TW200844231A - Vectors for multiple gene expression - Google Patents
Vectors for multiple gene expression Download PDFInfo
- Publication number
- TW200844231A TW200844231A TW097103228A TW97103228A TW200844231A TW 200844231 A TW200844231 A TW 200844231A TW 097103228 A TW097103228 A TW 097103228A TW 97103228 A TW97103228 A TW 97103228A TW 200844231 A TW200844231 A TW 200844231A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid molecule
- hpv
- vector
- polypeptide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
200844231 九、發明說明: 【号务日月戶斤胃j 本發明係關於經過基因改造可供獨立表現感興趣之多 重核苔酸序列之-種重組載體,該等核普酸序列係得自於 5同-有機體或得自密切相關之有機體。本發明係關於重組 核酸技術領域,用來於多種原核細胞試管内系統、以及真 核細胞試管内系統、以及於動物體或人體内,表現彼此具 有同源性之多重核苔酸序列供治療或預防目的。本發明特 別可用於免疫治療領域,特別係用於治療或預防由感染性 10有機體諸如乳頭狀瘤病毒及肝炎病毒所引起之病理情況。 Γ先前技術3 重組DNA技術已經可於培養的宿主細胞或於活有機體 内表現核普酸序列。已經產生數種質體£):^八及病毒載體且 用於多項目的,包括疫苗接種、基因治療、免疫治療及於 15培養的細胞表現。載體諸如腺病毒载體及痘病毒載體具有 大型選殖能力,可於寬廣多種宿主細胞表現多重核苷酸序 列之潛力之優勢。多重核苔酸序列之表現之優異之處在於 改良由編碼多肽所提供之治療功效(例如體液免疫與細胞 免疫的組合)。並非替代製造分開經過基因改造來各自表現 20期望之核苷酸序列之多種重組載體,反而較佳係製造單一 重組載體,至少來協助製造步驟及獲得法規核准。 舉例言之,有關乳頭狀瘤病毒感染,感興趣地係期望 有數種乳頭狀瘤病毒基因型表現免疫原性多肽,俾便特別 於有多重感染風險例如HPV-16及HPV-18之個體,加寬或增 200844231 強宿主的免疫反應。但編碼此種免疫原性多肽之核苷酸序 列於相關HPV基因型皆有高度同源性。舉例言之,hpv_16 E6與HPV-18 E6序列於核苷酸層面顯示總體同源性63%,雖 言如此,包含具有超過75%之極高同源性區域,該區可能 5妨礙由單一載體表現HPV-16及HPV-18基因。 此外,當表現病毒來源之多肽時,同源性核苷酸序列 也可能來自於病毒基因體之整體組織結構。相當常見病毒 使用相同核苷酸序列,來經由生物機轉諸如内部轉譯起始 或讀取框位移,亦即相同DNA序列,轉譯於多於一個讀取 10框,來編碼兩種不同的蛋白質。例如,於ιπ>ν-16基因體中, 相鄰的Ε1基因及Ε 2基因於不同讀取框轉譯之5 9個核苷酸重 疊。換言之,Ε1基因之最末59個核苷酸重疊Ε2基因之最初 59個核苷酸。 但於載體中存在有同源性序列,預期特別於載體製造 15步驟期間對其安定性造成負面影響,結果由於同源性序列 間發生的重組事件而導致喪失基因序列。如此,於一單一 載體表現HPV-16 Ε1基因及Ε2基因,涉及存在有59核苷酸之 一共同部分,其可能導致均質重組事件,最終導致Ε1&Ε2 同源性序列間包含的序列喪失。此種非期望之同源重組事 20件也可能發生於同一個載體表現HPV-16及HPV-18基因序 列時。此種不安定性問題可能導致載體備料的無用,特別 用於人體臨床試驗時無用。 於此面相中,W092/16636提示於該重組載體中***相 對於彼此方向相反之同源性核苷酸序列’來降低發生重組 200844231 事件的可能。但此項策略係就牛痘病毒載體作說明,而未 冒對其它重組载體諸如腺病毒載體作說明。此外由於可能 發生啟動基因干擾及構成限制,故於相反方向配置料經 常性可能。· …」5 肋界需要製造於宿主細胞或個體可表現得自同-個 ^體或密切相關有機體(其天然含有高度同源性部分)之 核普酸序列之重組載體。本發明提供經由使用遺傳密碼簡 • 舰來變更同源性核㈣序列之任-者或二者,讓核《 序列變成比修改之前之同源性更低,但不會變更或顯著改 W變編碼胺基酸序列之-種設計,來降低重組事件發生機率 之新穎策略,來解決此項需求。本發明允許克服特別於載 ’ 體製造步_間可能於儀性序列間發生同雜重組,結 U 果導致其間所含之核^酸序列的損失之缺點。發現本發明 : 載體出乎意外地可有效表現E1及E2乳頭狀瘤病毒基因,兩 15種基因於天然共旱59核苷酸之1〇〇〇/0同源性部分,而於載體 φ 製造步驟期間出乎意外地安定。也發現本發明載體可出乎 意外地有效表現得自密切相關之HPV_16及HPV_18基因型 之E6及E7基因。 經由提供如申請專利範圍所定義之實施例可解決此項 20 技術問題。 其它及額外本發明之面相、特徵及優點由後文本發明之 較佳實施例之說明將更為彰顯。此等實施例僅供揭示目的。 【發明内容3 如此,於一第一面相中,本發明提供一種載體,包含 200844231 編碼一第一多肽之至少一個第一核酸分子及編碼一第二多 肽之一個第二核酸分子,其中·· -該第一核酸分子及該第二核酸分子分別係得自於於 40個或更多個連續核苷酸部分具有約80%或大於80%之同 5 源性百分比之一第一天然核酸序列及一第二天然核酸序 列,以及 -包含於該載體中之該第一核酸分子及/或該第二核酸 分子經修改,因而將該同源性百分比降至低於75%。 如此處於全案中使用,除非内文另行指示,否則「一」 10 及「一個」等詞係用來表示「至少一個」、「至少一第一」、 「一個或多個」或「多個」所述化合物或步驟。例如,「一 個細胞」一詞包括多個細胞且包括其混合物。 用於此處任何位置「及/或」一詞包括「及」、「或」以 及「全部或任何其它以該詞所連接之各元件之組合」之定 15 義。例如,「第一核酸分子及/或第二核酸分子」表示該第 一核酸分子,或該第二核酸分子或第一核酸分子與第二核 酸分子二者。 如此處使用,「約」或「約略」等詞表示於一給定數值 或範圍之5%以内,較佳4%以内及更佳2%以内。 20 如此處使用,當用來定義產物、組成物及方法時,「包 含」一詞意圖表示包括所述組分或步驟之產物、組成物及 方法,但未排除其它組分及步驟。「主要由…所組成」表示 排除具有任何必要重要性之其它組分及步驟。如此,主要 係由所引述之組分所組成之一種組成物,並未排除微量污 200844231 染物及藥學上可接受之_。「組絲」表示排除其它組分 及步驟之微量元素。例如,當該多肽除了所引述之胺基酸 序列之外未合任何胺基酸時,一種多肽係由胺基酸序列「所 組成」。當此種胺基酸序列係只連同少數額外胺基酸殘基 5 (典型由約1至約5〇左右之額外殘基)存在時,一種多肽「主 要係由-胺基酸序列所組成」。當胺基酸序列為一種多肽之 、、胺基1序列之至少—部分時,該多肽「包含」—胺基酸 序列。此種多月太可有數個額外胺基酸殘基至高達數百個額 外fe基酸殘基。此種額外胺基酸殘基於多肽之異動上可扮 W濟某種角色,協助多肽的製造或純化;延長半生期等。同 等也適用於核苷酸序列。 如此處使用,「載體」可為任何於宿主細胞或個體可傳 4及表現至少该第一核酸分子及第二核酸分子之任一種媒 ’丨。錢體可為染色體外(例如游離基因)或整合式(結合於 15伤主染色體内)、可自發複製或否、多套複本或低套複本、 ,股或單股、裸露或與其它分子複合(例如載體複合脂質或 來口物來形成粒狀結構,諸如脂質體、脂質複體或奈米顆 粒、載體包裝於病毒殼體内部及載體㈣於固相顆粒上 專)載體」凋之定義也涵蓋已經經過修改來允許偏好 革疋於彳寸疋佰主細胞之載體。被靶定之載體之特徵特點 ,於其表©上存在有可賴且結合至細縣露組分及表面 恭路組力之-g&體’諸如細胞特異性標記(例如册乂感染細 月已)組織知·兴性標記或腫瘤特異性標記。配體可藉遺傳手 段***存在於载體表面上之多肽(例如腺病毒纖維、潘頓 200844231 (penton)、pIX述於WO94/10323及WO02/96939,或牛癌pl4 基因產物,述於EP 1 146 125)。 於本發明之内文中,「核酸」、「核酸分子」、「多核誓酸」 及「核苷酸序列」等詞可互換使用,定義任何長度之多去 5 氧核糖核苷酸(DNA)或多核糖核苷酸(RNA)分子或其任何 組合之聚合物。該項定義涵蓋單股或多股線性或圓形天然 多核苷酸或合成多核苷酸。此外,此種多核苷酸包含非天 然核苷酸(例如曱基化核苷酸及核苷酸類似物,諸如us 5,525,711、US 4,711 955或EPA 302 175戶斤述)及其化學修改 10 (例如參考WO 92/03568 ; US 5,118,672),俾便提高核酸之 活體内安定性,促進其傳送,或降低由宿主個體之清除率。 若存在有修改時,可於聚合前或聚合後賦予修改。 15 20 「多肽」、「胜肽」及「蛋白f」等詞於此處互換用來 表示包含透過胜肽鍵鍵結之9個歧多個胺基酸之胺基酸 殘基之聚合物。該聚合物可為祕、分支或環狀。於本發 明之内文中,「多肽」包括屬机立體異構物(天然形式)或^ 立體異構物之胺紐’且包括糊天然f驗基酸以外之 胺基酸’諸如[/5]·丙麟、鳥賊、錢賊亞礙或於一 個或多個^胺基、^•羧基或支鏈上例如藉附接甲基、甲酸 基、乙醯基、糖基、_基等而修改之胺基酸。至於一般 指示,若胺基酸聚合物之長度長(例如多於50個胺基_ 基),則較佳稱作為多肽轉”。結果,「職」係指長 約9至約5〇個胺基酸之一片段。於本發明之内文中,胜肽較 佳包含天然出現(或稱作為天㈣蛋白k—選定區,如含 10 200844231 有游離基因之一免疫原性片段。
10 15
如此處定義’「多肽」—詞涵蓋天然多肽及改性多肽 如此處使用,「天然」-詞細由天絲源所时之特料, 而與實驗室中經人μ性或改變之材料有別。例如,天炒 多肽係由存在於野生财機體或細胞之基因财之基因= 碼。相反地,雜纽麵於實驗室巾經祕改之核酸1 子編碼,因此改性多肽例如藉插人、刪失或取代-個^ 個胺基酸或其任-種組合而舆天然多肽不同。當涵蓋數= 修改時’可有關接續之殘基及域_續殘基。本發明n 之修改實例可料致天然纽職有之生物紐變更= 一給定生物活性有關鍵重要性之胺基酸可藉例行方法識 別,諸如由結構分析及功能分析識別,熟諳技藝人士方便 决疋可減少或消除此種生物活性之突變類型。此等修改可 藉例行技術諸如位置導向突變發生來進行。另外,可於自 動化方法中藉化學合成來產生編碼改性多肽之一合成核酸 分子(例如如隨附之實例章節所述,由重疊合成寡核苷酸組 裝來產生)。 「獲得」一詞用於此處係指由天然來源發現、單離、 純化或衍生之材料。「單離」表禾由天然環境分離。「純化」 20表示貫質上不含至少一種其它天然與其結合之組分。「衍 生」表示比較天然材料之一項或多項修改(特別為突變,諸 如取代、刪失及/或***)。單離、純化及改性技術為技藝界 例行使用且依據欲獲得之材科決定(例如可經由使用限剪 _、藉PCR或藉化學合成而由天然來源進行核酸分子的選 11 200844231 殖)。 如此處使用’「同源性」一詞通常係以百分比表示,代 表跨至少40個連續核苷酸(例如約40、45、50、55、57、58、 59、60、70或甚至更多個連續核苷酸)部分彼此保有給定之 5 相同度之核苷酸序列。「至少80%」表示約80%或大於8〇% (例如超過80%,較佳至少85%,期望至少87%,較佳至少 90%,更佳至少95%,又更佳至少97%至高達100%序列同源 性之任何數值)。「低於75%」表示低於75例如約74、72、70、 68、65、62、60%或甚至更少之任何數值。兩個核苔酸序 10 列間之同源性百分比為由該等序列所共享之相同位置數 目,考慮必須被導入來獲得各間隙的最佳校準及各間隙長 度之間隙數目。技藝界有多種電腦程式及數學演繹法則來 測定核苷酸序列間之相同度百分比,諸如GCG威斯康辛套 裝軟體及基礎局部校準研究工具(BLAST)程式,於國家生 15 技資訊中心(NCBI)可取得且說明於已經付梓之公開文獻 (例如 Altschul等人,1990, J· Mol· Biol. 215, 403-410)。 作為起點,於改性前第一核酸分子與第二核酸分子間 之序列校準可用來顯示共享80%或大於80%之同源性百分 比之一個或多個40個或以上連續核苷酸部分,亦即「同源」 20部分。於特定實施例中,第一核酸分子或第二核酸分子或 第一及第二核酸分子二者之密碼子使用樣式至少於該4〇個 或更多個(例如約40、45、50、55、57、58、59、60、70或 甚至更多個)連續核f酸之該(等)同源部分經修改(例如藉 逾、碼子使用樣式之簡併來修改),因而將同源性百分比降至 12 200844231 低於75% (例如約74、72、70、68、65、62、60%或甚至更 低)〇 而蛋胺酸殘基及色胺酸殘基各自係由獨特的核酸三聯 體(亦即密碼子)所編碼,不同密碼子用來編碼18種其它胺基 5酸(遺傳密碼之簡併)。舉例言之,由密碼子所編碼之胺基酸 如下:丙胺酸(Ala或A)係由密碼子GCA、GCC、GCG及GCU 編碼;半胱胺酸(C或Cys)係由密碼子UGC及UGU所編碼; 天冬酸(D或Asp)係由密碼子GAC及GAU所編碼;麩胺酸(E 或Glu)係由密碼子GAA及GAG所編碼;苯基丙胺酸(F或Phe) 10係由密碼子UUC及UUU所編碼;甘胺酸(G或Gly)係由密碼 子GGA、GGC、GGG及GGU所編碼;組胺酸(H或His)係由 密碼子CAC及CAU所編碼;異白胺酸(I或lie)係由密碼子 AUA、AUC及AUU所編碼;離胺酸(K或Lys)係由密碼子AAA 及AAG所編碼;白胺酸(L或Leu)係由密碼子UUA、UUG、 15 CUA、CUC、CUG及CUU所編碼;蛋胺酸(Μ或Met)係由密 碼子AUG所編碼;天冬醯胺(N或Asn)係由密碼子AAC及 AAU所編碼;脯胺酸(p或pro)係由密碼子CCA、CCC、CCG 及CCU所編碼;麩胺(Q或Gin)係由密碼子CAA及CAG所編 碼;精胺酸(R或Arg)係由密碼子AGA、AGG、CGA、CGC、 20 CGG及CGU所編碼;絲胺酸(S或Ser)係由密碼子AGC、 AGU、UCA、UCC、UCG及UCU所編碼;蘇胺酸(T或Thi〇 係由密碼子ACA、ACC、ACG及ACU所編碼;纈胺酸(V或 Val)係由密碼子GUA、GUC、GUG及GUU所編碼;色胺酸 (W或Tip)係由密碼子UGG所編碼及酪胺酸(Y或Tyr)係由密 13 200844231 碼子UAC及UAU所 存在於第一核酸分子及第二核酸分子中之該一個或多 個同源部分之同源性百分比降低可經由利用遺傳密碼的簡 併性,且修改於該第一核酸分子及/或第二核酸分子之密碼 5 10 15 20 子使用樣式來達成。密碼子使用樣式之修改典型係經由以 其它密碼子來置換一個或多個「天然」密碼子進行。例如 以Arg編碼之CGC密碼子置換Arg編碼之AGA密碼子將降低 密碼子三個位置中之兩個的同源性。並非必要簡併全部天 然密碼子,原因在於以部分置換即可充分降低同源性。此 外,#碼子使用樣式的修改可於整個核酸分子進行,或可 侷限於修改前所存在之同源性部分。期望於本發明之内文 中,於第一核酸分子進行簡併,且係限於同源部分。較佳, 密碼子使職式係於核㈣層面修改,郷改於胺基酸層 面為靜默,換言之,若可能時,各個「天然」密碼子係以 編碼相同胺基酸之-密碼子所置換,觀種修改不會於所 、’爲馬之夕肽轉澤。更佳’當可能時,密碼子使用樣式為第 -核酸分子與第二減分子間之同源部分限於少於9個或8 :接續核菩酸,較佳少於7個接續核_,較佳少於6個接 =苗酸,及更佳少於5個接續核《。密碼子使用樣式之 =藉熟諳技藝人士已知之多種方式之一產生,諸如位 突變發生(例如使用阿默山公司(A—)法國 炎之史考普特(SCUlptor)試管
突變發生、職穿梭、或化學合編生祕)、PCR 核酸分子)。 成技術(例如結果導致合成 14 200844231 當根據本發明之載體包含多於兩個核 以目文刀子時,則载 體内所包含的且得自天然核酸序列(其具有與由^ ~ 另一種核酸分子之至少另一個天然核酸库 ^ ^ 、 Μ,於40個或以 上連續核菩酸部分有約80%或大於之 7 J碾性百分比)之 任何核酸分子可經修改,俾將同源性八 刀比降至低於 75%’亦即包含於載體中並無任何成對核酸分子將組成4〇 個或以上接續核苷酸部分,其具有大於 、' )/〇之相同度百分 ρΚ 〇
Φ其中獲得該減分子之各個(成對)天然_序列間 1〇之序列校準可用來顯示一部分或多部分具有80%或大於 80%之同雜百分比。然後該天然序舰修改,特別為簡 併密碼子之使用經修改,因而將至少於該同源部分之^ 性百分比降至低於75%。結果,組成該載體之核酸分子皆 未包含40個或以上(例如45、50、55、57、58、59、6〇、7〇 15或甚至更多個)接續核酸部分具有與任何其它該载體所包 含之核酸分子大於75%之相同度百分比。 如前文說明’由該載體所包含之核酸分子所編碼之多 肽可能有或可能未有與天然多肽相同之胺基酸序列。特 別,除了用來簡併密碼子之使用之突變,因而至少於組成 20該載體之核酸分子之同源部分降低同源性之外,該載體所 包含之核酸分子也包含額外突變結果導致該編碼多肽之胺 基酸序列的修改或否。 本發明載體涵蓋病毒載體及非病毒載體(例如質體 DNA載體)。適當非病毒載體包括質體諸wpREP4、pCEp4 15 200844231 (因維左金公司(Invitrogene))、pCI (普米嘉(Promega))、 pCDM8 (Seed,1987,自然 329, 840)、pVAX及pgWiz (基因治 療系統公司(Gene Therapy System Inc)) ; Himoudi等人, 2002,J.VitOl· 76, 12735-12746)。「病毒載體」於此處係根據 5技藝界認可之定義使用。病毒載體係指包含病毒來源的至 少一個元體之載體,包括完整病毒基因體、其部分、或改 性病毒基因體,容後詳述,其包括其所產生之病毒顆粒(例 如病毒載體封裝入病毒殼體内來製造傳染性病毒顆粒)。本 舍明之病毋載體可為複製勝任,或可經過遺傳去能而變成 10複製缺陷或複製受損。「複製勝任」一詞用於此處係涵蓋複 製選擇性病毒載體及條件複製病毒载體,其經過基因改造 來於特定宿主細胞(例如腫瘤細胞)内更佳或更具選擇性地 複製。病毒載體可得自多種不同病毒,特別係得自選自於 2反錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、痙病毒、危療病 15 f、麻療病毒及泡沫病毒所組成之組群之—病毒。
△於-個實施例中,本發明載體為腺病毒載體(其綜論可 麥考「供基因治療之腺病毒載體」,2〇〇2年,編輯D 31)、亞群B (例如血清型3 亞群C (例如血清型1、2、 10、13、15、17、19、)n、 及J.D〇UglaS,學術出版社)。該腺病毒载體可衍生自任何人 腺病毒或動物腺病毒。任何血清型及亞群皆可用於本發明 20之内文。更特別值得一提者為亞群a⑽如血清型& μ及 、7、11、14、16、 、幻、34 及35)、
特佳為人腺病毒 、19、20、 亞君羊E (血/月型4)及亞君纤(血清型及叫。 16 200844231 2 (Ad2)、5 (Ad5)、6 (Ad6)、11 (Adll)、24 (Ad24)及35 (Ad35)。此等腺病毒可得自美國種型培養收集會(ATCC,馬 里蘭洛克維),且變成多種公開文獻之主題,該等公開文獻 說明其序列、組織及製法來允許業界人士可應用該等技術 5 (例如參考us 6,133,028 ; US 6,110,735 ; WO 02/40665 ; WO 00/50573 ; EP 1016711 ; Vogels等人,2003,J· Virol· 77, 8263-8271) 〇 本毛明之腺病毋載體可為複製勝任。複製勝任腺病毒 載體之多個實例為熟諳技藝人士方便易得(例如參考 10 Hernandez-Alcoceba 等人,2000,人類基因治療 2009-2024 ; Nemunaitis等人,2001,基因治療8, 746_759 ; Alemany等人,2000,天然生物技術18,723-727 ; WO00/24408 ; US5,998,205,WO99/25860,US5,698,443, WOOO/46355,WO00/15820及W001/36650)。 15 另外,本發明之腺病毒可為複製缺陷(例如參考 W094/28152)。較佳複製缺陷之腺病毒為E1-缺陷(例如US 6,136,594及US 6,013,638),E1刪失係由約略位置459延伸至 3328,或由約略位置459延伸至3510 (參考人腺病毒5型序 列,揭示於基因存庫(GeneBank)存取號碼Μ 73260及 20 Chroboczek等人,1992, Virol· 186,280-285)。經由刪失腺 病毒基因體之額外部分(例如於非必需E 3區或於其它必需 E2區、E4區,如 Lusky等人,1998, J· Virol 72, 2022-2032所 述)可進一步改良選殖能力及安全性。 第一核酸分子及第二核酸分子可獨立***本發明之腺 17 200844231 病毒載體之任何位置,如Chartier等人(1996, J. Vir()1. % 4805-4810)所述’該等位置個別係位於相對於***區之天然 轉錄方向之訊息方向及/或反訊息方向。例如二者可皆插人 來置換E1區,或另外一者可***來置換E1區而另一者可插 5 入來置換E3區。 於另一個實施例中,本發明之載體為痘病毒載體(例如 蒼考Cox專人’「人基因治療之病毒」’編輯J· M. Hos,加州 學術出版社)。可得自痘病毒科之任何成員特別為雀痘病毒 (例如ALVAC述於WO95/27780)、禽痘病毒(例如trovac述 10 於Paoletti等人,1995, Dev· Biol· Stand· 84, 159-163)或牛症 病毒,以後者為佳。適當牛痘病毒可選自於由哥本哈根種 系(Goebel 等人,1990,Virol· 179,247-266 及 517-563 ; Johnson等人,1993, Virol. 196, 381-401)、惠氏(Wyeth)種 系、NYVAC (參考W092m672及Tartaglia等人,1992,病 15毒學188, 217_232)及高度減毒改性安卡拉(MVA)種系(Mayr 等人,1975,感染3, 6-16)所組成之組群。此等載體及製法 係說明於熟諳技藝人士可得之多個文件(例如Paul等人, 2002 ’癌症基因治療9 ’ 470-477 ; Piccini等人,1987,酶學 方法 153,545-563 ; US 4,769,330 ; US 4,772,848 ; US 20 4,6035112 ; US 5,100,587及US 5,179,993)。本發明所使用之 第一核酸分子及第二核酸分子較佳係***痘病毒基因體之 非必需位置,讓重組痘病毒維持可存活及有傳染力。非必 需區為非編碼基因間區,或去活化或删失不會顯著損害病 毋之生長、複製或感染之任何基因。包含***於必需病毒 18 200844231 位置,限制條件為於病毒顆粒製造期間缺陷功能係以反式 供給,例如使用助手細胞系攜帶與該痘病毒基因體中被刪 失之序列相對應之互補序列來供給。 當使用哥本哈根牛痘病毒時,至少第一核酸分子及第 5 二核酸分子較佳***胸腺苷激酶基因(tk) (Hruby等人,1983,
Proc· Natl· Acad. Sci USA 80, 3411-3415 ; Weir等人,1983, J·
Virol· 46,530-537) 〇但其它***位置也適當,例如***血 球凝集素基因(Guo等人,1989, J. Virol· 63, 4189-4198)、插 入K1L位置、***u基因(Zhou等人,1990, J· Gen. Virol. 71, 10 2185-2190)及***參考文獻中曾經報告發生多種自發刪失 或經基因改造刪失之牛痘病毒基因體左端(Altenburger等 人,1989, Archives Virol· 105,15-27 ; Moss等人,1981,J· Virol· 40,387-395 ; Panicali 等人,1981,J. Virol· 37, 1000-1010 ; Perkus等人,1989, J· Virol· 63, 3829-3836 ; 15 Perkus等人,1990, Virol· 179, 276-286 ; Perkus等人,1991, Virol· 180, 406-410)。 當使用MVA時,該至少第一核酸分子及第二核酸分子 係分別***出現於MVA基因體(Antoine等人,1998,病毒學 244,365-396)及出現於D4R位置之經識別的刪失I至VII中之 20 任一者,但以***於刪失II及/或III為佳(Meyer等人,1991, J· Gen· Virol· 72,1031-1038 ; Sutter等人,1994,疫苗 12, 1032-1040) 〇 當使用禽痘病毒時,雖然可考慮***胸腺苷激酶基因 内部,但該至少第一核酸分子及第二核酸分子較佳係導入 19 200844231 於ORF7與ORF9間之基因間區(
5_75)。 314 569AUS 5 10 15 20 …於本發明之另-個實施例中,該至少第一核酸分子及 弟^酸分子分開編碼於呈現病理情況或對於呈現病理情 感之個體中可提供治療活性或保護活性之-多肽。如 ,處^用’「個體」-詞係指脊椎動物特別為哺乳動物成 貝,餐別為豕畜、農場動物、運動動物、及靈長類包括人 類。此種多肽較佳係選自於由免疫原性多耿及抗腫瘤多狀 所組成之組群。 「免疫原性」多肽係指於表⑽多耿之個體中可誘 導、帅、發展或增強免疫系統之多肽。此種免疫反應可 為體液或細胞或體液與細胞二者。體液反應提引出對抗該 多肽之抗體製造;而細胞反應提5丨出τ_助手細胞及/或ctl 反應及/或刺激細胞激素之製造。典型地,多肽之免疫原性 了於试f内或活體内藉多項技藝界標準之檢定分析評估 (有關評估免疫反應起點與活化之技術之一般說明,例如參 考Coligan等人,免疫學之目前方案;編輯約翰威利父子公 司’國家衛生院之最新版本)。例如檢測可為比色技術、螢 光技術 '或放射性及適當技術,包括ELISa、西方墨點、 放射性免疫檢定分析及免疫沉;殿檢定分析。細胞免疫之測 量係藉測量由活化效應物細胞包括衍生自CD4+及CD8+ T-細胞之細胞輪廓資料進行(例如藉ELIspot定量可產生iFNg 之細胞),經由測定免疫效應物細胞之活化狀態進行(例如藉 傳統[3H]胸腺苷攝取之τ細胞增生免疫分析),經由檢定分析 20 200844231 敏化個體之抗原特異性τ琳巴細胞進行(例如於胞毒性檢定 分析之胜肽特異性溶解)。多肽之免疫原性也可 基於四聚體之分析技術或其它τ細胞媒介免疫力分析之標 準技術而於適當動物研究模型中評估。適當免疫原性多肽 可付自Β型肝炎病毒(HBV)(例如S、preS2或preSl-多肽,如 EP 414 374 ; EP 304 578或EP 198 474所述);C型肝炎病毒 (HCV)(例如核心(〇、被膜糖蛋白E1、E2、非結構性多狀
10 15
20 NS2、NS3、NS4或NS5或其任一種組合);人免疫缺乏病毒 (HIV)(例如§1)120或§1>160)及乳頭狀瘤病毒(容後詳述)。 「抗腫瘤」多肽係指可提供遏止或淨減少腫瘤細胞之 擴增之多肽。多肽之抗腫瘤性質可於適當動物研究模型測 定,或於接受處理之個體經由經歷一段時間實際腫瘤大小 縮小測定。多種方法可用來估計腫瘤大小,包括放射性方 法(例如單光子及正子發射電腦斷層掃描術;大致上表考 「臨床腫瘤學之細胞核藥物」,winkler,c (編輯)史賓基_福 拉(Springer-Verlag),紐約,1986年)、採用習知成像劑(= 如檸檬酸鎵_67)之方法、免疫學方法(例如針對特定腫瘤標 圮之放射性標記單株抗體)以及超音波方法(參考「腫瘤之超 音波差動診斷」,Kossoff及Fukuda (編輯),醫學蚩院 dgaku-Shoin),紐約,漬年)。另夕卜,多耿之抗 可基於腫《記存在量的減州定。實例包細於攝護腺 癌檢測之PSA及用於大腸直腸癌及某些乳癌檢測之cm。此 外,多肽之抗腫瘤性質可於適當動物研究模型測定,例如 使用代表性人癌細胞系注射之小鼠測定。於發展】可角轉 21 200844231 之腫瘤後,小鼠被注射本發明之載體,然後監視腫瘤生長 速率的降低及存活率的增高。此外,多種試管内方法可用 來預測活體内之腫瘤抑制。適當抗腫瘤多肽包括與腫瘤相 關聯之抗原(TAA)諸如MUC-l (W092/07000 ; Acres等人, 5 2005, Exp· Rev. Vaccines 4 (4))、BRCA-1、BRCA-2 (Palma 等人,2006,腫瘤學/血液學之臨床綜論27,1-23)、癌胚抗 原CEA (Conroy等人,1995,基因治療;2,59-65)、MAGE (WO99/40188 ; De Plaen等人,1994,免疫遺傳學40, 360-369)、MART-卜 gp 100 (Bakker等人,1994, J· Exp· Med· 10 179,1005-9)、PRAME、BAGE、Lage(也稱作為NYEosl) SAGE、HAGE (WO99/53061)、GAGE (Robbins 及 Kawakami,1996,免疫學之流行觀點8, 628-36)及攝護腺特 異性抗原(PSA) (Ferguson等人,1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA· 96, 3114-9; W098/12302、W098/20117及WO00/04149) 15及得自具有腫瘤誘導潛力之病毒(例如乳頭狀瘤病毒)之病 毒性多肽。 於本發明之另一個實施例中,該至少第一核酸分子及 第二核酸分子係得自同一種有機體或密切相關之有機體。 如此處使用,「有機體」一詞涵蓋較佳有致病可能之微 20生物以及高等真核生物。「微生物」一詞表示真菌、細胞、 原虫*及病毋。病毋之代表性實例包括但非限於HIV(hiV· 1 或HIV-2)、人疱疹病毒(例如HSV14HSV2)、細胞巨病毒 (CMV)、EB病毒(EBV)、肝炎病毒(例如a型肝炎病毒 (HAV)、HBV、HCV及E型肝炎病毒)、黃病毒(例如黃熱病 22 200844231 毒)、水痘帶狀范療病毒(VZV)、副黏液病毒、呼吸道融合 病毒、副流行性感冒病毒、麻療病毒、流行性感冒病毒及 乳頭狀瘤病毒(定義如前)。適當細菌之代表性實例包括但非 限於奈瑟氏菌(Neisseria)(例如淋病奈瑟氏菌(N. g〇n〇rrhea) 5及腦膜炎奈瑟氏菌(Ν· meningitides));博德氏菌(B〇rdetella) (例如百曰咳博德氏菌(Β· pertussis)、副百日咳博德氏菌(b parapertussis)及支氣管炎博德氏 g(B· br〇nchiseptica));分 枝桿菌(Mycobacteria)(例如結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、牛分枝桿菌(Μ· bovis)、麻風分枝桿菌(Μ· 10 leprae)、禽分枝桿菌(Μ· avilim)、副結核分枝桿菌(μ pamtubenmlosis)、恥垢分枝桿菌(M smegmatis)) ·,退伍軍 人症菌(Legionella)(例如嗜肺退伍軍人症菌。 pneumophila));埃希氏菌(Escherichia)(例如腸毒性大腸桿 菌(E.coli)、腸出血性大腸桿菌、腸病原性大腸桿菌丨志賀 15氏菌(Shi明lla)(例如索氏志贺氏菌(S. sonnei)、痢疾志贺氏 菌(S· dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(s ^奶地));沙門氏菌 (Salm〇ndla)(例如傷寒桿菌(S· typhi)、副傷寒桿菌(s paratyphi)、雈亂桿菌(s· ch〇leraesuis)、腸炎桿菌(8 enteritidis));李氏菌(Listeria)(例如單核球產生性李氏菌⑴ 2〇 monocytogenes));螺旋桿菌(Helic〇bacter)(例如幽門螺旋桿 菌(H· pylori),假單胞菌(Pseud〇m〇nas)(例如綠膿桿菌(p aerugi腦郝葡萄球菌(Staphyl〇c〇ccus)(例如金黃葡萄球菌 (S· aureus)、表皮葡萄球菌以咖簡述⑼丨腸球菌 (Enter〇C〇CCUS)(例如糞腸球菌(E· faecalis)、屎腸球菌(Ε· 23 200844231 faecium));芽孢桿菌(Bacillus)(例如炭疽桿菌(β· anthracis));棒狀桿菌(Corynebacterium)(例如白喉棒狀桿菌 (C· diphtheriae)及彼衣菌(Chlamydia)(例如砂眼披衣菌(c· trachomatis)、肺炎彼衣菌(C· pneumoniae)、魏鴣熱披衣菌(c· 5 psittaci)) 〇寄生蟲之代表性實例包括但非限於瘧原蟲 (Plasmodium)(例如惡性癔原蟲(R falciparum));弓漿蟲 (Toxoplasma)(例如鼠弓漿蟲(T· gondii));利什曼原蟲 (Leishmania)(例如主要利什曼原蟲(L. major));肺囊蟲 (Pneumocystis)(例如卡氏肺囊蟲(P· carinii));及血吸蟲 10 (Schisostoma)(例如曼森氏血吸蟲(S· mansoni))。真菌之代 表性實例包括但非限於念珠菌(Candida)(例如白色念珠菌 (C· albicans))及麴菌(Aspergillus)。高等真核生物較佳為哺 乳類包括人類。 「相同有機體」係定義來自於共通祖先且遵循相同演 15 化徑路的有機體。代表性實例包括有相同血清型或基因型 之各種病毒單離株。例如HPV-16之二單離株被歸類為此類 別。「密切相關之有機體」係指來自於共通祖先但演化過程 中分歧之有機體。代表性實例包括有不同血清型或基因型 之病毒。例如HPV-16及HPV-18被歸類屬於此一類別。 20 於一較佳實施例中,獲得至少第一核酸分子及第二核 酸分子之有機體為乳頭狀瘤病毒,各自編碼乳頭狀瘤病毒 多月太。「乳頭狀瘤病毒」可定義為屬於乳頭狀瘤病毒科亞科 之病毒,此術語涵蓋非人種屬來源之動物乳頭狀瘤病毒, 包括但非限於牛、馬、兔、羊、犬、非人靈長類及齧齒類 24 200844231 以及人類乳頭狀瘤病毒(HPV)。目前已經識別多於1〇〇種 HPV之基因型(Van Ranst 等人,1992, j. Gen Vir〇1 73, 2653,DeViUiers等人,2004,病毒學324, 17-27),依據其 致癌基因潛力,被歸類為「低風險」(LR)及「高風險」(HR) _ 5企清型。LRHPV於感染個體引發良性腫瘤,而HRHPV有 惡性進展的高度風險。
有關大致指南,乳頭狀瘤病毒具有約7900鹼基對之雙 股圓形DNA,由蛋白質殼體所包圍(例如參考Pfister,i987, 於乳頭狀病毒科:乳頭狀瘤病毒,Salzman及Howley編輯, 晋能出版社(Plenum Press),紐約,1-38頁)。其基因體係由 二個功能區所組成,早期區(E)、晚期區(L)及長控制區 (LCR) ° LCR含有轉錄調節序列,諸如加強基因及啟動基 因。晚期區編碼結構L1蛋白質及L2蛋白質,分別為主要殼 體蛋白質及次要殼體蛋白質;而早期區編碼主要出現於細 胞核來控制病毒的增生、轉錄及細胞轉形之調節蛋白質 (E1-E7)。更特別’ E1蛋白質為具有Ajp相依性螺旋酶活性 之DNA結合碟酸蛋白(Desaintes及Demeret,1996,癌症生 物學研討會7,339-347 ; Wilson等人,2002,病毒基因 24,275-290)。E2蛋白質為多功能DNA結合作用磷蛋白,E2 20蛋白質調節病毒基因轉錄且控制DNA複製(Bechtold等人, 2003, JL Viirol· 77, 2021-8)。E4編碼蛋白質結合且破壞細胞 質角蛋白網路’且於病毒成熟扮演某種角色。仍蛋白質之 功能仍然有爭議,於病毒整合入宿主染色體時經常喪失E5 蛋白質之表現。HR HPV基因型之E6及E7編碼基因產物係 200844231 涉及感染細胞之致癌基因轉形(Kanda等人,1988, J. Virol. 62, 610-3 ; Vousden等人,1988,致癌基因研究3, 1-9 ; Bedell 等人,1987, J· Virol· 61,3635-40),推定係經由此等病毒蛋 白質分別結合至細胞腫瘤遏止基因產物p53及視網膜母細 5 胞瘤(Rb)(綜論於Howley,1996,乳頭狀瘤病毒及其複製, 2045 頁_2076 頁;綜論於B.N. Fields,D.M. Knipe及P.M. Howley (編輯),病毒學,第3版,里平考瑞文出版社 (Lippincott-Raven Press),紐約州紐約)。涉及天然HPV-16 E6 多肽結合至p53之胺基酸殘基已經明確定義係由殘基118至 10 122 (+1為第一個Met殘基,或由殘基111至115,始於較佳使 用的第二Met殘基)(Crook等人,1991,Cell 67, 547-556); 涉及天然HPV-16 E7多肽結合至Rb之該等胺基酸殘基係位 於由殘基 21 至 26 (Munger 等人,1989,EMBO J· 8, 4099-4105 ; Heck等人,1992, Proc· Natl· Acad· Sci· USA 89, 15 4442-4446)。 較佳至少該第一核酸分子及第二核酸分子分別係得自 選自於由HPV-16、HPV-18、HPV-30、HPV-31、HPV-33、 HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、 HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-70及HPV-85所 20 組成之組群之高風險乳頭狀瘤病毒。 如此處使用之「乳頭狀瘤病毋多肤」係才曰業界認知得 自乳頭狀瘤病毒基因體/來源之核酸分子所編碼之多肽。如 前文就「多肽」一詞定義,「乳頭狀瘤病毒多肽」涵蓋天然 經改性之乳頭狀瘤病毒多肽及其胜肽。乳頭狀瘤病毒來源 26 200844231 包括但非限於生物樣本(例如收集自已經暴露於乳頭狀瘤 病毒之個體之生物樣本、組織切片、生檢檢體及組織培 養)、培養細胞(例如得自ATCC之CaSki細胞)以及於寄存協 會、於商業型錄或如參考文獻所述可得之重組物質。多種 5乳頭狀瘤病毒基因體之核;酸序列及編碼多肽之胺基酸序 列已經說明於參考文獻,且於特定資料庫例如基因存庫可 得。有關概略資訊,HPV-16基因體於基因存庫以存取號碼 NC—01526 及 K02718 描述;HPV-18 以 NC—001357 及 X05015 ; HPV-31 以J04353 ; HPV-33以M12732 ; HPV-35以 10 NC—001529 ; HPV-39 以 NC_001535 ; HPV-45 以 X74479 ; HPV-51 以 NC—001533 ; HPV-52 以 NC—001592 ; HPV-56 以 X74483 ; HPV-58以D90400 ; HPV-59以NC—001635 ; HPV48 以 X67160 及 M73258 ; HPV-70 以 U21941 ;及 HPV-85)^ AF131950描述。 15 由第一核酸分子及/或第二核酸分子所編碼之乳頭狀 瘤病毒多肽可為早期、晚期或其組合。早期乳頭狀瘤病毒 多肽包括El、E2、E4、E5、E6及E7 ;而晚期多肽可為^ 或L2。大量乳頭狀瘤病毒血清型之早期多肽及晚期多肤之 核苷酸序列及胺基酸序列係說明於熟諳技藝人士可得之來 2〇 考文獻。 較佳,該至少第一核酸分子及第二核酸分子分別編石馬 選自於由El、E2、E6及E7所組成之組群之一早期多肽。供 舉例說明,天然HPV-16 El、E2、E6及E7多肽之胺基酸序 列分別係顯示於证卩ID NO: 1-4。但本發明非僅限於此等序 27 200844231 列實例。確實核普酸序列及胺基酸序列可於不同乳頭狀瘤 病毒單離株間變化,此天然基因變化係含括於本發明之範 圍及非天然改性,容後詳述。經適當改性之乳頭狀瘤病毒 夕肽之具體貫施例顯示如下(例如SEQ山n〇:5_8及 5 64-65) ’但热諳技藝人士可調整其中修改(例如藉序列比較 調整至始於其它乳頭狀瘤病毒基因型之多肽)。 供本發明使用之適當乳頭狀瘤病毒扪多肽涵蓋刺激病 毒增生有缺陷之突變株,亦即刺激病毒增生能力於統計方 面頦著低於相對應之天然E i多肽刺激病毒增生之能力(例 10如低於75%,較佳低於50%,較佳低於1〇%,及更佳低於 5%)。有關一般指南,負責刺激病毒增生之功能部位係位於 E1中部(例如Hugues及Romanos,1993,核酸研究21, 5817-23)。複製缺陷E1多肽之代表例係說明於熟諳技藝人 士可得之參考文獻,例如說明於Yasugi等人(1997,J. Virol 15 71 5942*·51)。本發明之内文中之較佳修改包括以另一個殘 基(較佳以Asp殘基)取代HPV-16 E1多肽於位置482之Gly殘 基(例如參考SEQ ID NO:5)或以另一個殘基(較佳以Asp殘 基)取代HPV-18 E1多肽於位置489之Gly殘基(例如參考SEQ ID NO:6)。 20 本發明有用之適當E2多肽涵蓋比較天然E2多肽於轉錄 活化活性及/或複製活性有缺陷之突變株(例如低於75%,較 佳低於50%,較佳低於10%,及更佳低於5%)。有關一般指 南,負責轉錄活化及刺激複製之功能部位係位於E2之N端 部(Seedorf等人,1985,病毒學,145, 181-185 ; Kennedy等 28 200844231 人,1991,J. Virol· 65, 2093-2097 ; Cole等人,1987,几以〇1· Biol· 193, 599-608 ; McBride等人,1989, Proc· Natl· Acad· Sci· USA,86, 510-514);複製及轉錄E2活性減低或缺陷容易 使用標準方法測定(例如參考Sakai等人,1996, J. Virol. 70, 5 1602-1611)。本發明所使用之適當缺陷E2突變株係說明於 热諳技藝人士可得之參考文獻,例如說明於Demeret等人 (1995,核酸研究23,4777-4784)、Sakai等人(1996, J· Virol· 70, 1602-1611)、Brokaw等人(1996,病毒學期刊 70,23_29)及 Ferguson等人(1996,病毒學期刊70,4193-4199)。於本發明 10 之内文中之較佳修改包括以Ala殘基(E39A)取代於HPV-16 E2位置38之Glu殘基及/或以Ala殘基(Γ73Α)取代於位置73之 lie殘基(例如參考SEQ IDNO:7)。供舉例說明,以HPV-16 E2 位置39及位置73之Glu殘基及lie殘基分別係與於HPV-18 E2 之位置43及位置77之Glu殘基及lie殘基相對應(例如參考 15 SEQIDNO:8)。 適曰用於本發明之E6多狀涵蓋結合至細胞腫瘤遏止基 因產物p 5 3有缺陷之非致癌突變株。非致癌E 6多肽之代表性 實例例如係說明於Pim等人(1994,致癌基因9,1869-1876) 及Crook等人(1991,細胞67, 547-556)。於本内文之較佳修 20改包括於HPV-16 E6刪失殘基118至122 (CPEEK)(例如參 考 SEQ ID NO:64)或於 HPV_18 E6 刪失殘基 113 至 117 (NPAEK) 〇 適合用於本發明之E7多肽涵蓋結合至細胞腫瘤遏止基 因產物Rb有缺陷之非致癌突變株。非致癌£7多肽之代表性 29 200844231 實例例如係述於例如Munger等人(1989,EMBO J. 8, 4099-4105)、Heck等人(1992, Pr〇c· Natl· Acad. Sci· USA 89, 4442-4446)及Phelps等人(1992, J. Virol· 66, 2148-2427)。於 本内文之較佳修改包括於HPV-16 E7刪失殘基21至26 5 (DLYCYE)(例如參考SEQ ID NO:65)或於HPV-18 E7冊]失 殘基24至28 (DLLCH)。 此外,由該至少第一核酸分子及/或第二核酸分子所編 碼之多肽(例如乳頭狀瘤病毒多肽)進一步包含對所編碼多 肽之處理、安定性及/或溶解度有利之額外修改,例如遏止 10可能裂解位置、遏止可能糖化位置及/或呈現於表現細胞表 面。舉例言之,所編碼之多肽包括用來定錨於表現細胞之 胞質膜之適當h號。確實先前顯示膜呈現,允許改良MHC I 類及MHC II類呈現,結果導致由宿主免疫系統辨識的加強 (例如參考WO99/0388)。因天然早期乳頭狀瘤病毒多肽 15 (El、E2、E6及E7)為核蛋白(但未能明確識別典型核定位信 號),較佳係將其定址於胞質膜,俾便改良其免疫原性潛 力,如此改善其於宿主個體之療效。 於表現作用的宿主細胞表面有效膜呈現多肽可經由將 多肽融合至信號胜肽及膜定錨胜肽來達成。此種胜肽為業 20界所已知。簡言之,信號胜肽通常係存在於膜所呈現的或 膜所分泌的多肽N端,起始其通過進人内f網㈣。信號胜 狀包含I5至35大致為斥水之胺基酸,隨後藉特定位於服之 胜肽内切酶移除來獲得成熟多肽。膜定錯胜肽通常本質上 為斥水性,用來將纽定錨於細胞膜(例如參考Bmnden及 30 200844231 T〇〇Ze,1991,蛋白質結構介紹,202-214頁,紐約葛蘭)。可 用於本發明内文之信號及膜定錨胜肽之選擇龐大。其分別 係得自任何分泌的多肽或膜定錨的多肽(例如細胞多肽或 病毒性多肽)諸如狂犬病糖蛋白、HIV病毒被膜糖蛋白或麻 5疹病毒F蛋白;或該多肽可為合成。信號肽之較佳***位^ 為松碼子下游用於轉譯起始端;膜定錯胜肽為C端例如 停止密碼子之緊鄰上游。若有所需,鏈接劑胜耿可用來將 信號胜肽及/或膜定錨胜肽鏈接至所編碼之多肽。 適合用於本發明之膜定錯及缺陷m多肽之代表例示於 10 SEQ ID Ν0··5 (定義實例章節所示之ΗρλΜ6 ss_ei、t魔 多肽)及於SEQ ID NO:6 (定義實例章節所示之Hpv_i8 SS-E1*-TMF多肽)。適合用於本發明之膜定錯及缺陷拉多 肽之代表例示於SEQ ID N〇:7 (定義實例章節所示之 HPV-16 SS-E2*-TMR多肽)及於SEQ ID N〇·8 (定義實例章 Η節戶斤示之HPV-18SS-E2、TMR多肽)。適合用於本發明之膜 定錯及非致癌性E6及E7多肽之代表例示於SEQ m n〇:64 (定義實例章節所示之HPV^6 ss韻*_醫多肽)及於_ ID N0.65 (定義貫例章節所示之Hpv i6 ss e7*_tmr多 肽)。 20 於特佳實施例中,該至少第-核酸分子及第二核酸分 子編碼得自相同HPV血清型之兩個不同乳頭狀瘤病毒多 肽。 於本貫施例之較佳面相中,該第一核酸分子編碼別多 肽,而該第二核酸分子編多月大,或反之亦然。較佳E1 31 200844231 AE2編碼核酸分子係得自HPV-16或得自HPV-18。較佳,該 第核酸分子編碼包含或主要組成為或組成為sEQ ID ΝΟ·5所不胺基酸序列之一多肽,而該第二核酸分子編碼包 含或主要組成為或組成為SEQ ID ΝΟ:7所示胺基酸序列之 5 一多肽。另外,該第一核酸分子編碼包含或主要組成為或 組成為SEQ ID NO :6所示胺基酸序列之一多肽,而該第二核 酸分子編碼包含或主要組成為或組成為SEq ID N〇:8所示 胺基酸序列之一多狀。 於自然部分(例如HPV_164HPV_18基因體),E1_編碼序 10列之3 °卩重4:E2-編碼序列之5’部共59個核苷酸。存在有此 等100%同源性59核苷酸預期對表現扪及拉編碼核酸分子 之載體安定性造成負面影響。同源重組可出現於此等共通 部分間,結果導致包含於其間之核苷酸序列喪失。 根據本發明,於改性前存在於E1及E2編碼核酸分子之 15 59核菩酸重疊部分間之1〇〇%同源性,經由簡併於該等核酸 分子中之一者之密碼子使用樣式,同源性可降至低於 75%。簡併序列之代表例示於3叫ID n〇:9,其中於E1/E2 重疊59核苷酸之同源性降至69% (如第i圖所示),編碼 HPV-16 E1及E2多肽之本發明之較佳載體包含狃卩出 20 N〇:9所示之核苷酸序列。相同策略可應用於存在於Hpv_is El及E2編碼序列之重疊部。此種簡併序列可導入耵編碼第 一核酸分子來置換天然重疊5 9核苷酸(例如分別為s E Q工d NO:10及 11)。 如此,本發明之較佳載體包含一第一核酸分子包含或 32 200844231 主要組成為或組成為SEQ ID NO:10所示之核苷酸序列(其 編碼SEQ ID N〇:5之HPV-16 E1多肽),及一第二核酸分子包 含或主要組成為或組成為SEQ ID ΝΟ··12所示之核苷酸序列 (其編碼SEQ ID ΝΟ:7之HPV-16 Ε2多肽)。本發明之另一個 5較佳載體包含一第一核酸分子包含或主要組成為或組成為 SEQ ID NO: 11所示之核苷酸序列(其編碼seq id NO:6之 HPV-18 El多肽),及一第二核酸分子包含或主要組成為或 組成為SEQ ID NO:13所示之核苷酸序列(其編碼seQ ID NO:8之HPV-18 E2多肽)。 10 更佳本發明之載體為MVA載體,第一(E1編碼)核酸分 子係置於牛痘7.5K啟動基因之控制之下,而第二(E2編碼) 核酸分子係置於牛痘H5R啟動基因之控制之下,第一核酸 分子及第二核酸分子皆係***該MVA載體之刪失m。 本發明亦係關於編碼HPV-16 E1多肽之一第一核酸分 15子,編碼HPV_16 E2多肽之一第二核酸分子,編碼hpv-18 Ei 多肽之一第三核酸分子,及編碼HPV-18 E2多肽之一第四核 酸分子,其中該第一、第二、第三及第四核酸分子並未包 含具有同源性百分比75%或大於75%之40個或以上連續核 苷酸部分。較佳,該HPV^16E1多肽包含SEQidn〇:5所示 20核酸序列,該HPV-16E2多肽包含SEQIDN0:7所示核酸序 列’該HPV-18E1多肽包含SEQIDN0:6所示核酸序列,及/ 或該HPV-18 E2多肽包含SEQIDNO:8所示核酸序列。 於天然版本中,HPV-16及HPV-18 E1編碼序列包含具 有同源性百分比8〇〇/0或大於80〇/〇之數個40或以上連續核苔 33 200844231 酸部分。就HPV-16及HPV-18 E2編碼序列而言,此點亦為 真。此外,相鄰的E1及E2編碼序列重疊於Hpv_i6及HPy-18 基因體中約59核苷酸之一部分。就此方面而言,建議修改 HPV-18 E1及E2編碼核酸分子序列,因而將其與hpv-16對 5偶的同源性降至低於75%,特別於由兩個血清型所共享之 同源部分之同源性降至低於75%。為了達成此項目的, HPV-16及HPV-18 E1及E2基因之核苷酸序列可經校準,於 核苷酸層面可設計改性,來將同源性降至少於8、7、6或較 佳5個接續核苷酸。此外,HPV-18 E1序列可進一步經修改 10 來將同源性降至低於75%,59核誓酸部分重疊hpV-18 E2序 列之5’端。較佳密碼子之使用經修改,但修改不會於胺基 酸層面轉譯,但產生如此處定義之修改,例如導致缺陷酶 功能。適合用作為第三核酸分子及第四核酸分子之「簡併」 HPV-18 E1-及HPV-18 E2編碼核苷酸序列之代表例分別列 15 舉於SEQIDNO.ll及SEQIDNO:13。本發明之較佳載體包 含一第一核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID NO:10所示核酸序列(編碼SEQ ID N〇:5所示HPV-16 El多 肽)’ 一第二核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID NO:12所示核酸序列(編碼SEQ ID NO:7所示HPV-16 E2多 20 肽),一第三核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID N0:11所示核酸序列(編碼SEQ ID NO:6所示HPV-18 El多 肽),及一第四核酸分子包含或主要組成為或組成為SEQ ID NO:13所示核酸序列(編碼SEQ ID NO:8所示HPV-18 E2多 肽)。較佳該載體為MVA載體,該第一、第二、第三及第四 34 200844231 核酉文分子係導入M VA載體之刪失j i j,該第一及第三(E〗編碼) 核酸分子係置於相反方向,各自係於牛痘ρ·5κ啟動基因之 k制之下,而第二及第·四(Ε2編碼)核酸分子係置於相反方 向’各自係於pH5R啟動基因之控制之下。 5 於另一個特佳實施例中,該至少第一核酸分子及第二 核馱分子編碼得自密切相關有機體,例如密切相關HPV血 清型諸如HPV-16 ' HPV-18、HPV-33及/或HPV-52之相同多 肽。 於本實施例之第一面相中,得自於密切相關有機體之 10相同夕肽較佳為E2多肽。編碼E2多肽較佳經改性,來經膜 定錨且為病毒複製缺陷,如此處定義。於天然方面,各種 基因型之E2編碼序列於核苷酸層面,特別於最為保留性部 分具有高度同源性。存在有此等同源性序列預期負面影響 共同表現兩種或多種(例如3、4或甚至更多)E2基因之载體 15安定性,該E2基因特別為得自HR、HPV之E2基因,諸如 HPV-16、HPV-18、HPV-33及HPV-52。此等同源性基因序 列間出現同源性重組,結果導致喪失包含於其間之核苷酸 序列,如此導致基因靜默。 根據本發明,包含於本發明載體之編碼E2多肽之核酸 20分子可經由簡併密碼子使用樣式來改性,因而將同源性特 別為高度同源部分之同源性降至低於75%。簡併後之編碼 E2多肽之核酸分子之代表例列舉於SEq ID N〇:13、66、67、 68及69。更特別,SEQIDNO:13編碼膜呈現的且為複製缺 陷之HPV-18E2多肽,其核苷酸序列已經經設計,因而將與 35 200844231 其E2編碼對偶之同源性降至少於8個或7個連續核驻酸。 SEQ ID NO:66及67二者皆編碼複製缺陷hpv-33 E2多肽(其 進一步於SEQ ID ΝΟ··67膜呈現),該等核苷酸序列經設計為 將其與其它Ε2編碼對偶之同源性降至少於8個或7個連續核 5甘酸。SEQ ID NO.68及69« —者皆編碼複製缺陷HPV-52 E2 多肽(其進一步於SEQ ID NO:69膜呈現),該等核誓酸序列 經設計為將其與其它E2編瑪對偶之同源性降至少於8個或7 個連續核苷酸。但本發明非僅限於此等序列實例,如前文 定義簡併之編碼E2乳頭狀瘤病毒多肽之核酸分子之其它版 10 本也可基於此項原則設計。 本發明之較佳載體包含編碼如此處定義之HP V-16 E2 多肽之一第一核酸分子(例如包含SEQ ID NO:7所示胺基酸 序列之膜呈現的複製缺陷E2多肽),編碼如此處定義之 HPV-18 E2多肽之一第二核酸分子(例如包含SEQ ID NO:8 15 所示胺基酸序列之膜呈現的複製缺陷E2多肽),編碼如此處 定義之HPV-33 E2多肽之一第三核酸分子(例如包含SEq π) NO:70所示胺基酸序列之膜呈現的複製缺陷E2多肽),及編 碼如此處定義之HPV-52 E2多肽之一第四核酸分子(例如包 含SEQ IDNO:71所示胺基酸序列之膜呈現的複製缺陷E2多 20 肽)。更佳該第一核酸分子包含或主要組成為SEQ ID NO: 12 所示之核酸序列;該第二核酸分子包含或主要組成為SEQ ID NO:13所示之核酸序列;該第三核酸分子包含或主要組 成為SEQIDNO:67所示之核酸序列;及/或該第四核酸分子 包含或主要組成為SEQIDNO:69所示之核酸序列。更佳, 36 200844231 本么月之載體為MVA載體,四個E2編碼核酸分子係***刪 失ΠΙ。又承 酸分子係於牛殖 5 反方向。 尺仏,該第一及第二核酸分子係於牛痘H5R啟動 之彳工制之下且置於彼此相反方向;而該第三及第四核 ρ·75Κ啟動基因之控制之下且置於彼此相
於本發明之另一面相中,得自密切相關有機體之相同 夕月太車父佳為恥多肽、E7多肽或E6及E7多肽二者。E6及E7 可刀開表現’或表現成為融合多肽。編碼之E6多肽及/或E7 夕較仏經改性’因而如此處定義為臈定錨且非致癌性。 1〇 於天然版本HPV-16及HPV-18,天然E6序列於核苷酸層 面有63%同源性,而HPV-16及HPV-18,天然E7序列彼此有 57%同源性。但於兩種情況下,HPV-16及HPV-18天然序列 共享具有80%或超過80%同源性之數個4〇核苷酸或以上部 分(參考第2圖)。存在有此等同源性部分預期對共同表現 15 HPV_16及HPV-18 E6基因及/或E7基因之一載體之安定性造 成負面影響。此等同源性部分間出現同源性重組,結果導 致包含於其間之核苷酸序列的喪失,如此導致基因靜默。 根據本發明,編碼HPV-16及/或HPV-18E6多肽及E7多 肽之核酸分子可經由簡併密碼子使用樣式改性,因而將同 2〇 源性特別為同源性部分之同源性降至低於75%。編碼 HPV-18 E6多肽之簡併後之核酸分子之代表例列舉於SEQ ID NO:14及編碼HPV-18 E7多肽之簡併後之核酸分子之代 表例列舉於SEQIDNO:15。更特別,SEQI〇n〇:14及SEQ ID NO:15經設計來將與HPV-16對偶之同源性降至少於8、 37 200844231 7、6或較佳5個連續核苷酸,同時編碼HPV-18膜定錨之非致 癌性E6多肽及E7多肽。但如前文定義之編碼E6及/或E7乳頭 狀瘤病毒多肽之經簡併的核酸分子之其它版本也可基於本 原則設計。 5 本發明之較佳载體包含編碼如此處定義之HPV-16 E6 多月太之一第一核酸分子(例如膜定錨及非致癌性),及編碼如 此處定義之HPV-18 E6多肽之一第二核酸分子(例如膜定錨 及非致癌性),其中該第二核酸分子包含或主要組成為SEQ ID NO:14所示之核酸序列。本發明之另一個較佳載體包含 1〇編碼如此處定義之HPV-16 E7多肽之一第一核酸分子(例如 膜定錨及非致癌性),及編碼如此處定義之HPV-18 E7多肽 之一第二核酸分子(例如膜定錨及非致癌性),其中該第二核 酸分子包含或主要組成為SEQ ID N〇:l5所示之核酸序列。 更佳,本發明之載體為MVA載體,第一核酸分子係置於牛 15痘7.5K啟動基因之控制之下,而第二核酸分子係置於牛痘 H5R啟動基因之控制之下,以及第一核酸分子及第二核酸 分子皆係***該MVA載體之刪失m。 本發明亦係關於一種載體,包含編碼Hpv_l6 E6多肽與 HPV-16 E7多肽之融合之一第一核酸分子;以及編碼 2〇 HPV-18 E6多肽與HPV-18 E7多肽之融合之一第二核酸分 子,其中該第一核酸分子及第二核酸分子並未包含具有同 源f生百刀比約75%或大於75%之40個或更多個連續核苔酸 部分。 本發明亦係關於一種載體,包含編碼迅^—“ E6多肽之 38 200844231 一弟一核酸分子,編碼HPV-18 E6多肽之一第二核酸分子, 編碼HPV-16 E7多肽之一第三核酸分子,編碼Ήρν_18 £7多 肽之一第四核酸分子,其中該第一、第二、第三及第四核 酸分子並未包含具有同源性百分比約75%或大於75%之4〇 5個或更多個連續核^"酸部分。較佳,該第二核酸分子包含、 主要組成為或組成為SEQ ID N0:14&/或該第四核酸分子 • 包含、主要組成為或組成為SEQ N〇:15。更佳,本發明 之載體為MVA載體,第一及第二核酸分子係置於牛痘75κ _ ⑨動基因之控制之下,而第三及第四核酸分子係置於牛痘 10 H5R啟動基因之控制之下,以及第一、第二、第三及第四 核酸分子皆係***該M VA載體之刪失m。 • 於另一個面相中,本發明也提供包含、主要組成為或 組成為SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、66 67 68或69中之任-者所示之核苔酸序列之一種實質上單離之 ; 15 核酸分子。 — 財發明之另一個實施例中,包含於本發明之载體之 響 帛一及第二核酸分子,以及若存在時第三及第四核酸分子 係呈適合於宿主細胞或個體表現編碼多肽之形式,李二苴 係置於其表現所需之調節序列之控制之下。 丁/、 >如此處使用,「調節序列」係指於一給定宿主細胞允 卉、促成或_節一核酸分子之表現之任何序列,包 酸或其衍生物中之一者(亦即mRNA)之增殖、複製匕該核 剪接、轉譯、安定性及/或轉運入該宿主細胞。於本彳^^彔、 内文中,調節序列係「工作式鏈接」至該欲 ,明之 兄之核酸分 39 200844231 子,亦即其係處於允許於宿主細胞或㈣表現之功能關 係。此種調節序列為技藝界眾所周知(例如參考㈤編, 1990,基因表現技術:料方法185,學術出版社,聖地牙 哥)。熟諳技藝人士須瞭解調節序列之選擇可依據多項因素 5諸如載體類型、宿主細胞、期望表現層面等因素決定。 啟動基因特別重要,本發明涵蓋組成性啟動基因之使 用,該組成性啟動基因指導核酸分子於多類宿主細胞之表 現以及/、於某些佰主細胞直接表現(例如組織特異性調節 序列)’或回應於特定事件或外生性因子(例如藉溫度、營養 10添加物、激素或其它配體)而表現。於真核系統組成性表現 之適當啟動基因包括病毒性啟動基因諸如SV40啟動基因、 細胞巨病毒(CMV)即刻早期啟動基因或加強基因B〇shart等 人,1985,細胞41,521-530)、腺病毒早期及晚期啟動基因、 單純疱疹病毒(H S V) -1之胸腺苷激酶(τκ)啟動基因及反錄 15病毒長端重複本(例如MoMuLV及勞斯肉瘤病毒(RSV) LTR),以及細胞啟動基因諸如磷酸糖激酶(Pgk)啟動基因 (Hitzeman等人,1983,科學219, 620-625 ; Adra等人,1987, 基因60, 65-74)。可用於痘病毒載體驅動核酸分子之表現之 適當啟動基因包括牛痘病毒之7.5K、H5R、TK、p28、pll 20 或K1L啟動基因。另外,可使用合成啟動基因,諸如述於 Chakrabarti等人(1997,生物技術23, 1094-1097)、Hammond 等人(1997,病毒學方法期刊66,135-138)及Kumar及Boyle (1990,病毒學179,151-158)以及早期與晚期痘病毒啟動基 因間之嵌合型啟動基因。 40 200844231 可誘導啟動基因係藉外部供給病毒調節,且包括但非 限於鋅可誘導金屬硫蛋白(MT)啟動基因(Me Ivor等人, 1987,Mol· Cell Biol· 7,838-848)、德沙美沙松 (dexamethasone) (Dex)誘導小鼠乳癌病毒(MMTV)啟動基 5因、T7聚合酶啟動基因系統(W098/10088)、艾戴松 (eedysone)昆蟲啟動基因(No等人,1996, Proc. Natl. Acad. Sci· USA 93,3346-3351)、四環素(tetracycline)可抑制啟動 基因(Gossen等人,1992, Proc· Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551)、四環素可誘導啟動基因(Kim等人,i995, j 10 Vkol. 69, 2565-2573)、RU486可誘導啟動基因(Wang等人, 1997, Nat. Biotech. 15, 239-243及Wang等人,1997,基因治 療4,432-441)、拉帕黴素(rapamycin)可誘導啟動基因(Magari 等人 ’ 1997, J· Clin· Invest. 100, 2865-2872)及得自大腸桿菌 之lac、TRP、及TAC啟動基因。 15 於本發明之内文中使用之調節序列也可為組織特異 性,來於需要療效的特定組織驅動核酸分子之表現。適當 啟動基因係取自於偏好於腫瘤細胞中表現的基因。此種基 因可藉顯示及比較性基因體雜交來識別(例如參考us 5,759,776及5,776,683)。 20 熟諳技藝人士瞭解控制包含於本發明之载體之核酸分 子表現之調節元體進一步包含用於轉錄之適當起始、調節 及/或結束之額外元體(例如p〇lyA轉錄結束序列卜轉 運(例如核定位信號序列)、處理(例如剪接信號)、安定性(例 如***序列及非編碼5,序列及3,序列)、及轉譯(例如三分先 200844231 導子序列、核糖體結合位置、辛道嘉莫(Shine-Dalgamo)序 列等)入宿主細胞或個體。 於另一面相中,本發明提供包含前述載體之傳染性病 毒顆粒。未嘗試描述進一步細節,於此處將進行傳染性病 5 毒顆粒製造之多種已知方法。典型地,此種病毒顆粒係藉 一種方法製造,該方法包含下列步驟:(a)將病毒載體導入 適當細胞系,(b)於適當條件下培養細胞系,允許傳染性病 毒顆粒的製造,由細胞系培養中回收所產生的傳染性病毒 顆粒,以及視需要可純化所回收之傳染性病毒顆粒。 10 當病毒載體為缺陷性時,傳染性病毒顆粒通常係於互 補細胞系製造,或透過使用助手病毒製造,助手病毒供給 反式非功能性病毒基因。舉例言之,E1經刪除之腺病毒載 體之適當互補細胞系包括293細胞(Graham等人,1997,J.
Gen. Virol· 36, 59-72)、PER-C6細胞(Fallaux等人,1998, 15 人類基因治療9,1909-1917)及HER96細胞。適合用於繁殖痘 病毒載體之細胞為禽細胞,更佳為由得自受精彡卩之雞胚所 製造之一次雞胚纖維母細胞(CEF)。製造者細胞可於適當溫 度、pH及氧含量條件下,於習知之發酵生物反應器、燒瓶 及培養皿中培養。 2〇 傳染性病毒顆粒可由培養上清液或於細胞溶解後由細 胞回收。病毒顆粒進一步根據標準技術純化(層析術、超離 心,例如說明於W096/27677、W098/00524、W098/22588、 WO98/26048、WO00/40702、EP1016700及 WO00/50573)。 於另一個面相中,本發明提供包含前述核酸分子、載 42 200844231 體或傳染性病毒顆粒之宿主細胞。如此處使用「宿主細胞」 一詞定義為可為本發明之載體或傳染性病毒顆粒之接受者 之任何細胞,及此等細胞之子代細胞。須廣義瞭解本術語 也涵蓋單離之細胞、一群細胞及特定細胞組織例如呈組織 5 或器官形式。此等細胞可為一次細胞、轉形細胞或培養之 細胞。 於本發明之内文中之宿主細胞包括原核細胞(例如大 腸桿囷、芽孢桿菌、退伍軍人症菌)、低等真核細胞諸如酵 母(例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、龐比酵母 10 (Saccharomyces pombe)或巴斯多比奇菌(Pichia pastoris))及 其它真核細胞諸如昆蟲細胞、植物細胞及高等真核細胞, 特別偏好使用哺乳動物細胞(例如人細胞及非人細胞)。適當 宿主細胞之代表性實例包括但非限於BHK細胞(嬰倉鼠腎 細胞)、MDCK細胞(馬丁-戴比(Madin-Darty)犬腎細胞系)、 15 CRFK細胞(可蘭戴爾(Crandell)貓腎細胞系)、CV-1細胞(非 洲猴腎細胞系)、COS(例如COS·7)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO) 細胞、小鼠NIH/3T3細胞、HeLa細胞及Vero細胞。「宿主細 胞」一詞也涵蓋可互補本發明之複製缺陷性載體(例如腺病 毒載體)之至少一項缺陷功能之互補細胞,諸如前文引述。 2〇 宿主細胞可用於藉重組手段製造包含於本發明之載體 或傳染性顆粒之該等核酸分子所編碼之多肽。此等技術為 業界眾所周知(例如參考Ausubel,分子生物學流行方案,約 翰威利公司,1987-2002年;及Sambrook等人,分子選殖, 實驗室手冊,冷泉港實驗室出版社之最新版本)。 43 200844231 於另一面相中,本發明提供包含前述核酸分子、載體、 傳染性病毒顆粒或宿主細胞(此處也稱作為「活性劑」或其 任一種組合之一種組成物。較佳該組成物為包含治療有效 量之活性劑及藥學上可接受之載媒劑之藥學組成物。 5 如此處使用,「藥學上可接受之載媒劑」一詞意圖包括 與藥物投予可相容之任何及全部載劑、溶劑、稀釋劑、賦 形劑、輔劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑及吸收 延遲劑等。如此處使用,「治療有效量」為足夠改善於個體 所期望治療或預防之病理情況通常相關聯之一項或多項症 10狀之劑量。當關聯治療用途時,本術語表示足夠預防或延 遲於個體建立病理情況之劑量。舉例言之,治療有效量為 足夠於接受治療之個體誘導或提升免疫反應之數量,或足 夠緩和、改善、穩定、逆轉、減慢、或延遲病理情況之進 打之數量(例如於個體之病灶或腫瘤的尺寸縮小或退行,感 I5 ^個體之病毒感染逆轉)。 20 較佳本發明組成物包含於使用之劑量及濃度為無毒之 一種或多種_及/或稀_。此種載劑及/或稀釋劑較佳係 選自於相來調配供线性投藥或顧㈣之單位劑=形 式或夕劑I形式之組成物。適當載劑可為溶劑、含有例如 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇 '液體聚乙 : =物油或其適當混合物之分散介質。稀釋劑較佳為等張 之代高張性且有相對低離子強度。適當稀釋劑 ^表性一包滅g水、纽食财(例域化納 〜夜、_萄糖、海藻糖或蔬糖溶液、漢克氏溶液、及^ 44 200844231 它水性生理上平衡鹽溶液(例如參考雷明頓:製藥科學及實 務 ’ A· Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins之最新版 本)。本發明組成物之pH適合經調整及緩衝來適當用於人類 或動物,較佳係於生理pH及/或微鹼性pH(约pH 7.5至約PH 5 9 ’特佳為或8.5)使用。適當缓衝劑包括磷酸鹽缓衝 劑(例如PBS)、碳酸氫鹽緩衝劑及/或Tris緩衝劑。 本發明組成物可呈多種形式例如冷凍形式、固體形式 (乾粉形式或凍乾形式)或液體形式(例如水性)。活性劑加任 何額外期望成分之固體組成物可得自先前經過無菌過濾溶 1〇液接文真空乾燥及冷凍乾燥。若有所需可以無菌安瓿形式 儲存,方便於使用前藉添加適當載媒劑來重新調製。 特佳組成物(例如當活性劑為腺病毒載體時)係調配於 1M蔗糖、150 mM NaCl、l MgCl2、54毫克/升吐溫(Tween) 8Ό、10 mM Tris pH 8·5。另一種較佳組成物係調配於1〇毫 15克/毫升甘露糖醇、1毫克/毫升HSA、20 mM Tris、pH 7.2 及150mMNaa。此等調配物特別適合於冷凍(例如_7〇它、 40°C、-2〇。〇或冷藏(例如代)溫度保有本發明組成物之安 定性經歷至少兩個月時間。 組成物也含有提供期望之藥物性質或藥效性質之一種 2〇或多種藥學上可接受之_劑,該等性質例如修改或維持 PH、滲透度、黏度、透明度、色彩、無菌性、安定性、釋 放入或吸收入人體或動物體。安定性成分之代表例包括聚 山梨糠醇醋8〇、L_精胺酸、聚乙烯基口比口各唆酮、海藻糖、 及聚合物諸如聚乙二醇’其可用來獲得溶解度、安定性及 45 200844231 半生期等期望性質(Davis等人,1978,酶邮.4,169_ Burnham等人,1994, Am. j H〇sp pharm”,2i〇_2i8)。黏 度提升劑包括叛甲基纖維素鈉、山梨糖醇、及葡萄聚糖。 、’且成物也3有技蟄界已知促進滲透或轉運跨越黏膜障壁或 5轉運入特定器官之已知物質。舉例言之,適合供***投藥 之組成物最終包括可用於増加黏膜之孔徑大小之一種或多 種吸收促進劑。 此外,本發明組成物包含適合於人體系統性投藥或黏 膜扠樂之一種或多種辅劑。「辅劑」一詞表示可提升對特定 10抗原之免疫反應之化合物。辅劑可於抗原位置或接近抗原 位置遞送。體液免疫力之提升典型係表現為對該抗原所提 引出之抗體力價顯著增高(通常大於10倍)。細胞免疫力的增 加例如可藉1%性皮膚試驗、胞毒性T細胞檢定分析、 或IL-2之ELIspot檢定分析測定。較佳用於本發明之輔劑可 15刺激對活性劑之免疫力,特別經由toll狀受體(TLR)諸如 TLR-7、TLR-8及TLR-9刺激對活性劑的免疫力。有用之輔 劑之代表性實例包括但非限於礬土、礦油乳液諸如福氏 (Freunds)完全及不完全(IFA)、脂多醣或其衍生物(RiH等 人,1986,細菌内毒素之免疫學及免疫藥理學),普能出版 20公司,紐約,407-419頁);皂素諸如QS2l (Sumino等人,1998, J. Virol· 72, 4931-9 ; WO 98/56415) ; 口米唾并唆琳化合物諸 如伊米奎莫(Imiquimod) (Suader,2000,j. Am Acad Dermatol· 43, S6-S11)、1H-咪唑并(4,5-c)喳喏酮-4-胺衍生物 (阿達拉(Aldara))及相關化合物(Smorlesi,2005,基因治療 46 200844231 12,1324-32);胞嘧啶磷酸鳥苷募去氧核苷酸諸如CpG(Chu 等人,1997, J· Exp· Med· 186:1623 ; Tritel等人,2003, J· Immunol· 171:2358-2547)及陽離子性胜肽諸如IC-31 (Kritsch等人,2005,J· Chromatogr Anal. Technol Biomed 5 Life Sci 822, 263-70)。 本發明之核酸分子、載體、傳染性顆粒或組成物可藉 多種投藥模式投予,包括系統性投藥、局部投藥、及黏膜 投藥。系統性投藥可藉任一種手段進行,例如經由皮下、 皮内、肌肉、靜脈、腹内、血管内、動脈内注射進行。注 1〇射可採用習知注射器及注射針,或技藝界可得之任何其它 適當裝置進行。經黏膜投藥可經口、經鼻、經氣管内、肺 内、***内、或直腸内途徑進行。局部投藥可使用經皮手 #又(例如貼片等)進行。肌肉投藥或皮下投藥於使用病毒載體 及傳染性顆粒為活性劑時為特佳。 15 適當劑量將依據多項因素而改變,諸如特定活性劑之 藥效學特性、個體年齡、健康狀況及體重、欲治療的病理 情況、症狀之本質及程度、合併治療之種類、治療頻率、 對預防或治療的需要及/或期望功效。劑量也可依據所選用 之特殊投藥途徑計算。有關判定治療用適當劑量所需計算 20之進一步精製可由執業人士鑑於相關情況例行性決定。有 關一般指南,腺病毒顆粒用之適當劑量係由約1〇5至約1〇n iu (傳染單位),期望由約1〇7至約1〇12比及較佳由約1〇δ至約 10 1 m。牛癌病毒顆粒之適當劑量係由約104至約l〇1G pfu G谷ii斑形成顆粒),較佳係由約1〇5至約1〇9 pfu及更佳係由 47 200844231 約106至約5xl〇8pfu。载體質體可以1〇微克至2〇亳克且較佳 100微克至2毫克之劑量投予。 此外,根據標準方案、劑量及計劃投藥可以單劑或另 外以多劑投予經歷數小時、數曰及/或數週 。此外,投藥可 5為大劑里注射或連續輸注。例如個體可使用至少技(例如2 至10次)投予前述核酸分子、載體、傳染性顆粒或叙成物。 較佳’第-系列投予係於由數日至4週之一連串時間内進 行,接著於第-系列之末次投藥後之丨個月至6個月内進行 第二系列投藥(例如-次投藥或二次投藥)。第二系列各自投 10藥間之間隔時間可由數日至4週。於較佳實施例中,第一系 列投藥包含以每週間隔3次循序投藥,而第二系列包含於第 -系列後之4個月至6個月内—次投藥。有關概略指南,使 用MVA載體,較佳投藥途徑於使用包含1〇6至5><1〇8扣^之 MVA病毒顆粒劑量皮下投予。 15 本發明之核酸分子、載體、傳染性顆粒、宿主細胞、 或組成物可導入個體用於治療或預防多種病理情况,包括 遺傳病、先天性疾病、及後天性疾病。本發明亦係關於使 用本發明之核酸分子、載體、傳染性顆粒、宿主細胞、戋 組成物製備意圖用於治療或預防此等病理情況之藥物。特 20別適合治療或預防傳染病(例如病毒性感染及/或細菌性I 染)、癌症及免疫缺乏病。「癌症」一詞用於此處涵蓋任一 種由於非期望的細胞增生所導致之任何癌性疾病,包括彌 漫性腫瘤或侷限性腫瘤、轉移癌、癌性息肉及腫瘤前期病 灶(例如腫瘤形成)。 48 200844231
10 預期涵蓋於本發明之内文之傳染病包括與如前文說明 由致病微生物麵㈣發之任何情況。_涵蓋於本發明 之内文之癌症包括但非限於神經膠母細胞廇、m素 瘤、肥大細胞瘤、癌瘤以及乳癌、攝護腺癌、畢丸癌、即 巢癌、子宮内膜癌、子宮頸癌(特別為與乳頭狀瘤病毒感毕 所引發之子宮職)、咖(包括大細胞、小細胞、鱗狀細胞 :腺癌)、腎癌、膀胱癌、肝癌、結腸癌、肛門癌、胰癌、 胃癌、胃腸道癌、口腔癌、腦癌及CNS癌、皮膚癌(例如里 =非黑素瘤)、血癌詞、白-病,特別係㈣^ 貝脰圑塊)、骨癌、視網膜母細胞癌及甲狀腺癌。
>於較佳實施例中,本發明用於預防性或治療性處理與 乳頭狀瘤病毒(特別為HRHPV)感染相M之病情,諸如持續 性感染、惡性前期病灶及惡性病灶。「持續性感染」係指= 感木個體尚未能達成病毒清除之乳頭狀瘤病毒感染之無症 狀J典型並未觀祭得臨床症狀。惡性前期病灶之實例包 括但非限於可於各個組織檢測得之低級、中級或高級上= 内腫瘤形成,諸如CIN(子宮頸上皮内腫瘤形成)、***上皮 内腫瘤形成(VIN)、肛門上皮内腫瘤形成(AIN)、陰莖上皮 内腫瘤形成(PIN)、及***上皮内腫瘤形成(VaIN)。惡性病 2〇灶之實例包括但非限於子宮頸癌、肛門癌、***癌、陰贫 癌、及口腔癌。編碼乳頭狀瘤病毒多肽之本發明之核酸八 子載體、傳染性顆粒、宿主細胞或組成物特別適合用於 治療惡性前期病灶,特別CIN2/3病灶或惡性病灶特別子宮 頸癌。於另一個實施例中,本發明也可用於預防性或治療 49 200844231 性處理與肝炎病毒(例如Η B V或H C V)感染所引發的病情, 諸如持續性感染、慢性肝炎或猛爆性肝炎及肝癌。 活性劑可單獨使用,或若有所需可結合習知治療模型 使用(例如放射性治療、化學治療及/或手術治療)。習知治 5療模型係根據標準方案使用標準藥劑、劑量及投藥計劃遞 送於動物體或人體;此種治療模型可於本發明之活性劑投 樂前、投藥期間及/或投藥後進行。舉例言之,用於治療與 HCV感染相關之病情,本發明之方法或用途較佳係與下列 結合:例如蛋白酶抑制劑(例如絲胺酸蛋白酶抑制劑諸如 10 VX950或福泰斯(Vertex))、聚合酶抑制劑、螺旋酶抑制劑、 抗纖維化劑、核苷類似物、TLR激動劑、siRNA、反訊息寡 核苷酸、抗-HCV抗體免疫調節劑、治療性疫苗及其用於治 療比HCV相關聯之肝癌之抗腫瘤劑(例如亞立亞黴素 (adriamycin)或亞立亞黴素、里皮朵(lipiodol)及史龐吉 15 (sPongel)之混合物通常係藉化學栓塞於肝動脈投予)。特別 適合之組合包括使用PEG化IFN- a (IFN- a 2a或IFN- a 2b) 及/或立巴維林(ribavirin)較佳於投予本發明之活性劑之前 經歷24週至48週處理。用於治療與乳頭狀瘤病毒感染相關 聯之病症,本發明之方法或用法可結合燒钱手術,諸如回 20 路電氣手術切除。根據本發明之方法或用法也可結合免疫 刺激劑進行,諸如細胞激素(例如11^2、11^7、11^15、11^18、 IL-21、IFNg)或自殺基因產物(例如HSV-1之胸腺答激酶, 述於Caruso等人,1993,Proc· Natl· Acad· Sci. USA 90, 7024-28 ; FCU-1述於W099/54481)或可表現此等多肽之載 50 200844231 5
>7; 71
10 15
20 接種追加接種治療模型進杆 ^ ' 了根據初次 4T包含循序投予初 成物及追加接種成物。典型地 :=劑組 加接種組成物錢用不__,其包 /成物及追 通用之抗雜钱部位。本發明之方法及心’至少一個 咖投予初次接種組成物接著為丨次至叫^含= 組成物。較佳注射間隔為丨日至,月。較佳= 加接種 或4次循序投予初次接種劑,個別 、匕括3次 週)之不等時間,接著於末次网开幻〇日(例如1 週,投予⑽編接㈣後1週至數 =加接種a成物可精㈣投或藉列投藥途 同一個位置或交替位置。例如美 予 途徑投藥,而基於載體之*且成::夕之、、且成物可藉黏膜 戰版之組成物較佳係藉注射投筚, MVA載體餘皮下注射,DNA質體或腺病毒載體係藉肌肉 注射投予。本發明之魏、«性齡餘成物可用於接 受治療的個體初次接種或追加接種或初次接種與追加接種 免疫反應二者。於-個實施财,初次接㈣使用本發明 之貝體載體進打,*追加接觀使財發明之牛痘病毒傳 染性顆粒進行。於另—個實關巾,初讀_使用本發 明之腺病毒傳染性顆粒進行,*追加接種係使用本發明之 牛痘病毒傳染性顆粒進行。於又另—個實施例巾,初次接 種係使用本發日狀牛痘病毒傳染關粒猶而追加接種係 使用本發明之腺病毒傳染性顆粒進行。 51 200844231 已經以舉例說明之方式說明本發明,但須瞭解所使用 之術語意圖供說明目的而非限制性。顯然鑑於前文教示對 本發明可做出多項修改及變化。因此須瞭解於隨附之申請 專利範圍,本發明可以此處特別說明之不同方式實施。 5 前文引述之全部專利案、公開文獻及資料庫之登錄項 目全文以引用方式併入此處彷彿該等個別專利案、公開文 獻或登錄項目係特別且個別指示供併入此處以供參考。 圖式簡單說明 第1圖顯示(A)存在於(a)天然HPV-16 E1序列終點及(b) 10天然HPV-16 E2序列起點之59個核苔酸與⑻存在於⑷天然 HPV-16 E1序列終點或存在於天然訊^6 E2序列起點及⑻ SEQIDNO:9之59個核苷酸之序列校準。 ' 第2圖顯示(A)秘編碼序列與(抝 HPV-16 E6編碼序列與sEQ仍N〇:丨4間之序列校準。 15 I:實施方式】 下列實例舉例說明本發明。 實例 下述組成係根據述於Maniatis等人(1989,實驗室手 冊,冷泉港實驗室出版社,紐約州冷泉港)之通用遺傳工程 2〇及分子選殖技術進行,或當使用商業套件組時係根據製造 商之推薦進行。PCR擴增技術為熟諳技藝人士 6知(例如# 考PCR方案-方法及應用指南,199〇年,Innis、Gdfand、
Sninsky及White公開,學術出版社)。攜帶安比西林 (ampicillin)抗藥性基因之重組質體於大腸桿菌C6〇〇 (史特 52 200844231 5 拉基因公司(3加13861^))、3乃183(1^1^1^11,1983,九]^〇1· Biol. 166, 557-580)及NM522於瓊脂上或補充100微克/毫升 抗生素之液體培養基中複製。重組牛痘病毒之組成係根據 前文引述之文件中之業界習知技術以及於Mackett等人 (1982, Proc· Natl. Acad· Sci· USA 79, 7415-7419)及Mackett 等人(1984, J· Virol· 49, 857-864)進行。大腸桿菌(Falkner及 Moss,1988, J. Virol· 62, 1849-1854)之選擇基因 gpt(黃嘌呤· 鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶)用來協助重組牛痘病毒的選擇。 • 實例1:表現HPV-16E1基因及E2基因之MVA載體之組 10 成(MVATG17410) a)編碼HPV-16 E2基因之重組MVA載體之組成 (MVATG17408) HPV16 E2基因之選殖 編碼HPV-16 E2之核苷酸序列係由分離自CaSKi細胞 : 15 • (ATCC CRL-1550)之基因體DNA選殖。E2基因係使用引子 OTG16809 (SEQ ID NO:16)及OTG16810 (SEQ ID NO:17)擴 增。所得片段藉BamHI及EcoRI消化且***由相同酶所限剪 的pGEX2T (阿默山生科公司(AmersllamBiosciences)),獲得 PTG17239。經選殖之E2基因之定序係使用比較HPV16 E2 20 原型序列(述於基因存庫NC-01526)之五項突變。兩項突變 為靜默,而三項非靜默突變(T210I、S219P、K310T)係使用 快速改變位置導向突變發生(QuickChange Site Directed Mutagenesis)套件組(史特拉基因公司)校正,獲得 pTG17268。 53 200844231 HPV-16 E2多肽之改性 結合入pTGl7268之E2核苷酸序列係藉位置導向突變 發生改性,來產生HPV-16 E2變異株(E39A及I73A),標示為 E2*°特定言之,經由以Aia取代位置39之Glu殘基來消除E2 5 複製功能,以及經由以Ala取代於位置73之lie殘基來消除轉 活化功能。所得質體pTG17318包含編碼HPV-16 E2*之改性 序列。 HPV-16 E2*進一步改性方式係於其N端融合至一胜肽 信號’而於其C端融合至衍生自狂犬病病毒(PG種系;基因 10 存庫ay009097)之糖蛋白之膜定錨序列,因而指導HPV-16 E2*呈現於表現宿主細胞之胞質膜表面。編碼膜呈現E2缺陷 變異株之核苷酸序列(SEQ ID NO:12)標示為SS-E2*-TMR 使用下列引子OTG17500 (SEQ ID NO:18)、OTG17501 (SEQ ID NO:19)、OTG17502 (SEQ ID NO:20)、OTG17503 (SEQ 15 ID NO:21)、OTG17504 (SEQ ID NO:22)及OTG17505 (SEQ ID NO:23)藉三重PCR重新組裝。重新組裝後之序列*** PBS衍生載體(史特拉基因公司)來獲得pTG17360,然後選殖 於PH5R啟動基因下游之牛痘轉移質體(R0sei等人,1986, J Virol· 60, 436-449),獲得pTG17408。 20 轉移質體設計來允許欲藉此轉移之核苗酸序列***供 於MVA基因體刪失III之同源重組。其係源自於質體PTG1E (述於Braun等人,2000,基因治療7, 1447-57),於該質體中 選殖環繞MVA刪失III之旁出序列(BRG3及BRD3),該等序 列係藉PCR而得自 MVATGN33.1 DNA (Sutter及Moss,1992, 54 200844231
Piroc· Natl· Acad· Sci· USA 89, 10847-51)。轉移質體也含有 於早期晚期牛痘病毒合成啟動基因ρ11Κ7·5 (由羅珊大學R· Wittek善思供)之控制之下,於經過Ae(jU〇rea vict〇ria加強 之綠螢光蛋白(eGFP基因,單離自pEGP-C1,複製科技公司 5 (clontech))與大腸桿菌黃噪呤-鳥嗓呤磷酸核糖基轉移酶基 因(gpt基因)間之融合。黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶合 ·— 成允許來於含有黴酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤 之選擇性培養基中形成溶菌斑(Falkner等人,1988, j. vir〇1· • 62, 1849_54);而沿卩?允許重組MVA溶菌斑變成目視可見。 10選擇標記eGPP-GPT於相同方向置於兩個同源序列間。當達 成純株選擇時,選擇標記容易藉數次繼代培養去除,而未 '選擇允許eGPP-GPT重組MVA之生長。 可表現HPV-16 S S-E2* -TMR基因之重組MVA之組成 MVATG17408病毒之生成方式係經由於感染 : 15 MVATGN33.1 (於ΜΟΙ=〇·1 pfu/細胞)之一次雞胚纖維母細 - 胞(CEF)中進行同源重組,以及以PTG17408轉移感染(根據 ® 標準麟酸鈣DNA沉澱)進行。病毒選擇係經由於含黴酚酸、 黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇性培養基存在下,藉三回合溶菌 斑純化進行。如前述,隨後經由於非選擇性培養基中繼代 2〇 培養去除選擇標記。藉PCR證實不存在有親代MVA的污染。
E2表現之分析係藉西方墨點進行。CEF係以 MVATG17408於ΜΟΙ=0·2感染,24小時後收穫細胞。使用市 售單株抗Ε2抗體TVG271 (亞博康公司(Abeam))進行西方墨 點分析。檢測有名目分子量55 kDA之蛋白質表現,E2*-TMR 55 200844231 之理論分子量為48·9 kDa。使用糖基内切酶F處理細胞萃取 物後,觀察重組蛋白質尺寸的縮小,提示由MVATG17408 所表現之E2*TMR多肽為N-糖化。 b)編碼於與HPV-16 E2基因重疊部分簡併的HPV-16 5 E1基因之重組MVA之組成(MVATG17409) 編碼HPV-16 Ε1多肽之核苷酸序列係由CaSKi細胞 DNA(ATCC CRL-1550)選殖。特定言之,E1基因於二部分 Ela (nt 1 至 1102)及 Elb(nt 1001 至 1950)擴增。引子 OTG16811 (SEQ ID ΝΟ··24)及OTG16814 (SEQ ID ΝΟ··25)用 10 於擴增Ela片段,藉BamHI及EcoRI消化且***於藉相同酶 所限剪的PGEX2T,獲得pTG17240。Elb片段係使用 OTG16813 (SEQ ID ΝΟ··26)及OTG16812 (SEQ ID NO:27)產 生,且藉BamHI及EcoRI消化,隨後***pGEX2T,獲得 PTG1724卜定序顯示比較HPV-16 E1原型序列(述於基因存 15庫NC-01526)有四個突變。一個突變為靜默,三個非靜默突 變存在於Ela (K130Q、N185T及T220S)係藉位置導向突變 發生校正。然後經由於藉BsrGI及EcoRI消化之pTG1724l中 選殖經過校正後之Ela片段,重新組裝完整E1基因。所得質 體定名為PTG17289。 20 於基因體中,E1基因之59個最末核苷酸係與E1 基因之59個第一核苷酸相同,為了防止於耵及£2編碼MVA 載體之製造期間之不安定問題,此E1編碼序列部分係藉密 碼子使用改性修改,來降低與E2編碼序列之序列同源性。 經由使用簡併的引子OTG17408 (SEQ ID n〇:28)及 56 200844231 OTG17409 (SEQ ID NO:29)擴增El基因3,端,獲得簡併的序 列(SEQ IDNO:9)。擴增後的片段藉”沿及抑瓜消化,以及 ***於藉相同酶所限剪之pTG17289内,獲得pTG17340。 HPV-16簡併的El序列也藉位置導向突變來突變,俾便 5 經由以AsP殘基取代ΗΡΛΜ6 E1之位置482之Gly殘基, (G482D ;此處也定名為E1*)來消除編碼之Ei多肽之複製功 ~ 能,結果獲得PTG17373。 HPV-16 Eldeg*序列也經改性,經由與衍生自狂犬病病 _ 毒(ERA單離株;說明於基因存庫n。M38452)之糖蛋白之膜 10定錨胜肽融合,來指導於漿細胞表面之編碼多肽之表現。 SS-Eldegί^TMR序列(SEQIDNO··10)係經由使用下列引子 藉三重 PCR 重新調整:OTG17560 (SEQ ID ΝΟ··30)、 OTG17561 (SEQ ID ΝΟ:31)、OTG17562 (SEQ ID ΝΟ:32)、 OTG17563 (SEQ ID NO:33)、OTG17564 (SEQ ID NO:34)及 : 15 OTG17565 (SEQ IDNO:35)。所得片段***於經pBS衍生之 : 載體(史特拉基因公司)來獲得pTG17404。然後 _ SS-Eldeg*-TMR序列選殖入Ρ7·5Κ啟動基因下游之牛痘轉 移質體(Cochran等人,1985,J. Virol· 54,30-7),獲得 PTG17409。 2〇 MVATG17409病毒之產生係於CEF藉前述同源重組進 行。 c)編碼HPV-16 E1基因及E2基因之重組MVA之組成 (MVATG17410) 由ρ7·5Κ啟動基因所控制且已經經過定序之 57 200844231 SS-Eldeg*-TMR係單離自 pTG17409且***於pTG17408,獲 得 pTG17410。 MVATG17410病毒之產生係於CEF藉前述同源重組進 行。 5 實例2:編碼HPV-18 E1基因及E2基因之MVA載體之組 成(MVATG17582) HPV-18 E1基因及E2基因係使用合成基因重新組成,寡 核苷酸經設計,因而⑴將天然HPV-16序列與HPV-18序列間 所共享之同源性部分之同源性百分比降至低於750/〇 10 (HPV-16及HPV-18 E1基因及E2基因之序列經校準,募核答 酸經設計,來將同源性降至少於5個連續核苔酸);(ii)將存 在於天然HPV-18 E1序列之3,端及HPV-18 E2序列之5,端二 者之該59核苷酸部分間之同源性降至低於75% ;以及(ii)導 入突變來消除HPV-18E1基因及E2基因產物之酶催化功能 15 (E1:G489D,E2:E43A及I77A)。 HPV-18 degEl*序列係經由組裝50募核誓酸,於pBS載 體中選痩來獲得pTG17473而重新組成。然後E1序列係藉三 重PCR,使用引子OTG15315 (SEQ ID NO:36)、OTG17881 (SEQ ID NO:37)、OTG17882 (SEQ ID NO:38)、OTG17883 20 (SEQ ID NO:39)、OTG17884 (SEQ NO:40)及OTG17885 (SEQ ID NO:41)融合至得自麻療病毒ρ蛋白質 (SS-18Eldeg*-TMF)之信號序列純株。所得片段(seq Π) NO: 11)於ρ7·5Κ啟動基因之控制之下選殖入MVA轉移載體 來產生PTG17521。 58 200844231
HPV-18 degE2*序列係經由組裝26寡核苷酸,且選殖入 pBS載體,獲得pTG17498來重新組成。與狂犬病病毒(ERA 種系;基因存庫n°M38452)之糖蛋白之信號胜肽及膜定錨胜 肽融合,係藉三重PCR,使用引子OTG17875 (SEQ ID 5 NO:42)、OTG17876 (SEQ ID NO:43)、OTG17877 (SEQ ID NO:44)、OTG17878 (SEQ ID NO:45)、OTG17879 (SEQ ID NO:46)及OTG17880 (SEQ ID NO:47)進行。SS-18E2*-TMR 卡匣係***於pH5R啟動基因下游之MVA轉移質體,獲得 PTG17552。最後,p7.5K-SS-Eldeg*-TMF 卡匣係由 10 pTG17521 單離且***於pTG17552,獲得pTG17582。 重組 MVATG17521、MVATG17552、及 MVATG17582 之產生係如前文說明進行。 實例3 :表現HPV-16及HPV-18 E1基因及E2基因之多 價MVA載體之組成(MVATG17583)
15 p7.5K-SS-18Eldeg*-TMF卡匣及 pH5R-SS-18E2*-TMR 卡匣係***於pTG17410 (含有p7.5K-SS-16Eldeg*_TMR卡 匣及pH5R-SS-16E2*-TMR卡匣),所得轉移質體定名為 PTG17583。MVATG17583之產生係如前文說明進行。 實例4:表現HPV16及HPV18E6基因及E7基因之一多 20 價重組病毒之組成 MVATG16327 為表現HPV-16及HPV-18 E6 多肽及 E7 多 肽之膜定錨變異株及非致癌變異株之一重組MVA病毒。E6 及E7核苷酸序列經突變,來去除其致癌性質(E6*及E7*), 融合至編碼適當信號胜肽及膜定錨胜肽(E6*tm、E7*tm)之 59 200844231 序列。更特定言之,HPV-18E7*與麻疹病毒F糖蛋白之信號 胜肽及膜定錨胜肽分別融合於其N端及c端;而HPV-16 E6*、HPV-16 E7*及HPV-18 E6*係於衍生自狂犬病病毒糖 蛋白之信號胜肽及膜定錯胜肽融合於其N端及C端。此外, 5 HPV-iS E6及E7核苷酸序列進一步藉密碼子使用改性修 改,來降低與其HPV16對偶之同源性。用於此項目的,天 然HPV16基因及HPV18基因之序列經校準,進行基因簡併 來將同源性減至少於5個連續核苷酸。於該載體中,HPV-16 及HPV-18 E6序列彼此相反方向皆係處於p7.5K啟動基因之 10 控制之下;而HPV-16及HPV-18 Ε7序列係藉Η5R啟動基因驅 動,全部表現卡匣皆係***MVA基因體之切除區III。 a) HPV-16E7*tm表現卡匣之組成 HPV-16 E7基因係分離自Caski細胞且經修改來編碼非 致癌性及膜呈現之E7多肽(16E7*tmR),如WO99/03885所 15 述。非致癌性突變係經由刪失胺基酸殘基21-26 (△ DLYCYE)進行;而膜呈現係經由E7*突變序列分別融合至 編碼選殖自狂犬病病毒糖蛋白(ERA種系;基因存庫存取號 碼M38452)之信號胜肽及膜定錨胜肽之編碼序列之5,端及 3’端進行。所得序列係於早期-晚期pH5R啟動基因之控制之 20 下選殖(Rosel等人,1986, J Virol· 60, 436-9),卡匣導入經 pBS衍生之載體,獲得pTG16161。 b) HPV-16 E6*tm及HPV-18 E6*tm表現卡匣之選殖 HPV-16 E6基因經單離及改性,因而編碼非致癌性及膜 呈現之E6多肽,如WO99/03885所述。非致癌性突變係經由 60 200844231 刪除胺基酸殘基118-122進行(ACPEEK);膜呈現係經由將 經過E6*突變之序列分別融合至衍生自狂犬病病毒糖蛋白 (PG種系;基因存庫存取號碼ay009097)之信號胜肽及膜定 錨胜肽之編碼序列之5’端及3’端進行。係經由將E6*-突變序 5 列***於含有信號胜肽與膜定錨胜肽由BamHI位置分開之 ’ 一載體内,獲得PTG16097。 合成HPV-18 E6序列係經由組裝寡核苷酸〇tg15174 (SEQ ID NO:48)、OTG15175 (SEQ ID NO:49)、OTG15176 _ (SEQ ID NO:50) ' OTG15177 (SEQ ID NO:51)、OTG15178 10 (SEQ ID NO:52)、OTG15179 (SEQ ID NO:53)、OTG15180 (SEQIDNO:54)及OTG15181(SEQIDNO:55)產生。募核苷 酸係設計成導入編碼胺基酸殘基113-117之密碼子刪失(非 致癌突變ΔΗΡΑΕΚ),以及簡併密碼子的使用來減少與 HPV-16 Ε6基因之同源性(簡併性序列)。所得合成序列然後 ' 15 分別與編碼衍生自狂犬病病毒糖蛋白基因之信號胜肽及膜 - 定錯胜肽序列,分別融合於其5’端及3’端,來獲得SEQ Π) • ^〇:14所示序列,獲得?丁〇16160。11?¥46£6*加11及11?¥-18 degE6*tmR序列係於相反方向***,各自係於ρ7·5Κ啟動基 因之控制之下。然後卡匣導入pTG16161來產生pTG16215。 20 c) HPV-18 E7*tmF表現卡匣之選殖 經由組裝寡核苷酸OTG14773 (SEQ ID NO:56)、 OTG14774 (SEQ ID NO:57)、OTG14775 (SEQ ID ΝΟ··58)、 OTG14776 (SEQ ID NO:59)、OTG14777 (SEQ ID NO:60)及 OTG14778 (SEQ ID NO:61),產生一合成HPV-18 E7序列。 61 200844231
募核苔酸係設計成導入胺基酸殘基24_28 (非致癌突變△ DLLCH)之編碼密碼子的刪失,以及簡併密碼子的使用,來 降低與HPV-16E7基因之同源性(簡併性序列)。然後所得合 成序列與由麻疹病毒F蛋白基因所選殖之信號胜肽及膜定 5銷胜肽之編碼序列分別融合於其5,端及3,端(說明於EP 0305229)。所得序列(SEQ ID NO:15)於pH5R啟動基因之控 制之下選殖,卡匣被導入經pBS衍生載體來產生pTG16015。 d)轉移質體PTG16327之組成 轉移質體PTG6019 (述於WO99/03885之實例2)含有旁 10出於MVA删失III之同源序列。如下修改。經由將引子 OTG15040 (SEQ ID NO:62)與OTG15041 (SEQ ID NO:63)雜 交所得之合成多鏈接劑導入由BamHI及SacI所消化之 pTG6019,獲得pTG16007。含有處於早期-晚期PH5R啟動 基因控制之下之大腸桿菌gpt編碼之表現卡匣之sacl-Sacl片 15 段係由PTG14033單離(述於EP 1 146 125之實例2),且導入 藉SacI所消化之PTG16007,獲得pTG 16093。黃嘌呤-鳥嘌呤 磷酸核糖基轉移酶之合成,允許GPT+重組MVA於含有黴酚 酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇性培養基形成溶菌斑(Falkner 等人,1988, J· Virol· 62, 1849-54)。選擇標記GPT位於相同 20 方向之兩個同源性序列間。當達成純株選擇時,藉數次繼 代培養容易消除選擇標記,無需選擇來允許GPT重組MVA 之生長。 含有HPV-18 degE7*TMF表現卡匣之Hindlll-Smal片段 係單離自PTG16015,導入藉相同酶消化之PTG16093,獲得 62 200844231 pTG16105。另一方面,pTG16215係藉Sail及EcoRI消化, 以T4 DNa聚合酶處理,所得含有HPV-16 E7*tmR、HPV-16 E6*tmR、及HPV-18 degE6*TMR表現卡匣之片段係導入藉 Smal消化之pTG16105,結果獲得pTG16327 (第2圖)。 5 e) MVATG16327之生成 MVATG16327之生成係經由於一次雞胚纖維母細胞 (CEF)同源重組進行。用於此項目的,pTG16327根據標準 磷酸鈣DNA沉澱而轉感染至先前以MVATGN33.1於 ΜΟΙ=0· 1 pfu/細胞感染之CEF上。病毒選擇係經由於含有黴 10 酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇培養基存在下,於CEF上 經歷三回合溶菌斑純化進行。然後經由於非選擇性培養基 中繼代培養去除選擇標記。藉PCR證實不存在有被親代 MVA污染。 基因表現之分析係藉西方墨點進行。CEF係使用 15 MVATG16327於ΜΟΙ=〇·2感染,經24小時後,收穫細胞。使 用抗HPV-16及HPV-18 Ε6蛋白質及Ε7蛋白質之兔多株抗體 進行西方墨點分析。結果顯示全部HPV多肽皆係由 MVATG16327正確表現。 f) MVATG16327之遺傳安定性研究 20 於以ΜΟΙ=10·2 i>fu/細胞及1(T4 pfu/細胞感染之CEF上 進行5次MVATG16327之繼代培養。於單離自研究備料之5 次繼代培養之100個病毒純株評估遺傳安定性。使用兩種方 法· PCR擴增來判定表現卡匣之結構,藉西方墨點檢測抗 原。PCR分析結果顯示99%純株含有感興趣之表現卡g。免 63 200844231 疫檢測顯示97%純株表現四種抗原:HPV-16及 HPV-18E6*tm 及 E7*tm多肽。 此等分析顯示5次繼代培養後證實97%純株衍生自 MVATG16327,指示此種組成體有良妤遺傳安定性。 5 實例5 ··表現HPV-16、HPV-18、HPV-33及HPV-52 E2 基因之多價MVA載體之組成 編碼HPV-33 E2多肽之合成基因係由基因藝術公司 (Geneart)(德國瑞金堡)合成。合成序列係設計成⑴與得自 HPV-16、HPV-18及HPV-52之E2基因之同源性百分比降至低 10 於75% (若屬可能,減少同源部分至少於6個連續核苷酸); 以及(ii)導入可消除HPV-33基因產物之酶功能之突變(E39A 及I73A)。 然後HPV-33 degE2*序列與編碼狂犬病病毒(ERA種 系;基因存庫n° M38452)之糖蛋白之信號胜肽及膜定錨胜 15 肽之核苷酸序列融合。此融合係藉三重PCR,使用引子 OTG18962 (SEQ ID NO:72)、OTG18963 (SEQ ro NO:73)、 OTG18964 (SEQ Π) NO:74)、OTG18965 (SEQ ID NO:75)、 OTG18966 (SEQ ID ΝΟ··76)及〇TG18967 (SEQ ID N〇:77)進 行。所得編碼SS-33degE2*-TMR多肽之片段(SEQ ID NO:67) 20於Ρ7·5Κ啟動基因之控制之下選殖於MVA轉移載體,如前文 舌兄明產生病毒顆粒。 編碼HPV-52 E2多肽之合成基因係由基因藝術公司(德 國瑞金堡)合成。合成序列係設計成⑴與得自Hpv-i6、HPV-18 及HPV-33之E2基因之同源性百分比降至低於75% (若屬可 25能,減少同源部分至少於6個連續核苷酸);以及(ii)導入可 64 200844231 消除HPV-52基因產物之酶功能之突變(E39A及173A)。 然後合成HPV-52 E2*deg序列使用引子OTG18968 (SEQ ID NO:78)、OTG18969 (SEQ ID NO:79)、OTG18970 (SEQ ID NO:80)、OTG18971 (SEQ ID NO:81)、OTG18972 5 (SEQ ID NO:82)及OTG18973 (SEQ ID NO:83),藉三重 PCR,與編碼麻疹病毒F蛋白質之信號胜肽及膜定錨胜肽之 核苷酸序列融合(獲得SS-52E2*deg-TMF)。 所得編碼SS_52E2*deg-TMF多肽之片段(SEQ ID NO:69)於ρ7·5Κ啟動基因之控制之下選殖於MVA轉移載 10 體,如前文說明產生病毒顆粒。 編碼膜呈現及酶催化缺陷HPV-18 E2多肽之 pH5R-SS-18E2*-TMR卡匣(單離自PTG17552)、編碼膜呈現 及酶催化缺陷 HPV-33 E2 多肽之p7.5K-SS-33degE2*-TMR 卡匣及編碼膜呈現及酶催化缺陷HPV-52 E2多肽之 15 p7.5K-SS-52degE2*-TMF卡匣導入pTG17408 (含有 pH5R-SS-16E2*-TMR卡匣),如前文說明生成病毒顆粒。 【圖式簡單說明】 第1圖顯示(A)存在於⑻天然HPV-16 E1序列終點及(b) 天然HPV-16 E2序列起點之59個核苷酸與(B)存在於(a)天然 2〇 HPV-16 E1序列終點或存在於天然HPV-16 E2序列起點及(b) SEQ ID NO:9之59個核苷酸之序列校準。 第2圖顯示(A) HPV-16與HPV-18 E6編碼序列與(B) HPV-16 E6編碼序列與SEQ IDNO:14間之序列校準。 【主要元件符號說明】 (無) 65
Claims (1)
- 200844231 十、申請專利範圍: 1. 一種載體,包含編碼一第一多肽之至少一個第一核酸分 子及編碼一第二多肽之一個第二核酸分子,其中: -該第一核酸分子及該第二核酸分子分別係得自於 5 於40個或更多個連續核苷酸部分具有約80%或大於80% 之同源性百分比之一第一天然核酸序列及一第二天然 核酸序列,以及 -包含於該載體中之該第一核酸分子及/或該第二 核酸分子經修改,因而將該同源性百分比降至低於 10 75%。 2·如申請專利範圍第1項之載體,其中該第一核酸分子或 該第二核酸分子或該第一及第二核酸分子二者之密碼 子使用樣式至少於該40個或以上連續核苷酸之同源性 部分經修改,因而將同源性百分比降至低於75%。 15 3·如申請專利範圍第2項之載體,其中該密碼子使用樣式 係於核苔酸層面經修改,且該修改於胺基酸層面為靜 4·如申請專利範圍第2或3項之載體,其中該密碼子使用樣 式之修改方式為該第一核酸分子與第二核酸分子間之 20 同源性部分係限於少於8個連續核苷酸。 5·如申請專利範圍第4項之載體,其中該密碼子使用樣式 之修改方式為該第一核酸分子與第二核酸分子間之同 源性部分係限於少於5個連續核苷酸。 6.如申請專利範圍第1至5項中任一項之載體,其中該載體 1 200844231 為一腺病毒載體。 7·如申請專利範圍第6項之載體,其中該腺病毒載體為複 4缺陷型。 8·如申請專利範圍第1至5項中任一項之載體,其中該載體 為一痘病毒載體。 9·如申請專利範圍第8項之載體,其中該痘病毒載體係得 自選自於由哥本哈根(Copenhagen)種系、惠氏(Wye⑻ 種系、NYVAC及高度減毒改性安卡拉(Ankara) (MVA) 種系所組成之組群之一牛痘病毒。 10·如申請專利範圍第項中任一項之載體,其中該第一 核酸分子及該第二核酸分子分別編碼選自於由免疫原 性多肽及抗腫瘤多肽所組成之組群之一多肽。 U•如申請專利範圍第1至10項中任一項之載體,其中該第 核酸分子及該第二核酸分子係得自於相同有機體戋 密切相關之有機體。 12.如申請專利範圍第n項之載體’其中該有機體為乳頭狀 瘤病毒,以及該第一核酸分子及該第二核酸分子各自編 石馬一乳頭狀瘤病毒多肽。 13·如申請專利範圍第12項之載體,其中該第一核酸分子及 2〇 該第二核酸分子分別係得自選自於由Hpv]6、 HPV-18、HPV-30、HPV-3卜 HPV-33、HPV-35、HPV-39、 HPV-45、HPV-5卜 HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、 HPV-66、HPV_68、HPV-70及HPV_85所組成之組群之一 高風險性乳頭狀瘤病毒。 ‘ 2 200844231 5 14.如申請專利範圍第12或13項之載體,其中該第一核酸分 子及該第二核酸分子分別編碼選自於由El、E2、E6及 E7所組成之組群中之一早期乳頭狀瘤病毒多肽。 15·如申請專利範圍第12至14項中任一項之載體,其中該第 一核酸分子及該第二核酸分子編碼得自相同HPV血清 型之至少兩種不同乳頭狀瘤病毒多肽。 16.如申請專利範圍第15項之載體,其中該第一核酸分子編 • 碼E1多肽,及該第二核酸分子編碼E2多肽。 17·如申請專利範圍第16項之載體,其中該第一核酸分子編 10 萼 碼包含於SEQ ID NO:5所示之胺基酸序列之一多肽,及 該第二核酸分子編碼包含於SEQ ID NO:7所示之胺基酸 序列之一多肽。 18.如申請專利範圍第16項之載體,其中該第一核酸分子編 碼包含於SEQ ID NO:6所示之胺基酸序列之一多肽,及 " 15 • 該第二核酸分子編碼包含於SEQ ID NO:8所示之胺基酸 序列之一多肽。 19·如申請專利範圍第16至18項中任一項之載體,其中該載 體包含於SEQIDNO:9所示核苷酸序列。 20·如申請專利範圍第17或19項之載體,其中該第一核酸分 20 子包含於SEQ ID NO:10所示之核苷酸序列以及其中該 第二核酸分子包含於SEQ ID ΝΟ··12所示之核苷酸序列。 21.如申請專利範圍第18項之載體,其中該第一核酸分子包 含於SEQ ID ΝΟ:11所示之核苷酸序列以及其中該第二 核酸分子包含於SEQIDNO.13所示之核苷酸序列。 200844231 22.如申請專利範圍第2〇或21項之載體,其中該載體為%^ 載體,該第一核酸分子係處於牛痘7.5&啟動基因之控制 之下,而該第二核酸分子係處於牛痘H5R啟動基因之控 制之下,以及該第一及第二核酸分子皆係***該MVA載 體之刪失III。 23·如申請專利範圍第16項之載體,其中該載體包含編碼 HPV-16 E1多肽之一第一核酸分子、編碼Hpv]6 E2多肽 之一第二核酸分子、編碼HPV-18 El多肽之一第三核酸 为子、及編碼HPV-l8 E2多肽之一第四核酸分子·,以及 其中該第一、第二、第三及第四核酸分子並未包含具有 同源性百分比為75%或大於75%之一 40或以上連續核苔 酸部分。 24·如申請專利範圍第23項之載體,其中該抑%16 m多肽 包含於SEQ ID NO:5所示胺基酸序列,該HPV-16 E2多肽 包含於SEQ ID NO:7所示胺基酸序列,該Ηρν·ΐ8 E1多肽 包含於SEQ ID NO:6所示胺基酸序列,及/或該hpv-18 E2多肽包含於SEQIDN0..8所示胺基酸序列。 25·如申请專利範圍第24項之載體,其中該载體包含包含於 S E Q ID N 0:10所示核苷酸序列之一第—核酸分子,包含 於SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列之一第二核酸分子,包 含於SEQ ID ΝΟ:11所示核苷酸序列之一第三核酸分 子,及包含於SEQIDN0:13所示核苷酸序列之一第四核 酸分子。 26♦如申請專利範圍第23至26項中任一項之载體,其中該載 200844231 體為一MVA载體,該第一、第二、第三及第四核酸分子 係導入該MVA載體之刪失III,該第一核酸分子及該第三 核酸分子係位於相反方向,各自係於牛痘ρ7.5Κ啟動基 因之控制之下,以及該第二核酸分子及該第四核酸分子 5 係位於相反方向,各自係於牛痘pH5R啟動基因之控制 之下。 27.如申請專利範圍第12至14項中任一項之载體,其中該第 一核酸分子及該第二核酸分子編碼得自密切相關HPV 血清型之至少相同多肽。 10 28·如申請專利範圍第27項之載體,其中該等密切相關HPV 血清型為HPV-16、HPV-18、HPV-33及/或HPV-52。 29·如申請專利範圍第28項之載體,其中得自密切相關有機 體之該相同多肽為E2多肽。 30.如申請專利範圍第29項之載體,其中該載體包含編碼 15 HPV-16 E2多肽之一第一核酸分子、編碼HPV-18 E2多肽 之一第二核酸分子、編碼HPV—33 E2多肽之一第三核酸 分子、及編碼HPV-52E2多肽之一第四核酸分子。 31·如申請專利範圍第30項之載體,其中該HPV-16 E2多肽 包含於SEQ IDNO:7所示胺基酸序列,該HPV-18 E2多肽 20 包含於SEQ IDNO:8所示胺基酸序列,該HPV-33 E2多肽 包含於SEQIDNO:70所示胺基酸序列,及該HPV-52E2 多肽包含於SEQIDNO:71所示胺基酸序列。 32·如申請專利範圍第30或31項之載體,其中該載體包含包 含於SEQ ID NO:12所示核苷酸序列之一第一核酸分 200844231 子,包含於SEQIDNO:13所示核苷酸序列之一第二核酸 分子,包含於SEQ ID NO:67所示核苷酸序列之一第三核 酸分子,及包含於SEQ ID ΝΟ··69所示核苷酸序列之一第 四核酸分子。 5 33·如申請專利範圍第27或28項之載體,其中得自密切相關 有機體之該相同多肽為Ε6多肽、Ε7多肽或Ε6多肽及Ε7 多肽二者。 34.如申請專利範圍第33項之載體,其中該第一核酸分子編 碼HPV-16 Ε6多肽,及該第二核酸分子編碼HPV-18 Ε6 1〇 多肽’其中該第二核酸分子包含於SEQ ID NO: 14所示之 该核酸序列。 35·如申請專利範圍第33項之載體,其中該第一核酸分子編 碼HPV-16 E7多肽,及該第二核酸分子編碼hpv-18 E7 多月太’其中該第二核酸分子包含於证卩ID No: 15所示之 15 該核酸序列。 36·如申請專利範圍第34或35項之載體,其中該載體為mva 載體,該第一核酸分子係處於牛痘7·5Κ啟動基因之控制 之下,而該第二核酸分子係處於牛痘H5R啟動基因之控 制之下,以及該第一及第二核酸分子皆係***該mva載 20 體之刪失ΠΙ。 A如申請專利範圍第則之載體,其中該載體包含編碼 HPV-16 E6多肽之-第-核酸分子、編碼Hpv_18 E6多肽 之一第二核酸分子、編碼HPV_16 E7多肽之一第三核酸 分子、及編碼HPV_18 E7多肽之一第四核酸分子;以及 6 200844231 其中該第一、第二、第三及第四核酸分子並未包含具有 同源性百分比為75%或大於75%之一40或以上連續核苷 酸部分。 38. —種實質上經單離之核酸分子,包含於SEQ ID NO:6、 5 10、η、12、13、14、15、66、67、68或69 中之任一者 所示之該核苔酸序列。39. —種宿主細胞,包含如申請專利範圍第38項之核酸分子 或如申請專利範圍第1至37項中任一項之載體。 40. —種藥學組成物,包含治療有效量之如申請專利範圍第 10 38項之核酸分子、如申請專利範圍第1至37項中任一項 之載體或如申請專利範圍第39項之宿主細胞及藥學上 可接受之載媒劑。 41·如申請專利範圍第40項之藥學組成物,其中該組成物包 含適合於人體系統性投藥或黏膜投藥之一種或多種輔 15 劑。42. 如申請專利範圍第41項之藥學組成物,其中該辅劑為咪 ϋ坐并σ奎琳化合物。 43. —種如申請專利範圍第38項之核酸分子、如申請專利範 圍第1至37項中任一項之載體、如申請專利範圍第39項 20 之宿主細胞或如申請專利範圍第40至42項中任一項之 組成物用於製備意圖供治療或預防傳染病、癌症或免疫 缺乏病症之藥物之用途。 44·如申請專利範圍第43項之用途,其係用於與受乳頭狀瘤 病毒感染相關聯之病情諸如持續性感染、惡性前期病灶 200844231 及惡性病灶之預防性處理或治療性處理。 45.如申請專利範圍第43或44項之用途,其中該用途係根據 初次接種追加接種治療模型進行;以及其中該載體或組 成物係用於一個體初次接種免疫反應或追加接種免疫 5 反應或初次接種與追加接種免疫反應。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP07360019 | 2007-05-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW200844231A true TW200844231A (en) | 2008-11-16 |
Family
ID=39522406
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW097103228A TW200844231A (en) | 2007-05-15 | 2008-01-29 | Vectors for multiple gene expression |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8337859B2 (zh) |
EP (1) | EP2162544B1 (zh) |
JP (1) | JP5474767B2 (zh) |
KR (1) | KR101514473B1 (zh) |
CN (1) | CN101688223B (zh) |
AR (1) | AR065075A1 (zh) |
AU (1) | AU2008250520B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0810305A2 (zh) |
CA (1) | CA2686772C (zh) |
ES (1) | ES2416361T3 (zh) |
HK (1) | HK1135731A1 (zh) |
IL (1) | IL201963A (zh) |
MX (1) | MX2009012272A (zh) |
PE (1) | PE20090483A1 (zh) |
RU (1) | RU2462513C2 (zh) |
TW (1) | TW200844231A (zh) |
WO (1) | WO2008138648A1 (zh) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20100021603A (ko) | 2007-05-15 | 2010-02-25 | 트랜스진 에스.에이. | 신호전달 펩타이드 |
WO2010085660A2 (en) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Roger Williams Hospital | Viral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same |
EP2461826A2 (en) * | 2009-08-07 | 2012-06-13 | Transgene SA | Composition for treating hbv infection |
US8795684B2 (en) | 2010-04-16 | 2014-08-05 | Charite-Universitaetsmedizin Berlin | Agent for use in the topical or local treatment of cervical dysplasias |
GB201016471D0 (en) * | 2010-09-30 | 2010-11-17 | Isis Innovation | Viral vector immunogenic compositions |
WO2012145577A1 (en) * | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Merial Limited | Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile |
ES2646590T3 (es) * | 2012-01-24 | 2017-12-14 | Sanford Health | Polinucleótidos para el tratamiento de tumores positivos para polipéptidos víricos oncogénicos |
RU2684211C2 (ru) | 2013-02-21 | 2019-04-04 | Тёрнстоун Лимитед Партнершип | Композиция вакцины |
MX2017004729A (es) * | 2014-10-14 | 2018-01-09 | Univ Pennsylvania | Terapia de combinacion para usar en la terapia contra el cancer. |
ES2634802B1 (es) * | 2016-03-28 | 2018-07-03 | Victor Manuel GALVEZ JEREZ | Molécula de ácido nucleico y método para modificar de forma bialélica un gen diana o locus presente en el material genético de una célula |
CN109922829A (zh) * | 2016-05-02 | 2019-06-21 | 扬森疫苗与预防公司 | 治疗性hpv疫苗组合 |
BE1024774B1 (fr) * | 2016-09-29 | 2018-07-02 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Compositions et procedes de traitement |
EP3461497A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-03 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Viral antigens |
CN113227361A (zh) * | 2018-11-21 | 2021-08-06 | 梅奥医学教育及研究基金会 | 腺病毒和使用腺病毒的方法 |
KR20240086779A (ko) * | 2022-12-05 | 2024-06-19 | 경상국립대학교산학협력단 | 다중 단백질의 발현을 위한 신규 핵산 구조체 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9105383D0 (en) * | 1991-03-14 | 1991-05-01 | Immunology Ltd | An immunotherapeutic for cervical cancer |
EP0997462B1 (en) | 1997-06-30 | 2004-12-22 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Novel naphthyridine derivatives or salts thereof |
FR2766091A1 (fr) | 1997-07-18 | 1999-01-22 | Transgene Sa | Composition antitumorale a base de polypeptide immunogene de localisation cellulaire modifiee |
FR2774699B1 (fr) * | 1997-11-17 | 2003-10-03 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de reduction des evenements de recombinaison homologue |
US7001995B1 (en) * | 1999-08-25 | 2006-02-21 | Merck & Co., Inc. | Synthetic human papillomavirus genes |
ATE284898T1 (de) * | 1999-08-25 | 2005-01-15 | Merck & Co Inc | Synthetische papillomavirus gene, welche für expression in menschlichen zellen optimiert sind |
WO2003018055A1 (en) * | 2001-08-23 | 2003-03-06 | Merck & Co., Inc. | Vaccine using papilloma virus e proteins delivered by viral vector |
PL216760B1 (pl) * | 2002-05-16 | 2014-05-30 | Bavarian Nordic As | Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowania |
ATE518958T1 (de) * | 2007-01-30 | 2011-08-15 | Transgene Sa | Zur impfung verwendetes papillomavirus-e2- polypeptid |
-
2008
- 2008-01-29 US US12/599,971 patent/US8337859B2/en active Active
- 2008-01-29 TW TW097103228A patent/TW200844231A/zh unknown
- 2008-01-29 MX MX2009012272A patent/MX2009012272A/es active IP Right Grant
- 2008-01-29 JP JP2010507858A patent/JP5474767B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-29 EP EP08708348.1A patent/EP2162544B1/en not_active Not-in-force
- 2008-01-29 CA CA2686772A patent/CA2686772C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-29 ES ES08708348T patent/ES2416361T3/es active Active
- 2008-01-29 AR ARP080100356A patent/AR065075A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-01-29 CN CN200880016061XA patent/CN101688223B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-29 BR BRPI0810305A patent/BRPI0810305A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-01-29 AU AU2008250520A patent/AU2008250520B2/en not_active Ceased
- 2008-01-29 KR KR1020097023308A patent/KR101514473B1/ko active IP Right Grant
- 2008-01-29 RU RU2009144898/10A patent/RU2462513C2/ru active
- 2008-01-29 WO PCT/EP2008/051031 patent/WO2008138648A1/en active Application Filing
- 2008-01-29 PE PE2008000210A patent/PE20090483A1/es not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-11-05 IL IL201963A patent/IL201963A/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-04-21 HK HK10103937.8A patent/HK1135731A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BRPI0810305A2 (pt) | 2018-07-10 |
AR065075A1 (es) | 2009-05-13 |
ES2416361T3 (es) | 2013-07-31 |
AU2008250520A1 (en) | 2008-11-20 |
US8337859B2 (en) | 2012-12-25 |
IL201963A (en) | 2013-09-30 |
EP2162544B1 (en) | 2013-04-17 |
CA2686772A1 (en) | 2008-11-20 |
AU2008250520B2 (en) | 2013-10-31 |
IL201963A0 (en) | 2011-08-01 |
RU2009144898A (ru) | 2011-06-20 |
MX2009012272A (es) | 2009-12-01 |
CN101688223A (zh) | 2010-03-31 |
CA2686772C (en) | 2015-03-24 |
HK1135731A1 (en) | 2010-06-11 |
JP5474767B2 (ja) | 2014-04-16 |
EP2162544A1 (en) | 2010-03-17 |
US20100303838A1 (en) | 2010-12-02 |
KR20100019432A (ko) | 2010-02-18 |
KR101514473B1 (ko) | 2015-04-22 |
RU2462513C2 (ru) | 2012-09-27 |
WO2008138648A1 (en) | 2008-11-20 |
PE20090483A1 (es) | 2009-05-20 |
JP2010526547A (ja) | 2010-08-05 |
CN101688223B (zh) | 2013-07-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TW200844231A (en) | Vectors for multiple gene expression | |
KR101636575B1 (ko) | 유두종바이러스 백신 | |
KR20090005010A (ko) | Hpv-18-기재의 유두종바이러스 백신 | |
KR20100021603A (ko) | 신호전달 펩타이드 | |
US8263560B2 (en) | HPV 16 peptide vaccine for head and neck cancer | |
KR20090005011A (ko) | Hpv-16-기재의 유두종바이러스 백신 | |
KR20080113358A (ko) | C형 간염 바이러스 비구조 융합 단백질 | |
US10329328B2 (en) | HPV-related fusion protein and applications thereof | |
ES2370674T3 (es) | Polipéptido e2 de papilomavirus utilizado para la vacunación. |