TW200844231A

TW200844231A - Vectors for multiple gene expression

Info

Publication number: TW200844231A
Application number: TW097103228A
Authority: TW
Inventors: Nathalie Silvestre; Doris Schmitt
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 2007-05-15
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2008-11-16
Also published as: BRPI0810305A2; AR065075A1; ES2416361T3; AU2008250520A1; US8337859B2; IL201963A; EP2162544B1; CA2686772A1; AU2008250520B2; IL201963A0; RU2009144898A; MX2009012272A; CN101688223A; CA2686772C; HK1135731A1; JP5474767B2; EP2162544A1; US20100303838A1; KR20100019432A; KR101514473B1

Description

200844231 九、發明說明：【号务日月戶斤胃j 本發明係關於經過基因改造可供獨立表現感興趣之多重核苔酸序列之-種重組載體，該等核普酸序列係得自於 5同-有機體或得自密切相關之有機體。本發明係關於重組核酸技術領域，用來於多種原核細胞試管内系統、以及真核細胞試管内系統、以及於動物體或人體内，表現彼此具有同源性之多重核苔酸序列供治療或預防目的。本發明特別可用於免疫治療領域，特別係用於治療或預防由感染性 10有機體諸如乳頭狀瘤病毒及肝炎病毒所引起之病理情況。 Γ先前技術3 重組DNA技術已經可於培養的宿主細胞或於活有機體内表現核普酸序列。已經產生數種質體£)：^八及病毒載體且用於多項目的，包括疫苗接種、基因治療、免疫治療及於 15培養的細胞表現。載體諸如腺病毒载體及痘病毒載體具有大型選殖能力，可於寬廣多種宿主細胞表現多重核苷酸序列之潛力之優勢。多重核苔酸序列之表現之優異之處在於改良由編碼多肽所提供之治療功效（例如體液免疫與細胞免疫的組合）。並非替代製造分開經過基因改造來各自表現 20期望之核苷酸序列之多種重組載體，反而較佳係製造單一重組載體，至少來協助製造步驟及獲得法規核准。舉例言之，有關乳頭狀瘤病毒感染，感興趣地係期望有數種乳頭狀瘤病毒基因型表現免疫原性多肽，俾便特別於有多重感染風險例如HPV-16及HPV-18之個體，加寬或增 200844231 強宿主的免疫反應。但編碼此種免疫原性多肽之核苷酸序列於相關HPV基因型皆有高度同源性。舉例言之，hpv_16 E6與HPV-18 E6序列於核苷酸層面顯示總體同源性63%，雖言如此，包含具有超過75%之極高同源性區域，該區可能 5妨礙由單一載體表現HPV-16及HPV-18基因。此外，當表現病毒來源之多肽時，同源性核苷酸序列也可能來自於病毒基因體之整體組織結構。相當常見病毒使用相同核苷酸序列，來經由生物機轉諸如内部轉譯起始或讀取框位移，亦即相同DNA序列，轉譯於多於一個讀取 10框，來編碼兩種不同的蛋白質。例如，於ιπ>ν-16基因體中，相鄰的Ε1基因及Ε 2基因於不同讀取框轉譯之5 9個核苷酸重疊。換言之，Ε1基因之最末59個核苷酸重疊Ε2基因之最初 59個核苷酸。但於載體中存在有同源性序列，預期特別於載體製造 15步驟期間對其安定性造成負面影響，結果由於同源性序列間發生的重組事件而導致喪失基因序列。如此，於一單一載體表現HPV-16 Ε1基因及Ε2基因，涉及存在有59核苷酸之一共同部分，其可能導致均質重組事件，最終導致Ε1&Ε2 同源性序列間包含的序列喪失。此種非期望之同源重組事 20件也可能發生於同一個載體表現HPV-16及HPV-18基因序列時。此種不安定性問題可能導致載體備料的無用，特別用於人體臨床試驗時無用。於此面相中，W092/16636提示於該重組載體中***相對於彼此方向相反之同源性核苷酸序列’來降低發生重組 200844231 事件的可能。但此項策略係就牛痘病毒載體作說明，而未冒對其它重組载體諸如腺病毒載體作說明。此外由於可能發生啟動基因干擾及構成限制，故於相反方向配置料經常性可能。· …」5 肋界需要製造於宿主細胞或個體可表現得自同-個 ^體或密切相關有機體（其天然含有高度同源性部分)之核普酸序列之重組載體。本發明提供經由使用遺傳密碼簡 • 舰來變更同源性核㈣序列之任-者或二者，讓核《序列變成比修改之前之同源性更低，但不會變更或顯著改 W變編碼胺基酸序列之-種設計，來降低重組事件發生機率之新穎策略，來解決此項需求。本發明允許克服特別於載 ’ 體製造步_間可能於儀性序列間發生同雜重組，結 U 果導致其間所含之核^酸序列的損失之缺點。發現本發明：載體出乎意外地可有效表現E1及E2乳頭狀瘤病毒基因，兩 15種基因於天然共旱59核苷酸之1〇〇〇/0同源性部分，而於載體 φ 製造步驟期間出乎意外地安定。也發現本發明載體可出乎意外地有效表現得自密切相關之HPV_16及HPV_18基因型之E6及E7基因。經由提供如申請專利範圍所定義之實施例可解決此項 20 技術問題。其它及額外本發明之面相、特徵及優點由後文本發明之較佳實施例之說明將更為彰顯。此等實施例僅供揭示目的。【發明内容3 如此，於一第一面相中，本發明提供一種載體，包含 200844231 編碼一第一多肽之至少一個第一核酸分子及編碼一第二多肽之一個第二核酸分子，其中·· -該第一核酸分子及該第二核酸分子分別係得自於於 40個或更多個連續核苷酸部分具有約80%或大於80%之同 5 源性百分比之一第一天然核酸序列及一第二天然核酸序列，以及 -包含於該載體中之該第一核酸分子及/或該第二核酸分子經修改，因而將該同源性百分比降至低於75%。如此處於全案中使用，除非内文另行指示，否則「一」 10 及「一個」等詞係用來表示「至少一個」、「至少一第一」、「一個或多個」或「多個」所述化合物或步驟。例如，「一個細胞」一詞包括多個細胞且包括其混合物。用於此處任何位置「及/或」一詞包括「及」、「或」以及「全部或任何其它以該詞所連接之各元件之組合」之定 15 義。例如，「第一核酸分子及/或第二核酸分子」表示該第一核酸分子，或該第二核酸分子或第一核酸分子與第二核酸分子二者。如此處使用，「約」或「約略」等詞表示於一給定數值或範圍之5%以内，較佳4%以内及更佳2%以内。 20 如此處使用，當用來定義產物、組成物及方法時，「包含」一詞意圖表示包括所述組分或步驟之產物、組成物及方法，但未排除其它組分及步驟。「主要由…所組成」表示排除具有任何必要重要性之其它組分及步驟。如此，主要係由所引述之組分所組成之一種組成物，並未排除微量污 200844231 染物及藥學上可接受之_。「組絲」表示排除其它組分及步驟之微量元素。例如，當該多肽除了所引述之胺基酸序列之外未合任何胺基酸時，一種多肽係由胺基酸序列「所組成」。當此種胺基酸序列係只連同少數額外胺基酸殘基 5 (典型由約1至約5〇左右之額外殘基)存在時，一種多肽「主要係由-胺基酸序列所組成」。當胺基酸序列為一種多肽之、、胺基1序列之至少—部分時，該多肽「包含」—胺基酸序列。此種多月太可有數個額外胺基酸殘基至高達數百個額外fe基酸殘基。此種額外胺基酸殘基於多肽之異動上可扮 W濟某種角色，協助多肽的製造或純化；延長半生期等。同等也適用於核苷酸序列。如此處使用，「載體」可為任何於宿主細胞或個體可傳 4及表現至少该第一核酸分子及第二核酸分子之任一種媒 ’丨。錢體可為染色體外(例如游離基因）或整合式(結合於 15伤主染色體内）、可自發複製或否、多套複本或低套複本、，股或單股、裸露或與其它分子複合(例如載體複合脂質或來口物來形成粒狀結構，諸如脂質體、脂質複體或奈米顆粒、載體包裝於病毒殼體内部及載體㈣於固相顆粒上專）載體」凋之定義也涵蓋已經經過修改來允許偏好革疋於彳寸疋佰主細胞之載體。被靶定之載體之特徵特點，於其表©上存在有可賴且結合至細縣露組分及表面恭路組力之-g&體’諸如細胞特異性標記(例如册乂感染細月已）組織知·兴性標記或腫瘤特異性標記。配體可藉遺傳手段***存在於载體表面上之多肽(例如腺病毒纖維、潘頓 200844231 (penton)、pIX述於WO94/10323及WO02/96939，或牛癌pl4 基因產物，述於EP 1 146 125)。於本發明之内文中，「核酸」、「核酸分子」、「多核誓酸」及「核苷酸序列」等詞可互換使用，定義任何長度之多去 5 氧核糖核苷酸(DNA)或多核糖核苷酸(RNA)分子或其任何組合之聚合物。該項定義涵蓋單股或多股線性或圓形天然多核苷酸或合成多核苷酸。此外，此種多核苷酸包含非天然核苷酸（例如曱基化核苷酸及核苷酸類似物，諸如us 5,525,711、US 4,711 955或EPA 302 175戶斤述)及其化學修改 10 (例如參考WO 92/03568 ; US 5，118,672)，俾便提高核酸之活體内安定性，促進其傳送，或降低由宿主個體之清除率。若存在有修改時，可於聚合前或聚合後賦予修改。 15 20 「多肽」、「胜肽」及「蛋白f」等詞於此處互換用來表示包含透過胜肽鍵鍵結之9個歧多個胺基酸之胺基酸殘基之聚合物。該聚合物可為祕、分支或環狀。於本發明之内文中，「多肽」包括屬机立體異構物(天然形式)或^ 立體異構物之胺紐’且包括糊天然f驗基酸以外之胺基酸’諸如[/5]·丙麟、鳥賊、錢賊亞礙或於一個或多個^胺基、^•羧基或支鏈上例如藉附接甲基、甲酸基、乙醯基、糖基、_基等而修改之胺基酸。至於一般指示，若胺基酸聚合物之長度長（例如多於50個胺基_ 基），則較佳稱作為多肽轉”。結果，「職」係指長約9至約5〇個胺基酸之一片段。於本發明之内文中，胜肽較佳包含天然出現(或稱作為天㈣蛋白k—選定區，如含 10 200844231 有游離基因之一免疫原性片段。

10 15

如此處定義’「多肽」—詞涵蓋天然多肽及改性多肽如此處使用，「天然」-詞細由天絲源所时之特料，而與實驗室中經人μ性或改變之材料有別。例如，天炒多肽係由存在於野生财機體或細胞之基因财之基因= 碼。相反地，雜纽麵於實驗室巾經祕改之核酸1 子編碼，因此改性多肽例如藉插人、刪失或取代-個^ 個胺基酸或其任-種組合而舆天然多肽不同。當涵蓋數= 修改時’可有關接續之殘基及域_續殘基。本發明n 之修改實例可料致天然纽職有之生物紐變更= 一給定生物活性有關鍵重要性之胺基酸可藉例行方法識別，諸如由結構分析及功能分析識別，熟諳技藝人士方便决疋可減少或消除此種生物活性之突變類型。此等修改可藉例行技術諸如位置導向突變發生來進行。另外，可於自動化方法中藉化學合成來產生編碼改性多肽之一合成核酸分子(例如如隨附之實例章節所述，由重疊合成寡核苷酸組裝來產生）。「獲得」一詞用於此處係指由天然來源發現、單離、純化或衍生之材料。「單離」表禾由天然環境分離。「純化」 20表示貫質上不含至少一種其它天然與其結合之組分。「衍生」表示比較天然材料之一項或多項修改(特別為突變，諸如取代、刪失及/或***）。單離、純化及改性技術為技藝界例行使用且依據欲獲得之材科決定（例如可經由使用限剪 _、藉PCR或藉化學合成而由天然來源進行核酸分子的選 11 200844231 殖）。如此處使用’「同源性」一詞通常係以百分比表示，代表跨至少40個連續核苷酸(例如約40、45、50、55、57、58、 59、60、70或甚至更多個連續核苷酸)部分彼此保有給定之 5 相同度之核苷酸序列。「至少80%」表示約80%或大於8〇% (例如超過80%，較佳至少85%，期望至少87%，較佳至少 90%，更佳至少95%，又更佳至少97%至高達100%序列同源性之任何數值）。「低於75%」表示低於75例如約74、72、70、 68、65、62、60%或甚至更少之任何數值。兩個核苔酸序 10 列間之同源性百分比為由該等序列所共享之相同位置數目，考慮必須被導入來獲得各間隙的最佳校準及各間隙長度之間隙數目。技藝界有多種電腦程式及數學演繹法則來測定核苷酸序列間之相同度百分比，諸如GCG威斯康辛套裝軟體及基礎局部校準研究工具(BLAST)程式，於國家生 15 技資訊中心（NCBI)可取得且說明於已經付梓之公開文獻 (例如 Altschul等人，1990, J· Mol· Biol. 215, 403-410)。作為起點，於改性前第一核酸分子與第二核酸分子間之序列校準可用來顯示共享80%或大於80%之同源性百分比之一個或多個40個或以上連續核苷酸部分，亦即「同源」 20部分。於特定實施例中，第一核酸分子或第二核酸分子或第一及第二核酸分子二者之密碼子使用樣式至少於該4〇個或更多個（例如約40、45、50、55、57、58、59、60、70或甚至更多個）連續核f酸之該（等）同源部分經修改（例如藉逾、碼子使用樣式之簡併來修改），因而將同源性百分比降至 12 200844231 低於75% (例如約74、72、70、68、65、62、60%或甚至更低）〇而蛋胺酸殘基及色胺酸殘基各自係由獨特的核酸三聯體（亦即密碼子)所編碼，不同密碼子用來編碼18種其它胺基 5酸(遺傳密碼之簡併）。舉例言之，由密碼子所編碼之胺基酸如下：丙胺酸(Ala或A)係由密碼子GCA、GCC、GCG及GCU 編碼；半胱胺酸(C或Cys)係由密碼子UGC及UGU所編碼；天冬酸(D或Asp)係由密碼子GAC及GAU所編碼；麩胺酸(E 或Glu)係由密碼子GAA及GAG所編碼；苯基丙胺酸(F或Phe) 10係由密碼子UUC及UUU所編碼；甘胺酸(G或Gly)係由密碼子GGA、GGC、GGG及GGU所編碼；組胺酸(H或His)係由密碼子CAC及CAU所編碼；異白胺酸(I或lie)係由密碼子 AUA、AUC及AUU所編碼；離胺酸(K或Lys)係由密碼子AAA 及AAG所編碼；白胺酸(L或Leu)係由密碼子UUA、UUG、 15 CUA、CUC、CUG及CUU所編碼；蛋胺酸(Μ或Met)係由密碼子AUG所編碼；天冬醯胺(N或Asn)係由密碼子AAC及 AAU所編碼；脯胺酸(p或pro)係由密碼子CCA、CCC、CCG 及CCU所編碼；麩胺(Q或Gin)係由密碼子CAA及CAG所編碼；精胺酸(R或Arg)係由密碼子AGA、AGG、CGA、CGC、 20 CGG及CGU所編碼；絲胺酸（S或Ser)係由密碼子AGC、 AGU、UCA、UCC、UCG及UCU所編碼；蘇胺酸(T或Thi〇係由密碼子ACA、ACC、ACG及ACU所編碼；纈胺酸(V或 Val)係由密碼子GUA、GUC、GUG及GUU所編碼；色胺酸 (W或Tip)係由密碼子UGG所編碼及酪胺酸(Y或Tyr)係由密 13 200844231 碼子UAC及UAU所存在於第一核酸分子及第二核酸分子中之該一個或多個同源部分之同源性百分比降低可經由利用遺傳密碼的簡併性，且修改於該第一核酸分子及/或第二核酸分子之密碼 5 10 15 20 子使用樣式來達成。密碼子使用樣式之修改典型係經由以其它密碼子來置換一個或多個「天然」密碼子進行。例如以Arg編碼之CGC密碼子置換Arg編碼之AGA密碼子將降低密碼子三個位置中之兩個的同源性。並非必要簡併全部天然密碼子，原因在於以部分置換即可充分降低同源性。此外，#碼子使用樣式的修改可於整個核酸分子進行，或可侷限於修改前所存在之同源性部分。期望於本發明之内文中，於第一核酸分子進行簡併，且係限於同源部分。較佳，密碼子使職式係於核㈣層面修改，郷改於胺基酸層面為靜默，換言之，若可能時，各個「天然」密碼子係以編碼相同胺基酸之-密碼子所置換，觀種修改不會於所、’爲馬之夕肽轉澤。更佳’當可能時，密碼子使用樣式為第 -核酸分子與第二減分子間之同源部分限於少於9個或8 :接續核菩酸，較佳少於7個接續核_，較佳少於6個接 =苗酸，及更佳少於5個接續核《。密碼子使用樣式之 =藉熟諳技藝人士已知之多種方式之一產生，諸如位突變發生(例如使用阿默山公司(A—)法國炎之史考普特(SCUlptor)試管

突變發生、職穿梭、或化學合編生祕）、PCR 核酸分子）。成技術(例如結果導致合成 14 200844231 當根據本發明之載體包含多於兩個核以目文刀子時，則载體内所包含的且得自天然核酸序列（其具有與由^ ~ 另一種核酸分子之至少另一個天然核酸库 ^ ^ 、 Μ，於40個或以上連續核菩酸部分有約80%或大於之 7 J碾性百分比）之任何核酸分子可經修改，俾將同源性八刀比降至低於 75%’亦即包含於載體中並無任何成對核酸分子將組成4〇個或以上接續核苷酸部分，其具有大於、' )/〇之相同度百分 ρΚ 〇

Φ其中獲得該減分子之各個（成對）天然_序列間 1〇之序列校準可用來顯示一部分或多部分具有80%或大於 80%之同雜百分比。然後該天然序舰修改，特別為簡併密碼子之使用經修改，因而將至少於該同源部分之^ 性百分比降至低於75%。結果，組成該載體之核酸分子皆未包含40個或以上(例如45、50、55、57、58、59、6〇、7〇 15或甚至更多個）接續核酸部分具有與任何其它該载體所包含之核酸分子大於75%之相同度百分比。如前文說明’由該載體所包含之核酸分子所編碼之多肽可能有或可能未有與天然多肽相同之胺基酸序列。特別，除了用來簡併密碼子之使用之突變，因而至少於組成 20該載體之核酸分子之同源部分降低同源性之外，該載體所包含之核酸分子也包含額外突變結果導致該編碼多肽之胺基酸序列的修改或否。本發明載體涵蓋病毒載體及非病毒載體（例如質體 DNA載體）。適當非病毒載體包括質體諸wpREP4、pCEp4 15 200844231 (因維左金公司（Invitrogene))、pCI (普米嘉（Promega))、 pCDM8 (Seed，1987，自然 329, 840)、pVAX及pgWiz (基因治療系統公司（Gene Therapy System Inc)) ; Himoudi等人， 2002，J.VitOl· 76, 12735-12746)。「病毒載體」於此處係根據 5技藝界認可之定義使用。病毒載體係指包含病毒來源的至少一個元體之載體，包括完整病毒基因體、其部分、或改性病毒基因體，容後詳述，其包括其所產生之病毒顆粒(例如病毒載體封裝入病毒殼體内來製造傳染性病毒顆粒）。本舍明之病毋載體可為複製勝任，或可經過遺傳去能而變成 10複製缺陷或複製受損。「複製勝任」一詞用於此處係涵蓋複製選擇性病毒載體及條件複製病毒载體，其經過基因改造來於特定宿主細胞（例如腫瘤細胞）内更佳或更具選擇性地複製。病毒載體可得自多種不同病毒，特別係得自選自於 2反錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、痙病毒、危療病 15 f、麻療病毒及泡沫病毒所組成之組群之—病毒。

△於-個實施例中，本發明載體為腺病毒載體(其綜論可麥考「供基因治療之腺病毒載體」，2〇〇2年，編輯D 31)、亞群B (例如血清型3 亞群C (例如血清型1、2、 10、13、15、17、19、）n、及J.D〇UglaS，學術出版社）。該腺病毒载體可衍生自任何人腺病毒或動物腺病毒。任何血清型及亞群皆可用於本發明 20之内文。更特別值得一提者為亞群a⑽如血清型& μ及、7、11、14、16、、幻、34 及35)、

特佳為人腺病毒、19、20、亞君羊E (血/月型4)及亞君纤（血清型及叫。 16 200844231 2 (Ad2)、5 (Ad5)、6 (Ad6)、11 (Adll)、24 (Ad24)及35 (Ad35)。此等腺病毒可得自美國種型培養收集會(ATCC，馬里蘭洛克維），且變成多種公開文獻之主題，該等公開文獻說明其序列、組織及製法來允許業界人士可應用該等技術 5 (例如參考us 6，133,028 ; US 6，110,735 ; WO 02/40665 ; WO 00/50573 ; EP 1016711 ; Vogels等人，2003，J· Virol· 77, 8263-8271) 〇本毛明之腺病毋載體可為複製勝任。複製勝任腺病毒載體之多個實例為熟諳技藝人士方便易得（例如參考 10 Hernandez-Alcoceba 等人，2000，人類基因治療 2009-2024 ; Nemunaitis等人，2001，基因治療8, 746_759 ; Alemany等人，2000，天然生物技術18，723-727 ; WO00/24408 ; US5,998,205，WO99/25860，US5,698,443， WOOO/46355，WO00/15820及W001/36650)。 15 另外，本發明之腺病毒可為複製缺陷（例如參考 W094/28152)。較佳複製缺陷之腺病毒為E1-缺陷（例如US 6，136,594及US 6,013,638)，E1刪失係由約略位置459延伸至 3328,或由約略位置459延伸至3510 (參考人腺病毒5型序列，揭示於基因存庫（GeneBank)存取號碼Μ 73260及 20 Chroboczek等人，1992, Virol· 186，280-285)。經由刪失腺病毒基因體之額外部分（例如於非必需E 3區或於其它必需 E2區、E4區，如 Lusky等人，1998, J· Virol 72, 2022-2032所述)可進一步改良選殖能力及安全性。第一核酸分子及第二核酸分子可獨立***本發明之腺 17 200844231 病毒載體之任何位置，如Chartier等人（1996, J. Vir()1. % 4805-4810)所述’該等位置個別係位於相對於***區之天然轉錄方向之訊息方向及/或反訊息方向。例如二者可皆插人來置換E1區，或另外一者可***來置換E1區而另一者可插 5 入來置換E3區。於另一個實施例中，本發明之載體為痘病毒載體(例如蒼考Cox專人’「人基因治療之病毒」’編輯J· M. Hos，加州學術出版社）。可得自痘病毒科之任何成員特別為雀痘病毒 (例如ALVAC述於WO95/27780)、禽痘病毒(例如trovac述 10 於Paoletti等人，1995, Dev· Biol· Stand· 84, 159-163)或牛症病毒，以後者為佳。適當牛痘病毒可選自於由哥本哈根種系（Goebel 等人，1990，Virol· 179，247-266 及 517-563 ; Johnson等人，1993, Virol. 196, 381-401)、惠氏(Wyeth)種系、NYVAC (參考W092m672及Tartaglia等人，1992，病 15毒學188, 217_232)及高度減毒改性安卡拉(MVA)種系（Mayr 等人，1975，感染3, 6-16)所組成之組群。此等載體及製法係說明於熟諳技藝人士可得之多個文件（例如Paul等人， 2002 ’癌症基因治療9 ’ 470-477 ; Piccini等人，1987，酶學方法 153，545-563 ; US 4,769,330 ; US 4,772,848 ; US 20 4,6035112 ; US 5，100,587及US 5，179,993)。本發明所使用之第一核酸分子及第二核酸分子較佳係***痘病毒基因體之非必需位置，讓重組痘病毒維持可存活及有傳染力。非必需區為非編碼基因間區，或去活化或删失不會顯著損害病毋之生長、複製或感染之任何基因。包含***於必需病毒 18 200844231 位置，限制條件為於病毒顆粒製造期間缺陷功能係以反式供給，例如使用助手細胞系攜帶與該痘病毒基因體中被刪失之序列相對應之互補序列來供給。當使用哥本哈根牛痘病毒時，至少第一核酸分子及第 5 二核酸分子較佳***胸腺苷激酶基因（tk) (Hruby等人，1983,

Proc· Natl· Acad. Sci USA 80, 3411-3415 ; Weir等人，1983, J·

Virol· 46，530-537) 〇但其它***位置也適當，例如***血球凝集素基因（Guo等人，1989, J. Virol· 63, 4189-4198)、插入K1L位置、***u基因（Zhou等人，1990, J· Gen. Virol. 71， 10 2185-2190)及***參考文獻中曾經報告發生多種自發刪失或經基因改造刪失之牛痘病毒基因體左端（Altenburger等人，1989, Archives Virol· 105，15-27 ; Moss等人，1981，J· Virol· 40，387-395 ; Panicali 等人，1981，J. Virol· 37, 1000-1010 ; Perkus等人，1989, J· Virol· 63, 3829-3836 ; 15 Perkus等人，1990, Virol· 179, 276-286 ; Perkus等人，1991， Virol· 180, 406-410)。當使用MVA時，該至少第一核酸分子及第二核酸分子係分別***出現於MVA基因體(Antoine等人，1998，病毒學 244,365-396)及出現於D4R位置之經識別的刪失I至VII中之 20 任一者，但以***於刪失II及/或III為佳(Meyer等人，1991， J· Gen· Virol· 72，1031-1038 ; Sutter等人，1994,疫苗 12, 1032-1040) 〇當使用禽痘病毒時，雖然可考慮***胸腺苷激酶基因内部，但該至少第一核酸分子及第二核酸分子較佳係導入 19 200844231 於ORF7與ORF9間之基因間區（

5_75)。 314 569AUS 5 10 15 20 …於本發明之另-個實施例中，該至少第一核酸分子及弟^酸分子分開編碼於呈現病理情況或對於呈現病理情感之個體中可提供治療活性或保護活性之-多肽。如，處^用’「個體」-詞係指脊椎動物特別為哺乳動物成貝，餐別為豕畜、農場動物、運動動物、及靈長類包括人類。此種多肽較佳係選自於由免疫原性多耿及抗腫瘤多狀所組成之組群。「免疫原性」多肽係指於表⑽多耿之個體中可誘導、帅、發展或增強免疫系統之多肽。此種免疫反應可為體液或細胞或體液與細胞二者。體液反應提引出對抗該多肽之抗體製造；而細胞反應提5丨出τ_助手細胞及/或ctl 反應及/或刺激細胞激素之製造。典型地，多肽之免疫原性了於试f内或活體内藉多項技藝界標準之檢定分析評估 (有關評估免疫反應起點與活化之技術之一般說明，例如參考Coligan等人，免疫學之目前方案；編輯約翰威利父子公司’國家衛生院之最新版本）。例如檢測可為比色技術、螢光技術 '或放射性及適當技術，包括ELISa、西方墨點、放射性免疫檢定分析及免疫沉;殿檢定分析。細胞免疫之測量係藉測量由活化效應物細胞包括衍生自CD4+及CD8+ T-細胞之細胞輪廓資料進行（例如藉ELIspot定量可產生iFNg 之細胞），經由測定免疫效應物細胞之活化狀態進行(例如藉傳統[3H]胸腺苷攝取之τ細胞增生免疫分析），經由檢定分析 20 200844231 敏化個體之抗原特異性τ琳巴細胞進行(例如於胞毒性檢定分析之胜肽特異性溶解）。多肽之免疫原性也可基於四聚體之分析技術或其它τ細胞媒介免疫力分析之標準技術而於適當動物研究模型中評估。適當免疫原性多肽可付自Β型肝炎病毒(HBV)(例如S、preS2或preSl-多肽，如 EP 414 374 ; EP 304 578或EP 198 474所述）；C型肝炎病毒 (HCV)(例如核心（〇、被膜糖蛋白E1、E2、非結構性多狀

10 15

20 NS2、NS3、NS4或NS5或其任一種組合）；人免疫缺乏病毒 (HIV)(例如§1)120或§1>160)及乳頭狀瘤病毒(容後詳述）。「抗腫瘤」多肽係指可提供遏止或淨減少腫瘤細胞之擴增之多肽。多肽之抗腫瘤性質可於適當動物研究模型測定，或於接受處理之個體經由經歷一段時間實際腫瘤大小縮小測定。多種方法可用來估計腫瘤大小，包括放射性方法（例如單光子及正子發射電腦斷層掃描術；大致上表考「臨床腫瘤學之細胞核藥物」，winkler，c (編輯）史賓基_福拉（Springer-Verlag)，紐約，1986年）、採用習知成像劑（= 如檸檬酸鎵_67)之方法、免疫學方法(例如針對特定腫瘤標圮之放射性標記單株抗體)以及超音波方法(參考「腫瘤之超音波差動診斷」，Kossoff及Fukuda (編輯），醫學蚩院 dgaku-Shoin)，紐約，漬年）。另夕卜，多耿之抗可基於腫《記存在量的減州定。實例包細於攝護腺癌檢測之PSA及用於大腸直腸癌及某些乳癌檢測之cm。此外，多肽之抗腫瘤性質可於適當動物研究模型測定，例如使用代表性人癌細胞系注射之小鼠測定。於發展】可角轉 21 200844231 之腫瘤後，小鼠被注射本發明之載體，然後監視腫瘤生長速率的降低及存活率的增高。此外，多種試管内方法可用來預測活體内之腫瘤抑制。適當抗腫瘤多肽包括與腫瘤相關聯之抗原（TAA)諸如MUC-l (W092/07000 ; Acres等人， 5 2005, Exp· Rev. Vaccines 4 (4))、BRCA-1、BRCA-2 (Palma 等人，2006，腫瘤學/血液學之臨床綜論27，1-23)、癌胚抗原CEA (Conroy等人，1995，基因治療；2,59-65)、MAGE (WO99/40188 ; De Plaen等人，1994，免疫遺傳學40, 360-369)、MART-卜 gp 100 (Bakker等人，1994, J· Exp· Med· 10 179，1005-9)、PRAME、BAGE、Lage(也稱作為NYEosl) SAGE、HAGE (WO99/53061)、GAGE (Robbins 及 Kawakami，1996，免疫學之流行觀點8, 628-36)及攝護腺特異性抗原（PSA) (Ferguson等人，1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA· 96, 3114-9; W098/12302、W098/20117及WO00/04149) 15及得自具有腫瘤誘導潛力之病毒（例如乳頭狀瘤病毒）之病毒性多肽。於本發明之另一個實施例中，該至少第一核酸分子及第二核酸分子係得自同一種有機體或密切相關之有機體。如此處使用，「有機體」一詞涵蓋較佳有致病可能之微 20生物以及高等真核生物。「微生物」一詞表示真菌、細胞、原虫*及病毋。病毋之代表性實例包括但非限於HIV(hiV· 1 或HIV-2)、人疱疹病毒（例如HSV14HSV2)、細胞巨病毒 (CMV)、EB病毒（EBV)、肝炎病毒（例如a型肝炎病毒 (HAV)、HBV、HCV及E型肝炎病毒）、黃病毒(例如黃熱病 22 200844231 毒）、水痘帶狀范療病毒(VZV)、副黏液病毒、呼吸道融合病毒、副流行性感冒病毒、麻療病毒、流行性感冒病毒及乳頭狀瘤病毒(定義如前）。適當細菌之代表性實例包括但非限於奈瑟氏菌（Neisseria)(例如淋病奈瑟氏菌（N. g〇n〇rrhea) 5及腦膜炎奈瑟氏菌(Ν· meningitides));博德氏菌（B〇rdetella) (例如百曰咳博德氏菌（Β· pertussis)、副百日咳博德氏菌（b parapertussis)及支氣管炎博德氏 g(B· br〇nchiseptica));分枝桿菌（Mycobacteria)(例如結核分枝桿菌（M. tuberculosis)、牛分枝桿菌（Μ· bovis)、麻風分枝桿菌（Μ· 10 leprae)、禽分枝桿菌（Μ· avilim)、副結核分枝桿菌（μ pamtubenmlosis)、恥垢分枝桿菌（M smegmatis)) ·，退伍軍人症菌（Legionella)(例如嗜肺退伍軍人症菌。 pneumophila));埃希氏菌（Escherichia)(例如腸毒性大腸桿菌（E.coli)、腸出血性大腸桿菌、腸病原性大腸桿菌丨志賀 15氏菌（Shi明lla)(例如索氏志贺氏菌（S. sonnei)、痢疾志贺氏菌（S· dysenteriae)、弗氏志贺氏菌（s ^奶地)）；沙門氏菌 (Salm〇ndla)(例如傷寒桿菌（S· typhi)、副傷寒桿菌（s paratyphi)、雈亂桿菌（s· ch〇leraesuis)、腸炎桿菌（8 enteritidis));李氏菌（Listeria)(例如單核球產生性李氏菌⑴ 2〇 monocytogenes));螺旋桿菌（Helic〇bacter)(例如幽門螺旋桿菌（H· pylori)，假單胞菌（Pseud〇m〇nas)(例如綠膿桿菌（p aerugi腦郝葡萄球菌（Staphyl〇c〇ccus)(例如金黃葡萄球菌 (S· aureus)、表皮葡萄球菌以咖簡述⑼丨腸球菌 (Enter〇C〇CCUS)(例如糞腸球菌（E· faecalis)、屎腸球菌（Ε· 23 200844231 faecium));芽孢桿菌（Bacillus)(例如炭疽桿菌（β· anthracis));棒狀桿菌（Corynebacterium)(例如白喉棒狀桿菌 (C· diphtheriae)及彼衣菌（Chlamydia)(例如砂眼披衣菌（c· trachomatis)、肺炎彼衣菌（C· pneumoniae)、魏鴣熱披衣菌（c· 5 psittaci)) 〇寄生蟲之代表性實例包括但非限於瘧原蟲 (Plasmodium)(例如惡性癔原蟲（R falciparum));弓漿蟲 (Toxoplasma)(例如鼠弓漿蟲（T· gondii));利什曼原蟲 (Leishmania)(例如主要利什曼原蟲（L. major));肺囊蟲 (Pneumocystis)(例如卡氏肺囊蟲（P· carinii));及血吸蟲 10 (Schisostoma)(例如曼森氏血吸蟲（S· mansoni))。真菌之代表性實例包括但非限於念珠菌（Candida)(例如白色念珠菌 (C· albicans))及麴菌（Aspergillus)。高等真核生物較佳為哺乳類包括人類。「相同有機體」係定義來自於共通祖先且遵循相同演 15 化徑路的有機體。代表性實例包括有相同血清型或基因型之各種病毒單離株。例如HPV-16之二單離株被歸類為此類別。「密切相關之有機體」係指來自於共通祖先但演化過程中分歧之有機體。代表性實例包括有不同血清型或基因型之病毒。例如HPV-16及HPV-18被歸類屬於此一類別。 20 於一較佳實施例中，獲得至少第一核酸分子及第二核酸分子之有機體為乳頭狀瘤病毒，各自編碼乳頭狀瘤病毒多月太。「乳頭狀瘤病毒」可定義為屬於乳頭狀瘤病毒科亞科之病毒，此術語涵蓋非人種屬來源之動物乳頭狀瘤病毒，包括但非限於牛、馬、兔、羊、犬、非人靈長類及齧齒類 24 200844231 以及人類乳頭狀瘤病毒(HPV)。目前已經識別多於1〇〇種 HPV之基因型（Van Ranst 等人，1992, j. Gen Vir〇1 73, 2653，DeViUiers等人，2004，病毒學324, 17-27)，依據其致癌基因潛力，被歸類為「低風險」（LR)及「高風險」（HR) _ 5企清型。LRHPV於感染個體引發良性腫瘤，而HRHPV有惡性進展的高度風險。

有關大致指南，乳頭狀瘤病毒具有約7900鹼基對之雙股圓形DNA，由蛋白質殼體所包圍（例如參考Pfister，i987，於乳頭狀病毒科：乳頭狀瘤病毒，Salzman及Howley編輯，晋能出版社(Plenum Press)，紐約，1-38頁）。其基因體係由二個功能區所組成，早期區（E)、晚期區（L)及長控制區 (LCR) ° LCR含有轉錄調節序列，諸如加強基因及啟動基因。晚期區編碼結構L1蛋白質及L2蛋白質，分別為主要殼體蛋白質及次要殼體蛋白質；而早期區編碼主要出現於細胞核來控制病毒的增生、轉錄及細胞轉形之調節蛋白質 (E1-E7)。更特別’ E1蛋白質為具有Ajp相依性螺旋酶活性之DNA結合碟酸蛋白（Desaintes及Demeret，1996，癌症生物學研討會7，339-347 ; Wilson等人，2002，病毒基因 24,275-290)。E2蛋白質為多功能DNA結合作用磷蛋白，E2 20蛋白質調節病毒基因轉錄且控制DNA複製(Bechtold等人， 2003, JL Viirol· 77, 2021-8)。E4編碼蛋白質結合且破壞細胞質角蛋白網路’且於病毒成熟扮演某種角色。仍蛋白質之功能仍然有爭議，於病毒整合入宿主染色體時經常喪失E5 蛋白質之表現。HR HPV基因型之E6及E7編碼基因產物係 200844231 涉及感染細胞之致癌基因轉形(Kanda等人，1988, J. Virol. 62, 610-3 ; Vousden等人，1988，致癌基因研究3, 1-9 ; Bedell 等人，1987, J· Virol· 61，3635-40)，推定係經由此等病毒蛋白質分別結合至細胞腫瘤遏止基因產物p53及視網膜母細 5 胞瘤（Rb)(綜論於Howley，1996,乳頭狀瘤病毒及其複製， 2045 頁_2076 頁；綜論於B.N. Fields，D.M. Knipe及P.M. Howley (編輯），病毒學，第3版，里平考瑞文出版社 (Lippincott-Raven Press)，紐約州紐約）。涉及天然HPV-16 E6 多肽結合至p53之胺基酸殘基已經明確定義係由殘基118至 10 122 (+1為第一個Met殘基，或由殘基111至115，始於較佳使用的第二Met殘基）（Crook等人，1991，Cell 67, 547-556); 涉及天然HPV-16 E7多肽結合至Rb之該等胺基酸殘基係位於由殘基 21 至 26 (Munger 等人，1989，EMBO J· 8, 4099-4105 ; Heck等人，1992, Proc· Natl· Acad· Sci· USA 89, 15 4442-4446)。較佳至少該第一核酸分子及第二核酸分子分別係得自選自於由HPV-16、HPV-18、HPV-30、HPV-31、HPV-33、 HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、 HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-70及HPV-85所 20 組成之組群之高風險乳頭狀瘤病毒。如此處使用之「乳頭狀瘤病毋多肤」係才曰業界認知得自乳頭狀瘤病毒基因體/來源之核酸分子所編碼之多肽。如前文就「多肽」一詞定義，「乳頭狀瘤病毒多肽」涵蓋天然經改性之乳頭狀瘤病毒多肽及其胜肽。乳頭狀瘤病毒來源 26 200844231 包括但非限於生物樣本（例如收集自已經暴露於乳頭狀瘤病毒之個體之生物樣本、組織切片、生檢檢體及組織培養）、培養細胞(例如得自ATCC之CaSki細胞）以及於寄存協會、於商業型錄或如參考文獻所述可得之重組物質。多種 5乳頭狀瘤病毒基因體之核；酸序列及編碼多肽之胺基酸序列已經說明於參考文獻，且於特定資料庫例如基因存庫可得。有關概略資訊，HPV-16基因體於基因存庫以存取號碼 NC—01526 及 K02718 描述；HPV-18 以 NC—001357 及 X05015 ; HPV-31 以J04353 ; HPV-33以M12732 ; HPV-35以 10 NC—001529 ; HPV-39 以 NC_001535 ; HPV-45 以 X74479 ; HPV-51 以 NC—001533 ; HPV-52 以 NC—001592 ; HPV-56 以 X74483 ; HPV-58以D90400 ; HPV-59以NC—001635 ; HPV48 以 X67160 及 M73258 ; HPV-70 以 U21941 ;及 HPV-85)^ AF131950描述。 15 由第一核酸分子及/或第二核酸分子所編碼之乳頭狀瘤病毒多肽可為早期、晚期或其組合。早期乳頭狀瘤病毒多肽包括El、E2、E4、E5、E6及E7 ;而晚期多肽可為^ 或L2。大量乳頭狀瘤病毒血清型之早期多肽及晚期多肤之核苷酸序列及胺基酸序列係說明於熟諳技藝人士可得之來 2〇考文獻。較佳，該至少第一核酸分子及第二核酸分子分別編石馬選自於由El、E2、E6及E7所組成之組群之一早期多肽。供舉例說明，天然HPV-16 El、E2、E6及E7多肽之胺基酸序列分別係顯示於证卩ID NO: 1-4。但本發明非僅限於此等序 27 200844231 列實例。確實核普酸序列及胺基酸序列可於不同乳頭狀瘤病毒單離株間變化，此天然基因變化係含括於本發明之範圍及非天然改性，容後詳述。經適當改性之乳頭狀瘤病毒夕肽之具體貫施例顯示如下（例如SEQ山n〇:5_8及 5 64-65) ’但热諳技藝人士可調整其中修改(例如藉序列比較調整至始於其它乳頭狀瘤病毒基因型之多肽）。供本發明使用之適當乳頭狀瘤病毒扪多肽涵蓋刺激病毒增生有缺陷之突變株，亦即刺激病毒增生能力於統計方面頦著低於相對應之天然E i多肽刺激病毒增生之能力（例 10如低於75%，較佳低於50%，較佳低於1〇%，及更佳低於 5%)。有關一般指南，負責刺激病毒增生之功能部位係位於 E1中部（例如Hugues及Romanos，1993，核酸研究21， 5817-23)。複製缺陷E1多肽之代表例係說明於熟諳技藝人士可得之參考文獻，例如說明於Yasugi等人（1997，J. Virol 15 71 5942*·51)。本發明之内文中之較佳修改包括以另一個殘基(較佳以Asp殘基)取代HPV-16 E1多肽於位置482之Gly殘基(例如參考SEQ ID NO:5)或以另一個殘基(較佳以Asp殘基)取代HPV-18 E1多肽於位置489之Gly殘基(例如參考SEQ ID NO:6)。 20 本發明有用之適當E2多肽涵蓋比較天然E2多肽於轉錄活化活性及/或複製活性有缺陷之突變株(例如低於75%，較佳低於50%，較佳低於10%，及更佳低於5%)。有關一般指南，負責轉錄活化及刺激複製之功能部位係位於E2之N端部（Seedorf等人，1985，病毒學，145, 181-185 ; Kennedy等 28 200844231 人，1991，J. Virol· 65, 2093-2097 ; Cole等人，1987，几以〇1· Biol· 193, 599-608 ; McBride等人，1989, Proc· Natl· Acad· Sci· USA，86, 510-514);複製及轉錄E2活性減低或缺陷容易使用標準方法測定(例如參考Sakai等人，1996, J. Virol. 70, 5 1602-1611)。本發明所使用之適當缺陷E2突變株係說明於热諳技藝人士可得之參考文獻，例如說明於Demeret等人 (1995，核酸研究23,4777-4784)、Sakai等人（1996, J· Virol· 70, 1602-1611)、Brokaw等人（1996，病毒學期刊 70,23_29)及 Ferguson等人（1996，病毒學期刊70,4193-4199)。於本發明 10 之内文中之較佳修改包括以Ala殘基(E39A)取代於HPV-16 E2位置38之Glu殘基及/或以Ala殘基(Γ73Α)取代於位置73之 lie殘基(例如參考SEQ IDNO:7)。供舉例說明，以HPV-16 E2 位置39及位置73之Glu殘基及lie殘基分別係與於HPV-18 E2 之位置43及位置77之Glu殘基及lie殘基相對應（例如參考 15 SEQIDNO:8)。適曰用於本發明之E6多狀涵蓋結合至細胞腫瘤遏止基因產物p 5 3有缺陷之非致癌突變株。非致癌E 6多肽之代表性實例例如係說明於Pim等人（1994，致癌基因9，1869-1876) 及Crook等人（1991，細胞67, 547-556)。於本内文之較佳修 20改包括於HPV-16 E6刪失殘基118至122 (CPEEK)(例如參考 SEQ ID NO:64)或於 HPV_18 E6 刪失殘基 113 至 117 (NPAEK) 〇適合用於本發明之E7多肽涵蓋結合至細胞腫瘤遏止基因產物Rb有缺陷之非致癌突變株。非致癌£7多肽之代表性 29 200844231 實例例如係述於例如Munger等人（1989，EMBO J. 8, 4099-4105)、Heck等人（1992, Pr〇c· Natl· Acad. Sci· USA 89, 4442-4446)及Phelps等人（1992, J. Virol· 66, 2148-2427)。於本内文之較佳修改包括於HPV-16 E7刪失殘基21至26 5 (DLYCYE)(例如參考SEQ ID NO:65)或於HPV-18 E7冊]失殘基24至28 (DLLCH)。此外，由該至少第一核酸分子及/或第二核酸分子所編碼之多肽(例如乳頭狀瘤病毒多肽）進一步包含對所編碼多肽之處理、安定性及/或溶解度有利之額外修改，例如遏止 10可能裂解位置、遏止可能糖化位置及/或呈現於表現細胞表面。舉例言之，所編碼之多肽包括用來定錨於表現細胞之胞質膜之適當h號。確實先前顯示膜呈現，允許改良MHC I 類及MHC II類呈現，結果導致由宿主免疫系統辨識的加強 (例如參考WO99/0388)。因天然早期乳頭狀瘤病毒多肽 15 (El、E2、E6及E7)為核蛋白（但未能明確識別典型核定位信號），較佳係將其定址於胞質膜，俾便改良其免疫原性潛力，如此改善其於宿主個體之療效。於表現作用的宿主細胞表面有效膜呈現多肽可經由將多肽融合至信號胜肽及膜定錨胜肽來達成。此種胜肽為業 20界所已知。簡言之，信號胜肽通常係存在於膜所呈現的或膜所分泌的多肽N端，起始其通過進人内f網㈣。信號胜狀包含I5至35大致為斥水之胺基酸，隨後藉特定位於服之胜肽内切酶移除來獲得成熟多肽。膜定錯胜肽通常本質上為斥水性，用來將纽定錨於細胞膜(例如參考Bmnden及 30 200844231 T〇〇Ze，1991，蛋白質結構介紹，202-214頁，紐約葛蘭）。可用於本發明内文之信號及膜定錨胜肽之選擇龐大。其分別係得自任何分泌的多肽或膜定錨的多肽（例如細胞多肽或病毒性多肽)諸如狂犬病糖蛋白、HIV病毒被膜糖蛋白或麻 5疹病毒F蛋白；或該多肽可為合成。信號肽之較佳***位^ 為松碼子下游用於轉譯起始端；膜定錯胜肽為C端例如停止密碼子之緊鄰上游。若有所需，鏈接劑胜耿可用來將信號胜肽及/或膜定錨胜肽鏈接至所編碼之多肽。適合用於本發明之膜定錯及缺陷m多肽之代表例示於 10 SEQ ID Ν0··5 (定義實例章節所示之ΗρλΜ6 ss_ei、t魔多肽）及於SEQ ID NO:6 (定義實例章節所示之Hpv_i8 SS-E1*-TMF多肽）。適合用於本發明之膜定錯及缺陷拉多肽之代表例示於SEQ ID N〇:7 (定義實例章節所示之 HPV-16 SS-E2*-TMR多肽)及於SEQ ID N〇·8 (定義實例章 Η節戶斤示之HPV-18SS-E2、TMR多肽）。適合用於本發明之膜定錯及非致癌性E6及E7多肽之代表例示於SEQ m n〇:64 (定義實例章節所示之HPV^6 ss韻*_醫多肽)及於_ ID N0.65 (定義貫例章節所示之Hpv i6 ss e7*_tmr多肽）。 20 於特佳實施例中，該至少第-核酸分子及第二核酸分子編碼得自相同HPV血清型之兩個不同乳頭狀瘤病毒多肽。於本貫施例之較佳面相中，該第一核酸分子編碼別多肽，而該第二核酸分子編多月大，或反之亦然。較佳E1 31 200844231 AE2編碼核酸分子係得自HPV-16或得自HPV-18。較佳，該第核酸分子編碼包含或主要組成為或組成為sEQ ID ΝΟ·5所不胺基酸序列之一多肽，而該第二核酸分子編碼包含或主要組成為或組成為SEQ ID ΝΟ:7所示胺基酸序列之 5 一多肽。另外，該第一核酸分子編碼包含或主要組成為或組成為SEQ ID NO :6所示胺基酸序列之一多肽，而該第二核酸分子編碼包含或主要組成為或組成為SEq ID N〇:8所示胺基酸序列之一多狀。於自然部分(例如HPV_164HPV_18基因體），E1_編碼序 10列之3 °卩重4:E2-編碼序列之5’部共59個核苷酸。存在有此等100%同源性59核苷酸預期對表現扪及拉編碼核酸分子之載體安定性造成負面影響。同源重組可出現於此等共通部分間，結果導致包含於其間之核苷酸序列喪失。根據本發明，於改性前存在於E1及E2編碼核酸分子之 15 59核菩酸重疊部分間之1〇〇%同源性，經由簡併於該等核酸分子中之一者之密碼子使用樣式，同源性可降至低於 75%。簡併序列之代表例示於3叫ID n〇:9，其中於E1/E2 重疊59核苷酸之同源性降至69% (如第i圖所示），編碼 HPV-16 E1及E2多肽之本發明之較佳載體包含狃卩出 20 N〇:9所示之核苷酸序列。相同策略可應用於存在於Hpv_is El及E2編碼序列之重疊部。此種簡併序列可導入耵編碼第一核酸分子來置換天然重疊5 9核苷酸(例如分別為s E Q工d NO:10及 11)。如此，本發明之較佳載體包含一第一核酸分子包含或 32 200844231 主要組成為或組成為SEQ ID NO:10所示之核苷酸序列（其編碼SEQ ID N〇:5之HPV-16 E1多肽），及一第二核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID ΝΟ··12所示之核苷酸序列 (其編碼SEQ ID ΝΟ:7之HPV-16 Ε2多肽）。本發明之另一個 5較佳載體包含一第一核酸分子包含或主要組成為或組成為 SEQ ID NO: 11所示之核苷酸序列（其編碼seq id NO:6之 HPV-18 El多肽），及一第二核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID NO:13所示之核苷酸序列（其編碼seQ ID NO:8之HPV-18 E2多肽）。 10 更佳本發明之載體為MVA載體，第一（E1編碼)核酸分子係置於牛痘7.5K啟動基因之控制之下，而第二(E2編碼）核酸分子係置於牛痘H5R啟動基因之控制之下，第一核酸分子及第二核酸分子皆係***該MVA載體之刪失m。本發明亦係關於編碼HPV-16 E1多肽之一第一核酸分 15子，編碼HPV_16 E2多肽之一第二核酸分子，編碼hpv-18 Ei 多肽之一第三核酸分子，及編碼HPV-18 E2多肽之一第四核酸分子，其中該第一、第二、第三及第四核酸分子並未包含具有同源性百分比75%或大於75%之40個或以上連續核苷酸部分。較佳，該HPV^16E1多肽包含SEQidn〇:5所示 20核酸序列，該HPV-16E2多肽包含SEQIDN0:7所示核酸序列’該HPV-18E1多肽包含SEQIDN0:6所示核酸序列，及/ 或該HPV-18 E2多肽包含SEQIDNO:8所示核酸序列。於天然版本中，HPV-16及HPV-18 E1編碼序列包含具有同源性百分比8〇〇/0或大於80〇/〇之數個40或以上連續核苔 33 200844231 酸部分。就HPV-16及HPV-18 E2編碼序列而言，此點亦為真。此外，相鄰的E1及E2編碼序列重疊於Hpv_i6及HPy-18 基因體中約59核苷酸之一部分。就此方面而言，建議修改 HPV-18 E1及E2編碼核酸分子序列，因而將其與hpv-16對 5偶的同源性降至低於75%，特別於由兩個血清型所共享之同源部分之同源性降至低於75%。為了達成此項目的， HPV-16及HPV-18 E1及E2基因之核苷酸序列可經校準，於核苷酸層面可設計改性，來將同源性降至少於8、7、6或較佳5個接續核苷酸。此外，HPV-18 E1序列可進一步經修改 10 來將同源性降至低於75%，59核誓酸部分重疊hpV-18 E2序列之5’端。較佳密碼子之使用經修改，但修改不會於胺基酸層面轉譯，但產生如此處定義之修改，例如導致缺陷酶功能。適合用作為第三核酸分子及第四核酸分子之「簡併」 HPV-18 E1-及HPV-18 E2編碼核苷酸序列之代表例分別列 15 舉於SEQIDNO.ll及SEQIDNO:13。本發明之較佳載體包含一第一核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID NO:10所示核酸序列（編碼SEQ ID N〇:5所示HPV-16 El多肽）’ 一第二核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID NO:12所示核酸序列（編碼SEQ ID NO:7所示HPV-16 E2多 20 肽），一第三核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID N0:11所示核酸序列（編碼SEQ ID NO:6所示HPV-18 El多肽），及一第四核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID NO:13所示核酸序列（編碼SEQ ID NO:8所示HPV-18 E2多肽）。較佳該載體為MVA載體，該第一、第二、第三及第四 34 200844231 核酉文分子係導入M VA載體之刪失j i j，該第一及第三(E〗編碼）核酸分子係置於相反方向，各自係於牛痘ρ·5κ啟動基因之 k制之下，而第二及第·四（Ε2編碼)核酸分子係置於相反方向’各自係於pH5R啟動基因之控制之下。 5 於另一個特佳實施例中，該至少第一核酸分子及第二核馱分子編碼得自密切相關有機體，例如密切相關HPV血清型諸如HPV-16 ' HPV-18、HPV-33及/或HPV-52之相同多肽。於本實施例之第一面相中，得自於密切相關有機體之 10相同夕肽較佳為E2多肽。編碼E2多肽較佳經改性，來經膜定錨且為病毒複製缺陷，如此處定義。於天然方面，各種基因型之E2編碼序列於核苷酸層面，特別於最為保留性部分具有高度同源性。存在有此等同源性序列預期負面影響共同表現兩種或多種(例如3、4或甚至更多）E2基因之载體 15安定性，該E2基因特別為得自HR、HPV之E2基因，諸如 HPV-16、HPV-18、HPV-33及HPV-52。此等同源性基因序列間出現同源性重組，結果導致喪失包含於其間之核苷酸序列，如此導致基因靜默。根據本發明，包含於本發明載體之編碼E2多肽之核酸 20分子可經由簡併密碼子使用樣式來改性，因而將同源性特別為高度同源部分之同源性降至低於75%。簡併後之編碼 E2多肽之核酸分子之代表例列舉於SEq ID N〇:13、66、67、 68及69。更特別，SEQIDNO:13編碼膜呈現的且為複製缺陷之HPV-18E2多肽，其核苷酸序列已經經設計，因而將與 35 200844231 其E2編碼對偶之同源性降至少於8個或7個連續核驻酸。 SEQ ID NO:66及67二者皆編碼複製缺陷hpv-33 E2多肽(其進一步於SEQ ID ΝΟ··67膜呈現），該等核苷酸序列經設計為將其與其它Ε2編碼對偶之同源性降至少於8個或7個連續核 5甘酸。SEQ ID NO.68及69« —者皆編碼複製缺陷HPV-52 E2 多肽(其進一步於SEQ ID NO:69膜呈現），該等核誓酸序列經設計為將其與其它E2編瑪對偶之同源性降至少於8個或7 個連續核苷酸。但本發明非僅限於此等序列實例，如前文定義簡併之編碼E2乳頭狀瘤病毒多肽之核酸分子之其它版 10 本也可基於此項原則設計。本發明之較佳載體包含編碼如此處定義之HP V-16 E2 多肽之一第一核酸分子(例如包含SEQ ID NO:7所示胺基酸序列之膜呈現的複製缺陷E2多肽），編碼如此處定義之 HPV-18 E2多肽之一第二核酸分子(例如包含SEQ ID NO:8 15 所示胺基酸序列之膜呈現的複製缺陷E2多肽），編碼如此處定義之HPV-33 E2多肽之一第三核酸分子(例如包含SEq π) NO:70所示胺基酸序列之膜呈現的複製缺陷E2多肽），及編碼如此處定義之HPV-52 E2多肽之一第四核酸分子（例如包含SEQ IDNO:71所示胺基酸序列之膜呈現的複製缺陷E2多 20 肽）。更佳該第一核酸分子包含或主要組成為SEQ ID NO: 12 所示之核酸序列；該第二核酸分子包含或主要組成為SEQ ID NO:13所示之核酸序列；該第三核酸分子包含或主要組成為SEQIDNO:67所示之核酸序列；及/或該第四核酸分子包含或主要組成為SEQIDNO:69所示之核酸序列。更佳， 36 200844231 本么月之載體為MVA載體，四個E2編碼核酸分子係***刪失ΠΙ。又承酸分子係於牛殖 5 反方向。尺仏，該第一及第二核酸分子係於牛痘H5R啟動之彳工制之下且置於彼此相反方向；而該第三及第四核 ρ·75Κ啟動基因之控制之下且置於彼此相

於本發明之另一面相中，得自密切相關有機體之相同夕月太車父佳為恥多肽、E7多肽或E6及E7多肽二者。E6及E7 可刀開表現’或表現成為融合多肽。編碼之E6多肽及/或E7 夕較仏經改性’因而如此處定義為臈定錨且非致癌性。 1〇於天然版本HPV-16及HPV-18，天然E6序列於核苷酸層面有63%同源性，而HPV-16及HPV-18，天然E7序列彼此有 57%同源性。但於兩種情況下，HPV-16及HPV-18天然序列共享具有80%或超過80%同源性之數個4〇核苷酸或以上部分（參考第2圖）。存在有此等同源性部分預期對共同表現 15 HPV_16及HPV-18 E6基因及/或E7基因之一載體之安定性造成負面影響。此等同源性部分間出現同源性重組，結果導致包含於其間之核苷酸序列的喪失，如此導致基因靜默。根據本發明，編碼HPV-16及/或HPV-18E6多肽及E7多肽之核酸分子可經由簡併密碼子使用樣式改性，因而將同 2〇源性特別為同源性部分之同源性降至低於75%。編碼 HPV-18 E6多肽之簡併後之核酸分子之代表例列舉於SEQ ID NO:14及編碼HPV-18 E7多肽之簡併後之核酸分子之代表例列舉於SEQIDNO:15。更特別，SEQI〇n〇:14及SEQ ID NO:15經設計來將與HPV-16對偶之同源性降至少於8、 37 200844231 7、6或較佳5個連續核苷酸，同時編碼HPV-18膜定錨之非致癌性E6多肽及E7多肽。但如前文定義之編碼E6及/或E7乳頭狀瘤病毒多肽之經簡併的核酸分子之其它版本也可基於本原則設計。 5 本發明之較佳载體包含編碼如此處定義之HPV-16 E6 多月太之一第一核酸分子（例如膜定錨及非致癌性），及編碼如此處定義之HPV-18 E6多肽之一第二核酸分子(例如膜定錨及非致癌性），其中該第二核酸分子包含或主要組成為SEQ ID NO:14所示之核酸序列。本發明之另一個較佳載體包含 1〇編碼如此處定義之HPV-16 E7多肽之一第一核酸分子（例如膜定錨及非致癌性），及編碼如此處定義之HPV-18 E7多肽之一第二核酸分子(例如膜定錨及非致癌性），其中該第二核酸分子包含或主要組成為SEQ ID N〇:l5所示之核酸序列。更佳，本發明之載體為MVA載體，第一核酸分子係置於牛 15痘7.5K啟動基因之控制之下，而第二核酸分子係置於牛痘 H5R啟動基因之控制之下，以及第一核酸分子及第二核酸分子皆係***該MVA載體之刪失m。本發明亦係關於一種載體，包含編碼Hpv_l6 E6多肽與 HPV-16 E7多肽之融合之一第一核酸分子；以及編碼 2〇 HPV-18 E6多肽與HPV-18 E7多肽之融合之一第二核酸分子，其中該第一核酸分子及第二核酸分子並未包含具有同源f生百刀比約75%或大於75%之40個或更多個連續核苔酸部分。本發明亦係關於一種載體，包含編碼迅^—“ E6多肽之 38 200844231 一弟一核酸分子，編碼HPV-18 E6多肽之一第二核酸分子，編碼HPV-16 E7多肽之一第三核酸分子，編碼Ήρν_18 £7多肽之一第四核酸分子，其中該第一、第二、第三及第四核酸分子並未包含具有同源性百分比約75%或大於75%之4〇 5個或更多個連續核^"酸部分。較佳，該第二核酸分子包含、主要組成為或組成為SEQ ID N0:14&/或該第四核酸分子 • 包含、主要組成為或組成為SEQ N〇:15。更佳，本發明之載體為MVA載體，第一及第二核酸分子係置於牛痘75κ _ ⑨動基因之控制之下，而第三及第四核酸分子係置於牛痘 10 H5R啟動基因之控制之下，以及第一、第二、第三及第四核酸分子皆係***該M VA載體之刪失m。 • 於另一個面相中，本發明也提供包含、主要組成為或組成為SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、66 67 68或69中之任-者所示之核苔酸序列之一種實質上單離之； 15 核酸分子。 — 財發明之另一個實施例中，包含於本發明之载體之響帛一及第二核酸分子，以及若存在時第三及第四核酸分子係呈適合於宿主細胞或個體表現編碼多肽之形式，李二苴係置於其表現所需之調節序列之控制之下。丁/、 >如此處使用，「調節序列」係指於一給定宿主細胞允卉、促成或_節一核酸分子之表現之任何序列，包酸或其衍生物中之一者（亦即mRNA)之增殖、複製匕該核剪接、轉譯、安定性及/或轉運入該宿主細胞。於本彳^^彔、内文中，調節序列係「工作式鏈接」至該欲，明之兄之核酸分 39 200844231 子，亦即其係處於允許於宿主細胞或㈣表現之功能關係。此種調節序列為技藝界眾所周知(例如參考㈤編， 1990，基因表現技術：料方法185，學術出版社，聖地牙哥)。熟諳技藝人士須瞭解調節序列之選擇可依據多項因素 5諸如載體類型、宿主細胞、期望表現層面等因素決定。啟動基因特別重要，本發明涵蓋組成性啟動基因之使用，該組成性啟動基因指導核酸分子於多類宿主細胞之表現以及/、於某些佰主細胞直接表現(例如組織特異性調節序列）’或回應於特定事件或外生性因子(例如藉溫度、營養 10添加物、激素或其它配體）而表現。於真核系統組成性表現之適當啟動基因包括病毒性啟動基因諸如SV40啟動基因、細胞巨病毒(CMV)即刻早期啟動基因或加強基因B〇shart等人，1985，細胞41,521-530)、腺病毒早期及晚期啟動基因、單純疱疹病毒(H S V) -1之胸腺苷激酶(τκ)啟動基因及反錄 15病毒長端重複本（例如MoMuLV及勞斯肉瘤病毒（RSV) LTR)，以及細胞啟動基因諸如磷酸糖激酶(Pgk)啟動基因 (Hitzeman等人，1983,科學219, 620-625 ; Adra等人，1987，基因60, 65-74)。可用於痘病毒載體驅動核酸分子之表現之適當啟動基因包括牛痘病毒之7.5K、H5R、TK、p28、pll 20 或K1L啟動基因。另外，可使用合成啟動基因，諸如述於 Chakrabarti等人（1997，生物技術23, 1094-1097)、Hammond 等人（1997，病毒學方法期刊66，135-138)及Kumar及Boyle (1990，病毒學179,151-158)以及早期與晚期痘病毒啟動基因間之嵌合型啟動基因。 40 200844231 可誘導啟動基因係藉外部供給病毒調節，且包括但非限於鋅可誘導金屬硫蛋白（MT)啟動基因（Me Ivor等人， 1987，Mol· Cell Biol· 7，838-848)、德沙美沙松 (dexamethasone) (Dex)誘導小鼠乳癌病毒(MMTV)啟動基 5因、T7聚合酶啟動基因系統（W098/10088)、艾戴松 (eedysone)昆蟲啟動基因（No等人，1996, Proc. Natl. Acad. Sci· USA 93，3346-3351)、四環素(tetracycline)可抑制啟動基因（Gossen等人，1992, Proc· Natl. Acad. Sci. USA 89， 5547-5551)、四環素可誘導啟動基因（Kim等人，i995, j 10 Vkol. 69, 2565-2573)、RU486可誘導啟動基因（Wang等人， 1997, Nat. Biotech. 15, 239-243及Wang等人，1997，基因治療4,432-441)、拉帕黴素(rapamycin)可誘導啟動基因（Magari 等人 ’ 1997, J· Clin· Invest. 100, 2865-2872)及得自大腸桿菌之lac、TRP、及TAC啟動基因。 15 於本發明之内文中使用之調節序列也可為組織特異性，來於需要療效的特定組織驅動核酸分子之表現。適當啟動基因係取自於偏好於腫瘤細胞中表現的基因。此種基因可藉顯示及比較性基因體雜交來識別（例如參考us 5,759,776及5,776,683)。 20 熟諳技藝人士瞭解控制包含於本發明之载體之核酸分子表現之調節元體進一步包含用於轉錄之適當起始、調節及/或結束之額外元體(例如p〇lyA轉錄結束序列卜轉運(例如核定位信號序列）、處理(例如剪接信號）、安定性(例如***序列及非編碼5,序列及3,序列）、及轉譯(例如三分先 200844231 導子序列、核糖體結合位置、辛道嘉莫(Shine-Dalgamo)序列等）入宿主細胞或個體。於另一面相中，本發明提供包含前述載體之傳染性病毒顆粒。未嘗試描述進一步細節，於此處將進行傳染性病 5 毒顆粒製造之多種已知方法。典型地，此種病毒顆粒係藉一種方法製造，該方法包含下列步驟：（a)將病毒載體導入適當細胞系，（b)於適當條件下培養細胞系，允許傳染性病毒顆粒的製造，由細胞系培養中回收所產生的傳染性病毒顆粒，以及視需要可純化所回收之傳染性病毒顆粒。 10 當病毒載體為缺陷性時，傳染性病毒顆粒通常係於互補細胞系製造，或透過使用助手病毒製造，助手病毒供給反式非功能性病毒基因。舉例言之，E1經刪除之腺病毒載體之適當互補細胞系包括293細胞(Graham等人，1997，J.

Gen. Virol· 36, 59-72)、PER-C6細胞(Fallaux等人，1998， 15 人類基因治療9，1909-1917)及HER96細胞。適合用於繁殖痘病毒載體之細胞為禽細胞，更佳為由得自受精彡卩之雞胚所製造之一次雞胚纖維母細胞(CEF)。製造者細胞可於適當溫度、pH及氧含量條件下，於習知之發酵生物反應器、燒瓶及培養皿中培養。 2〇傳染性病毒顆粒可由培養上清液或於細胞溶解後由細胞回收。病毒顆粒進一步根據標準技術純化(層析術、超離心，例如說明於W096/27677、W098/00524、W098/22588、 WO98/26048、WO00/40702、EP1016700及 WO00/50573)。於另一個面相中，本發明提供包含前述核酸分子、載 42 200844231 體或傳染性病毒顆粒之宿主細胞。如此處使用「宿主細胞」一詞定義為可為本發明之載體或傳染性病毒顆粒之接受者之任何細胞，及此等細胞之子代細胞。須廣義瞭解本術語也涵蓋單離之細胞、一群細胞及特定細胞組織例如呈組織 5 或器官形式。此等細胞可為一次細胞、轉形細胞或培養之細胞。於本發明之内文中之宿主細胞包括原核細胞（例如大腸桿囷、芽孢桿菌、退伍軍人症菌）、低等真核細胞諸如酵母（例如啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、龐比酵母 10 (Saccharomyces pombe)或巴斯多比奇菌（Pichia pastoris))及其它真核細胞諸如昆蟲細胞、植物細胞及高等真核細胞，特別偏好使用哺乳動物細胞(例如人細胞及非人細胞）。適當宿主細胞之代表性實例包括但非限於BHK細胞（嬰倉鼠腎細胞）、MDCK細胞（馬丁-戴比(Madin-Darty)犬腎細胞系）、 15 CRFK細胞（可蘭戴爾（Crandell)貓腎細胞系）、CV-1細胞（非洲猴腎細胞系）、COS(例如COS·7)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO) 細胞、小鼠NIH/3T3細胞、HeLa細胞及Vero細胞。「宿主細胞」一詞也涵蓋可互補本發明之複製缺陷性載體(例如腺病毒載體)之至少一項缺陷功能之互補細胞，諸如前文引述。 2〇宿主細胞可用於藉重組手段製造包含於本發明之載體或傳染性顆粒之該等核酸分子所編碼之多肽。此等技術為業界眾所周知(例如參考Ausubel，分子生物學流行方案，約翰威利公司，1987-2002年；及Sambrook等人，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社之最新版本）。 43 200844231 於另一面相中，本發明提供包含前述核酸分子、載體、傳染性病毒顆粒或宿主細胞（此處也稱作為「活性劑」或其任一種組合之一種組成物。較佳該組成物為包含治療有效量之活性劑及藥學上可接受之載媒劑之藥學組成物。 5 如此處使用，「藥學上可接受之載媒劑」一詞意圖包括與藥物投予可相容之任何及全部載劑、溶劑、稀釋劑、賦形劑、輔劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑及吸收延遲劑等。如此處使用，「治療有效量」為足夠改善於個體所期望治療或預防之病理情況通常相關聯之一項或多項症 10狀之劑量。當關聯治療用途時，本術語表示足夠預防或延遲於個體建立病理情況之劑量。舉例言之，治療有效量為足夠於接受治療之個體誘導或提升免疫反應之數量，或足夠緩和、改善、穩定、逆轉、減慢、或延遲病理情況之進打之數量（例如於個體之病灶或腫瘤的尺寸縮小或退行，感 I5 ^個體之病毒感染逆轉）。 20 較佳本發明組成物包含於使用之劑量及濃度為無毒之一種或多種_及/或稀_。此種載劑及/或稀釋劑較佳係選自於相來調配供线性投藥或顧㈣之單位劑=形式或夕劑I形式之組成物。適當載劑可為溶劑、含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇 '液體聚乙 : =物油或其適當混合物之分散介質。稀釋劑較佳為等張之代高張性且有相對低離子強度。適當稀釋劑 ^表性一包滅g水、纽食财(例域化納〜夜、_萄糖、海藻糖或蔬糖溶液、漢克氏溶液、及^ 44 200844231 它水性生理上平衡鹽溶液(例如參考雷明頓：製藥科學及實務 ’ A· Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins之最新版本）。本發明組成物之pH適合經調整及緩衝來適當用於人類或動物，較佳係於生理pH及/或微鹼性pH(约pH 7.5至約PH 5 9 ’特佳為或8.5)使用。適當缓衝劑包括磷酸鹽缓衝劑(例如PBS)、碳酸氫鹽緩衝劑及/或Tris緩衝劑。本發明組成物可呈多種形式例如冷凍形式、固體形式 (乾粉形式或凍乾形式）或液體形式(例如水性）。活性劑加任何額外期望成分之固體組成物可得自先前經過無菌過濾溶 1〇液接文真空乾燥及冷凍乾燥。若有所需可以無菌安瓿形式儲存，方便於使用前藉添加適當載媒劑來重新調製。特佳組成物（例如當活性劑為腺病毒載體時)係調配於 1M蔗糖、150 mM NaCl、l MgCl2、54毫克/升吐溫(Tween) 8Ό、10 mM Tris pH 8·5。另一種較佳組成物係調配於1〇毫 15克/毫升甘露糖醇、1毫克/毫升HSA、20 mM Tris、pH 7.2 及150mMNaa。此等調配物特別適合於冷凍(例如_7〇它、 40°C、-2〇。〇或冷藏(例如代）溫度保有本發明組成物之安定性經歷至少兩個月時間。組成物也含有提供期望之藥物性質或藥效性質之一種 2〇或多種藥學上可接受之_劑，該等性質例如修改或維持 PH、滲透度、黏度、透明度、色彩、無菌性、安定性、釋放入或吸收入人體或動物體。安定性成分之代表例包括聚山梨糠醇醋8〇、L_精胺酸、聚乙烯基口比口各唆酮、海藻糖、及聚合物諸如聚乙二醇’其可用來獲得溶解度、安定性及 45 200844231 半生期等期望性質(Davis等人，1978，酶邮.4，169_ Burnham等人，1994, Am. j H〇sp pharm”，2i〇_2i8)。黏度提升劑包括叛甲基纖維素鈉、山梨糖醇、及葡萄聚糖。、’且成物也3有技蟄界已知促進滲透或轉運跨越黏膜障壁或 5轉運入特定器官之已知物質。舉例言之，適合供***投藥之組成物最終包括可用於増加黏膜之孔徑大小之一種或多種吸收促進劑。此外，本發明組成物包含適合於人體系統性投藥或黏膜扠樂之一種或多種辅劑。「辅劑」一詞表示可提升對特定 10抗原之免疫反應之化合物。辅劑可於抗原位置或接近抗原位置遞送。體液免疫力之提升典型係表現為對該抗原所提引出之抗體力價顯著增高（通常大於10倍）。細胞免疫力的增加例如可藉1%性皮膚試驗、胞毒性T細胞檢定分析、或IL-2之ELIspot檢定分析測定。較佳用於本發明之輔劑可 15刺激對活性劑之免疫力，特別經由toll狀受體（TLR)諸如 TLR-7、TLR-8及TLR-9刺激對活性劑的免疫力。有用之輔劑之代表性實例包括但非限於礬土、礦油乳液諸如福氏 (Freunds)完全及不完全（IFA)、脂多醣或其衍生物（RiH等人，1986，細菌内毒素之免疫學及免疫藥理學），普能出版 20公司，紐約，407-419頁）；皂素諸如QS2l (Sumino等人，1998, J. Virol· 72, 4931-9 ; WO 98/56415) ; 口米唾并唆琳化合物諸如伊米奎莫（Imiquimod) (Suader，2000，j. Am Acad Dermatol· 43, S6-S11)、1H-咪唑并(4,5-c)喳喏酮-4-胺衍生物 (阿達拉(Aldara))及相關化合物（Smorlesi，2005，基因治療 46 200844231 12，1324-32);胞嘧啶磷酸鳥苷募去氧核苷酸諸如CpG(Chu 等人，1997, J· Exp· Med· 186:1623 ; Tritel等人，2003, J· Immunol· 171:2358-2547)及陽離子性胜肽諸如IC-31 (Kritsch等人，2005，J· Chromatogr Anal. Technol Biomed 5 Life Sci 822, 263-70)。本發明之核酸分子、載體、傳染性顆粒或組成物可藉多種投藥模式投予，包括系統性投藥、局部投藥、及黏膜投藥。系統性投藥可藉任一種手段進行，例如經由皮下、皮内、肌肉、靜脈、腹内、血管内、動脈内注射進行。注 1〇射可採用習知注射器及注射針，或技藝界可得之任何其它適當裝置進行。經黏膜投藥可經口、經鼻、經氣管内、肺内、***内、或直腸内途徑進行。局部投藥可使用經皮手 #又(例如貼片等）進行。肌肉投藥或皮下投藥於使用病毒載體及傳染性顆粒為活性劑時為特佳。 15 適當劑量將依據多項因素而改變，諸如特定活性劑之藥效學特性、個體年齡、健康狀況及體重、欲治療的病理情況、症狀之本質及程度、合併治療之種類、治療頻率、對預防或治療的需要及/或期望功效。劑量也可依據所選用之特殊投藥途徑計算。有關判定治療用適當劑量所需計算 20之進一步精製可由執業人士鑑於相關情況例行性決定。有關一般指南，腺病毒顆粒用之適當劑量係由約1〇5至約1〇n iu (傳染單位），期望由約1〇7至約1〇12比及較佳由約1〇δ至約 10 1 m。牛癌病毒顆粒之適當劑量係由約104至約l〇1G pfu G谷ii斑形成顆粒），較佳係由約1〇5至約1〇9 pfu及更佳係由 47 200844231 約106至約5xl〇8pfu。载體質體可以1〇微克至2〇亳克且較佳 100微克至2毫克之劑量投予。此外，根據標準方案、劑量及計劃投藥可以單劑或另外以多劑投予經歷數小時、數曰及/或數週。此外，投藥可 5為大劑里注射或連續輸注。例如個體可使用至少技(例如2 至10次)投予前述核酸分子、載體、傳染性顆粒或叙成物。較佳’第-系列投予係於由數日至4週之一連串時間内進行，接著於第-系列之末次投藥後之丨個月至6個月内進行第二系列投藥(例如-次投藥或二次投藥）。第二系列各自投 10藥間之間隔時間可由數日至4週。於較佳實施例中，第一系列投藥包含以每週間隔3次循序投藥，而第二系列包含於第 -系列後之4個月至6個月内—次投藥。有關概略指南，使用MVA載體，較佳投藥途徑於使用包含1〇6至5><1〇8扣^之 MVA病毒顆粒劑量皮下投予。 15 本發明之核酸分子、載體、傳染性顆粒、宿主細胞、或組成物可導入個體用於治療或預防多種病理情况，包括遺傳病、先天性疾病、及後天性疾病。本發明亦係關於使用本發明之核酸分子、載體、傳染性顆粒、宿主細胞、戋組成物製備意圖用於治療或預防此等病理情況之藥物。特 20別適合治療或預防傳染病（例如病毒性感染及/或細菌性I 染）、癌症及免疫缺乏病。「癌症」一詞用於此處涵蓋任一種由於非期望的細胞增生所導致之任何癌性疾病，包括彌漫性腫瘤或侷限性腫瘤、轉移癌、癌性息肉及腫瘤前期病灶(例如腫瘤形成）。 48 200844231

10 預期涵蓋於本發明之内文之傳染病包括與如前文說明由致病微生物麵㈣發之任何情況。_涵蓋於本發明之内文之癌症包括但非限於神經膠母細胞廇、m素瘤、肥大細胞瘤、癌瘤以及乳癌、攝護腺癌、畢丸癌、即巢癌、子宮内膜癌、子宮頸癌(特別為與乳頭狀瘤病毒感毕所引發之子宮職）、咖（包括大細胞、小細胞、鱗狀細胞 :腺癌)、腎癌、膀胱癌、肝癌、結腸癌、肛門癌、胰癌、胃癌、胃腸道癌、口腔癌、腦癌及CNS癌、皮膚癌(例如里 =非黑素瘤)、血癌詞、白-病，特別係㈣^ 貝脰圑塊）、骨癌、視網膜母細胞癌及甲狀腺癌。

>於較佳實施例中，本發明用於預防性或治療性處理與乳頭狀瘤病毒(特別為HRHPV)感染相M之病情，諸如持續性感染、惡性前期病灶及惡性病灶。「持續性感染」係指= 感木個體尚未能達成病毒清除之乳頭狀瘤病毒感染之無症狀J典型並未觀祭得臨床症狀。惡性前期病灶之實例包括但非限於可於各個組織檢測得之低級、中級或高級上= 内腫瘤形成，諸如CIN(子宮頸上皮内腫瘤形成）、***上皮内腫瘤形成(VIN)、肛門上皮内腫瘤形成(AIN)、陰莖上皮内腫瘤形成(PIN)、及***上皮内腫瘤形成(VaIN)。惡性病 2〇灶之實例包括但非限於子宮頸癌、肛門癌、***癌、陰贫癌、及口腔癌。編碼乳頭狀瘤病毒多肽之本發明之核酸八子載體、傳染性顆粒、宿主細胞或組成物特別適合用於治療惡性前期病灶，特別CIN2/3病灶或惡性病灶特別子宮頸癌。於另一個實施例中，本發明也可用於預防性或治療 49 200844231 性處理與肝炎病毒(例如Η B V或H C V)感染所引發的病情，諸如持續性感染、慢性肝炎或猛爆性肝炎及肝癌。活性劑可單獨使用，或若有所需可結合習知治療模型使用（例如放射性治療、化學治療及/或手術治療）。習知治 5療模型係根據標準方案使用標準藥劑、劑量及投藥計劃遞送於動物體或人體；此種治療模型可於本發明之活性劑投樂前、投藥期間及/或投藥後進行。舉例言之，用於治療與 HCV感染相關之病情，本發明之方法或用途較佳係與下列結合：例如蛋白酶抑制劑（例如絲胺酸蛋白酶抑制劑諸如 10 VX950或福泰斯(Vertex))、聚合酶抑制劑、螺旋酶抑制劑、抗纖維化劑、核苷類似物、TLR激動劑、siRNA、反訊息寡核苷酸、抗-HCV抗體免疫調節劑、治療性疫苗及其用於治療比HCV相關聯之肝癌之抗腫瘤劑（例如亞立亞黴素 (adriamycin)或亞立亞黴素、里皮朵（lipiodol)及史龐吉 15 (sPongel)之混合物通常係藉化學栓塞於肝動脈投予）。特別適合之組合包括使用PEG化IFN- a (IFN- a 2a或IFN- a 2b) 及/或立巴維林(ribavirin)較佳於投予本發明之活性劑之前經歷24週至48週處理。用於治療與乳頭狀瘤病毒感染相關聯之病症，本發明之方法或用法可結合燒钱手術，諸如回 20 路電氣手術切除。根據本發明之方法或用法也可結合免疫刺激劑進行，諸如細胞激素(例如11^2、11^7、11^15、11^18、 IL-21、IFNg)或自殺基因產物（例如HSV-1之胸腺答激酶，述於Caruso等人，1993，Proc· Natl· Acad· Sci. USA 90, 7024-28 ; FCU-1述於W099/54481)或可表現此等多肽之載 50 200844231 5

>7； 71

10 15

20 接種追加接種治療模型進杆 ^ ' 了根據初次 4T包含循序投予初成物及追加接種成物。典型地：=劑組加接種組成物錢用不__，其包 /成物及追通用之抗雜钱部位。本發明之方法及心’至少一個咖投予初次接種組成物接著為丨次至叫^含= 組成物。較佳注射間隔為丨日至，月。較佳= 加接種或4次循序投予初次接種劑，個別、匕括3次週)之不等時間，接著於末次网开幻〇日（例如1 週，投予⑽編接㈣後1週至數 =加接種a成物可精㈣投或藉列投藥途同一個位置或交替位置。例如美予途徑投藥，而基於載體之*且成：：夕之、、且成物可藉黏膜戰版之組成物較佳係藉注射投筚， MVA載體餘皮下注射，DNA質體或腺病毒載體係藉肌肉注射投予。本發明之魏、«性齡餘成物可用於接受治療的個體初次接種或追加接種或初次接種與追加接種免疫反應二者。於-個實施财，初次接㈣使用本發明之貝體載體進打，*追加接觀使財發明之牛痘病毒傳染性顆粒進行。於另—個實關巾，初讀_使用本發明之腺病毒傳染性顆粒進行，*追加接種係使用本發明之牛痘病毒傳染性顆粒進行。於又另—個實施例巾，初次接種係使用本發日狀牛痘病毒傳染關粒猶而追加接種係使用本發明之腺病毒傳染性顆粒進行。 51 200844231 已經以舉例說明之方式說明本發明，但須瞭解所使用之術語意圖供說明目的而非限制性。顯然鑑於前文教示對本發明可做出多項修改及變化。因此須瞭解於隨附之申請專利範圍，本發明可以此處特別說明之不同方式實施。 5 前文引述之全部專利案、公開文獻及資料庫之登錄項目全文以引用方式併入此處彷彿該等個別專利案、公開文獻或登錄項目係特別且個別指示供併入此處以供參考。圖式簡單說明第1圖顯示(A)存在於(a)天然HPV-16 E1序列終點及(b) 10天然HPV-16 E2序列起點之59個核苔酸與⑻存在於⑷天然 HPV-16 E1序列終點或存在於天然訊^6 E2序列起點及⑻ SEQIDNO:9之59個核苷酸之序列校準。 ' 第2圖顯示（A)秘編碼序列與（抝 HPV-16 E6編碼序列與sEQ仍N〇:丨4間之序列校準。 15 I：實施方式】下列實例舉例說明本發明。實例下述組成係根據述於Maniatis等人（1989，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，紐約州冷泉港)之通用遺傳工程 2〇及分子選殖技術進行，或當使用商業套件組時係根據製造商之推薦進行。PCR擴增技術為熟諳技藝人士 6知(例如# 考PCR方案-方法及應用指南，199〇年，Innis、Gdfand、

Sninsky及White公開，學術出版社）。攜帶安比西林 (ampicillin)抗藥性基因之重組質體於大腸桿菌C6〇〇 (史特 52 200844231 5 拉基因公司（3加13861^))、3乃183(1^1^1^11，1983，九]^〇1· Biol. 166, 557-580)及NM522於瓊脂上或補充100微克/毫升抗生素之液體培養基中複製。重組牛痘病毒之組成係根據前文引述之文件中之業界習知技術以及於Mackett等人 (1982, Proc· Natl. Acad· Sci· USA 79, 7415-7419)及Mackett 等人（1984, J· Virol· 49, 857-864)進行。大腸桿菌（Falkner及 Moss，1988, J. Virol· 62, 1849-1854)之選擇基因 gpt(黃嘌呤· 鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶)用來協助重組牛痘病毒的選擇。 • 實例1:表現HPV-16E1基因及E2基因之MVA載體之組 10 成(MVATG17410) a)編碼HPV-16 E2基因之重組MVA載體之組成 (MVATG17408) HPV16 E2基因之選殖編碼HPV-16 E2之核苷酸序列係由分離自CaSKi細胞 : 15 • (ATCC CRL-1550)之基因體DNA選殖。E2基因係使用引子 OTG16809 (SEQ ID NO:16)及OTG16810 (SEQ ID NO:17)擴增。所得片段藉BamHI及EcoRI消化且***由相同酶所限剪的pGEX2T (阿默山生科公司（AmersllamBiosciences))，獲得 PTG17239。經選殖之E2基因之定序係使用比較HPV16 E2 20 原型序列（述於基因存庫NC-01526)之五項突變。兩項突變為靜默，而三項非靜默突變(T210I、S219P、K310T)係使用快速改變位置導向突變發生（QuickChange Site Directed Mutagenesis)套件組（史特拉基因公司）校正，獲得 pTG17268。 53 200844231 HPV-16 E2多肽之改性結合入pTGl7268之E2核苷酸序列係藉位置導向突變發生改性，來產生HPV-16 E2變異株(E39A及I73A)，標示為 E2*°特定言之，經由以Aia取代位置39之Glu殘基來消除E2 5 複製功能，以及經由以Ala取代於位置73之lie殘基來消除轉活化功能。所得質體pTG17318包含編碼HPV-16 E2*之改性序列。 HPV-16 E2*進一步改性方式係於其N端融合至一胜肽信號’而於其C端融合至衍生自狂犬病病毒(PG種系；基因 10 存庫ay009097)之糖蛋白之膜定錨序列，因而指導HPV-16 E2*呈現於表現宿主細胞之胞質膜表面。編碼膜呈現E2缺陷變異株之核苷酸序列（SEQ ID NO:12)標示為SS-E2*-TMR 使用下列引子OTG17500 (SEQ ID NO:18)、OTG17501 (SEQ ID NO:19)、OTG17502 (SEQ ID NO:20)、OTG17503 (SEQ 15 ID NO:21)、OTG17504 (SEQ ID NO:22)及OTG17505 (SEQ ID NO:23)藉三重PCR重新組裝。重新組裝後之序列*** PBS衍生載體（史特拉基因公司）來獲得pTG17360,然後選殖於PH5R啟動基因下游之牛痘轉移質體(R0sei等人，1986, J Virol· 60, 436-449)，獲得pTG17408。 20 轉移質體設計來允許欲藉此轉移之核苗酸序列***供於MVA基因體刪失III之同源重組。其係源自於質體PTG1E (述於Braun等人，2000，基因治療7, 1447-57)，於該質體中選殖環繞MVA刪失III之旁出序列(BRG3及BRD3)，該等序列係藉PCR而得自 MVATGN33.1 DNA (Sutter及Moss，1992, 54 200844231

Piroc· Natl· Acad· Sci· USA 89, 10847-51)。轉移質體也含有於早期晚期牛痘病毒合成啟動基因ρ11Κ7·5 (由羅珊大學R· Wittek善思供）之控制之下，於經過Ae(jU〇rea vict〇ria加強之綠螢光蛋白（eGFP基因，單離自pEGP-C1，複製科技公司 5 (clontech))與大腸桿菌黃噪呤-鳥嗓呤磷酸核糖基轉移酶基因（gpt基因）間之融合。黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶合 ·— 成允許來於含有黴酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇性培養基中形成溶菌斑(Falkner等人，1988, j. vir〇1· • 62, 1849_54);而沿卩？允許重組MVA溶菌斑變成目視可見。 10選擇標記eGPP-GPT於相同方向置於兩個同源序列間。當達成純株選擇時，選擇標記容易藉數次繼代培養去除，而未 '選擇允許eGPP-GPT重組MVA之生長。可表現HPV-16 S S-E2* -TMR基因之重組MVA之組成 MVATG17408病毒之生成方式係經由於感染 : 15 MVATGN33.1 (於ΜΟΙ=〇·1 pfu/細胞）之一次雞胚纖維母細 - 胞(CEF)中進行同源重組，以及以PTG17408轉移感染（根據 ® 標準麟酸鈣DNA沉澱)進行。病毒選擇係經由於含黴酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇性培養基存在下，藉三回合溶菌斑純化進行。如前述，隨後經由於非選擇性培養基中繼代 2〇培養去除選擇標記。藉PCR證實不存在有親代MVA的污染。

E2表現之分析係藉西方墨點進行。CEF係以 MVATG17408於ΜΟΙ=0·2感染，24小時後收穫細胞。使用市售單株抗Ε2抗體TVG271 (亞博康公司（Abeam))進行西方墨點分析。檢測有名目分子量55 kDA之蛋白質表現，E2*-TMR 55 200844231 之理論分子量為48·9 kDa。使用糖基内切酶F處理細胞萃取物後，觀察重組蛋白質尺寸的縮小，提示由MVATG17408 所表現之E2*TMR多肽為N-糖化。 b)編碼於與HPV-16 E2基因重疊部分簡併的HPV-16 5 E1基因之重組MVA之組成（MVATG17409) 編碼HPV-16 Ε1多肽之核苷酸序列係由CaSKi細胞 DNA(ATCC CRL-1550)選殖。特定言之，E1基因於二部分 Ela (nt 1 至 1102)及 Elb(nt 1001 至 1950)擴增。引子 OTG16811 (SEQ ID ΝΟ··24)及OTG16814 (SEQ ID ΝΟ··25)用 10 於擴增Ela片段，藉BamHI及EcoRI消化且***於藉相同酶所限剪的PGEX2T，獲得pTG17240。Elb片段係使用 OTG16813 (SEQ ID ΝΟ··26)及OTG16812 (SEQ ID NO:27)產生，且藉BamHI及EcoRI消化，隨後***pGEX2T，獲得 PTG1724卜定序顯示比較HPV-16 E1原型序列（述於基因存 15庫NC-01526)有四個突變。一個突變為靜默，三個非靜默突變存在於Ela (K130Q、N185T及T220S)係藉位置導向突變發生校正。然後經由於藉BsrGI及EcoRI消化之pTG1724l中選殖經過校正後之Ela片段，重新組裝完整E1基因。所得質體定名為PTG17289。 20 於基因體中，E1基因之59個最末核苷酸係與E1 基因之59個第一核苷酸相同，為了防止於耵及£2編碼MVA 載體之製造期間之不安定問題，此E1編碼序列部分係藉密碼子使用改性修改，來降低與E2編碼序列之序列同源性。經由使用簡併的引子OTG17408 (SEQ ID n〇:28)及 56 200844231 OTG17409 (SEQ ID NO:29)擴增El基因3,端，獲得簡併的序列（SEQ IDNO:9)。擴增後的片段藉”沿及抑瓜消化，以及 ***於藉相同酶所限剪之pTG17289内，獲得pTG17340。 HPV-16簡併的El序列也藉位置導向突變來突變，俾便 5 經由以AsP殘基取代ΗΡΛΜ6 E1之位置482之Gly殘基， (G482D ;此處也定名為E1*)來消除編碼之Ei多肽之複製功 ~ 能，結果獲得PTG17373。 HPV-16 Eldeg*序列也經改性，經由與衍生自狂犬病病 _ 毒(ERA單離株；說明於基因存庫n。M38452)之糖蛋白之膜 10定錨胜肽融合，來指導於漿細胞表面之編碼多肽之表現。 SS-Eldegί^TMR序列（SEQIDNO··10)係經由使用下列引子藉三重 PCR 重新調整：OTG17560 (SEQ ID ΝΟ··30)、 OTG17561 (SEQ ID ΝΟ:31)、OTG17562 (SEQ ID ΝΟ:32)、 OTG17563 (SEQ ID NO:33)、OTG17564 (SEQ ID NO:34)及 : 15 OTG17565 (SEQ IDNO:35)。所得片段***於經pBS衍生之 : 載體（史特拉基因公司）來獲得pTG17404。然後 _ SS-Eldeg*-TMR序列選殖入Ρ7·5Κ啟動基因下游之牛痘轉移質體（Cochran等人，1985，J. Virol· 54，30-7)，獲得 PTG17409。 2〇 MVATG17409病毒之產生係於CEF藉前述同源重組進行。 c)編碼HPV-16 E1基因及E2基因之重組MVA之組成 (MVATG17410) 由ρ7·5Κ啟動基因所控制且已經經過定序之 57 200844231 SS-Eldeg*-TMR係單離自 pTG17409且***於pTG17408，獲得 pTG17410。 MVATG17410病毒之產生係於CEF藉前述同源重組進行。 5 實例2:編碼HPV-18 E1基因及E2基因之MVA載體之組成(MVATG17582) HPV-18 E1基因及E2基因係使用合成基因重新組成，寡核苷酸經設計，因而⑴將天然HPV-16序列與HPV-18序列間所共享之同源性部分之同源性百分比降至低於750/〇 10 (HPV-16及HPV-18 E1基因及E2基因之序列經校準，募核答酸經設計，來將同源性降至少於5個連續核苔酸）；（ii)將存在於天然HPV-18 E1序列之3,端及HPV-18 E2序列之5,端二者之該59核苷酸部分間之同源性降至低於75% ;以及(ii)導入突變來消除HPV-18E1基因及E2基因產物之酶催化功能 15 (E1:G489D，E2:E43A及I77A)。 HPV-18 degEl*序列係經由組裝50募核誓酸，於pBS載體中選痩來獲得pTG17473而重新組成。然後E1序列係藉三重PCR，使用引子OTG15315 (SEQ ID NO:36)、OTG17881 (SEQ ID NO:37)、OTG17882 (SEQ ID NO:38)、OTG17883 20 (SEQ ID NO:39)、OTG17884 (SEQ NO:40)及OTG17885 (SEQ ID NO:41)融合至得自麻療病毒ρ蛋白質 (SS-18Eldeg*-TMF)之信號序列純株。所得片段（seq Π) NO: 11)於ρ7·5Κ啟動基因之控制之下選殖入MVA轉移載體來產生PTG17521。 58 200844231

HPV-18 degE2*序列係經由組裝26寡核苷酸，且選殖入 pBS載體，獲得pTG17498來重新組成。與狂犬病病毒(ERA 種系；基因存庫n°M38452)之糖蛋白之信號胜肽及膜定錨胜肽融合，係藉三重PCR，使用引子OTG17875 (SEQ ID 5 NO:42)、OTG17876 (SEQ ID NO:43)、OTG17877 (SEQ ID NO:44)、OTG17878 (SEQ ID NO:45)、OTG17879 (SEQ ID NO:46)及OTG17880 (SEQ ID NO:47)進行。SS-18E2*-TMR 卡匣係***於pH5R啟動基因下游之MVA轉移質體，獲得 PTG17552。最後，p7.5K-SS-Eldeg*-TMF 卡匣係由 10 pTG17521 單離且***於pTG17552，獲得pTG17582。重組 MVATG17521、MVATG17552、及 MVATG17582 之產生係如前文說明進行。實例3 :表現HPV-16及HPV-18 E1基因及E2基因之多價MVA載體之組成(MVATG17583)

15 p7.5K-SS-18Eldeg*-TMF卡匣及 pH5R-SS-18E2*-TMR 卡匣係***於pTG17410 (含有p7.5K-SS-16Eldeg*_TMR卡匣及pH5R-SS-16E2*-TMR卡匣），所得轉移質體定名為 PTG17583。MVATG17583之產生係如前文說明進行。實例4:表現HPV16及HPV18E6基因及E7基因之一多 20 價重組病毒之組成 MVATG16327 為表現HPV-16及HPV-18 E6 多肽及 E7 多肽之膜定錨變異株及非致癌變異株之一重組MVA病毒。E6 及E7核苷酸序列經突變，來去除其致癌性質(E6*及E7*)，融合至編碼適當信號胜肽及膜定錨胜肽(E6*tm、E7*tm)之 59 200844231 序列。更特定言之，HPV-18E7*與麻疹病毒F糖蛋白之信號胜肽及膜定錨胜肽分別融合於其N端及c端；而HPV-16 E6*、HPV-16 E7*及HPV-18 E6*係於衍生自狂犬病病毒糖蛋白之信號胜肽及膜定錯胜肽融合於其N端及C端。此外， 5 HPV-iS E6及E7核苷酸序列進一步藉密碼子使用改性修改，來降低與其HPV16對偶之同源性。用於此項目的，天然HPV16基因及HPV18基因之序列經校準，進行基因簡併來將同源性減至少於5個連續核苷酸。於該載體中，HPV-16 及HPV-18 E6序列彼此相反方向皆係處於p7.5K啟動基因之 10 控制之下；而HPV-16及HPV-18 Ε7序列係藉Η5R啟動基因驅動，全部表現卡匣皆係***MVA基因體之切除區III。 a) HPV-16E7*tm表現卡匣之組成 HPV-16 E7基因係分離自Caski細胞且經修改來編碼非致癌性及膜呈現之E7多肽（16E7*tmR)，如WO99/03885所 15 述。非致癌性突變係經由刪失胺基酸殘基21-26 (△ DLYCYE)進行；而膜呈現係經由E7*突變序列分別融合至編碼選殖自狂犬病病毒糖蛋白（ERA種系；基因存庫存取號碼M38452)之信號胜肽及膜定錨胜肽之編碼序列之5,端及 3’端進行。所得序列係於早期-晚期pH5R啟動基因之控制之 20 下選殖(Rosel等人，1986, J Virol· 60, 436-9)，卡匣導入經 pBS衍生之載體，獲得pTG16161。 b) HPV-16 E6*tm及HPV-18 E6*tm表現卡匣之選殖 HPV-16 E6基因經單離及改性，因而編碼非致癌性及膜呈現之E6多肽，如WO99/03885所述。非致癌性突變係經由 60 200844231 刪除胺基酸殘基118-122進行(ACPEEK);膜呈現係經由將經過E6*突變之序列分別融合至衍生自狂犬病病毒糖蛋白 (PG種系；基因存庫存取號碼ay009097)之信號胜肽及膜定錨胜肽之編碼序列之5’端及3’端進行。係經由將E6*-突變序 5 列***於含有信號胜肽與膜定錨胜肽由BamHI位置分開之 ’ 一載體内，獲得PTG16097。合成HPV-18 E6序列係經由組裝寡核苷酸〇tg15174 (SEQ ID NO:48)、OTG15175 (SEQ ID NO:49)、OTG15176 _ (SEQ ID NO:50) ' OTG15177 (SEQ ID NO:51)、OTG15178 10 (SEQ ID NO:52)、OTG15179 (SEQ ID NO:53)、OTG15180 (SEQIDNO:54)及OTG15181(SEQIDNO:55)產生。募核苷酸係設計成導入編碼胺基酸殘基113-117之密碼子刪失（非致癌突變ΔΗΡΑΕΚ)，以及簡併密碼子的使用來減少與 HPV-16 Ε6基因之同源性（簡併性序列)。所得合成序列然後 ' 15 分別與編碼衍生自狂犬病病毒糖蛋白基因之信號胜肽及膜 - 定錯胜肽序列，分別融合於其5’端及3’端，來獲得SEQ Π) • ^〇:14所示序列，獲得？丁〇16160。11?¥46£6*加11及11?¥-18 degE6*tmR序列係於相反方向***，各自係於ρ7·5Κ啟動基因之控制之下。然後卡匣導入pTG16161來產生pTG16215。 20 c) HPV-18 E7*tmF表現卡匣之選殖經由組裝寡核苷酸OTG14773 (SEQ ID NO:56)、 OTG14774 (SEQ ID NO:57)、OTG14775 (SEQ ID ΝΟ··58)、 OTG14776 (SEQ ID NO:59)、OTG14777 (SEQ ID NO:60)及 OTG14778 (SEQ ID NO:61)，產生一合成HPV-18 E7序列。 61 200844231

募核苔酸係設計成導入胺基酸殘基24_28 (非致癌突變△ DLLCH)之編碼密碼子的刪失，以及簡併密碼子的使用，來降低與HPV-16E7基因之同源性（簡併性序列）。然後所得合成序列與由麻疹病毒F蛋白基因所選殖之信號胜肽及膜定 5銷胜肽之編碼序列分別融合於其5,端及3,端（說明於EP 0305229)。所得序列（SEQ ID NO:15)於pH5R啟動基因之控制之下選殖，卡匣被導入經pBS衍生載體來產生pTG16015。 d)轉移質體PTG16327之組成轉移質體PTG6019 (述於WO99/03885之實例2)含有旁 10出於MVA删失III之同源序列。如下修改。經由將引子 OTG15040 (SEQ ID NO:62)與OTG15041 (SEQ ID NO:63)雜交所得之合成多鏈接劑導入由BamHI及SacI所消化之 pTG6019，獲得pTG16007。含有處於早期-晚期PH5R啟動基因控制之下之大腸桿菌gpt編碼之表現卡匣之sacl-Sacl片 15 段係由PTG14033單離(述於EP 1 146 125之實例2)，且導入藉SacI所消化之PTG16007，獲得pTG 16093。黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶之合成，允許GPT+重組MVA於含有黴酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇性培養基形成溶菌斑(Falkner 等人，1988, J· Virol· 62, 1849-54)。選擇標記GPT位於相同 20 方向之兩個同源性序列間。當達成純株選擇時，藉數次繼代培養容易消除選擇標記，無需選擇來允許GPT重組MVA 之生長。含有HPV-18 degE7*TMF表現卡匣之Hindlll-Smal片段係單離自PTG16015，導入藉相同酶消化之PTG16093，獲得 62 200844231 pTG16105。另一方面，pTG16215係藉Sail及EcoRI消化，以T4 DNa聚合酶處理，所得含有HPV-16 E7*tmR、HPV-16 E6*tmR、及HPV-18 degE6*TMR表現卡匣之片段係導入藉 Smal消化之pTG16105，結果獲得pTG16327 (第2圖）。 5 e) MVATG16327之生成 MVATG16327之生成係經由於一次雞胚纖維母細胞 (CEF)同源重組進行。用於此項目的，pTG16327根據標準磷酸鈣DNA沉澱而轉感染至先前以MVATGN33.1於 ΜΟΙ=0· 1 pfu/細胞感染之CEF上。病毒選擇係經由於含有黴 10 酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇培養基存在下，於CEF上經歷三回合溶菌斑純化進行。然後經由於非選擇性培養基中繼代培養去除選擇標記。藉PCR證實不存在有被親代 MVA污染。基因表現之分析係藉西方墨點進行。CEF係使用 15 MVATG16327於ΜΟΙ=〇·2感染，經24小時後，收穫細胞。使用抗HPV-16及HPV-18 Ε6蛋白質及Ε7蛋白質之兔多株抗體進行西方墨點分析。結果顯示全部HPV多肽皆係由 MVATG16327正確表現。 f) MVATG16327之遺傳安定性研究 20 於以ΜΟΙ=10·2 i>fu/細胞及1(T4 pfu/細胞感染之CEF上進行5次MVATG16327之繼代培養。於單離自研究備料之5 次繼代培養之100個病毒純株評估遺傳安定性。使用兩種方法· PCR擴增來判定表現卡匣之結構，藉西方墨點檢測抗原。PCR分析結果顯示99%純株含有感興趣之表現卡g。免 63 200844231 疫檢測顯示97%純株表現四種抗原：HPV-16及 HPV-18E6*tm 及 E7*tm多肽。此等分析顯示5次繼代培養後證實97%純株衍生自 MVATG16327，指示此種組成體有良妤遺傳安定性。 5 實例5 ··表現HPV-16、HPV-18、HPV-33及HPV-52 E2 基因之多價MVA載體之組成編碼HPV-33 E2多肽之合成基因係由基因藝術公司 (Geneart)(德國瑞金堡）合成。合成序列係設計成⑴與得自 HPV-16、HPV-18及HPV-52之E2基因之同源性百分比降至低 10 於75% (若屬可能，減少同源部分至少於6個連續核苷酸)；以及(ii)導入可消除HPV-33基因產物之酶功能之突變(E39A 及I73A)。然後HPV-33 degE2*序列與編碼狂犬病病毒（ERA種系；基因存庫n° M38452)之糖蛋白之信號胜肽及膜定錨胜 15 肽之核苷酸序列融合。此融合係藉三重PCR，使用引子 OTG18962 (SEQ ID NO:72)、OTG18963 (SEQ ro NO:73)、 OTG18964 (SEQ Π) NO:74)、OTG18965 (SEQ ID NO:75)、 OTG18966 (SEQ ID ΝΟ··76)及〇TG18967 (SEQ ID N〇:77)進行。所得編碼SS-33degE2*-TMR多肽之片段(SEQ ID NO:67) 20於Ρ7·5Κ啟動基因之控制之下選殖於MVA轉移載體，如前文舌兄明產生病毒顆粒。編碼HPV-52 E2多肽之合成基因係由基因藝術公司（德國瑞金堡)合成。合成序列係設計成⑴與得自Hpv-i6、HPV-18 及HPV-33之E2基因之同源性百分比降至低於75% (若屬可 25能，減少同源部分至少於6個連續核苷酸）；以及(ii)導入可 64 200844231 消除HPV-52基因產物之酶功能之突變(E39A及173A)。然後合成HPV-52 E2*deg序列使用引子OTG18968 (SEQ ID NO:78)、OTG18969 (SEQ ID NO:79)、OTG18970 (SEQ ID NO:80)、OTG18971 (SEQ ID NO:81)、OTG18972 5 (SEQ ID NO:82)及OTG18973 (SEQ ID NO:83)，藉三重 PCR，與編碼麻疹病毒F蛋白質之信號胜肽及膜定錨胜肽之核苷酸序列融合(獲得SS-52E2*deg-TMF)。所得編碼SS_52E2*deg-TMF多肽之片段（SEQ ID NO:69)於ρ7·5Κ啟動基因之控制之下選殖於MVA轉移載 10 體，如前文說明產生病毒顆粒。編碼膜呈現及酶催化缺陷HPV-18 E2多肽之 pH5R-SS-18E2*-TMR卡匣（單離自PTG17552)、編碼膜呈現及酶催化缺陷 HPV-33 E2 多肽之p7.5K-SS-33degE2*-TMR 卡匣及編碼膜呈現及酶催化缺陷HPV-52 E2多肽之 15 p7.5K-SS-52degE2*-TMF卡匣導入pTG17408 (含有 pH5R-SS-16E2*-TMR卡匣），如前文說明生成病毒顆粒。【圖式簡單說明】第1圖顯示(A)存在於⑻天然HPV-16 E1序列終點及(b) 天然HPV-16 E2序列起點之59個核苷酸與(B)存在於(a)天然 2〇 HPV-16 E1序列終點或存在於天然HPV-16 E2序列起點及(b) SEQ ID NO:9之59個核苷酸之序列校準。第2圖顯示（A) HPV-16與HPV-18 E6編碼序列與（B) HPV-16 E6編碼序列與SEQ IDNO:14間之序列校準。【主要元件符號說明】 (無） 65

Claims

200844231 十、申請專利範圍： 1. 一種載體，包含編碼一第一多肽之至少一個第一核酸分子及編碼一第二多肽之一個第二核酸分子，其中： -該第一核酸分子及該第二核酸分子分別係得自於 5 於40個或更多個連續核苷酸部分具有約80%或大於80% 之同源性百分比之一第一天然核酸序列及一第二天然核酸序列，以及 -包含於該載體中之該第一核酸分子及/或該第二核酸分子經修改，因而將該同源性百分比降至低於 10 75%。 2·如申請專利範圍第1項之載體，其中該第一核酸分子或該第二核酸分子或該第一及第二核酸分子二者之密碼子使用樣式至少於該40個或以上連續核苷酸之同源性部分經修改，因而將同源性百分比降至低於75%。 15 3·如申請專利範圍第2項之載體，其中該密碼子使用樣式係於核苔酸層面經修改，且該修改於胺基酸層面為靜 4·如申請專利範圍第2或3項之載體，其中該密碼子使用樣式之修改方式為該第一核酸分子與第二核酸分子間之 20 同源性部分係限於少於8個連續核苷酸。 5·如申請專利範圍第4項之載體，其中該密碼子使用樣式之修改方式為該第一核酸分子與第二核酸分子間之同源性部分係限於少於5個連續核苷酸。 6.如申請專利範圍第1至5項中任一項之載體，其中該載體 1 200844231 為一腺病毒載體。 7·如申請專利範圍第6項之載體，其中該腺病毒載體為複 4缺陷型。 8·如申請專利範圍第1至5項中任一項之載體，其中該載體為一痘病毒載體。 9·如申請專利範圍第8項之載體，其中該痘病毒載體係得自選自於由哥本哈根(Copenhagen)種系、惠氏（Wye⑻ 種系、NYVAC及高度減毒改性安卡拉(Ankara) (MVA) 種系所組成之組群之一牛痘病毒。 10·如申請專利範圍第項中任一項之載體，其中該第一核酸分子及該第二核酸分子分別編碼選自於由免疫原性多肽及抗腫瘤多肽所組成之組群之一多肽。 U•如申請專利範圍第1至10項中任一項之載體，其中該第核酸分子及該第二核酸分子係得自於相同有機體戋密切相關之有機體。 12.如申請專利範圍第n項之載體’其中該有機體為乳頭狀瘤病毒，以及該第一核酸分子及該第二核酸分子各自編石馬一乳頭狀瘤病毒多肽。 13·如申請專利範圍第12項之載體，其中該第一核酸分子及 2〇該第二核酸分子分別係得自選自於由Hpv]6、 HPV-18、HPV-30、HPV-3卜 HPV-33、HPV-35、HPV-39、 HPV-45、HPV-5卜 HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、 HPV-66、HPV_68、HPV-70及HPV_85所組成之組群之一高風險性乳頭狀瘤病毒。 ‘ 2 200844231 5 14.如申請專利範圍第12或13項之載體，其中該第一核酸分子及該第二核酸分子分別編碼選自於由El、E2、E6及 E7所組成之組群中之一早期乳頭狀瘤病毒多肽。 15·如申請專利範圍第12至14項中任一項之載體，其中該第一核酸分子及該第二核酸分子編碼得自相同HPV血清型之至少兩種不同乳頭狀瘤病毒多肽。 16.如申請專利範圍第15項之載體，其中該第一核酸分子編 • 碼E1多肽，及該第二核酸分子編碼E2多肽。 17·如申請專利範圍第16項之載體，其中該第一核酸分子編 10 萼碼包含於SEQ ID NO:5所示之胺基酸序列之一多肽，及該第二核酸分子編碼包含於SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列之一多肽。 18.如申請專利範圍第16項之載體，其中該第一核酸分子編碼包含於SEQ ID NO:6所示之胺基酸序列之一多肽，及 " 15 • 該第二核酸分子編碼包含於SEQ ID NO:8所示之胺基酸序列之一多肽。 19·如申請專利範圍第16至18項中任一項之載體，其中該載體包含於SEQIDNO:9所示核苷酸序列。 20·如申請專利範圍第17或19項之載體，其中該第一核酸分 20 子包含於SEQ ID NO:10所示之核苷酸序列以及其中該第二核酸分子包含於SEQ ID ΝΟ··12所示之核苷酸序列。 21.如申請專利範圍第18項之載體，其中該第一核酸分子包含於SEQ ID ΝΟ:11所示之核苷酸序列以及其中該第二核酸分子包含於SEQIDNO.13所示之核苷酸序列。 200844231 22.如申請專利範圍第2〇或21項之載體，其中該載體為％^ 載體，該第一核酸分子係處於牛痘7.5&啟動基因之控制之下，而該第二核酸分子係處於牛痘H5R啟動基因之控制之下，以及該第一及第二核酸分子皆係***該MVA載體之刪失III。 23·如申請專利範圍第16項之載體，其中該載體包含編碼 HPV-16 E1多肽之一第一核酸分子、編碼Hpv]6 E2多肽之一第二核酸分子、編碼HPV-18 El多肽之一第三核酸为子、及編碼HPV-l8 E2多肽之一第四核酸分子·，以及其中該第一、第二、第三及第四核酸分子並未包含具有同源性百分比為75%或大於75%之一 40或以上連續核苔酸部分。 24·如申請專利範圍第23項之載體，其中該抑％16 m多肽包含於SEQ ID NO:5所示胺基酸序列，該HPV-16 E2多肽包含於SEQ ID NO:7所示胺基酸序列，該Ηρν·ΐ8 E1多肽包含於SEQ ID NO:6所示胺基酸序列，及/或該hpv-18 E2多肽包含於SEQIDN0..8所示胺基酸序列。 25·如申请專利範圍第24項之載體，其中該载體包含包含於 S E Q ID N 0:10所示核苷酸序列之一第—核酸分子，包含於SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列之一第二核酸分子，包含於SEQ ID ΝΟ:11所示核苷酸序列之一第三核酸分子，及包含於SEQIDN0:13所示核苷酸序列之一第四核酸分子。 26♦如申請專利範圍第23至26項中任一項之载體，其中該載 200844231 體為一MVA载體，該第一、第二、第三及第四核酸分子係導入該MVA載體之刪失III，該第一核酸分子及該第三核酸分子係位於相反方向，各自係於牛痘ρ7.5Κ啟動基因之控制之下，以及該第二核酸分子及該第四核酸分子 5 係位於相反方向，各自係於牛痘pH5R啟動基因之控制之下。 27.如申請專利範圍第12至14項中任一項之载體，其中該第一核酸分子及該第二核酸分子編碼得自密切相關HPV 血清型之至少相同多肽。 10 28·如申請專利範圍第27項之載體，其中該等密切相關HPV 血清型為HPV-16、HPV-18、HPV-33及/或HPV-52。 29·如申請專利範圍第28項之載體，其中得自密切相關有機體之該相同多肽為E2多肽。 30.如申請專利範圍第29項之載體，其中該載體包含編碼 15 HPV-16 E2多肽之一第一核酸分子、編碼HPV-18 E2多肽之一第二核酸分子、編碼HPV—33 E2多肽之一第三核酸分子、及編碼HPV-52E2多肽之一第四核酸分子。 31·如申請專利範圍第30項之載體，其中該HPV-16 E2多肽包含於SEQ IDNO:7所示胺基酸序列，該HPV-18 E2多肽 20 包含於SEQ IDNO:8所示胺基酸序列，該HPV-33 E2多肽包含於SEQIDNO:70所示胺基酸序列，及該HPV-52E2 多肽包含於SEQIDNO:71所示胺基酸序列。 32·如申請專利範圍第30或31項之載體，其中該載體包含包含於SEQ ID NO:12所示核苷酸序列之一第一核酸分 200844231 子，包含於SEQIDNO:13所示核苷酸序列之一第二核酸分子，包含於SEQ ID NO:67所示核苷酸序列之一第三核酸分子，及包含於SEQ ID ΝΟ··69所示核苷酸序列之一第四核酸分子。 5 33·如申請專利範圍第27或28項之載體，其中得自密切相關有機體之該相同多肽為Ε6多肽、Ε7多肽或Ε6多肽及Ε7 多肽二者。 34.如申請專利範圍第33項之載體，其中該第一核酸分子編碼HPV-16 Ε6多肽，及該第二核酸分子編碼HPV-18 Ε6 1〇多肽’其中該第二核酸分子包含於SEQ ID NO: 14所示之该核酸序列。 35·如申請專利範圍第33項之載體，其中該第一核酸分子編碼HPV-16 E7多肽，及該第二核酸分子編碼hpv-18 E7 多月太’其中該第二核酸分子包含於证卩ID No: 15所示之 15 該核酸序列。 36·如申請專利範圍第34或35項之載體，其中該載體為mva 載體，該第一核酸分子係處於牛痘7·5Κ啟動基因之控制之下，而該第二核酸分子係處於牛痘H5R啟動基因之控制之下，以及該第一及第二核酸分子皆係***該mva載 20 體之刪失ΠΙ。 A如申請專利範圍第則之載體，其中該載體包含編碼 HPV-16 E6多肽之-第-核酸分子、編碼Hpv_18 E6多肽之一第二核酸分子、編碼HPV_16 E7多肽之一第三核酸分子、及編碼HPV_18 E7多肽之一第四核酸分子；以及 6 200844231 其中該第一、第二、第三及第四核酸分子並未包含具有同源性百分比為75%或大於75%之一40或以上連續核苷酸部分。 38. —種實質上經單離之核酸分子，包含於SEQ ID NO:6、 5 10、η、12、13、14、15、66、67、68或69 中之任一者所示之該核苔酸序列。

39. —種宿主細胞，包含如申請專利範圍第38項之核酸分子或如申請專利範圍第1至37項中任一項之載體。 40. —種藥學組成物，包含治療有效量之如申請專利範圍第 10 38項之核酸分子、如申請專利範圍第1至37項中任一項之載體或如申請專利範圍第39項之宿主細胞及藥學上可接受之載媒劑。 41·如申請專利範圍第40項之藥學組成物，其中該組成物包含適合於人體系統性投藥或黏膜投藥之一種或多種輔 15 劑。

42. 如申請專利範圍第41項之藥學組成物，其中該辅劑為咪 ϋ坐并σ奎琳化合物。 43. —種如申請專利範圍第38項之核酸分子、如申請專利範圍第1至37項中任一項之載體、如申請專利範圍第39項 20 之宿主細胞或如申請專利範圍第40至42項中任一項之組成物用於製備意圖供治療或預防傳染病、癌症或免疫缺乏病症之藥物之用途。 44·如申請專利範圍第43項之用途，其係用於與受乳頭狀瘤病毒感染相關聯之病情諸如持續性感染、惡性前期病灶 200844231 及惡性病灶之預防性處理或治療性處理。 45.如申請專利範圍第43或44項之用途，其中該用途係根據初次接種追加接種治療模型進行；以及其中該載體或組成物係用於一個體初次接種免疫反應或追加接種免疫 5 反應或初次接種與追加接種免疫反應。