中的任意方法实现，例如，通过将其构建为合适核酸表达载体的一部分，并通过例如缺陷逆转录病毒或减毒逆转录病毒或其它病毒载体的感染施用该载体，使序列进入细胞内(参见美国专利4,980,286)；或通过直接注射裸露DNA；或通过微粒轰击(例如，基因枪法；Biolistic，Dupont)；或以脂质或细胞表面受体或转染剂包覆，包封在脂质体、微粒或微胶囊中；或通过将其与已知进入细胞核的的肽相连接进行施用；通过将其与受到受体介导的内吞作用的配体相连接进行施用(例如参见，Wu，et ah，J Biol Chem 262：4429(1987))(其可用于靶向特异性表达该受体的细胞类型)等。在另一实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中该配体包含融合的病毒肽以破坏内涵体，使核酸避免溶酶体降解。在另一实施方案中，该核酸可通过靶向特异性受体在体内定向，从而进行细胞特异性摄取和表达(例如，参见PCT公开WO 92/06180；WO 92/22635；WO92/20316；WO93/14188，WO 93/20221)。可替代地，核酸可被导入胞内，并通过同源重组被整合至该宿主细胞DNA中以进行表达(Koller等人，Proc Natl Acad SciUSA 86：8932(1989)；Zijlstra等人，Nature 342：435(1989))。
在具体实施方案中，使用了包含编码本发明抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等人，Meth Enzymol 217：581(1993))。这些逆转录载体包含正确包装病毒基因组并整合进入宿主细胞DNA所必需的成分。将在基因疗法中使用的编码抗体的核酸序列被克隆进入一种或多种帮助基因递送进入患者的载体中。有关逆转录病毒载体的更多细节可参见Boesen等人，Biotherapy 6：291(1994)，其描述了逆转录病毒载体递送mdr1基因进入造血干细胞，以使干细胞对化疗更具耐受力的用途。其它阐述逆转录病毒在基因疗法中的用途的参考文献为：Clowes等人，J CHn Invest 93：644(1994)；Kiem等人，Blood 83：1467(1994)；Salmons等人，Human Gene Therapy4：129(1993)；以及Grossman等人，Curr Opin Gen and Dev 3：110(1993)。
腺病毒也可被用于本发明。腺病毒是本发明中用于向呼吸道上皮细胞递送抗体的特别受人关注的运载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮细胞。基于腺病毒的递送***的其它靶标为肝、中枢神经***、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非***细胞的优势。Kozarsky等人，Curr Opin Gen Dev 3：499(1993)提供了基于腺病毒的基因疗法的综述。Bout等人，Human Gene Therapy5：3(1994)证实了腺病毒载体在向恒河猴的呼吸道上皮细胞递送基因中的用途。腺病毒在基因疗法中的用途的其它例子可参见Rosenfeld等人，Science252：431(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68：143(1992)；Mastrangeli等人，J ClinInvest 91：225(1993)；PCT公开WO94/12649；Wang等人，Gene Therapy 2：775(1995)。腺相关病毒(AAV)也已被提议用于基因疗法(Walsh等人，Proc Soc ExpBiol Med 204：289(1993)；美国专利5,436,146；6,632,670；和6,642,051)。
基因疗法的另一方法包括通过诸如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等方法将基因转移进入组织培养中的细胞。转移方法通常包括将可选择标记物转移进入该细胞。然后对该细胞进行选择，以分离那些摄取并表达转移基因的细胞。这些细胞随后被递送进入患者。
在该实施方案中，核酸首先被导入细胞，随后在体内施用所得的重组细胞。该种导入可通过本领域任何已知的方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领域中已知多种技术可用于将外源基因导入细胞(例如，参见Loeffler等人，Meth Enzymol217：599(1993)；Cohen等人，Meth Enzymol 217：618(1993)；Cline，Pharmac Ther29：69(1985))，这些技术在受体细胞必要的发育和生理功能未被破坏的前提下可用于本发明。该技术应能将核酸稳定转移至细胞，从而使核酸可被细胞表达，并优选可被该细胞子代继承和表达。
所得的重组细胞可通过本领域已知的各种方法递送至患者。重组血细胞(例如，造血干或祖细胞)优选通过静脉内施用。预期使用的细胞的量取决于所需的效果、患者状态等，并可由本领域技术人员确定。
为基因治疗目的导入核酸的细胞包括任意希望的、可获取的细胞类型，并包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是造血干细胞或祖细胞，例如，由骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等获得的造血干细胞或祖细胞。
在一个实施方案中，用于基因疗法的细胞与患者自体同源。编码本发明的抗体的核酸序列被导入细胞，从而使它们可被细胞或其后代所表达，然后该重组细胞可被体内施用以达到治疗效果。在具体实施方案中，使用了干细胞或祖细胞。可被分离并在体外维持的任意干细胞和/或祖细胞均潜在地可被用于本发明的该实施方案(例如，参见PCT公开WO 94/08598；Stemple等人，Cell 71：973(1992)；Rheinwald，Meth Cell Bio 21A：229(1980)；Pittelkow等人，Mayo Clinic Proc 61：771(1986))。
6.实施例
本发明可进一步通过本发明优选实施方案的如下实施例阐述，但应理解这些实施例仅为阐述目的被包含在本文中，除非另行指明，无意限制本发明的范围。
实施例1：人OX40/FC免疫原的制备
两种形式的OX40受体被用作免疫原以生成本发明的拮抗剂抗-OX40抗体。第一种是表达为融合蛋白的人OX40受体的可溶形式，该融合蛋白包含了人Fcγ1和SEQ ID NO：1的核苷酸残基105至627编码的胞外结构域。第二种形式是基于细胞的免疫原，其包含了在稳定转染的小鼠纤维原细胞L-细胞表面表达的全长OX40。
OX40的可溶形式由从TCR-激活的人CD4T-细胞分离的OX40cDNA克隆而克隆得到。用于生成OX40cDNA克隆的两种引物为：(1)具有核苷酸序列cccaagctttaccccagcaacgaccggtgctgc(SEQ ID NO：3)的含HindIII位点的正义引物，和(2)具有核苷酸序列cgcctcgaggacctccacgggccgggtgg(SEQ ID NO：4)的含XhoI位点的与人Fcγ1同框的反义引物。所得的540bp PCR片段被亚克隆进入市售载体，该载体在5′端含有分泌信号肽序列，在3′端含有人Fcγ1序列(铰链和恒定区CH2和CH3)。该构建体的组成通过测序确定。
为进行瞬时表达，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)并参照制造商的方案将OX40/Fcγ1 DNA转染进入293T-细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。转染后72小时，从转染的细胞采集培养上清液以进行纯化。同样在293T-细胞系中建立OX40/Fcγ1的稳定表达。为了确认表达，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析培养上清液。将分离的蛋白转移至硝基纤维素膜，并以辣根过氧化酶(HRP)偶联的小鼠抗人IgG(Fc)单克隆抗体(Sigma，St.Louis，MO)检测或用多克隆山羊抗-OX40抗体(R&DSystems，Minneapolis，MN)并以HRP-驴抗-山羊IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)检测。免疫活性蛋白通过增强化学发光检测(Pierce，Rockford，IL)在膜上鉴定。使用在磷酸盐缓冲液(PBS)中平衡的蛋白-A亲和柱(Invitrogen，Carlsbad，CA)纯化OX40/Fcγ1。将该细胞培养上清液加到柱上后，先后用大约20倍柱体积的PBS和SCC缓冲洗涤液(0.05M柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 6.0)洗涤树脂，以去除未结合的蛋白。该OX40融合蛋白在以0.05M柠檬酸钠、0.15M氯化钠(pH 3.0)洗脱后在PBS(pH 7.0)中透析。通过SDS-PAGE分析来自亲和柱的含OX40/Fcγ1的组分。通过考马斯亮蓝染色分析该蛋白的纯度，并采用上述山羊抗-人IgG(Fc)抗体(Sigma，St Louis，MO)和山羊抗-人OX40抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)通过Western免疲印迹鉴定该蛋白。
第二种形式的免疫原采用由TCR-激活的人CD4 T-细胞克隆的全长人OX40 cDNA进行构建。所用的两种引物为具有核苷酸序列caccatgtgcgtgggggctcggcggctggg(SEQ ID NO：5)和gatcttggccagggtggagtgggcgtcggcc(SEQ ID NO：6)的OX40-特异性引物。所得的PCR产物被直接克隆进入市售载体，并稳定转染进入小鼠L成纤维细胞，以表达高水平的OX40。在施用前，使用A型GammaCell 1000 Elite(MDSNordion，Ottawa Canada)以6800Grays辐射该基于细胞的免疫原L-细胞，从而抑制该免疫原的增殖。
实施例2：抗-OX40单克隆抗体的生成
将大约20μg的可溶OX40/Fcγ1免疫原与弗氏佐剂(1∶1)混合，并以7天间隔经三次皮下注射后一次腹膜内注射(无佐剂)施用至两只六周大A/J小鼠(Harlan，Houston，Tex.)。最后一次注射三天后，根据下文Groth和Scheidegger(JImmunol Methods，1980)所述的方法将免疫小鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合。
对于基于细胞的免疫原，将3×106个经γ-辐射的OX40-稳定转染的L-细胞以7天间隔经三次皮下注射(于PBS中)后一次腹膜内注射施用至六周大的A/J小鼠(Harlan，Houston，Tex.)。最后一次注射三天后，根据下文将免疫小鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合。
在导致抗-OX40 mAb生成的融合中，由免疫小鼠的脾制备单细胞悬浮液，并采用合适的融合剂聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak，Rochester，NY)和5％二甲亚砜(Sigma，St Louis，MO)与永生化Sp2/0骨髓瘤细胞(以1∶1的比例)融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，第59-103页(1986)。10天后，在合适的DMEM完全培养基中(Invitrogen，Carlsbad，CA)培养该杂交瘤细胞系，该培养基优选包含次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)，这是一种抑制未融合的、永生化细胞的生长或存活的物质。从2个融合实验得到24000个优选永生化细胞系，这些细胞系有效融合，支持抗体的稳定、高水平生产，并对HAT培养基敏感。
实施例3：拮抗剂抗-OX-40抗体的筛选
测定生长杂交瘤细胞的培养基中针对OX40的单克隆抗体(mAb)的生成。通过三种不同的方法测定杂交瘤生产的mAb的结合特异性：FMAT、ELISA和流式细胞仪免疫测定。
A.FMAT筛选
使用FMAT方法，通过与OX40-瞬时转染的L-细胞、而非假的未转染的L-细胞的强反应性鉴定220个分泌小鼠抗-人OX40mAb的杂交瘤细胞系。抗-OX40杂交瘤悬浮液采用大共焦筛选平台进行FMAT筛选，以在96-孔微滴定板中对细胞数和荧光进行成像和定量。将表达OX40抗原的L-细胞与5μl抗-OX40杂交瘤上清液孵育，并用在筛选缓冲液中稀释至0.125μg/ml的Cy-5-偶联的山羊抗-小鼠IgG-Fcγ抗体(Jackson Laboratories，PA)进行荧光标记。在2小时后孵育后，使用FMAT 8100 HTS***(Applied Biosystem，CA)扫描该平板。在下文表1中的结果显示克隆B24和B39具有与阳性对照相当的活性。
B.ELISA筛选
在4℃下用OX40/Fcγ1(5ng/微孔)或作为筛选对照的人Fcγ1(25ng/微孔)涂覆聚氯乙烯96孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)过夜，然后与含有2％BSA的PBS孵育一小时以封闭非特异性结合。添加大约50μl的杂交瘤悬浮液，并孵育1小时。用0.05％
Figure A20088001391400901
-PBS洗涤四次后，在室温下于1小时中添加大约0.2μg的HRP-山羊抗-小鼠IgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch Laboratories，PA)，以检测结合的抗-OX40抗体的存在。向每个微孔添加100μl的1mM TMB(Sigma)新鲜配制的底物溶液30分钟，并通过添加50ml的0.2M H2SO4终止反应，并用酶标仪(Molecular Devices，CA)在450nm读板。在24000微孔中，有220个被FMAT和ELISA认定为阳性。代表性的数据报道于表1中。
表1
                FL1(平均荧光)    荧光细胞数    OD450
克隆#B24        5560             39            3.4
克隆#B39        7665.3           44            3.6
阴性对照        0                0             NA
阳性对照        5028.5           41            NA
C.流式细胞术筛选
还使用OX40稳定转染的L-细胞通过流式细胞术测试由FMAT和ELISA选出的220个阳性杂交瘤，所述L-细胞用5μl的抗-OX40杂交瘤上清液染色并用FITC-偶联的山羊抗小鼠IgG-Fcγ抗体(Jackson Laboratories，PA)荧光标记。表2中显示的数据表示采用抗-OX40杂交瘤上清液染色的总OX40-转染的L-细胞的百分比。
表2
                克隆#B2       克隆#B17        克隆#B36        克隆#B37
                ％荧光细胞    ％荧光细胞      ％荧光细胞      ％荧光细胞
L-细胞          0.82          0.7             0.9             0.4
OX40L L-细胞    30.4          0.3             15.0            32.7
从表1和2鉴定的220个抗-OX40单克隆抗体，B2、B24、B36、B37和B39号抗-OX40单克隆抗体克隆显示了与OX40L L-细胞而非对未转染的L-细胞的阳性结合。B-17由于未显示结合OX40L L-细胞而被排除。
实施例4：拮抗剂抗-OX40单克隆抗体的初始表征
当鉴定了能够生产特异性针对人OX40的抗体的220个杂交瘤后，克隆通过有限稀释法进行亚克隆并以标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，第59-103页(1986))。由亚克隆分泌的220种抗-OX40 mAb采用蛋白A-琼脂糖通过常规纯化步骤从该培养基纯化。
A.细胞系制备
采用特异性细胞系和新鲜分离的人初始CD4+T-细胞检验OX40共刺激对人CD4+T-细胞发育的影响，以表征220个抗-OX40mAb结合剂。这些细胞系包括：(1)OX40转染的人Hut-78白血病CD4+T-细胞系，(2)OX40L-转染的L纤维原细胞小鼠L-细胞及其亲代细胞系(由M.D.Anderson Cancer Center，Houston，TX的Yong-Jun Liu博士提供)，(3)人初始CD4+T-细胞，和(4)在人IL-4和GM-CSF存在下培养并由分离的CD14+单核细胞分化的人树突细胞(DC)。从健康成年个体采集的血液的白细胞层组分被用作通过磁性耗竭(magnetic depletion)分离的人初始T-细胞的来源(CD4+、CD45RA+、CD45RO-和CD 14-表型)；作为通过细胞分选分离的CD11c+树突细胞(DC)的来源；或作为分化成为不成熟的DC的分离CD 14+单核细胞的来源。
B.功能测定
1.Hut-78测定
在经辐射(6800cGray)的OX40L-转染的L-细胞或未转染的L-细胞的存在下，用5μg/ml抗-CD3(OKT3，BD Bioscences，CA)和1μg/ml抗-CD28mAb(CD28.2，BD Bioscences，CA)将OX40转染的人Hut-78白血病CD4+T-细胞致敏48小时(OX40-Hut78细胞/L-细胞比例为4∶1)。在测定开始添加在实施例3中鉴定的220个抗-OX40mAb，以筛选拮抗性活性，该拮抗剂活性被定义为CD4+T-细胞细胞因子释放的抑制。采用同样的方案将该测定重复三次。在表3中总结的实验是***性抗-OX40mAb(B66、B76和B86)的例子，并显示在OX40L转染的细胞存在下激活的T-细胞产成的IL-2(138pg/ml)和IL-13(620pg/ml)比未转染的L-细胞存在下激活的T-细胞(IL-2为22pg/ml，而IL-13为70pg/ml)高至少10倍。添加在细胞培养物中的纯化的抗-OX40mAbB66和B76以剂量应答方式阻断了Hut-78CD4+T-细胞系细胞因子生成。克隆B66在最高浓度下抑制了88％的IL-2和92％的IL-13细胞因子生产。在所测试的220个抗-OX40mAb中，选择了10个显示了对IL-2和IL-13细胞因子生成具有60％以上的抑制的克隆(数据未显示)。
表3
OX40         OX40                            OX40  Hut78+
Hut-78+      Hut78+                                +
             +                               OX40L-L 细胞+
             L-细胞
细胞因                   IC            B66            B76             B86
子生成                   (n:3)         (n:3)          (n:3)           (n:3)
Ab浓                  0   20   0   1    5    20   0    1    5    20   0    1    5    20
度
(μg/ml)
IL2      22    0    138  148  138  61   27   15   138  69   21   12   138  161  135  152
(pg/ml)  8.7   5.2  13.9 13.5 13.9 1.1  3    5.7  13.9 10.1 8.6  9.3  13.9 15   6.3  26.8
±SD
IL13     70    0    620  712  620  139  95   41   620  316  234  223  620  623  616  645
(pg/ml)  0     18.7 49.5 64.7 49.5 33.3 21.1 23.6 49.5 11.3 25.1 4624 9.52 2.82 7.91 7.1
+SD
C.初始CD4+T-细胞测定
为了阻断OX40对T-细胞增殖和细胞因子生成的共刺激，对220个抗-OX40mAb抑制细胞因子生成、增殖和诱导人CD4+T-细胞凋亡的能力进行功能性筛选。初始人CD4+T-细胞采用市售的初始CD4+T-细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)从健康成年志愿者(Gulf Coast Regional BloodCenter，Houston，TX)的人血液的白细胞层分离得到。分离的初始人CD4+T-细胞用5μg/mL抗-CD3(OKT3，BD Biosciences，CA)和1μg/ml抗-CD28mAb(CD28.2，BD Biosciences，CA)在经辐射的OX40L-转染L-细胞或亲代L-细胞的存在下(L-细胞/初始CD4+T-细胞的比例为1∶4)激活。培养七天后，在OX40L转染子存在下激活的初始CD4+T-细胞生成的IL-2和IL-13比L-细胞存在下致敏的细胞至少高10倍(图2)。采用来自R&D Systems(Minneapolis，MN)的ELISA-试剂盒测定细胞因子生成的水平。细胞在OX40共刺激的存在下同样增殖更多，如图3所示。对于图2和3：空心方框代表初始CD4；空心三角代表初始CD4+与对照L-细胞；实心三角代表B66与初始CD4+和OX40L L-细胞；实心方框代表2C4(同种型对照)与初始CD4+和OX40L L-细胞；而实心圆圈代表G3-519不相关mAb对照与初始CD4+和OX40L-L-细胞。
向培养物中添加抗-OX40mAb B66抑制了细胞因子释放(图2)、细胞增殖(图3)，且与2C4或G3-519对照相比，在CD4+T-细胞中以剂量依赖型方式诱导了凋亡(表4)。
表4
                                           凋亡细胞(％)   存活抑制(％)
初始CD4+T-细胞+L-细胞                      21.9           22
初始CD4+T-细胞+OX40L L-细胞                11.0           11
初始CD4+T-细胞+OX40L L-细胞+B66(20μg/ml)  37.9           38
初始CD4+T-细胞+OX40L L-细胞+A10(20μg/ml)  32.3           32
初始CD4+T-细胞+OX40L L-细胞+IC：G3-519(20  11.7           12
μg/ml)
实施例5：选定的拮抗剂抗-OX40mAb的进一步表征
细胞因子可以控制初始CD4+的分化，形成通过其细胞因子生成谱定义的T-细胞子集。IL-12推动Th1细胞的分化，该细胞主要生成IFN-γ和IL-2并控制细胞介导的免疫和炎症前应答。IL-4使初始CD4+T-细胞向Th2细胞分化，该Th2细胞主要生成IL-4和IL-5并负责控制体液免疫和抗炎症应答。两种由初始表征选定的抗-OX40mAb，A10和B66，均在Th1和Th2细胞中测试其阻断增殖存活和细胞因子释放的能力。为此，它们首先被转化为包含鼠亲代抗体可变区和人恒定区的嵌合形式。所有商业抗体和细胞因袭均从BDBiosciences，CA购得。
A.Th1测定
人初始CD4+T-细胞按上文实施例4(B)(2)所述采用试剂盒从人血液的白细胞层分离得到。采用5μg/ml抗-CD3(OKT3，1μg/ml抗-CD28(CD28.2)和10μg/ml抗-IL-4中和抗体(MP4-25D2)在添加了50ng/ml IL-12细胞因子的培养基中将细胞致敏7天，以诱导Th1-细胞因子生成谱。将该细胞与抗-CD3和抗-CD28mAb在经辐射的OX40L-转染的L-细胞或亲代L-细胞的存在下(L-细胞/初始CD4+T-细胞比例为1∶4)培养。由对膜连蛋白染色呈阳性的CD4+细胞数量的减少可见，OX40共刺激提高了Th1效应细胞的存活(表5)。在经辐射的L-细胞共培养开始时添加嵌合抗-OX40mAb B66，抑制该种存活。OX40共刺激也提高IFN-γ生成，且B66的添加以剂量依赖方式抑制其生成(表6)。
表5
                                            Th1存活(％)
初始CD4+T-细胞+L-细胞                       52.6
初始CD4+T-细胞+OX40L L-细胞                 65.9
初始CD4+T-细胞+OX40L L-细胞+B66(0.2μg/ml)  58.4
初始CD4+T-细胞+OX40L L-细胞+B66(2μg/ml)               55.9
初始CD4+T-细胞+OX40L L-细胞+B66(20μg/ml)              53.2
表6
                                      IFN-γ浓度(pg/ml)SD(n:3)
Th1细胞                               10280.2          123.0
Th1细胞+L-细胞                        10934.4          267.7
Th1细胞+OX40L L-细胞                  33040.4          237.5
Th1细胞+OX40L L-细胞+B66(0.2μg/ml)   17148.3          234.6
Th1细胞+OX40L L-细胞+B66(2μg/ml)     11049.3          141.7
Th1细胞+OX40L L-细胞+B66(20μg/ml)    11540.6          51.6
B.Th2测定
参照上文所述分离人初始CD4+T-细胞。采用5μg/ml抗-CD3、1μg/ml抗-CD28和10μg/ml抗-IFN-γ中和抗体在添加了50ng/ml IL-4细胞因子的培养基中将细胞致敏7天，以诱导Th2-细胞因子生产谱。将该细胞与抗-CD3和抗-CD28mAb在经辐射的OX40L-转染的L-细胞或亲代L-细胞的存在下(L-细胞/初始CD4+T-细胞比例为1∶4)培养。由对膜连蛋白染色呈阳性的CD4+细胞数量的降低可见，OX40共刺激提高了Th2效应细胞的存活(图4)。在经辐射的L-细胞共培养开始时，添加抗-OX40mAb A10和B66抑制该种存活(图4)，并以剂量依赖方式抑制Th2细胞增殖(图5)以及IL-2(图6A)和IL-13(图6B)的细胞因子生成。
C.Th17测定
在IL-23存在下致敏的T-细胞的独特子集表征为生成IL-17，并关键性地参与某些慢性炎症疾病的发病机理。最近的数据显示Th17细胞代表了早期自Th1和Th2系分出的CD4+T-细胞的完全分离的细胞系，并被支配Th1和Th2细胞的发育的细胞因子和信号转导途径所拮抗。Th17T-细胞被致敏以研究OX40共刺激的作用和拮抗性抗-OX40mAb抑制Th17分化的能力。
初始CD4+T-细胞参照实施例4(B)(2)所述从白细胞层分离。在100ng/mlIL-23细胞因子(R&D，Minneapolis，MN)、hIL-6和hTGFβ1各20ng/ml、5μg/ml预涂覆的抗-CD3(OKT3，BD Biosciences，CA)、1μg/ml可溶抗-CD28(CD28.2)、抗-IL4(MP4-25D2)以及抗-IFN-γ(B27)各10μg/ml的存在下将这些细胞致敏7天。洗涤经致敏的细胞，并将其与抗-CD3和抗-CD28mAb在经辐射的OX40L-转染的L-细胞或亲代L-细胞的存在下(L-细胞/初始CD4+T-细胞比例为1∶4)再传代培养3天。通过以OX40L-L-细胞诱导OX40共刺激，Th17细胞相比于无OX40L共刺激下培养的相同细胞增殖4倍。抗-OX40mAb A10和B66以剂量依赖方式抑制Th17增殖(表7)。
表7
                                           CMP平均  ±SD
                                           (n:3)
Th17细胞+L-细胞                            18092    2592.6
Th17细胞+OX40L L-细胞                      66035.7  2106.2
Th17细胞+OX40L L-细胞+同种型对照(20μg/ml) 70176.7  3080.8
Th17细胞+OX40L L-细胞+A10(0.2μg/ml)       70176.7  7622.6
Th17细胞+OX40L L-细胞+A10(2μg/ml)         40347.7  8059.5
Th17细胞+OX40L L-细胞+A10(20μg/ml)        17456.7  563.9
Th17细胞+OX40L L-细胞+B66(0.2μg/ml)       46735.3  10667.1
Th17细胞+OX40L L-细胞+B66(2μg/ml)         31658.0  5492.6
Th17细胞+OX40L L-细胞+B66(20μg/ml)        18336.3  956.4
表8的数据显示了OX40L明显增加Th-17存活(68％对84％)。增加的存活被抗-OX40mAb A10和B66以剂量依赖方式抑制(表8)。
表8
                                           Th-17存活(％)
Th17细胞+L-细胞                            68.4
Th17细胞+OX40L L-细胞                       84.3
Th17细胞+OX40L L-细胞+同种型对照(20μg/ml)  84.3
Th17细胞+OX40L L-细胞+A 10(0.2μg/ml)       80.7
Th17细胞+OX40L L-细胞+A10(2μg/ml)          72.3
Th17细胞+OX40L L-细胞+A10(20μg/ml)         70.7
Th 17细胞+OX40L L-细胞+B66(0.2μg/ml)       77.0
Th17细胞+OX40L L-细胞+B66(2μg/ml)          74.1
Th 17细胞+OX40L L-细胞+B66(20μg/ml)        67.3
通过评估蛋白存活素(Survivin)(一种凋亡抑制剂和OX40蛋白的潜在靶标)的胞内表达，OX40刺激增加了它的表达。该增加的表达被抗-OX40mAb A10和B66以剂量依赖方式抑制(表9)。
表9
                                            存活素表达(％)
Th17细胞+L-细胞                             19.2
Th17细胞+OX40L L-细胞                       49.0
Th17细胞+OX40L L-细胞+同种型对照(20μg/ml)  45.4
Th17细胞+OX40L L-细胞+A10(0.2μg/ml)        34.3
Th17细胞+OX40L L-细胞+A10(2μg/ml)          22.8
Th17细胞+OX40L L-细胞+A10(20μg/ml)         15.4
Th17细胞+OX40L L-细胞+B66(0.2μg/ml)        45.2
Th17细胞+OX40L L-细胞+B66(2μg/ml)          28.3
Th17细胞+OX40L L-细胞+B66(20μg/ml)         20.3
与Th1致敏细胞相比，TH17细胞在致敏初始CD4+T-细胞7天后显示了明显更高的IL-17水平。在对Th17与经辐射的OX40L转染的L-细胞或亲代L-细胞进行了额外的共培养后，与Th1致敏细胞相比，Th17细胞在OX40共刺激下生成了显著水平的IL-17。与同种型对照G3-519(IC)相比，该IL17生成被嵌合抗-OX40mAb A10和B66以剂量依赖方式抑制(表10)。
表10
                      TH-17                 TH-1
                      IL-17浓度  SD         IL-17浓度 SD
                      (pg/ml)    (n:3)     (pg/ml)    (n:3)
CD4+细胞+L-细胞                        409.7    41.1    29.8    5.4
CD4+细胞/OX40L L-细胞                  2264.1   40.8    20.5    4.7
CD4+细胞/OX40L L-细胞+IC(20μg/ml)     2032.7   90.0    56.1    10.7
CD4+细胞/OX40L L-细胞+A 10(0.2μg/ml)  2054.6   254.0   41.4    8.4
CD4+细胞/OX40L L-细胞+A10(2μg/ml)     1795.1   304.6   39.3    9.4
CD4+细胞/OX40L L-细胞+A 10(20μg/ml)   1059.9   448.6   54.1    5.7
CD4+细胞/OX40L L-细胞+B66(0.2μg/ml)   2296.3   56.8    56.6    5.8
CD4+细胞/OX40L L-细胞+B66(2μg/ml)     1144.0   224.5   63.1    3.7
CD4+细胞/OX40L L-细胞+B66(20μg/ml)    1069.5   224.5   71.5    6.9
D.L106比较
采用实施例4(B)(2)中相同的方案，将抗-OX40mAb A10和B66在OX40共刺激存在下抑制激活的人CD4+T-细胞释放细胞因子IL-2和IL-13的能力与市售的抗-OX40抗体L106(BD Biosciernce，San Jose，CA)进行比较。L106对细胞因子生成的抑制与对照抗体并无统计学差异(参见图7)。因此，该抗体表现为非功能性的(即，没有激动或拮抗活性)。
实施例6：抗-OX40mAb的人源化
鼠mAb A10和B66的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的核酸序列显示在图14A-D中。图12提供了鼠抗体的轻链可变区(来自于252-B66和252-A10的DNA序列)的氨基酸序列与选定的人轻链模板的比较。两种抗体均可作为OX40拮抗剂并彼此竞争。将这些序列与公共数据库中可获取的人抗体种系序列进行比较。在决定模板时使用多种标准，包括总体长度、框内类似的CDR位置、总体同源性、CDR的大小等。所有这些标准共同提供了最佳人模板，如图12A和图12B中图示的A10和B66mAb重链和轻链序列与相应人模板序列的序列比对所显示的。噬菌体载体中的嵌合Fab被构建为对照，其组合了鼠A10的可变区和人κ链的恒定区和人IgG的CH1部分。
在该情况下，一个以上的人框架模板被用于设计该抗体。为VH链选择的人模板是亚组V1的IGHV1-46(Gene Bank录入号X92343)和种系IGHJ4(GeneBank录入号J00256)的组合(参见图12B)。为VL链选择的人模板是IGKV4-1(Gene Bank录入号Z00023)和种系J模板IGHJ1(Gene Bank录入号J00242)的组合(参见图12A)。图12B提供了鼠抗体的重链可变区的氨基酸序列(来自于DNA序列)，其与选定的人种系模板和A10(TH)hu336F的人源化可变区序列的比对。氨基酸序列的编号可参照Kabat方法进行。来自于A10的鼠CDR被嫁接至人可变框架。在该序列中，在该框架中的氨基酸残基的总数为87；在该人和鼠框架之间不同的氨基酸残基的总数为21，在人源化重链的框架中未残留鼠源残基。
序列比较揭示鼠抗体B66在可变序列中仅有4个氨基酸不同于A10，但上文实施例4中讨论的功能分析显示了B66具有更高的OX40结合和拮抗剂活性。B66中的两个氨基酸变化位于该第一CDR，并自小鼠种系序列改变。据推测这些变化可能导致了B66的增强的活性。然而，当来自这些抗体的CDR被嫁接至人可变框架时，B66分泌极少，且因此相对不适于进一步开发。因此，B66的CDRL1和A10的CDR12和CDR13被选择嫁接至人可变模板上，以制备人源化抗-OX40拮抗剂。通过该方法，人源化A10分子的结合亲和性和拮抗剂活性相对于亲代鼠抗体被提高了。
A.通过BiaCore对抗-OX40Fab进行的动力学分析
图13显示了生成的分子相比于原始鼠分子的OX40结合活性。CDRL1同样被突变，以反映A10的原始CDRL1序列。以B66的CDRL1替换A10的CDRL1导致“人源化”A10分子A10(TH)hu336F增高的结合活性。图15显示了人源化克隆A10(TH)hu336F、鼠A10及其嵌合形式对OX40的竞争相当。
实施例7：A10(TH)HU336F的人源化变体的表征
通过结合ELISA、基于细胞的结合测定和显示拮抗活性的进一步的功能测定对人源化A10候选物A10(TH)hu336F的六种变体进行筛选。对6种人源化A10的两种(变体A10-D和F)进行了六种功能性测定。
上述的人源化可变区被克隆进入哺乳动物表达载体，使得该人源化可变区与人恒定区在表达时框内融合。其它的人源化候选物也被克隆进入哺乳动物表达载体，以制备全抗体进行测试。这些其它的候选物包括具有原始A10CDRL1的人源化A10VL区(A&D)，Kabat编号34由精氨酸(N)改变为组氨酸(H)的人源化A10VL区(B&E)(该变体的CDR-L1包含氨基酸序列KASQTVDYDGDSYMH(SEQ ID NO：61))，以及在序列编号70包含鼠源亮氨酸(L)的替代性人源化VH区(A10L70)(Kabat编号69)。抗体以表11中所示的组合在哺乳动物细胞中表达。表12显示了相应的Biacore数据。这些人源化候选物的可变区以及鼠可变区的核酸序列显示于图14中。
表11
全抗体名称        κ可变候选物            重链可变候选物
A                  A10LC(SH)，            A10L70
B                  A10LC(SN)              A10L70
C                  A10LC(TH)hu336         A10L70
D                  A10LC(SH)              A10人源化
E                  A10LC(SN)              A10人源化
F                  A10LC(TH)hu336         A10人源化
表12
样本    KD[nM]    ka[M-1s-1]    SE(ka)    Kd[s-1]    SE(kd)     χ2
A       1.38      1.31e5        452       1.79e-4    7.44e-7    0.257
B       0.94      1.70e5        355       1.56e-4    6.50e-7    0.524
C       1.44      1.16e5        483       1.51e-4    8.28e-7    0.352
D       1.21      1.40e5        508       1.70e-4    8.55e-7    0.319
E       1.25      1.51e5        391       1.91e-4    8.48e-7    0.395
F        1.12    1.41e5    474    1.58e-4    7.53e-7    0.267
A.TCR-激活的初始CD4+T-细胞测定
根据上文实施例4(B)(2)所述的相同方案激活初始CD4+T-细胞。培养七天后，在OX40L存在下激活的初始CD4+T-细胞比L-细胞存在下致敏的细胞生成的IL-2、IL5和IL-13至少高10倍，且更为明显地增殖(图8)。
与同种型对照相比，人源化变体A10-D和A10-F以与A10的鼠源亲代和嵌合形式相同的水平抑制细胞因子(IL-2/IL-5/IL-13)释放和CD4+T-细胞增殖(图8)。
B.致敏T-细胞测定
在经辐射的OX40L转染的L-细胞或亲代L-细胞存在下测试人源化变体A10-D和A10-F的拮抗活性，对Th1致敏的T-细胞、Th2致敏的T-细胞和Th17细胞的增殖和细胞因子释放的抑制(参见实施例5的方案)。
在Th1条件下，与该同种型对照相比，人源化变体A10-D和A10-F以与嵌合(CC-A10)和亲代小鼠(M-A10)mAb相同的程度抑制IL-2、IL-5和IL-13细胞因子的生成和细胞增殖(图9)。
在Th2条件下，人源化变体A10-D和A10-F通过抑制激活的CD4+T-细胞的增殖和细胞因子释放(IL-2、IL-5和IL-13)显示了对激活的CD4+T-细胞的拮抗作用。(图10)。
人源化变体A10-D和A10-F还与它们的嵌合和小鼠抗-OX40mAb进行平行测试，以比较它们对Th17细胞增殖、IL-17细胞因子生成和细胞凋亡的拮抗活性。结果显示于表13中。
表13
Figure A20088001391401011
Figure A20088001391401021
通过以流式细胞术和膜连蛋白-V染色鉴定凋亡细胞，表12中所示的数据显示了OX40L显著增加了Th17凋亡，而人源化变体A10-D和A10-F与同种型对照G3-519处理(IC)相比以剂量依赖方式增加了凋亡(表14)。
表14
Figure A20088001391401022
C.Th2/TSLP-DC
CD11c+树突细胞(DC)从健康成年志愿者的血液的白细胞层分离。采用针对种系标记物CD3(OKT3)、CD14(M5E2)、CD15(HB78)、CD20(L27)、CD56(B159)和CD235α(10F7MN)的mAb的混合物通过阴性免疫选择从PBMC获得DC-富集群体。将该群体通过山羊抗-小鼠IgG-涂覆的磁性珠(M-450；MiltenyiBiotec；CA)以去除结合的细胞。CD11c+系和CD4+细胞通过FACS Aria(使用别藻蓝蛋白(APC)-标记的抗-CD 11c(B-1y6)、FITC-标记的mAb CD19(HIB 19)和CD56(NCAM 16.2)的混合物以及APC-Cy7-标记的CD4(RPA-T4)分离，以达到＞99％的纯度。将CD11c+DC培养在含2％人AB血清的Yssel培养基(Gemini Bio-Products，Woodland，CA)中。将细胞以2×105细胞/200ml培养基的密度接种于存在15ng/ml TSLP(重组人TSLP由M.D.Anderson CancerCenter的Yun-Jun Liu博士慷慨赠与)的平底96-孔板培养基中，孵育24小时。
同种异体的CD4+CD45RA+初始T-细胞(纯度＞99％)采用细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec，CA)分离，随后进行细胞分选(作为CD4+CD45RA+CD45RO-CD25-组分)。将细胞与洗过的TSLP-刺激的脊髓树突细胞(mDC)(DC/T-细胞比例，1∶5)在圆底96-孔培养板共培养7天。以mDC刺激一个周期后(7天)，采集并洗涤致敏的CD4+T-细胞。
为了在培养上清液中检测细胞因子生成，用平板结合的5μg/ml抗-CD3和1μg/ml可溶抗-CD28在106细胞/ml的浓度下重新刺激T-细胞48小时。通过ELSIA测定IL-5、IL-13和TNF-α的水平。与同种型对照抗体相比，以TSLP-激活的脊髓DC致敏的Th2细胞的细胞增殖和细胞因子生成在人源化变体A10-F的存在下受到抑制(表15)。
表15
Figure A20088001391401031
Figure A20088001391401041
为了胞内细胞因子生成，用50ng/ml PMA加上2μg/ml离子霉素刺激致敏的CD4+T-细胞6小时。在最后2小时中添加10μg/ml的brefeldinA(eBioscience，San Diego，CA)。用针对IL-2和IL-13的PE-标记的mAb与FITC-标记的抗IFN-γ或抗-TNF-α的组合使用固定和透化缓冲液(eBioscience，CA)将该细胞染色。与同种型对照抗体相比，在人源化变体A10-F的存在下，以TSLP-激活的脊髓DC致敏的Th2细胞中IL-2、IL-13和TNF-α细胞因子的生成受到抑制(表16)。
表16
Figure A20088001391401042
OX40共刺激提高了致敏Th2细胞的存活，这显示为以膜连蛋白染色的CD4+细胞数量的减少和具有胞内存活素蛋白表达的CD4+细胞数量的上升。然而，向该细胞培养物中添加人源化变体A10-F诱导了凋亡的显著上升和存活素的表达减少(表17)。
表17
Figure A20088001391401043
Figure A20088001391401051
D.Th1/LPS-DC方案
为了分析T-细胞针对Th1特征的分化，将初始CD4T-细胞与经LPS刺激的同种异体单核细胞衍生的DC共培养24小时。通过本领域熟知的标准方案从人PBMC生成DC。收获该低密度PBMC，并采用CD14-微珠和AutoMacs设备(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)阳性选择CD 14+细胞。为了诱导DC分化，将106细胞/ml的CD 14+单核细胞在含有500IU/ml人rGM-CSF(R&DSystems，MN)和400IU/ml人rIL-4(R&D Systems，MN)的完全培养基(RPMI-10％FBS)中在37℃下和5％CO2中培养。在第2或3天，向DC培养物中添加额外剂量的GM-CSF和IL-4。在第5天，通过轻柔吹吸收获非贴壁DC，并以1μg/ml LPS(Sigma-Aldrich，MO)重新培养。收获LPS-激活的DC，洗涤，并用于将初始CD4T-细胞致敏为Th-1分化的T-细胞。将该细胞以1∶4的DC/T-细胞比例培养于96-孔板中。同样测试人源化变体A10-D和A10-F的拮抗活性；以及抑制Th1致敏的T-细胞在LPS-激活的DC存在下的增殖和细胞因子生产的能力。与同种型对照相比，人源化变体A10-D和F以与嵌合(CC-A10)和小鼠(M-A10)变体mAb相同的程度抑制IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子的生成和细胞增殖的程度(图11)。对细胞增殖以及IFN-γ和TNF-α细胞因子生产的抑制并不完全，因为LPS-激活的DC可提供OX40以外的其它共刺激信号。
E.交叉反应性测定
根据公开文献，人和小鼠OX40蛋白被认为具有较低的同源性。与此一致，和同种型对照(IC∶2C4)相比，在ELISA平台中，嵌合A10和B66对小鼠OX40蛋白并未显示任何交叉反应性(表18)。
表18
              小鼠OX40Fc(ng/ml)           人OX40Fc(ng/ml)
OD450         0      3.9    62.5   250    0      3.9    62.5   250
B66           0.134  0.034  0.039  0.045  0.02   1.225  2.859  3.377
A10           0.025  0.04   0.035  0.035  0.019  1.308  2.586  2.832
IC(2C4)       0.035  0.046  0.078  0.294  0.02   0.031  0.027  0.031
抗-小鼠OX40Ab 0.051  2.486  4.0    4.0    0.026  0.047  0.046  0.083
因此，采用流式细胞染色以在临床前动物模型设置中测试抗-OX40mAb从而测定它们是否与猴OX40蛋白交叉反应。采用CD4微珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)将总CD4+T-细胞从恒河猴和短尾猴的总血液和从人白细胞层分离。采用5μg/ml的预涂覆抗-CD3mAb(SP34，能够与人以及恒河猴和短尾猴两种物种的CD3蛋白交叉反应)和1μg/ml可溶抗-CD28mAb(CD28.2，能够与人以及恒河猴和短尾猴两种物种的CD28蛋白交叉反应)将分离的细胞激活2天。使用与猴以及人CD4(L200)和CD25(M-A251)蛋白交叉反应的抗体对细胞进行表面染色。对于OX40细胞表面表达，采用与PE偶联的人源化A10-FOX40mAb。数据分析显示A10-F容易地识别人、恒河猴和短尾猴激活的CD4T-细胞(表19)。
表19
                                激活的CD4+T-细胞识别％
人                              70
短尾猴                          88
恒河猴                          75
实施例8：表位定位
A10(TH)hu336F结合的OX40表位采用两种标准的表位定位方法(酵母表面展示和嵌合分子的构建)进行定位。在酵母表位展示中，OX40的胞外结构域在酿酒酵母中作为能够被分泌并在酵母表面展示的融合蛋白进行表达。OX40表达载体的随机突变允许OX40突变体蛋白库在酵母表面表达。表达不能结合OX40的蛋白的突变体(通过C-末端标记的存在进行测定)采用荧光抗体染色并通过FACS分离。突变体表达质粒从援救酵母(rescued yeast)分离和测序，以确定A10(TH)hu336F-OX40结合需要哪个氨基酸残基。
第二种表位定位方法依赖于以下发现：A10(TH)hu336F结合人而非鼠OX40。构建嵌合OX40分子，其中人OX40区域被鼠OX40的同源区替换。该嵌合分子在哺乳动物细胞表面上表达，并通过FACS监测其与荧光标记的A10(TH)hu336F的结合。该OX40结合表位可通过分析A10(TH)hu336F结合需要人OX40的哪些区域进行确定。
本领域技术人员可通过不超越常规实验以外的方法认识或者能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的众多等同方式。本发明的权利要求意在包含这些等同方式。
序列表
<110>健泰科生物技术公司
拉姆哈迈斯-谢拉蒂，萨拉赫-艾迪尼
姚政彬
桑贾耶.辛格
<120>拮抗剂OX40抗体及其在炎性和自身免疫疾病的治疗中的用途
<130>12279-205-228
<140>未知
<141>
<150>60/903,693
<151>2007-02-27
<160>60
<170>用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210>1
<211>1084
<212>DNA
<213>智人
<400>1
cgaggatgtg cgtgggggct cggcggctgg gccgcgggcc gtgtgcggct ctgctcctcc 60
tgggcctggg gctgagcacc gtgacggggc tccactgtgt cggggacacc taccccagca 120
acgaccggtg ctgccacgag tgcaggccag gcaacgggat ggtgagccgc tgcagccgct 180
cccagaacac ggtgtgccgt ccgtgcgggc cgggcttcta caacgacgtg gtcagctcca 240
agccgtgcaa gccctgcacg tggtgtaacc tcagaagtgg gagtgagcgg aagcagctgt 300
gcacggccac acaggacaca gtctgccgct gccgggcggg cacccagccc ctggacagct 360
acaagcctgg agttgactgt gccccctgcc ctccagggca cttctcccca ggcgacaacc 420
aggcctgcaa gccctggacc aactgcacct tggctgggaa gcacaccctg cagccggcca 480
gcaatagctc ggacgcaatc tgtgaggaca gggacccccc agccacgcag ccccaggaga 540
cccagggccc cccggccagg cccatcactg tccagcccac tgaagcctgg cccagaacct 600
cacagggacc ctccacccgg cccgtggagg tccccggggg ccgtgcggtt gccgccatcc 660
tgggcctggg cctggtgctg gggctgctgg gccccctggc catcctgctg gccctgtacc 720
tgctccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg ggaggcagtt 780
tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc aagatctgac 840
ctgggcccac caaggtggac gctgggcccc gccaggctgg agcccggagg gtctgctggg 900
cgagcagggc aggtgcaggc cgcctgcccc gccacgctcc tgggccaact ctgcaccgtt 960
ctaggtgccg atggctgcct ccggctctct gcttacgtat gccatgcata cctcctgccc 1020
cgcgggacca caataaaaac cttggcagac gggagtctcc gaccggcaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaa                                                              1084
<210>2
<211>277
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
            20                  25                  30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
        35                  40                  45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
    50                  55                  60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65                  70                  75                  80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
                85                  90                  95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
            100                 105                 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
        115                 120                 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
    130                 135                 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145                 150                 155                 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
                165                 170                 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
            180                 185                 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
        195                 200                 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
    210                 215                 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225                 230                 235                 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
            260                 265                 270
Thr Leu Ala Lys Ile
        275
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>OX40的寡核苷酸引物
<400>3
cccaagcttt accccagcaa cgaccggtgc tgc                                 33
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>OX40的寡核苷酸引物
<400>4
cgcctcgagg acctccacgg gccgggtgg                                       29
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>OX40的寡核苷酸引物
<400>5
caccatgtgc gtgggggctc ggcggctggg                                      30
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>OX40的寡核苷酸引物
<400>6
gatcttggcc agggtggagt gggcgtcggc c                                    31
<210>7
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>鼠抗OX40抗体B66的可变轻链区
<400>7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Thr Val Asp Tyr Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>8
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>鼠抗OX40抗体A10的可变轻链区
<400>8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>9
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗-OX40抗体A10LC(TH)hu336可变轻链区
<400>9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Thr Val Asp Tyr Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Tle Lys
            100                 105                 110
<210>10
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>鼠抗OX40抗体A10的可变重链区
<400>10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile His Pro Lys Ser Gly Asn Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Glu Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
        115                 120
<210>11
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗-OX40抗体A10LC(TH)hu336可变重链区
<400>11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Glu Ile His Pro Lys Ser Gly Asn Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Glu Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>鼠抗OX40抗体B66的CDR-L1
<400>12
Lys Ala Ser Gln Thr Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met His
 1               5                  10                  15
<210>13
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗OX40抗体A10和B66的CDR-L2
<400>13
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
 1               5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗OX40抗体B66的CDR-L3
<400>14
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
 1               5
<210>15
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗OX40抗体A10的CDR-L1
<400>15
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
 1               5                  10                  15
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗OX40抗体A10的CDR-L3
<400>16
His Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr
 1               5
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗OX40抗体A10和B66的CDR-H1
<400>17
Ser Tyr Trp Met His
 1               5
<210>18
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗OX40抗体A10和B66的CDR-H2
<400>18
Glu Ile His Pro Lys Ser Gly Asn Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
 1               5                  10                  15
Gly
<210>19
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗OX40抗体A10和B66的CDR-H3
<400>19
Gly Pro Glu Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr
 1               5                  10
<210>20
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠抗OX40抗体A10的可变轻链区
<400>20
gacattgtgc tgacccaatc tccaacttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tacaacctat tactgtcacc agagtaatga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa                              333
<210>21
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠抗OX40抗体B66的可变轻链区
<400>21
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aactgttgat tatgatggtg acagttatat gcattggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa                              333
<210>22
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗OX40抗体A10B和A10E的可变轻链区
<400>22
gacatcgtga tgacccagag cccagacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60
atcaactgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacat gaactggtac 120
cagcagaagc caggccagcc accaaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180
ggcgtgccag accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccacc agagcaacga ggacccatgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag                              333
<210>23
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗OX40抗体A10A和A10D的可变轻链区
<400>23
gacatcgtga tgacccagag cccagacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60
atcaactgca aggccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacat gcactggtac 120
cagcagaagc caggccagcc accaaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180
ggcgtgccag accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccacc agagcaacga ggacccatgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag                              333
<210>24
<211>333
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗OX40抗体A10(TH)HU336F&A10C的可变轻链区
<400>24
gacatcgtga tgacccagag cccagacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgcgccacc 60
atcaactgca aggccagcca gaccgtggac tacgacggcg acagctacat gcactggtac 120
cagcagaagc caggccagcc accaaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180
ggcgtgccag accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccacc agagcaacga ggacccatgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag                              333
<210>25
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠抗OX40抗体A10的可变重链区
<400>25
caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgtg ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcattgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag attcatccta aaagtggtaa tagtaactac 180
aatgagaagt tcaagggcag ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
gtggatctta gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggtccg 300
gaatatagta atttttggtt tgcttattgg ggccaaggaa ctctggtcac tgtctctgca 360
<210>26
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗OX40抗体A10(TH)HU336F&A10D&A10E的可变重链区
<400>26
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc caggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgccaggcc 120
ccaggccagg gcctggagtg gatgggcgag atccacccaa agagcggcaa cagcaactac 180
aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccatg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcggccca 300
gagtacagca acttctggtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210>27
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗OX40抗体A10L70&A10A-C的可变重链区
<400>27
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc caggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgccaggcc 120
ccaggccagg gcctggagtg gatgggcgag atccacccaa agagcggcaa cagcaactac 180
aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccctg acccgcgaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcggccca 300
gagtacagca acttctggtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210>28
<211>111
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>变体
<222>24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，35，36，37，38，54，55，56，57，58，59，93，94，95，96，97，98，99，100，101
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>人模板可变轻链IGKV4-1/IGKJ1
<400>28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa
                85                  90                  95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>29
<211>120
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>变体
<222>31，32，33，34，35，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>人模板重链区IGHV1-45/IGHJ4
<400>29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>30
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>31，32，33，34，35，36，37，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>31
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>32
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>33
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>34
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>31，32，33，34，35，36，37，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>35
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>36
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>37
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>38
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>31，32，33，34，35，36，37，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>39
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>40
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>41
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>42
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>31，32，33，34，35，36，37，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>43
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>44
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>45
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>3l，32，33，34，35，36，37，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>46
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>47
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>48
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>重链框架区
<400>48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105                 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210>49
<211>82
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>变体
<222>24，40
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<223>轻链框架区
<400>49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
            20                  25                  30
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
        35                  40                  45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
    50                  55                  60
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
65                  70                  75                  80
Ile Lys
<210>50
<211>80
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
            20                  25                  30
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
        35                  40                  45
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
    50                  55                  60
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
65                  70                  75                  80
<210>51
<211>80
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>51
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
            20                  25                  30
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
        35                  40                  45
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
    50                  55                  60
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
65                  70                  75                  80
<210>52
<211>80
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>52
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ash Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
            20                  25                  30
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
        35                  40                  45
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
    50                  55                  60
Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
65                  70                  75                  80
<210>53
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
            20
<210>54
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>54
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
 1               5                  10                  15
<210>55
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>55
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr
 1               5                  10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>56
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
 1               5                  10
<210>57
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
            20                  25
<210>58
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>58
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
 1               5                  10
<210>59
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>59
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
 1               5                  10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>60
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链框架区
<400>60
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
 1               5                  10

Claims (48)

1.特异性结合人OX40表位的分离的拮抗剂抗体，所述抗体包含：
a.重链可变区(VH)，其包含：
i.具有SEQ IDNO：17的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2；和/或
iii.具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
b.轻链可变区(VL)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：12、15或61的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2；和/或
iii.具有SEQ ID NO：14或16的氨基酸序列的VL CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a.重链可变区(VH)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
b.轻链可变区(VL)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VL CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a.重链可变区(VH)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
b.轻链可变区(VL)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL CDR3。
4.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a.重链可变区(VH)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
b.轻链可变区(VL)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VL CDR3。
5.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a.重链可变区(VH)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
b.轻链可变区(VL)，其包含：
i.具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VL CDR1；
ii.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VL CDR2；以及具有SEQ IDNO：16的氨基酸的VL CDR3。
6.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a.具有SEQ ID NO：10或11任意一个所示氨基酸序列的重链可变区(VH)；和/或
b.具有SEQ ID NO：7、8或9任意一个所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
7.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a.由SEQ ID NO：25、26或27任意一个核酸序列所编码的重链可变区(VH)；和/或
b.由SEQ ID NO：20、21、22、23或24任意一个核酸序列所编码的轻链可变区(VL)。
8.如权利要求6所述的抗体，其中所述抗体包含：
a.具有SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的VH以及具有SEQ ID NO：7或8任意之一所示氨基酸序列的VL；或
b.具有SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的VL。
9.如权利要求7所述的抗体，其中所述抗体包含：
a.由SEQ ID NO：25的核酸序列编码的VH以及由SEQ ID NO：20或21的核酸序列编码的VL；
b.由SEQ ID NO：26的核酸序列编码的VH以及由SEQ ID NO：22、23或24的核酸序列编码的VL；或
c.由SEQ ID NO：27的核酸序列编码的VH以及由SEQ ID NO：22、23或24的核酸序列编码的VL。
10.如权利要求8所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
11.如权利要求8所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
12.如权利要求8所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，而所述VL包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
13.如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体，其进一步包含恒定区。
14.如权利要求13所述的抗体，其进一步包含具有CH1、CH2或CH3结构域的抗体恒定区。
15.如权利要求14所述的抗体，其中所述恒定区来自于IgG抗体。
16.如权利要求15所述的抗体，其中所述IgG抗体为IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、或IgG4抗体。
17.如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体，其中所述抗体为人抗体。
18.如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体、单克隆抗体、或重组抗体。
19.如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体，其中所述抗体为Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、单链Fv、单链抗体、二硫键连接的Fv、单结构域抗体、抗原结合片段、双链抗体、三链抗体或微抗体。
20.如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体，其进一步包含标记物。
21.如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体，其进一步包含细胞毒素或免疫毒素。
22.包含编码权利要求1所述抗体的核苷酸序列的分离的核酸分子。
23.包含权利要求22所述的核酸分子的载体。
24.包含权利要求23所述载体的宿主细胞。
25.包含权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述抗体以及生理可接受的载体、稀释剂、赋形剂和稳定剂中至少一种的组合物。
26.在患者中治疗OX-40-介导的病症的方法，其包括向该患者施用有效量的权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9任意一项所述的抗体，其中所述抗体阻断OX40L与OX40的结合和/或抑制一种或多种与OX40L和OX40结合相关的功能。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述OX40介导的病症是炎性或自身免疫疾病。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述疾病为过敏、哮喘或与自身免疫或炎症相关的疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、自身免疫性神经疾病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、重症肌无力、实验性利什曼病、胶原诱导的关节炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病、克隆氏病、Grave’s病、肉状瘤病、恶性贫血、颞动脉炎、抗磷脂综合症、血管炎(例如Wegener肉芽肿病)、***、疱疹样皮炎、寻常天疱疮、白斑病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性***和***、肾上腺的自身免疫性疾病、***性红斑狼疮、硬皮病、皮肤肌炎、多发性肌炎、皮肤肌炎、脊椎关节病(例如强直性脊柱炎)、Reiter综合症、或Sjogren综合症。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述疾病为过敏、哮喘或与自身免疫或炎症相关的疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性利什曼病、胶原诱导的关节炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病、克隆氏病、或Grave病。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体通过一种或多种途径被施用至患者，所述途径包括静脉内、腹膜内、吸入、肌肉内、皮下和口服途径。
31.通过抑制患者体内IgE抗体生成来治疗病症的方法，其包括向所述患者施用有效量的权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9任意一项所述的抗体。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述病症为支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、过敏性反应、荨麻疹或异位性皮炎。
33.降低哺乳动物中哮喘的严重性的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9任意一项所述的抗体，其中所述抗体包含至少一种如下属性：(a)以介于约1×10-10至约1×10-12M的KD结合人OX40；(b)抑制一种或多种与结合OX40相关的功能；和(c)抑制OX40L与OX40的结合。
34.如权利要求33所述的方法，其中该抗体以介于约1×10-12至约1×10-11M、1×10-11至约1×10-10M、1×10-10至约1×10-9M、1×10-9至约1×10-8M、或1×10-8至约1×10-7M之间的KD结合人OX40。
35.制备抗体的方法，其包括在适于生成所述抗体的条件下培养权利要求24所述的细胞，并分离所述抗体。
36.生成权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体的杂交瘤。
37.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9任意一项所述的抗体在药物制备中的用途。
38.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9任意一项所述的抗体在治疗OX40相关的疾病或病症中的用途。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述疾病为过敏、哮喘或与自身免疫或炎症相关的疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、自身免疫性神经疾病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、重症肌无力、实验性利什曼病、胶原诱导的关节炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病、克隆氏病、Grave病、肉状瘤病、恶性贫血、颞动脉炎、抗磷脂综合症、血管炎(例如Wegener肉芽肿病)、***、疱疹样皮炎、寻常天疱疮、白斑病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性***和***、肾上腺的自身免疫性疾病、***性红斑狼疮、硬皮病、皮肤肌炎、多发性肌炎、皮肤肌炎、脊椎关节病(例如强直性脊柱炎)、Reiter综合症、或Sjogren综合症。
40.如权利要求39所述的用途，其中所述疾病为过敏、哮喘或与自身免疫或炎症相关的疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、移植物抗宿主病、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性利什曼病、胶原诱导的关节炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、接触超敏反应、糖尿病或克隆氏病。
41.如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体在检测OX40中的用途。
42.在样本中检测OX40的方法，其包括将所述样本与权利要求20所述的抗体相接触。
43.试剂盒，其在容器中包含预定量的权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体，并在单独的容器中包含缓冲液。
44.试剂盒，其在容器中包含预定量的权利要求25所述的组合物，并在单独的容器中包含缓冲液。
45.包含权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗体的医学装置。
46.如权利要求45所述的医学装置，其为吸入装置。
47.包含权利要求25所述组合物的医学装置。
48.如权利要求47所述的医学装置，其为吸入装置。
CN200880013914A 2007-02-27 2008-02-26 拮抗剂ox40抗体及其在炎性和自身免疫疾病的治疗中的用途 Pending CN101668776A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90369307P 2007-02-27 2007-02-27
US60/903,693 2007-02-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101668776A true CN101668776A (zh) 2010-03-10

Family

ID=39620235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880013914A Pending CN101668776A (zh) 2007-02-27 2008-02-26 拮抗剂ox40抗体及其在炎性和自身免疫疾病的治疗中的用途

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20100136030A1 (zh)
EP (1) EP2125891A2 (zh)
JP (1) JP2010518873A (zh)
KR (1) KR20100014588A (zh)
CN (1) CN101668776A (zh)
AR (1) AR065506A1 (zh)
AU (1) AU2008219666A1 (zh)
BR (1) BRPI0807269A2 (zh)
CA (1) CA2679399A1 (zh)
CL (1) CL2008000578A1 (zh)
CO (1) CO6231009A2 (zh)
CR (1) CR11042A (zh)
EC (1) ECSP099656A (zh)
IL (1) IL200572A0 (zh)
MA (1) MA31246B1 (zh)
MX (1) MX2009009194A (zh)
PE (1) PE20090689A1 (zh)
RU (1) RU2009135824A (zh)
TW (1) TW200846367A (zh)
WO (1) WO2008106116A2 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106554417A (zh) * 2010-08-23 2017-04-05 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
CN107074953A (zh) * 2014-10-10 2017-08-18 免疫医疗有限责任公司 人源化抗ox40抗体及其用途
CN107915775A (zh) * 2011-07-11 2018-04-17 格兰马克药品股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
CN109651510A (zh) * 2018-12-04 2019-04-19 上海嘉霈医药科技有限公司 抗Eno1抗体及其用途
CN110536903A (zh) * 2017-03-25 2019-12-03 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN110536901A (zh) * 2016-12-26 2019-12-03 协和麒麟株式会社 与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白结合的抗体
WO2020103836A1 (zh) * 2018-11-20 2020-05-28 上海开拓者生物医药有限公司 Ox40抗体及其制备方法和应用
CN112513088A (zh) * 2018-09-26 2021-03-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗ox40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN114504651A (zh) * 2015-03-03 2022-05-17 科马布有限公司 抗体、用途和方法
CN110198723B (zh) * 2017-02-23 2024-03-05 志瑞亚新药工业株式会社 抗炎药

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7291331B1 (en) 2002-09-11 2007-11-06 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods of treating OX40 medicated recall immune responses
BRPI0621065A2 (pt) 2005-12-16 2011-11-29 Genentech Inc anticorpo anti-ox40l, anticorpos isolados, polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para fabricar um anticorpo anti-ox40l, método para tratar ou previnir uma disfunção imune, composição e uso de um anticorpo anti-ox40l
CA2749539C (en) 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
MA33122B1 (fr) * 2009-02-17 2012-03-01 Ucb Pharma Sa Molecules d'anticorps ayant une specificite pour ox40 humain
AU2012299421B2 (en) * 2011-08-23 2016-02-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-OX40 antibodies and methods of using the same
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
EP2900061B1 (en) * 2012-09-17 2020-01-22 Galectin Therapeutics Inc. Method for enhancing specific immunotherapies in cancer treatment
SG11201507781VA (en) 2013-03-18 2015-10-29 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
CA2943326A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Novartis Ag Methods of selectively treating asthma using il-13 antagonists
NZ726513A (en) 2014-05-28 2023-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-gitr antibodies and methods of use thereof
US11111284B2 (en) 2014-08-21 2021-09-07 The General Hospital Corporation Tumor necrosis factor superfamily and TNF-like ligand muteins and methods of preparing
US9512229B2 (en) 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
EP3268387A4 (en) * 2015-03-11 2018-10-10 Providence Health & Services - Oregon Compositions and methods for enhancing the efficacy of cancer therapy
JP6878301B2 (ja) 2015-04-09 2021-05-26 コーネル ユニヴァーシティー アレルゲンに対する反応を予防するための遺伝子治療
UA126270C2 (uk) 2015-04-10 2022-09-14 Емджен Інк. Мутеїни інтерлейкіну-2 для росту регуляторних t-клітин
KR20180015650A (ko) 2015-05-07 2018-02-13 아게누스 인코포레이티드 항-ox40 항체 및 이의 사용 방법
MY188049A (en) 2015-05-29 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against ox40 and uses thereof
US20190022092A1 (en) 2015-09-15 2019-01-24 Acerta Pharma B.V. Therapeutic Combinations of a BTK Inhibitor and a GITR Binding Molecule, a 4-1BB Agonist, or an OX40 Agonist
JP6904947B2 (ja) * 2015-09-22 2021-07-21 スプリング バイオサイエンス コーポレーション 抗ｏｘ４０抗体及びその診断用途
US10624974B2 (en) * 2015-10-15 2020-04-21 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Anti-OX40 antibody and application thereof
CA3007233A1 (en) * 2015-12-02 2017-06-08 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
WO2017134292A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-ox40 antagonistic antibodies for the treatment of atopic dermatitis
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
MA46770A (fr) 2016-11-09 2019-09-18 Agenus Inc Anticorps anti-ox40, anticorps anti-gitr, et leurs procédés d'utilisation
US11840565B2 (en) 2016-12-29 2023-12-12 University Of Miami Methods and compositions for treating virus-associated inflammation
CN110461356A (zh) 2016-12-29 2019-11-15 迈阿密大学 用于调节肺中炎性体活性和炎症的方法
KR20190104048A (ko) 2017-01-06 2019-09-05 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 (tnfrsf) 효능제를 사용한 종양 침윤 림프구 (til)의 확장 및 til과 tnfrsf 효능제의 치료 조합물
AR112072A1 (es) 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
SG11202004457XA (en) 2017-11-17 2020-06-29 Iovance Biotherapeutics Inc Til expansion from fine needle aspirates and small biopsies
EP3737743A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
US20210137930A1 (en) 2018-02-13 2021-05-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with adenosine a2a receptor antagonists and therapeutic combinations of tils and adenosine a2a receptor antagonists
BR112020021660A2 (pt) 2018-04-27 2021-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um indivíduo com câncer, população de linfócitos infiltrantes de tumor, e, composição de criopreservação
BR112020026798A2 (pt) * 2018-07-03 2021-03-30 University Of Miami Composições e métodos para o tratamento de doenças ou condições relacionadas com o inflamassoma
TW202031273A (zh) 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
SG11202101787XA (en) 2018-09-20 2021-04-29 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion of tils from cryopreserved tumor samples
US20220033775A1 (en) 2018-11-05 2022-02-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathways inhibitors
AU2019374761A1 (en) 2018-11-05 2021-06-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
US20230039976A1 (en) 2018-11-05 2023-02-09 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
BR112021008549A2 (pt) 2018-11-05 2022-01-04 Iovance Biotherapeutics Inc Método de tratamento de carcinoma pulmonar de células não pequenas com uma população de linfócitos infiltrantes de tumor
EP3898949A1 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
AU2020215725A1 (en) * 2019-02-01 2021-09-23 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
KR20220002336A (ko) 2019-03-29 2022-01-06 미스트 쎄라퓨틱스, 엘엘씨 T 세포 치료제를 제조하기 위한 생체외 방법 및 관련 조성물 및 방법
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
CA3155727A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Cecile Chartier-Courtaud Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2021108727A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Myst Therapeutics, Inc. Method of producing tumor-reactive t cell composition using modulatory agents
EP4073236A1 (en) 2019-12-11 2022-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same
EP4110799A1 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Myst Therapeutics, LLC Methods for ex vivo enrichment and expansion of tumor reactive t cells and related compositions thereof
JP2023524108A (ja) 2020-05-04 2023-06-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
EP4146794A1 (en) 2020-05-04 2023-03-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
JP2023546359A (ja) 2020-10-06 2023-11-02 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球療法によるｎｓｃｌｃ患者の治療
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
CA3187272A1 (en) 2020-10-08 2022-04-14 Thorsten Ross Trispecific binders
CA3201818A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Maria Fardis Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
US20240123067A1 (en) 2020-12-17 2024-04-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
AU2021401302A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
BR112023021665A2 (pt) 2021-04-19 2023-12-19 Iovance Biotherapeutics Inc Método para tratar um câncer, e, composição
CA3226942A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
CA3216098A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Uwe Reusch Duplexbodies
CA3235824A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Frederick G. Vogt Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023147486A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024056862A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5821332A (en) * 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
US5759546A (en) * 1994-02-04 1998-06-02 Weinberg; Andrew D. Treatment of CD4 T-cell mediated conditions
US6057421A (en) * 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
DE60317677T2 (de) * 2002-06-13 2008-10-30 Crucell Holland B.V. Ox40 (=cd134) rezeptor agonisten und therapeutische verwendung
US20040136992A1 (en) * 2002-08-28 2004-07-15 Burton Paul B. J. Compositions and method for treating cardiovascular disease
DE602005018325D1 (de) * 2004-02-19 2010-01-28 Genentech Inc Antikörper mit korrigierten cdr
CA2605024C (en) * 2005-04-15 2018-05-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
BRPI0621065A2 (pt) * 2005-12-16 2011-11-29 Genentech Inc anticorpo anti-ox40l, anticorpos isolados, polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para fabricar um anticorpo anti-ox40l, método para tratar ou previnir uma disfunção imune, composição e uso de um anticorpo anti-ox40l

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106554417B (zh) * 2010-08-23 2020-11-06 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
CN106554417A (zh) * 2010-08-23 2017-04-05 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
CN107915775B (zh) * 2011-07-11 2022-07-12 伊克诺斯科学公司 结合ox40的抗体及其用途
CN107915775A (zh) * 2011-07-11 2018-04-17 格兰马克药品股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
CN107074953A (zh) * 2014-10-10 2017-08-18 免疫医疗有限责任公司 人源化抗ox40抗体及其用途
CN114504651A (zh) * 2015-03-03 2022-05-17 科马布有限公司 抗体、用途和方法
CN110536901A (zh) * 2016-12-26 2019-12-03 协和麒麟株式会社 与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白结合的抗体
CN110198723B (zh) * 2017-02-23 2024-03-05 志瑞亚新药工业株式会社 抗炎药
CN110536903A (zh) * 2017-03-25 2019-12-03 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN112513088B (zh) * 2018-09-26 2023-05-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗ox40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN112513088A (zh) * 2018-09-26 2021-03-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗ox40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN113348180A (zh) * 2018-11-20 2021-09-03 上海开拓者生物医药有限公司 Ox40抗体及其制备方法和应用
WO2020103836A1 (zh) * 2018-11-20 2020-05-28 上海开拓者生物医药有限公司 Ox40抗体及其制备方法和应用
CN109651510B (zh) * 2018-12-04 2023-03-24 上海长征医院 抗Eno1抗体及其用途
CN109651510A (zh) * 2018-12-04 2019-04-19 上海嘉霈医药科技有限公司 抗Eno1抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
MX2009009194A (es) 2009-10-08
PE20090689A1 (es) 2009-06-20
CA2679399A1 (en) 2008-09-04
MA31246B1 (fr) 2010-03-01
WO2008106116A2 (en) 2008-09-04
JP2010518873A (ja) 2010-06-03
CL2008000578A1 (es) 2008-10-10
AR065506A1 (es) 2009-06-10
AU2008219666A1 (en) 2008-09-04
CR11042A (es) 2009-11-03
CO6231009A2 (es) 2010-12-20
IL200572A0 (en) 2010-05-17
TW200846367A (en) 2008-12-01
ECSP099656A (es) 2009-10-30
EP2125891A2 (en) 2009-12-02
US20100136030A1 (en) 2010-06-03
WO2008106116A3 (en) 2008-10-16
BRPI0807269A2 (pt) 2014-04-29
KR20100014588A (ko) 2010-02-10
RU2009135824A (ru) 2011-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101668776A (zh) 拮抗剂ox40抗体及其在炎性和自身免疫疾病的治疗中的用途
US9518124B2 (en) Anti-Notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of Notch3-related diseases
JP5665702B2 (ja) Ｎｋ細胞増強化合物を使用する治療抗体の有効性を増大させる方法および組成物
AU2007333805B2 (en) Antagonist anti-Notch3 antibodies and their use in the prevention and treatment of Notch3-related diseases
CN109071664A (zh) 新型抗-SIRPa抗体及其治疗应用
CN101563366B (zh) 抗notch3激动性抗体及其在制备治疗notch3相关疾病的药物中的用途
CN109715206A (zh) 结合蛋白及其使用方法
TW201729840A (zh) 抗ｖｉｓｔａ抗體及片段、其用途及鑑定其之方法
CN106414489A (zh) 抗-b7-h5抗体及其用途
CN101842115A (zh) 人源化的抗-cxcr5抗体、其衍生物及它们的应用
CN109153729A (zh) Cd40l-fc融合多肽及其使用方法
CN101977937A (zh) Ron抗体及其用途
CN104968679B (zh) 抗h7cr抗体
CN108218990A (zh) 分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用
CN102282172B (zh) 抗伸展的ⅰ型鞘糖脂抗体、其衍生物以及用途
CN101605815B (zh) 拮抗性抗刻缺蛋白3抗体及其在预防和治疗刻缺蛋白3相关疾病中的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100310