TW200817437A

TW200817437A - Monoclonal antibodies against stromal cell derived factor-1 (SDF-1)

Info

Publication number: TW200817437A
Application number: TW096129514A
Authority: TW
Inventors: Sarah L Pogue; Alan J Korman; Josephine M Cardarelli; Mohan Srinivasan; Bingliang Chen; Alasdair F Bell
Original assignee: Medarex Inc; Ono Pharmaceutical Co
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-10
Publication date: 2008-04-16
Also published as: EP2046834B9; US8496931B2; JP2010500005A; WO2008018641A1; EP2046834A4; EP2046834A1; US20100158902A1; EP2046834B1; ES2396220T3; JP5244785B2

Description

200817437 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本揭示提供以高親和力特異性結合至基質細胞衍生因子-1 (SDF-1)之分離之單株抗體，特別為人類單株抗體。也提供編碼SDF-1抗體之核酸分子、供表現用之表現載體、佰主細胞及方法。也提供包括該SDF-1抗體之免疫軛合物、雙特異性分子及醫藥組成物。揭示仰卜丨之檢測方法以及多種B細胞惡性病包括乳癌、多發性骨趫瘤及非何杰金氏淋巴瘤及自體免疫病症之治療方法。【先前技術】趨化素（chemokine)為涉及白血球亞群移動至發炎部位、淋巴細胞生成、血管新生、及淋巴器宫發育之分泌蛋白質（Nelson and Krensky (2001 ) /u/n·亡y 14 : 377-86 ; Campbell ei a]· (2003) Immunol Rev 195 : 58-71 ; Moser et aJ· (2004) Trends J/b顧25 : 75-84 ; Moriguchi ei ah (2005) J Biol Chem 280 : 17408-14)。趨化素透過其誘導細胞趨化反應的作用，於多種發炎疾病及感染疾病上扮演某種角色。兩大次家族可由頭兩個半胱胺酸之位置區別，兩個半胱胺酸可由一個胺基酸隔開（CXC趨化素）或兩個半胱胺酸可相鄰（CC趨化素）（Zlotnik and Yoshie (2000) Immunity 12 · 121-7 > Loetscher and Clark-Lewis (2001 ) J Leukocyte Biol 69 : 881-4)。趨化素經由結合至七個穿膜G蛋白偶合受體來調控其功能（Murphy ei: aJ. (2000) Pharmacol Rev 52 : 145-76) 〇 5 319504 200817437 趨化素基質細胞衍生因子1 (SDF-1/CXCL12)乃受體 % CXCR4唯一已知之天然配體。晚近報告提示SDF-1可用作為第二受體 RDC1 (CXCR7)之配體（Balabanian ei a2. (2005) J Biol Chem 280 : 35760-35766)。CXCR4 廣泛於造血細胞及非造血細胞兩種細胞中表現，並發現CXCR4於某些腫瘤細胞表現。亦有提示SDF-1於導向CXCR4+腫瘤細胞轉移至可高度表現SDF-1之器官諸如淋巴節、肺臟、肝臟及骨絡上扮演某種角色（Kucia et aJ· (2005) Ste/o ^ CeHs 23 : 879-894)。其他研究顯示，於腫瘤微環境内的間葉基質細胞或骨髓衍生之基質細胞持續分泌SDF-1 (Burger and Kipps 2005) 〇鼠SDF-1基因剔除模型顯示SDF-1對下列各項有關鍵重要性··於胚胎發生期間，由胎肝衍生之造血幹細胞將骨髓群落化、於成年期保有此等細胞、胃腸道之血管形成、心室中隔形成及小腦分化（Nagasawa etai. (1996) yVati/re 382 : 635-8 ; Ma et ai· (1 999) 10 : 463-71 ;

You et a7. (1 998) iVati/re 393 : 595-9)。SDF-1 亦顯示涉及Jak激酶及St at激酶之活化（Vi la-Coro eta7. (1999) FASEB J 13 ： 1 699-1710 ； Zhang et al. (2001 ) Blood 97 ： 3342-8)。此外，於患有增生性糖尿病性視網膜病變之糖尿病患者，於眼球也顯示SDF-1含量局部升高（Butler et ah (2005) J Clin Invest 115 ·· 86-93)。【發明内容】本發明提供結合至SDF-1且具有多種期望性質之分離 6 319504 200817437 •之單株抗體’特別為人類單株抗體。此等性質包括對人x SDF-1有高度親和力。 ^ 於一態樣中，本發明係關於一種分離之單株抗體或其抗原結合部，其中該抗體： ^ (a) 以1x1 〇 7M或更少之Kd結合至人類SDF-1 ;以及 (b) 藉免疫沈殿分析而結合至天然人類sdf — 1。較佳抗體為人類抗體，但於另一實施例中，抗體可為鼠抗體、嵌合抗體或人類化抗體。於一實施例中，該抗體係以5x1 (Γ8Μ或更少之kd結合至人類SDF -1 ’以2x10 8M或更少之Kd結合至人類SDF -1，以1χ1(Γ8Μ或更少之Kd結合至人類SDF-1，以5x10—9M或更夕之Kd結合至人類SDF-1 ’以4x10 9M或更少之Kd結合至人類SDF-1，以3χ1(Γ9Μ或更少之Kd結合至人類SDF-1，或以2χ1(Γ9Μ或更少之Kd結合至人類SDF-1。於另一實施例中，本發明提供一種分離之單株抗體或其抗原結合部，其中該抗體係與參考抗體交叉競爭結合至 SDF-1，該參考抗體包含·· (a) 重鏈可變區，包含選自於由SEQ ID NO : 1、2、3 及4所組成之組群之胺基酸序列；以及 (b) 輕鏈可變區，包含選自於由SEQ ID N0 : 5、6、7 及8所組成之組群之胺基酸序列。於不同實施例中，該參考抗體包含： (a)包含SEQ ID NO : 1之胺基酸序列之重鏈可變區；及 7 319504 200817437 (b)包含SEQ ID NO : 5之胺基酸序列之輕鏈可變區或該參考抗體包含： (a) 包含SEQ ID N0: 2之胺基酸序列之重鏈可變區及 (b) 包含SEQ ID N0 : 6之胺基酸序列之輕鏈可變區或該參考抗體包含： (a) 包含SEQ ID N0: 3之胺基酸序列之重鏈可變區及 (b) 包含SEQ ID N0 · 7之胺基酸序列之輕鏈可變區或該參考抗體包含： (a)包含SEQ ID N0 : 4之胺基酸序列之重鏈可變區及又 (b)包含SEQ ID N0 ·· 8之胺基酸序列之輕鏈可變區。於另一態樣中，本發明係有關一種分離之單株抗體戋其抗原結合部’包含人類Vh 1-24基因之產物或衍生自人類Vh 1-24基因之重鏈可變區，其中該抗體係特異性結合 SDF-1。本發明亦提供一種分離之單株抗體或其抗人部，包含人類Vh 3-7基因之產物或衍生自人類Vh3'^ 因之重鏈可變區，其中該抗體係特異性結合。本二明又提供—種分離之單株抗體或其抗原結合部，包含人類 V: L18基因之產物杨生自人類％ u8基因之輕鏈可變、區，其中該抗體係特異性結合Sdf—j。於較佳實施例中，本發明提供一其抗原結合部，包含·· 種分離之單株抗體或 319504 200817437 及 ⑷人基因或Vh3-7基因之重鏈可變區 (b)人類Vk L18基因之輕鏈可變區，· 其中该抗體係特異性結合Sdf- 1。，較佳實施例中’抗體包含人類Vh卜24基因之重鍵 --及人類VKL18基因之輕鏈可變區例中，抗體包含人類Vh3_7其閲夕舌，± 孕乂仏貝施 .A 3 7基因之重鏈可變區及人類VKL18 基因之輕鏈可變區。厂=-態樣中，本發明提供—種分離之單株抗體或其抗原結合部，包含·· 包含CDR1、包含CDR1、其中： CDR2及CDR3序列之重鏈可變區；及 CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區， (a) 該重鏈可變區CDR3序列包含選自於由別⑽肋: 17、18、19及20之胺基酸序列所組成之組群之胺基酸序列，及其保留性修飾； (b) 該輕鏈可變區CDR3序列包含選自於由seqid㈣： 29、30、31及32之胺基酸序列所組成之組群之胺基酸序列，及其保留性修飾； (c) ，抗體以KD 1 x 10-7 M或更少結合至人類SDF-i ; (d) 藉免疫沈版分析結合至天然人類sdf-i。 .較佳，該重鏈可變區CDR2序列包含選自於由SEQ id N〇 · 13、14、15及16之胺基酸序列所組成之組群之胺基酉文序列，及其保留性修改；及該輕鏈可變區⑶序列包含 319504 9 200817437 、選自於由SEQ ID NO: 25、26、27及28之胺基酸序列所組成之組群之胺基酸序列，及其保留性修改。較佳，該重鏈可變區CDR1序列包含選自於由SEQ ID N0 : 9、10、Π及 12之胺基酸序列所組成之組群之胺基酸序列，及其保留性修改，及该輕鏈可變區CDR1序列包含選自於由seq id N0 · 21、2 2、2 3及2 4之胺基酸序列所組成之組群之胺基酸序列，及其保留性修改。較佳組合包含： (a) 包含SEQ ID N0: 9之重鍵可變區CDR1 ; (b) 包含SEQ ID N0 ·· 13之重鏈可變區CDR2 ; (c) 包含SEQ ID N0 : 17之重鏈可變區CDR3 ; (d) 包含SEQ ID N0: 21之輕鏈可變區cdri ; (e) 包含SEQ ID N0 ·· 25之輕鏈可變區CDR2 ;及 (f) 包含SEQ ID N0 : 29之輕鏈可變區CDR3。另一種較佳組合包含： (a) 包含SEQ ID N0 ·· 10之重鏈可變區CDR1 ; (b) 包含SEQ ID N0 ·· 14之重鏈可變區CDR2 ; (c) 包含SEQ ID N0: 18之重鏈可變區cdR3 ; (d) 包含SEQ ID N0 : 22之輕鏈可變區CDR1 ; (e) 包含SEQ ID N0: 26之輕鏈可變區CDR2 ;及 (f) 包含SEQ ID N0 : 30之輕鏈可變區CDR3。另一種較佳組合包含： (a) 包含SEQ ID N0 ·· 11之重鏈可變區cdRI ; (b) 包含SEQIDN0··15之重鏈可變區cDR2; 319504 10 200817437 (C)包含 SEQ ID NO : • 19之重鏈可變區CDR3 ;

另一種較佳組合包含： CDR1 ； CDR2 ;及 (a) 包含SEQ ID N0 : 12之重鏈可變區CDR1 ; (b) 包含SEQ ID NO ·· 16之重鏈可變區CDR2 ; (c) 包含SEQ ID NO ·· 20之重鏈可變區CDR3 ; (d) 包含SEQ ID NO ·· 24之輕鏈可變區CDR1 ; (e) 包含SEQ ID NO · 28之輕鏈可變區CDR2 ;及 (O包含SEQ ID NO: 32之輕鏈可變區CDR3。其匕本發明之較it抗體或其抗原結合部包含： (a) 包含選自於由SEQ ID N0: 1、2、3及4所組成之組群之胺基酸序列之重鏈可變區；以及 (b) 包含選自於由SEQ ID N0 : 5、6、7及8所組成之組群之胺基酸序列之輕鏈可變區；其中該抗體係特異性結合SDF-1。一種較佳組合包含： (a) 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包含SEQ ID N0 ·· 5之胺基酸序列之輕鏈可變區；另一種較佳組合包含： (a)包含SEQ ID N0 : 2之胺基酸序列之重鏈可變區；及 11 319504 200817437 ^ (b)包含MQ ID NO · 6之胺基酸序列之輕鍵可變區；另一種較佳組合包含： (a) 包含SEQ ID N0 : 3之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包含SEQ ID N0 : 7之胺基酸序列之輕鏈可變區；另一種較佳組合包含： (a) 包含SEQ ID N0 ·· 4之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包含SEQ ID N0 ·· 8之胺基酸序列之輕鏈可變區。於本發明之另一態樣中，提供與前述抗體中之任一者競爭結合至SDF-1之抗體或其抗原結合部。本發明之抗體例如可為全長抗體，例如IgG1、igG2、或IgG4同型（is〇type)。另外，抗體可為抗體片段，諸如 Fab、Fab’或Fab’ 2片段或單鏈抗體。本發明亦提供一種免疫軛合物，包含本發明之抗體或其抗原結合部鍵聯至治療劑，諸如細胞毒素（cyt〇t〇xin) 或放射性同位素。本發明也提供一種雙特異性分子，包含本卷明之抗體或其抗原結合部鍵聯至與該抗體或其抗原結合部具有不同結合特異性之第二功能部分。亦提供包含本發明之抗體、或其抗原結合部、或免疫幸厄口物或雙特異性分子及醫藥上可接受之載劑之組成物。分、本毛明亦涵蓋編碼本發明之抗體或其抗原結合部之核酉欠刀子、包含此種核酸之表現載體及包含此種表現載體之宿主細胞。 319504 12 200817437 • 其它本發明之特色及優點由後文詳細說明及實例將更為歡减’該等詳細說明及實例不可解譯為限制性。本案全文所引用之全部參考文獻、基因庫登錄項目、專利案及公開之專利申請案之内容皆以引用方式明白併入此處。【實施方式】本發明係關於以高度親和力特異性結合至SDF-1之分離單株抗體，特別為人類單株抗體。於若干實施例中，本毛月之抗肢係仿生自特定重鏈及輕鏈種系序列，及/或包含特定結構特徵，諸如包含特定胺基酸序列之CDR區。本發明提供为離之抗體、此種抗體之製法、包含此種抗體之免疫輛合物及雙特異性分子及含有本發明之抗體、免疫辆合物或雙特異性分子之醫藥組成物。本發明亦係關於使用該抗體之方法，諸如用來檢測SDF-1，以及治療與仙卜丨表現相關疾病，諸如表現SDF—丨之惡性腫瘤，包括乳癌、細胞惡性腫瘤、及轉移性腫瘤。本發明復關於使用抗體來治療自體免疫病，諸如類風濕性關節炎（ra)及骨關節炎（0A)，或治療移植排斥之方法。本發明復關於使用抗體來治療增生性糖尿病性視網膜病變之方法。 ^為求更完全了解本發明，首歧義某些名詞。額外定義係綜觀詳細說明部分以為陳述。「基質細胞衍生因子—1」及「SDF —丨」等名詞可互換使用:包括人類SDF-1之變異體、異構型（is〇f〇rm)、及種屬同系物。如此，本揭示之人類抗體可與SDF-丨異構型中之任一者交叉反應。此外，於若干情況下，本揭示之人類抗 319504 13 200817437

•體可與得自人類以外之種屬之_]交叉反應。於若干實轭例中’抗體可能對一種或多種人類SDF_i具有完全特異性’且可能+會顯示非人類種屬交叉反應或其它非人類類，交叉反應。例示性人類SDF-Ια、石及^異構型之完整私基酸序列分別具有基因庫寄存號碼Np—95463?(卿D

NO . 44)、NP_〇〇〇6〇〇 (SEQ ID N0 : 45)及 NP—001 029058 (SEQ ID NO : 46) 〇免疫反應」一詞係指例如由前述細胞或肝臟所製造之淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞嗟細胞、顆粒細胞及可溶性大分子（包括抗體、趨化素及補體），其導致入侵病原、病原所感染的細胞或組織、癌細胞、或於自體免疫病或病 1*生叙k之If况下，導致正常人類細胞或紐織之選擇性損傷、摧毁或清除。、乜心傳‘路径」係指在將信號由細胞之一部分傳輸至細胞另一部分扮演一角色之各種信號轉導分子間之生物化學關係。如此處使用，「細胞表面受體」一詞包括，例如可接收信號且可將此種信號跨越細胞膜而傳輸之分子及分子複體。本發明之「細胞表面受體」之實例為— 1受體。「抗體」一詞於此處包括全抗體及其任何抗原結合片段（亦即「抗原結合部」）或其單鏈。「抗體」係指—種糖蛋白，包含至少兩個重鏈（H)及兩個輕鏈（L)，藉雙硫鍵互連、或其抗原結合部。各重鏈係由重鏈可變區（縮寫為重鏈恆定區所組成。重鏈恆定區由三個功能部位Ch〗、及匕3 所組成。各輕鏈係由輕鏈可變區（縮寫為ν〇及輕鏈恆定^ 319504 14 200817437 •所組成。輕鏈恆定區係由一個功能部位Cl所組成。％區及 Vl區又再細分為高度可變區，定名為互補決定區（CDR)，直間插置較高保留性之區’定名為架構區⑽。各個Vh及：係由三個CDR及四* FR由胺端至叛端以下述順序排列：一 FR2、、FR3、CDR3、FR4。重鏈可變區及輕鏈可變區含有與抗原交互作用之結合功能部位。抗體之恒疋區可调控免疫球蛋白結合至宿主組織或宿主因子，包括免疫系統之各種細胞（例如效應細胞（ef fect〇r Ml 1)) 及典型補體系統之第一成份（Clq)。如此處使用，抗體之「抗原結合部」（或簡稱為「抗體部」）係指保有可特異性結合至抗原（例如仙卜^能力之一個或多個抗體片段，業已顯示抗體之抗原結合功能可經由全長杬體之片段進行。涵蓋於抗體之「抗原結合部」一詞内之結合片段之實例包括（i) Fab片段，由VL.、Vh、匕及 ChI功能部位所組成之一價片段；（ii) F(ab，）2片段，包含以雙硫橋於樞紐區連結之兩個Fab片段之二價片段；（u 土） Fab’片段，其實質上為有部分樞紐區之Fab(可見於「FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY」（Paul ed·， 3· sup· rd ed· 1 993) ; (iV)Fd片段，由Vh及Cd功能部位所組成；（v)Fv 片4又’由抗體單臂之Vl及Vh功能部位所組成，（vi )dAb片段（Ward ei ai·，（1 989) iVahre 341 : 544-546)，係由

Vh功能部位所組成；（νϋ)分離之互補決定區（CDR);及 (v i i i)奈米體，含有單一可變功能部位及兩個恆定功能部位之重鏈可變區。此外，雖然FV片段之兩個功能部位，亦 15 319504 200817437 .即Vl及Vh，係、由分開基因編石馬，但也可藉合成的鍵聯基使用重組方法接合二功能部位，允許其可被製成單一蛋白質鏈’其巾VL區及％區配對來形成一價分子（稱作為單鍵 (SCFV);例如參考Bird以以，（1 988)如.咖e 242: 423-426；^ Hastened；. (1 988) Pr〇〇. Natl. Acad. Sci. USA 85 . 5879_5883)。此種單鏈抗體亦涵蓋於抗體之「抗原結合部」一詞之範圍内。此等抗體片段係使用熟諳技藝人士已知之習知技術獲得，且該片段係以與完好抗體之相同方式師檢其用途。一如此處使用之「分離之抗體」意指實質上不含其它不同抗原彳寸異性之抗體（例如特異性結合SDF-丨之分離之抗體係λ貝上不含特異性結合汕卜丨以外抗原之抗體）。但特異性結合SDF]之分離之抗體對其它抗原，諸如得自其它種屬之SDF-1分子’可具有交叉反應性。此外，分離之抗體貝貝上不含其它細胞材料及/或化學品。 ^ 單株抗體」或「單株抗體組成物」等詞用於此處係指單一分子組成物之抗體分子之製劑。單株抗體組成物顯不對扣定抗原決定部位之單一結合特異性及親和力。「人類抗體」一詞用於此處包括有可變區之抗體，其中‘構區及CDR區皆衍生自人類種系（germline)免疫球蛋白序列，此外，若抗體含有一恆定區，則該恆定區也衍生自人類種系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括非 $人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（包括於試管内藉隨機或特定位置突變，或於體内藉體細胞突變所導 16 319504 200817437 入的突變）。但如此處使用，「人類 ^ 括其⑽序列衍生自他種哺乳動物，ς二:^非意圖包已移殖至人類架構序列上之抗體。-、乳，之種系且人類單株抗體」-詞係指顯示單—結合特異性之抗體，其具有架構區及CDR區皆衍&自Α 4 6何生自人類種系免疫球蛋白 ^:可於一個實施例中，人類單株抗體係藉融合瘤“，融合瘤包括得自非人類轉基因動物，例如轉基因鼠之B細胞’其具有—基因體’包含融合至—永生化細胞之人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因。如此處使用，「重組人類抗體」一詞包括藉重組手段所製備:表現、創&、或分離之全部人類抗體，諸如⑷分離自人類免疫球蛋白基因之基因轉殖或染色體轉殖的動物 (例如小鼠），或由其中製備之融合瘤（容後詳述）之抗體，· (b)分離自轉形而表現人類抗體之宿主細胞之抗體，例如得自轉染瘤（transfectoina) ; (c)分離自重組、組合的人類抗體庫之抗體，·以及（d)藉任何其它涉及將人類免疫球蛋白基口序列剪接至其它DNA序列之手段所製備、表現、創造、或分離之抗體。此種重組人類抗體具有可變區，其中架構區及CDR區係衍生自人類種系免疫球蛋白序列。但於若干貫施例中，此種重組人類抗體可接受試管内突變誘發（或當使用人類Ig序列之轉基因動物時，體内體細胞突變誘發）’故’重組抗體之VH及vL區之胺基酸序列雖為衍生自人類種系Vh及Vl序列之序列，但該等序列於活體内可能並非天然存在於人類抗體種系之譜系。 17 319504 200817437 如此處使用，「同型矣— 抗體類鏈恒定區基因所編石馬之 ::識抗原之抗體」及「抗原之特異性此處，與，「特異性結合至抗原之抗體」交互使用。人#抗體何生物」—詞係指人類抗體之任何修改來式，，如抗體與其他因子或抗體之軛合物。 ’ :類化抗體」一阔意圖表示其中衍生自其他哺乳動如小乳之種系之CDR序列已經移殖至人類架構序列之抗體。=類架構序列内可做出額外架構區修改。瓜口抗體」一詞意圖表示可變區序列係衍生自一個種屬’而恆定區序列係衍生自另_種屬之抗體，諸如可變區序列係何生自小鼠抗體，而恆定區序列係衍生自人體之抗體。 —如此處使用，4寸兴性結合人類聊一！」之抗體意圖表不以1x10 7M或更少、更佳5χ1(Γ8Μ或更少、更佳3χΐ〇ι 或更少、更佳lxl(T8M或更少、甚至更佳5χ1(Γ9Μ或更少之 Kd結合至人類SDF-1之抗體。 ▲如此處使用，「實質上並未結合」至蛋白質或細胞一詞，表示並未結合或並未以高度親和力結合至蛋白質或細胞，換έ之，以1x10 或更多、更佳ixi〇-5m或更多、更佳1x101或更多、更佳1χ1(γ3μ或更多、甚至更佳ΐχΐ〇_2Μ 或更多之Kd結合至蛋白質或細胞。如此處使用之「KassQ。」或「Ka」等詞意圖表示特定抗體-抗原交互作用之結合速率；此處使用之「“s」或「κ 319504 18 200817437 等詞意圖表不特定抗體-抗原交互作用之解離速率。如此處使用「KD」一詞係指解離常數，係由心對匕之比（亦即Kd/^ 求出，且以莫耳濃度（M)表示。抗體之^值可使用本技術領域確立之方法測定。抗體Kd之較佳測定方法係經由使用表面電漿共振（surface plasm〇n res〇nance)，較佳使用諸如拜可（Biacore®)系統之生物感測器系統測定。如此處使用，Ϊ gG抗體之「高度親和力」係指對目標抗原具有Kd為lxl〇-7M或更少，更佳5χ1(Γ8Μ或更少，又更佳lxio Μ或更少，又更佳5χ1〇-9μ或更少及又更佳^10 1 或更少的抗體。但「高度親和力」結合可因其它抗體同型而改變。例如IgM同型之「高度親和力」表示具有。為ι〇_6μ 或更少，更佳ΙΟ-%或更少，又更佳10-8μ或更少之抗體。如此處使用，「個體」一詞包括任何人類或非人類動物。「非人類動物」一詞包括全部脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、羊、犬、豸苗、馬、牛、雞、兩棲類、爬蟲類等。本發明之不同態樣將於下列小節中進一步說明。本發明之抗體係以抗體之特定功能特徵或性質來特徵化。例如’抗體特異性結合至人類SDF-1。較佳，本發明抗體係以高度親和力’例如lxl01或更少之1，予以、合至SDF-1。本發明之抗SDF —丨抗體較佳具有一種或下列特性： (i)以Kd 1χ1〇_7Μ或更少結合至人類SDF-1 ; 319504 19 200817437 (i i)藉免疫沈澱分析而結合至天然人類SDF-1 ; (iii) 阻斷SDF-1結合至CEM細胞； (iv) 阻斷CEM細胞内SDF-1誘導之鈣流（caicium flux)； (v) 阻斷SDF-1誘導之CEM細胞遷移；或 (vi) 阻斷HuVEC細胞中之微血管形成（capiHary tube formation) 〇較佳，抗體係以5x1 (Γ8Μ或更少之Kd結合至人類 SDF-1，以2χ1(Γ8Μ或更少之Kd結合至人類SDF-1，以5χ1(Γ9Μ 或更少之Kd結合至人類SDF-1，以4χ10-9Μ或更少之Kd結合至人類SDF-1，以3xl(T9M或更少之Kd結合至人類 SDF-1，以2xlO-9M或更少之Kd結合至人類SDF-1，或以1 xl〇 9M或更少之Kd結合至人類SDF-1。抗體較佳結合至存在於SDF-1之抗原決定部位，該抗原決定部位並未存在於其它蛋白質。抗體典型係結合至 SDF-1 ’但不結合至其它蛋白質，或以低親和力結合至其它蛋白質’諸如以lxl〇-6M或更多、更佳ΐχΐ〇-5Μ或更多、更佳1x10 4M或更多、更佳ιχ1〇-3Μ或更多、又更佳ιχ1〇-2Μ 或更多之Kd結合至其它蛋白質。評估抗體對SDF-ι之結合能力之標準分析為本技術領域已矣包括例如ELISA、西方墨點（Western blot)、RIA、及級里細胞儀分析。適當分析詳述於實例。抗體之結合動力學（例如結合親和力）可藉本技術領域已知標準檢定分析，例如藉拜可系統分析來評估。 20 319504 200817437 魅體1農本發明之較佳抗體為人類單株抗體m⑽及 2 A 5，其分離及結構特徵化係再㈣化係如貫例1及2之說明。11)3、 1 2ZV ^ NO： D3、1H2、1C6及2A5之VL胺基酸序列八別顯示於SEQ ID腿：5、6、7及8。土夂序列刀別人假設各抗體可結合至SDFm序列及vL序列可「、，日口^配對」來形成本發明之其它抗SDF-1結合分子。二't與配對」抗體之SDF—結合可使用前述及實例中之 ::二析如广SA)試驗。較佳為當h鏈與V，混合^ =，件自特"H/Vt配對之Μ列以結構類似 J置換。同理’較佳為得自特定祕配對之構類似之VL序列置換。 π 乂… 據此’於-態樣中，本發明提供—種分離或其抗原結合部，包含·· 早株抗體 (a) 重鏈可變區，包含選自於由卿a N〇 : i 及4所組成之組群之胺基酸序列；以及 3 (b) 輕鏈可變區，包含選自於由SEQ ID N0 : 5、β、及8所組成之組群之胺基酸序列；、7 其中該抗體係特異性結合較佳為人類於較佳實施例中，本發明之抗體、。之-者或多者：進步有下列特性中 (i)以^χ10-7Μ或更少之匕結合至人類 (u)藉免疫沈澱分析而結合至天然人類. 319504 21 200817437 (iii) 阻斷SDF-1結合至CEM細胞； (iv) 阻斷CEM細胞内SDF-1誘導之鈣流； (v) 阻斷SDF-1誘導之CEM細胞遷移；或 (vi) 阻斷HuVEC細胞中之微血管形成。較佳重鏈與輕鏈之組合包括： (a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO : 1之重鏈可變區；及 (b) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 : 5之輕鏈可變區；或 (a) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 :2之重鏈可變區；及 (b) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 ·· 6之輕鏈可變區；或 (a) 包含胺基酸序列SEQ ID N0: 3之重鏈可變區；及 (b) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 : 7之輕鏈可變區；或 (a) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 : 4之重鏈可變區；及 (b) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 : 8之輕鏈可變區。於另一態樣中，本發明提供包含1D3、1H2、1C6及2A5 之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合之抗體。1D3、 1H2、1C6及2A5之Vh CDR1之胺基酸序列顯示於SEQ ID N0: 9、10、11 及 12。1D3、1H2、1C6 及 2A5 之 Vh CDR2 之胺基酸序列顯示於 SEQ ID N0 : 13、14、15 及 16。1D3、1H2、 Κβ及2A5之Vh CDR3之胺基酸序列顯示於SEQ ID N0 : 17、 18、19 及 20。1D3、1H2、1C6 及 2A5 之¥“0以之胺基酸序列顯示於 SEQ ID N0 : 21、22、23 及 24。1D3、1H2、1C6 及2A5之Vk CDR2之胺基酸序列顯示於SEQ ID N0 : 25、 26、27 及 28。1D3、1H2、1C6 及 2A5 之 VK CDR3 之胺基酸序列顯示於SEQ ID N0 ·· 29、30、31及32。CDR區係使用 319504 22 200817437 卡貝（Kabat)系統說明（Kabat，Ε· A·，et aJ· (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services， NIH Publication No· 91-3242) o 假設此等抗體各別皆可結合至SDF_ 1，且抗原結合特異性主要係由CDR1、CDR2及CDR3區所提供，則Vh CDR1、 CDR2及CDR3序列與Vk CDR1、CDR2及CDR3序列可「混合與配對」（亦即得自不同抗體之CDR混合且配對，但各抗體必須含有 Vh CDR1、CDR2 及 CDR3 及 Vk CDR1、CDR2 及 CDR3) 來形成本發明其它抗SDF-1結合分子。此種「混合且配對」抗體之SDF-1結合可使用前述及實例中所述之結合分析 (例如ELISA，拜可分析）試驗。較佳為當Vh CDR序列混合與配對時，得自特定Vh序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列係以結構類似之CDR序列置換。同理，當Vk CDR序列混合與配對時，得自特定Vk序列之CDR1、CDR2及/或CDR3 序列係以結構類似之CDR序列置換為較佳。熟諳本技術人士顯然易知，對前文揭示之單株抗體1D3、1H2、1C6及2A5 之CDR序列，以結構類似序列取代一個或多個Vh及/或Vl CDR區，可形成新穎Vh序列及Vl序列。據此，於另一態樣中，本發明提供一種分離之單株抗體或其抗原結合部，包含： (a) 重鏈可變區CDR1，包含選自於由SEQ ID N0 : 9、 10、11及12所組成之組群之胺基酸序列； (b) 重鏈可變區CDR2，包含選自於由SEQ ID N0 : 13、 23 319504 200817437 14、15及16所組成之組群之胺基酸序列； (c) 重鏈可變區CDR3，包含選自於由SEQ ID N0 : 17 18、19及20所組成之組群之胺基酸序列； (d) 輕鏈可變區CDR1，包含選自於由SEQ ID N〇 : 2ι 22、23及24所組成之組群之胺基酸序列； (e) 輕鏈可變區CDR2，包含選自於由SEQ ID N0 : & 26、27及28所組成之組群之胺基酸序列；及 ⑴輕鏈可變區CDR3，包含選自於由SEQ ID Ν0 : 29 30、31及32所組成之組群之胺基酸序列；其中該抗體係特異性結合SDF-1，較佳為人類於一較佳實施例中，該抗體包含： (a) 包含SEQ ID NO: 9之重鏈可變區CDR1 ; (b) 包含SEQ ID N0 ·· 13之重鏈可變區CDR2 ; (c) 包含SEQ ID N0 : 17之重鏈可變區CDR3 ; (d) 包含SEQ ID N0 · 21之輕鏈可變區cdri ; (e) 包含SEQ ID N0 : 25之輕鏈可變區CDR2 ;及 (f) 包含SEQ ID NO· 29之輕鏈可變區cj)R3。於另一較佳實施例中，該抗體包含： (a) 包含SEQ ID N0· 10之重鏈可變區cdri ; (b) 包含SEQ ID NO· 14之重鏈可變區cj)R2; (c) 包含SEQ ID NO· 18之重鏈可變區cj)R3 ; (d) 包含SEQ ID N0· 22之輕鏈可變區cdri ; (e) 包含SEQ ID NO· 26之輕鍵可變區;及 (f) 包含SEQ ID NO· 30之輕鏈可變區〇训3。 319504 24 200817437 於另一較佳實施例中，該抗體包含： (a) 包含SEQ ID N0 : 11之重鏈可變區CDR1 ; (b) 包含SEQ ID N0 : 15之重鏈可變區CDR2 ; (c) 包含SEQ ID N0 : 19之重鏈可變區CDR3 ; (d) 包含SEQ ID N0 : 23之輕鏈可變區CDR1 ; (e) 包含SEQ ID N0 ·· 27之輕鏈可變區CDR2 ;及 (f) 包含SEQ ID N0 ·· 31之輕鏈可變區CDR3。於另一較佳實施例中，該抗體包含： (a) 包含SEQ ID N0 : 12之重鏈可變區CDR1 ; (b) 包含SEQ ID N0 : 16之重鏈可變區CDR2 ; (c) 包含SEQ ID N0 : 20之重鏈可變區CDR3 ; (d) 包含SEQ ID N0 : 24之輕鏈可變區CDR1 ; (e) 包含SEQ ID N0: 28之輕鏈可變區CDR2 ;及 (f) 包含SEQ ID N0 : 32之輕鏈可變區CDR3。本領域已知，CDR3功能部位獨立於CDR1及/或CDR2 功能部位，可單獨決定抗體對同源抗原之結合特異性，共通CDR3序列產生有相同結合特異性之多個抗體係為可預涓1J 。如參考 Klimka et ai.， British J. of Cancer 83(2) : 252-260(2000)(說明只使用鼠類抗CD30抗體Ki-4 之重鏈可變區CDR3之人類化抗CD30抗體之製造）；Beiboer etaJ·，J. Mol. Biol. 296: 833-849(2000)(說明只使用親代鼠MOC-31抗EGP-2抗體之重鍵CDR3序列之重組上皮糖蛋白-2(£0?-2)抗體）；83(16『613].，？1*〇〇.如士1.人〇&(1· Sci. U. S. A. 95 : 8910-8915(1 998)(說明一組人類化抗接 25 319504 200817437 合素α v石3抗體’使用鼠類抗接合素α v /5 3抗體LM609之重鏈及輕鏈可變CDR3功能部位，其中各成員抗體包含CDR3 功能部位外側之獨特序列，可以與親代鼠抗體等高或更高之親和力來結合與親代鼠抗體相同之抗原決定部位）；

Barbas ei ai.，J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-2162 (1994) (揭示CDR3功能部位對抗原結合提供最顯著貢獻）；肋汕“ etaL, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 ： 2529-2533 (1 995)(說明抗人類胎盤DNA之三種Fab 、SI_4〇及 SI-32)之重鏈CDR3序列移殖至抗破傷風類毒素Fab之重鏈上，藉此原有重鏈CDR3之置換，驗證單獨CDR3功能部位即可提供結合特異性）；j. Immun〇l. 157 · 739-749( 1996)(說明僅親代多重特異性Fab LNA3之重鏈CDR3轉移至單一特異性IgG破傷風類毒素結合 P313抗體之重鏈，即足以保有親代Fab之結合特異性之移殖研究。參考文獻全文各自以引用方式併入此處。如此，本發明提供包含衍生自人類或非人類動物抗體之一個或多個重鏈及/或輕鏈CDR3功能部位之單株抗體，其中該單株抗體可特異性結合至SDF—丨。於其他面向中，本發明提供包含得自非人類抗體，諸如小鼠或大鼠抗體，之一個或多個重鏈及/或輕鏈CDR3功能部位之單株抗體，其中該單株抗體可特異性結合至汕卜丨。於若干實施例中，包含得自非人類抗體之一個或多個重鏈及/或輕鏈 CDR3功能部位之此等本發明抗體可競爭結合；（b)保有功月b特性；（c)結合至相同抗原決定部位；及/或（d)具有對 319504 26 200817437 .應親代非人類抗體之類似的結合親和力。於其它態樣中，本發明提供包含得自人類抗體之—個或多個重鏈及/或輕鏈CDR3功能部位之單株抗體，例如=

自非人類動物之人類抗體，其中該人類抗體可特異性結Z 至SDF-1。於其它態樣中，本發明提供包含得自第一人類抗體，諸如得自非人類動物之人類抗體，之一個或多個重鏈及/或輕鏈CDR3功能部位之單株抗體，其中該第一人來抗體可特異性結合SDH，以及其中得自第_人類抗體= CDR3功能部位置換缺乏結合特異性之人類抗體之 CDR3功能部位，來產生可特異性結合至sdf_i之第二人抗體。於若干實施例中，包含得自第一人類抗體之-個或鏈=或輕鍵⑽3功能部位之本發明抗體⑷可競 f結合，（b)保有功.能特性；（）砝人及/或⑷具有對岸親_ °至相㈣原決定部位；㈣應親代弟-人類抗體之類❿的結合親和 :。於較佳實施例中’第一人類抗體為⑽、ΐΗ2、⑽或财實施例中，本發明之抗體包含得自特定種系1 鏈免疫球蛋白基因之番鰱 ’、- 免心…i 變區，及/或得自特定種系輕4 a未蛋白基因之輕鏈可變區。 =如於較佳實施例中，本發明提供或其抗原結合部，包刀雕之早株抗邀因之產物或衍生自人鏈了雙區’其為人類V“-24基 ^ ^ 自人續VH卜24基因，1中哕祐舻焱牡® 性結合SDF-1。於另一鲈供· a 、中該抗體係特異車乂乜n鈿例中，本發明提供一分離 319504 27 200817437 •之單株抗體或其抗原結合部， …基因之產物或衍生自人類二=變區，其為人類係特異性結合Si)F-l。於又另—較佳每:因，其中該抗體供-分離之單株抗體或其抗原結 1例中，本發明提其為人類h U8基因之產物或衍；。人輕鏈可變區’ 其中該抗體係特異性結合SDF」。人頌⑽基因，中，本發明提供一種分 _ —較佳實施例中該抗體：刀叙早株抗體或其抗原結合部，其 (a)包含重鏈可變區，其為人類v 產物或衍生自人類Vb1-24或3_7基因基因之和請：41及42所述胺基酸㈣）(料基因分別編碼々 (b)包含輕鏈可變區’其為人類VkU8基因之產物或丁人類Vk L18基因（該等基因分別編碼SEQ汕⑽:一 4 3所述胺基酸序列）；以及 (c)4寸異性結合SDF-1，較佳為人類sdf-1。分別有vfi 1-24及VKL18之νΗ及νκ之抗體實例為1D3 及1H2。分別有Vh 3 —7及Vk U8之％及％之抗體實 1C6 及 2A5。 ' 於較佳實施例中，本發明之抗體進一步有下列特性中之一者或多者： (1)以1χ1(Γ?Μ或更少之Kd結合至人類SDF-1 ; (ii) 藉免疫沈澱分析而結合至天然人類SDF-1 ; (iii) 阻斷SDF-1結合至CEM細胞； (i v)阻斷CEM細胞内SDF-1誘導之I弓流； 28 319504 200817437 (v) 阻斷SDF-1誘導之CEM細胞遷移；或 (vi) 阻斷fjuVEC細胞中之微血管形成。如此處使用，若抗體之可變區係得自使用人類種系免疫球蛋白基因之系統，則人類抗體包含為特定種系序列之產物」或「衍生自」特定種系序列之重鏈或輕鏈可變區。此等系統包括以感興趣之抗原免疫接種攜帶人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠，或以感興趣抗原篩檢顯示於噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫。為人類種系免疫球蛋白序歹J之產物」或「衍生自」人類種系免疫球蛋白序列之人類抗體可經由比較該人類抗體之胺基酸序列與人類種系免疫球蛋白基因之胺基酸序列，以及選出與人類抗體序列最接近（亦即最大相同性百分比）之人類種系免疫球蛋白序列來就此辨識。為人類種系免疫球蛋白序列之「產物」或「衍生自」人類種系免疫球蛋白序列之人類抗體可含有與種系 2列比較不同的胺基酸，係因例如天然發生體基因突變或蓄意導入部位導向突變。但一選定之人類抗體在胺基酸序列上，與藉人類㈣免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列典型至少有90%相同性，且含有當與其它種屬之種系免产球蛋白胺基酸序列（例如鼠種系序列）比較時可識別人類1 體為人類抗體之胺基酸序列。於某些情況下，人類抗體之胺基酸序㈣㈣免疫球蛋白基因編碼之絲酸序^至少有95%或甚至至少96%、97%、98%或99%相同性。典型地^，衍生自特定人類種㈣狀人類抗體與人類㈣免疫球疋白基因所編碼之胺基酸序賴示胺基酸差異不超過 319504 29 200817437 •胺基s文於某些情況下，人類抗體顯示與種系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列之胺基酸差異不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。同源抗體於又另一個實施例中，本發明之抗體包含重鏈及輕鏈可變區，其包含與此處所述較佳抗體之胺基酸序列同源之胺基酸序列，且其中該等抗體保有本發明之抗SDF〜1抗體期望的功能性質。. _ 舉例言之，本發明提供一種分離之單株抗體或其抗原結合部’包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： (a) 該重鏈可變區包含一胺基酸序列，其與選自於SEQ ID NO : 1、2、3及4所組成之組群中之胺基酸序列 80%同源性； " (b) 該輕鏈可變區包含一胺基酸序列，其與選自於8印 ID N0 ·· 5、6、7及8所組成之組群中之胺基酸序列至 80%同源性； " (C )該抗體係以1 X1 0 或更少之Kd結合至人類 SDF_ 1 ;以及 (d)該抗體係藉免疫沈殿分析而結合至天然人類 SDF-1 。於不同實施例中，該抗體可為例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。於較佳實施例中，本發明之抗體進一步有下列特性中之一者或多者： 319504 30 200817437 (i) 阻斷SDF-1結合至CEM細胞； (ii) 阻斷CEM細胞内SDF-1誘導之鈣流； (iii) 阻斷SDF-1誘導之CEM細胞遷移； (iv) 阻斷HuVEC細胞中之微血管形成。於其它實施例中，Vh及/或Vl胺基酸序列可與前述序列為 85%、90%、95%、96%、97%、98°/◦或 99%同源性。具有與前述序列之VH區及Vl區高度（亦即80%或更多）同源性之 Vh及VL區之抗體可經由編碼SEQ ID N0 : 33、34、35、、 37、38、39及40之核酸分子之突變誘發（如定點突變或pCR 媒介突變）而獲得，接著使用此處所述功能分析來測試編碼史更之抗體之保留功能（亦即如上（c)及（d)所陳述之功月匕’以及如上（i )至（i v)所列舉之功能）。如此處使用，兩個胺基酸序列間之同源性百分比係相‘ 當於兩種序列間之相同性百分比。兩種序列間之相同性百刀比為由該等序列所共享之相同位置數目之函數（亦即％同源性=相同位置數目/位置總數xl00)，考慮間隙數目及各間隙長度，必須導入間隙來獲得二序列間之最佳比對。二序列間之序列比較及相同性百分比之測定可使用數學演繹法則來達成，如下非限制性實施例所述。兩種胺基酸序列間之相同度百分比可使用PAM12〇權重殘數表、間隙長度罰數12及間隙罰數4，使用E. Mayers 及 W· Mi 1 ler 演繹法則（c⑽pUt· Appl· Biosci·，4 : 11-17 (1988))[已經結合入ALIGN程式（2· 0版）]測定。此外，兩種私基酸序列之相同度百分比可使用B1 〇ssum 62矩陣或 31 319504 200817437 • PAM250 矩陣，及間隙權值 16、14、12、1〇、8、6、或 4 及長度權值 1、2、3、4、5 或 6,使用 Needleman 及 Wunsch(J· Mol· Biol· 48.444-453)演繹法則[已經結合入gcg套裝軟體中之GAP程式（可得自http ·· //www· gCg· com)]測定。額外或替代的，本發明之蛋白質序列進一步可用作為「查詢序列」來進行對公開資料庫的搜尋，例如識別相關序列。此等搜尋可使用AltSchul “·（1 990) J· Mol·

Biol· 215 : 403-10 之 XBLAST 程式（2· 〇版）進行。BLAST 蛋白質搜尋可以XBLAST程式、分數=5〇、字長=3進行，來獲得與本發明之抗體分子同源之胺基酸序列。為了獲得間隙比對以達成比較，可利用加間隙之BLAST，W Altschul et aL，（1997)核酸研究 25(17) : 3389-3402 所述。當使用BLAST及加間隙之BLAST程式時，可使用個別程式之内設參數（例如 XBLAST 及 NBLAST)。參考 http ·· "www· ncbi · nlm.nih.gov 〇具保留性修改之抗體於若干實施例中，本發明之抗體包含：包含CDR卜CDR2 及CDR3序列之重鏈可變區，及包含CDR1、CDR2及CDR3 序列之輕鏈可變區，其中此等CDR序列中之一者或多者包含基於此處所述較佳抗體（例如1D3、1H2、1C6或2A5)之特定胺基酸序列或其保留性修改；以及其中該等抗體保有本發明之抗SDF-1抗體之期望功能性質。如此，本發明提供一種分離之單株抗體或其抗原結合部，包含：包含 CDR卜CDR2及CDR3序列之重鏈可變區，及包含CDIH、CDR2 32 319504 200817437 及CDR3序列之輕鏈可變區，其中： 17 ia)該重鍵可變區C贈序列包含與選自於SEQIDN0: 8 19及20之胺基酸序列所組成之組群中之胺基酸序列及其保留性修改；㈦該輕鍵可變區CDR3序列包含與選自於卿id n〇 : 29 30 31及32之胺基酸序列所組成之組群中之胺基酸序列及其保留性修改；以及 (c) 該抗體係以lxl0-7M或更少之匕結合至人類 SDF-1 ;以及 (d) 該抗體係藉免疫沈殿分析而結合至天然人類 SDF-1。、、 ' 於較佳實施例中，本發明之抗體進一步有下列特性中之一者或多者： (i)阻斷SDF-1結合至CEM細胞； (i i)阻斷CEM細胞内SDF -1誘導之飼流； (iii) 阻斷SDF-1誘導之CEM細胞遷移； (iv) 阻斷HuVEC細胞中之微血管形成。於較佳實施例中，該重鏈可變區CDR2序列包含選自於 SEQ Π) N0 : 13、14、15及16之胺基酸序列所組成之組群中之胺基酸序列及其保留性修改；及該輕鏈可變區CDR2 序列包含選自於SEQ ID N0 : 25、26、27及28之胺基酸序列所組成之組群中之胺基酸序列及其保留性修改。於另一較佳實施例中，該重鏈可變區CDR1序列包含選自於SEQ Π) N0 : 9、1〇、11及12之胺基酸序列所組成之組群中之胺基 33 319504 200817437 酸序列及其保留性修改；及該輕鏈可變區CDR1序列包含選自於SEQ ID N0 : 21、22、23及24之胺基酸序列所組成之組群中之胺基酸序列及其保留性修改。於不同實施例中，抗體可為例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。如此處使用’「保留性序列修改」一詞意指並未顯著影響或變更含有胺基酸序列之抗體之結合特性之胺基酸修改。此種保留性修改包括胺基酸取代、加成及刪失。修改可藉本技術領域已知標準方法，諸如定點突變或pCR媒介突變，而導入本發明之抗體。保留性胺基酸取代為，胺基酸殘基係以具有類似支鏈之胺基酸殘基置換者。具有類似支鏈之胺基酸殘基家族已經本技術領域定義。此等家族包括有鹼性支鏈之胺基酸（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、有酸性支鏈之胺基酸（例如天門冬胺酸、麩胺酸）、有未帶電的極性支鏈之胺基酸（例如甘胺酸、天門冬醯胺酸、麵酿胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、有非極性支鏈之胺基酸（例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、***酸、甲硫胺酸）、有万_分支支鏈之胺基酸（例如酥胺酸、纈胺酸、異白胺酸）及有芳香族支鏈之胺基酸（例如酪胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸）。如此，於本發明抗體之CDR區内部之一個或多個胺基酸殘基可以相同支鏈家族之其它胺基酸殘基置換；變更後之抗體可使用此處所述功能分析來試驗所保留的功能（亦即如上 (c)及（d)列舉之功能及如上（i)至（iv)列舉之功能）。 319504 34 200817437 ‘ SEQ ID NO : 9、l〇、11或12之重鏈CDri序列可包含一個或多個保留性序列修改，諸如一、二、三、四、五或多個胺基酸取代、加成或刪失；SEq ID NO : 21、22、23 或24之輕鏈CDR1序列可包含一個或多個保留性序列修改，諸如一、二、三、四、五或多個胺基酸取代、加成或刪失；SEQ ID N0 : 13、14、15或16之重鏈CDR2序列可包含一個或多個保留性序列修改，諸如一、二、三、四、五或多個胺基酸取代、加成或刪失；SEq N0 : 25、26、 27或28之輕鏈CDR2序列可包含一個或多個保留性序列修改，諸如一、二、三、四、五或多個胺基酸取代、加成或刪失；SEQ ID N0 : 17、18、19或20之重鏈CDR3序列可包含一個或多個保留性序列修改，諸如一、二、三、四、五或多個胺基酸取代、加成或刪失；SEq ID N〇 ·· 29、3〇、 31或32之輕鏈CDR3序列可包含一個或多個保留性序列修改，諸如一、二、三、四、五或多個胺基酸取代、加成或刪失。

於其他實施例中，本發明提供結合至與本發明之 SDF-1單株抗體中之任一者相同之人類抗原決定部位之抗體（亦即具有與本發明之單株抗體任一者交又競爭結合至SDF-1之能力之抗體）。於較佳實施例中，交又競爭研究之參考抗體可為單株抗體1D3(分別具有如SEQ NO · 1及5之Vh序列及VL序列），或單株抗體1H2 (分別具 319504 35 200817437 •有如SEQ ID NO : 2及6之Vh序列及VL序列），或單株抗體 1C6(分別具有如SEQ ID N0 ·· 3及7之Vh序列及Vl序列），或單株抗體2A5(分別具有如SEQ ID N0 : 4及8之Vh序列及VL序列）。此種交又競爭抗體可基於於標準sdf-1結合分析中與1D3、1H2、1C6或2A5交叉競爭之能力來識別。例如拜可分析、ELISA分析或流量細胞儀可用來驗證與本發明之抗體之交叉競爭。試驗抗體抑制例如丨D3、丨、1C6 或2A5結合至人類SDF-1之能力，驗證該試驗抗體可與 1D3、1H2、1C6或2A5競爭結合至人類SDF-1，並可結合至與1D3、1H2、1C6或2A5相同之人類SDF-1上之抗原決定部位。於較佳實施例中，結合至與1D3、1H2、1C6或2A5 之相同人類SDF-1抗原決定部位之抗體為人類單株抗體。此種人類單株抗體可如實例所述而製備及分離。麗過加工及絛改之杭體本發明之抗體進一步可使用具有此處揭示之一種或多種Vh及/或VL序列之抗體製備，本發明抗體可用作為加工修改之抗體之起始原料，修改之抗體與起始抗體比較，具有經過變更之性質。經由修改於一個或兩個可變區（亦即 Vh及/或Vl)内部，例如於一個或多個CDR區内部及/或於一個或夕個架構區内部之一個或多個胺基酸，可對抗體進行加工。額外或替代的，經由修改恆定區内部之殘基例如變更抗體之效應功能（effector functi〇n)，可對抗體進行加工。於右干貫施例中，CDR移殖（grafting)可用來加工抗 319504 36 200817437 *體之可變區。抗體與目標抗原之交互作用主要係透過位在 6個重鏈及輕鏈互補決定區（CDR)中之胺基酸殘基。因此，於CDR内部之胺基酸序列於個別抗體間比CDR之外之序列更多樣化。由於CDR序列負責大部分抗體-抗原交互作用，經由構築表現載體可表現模擬特定天然抗體性質之重組抗體，該表現載體包括將特定天然抗體之序列移殖於具有不同性質之不同抗體之架構序列上（例如參考

Riechmann, L. etal. (1 998) iVature 332： 323-327； Jones, P. etal. (1 986) Nature S21 ： 522-525 ； Queen, C. et al. (1 989) Proc. Natl. Acad. See. U. S. A. 86 ： 10029-1 0033 ；美國專利5, 225, 539核發給Winter，及美國專利 5, 530, 101 ’· 5, 585, 089 ; 5, 693, 762 及 6, 180, 370 核發給

Queen et al. ) 〇據此’本發明之另一實施例係有關一種分離之單株抗體或其抗原結合部，包含重鏈可變區，其包含C])ri、CDR2 及CDR3序列，該等序列分別包含選自於由SEQ ID N〇 : 9、 H)、11&12、SEQIDN0:13、14、15&16、&SEQIDN0: 17、18、19及20所組成之組群之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含CDR1、CDR2及CDR3序列，該等序列分別包 § 遥自於由 SEQ ID NO : 21、22、23 及 24、SEQ ID NO : 25、26、27 及 28、及 SEQ ID NO ·· 29、30、31 及 32 所組成之組群之胺基酸序列。如此，該等抗體含有單株抗體 1D3、1H2、1C6或2A5之VH及VL CDR序列，又可含有與此等抗體不同之架構序列。 319504 37 200817437 此等架構序列可得自公共DNA基因庫或公開的參考文獻，其包括種系抗體基因序列。舉例言之，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DMA序列可得自「VBase」人類種系序列基因庫（可得自網際網路www· mrc-cpe· cam. ac. uk/ vbase)，以及可參考 Kabat，Ε·Α· etah (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fi f th Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 ; Tomlinson，I· M.，et al· (1992) f, The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops1 丨 J. Mol· Biol. 227 : 776-798 ； and Cox, J. P. L. et al. (1994) f, A Directory of Human Germ-1ine Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage1’ 仙r. /· 24 · 827-836 ;各參考文獻内容係以引用方式併入此處。至於另一實例，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可參考基因庫資料庫。舉例言之，出現於HCo7 HuMAb小鼠之下列重鏈種系序列可以下列基因庫寄存號碼取得：1-69(NG_001 0109、 NT—024637 及 BC070333)、3-33(NG—0010109 及 NT—024637) 及 3-7(NG—001 01 09 及 NT—024637)。舉另一實例，於 HCol2 HuMAb小鼠之重鏈種系序列可以下列基因庫寄存號碼取得：卜69(NG—0010109 、 NT—024637 及 BC070333) 、 5-51 (NG—0010109 及 NT—024637) 、 4-34(NG—0010109 及 NT—024637) 、 3-30. 3(CAJ556644)及 3-23(AJ406678)。 38 319504 200817437 • <用本技術領域眾所周知之稱作為加間隙：B L a S τ之序列相似度搜尋法中之一者將抗體蛋白質序列與棄編之蛋白質序列資料庫進行比對（Altschui心；.，（1997)—

Acids Research 25 ： 3389-3402) 〇 BLAST 則^寸破在於抗體序列與資料庫序列間統計上顯著的比對 :能^有比對字之高分節段對（HSp)。其分數無法藉延長或藉裁j來改善之節段對稱為命中（hH)。簡言之，來源之核普酸序列（http : //vbase. mix_cpe. eam.扣.— 咖^⑴⑽為）經轉譯，保有FR1至FR3間（含）架構區之區。基因庫序列之平均長度為98殘基。確切匹配蛋白質全長之重複序列被去除。BLAST搜尋蛋白質，使用程式 blastp具有内設標準參數，但低複雜度篩選器除外，該篩，器被關閉，以及BL0SUM62之取代矩陣除外，BUST篩選最而5次命中而獲得序列匹配。核苷酸序列轉譯入全部6 個框架（frame)’於資料庫序列之匹配節段中不含停止密碼子之框架被視為可能命中。如此又使用BLAST程式tblastX 證貫，其轉譯全部6框架中的抗體序列，並將該等轉譯與於全部6框架中動態轉譯之VBASE核苷酸序列做比較。相同性為抗體序列與蛋白質資料庫間確切胺基酸為序列王長匹配。正值（相同性+取代匹配）並非相同，而是由 BL0SUM62取代矩陣所導引之胺基酸取代。若抗體序列以相同的相同性匹配資料庫序列之二序列，則以具有最高正值之命中決定為匹配序列命中。用於本發明抗體之較佳架構序列為由本發明之選定之 319504 39 200817437 .抗體所❹之架構相，例如類似本發明較佳單株抗體所使用之VH卜24架構序列⑽ID N〇: 41)及/或Vh 3_7架構序列（SEQ ID恥：42)及/或Vk U8架構序列（SEQ ID N〇 : 43) ° VH CDR1、CDR2 及 CDR3 序列及 VK CDR卜 CDR2 及 CDR3 序列可移殖於具有與架構序列所衍生之種系免疫球蛋白基口所見相同序列之架構區，或該等⑽序列可移殖於與種系：列：較含有一個或多個突變之架構區上。例如，發現 =若干情況下，將架構區内部之殘基突變可有益於維持或提升抗體之抗原結合能力（例如參考美國專利案 5, 53〇, 101 ; 5, 585, 089 ; 5, 693, 762 及 M 80, 370 核發給

Queen et al. ) 〇另一型可變區修改係將^及/或Vk CDRi、CDR2及/或 CDR3區内部之胺基酸殘基突變，藉此改良感興趣之抗體之一種或多種結合性質（例如親和力）。可進行定點突變或 PCR媒介突變，來導入突變，對抗體結合或其它感興趣之功能性質的影響，可以如此處所述或於實施例提供之體外或體内分析評估。較佳為導入保留性修改（如前文討論）。該突變可為胺基酸取代、加成或刪失，但較佳為取代。此外’典型改變不多於一個、兩個、三個、四個或五個CDR 區内部之殘基。據此，於另一實施例中，本揭示提供分離之抗SDF-1 早株抗體或其抗原結合部’包含一重鍵可變區包含：（&)Vh CDR1區，包含選自於由SEQ ID NO : 9、10、11及12所組成之組群之胺基酸序列，或與SEq ID NO ·· 9、10、11及 40 319504 200817437 比車乂具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、刪失或加成之胺基酸序列；（b)%CDR2區，包含選自於由SEQ iD NO · 13、14、15及1 6所組成之組群之胺基酸序列，或與 SEQ ID N0 : 13、14、15及 16 比較，具有一、二、三/四或五個胺基酸取代、刪失或加成之胺基酸序列，·（c)Vh CDR3 區，，包含選自於由SEQIDN0:17、18、19及20所組成之組群之胺基酸序列，或與SEQ ID N0 : 17、18、19及20 比較’具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、刪失或加成之胺基酸序列；（d)VK CDR1區，包含選自於由SEQ ID N0 : 21、22、23及24所組成之組群之胺基酸序列，或與SEQ ID 21、22、23及24比較，具有―、二、三、四或五個胺基I取代、刪失或加成之胺基酸序列；（e)VK CDR2區，包^選自於由卿1請：25、26、27及28所組成之組群之胺基酸序列，或與卿Π) NQ: 25、26、27及28比較，具有一、_ 、_ 、 —、二、四或五個胺基酸取代、刪失或加成之胺基§夂序列，及（f)Vk CDR3區，包含選自於由SEQ ID N0 :

29 30、31及32所組成之組群之胺基酸序列，或與SEq ID 29 30、31及32比較，具有一、二、三、四或五個胺基駄取代、刪失或加成之胺基酸序列。立，發明之經加工之抗體包括其中已經對Vh及/或Vk内 ^采構蜮基作修改之該等抗體，例如來改良抗體之性、/、i地進行此等架構修改係為了降低抗體之免疫原、例如種辦法係將一個或多個架構殘基「反向突變」成相對應之種系序列。特別，已經進行體細胞突變之抗體 41 319504 200817437 •可含有與該抗體衍生自其中之該種系、序列不同之某些架構殘基。此等殘基可經由比較抗體架構序列與抗體由其中所衍生之種系序列而識別。至於又另一貫例，對2A5，VH之胺基酸殘基#1(FR1内部）為賴胺酸⑽ID NQ:4)，而於相對應之Vh 3_7種系序列中之此一殘基為麵胺酸（SEQ IDN〇: 42)。為了將架構區序列返回其種系組態，例如2A5之VfiiFR1内部之殘可由麵醯胺酸「反向突變」成麩胺酸。此種「反向突變」的抗體亦涵蓋於本發明之範圍。、至於又另一實例，對2A5，νΗ之胺基酸殘基#6(FR1内部）為麵醯胺酸（SEQ ID N〇 : 4)，而於相對應之％ 3 — 7種系序列中之此一殘基為麩胺酸（SEQ IDN〇 : 42)。為了將架構區序列返回其種系組態，例如2A5之yH之fri内部之殘基#6可由麵醯胺酸「反向突變」成麵胺酸。此種「反向突、交」的抗體亦涵蓋於本發明之範圍。例如’下表1顯示與重鏈親代種系序列不同之抗Sdf — j 抗體1D3、1H2、1C6及2A5之架構區之胺基酸變化數目。為了將架構區中之一個或多個胺基酸殘基返回其種系組悲’可經由例如定點突變或PCR媒介突變將體細胞突變「反向突變」回種系序列。舉另一個實例，下表2顯示與輕鏈親代種系序列不同之抗SDF —1抗體1D3、1H2、1C6及2A5之架構區之胺基酸曼化數目。為了將架構區中之一個或多個胺基酸殘基返回其種系組態，可經由例如定點突變或PCR媒介突變將體細 42 319504 200817437 . 胞突變「反向突變」回種系序列。 1D3 及 1H2 之 VH 區對親代種系 vH 1 一24(SEQ ID N0 : 41) 序列之校準顯示於第6圖。1C6及2A5之Vh區對親代種系

Vh 3_7(SEQ ID N0· 42)序列之校準顯示於第7圖。1D3及 1H2之Vk區對親代種系vK L18 (SEQ ID N0 : 43)序列之校準顯示於第7圖。1C6及2A5之VK區對親代種系VkU8 (Seq ID NO : 43)序列之校準顯示於第8圖。表1.對得自重鏈種系組態之抗體1D3、1H2、1C6及2A5之修改抗 SDF-1 ’胺基酸抗體位置 1D3 1 84 1H2 29 117 1C6 9 2A5 1 6 抗體之原先種系胺基酸之胺基 E Q T S F L Μ Τ R G Q Ε Q Ε 319504 43 200817437 •表2.對得自輕鏈種系組態之抗體1D3、1H2、1C6及2A5之修改胺基酸抗體之原先種系組態位置胺基酸之胺基酸 1 E A 3 v Q I E A 3 V Q 3 R Q 4 Μ τ II V t 39 Τ K 1 D A 4 Μ τ 5 I τ 抗 SDF-1 抗體 1D3 1Η2 1C6 2Α5 另一型架構修改涉及突變架構區内部、或甚至一個或多個CRD區内部之一個或多個殘基，以去除τ細胞抗原決定部位，藉此降低抗體可能之免疫原性。此種辦法也稱作為「脫免疫化」，細節說明於美國專利公開案 20030153043，申請人 Carr ei a7.。除了於架構區或CDR區内部之修改，額外或替代的，本發明之抗體可經加玉來包括於Fe區内部之修改，典型係變更抗體之一種或多種功能性質，諸如血清半生期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒殺性。/此外，本發明之抗體可經化學改性（例如一個或多個化學部分可附接至抗體或本發明之抗體可經改性來變更其糖化，再 319504 44 200817437

. 度變更抗體之一種戎吝錄：^台匕从斯 lL 裡^夕種功此性負。此等實施例各自說明

其進一步細節如下。於F F 於tc £之殘基之編號為Kabat EU指標之殘基之編號。於一實施例中，CH1之樞紐區經修改，故植紐區之半耽胺酸殘基數目改變，例如增或減。此種辦法進一步說明於Bodmer ^ 之美國專利第5,677,425號。於⑶丨樞紐區之半胱胺酸數目經改變以，例如，辅助輕鍵及重鍵的組裝，及/或增減抗體之安定性。於另一貫施例中，抗體之F c樞紐區經突變來縮短抗體之生物半生期。特別是，將一項或多項胺基酸突變導入FC 枢紐片段之CH2-CH3功能部位介面$，故該抗體具有相對於天然Fc-樞紐功能部位而言，受損之葡萄球菌蛋白質a (SpA)結合。此種辦法之進一步細節說明於Ward &石厶之美國專利第6, 165, 745號。於另一實施例中，抗體經修改來延長其生物半生期。多種辦法皆屬可能，例如可導入下列突變中之一者或多者· T252L、T254S、T256F，說明於Ward之美國專利第 6, 277, 375號。另外，為了延長生物半生期，抗體可於cH1 區或Cl區改變，含有取自IgG之以區CH2功能部位之兩個回路之救援受體結合抗原決定部位，說明於Pada W·之美國專利第5, 869, 046及6, 121，022號。於又另一實施例中，Fc區係經由以不同的胺基酸殘基來置換至少一個胺基酸殘基而改變，來變更抗體之效應功能。例如，選自於胺基酸殘基234、235、236、237、297、 319504 45 200817437 318、320及322之一個或多個胺基酸可以以不同胺基酸殘基置換，讓抗體對效應配體的親和力改變，但仍然保有親代抗體之抗原結合能力。親和力已經變更的效應配體可為，例如F c受體或補體之C1成分。此種辦法之進一步細節係說明於美國專利案5, 624, 821及5, 648, 260，申請人皆為 Winter et al.。於另一實例中，選自於胺基酸殘基329、331及322 之一個或多個胺基酸可以不同的胺基酸殘基置換，故抗體具有變更的Clq結合及/或減低的或消除的補體依賴性細胞毒殺性（CDC)。此種辦法之進一步細節係說明於 Idusogie et ah之美國專利案第6, 1 94, 551號。於另一個實例中，變更胺基酸位置231及239内部之一個或多個胺基酸殘基，藉此變更抗體固定補體的能力。此項辦法進一步說明於Bodmer ei: ai.之PCT公開案W0 94/2935卜於又另一實例中，Fc區經修改來經由修改於下列位置之一個或多個胺基酸，而提高抗體媒介抗體依賴性細胞毒殺性（ADCC)之能力及/或增加抗體對Fct受體之親和力： 238 、 239 、 248 、 249 、 252 、 254 、 255 、 256 、 258 、 265 、 267 、 268 、 269 、 270 、 272 、 276 、 278 、 280 、 283 、 285 、 286 、 289 、 290 、 292 、 293 、 294 、 295 、 296 、 298 、 3(Π 、 303 、 305 、 307 、 309 、 312 、 315 、 320 、 322 、 324 、 326 、 327 、 329 、 330 、 33卜 333 、 334 、 335 、 337 、 338 、 340 、 360 、 373 、 376 、 378 、 382 、 388 、 389 、 398 、 414 、 416 、 46 319504 200817437 419、430、434、435、437、438 或 439。此項辦法進一 + 說明於Presta之PCT公開案W0 00/42072。此外，人類Ig(n 上對FcrR卜Fcr RII、Fcr RIII及FcRn之結合部位已經拼出圖譜，具有改良結合能力之變異株亦已被描述（參考 Shields, R.L. et al. (2001 ) J. Biol. Chem. 276： 6591-6604)。於位置 256、290、298、333、334 及 339 之特定突變顯示可改良對Fcr RI Π之結合。據此，下列組合突變株顯示可改良FcyRIII結合：T256A/S298A、S298A/ E333A 、 S298A/K224A 及 S298A/E333A/K334A 。於又另一實施例中，抗體之糖化經修改。例如可做出非糖化抗體（亦即抗體缺糖化）。糖化可經變更，例如，來增加抗體對抗原之親和力。此等碳水化合物修改可由，例如變更抗體序列中之一個或多個糖化位置來達成。舉例言之，可進行一個或多個胺基酸取代，導致一個或多個可變區架構糖化位置的消失，藉此消除於該位置的糖化。此種無糖化作料提高抗體對抗狀親和力。此項辦法之進一步細節說明於Co 之美國專利案5, 714, 350及 6, 350, 861。二頜外，替代的，可製作具有變更之糖化類型之抗體，諸如有減里的石澡糖基之低岩藻糖化抗體或有較高二分 G1 cNac 結構之抗體。此 ^ ^ ^ ^ 凡裡又更之糖化樣式已經驗證可提高抗體之ADCC能力0 去山，回變更之糖化機轉之户七，二」精於有糖化機轉之細胞已鈾文之破该本技術領域所描述，且可用作為苴 319504 47 200817437

_中表現本發明之重組抗體之宿主細胞，藉此製造有變更糖化之抗體。例如細胞株Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基轉移酶基因FUT8(a (1，6)岩藻糖基轉移酶），故於 Ms704、Ms705及Ms709細胞株所表現之抗體於其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705及Ms709 FUT8*細胞株係經由使用兩個置換載體於CH0/DG44細胞中藉靶定摧毀 FUT8基因來形成（參考Yamane ei ai.之美國專利公開案第 200401 10704 號及 Yamane-Ohnuki ei ai. (2004) Biotechnol Bioeng 87 : 614-22)。至於另一個實例 ’ Hanai et ah之EP 1，176, 195說明有功能摧毀FUT8基因之細胞株，其編碼岩条糖轉移酶，故於此種細胞株所表現之抗體經由減少或去除α 1，6鍵結相關酶而呈現低岩藻糖化。 Hana i e ί a 7.也描述細胞株，該等細胞株對添加岩藻糖至結合至抗體Fc區的N-乙醯基葡萄糖胺具有低酶活性，或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0(ATCCCRL 1662)。Presta之PCT公開案W0 03/035835說明對附接岩藻糖至與Asn(297)-鍵聯之碳水化合物之能力降低之變異株C Η 0細胞株’ L e c 13細胞’也造成該宿主細胞内表現低岩藻糖化之抗體（也參考Shields, R.L· etaL (2002) J· Biol· Chem· 277 : 26733-26740) 。 Umana ei ai.之 PCT 公開案WO 99/54342描述細胞株經加工來表現糖蛋白改性之糖基轉移酶（例如/S(l，4)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III (GnTIII))，故於加工的細胞株中表現之抗體具有較高二分GlcNac結構，結果導致抗體之ADCC活性增高（也 48 319504 200817437 •參考 Umana ei W· (1 999) Nat· Biotech· Π : 1 76-180)。另外’抗體之岩藻糖殘基可使用岩藻糖苷酶去除，例如岩藻糖苷酶亦即α-L-岩藻糖苷酶係自抗體去除岩藻糖殘基 (Tarentino，A.L· eiai· (1975) Biochem· 14: 5516-23)。本發明於此處涵蓋另一種抗體之修改為pEG化。抗體可經PEG化來，例如延長抗體之生物（例如血清）半生期。為了將抗體PEG化，該抗體或其片段典型係與聚乙二醇 (PEG)，諸如PEG之反應性酯衍生物或反應性醛衍生物，於其中一個或多個PEG基變成附接至該抗體或抗體片段之條件下反應。較佳為PEG化係透過與反應性peg分子（或類似之反應性水溶性聚合物）作用之醯化反應或烷化反應來進行。如此處使用，「聚乙二醇」一詞意圖涵蓋已經用來衍生其它蛋白質之任一種PEG形式，諸如單（ci-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇—順丁烯二醯亞胺。於若干實施例中，欲PEG化之抗體為非糖化抗體。蛋白質之 PEG化方法為本技術領域所已知，且可應用於本發明之抗體。例如參考 Nishimura eiaL 之 EP 0 154 316 及 Ishikawa ei aJ·之 EP 〇 401 384。抗體物理神暂本發明之抗體可進一步藉抗SDF-1抗體之多種物理性質來特徵化，可基於此等物理性質使用不同分析來檢測及/ 或區別不同類別的抗體。於若干實施例中，本發明抗體於輕鏈或重鏈可變區含有一個或多個糖化位置。於可變區存在有一個或多個糖化 319504 49 200817437 - 位置，可能導致抗體之免疫原性增高，或因抗原結合性變更導致抗體之 ρΚ 改變（Marshall et aJ. ( 1 972) Annu Rev Biochem 41 · 673-702 ； Gala Fa and Morrison SL (2004) J Immunol 172 ： 5489-94 ； Wallick et al. (1 988) J Exp Med 168 · 1099-109 > Spiro RG(2002) Glycobiology 12 · 43R-56R； Parekh et al. (1 985) Nature 316： 452-7； Miraura ei sJ· (2000) Mol Iminunol 37 · 697-706)。已知糖化係出現於含N-X-S/T序列之部分。可變區之糖化可使用糖墨點（Glycoblot)檢定分析試驗，其可裂解抗體來製造Fab，然後使用測量過蛾酸鹽氧化及席夫驗形成之檢定分析來進行糖化試驗。另外，可變區糖化可使用待歐尼士（Di〇nex) 光層析術（待歐尼士-LC)試驗，待歐尼士-LC由Fab裂解醣類成為早釀’並分析個別釀類含量。於若干情況下，較佳抗SDF -1抗體不含可變區糖化。此項目的可經由選擇可變區不含糖化部分之抗體而達成，或經由使用本技術領域眾所周知之標準技術，突變糖化部分内部殘基而達成。於較佳實施例中，本發明之抗體不含天門冬醯胺異構位置。去S&胺化或異天門冬胺酸效應可能分別出現於n 一〇序列或D-G序列。去醯胺化或異天門冬胺酸效應導致形成異天門冬胺酸，異天門冬胺酸經由形成偏離支鏈羧基端之紐結結構，而非主鏈，降低抗體之安定性。異天門冬胺酸之形成也可使用異量化（i so-quant)分析來測定，該分析係使用反相HPLC來試驗異天門冬胺酸。各個抗體有獨特等電點（pl)，但通常抗體係落入6至 319504 50 200817437 .9. 5之pH範圍。IgGl抗體之pi典型係落入7至9· 5之pH 範圍，IgG4之pi典型係落入6至8之pH範圍。抗體可具有超出此範圍以外之pi。雖然影響通常為未知，但推測具有超出正常範圍以外pi之抗體於活體内條件下可能有若干未摺疊性及不安定性。等電點可使用毛細等電聚焦檢定分析來試驗，該檢定分析形成pH梯度，且可利用雷射聚焦來提高準確度（Janini ei ah (2002)五 23 · 1605-11 ^ Ma et al. (2001) Chromatographia 53 ： S75-89 ; Hunt ei ah (1998) J Chromatogr A 800 : 355-67)。於若干情況下，較佳抗SDF-1抗體含有落入正常範圍之pi值。此項目的可經由選擇具有pi於正常範圍之抗體來達成，或經由使用本技術領域眾所周知之技術突變帶電表面殘基來達成。各抗體具有指示熱安定性之溶點（Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3 · 361-71)。熱安定性愈高，暗示於活體内整體抗體安定性愈高。抗體熔點可使用諸如差動掃描量熱儀等技術測量（Chen et aL (2003) Pharm Res 20 ： 195260 ； Ghirlando et al. (1 999) Immunol Lett 68 : 47-52)。Tmi 指示抗體初始未摺疊之溫度。TM2指示抗體之完全未摺疊之溫度。通常本發明之抗體之TM1係大於60°C為佳，較佳大於65°C，更佳大於 70°C。另外，抗體之熱安定性可使用圓二向色性測定 (Murray ei aL (2002) J· Chr⑽atogr Sci 40 : 343-9)。於較佳實施例中，係選擇不會快速分解的抗體。如本 51 319504 200817437 技術領域♦所周知，抗SDF-1抗體之分段可使用毛細電泳 (CE)及 MALDI-MS 測定（Alexander AJ and Hughes DE( 1 995) Anal Chem 67 : 3626-32)。於另一較佳實施例中，係選擇具有最低凝集效應的抗體。’旋集可能導致觸發非期望之免疫反應及/或變更的或不利的藥物動力學性質。通常抗體具有25%或更少的凝集為可接受，較佳為20%或更少，又更佳為15%或更少，又更佳 ^ 10%或更少，又更佳為5%或更少。凝集可藉本技術領域眾所周知之右干技術測定，包括尺寸排除管柱（SEC)高效液相層析術（HPLC)，及光繞射來識別單體、二元體、三元體或多元體。起^之加工方沐如前文討論，此處揭示之具有M D列之抗H :體’可經由修改Vh及/或Vk序列’或附接其上之悝定區 :以：新的抗SDH抗體。如此，於本發明之另一態樣 U抗SDF-1抗體之結構特徵，例如⑽、iH2、似，2A5用來形成結構相關之抗抗體，保有至少 ΓβΓΙΓ體之功能性質，諸如結合至人類例如，已知加構^⑽或2Α5之一個或多個C⑽區或其突變可盘請重組組合，來形成本發明額外的抗趙’如前文討論。其它類型之修口又巴栝刖即討論之修改。加序列及βνκ序列中之—者或多^之^為此處提供之^ 區。為了形成加工之抗體，一個或多個咖而只際上製備（亦即表現呈蛋 319504 200817437 白質）有一個或多個此處提供之Vh序列及/或Vk序列之抗體、或其一個或多個CDR區。反而，序列所含資訊可作為原料用以形成衍生自原先序列之「第二代」序列，然後，「第二代」序列經製備且表現為蛋白質。據此，於另一實施例中，本發明提供一種製備抗SDn 抗體之方法，包含： (a) 提供：（i)重鏈可變區抗體序列，包含選自於由SEQ ID NO · 9、10、11及12所組成之組群之CDR1序列、選自於由SEQIDN0: 13、14、15及16所組成之CDR2序列及/ 或選自於由SEQ ID N0 : 17、18、19及20所組成之組群之 CDR3序列；及/或（π)輕鏈可變區抗體序列，包含選自於由SEQ ID N0 · 21、22、23及24所組成之組群之CDR1序列、選自於由SEQ ID NO : 25、26、27及28所組成之CDR2 序列及/或選自於由SEQ ID N0: 29、3〇、31及32所組成之組群之CDR3序列； (b) 變更於該重鏈可變區抗體序列及/或該輕鏈可變區抗體序列中之至少一個胺基酸殘基，來形成至少一種變更的抗體序列；及 (C)表現該變更的抗體序列為蛋白質。標準分子生物技術可用來製備及表現變更的抗體序列。由交更的抗體序列所編碼之抗體較佳為保有如此處所述，抗SDF-1抗體之功能性質中之一者、數者或全部性質之抗體，該等功能性質包括但非限於： 319504 53 200817437 (&)以1χ10_7Μ或更少之Kd結合至人類SDF4 ; (b) 藉免疫沈澱分析而結合至天然人類sdf」； (c) 阻斷SDF-丨結合至CEM細胞； (d) 阻斷CEM細胞内SDF-1誘導之鈣流； (e) 阻斷SDF-1誘導之CEM細胞遷移；或 (〇阻斷HuVEC細胞中之微血管形成。义更之抗體之功能性質可使用本技術領域可得及/或此處所述之標準分析評估，諸如實例所述（例如流動細胞儀、結合分析）。於本發明抗體之加工方法之若干實施例中，突變可連同王口卩或口[5刀抗SDF-1抗體編碼序列而隨機導入或選擇性導入，所得經修改之抗SDF — 丨抗體可依如此處所述之結合活性及/或其它功能性質進行篩檢。本技術領域已經說明突變方法，例如Short之PCT公告案W0 02/092780敘述使用飽和大、夂發生、合成接合組裝或其綜合辦法來形成與篩檢抗體大變之方法。另外，Lazar e亡之pCT公告案肋 03/074679說明使用電腦篩檢方法來最佳化抗體之物理化學性質之方法。龜碼本發明之抗體之核醅公子本發明之一悲樣係有關編碼本發明之抗體之核酸分子。核酸可存在於全細胞、存在於細胞溶解產物，或呈部分純化形式或呈實質純化形式存在。當核酸藉標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl頻帶化、管柱層析法、瓊脂凝膠電泳及其匕本技術領域眾所周知之技術，而由其它細胞成分或 319504 54 200817437 其它污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質純化時’核酸變成「分離的」或「變成實質純質」。參考F. Ausubel et aL 編輯（1987)分子生物學之目前方案（Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版公司及威利科技公司，紐約。本發明之核酸例如可為DNA或RNA，且可含有或不含有内含子的序列（intronic sequence)。於較佳實施例中，核酸為cDNA分子。本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由融合瘤（例如由攜帶人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠所製備之融合瘤，容後詳述）所表現之抗體，由融合瘤所製造之抗體之輕鏈及重鏈之編碼cDNA可藉標準PCR放大技術或cDNA棒殖技術獲得。對於得自免疫球蛋白基因庫之抗體（例如使用嗤菌體表現技術獲得），可由該基因庫重獲該抗體之編碼核酸。本發明之較佳核酸分子為1D3、1H2、1C6或2A5單株抗體之Vh序列及Vl序列之編碼核酸分子。id3、1H2、1C6 及2A5之Vh序列之編碼DNA序列分別顯示於SEQ ID N0 : 33、34、35 及 36。1D3、1H2、1C6 及 2A5 之 VL 序列之編碼 DNA序列分別顯示於SEQ ID N0 ·· 37、38、39及40。其它較佳本發明之核酸為具有與SEQ ID N0 : 33、34、 35、36、37、38、39或40所示序列之一，至少80%序列相同度，諸如至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之核酸，該等核酸編竭本發明之抗體或其抗原結合部。 319504 55 200817437 . 兩種核酸序列間之相同度百分比為於該序列中核普酸為相同之位置數目，考慮間隙數目及各間隙長度入間隙來獲得二序列之最佳比對。二序列間之序列比較= 目同度百分比之判定可使用數學演绎法則諸如㈣奶及 MlUer演繹法則或前述Altschul之xblast程式達成。又復，本發明之較佳核酸包含SEQ ID N0 : 33、34、 36 37、38、39及40所示核酸序列之一個或多個⑽ 編碼部。於本實施例中，核酸可編碼1D3、1H2、1C6或2A5 之重鏈伽、⑽2及/或CDR3序列或1D3、1H2、1C6或 2A5之輕鏈CDR1、CDR2及/或CDR3序列。具有與 SEQ ID N0 : 33、34、35、36、37、38、39 或 W之此種CDR編碼部，至少8〇%，諸如至少85%，至少9⑽，至^5%’至少98%或至少序列相同度之核酸亦屬本發明之較佳核酸。此等核酸與於非CDR編碼區及/或於⑽ 編碼區中之 SEQ ID nm、37、38'、395t 40之相對應部分不同。當差異係於CDR編碼區時，與1⑽、肥、1C6或2A5之相對應CDR序列比較，該核酸咖區係由典型的包含一個或多個如此處定義之保留性序列修改的核酸所編碼。乂一旦獲得編碼Vh序列及W序列之DNA片段，此等DM 片奴可進一步藉標準重組DNA技術操控，例如將可變區基因轉成全長抗體鏈基因、轉成Fab片段基因或轉成％μ 基因。於此等操作中，Vl編碼或Vh編碼DNA片段係操作式聯結至編碼另一蛋白質之另〆DNA片段，該另—蛋^質^ 319504 56 200817437 ‘如為抗體怪定區或可撓性鍵聯基。於本上下文中使用「操作式聯結」一詞意圖表示兩個DNA片段經接合讓該二DNA 片段所編碼之胺基酸序列維持於讀框内（in_frame)。編碼Vh區之分離之DNA可經由將Vh編碼DNA操作式聯結至編碼重鏈恆定區（CH1、CH2及CH3)之另一個DNA分子，來轉成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因序列為本技術領域已知（例如參考 Kabat，Ε Α· eid· (1991) Sequences

of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH

Publication No· 91 -3242)，涵蓋此等區域之DM片段可藉標準PCR放大作用而獲得。重鏈恆定區可為IgG1、Ig(J2、 IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM 或 IgD 恆定區，但最佳為 igGi 或IgG4恆定區。對Fab片段重鏈基因而言，Vh編碼DNA 可操作式聯結至只編碼重鏈CH1恆定區之另一個DNA分子。經由操作式聯結Vl編碼DNA至編碼輕鏈怪定區，cl，之另一個DNA分子，編碼vL區之分離之DNA可轉成全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人類輕鏈恆定區基因之序列為本技術領域已知（例如參考Kabat，EA. (1991)

Sequences of Proteins of Immunological Interest,

Fifth Edition, U，S· Department of Health and Human Services，NIH Publication No· 91 -3242)，涵蓋此等區域之DNA片段可藉標準PCR放大作用而獲得。於較佳實施例中，輕鏈恆定區可為kappa或1 ambda恆定區。為了形成scFv基因，vH及vL編碼DNA片段係操作式 319504 57 200817437 聯結至編碼一可撓性鍵聯基之另一片段，例如編碼胺基酸序列（Gly4 - Ser)3(SEQ ID N0 : 51)之另一片段，讓Vh序列及Vl序列呈連續單鏈蛋白質表現，Vl區及Vfl區係藉可撓性鍵聯基接合（例如參考Bird ei ah (1 988) Science 242 : 242-423-426 ； Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85： 5879-5883； McCafferty et a7. (19Q0) Nature 348 ·· 552-554)。屋株抗體之f j告本發明之單株抗體（mAb)可藉多種技術製造，包括習知單株抗體方法，例如 Kohler and Milstein(1 975) YaiL/re 256 : 495之標準體細胞雜交技術製造。雖然以體細胞雜交程序為較佳，但原則上可採用其它技術來製造單株抗體，例如採用B淋巴細胞之病毒轉形或致癌基因轉形。較佳製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。於小鼠製造融合瘤係為完整建構的流程。分離用於融合之免疫化脾細胞之免疫化方法及技術為本技術領域所已知。融合伴侣 (fusion partner)(例如鼠骨髓瘤細胞）及融合程序亦屬已知0 本發明之肷合抗體或人類化抗體可基於如前述製備之非人類單株抗體序列來製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可知自感興趣之非人類融合瘤，且使用標準分子生物技術’亚加工來獲得非鼠類（例如人類）免疫球蛋白序歹J舉例口之’為了形成喪合抗體，鼠類可變區可使用本技術領域已知方法鍵聯至人類恆定區(例如參考⑽… 319504 58 200817437 .心之美國專利4,816,567)。為了形成人類化抗體，鼠類CDR區可使用本技術領域已知方法，***人類架構内部 (例如夢考Winter之美國專利5,225,539及Queen et -之美國專利 5,530，1〇1 ; 5,585,089 ; 5,693,762 及 · • 6, 180, 370)。 ’ 於較佳實施例中，本發明之抗體為人類單株抗體。此種針對SDF-1之人類單株抗體可使用载有部分人類免疫系統而非鼠類免疫系統之基因轉殖小鼠或染色體轉殖小鼠來產生。此等基因轉殖小鼠及染色體轉殖小鼠包括，於此處稱作 HuMAb 小鼠（HuMAb Mouse®)及 KM 小鼠（KM Mouse®)，於此處合稱為「人類Ig小鼠」。

HuMAb小鼠（米達瑞斯公司（Medarex®，Inc·))含有人類免疫球蛋白基因迷你位置（mini l〇ci)，編碼未經重排之人類重鏈（//及T )及κ輕鏈免疫球蛋白序列，連同鈍化内生性//鏈位置及κ鏈位置之靶定突變（例如參考L〇nberg ei ai· (1994) iVatL/re 368 (6474) : 856-859)。如此，小鼠具有小鼠I gM或κ之表現降低，回應於免疫接種，所導入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因進行類別轉換（Class switching)與體細胞突變，來產生高度親和力之人類igGK 單株抗體（Lonberg，Ν· ai· (1994)參見上文；綜論參

考 Lonberg，fL (19H) Handbook of ExperjimentaJ

Pharmacology IIS ： 49-101 ； Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern· Rev. Immunol. 1 3 : 65-93，及 Harding， F· and Lonberg，Ν· (1 995) Ann· Ν·Υ· Acad· Sci. 764: 59 319504 200817437 .536-546)。HuMAb小鼠之製備及使用，及由此等小鼠所攜帶之基因體修改係進一步說明於Taylor，L. etai. ( 1 992) Nucleic Acids Research 2Q ·· 6287-6295 ； Chen, J. et al. ' ( 1 993) International Immunology 5 ·· 647656 ; Tuai 1 Ion 'et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90· 3720-3724 ； Choi et al. (1993) Nature Genetics 4 · 117-123 ； Chen, J. et al. ( 1993) EMBO J. 12 ： 821-830 ； Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152 · 2912-2920 ； Taylor, L. et al. (1 994) International Immunology Q ·· 579-591 ;及 Fishwild，D· ei a7· (1 996) Wait/re 召iotechfloJ 〇灯14: 845-851，各文件内容全文以引用方式併入此處。進一步參考美國專利案5, 545, 806 ; 5, 569, 825 ; 5, 625, 126 ; 5, 633, 425 ; 5, 789, 650 ; 5, 877, 397 ; 5, 661，016 ; 5, 814, 318 ; 5, 874, 299 ;及 5, 770, 429 全部皆核發給 Lonberg 及 Kay ; Surani et ai. 之美國專利 5, 545, 807 ; PCT 公開案 WO 92/03918、W0 93/12227 、 WO 94/25585 、 WO 97/13852 、 WO 98/24884 及 WO 99/45962，全部皆核發給 Lonberg 及 Kay ;及 Korman et aJ·之 PCT 公開案 W001/14424。於另一實施例中，本發明之人類抗體可使用攜帶人類免疫球蛋白序列於轉殖基因上及於轉殖染色體上之小鼠，諸如攜帶人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉殖染色體之小鼠。此種小鼠於此處稱作為「KM小鼠」，進一步細節說明於 Ishida ei ah 之 PCT 公開案 W0 02/43478。 60 319504 200817437 •又復，可表現人類免疫球蛋白基因之另一種基因轉殖動物系統為本技術領域可得，可用來提引出本發明之抗 SDF-1抗體。例如，可使用稱作Xen_〇use之小鼠（阿吉尼斯公司（Abgenix))之另一種基因轉殖系統；此種小鼠係說 •明於例如美國專利案 5, 939, 598，· 6, 075, 181 ; 6, 114, 598，· 6, 150, 584 及 6, 1 62, 963，核發給 Kucherlapati et ai·。此外，表現人類免疫球蛋白基因之另一種染色體轉殖動物系統為本技術領域可得，且可用來提引出本發明之抗 SDF-1抗體。例如可使用稱作「TC小鼠」的攜帶人類重鏈轉殖染色體及人類輕鏈轉殖染色體之小鼠；此等小鼠係說

明於 Tomizukaeia/· (2000)Proc· Natl· Acad· Sci· USA 97 · 722-727。此外’攜帶人類重鏈及輕鏈轉殖染色體之牛已經於本技術領域說明（Kur〇iwa ei 万iotec/3肋20 : 889-894)，且可用來提引出本發明之抗SDF-1抗體。本發明之人類單株抗體也可使用噬菌體表現方法製備’以篩檢人類免疫球蛋白基因庫。此種分離人類抗體之噬菌體表現系統為本技術領域所確立。例如參考·· Ladne：r eiaL 之美國專利 5, 223, 40 9; 5, 403, 484 ;及 5, 571，698; Dower ei aL 之美國專利 5, 427, 908 及 5,580,71 7; McCafferty ei 3厶之美國專利 5, 969, 108 及 6, 1 72, 197 ; 及 Griffiths ei ah 之美國專利 5, 885, 793 ; 6, 521，404 ; 6, 544, 731 ; 6, 555, 313 ; 6, 582, 915 及 6, 593, 081。本發明之人類單株抗體也可使用SCID小鼠製備，其中 61 319504 200817437 已經重新建構人類免疫細胞，故免疫接種時可產生人類抗體反應。此專小鼠係說明於例如W i 1 son et a7·之美國專利 5, 476, 996 及 5, 698, 767。人類I g小鼠之氣疫接種當使用人類Ig小鼠來提引出本發明之人類抗體時，此種小鼠可以經純化或經豐富化之SDF-1抗原及/或重組 SDF-1之製劑、或表現SDF-1之細胞、或SDF—1融合蛋白進行免疫接種，如 Lonberg，N. ai. (6474) ： 856-859 ； Fishwild, D. et al. (1996) Mature 14 : 845-851 ;及 pCT 公開案 w〇 98/24884 及WO 01/14424所述。首次輸注時，小鼠較佳為6至16 週齡。例如SDF-1抗原之純化製劑或重組製劑（5至別微克）可用來腹内免疫接種人類Ig小鼠。產生抗SDF-1之完整人類單株抗體之詳細程序說明於如下實例卜使用各種抗原之累積經驗顯示，當使用抗原於το全弗冷氏（Freund，s)輔劑進行初步腹内（Ip)免疫接種時，接著每隔-週使用抗原於不完全弗冷氏輔劑作P免疫 ^種^計6次），轉殖基因小鼠有反應。但弗冷氏辅劑以一卜之輔劑也有效。此外，於無辅劑存在下，發現全細胞有疫原性。可於免疫接種方案過程監視免疫反應，血係糟反向軌道滲漏獲得。血漿藉eusa篩檢（容後詳 =足夠抗SDF-1人類免疫球蛋白力價之小氣可用於融 a。犧牲且移除脾臟前3曰，小 J、乳以抗原經靜脈追加接種。預^ 了月匕萬要對各免疫接種進從适仃2至3次融合。對各種抗 319504 62 200817437 ，原典型係免疫接種6至24隻小鼠。通常使用hc〇7及HCol 2 種系。此外，HC〇7及HC〇12轉殖基因可共同育種成為有兩種不同人類重鏈轉殖基因之單一小鼠（HC〇7/HC〇12)。替代或額外的，可使用KM小鼠種系，如實例1所述。 ^囷體表現综合庫之產生與篩檢 4几體可變區之初始cDNA庫係使用得自以SDF-1免疫接種之HuMAb小鼠或KM小鼠之脾臟構成。然後將抗體可變區轉殖入噬菌體表現載體。噬菌體選擇係使用全克隆 (Omniclonal®)噬菌體選擇方法（百歐赛公司（Bi〇site)，加州聖地牙哥）進行，使用生物素化SDF-1來篩檢有奈莫耳濃度親和力（nan⑽olar affinity )(KM脾臟）或次奈莫耳濃度親和力（HuMAb脾臟）之可變區片段。感興趣之可變區片段再重殖入（reel one)Fab表現載體，Fab再度測試結合親和力及功能親和力。經過引子編碼之可變區之N端部對各個可、交區反犬k成為種系序列。然後使用標準分子生物技術由高度親和力抗SDF-1 Fab產生全抗體。可產生人類單株抗體之融合痼之哇# 為了產生可製造本發明之人類單株抗體之融合瘤，得自免疫接種小既之脾細胞及/或淋巴節細胞可經分離及融合至適當永生化細胞株，諸如小鼠骨髓瘤細胞株。可篩檢所得融合瘤以製造抗原特異性抗體，例如，得自免疫接種小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液可使用5〇% pEG融合至六分之一數目的P3X63-Ag8· 653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞 (ATCC，CRL 1 580)。另外，得自免疫接種小鼠之脾淋巴細 319504 63 200817437 -胞之單細胞懸洋液可使用細胞脈衝（Cyt〇Pulse)大腔室細胞融合電穿孔器（細胞脈衝科學公司，馬里蘭州葛林伯尼），使用基於電場之電融合法來融合。細胞以約2χ1 〇5平塗於平底微I滴定盤，接著於選擇性培養基培養二週，該培養基含有20%胎純株血清，18%「653」經調理之培養基， 5%原先培養基（IGEN)、4 _ L-麵醯胺酸、1 mM焦丙酮酸鈉、5 mM HEPES、0·〇55祕2-巯基乙醇、50單位/毫升青黴素（Penicillin)、50毫克/毫升鏈黴素 (Strept〇mycin)、50 毫克 / 毫升建它黴素（gentamycin)及 IX HAT(希格瑪公司（Sigma);融合後24小時添加HAT)。約2週後，細胞於培養基培養，培養基中HAT以Ητ置換。然後個別孔藉ELISA篩檢人類單株IgM及IgG抗體。一旦出現全面性融合瘤生長，通常於1〇至14日後觀察培養基。分泌抗體之融合瘤可重新平塗，再度篩檢，若仍然對人類 IgG呈陽性，則該單株抗體可藉限制稀釋次轉殖至少兩次。然後穩定的次轉殖株於試管内培養，來於組織培養基中產生小1抗體接受特徵化測定。欲純化人類單株抗體，選擇的融合瘤可於二升單株抗體純化用之攪拌培養瓶内生長。上清液經過濾及濃縮，隨後使用蛋白貝A-希法羅司（sepharose)(法瑪西亞公司 (Pharmacia)，紐澤西州匹茲卡威）進行親和層析術。洗提出之I gG猎凝膝電泳及高效液相層析檢查來確定純度。缓衝液了交換入PBS，使用丄43消光係數藉〇D28〇測定濃度。單株抗體可整份儲存於-80乞。 319504 64 200817437 -i製造染瘤之產峰本發明之抗體也可使用例如本技術領域眾所周知之重組腿技術與基因轉染方法之組合，而於宿主細胞轉染瘤製造（例如 M〇rrison，s. (1985) &ie/]ce 229: 12〇2)。例如為了表現抗體或其抗體片段，編碼部分或全長_ 鏈及重鏈之舰可藉標準分子生物技術獲得（例X吏料工表現感興趣抗體之融合瘤進行pCR擴增或c繼轉殖），臟 I***表現載體内，讓該等基因係操作式聯結至轉錄控制序列及轉譯控制序列。於本内文中，「操作式聯結」一詞意圖表不抗體基因接合至載體内，故載體内部之轉錄控制序歹J及^專澤控制序列提供調節抗體基因之轉錄及轉譯之期望的功此。表現載體序列及表現控制序列經選擇，係盘所使 = 表現宿主細胞為可相容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基 2***分開載體，或更典型地，二基因***同一個表現載體=體基因藉標準方法插人表現載體（例如，抗體基因 ^及载體上互補的限制位（旧计此⑽仙）之接合， ^不存在限制位則為平端接合）。此處所述抗體之輕鍵及 —F可=區，可經由將其***已經編碼所欲同型之重鏈恆鍵怔定區之表現载體’來形成任何抗體同型之全广，基因，如讓VHf段操作式聯結至載體内部之。節 ^代式聯結至載體内部之&節段。額外或由令’重組表現載體可編碼一信號胜狀，其協助抗體鍵 :::分泌。抗體鏈基因可轉殖入載體，讓信太只框内連結至抗體鏈基因之胺端。信號胜肽可為免疫球 319504 65 200817437 白信號胜肽或非同源信號胜肽(亦即得自非免疫球蛋白蛋白質之信號胜肽）。 &曰 .除W體鏈基因外’本發明之重組表現載體携帶調節价=該㈤g卩序列控制抗體鏈基因於宿主細胞之表現。「調 p歹!」心圖包括啟動子、增強子、及控制抗體因之轉錄或轉譯之其它表現控制元件（_trQieiement) 列如多腺苦化信號）。該等調節序列係說明於例如

GoeddeKGene Expression Technology. Methods in Enzyffi〇l〇gy 185, Acadefflic ^ ^ agg〇技蟄人士了解表現載體之設計包括調節序列之 ^ 據諸如欲轉形之宿主細胞之選擇、期望之蛋白二=3等因素而決定。用於哺乳動物宿主細胞表現之 °\即列包括’於嗜乳動物細胞中直接高度的蛋白質、見諸如何生自細胞巨病毒（CMV)、猴病毒(評4〇)、如腺病毒主要後期啟動伽Lp))及多發性瘤如:^肤去及/或、強子。另外，可使用非病毒調節序列，諸肤素（UblQUitin)啟動子或/5-球蛋白啟動子。又復，

得自不同來源之序列諸如心啟動子系統其含有得自_早期啟動子及人類τ細胞白血病 ^ ^^^i,14^i(Takebe, Y. et aL Cl 988) M〇L

Mil· Β1〇ι· 8 : 466-472)。體可=抗體鍵基因及調節序列外，本發明之重組表現载 :二厂爾列，諸如調節於宿主細胞中载體之複製之序列（例如複製起點）及選擇性標記基因之序列。選擇性標 319504 66 200817437 -=基因協助已經導入載體之宿主細胞的選定（例如表考皆屬Axel扣仏之美國專利案4,399,21 6、4,634,665及 5, 179, 017)。例如，典型地選擇性標記基因對已經導入载 .•體之宿主細胞提供藥物（諸如G418、吸濕徽素（匕似呵c⑷ 或胺甲嗓呤（meth〇trexate))抗藥性。較佳選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（用於帶有二甲喋呤選擇/ 擴增之dhfr宿主細胞）及neo基因（用於G418選擇性）。對於輕鏈及重鏈之表現，編碼重鏈及輕鏈之表現載體藉標準技術轉染入宿主細胞。「轉染」一詞之各種形式也涵蓋廣泛用於將外生性DNA導入原核或真核宿主細胞之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE_葡聚糖轉染等。雖然理論上可於原核宿主細胞或真核宿主細胞表現本發明之抗體，但以於真核細胞且最佳為哺乳動物宿主細胞表現抗體為最佳，原因在於此種真核細胞，特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能組裝且分泌經過適當摺疊之免疫活性抗體。抗體基因之原核表現業已報告對製造高產率之活性抗體無效（Boss，Μ·Α·及 Wood, C.R· (1 985) /歷_/〇灯 T'ocfay 6 · 12-13)。較佳表現本發明之重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞（CH0細胞）（包括dhfr- CH0細胞，說明於 Urlaub and Chasin，（1 980) Proc· Natl. Acad. Sci· USA 77 : 4216-4220，使用DHFR選擇性標記，例如說明於 R· J· Kaufman and Ρ·Α· Sharp (1 982) J· Mol· Biol· 159: 601-621 )、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。特別是， 67 319504 200817437 使用NS0骨髓瘤細胞，另一種較佳表現系統為揭示於w〇 87/04462(Wilson) 、 WO 89/01036(Bebbington)及 EP 338, 841 (Bebbingt〇n)之GS基因表現系統。當編碼抗體基因之重組表現載體被導入哺乳動物宿主細胞内時，經由將 *該等宿主細胞培養一段足夠允許抗體於宿主細胞内表現之時間’或更佳培養一段允許抗體分泌至宿主細胞生長之培養基之時間來製造抗體。可使用標準蛋白質純化方法由培養基獲得抗體。盤合至抗原之抗體的特糌化本發明之抗體可藉例如標準ELISA試驗其結合至 SDF-1。簡言之，微量滴定盤以〇·25微克/毫升經純化之 SDF-1於PBS塗覆，然後使用5%牛血清白蛋白於pBS阻斷。抗體稀釋液（例如得自SDF-1免疫接種小鼠之血漿稀釋液）添加至各孔’於37 C培養1至2小時。平盤以PBS/吞恩 (Tween)洗滌，然後與軛合至鹼性磷酸酶之第二試劑（例如，用於人類抗體，山羊抗人類IgGFc—特異性多株試劑）於37 C培養1小時。於洗滌後，平盤以p,p酶受質（1毫克/毫升）顯色並以0D 405至650分析。較佳，顯色出最高力價之小鼠將用於融合。前述ELISA分析也可用於篩檢顯示與sdf—1免疫原有陽性反應性之融合瘤。以高活力結合至SDFq之融合瘤經過次轉殖且進一步特徵化.。得自各個融合瘤之一個純株，其保有親代細胞反應性（藉ELISA)可選用於製造5至1〇小瓶細胞存庫，儲存於—14(rc供用於抗體純化。 319504 68 200817437 欲純化抗SDF-i抗體，選擇的融合瘤可於二升單株抗體純化用之攪拌培養瓶内生長。上清 $ 液經過濾及濃縮，隨後使用蛋白質A-希法羅司（sephar〇se)(法瑪西亞公司 (Pharmacia)，紐澤西州匹兹卡威）進行親和層析。洗提出之IgG藉凝膠電泳及高效液相層析檢查來確定❹。缓衝，可交換人PBS，使们.43消光係數藉〇咖〇須&濃度。單株抗體可整份儲存於-8〇°C。欲判定選用之抗SDF-1單株抗體是否結合至獨特抗原決定部位，各抗體可使用市售試劑（皮爾斯公司（pierce)，伊利諾州洛克維）生物素化。使用未經標記之單株抗體及生物素化單株抗體進行競爭研究，可如前文所述，使用塗覆之ELISA平盤進行。生物素化mAb結合可使用鍵絲菌一抗生物素-鹼性磷酸酶探針檢測。為了判定純化抗體之同型，可使用對特定同型抗體具有特異性之試劑來進行同型EUSA。例如，欲判定人類單株抗體之同型基因，微量滴定盤之各孔以丨微克/毫升抗人類免疫球蛋白於4°C塗覆隔夜。於使用1%BSA阻斷後，該平盤與1微克/毫升或更少之試驗單株抗體或經純化之同型對妝組於周圍溫度反應丨至2小時。然後各孔與人類

IgGl或人類IgM—特異性鹼性磷酸酶軛合探針反應。該平盤係如前文說明顯色及分析。抗SDF-1人類igG可藉西方墨點進一步試驗與 ^原之反應性。簡言之，SDF—i可製備並接受硫酸十二烷酉曰鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳後，分離之抗原移轉至硝 319504 69 200817437 _基纖維素膜，以10%胎牛血清阻斷，以欲試驗之單株抗體探測。人類IgG結合可使用抗人類IgG鹼性磷酸酶檢測，並使用BCIP/NBT受質錠（希格瑪化學公司（Sigma chem. • Co·)，密蘇里州聖路易）顯色。本發明抗體之結合特異性也可經由，例如藉流量細胞儀’ &測抗體與可表現SDF-1細胞之結合來測定。典型地，細胞株，諸如CH0細胞株，可以被編碼SDF-1穿膜形式之表現載體轉染。轉染蛋白質可包含一標籤（tag)，諸如 myc ’標籤較佳於n端供使用該標籤之抗體來檢測。本發明抗體結合至SDF-1可經由轉染細胞與抗體共同培養，並檢測結合抗體來測定。抗體與轉染蛋白質上的標籤結合，可用作陽性對照。本發明抗體對SDF-1之特異性可經由使用測定與 SDF-1結合之相同方法，判定抗體是否結合至其它蛋白質來進一步研究。免疫軛合物於另一態樣中，本發明有一特徵係有關抗SDF-1抗體或其片段軛合至治療性部分，諸如細胞毒素、藥物（例如免疫抑制劑）或放射性毒素。此種軛合物於此處稱作為「免疫輛合物」。包括一種或多種細胞毒素之免疫軛合物稱作為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒殺劑包括對細胞有害（例如殺死細胞）之任何藥劑。細胞毒素或細胞毒殺劑之實例包括紫杉醇（taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素（gramicidin) D、溴化乙鑌（ethidium bromide)、吐 70 319504 200817437 根驗、絲裂黴素（mitomycin)、足葉乙甙（etoposide)、鬼臼嗟吩甙（tenoposide)、長春新驗（vincristine)、長春驗 (vinblastine)、秋水仙素、艾黴素（doxorubicin)、柔紅黴素（daunorubicin)、二經基蒽基二酮、雙經蒽酷 (mi toxantrone)、普卡黴素（mithramycin)、放線菌素 D (actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素類、普羅卡因（procaine)、四卡因（tetracaine)、里多卡因 (lidocaine)、普潘奈（propranolol)及嘌呤黴素 (puromycin)及其類似物或同系物。治療劑也包括例如抗代謝劑（例如胺基喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷 (cytarabine)、5-氟尿嘧啶去咔哄（5-fluorouracil decarbazine))、烧化劑（例如氮芥（mechlorethamine)、席歐帕（thioepa)苯丁酸氮芥（chlorambuci l )、左旋苯丙氨酸氮芥（melphalan)、卡木斯汀（carmustine) (BSNU)及洛木斯汀（1〇111113以116)((^腳）、環鱗醯胺（。7(：1〇?11〇3011&1111(16)、二曱磺酸丁酯（busulfan)、二溴甘露糖醇、鍊脲佐菌素 (streptozotocin)、絲裂黴素C、及順-二氯二胺鉑（II) (DDP)順鉑（cisplatin))、蒽環素（anthracyclines)(例如柔紅黴素（前名柔毛黴素（daunomycin))及艾黴素）、抗生素 (例如更生黴素（dactinomycin)(前名放線菌素 (actinomycin))、博來黴素（ble⑽ycin)、普卡黴素及安曲黴素（anthramycin)(AMC))、及抗有絲***劑（例如長春新驗及長春驗）。其它可輛合至本發明之抗體之治療性細胞毒素之較佳 71 319504 200817437 實例包括道卡黴素（duocarmycins)、刺孢黴素 (calicheamicins)、美登驗（maytansines)及奥里塔汀 (aur istat ins)及其衍生物。刺孢黴素抗體輛合物之實例為 -市售可得（米洛塔格（Mylotarg);美國家庭產品公司 (American Home Products)) 〇細胞毒素可使用本技術領域可利用之鍵聯基技術而軛合至本發明之抗體。用來將細胞毒素軛合至抗體之鍵聯基類型之實例包括但非限於腙類、硫醚類、酯類、二硫化物類及含胜肽鍵聯基。鍵聯基可選擇為，例如，對溶小體腔室内之低pH的裂解敏感者，或對於藉蛋白酶，諸如偏好表現於腫瘤細胞之蛋白酶如組織蛋白酶（cathepsins)(例如組織蛋白酶B、C、D)之裂解敏感者。有關細胞毒素類別、鍵聯基及治療劑輛合至抗體之方法之進一步討論也可參考88丄1:〇，0.6亡3厂（2003) ^4办· DrugDeliv. Rev. 55 · 199-215 ； Trai 1, P. A. etal. (2003) Cancer Immiinol· Iimnunother. 52 : 328 — 337 ; Payne， G. (2003) Cancer Cell 3 ： 207-212 ； Allen, T. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2 : 750-763 ; Pastan，I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3 ： 1089-1091 ； Senter, P. D. and Springer, C. 1. (2001) Adv. DrugDeliv. Rev. 53 ： 247-264/ 本發明抗體也可軛合至放射性同位素來產生細胞毒殺性放射性藥品，也稱作為放射性免疫輛合物。可輛合至抗體供診斷用或治療用之放射性同位素之實例包括但非限於 72 319504 200817437 蛾、f、^。、及錦m。放射性免㈣合物以㈣本技術領域已經確立。放射性免疫軛合物之實可得，包括哲法林（Zevalin®)(艾德克藥品公司（IDEC Pharmaceuticals))及貝克薩（Bexxar(B)(可里薩藥品公司 (Corixa Pharmaceuticals))，類似方法可用來使用本發明之抗體製備放射性免疫軛合物。本發明之抗體輕合物可用來修改給定之生物反應，藥物部分並非解譯為限於傳統化學治療劑。例如，藥物部分可為具有期望之生物活性之蛋白質或多胜肽。此等蛋白質包括，例如酶活性毒素、或其活性片段，諸如雞母珠毒蛋白（abrin)、蓖麻毒蛋白A、假單胞桿菌外毒素、或白喉毒素；蛋白質諸如腫瘤壞死因子或干擾素—r ;或生物反應修改劑諸如淋巴激肽、介白素一1(「IL-1」）、介白素一2 (「IL-2」）、介白素-6(「IL-6」）、顆粒細胞巨噬細胞群落刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒細胞群落刺激因子(r G-CSF」）或其它生長因子。此專治療部分輛合至抗體之技術為眾所周知，例如參考 Arnon ei aL “Monoclonal Antibodies For Imraunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, 55 in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds. )5 pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hel lstrom et al. , “Antibodies For Drug Del ivery，，，in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds·)， pp. 623-53 (Marcel Dekker， Inc· 1987); Thorpe， 73 319504 200817437 “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review，” in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera ei aJ· (eds·)， pp· 475-506 (1985); “Analysis， Results， And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy，” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy， Baldwin et al. (eds·)， pp· 303—16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al. , Immunol. Rev. , 62 · 119-58(1982) 〇雙特異性分子於另一態樣中，本發明之特徵係針對包含本發明之抗 SDF-1抗體或其片段之雙特異性分子。本發明之抗體或其抗原結合部可經衍生或鍵聯至另一個功能分子，例如另— 個胜肽或蛋白質（例如另一抗體或一受體之配體）來產生結合至至少兩個不同結合部位或標靶分子之雙特異性分子。實際上，本發明抗體可經衍生或鍵聯至多於一個其它功能分子，來產生結合至多於兩個不同結合位置及/或標革巴分子之多特異性分子；此等多特異性分子也意圖涵蓋於此處所使用之「雙特異性分子」一詞。為了形成本發明之雙特異性分子，本發明之抗體可功能性鍵聯（例如藉化學偶合、基因融合、非共價結合或其它方式）至一個或多個其它結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、胜肽或結合模擬物，獲得雙特異性分子結果。 319504 74 200817437 • 據此，本發明包括雙特異性分子，包含至少一種對 SDF-1之第一結合特異性及對第二標靶抗原決定部位之第 -結合特異性。於本發明之特殊實施例中，第二標革巴抗原決疋部位為Fc受體，例如人類Fcr RI(CD64)或人類Fca 文體（CD89)。因此，本發明包括可結合至可表現FqR或 Fc a R之效應細胞（例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞 (ΡΜΝ))，且結合至可表現SDF —丨之標靶細胞之雙特異性分子。此等雙特異性分子將SDF — 丨表現細胞靶定至效應細胞，並觸發Fc受體調控之效應細胞活性，諸如SDF —丨表現性細胞之吞嗤作用、抗體依賴性細胞調控之細胞毒殺作用 (ADCC)、細胞激素之釋放或超氧化物陰離子之產生。於本發明之實施例中，其中該雙特異性分子為多特異性，除了抗Fc結合特異性及抗SDF —丨結合特異性外，分子了進乂包括弟二結合特異性。於一個實施例中，該第三結合特異性為抗加強因子（EF)部，例如一個分子結合至涉及細胞毒殺活性之表面蛋白，藉此提高抗標靶細胞之免疫反應。「抗加強因子部」可為抗體、功能抗體片段、或結合至給定分子諸如抗原或受體之一配體，結果導致結合決定子對Fc受體或標靶細胞抗原之影響加強。「抗加強因子部」了、、s F c受體或標革巴細胞抗原。另外，抗加強因子部可結〇至與第一結合特異性及第二結合特異性所結合之實體不同之實體。例如，抗加強因子部可結合細胞毒殺性T細胞 (例如透過 CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1 或其它免疫細胞，結果導致抗標靶細胞之免疫反應增高）。 75 319504 200817437 於-個實施例中，本發明之雙特異性分子包含至少_ 個抗體、或其抗體片段包括，例如，Fab、^，、F⑽，）

Fv、Fd、dAb或單鏈Fv作為結合特異性。抗體也可為㈣，元體或重鏈二元體或其任何最小片段，諸如^或單鍵構築體，如Ladner μ仏之美國專利4,946,778所述，該案内容以引用方式併入此處。人於-個實施例中，FCr受體之結合特異性係由單株抗體所提供，其結合並未由人類免疫球蛋白G (IgG)所阻斷。如此處使用，「IgG受體」一詞係指位在染色體i上之&個 7鏈基因中之任一者。此等基因共編碼丨2個穿膜或可溶性受體異構型，分成三個Fcr受體類別·· Fc7 RI(CD64)、Fc r RII (CD32)、及Fc r RI11 (CDl 6)。於一個較佳實施例中，

Fc r X體為人類高度親和力Fc 7 RI。人類Fc ^ RI為为子’顯示對單體IgG之高度親和力（1 〇8至1 。若干較佳抗Fcr單株抗體之製造及特徵化係說明於 PCT公開案W0 88/00052及Fanger et a;·之美國專利案 4, 954, 617,二案教示完全以引用方式併入此處。此等抗體係結合至Fcr Ri、Fcr RII或Fcr RIII之抗原決定部位，結合位置係與受體之Fcr結合位置不同，故其結合實質上並未由生理含量之IgG所阻斷。可用於本發明之特定抗fc r RI 抗體為 mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62 及 mAb 197。製造mAb 32之融合瘤可得自美國菌種中心（American Type

Culture Collection)，ATCC 寄存號碼 HB9469。於其它實施例中’抗Fc r受體抗體為單株抗體22之人類化形式 319504 76 200817437 • (H22)。H22抗體之製造及特徵化係說明於Graz i ano, R. F. ei aL (1995) J. lminunol 155 : (1〇) : 4996_5〇〇2，及

Tempest ei ah 之 PCT 公告案 w〇 94/1 0332。製造 H22 抗 ‘體之細胞株以名稱HA022CL1寄存於美國菌種中心，寄存號 •碼為 CRL 11177。於其它較佳實施例中，Fc受體之結合特異性係由結合至人類IgA受體，例如Fc—α受體（FcaRI(CD89))之抗體所提供，其結合較佳並未被人類免疫球蛋白A (IgA)所阻 Μ1。「IgA文體」一詞意圖包括位在染色體19之一個“基因（FcaRI)之基因產物。此種基因已知編碼55 kDa至11〇 kDa之數種不同的經剪接之穿膜同型。FcaRI(CD89)係組成性表現於單核細胞/巨噬細胞、嗜伊性顆粒細胞及嗜中性顆粒細胞上，但未表現於非效應細胞族群上。Fc a rI對 IgAl及IgA2有中等親和力（約等於5xi〇7m-i)，當暴露於諸如G-CSF或GM-CSF之細胞激素時親和力增高（M〇rt〇n，Η· c. et al· (1996) Critical Reviews jn Inmun〇1〇gy ·· 423-440)。四種Fca RI-特異性單株抗體識別為A3、A59、 A62及A77，其係結合於IgA配體結合功能部位外側之 aRKMonteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148 ： 1764) 〇

Fca RI及Fct RI為用於本發明之雙特異性分子之較佳觸發受體，原因在於（1)其係主要表現於免疫效應細胞上，例如單核細胞、PMN、巨噬細胞及樹狀細胞；（2)以高濃度表現（例如每個細胞5, 〇〇〇至1〇0, 000) ; (3)細胞毒殺 319504 77 200817437 -性活性（例如ADCC、吞噬作用）的調控物質；以及（4)調控靶定於其上之抗原（包括自我抗原）增強的抗原呈現。雖然以人類單株抗體為較佳，但可用於本發明之雙特異性分子之其它抗體為鼠類單株抗體、嵌合單株抗體及人 -類化單株抗體。本發明之雙特異性分子可經由使用本技術領域已知方法輛a組成物之結合特異性，例如抗FcR結合特異性及抗SDF-1結合特異性而製備。舉例言之，雙特異性分子之各種結合特異性可分開產生，然後彼此軛合。當結合特異性為蛋白質或胜肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價軛合。父聯劑之實例包括蛋白質A、曱二醯亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基〜硫乙酸鹽（SATA)、5, 5，一二硫貳（2 —硝基苯甲酸）（DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺（〇pDM)、N-丁一醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫）丙酸鹽（spDp)、及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基曱基）環己烷―丨—羧酸鹽（sulfo-SMCC)(例如參考 Karp〇vsky & (1984) j.

Exp. Med. 160 ： 1686 ； Liu, MA etal. (1 985) Proc. Natl. Acad· Sci· USA 82 :8648)。其它方法包括述於 paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132 ； Brennan et a7· (1 985) S^e/]Ce 229: 81-83,及 Glennie (1987) J· Immunol· 139 · 2367-2375)。較佳軛合劑為 SATA 及

Sulf〇-SMCC，二者皆係得自皮爾斯化學公司（Pierce Chemi ca 1 Co·)(伊利諾州洛克維）當結合特異性為抗體時，T透過兩個重鏈之C端枢紐 319504 78 200817437 • 區之巯基鍵結軛合。於特佳實施例中，軛合前，樞紐區經修改來含有奇數魏基，且較佳為一個Μ基。另外，兩種結合特異性可編碼於同一載體，並於同一 •個宿主細胞内表現及組裝。當雙特異性分子為mAb X mAb、 • mAb x Fab、Fab x F(ab’）2或配體x Fab融合蛋白質時，此種方法特別有用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及結合決定子之單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子包含至少兩個單鏈分子。雙特異性分子之製法說明如美國專利案 5, 260, 203 ; 5, 455, 030 ; 4, 881，175 ; 5, 132, 405 ; 5, 091，513 ; 5, 476, 786 ; 5, 01 3, 653 ; 5, 258, 498 ;及 5, 482, 858，各案皆以引用方式併入此處。雙特異性分子結合至其特定標靶可經由，例如，酶聯結免疫吸附分析（ELISA)、放射性免疫分析（RIA)、FACS分析、生物分析（例如生長抑制）、或西方墨點分析證實。此等分析通常經由採用對感興趣之複合體之特異性經標記的試劑（例如抗.體）來檢測特別感興趣之蛋白質-抗體複合體。例如，FcR-抗體複合體可使用，例如辨識且特異性結合至抗體-FcR複合體之酶連結抗體或抗體片段，來檢測。另外，複合體可使用多種其它免疫分析中之任一者來檢測。例如，抗體可經放射性標記並用於放射性免疫分析（RIA) (例如參考Weintraub，B.，放射性免疫分析原理，内分泌學會放射性配體分析技術之第七期訓練課程，1986年3 月，以引用方式併入此處）。放射性同位素可經由如使用珈 79 319504 200817437 矗 .瑪計數器或閃爍計數器或藉自動放射性攝影術等手段來檢測0 醫藥組成物於另-態樣中，本發明提供一種組成物，例如醫寧组成物，含有本發明之單株抗體或其抗原、结合部中之一者其組合，連同醫藥上可接受之截一戰J凋配而成。此等組成物包括本發明之抗體或免疫輛合物或雙特異性分子中之一者或其組合（例如兩種或多種不同之抗體）。舉例言之，本發明之醫藥組成物包含結合至標乾抗原上之不同抗原決定苦; 位或具有互補活性之抗體（或免疫輛合物或雙特異性分子之組合。本發明之醫藥組成物也可以組合治療，亦即盘盆它兹劑組合投藥。舉例言之，組合治療包括本發明之抗·一了抗體與至少另—種抗炎劑或免疫抑制劑的組合。可用於組合治療之治療劑之實例，進一步詳細說明於本發明之抗體之用途章節。如此處使用，「醫藥上可接受之载劑」包括生理上可相 $之任：種及全部溶劑、分散介質、塗層、抗菌劑及抗真囷劑、等張劑及吸收延遲劑等。較佳載劑適合供靜脈、肌肉、皮下、非腸道、脊椎或表皮投藥（例如藉注射或藉點滴）。依據投樂途徑而定，活性化合物亦即抗體、免疫輛合物或雙特異性分子可被塗覆於材料中，來保護化合物免於酉文的作用及其它可能造成化合物鈍化之自然條件。本叙月之商藥化合物可包括一種或多種醫藥上可接受 319504 80 200817437 之鹽。「醫藥上可接受之鹽」表示保有親代化合物期望之活性，且不會造成任何非期望之毒理學效應之鹽（例如參考 Berge, S. M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66： l-i9) 0 此等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自下列無毒無機酸之酸加成鹽諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等；以及衍生自下列無毒有钱I之k加成鹽，諸如脂肪族一羧酸及二，敌酸、苯基取狀燒酸、㈣㈣、芳錢、脂肪族賴及芳香族^酸等鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬之鹼加成鹽，諸如鈉、卸、，鎂、舞等；以及衍生自無毒有機胺之驗加成鹽，諸如 Ν’ Ν 一苄基伸乙基二胺、Ν_甲基葡萄糖胺、氯普羅卡因、膽鹼、二乙醇胺、伸乙基二胺、普羅卡因等。本發明之醫藥組成物也包括醫藥上可接受之抗氧化劑°醫藥上可接受之抗氧化劑之實例包括：⑴水溶性抗氧化d諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鋼、亞硫酸氫納等；⑵油溶性抗氧化劑諸如棕搁酸抗展血醋、丁基化經基衫_咖）、丁基化㈣甲苯⑽τ)、 :磷脂、五倍子酸丙酯、α_生育酚等；及⑶金屬螯合劑二擰檬酸、伸乙基二胺四乙酸⑽ΤΑ)、山梨糖醇、酒石 I、嶙酸等。 ▲可用於本發明之醫藥組成物之適當水性_及非水性之實例包括水、乙醇、多元醇類（例如甘油、丙二醇、 :乙：輪其適當混合物，·植物油類例如撖欖油；及注、用有機醋類諸如油酸乙酷。適當流動性可例如經由使用 319504 81 200817437 .塗覆材料如卵磷脂，於分散液之情況下經由維持所需粒徑，以及經由使用界面活性劑而維持流動性。 • 此等組成物也含有輔劑諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。經由滅菌程序（參見上文），以及經由含有多^ 抗菌及其抗真菌劑，諸如對經基苯曱酸酯類、氯丁醇、齡山梨酸等，可確保防止微生物的存在。也期望組成物内包括等張劑，諸如醣類、氯化鈉等。此外，經由含括可延遲及收之作用劑’諸如單硬脂酸紹及明膠而獲得注射用劑型之長時間吸收。射醫藥上可接受之載劑包括，供臨時準備無菌注射用液笙入所Ώ /奋欣釗或/刀散液劑及無菌粉末。此卓）丨貝及作用劑對於醫藥活性物知。除了 δ曰^ L 初貝之用通為本技術領域已知入已知與活性化合物不可相容之任何習 ’I貝或作用劑之外’皆預期補充性活性化合物也可結合入該組成物組成物。定。成物典型於製造及料條件下須為無菌安用於高藥物濃度之有序結構。载二多元醇(例如甘油、丙二醇、及液有例如水、乙醇、分散介質及1適者、、日人 /體來乙二醇等）之溶劑或於分散液之情況下經由維持所使用塗層如㈣脂，活性劑可維持適當流動性。而^戈以及經由使用界面劑例如醣類、多元醇類如甘露 ^兄1，較佳含括等張組成物。經由於組成物 Β 梨糖醇或氯化納於 3括可延遲吸收之作用劑，例如 319504 82 200817437 •單硬月曰酸鹽及明膠，可獲得長期吸收注射用組成物。 ”、、囟庄射用液劑之製法，係將活性化合物以需要量摻 •混於適當㈣，視需要可含有前文列舉之成分之一或成^ 組s接著進行滅菌微過濾。大致上，分散液之製法係經由將活性化合物摻混於無菌載劑，該載劑含有鹼性分散介質及前文列舉之所需的其它成分。於製備無菌注射用液劑之無菌粉末之情況下，較佳製法為真空乾燥及冷凍乾燥（凍乾）’由先前經過滅菌過濾之溶液獲得活性成分及任何其它所欲成分之粉末。可與載劑材料組合來製造單一劑型之活性成分用量係依據接受治療之個體及特定投藥模式決定。可與載劑材料組合來？造單一劑型之活性成分量通常為可產生療效之組成物之里。大致上，於100%中，此量之範圍係由約0.01% 至約99%活性成分，較佳由約〇1%至約7〇%，及最佳由約 1%至約30%活性成分與醫藥上可接受之載劑的組合。用藥劑量經調整來獲得最佳期望反應（例如治療反應）。例如，可投予單一大劑量，可隨時間之經過投予數個分開^量，或可從治療情況之緊急程度決定，可成比例增減劑1。特佳係以容易投藥及均勻_量之單位劑量形式調配腸道外用藥組成物。如此處使用之單位劑型，係指適; 用於欲治療個體之單位劑量之實體上分開的單位；各個單位含有經過計算可產生期望療效之預定活性化合物量與所需醫藥載劑之組合。本發明單位劑型之規格可由下列因素決定，且與下列因素有直接相關：（a)活性化合物之獨特特 319504 83 200817437 •性及欲達成的特定療效，以及（b)將此種化合物混料用於個體治療的敏感度之本技術領域特有的限制。供投予抗體，劑量係由約〇. 〇〇〇1至1〇〇亳克/千克，更常見0.01至5毫克/千克宿主體重。例如劑量可 .毫克/千克體重，i毫克/千克體重，3毫克/千克體重，.5 宅克/千克體重，或丨〇毫克/千克體重，或於1至10毫克/ 千克之範圍内。治療計晝實例包含每週投藥一次、每兩週一=、每三週一次、每四週一次、每個月一次、每三個月 -人、或每二至六個月一次。本發明之抗SDF—丨抗體之較佳用藥計晝包括透過靜脈投予1毫克/千克體重或3毫克/ 千克體重，抗體係使用下列劑量計晝中之一者投予：母4週6劑，然後每3個月一劑；（i i)每3週一劑；（土 ^) 3毫克/千克體重一次，接著為每3週丨毫克/千克體重。 ϋ若干方法中，係同時投予不同結合特異性之兩種或夕種單株抗體’於該種情況下，各抗體之投藥劑量係落入指示範圍内。通常係於多種情況下投予抗體。單劑中^間隔為，例如，每週、每月、每3個月或每年。經由測定病人體内抗標乾抗原之抗體在血中之濃度，可據此採用不規貝J間。於右干方法中，可調整劑量來達成約工至玉刚微克/名升血漿抗體濃度，某些方法中約25至3〇〇微克/ 宅升。 +另外，可投予抗體作為持釋配方，於該種情況下所需投，頻次較低。劑量及頻次係⑯據病人體内抗體之半生期决疋。大致上，人類抗體顯示最長半生期，接著為人類化 319504 84 200817437 抗體肷合抗體及非人類抗體。投藥劑量及頻次係依據處理為預防性處理H療性處理而改變。於預防性用途中，長時間以相對不頻繁的間隔投予相對低劑量。某些病人終其生持續接受治療。於治療用途中，偶爾需要於相對短間隔時間之相對高劑量，直到病程減輕或結束，且較佳係直到病人顯示疾病症狀的部分或完全緩解。隨後，可對病人投予預防性用藥。士本發明之醫藥組成物中，活性成分之實際劑量程度可 =變’因而獲得對特定病人、組成物及投藥模式達成期望治敍應之有效活性成分用量。選用之劑量程度將依據多，樂力學因素決定，包括所採用之本發明之f藥組成物或 ^旨、鹽或酿胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所採用之 =化合物之***速率、治療時間長度、與料所使用之 :::組合之其它藥物、化合物及/或材料、接受治療病人步望二2別、體重、情況、一般健康狀況及先前醫療病史等樂界眾所周知之類似因素。、本發明之抗SDF-1抗艚之「、么、逸士， mm "几體之~療有效劑量」將導致疾正狀嚴重度的減輕、疾病無症狀頻增加、或防止因染病造成的損害或失二期 ;::=DF_1+腫瘤，「治療有效量」較佳可抑制細胞生、或腫瘤生長相對於未接受治療個 =n，又更佳至少賴，及又更 :有預=腫瘤生長的能力，可於對用於人類腫瘤之功效 /、有預測性之動物模型系統中評估。另外，此種組成物之 319504 85 200817437 性質可經由檢驗化合物抑制細胞生長的能力來評估，此等抑制可於試管内經由熟諳技藝人士已知之檢定分析測定、。治療有效量之治療性化合物可縮小腫瘤大小，或以其它方式改善個體的症狀。熟諳技藝人士可基於個體身材、個體症狀嚴重程度、及所選料特定組成物或投藥途徑等決定用量。，、一本發明組成物可使用本技術領域已知之多種方法中之一者或多者’透過-個或多個投藥途徑投予。如熟諸技藝人士了解’投藥途徑及/或投藥模式將隨期望之結果而改變。較佳本發明抗體之投藥途徑包括靜脈、肌肉、皮内、腹内、皮下、脊椎或其它非腸道投藥途徑，例如藉注射或點滴投予。如此處使用，「非腸道投詞表示腸道投藥及局部投予以外之其它投藥模式，通常藉注射投予，且包括但非限制’例如靜脈、肌肉、動脈内、鞘内、囊内、眶 :内皮内、腹内、穿氣管、皮下、角質層下、關節、、囊下、蜘蛛膜下、椎骨下、硬腦膜外及胸内注射及點滴0 ” 、"另外，本發明之抗體可透過非腸道外（n〇n_parentai) 途徑投予，諸如皮下、表皮或黏膜投藥途徑投^，例如鼻内、經口、經***、經直腸、、經舌下或經局部投予。 *活性化合物可與載劑製備，载劑將保護化合物免於快 j放，諸如控制釋放配方，包括植體、經皮貼片及微包 =送系統。可使用生物分解性、生物相容性聚合物，諸如乙埽/乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、谬原蛋白、㈣ 319504 86 200817437 •酸醋類、及聚乳酸。多種此等配方之製備方法已獲頒專利，或通常為熟諸技藝人士所已知。例如參考持續經控制釋放藥物輪迭系洗（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, l. R. Robinson ed. , Marcel Dekker, ’ Inc·，New York，1978) o 治療性組成物可使用本技術領域已知之醫療裝置投予。例如於較佳實施例中，本發明之治療性組成物可使用無針皮下注射裝置投予，諸如美國專利案5, 399, 163 ; 5, 383, 851 ； 5, 312, 335 ； 5, 064, 413 ； 4, 941, 880 ； 4’ 790’ 824 ’或4, 596, 556所揭露之無針皮下注射裝置。有用於本發明之眾所周知之植體及模組實例包括··美國專利第4, 487, 603號，其揭示植入式微輸注幫浦供以控制速率配送藥物；美國專利第4, 486, 194號，揭示經皮膚投予藥物之治療性裝置；美國專利第4,447,233號，揭示以精準輸注速率輸送藥物之藥物輸送幫浦；美國專利第 4, 447, 224號，揭示連續藥物輸送用之可變流量植入式輸入裝置，美國專利第4, 439, 196號，揭示有多室隔間之滲透壓，物輸送系統；及美國專利第4,475，196號，揭示滲透麼藥物輸❹統。此等專利㈣以引用方式併人此處。多種其它此等植體、輪送系統及模組為熟諳技藝人士所已知0 於右干貫施例中，本發明之人類單株抗體可經調配來確保於活體内之適t分布。例如，血腦障壁（_可排除多種兩度親水化合物。為了確保本發明之治療性化合物穿越 319504 87 200817437 -BBB (若有所需），化合物例如可調配於微脂粒内。至於微脂粒之製法，例如參考美國專利第4, 522, 81 1 ; 5, 374, 548 ; 及5，3 9 9，3 31號。微脂粒可包含一個或多個為選擇性轉運入特定細胞或特定器官之部分，如此可提升靶定之藥物輸送（例如參考 V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol· 2 9 · 6 8 5)。乾定部分之實例包括葉酸鹽或生物素（例如參考

Low ei ah之美國專利5, 416, 016);甘露糖苷類（Umezawa ei aJ· (1988) Biochem· Biophys· Res· Commun. 153 : 1038);抗體（ρ·〇· Bloeman et ah (1 995) FEBS Lett· 357 : 140 ; M· Owais ei ah (1995) Antimicrob· Agents Chemother· 39 : 180);界面活性蛋白質 a 受體（Briscoe ei al. (1 995) Am. J. Physiol. 1233 ： 134) ； pl20 (Schreier et aL (1994) J· Biol. Chem· 269 : 9090);也參考 κ·

Keinanen ； M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346 ： 123 ； J. J. Killion, I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4： 273 〇用途及方法本發明之抗體，特別是人類抗體、抗體組成物及方法有多項試管内及體内診斷及治療用途，涉及SDF — 丨調控的病症之診斷與治療。例如，此等分子可於試管内或活體外投予培養中之細胞，或例如於活體内投予人體來治療、預防及診斷多個病症。如此處使用，「個體」一詞意圖包括人類及非人類動物。非人類動物包括全部脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、羊、犬、貓、 88 319504 200817437 •牛、馬、雞、兩棲類及爬蟲類。較佳個體包括患有由SDF-1 活性所調控之病症之病人。該等方法特別適合用於治療具 .有與SDF-1表現異常相關聯之病症之人類病人。當抗卯Η .之抗體係連同另-種藥劑投予日f，二者可以任一種順序或同時投予。因本發明抗體對SDF-1有特異性結合，本發明抗體可用於特異性檢測細胞表面之SDF—i之表現，此外可用來透過免疫親和純化而純化SDF-1。乳癌轉移係以各種樣式包括區域淋巴節、骨髓、肺、，肝而出現。發現CXCR4於原發性及轉移人類乳癌細胞中鬲度表現，而正常***組織無法檢測得⑶…“厂沒八 (jOOl) #abre 410 : 50-6)。也提示沾卜丨於非小細胞肺癌的轉移上扮演某種角色，此處癌細胞回應於SDF—丨有趨化性（Phillips ei ai· (2003) Am j Respir CHt Care Med 167· 1676-86)。冒經提示SDF-1可誘導於乳癌細胞、肺及肝萃取物中之高濃度F-肌動蛋白（F—actin)聚合及偽足的开乂成，結果導致於試管内乳癌細胞之方向性移動。此種乳癌細胞的移動先前曾經顯示可藉抗CXCR4或CCL21之抗體而阻斷。業已顯示SDF-1於肝内膽管癌（icc)扮演某種角色 (〇hira ei ai· (2006) Am J Pathol 168 : 1 155-68)。此外，SDF-1與CXCR4之交互作用之抑制，已發現涉及幹細胞的驅動（mobilization)，可為多種其它癌症，諸如多發性骨髓瘤及非何杰金氏淋巴瘤（non—H〇dgkin，s lymphDma) 有用 /口療（Fricker etal· (2006)付梓前公開；Fruehauf 319504 89 200817437 -及 See§er (2005) Fi/iure ^c〇7 1 : 375-83)。較佳為生長可受本發明抗體抑制之癌症，包括典型地對免疫治療有反應之轉移腫瘤及轉移癌症。較佳可供治療之癌症之非限制性實例包括··乳癌、多發性骨髓瘤及淋巴瘤（例如何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、原發性中樞神經系統（CNS)淋巴瘤、T細胞淋巴瘤）。其它可使用本發明方法治療之癌症之實例包括：黑素瘤（例如轉移惡性黑素瘤）、腎癌（例如腎細胞癌）、腦踵瘤、慢性白血病或急性白血病包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴母細胞性白血病、及鼻咽癌、攝護腺癌、大腸癌、肺癌、骨癌、胰癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚惡性黑素瘤、或眼内惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、***癌、 ***癌、食道癌、小腸癌、内分泌系統癌、曱狀腺癌、副曱狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒里期只體腫瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS)腫瘤、腫瘤血管新生、脊轴腫瘤、腦幹神經膠細胞瘤、腦垂腺腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘發之癌症，包括石綿誘發之癌症，例如間皮瘤’及此專癌症之組合。此外，本發明之人類抗體、抗體組成物及本發明方法可用於治療有腫瘤原性病症之個體，例如存在有可表現 SDF-1之腫瘤細胞為特徵之病症，例如包括乳癌、多發性 319504 90 200817437 - 骨魏瘤、非何杰金氏淋巴瘤（NHL)、腎細胞癌（RCC)諸如透明細胞RCC、神經膠母細胞瘤、乳癌、腦腫瘤、鼻咽癌、急性淋巴細胞性白血病（ALL)、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、伯奇氏（Burkitΐ’s)淋巴瘤、退化性大細胞淋巴瘤 (ALCL)、皮膚Τ細胞淋巴瘤、結節性小***細胞淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、周邊Τ細胞淋巴瘤、蘭諾氏（Lennert’ s) 淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴瘤、T細胞白血病/淋巴瘤 (ATLL)、成人T細胞白血病（T-ALL)、内母細胞性/中心細胞性（entroblast ic/centrocyt ic(cb/cc))濾泡性淋巴癌、瀰漫性B細胞系大細胞淋巴瘤、類血管免疫母細胞性淋巴腺病（AILD) T細胞淋巴瘤、基於HIV相關聯之體腔淋巴瘤、胚胎癌、未分化之鼻咽癌（例如席明克氏 (Schmincke’ s)腫瘤）、凱梭曼氏（Castleman，s)病、卡波西氏肉瘤、多發性骨髓瘤、瓦丹崇氏（Waldenstr⑽，s)巨球蛋白血症及其它B細胞淋巴瘤。據此，於一實施例中，本發明提供於個體中抑制腫瘤細胞生長之方法，包含對該個體投予治療有效量之抗 SDF-1抗體或其抗原結合部。該抗體較佳為人類抗sdfh 抗體（諸如此處所述之任一種人類抗SDF-1抗體）。另外或此外，抗體可為嵌合或人類化抗SDF-1抗體。

SDF-1也可於高度增生内襯檢測得，並朝向胞外基質及血管周圍襯層檢測，包括類風濕性關節炎（RA)及骨關節炎滑囊（0A)截面之血管内皮（pabi〇s ei a]· (2003) J

Immunol 170 : 2147-52)。0A及RA類纖維母細胞滑膜細胞 319504 91 200817437 •之北方墨點分析檢測得SDF-1表現，無法由前發炎性細胞激素、血管新生因子或低氧症來誘導。由内皮細胞移除硫酸乙醯肝素分子，去除此等細胞之SDF-1免疫染色，提示 SDF-1積聚於内皮細胞表面。提示於ra滑膜中SDF-1產量 -增加’導致SDF-1積聚於内皮細胞之肝素酶敏感因子上，且SDF-1參與與慢性發炎相關聯之血管新生。業已顯示 SDF-1誘發氣喘個體之支氣管黏膜新生血管且阻斷 CXCR-4，SDF-1的受體可緩和過敏非細胞發炎、過敏呼吸道疾病、呼吸道過度反應性及過度敏感型肺肉芽腫形成 (Hoshino et al. (2003) Eur Respir J 21 ： 804-9 ； Lukacs etal. (2002) Am J Pathol 160 ： 1353-60 ； Gonzaloetai.

(2000) J Immunol 165 ·· 499-508 ; Hu et a7· (2006) Am J

Pathol 169 · 424-32)。據此，本發明之人類抗體、抗體組成物及方法可用來治療患有自體免疫病症之個體，自體免疫病症例如以存在有SDF-1為特徵之病症，例如包括類風濕性關節炎（RA)、骨關卽炎（0 A )、貫驗性自體免疫性腦脊髓炎、氣喘、過敏性發炎諸如過敏性肺發炎、過敏性呼吸道病、呼吸道過度敏感及過度敏感型肺肉芽腫。其中可使用本發明抗體之其他自體免疫病症，包括但非限於，全身性紅斑性狼瘡 (SLE)、胰島素依賴型糖尿病（IDDM)、發炎性腸病（IJBD)(包括克隆氏病、潰瘍性大腸炎及腹腔疾病）、多發性硬化 (MS)、乾癬、自體免疫性甲狀腺炎及腎小球性腎炎。此外，本發明之抗體可用於治療移植排斥。 319504 92 200817437 - 據此，於一個實施例中，本發明提供治療束自辦务产病症之個體之方法，包含對該個體投予治療有效量之抗a • SDF-1抗體或其抗原結合部。較佳抗體為人類抗$肿—1抗體（諸如此處所述人類抗人類SDF —丨抗體中之任一者）。另 .外或此外，抗體可為嵌合或人類化抗SDF-1抗體。於心有杧生性糖尿病性視網膜病變病人，驗證於玻璃體内之SDF-1濃度顯著增高且與疾病嚴重度相關 ei a/· (2005) J Clin Invest 115 ·· 86-93)。使用崔安希諾隆（triamcin〇i〇ne)治療病人，降低玻璃體内幼卜丨濃度，疾病顯著改善，SDF-1含量及血管内皮生長因子（VEGF) 含量減低，去除瀰漫性黃斑部水腫，造成活性新生血管的退行（Brooks et ah (2004) Arch Ophthalmol 122 ·· 1801-7)。於增生性糖尿病性視網膜病變之小鼠研究模型中，SDF-1濃度符合病患之濃度以誘導小鼠視網膜病變，玻璃體内庄射阻斷抗SDF-1抗體，防止視網膜之新生血管。SDF-1及CXCR-4表現於老化相關黃斑部退化的眼球中可見（Bhutto 以 w· (2006) Br j 〇phthalm〇1 9〇 : 906-10) ° 如此，於一個實施例中，本發明提供一種治療患有增生性糖尿病性視網膜病變、囊性黃斑部水腫或老化相關之黃斑部退化之個體之方法，包含對該個體投予治療有效量之抗SDF-1抗體或其抗原結合部。抗體較佳為人類抗抗體（諸如此處所述之任一種人類抗人類SDF-丨抗體）。另外或此外’抗體可為嵌合或人類化抗抗體。 319504 93 200817437 • — CD45+、膠原蛋白I+、CKR4+纖維細胞之循環匯集物頌不可私動至纖維化區域，包括肺纖維化區域。使用抗 • SDF-1抗體治療顯示可抑制肺内補充邙45+、膠原蛋白 ,CXCR4 +纖維細胞，且緩和肺臟纖維化⑽⑴咖以 (2004) J Clin Invest 114 : 438—46)。如此於-個實施例中，本發明提供治療患有纖維化諸如肺纖維化之病人之方法，包含對該個體投予治療有效量之抗SDF 1抗體或其抗原結合部。較佳抗體為人類抗sDpq 杬體（諸如此處所述之任一種人類抗人類sdf —1抗體）。另外或此外，抗體可為嵌合或人類化抗SDp — 1抗體。 :、胃SDF-1結合至CXCR4也顯示於缺血情況，包括缺血所誘導之血管新生及冠狀動脈微血管收縮，扮演某種角色 (Mieno ei a7· (2006) Ann Thorac Surg 82 ·· 657-63)。如此於一㈣施例中，本發明提供一種治療患有缺血、缺血誘生血官新生或冠狀動脈微血管收縮之個體之方法，包 3對该個體投予治療有效量之抗響」抗體或其抗原結合部。較佳該抗體為人類抗仰卜丨抗體（諸如此處所述之任一種人類抗人類SDF-1抗體）。另外或此外，抗體可為嵌合或人類化抗SDF-1抗體。於一個實施例中，本發明之抗體(例如人類單株抗體、夕4寸異性及雙特異性分子及組成物）可用於檢測sdf—1含 =或膜表面上含有SDF—i之細胞含量，然後該等含量可關聯至某些疾病症狀。另外，抗體可用來抑制或阻斷功能，其又關聯某些疾病症狀的預防或改善，因而暗示 319504 94 200817437 m • SD=1為疾病之調控者。可於抗體與sDF-i間形成複合體之條件下，讓樣本及對照樣本與抗抗體接觸來達 •成抗體與SDF-1間所形成之任何複合體皆檢測且於樣及對照樣本作比較。於另貫施例中，本發明抗體（例如人類抗體、多特異 f生及雙特異性分子及組成物）初步可測試於試管内之治療用途或診斷用途相關聯之結合活性。例如，本發明之組成物可使用下列實例所述之流量細胞計量分析試驗。本發明之抗體（例如人類抗體、多特異性及雙特異性分子及組成物）具有於SDF-1相關疾病的治療及診斷之其他用返。例如，人類單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫軛合物可用於活體内或試管内提引出下列生物活性中之一者或多者：抑制表現SDF-1細胞之生長及/或殺死表現 SDF-1之細胞；於人類效應細胞存在下調控表現1細胞之吞i作用或ADCC，或阻斷SDF-1配體結合至SDF-1。於特定實施例中，抗體（例如人類抗體、多特異性及雙特異性分子及組成物）於活體内用來治療、預防或診斷多種 SDF-1相關疾病。SDF-1相關疾病之實例包括乳癌、類風濕性關節炎、骨關節炎、增生性糖尿病性視網膜病變、自體免疫疾病、癌症、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病（ALL)、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、伯奇氏 (Burkitt’s)淋巴瘤、退化性大細胞淋巴瘤（ALCL)、多發性黑素瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、結節性小***細胞淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、蘭諾氏（Lennert，s) 319504 95 200817437 • 淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴瘤、T細胞白血病/淋巴瘤 (ATLL)、成人T細胞白血病（T-ALL)、内母細胞性/中心細胞性（entroblastic/centrocytic(cb/cc))濾泡性淋巴 ;癌、瀰漫性B細胞系大細胞淋巴瘤、類血管免疫母細胞性 •淋巴腺病UILD) Τ細胞淋巴瘤、基於HIV相關聯之體腔淋巴瘤、胚胎癌、未分化之鼻咽癌（例如席明克氏 (Schmincke’s)遽瘤）、凱梭曼氏（Castleman，s)病、卡波西氏肉瘤、多發性骨髓瘤、瓦丹崇氏（Waldenstr⑽，s)巨球蛋白血症及其它B細胞淋巴瘤。本發明之抗體組成物（例如人類抗體、多特異性及雙特異性分子及組成物）於活體内及試管内之適當投藥途徑為本技術領域眾所周知，可由熟諳技藝人士選用。例如，抗體組成物可藉注射（例如靜脈注射或皮下注射）投予。所使用適當之分子劑量將依據個體之年齡及體重，及抗體組成物之濃度及/或配方決定。如先前說明，本發明之人類抗SDF-丨抗體可與一種或其它多種治療劑，例如細胞毒殺劑、放射性毒殺抑制劑共同投予。抗體可連結至該作用劑（呈免疫複體）投予或可與作用劑分開投予。於後述情況下（分開投予），抗體可於作用劑之前、之後或同時投予，或可與其它治療，例如抗癌治療如放射線共同投予。此等治療劑包括抗腫瘤 =諸如艾黴素（阿黴素（adriamycin))、職博來徽素硫酸孤卡木斯、/T、苯丁酸氮芥及環磷醯胺羥基脲，其本身唯有於對病人有毒性或次毒性之濃度使用。順錄可每4週一 319504 96 200817437 參 •认以100耄克/千克劑量以靜脈注射投予，阿黴素可以每 21天-人以6〇至75毫克/毫升劑量以靜脈注射投藥。本 •卷月j人類抗SDF-1抗體或其抗原結合部與化學治療劑共投藥，係提供兩種抗癌劑，透過不同機轉發揮作用，獲得對人類腫瘤細胞之細胞毒殺效果。此種共同投予可解決因對藥物之抗藥性產生，或腫瘤細胞抗原性改變讓其與抗體不具有反應性之問題。二標靶特異性效應細胞，例如連結至本發明組成物（人類二體夕特異性分子及雙特異性分子）之效應細胞可用作為治療劑。靶定用之效應細胞可為人類白血球，諸如巨噬細曰中f生白血球或單核細胞。其它細胞包括嗜伊性白血球、自然殺手細胞及其它IgG或IgA受體承載細胞。若有所需，效應細胞可得自欲治療的個體。標靶特異性效應細月l可以與生理可接受溶液之細胞懸浮液投予。投予細胞數、力為10至1 〇，但將隨治療目的而改變。通常，用量係足以獲得於標靶細胞之定位，例如表現SDF — 丨之腫瘤細胞，且用量將足以執行細胞撲殺，例如吞噬作用。投藥途徑也可改變。使用標靶特異性效應細胞治療可結合其它靶定細胞去除技術進行，例如使用本發明之組成物（例如人類抗體、多特異性分子及雙特異性分子）及/或以此等組成物來武裝之效應細胞之抗腫瘤治療，可與化學治療結合。此外，組合免疫/σ療可用來導引兩種不同的細胞毒殺效應族群進行腫瘤細胞排斥，例如連結至抗-Fc-T RI或抗-CD3之抗SDF-1 319504 97 200817437 ,抗體可結合IgG-或lgA_受體特異性結合劑使用。本發明之雙特異十生分子及多特異性分子也可用來調節效應細胞上之Fcr R或Fc”含量，例如也可經由加帽 .(⑶卯丨叫）且去除細胞表面之受體。抗-Fc受體之混合物也 • 可用於此項目的。本赉明之組成物（例如人類抗體、人類化抗體、或嵌合抗體、多特異性分子及雙特異性分子及免錄合物）其具有補體結合位置，例如得自IgG卜IgG2或IgG3或IgM之結合補體部分，也可於補體存在下使用。於一實施例中，使用本發明之結合劑及適當效應細胞於活體外治療包含標靶細胞之細胞族群，可藉添加補體或含補體血清來補充。塗後以本發明之結合劑之標靶細胞之吞噬作用可經由結合補體蛋白來改良。於另一實施例中，塗覆本發明組成物（例如人類抗體、多特異性及雙特異性分子）之標靶細胞也可藉補體/合解。於又另一實施例中，本發明之組成物不會活化補體。本發明之組成物（例如人類抗體、或嵌合抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫軛合物）也可連同補體一起投予。於若干實施例中，本揭示提供包含人類抗體、多特異性及雙特異性分子及血清或補體之組成物。當補體位置適當地鄰近於人類抗體、多特異性分子或雙特異性分子時，此專組成物為較佳。另外，本發明之人類抗體多特異性分子及雙特異性分子可與補體或血清分開投予。於本發明之範圍内也包含套組，包含本發明之抗體組 319504 98 200817437 .成物（例如人類抗體、雙特異性分子或多特異性分子或免疫軛&物）及使用指南。套組復包含一種或多種額外的反應 •劑，諸如免疫抑制劑、細胞毒殺劑或放射性毒殺劑、或一 •種或多種額外之本發明人類抗體（例如有互補活性，結合至 •與第一人類抗體不同之SDF-1抗原上之抗原決定部位之人類抗體）。如此，以本發明抗體組成物治療之病人可額外投予（於本發明之人類抗體之前、同時或之後投予）另一治療劑，諸如細胞毒殺劑或放射性毒殺劑，可提升或放大本發明之抗體之療效。 Χ 於其它實施例中，個體額外使用藥劑處理，該藥劑例如以細胞激素處理個體來調節，例如提升或抑制或Fc 7受體之表現或活性。較佳於使用多特異性分子治療期間投予之細胞激素，包括顆粒細胞群落刺激因子、顆粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子（GM-CSF)、干擾素—7 (ifn一 r )、及腫瘤壞死因子（丁肿）。本發明之組成物（例如人類抗體、多特異性分子及雙特異性分子）也可用來靶定可表現Fcr R或SDF—丨之細胞，例如用於標記此等細胞。用於此項目的，結合劑可連結至可被檢測之分子。如此，本發明提供用於定位活體外或試管内可表現Fc受體之細胞，諸如Fcr R或仰卜丨之方法。可檢測標記為，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。於特定實施例中，本發明提供於樣本中檢测s^—丨抗 319504 99 200817437 原存在或測量SDF -1抗原量之方法，包含於允許抗體或其抗原結合部與SDF-1間形成複合體之條件下5讓樣本及對照樣本與人類單株抗體或其抗原結合部接觸。然後檢測複合體之形成，其中樣本比較對照樣本間形成複合體之差異指不樣本内存在有S D F -1抗原。於又另一個實施例中，本發明之免疫軛合物可用於將化合物（例如治療劑、標記、細胞毒素、放射性毒素免疫抑制劑等）連結至抗體，用來將該等化合物靶定於具有SDF -1 細胞表面受體之鈿胞。例如，抗SDF-1抗體可軛合至美國專利案6, 281，354及6, 548, 530，美國專利公開案 20030050331、20030064984、20030073852 及 20040087497 或WO 03/022806所公開或說明之任一種毒素化合物。如此，本發明也提供用於定位活體外或活體内表現SDF-1之細胞之方法（例如使用可檢測標記，諸如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子）。另外，放射性輛合物可經由將細胞毒素或放射性毒素靶定於SDF-1，而用以殺死具有 SDF-1細胞表面受體之細胞。美國專利申請案第60/837003號，申請曰2006年8 月11日之内容全文以引用方式併入此處。本發明進一步係以下列實例說明，該等實例並非為進一步限制本發明。本申請案中全部圖式及全部參考文獻、專利案及公開的專利申請案之内容皆以引用方式併入此處。實例 100 319504 200817437 . • 實例1 ··抗SDF -1人類單株抗體之產生抗體係使用轉噬菌體（Trans-PhageSM)技術製造，該技術組合UltiMAb人類抗體建構系統（UltiMAb Human Antibody Development System®)，於穩定轉基因小鼠系統 * 中產生完整人類抗體；以及使用全純株（Omniclonal®)嗤菌體展示系統技術製造客製化抗體庫，允許由抗體重鏈及輕鏈之綜合存庫作選擇。轉基因HuMAb小鼠及KM小鼠抗SDF-1之全人類單株抗體係使用轉基因HuMAb小鼠 (HuMAb Mouse®)之HCo7種系及轉基因轉染色體之KM種系製備，其各自表現人類抗體基因。於各小鼠種系中，内生性小鼠kappa輕鏈基因已經藉同型合子摧毁，如Chen et aL ( 1 993) EMBOJ. 12 : 81 1-820所述；及内生小鼠重鏈基因已經經過同型合子摧毀，如PCT公告案W0 01/09187之實例1所述。各小鼠種系攜帶人類kappa輕鏈轉殖基因 KCo5，如 Fishwild ei aJ. (1996) A^ti/re 14:845-851所述。HCo7種系載有HCo7人類重鏈轉殖基因，如美國專利案 5, 545, 806; 5, 625, 825;及 5, 545, 807 所述。 KM小鼠（KMMouse®)種系含有SC20轉殖染色體，如PCT公開案W0 02/43478所述。

HuMab及KM免疫接種為了產生抗SDF-1之全人類單株抗體，HuMAb小鼠及 KM小鼠以經純化之重組SDF-1 α免疫接種（培徹泰克 (Peptrotech);紐澤西州洛基山）。人類同型基因SDF-1 101 319504 200817437 ‘ 0、SDF —丨/5及SDF-lr可互換使用，因胞外功能部位相同。HuMAb小鼠之大致免疫接種方案說明於L〇nberg，N. al. (1994) Nature 368(6474) ： 856-859 ； Fishwild, D. et .al. (1996) Nature Biotechnology 14 ： 845—851 及 PCT 公開案WO 98/24884。小鼠初次輸注抗原時為6至16週齡。純化後之重組SDF-1 α製劑（5-50微克）用來免疫接種各 HuMab小鼠及ΚΜ小鼠。轉基因小鼠使用抗原於完全弗冷氏輔劑或瑞比（Ribi) 輔劑經腹内（IP)、皮下（Sc)或足掌（FP)免疫接種兩次，接著為使用抗原於不完全弗冷氏輔劑或瑞比輔劑、Sc或 FP免疫接種3至21日（共達U次免疫接種）。藉眶後放血末視免疫反應。猎EL ISA師檢血清（容後詳述），具有足夠之抗SDF-1人類免疫球蛋白力價之小鼠用於融合。小氟於犧牲前及移除脾臟前3日及2日經靜脈追加接種。 |逵抗SDF-1抗體之HuMab小鼠，或Km夕遝坪欲選出可製造與SDF-1結合之抗體之HuMab小鼠或隨小鼠，得自接受免疫接種小鼠之血清藉EUSA測試，如 Fishwild，D. (1996年）（參見上文）之說明。簡言之’微量滴定盤以經過純化之SDF—丨以1至2微克/毫升^ PBS塗覆’每孔5〇微升，於培養隔夜，然後使用_ 微升/孔5%雞血清於PBS/吞恩（Tween)(〇〇5%)封阻。得自 SDF-1免疫接種小鼠之血漿稀释液添加至各孔，於室溫培養1至2小時。平盤以PBS/吞恩洗滌’然後與與辣根過° 化酶⑽ρ)輛合之山羊抗人類IgG Fe多株抗體於室溫培養 319504 102 200817437 m • 1小時。洗滌後，平盤使用ABTS酶受質（希格瑪公司， A-1888，〇· 22毫克/毫升）顯色，於0D 415至495藉分光光度計分析。顯示出最高抗SDF-1抗體力價之小鼠用於抗 ' 體的產生。嘗U體-展示綜合存庫的產生邀篩檢使用經由SDF-1免疫接種之HuMab小鼠或KM小鼠之脾臟’組構成抗體可變區之初始cDNA存庫。然後將抗體可變區轉殖入噬菌體表現載體内部。噬菌體之選擇係使用全純株噬菌體選擇方法（百歐赛公司，加州聖地牙哥）以生物素化SDF-1進行，來篩檢有奈莫耳親和力（KM脾臟）或次奈莫耳（nanomolar)親和力（HuMab脾臟）之可變區片段。感興趣之可變區片段被再轉殖入Fab表現載體，再度測試Fab之結合親和力及功能親和力。經引子編碼之可變區之N端部反向突變成各個可變區之種系序列。然後使用標準分子生物技術對高度親和力之anti-SDF-1 Fab產生全抗體。 31,製造抗SDF-1人類單株抗體之融合瘤之產峰至於另一種方法，分離自HuMab小鼠及/或KM小鼠之小鼠脾細胞使用基於PEG之標準方案，或使用細胞脈衝 (Cyto Pulse)大型腔室細胞融合電穿孔器（細胞脈衝科學公司，馬里蘭州，格林伯尼）進行基於電場之電融合，來與 PEG融合成小鼠骨髓瘤細胞株。然後所得融合瘤篩檢抗原知'異性抗體的製造。得自免疫接種小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與50% PEG(希格瑪公司）融合至四分之一數目之SP2/0非分泌性小鼠融合瘤細胞（ATCc，CRL 1581)。細 319504 103 200817437 . 胞以約lxio5/孔平塗於平底微量滴定盤，接著於選擇性培養基約培養兩週，該選擇性培養基含有10%胎牛血清、10〇/〇 P388D1(ATCC，CRL TIB-63)經調理之培養基、3至5%原點素（origen)(IGEN)於 DMEM(美迪泰克（Mediatech)，CRL 10013，含高含量葡萄糖、L-麵Si胺酸及丙酮酸納）加5 mM HEPES、0.055 mM 2-毓基乙醇、50毫克/毫升建它黴素及 1χ ΉΑΤ(希格瑪公司，CRL P-7185)。經1至2週後，細胞於培養基培養，培養基内之HAT以ΗΤ置換。然後各孔藉 ELISA(如前文說明）篩檢人類抗SDF-1單株IgG抗體。一旦出現全面性融合瘤生長，通常於1 〇至14日後監視培養基。重新平塗抗體分泌性融合瘤，再度篩檢，若對人類I gG仍然呈陽性，則藉限制性稀釋將抗SDF-1單株抗體次轉殖至少兩次。然後安定之次純株於試管内培養來產生小量抗體於組織培養基供進一步特徵化之用。由KM小鼠所產生之融合瘤純株1D3及1H2,及由HuMab 小鼠所產生之融合瘤純株1C6及2A5選用供進一步分析。實例2 :人類單株抗體iD3、1H2、iC6及2A5之結構特徵化編碼1D3、1H2、1C6及2A5單株抗體之重鏈及輕鏈可變區之編碼cDNA係使用PCR技術，分別得自iD3、1H2、 1C6及2A5融合瘤，且使用標準DNA定序技術定序。 1D3之重鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列分別係顯示於第1A圖及SEQ ID NO : 33及1。 1D3之輕鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列分別係 319504 104 200817437 -顯示於第1β圖及SEQ ID N0: 37及5。 1D3重鍵免疫球蛋白序列與已知之人類種系免疫球蛋白重鏈序列之比較，驗證1D3重鏈利用得自人類種系Vh ··卜24之VH片段、得自人類種系、6-19之D片段、及得自人類種系JH 6b之jh片段。1D3 Vh序列與種系&卜以序列之校準顯示於第5圖。使用測定CDR區之卡貝系統 system)進步分析1D3 VH序列，獲得重鏈CDRl、CDR2及 CDR3區之闡釋’分別如f 1A圖及第5圖所示，以及顯示於 SEQ ID N0: 9、13 及 17。 1D3輕鏈免疫球蛋白序列與已知之人類種系免疫球蛋白I鏈序列之比較，驗證1 輕鏈利用得自人類種系L u 8 之/Vl片段及得自人類種系JK4之JK片段。1D3 VL序列與種系WL18序列之校準顯示於第7圖。使用測定cDR區之卡貝系統進一步分析1D3 VL序列，獲得輕鏈CDR1、cdr2 及CDR3區之闈釋，分別如第1β圖及第7圖所示，以及顯示於 SEQ ID N0 ·· 21、25 及 29。 1H2之重鍵可變區之核苷酸序列及胺基酸序列分別係顯示於第2A圖及SEQ ID N0 : 34及2。 1H2之輕鍵可變區之核苷酸序列及胺基酸序列分別係顯示於第2B圖及SEQ ID N0 ·· 38及6。 1H2重鍵免疫球蛋白序列與已知之人類種系免疫球蛋白重鏈序列之比較，驗證重鏈利用得自人類種系％ 1 -24之Vh片段、得自人類種系6 —19之^片段、及得自人類種系JH 6b之JH片段。m2 VH序列與種系Vh -24序列 105 319504 200817437 •=校準顯示於第5圖。使用測定CDR區之卡貝系統進一步 =析1=νΗ序列，獲得重鏈CDR卜CDR2及CDR3區之闡釋，刀別如第2A圖及第5圖所示，以及顯示於seq id no : 1 〇、 14 及 18 〇 - 1H2輕鏈免疫球蛋白序列與已知之人類種系免疫球蛋白輕鏈序列之比較，驗證1H2輕鏈利用得自人類種系VkU8 之VL片段及得自人類種系JK42H片段。1H2 Vl序列與種系Vk L18序列之权準顯示於第7圖。使用測定cdr區之卡貝糸、、先進一步分析1H2 Vl序列，獲得輕鏈cdri、CDR2 及CDR3區之闡釋，分別如第2β圖及第7圖所示，以及顯示於 SEQ ID N0 ·· 22、26 及 30。 1C6之重鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列分別係顯示於第3A圖及SEQ ID N0 : 35及3。 1C6之輕鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列分別係顯示於第3B圖及SEQ ID N0 ·· 39及7。 1C6重鏈免疫球蛋白序列與已知之人類種系免疫球蛋白重鏈序列之比較，驗證1C6重鏈利用得自人類種系％3一7 之Vh片段、得自人類種系7-27之D片段、及得自人類種系JH 6b之JH片段。1C6 Vh序列與種系Vh 3一7序列之校準顯示於第6圖。使用測定CDR區之卡貝系統進一步分析 1C6 Vh序列，獲得重鏈CDR1、CDR2及CDR3區之闡釋，分別如第3A圖及第6圖所示，以及顯示於SEq iD N〇 :丨j、 15 及 19 。 1C6輕鏈免疫球蛋白序列與已知之人類種系免疫球蛋 319504 106 200817437 •白輕鏈序列之比較，驗證1C6輕鏈利用得自人類種系Vk U8 之Vl片段及得自人類種系JK 1之JK片段。1C6 Vl序列與 •種系IL18序列之校準顯示於第8圖。使用測定CDR區之卡貝系統進一步分析1C6 Vl序列，獲得輕鏈cdri、及CDR3區之闡釋，分別如第3B圖及第8圖所示，以及顯示於 SEQ ID N0 ·· 23、27 及 31。 2A5之重鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列分別係顯示於第4A圖及SEQ ID N0 : 36及4。 2A5之輕鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列分別係顯示於第4B圖及SEQ ID N0 ·· 40及8。 2A5重鏈免疫球蛋白序列與已知之人類種系免疫球蛋白重鏈序列之比車父’驗證2A5重鏈利用得自人類種系Vh 3一7 之Vh片段、得自人類種系7_272D片段、及得自人類種系JH 6b之JH片|又。2A5 Vh序列與種系vH 3-7序列之校準顯示於第6圖。使用測定CDR區之卡貝系統進一步分析 2A5 VH序列，獲得重鏈CDR1、〇即2及cdr3區之闡釋，分別如第4A圖及第6圖所示，以及顯示於seq id n〇: 12、 16 及 20 。 2A5輕鏈免疫球蛋白序列與已知之人類種系免疫球蛋白輕鍵序列之比較，驗證出輕鏈利用得自人類種系Vk L18 之w片段及得自人類種系JK 1之JK片段。2A5 Vl序列與種系VkL18序列之校準顯示於第8圖。使用測定⑽區之卡貝系統進一步分析2A5 Vl序列，獲得輕鍵_、· 及_區之闡釋，分別如第4β圖及第8圖所示，以及顯 319504 107 200817437 示於 SEQ ID NO : 24、28 及 32。結合特異性及結合動力貫例3 ·抗SDF-1人類單株抗體之學之特徵化於本實例中，抗SDF-U體之結合親和力及結合動力學係猎拜可分析（Biac〇re贿⑺⑷及西方免疫墨點分析檢驗。結合親和力及結合動力學抗SDF-1抗體藉拜可分析（拜可公司，瑞典烏普莎拉）決定親和力及結合動力學特徵。經純化之抗仰卜丨單株抗體使用標準胺偶合化學及拜可公司所提供之套件組，透過初級胺類而共價鍵聯至CM5晶片（經羧基甲基葡聚糖塗覆之晶片）。經由以75微升/分鐘流速流動具4〇、3〇、2〇、 10及5 nM濃度之SDF-1(培波泰克公司（Pepr〇1：ech)，紐澤西州洛基山）於PBS緩衝液（ρΗ 7· 4)來測定結合情況。恰在稀釋後注入SDF-1來讓二元體族群變成最大化。追蹤抗原一抗體結合動力學2分鐘，追蹤解離動力學8分鐘。使用 BIAevaluation軟體（拜可公司）將結合曲線及解離曲線帶入1 : 1 (蘭木爾（Langmuir))結合模型。測得之Kd、^及 k〇ff值顯示於表3。 319504 108 200817437 親和力 KdxI 〇'9(M) 0. 63 1. 32 0. 46 0. 37

HuMAb之拜可結合資料表 3. SDF-1 抗 SDF-1 抗體 1D3 1H2 1C6 2A5

On速率 k〇nxl 05( 1 /Ms) 8. 0 6. 0 14 29

Of f速率 koffxlO^4 1/s 5. 0 8. 4 6. 4 11 迎F-1之免疫沈澱及^ 抗SDF-1抗體係藉免疫沈澱隨後藉西方墨點分析來測定與天然SDF-1結合之特徵。製作4· 5xl08血小板製劑，製備一個T75燒瓶，含有各90至95%CH0-SDF、CHO-S及MCF7融合細胞。細胞以冷 PBS洗兩次。細胞以1· 5毫升溶解緩衝液（羅氏（R〇che)免疫沈澱套件組，型號1719394)溶解，於冰上使用5次i秒叢發脈衝來進行超音波振盪打碎細胞。混合物於離心ίο分鐘，收集上清液。使用MicroBCA蛋白質檢定分析套件組（皮爾斯公司（PIERCE)型號23235)測定蛋白質濃度。經由添加50微升蛋白質G瓊脂糖至混合物且於2至8χ：培養3小時，對細胞溶解產物進行前清潔。5微克抗抗體2A5或同型基因對照抗體添加至5〇〇微克血小板及 CHO-SDF、CHO-S及MCF3細胞溶解產物中之一者，於振搖平台上於2至8°C培養1小時。經由添加50微升蛋白質G 填脂糖至混合物，於振搖平台上於2至8它培養隔夜，對抗體-SDF-1複體進行免疫沈澱。經由於12,〇〇〇χ§離心i 319504 109 200817437 分鐘將珠粒沈澱。然後珠粒以洗滌緩衝液（羅氏免疫沈澱套件組型號1 71 9394)洗6次。用於西方分析，6〇微升LDS 载荷緩衝液（英維仇貞公司（invitrogen)，型號Np〇〇〇7)添加至各樣本，加熱至1〇〇艺3分鐘讓蛋白質變性。使用標準西方墨點技術，於室溫使用3微克/毫升2A5小鼠嵌合抗體打墨點1小吁。結果顯示抗Sj)F—〗抗體結合至約8⑽a帶，該τ係與SDF-1之分子量相對應。貝例4·基於拜可方法及基於螢光光譜術方法來決定sDpy 寡聚合狀態之特徵 SDF-1养聚合狀態係藉螢光各向異性實驗及螢光共振能轉移（FRET)實驗測定。兩組實驗皆係於螢光光譜儀3附

Fluorolog 3. 2(史沛士公司（Spex)，紐澤西州愛迪森）進行0 螢光各向異f生只驗係利用經螢光素標記之1。實驗係使用於494奈米激光及於514奈米監視發光以及裂隙 »又疋為5奈米▼通來進行。此等實驗中，$微莫耳濃度 ⑽）SDF];容液稀釋至5〇奈莫耳濃度（nM)，呈時間之函數測定各向異性。此等實驗係於PBS、PBS& i毫莫耳濃度 ⑽祕中進行。各向異性為分子複合體之總質量及形狀之ώ數，各向異性於無氯化㉝存在下降低，但藉添加 CaCl2維持恆定。 FRET貫驗係使用丹黃驢基標記之SDF-1及螢光素標記之SDF-卜此等實驗係以咖奈米激光及㈣奈米發光進行，光譜儀上的帶通設定為5奈米。此等實驗中，12.5_ 319504 110 200817437 /谷液稀釋至5 〇 nM，FRET信號係以時間之函數測定。，等實驗，於PBS及PBS+1 mM GaGh中進行。結果顯示於第9圖。第9A圖顯示基於各向異性之測量，1 _ caCl2 .對SDF-1二元體喪失之影響呈稀釋後時間之函數。第兆圖顯不基於FRET之測量，1 mMCaCl2對SDF-1二元體喪失 ^影響呈稀釋後時間之函數。螢光各向異性及FRET實驗驗 1 、元肢損失，於PBS緩衝液内稀釋後呈時間之函 =，但於補充有1 mM CaCh之PBS緩衝液内稀釋則否。只例5 ·藉差動掃描量熱術測定抗仙卜丨單株抗體之埶定性 #、、、文抗-SDF-1單株抗體的熱安定性係使用抗體熔點之執量計量分析測定。 …' 熔點（Tm)之熱量計量分析係於vp_毛細Dsc差動掃描微量熱計平台組合自動採樣器（麥可科公司（Microcal LLC)，美國麻省諾安頓）進行。樣本細胞體積為g.⑷毫升。經由將樣本以2.0/zM濃度，幻。以分鐘之加熱速率由30 C加熱至95。(：獲得變性資料。蛋白質樣本係存在於 PH 7. 4 % 1鹽緩衝食鹽水（pBS)。相同缓衝液用於參考细胞來藉比較獲得莫耳熱容。觀察得之溫度圖係基於非2步驟式杈型（non-2-step m〇dei)使用軟體〇rigin ν7· 〇進行基準線校正及規度化資料分析。資料顯示於表4。藉差動掃描量熱術，抗SDF-1單株抗體2Α5比1C6、1Η2及lD3 更為安定。 319504 111 200817437 表4. SDF-1 HuMAb之差動掃描量熱術資料抗SDF-1抗體 1D3 1H2 1C6 2A5 T,1 (°C ) 57. 8 59. 9 59. 6 68. 6 T,2 (°C) 65. 8 65. 7 66. 8 75. 0 實例6 ··於化學變性下之物理安定性方法經由藉螢光光譜術測定化學變性中點，來比較抗 SDF-1單株抗體之安定性。化學變性之螢光測量係於Spex Fluor〇log 3· 22光譜儀裝配有麥可邁士（Micromax)平盤讀取器（史沛士公司，紐澤西州愛迪森）上進行。於已經放置24小時來於16種不同濃度之胍鹽酸鹽於PBS缓衝液中平衡之抗體樣本進行測量。於黑色小容量非結合性表面384孔平盤（康寧公司 (Corning)，麻省艾克頓）進行測量，於12微升之孔體積要求1//Μ抗體。螢光係於280奈米激光，發光光譜係於300 奈米至400奈米測定。掃描速度為每奈米1秒，裂隙設定於5奈米帶通。使用PBS做為緩衝液之空白組，且由資料中自動扣除。使用GraphPad Prism軟體將資料帶入二態變性模型（two-state denaturation model)。資料顯示於表 5 〇 112 319504 200817437 表 :藉螢光光譜術測定抗SDF-1單株抗體之化學純株未摺疊中點（M) Z2/A5 2. 63 B1/H2 1· 96 Z1/C6 1. 94 B1/D3 1. 94 •藉質譜術及拜可基於天然胜肽及合成胜肽抗原決定部位之基因圖譜方法變性對利用質譜術進行趨化素上之分子抗原決定部位之序列識別有兩種辦法··抗原決定部位截取及抗原決定部位切除。於抗原決定部位截取中，細胞激肽首先接受酶消化，然後其胜肽片段與抗趨化素抗體結合的p〇R〇s樹脂混合來檢驗結合者；於抗原決定部位切除中，係將趨化素結合至抗體，再於原位進行消化。

於洗掉非結合者後，仍然結合於抗體樹脂上之含抗原決定部位之胜肽直接用於MALD卜MS分析，或由抗體中洗提而分開並藉ESI-MS進行分析。使用各種蛋白酶來涵蓋整個趨化素序列，產生若干胜肽片段樣式。有不同重疊，於還原形式及天然形式二者之趨化素胜肽檢驗抗原決定部位之結合情況。可能需要多種酶組合或依序使用，來達成抗原決定部位區附近的最緊密切割。 113 319504 200817437 • 經藉質譜術識別為對抗體之結合者之胜肽係於趨化素之二度構造上識別，藉X射線結晶術測定，可於公開領 (WWW, rcsb.org)。藉此程序，可删除質譜儀曲解的某些胺基酸為偽陽性，例如該等分子對欲由抗體所識別之核心抗原決定部位太過遠端。基於如此定位之抗原決定部位，設計合成胜肽之胺基酸序列。為了進一步識別於抗原決定部位（功能性抗原決定部位）中之關鍵殘基，於關鍵位置上以丙胺酸取代之胜肽也被設計供合成。結合至此等合成胜肽之抗體係於拜可及/或於質譜儀上試驗。猎拜可研究合成胜狀結合$ mAb之方法抗體係共價鍵結至拜可CM5晶片。胜肽係於2〇 mM乙酸銨缓衝液，ρΗ 7·〇，濃度1〇微克/毫升新鮮製備。此等胜肽以ίο微升/分鐘流速流過抗體表面上經歷15分鐘。胜肽與同型對照組之結合用作為空白信號。基於此種辦法，識別出與抗體結合之胜肽，該等胜肽有天然抗原序列以及有丙胺酸取代。由融合瘤所製造的兩群不同的HuMab族群，識別兩種分子抗原決定部位，標示為mAb z&mAb B。兩組抗體各自選擇性結合至單體仰卜10或二元體SDF_la。抗抗體1D3及1H2為mAb β族抗體。抗SDF-1抗體ic6及2A5 為mAb Ζ族抗體。mAb ζ族抗體辨識兩個抗原決定部位胜肽，一個接近Ν端區胺基酸殘基7至19亦屬已知之受體結合位置，另一者位於殘基37至50間之第三々股。mAb Β 族阻斷肝素結合位置，顯示為SDF_la二元體介面。藉由 319504 114 200817437 •來自拜可資料的干擾，mAb B主要係結合至第一單體與第一單脰之殘基24至30間之二元體介面，肝素也結合於該處。涉及於mAb Z之抗原決定部位結合之關鍵性殘基Arg8 也由此基於質譜術之分析而識別。實例8 :基於拜可方法及螢光之方法來監視當下列條件改變時’ SDF-1募聚合狀態及mAb結合之變化欲測量抗SDF-1單株抗體與單體SDF-1之結合，進行拜可實驗，以低密度SDF-1共價附接至CM5晶片。對1C6 及2A5 ’係經由濃度為5〇、40、30、20及1〇禮之SDF-1(培波泰克公司，紐澤西州洛基山）於PBS緩衝液（ρΗ7·4)流過來測量結合。對1D3及1Η2，係經由濃度為5〇〇、4〇〇、3〇〇、 200及100 ηΜ之SDF-1(培波泰克公司，紐澤西州洛基山）於PBS緩衝液（pH 7· 4)流過來測量結合。資料顯示於表6。 1C6及2A5對結合至單體形式SDF—丨顯示更高之親和^。

On速率 k〇nxl04(l/Ms) 1· 1 0. 91 11 9· 6

Of f速率 koffxl 〇"4 I /s 17 16 4. 0 表6·單株抗體與單體SDF-1之結合特異性抗SDF-1 親和力抗體 Kdx1(T9(M) 1D3 151 1H2 176 1C6 3.6 2A5 4. 6 SDF-1稀釋對與單株抗體之結合之影響係藉下述方監視，經由將抗體捕捉於抗CH1晶片上，然後於2八二渾里名士合後測定SDF-1結合反應呈稀釋後時間之函數。。、此寺貧驗 319504 115 200817437 .係於及1C6單株抗體於PBs(pH 7· 4)進行，灿卜丨係由 12.5//M 稀釋至 1〇〇 nM。欲測定pH、Ca2+離子及EDTA對抗SDF-1單株抗體結合至SDF-1之影響，係進行拜可分析。抗仙卜丨單株抗體共價鍵結至CM5晶片（拜可公司）。於各缓衝液中，1〇〇 nM SDF-1流經晶片，於2分鐘結合期結束後測定反應呈稀釋後時間之函數。使用之緩衝液為HBS_Ep(拜可公司）、一p (缺乏 EDTA)、PBS、PBS+1 niM CaCl2、及乙酸鈉 pH5. 5 + 15〇 mM NaCl 〇 SDF-1結合至肝素硫酸鹽之阻斷係藉下述方式測定，經由將生物素化肝素硫酸鹽（希格瑪公司）捕捉於鏈絲菌抗生物素晶片（拜可公司，瑞典烏普莎拉）上，然後測量有及無過i單株抗體（1H2及2A5)時之SDF-1結合情況。實驗係於PBS進行。貫例9 :經由125i-SDF-la結合至細胞之阻斷測得之功能活性藉標準放射性標記配體結合分析進行抗SDF-1 a抗體對於阻斷SDF-1結合至CEM鈿胞之比較試驗。抗SDF-la 抗體經過序列稀釋1 : 3來獲得由40 nM至2 pM之濃度範圍。於具有比活性2000 Ci/毫莫耳之i〇〇pM 125l-SDF-1(得自阿默山公司（Amersham)，型號IM314-25UCI)存在下，抗體添加至CEM細胞。有相同同型之不相關的抗體用作為陰性對照。經由允許125I-SDF-1於無抗體存在下結合至CEM 細胞’來測定所有可能結合的放射性標記配體。放射性標 319504 116 200817437 •記配體之非特異性結合係經由讓1251-SDF-1於1 // Μ未經標記SDF-1 (得自培波泰克公司，型號3〇〇-28Α)存在下結合來測定。結果顯示於第1 〇圖。實例10 :抗SDF-1抗體阻斷於CEM細胞中SDF-1誘導之每 *流 CEM細胞以螢光鈣染料鈣3(Caicinm 3，分子裝置公司 (Molecular Devices)，加州桑尼維爾）加標記。抗sDpy 抗體係於獲得由1〇〇 nM至1 濃度範圍且與50 nM α (培波泰克公司，紐澤西州洛基山）之丨：3序列稀釋系列中滴疋，Ik後載入至螢光檢測儀Fiexstafi〇n(分子裝置公司）。至於陰性對照，使用同型之不相關抗體。然後細胞以 SDF-la/抗體混合物刺激。不含抗體之細胞以SDF-la (於漢克氏（Hank’s)緩衝食鹽水含0· 1% BSA或HBS調配）刺激來達成最大可能之鈣流信號。欲測定基準線，細胞以含 O.U BSA之HBS刺激。經SDF-Ια刺激釋放出之鈣，係隨時間以鈣依賴性螢光來測定。所得螢光執跡之曲線下方面積係以鈣通量指示報告。所得鈣通量受抗SDF — 丨抗體之抑制顯不於第11圖。資料經作圖，使用GraphPad Prism軟體及非線性曲線匹配s形劑量反應曲線來算出EC5()。實例11 :抗SDF-1抗體阻斷SDF—丨誘導之CEM細胞遷移 CEM細胞以得自伯金愛瑪公司（ρ6ϋη Eimer)之batda 試劑加標記。抗SDF-1抗體係於獲得由1〇〇 nM至】pM濃度範圍且與5 nM SD：F-1 α (培波泰克公司，紐澤西州洛基山）之1 ·· 3序列稀釋系列中滴定。至於陰性對照，使用有 319504 117 200817437 同型之不相關抗體。有或無抗體之重組人類聊七以5讀添加至9"europrobe遷移板之下室，每孔有57毫米直徑之過慮膜。各孔含5微米孔隙。加標記之_細胞以每孔50萬個細胞之濃度載荷至過遽膜上。遷移板於阶培養2.5小時。遷移細胞捕捉於板之下室，經溶解，且使用伯金愛瑪公司之銪檢測溶液檢測。於融合儀器（f u s i 〇 n lnStrUment)上記錄化學冷光信號。藉抗SDH抗體對 SDF-la誘導遷移之抑制顯示於第12圖。貝例12 .使用抗SDF-1抗體治療抗體誘發之關節炎小鼠之膠原蛋白誘生之關節炎（CIA)廣用作為人類類風，性關節炎的實驗性ϋ檢模型。於本_檢模型中，小鼠以第Π型膠原蛋白免疫接種，第π型膠原蛋白觸發對第 II $膠原蛋白分子特定區之抗體的產生。疾病的起點為漸進j，6週為典型CIA模型的最短長度。晚近，識別出四個第Π型膠原蛋白之自體抗原之抗原決定部位，及抗此等抗原=定部位所產生之四種單株抗體之混合液用來快速誘發關節炎。於抗膠原蛋白抗體投予後3日，注射Lps以誘發疾病快速表現。於本抗體誘發模型中，疾病的開始快速，整個研究以兩週進行。抗體誘導模型顯示類似傳統模型所見的特徵，諸如發炎細胞全面性浸潤於滑膜及接合空 B初（pannus)的形成，以及硬骨及軟骨矣且織顯著破壞。如此，此種模型可以較傳統模型更短的研究時間、以類似方式監視抗炎物質的功效。於實驗中’使用6至8週齡Balb/c小鼠。於第〇日， 319504 118 200817437 小鼠注射4毫克抗膠原蛋白抗體混合液（亞梭貞 (Ai*thr〇gen))，接著於第2日注射25微克Lps。於第卜心 7及10日，小乳使用發明人類之抗SDjr_ 1抗體、同型對照，體、PBS、或皮質類固醇，氟美松（dexamethas〇ne)w 15 笔克/千克用於抗體及0.3毫克/千克用於氟美松處理。本研，中試驗之抗SDF-1抗體為純株1H2、2A5及1C6。經由於第3、5、8、10、12及15日進行臨床觀察（發紅及腫脹），以〇至4之分數來評分關節炎的發展。嚴重程度分數以正常為〇分，踩關節或腕關節明顯發紅或略微腫脹為i分， =一個指關節腫脹為卜分，多於一個指關節發紅腫服為2 分’整個足掌、跛骨、膝關節及/或腕關節發紅腫脹為3 分’足掌發炎、腫脹或變形且涉及多個關節為4分。對全部4個足掌皆評估嚴重度分數，各頭動物的總分為μ分。全部4個足掌腫脹（足掌厚度）係於第3、5、8、1〇、^及 15曰使用精密卡規測量。於兩種情況下由全部小鼠收集血樣用來製備血清：開 :處理前及屍體剖檢前。於第15曰’犧牲動物，約在踝關即上方的0.5厘米切除兩個後足掌’保存於谓中性缓衝褐馬林供組織病理學分析。結果顯示於第13-1至13-3 。蝥10 , ^ w d圖。弟13-1圖顯示各小 =平均分數⑴及平均足掌寬度⑻。第13_2圖顯示^ ::均分數⑹及平均足掌(厚度D)。g 13_3圖顯示』均疾病分數（E)及第24日之半妁广声師之+均疾病分數（F)。使用2A5 處理之小鼠（黑色實心直立二条报、你处m —角形）與使用同型對照處理· 319504 119 200817437 小鼠（灰色倒三角形）相比，發病顯著較不嚴重。同型對只g 組之疾病嚴重程度及足掌發炎程度係類似陽性對照組氣美松（大方框）。但1H2組及1C6組並未顯示任何使用抗體處理的效果，可與同型對照組比較。評估此等發現之顯著性之統計分析，指出Z2A5組之影響為顯著達p值=〇. 〇〇〇6 ; 而B1H2組之影響為不顯著（ρ=〇·346)。實例13 ··於小鼠氣袋（air p0uch)模型中抗sdf — 1抗體之效果氣袋模型係建構來試驗抗SDF-1抗體之功效。本活體内模型中，多類細胞可回應於SDF-1而遷移，氣袋可提供活體内細胞遷移之微環境。簡言之，小鼠經麻醉，注入無菌空氣來形成氣袋。研究當天，於無及有抗仙卜丨抗體存在下，氣袋内注射重組人類SDF_la。測定抗體之功效。本例中’試驗抗SDF-1抗體2A5、1C6、1D3及1H2。 8至12週齡雌C57BL/6小鼠（CRL)使用異氟烷 (isoflorane)麻醉，小鼠皮下背部注射5亳升無菌空氣形成氣袋。3曰後，又再注入3毫升無菌空氣。於第7日，注入1毫升m、或單獨SDF] a (2〇〇奈克，培波泰克公司）或SDF-i a加人類IgG4同型對照，或_七加5〇微克或100微克抗SDF-1抗體，注射量為】毫升。各試驗組使用5隻小鼠。四曰後，使用二氧化碳藉窒息犧牲小鼠，氣袋以2宅升㈣5 _職洗務，接著又以3毫升PBS/5 禮腿洗兩次。滲出液於室溫以5〇〇χ§離心5分鐘。以血球計來計算細胞數目’於❹奎克迪夫awo 319504 120 200817437 色套件組（熱電子公司（Thermo Electron Corporation)，麻省沃桑）染色的細胞離心（cyt〇spin)製劑上進行白血球亞群的差異數目計算。結果顯示於第14圖。結果顯示400奈克SDF-1 α誘導白血球遷移入氣袋内，比較以PBS填充之氣袋，白血球總數典型增加2至3倍。於1〇〇微克/毫升投予之抗sdf-1 抗體完全阻斷細胞遷移，回至如同單獨使用pBS之程度（第 14A圖）。同型對照組抗體不具任何功效。第14B圖中測量嘻中性細胞（Neu)或單核細胞/淋巴細胞（其它）之遷移百分比。以嗜中性細胞表示之大部分遷移細胞被抗Sdf—i抗體所阻斷。同樣地，單核細胞及淋巴細胞也被阻斷。於此抗體濃度，對該等試驗抗體之阻斷活性未觀察得任何差異。次一研究中’用來誘導遷移之SDF-1濃度降至200奈克，抗體濃度係於100微克/毫升及50微克/毫升之較低濃度二者試驗。2A5及1C6二者於50微克及100微克皆可阻斷嗜中性細胞、淋巴細胞及單核細胞的遷移（第丨5圖）。嗜中性細胞、淋巴細胞及單核細胞數目完全降至PBS的程度。兩種抗體於此濃度之強度類似。於1 〇〇微克之同型對照組不具任何功效。簡言之，抗SDF-1抗體亦即2A5、1C6、1H2及1D3為活體内細胞遷移的強力抑制劑。實例14 :螢光計量微量檢定分析技術{?ΜΑΤ研究本例中，檢驗於HuVEC細胞存在下，抗SDF-1抗體與 SDF-1之結合。HuVEC細胞含有SDF-1結合至糖胺基聚糖 121 319504 200817437 .(GAG)。 HUVEC(人類臍靜脈内皮細胞，康布雷士公司 (Cambrex)，P/N CC-2519)細胞以每孔 lxlO4 細胞於 200 微 • 升/孔培養基（康布雷士公司，P/NCC-3124，添加額外FBS ，至10%終濃度）接種於96孔黑色透明底之不透明平盤上，且於37°C與二氧化碳培養隔夜。小心去除細胞上清液。以 4倍濃度稀釋抗原及抗體。添加50微升分析緩衝液（PBS 加0. 5% FBS)、50微升rh SDF-1 α (培波泰克公司，P/N 300-28Α)，50微升抗體及50微升1 : 3000稀釋（亞雷弗洛 (Alexa Fluor)647山羊抗人類IgG (H+L)(英維仇貞公司， ?/^ 21445)或山羊抗小鼠1容0(11+〇(英維仇貞公司，？/^ 21235)。使用金屬箔覆蓋平盤且於室溫培養2小時。使用應用生物系統公司（Applied Biosystems’）FMAT 8200 讀取平盤。結果顯示於第16圖。本實驗顯示抗SDF-1抗體 1C6及2A5比較抗SDF-1抗體1D3及1H2顯示與GAG結合之SDF-1有更佳結合效果，提示抗體1D3及1H2可結合至與GAG結合位置重疊之抗原決定部位區。實例15 :於非CXCR4表現細胞上125I-SDF-Ια結合至GAG 之阻斷於本實例中，使用抗SDF-1抗體來試驗SDF-Ια結合至非特異性糖胺基聚糖（GAG)之抑制作用。藉標準放射性標記配體結合分析來進行抗SDF-1抗體對封阻 SDF-1 結合至得自 ATCC (cat# CRL-1 730)之 HuVEC 細胞之比較。抗SDF-1抗體經過1 : 3倍之序列稀釋來獲得 122 319504 200817437 ，由Μ.至0·5ΡΜ之濃度範圍。於具有比活性2〇〇〇ci/毫莫耳之100 pM 125I-SDF-1 α (得自阿默山公司型號 IM314-25UCI)存在下，將抗體添加至HuVEc細胞。以同型之不相關抗體用作為陰性對照。於無抗體存在下，允許，125i-SDF-1 α結合至fiiiVEC細胞，測定全部可能結人放性標記配體。放射性標記配體之非特異性結合係經由於i //Μ未標記之重組人類SDF-la (得自培波泰克公司，型號 300-28A)存在下，允許125i-SDF-1 α結合來測定。HuVE(：細胞不會表現CXCR4,如此SDF-la唯一之非特異性結合至此等細胞推定係透過GAG結合。結果顯示於第17圖。實例16 :抗SDF-1抗體阻斷HUVEC形成微血管本例中，試驗抗SDF-1抗體對HuVEC細胞間形成微血管連接點之影響。基質膠（Matrigel)以RPMI以1 ·· 1稀釋，接種於96 孔平盤之各孔，讓其於37°C聚合30分鐘。於80%融合之 HuVEC (得自康布雷士公司，型號CC-2519)藉胰蛋白酶消化，以每毫升lxl〇6細胞重新溶散於含〇. 5% FBS之RPMI。抗體與HuVEC以終濃度3微克/毫升徹底混合並於室溫培養 30分鐘。同型之不相關抗體或培養基用作為陰性對照。至於抑制微血管形成的陽性對照，使用小鼠抗人類aV万3 (CD51/CD61)抗體（得自R&D系統公司，型號MAB3050)。含或未含抗體之HuVEC接種於經基質膠塗覆之孔内，於37 培養18小時。

HuVEC與培養基或同型對照組培養形成微血管，導致 123 319504 200817437 ，出現跨孔板連接的細胞，每個細胞有3至5個連接點或分支點。與抗SDF-1抗體或抗-a V/5 3抗體共同培養之HuVEC 並未形成微血管。細胞顯然各自分開，極少或無分支點。 •抗SDF-1抗體1H2獲得極少數分支點，至於2A5則於小量百分比細胞產生若干分支點。【圖式簡單說明】第1A圖顯示1D3人類單株抗體之重鏈可變區之核酸序列（SEQ ID N0 : 33)及胺基酸序列（SEQ ID NO : 1)。顯示

CDR1 (SEQ ID NO : 9)、CDR2 (SEQ ID N0 : 13)、及 CDR3 (SEQ ID NO : 17)等各區及指示v、D及J種系衍生物。第1B圖顯示1D3人類單株抗體之輕鏈可變區之核酸序列（SEQ ID N0 : 37)及胺基酸序列（SEQ ID N0 : 5)。顯示 CDR1 (SEQ ID N0 : 21) 、 CDR2 (SEQ ID NO : 25)、及 CDR3 (SEQ ID NO : 29)等各區及指示V及J種系衍生物。第2A圖顯示1H2人類單株抗體之重鏈可變區之核酸序列（SEQ ID N0 : 34)及胺基酸序列（SEQ ID N0 : 2)。顯示 CDR1 (SEQ ID N0 : 10)、CDR2 (SEQ ID N0 : 14)、及 CDR3 (SEQ ID NO : 18)等各區及指示v、D及J種系衍生物。第2B圖顯示m2人類單株抗體之輕鏈可變區之核酸序列（SEQ ID N0 : 38)及胺基酸序列（SEQ ID N0 : 6)。顧示 CDR1 (SEQ ID NO : 22) 、 CDR2 (SEQ ID N0 : 26)、及 CDR3 (SEQ ID NO : 30)等各區及指示V及J種系衍生物。第3A圖顯示1C6人類單株抗體之重鏈可變區之核酸序列（SEQ ID NO : 35)及胺基酸序列（SEQ ID N0 : 3)。顯示 124 319504 200817437 CDRl (SEQ ID NO : 11) 、 CDR2 (SEQ ID NO : 15)、及 CDR3 (SEQ ID NO : 19)等各區及指示V、D及J種系衍生物。第3B圖顯示1C6人類單株抗體之輕鏈可變區之核酸序 •列（SEQ ID N0 : 39)及胺基酸序列（SEQ ID N0 : 7)。顯示 * CDR1 (SEQ ID N0 ·· 23)、CDR2 (SEQ ID N0 : 27)、及 CDR3 (SEQ ID NO : 31)等各區及指示V及J種系衍生物。第4A圖顯示2A5人類單株抗體之重鏈可變區之核酸序列（SEQ ID N0 : 36)及胺基酸序列（SEQ ID N0 : 4)。顯示 CDR1 (SEQ ID N0 : 12)、CDR2 (SEQ ID N0 : 16)、及 CDR3 (SEQ ID NO : 20)等各區及指示V、D及J種系衍生物。第4B圖顯示2A5人類單株抗體之輕鏈可變區之核酸序列（SEQ ID N0 : 40)及胺基酸序列（SEQ ID N0 : 8)。顯示 CDR1 (SEQ ID NO : 24) 、 CDR2 (SEQ ID N0 : 28)、及 CDR3 (SEQ ID NO : 32)等各區及指示V及J種系衍生物。第 5 圖顯示 1D3 (SEQ ID NO : 1)及 1H2 (SEQ ID N0 ·· 2)之重鏈可變區之胺基酸序列與人類種系Vh 1-24胺基酸序列（SEQ IDN0: 41)之比對。所顯示之JH6b序列為SEQ ID NO : 47 〇第 6 圖顯示 1C6 (SEQ ID NO : 3)及 2A5 (SEQ ID NO : 4)之重鏈可變區之胺基酸序列與人類種系Vh 3-7胺基酸序列（SEQ ID N0 : 42)之比對。所顯示之JH6b序列為SEQ ID NO : 48 。第 7 圖顯示 1D3 (SEQ ID N0 : 5)及 1H2 (SEQ ID N0 : 6)之輕鏈可變區之胺基酸序列與人類種系VkL18胺基酸序 125 319504 200817437 列（3£<3 10肋：43)之比對。所顯示之1]{4序列為3即11)恥: 49 〇 > - 第 8 圖顯示 1C6 (SEQ ID NO : 7)及 2Α5 (SEQ ID NO : 8)之輕鏈可變區之胺基酸序列與人類種系VkU8胺基酸序列（3£〇10_:43)之比對。所顯示之11[1序列為8即11)恥： 50 〇第9圖顯示拜可（Biac〇re)實驗及螢光光譜術實驗結果，驗證於PBS緩衝液内稀釋後，SDF —丨二聚合之損耗呈時間之函數；而於補充以i mM CaCh之pBS緩衝液内稀釋後則無。（A)基於各向異性測量值，丨mM CaCh對於稀釋後呈時間之函數之SDF-1二元體損耗之影響。（B)基於fret 測量值，1 mM CaCh對於稀釋後呈時間之函數之sdf—丨二元體損耗之影響。第10圖顯示實驗結果，驗證抗SDF — 丨之人類單株抗體阻斷SDF-1結合至CEM細胞。第11圖顯示實驗結果，驗證抗SDF — 丨之人類單株抗體阻斷CEM細胞中SDF-1誘導之鈣流。第12圖顯示實驗結果，驗證抗SDF-1之人類單株抗體阻斷SDF-1誘導之CEM細胞遷移。一第13-1圖顯示於活體内以抗sdF-1抗體治療膠原蛋白誘發的關節炎之結果。（A)表示分數，（B)表示足掌寬度。第13-2圖顯示於活體内以抗sDF—丨抗體治療膠原^白誘發的關節炎之結果。（C)表示第15曰之分數，（D)表示第 15日之足掌（厚度）。 319504 126 200817437 第13-3圖顯示於活體内以抗SDF-1抗體治療膠原蛋白誘發的關節炎之結果。（E)表示疾病分數，（F)表示於第24 日之疾病分數。第14圖顯示活體内氣囊實驗結果，驗證抗SDF-1抗體可阻斷白血球遷移入氣囊内。（A)測量氣囊内之總細胞數。 (B)測量氣囊内之嗜中性細胞。第15圖顯示於抗SDF_ 1抗體之較低投藥劑量於活體内之氣囊實驗結果，驗證抗SDF-1抗體可阻斷白血球之遷移入氣囊内。（A)測量氣囊内之總細胞數。（B)測量氣囊内之嗜中性細胞。第16圖顯示FMAT研究結果，驗證抗SDF-1抗體結合於HuVEC細胞。（A) rh SDF-la FMAT分析使用1C6抗體。 (B) rhSDF-laFMAT 分析使用 2A5 抗體。（C) rhSDF-laFMAT 分析使用I-CAM抗體。（D) rh SDF-la FMAT分析使用1D3 及Neg對照抗體。第17圖顯示結合分析之結果，顯示直接抗SDF-1之抗體可阻斷SDF-1結合至HuVEC細胞。 127 319504 200817437 序列表總覽 SEQ ID NO ：序列 SEQ ID NO : 序列 1 VH a. a. 1D3 21 VK CDR1 a. a. 1D3 2 VH a. a. 1H2 22 VK CDR1 a. a. 1H2 3 VH a. a. 1C6 23 VK CDR1 a. a. 1C6 4 VH a.a.2A5 24 VK CDR1 a. a. 2A5 5 VK a. a. 1D3 25 VK CDR2 a.a. 1D3 6 VK a. a. 1H2 26 VK CDR2 a. a. 1H2 7 VK a. a. 1C6 27 VK CDR2 a. a. 1C6 8 VK a. a. 2A5 28 VK CDR2 a. a. 2A5 9 VH CDR1 a. a. 1D3 29 VK CDR3 a. a. 1D3 10 VH CDR1 a. a. 1H2 30 VK CDR3 a. a. 1H2 11 VH CDR1 a. a. 1C6 31 VK CDR3 a. a. 1C6 12 VH CDR1 a.a. 2A5 32 VK CDR3 a. a. 2A5 13 VH CDR2 a. a. 1D3 33 VH n. t. 1D3 14 VH CDR2 a. a. 1H2 34 VH n. t. 1H2 15 VH CDR2 a. a. 1C6 35 VH n. t. 1C6 16 VH CDR2 a.a. 2A5 36 VH n. t. 2A5 17 VH CDR3 a. a. 1D3 37 VK n. t. 1D3 18 VH CDR3 a. a. 1H2 38 VK n. t. 1H2 19 VH CDR3 a. a. 1C6 39 VK n. t. 1C6 20 VH CDR3 a.a. 2A5 40 VK n. t. 2A5 41 VH 1-24 種系 a. a. 42 VH 3-7 種系 a.a· 43 VK L18 種系 a. a. 44 SDF-loc a. a. 45 SDF-1 β a. a. 46 SDF-Ιγ a. a. 47 JH6b 種系 a. a. 48 JH6b 種系 a. a. 49 JK4 種系 a. a. 50 J K1 種糸 a. a. 51 合成Gly-Ser聯結子 128 319504

Claims

200817437 十、申請專利範圍： 1. 一種分離之單株抗體或其抗原結合部，包含： (a) 重鏈可變區，包含選自於由SEQ ID NO : 1、2、 3及4所組成之組群之胺基酸序列；及 (b) 輕鏈可變區，包含選自於由SEQ ID N0 : 5、6、 7及8所組成之組群之胺基酸序列；其中，該抗體係特異性結合至SDF-1。 2·如申請專利範圍第1項之抗體，其包含： (a) 包含SEQ ID NO : 1之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包含SEQ ID NO·· 5之胺基酸序列之輕鍵可變區。 3·如申請專利範圍第1項之抗體，其包含： (a) 包含SEQ ID N0 ·· 2之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包含SEQ ID N0: 6之胺基酸序列之輕鏈可變區。 4.如申請專利範圍第1項之抗體，其包含： (a)包含SEQ ID N0 : 3之胺基酸序列之重鏈可變區；及 5 (b)包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之輕鏈可變區。如申睛專利範圍第1項之抗體，其包含： (a)包含SEQ ID N0: 4之胺基酸序列之重鏈可變跑，及 6 ⑻包含SEQIDN〇:k胺基酸序列之輕鍵可變區。重分離之單株抗體或其抗原結合部，其中，該抗體與 319504 129 200817437 參考抗體交叉競爭結合至SDF-1，其令，該抗體： Ca)以1x1 〇 Μ或更少之Kd結合至人類sdf-1 ; (b)可藉免疫沈殿分析檢測出結合至人類sdf — 1。 7.如申請專利範圍第6項之抗體或其抗原結合部，其中，該參考抗體包含： (a) 包含SEQ ID N0 · 1之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包含SEQ ID N0: 5之胺基酸序列之輕鏈可變區。 8·如申凊專利範圍第6項之抗體或其抗原結合部，其中，該參考抗體包含： (a) 包含SEQ ID N0· 2之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包g SEQ ID N0· 6之胺基酸序列之輕鏈可變區。 9·如申請專利範圍第6項之抗體或其抗原結合部，其中，該參考抗體包含·· (a) 包含SEQ ID N0: 3之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包§ SEQ ID N0· 7之胺基酸序列之輕鏈可變區。 10·如申請專利範圍第6項之抗體或其抗原結合部，其中，該參考抗體包含： (a) 包含SEQ ID N0 · 4之胺基酸序列之重鏈可變區；及 (b) 包含SEQ ID N0: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區。 U· 一種分離之單株抗體或其抗原結合部，其中，該抗體· 319504 130 200817437 (a) 以Ιχίο 或更少之Kd結合至人類sdf-1 ;或 (b) 可藉免疫沈殿分析檢測出結合至人類sdf — 1。 12·如申請專利範圍第u項之抗體或其抗原結合部，其為人類抗體。 13 ·如申明專利範圍第11項之抗體或其抗原結合部，其為肷合抗體或人類化抗體。 14·如申請專利範圍第ι2項之抗體或其抗原結合部，其為 kGl、IgG2或IgG4同型之全長抗體。 15·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其為抗體片段或單鏈抗體。 16·如申請專利範圍第μ項之抗體或其抗原結合部，其中’該抗體係以lxl 〇_8M或更少之Kd結合至人類SDF-1。 Π·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其中，該抗體係以lxl〇-9M或更少之Kd結合至人類SDF-：1。 18·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其中，該抗體具有57t：或更高之熔點。 19·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其中’該抗體具有68°C或更高之熔點。 20·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其中’該抗體阻斷SDF-1結合至CEM細胞。 21 ·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其中’該抗體阻斷CEM細胞中的SDF-1誘導i弓流。 22·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其中’該抗體阻斷SDF-1誘導的CEM細胞遷移。 131 319504 200817437 23·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其中，該抗體阻斷HuVEC細胞中之微血管形成。 24·如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合部，其中，人類SDF-1包含具有如SEQ ID N〇 : 44[基因庫寄存號碼NM—000609]列舉之胺基酸序列之多胜肽。 25·種分離之單株抗體或其抗原結合部，包含重鏈可變區，其為人類Vh 1-24基因或人類Vh 3 —7基因之產物或係衍生自該等基因，其中，該抗體係特異性結合至 SDF-1 〇 26·種分離之單株抗體或其抗原結合部，包含輕鏈可變區，其為人類VK L18基因之產物或係衍生自該基因，其中’該抗體係特異性結合至SDF-1。請專利範圍第26項之分離之單株抗體或其抗原結合部，復包含重鏈可變區，其為人類Vh1 —24基因或人頭Vh 3-7基因之產物或係衍生自該等基因。 28·如申請專利範圍第11項之抗體，其包含： (a) 重鏈可變區CDRi，包含SEq η NO : 9 ; (b) 重鏈可變區c〇R2，包含SEQ ID NO : 13 ; (c) 重鏈可變區CDR3,包含SEQ ID N〇: 17; (d) 輕鏈可變區CDR1，包含SEQ ID NO : 21 ; (e) 輕鏈可變區CDR2，包含SEQ ID NO : 25 ;及 (f) 輕鏈可變區CDR3，包含SEQ ID NO : 29。 9·如申請專利範圍第11項之抗體，其包含： (a)重鏈可變區CDR1，包含SEq ID no : ; 319504 132 200817437 (b) 重鏈可變區cdR2，包含SEQ ID NO : 14 ; (c) 重鏈可變區cdR3，包含SEQ ID NO : 18 ; (d) 輕鏈可變區CDR1，包含SEQ ID NO : 22 ; (e) 輕鏈可變區cdR2，包含SEQ ID NO : 26 ;及 (f) 輕鏈可變區CDR3，包含SEQ ID NO : 30。 30·如申請專利範圍第n項之抗體，其包含： (a) 重鏈可變區cDm，包含SEQ ID N0 : 11 ; (b) 重鏈可變區cdR2，包含SEQ ID NO : 15 ; (c) 重鏈可變區CDR3，包含SEQ ID NO : 19 ; (d) 輕鏈可變區CDR1，包含SEQ ID NO : 23 ; (e) 輕鏈可變區CDR2，包含SEQ ID NO : 27 ;及 (O輕鏈可變區CDR3，包含SEQ ID NO : 31。 31·如申請專利範圍第u項之抗體，其包含： (a) 重鏈可變區CDR1，包含SEQ ID NO : 12 ; (b) 重鏈可變區CDR2，包含SEQ ID NO : 16 ; (c) 重鏈可變區CDR3，包含SEQ ID NO : 20 ; (d) 輕鍵可變區CDR1，包含SEQ ID NO : 24 ; (e) 輕鍵可變區CDR2，包含SEQ ID NO : 28 ;及 (f) 輕鏈可變區CDR3，包含SEQ ID NO : 32。 32.:種組成物，包含如申請專利範圍第u項之抗體或其抗原結合部及醫藥上可接受之載劑。種免疫輛合⑯，包含如申請專利範圍帛u項之抗體或其抗原結合部聯結至治療劑。 34· -種組成物，包含如巾請專利範圍第項之免疫輛合 319504 133 200817437 物及醫藥上可接受之載劑。 35. 如申請專利範圍第33項之免疫軛合物，其中，該治療劑為細胞毒素。％ ' 36. —種組成物，包含如申請專利範圍第扣項之免疫 ' 物及醫藥上可接受之載劑。口 37. 如申請專利範圍第33項之免疫軛合物，其中，該治療劑為放射性同位素。 ’、 38·—種組成物，包含如申請專利範圍第37項之免疫軛合物及醫藥上可接受之載劑。 39.—種分離之核酸分子，係編碼如申請專利範圍第^項之抗體或其抗原結合部。 40·—種表現載體，包含如申請專利範圍第39項之核酸分子。 41· 一種宿主細胞，包含如申請專利範圍第4〇項之表現載體。、 42·種製備抗SDF-1抗體之方法，包含於如申請專利範圍第41項之佰主細胞表現該抗體，及由該宿主細胞分離該抗體。 43·種於個體中治療癌症之方法，包含對該個體投予如申明專利範圍第1至32項中任一項之抗體或其抗原結合部，以此讓該個體接受癌症之治療。 44.如申請專利範圍第43項之方法，其中，該癌症係選自於由下列所組成之組群：乳癌、多發性骨髓瘤及淋巴瘤 (例如何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤、淋巴細胞 319504 134 200817437 性淋巴瘤、原發性中樞神經系統（CNS)淋巴瘤、τ細胞淋巴瘤）；黑素瘤（例如轉移性惡性黑素瘤）、腎癌（例如腎細胞癌）、腦腫瘤、慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴母細胞性白血病、及鼻咽癌、攝護腺癌、大腸癌、肺癌、骨癌、胰癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚惡性黑素瘤、或眼内惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、***癌、***癌、食道癌、小腸癌、内分泌系統癌、甲狀腺癌、副曱狀腺癌、腎上腺癌、 =組織瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童期實體腫瘤、膀胱癌、月癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS)腫瘤、腫瘤血管新生、脊軸腫冑、腦幹神經膠細胞瘤、腦垂腺腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘卷之癌症，包括石綿誘發之癌症如間皮瘤及上述癌症之組合。 45.如申請專利範圍第44項之方法，其中，該腫瘤細胞為乳癌細胞。 46·如申請專利範圍第44項之大、、土 ^ , 丄图乐 μ又万去，其中，該腫瘤細胞為多發性骨髓瘤細胞。 47·如申請專利範圍第44項之方、、土 ^ ^ . ^ 万去，其中，該腫瘤細胞為非何杰金氏淋巴瘤細胞。 48. 一種治療患有自體免疫病症之個體之方法，包含對該個體投予如申請專利範圍第心項中任一項之抗體或 319504 135 200817437 其抗原結合部’以此讓該個體接受自體免疫病症之治療0 49·如申請專利範圍第48項之方法，其中，該自體免疫病症係選自於由類風濕性關節炎（RA)、骨關節炎（〇A)、實驗性自體免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑性狼瘡（SLE)、胰島素依賴型糖尿病（IDDM)、發炎性腸病（IBD)(包括克隆氏病、潰瘍性大腸炎及腹腔疾病）、多發性硬化症 (MS)、乾癖、自體免疫性甲狀腺炎、腎小球性腎炎及移植排斥所組成之組群。 50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中，該自體免疫病症為類風濕性關節炎（RA)。 51. 如申請專利範圍第49項之方法，其中，該自體免疫病症為骨關節炎（〇A)。 52. —種治療個體移植排斥之方法，包含對該個體投予如申明專利辄圍第1至32項中任一項之抗體或其抗原結合部’以此讓該個體接受移植排斥之治療。 53· —種治療患有增生性糖尿病性視網膜病變之個體之方法，包含對該個體投予如申請專利範圍第1至犯項中任，項之抗肢或其抗原結合部，以此讓該個體接受增生性糖尿病性視網膜病變之治療。曰 54.-種驅動幹細胞之方法，包含投予如中請專利範圍第丄至32項中任—項之抗體或其抗原結合部，以此驅動該幹細胞。瓜如申請專利範圍第u項之分離之單株抗體，其中，該 319504 136 200817437 單株抗體係結合至SDF-1之單體形式及二元體形式。 56.如申請專利範圍第11項之分離之單株抗體，其中，該單株抗體係結合至SDF-1蛋白質之受體結合部位。 —57.如申請專利範圍第56項之分離之單株抗體，其中，該 • 單株抗體係結合至SDF-1蛋白質之胺基酸殘基7至19。 58. 如申請專利範圍第11項之分離之單株抗體，其中，該單株抗體係結合至SDF-1蛋白質之胺基酸殘基37至 50 ° 59. 如申請專利範圍第11項之分離之單株抗體，其中，該單株抗體結合至SDF-1之二元體形式但非單體形式。 60. 如申請專利範圍第59項之分離之單株抗體，其中，該單株抗體結合至SDF-1之肝素結合部位。 61. 如申請專利範圍第59項之分離之單株抗體，其中，該單株抗體結合至SDF-1之二聚合界面。 62. 如申請專利範圍第59項之分離之單株抗體，其中，該單株抗體結合至SDF-1之胺基酸殘基24至30。 137 319504 200817437 序列表 <110〉米德列斯公司 <110>小野藥品工業股份有限公司 <120〉抗基質細胞衍生因子-1 (SDF-1)之單株抗體 <130> GEOP-53 <140〉 <141> <150> 60/837,004 <151> 2006-08-11 <160> 51 <170> Patentln Ver. 3.3 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400〉 1 Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Lys Leu 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ser Gin Arg Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Glu Gly Gin Trp Leu Val Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens } 1 319504 200817437 <400> 2 Gin Val Gin Leu Val Gin ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val 20 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Leu 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ser Gin Arg Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Glu Gly Gin Trp Leu Val Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 124 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens } <400> 3 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Arg Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Met Asn Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Sar Leu Arg TUa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Thr Gly Pro Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 2 319504 200817437 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 4 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 、 35 40 45 Ala Asn Met Asn Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Thr Gly Pro Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 5 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 3 319504 200817437 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 6 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 7 Ala lie Arg Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys JUa Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 4 319504 200817437 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 工le Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 8 Asp lie Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 9 Lys Leu Ser Val His 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) 5 319504 200817437 <400> 10 Lys Leu Ser Val His 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 11 Ser Tyr Trp Met Ser 1 5 <210〉 12 <211> 5 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 12 Ser Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> 人類{ Homo sapiens ) <400> 13 Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ser Gin Arg Phe Gin 15 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens } <400> 14 Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr 工le Tyr Ser Gin Arg Phe Gin 15 10 15 Gly <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) 6 319504 200817437 <400> 15 Asn Met Asn Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 16 Asn Met Asn Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 17 Glu Gly Gin Trp Leu Val Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 18 Glu Gly Gin Trp Leu val Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 <210> 19 <211> 15 <212 > PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 19 Asp Leu Thr Gly Pro Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 20 200817437 Asp Leu Thr Gly Pro Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 15 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 21 Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Ala Leu Ala 15 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 22 Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala Leu Ala 15 10 <210〉 23 <211> 11 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 23 Arg Ala Ser Gin Gly 工le Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 24 Arg Ala Ser Gin Gly 工le Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 25 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210〉 26 <211> 7 200817437 <212> PRT <213> 人類（Horn。sapiens ) <400> 26 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> 人類（Horn。sapiens ) <400> 27 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 28 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212 > PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 29 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212 > PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 30 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> 人類（Horn。sapiens ) <400> 31 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 9 319504 200817437 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 32 Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 33 <211> 366 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens ) <220> <221> CDS <222> (1)··《366) <400> 33 gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg get gag gtg aag aag cct ggg gcc Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 tea gtg aag gtc tcc tgc aag gtt tcc gga tac acc etc act aaa tta Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Lys Leu 20 25 30 tcc gtg cac tgg gtg ega cag get cct gga aaa ggg ett gag tgg atg Ser Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga agt ttt gat cct gaa gat ggt gaa aca ate tac tea cag agg ttc Gly Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ser Gin Arg Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc gag gac aca tct aca gac aca gcc tac Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg acc age ctg aga tct gag gac aeg gcc gtg tat tac tgt Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aeg gag ggg cag tgg ctg gta gcc tac tac ggt atg gac gtc tgg Ala Thr Glu Gly Gin Trp Leu Val Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tcc tea Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 48 96 144 192 240 286 336 366 <210> 34 <211> 366 10 319504 200817437 <212> DNA <213> 人類（Horn。sapiens ) <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 34 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg get gag gtg aag aag cct ggg gee 48 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 tea gtg aag gtc tee tgc aag gtt tee gga tac acc ttc act aaa tta 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Leu 20 25 30 tee gtg cac tgg gtg ega cag get cct gga aaa ggg ett gag tgg atg 144 Ser Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga agt ttt gat cct gaa gat ggt gaa aca ate tac tea cag agg ttc 192 Gly Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ser Gin Arg Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc gag gac aca tct aca gac aca gee tac 240 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg age age ctg aga tct gag gac aeg gee gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aeg gag ggg cag tgg ctg gta gee tac tac ggt atg gac gtc tgg 336 Ala Thr Glu Gly Gin Trp Leu Val Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc atg gtc acc gtc tee tea 366 Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 372 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens } <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 35 gaa gtg cag ctg gtg gag tct ggg aga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Arg Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 11 319504 96 200817437 96 tcc ctg aga etc tee tgt gca gee tet gga ttc acc ttt agt age tat Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 tgg atg age tgg gtc ege cag get cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gee aac atg aat caa gat gga agt gag aaa tac tat gtg gac tet gtg Ala Asn Met Asn Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc ega ttc acc ate tec aga gac aac gee aag aac tea ctg tat Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac age ctg aga gee gag gac aeg get gtg tat tac tgt Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 geg agg gat eta act ggg cca tat tac tat gac tac tac ggt atg gac Ala Arg Asp Leu Thr Gly Pro Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 gtc tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tec tea Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 144 192 240 288 336 372 <210> 36 <211> 372 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens ) <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 36 48 cag gtg cag ctg gtg cag tet ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 96 tee ctg aga etc tec tgt gca gee tet gga ttc acc ttt agt age tat Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 144 tgg atg age tgg gtc ege cag get cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 192 gee aac atg aat caa gat gga agt gag aaa tac tat gtg gac tet gtg Ala Asn Met Asn Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 12 319504 240200817437 aag ggc cga ttc acc ate tee aga gac aac gee aag aac tea ctg tat Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac age ctg aga gee gag gac aeg get gtg tat tac tgt Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 geg agg gat eta act ggg cca tat tac tat gac tac tac ggt atg gac Ala Arg Asp Leu Thr Gly Pro Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 gtc tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tee tea Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 288 336 372 <210> 37 <211> 321 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens ) <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 37 gaa att gtg etc acc cag tet cca tee tee ctg tet gca tet gta gga Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc egg gca agt cag ggc att age agt get Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 tta gee tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa get cct aag etc ctg ate Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 tat gat gee tee agt ttg gaa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg etc Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaa Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 48 96 144 192 240 288 321 13 319504 200817437 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> 人類（Homo sapiens ) <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 38 gaa att gtg etc acc cag tet cca tee tee ctg tet gca tet gta gga 48 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc egg gca agt cag ggc att age agt get 96 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 tta gee tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa get cct aag etc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 tat gat gee tee agt ttg gaa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro €5 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg etc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213〉人類（Homo sapiens } <220> <221> CDS <222〉（1)··(321) <400> 39 gee ate egg atg acc cag tet cca tet tee gtg tet gca tet gta gga 48 Ala lie Arg Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 14 319504 96200817437 gac aga gtc acc ate act tgc egg gca agt cag ggc att age agt get Asp Arg Val Thr 工le Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 tta gee tgg tat cag cag aca cca ggg aaa get cct aag etc ctg ate Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 tat gat gee tee agt ttg gaa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac cct egg Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 aeg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 144 192 240 288 321 <210> 40 <211> 321 <212> DMA <213> 人類（Homo sapiens ) <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 40 gac ate cag atg ate cag tet cca tee tee ctg tet gca tet gta gga Asp lie Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc egg gca agt cag ggc att age agt get Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 tta gee tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa get cct aag etc ctg ate Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 tat gat gee tee agt ttg gaa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 46 96 144 192 240 15 319504 288 200817437 gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac cct egg Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 321 aeg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 41 <211〉 98 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 41 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr <210> 42 <211> 98 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 42 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn lie Lys Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 16 319504 200817437 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 43 <211> 95 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens } <400> 43 Ala He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Asn Tyr Pro 85 90 95 <210> 44 <211> 89 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens } <400 44 Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu 15 10 15 Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30 Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 lie Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gin lie Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Asn Asn Asn Arg Gin Val Cys lie Asp Pro Lys Leu Lys Trp lie Gin 65 70 75 80 17 319504 200817437 Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys 85 <210> 45 <211〉 93 <212> PRT <213> 人類（Horn。sapiens } <400> 45 Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30 Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 lie Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gin lie Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Asn Asn Asn Arg Gin Val Cys lie Asp Pro Lys Leu Lys Trp lie Gin 65 70 75 80 Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met 85 90 <210> 46 <211> 119 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 46 Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu 15 10 15 Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30 Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 lie Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gin 工le Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Asn Asn Asn Arg Gin Val Cys lie Asp Pro Lys Leu Lys Trp lie Gin 65 70 75 80 Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Arg Arg Glu Glu Lys Val 85 90 95 ,Gly Lys Lys Glu Lys 工le Gly Lys Lys Lys Arg Gin Lys Lys Arg Lys 7 100 105 110 Ala Ala Gin Lys Arg Lys Asn 18 319504 200817437 115 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens > <400> 47 Tvr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 1 5 l〇 15 Ser <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens ) <400> 48 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 15 l〇 15 Thr Val Ser Ser 20 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> 人類（Homo sapiens } <400> 49 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> 人類（Horn。sapiens } <400> 50 Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 1 5 10 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列說明：合成Gly-Ser聯結子 <400> 51 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15 19 319504