TW200829602A - Novel antiproliferation antibodies - Google Patents

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TW200829602A
TW200829602A TW096144763A TW96144763A TW200829602A TW 200829602 A TW200829602 A TW 200829602A TW 096144763 A TW096144763 A TW 096144763A TW 96144763 A TW96144763 A TW 96144763A TW 200829602 A TW200829602 A TW 200829602A
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Liliane Goetsch
Nathalie Corvaia
Jean-Francois Haeuw
Cedric Bes
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Pf Medicament
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Description

200829602 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域1 本發明係關於特別指鼠單株抗體之能抑制腫瘤生長的 嵌合和人源化新穎抗體，以及編碼此類抗體的胺基酸及核 5 酸序列。從一方面，本發明係關於能抑制腫瘤細胞增生的 新穎抗體、衍生化合物或功能片段。本發明亦包括使用此 類抗體作為癌症之預防及/或治療處理，以及有關癌症診斷 之程序或套組内的藥物。最後，本發明包括含有併用其他 抗癌化合物如抗體或與毒素共軛之此類抗體的組成物，以 10 及其於某些癌症之預防及/或治療的用途。 【先前技術3 通常，選擇用於製造單株抗體的標準為辨識其可能治 療標的的免疫抗原。實務中，以對抗該免疫抗原的重組蛋 白免疫小白鼠，以及收集該小白鼠所產生的單株抗體，再 15 經過特殊的方法進行其對該免疫抗原之辨識能力的第一次 篩選。在第二階段中，為判定其活性和性質及/或作用機 制，在體内和活體外測定該選擇的抗體。 此“習知”方法即使在開始時已知其工作標的通常仍會 產生大量的抗體，其當然能特異性地辨識一已知標的但在 20 體内卻無法展現顯著的生物活性。在癌症的領域中，事實 上已知即使一抗體可在活體外產生良好的結果，但此類抗 體並不必然在體内可展現其真正的抗腫瘤活性。 本發明不同於此處理方法，由於其根據“功能性”方法 及更明確而言係根據抗體的功能而非抗體的辨識而因此甚 200829602 至與上述的方法相反。 更明確而言，發明者已選定一種已知的功能’即抑制 基底細胞的增生而非誘發，作為一抗體的述疋參數。 此製造方法將更詳細描述於下列實例中。 5 【發明内容2 藉由此功能性方法，發明者已驚奇地製造和筛選出能 於活體外及/或體内明顯抑制腫瘤細胞增生的抗體。 根據第一態樣，本發明係關於一種能於活體外及/或體 内抑制腫瘤細胞增生的分離抗體或其衍生化合物或功能片 10 段；該抗體或其衍生化合物或功能片段含有選自序列辨識 編號1 ' 2、3、4、5或6之互補決定區（CDRS)的至少一CDR 序列或經最適比對之後與序列辨識編號1、2、3、4、5或6 具有至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度的至少 一 CDR序列。 I5 一抗體的功月匕片丰又係特別指如Fv、scFvCsc1^簡單 鏈）、Fab、F(ab，)2、Fab、scFv_Fc或雙鏈抗體的抗體片段， 或被增加半衰期的任何片段。此類功能片段將詳述於下文。 一抗體的“折生化合物”係特別指構成肽骨架的壯八蛋 白以及該原始抗體的至少一咖8以保留其被辨識㈣ 2〇力。此類已被熟習本技術者所習知的衍生化合物將詳述於 下文。 本發明更佳為包含根據本發明特別指藉由基因重组或 化學合成所獲得之嵌合或人源化的抗體、其衍生化合㈣ 其功能片段。 / 200829602 根據一較佳具體實施例，本發明之抗體或其衍生化合 物或功能片段的特徵為其可構成一單株抗體。 “單株抗體”指由接近同質的抗體族群所構成的抗體。 更明確而言，其除了少數極小比例天然性突變之外具有相 5同族群的個別抗體。換言之，由單株抗體構成的均質抗體 係選殖自生長的單—細胞(雜交瘤，一種轉染編碼該均質抗 體之DNA分子的真核宿主細胞、一種轉染編碼該均質抗體 之DNA分子的原核宿主細胞等）以及其一般特徵為具有獨 /無二之重鏈的種類和亞類及唯一類型的輕鏈。單株抗體 1〇具有高度專一性並且可直接對抗一單一抗原。此外，與製 造具有直接對抗各種抗原決定區或抗原決定部位之各種抗 體的多株抗體相比較，各單株抗體僅直接對抗抗原的單一 抗原決定部位。 需瞭解本發明與天然抗體無關，即非取自其天然環境 15而是分離或獲得自天然來源的純化或獲得自基因重組或化 學合成，因此其可攜帶如下所述的非天然胺基酸。 更明確而言，根據本發明一較佳具體實施例，該抗體 或其衍生化合物或功能片段的特徵為其含有選自序列辨識 編號1、3或5胺基酸序列之CDRs中至少一CDR的輕鏈，或 2〇 與序列辨識編號1、3或5經最適比對之後具有至少8〇%較佳 為85% ' 90%、95%和98%相似度的至少一 CDR序列；或其 含有選自序列辨識編號2、4或6胺基酸序列之CDRs中至少 ^CDR的重鏈，或與序列辨識編號2、4或6經最適比對之後 具有至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度的至少 7 200829602 一 CDR序列。 更明確而言，本發明之抗體或其一衍生化合物或功能 片段的特徵為其含有序列辨識編號2 、4或6三種序列中至少 一CDRs的重鏈，或與序列辨識編號2、4或6經最適比對之 5後具有至少80%較佳為85%、90%、95。/。和98%相似度的至 少一 CDR序列。 又更明確而言，本發明之抗體或其一衍生化合物或功 能片段的特徵為其含有下列三種分別為Cdr_hi、CDR-H2 和CDR-H3之CDRs的重鏈，其中： 10 -CDR-Hl含有序列辨識編號2、7或9的序列，或與序列 辨識編號2、7或9經最適比對之後具有至少8〇%相似度的序 列； -CDR-H2含有序列辨識編號4或11的序列，或與序列辨 識編號4或11經最適比對之後具有至少8〇%相似度的序 15 列；以及 -CDR-H3含有序列辨識編號6或12的序列，或與序列辨 識編號6或12經最適比對之後具有至少80%相似度的序列。 根據一特定具體實施例，抗體或其一衍生化合物或功 能片段的特徵為其含有序列辨識編號7之CDR-H1、序列辨 20 識編號4之CDR_H2及序列辨識編號12之CDR-H3的重鏈。 根據另一特定具體實施例，抗體或其一衍生化合物或 功能片段的特徵為其含有序列辨識編號9之CDR-H1、序列 辨識編號11之CDR-H2及序列辨識編號6之CDR-H3的重鏈。 根據另一具體實施例，本發明之抗體或其一衍生化合 200829602 物或功能片段的特徵為其含有序列辨識編號丨、3或5三種序 列中至少一CDRs的輕鏈，或與序列辨識編號j、3或5經最 適比對之後具有至少80%較佳為85%、9〇%、95%和98%相 似度的至少一 CDR序列。 5 在一較佳方法中，本發明之抗體或其一衍生化合物或 功能片段的特徵為其含有下列三種分別為CDR-L1、 CDR-L2和CDR-L3之CDRs的輕鏈，其中： -CDR-L1含有序列辨識編號丨或8的序列，或與序列辨 識編號1或8經最適比對之後具有至少8〇%相似度的序列； 10 -CDR_L2含有序列辨識編號3或10的序列，或與序列辨 識編號3或10經最適比對之後具有至少8〇%相似度的序 列；以及 -CDR-L3含有序列辨識編號5的序列，或與序列辨識編 號5經最適比對之後具有至少8〇%相似度的序列。 15 根據一特定具體實施例，抗體或其一衍生化合物或功 能片段的特徵為其含有序列辨識編號1之CDR-L1、序列辨 識編號3之CDR-L2及序列辨識編號5之CDR-L3的輕鏈。 根據另一特定具體實施例，抗體或其一衍生化合物咬 功能片段的特徵為其含有序列辨識編號8之CDR-L1、序歹,j 20辨識編號1〇之CDR-L2及序列辨識編號5之CDR-L3的輕鍵。 本發明的描述中“多肽”、“多肽序列，，、“肽，，和“連接至 抗體化合物或其序列的蛋白質，，可互用。 需瞭解本發明與天然抗體無關，即非取自其天然環境 而是分離或獲得自天然來源的純化或獲得自基因重組或化 9 200829602 學合成，因此其可攜帶如下所述的非天然胺基酸。 在第一具體實施例中，立補決定區或CDRs指如Kabat 等人(Kabat等人，免疫球蛋白之標的蛋白質的序列，第5版， 美國國家衛生研究院衛生與公眾服務部，1991，及其後版 5 本)所定義免疫球蛋白之重鏈和輕鏈的高變異區。其具有三 個重鏈CDRs和三個輕鏈CDRs。此處使用之”CDR，， 和”CDRs”一詞視情況指含有決定大多數胺基酸殘基對抗 原或其所辨識抗原決定部位之抗體結合親和力的一或多個 或甚至全部的區域。 10 在第二具體實施例中，CDR區或CDR(s)意指免疫遺傳 學資料庫(IMGT)所定義免疫球蛋白之重鍵和輕鍵的高變異 區〇 IMGT的獨特編號被用於比較任何抗原受體、鏈型或品 種的可變區[Lefranc Μ·-Ρ· ’ 18， 15 509(1997)/Lefranc M.-P. ^ The Immunologist ^ 7 ： 132^136 (1999)/Lefranc，Μ·-Ρ·，Pommie，C·，Ruiz，M·，Giudicelli，VI， Foulquier，E·，Truong，L·，Thouvenin-Contet，V.和 Lefranc， C⑽;;· /mmiz⑽/·，27 : 55〜77(2003)]。在此IMGT獨特 編號中’其保守胺基酸通常具有相同位置，例如半胱胺酸 20 13(第一-CYS)、色胺酸41(保守_TRP)、疏水性胺基酸89、
半胱胺酸104(第二-CYS)、***酸或色胺酸118(J-PHE或 J-TRP)。該IMGT獨特編號提供骨架區（FR1_IMGT :位置J 至 26、FR2.IMGT : 39 至 55、FR3-IMGT : 66 至 104 和 FR4-IMGT : 118至 128)及互補決定區：CDR1-IMGT : 27至 10 200829602 38、CDR2-IMGT ·· 56至65和CDR3-IMGT ·· 105至 117的標準 化界限。由於空隙代表未被佔用位置，因此該CDR-IMGT 長度（括弧内以逗點隔開，例如[8.8.13])含有關鍵訊息。該 IMGT獨特編號被用於稱為IMGT Colliers de Perles[Ruiz，M. 5 *Lefranc,M.-P.，Immunogenetics，53:857〜 883(2002)/Kaas， Q_和 Lefranc，Μ·_Ρ·，Current Bioinfor· matics，2: 21 〜30(2007)] 的平面圖解，以及用於 IMGT/ 3Dstructure-DB[Kaas，Q.， Ruiz，Μ·和Lefranc，Μ·-Ρ·，T細胞受體和MHC結構數據， 心油· ，32 : D208〜D210 (2004)]的立體結構。 10 其具有三個重鏈CDRs和三個輕鏈CDRs。此處使用之 “CDR”和“CDRs” 一詞視情況指含有決定大多數胺基酸殘基 對抗原或其所辨識抗原決定部位之抗體結合親和力的一或 多個或甚至全部的區域。 為更清礎之便，必需瞭解下列特別指表2和3的描述中 15 將藉由IMGT編號、Kabat編號和常見編號定義該CDRs。 常見編號重組IMGT和Kabat編號系統所定義共同CDR 之各CDR的殘基部分。 IMGT編號系統定義根據上述IMGT編號的CDRs同時 Kabat編號系統定義根據上述Kabat編號的CDRs。 20 更明確而言，CDR_L1由常見編號和IMGT編號系統之 序列辨識編號1 (QDINNY)以及由Kabat編號系統之序列辨 識編號8(KASQDINNYIA)所構成。 關於CDR-L2，其由常見編號和IMGT編號系統之序列 辨識編號3(YTS)以及由Kabat編號系統之序列辨識編號 11 200829602 lO(YTSTLQA)所構成。 該CDR-L3分別由該三種編號系統之序列辨識編號5 (LQYDNLWT)所構成。 就重鏈而言，該C D R - Η1由常見編號系統之序列辨識編 5號2(TDYS)、IMGT編號系統之序列辨識編號7(GYSFTD YS) 以及Kabat編號糸統之序列辨識編號9(TDYSMY)所構成。 該CDR-H2由常見編號系統和IMGT編號系統之序列辨 識編號4(IDPYNGGT)以及Kabat編號系統之序列辨識編號 ll(YIDPYNGGTRYNQKFKG)所構成。 1〇 最後’該CDR-H3由常見編號系統和Kabat編號系統之 序列辨識編號6(QTDYFDY)所構成同時由IMGT編號系統 之序列辨識編號12(ARQTDYFDY)所構成。 就本發明的義意而言，兩種核酸或胺基酸序列間之“相 似度百分比”指在最適比對之後比較兩序列間相同核苦酸 15 或胺基酸殘基的百分比，此百分比係純統計學以及兩序列 間的差異係沿其長度隨機分佈。傳統上比較二核酸或胺基 酸序列係在最適比對之後比較其序列，該比較的進行係藉 由片段或利用“比對窗”。序列的最適比對除了人工比較之 外可藉由Smith和Waterman(1981)的局部相似演算法[Jd 20 ΜαίΑ. 2 ·· 482]、Neddleman和Wunsch(1970)的局部相似 演算法[J. Mo/. 5/〇/· 48 : 443]、Pearson和Lipman(1988)的相 似結構檢索法/Proc.論//. /cat/· 5W· USA 85 ·· 2444]，或藉 由利用這些演算法的電腦軟體(Wisconsin基因套裝軟體中 的 GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA，基因電腦小組，575 12 200829602
Science Dr.，威斯康辛州Madison市，或藉由比較軟體 BLAST NR或 BLAST P) 〇 藉由相對參考序列之被比較核酸或胺基酸序列具有加 入或删除的二最適比對序列測定二核酸或胺基酸序列間的 5相似度百分比。藉由測定二序列間具有相同胺基酸核苷酸 或殘基的位置數計算其相似度百分比，將此相同位置數除 以比對窗内的總位置數再乘以100而獲得二序列間的相似 度百分比。 例如，從網站取得的BLAST程式之“BLAST 2序 10 列’’(Tatusova等人，“Blast 2序列-用於比較蛋白質和核苷酸 序列的一種新穎工具”，FEMS Microbiol·，1999,快報174 : 247〜250)可被用於預設參數（重要參數為“開放空隙扣分，，：5 和延伸空隙扣分”：2;該程式建議的選定矩陣為例如 BLOSUM 62矩陣），直接藉由該軟體計算被比較二序列間 15 的相似度百分比。 對與參考胺純相具有至少8G%較佳為85%、9〇% 95%和98%—致性的胺基酸序列而言，輕 考序列之特別指刪除、加入或取代至少 ’較佳實例包括含有參
根據與被取代或所Μ各種抗體 間生物活性的比較試 13 200829602 驗結果之胺基酸的構造相似度測定該等效胺基酸。 在一非限制性實例中，不導致對應修飾抗體被明顯修修 飾其生物活性的可能取代作用摘錄於下表1 ;在相同條件下 可能產生自然的逆取代作用。 5 表1 原始殘基 取代作用 Ala(A) Val、Gly、Pro Arg(R) Lys、His Asn(N) Gin Asp(D) Glu Cys(C) Ser Gln(Q) Asn Glu(G) Asp Gly(G) Ala His(H) Arg He(I) Leu Leu(L) lie、Val、Met Lys(K) Arg Met(M) Leu Phe(F) Tyr Pro(P) Ala Ser(S) Thr、Cys Thr(T) Ser Trp(W) Tyr Tyr(Y) Phe、Trp Val(V) Leu、Ala 目前技術已發現該六種CDRs間之最大變異性（長度和 組成）存在於其重鏈CDRs以及更明確而言存在於該重鏈的 CDR-H3，此已為熟習本技術者所習知。因此，顯然本發明 抗體或其一衍生化合物或功能片段的較佳CDRs定性法將 14 200829602 為該重鏈的三種CDRS，即分別被序列辨識編號2、4和6所 編碼的CDRs，以及更佳為被序列辨識編號6所編碼之對應 該 CDR-H3 的 CDR。 在特定具體實施例中，本發明係關於一種鼠抗體或其 5 衍生化合物或功能片段。 本發明另一具體實施例中揭示一種含有下列三種 CDRs之輕鏈的抗體或其衍生化合物或功能片段·· 序列辨識編號1或與序列辨識編號1經最適比對之後具 有至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度之序列的 10 CDR-L1 ； 序列辨識編號3或與序列辨識編號3經最適比對之後具 有至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度之序列的 CDR-L2 ;以及 序列辨識編號5或與序列辨識編號5經最適比對之後具 15 有至少8〇%較佳為85%、90%、95%和98%相似度之序列的 CDR-L3 ; 以及含有下列三種CDRs之重鏈： 序列辨識編號7或與序列辨識編號7經最適比對之後具 有至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度之序列的 20 CDR-H1 ； 序列辨識編號4或與序列辨識編號4經最適比對之後具 有至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度之序列的 CDR-H2 ;以及 序列辨識編號12或與序列辨識編號12經最適比對之後 15 200829602 具有至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度之序列 的 CDR-H3。 本發明又另一具體實施例中揭示一種含有下列三種 CDRs之輕鏈的抗體或其衍生化合物或功能片段： 5 序列辨識編號8或與序列辨識編號8經最適比對之後具 有至少80°/°相似度之序列的CDR-L1 ; 序列辨識編號10或與序列辨識編號10經最適比對之後 具有至少80%相似度之序列的CDR_L2 ;以及 序列辨識編號5或與序列辨識編號5經最適比對之後具 10有至少80%相似度之序列的CDR_L3 ; 以及含有下列三種CDRs之重鏈： 序列辨識編號9或與序列辨識編號9經最適比對之後具 有至少80%相似度之序列的CDR-H1 ; 序列辨識編號11或與序列辨識編號11經最適比對之後 15 具有至少80%相似度之序列的CDR-H2 ;以及 序列辨識編號6或與序列辨識編號6經最適比對之後具 有至少80%相似度之序列的CDR-H3。 根據又另一具體實施例，本發明抗體或其衍生化合物 或功能片段的特徵為其含有序列辨識編號13或與序列辨識 2〇 編號13經最適比對之後具有至少80%較佳為85%、90%、95% 和98%相似度之胺基酸序列的輕鏈序列；以及特徵為含有 序列辨識編號14或與序列辨識編號14經最適比對之後具有 至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度之胺基酸序 列的重鏈序列。 16 200829602 亦揭示一種人源抗體或其衍生化合物或功能片段，特 徵為其含有序列辨識編號17或與序列辨識編號17經最適比 對之後具有至少80%相似度之胺基酸序列的輕鍵序列，以 及特徵為含有序列辨識編號18或19或與序列辨識編號18或 5 19經最適比對之後具有至少80%相似度之胺基酸序列的重 鍵序列。 如上所述，本發明亦係關於衍自本發明所述抗體的任 何化合物。 更明確而言，本發明之抗體或其衍生化合物或功能片 10 段的特徵為該衍生化合物係由含有被植入至少一c：dr以保 邊王4或部为初始抗體之抗體決定部位(parat〇pe)辨識性質 之肽骨架的結合蛋白所構成。 述於本發明之六種CDR序列中的一或多種序列亦可存 在於各種免疫球蛋白骨架。在此情況下，該蛋白質序列可 15產生有利於折疊被植入CDRs的肽骨骼而使其保留抗體決 定部位的抗原辨識性質。 通常，熟習本技術者將瞭解如何測定被植入至少一源 自$亥原始抗體之CDRs的蛋白骨架類型。 更明確而g，已知選擇此類骨架時必需符合下列大多 20 數的標準（SkerraA·，J.Mol.Recogn.，2〇〇〇, 13: 167〜187): -可保留最佳的親緣性； -具有習知的立體結構(例如藉由晶體學、Nmr光譜學 或熟習本技術者所習知的任何其他技術）； -具有小體積； 17 200829602 -極少或無轉錄後的修飾作用；及/或 -易於被製造、表現和純化。 此類骨架蛋白的來源可選自但不侷限於下列的構造： 纖黏蛋白及較佳為第III型功能區10纖黏蛋白、脂籠蛋白 5 (lip〇calin)、抗運載蛋白（anticalin)(Skerra A.，J. ， 2001，74(4) : 257〜75)、源自金黃色葡萄球菌A蛋白之b功 能區的Z蛋白、硫氧化還原蛋白（thioredoxir^A或具有重複基 序的蛋白例如“錨蛋白重複序列”(Kohl等人，2003， 弟100卷第4號，1700〜1705)、“armadillo重複序列”、“富含 10 党胺酸重複序列”和“三十四肽（tetratricopeptide)重複序 列”。 亦必需提及源自毒素的骨架舉例如蠍子、昆蟲、植物、 軟體動物等，以及神經元型一氧化氮合成酶蛋白抑制劑 (PIN) 〇 15 此類混合構造的一種非限制性實例為將抗c D 4抗體的 CDR-m，即13B8.2，***PIN的其一環中，因此可獲得保 留如原始抗體之結合性質的新結合蛋白（Bes等人， ’ 2006，343(1) : 334〜344)。在一純 說明的基礎上，亦必需提及被植入抗-溶菌酶VHH抗體之 20 CDR-H3(重鏈）的新制癌菌素（neocarzinostatin) (Nicaise等 人，Sc/Mce，13(7) : 1882〜1891)。 最後，如上所述，此類肽骨架可含有從一至六個源自 該原始抗體的CDRs。熟習本技術者較佳為但非必需選擇來 自重鏈的至少一CDR，後者已知為主要司掌該抗體的專一 18 200829602 性。熟習本技術者可經由選擇適當的已知技術選取一或多 種相關的CDRs(Bes等人，FEBS快報508，2001，67〜74)。 本發明一具體態樣係關於一種選擇源自根據本發明抗 體之化合物的方法，該衍生化合物能於活體外及/或體内抑 制腫瘤、、、田胞的生長以及該衍生化合物含有被植入至少一抗 體CDR的肽骨架，特徵為其包括下列的步驟： 口 (a)使被植入至少一抗體CDR的肽骨架在活體外與含
1生長及在4細胞生長條件下之腫瘤細胞的生物樣本相接 觸；以及 〇 (b)選取能抑制踵瘤細胞生長的化合物， 乂及特徵為5亥至少一被植入的cdr係選自下列CDRs : /序列辨識編號1、8或與序列辨識編號1、8經最適比對 之後具有至少80%㈣為85%、9()%、95%和98%相似度之 序列的CDR ; 序列辨識編號3、10或與序列辨識編號3、10經最適比 、十之後具有至少80%較隹為85%、9〇%、95%和98%相似度 之序列的CDR ; 20 序列辨識編號5或與序列辨識編號5經最適比對之後 ^有至v 8G%較佳為85%、9Q%、95%和㈣相似度之序列 序列辨識編號2、7、9或與序列辨識編號2、7、9緩最 適比對之後具有至少8〇%較佳為⑽ 、90%、95%和 98〇/〇相 似度之序列的CDR ; _序列辨識編號4、u或與序列辨識編號4、^經最適比 19 200829602 對之後具有至少8〇%較佳為85%、90。/。、95%和98%相似度 之序列的CDR;以及 -序列辨識編號6、12或與序列辨識編號ό、12經最適比 、子之後具有至少8〇%較佳為85%、、95%和98%相似度 5 之序列的CDR。 八根據較佳模式，該方法可包含於步驟(a)在活體外與 有被植入至少二或三抗體CDRs之肽骨架的化合物相接 觸。 根據此方法的又更佳模式，在上述構造的骨架或結合 1〇蛋白中選擇該肽骨架。 ^月顯地’這些為非限制性實例，以及被熟習本技術者 所習知或瞭解的任何其他構造均屬於本專利申請的保護範 圍内。 ^本發明因此係關於一種抗體或其衍生化合物或功能片 15 特徵為其具有選自下列蛋白質的肽骨架：⑷保留最佳 親緣!·生’（b)㈣的結構；⑷具有習知的立體結構，·⑷ 具有小體積及/或(e)含有不改變穩定性之下被刪除及/或插 入之修飾的區域。 根據-較佳具體實施例，本發明抗體或其衍生化合物 ，力月的特徵為該肽骨架係選自：⑴源自纖黏蛋白及 較佳為第m型功能區10纖黏蛋白、脂籠蛋白、抗運載蛋白、 源自金黃色葡萄球菌A蛋白之B功能區似蛋白、硫氧化還 '、白A或具有重複基序的蛋白例如“錯蛋白重複序 列，，(K〇hl等人，p赠，·，第1〇〇卷第*號，·〜闕、 20 200829602 “armadillo重複序列”、“富含亮胺酸重複序列”和“三十四肽 重複序列”，或(ii〇神經元型一氧化氮合成酶蛋白抑制劑 (PIN)。 本發明另一態樣係關於上述抗體的功能片段。 5 更明確而言，本發明係針對一抗體或其衍生化合物或 功能片段，特徵為該功能片段係選自Fv、Fab、F(ab’)2、 Fab’、scFv、scFv-Fc或雙鏈抗體的片段，或被增加半衰期 的任何片段例如聚乙烯二醇化片段。 根據本發明抗體之此類功能片段係由例如Fv、scFv 10 (sc=簡單鏈）、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc或雙鏈抗 體的片段；或藉由化學修飾例如加入聚亞烷基乙二醇如聚 乙二醇（聚乙烯二醇化）（聚乙烯二醇化片段被稱為卩乂- PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG和 Fab’-PEG);或 藉由併入一脂質體、微球或PLGA而增加其半衰期的任何片 15 段所構成，該片段具有能明顯展現甚至一部分其來源抗體 一般活性之本發明CDRs的至少一特徵。 該功能片段較佳為包含或含有其來源抗體之可變重鏈 或輕鏈的部分序列，該部分序列足以保留與其來源抗體相 同的結合專一性以及其較佳為至少等於1/100更佳為至少 20 1/10之來源抗體的親和力。 此類功能片段含有至少五個胺基酸，較佳為6、7、8、 10、15、25、50或100個其來源抗體之序列的連續胺基酸。 這些功能片段較佳為Fv、scFv、Fab、F(ab，)2、:Fab,、 scFv-Fc或雙鏈抗體的類型，其通常具有與其來源抗體相同 21 200829602 根據本發明，從上述抗體獲得本發明抗體之 一、/·、、、例如酵素如胃蛋白酶或木瓜酵素的酵解 或精由化學喊法⑽錢硫鍵。亦可藉由H本技術 習知的基因重組技㈣得該抗體片段，或藉由肽合成法例如 5利用APPlledBiGSystems公司等所販售的自動肽合成儀。 本發明亦針對根據本發明之抗體的原始鼠抗體或其衍 生化合物或功能片段，特徵為該抗體為一種鼠抗體以^ 含有序列辨識編號b或與序列辨識編號15經最適比對之後 具有至少80%較佳為85%、90%、95%和98%相似度的輕鏈 1〇胺基酸序列，以及含有序列辨識編號16或與序列辨識編號 16經最適比對之後具有至少8〇%較佳為85%、9〇%、95%和 98%相似度的重鏈胺基酸序列。 為更清礎之便，下表2摘錄相當於本發明之抗體的各種 胺基酸序列。 拉这人琿化) 抗艘 CDR編碼 重璉 邮一八碎化, 輕鏈 序列辨識編號 6F4 常見 CDR-L1 1 CDR-L2 3 CDR-L3 5 CDR-H1 2 CDR-H2 4 CDR-H3 6 CDR-L1 1 CDR-L2 3 IMGT CDR-L3 5 CDR-H1 7 CDR-H2 4 CDR-H3 12 22 200829602
Kabat CDR-L1 8 CDR-L2 10 CDR-L3 5 CDR-H1 9 CDR-H2 11 CDR-H3 6 Mu可變區 13 Mu可變區 14 Mu全部 15 Mu全部 16 Hu可變區 17 Hu可變區（VI) 18 Hu可變區（V2) 19
本發明另一具體態樣係關於一種嵌合抗體或其衍生化 合物或功能片段，特徵為該抗體亦含有源自與小白鼠特別 指人之異源品種抗體的輕鏈和重鏈恒定區。 本發明又另一具體態樣係關於一種人源化抗體或其衍 5 生化合物或功能片段，特徵為該源自人類抗體之輕鏈和重 鏈的恒定區分別為λ或/c區以及7 -1、7" -2或τ -4區。 根據另一態樣，本發明係關於一種能分泌根據本發明 之單株抗體的鼠雜交瘤，該鼠源的雜交瘤能分泌示於第1圖 中鼠抗體之重鏈和輕鏈序列的單株抗體，其亦稱為”6F4”抗 10 體。該雜交瘤係藉由融合Balb/C經免疫小白鼠脾細胞和骨 髓瘤Sp 2/O-Ag 14株之細胞而獲得。 此處稱為6F4的單株抗體或其衍生化合物或功能片段 明顯形成本發明的一部分。 本發明之抗體亦包括嵌合或人源化抗體。 15 一嵌合抗體係含有源自一已知品種之抗體的天然可變 23 200829602 區（輕鏈和重鏈）結合該已知品種之異源品種抗體的輕鏈和 重鏈之恒定區者。 藉由基因重組技術可製備該抗體或其嵌合片段。例 如，藉由選殖含一啟動子和編碼本發明較佳為鼠之非人源 5單株抗體可變區之序列，以及編碼該人類抗體恒定區之序 列的重組DNA可製備該嵌合抗體。編碼一此類重組基因之 根據本發明的嵌合抗體可為例如一小白鼠_人類嵌合體，此 抗體的專一性決定於源自該鼠DNA的可變區以及其同種型 決定於源自人類DNA的恒定區。製備嵌合抗體的方法請參 10 考Verhoeyn等人(BioEssays，8 ·· 74，1988)。 “人源化抗體”意指含有源自非人源抗體之CDr區的抗 體，其他抗體分子部分為源自一（或數種）人類抗體。此外， 可修飾一些骨骼片段殘基（稱為FR)以保留其親合力（J〇nes 等人，，321: 522〜525，1986; Verhoeyen等人，， 15 239 : 1534〜1536，1988 ; Riechmann等人，，332 : 323〜327 ， 1988) 〇 藉由熟習本技術者所習知的技術可製備本發明的人源 化抗體或其片段(舉例如述於Singer等人，J. /mmww.，150 : 2844〜2857，1992 ; Mountain等人，5zc^c/m〇/· Gwei· £>zg· 20 ，10 : 1 〜142，1992 ;以及 Bebbington 等人，所
Ac/mo/叹y，10 : 169〜175，1992)。此類人源化抗體較佳為 被用於活體外診斷法或體内預防及/或治療處理法中。其他 人源化技術亦已為熟習本技術者所習知，舉例如述於PDL 之專利EP 0 451 26卜 EP 0 682 040、EP 0 939 127、EP 〇 566 24 200829602 647 或 US 5,530，101、US 6，180,370、US 5,585,〇89*us 5,693,761中的“CDR接枝”技術。亦包括美國專利5,639,641 或6,054,297、5,886，152和5,877,293。 此外’本發明亦係關於源自上述鼠抗體的人源化抗體。 • 5 更明確而言，6F4抗體的人源化方法分別詳述於實例2 ^ 和3中的輕鏈和重鏈。 在一較佳方法中’源自人化抗體之輕鏈和重鏈的恒定 ,f ' 區分別為λ或/c及τ -1、7 -2或7 ·4區。 \ ... 在相當於IgGl同種型IgGl的具體實施例中，該抗體的 10附加特徵為展現效應子功能，例如抗體依賴細胞介導細胞 毒(ADCC)及/或補體依賴細胞毒(CDC)。 本發明的另一態樣中’發明者亦鑑定根據本發明抗體 的抗原可辨認性。 該方法被詳述於下列實例4。 ~ 15 JAM_A係一種屬於免疫球蛋白大家族（igSF)的膜蛋
ί 白，其屬於細胞連接黏附分子(JAM)家族。在人類中，JAM 豕族包括數種成員如JAM-A、JAM-B、JAM-C、A33和A34 蛋白。這些JAM家族成員中，JAM-A與JAM-B和JAM-C具 有最高的同源性，其胺基酸具有約35%的序列一致性及與 2〇 上 該兩種蛋白具有45%相似度。JAM-A蛋白亦被稱為JAM A、 FllR、F11 受體、JAM-1、JAM 1、PAM-ι 或CD321。 已鑑定出兩種同種型之胞外區不同長度的JAM-A前驅 蛋白： -同種型a : 299個胺基酸(序列辨識編號61); 25 200829602 -同種型b · 259個胺基酸(序列辨識編號63)。 此兩種同種型的核苷酸序列以序列辨識編號62代表同 種型a及以序列辨識編號6 4代表同種型b。 表現於人類細胞表面的蛋白具有含細胞内C-端區、單 5 一跨膜區（21個胺基酸）以及含兩個”Ig-樣，，區之N-端胞外區 的單一多肽鍵。 JAM-A具有一個N-糖基化位點、同種型&内185位置和 同種型b内145位置的一Asn殘基，以及一位於ig N-端區内 Cys殘基50和109之間和一位於第二ig區内cys殘基153和 10 212之間的兩個雙硫鍵。 藉由結晶學可確認該兩個胞外Ig-樣區的存在 (Kostrewa等人，2001，£71/50 J· 16 : 4391 〜4398 ; Prota等 人，2003，Pn dead 5W· USA，100 : 5366〜5371)。 此兩區藉由三肽鏈(序列VLV[127〜129]，同種型A)相連接。 15 這些結構上研究亦證實JAM-A在胞外區細胞表面上之嗜同 種間相互作用的蘊含意義；此重組型内及能於溶液内形成 同種二聚體的區（Bazzoni等人，2000，*/· CAe/n. 275 : 30970〜30976)亦可被用於鑑別這些相互作用的胺基酸：Arg 59、Glu 61、Lys 63、Leu 72、Tyr 75、Met 110、Glu 114、 20 Tyr 119和Glu 12卜此三肽RVE[59〜61]被相當地保留於JAM 家族内（JAM-B的RLE、JAM-C的RIE)並且構成形成同種二 聚體的最小基序(Kostrewa等人，五M50 乂 16 : 4391〜4398)。 在上皮及内皮細胞中，JAM-A主要發現於緊密接合内 (Liu等人，2000，J. ，113 ·· 2363〜2374)。其胞質區 26 200829602 含有C-端位置内的第II型PDZ功能區（序列FLV[298〜 300]);同種型a，其負責JAM-A與緊密接合有關之各種細胞 質蛋白的相互作用；亦含有PDZ功能區，例如z〇_l、AF-6、 MUPP-1和 PAR-3(Ebnet專人 ’ 2000 ’《/· 5/(9/· ，275 : 5 27979〜27988;^〇11等人，2001，/.0//价〇/.，154:491〜498;
Hamazaki等人，2002，J. 5zo/· CAem·，277 : 455〜461)。被 稱為J3F. 1和J10.4抗體之直接對抗雙體形成之區[111〜123] 的鼠抗體在體外能抑制JAM-A的同源雙體化作用以及上皮 細胞屏障的重建(Mandell等人，2004，J.及·〇/. CT^m.，279 : 10 16254〜16262) 〇 JAM-A與αν/53整合素相互作用以及涉及玻連蛋白 (vitronectin)，αν召3整合素之配體，造成之内皮細胞的移 行(Naik和Naik，2005，/· Ce//5W· 119 : 490〜499)。依相同 方式作為抗-α v/?3抗體的抗JAM-A抗體J3F.1在活體外可抑 15 制内皮細胞的移行以及bFGF誘發的血管增生(Naik等人， 2003 ’ 5/⑽¢/ ’ 102 : 2108〜2114)。内皮細胞内已證明各種的 信號徑路·· MAP激酶、PI3_激酶和PKC(Naik和Naik，2005， 乂 Ce// 如··，119 : 490〜499 ; Naik等人，2003，5/〇〇心 102 : 2108〜2114，Naik專人 ’ 2003， 20 ，23 : 2165〜2171)。 JAM-A亦表現於單核細胞、淋巴細胞、嗜中性細胞和 血小板（Williams荨人 ’ 1999，Afo/· /mmwwo/·，36 : 1175〜 1188)。然而JAM-A蛋白被初步鑑定為fii抗體的受體，一 種能活化血小板及誘發其凝集的抗體(灿化等人，1995， 27 200829602 价ocAem. /·，310 : 155〜162 ; Sobocka等人，2000，， 95 : 2600〜2609)。胜肽[28〜60]和[97〜109]屬於F11抗體之抗 原決定部位及涉及血小板的活化及凝集現象，以及涉及同 源雙體化作用（Babinska等人，2002，TTiromZ)· //此，87 : 5 712 〜721)。 直接對抗鼠型JAM-A的大鼠抗體BV11在活體外和體 内可抑制單核細胞的跨内皮細胞移行(Del Maschio等人， 1999，J· £*：φ· Med，190 : 1351 〜1356)。Ostermann及其同
僚(2002，Nature Immunol·，3 : 151 〜158)指出 JAM-A為 aL 10 或LFA-1(淋巴球功能相關抗原1)整合素的一種配體，其 在形成抗炎反應的過程中會過度表現對某些趨化激素 (chemokines)的反應，以及為白血球至炎症部位的血球滲出 或移行所必需。JAM-A藉由該第二Ig-樣的功能區能促成τ 淋巴細胞和嗜中性細胞的黏附作用及跨内皮細胞的移行 15 (Ostermann等人，2002，TVaiwre /mmw⑽/.，3 : 151〜158)， 因此在白血球聚集至炎症部位的過程中扮演重要角色。 JAM-A蛋白亦與病毒的感染有關。jaM-A事實上為里 奥病毒(reovirus)的受體，一種導因於藉由與吸附蛋白σ 1 相互反應之某些腦炎類型的病毒(Barton等人，2001，Ce// 20 104 : 441〜451) 〇 抗JAM-A抗體J10.4可抑制里奥病毒與jam-A的結合 (Forrest等人，2003，/·及·〇/· CAem·，278 : 48434〜48444)。 迄今，上述無一抗體可在體内直接對抗人型JAM-A而 具有極低的抗腫瘤活性。此類抗體僅被作為研究的用途。 28 200829602 因此’於先前技術中，仍無在活體外和體内具有抗腫瘤活 性的抗體。 根據一特殊態樣，本發明之抗體或其衍生化合物或功 能片段的特徵為能夠專一性地結合至J Α Μ _ A蛋白（根據英 5 國命名法被稱為“細胞連接黏附分子”）。 仍根據另一態樣，本發明之抗體或其衍生化合物或功 能片段的特徵為其對JAM-A的KD介於約1奈克分子和約1皮 克分子之間。更明確而言，該對JAM-A的KD為介於約1〇皮 克分和約40皮克分子之間。 10 “KD”意指一已知抗體-抗原複合物的解離常數。Kd=
Koff/K^n ’其KQff為抗體從抗體-抗原複合物解離的“解離速 率”常數以及KQn為抗體結合該抗原的程度(Chen Y.等人， 1999，，Mo/·別〇/·，293 : 865〜881)。 本發明一新穎態樣係關於一種獨立的核酸，特徵為其 15 選自下列的核酸（包括任何簡併基因密碼）： (a) 編碼根據本發明之抗體或其一衍生化合物或功能 片段的一核酸、DNA或RNA ; (b) 與(a)定義之核酸互補的核酸； (c) 在高度限制條件下能與序列辨識編號20至31或與 20 序列辨識編號20至31經最適比對之後具有至少80%較佳為 85%、90%、95%和98%相似度之核酸序列至少一CDRs雜交 的至少18個核苷酸之核酸；以及 (d) 在高度限制條件下能至少與序列辨識編號32或36 之核酸序列輕鏈及/或序列辨識編號33、37或38之核酸序列 29 200829602 重鏈，或與序列辨識編號32或36及/或33、37或38經最適比 對之後具有至少80%相似度之序列雜交的至少18個核苷酸 之核酸。 下表3摘錄有關本發明抗體的各種核苷酸序列。 5 表3 抗艘 CDR編碼 重鏈 輕鏈 序列辨識編號 CDR-L1 20 CDR-L2 22 常見 CDR-L3 24 CDR-H1 21 CDR-H2 23 CDR-H3 25 CDR-L1 20 CDR-L2 22 IMGT CDR-L3 24 CDR-H1 26 CDR-H2 23 CDR-H3 27 6F4 CDR-L1 28 CDR-L2 29 Kabat CDR-L3 24 CDR-H1 30 CDR-H2 31 CDR-H3 25 Mu可變區 32 Mu可變區 33 Mu全部 34 Mu全部 35 Hu可變區 36 Hu可變區(VI) 37 Ηιι可變區(V2) 38 30 200829602 本發明可互用之名詞“核酸，，、“核酸序$，、“㈣之序 列，，、“多核苦酸”、“寡㈣酸，，、“多核芽酸序列”和“核苦酸 序列”指有或無修飾、定義核酸的-片段或區域、含或不含 非天然核苦酸之核普酸的-明確序列，以及可為雙二 5 DNA、單鏈DNA或該DNAs的轉錄產物。 本發明與自'然染色體環境即自_態下的核普酸無 關。已分離及/或純化出本發明的序歹,】，即其經由直接或間 接的採樣，例如藉由複製已至少經部分修都的環境。此^ 亦述及藉由如宿主細胞的重組基因或藉由化學合成法獲= 10 分離的核酸。 “與參核酸考序列經最適比對之後具有至少8〇%較佳 為85%、90%、95%和98%百分比相似度的核酸序列，，意指經 由某些修飾例如特別指較佳為在特定時間之删除、截斷、 延伸、後合融合及/或取狀後驗其參考賊序列的核酸 15序列。這些序_佳為與參考序列編碼相同的胺基酸序 列，其較佳為在特別如下述定義之高度限制條件下與能專 -性地與參考序列雜交之基因密碼或互補序列的簡併有 關0 在同度限制條件下雜交意指選擇於兩條互補D N A片段 20之間可進行雜父之溫度和離子強度的條件。在單純說明的 基礎上，用於定義上述多核苷酸片段之該雜交步驟的高度 限制條件具有下列的優點。 以兩步驟進行DNA-DNA或DNA-RNA的雜交：（1)在 42°C預雜交3小時其係於含5xSSC(lxSSC相當於0.15克分子 31 200829602 鹽酸+0.015克分子擰檬酸鈉的溶液）、50%曱醯胺、7%月桂 基硫酸鈉（SDS)、1〇χ Denhardt’s溶液、5%硫酸葡聚糖和1% 鮭魚***ϋΝΑ的磷酸鹽緩衝液(2〇毫克分子 在視探針長度的溫度（即，探針>1〇〇核苷酸長度為42。〇下進 行20分鐘的初級雜交反應接著在2(rc的2x ssc+2% SDS内 進行兩次的20分鐘沖洗，及在2(rc的〇 1χ ssc+〇 1% sds内 進打一次的20分鐘沖洗。在探針>1〇〇核苷酸長度的6(rc下 於O.lx ssc+0.1% SDS内進行30分鐘最後的沖诜。根據 sambrook等人魏的㈣（分子選殖··實驗室手冊，冷泉港 實驗室；第三版’細）熟習本技術者可採用上述用於確定 大小的高度限制條件於較長或較_募核苦酸。 本發明亦係關於含有如本發明所述核_一載體。 庠列的詩特料對伽及/或表㈣含有此類多核苷酸 序列的載體。 15 20 /或分μ為含有在—已知宿主細胞内表現及 /或以核錢相的成分 子、轉譯起始和終止信號，以Τ體必需含有一啟動 需能穩定地存在於宿主細胞内的轉錄調㈣。其必 轉譯蛋白的專_性信號。熟習選擇性地具有分泌指定 細胞選取及最佳化該各軸成分。*者可根據使用的宿主 酸序列可在選擇宿主内被***用於此目的時，該核苷 宿主的整合載體。 行複製的載體或成為選擇 精由熟習本技術者的一般使 獲得的選殖株可藉由標準方、、 万法製備此類載體以及 丁’去如微脂粒感染法、電穿透 32 200829602 • 5 法、熱衝擊法或化學法被導入一適當宿主内。 該載體可為例如質粒或病毒性載體。其被用於轉化宿 主細胞以選殖或表現本發明的核苷酸序列。 本發明亦包括藉由或含有本發明所述載體所轉化的宿 主細胞。 可在原核或真核系統内選擇該宿主細胞例如細菌細胞 如但亦包括酵母細胞或特別指哺乳動物細胞的動物細胞。 / i 亦可使用昆蟲或植物細胞。 本發明亦係關於具有根據本發明之轉化細胞的非人類 10 動物。 本發明另一態樣係關於製備根據本發明之抗體或其功 能片段的方法，該方法的特徵為包含下列步驟： (a)在培養基及適當培養條件下培養根據本發明的宿 主細胞；以及 15 l (b)從該培養基或培養細胞收獲該抗體或其一功能片 段。 將根據本發明的轉化細胞用於根據本發明的重組多肽 製備法中。根據本發明製備重組型多肽之方法的特徵為該 方法係利用根據本發明之載體及/或藉由載體轉化的細 20 胞，其亦屬於本發明的範圍内。根據本發明被一載體轉化 的細胞較佳為在容許表現上述多肽及可收獲該重組多肽的 條件下進行培養。 如前所述，可在原核或真核系統内選擇該宿主細胞。 明確而言，可鑑定易於此類原核或真核系統内分泌的本發 33 200829602 明之核苷酸序列。根據本發明攜帶此類序列的載體因此可 有效地用於製造被分泌的重組蛋白。事實上，由於其存在 於細胞培養基的上清液而非宿主細胞内而有助於目標重組 蛋白的純化。 5 亦可藉由化學合成法製備本發明的多肽。本發明的目 標亦針對其中一種製備方法。熟習本技術者已習知該化學 合成法，例如固相技術(請看steward等人，1984,固相多狀 合成法，Pierce化學公司，Rockford，111，第二版）或藉由 片段縮合或習知溶液内合成法的部分固相技術。本發明亦 10包括藉由化學合成法以及含有對應非天然胺基酸所獲得的 多肽。 本發明亦包括可能藉由本發明之方法獲得的抗體或其 衍生化合物或功能片段。 又根據另一態樣，本發明係關於一種上述的抗體，特 15 徵為其除了能專一性地結合人類酪胺酸激酶家族受體之外 還能專一性地抑制此類受體的酪胺酸激酶活性。 根據一新穎具體實施例，本發明係關於由含有能與形 成腫瘤之任何受體相互作用之第二基序的雙專一性抗體舉 例如 VEGFR、VEGF、EGFR、IGF-1R、HER2/neu、HGF、 20 cMET、FGF、四跨膜蛋白（tetraspanins)、整合素、CXCR4 或CXCR2所構成的抗體或其衍生化合物或功能片段。 根據第一具體實施例’其一此類抗體係由雙專一性抗 體以及含有專一性地抑制EGF與人類上皮生長因子受體 (EGFR)之結合及/或專〆性地抑制該EGFR之赂胺酸激轉活 34 200829602 性的第二基序所構成。根據本發明又更佳的態樣，該第二 抗EGFR基序係源自西妥昔單抗（cetuximab、C225或 Erbitux)、馬妥珠單抗（脱恤騰叫、huR3、HuMax_EGFR 或 panitumab 〇 5 根據第二具體實施例，根據本發明的抗體係由雙專一 性抗體以及含有專一性地抑制藉由HER2/neu受體調節活性 及/或專一性地抑制該HER2/neu受體之酪胺酸激酶活性的 第二基序所構成。更明確而言，該第二抗HER2/neu基序係 源自4D5或2C4小白鼠單株抗體或源自妥珠單抗 10 (trastuzumab)或帕妥珠單抗(pertuzumab)的人源化抗體。 根據第三具體實施例，根據本發明的抗體係由雙專一 性抗體以及含有專一性地抑制肝細胞生長因子（HGF)與 cMET受體之結合及/或專一性地抑制該cMET受體之酪胺 酸激酶活性的第二基序所構成。 15 根據第四具體實施例，根據本發明的抗體係由雙專一 性抗體以及含有專一性地抑制藉由IGF-1R受體調節活性及 /或專一性地抑制該IGF-1R受體之酪胺酸激酶活性的第二 基序所構成。更明確而言，該第二抗IGF-1R基序係源自7C10 小白鼠單株抗體、源自對應的人源化抗體h7C10 (Goetsch 20 等人，國際專利申請案WO 03/059951)、源自hEM 164抗體 (Maloney等人，Cancer Res.，2003，63(16) : 5073〜5083)、 源自Abgenix公司的抗IGF-1R抗體（請看美國專利申請案 2005/281812)，或源自 Mab 39、lH7(Li等人，/mmw⑽/· ，2000 ，49(4〜5) : 243〜252)或 4G11 35 200829602 (Jackson-Booth等人，MWaZ). 7?從，2003，35(11 〜12): 850〜856)。 最後根據最終具體實施例，本發明之抗體係由雙專一 性抗體以及含有能與形成腫瘤之任何類型受體相互作用的 5 第二基序在一非限制性實例，例如VEGFR'VEGF、FGF(纖 維母細胞生長因子）或許多的CXCR(趨化激素受體）家族如 CXCR2或CXCR4所構成。 亦必需提及的抗體為抗CD20抗體例如利妥昔單抗 (rituximab)、替伊莫單抗(ibritumomab)或托西莫單抗(t〇si-10 tumomab);抗CD33抗體例如吉妥珠單抗(gemtuzmnab)或林 妥珠單抗(lintuzumab);抗CD22抗體例如epratuzumab ;抗 CD52抗體例如阿侖珠單抗(alemtuzumab);抗EpCAM抗體例 如依決洛單抗0(^。〇1〇111&13)、（^1117-1八或1〇^[-1〇1;抗 CTP21 或 16抗體例如 Xactin ;抗DNA-Ag抗體例如 1311-Cotara 15 TNT-1 ;抗MUC1抗體例如pemtumomab或R1150 ;抗MUC18 抗體例如ABX_MA1 ;抗GD3抗體例如米妥莫單抗 (mitumomab);抗ECA抗體例如 CeaVac或labetuzumab ;抗 CA125抗體例如OvaRex ;抗HLA-DR抗體例如apolizumab ; 抗CTLA4抗體例如MDX-010 ;抗PSMA抗體例如 20 MDX-070、ηιΙη和90Y-J591、mLu J59卜 J591- DM1 ;抗Lewis Y抗體例如IGN311 ;抗血管生成抗體例如AS1405和 90YmuBCl ;抗 Trail-Rl 抗體例如 TRAIL RlmAb 或 TRAIL R2mAb 〇 構成第二代單株抗體的雙專一性或雙功能性抗體具有 36 200829602 被結合於相同分子的兩種不同可變區（Hollinger和Bohlen， 1999，癌症和#多，修訂，18 : 411〜419)。其相對聚集效應 子功能或標定腫瘤細胞表面上數種分子的能力已在診斷和 治療領域的實用性上獲得證實；可藉由化學方法(Glennie MJ 5 等人，1987，*/· /mmw⑽/· 139 ’ 2367〜2375 ; Repp R.等人，1995， «/. //⑽如.，377〜382)或體細胞法(Staerz U.D·和Bevan M.J.， 1986，83，1453〜1457 ; Suresh M.R·等人，1986，MeAod ，121 : 210〜228)獲得此類的抗體；但同樣較佳為藉 由基因工程技術使其被迫異源二聚體化而有助於抗體的純 10 化(Merchand等人，1998，，16 : 677〜681) 〇 這些雙專一性抗體可構成完整的IgG、雙專一性 Fab’2、Fab’PEG、雙鏈抗體或雙專一性scFv，但亦可作為 其兩個結合位置代表各抗原標的的四價雙專一性抗體(Park 等人，2000 ’ Mo/· /mmw⑽/·，37(18) : 1123〜30)或如上所述 15 的片段。 除了製造及投與雙專一性抗體較製造兩種專一性抗體 更為便宜的經濟利益之外，使用此類雙專一性抗體具有降 低治療毒性的優點。事實上，使用雙專一性抗體可降低循 環抗體的整體數量而因此減少毒性的效應。 20 在本發明的一較佳具體實施例中，該雙專一性抗體為 雙價或四價抗體。 最後’本發明係關於用作為藥物的上述抗體或其衍生 化合物或功能片段。 本發明亦係關於含有由本發明抗體或其一衍生化合物 37 200829602 或功能片段構成之化合物作為活性成分的醫藥組成物。該 抗體較佳為添加一賦形劑及/或醫藥上可接受載劑。 又根據另一具體實施例，本發明亦係關於上述的醫藥 組成物其含有至少一種選自能專一性地抑制受體之絡胺酸
5 激酶活性例如IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET、VEGFR 或VEGF的弟二種抗腫瘤化合物，或熟習本技術者所習知的 任何其他抗腫瘤化合物。在本發明的第二較佳態樣中，該 第二化合物可選自抗EGFR、抗IGIMR、抗HER2/neu、抗 CMET、VEGFR、VEGF等之分離抗體或其功能片段及衍生 10化合物，其能抑制增殖及/或抗凋亡及/或血管生成及/或被 該受體促發之轉移擴散的誘導活性。 又根據本發明的另一具體實施例，該組成物含有作為 用於同步、分開或延時投藥之附加組合產品之受體的至少 一種絡胺酸激酶活性抑制劑例如IGF-IR、EGFr、HER2/ 15 neu、cMET和 VEGFR。 在另一較佳具體實施例中，這些受體的酪胺酸激酶活 ^生抑制劑係選自包括衍生天然物、二苯胺酖亞胺、吡唑·或 各比多％。疋或喧σ坐琳(quinaz〇iines)的群組。此類技術者 所習知的抑制劑已被述於文獻中（Ciardiello F.， 20 2000，增訂版卜25〜32)。 補充本發明的另一具體實施例中，上述組成物含有作 為用於同步、分開或延時投藥之細胞毒性/細胞抑制劑的附 加級合產品。 同步使用”意指投與單一劑型内之組成物的二者化合 38 200829602 物0 分開使用”意指於相同時問於访+ τ N时間ί又與在不同劑型内之組成 物的化合物。 “延時使用”意指逐次投盥名又π w l7 ?又興在不问劑型内之組成物的化 5 合物。 ▲通常’根據本發明之組成物可大為提升癌症治療的有 效性。換言之’藉由細胞毒性劑的投與可意外地加強本發 明之抗體的治療效應。本發明組成物的另一種重要後續效 應為可降低活性成分的有效劑量而避免或減少特別指該細 10胞毒性劑之效應的副作用。此外，此組成物可更迅速地達 到預期的治療效應。 “治療性抗癌劑”或，，細胞毒性劑，，意指當被投與至—病 人日守可治療或預防癌症形成的物質。此類藥物的非限制性 實例包括，，烧化”劑、代謝拮抗劑、抗腫瘤抗生素、有絲分 15褎抑制劑、染色質功能抑制劑、新生血管阻斷劑、抗雌教 素劑、抗雄激素劑和免疫調節劑。 此類藥物例如述於VIDAL内標題為，，細胞毒性，，下腫瘤 學和血液學的有關化合物被引述於此文件中作為較佳細皰 毒性劑的細胞毒性參考化合物。 20 ‘‘烧化劑”指可共價鍵結合或烧化任何分子的任何物 質，其在細胞内較佳為一種核酸(例如，DNA)。此類烷化 劑的貫例包括氮芥子氣例如氮芥(mechlorethamine)、笨丁酉曼 氮务(chlorambucil)、美法命(mephalan)、氫氣酸鹽、旅泊 臭 燒(pipobroman)、潑尼莫司、;丁(prednimustine)、鱗酸二鈉或 39 200829602 雖莫司汀(estramustine)，氧氮鱗環類（oxazaph〇s- phorines) 例如環磷醯胺（cyclophosphamide)、三聚氰胺（altretamine)、 曲環磷醯胺(trofosfamide)、葡環磷醯胺(ghjfosfamide)或異 環磷醯胺；氮丙烷（aziridines)或亞甲基亞胺例如塞替派 5 (thiotepa)、三乙烯胺或別四胺；亞硝基脲例如卡莫司汀 (carmustine)、鏈脲佐菌素（streptozodne)、福莫司汀 (fotemustine)或洛莫司汀(lomustine);烷基磺酸鹽例如白消 安（busulfan)、曲奥舒凡（treosuifan)或英丙舒凡 (improsulfan);三氮烯類例如達卡巴嗪(dacarbazine);或鉑 10錯合物例如順麵（cisplatine)、奥沙利舶（oxaiipiatine)或卡舶 (carboplatine) 〇 “代謝拮抗劑”指藉由干擾通常為DNA合成的某些活動 而阻斷生長及/或細胞代謝的物質。代謝拮抗劑的實例包括 甲胺蝶呤（methotrexate)、5-氟尿嘧啶（5FU)、氟尿苷 15 (floxddine)、5·氟去氧尿苷、卡培他賓（capecitabine)、阿 拉伯胞疋糖普（cytarabine)、氟達拉賓（fiu(jarat)ine)、阿糖 胞嘧啶(cytosine arabinoside)、6-巯嘌呤(6-MP)、6·硫氫基鳥 糞嘌呤（6-TG)、氣去氧腺苷、5-氮雜胞苷、吉西他賓 (gemcitabine)、克拉屈濱（cladribine)、脫氧考福黴素(de〇xy_ 20 coformycin)和喷司他汀（pentostatin)。 “抗腫瘤抗生素”指可預防或抑制DNA、RNA及/或蛋白 質合成的化合物。此類抗腫瘤抗生素的實例包括多柔比星 (doxombicin)、柔紅比星（daun〇rubicin)、伊達比星 (idambidn)、戊柔比星（valrubidn)、米托蒽醌 200829602 (mitoxantron)、放線黴素（dactin〇mycin)、光輝黴素 (mhhramycin)、普卡黴素（plicamydn)、絲裂 1 素 C(mit〇mydn C)、博萊黴素（ble〇_ mydn)和丙卡巴肼 (procarbazine) 〇 5 “有絲***抑制劑，，可阻止細胞循環和有絲***的正常 進行。通常，T抑制有絲***者為微細管抑制劑或，，紫杉醇 類化合物(taxmds)”例如太平洋紫杉醇(paclitaxd)*多西紫 杉醇(docetaxel)。亦能抑制有絲***者為長春花生物鹼例如 長春花驗(vinblastine)、長春新驗(vincristine)、長春地辛 10 (vindesine)和長春瑞賓(vin〇rdbine)。 “染色質功能抑制劑，，或，，拓樸異構酶抑制劑，，為抑制形 成染色質之正常蛋白質功能的物質，例如拓樸異構酶^口 π。此類抑制劑的實例包括拓樸異構酶〗的喜樹鹼(campt〇_ thecine)及其衍生物如伊立替康（irin〇tecan)或托普替康 15 (toPotecan);拓樸異構酶Π的依託泊苷（etoposide)、依託泊 普石粦酸鹽和替尼泊普(teniposide) 〇 “新生血管阻斷劑，，係可抑制血管生長的任何藥物、化 合物、物質或藥劑。新生血管阻斷劑的實例包括，但不侷 限於雷佐生（razoxin)、馬立馬司他(marimastat)、巴馬司他 20 (batimastat)、皮諾馬司他（prinoniastat)、泰洛馬司他（tano-mastat)、伊洛馬司他（ilomastat)、CGS-27023 A、鹵夫酮 (halofuginone)、COL-3、癌立消（neovastat)、BMS-275291、 沙利度胺(thalidomide)、CDC 501、DMXAA、L-651582、 角鯊胺（squalamine)、英多司他、;丁（endostatin)、SU5416、 200829602 SU6668、α -干擾素、EMD121974、白介素-12、IM862、 血管抑制素(angiostatin)和 α V /3 3 整合素(Vitaxin)。 “抗***劑”或，，***拮抗劑，，指可降低、拮抗或抑 制***作用的任何物質。此類藥物的實例包括他莫昔芬 5 (tam〇xifen)、托瑞米芬(toremifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、 屈洛昔芬(droloxifene)、埃醯昔芬(iodoxyfene)、阿那曲11 坐 (anastrozole)、來曲嗤（letrozole)和依西美坦（exemestane) 0 “抗雄激素劑”或”雄激素拮抗劑，，指可降低、拮抗或抑 制雄激素作用的任何物質。抗雄激素的實例包括氟卡胺 10 (flutamide)、尼魯米特(nilutamid)、比卡魯胺(bicalutamid)、 螺内酯（spironolactone)、醋酸環丙孕酮(cyproterone)、非那 雄胺(finasteride)和西口米替丁（cimitidine)。 免疫調節劑為刺激免疫系統的物質。免疫調節劑的實 例包括干擾素、白介素例如阿地白介素（aldesleukin)、 15 OCT-43、地尼白介素-毒素連接物(denileukin diftitox)或白 介素-2 ;腫瘤壞死因子例如他索納明（tasonermin)，或其他 類型的免疫調節劑例如香菇多_體（lentinan)、西佐糖 (sizofiran)、羅喹美克(roquinimex)、匹多莫德(pid〇tim〇d)、 培加酶(pegademase)、胸腺喷丁(thymopentin)、聚I : C或左 20 美素(levamisole)併用5-氟尿定。 進一步細節，熟習本技術者可參考法國治療化學教師 學會稱為”治療化學”第6卷，治療癌症的抗腫瘤藥物和展 望，TEC和DOC編輯，2003[法文]所出版的手冊。 在一最佳具體實施例中，本發明組成物之組合產品的特 42 200829602 徵為該細胞毒性劑係被化學結合至該抗體以供同時使用。 在一最佳具體實施例中，該組成物的特徵為該細胞毒 性/細胞抑制劑係選自紡錘體抑制劑或穩定劑，較佳為長春 瑞賓及/或長春氟寧(vinflunine)及/或長春新鹼。 5 為有助於該細胞毒性劑及根據本發明之抗體間的結 合，可於该一化合物之間引入間隔分子以結合例如聚（亞院 基)甘醇聚乙二醇或胺基酸；或在另一具體實施例中，該細 胞毋性劑可使用被引入能與該抗體反應之功能的活性衍生 物。這些結合技術已為技術者所習知，因此在本發明中不 10 詳加討論。 其他EGFR抑制劑包括，但不侷限於單株抗體C225和抗 EGFR 22Mab(ImClone糸統公司）、abX-EGF (Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)或化合物 ZD-1834、 ZD-1838和ZD_1839(阿斯利康公司）、ρκΐ-166(諾華）、 15 PKI-166/CGP-75166(諾華）、PTK 787(諾華）、CP 701 (Cephalon)、氟諾胺（fhmomide)(法馬西亞/薩基公司）、 CI-1033(華納蘭伯特藥廠）、CI-1033/PD 183、805(華納蘭伯 特藥廠）、CL-387、785(美國惠氏藥廠）、BBR-1611(德國寶 靈曼/羅氏）、naamidine A(必治妥施貴寶）、RC-3940-II(法馬 20 西亞）、BIBX-1382(百靈佳殷格翰）、〇LX-103(默克公司）、 VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素（Seragen生技 公司）、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808 (Imperial 癌症基金會）、RG-50864(INSERM)、LFM-A12 (Parker Hughes癌症中心）、WHI-P97(Parker Hughes 癌症中心）、 43 200829602 GW-282974(葛蘭素）、KT_8391(協和發酵公司）或，，邱哎疫 苗”(York醫學/免疫分子中心）。 ^ 本發明的另-態樣係關於一種共扼細胞性毒素及/或 一放射性同位素之含有至少_種該抗體或其衍生化合物或 5 功能片段的组成物。 讜毒素或放射性同位素較佳為能阻止腫瘤細胞的生長 或增殖，更佳為能完全不活化該腫瘤細胞。 該毒素較佳為一種腸桿菌毒素，更佳為綠膿桿菌外毒 A(Pseudomonas exotoxin A) 〇 10 該放射性同位素較佳為結合治療性抗體，該放射性同位素 可發射較佳為破131、紀9G、金199、|巴_、銅67、絲217和錄川的 T-射線。發射α和/3的放射性同位素亦可被用於治療中。 “毒素或放射性同位素結合至少一種本發明的抗體或 其功能片段”指可將該毒素或放射性同位素結合至少一種 15抗體的任何方法，較佳為在有或無結合分子之下以共價鍵 結合該兩種化合物。 可化學（共價鍵）、靜電或非共價鍵結合全部或部分共輛 分子之藥劑的實例特別包括苯酿(benzoquinone)、碳二亞胺 (carbodiimide)及更特別指EDC(1 -乙基-3-[3-二甲基胺丙基] 20 碳二亞胺鹽酸鹽）、二醯亞胺(dimaleimide)、二硫雙确基苯 甲酸(DTNB)、N_琥珀硫亞胺基S-乙醯基硫醋酸鹽（SATA); 與一或多個基、與一或多個疊氮苯基、與紫外線(UV)反應 的硫化劑，最佳為N-[4-(疊氮柳胺基）丁基]-3’-(2,比啶基二 硫）丙醯胺(APDP)、N-琥珀硫亞胺-3-基(2-吡啶基二硫）丙酸 44 200829602 鹽（SPDP)和6-肼基菸鹼醯胺(HYNIC)。 用於放射性同位素的另一種較佳結合形式為利用雙功 能離子螯合劑。 此類螯合劑的實例包括源自用於結合特別指放射性同 5位素金屬及免疫球蛋白之四醋酸乙二胺(E D TA)或五醋酸二 乙三胺(DTPA)的螯合劑。因此，DTPA及其衍生物可在碳鏈 上被各種基團所取代而使其增加配體-金屬複合物的穩定 性和硬度（Krejcarek等人，1977 ; Brechbiel等人，1991 ; Gansow，1991 ;美國專利案4,831，175)。 10 例如，長久以來五醋酸二乙三胺(DTPA)及其衍生物之 游離型或與金屬離子的複合物已被廣泛地用於藥物和生物 學中而可形成與金屬離子的穩定螯合物，其可被治療或診 斷用蛋白質如抗體所螯合以形成用於癌症治療的放射性免 疫共軛物(Meases等人，1984 ; Gansow等人，1990)。 15 形成該共軛物之本發明的該至少一種抗體較佳為選自 其功此片段’更佳為已失去其Fc成分如scFv片段的片段。 本發明亦包括使用該組成物於製備用於預防或治療癌 症的藥物。 本發明亦係關於使用根據本發明較佳為人源化的抗體 20或其衍生化合物或功能片段，及/或組成物於製備用於抑制 腫瘤細胞生長的藥物。通常，本發明係關於使用較佳為人 源化的抗體或其衍生化合物或功能片段，及/或組成物於製 備用於預防或治療癌症的藥物。 可被預防及/或治療的癌症較佳為包括***癌、骨肉 45 200829602 肺癌、***癌、子宮内膜癌、大腸癌、多發性骨髓瘤、 印巢癌、騰腺癌或任何其他的癌症。 在一較佳方式中，該癌症係一種選自***相關*** 癌、非小細胞肺癌、大腸癌及/或胰腺癌的癌症。 5 本發明的另一態樣係關於使用該抗體較佳為在活體外 乍為θ斷與JAM_A表現程度有關之疾病的方法。在該診斷 方法中，該JAM-A蛋白有關的疾病較佳為癌症。 因此’本發明之抗體或其衍生化合物或功能片段可被 用於偵測及/或定量活體外之生物樣本内j A μ - A蛋白的方 10法中，其較佳為被用於診斷與此蛋白異常表現如癌症有關 的疾病，其中該方法包括下列的步驟： a) 使該生物樣本接觸根據本發明的抗體或其衍生化 合物或功能片段； b) 測定其可能形成的抗原_抗體複合物。 15 因此，本發明亦包括用於執行所述方法的套組或配件 (用於偵測來自巴黎嗜肺性退伍軍人桿菌或相關生物，或用 於偵測及/或鍅定巴黎嗜肺性退伍軍人桿菌或相關微生物 的基因表現），其包含下列的成分： a)本發明的多株或單株抗體； 20 b)視需要，用於構成有利於免疫學反應之介質的試 劑； c) 視需要，能呈現該免疫學反應所產生之抗原-抗體複 合物的試劑。 該抗體或其功能片段可被固定於較佳為蛋白質晶片的 46 200829602 支撐物上。本發明的目的為製造一種此類蛋白質晶片。 該蛋白質晶片較佳為被用於偵測及/或定量生物樣本 内之JAM-A蛋白的套組或配件内。 必需說明此處“生物樣本，，一詞係指從活體生物採集的 5樣本(較佳為血液、組織、器官或取自較佳為人類之哺乳動 物的其他樣本）或可能含有一種此類JAM-A蛋白的任何樣 本(例如需要時被轉化的細胞樣本）。 為獲得可偵測及/或可定量信號，該抗體或其功能片段 可為免疫共輕物的形式或為一標示抗體。 10 本發明之標不抗體或其功能片段包括例如抗體共軛物 (免疫共輛物）’其可與酵素相結合例如過氧化酶、鹼性碟酸 酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖澱粉酶、碳 酸酐酶、乙醯膽鹼酯酶、溶菌酶、蘋果酸酯脫氫酶或葡萄 糖-6-磷酸鹽脫氫酶或藉由一分子例如生物素、毛地黃配體 15 (dig〇xisenin)或5_溴脫氧尿嘧啶。本發明之抗體或其功能片 段亦可結合螢光標示物較佳為包括螢光素和其衍生物、螢 光染料、羅丹明（rhodamine)和其衍生物、綠色螢光蛋白 (GFP)、丹磺醯(dansyl)、傘形花内酯（umbemfer〇ne)等。在 此類共輊物中，可藉由熟習本技術者所習知的方法製備本 20發明之抗體或其功能片段。其可直接結合酵素或螢光標示 物，經由一聯結基團或鏈結基例如聚酸、戊二酸、五醋酸 二乙二胺ΦΤΡΑ)或五醋酸一乙三胺(DTpA);或存在結合劑 例如上述用於治療性共耗物者。藉由與異硫氛酸鹽的反應 可製備攜帶螢光標示物的共軛物。 47 200829602 5 其他共輛物亦τ包括丨學發光標示物例如魯米諾 (luminol)和二氧烧ig(dioxetane);生物發光標示物心】士螢光 素酶dudfe—和t光素(ludferin);歧射性標=例如 …碘125、碘126、碘⑶、溴77、鍀、、銦丨丨丨、銦 釕95、_97、釕⑻、釘105、采阳、表2。3、銖 1〇1、銖⑼、銳47、碲⑵爪、碲心、碑心、録165、鐘167、 氟18、纪199和蛾⑶。目前熟習本技術者所習知用於結 合放射性同&素與&體的方法係直接或經由聲合劑例如上 述的EDTA或DTPA ’其亦可被用作為診斷用的放射性同位 123 67、鎵 68 鎵 99m 銖铥168 10 15 素。因此必需提及藉由氣胺_T技術標示以[碘⑵^鈉田仙 W.M.和 Greenwood F.C.( 1962)細騰 194: 495];如 Cr〇ckf〇rd 等人所述標示以鍀99m (美國專利案4,424,2〇〇)或如
Hnatowich所述經由DTPA結合（美國專利案4,479,93〇)。 本發明係關於使用根據本發明之抗體於製備專一性地 針對表現或過度表現jAM_A蛋白生物活性細胞之化合物的 藥物。 就本發明描述的意義而言，一”生物活性化合物，，指能 凋節較佳為抑制細胞生長、增殖、轉錄和基因轉譯之活動 的任何化合物。 本發明亦係關於由較佳為標示放射性同位素之根據本 發明抗體或其功能諸，以及制於較佳域測細胞表現 或過度表現JAM-A蛋白有關癌症之醫學造影的一種體内診 斷試劑。 本發明亦係關於一種用作為藥物之根據本發明組合產 48 200829602 品或抗JAM-A/毒素共軛物或放 禮作為組合產品或杜^仏 射性同位素的組成物。
在本發明的描述中，，， 劑及/或醫藥上載劑。
徑被熟習本技術者所採用。 10 M化合物較佳為經㈣、統性途徑被投藥，更佳為夢 由靜脈内、肌肉内、皮内、腹腔内、皮下或口服途經^ 組成物更佳為由根據本發明之抗體以相同間隔時間的數= 劑量被投藥。 可根據一般適合用於病人治療的標準舉例如病人的年 I5齡或體重、疾病的嚴重程度、對治療的忍受度以及可能發 生的副作用決定其投藥途徑、給藥方法和最適劑型。 因此，本發明係關於使用抗體或其一功能片段於製備 專一性地針對表現或過度表現JAM_A蛋白生物活性之化人 物的藥物。 σ 20 藉由下列說明的實例和圖示進一步描述本發明的其他 特徵和優點。 圖式簡單說明 第1圖分別為鼠6F4抗體之重鏈和輕鏈的序列。以底、線 粗體字表示其CDRs(根據Kabat編號）。 49 200829602 第2A和2B圖分別比對鼠6F4抗體之V(第2A圖）和J(第 2B圖）區與選自v區之IGKV19_93*叫序列辨識編謂及】 區之IGKJl*〇l(序列辨識編號4〇)的鼠細胞株。 第3A和3B圖分別比對鼠6F4抗體之V(第3八圖）和J(第 5 3B圖）區與選自V區之IGKV1_33*〇1(序列辨識編號叫及顶 之IGKJ1*01(序列辨識編號42)的人類細胞株。 第4圖代表參考各自KABAT和IMGT編碼系統之6ρ4抗 體輕鏈的蛋白質序列。 苐5A、5B和5C圖分別比對鼠6F4抗體之v(第圖）、 1〇 D(第5B圖）和J(第5C圖）區與選自V區之IGKV1S135 *01(序 列辨識編號43)、D區之IgHD-ST4*01(序列辨識編號44)及】 區之IGHJ2*01(序列辨識編號45)的鼠細胞株。 第6A、6B和6C圖分別比對鼠6F4抗體之v(第6A圖）、 D(第6B圖）和J(第6C圖）區與選自V區之lGHV1_f *〇1(序列 15辨識編號46)、D區之IgHDl-l*01(序列辨識編號47)&j區之 IGHJ4*01(序列辨識編號48)的人類細胞株。 第7圖為參考各自KAB AT和IMGT編碼系統之6F4抗體 重鏈的蛋白質序列。 第8A和8B圖為來自HT-29細胞膜之6F4抗原的6F4_^ 20 脂糖凝膠免疫純化反應。亦顯示藉由SDS-PAGE電泳法（第 8A圖）和西方墨點法（第8B圖）收集的分率。 第9A和9B圖為藉由免疫純化蛋白之SDS-PAGE電泳法 (第9A圖）和西方墨點法（第9B圖）的分析。在還原和非還原條 件下進行及分析該兩種純化物(#1和#2)。 50 200829602 第10圖為胰蛋白酶水解後藉由maldi-tof質譜儀萃 取的肽混合物。 第11A和11B圖係藉由西方墨點法（非還原條件）所鏜定 之經確認蛋白質的組成：顯示利用6F4抗體（第11A圖）和抗 5 人類JAM-A多株抗體（第11圖）。 第12圖顯示6F4抗體對人類JAM-A蛋白的專一性。各蛋 白的沈積數量分別為250奈克、25奈克和1〇奈克。 第13圖為注射6F4抗體2分鐘（雙箭頭）之後在100奈米 之鼠JAM1 Fc蛋白（流通槽#1，下圖）和鼠JAM1 Fc蛋白（流通 10 槽#2，上圖）的HBS-EP緩衝液内於5分鐘25°C解離時間和流 速30微升/分鐘（CM4 ·· m-JAMl-Fc 501.6 RU(Fcl)和511.5 RU(Fc2))的感應圖。 第 14圖為以雙基準(Fc2-Fcl)6F4(FC2-Fcl)HBS-EP獲得 的感應圖。利用Langmuir A+B結合模式適配此曲線。依如 15下方法計算其動力學參數（黑色曲線）：ka=(1.38 士 0·001)*105Μ_ν ; kd=(0.25±1.58)*l(TV ; Rmax(整體適 配)=371 RU ; κ 2 =0.853。 弟15圖說明6F4抗體在瑞士裸鼠MCF-7細胞之異種移 植模式内的抗腫瘤活性。以未純化型（腹膜腔液）的25〇微克/ 20小白鼠每週兩次理論劑量藉由IP途徑測定該6F4抗體。該 9G4抗體係一種與活性測定無關的同種型（IgG丨)抗體。 第16圖說明在各種腫瘤株表面藉由Mab 6F4確認的 JAM-A蛋白表現。 第17圖為人源化6F4 VL功能區的序列，其中：*相當於 51 200829602 事實上改變成其人類複本的胺基酸；1相當於分析其被人源 化能力的胺基酸，符號下方為人源化殘基；以及2相當於人 源化6F4 VL功能區内保留鼠的胺基酸。 第18圖為人源化6F4 VH功能區的序列，其中：*相當於 5事實上改變成其人類複本的胺基酸；1相當於分析其被人源 化能力的胺基酸，符號下方為人源化殘基；以及2相當於人 源化6F4 VH功能區内保留鼠的胺基酸。 第19圖說明6F4 MAb所誘導的活體外JAM-A向下調 即° 10 第20圖說明6F4 MAb所誘導的體内抑制腫瘤細胞增 殖。 第21圖為6F4MAb之體内JAM-A的向下調節。 第22圖為6F4及其F(ab’)2片段於MCF-7體内模式的比 較曲線。 15 第23圖說明正常對腫瘤表現之JAM-A於甲狀腺組織的 比較。 第24圖說明正常對腫瘤表現之jam-A於肺組織的比 較。 第25圖說明正常對腫瘤表現之jam-A於***組織的比 20 較0 第26圖為說明6F4於裸鼠内A431鱗狀上皮癌異種移植 物的體内活性。 第27圖說明6F4抗體對(A)以PHA誘導之非專一性淋巴 增生；及(B)抗原呈現過程的效應。以2獨立供體的第一試驗。 52 200829602 第28圖說明6F4抗體對(A)以PHA誘導之非專一性淋巴 增生；及(B)抗原呈現過程的效應。以2獨立供體的第二試驗。 第29圖說明10種人類正常供體的血小板凝集作用。以 平均±標準偏差表示其結果。 5 第30圖為10種人類正常供體的血清素釋放作用。以平 均士標準偏差表示其結果。 第31圖為6F4 VH功能區與IGHV1_03*01胚系基因（序 列辨識編號49)的比對。 【實施方式：！ 10 f例1 : 6F4抗碰的產生 利用取自美國菌種收集中心（ATCC)的5xl06個MCF-7 細胞免疫BALB/C小白鼠以產生鼠單株抗體(Mab)。 在最後注射107個MCF-7細胞加強免疫注射之後，利用 述於Kohler和Milstein的習知技術使來自小白鼠淋巴結的細 15 胞與SP2/〇-Agl4骨髓瘤細胞相融合。然後篩檢經融合骨髓 瘤之上清液於體外抑制MCF-7細胞的功能活性。 篩檢時，在96-孔培養皿内將MCF-7細胞以5x103個細胞 /孔培養於100微升不含胎牛血清的雜交瘤介質。該平板在 37°C的5% C02大氣下培養24小時。在24小時之後，將50微 20升被筛檢雜交瘤的上清液加入各孔内。盤中的最後一行保 留作為對照： -二孔加入50微升與活性無關的雜交瘤上清液並培養 於與融合細胞相同的培養液内。這些孔將被用於檢查無活 性上清液對併入滴定胸腺嘧啶的影響； 53 200829602 -三孔將被加入50微升的雜交瘤培養液。 在培養約52小時之後，各孔加入〇 25微居里（μα)的[3h] 胸腺噹啶然後於37°c再培養2〇小時。利用液體閃爍計數定 里被併入DNA内之顯示細胞增生的[3H]胸腺嘧啶。測定背 5景餘音和臨界值作為各平板内單獨含介質及非相關雜交瘤 上清液之對照孔的基礎值。 藉由此方法，在第一次篩檢之後選取可抑制MCF-7細 胞生長的43株雜交瘤分泌抗體。這些43株雜交瘤中捨棄其 中7株弱或未冒生長者。擴增和選殖雜交瘤之後所進行的增 10生試驗過程中，僅選取其上清液對MCF-7細胞之增殖具有 -20%抑制活性的雜交瘤。在選殖/選擇過程結束後，僅有 一選殖株具有所需的性質，即6F4選殖株。 f例2 :藉由6F4抗饉翅健可變區（6F4 VL1之CDR-嫁接的人 源化方法 15 比較6F4VL核苷酸序列與全部已知的鼠細胞株序列 如藉由CDR-嫁接的人源化最初步驟，初步比較該6F4 VL核苷酸序列與存在於IMGT資料庫（網址：http://imgt. cines.fr、内的全部鼠細胞株序列。
小白鼠細胞株的V和J區具有分別與IGKV19-93*01 (序 20 列辨識編號39，EMBL命名：AJ235935)和IGKJ1*01(序列辨 識編號40，EMBL命名：V00777)98.56%之V區及100%之J 區的序列相似度。 就這些序列相似度百分比而論，決定直接使用6F4 VL 序列。 54 200829602 這些比對就V區而言係示於第2A圖，就J區而言係示於 第2B圖。 W比較6F4VL核苷酸序列與全部已知的人細胞株序列 為鑑定用於CDR-嫁接的最佳人類候選者，尋找與 5 VL具有最大可能相似度的人類原始胚系。就此目的而言， 比較小白鼠6F4 VL的核苷酸序列與IMGT資料庫内的全部 人類細胞株序列。 人類原始細胞株的V和J區與IGKV1-33*01(序列辨識編 號4卜EMBL命名：M64856)之V區的序列相似度為91.36% 10以及與IGKJl*〇l(序列辨識編號42，EMBL命名：J〇〇242) 之J區為86.84%。 因此選擇V區之IGKV1-33*01及J區之IGKJl*〇l作為用 於小白鼠6F4 VL CDRs的人類受體序列。 這些比對就V區而言係示於第3A圖，就J區而言係示於 15 第3B圖。 c) 6F4 VL的人源化型 在人源化過程的下列步驟中為連接IGKV1-33*〇1* IGKJ1*01細胞株序列然後將小白鼠6F4 vl CDRs連接至這 些相同胚系的骨架區。 20 由於其扮演維持分子立體結構（CDRs的標準構造、 VH/VL界面等）或結合該抗原的角色，因此處理小白鼠佔4 Fv區之分子模型的階段在保存小白鼠殘基的選擇上特別有 用。在該骨架區中，需極小心地分別檢查小白鼠(6F4 VL) 和人類（IGKVl_33*〇l/IGKJl*〇l)核苷酸之間的差異。 55 200829602 為更清礎之便，下列第4圖中列舉參考KABAT和IMGT 分類法中代表6F4VL的序列。 鑑定出必需保留的三種小白鼠殘基。 殘基33 (lie)參與根據IMGT的CDR1錨定以及其為根據 5 Kabat 的 CDR1 — 部分。
殘基49(His)參與根據IMGT的CDR2錨定、參與VH/VL 界面以及屬於Vernier區。 殘基5 3 (Thr)參與極據IMGT的CDR2錨定以及其為根據 Kabat 的 CDR2—部分。 10 最初，將研究IGKV1_33*01和IGKJ1*01之骨架區内的 三種變化。這些變化與殘基24、69和71(IMGT命名）有關。 當然，亦必需瞭解此三種變化將分別獨立及以各種組合被 研究。為了進行其測定及選擇具有保存最佳結合性能的突 變株，因此其目的為獲得可能的全部突變株。因此對各突 15 變株進行ELISA/Biacore結合試驗。 殘基24(Lys/Gln)接近CDR1以及其為用於維持適當代 表CDR1構造的關鍵。更明確而言，此殘基可與Vernier區内 的殘基69〜70相互作用。Lys在人類VLs中僅稍具代表性但為 根據Kabat為CDR1的一部分。 20 殘基69(Arg/Thr)雖然在Vernier區内而因此直接參與 CDR1的標準構造，但此殘基在人類VL内經常為Thr。 殘基71(Tyr/Phe)雖然直接參與CDR1的標準構造，但其 為人類VL内的系統性Phe。 其次，可考慮將殘基56(Ala)修飾成Thr。此殘基雖然根 56 200829602 據IMGT為在CDRs的外側，但是根據Kabat其屬於CDR2。 第三及最後，在殘基34和55(IMGT命名）可進行兩種附 加的變化。在IMGT定義之CDR外側的該兩種殘基被包含於 Kabat定義的CDRs内。 5 殘基34(Ala/Asn)屬於根據Kabat的CDR1以及參與 VH/VL界面。此類突變儘管在人類中具有Ala的強代表性但 仍具有相關性。 殘基55(Gln/Glu)根據Kabat為CDR2的一部分以及亦參 與VH/VL的界面。此類突變儘管在人類中具有Gln的強代表 10 性但仍亦保留其相關性。 如上所述，可獨立或以各種組合測定此三種突變。 實例3 ··藉由6F4抗鳢重鏈可蝣區（6F4 VH)之CDR-嫂拢的又 源化方法 d)比較6F4 VH核苷酸序列與全部已知的鼠細胞株序列 15 如藉由CDR_嫁接的人源化最初步驟，初步比較該6F4 VH核苷酸序列與存在於IMGT資料庫（網址：httpi/Zinr^ cines.fr)内的全部鼠細狍梓序列。 鼠細胞株的V、D和J區具有99.30%與V區（IGHV 1S135*01 ;序列辨識編號43 ; EMBL命名：AF304556)' 80% 20與D區（IgHD-ST4*〇l ;序列辨識編號44 ; EMBL命名： M23243)以及100%與J區（IgHJ2*01 ;序列辨識編號45 ; EMBL命名：V00770)的序列相似度。 這些比對就V區而言係示於第5A圖，就D區而言係示於 第5B圖，就J區而言係示於第5C圖。 57 200829602 就這些序列相似度百分比而論，如同6 F 4 V L決定直接使 用6F4 VH序列。 \))比較6F4 VH核苷酸序列與全部已知的人細胞株序列 為鑑定用於CDR-嫁接的最佳人類候選者，尋找分別與 5 6F4 VH之V、D和J三區具有最大可能相似度的人類原始胚 系。就此目的而言’比較小白鼠6F4 VH的核苦酸序列盘 IMGT資料庫内的全部人類細胞株序列。 被鑑定之人類原始胚系具有75.34%與V區（iGHV1_ f*01 ;序列辨識編號46 ; EMBL命名：Z12305)、71.42%與 10 D區（IGHD1-1*01 ;序列辨識編號47 ; EMBL命名：X97051) 以及87.51%與J區（IGHJ4*01 ;序列辨識編號48 ; EMBL命 名：J00256)的序列相似度。 就V、D和J各區而言，選擇上述胚系並於其間進行重排。 這些比對就V區而言係示於第6A圖，就D區而言係示於 15 第6B圖，就J區而言係示於第6C圖。 c) 6F4 VH的人源化型 在人源化過程的下列步驟中為連接、 IGHD1-1*01和IGHJ4*01細胞株序列然後將小白鼠綱VH CDRs連接至這些相同胚系的骨架區。 20 由於其扮演維持分子立體結構（CDRs的標準構造、 VH/VL界面等）或結合該抗原的角色，因此處理小白鼠6F4 Fv 區之分子模型的階段在保存小白鼠殘基的選擇上特別有用。 在该骨架區中’需極小心地分別檢查小白鼠(6F4 VH)和人類 (IGHV1-PG1、IGHDM*G1和腿;㈣)核_之間的差異。 58 200829602 為更清礎之便，下列第7圖中列舉參考καβατ*ΙΜ(}τ 分類法中代表6F4VL的序列。 如同輕鏈所述，鑑定出必需保持不變的四種殘基。 殘基2(Ile)屬於Vernier區的一部分以及參與CDR3構 5 造。 殘基柯如)參與根據IMGT的CDR1錨定、為根據Kabat 的CDR1一部分，以及參與VH/VL界面和與CDR3相互作用。 殘基州1»參與根據IMGT的CDR2錨定、為根據Kabat 的CDR2—部分，亦屬於vernier區的一部分和亦參與vh/VL 界面。 殘基59(Arg)參與根據IMGT的CDR2錨定、為根據Kabat 的CDR2—部分和參與vh/VL界面。 第一人源化型分別在殘基61、62和65將能包括三種突 變(IMGT分類法）。
15 此三種殘基係位於根據Kabat的CDR2内及參與VH/ VL 界面。 殘基61(Asn/Ala)與抗原辨識無直接關聯。因此可考慮 其突變。 殘基62(Gln/Glu)和殘基65(Lys/Gln)。 20 第二，將評估兩種附加變化。此兩種變化係關於殘基 48和 74(IMGT命名）。 屬於骨架區的殘基48(Ile/Met)參與VH/VL界面。 殘基74(Lys/Thr)為Vernier區的一部分及與CDR2構造 有關。 59 200829602 苐二和隶後，可考慮弟二種糸列的突變，亦即改變殘基 9(PiO/Ala)和41(HiS/PtO)。因此其目標為依照類似例vL計劃 突變的方式在不修飾CDR錫定之下使其儘可能接近人源胚系。 僅為摘錄之目的，下列表4和5列舉所使用的細胞株以 5 及其各別的胺基酸和核苷酸序列編號。 表4 胚系（EMBL參考） 序列辨識編號 IGKV19-93*01(AJ235935) 39 IGKJ1*01(V00777) 40 IGKV1-33*01(M64856) 41 IGKJ1*01(J00242) 42 IGHV1S135*01(AF304556) 43 IGHD-ST4*01(M23243) 44 IGHJ2*01(V00770) 45 IGHVl-f*01(Z12305) 46 IGHD1-1*01(X97051) 47 IGHJ4*01(J00256) 48 IGHV1-03*01(X62109) 49 Μ 胚系（EMBL參考） 序列辨識編號 IGKV19-93*01(AJ235935) 50 IGKJ1*01(V00777) 51 IGKV1-33*01(M64856) 52 IGKJ1*01(J00242) 53 IGHV1S135*01(AF304556) 54 IGHD-ST4*01(M23243) 55 IGHJ2*01(V00770) 56 IGHVl-f*01(Z12305) 57 IGHD1-1*01(X97051) 58 IGHJ4*01(J00256) 59 IGHV1-03*01(X62109) 60 60 200829602 f例4 :免痖親釦性純化6F4抗艚抗廣摞样的純化和鑑別 從富含HT-29細胞的膜質部分純化6F4抗體的抗原標 靶。在增溶於含150毫克分子NaCl、TritonX-l〇〇和IGEPAL 5的50毫克分子ΡΗ 7·4之Tris/HCl緩衝液内之後，將膜蛋白於 6F4抗體固定於瓊脂糖凝膠球之溫和攪拌的4。〇下培養隔 夜。為了清除吸附其上的非特異性蛋白以含清潔劑的各種 溶液沖洗形成於球珠上的6F4-Ag複合物。利用pH 2.7的0.1 克分子Gly/HCl緩衝液從6F4-瓊脂糖凝膠支撐物上洗脫該 10 6F4抗原標靶。在轉置硝化纖維素膜(使用0.5微克/毫升的原 始6F4抗體，藉由化學發光進行偵測）之後藉*SDS_ pAGE 電泳法（10%凝膠，非還原條件)和西方墨點法分析其收集部 分以選取富含標的抗原的部分（第8A和8B圖）。西方墨點法 的分析證實在未選取部分和清洗液，以及其後酸性pH下的 15特異性洗脫液内不存在該標的蛋白。 然後在上述條件下藉由SDS-PAGE電泳法（丨〇%凝膠)和 西方墨點法分析取自該兩種純化物的濃縮部分。在還原條 件下分析之後西方墨點法中被仆4抗體辨識的抗原具有％ 仟道耳頓的表觀分子量（第9A和9B圖）。可注意在非還原條 20件下進行電泳之表觀分子量的差異··在這些條件下，其事 實上稍低於還原條件下所觀察的表觀分子量。 抵原標靶的鑑定 在SDS-PAGE電泳（1〇〇/0凝膠)之後，利用與質譜分析相 容的方法以藍膠(colloidal blue)染色該蛋白（第1〇圖）。利用 61 200829602 手術刀切下藉由西方墨點法所偵測到之蛋白的染色帶然後 藉由培養於25毫克分子碳酸氫胺溶液内去染色。在還原 (DTT)/烷基化(碘乙醯胺)及藉由胰蛋白酶(Promega)於，，凝 膠内”水解(37°C下隔夜)該蛋白質之後，以在離胺酸和精胺 5 酸殘基的蛋白質分解酵素水解蛋白質而釋出在C-端位置具 有離胺酸或精胺酸殘基的胜肽，然後於存在甲酸之下利用 乙腈/水混合物(70/30，體積/體積）萃取該產生的胜肽。然後 10 於存在ATFA之與基質（α-氰-4-沒基桂皮酸，Bruker Daltonics)的混合物内於MALDI標粗上進行沈積，接著藉由 MALDI-TOF質譜法(Autoflex，Bruker Daltonics)進行分析。 獲得的質譜示於第1 〇圖。利用源自此分析所列舉的胜肽夢 由Mascot搜尋引擎(Matrix Sciences)搜尋資料庫以鑑定該蛋 白質。 侷限於人源蛋白質的NCBInr資料庫搜尋結果顯示三種 15 蛋白具有意義的分數(分數>64): 1 ·弟1型人類細胞連接黏附分子的結晶構造 分數=116 此蛋白相當於作為結構研究2F11R/JAM_A蛋白的 細胞外功能區。 20 2. F11受體（趨代Λ) 分數=116 此蛋白相當於蛋白F11R/同種型A的前驅物。 3· F11受體同種型B(趨#λ) 分數=65 62 200829602 此為蛋白F11R之同種型b的前驅物，其就同種型A 而言具有20個胺基酸的兩個刪除。 藉由此方法所鑑定的蛋白質因此被稱為F11R或F11受 體。當被第一次描述作為所謂F11抗體之受體時其事實上被 5 採用作為正式指定的蛋白質（Naik等人，1995，/·， 310: 155〜162)。目前已更瞭解此被稱為jam_a或”細胞連 接黏附分子A”的蛋白質，其亦被稱為jam卜PAM-1、CD321 或抗原106。 藉由胰蛋白酶水解和藉由質譜儀分析所釋出的胜肽 10中，具有來自相當於人型JAM-A/同種型A理論水解胜肽之 0.1道耳頓内實驗分子量的九種胜肽。此九種胜肽涵蓋37〇/〇 的蛋白質主要序列。此外，JAM-A前驅物的理論分子量 (〜32.9仟道耳頓）與SDS-PAGE實驗測定的表觀分子量具有 —致性° 15氣鱼A方墨點的鑑定砝铖玆摞鉍 然後將藉由蛋白質組學檢測法所鑑定的jAM-Α經由西 方墨點法確認（非還原條件下於1 〇%的SDS_PAGE凝膠内， 6F4抗體為〇·5微克/毫升，藉由化學發光法偵測）。 如第11A圖所示，該6F4抗體可辨識HT-29膜萃取物和 20藉由免疫純化的濃縮部分内（表觀分子量=35仟道耳頓），以 及雙聚體重組蛋白 JAM-A/Fc(R&D Systems ref. 11 〇3_JM， 表觀分子量〜120仟道耳頓）的天然JAM-A蛋白。此辨識等同 於稀釋至1/1000的市售抗人類JAM-Α山羊多株抗體（r&d
Systems ref· AF1103)(第 11B 圖）。 63 200829602 資例5 : 6F4抗體對人類JAM-A的專一性 在上述條件下藉由西方墨點法測定該6F4抗體的專一 性。
第12圖顯示由於該6F4抗體可辨識重組蛋白hJAM-A 5 /Fc(R&D Systems ref· 1103-JM)因此對人型JAM-A具有專 一性，但無法辨識人型JAM-B和JAM-C(重組蛋白hJAM-B/
Fc和 hJAM_C/Fc ’ R&D Systems ref· 1074-VJ和 1189-J3)或鼠 型 JAM-A(重組蛋白 mJAM-A/Fc，R&D Systems ref. 1074-JM)。 10 f例6 :藉由BIAcore(表面電漿共振)測定6F4抗醴的親和力 根據公式 KD=kd/ka(Rich和 Myszka，J. Mo/. Acog.， 2005，18 : 431)可從結合動能(ka)(l/米秒)和解離動能(kd)(l/ 秒）的測定利用BIAocre計算6F4抗體對可溶蛋白JAM-1-Fc(細胞外功能區融合抗體以片段及於ns〇細胞内重組所形 15 成）的親和力常數KD(克分子）。 材料和方法 使用儀器：BIAcore X和BIAevauation 3·1 X軟體(Uppsala，SW) 試劑： -鼠單株6F4抗體：1.3毫克/毫升 20 -人JAM-1-Fc(ref· 1103-JM R&D Systems) : 50微克無載劑 -鼠JAM-1-Fc(ref· 1077-JMR&D Systems) ·· 50微克無載劑 -電泳緩衝液·· HBS-EP(BIAcore) 、结合套組：”Amine”(BIAcore) '結合緩衝液：醋酸pH5.0(BIAcore) 64 200829602 -捕捉抗體：山羊IgG Fc抗人類（=GAH，山羊抗人 類）(BIAcore) -再生緩衝液：甘胺酸，pH 1.5鹽酸30秒(BIAcore) 討論和結論 5 第13圖的數據顯示該鼠6F4抗體被結合至人類JAM_1 蛋白的細胞外部分但非結合至鼠JAM_1蛋白的細胞外部。 利用第14圖的數據可在該實驗條件下計算出6F4抗體 對人類JAM-1蛋白的KD為22皮克分子。 該緩慢解離的動能表示抗體對該抗原具有親和力（雙 10 價分析模式）。 實例7: 6F4抗碰於MCF-7異種移植模式内的體内活性 一項未純化及250微克/小白鼠劑量腹腔注射的6F4抗體 試驗證明此抗體可明顯抑制體内MCF-7細胞的生長，與注 射PBS的小白鼠比較其抑制百分率達56%(第15圖）。用作為 15 IgGl同種型對照的非相關9G4抗體如預期不具有抗腫瘤活 性。 實例8 : —組腫瘤細胞上囍由6F4辨識抗廣分佈的試驗 為了測定6F4抗體所展示的潛力，根據膜表達圖譜藉由 流式細胞儀研究四種類型的腫瘤。選擇的四種細胞株為 20 MCF-7(***相關***癌）、A-549(非小細胞肺癌）、HT29 和Colo 205(大腸癌）和BxPC3(胰腺癌）。就標示細胞而言， 測定一劑量範圍（10、5、1、0.5、0.25和0.125微克/毫升）。 示於第16圖的結果顯示6F4抗體可辨識大量表達於全 部受測細胞表面的抗原。該獲得的標定為可飽和，證明其 65 200829602 具有專一性。以1微克/毫升的抗體可使該位置呈飽和，此 證明6F4抗體對JAM-A抗原具有高親和力。 實例9 :藉由6F4抗教輕鏈可變區（6F4 VL)的CDR-嫁接進 行人源化 5 -免疫遺傳分析摘要
結果摘要： 生產IGK重排序列 _____[無終止碼及柜内遠接、 V-基因和對偶基因 1GKV1-33* 01 分數=922 相)以度=81，36% (227/279 nt) J-基因和對偶基因 IGKJ1*01 分數=140 相似度=86, 49% (32/37 nt) CDR-IMGT長度和A A連接 [6,3,8] 1 CLQ， YDNLWTF -鑑定最接近人類V·基因的詳細數據 最接近V-區（從V-區第 一核苦酸3 L第二-CYS密碼子加 上 15 nt的CDR34MGT) 分數 相似度 M64856 IGKV1-33*01 922 81，36%(227/279nt) M64855 IGKV1D-33*01 922 81，36%(227/279 nt) X63398 IGKV1-27*01 868 79,21%(221/279nt) Y14865 IGKV1-NL1*01 841 78514%(218/279 nt) X72817 IGKV1D-43*01 841 78,14%(218/279 nt) -鑑定最接近人類J-基因的詳細數據 10 隶接近區· Z00242 IGKJ1*01 AF103571 IGKJ4*02 J00242 IGKJ4*01 Z70260 IGKJ2*02 Z46620 IGKJ2*04 分數 相似度 140 86,49%(32/37 nt) 122 81,08%(30/37 nt) 113 78,38%(29/37 nt) 104 75,68%(28/37 nt) 95 72?97%(27/37 nt) -關鍵殘基的鑑定 外CDR關鍵殘基的定義和排列涉及數種標準。這些至 66 200829602 少包括已知參與VH/VL界面、抗原結合或CDR結構、鼠和 人類殘基之間的胺基酸種類變化、可變區立體構造内的殘 基定位…等的殘基。 6F4 VL功能區和最接近1(31^1-33*01人胚系V基因之 5間已發現21種不同的胺基酸，其全部為外CDR殘基。這些 21種殘基之中，利用上述參數的分析可鑑定出9種最重要的 殘基。這些鼠殘基為K24、139、A40、H55、T66、Q68、
A69、R85和Y87。此9種殘基之中，其中以在人源化型中仍保 留其鼠源的3種最為重要。這些為分別位於CDR1和CDR2銷定 10的殘基139、H55和T66。最後，將個別及/或分析6種胺基酸的 組合以測定其是否可被人源化或必需保持其原始鼠型。 考慮J區在抗原結合及V區結構化的不相關性，決定使 用天然人類IGKJ1*01胚系基因。 人源化6F4VL功能區的序列設計說明於第17圖： 15 *相當於事實上變成其人類複本的胺基酸 1相當於分析其被人源化能力的胺基酸，符號之下為 其人類殘基 2相當於在人源化6F4VH功能區中仍保留其鼠源的胺 基酸 20免felM:藉由6F4抗碰重鏈可》區（6F4VH)的CDR·雙接被 化的第一迤 -免疫遺傳分析摘要 結果摘要· V-基因和對偶基因 -基因和對偶基因 生產IGH重排序列 (無終止碼及框内連接） IGHV1-P01 分數=796 IGHJ4*01 分數=181 相似度=75, 35%(2JJg88^_ 67 200829602 CDR-IMGT 長度和 AA 連接 [8,8,9]
CARQTDYFDYW D-基因絕對屬於VH功能區内的CDR3g。人源化過程 係根據“CDR-嫁接”法。此方法中無法有效地使用最接近人 類D-基因的分析。 -鑑定最接近人類V·基因的詳細數據 最接近V-區（從V-區第一核苷酸至第二_CYS密碼子的 評估） 相似度 75,35%(217/288 nt) 75,00%(216/288 nt) 74,65%(215/288 nt) 74,65%(215/288 nt) 73,96%(213/288 nt) 分數 Z12305 IGHVl-f^Ol 796 X62106 IGHVl-2*02 787 X92208IGHVl-2*03 782 Z12310IGHVl-2*04 778 M99642 IGHV1-24*01 760 -鑑定最接近人類J-基因的詳細數據 最接近J-區： 分數 相似度 J00256 IGHJ4*01 181 87,23%(41/47 nt) X86355 IGHJ4*02 172 85，ll%(40/47nt) M25625 IGHJ4*03 172 85,ll%(40/47 nt) J00256 IGHJ1*01 138 74,51%(3 8/51 nt) J00256 IGHJ5*01 133 74,00%(37/50 nt) -關鍵殘基的鑑定 10 外CDR關鍵殘基的定義和排列涉及數種標準。這些至 少包括已知參與VH/VL界面、抗原結合或CDR結構、鼠和 人類殘基之間的胺基酸種類變化、可變區立體構造内的殘 基定位…等的殘基。 6F4 VL功能區和最接近IGHVl-f*01人胚系V基因之間 68 200829602 已發現31種不同的胺基酸，其全部為外cdr殘基。這些31 種殘基之中，利用上述參數的分析可鑑定出9種最重要的殘 基。這些鼠殘基為 12、Y40、153、Y55、R66、N68、Q69、 K72和K82。此9種殘基之中，其中以在人源化型中仍保留 5其鼠源的2種最為重要。這些為位於CDR2錨定的殘基Y55 和R66。最後，將個別及/或分析7種胺基酸的組合以測定其 是否可被人源化或必需保持其原始鼠型。 考慮J區在抗原結合及V區結構化的不相關性，決定使 用天然人類IGHJ4*01胚系基因。 10 人源化6F4VH功能區的序列設計說明於第18圖： *相當於事實上變成其人類複本的胺基酸 1相當於分析其被人源化能力的胺基酸，符號之下為 其人類殘基 2相當於在人源化6F4VH功能區中仍保留其鼠源的胺 15 基酸 實例11:藉由6F4抗體重艟可變區（6F4 vm的CDR-嫁接被 人源化的笫二型 鑑定用於CDR_嫁接之人類V-基因候選者的另一種方 式為利用IMGT/DomainGapAlign工具在胺基酸層次上尋找 20 人類同源序列。 -IMGT/DomainGapAlign免疫遺傳分析的結果摘錄如 下： 基因座 品種 功能區 Smith-Waterman 分數 相似度百分比 重疊 IGHV1-3*01 現代人 1 451 64.3 98 -IGHV1-03*01胚系基因（序列辨識編號49，EMBL命 69 200829602 名：X62109)内關鍵殘基的鑑定 6F4 VH功能區和IGHV1_3*〇1蛋白質序列的比對示於 第31圖。 這些殘基的選擇和排序係根據各單一位置對其構造上 5相關性的相對重要性、其已知構造_功能關係、胺基酸種類 改變和獲得第一人源化過程之利益的判別標準。 在第-步订動中，全部不同“外部CDRs”胺基酸除了被 強烈認為與結合CDR2-錯定指定殘基有關的殘基γ55和腿 之外已改變其人類複本。在過程結束時將探究此兩種殘基 10的人源化能力並且將進行全部其他的分析。事實上，恢復 親代抗體的完整活性，6F4 Hz2再人源化VH功能區將隨之 被改善；需要時“去人源化”過程將出現於復原突變中，其 鼠類複本的胺基酸為： 稱為E1Q、K43R和K75R之強組合標準以及相當於需要 15 時被測定“去人源化”第一位置的第一組殘基。 然後來自第二組稱為K48Q、S49R、F88Y和H90R的殘 基被進行化學性相關突變但構造上較不認定為關鍵殘基以 及將於第二回合試驗中被測定。 來自第三組的六種殘基被推測更涉及整體及/或核心 20 型殘基及因此認為與結合較無關係而在需要時於第三回改 善中進行探究。 來自第4組的殘基被認為較不具構造上及/或胺基酸類 型改變相關性以及將於稍後探究其“去人源化”。
最後，下列I2V、Y40H、I53M、N68S、K72Q和K82T 70 200829602 六種殘基相當於至少在初步組合中其人源化並未改變第一 人源化VH功能區之結合活性的胺基酸。在最後回合改善中 將進行這些殘基的“去人源化，，。 D-基因純粹屬於VH功能區内的CDR3區。人源化過程 5係根據“CDR_嫁接”法。此方法中無法有效地使用最接近人 類D-基因的分析。 考慮J區在抗原結合及V區結構化的不相關性，決定使 用天然人類IGHJ4*01胚系基因。 -獲得自再人源化6F4抗體的試驗數據 10 在下列的試驗中，僅對重鏈進行再人源化，其輕鏈相 當於舉例說明於實例9中的QTY/AET人源化6F4 VL功能 區’此最後選擇的人源化VL功能區展現類似重組嵌合6F4 抗體的抗JAM-A結合活性。同樣，如ELISA檢測法中所定 義參考重組嵌合6F4抗體抗JAM-A結合活性進行再人源化 15型改善檢測（未顯示數據）。 6F4 MAb在活饉外胬JAM_A表現的向下調筋 選擇MCF-7、HT29和A549細胞株以測定6F4 MAb對 JAM_A表現的效應。簡言之，將細胞接種於75平方釐米的 燒瓶内然後在37°C的5% C02大氣壓下於含10%胎牛血清 20 (FCS)的培養液内培養24小時。以PBS將細胞沖洗三次以及 在無血清培養液内再培養一天。在第二次培養之後，移除 該無血清培養液然後取代以單獨的新鮮無血清培養液或含 6F4或如9G4所述之IgGl同種型對照的新鮮無血清培養 液。在培養5或6小時之後，加入***解緩衝液(10毫克分子 71 200829602
Tris鹽酸緩衝液，ρΗ 7·5 ; 15%氯化鈉1克分子（Sigma化學公 司）；10%清潔劑混合物（10毫克分子Tris鹽酸，1〇〇/〇 Igepal 溶解液）(Sigma化學公司）；5%去氧膽酸鈉（Sigma化學公 司）；1蛋白酶抑制劑溶液完全TM錠劑（羅氏)和1%磷酸酶抑 5制劑溶液Η組(Calbiochem)，pH 7.5)然後在冰上刮除細胞。 在4°C下離心而澄清溶解產物。藉由BCA蛋白檢測法定量蛋 白質然後將25微克蛋白質置入各行的Biorad 4〜12% Bis-Tris凝膠。在l〇〇°c下將樣本加熱5分鐘然後置於-20°C或 直接置於4〜12% SDS-PAGE凝膠而被轉置於硝化纖維素膜 10 上。以5% BSA先阻斷全部抗體的墨點。在室溫下將專一性 抗-JAMA初級抗體培養2小時。於tBst内沖洗濾過物然後 與適當的HRP-連接次級抗體在室溫下共同培養丨小時。在以 ECL(Amersham)使蛋白質顯像之前於TBST内沖洗纖維膜。 如第19圖所示，以6F4 MAb處理的3細胞株可觀察到 15 JAM_A被明顯地向下調節。最敏感者為MCF-7，其在與6F4 培養5小時之後即可觀察到以完全及穩定的速度向下調 節。亦注意到HT29細胞能部分但持續性地使JAM-A向下調 節。在早期培養期間未觀察到A549細胞的明顯效應其在向 下調節動力學上具有差異性，但在與6F4 MAb培養16小時 20之後可產生完全的抑制作用。未經處理細胞和與9G4同種型 對照培養的細胞之間如預期無明顯的差異。 實例_晃一次注射6F4j^·嫌内腫痼增生的效應 為測定6F4 MAb在體内的作用機制，將MCF_7細胞注 射入具有***粒的7週齡雌性小白鼠。當腫瘤大小達到80 72 200829602 至100立方釐米時’可培育出具有類似腫瘤的3組小白鼠。 在任何注射之前’從其一組中切除下腫瘤以檢查未治療腫 瘤中之腫瘤細胞的基底細胞增生。其他2組小白鼠被注入1 毫克的6F4或相同劑量之如9G4所述的IgGl同種型對照。 5 注射後6小時’切除腫瘤、固定於福馬林、嵌入石堪、 切成5微米切片然後以抗-Ki67抗體染色以測定經處理與對 照腫瘤之間的增生程度。 如第20圖所示’注射前被切除的腫瘤（稱為〇時間的το) 和以同種型對照9G4處理的腫瘤之間未觀察到差異性。另一 10 方面，在單〆次注射6F4之後可觀察到腫瘤細胞增生的明顯 抑制作用。 實例I4 :單^一夹注射6F4對艚内JAM-A表現的效慮 此試驗除了被切除腫瘤立即於液態氮内冷凍以進行西 方墨點分析之外其餘和體内增生試驗所述相同。如上述實 15 例13的方法進行西方墨點法。 第21圖證明未經處理小白鼠（稱為〇時間的T0)與注射 一次6G4同種型對照的小白鼠之間在JAM-A表現並無差 異。當以6F4 MAb處理小白鼠時可發現明顯的向下調節而 表示此抗體具有向下調節受體之體内抗腫瘤活性的作用機 20 制。這些結果與活體外及下列實例13所述具有一致性。 實例15: 6F4及其F(ab’)，片段之抗腫痼活性的比較 由於JAM-A被高度表現於MCF-7細胞以及儘管6F4為 一種IgGl的事實（已知未參與小白鼠體内效應子功能的同 種型），已設計一種體内比較6F4與其F(ab’)2片段之間的 73 200829602 MCF-7模式以測定其在體内活動有關的效應子功能。 基於此目的，將5,000,000個MCF7細胞植入具有*** 粒的7週齡雌性小白鼠。在植入細胞五天之後，以300微克 的6F4或200微克的6F4 F(ab’)2每週三次處理該小白鼠。就 5 第一次注射而言，被注射600微克的抗體及400微克的6F4 F(ab’)2。總共四週期間每週兩次測量腫瘤的大小。 第22圖顯示從D3至D27以6F4和6F4 F(ab’)2處理的小白 鼠與對照小白鼠比較其明顯具有不同的腫瘤生長程度(6F4 為ρ$0·03及6F4 F(ab，)2為pSO.015)。6F4和6F4 F(ab，)2組小 10 白鼠之間並無差異而顯示其效應子功能未涉及6F4的活動。 實例16 :在人類組織上測定JAM-A的表現 在腫瘤及正常病人組織上比較JAM-A的表現以選擇過 度表達JAM-A的腫瘤類型。此試驗從相同病人選取成對的 正常與腫瘤組織。這些病人的正常組織係取自腫瘤附近。 15 利用Superships的組織陣列藉由免疫組織化學（IHC)測定 JAM-A的表現。簡言之，將載玻片除蠟以及在98°C下利用 Dakocytomation溶液S1699搜尋20分鐘的抗原。在減弱内源 性過氧化酶(0.3%之H202溶液5分鐘）及阻斷非專一性位點 (Ultra-V-Block ; Labvision，ref. TA-125-UB)之後，在室溫 20 下將初級抗體(抗-hJAM_A，取自R&D system的AF1103或取 自Zymed的山羊IgG同種型對照）培養1小時。在TBS-tween 内沖洗之後，利用取自Dakocytomation的LSAB+套組展現 抗-hJAM-A的結合。藉由HRP-DAB顯色反應顯示初級抗體 和LSAB+的複合物。然後藉由蘇木紫(hematoxylin)複染載 74 200829602 玻片。 分析甲狀腺、肺和***癌樣本。就甲狀腺樣本而言（第 23圖），正常甲狀腺組織未觀察到其表現同時JAM_A似乎可 強烈表現於取自相同病人的腫瘤切片（細胞膜染色）。在肺正 5常組織JAM-A中被肺細胞所表現。然而，在全部腫瘤的樣 本中發現有強烈的細胞膜表達（第24圖）。就***癌 而言，正 常***組織的乳小葉管可看到弱的JAM-A表達。在癌切片 中，第25圖所顯示的三種癌症樣本(浸潤性乳腺癌、非典型 髓樣癌和浸潤性乳頭狀癌）證明J A Μ - A被過度表現於*** 10 癌組織。 這些數據認為甲狀腺癌、***癌和肺癌可能為JAM-A 治療的最佳標的。 例17: 6F4對異種移植入裰鼠之A431鱗狀上皮癌的 活性 15 將A-431細胞培養於補充10%之熱不活化胎牛血清 (Sigma)的DMEM(Lonza)内。在被植入前兩天分散細胞而使 其呈生長的指數期。將1〇,〇〇〇,〇〇〇個A-431細胞植入7週齡的 無胸腺裸鼠。在植入後第五天(D5)以下列方式腹腔内隨機 處理小白鼠：對照組每週兩次注射PBS及6F4處理組則以腹 20 腔注射2毫克劑量接著每週兩次被注射1毫克劑量的抗體。 每週測量腫瘤兩次及利用公式：冗長X寬X高計算腫瘤體 積。利用Mann-Whitney檢定法及SigmaStat軟體進行各時間 點的統計分析。第26圖顯示6F4 MAb可明顯地抑制體内 A431細胞株的生長(從第38至56天，ρ<0·009)。 75 200829602 實例:藉由抗原呈現鈿跑(APC)评估6F4在抗原呈現上 的活性
JAM蛋白被廣泛地表達於人類身體的各種組織内以及 於血小板、白血球和紅血球的表面[Naik 1995 ; Malergue 5 1998 » Korneki 1990 , Williams 1999 J Gupta 2000] ° JAM-A 似乎被表達於血小板、嗜中性球、單核球、淋巴球和紅血 球内[請參考Mandell 2005]。 為測定6F4是否可影響病人之抗原的呈現，進行包括巨 噬細胞和樹突細胞之抗原呈現細胞(APC)的干擾。在呈現的 10 過程中，内化APC抗原及將其裂解而產生胜肽，其與CMH 第II類分子被結合於胞質内。然後於APC膜上表現該複合物 以及呈現藉由增生刺激而反應的專一性T淋巴細胞。 在下列的試驗中，評估6F4對藉由人類PBMC呈現破傷 風類毒素的效應。基於此目的，從血液藉由Ficoll梯度離心 15 法分離PBMC。於PBS内沖洗細胞，計數及懸浮於補充10% 熱不活化胎牛血清(FCS)、麩醯胺酸和濃度0.25之抗生素的 RPMI 1640培養液内，1〇6個細胞/毫升。在加入抗原及1〇微 克/毫升終濃度的受測抗體之前將100微升的PBMC接種入 96孔平板的各孔内。使用作為IgGl同種型對照的9G4 MAb 20 以及作為淋巴球之多細胞系啟動子的楂物血凝素ΡΗΑ(2·5 微克/毫升終濃度)作為陽性對照。 選擇專一性抗原啟動子破傷風類毒素(ΤΤ)以及將其以 100微克/毫升的終濃度加入PBMC。然後在37°C的5% C02 大氣下將平板培養96小時。接著，將0.25微居里[3H]-胸腺 76 200829602 嘧啶加入孔内及培養24小時。培養後收赛該細胞，乾燥其 渡膜然後在閃爍計數器内計算其放射活性量。 第27A和28A圖為兩項獨立試驗的值，作為製備PBMC 之％性對的PHA係一種淋巴球增殖誘導刻，其多細胞糸 5啟動子視供體和該試驗而具有介於3〇和7〇之間的指數。在 這些條件下，不管與任何抗體共同培養旅未改變其淋巴球 增殖指數，以及6F4並未展示任何明顯的激動或拮抗活性。 第27B和28B圖為兩項獨立試驗的值，其顯示供體間對淋巴 球增殖的TT活化作用發生明顯的變化。在這些試驗中，視 10供體及該試驗其指數介於2和5之間。然而，存在6F4之下並 未觀察到對抗原呈現的干擾。 總之，儘管JAM-A明顯地表達於apC和淋巴球，但使 用直接對抗此標的的抗體並未影響淋巴球專一性的增殖或 是其抗原呈現過程。 15實创19 :在证4培養之後血小；fe怒华釦活化作用的評色 為了調查結合至人類血小板之6174的任何生物功能，測 定其兩種參數：血小板凝集作用和血清素釋放作用。 基於此目的，將取自10位正常供體的人類血小板與5 微克/毫升的數種受測抗體共同培養。 2〇 已報告PM6/248(—種抗_ ck lib /3 3)可誘發血小板的凝 集作用。9G4被用作為陰性同種型對照。 如所預期，當於人類血小板、凝血酶和ADP上測定時 可誘發凝集作用。PM6/248亦可誘發血小板的凝集作用。 在與6F4培養之後未產生血小板的凝集作用。此效應類 77 200829602 似於用作為陽性對照的9(34(第29圖）。 在類似的方法中，6F4亦無法誘發血清素的釋放（第3〇 圖）同時凝血酶如所預期可誘發5-HT的釋出。 總結而言，這些結果表示當JAM-A被表達時，在6F4 5 活化後並未觸發人類血小板的生物功能。 【圖式簡單說明】 第1圖分別為鼠6F4抗體之重鏈和輕鏈的序列。以底線 粗體字表示其CDRs(根據Kabat編號）。 第2A和2B圖分別比對鼠6F4抗體之V(第2A圖）和J(第 10 2B圖）區與選自V區之IGKV19_93*01(序列辨識編號39)及J 區之IGKJ1*01(序列辨識編號40)的鼠細胞株。 第3A和3B圖分別比對鼠6F4抗體之V(第3A圖）和J(第 3B圖）區與選自V區之IGKV1_33*01(序列辨識編號41)及J區 之IGKJ1*01(序列辨識編號42)的人類細胞株。 15 第4圖代表參考各自KAB AT和IMGT編碼系統之6F4抗 體輕鏈的蛋白質序列。 第5A、5B和5C圖分別比對鼠6F4抗體之V(第5A圖）、 D(第5B圖）和J(第5C圖）區與選自V區之IGKV1S135 *01(序 列辨識編號43)、D區之IgHD-ST4*〇l(序列辨識編號44)及J 20區之IGHJ2*01(序列辨識編號45)的鼠細胞株。 第6A、6B*6C圖分別比對鼠6F4抗體之v(第6A圖）、 D(第6B圖）和J(第6C圖）區與選自V區之IGHVl-f *01(序列 辨識編號46)、D區之IgHDl-l*01(序列辨識編號4乃及〗區之 IGHJ4*01(序列辨識編號48)的人類細胞株。 78 200829602 第7圖為參考各自KABAT和IMGT編碼系統之6F4抗體 重鏈的蛋白質序列。 第8A和8B圖為來自HT-29細胞膜之6F4抗原的6F4-瓊 脂糖凝膠免疫純化反應。亦顯示藉由SDS_PAGE電泳法（第 5 8A圖）和西方墨點法（第8B圖）收集的分率。 第9A和9B圖為藉由免疫純化蛋白之SDS-pAGE電泳法 (第9A圖）和西方墨點法（第9B圖）的分析。在還原和非還原條 件下進行及分析該兩種純化物(#1和#2)。 第10圖為胰蛋白酶水解後藉由MALDI-TOF質譜儀萃 10 取的肽混合物。 第11A和11B圖係藉由西方墨點法（非還原條件)所鑑定 之經確認蛋白質的組成：顯示利用6F4抗體（第11A圖）和抗 人類JAM-A多株抗體（第11圖）。 第12圖顯示6F4抗體對人類JAM-A蛋白的專一性。各蛋 15 白的沈積數量分別為250奈克、25奈克和10奈克。 第13圖為注射6F4抗體2分鐘（雙箭頭）之後在1〇〇奈米 之鼠JAM1 Fc蛋白（流通槽#卜下圖）和鼠JAMl Fc蛋白（流通 槽#2，上圖）的HBS-EP緩衝液内於5分鐘25t解離時間和流 速30微升/分鐘（CM4 : m-JAMl_Fc 501.6 RU(Fcl)和511.5 20 RU(Fc2))的感應圖。 第 14 圖為以雙基準(Fc2-Fc 1 )6F4(Fc2-Fc 1 )HB S-EP 獲得 的感應圖。利用Langmuir A+B結合模式適配此曲線。依如 下方法計算其動力學參數（黑色曲線）：ka=(1.38 士 Ο.ΟΟΙΡΠ^Μ^·1 ; ; Rmax(整體適 79 200829602 配)=371 RU ; /c 2 =0.853。 第15圖說明6F4抗體在瑞士裸鼠MCF-7細胞之異種移 植模式内的抗腫瘤活性。以未純化型（腹膜腔液）的250微克/ 小白鼠每週兩次理論劑量藉由IP途徑測定該6F4抗體。該 5 9G4抗體係一種與活性測定無關的同種型（IgGi)抗體。 第16圖說明在各種腫瘤株表面藉由Mab 6F4確認的 JAM-A蛋白表現。 第17圖為人源化6F4 VL功能區的序列，其中：*相當於 事實上改變成其人類複本的胺基酸；1相當於分析其被人源 10 化能力的胺基酸，符號下方為人源化殘基；以及2相當於人 源化6F4 VL功能區内保留鼠的胺基酸。 第18圖為人源化6F4 VH功能區的序列，其中：*相當於 事實上改變成其人類複本的胺基酸；1相當於分析其被人源 化能力的胺基酸，符號下方為人源化殘基；以及2相當於人 15 源化6F4 VH功能區内保留鼠的胺基酸。 第19圖說明6F4 MAb所誘導的活體外JAM-A向下調 即0 苐20圖說明6F4 MAb所誘導的體内抑制腫瘤細胞增 殖。 2〇 第21圖為6F4MAb之體内JAM_A的向下調節。 第22圖為6F4及其F(ab’)2片段於MCF-7體内模式的比 較曲線。 第2 3圖說明正常對腫瘤表現之J A Μ - A於曱狀腺組織的 比較。 80 200829602 第24圖說明正常對腫瘤表現之JAM-A於肺組織的比 較。 第25圖說明正常對腫瘤表現之JAM-A於***組織的比 較。 5 第26圖為說明6F4於裸鼠内A431鱗狀上皮癌異種移植 物的體内活性。 第27圖說明6F4抗體對(A)以PHA誘導之非專一性淋巴 增生；及(B)抗原呈現過程的效應。以2獨立供體的第一試驗。 第28圖說明6F4抗體對(A)以PHA誘導之非專一性淋巴 10 增生；及(B)抗原呈現過程的效應。以2獨立供體的第二試驗。 第29圖說明10種人類正常供體的血小板凝集作用。以 平均±標準偏差表示其結果。 第30圖為10種人類正常供體的血清素釋放作用。以平 均土標準偏差表示其結果。 15 第31圖為6F4 VH功能區與IGHV1-03*01胚系基因（序 列辨識編號49)的比對。 【主要元件符號說明】 (無) 81 200829602 序列表 <110〉Pierre Fabre藥廠 GOETSCH Liliane CORVAIA Nathalie HAEUW Jean-Francois BES Cedric <120〉新穎的抗增生抗體 <130> D24958 <150> FR0610329 〈151〉 2006-11-24 〈160〉 64 <170〉 Patentln第3.3版 <210> 1 <211〉 6 <212> PRT <213〉小家鼠 〈400〉 1
Gin Asp lie Asn Asn Tyr 1 5 〈210〉 2 〈211〉 4 〈212〉 PRT 〈213〉小家鼠 <400〉 2
Thr Asp Tyr Ser <210〉 3 <211〉 3 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 3
Tyr Thr Ser <210〉 4 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 4 lie Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr 1 200829602 1 5 <210> 5 <211> 8 〈212> PRT <213〉小家鼠 <400> 5
Leu Gin Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 1 5 <210〉 6 <211〉 7 <212> PRT <213〉小家鼠 <400〉 6
Gin Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 〈210〉 7 〈211〉 8 <212〉 PRT <213〉小家鼠 〈400〉 7
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ser 1 5 <210〉 8 <211> 11 〈212〉 PRT 〈213〉小家鼠 <400〉 8
Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Asn Tyr lie Ala 1 5 10 <210〉 9 <211> 6 〈212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 9
Thr Asp Tyr Ser Met Tyr 1 5
〈210〉 10 <211〉 7 <212> PRT 2 200829602 〈213>小家鼠 〈400> 10
Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Ala 1 5 〈210〉 11 <211〉 17 〈212〉 PRT <213〉小家鼠 〈400〉 11
Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly 〈210〉 12 〈211〉 9 <212> PRT 〈213〉小家鼠 <400〉 12
Ala Arg Gin Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 13 <211〉 106 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400> 13
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr lie Thr Cy s Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Asn Tyr 20 25 30 lie Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Ala Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser lie Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp lie Gly Thr Tyr Tyr Cy s Leu Gin Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 14 〈211〉 116 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 14 200829602
Glu lie Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gin Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 15 <211〉 215 〈212〉 PRT 〈213〉小家鼠 <400〉 15
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Gly Lys Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Asn Tyr 20 25 30 lie Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Ala Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser lie Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Gly Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110
Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gin Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp lie Asn 130 135 140
Val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gin Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro lie Val Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys Asn His 210 215 <210> 16 <211〉 440 〈212〉 PRT <213〉小家鼠 4 200829602 <400> 16
Glu lie Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gin Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala 115 120 125
Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu 130 135 140
Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160
Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp 165 170 175
Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro 180 185 190
Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys 195 200 205
Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie 210 215 220
Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240
Lys Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val 245 250 255
Val Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val 260 265 270
Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin 275 280 285
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met His Gin 290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala 305 310 315 320
Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro 325 330 335
Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala 340 345 350
Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe Phe Pro Glu 355 360 365
Asp lie Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr 370 375 380
Lys Asn Thr Gin Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr 385 390 395 400
Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe 405 410 415
Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys 420 425 430
Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210〉 17 5 200829602 <211> 106 <212> PRT 〈213〉小家鼠 <400> 17
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Asn Asn Tyr 20 25 30 lie Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 〈210〉 18 <211> 116 〈212〉 PRT <213〉小家鼠 <400> 18
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Ser Met His Trp Val Gin Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gin Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 116 〈212〉 PRT <213〉小家鼠 〈400〉 19
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Phe 6 200829602 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gin Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 20 〈211〉 18 <212〉 DNA 〈213〉小家鼠 <400> 20 caagacatta acaattat 18 〈210〉 21 <211〉 12 〈212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 21 actgactaca gc 12 <210〉 22 〈211〉 9 <212> DNA <213〉小家鼠 <400〉 22 tacacatct 9 <210〉 23 <211〉 24 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 23 24 attgatcctt acaatggtgg tact <210〉 24 〈211〉 24 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400〉 24 ctacagtatg ataatctgtg gacg 24 <210〉 25 7 21200829602 <211> 21 <212> DNA 〈213〉小家鼠 〈400〉 25 cagacggact actttgacta c <210> 26 〈211〉 24 <212> DNA 〈213>小家鼠 <400〉 26 ggttactcat tcactgacta cage 24 〈210〉 27 〈211〉 27 <212> DNA 〈213〉小家鼠 <400> 27 gcaagacaga cggactactt tgactac 27 〈210〉 28 <211〉 33 <212> DNA 〈213〉小家鼠 〈400〉 28 aaggcaagcc aagacattaa caattatata get 33 〈210〉 29 〈211〉 21 <212> DNA <213〉小家鼠 <400〉 29 tacacatcta cattacaagc a 21 〈210〉 30 <211〉 18 〈212〉 DNA <213〉小家鼠 <400〉 30 actgactaca gcatgtac 18 <210> 31 〈211〉 51 8 200829602 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 31 IX 5 tatattgatc cttacaatgg tggtactagg tacaaccaga agttcaaggg c 〈210〉 32 〈211〉 318 〈212〉 DNA 〈213〉小家鼠 <400〉 32 gacatccaga atcacttgca ggaaaaggtc aggttcagtg gaagatattg accaagctgg tgacacagtc aggcaagcca ctaggctgct gaagtgggtc gaacttatta 3.8,8, t C 8.3-3-tccatcctca agacattaac catacattac tgggagagat ttgtctacag ctgtctgcat aattatatag acatctacat tattccttca tatgataatc ctctgggagg cttggtacca tacaagcagg gcatcagcaa tgtggacgtt caaagtcacc acacaagcct catcccatca cctggagcct cggtggaggc 2 8 4 0 1 112 3 3 <210〉 <211〉<212> <213> 33 348 DNA小家鼠 <400> 33 gagatccagc tcctgcaagg catggaaaga aaccagaagt atgcatctca gactactttg tgcagcagtc cttctggtta gccttgagtg tcaagggcaa acagcctgac actactgggg tggacctgag ctcattcact gattggatat ggccacattg atctgaggac ccaaggcacc ctggtgaagc gactacagca attgatcctt actgttgaca tctgcagtct actctcacag ctggggcttc tgtactgggt acaatggtgg agtcctccag attactgtgc tctcctca agtgaaggta gaagcagagc tactaggtac cacagccttc aagacagacg o 6 2I8I4I0I41 112 3 3 〈210〉 34 <211〉 639 〈212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 34 gacatccaga atcacttgca ggaaaaggtc aggttcagtg gaagatattg accaagctgg agtgagcagt aaagacatca agttggactg accaaggacg acttcaccca tgacacagtc aggcaagcca ctaggctgct gaagtgggtc gaacttatta aaatcaaacg taacatctgg atgtcaagtg atcaggacag agtatgaacg ttgtcaagag tccatcctca agacattaac catacattac tgggagagat ttgtctacag ggctgatgct aggtgcctca gaagattgat caaagacagc acataacagc cttcaacagg ctgtctgcat aattatatag acatctacat tattccttca tatgataatc gcaccaactg gtcgtgtgct ggcagtgaac acctacagca tatacctgtg aatgagtgt ctctgggagg cttggtacca tacaagcagg gcatcagcaa tgtggacgtt tatccatctt tcttgaacaa gacaaaatgg tgagcagcac aggccactca caaagtcacc acacaagcct catcccatca cctggagcct cggtggaggc cccaccatcc cttctacccc cgtcctgaac cctcacgttg caagacatca 00000000009 62840628403 1123344566
〈210〉 35 <211> 1320 <212〉 DNA 9 200829602 〈213>小家鼠 <400> 35 gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacagca tgtactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtgg tactaggtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240 atgcatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagacagacg 300 gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagc caaaacaaca 360 gccccatcgg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 420 ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 480 tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 540 agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 600 gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt 660 aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc 720 aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc 780 aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct 840 cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc 900 atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct 960 ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag 1020 gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc 1080 atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca 1140 gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta cttcgtctac 1200 agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg 1260 ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa 1320 <210〉 36 <211〉 318 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400〉 36
gacatacaga tgactcagag cccatcatca ttgagcgcgt ctgtcggcga tcgggttacc 60 attacctgcc aggcaagtca agatatcaac aactatattg cttggtatca acagaagccc 120 ggtaaagccc caaagctgct gatacactac acctccaccc tggagaccgg cgtgccttct 180 agattttctg gaagcgggtc cggaaccgat tatacgttca caatctccag ccttcagccc 240 gaagacatcg ccacatacta ctgtctgcaa tacgacaatc tgtggacatt tggccagggg 300 actaaggtgg agatcaaa 318 <210> 37 <211> 345 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 37 gaagtgcagc tggttcagag cggcgccgag gtaaaaccag gggcgacggt gaagataagc 60 tgcaaggtga gtgggtactc attcaccgac tattcaatgc actgggtcca acaggcccct 120 ggtaaaggac tggagtggat gggatacatc gatccctaca atggaggcac taggtacgcc 180 gagaagttcc aggggagagt cactattacc gcagatactt ctaccgatac tgcctacatg 240 gaactcagca gtctgcggtc cgaggacaca gcagtctact attgtgctcg ccaaacagac 300 tattttgact attggggcca gggaaccttg gtgacagtgt cctct 345
841N, 3 3 D <210〉 〈211> <212> 10 200829602 <213〉小家鼠 <400> 38 0 0 0 0 0 8 6 2 8 4 0 4 112 3 3 caggtgcaat tggtacagtc aggcgcggag gtgaagaagc ctggggctag tgttaaagtc tcctgtaaag cctccggata ttccttcact gactactcta tgcattgggt tcgccaggca ccagggcagc ggctggaatg gatggggtac attgatccct acaacggagg cacgcgatat agtcagaagt tccagggtcg ggtgacaatc acagccgata cgtccaccag caccgcctac atggagttga gcagtctcag gtcagaagac acagccgtgt actattgcgc aagacagacc gattatttcg actactgggg ccaaggcact ctcgtgaccg tctctagc 〈210> 39 <211> 115 <212〉 PRT 〈213>小家鼠 <400> 39
Met Arg Pro Ser lie Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 15 10 15
Gly Ala Gin Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Asn Lys Tyr lie Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60
Arg Leu Leu lie His Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Pro Gly lie Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser lie Ser 85 90 95
Asn Leu Glu Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp 100 105 110
Asn Leu Leu 115 <210> 40 <211〉 12 〈212〉 PRT 〈213〉小家鼠 <400〉 40
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 1 5 10 〈210〉 41 <211〉 117 〈212〉 PRT 〈213>現代人 <400〉 41
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Gin Leu Trp 1 5 10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser 35 40 45 11 200829602
Gin Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Tyr Asp Asn Leu Pro 115 <210> 42 〈211〉 12 <212> PRT <213〉現代人 <400> 42
Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 1 5 10 〈210〉 43 〈211〉 98 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400> 43
Glu lie Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210〉 44 〈211〉 2 <212〉 PRT <213〉小家鼠 〈400〉 44
Gin Thr <210〉 45 <211〉 16 <212〉 PRT <213〉小家鼠 12 200829602 <400> 45
Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 15 10 15 人 T代 6 8 R見 4 9 p Ϊ <210> <211〉 〈212> <213> 〈400> 46
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gin Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr <210〉 47 <211〉 121 <212> PRT <213〉現代人 <400> 47
Met Ser Val Ser Phe Leu lie Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 15 10 15
Gly Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30
Lys Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser 35 40 45
Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser 50 55 60
Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80
Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg lie Thr lie Asn Pro Asp 85 90 95
Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 115 120 <210> 48 <211> 15 <212〉 PRT <213〉現代人 〈400〉 48 13 200829602
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210〉 49 〈211〉 97 <212〉 PRT <213〉現代人 <400> 49
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala 〈210〉 50 <211〉 643 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 50 cagatgaagc tgatttgcat gtgctgagat catattctac tgccccagag atttaataat 60 ctgatcatac acactccaac agtcattctt ggtcaggaga cgttgtagaa atgagaccgt 120 ctattcagtt cctggggctc ttgttgttct ggcttcatgg taaggagttt aacattgaat 180 atgctaaaaa gagtatgtga tcaggaattt ctggtccttc agaaaaatct tctttgaata 240 taattaattt catagggatt tgtgttcttt ttaattatag gtgctcagtg tgacatccag 300 atgacacagt ctccatcctc actgtctgca tctctgggag gcaaagtcac catcacttgc 360 aaggcaagcc aagacattaa caagtatata gcttggtacc aacacaagcc tggaaaaggt 420 cctaggctgc tcatacatta cacatctaca ttacagccag gcatcccatc aaggttcagt 480 ggaagtgggt ctgggagaga ttattccttc agcatcagca acctggagcc tgaagatatt 540 gcaacttatt attgtctaca gtatgataat cttctaccca cagtgataca aatcataaca 600 aaaaccaccc agggaagcag aagtgagagg ctaggttgcc cac 643 〈210〉 51 <211〉 39 <212〉 DNA <213〉小家鼠 〈400〉 51 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgt 39 〈210〉 52 <211> 667 <212〉 DNA <213〉現代人 14 200829602 <400> 52 ctgcagctgt gcccagcctg ccctatcccc tgctgatttg catgttcgca gagcacagcc 60 ccctgccctg aagacttatt aataggctgg tcgcaccctg tgcaggagtc agtcccaacc 120 aggacacagc atggacatga gggtccctgc tcagctcctg gggctcctgc agctctggct 180 ctcaggtaag gaaggataac actaggaatt ttctcagcca gtgtgctcag tacagcctgg 240 ctcttgatgg aagccttcct ataatatgac taatagtatg aatatttgtg tttatgtttc 300 taatcgcagg tgccagatgt gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat 360 ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa 420 attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt 480 tggaaacagg ggtcccatca aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca 540 ccatcagcag cctgcagcct gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc 600 tccctcccac agtgtaacaa gtcataacat aaatcaccca ggggagcaga tgcgtgaggc 660 tcagctg 667 <210> 53 〈211〉 37 <212> DNA <213〉現代人 <400〉 53 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaac 37 <210〉 54 <211> 294 〈212〉 DNA <213〉小家鼠 〈400〉 54 gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgtactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtgg tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240 atgcatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aaga 294 〈210〉 55 〈211〉 163 <212〉 DNA 〈213〉小家鼠 <400> 55 aagcttgccc aggaaccact agtgctcaca cagctctgcc cacaggggaa acctaaccat 60 gcctgccccc tactcagcag gaaggctctg aagctctgag aggattttga acaagttact 120 gtcacagtga gacagctcgg gctaccatgt aagaaaagct caa 163 <210> 56 <211〉 45 <212> DNA <213〉小家鼠 <400〉 56 tactttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 45 15 200829602 <210> 57 <211> 294 <212〉 DNA <213〉現代人 <400> 57 gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60 tcctgcaagg tttctggata caccttcacc gactactaca tgcactgggt gcaacaggcc 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt gttgatcctg aagatggtga aacaatatac 180 gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aaca 294 <210> 58 〈211〉 17 <212〉 DNA <213〉現代人 <400> 58 ggtacaactg gaacgac 17 〈210〉 59 <211〉 46 <212〉 DNA <213〉現代人 <400> 59 tactttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctcag 46 〈210〉 60 <211〉 291 <212〉 DNA <213〉現代人 〈400〉 60 ggggcctcag tgaaggtttc ctgcaaggct tctggataca ccttccaggt ccagcttgtg 60 cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctact agctatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacgctg gcaatggtaa cacaaaatat 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc g 291 <210〉 61 <211〉 299 <212〉 PRT <213〉現代人 〈400〉 61
Met Gly Thr Lys Ala Gin Val Glu Arg Lys Leu Leu Cys Leu Phe He 15 10 15
Leu Ala lie Leu Leu Cys Ser Leu Ala Leu Gly Ser Val Thr Val His 16 200829602 20 25 30
Ser Ser Glu Pro Glu Val Arg lie Pro Glu Asn Asn Pro Val Lys Leu 35 40 45
Ser Cys Ala Tyr Ser Gly Phe Ser Ser Pro Arg Val Glu Trp Lys Phe 50 55 60
Asp Gin Gly Asp Thr Thr Arg Leu Val Cys Tyr Asn Asn Lys lie Thr 65 70 75 80
Ala Ser Tyr Glu Asp Arg Val Thr Phe Leu Pro Thr Gly lie Thr Phe 85 90 95
Lys Ser Val Thr Arg Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Met Val Ser 100 105 110
Glu Glu Gly Gly Asn Ser Tyr Gly Glu Val Lys Val Lys Leu lie Val 115 120 125
Leu Val Pro Pro Ser Lys Pro Thr Val Asn lie Pro Ser Ser Ala Thr 130 135 140 lie Gly Asn Arg Ala Val Leu Thr Cys Ser Glu Gin Asp Gly Ser Pro 145 150 155 160
Pro Ser Glu Tyr Thr Trp Phe Lys Asp Gly lie Val Met Pro Thr Asn 165 170 175
Pro Lys Ser Thr Arg Ala Phe Ser Asn Ser Ser Tyr Val Leu Asn Pro 180 185 190
Thr Thr Gly Glu Leu Val Phe Asp Pro Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly 195 200 205
Glu Tyr Ser Cys Glu Ala Arg Asn Gly Tyr Gly Thr Pro Met Thr Ser 210 215 220
Asn Ala Val Arg Met Glu Ala Val Glu Arg Asn Val Gly Val lie Val 225 230 235 240
Ala Ala Val Leu Val Thr Leu lie Leu Leu Gly lie Leu Val Phe Gly 245 250 255 lie Trp Phe Ala Tyr Ser Arg Gly His Phe Asp Arg Thr Lys Lys Gly 260 265 270
Thr Ser Ser Lys Lys Val lie Tyr Ser Gin Pro Ser Ala Arg Ser Glu 275 280 285
Gly Glu Phe Lys Gin Thr Ser Ser Phe Leu Val 290 295 <210> 62 〈211〉 897 <212> DNA <213〉現代人 <400〉 62 atggggacaa aggcgcaagt cgagaggaaa ctgttgtgcc tcttcatatt ggcgatcctg 60 ttgtgctccc tggcattggg cagtgttaca gtgcactctt ctgaacctga agtcagaatt 120 cctgagaata atcctgtgaa gttgtcctgt gcctactcgg gcttttcttc tccccgtgtg 180 gagtggaagt ttgaccaagg agacaccacc agactcgttt gctataataa caagatcaca 240 gcttcctatg aggaccgggt gaccttcttg ccaactggta tcaccttcaa gtccgtgaca 300 cgggaagaca ctgggacata cacttgtatg gtctctgagg aaggcggcaa cagctatggg 360 gaggtcaagg tcaagctcat cgtgcttgtg cctccatcca agcctacagt taacatcccc 420 tcctctgcca ccattgggaa ccgggcagtg ctgacatgct cagaacaaga tggttcccca 480 ccttctgaat acacctggtt caaagatggg atagtgatgc ctacgaatcc caaaagcacc 540 cgtgccttca gcaactcttc ctatgtcctg aatcccacaa caggagagct ggtctttgat 600 cccctgtcag cctctgatac tggagaatac agctgtgagg cacggaatgg gtatgggaca 660 cccatgactt caaatgctgt gcgcatggaa gctgtggagc ggaatgtggg ggtcatcgtg 720 gcagccgtcc ttgtaaccct gattctcctg ggaatcttgg tttttggcat ctggtttgcc 780 tatagccgag gccactttga cagaacaaag aaagggactt cgagtaagaa ggtgatttac 840 agccagccta gtgcccgaag tgaaggagaa ttcaaacaga cctcgtcatt cctggtg 897 17 200829602 <210> 63 <211> 259 〈212〉 PRT <213〉現代人 〈400〉 63
Met Gly Thr Lys Ala Gin Val Glu Arg Lys Leu Leu Cys Leu Phe lie 1 5 10 15
Leu Ala lie Leu Pro Glu Asn Asn Pro Val Lys Leu Ser Cys Ala Tyr 20 25 30
Ser Gly Phe Ser Ser Pro Arg Ala Ala Ser Tyr Glu Asp Arg Val Thr 35 40 45
Phe Leu Pro Thr Gly lie Thr Phe Lys Ser Val Thr Arg Glu Asp Thr 50 55 60
Gly Thr Tyr Thr Cys Met Val Ser Glu Glu Gly Gly Asn Ser Tyr Gly 65 70 75 80
Glu Val Lys Val Lys Leu lie Val Leu Val Pro Pro Ser Lys Pro Thr 85 90 95
Val Asn lie Pro Ser Ser Ala Thr lie Gly Asn Arg Ala Val Leu Thr 100 105 110
Cys Ser Glu Gin Asp Gly Ser Pro Pro Ser Glu Tyr Thr Trp Phe Lys 115 120 125
Asp Gly lie Val Met Pro Thr Asn Pro Lys Ser Thr Arg Ala Phe Ser 130 135 140
Asn Ser Ser Tyr Val Leu Asn Pro Thr Thr Gly Glu Leu Val Phe Asp 145 150 155 160
Pro Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly Glu Tyr Ser Cys Glu Ala Arg Asn 165 170 175
Gly Tyr Gly Thr Pro Met Thr Ser Asn Ala Val Arg Met Glu Ala Val 180 185 190
Glu Arg Asn Val Gly Val lie Val Ala Ala Val Leu Val Thr Leu lie 195 200 205
Leu Leu Gly lie Leu Val Phe Gly lie Trp Phe Ala Tyr Ser Arg Gly 210 215 220
His Phe Asp Arg Thr Lys Lys Gly Thr Ser Ser Lys Lys Val lie Tyr 225 230 235 240
Ser Gin Pro Ser Ala Arg Ser Glu Gly Glu Phe Lys Gin Thr Ser Ser 245 250 255
Phe Leu Val 〈210〉 64 <211> 777 <212〉 DNA 〈213>現代人 〈400〉 64 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 atggggacaa aggcgcaagt cgagaggaaa ctgttgtgcc tcttcatatt ggcgatcctt cctgagaata atcctgtgaa gttgtcctgt gcctactcgg gcttttcttc tccccgtgca gcttcctatg aggaccgggt gaccttcttg ccaactggta tcaccttcaa gtccgtgaca cgggaagaca ctgggacata cacttgtatg gtctctgagg aaggcggcaa cagctatggg gaggtcaagg tcaagctcat cgtgcttgtg cctccatcca agcctacagt taacatcccc tcctctgcca ccattgggaa ccgggcagtg ctgacatgct cagaacaaga tggttcccca ccttctgaat acacctggtt caaagatggg atagtgatgc ctacgaatcc caaaagcacc cgtgccttca gcaactcttc ctatgtcctg aatcccacaa caggagagct ggtctttgat cccctgtcag cctctgatac tggagaatac agctgtgagg cacggaatgg gtatgggaca cccatgactt caaatgctgt gcgcatggaa gctgtggagc ggaatgtggg ggtcatcgtg gcagccgtcc ttgtaaccct gattctcctg ggaatcttgg tttttggcat ctggtttgcc 18 200829602 tatagccgag gccactttga cagaacaaag aaagggactt cgagtaagaa ggtgatttac agccagccta gtgcccgaag tgaaggagaa ttcaaacaga cctcgtcatt cctggtg 720 777 19

Claims (1)

  1. 200829602 十、申請專利範圍： L 一種能於活體外及/或體内抑制腫瘤細胞增生的分離抗 體或其衍生化合物或功能片段，特徵為其含有選自序列 辨識編號1、2、3、4、5或6之CDRs的至少— CDR序列 或經最適比對之後與序列辨識編號1、2、3、4、5或6具 有至少80%相似度的至少一 cdr序列。 2 j 如申請專利範圍第1項之抗體或其衍生化合物或功能片 段，特徵為其可構成一單株抗體。 3 •如申請專利範圍第1或2項之抗體或其衍生化合物或功 把片段，特徵為其含有序列辨識編號2、4和6三種CDRs 至夕、其一或與序列辨識編號2、4和ό經最適比對之後 具有至少80%相似度之至少一序列的重鏈。 4·如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為其含有分別為CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3的下列三種CDRS，其中： CDR H1 §有序列辨識編號2、7或9或與序列辨識 編號2、7或9經最適比對之後具有至少8〇%相似度的序 列； _CDR-m含有序列辨識編號4或丨丨或與序列辨識編號 4或11經最適比對之後具有至少8〇%相似度的序列·以及 -CDR-Η3含有序列辨識編號“η或與序列辨識編 號6或I2經最適比對之後具有至少議相似度的序列。 5·如上述申請專利範圍中任—項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為其含有序列辨識編號7之CDR_ 1 200829602 HI、序列辨識編號4之CDR_H2和序列辨識編號12之 CDR-H3的重鏈。 6.如申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或其衍生化 合物或功能片段，特徵為其含有序列辨識編號9之 CDR-H1、序列辨識編號11之CdR-H2和序列辨識編號6 之CDR-H3的重鏈。 7·如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或功能片段’特徵為其含有序列辨識編號1、3和5三種 CDRs中至少其一或與序列辨識編號1、3和5經最適比對 之後具有至少80%相似度之至少一序列的輕鏈。 8·如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為其含有分別為CDR-L1、CDR-L2和 CDR-L3的下列三種CDRs，其中： -CDR-L1含有序列辨識編號丨或8或與序列辨識編 號1或8經隶適比對之後具有至少8〇%相似度的序列； -CDR-L2含有序列辨識編號3或1〇或與序列辨識編 號3或10經隶適比對之後具有至少相似度的序列； 以及 -CDR-L3含有序列辨識編號5或與序列辨識編號5 經最適比對之後具有至少80%相似度的序列。 9·如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為其含有序列辨識編號iiCDL u、 序列辨識編號3之CDR-L2和序列辨識編號5之CDR_ L3 的輕鏈。 200829602 10. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其衍生化 合物或功能片段，特徵為其含有序列辨識編號8之 CDR-L1 、序歹辨1¾編號10之CDR-L2和序歹識編號5 之CDR-L3的輕鏈。 11. 如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為其含有下列三種CDRs的輕鏈： -序列辨識編號1或與序列辨識編號1經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的CDR-L1 ; -序列辨識編號3或與序列辨識編號3經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的CDR-L2 ;和 -序列辨識編號5或與序列辨識編號5經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的CDR-L3 ;以及 -序列辨識編號7或與序列辨識編號7經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的CDR-H1 ; -序列辨識編號4或與序列辨識編號4經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的CDR-H2 ;和 -序列辨識編號12或與序列辨識編號12經最適比對 之後具有至少80%相似度之序列的CDR-H3。 12. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之抗體或其衍生化 合物或功能片段，特徵為其含有下列三種CDRs的輕鏈： -序列辨識編號8或與序列辨識編號8經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的CDR-L1 ; -序列辨識編號10或與序列辨識編號10經最適比對 之後具有至少80%相似度之序列的CDR-L2 ;和 3 200829602 序列辨識編號5或與序列辨識編號$經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的CDR-L3 ;以及 含有下列三種CDRs的重鍵： _序列辨識編號9或與序列辨識編號9經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的cdr-HI ; 序列辨識編號11或與序列辨識編號u經最適比對 之後具有至少80%相似度之序列的CDR_H2 ;和 _序列辨識編號6或與序列辨識編號6經最適比對之 後具有至少80%相似度之序列的cdr_h3。 13·如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為其含有序列辨識編號13或與序列辨 識編號13經最適比對之後具有至少8〇%相似度之胺基 酸序列的輕鏈，以及特徵為其含有序列辨識編 號14或與 序列辨識編號14經最適比對之後具有至少8〇%相似度 之胺基酸序列的重鏈。 14. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之人源化抗體或其 衍生化合物或功能#段’特徵為其含有序韻識編號17 或與序列辨識編號丨7經最適比對之後具有至少8〇%相 似度之胺基酸序列的輕鏈，以及特徵為其含有序列辨識 編號18或19或與序列辨識編號18或19經最適比對之後 具有至少80%相似度之胺基酸序列的重鏈。 15. 如上述申請專利範圍中任-項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為該衍生化合物係由含有被植入至少 'CDR以保留全部或部分初始抗體之抗體決定部位辨 4 200829602 識性質之肽骨架的結合蛋白所構成。 16. 如申請專利範圍第15項之抗體或其衍生化合物或功能 片段，特徵為具有選自下列蛋白質的肽骨架：（a)保留 最佳的親緣性；（b)堅固的結構；（c)具有習知的立體 結構；（d)具有小體積及/或(e)含有不改變穩定性之下 被刪除及/或***之修飾的區域。 17. 如申請專利範圍第15或16項之抗體或其衍生化合物或 功能片段，特徵為該肽骨架係選自（i)源自纖黏蛋白及 較佳為第III型功能區10纖黏蛋白、脂籠蛋白、抗運載蛋 白、源自金黃色葡萄球菌A蛋白之B功能區的Z蛋白、硫 氧化還原蛋白A或具有重複基序的蛋白例如“錨蛋白重 複序列”、“armadillo重複序列”、“富含亮胺酸重複序列” 和“三十四肽重複序列”，或(iii)神經元型一氧化氮合成 酶蛋白抑制劑(PIN)的蛋白。 18. 如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為該功能片段係選自Fv、Fab、 F(ab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc和雙鏈抗體的片段，或被 增加半衰期的任何片段例如聚乙烯二醇化片段。 19. 如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或功能片段，特徵為該抗體係一種鼠抗體以及特徵為其 含有序列辨識編號15或與序列辨識編號15經最適比對 之後具有至少80%相似度之胺基酸序列的輕鏈，以及序 列辨識編號16或與序列辨識編號16經最適比對之後具 有至少80%相似度之胺基酸序列的重鏈。 5 200829602 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 士上述申清專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 / 片I又特徵為該抗體係一種嵌合抗體其亦含有源 自與小白鼠之異源品種抗體的輕鏈和重鏈恒定區。 如申4專利範圍第2〇項之嵌合抗體或其衍生化合物或 功％片段’特徵為該異源品種為人類。 如申請專利範圍第21項之人源化抗體或其衍生化合物 或功能片段’特徵為源自人類抗體之輕鏈和重鏈的恒定 品刀別為入或蛇區以及，-1、T -2或τ _4區。 一種能分泌如第1圖所示之具有重鏈和輕鏈序列，，6F4，， 抗體的鼠雜交瘤。 一種破如申請專利範圍第23項之雜交瘤所分泌的抗體。 如上述申請專利範圍中任一項之抗體或其衍生化合物 或力月b片^又’特徵為其能專一性地結合至JAM-A(細胞 連接點附分子A)蛋白。 如申清專利範圍第25項之抗體或其衍生化合物或功能 片段’特徵為其對介於約1奈克分子和1皮克 刀子之間’更佳為介於10皮克分和40皮克分子之間。 種獨立的核酸，特徵為其選自下列的核酸： ㈡編爲如申請專利範圍第1至22項及24至26項中任 項之抗體或其衍生化合物或功能片段的一核酸、DNA 或 RNA ; b) 與a)定義之核酸互補的核酸； c) 在向度限制條件下能與序列辨識編號2〇至31之 核酉欠序列至少一 CDRs雜交的至少18個核苷酸之核酸； 200829602 以及 d)在高度限制條件下能至少與序列辨識編號32或 36之核酸序列輕鏈及/或序列辨識編號33、37或38之核 酸序列重鏈雜交的至少18個核苷酸之核酸。 28· —種如申請專利範圍第27項之核酸所構成的載體。 29· —種含有如申請專利範圍第28項之載體的宿主細胞。 30· —種製造如申請專利範圍第1至22及第24至26項中其一 抗體或其衍生化合物或功能片段的方法，特徵為該方法 包含下列步驟： a) 在培養基及適當培養條件下培養如申請專利範 圍第29項的宿主細胞；以及 b) 從該培養基或培養細胞收獲該抗體或其一功能 片段。 31·如申請專利範圍第1至22及第24至26項中任一項之抗體 或其衍生化合物或功能片段，特徵為其由含有能與形成 腫瘤之任何受體相互作用之第二基序的雙專一性抗體 所構成，該受體係選自VEGFR、VEGF、EGFR、IGF-1R、 HER2/neu、HGF、cMET、FGF、CXCR4和 CXCR2。 32. 如申請專利範圍第1至22、24至26及31項中任一項之抗 體或其衍生化合物或功能片段，其被用作為藥物。 33. —種組成物，其含有如申請專利範圍第1至μ、24至26 及32項中任一項之抗體或其衍生化合物或功能片段所 構成之化合物的活性成分。 34·如申請專利範圍第33項之組成物，特徵為其除了直接對 7 200829602 抗JAM-A蛋白的抗體之外含有作為用於同步、分開或延 曰守投樂之抗腫瘤抗體的組合產品。 35·如申請專利第33或34項之組成物，特徵為其含有作 為用於同步、分開或延時投藥之細胞毒性/細胞抑制劑 的附加組合產品。 36·如f請專利第35項之域物，特徵為㈣胞毒性/ 細胞抑制劑係被化學結合至該抗體以供同時使用。 37·如申請專利範圍第33至36項中任1之組成物，特徵為 該至少-抗體或其衍生化合物或功能片段係共概一細 胞毒素及/或放射性同位素。 38. 如申請專利第32至37射任_奴組成物，特 其被用作為藥物。 39. -種如中請專利範圍第丨至22、啦叫⑶項中任—項 =抗體或其社化合物或功能片段，及/或如中請專利 範圍第33至38項中任_項之組成物的用途，其被用於製 造預防或治療與腫瘤增生相關疾病的藥物。 4〇.如申料·圍第39項之崎，其仙於製造預防或治 療癌症的藥物。 礼如申請專利範圍⑽項之用途，特徵為該癌症係選 列腺癌、骨肉瘤、肺癌、***癌、子宮内膜癌、多發性 骨髓瘤 '印巢癌、胰腺癌和大腸癌。 仏如申請專利範圍第41項之用途，特徵為該癌症係選自峰 激素相關***癌、非小細胞肺癌、大腸癌和騰腺癌的癌
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