TR201806853T4

TR201806853T4 - Bir düzlemsel dalga kılavuzunun bir dış yüzeyini çok sayıda önceden belirlenmiş çizgi boyunca hedef numuneleri bağlayabilecek şekilde hazırlamak için usul ve bir düzlemsel dalga kılavuzu.

Info

Publication number: TR201806853T4
Application number: TR2018/06853T
Authority: TR
Inventors: Fattinger Christof
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2018-06-21
Also published as: BR112015016590A2; US20150338579A1; JP2016505140A; RU2015134553A; JP6358476B2; CN104937417B; CN104937417A; EP2946210A1; MX2015009053A; KR102216084B1; US9405069B2; KR20150105473A; ES2671951T3; EP2946210B1; HK1211698A1; EP2757374A1; PL2946210T3; BR112015016590B1; RU2674696C2; CA2897890C

Abstract

Bu buluşa göre, düzlemsel dalga kılavuzunun (1) dış yüzeyinin (11), çok sayıda önceden belirlenmiş çizgi (4) boyunca hedef numuneleri bağlamak üzere hazırlanmasına yönelik bir usul sağlanmaktadır. Bu usul aşağıdaki aşamaları içerir. Bir bağlayıcı molekülün bir baş grubunun dış yüzeye eklenmesi için uyarlanmış bir dış yüzeye sahip bir düzlemsel dalga kılavuzu sağlama. Bağlayıcı moleküllerin en az bir adet çokluğunu sıralı olarak dış yüzeye uygulama. Bağlayıcı moleküllerin en az bir adet çokluğundan her çokluk, bağlayıcı moleküllerden meydana gelen ayrı bir katman oluşturmak üzere birleşir, ve ayrı ayrı katmanlar, düzlemsel dalga kılavuzunun dış yüzeyinden başlayarak birbirinin üstünde oluşur.

Description

TARIFNAME BIR DÜZLEMSEL DALGA KILAVUZUNUN BIR DIS YÜZEYINI ÇOK SAYIDA ÖNCEDEN BELIRLENMIS ÇIZGI BOYUNCA HEDEF NUMUNELERI BAGLAYABILECEK SEKILDE HAZIRLAMAK IÇIN USUL VE BIR DÜZLEMSEL DALGA KILAVUZU Açiklama Mevcut bulus, bir düzlemsel dalga kilavuzunun bir dis yüzeyinin, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca hedef numuneleri baglayabilecek sekilde hazirlanmasina yönelik bir usulle ilgilidir.

Dalga kilavuzlariyla ilgili olmayan uzak teknik alanlarda, nanoyapilarin dogal titanyum gibi metal yüzeyler üzerinde modellenmesi bilinmektedir (örnegin, "Getachew Tizazu ve digerleri, Large area nanopatteming of alkylphosphonate self-assembled monolayers on titanium oxide surfaces by interferometric photo-lithography", Nanoscale, 2011, 3, 2511, 23 Mart .

Metaller genel olarak düzlemsel bir dalga kilavuzu olusturmak için uygun degildir. Metal yüzeylerin hazirlanmasi, düzlemsel bir dalga kilavuzunun bir dis yüzeyinin hazirlanmasi konusunda bir ipucu saglamaz. Özel olarak dogal titanyum, düzlemsel bir dalga kilavuzunda kullanilmaya uygun bir malzeme degildir.

Mevcut bulusun uygulama alani, baglanma olaylarinin saptanmasidir. Iyi bilinen aygitlar, eksitasyon üzerine floresan isigi yapma kabiliyetine sahip etiketlerin kullanimi yoluyla, bir yakalama molekülü ile, bir hedef numunenin baglanma olaylarini saptar. Örnegin, hedef numunelerin etiketlenmesi için etiketler olarak floresan etiketler kullanilabilir. Eksitasyon üzerine, floresan etiketlerin karakteristik bir emisyon spektrumuna sahip floresan isigi yaymasi saglanir. Belirli bir noktada bu karakteristik emisyon spektrumunun saptanmasi, etiketlenmis hedef molekülün, düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyindeki ilgili belirli noktada mevcut belirli tipteki yakalama molekülüne baglanmis oldugunu gösterir. 6945] Weinheim, Almanya) baslikli makalede, etiketlenmis hedef numunelerin saptanmasi için bir sensör açiklanmaktadir.

Al 'den bilinmektedir.

Baglanina olaylarinin optik saptanmasi için yeni bir aygit, yakalama moleküllerinde hedef numunelerin mevcudiyetini dogrudan saptama yoluyla etiket ihtiyacini ortadan kaldirmak için avantajli bir yöntem saglamaktadir. Bu aygit, esevreli isigin, düzlemsel dalga kilavuzunun bir dis yüzey boyunca yayilan azalan esevreli isik dalga alani ile düzlemsel dalga kilavuzundan yayilacagi sekilde, isigin bir optik bagdastirici tarafindan bagdastirildigi bir düzlemsel dalga kilavuzu içerir. Düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyi, azalan dalga alaninin isiginin, hedef numuneler tarafindan çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen hedef nuinuneler tarafindan saçilacagi sekilde, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca hedef numuneleri baglama kabiliyetine sahip olmak üzere hazirlanir. Saçilan isik, hedef numunelerden çikan bindirilmis saçilan isiktan gelen saptanabilir bir sinyale katkida bulunmak üzere, önceden belirlenmis bir saptaina konumunda yapici biçimde girisime yol açar.

Bu yeni aygit, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen hedef numunelerde saçilan esevreli isigin bindirilmesi yoluyla yüksek bir saptama hassasiyeti elde eder; bu fiziksel olgu, "difraksiyon" olarak ifade edilir. Saçilan isik, örnegin önceden belirlenmis bir saptama konumunda, siddette bir maksimuma kadar yapici biçimde girisime yol açtigindan, çok sayidaki önceden belirlenmis çizginin çizgileri, farkli çizgilerdeki hedef numunelerde saçilan isigin, önceden belirlenmis saptama konumunda, düzlemsel dalga kilavuzundan yayilan isigin dalga boyunun bir tamsayi kati kadar optik yol uzunlugunda bir farka sahip olacagi sekilde düzenlenir. Önceden belirlenmis saptama konumu, yapici girisimin gereklerini karsilamak üzere çok sayida önceden belirlenmis çizgiye göre düzenlenecektir. Diger örneklerde, isik, düzlemsel dalga kilavuzundaki önceden belirlenmis yönlerde girisime yol açmak üzere, çok sayida önceden belirlenmis çizgide saptirilir.

Dolayisiyla bu bulusun bir amaci, bir düzlemsel dalga kilavuzunun bir dis yüzeyinin, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca hedef numuneleri baglayabilecek sekilde hazirlanmasi için bir usul saglamaktir.

Bu bulusa uygun usulün avantajli düzenlemeleri, ilgili bagimli istemlerin konusudur.

Bu bulusa göre, bir düzlemsel dalga kilavuzunun bir dis yüzeyinin, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca hedef numuneleri baglayabilecek sekilde hazirlanmasi için bir usul saglanmaktadir. Önceden belirlenmis çizgiler, önceden belirlenmis bir saptama konumunda, düzlemsel dalga kilavuzundan yayilan esevreli isigin dalga boyunun bir tamsayi kati olan optik yol uzunlugunda bir farkla yapici olarak girisime yol açmak için, çalisma sirasinda, düzlemsel dalga kilavuzuna bagdastirilan ve içinden yayilan esevreli isigin bir azalan dalga alaninin, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen hedef numunelerde saçilacagi sekilde düzenlenir, ya da önceden belirlenmis çizgiler, düzlemsel dalga kilavuzu içindeki önceden belirlenmis yönlerde girisime yol açmak için, çalisma sirasinda, düzlemsel dalga kilavuzuna bagdastirilan ve içinden yayilan esevreli isigin azalan dalga alaninin, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen hedef numunelerde saçilacagi sekilde düzenlenir. Bu usul asagidaki asamalari Bir baglayici molekülün bir bas grubunun dis yüzeye eklenmesi için uyarlanmis bir dis yüzeye sahip bir düzlemsel dalga kilavuzu saglanir.

Bundan sonra, baglayici moleküllerin en az bir adet çoklugu sirali olarak dis yüzeye uygulanir. Baglayici moleküllerin en az bir adet çoklugundan her çokluk, baglayici moleküllerden meydana gelen ayri bir katman olusturmak üzere birlesmekte olup, ayri ayri katmanlar, düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyinden baslayarak birbirinin üstünde olusur. Her baglayici molekül, en az bir adet fonksiyonel grup, ve düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyine, veya esdegerli bir bag olusumu yoluyla baglayici moleküllerin önceki katmaninin fonksiyonel gruplarina eklenme kabiliyetine sahip olan ya da elektrostatik etkilesim vasitasiyla emilen bir bas grubu içerir. En üstteki katmanin çok sayida baglayici moleküllerinin fonksiyonel gruplari, söz konusu isiga karsi dayaniksiz koruma grubu tarafindan korunan her fonksiyonel grubun, bir diger molekülün tamamlayici fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip olmayacagi sekilde, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina eklenir.

Daha sonra, bu fonksiyonel gruplari, bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip hale getirmek üzere, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen en üstteki katmanin bu isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari, fonksiyonel gruplardan isiga maruz birakilan isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini çikarmak için önceden belirlenmis bir dalga boyunda isiga maruz birakilir.

Sonuç olarak, isiga maruz birakilan isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin fonksiyonel gruplardan çikarilmasi, bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip bu fonksiyonel gruplarin geometrik konumlarini tanimlar. Fonksiyonel gruplarin konumlari, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi olacak sekilde seçilir. Giris kisminda açiklandigi gibi, bu çizgilerde hedef numunelerde saçilan esevreli isik, önceden belirlenmis bir saptama konumunda yapici biçimde girisime yol açar. Teknik açidan tercih edilen, yan yana çizgiler arasinda azalan bir mesafeye sahip çok sayida önceden belirlenmis egimli çizgi üzerindeki düzenlemedir. Yan yana çizgiler arasinda azalan bir mesafeye sahip egimli çizgilerin düzenlenmesi, saptirilan isigin önceden belirlenmis bir saptama konumuna odaklanmasina imkan verir. Çok sayidaki önceden belirlenmis egimli çizginin düzenlenmesi, baska ayri odaklar saglayacak sekilde (örnegin, sonraki çok sayida önceden belirlenmis çizginin her birinin, önceki çok sayida önceden belirlenmis çizgiye göre döndürülmesi yoluyla), bir dizi çok sayida önceden belirlenmis çizginin birbiri üzerinde tekrar tekrar düzenlenmesini kapsar. Çok sayida önceden belirlenmis çizgi dizilerinin her biri, farkli bir kimyasal, biyolojik veya farmasötik karakteristige sahip olabilir. Alternatif olarak, düzlemsel dalga kilavuzunun, saptirilan isigin düzlemsel dalga kilavuzu içinde önceden belirlenmis yönlerde girisime yol açtigi düzleniinin içinde isigi saptirmak üzere, düz çizgiler üzerindeki düzenleine tercih edilir. Çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakilmasi, çesitli fotolitografik usullerle (örnegin, temas modu veya uzak alan fotolitografisi) tamamen (ideal olarak, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin tümü çikarilir) veya kismen (isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin önceden belirlenmis bir bölümü çikarilir; örnegin %10, %20) yerine getirilebilir, ancak tercihen, fotolitografik maskenin dalga kilavuzuna temasinin olmadigi, ancak maske ile dalga kilavuzunun dis yüzeyi arasinda küçük bir bosluk olusturdugu yakin alan fotolitografisiyle gerçeklestirilir (uygun biçimde, dalga kilavuzunun dis yüzeyine eklenmis baglayici moleküllerdeki isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakilmasi sirasinda bir siviyla doldurulabilen baglayici inoleküllerin isiga maruz birakilmis isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari). Fotolitografîk usullerde isiga maruz birakina, John A. Rogers ve digerleri (Generating -90 nanometer features using near-Ileld contact-mode photophoto-lithography with an elastomeric phase mask, J. Vac. Sci. Technol. B 16(1), Ocak/Subat 1998, sayfa 59 ve sonrasi) kapsaminda detayli olarak açiklandigi sekilde, yakin alan temas modu fotolitografisi için bir elastomerik faz maskesi gibi fotolitografik olarak üretilmis araçlarin kullanimini kapsar.

Baglayici moleküllerin en az bir adet çoklugunun ardisik uygulamasi, asagida daha detayli olarak açiklanan iki adet tercih edilen örnegi kapsar. Bir varyantta, baglayici moleküllerin bir adet çoklugu, tek bir ayri katman halinde birlesen düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyine dogrudan uygulanir. Bir diger varyantta, baglayici moleküllerin bir birinci çoklugu dis yüzeye uygulanir ve daha sonra, biri digerinin üstünde olmak üzere sadece iki ayri katman halinde birlesecekleri sekilde, buraya baglayici moleküllerin ikinci bir çoklugu uygulanir. Her örnekte, baglayici moleküllerin en üstteki katmaninda birlesen baglayici moleküllerin fonksiyonel gruplari, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina baglanir. Bu, baglayici moleküllerin en üstteki çoklugunun uygulanmasindan önce veya sonra gerçeklestirilebilir. En üstteki katman, veya bir baska ifadeyle en distaki katman, en üstteki katmanin fotolitografik olarak dogrudan içinden aydinlatilabilecegi sekilde bir fotolitografik maskenin düzenlenmesine imkan verir.

Mevcut basvurunun amaci kapsaminda "moleküller", çok çesitli anlamlari kapsar, ancak prensip olarak, kimyasal baglarla birbirine baglanan iki veya daha çok atomun birlesmesidir. Atomlarin türü ve sayisi sinirlandirilmis olmayip, burada moleküller terimi açik bir sekilde iki ve daha çok molekülün bilesiinini kapsamaktadir. Molekül terimi, spesifik tipte moleküller arasi ve molekül içi baglanmalarin yani sira, spesifik kimyasal, farmasötik veya fiziksel karakteristiklerle sinirli degildir. Özel olarak, makromoleküller ve molekül birlesmeleri, açikça terime dahil edilmektedir (örnegin, polimerler, oligonükleotitler, nükleik asitler, proteinler, lipozomlar ve peptitler). Prensip olarak molekül terimi, herhangi bir sentetik veya dogal stabil poliatomik birlesme anlamina gelir.

Bu bulusun kapsami içinde, kimyasal baglarin, bu alandaki uzinanlarca bilindigi gibi, iyonik etkilesim, hidrofobik etkilesim, kompleks olusumu, hidrojen baglanmasi, fluoroz faz olusumu ve benzerleri gibi moleküler etkilesimlerin herhangi bir baska stabil spesifik birlesmesiyle degistirilebildigi anlasilacaktir.

Mevcut basvurunun amaci kapsaminda "fonksiyonel gruplar", spesifik bir parça veya molekülün, özellikle bir baska molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunun baglanabildigi parçalar (molekül bölümleri) veya moleküllerdir (biyomoleküller dahil). Örnegin, bir baglayici molekül en az bir adet fonksiyonel grup içerir. Fonksiyonel gruplarin örnekleri, amino-, karboksilik asit-, karboksilik asit ester, tiyoester, hidroksil-, merkapto-, boronik asit-, alkin-, azid0-, siklooktin-, maleinimid0-, iyodaseti1-, aldehit-, ket0-, hidroksilamino-, siyan0-, epoksi-, sülfonik asit gruplari gibi olagan fonksiyonel gruplardir. Diger örnekler, bir visinal diol, bir aromatik orto dialdehit veya bir alfa merkapto amino alkan (örnegin bir N terminal Sistein) gibi bisfonksiyonel gruplar ve nitrilotriasetik asit (NTA) ya da Ni2+, tek Zincirli bir DNA, streptavidin, biyotin, bir reseptör veya onun ligandi ile poli-histidin Olusturucu stabil kompleksler gibi bir organik veya peptidik metal selat adsorbandir. Fonksiyonel gruplarin diger örnekleri, bir etiket ile tamamlayici bir "etiket" arasinda esdegerli bir bag olusturmak üzere enzimler tarafindan taninan "etiketler"dir. Örnekler, Snap etiketi, Clip etiketi ve Sortase etiketidir. Çok sayidaki baglayici molekülün birçok fonksiyonel grubunun ve bir diger molekülün tamamlayici fonksiyonel gruplarinin çoklu etkilesimleri de dahil edilmektedir. Çoklu etkilesimler esdegerli bir sekilde ve esdegerli olmayan bir sekilde olabilir ve ayrica hidrofobik etkilesimi de kapsar; yani fonksiyonel grup terimi, diger molekülün hidrofobik varliklariyla etkilesime girme kabiliyetine sahip hidrofobik parçalari da kapsar.

Bu nedenle, fonksiyonel gruplarin ve tamamlayici fonksiyonel gruplarin, bir diger molekülün hareketsiz hale getirilmesine yol açan her tür etkilesimi dahil edilmektedir. açisindan, yakalama molekülü, modifiye edilmis yakalama molekülü ya da baglayici moleküllerin uygulanan diger çoklugunun bir bas grubunu içeren bir baglayici moleküldür.

Tamamlayici bir fonksiyonel grup, baglayici moleküllerin bir fonksiyonel grubuyla reaksiyona veya etkilesime girine kabiliyetine sahiptir.

Mevcut basvurunun amaci açisindan bir "tamamlayici fonksiyonel grup", spesifik bir parça veya molekülün baglanabildigi bir parça (bir molekülün bir bölümü), bir molekül veya bir biyomoleküldür. Örnegin, bir diger molekülün tamamlayici fonksiyonel grubu, bir baglayici molekülün bir bas grubunun yani sira, önceki katinanin bir baglayici grubunun fonksiyonel grubuna baglanma kabiliyetine sahip bir yakalama molekülünün bir bölümüdür. Örnegin, tamamlayici tek Zincirli DNA, ortogonal eslestirme kimyasini gerçeklestirmek üzere hidrojen baglanmasi yoluyla bir çift sarmal olusturabilir. Bir baska seçenek, protein ligand etkilesimlerinin kullanimi yoluyla esdegerli olmayan stabil bir bag olusturmaktir. Tamamlayici fonksiyonel gruplarin örnekleri, NH2-, COOH-, OH-, SH-, sülfonik asit gibi olagan fonksiyonel grup, nitrilotriasetik asit (NTA) gibi bir organik veya peptidik metal selat adsorban ya da Ni2+, tek Zincirli bir DNA, streptavidin, biyotin, bir reseptör veya onun ligandi ile poli-histidin Olusturucu stabil komplekslerdir. Genel olarak, tamamlayici fonksiyonel gruplar, fonksiyonel gruplarin belirtilen örneklerinin tamamlayici fonksiyonel gruplar için de geçerli olacagi sekilde, fonksiyonel grupla ayni türde olabilir. baglanabildigi herhangi bir türde farmasötik, biyolojik veya kiinyasal moleküler hedeftir. Örnegin biyolojik reseptörler, proteinler, lipozomlar, nanoreaktörler. Genel olarak bir bir numunedeki bir hedef moleküldür.

Mevcut basvurunun amaci açisindan "baglanma" ve "baglanma olayi", her tür moleküler tanimayi, ve her tür yakalama molekülü veya onun bir baglayici bölgesi ile her tür hedef numune arasindaki her tür moleküler etkilesimi kapsar. Bu, iki veya daha çok baglanma ortaginin gerçek baglanmasinin yani sira, biyomoleküler etkilesim ortaklarinin (bir kanal proteinine sahip tar lipo) birikimini içerir. (örnegin, baglayici molekülün veya yakalama molekülünün bas grubu), düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyine, ya da esdegerli bir bag olusumu yoluyla, ya da van der Waals veya elektrostatik veya iyonik etkilesiinler ya da hidrojen baglanmalari veya fluoroz faz olusumu vasitasiyla kimyasal emme veya fiziksel emme yoluyla bir baglayici molekülün fonksiyonel grubuna eklendigi her tür kimyasal veya fiziksel eklenme (veya eslesme) ile ilgilidir. Genel olarak, bir adet baglanma ortaginin bir diger baglanma ortagina baglanacagi sekilde her tür kimyasal eklenme dahildir. Bu, her iki kimyasal ortagin, uygun biçimde eklenmis her molekülün uygun baglanma nitelikleriyle ilgili herhangi bir ön kosul olmadan birbirine eklendigi seklinde anlasilacaktir. Örnegin fonksiyonel grup, yakalama molekülünün fonksiyonel gruba eklenmesine esit biçimde yakalama molekülüne eklenir, ya da her ikisi de birbirine eklenir.

Saglanan düzlemsel dalga kilavuzu, baglayici moleküllerin bas grubunun eklenebildigi bir malzemedendir. Mevcut bulus için uygun dalga kilavuzu malzemeleri, dalga kilavuzlugu Özelliklerine sahip düzgün optik filmlerin hazirlanmasi için ince film çöktürme teknolojilerinin temin edilebildigi Ta205, TiOz, Nb205 veya Si3N4 gibi yüksek kirilma indeksine sahip malzemelerdir. Bir optik ag bagdastiricisinin olusturuldugu cam ve polimer alt tabakalarda yüksek kirilma indeksli dalga kilavuzlari için etkin bir üretim islemi, "Fattinger ve digerleri, Bidiffractive grating coupler: Universal transducer for Eylül 1995) kapsaminda detayli olarak açiklanmaktadir. Düzlemsel dalga kilavuzu, en azindan bir adedinin yüksek kirilma indeksli oldugni birden çok katman içerebilir. Saglanan düzlemsel dalga kilavuzu, düzlemsel dalga kilavuzunun üst tarafini olusturan dis yüzeydeki ortama göre yüksek bir kirilma indeksine sahiptir. Örnegin, düzlemsel dalga kilavuzunun kirilma indeksi 1.7 ila 2.8 araliginda olabilirken, düzlemsel dalga kilavuzunun yüzeyindeki ortamin kirilma indeksi, tipik olarak su veya sulu deney tamponu için 1 ila 1.5, özellikle 1.33 - 1.4 araligindadir ve hava için l'dir. Esevreli isik, dalga kilavuzunun dis yüzeyinde azalan bir dalga alani ile yayilacak sekilde, bir optik bagdastiricinin içinden düzlemsel dalga kilavuzuna bagdastirilir. Dis yüzeyden disari sizan azalan dalga alani, dalga kilavuzunun dis yüzeyinde çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca bagli hedef numunelerde saptirilir. Dalga kilavuzu filminin kalinligi tercihen 60 ila 200 nm araligindadir. Azalan dalga alaninin, dalga kilavuzunun dis yüzeyindeki ortama penetrasyon derinligi tercihen 150 nm'den azdir.

Bu usulün birinci varyantinda, yukarida açiklanan baglayici moleküllerin en az bir adet çoklugunu art arda uygulama asamasi, baglayici moleküllerinin sadece iki adet çoklugunun uygulanmasini içerir. Baglayici moleküllerin iki adet çoklugu, baglayici moleküllerin iki ayri katmanini olusturmak üzere, düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyinden baslayarak üst üste birlesir.

Birinci varyantin bir özelligine göre, bu usul ayrica asagidaki asamalari içerir. Yakalama moleküllerinin tamamlayici fonksiyonel gruplari, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen baglayici moleküllerin en üstteki katmaninin fonksiyonel gruplarina eklenir. Her yakalama molekülü, bir hedef numuneyi baglama kabiliyetine sahiptir. Daha sonra, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari, bu fonksiyonel gruplari, söz konusu bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip hale getirmek için, fonksiyonel gruplardan isiga maruz birakilmis isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini çikarmak için önceden belirlenmis dalga boyunda isiga maruz birakilir. Daha sonra, modifiye edilmis yakalama moleküllerinin tamamlayici fonksiyonel gruplari, çok sayidaki önceden belirlenmis çizginin arasinda düzenlenen fonksiyonel gruplara eklenir. Modifiye edilmis her yakalama molekülü, birinci yakalama moleküllerinin baglanma kabiliyetine sahip olduklari hedef numuneye baglanma kabiliyetine sahip degildir. Çok sayidaki önceden belirlenmis çizginin arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakilmasi (ikinci maruz birakma), gölgeli bölgeler olmadan, geri kalan isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin düzenlendigi tüm katman boyunca gerçeklestirilir. Gerçekte, çok sayidaki önceden belirlenmis çizginin arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari, sadece, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin birinci fotolitografik maruz birakilmasindan sonra geri kalan isiga karsi dayaniksiz koruma gruplaridir.

Modifiye edilmis yakalama molekülleri, esevreli isigin, yakalama inoleküllerine kiyasla benzer sekilde saçildigi moleküllerdir. Avantajli biçimde, yakalama moleküllerinden ve modifiye edilmis yakalama moleküllerinden saçilan isik, önceden belirlenmis bir saptama konumunda yikici biçimde girisime yol açmak üzere, eslesen genliklere ve optik yol uzunlugunda bir farka sahiptir. Bu nedenle, önceden belirlenmis saptama konumundaki minimum sinyal, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin çikarildigi fonksiyonel gruplarin miktariyla baglantili olan ilgili maruz kalma süresinin degistirilmesi yoluyla ayarlanabilir. Hedef numunelerin uygulanmasindan sonra, saptama konumundaki sinyalin degisimi esas olarak yakalama moleküllerine bagli hedef` numuneden kaynaklandigi sürece, minimum sinyal avantajlidir. Böylece hedef numunenin saptama konumundaki sinyale katkisi, hedef nuinuneler olmadan yakalama moleküllerinden gelen sinyale kiyasla, yani tek basina yakalama moleküllerinde saçilan isiga kiyasla artar. Yakalama molekülleri veya modifiye edilmis yakalama molekülleri, batirma, daldirma, isaretleme, baski veya bir akiskan aygitinin kullanimi yoluyla dalga kilavuzunun dis yüzeyine uygulanir.

Bu usulün ikinci varyantinda, yukarida açiklanan baglayici moleküllerin en az bir adet çoklugunu art arda uygulama asainasi, baglayici moleküllerin sadece bir adet çoklugunun uygulanmasini içerir.

Ikinci varyantin bir özelligine göre, usul ayrica bir diger çok sayida baglayici molekülün bas gruplarini, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen baglayici moleküllerin önceki katmaninin fonksiyonel gruplarina ekleme asamasini içerir. Diger çok sayidaki baglayici molekülün baglayici moleküllerinin fonksiyonel gruplari, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina bagli degildir ve bir diger molekülün bir tamamlayici fonksiyonunu ekleme kabiliyetine sahiptir. Diger çok sayidaki baglayici molekülden baglayici moleküller, esneklik, hidrofiliklik, minimum spesifik olmayan baglanma ve yakalama moleküllerinin düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyinde hareketsiz hale getirilmesi için optimum uzunluk gibi farkli karakteristikler saglainak üzere, önceki katmanin baglayici molekülünden farklidir. Bu asamadan sonra, diger çok sayidaki baglayici molekülden baglayici molekülleri ve diger çok sayidaki baglayici molekülüne bagli yakalama molekülleri, sadece çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenir.

Ikinci varyantin bir baska özelligine göre, bu usul ayrica asagidaki asamalari içerir.

Yakalama moleküllerinin tamamlayici fonksiyonel gruplari, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen diger çok sayidaki baglayici molekülün baglayici moleküllerinin fonksiyonel gruplarina eklenir. (Bu, baglayici moleküllerin yakalama molekülleriyle birlikte uygulanmasi vasitasiyla gerçeklestirilebilir.) Daha sonra, bu fonksiyonel gruplari, bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip hale getirmek üzere, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari, fonksiyonel gruplardan isiga maruz birakilmis isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini çikarmak için önceden belirlenmis dalga boyunda isiga maruz birakilir. Bundan sonra, bir diger çok sayida baglayici molekülün tamamlayici fonksiyonel gruplari (bas gruplari), çok sayidaki Önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen baglayici moleküllerin önceki katmaninin fonksiyonel gruplarina eklenir. Diger çok sayidaki baglayici molekülden baglayici moleküllerinin fonksiyonel gruplari, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina bagli degildir ve bir diger molekülün bir tamamlayici fonksiyonunu ekleme kabiliyetine sahiptir.

Daha sonra, modifiye edilmis yakalama inoleküllerinin tamamlayici fonksiyonel gruplari, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi arasinda düzenlenen diger çok sayidaki baglayici molekülden baglayici moleküllerinin fonksiyonel gruplarina eklenir.

Bu ikinci varyantta, özellikle önceden belirlenmis bir saptama konumundaki yakalama moleküllerinden ve modifiye edilmis yakalama moleküllerinden saçilan isigin yikici girisimi açisindan, birinci varyanttakiyle ayni avantajlar elde edilir. Diger çok sayidaki baglayici molekülün uygulanmasinin, yakalama moleküllerinin veya modifiye edilmis yakalama moleküllerinin uygulanmasiyla birlikte yürütülmesi avantajlidir. Bu, yakalama moleküllerinin ve modifiye edilmis yakalama moleküllerinin, diger yakalama molekülleri tarafindan kismen kapatilmis olarak uygulanabilinesi avantajini saglar. Bu sekilde baglayici moleküller, yakalama moleküllerinin gömüldügü gevsek biçimde istiflenmis bir matris (Örnegin, DEXTRAN veya poli(etilen glikol) (PEG) gibi bir polimer) saglayabilir.

Bunun avantajlari asagida detayli olarak ele alinmaktadir.

Bu bulusun bir özelligine göre, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini isiga maruz birakma asamasi, bir birinci maruz birakma dozu için gerçeklestirilir; daha sonra çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini isiga maruz birakma asamasi, ikinci bir maruz birakma dozu için gerçeklestirilir. Birinci maruz birakma dozu, ikinci maruz birakma dozundan farklidir. Genel olarak maruz birakma süresi, çok sayidaki baglayici molekülün fonksiyonel gruplarindan çikarilan isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin iniktariyla ilgilidir. Bu, yakalama molekülleri gibi bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip fonksiyonel gruplarin toplam sayisini belirler. Fonksiyonel gruplara bagli yakalama moleküllerinin sayisi, saptama konumunda saçilan isigin sinyalini belirler. Bu nedenle, birinci ve ikinci maruz birakma süresi, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen yakalama moleküllerinde saçilan isigin, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi arasinda düzenlenenlere kiyasla nispi katilimini belirler. Her ikisinin katiliminin yikici biçimde girisime yol açmasi nedeniyle, saptanan sinyal, iki maruz birakma süresinin bagimsiz olarak degistirilmesi yoluyla bir minimuma kadar ayarlanabilir.

Maksimum maruz birakma Süresi, önceden belirlenmis çizgilerin mesafesinin yarisindan daha az genislige sahip çizgiler boyunca isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini ayirmak üzere, 1 ile 10 `Jul/cm2 arasinda olacak sekilde seçilen bir maksimum maruz birakma enerjisi dozuna tekabül eder. Tercihen birinci maruz kalma dozu ve ikinci maruz kalma dozu 10 Jul/cmzden azdir; bu, yaklasik 390 nm dalga boyunda standart bir LED isik kaynagi kullanilirken, 60 saniyeden az veya daha tercihen 1 ile 10 saniye arasinda bir maruz kalma süresine yol açar. Bu maruz kalma dozunun, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin, yüksek verimde ve minimum yari reaksiyonlar içeren geçici biyokonjugat sentezi için diarilsülü'ir -NPPOC omurgali isikla bölünebilen baglayici moleküller olarak fonksiyonel gruplardan çikarilmasi için uygun oldugu gösterilmistir.

Yine bir baska örnekte, isinim üzerine triplet-triplet FRET enerji transferi vasitasiyla arzu edilen dalga boyunda isikla korumayi kaldirma asamasini gerçeklestirmek için, D. Wöll, S.

Walbert, K.-P. Stengele, T. Albert, T. Richmond, J. Norton, M. Singer, R. Green, W.

Pfleiderer, U.E. Steiner, Triplet-sensitized photodeprotection of oligonucleotides in isikla korumayi kaldirma isleminin hassaslastirilmasi yararli olabilir.

Avantajli bir özellikte, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini isiga maruz birakma asamasi, asagidaki asamalari içerir. Isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin yakinina bir faz maskesi yerlestirilir. Faz maskesi, bir birinci kirilma indeksine (ni) sahip çok sayida çikinti içerir. Birinci kirilma indeksi (nl) ikinci kirilma indeksinden (nz) farkli olmak üzere, faz maskesi ile düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyi arasinda ikinci bir kirilma indeksine (nz) sahip bir ortam düzenlenir. Çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakilmasi için, önceden belirlenmis dalga boyundaki isik, faz maskesinin içinden iletilir. uygun bir yüksek kirilma indeksli malzemeden yapilmis çok sayida çikinti içerir. Faz maskesi örnegin ikili bir difraktif faz maskesidir. Bu çikintilarin her biri, faz inaskesinin çikintilarindan yayilan isik için, faz maskesinin çikintilarin arasindaki sivi ortamdan yayilan isiga kiyasla it seviyesinde (yani dalga boyunun yarisi kadar) bir faz kaymasi saglayacak sekilde, önceden belirlenmis bir derinlige ve bitisik çikintilarla önceden belirlenmis bir mesafeye sahiptir. Faz maskesinden yayilan isigin ara yüzeyi, çikintilarin kenarlari boyunca minimum isik siddetine sahip bir girisim deseni olusturur. Bu nedenle, faz maskesinin arkasindaki girisim deseni, faz maskesindeki çikintilarin lokal periyodiklige kiyasla, periyodikligi ikiye katlanmis bir karanlik-aydinlik desendir. Çikintilarin genisligi ve formu, faz maskesi boyunca degisebilir. Fotolitografik aydinlatma, Suleski ve digerleri olarak açiklandigi gibi, holografik usulleri kapsar. Çok sayidaki önceden belirlenmis çizgiyi olusturmak (veya düzenlemek) için, yakin alan holografisi gibi holografik usullerin kullanilabilmesi nedeniyle, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen, hedef numunenin baglanabildigi baglayici bölgeleri ifade eden "mologram" terimi türetilmistir. Bir örnek olarak, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi, Mologram A olarak ifade edilebilirken, çok sayida önceden belirlenmis çizginin arasinda yer alan çizgiler Mologram B olarak ifade edilebilir. Yararli uygulamalarda, bir detektöre çarpan, Molograin A'da saptirilan isik, Mologram B'de saptirilan isiga kiyasla it (yani dalga boyunun yarisi) kadar faz kaymasina ugrar. Ilave olarak, faz maskesi, Pasi Laakkonen ve digerleri, "Coated phase mask for proximity printing of Bragg gratings" (Optics Communications kapsaminda detayli olarak açiklandigi gibi, girisim deseninin kalitesini arttirmak için kaplanabilir. Isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin maruz kaldigi isigi faz maskesinin içinden iletmek için kullanilan isik, örnegin 390 nm dalga boyundadir. Fonksiyonel gruplardan çikarilacak isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina bagli olarak, baska dalga boyu kullanimi gerekebilir. Isiga maruz birakmanin, dogrudan fotokimyasal eklenme (örnegin Benzofenon veya Arilazid veya Diazirin aracili fotoradikal ekleme reaksiyonlari ya da Tiyoksantonlar gibi radikal baslaticilarla hassaslastirma kullanilarak) için uygun olabildigi anlasilacaktir. Prensip olarak, çikintilarin boyutlarinin bu dalga boylarina göre seçilmeleri gerekir.

Bas gruplarin dis yüzeye eklendigi çok sayida baglayici molekülün, 0.5 nm ila 10 nm kalinliga sahip ayri bir katman olusturmak için birlesmeleri tercih edilmektedir. Birinci katmandaki baglayici moleküllerin ortalama yogunlugu, uygulanan diger moleküllerin, dalga kilavuzunun dis yüzeyine temasini önleyecek sekilde seçilir. Bu, örnegin, yakalama moleküllerinin ve uygulanan numunelerdeki diger moleküllerin, dalga kilavuzunun dis yüzeyine spesifik olmayan baglanmasini önlemek açisindan önemlidir.

Baglayici moleküllerin birinci katmani, dogrudan düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyine eklenir. Avantajli biçimde, birinci katman yüksek bir yogunluga ve az bir yükseklige sahiptir. Ideal olarak birinci katman, baska herhangi bir molekül tarafindan dis yüzeye temasin imkansiz olacagi sekilde, dis yüzeyi örter.

Avantajli bir özellikte, bas gruplarin, dalga kilavuzunun dis yüzeyine eklendigi çok sayida baglayici molekül, baglayici inoleküllerden olusan bir tek katman meydana getirmek üzere birlesir. Birinci katman dis yüzey üzerinde düzgün biçimde düzenlendiginde, saptama konumunda saptirilan isigin sinyalinin kalitesi artar; bu da dalga kilavuzunun dis yüzeyinde baglayici moleküllerde çok az, hatta bir arka plan isiginin saçilmasini saglar.

Birinci katmani olusturan çok sayidaki baglayici molekül, tercihen kendiliginden olusan bir tek katmandir (SAM). Bir SAM, fotolitografik isleme kabiliyetine sahip olacak sekilde, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini tasiyabilir.

SAM, bir düzenlemede, Alkanlar'iii, fonksiyonel gruplar olarak %10 ile %100 arasinda amino gruplari tasiyan bir karisimindan olusabilir; bu da, bu bulusa göre, arzu edilen foto modülasyona hazir SAM'yi meydana getirmek üzere, SAM'nin olusturulmasindan önce veya SAM'nin olusturulinasindan sonra bir fotoprotektif grup tarafindan modifiye edilebilir.

SAM, bir baska düzenlemede, Alkanlar'in, fonksiyonel gruplar olarak %10 ile %100 arasinda karboksi gruplari tasiyan bir karisimindan olusabilir; bu da, bu bulusa göre, arzu edilen foto modülasyona hazir SAM'yi meydana getirmek üzere, SAM'nin olusturulmasindan önce veya SAM'nin olusturulmasindan sonra bir fotoprotektif grup tarafindan modifiye edilebilir.

Bulusun bir diger özelliginde, bas grubun, baglayici moleküllerin önceki katmaninin fonksiyonel gruplarina eklendigi çok sayidaki baglayici molekül, 10 nm ila 200 nm kalinliga sahip olan en üstteki ayri katmani olusturmak üzere birlesir. Alan basina baglayici moleküllerin lokal ortalama yogunlugu, yakalama moleküllerinin içinden nüfuz etmesine veya içinde yakalama moleküllerinin kismen kapatilmasina imkan verecek sekilde düsük olarak seçilir. En üstteki katinanin, birinci katmanin inoleküllerine kiyasla uzun olan baglayici moleküller içermesi tercih edilir. En üstteki katman, hedef numunedeki moleküllerin yandan nüfuz etmesine imkan vermek üzere düsük bir uzaysal yogunluga sahip olmalidir. Bu baglayici moleküller, sekle uyum saglama kabiliyetine sahip olabilmeleri için esnek olabilir. Bu baglayici moleküller, avantajli bir örnekte, gevsek biçimde istiflenmis bir matris içerir (bir polisakarit, örnegin dekstran, karboksiinetilatli dekstran, karboksimetilatli hiyaluronik asit, hiyaluronik asit ve aljinik asit, veya polilaktik tarafindan açiklanan hidrofilik bir 3D-akrilat polimer ya da bir poli(etilen glikol) (PEG) gibi bir polimer veya tek Zincirli bir DNA oligonükleotit).

Polimerler ayrica, omurga modifikasyonlarinin iyonik gruplar, lipidler, peptitler, oligonükleotitlerden olusabildigi omurga modifikasyonlu polimer aglari meydana getirmek için modifiye edilebilir.

Bulusun bir diger özelliginde, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi, düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyinde en az iki ayri difraksiyon noktasinda düzenlenir. Her difraksiyon noktasi, 25 (um)2den genis bir alana sahiptir ((um)2 = umz). Çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi, yan yana çizgiler arasinda 1.5 pm*den az, özellikle 1 um'den az bir mesafeye sahiptir. Bu, üzerine saçilan isigin saptanmasi için, yeterli siddette bir sinyalin saptanmasini saglamak üzere minimum boyuta sahip difraksiyon noktalarini saglar. Çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi, yan yana çizgiler arasinda, difraksiyon noktalarinda saptirilan isikla belirlenen maksimum mesafeye sahiptir. Görünür isik kullanilmasi tercih edilir. Bu mesafe, yan yana çizgiler arasindaki mesafenin, düzlemsel dalga kilavuzundan yayilan isigin dalga boyunun bir kati olan önceden belirlenmis dalga boyunda harmonikler içerir.

Bu bulusun diger avantajli özellikleri, bulusun düzenlemelerinin ekteki çizimlere atitla açiklanmasi ile açikça görülecek olup, bu çizimlerde: Sekil 1'de, çok sayida önceden belirlenmis çizginin büyütülmüs bir detayi ve bir fotolitografik maskenin bir bölümü ile birlikte, bir düzlemsel dalga kilavuzunun bir düzenlemesi gösterilmektedir; Sekil 2'de, Sekil 1'de örneklendigi gibi bir düzlemsel dalga kilavuzunun bir bölümünün, ona uygulanan baglayici moleküllerin iki adet çoklugunu içeren bir yan görünümü gösterilmektedir; Sekil 3'te, diger çok sayidaki baglayici molekülün bir baglayici molekülünün bagli olmadigi fonksiyonel gruplarin deaktive edildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 2'nin düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 4'te, çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 3'ün düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 5'te, çok sayida yakalama molekülünün uygulandigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 4'ün düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 6'da, hiçbir yakalama molekülünün bagli olmadigi fonksiyonel gruplarin deaktive edildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 5'in düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 7'de, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 6'nin düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 8'de, çok sayida modifiye edilmis yakalama molekülünün uygulandigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 7'nin düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 9'da, hiçbir modifiye edilmis yakalama molekülünün bagli olmadigi fonksiyonel gruplarin deaktive edildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 8'in düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil lO'da, çok sayida hedef numunenin uygulandigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 9'un düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil ll'de, baglayici moleküllerin, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina sahip baglayici moleküllerin bir adet katmaninin uygulandigi bir asamayi ortaya koyan bir diger düzenlemeye göre baglayici moleküllerin düzenlendigi, Sekil 1'de ömeklendigi gibi bir düzlemsel dalga kilavuzunun bir yan gön'inümü gösterilmektedir; Sekil [2'de, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 11'in düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil l3'te, fonksiyonel gruplar vasitasiyla yakalama moleküllerine kismen baglanan diger çok sayida baglayici molekülün uygulandigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 12'nin düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmekte olup, diger çok sayidaki baglayici molekül, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenmistir; Sekil 14'te, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil l3'ün düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 15'te, fonksiyonel gruplar vasitasiyla modifiye edilmis yakalama moleküllerine kismen baglanan diger çok sayida baglayici molekülün uygulandigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 14'ün düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmekte olup, diger çok sayidaki baglayici molekül, çok sayidaki önceden belirlenmis çizginin arasinda düzenlenmistir; Sekil 16'da, baglayici moleküllerin baska baglayici molekülün bagli olmadigi birinci katmaninin geri kalan fonksiyonel gruplarinin ve baglayici moleküllerin baska yakalama molekülünün bagli olmadigi ikinci katmaninin geri kalan fonksiyonel gruplarinin deaktive edildigi ve baglayici moleküllerin, modifiye edilmis yakalama moleküllerinin bagli olmadigi ikinci katmaninin geri kalan fonksiyonel gruplarinin deaktive edildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 15'in düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 17'de, alternatif moleküler baglayicilarin ve alternatif yakalama moleküllerinin ortaya kondugu, moleküler baglayicilarin bulusun bir baska varyantina göre düzenlendigi bir düzlemsel dalga kilavuzunun bir yan görünümü gösterilmektedir; Sekil 18'de, bu bulusun, önceden belirlenmis çizgilerin üç adet çoklugunun tek bir difraksiyon noktasinda düzenlendigi bir baska özelligi gösterilmekte olup, her çokluk, farkli bir saptama konumunda saptirilan isigi odaklamaktadir; Sekil 19'da, Sekil 18'in, baglayici moleküllerin iki adet çoklugunun, düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyinde tüm bir difraksiyon noktasi boyunca uygulandigi düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmekte olup, en üstteki çokluk, isiga karsi dayaniksiz koruma gmplarini tasimaktadir; Sekil 20'de, önceden belirlenmis çizgilerin birinci çoklugu boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin kismen isiga maruz birakildigi bir asamayi ortaya koyan, Sekil 19'un düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 21'de, Sekil 20'nin, önceden belirlenmis çizgilerin üç adet kismen isiga maruz birakilmis çoklugunda düzenlenmek üzere sonradan üç tip tek Zincirli DNA'nin uygulandigi düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 22'de, Sekil 21'in, önceden belirlenmis çizgilerin üç farkli çoklugunda üç farkli tipte yakalama molekülünün düzenlendigi düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir; Sekil 23'te, bu bulusun, önceden belirlenmis çizgilerin iki adet çoklugunun tek bir difraksiyon noktasinda düzenlendigi bir baska özelligi gösterilmekte olup, her çokluk, ayri bir saptama konumunda saptirilan isigi odaklamaktadir; ve Sekil 24'te, önceki örneklere kiyasla farkli bir tipteki iki farkli tipte yakalama molekülünün, Sekil 23'ün önceden belirlenmis çizgilerinin iki farkli çoklugunda düzenlendigi düzlemsel dalga kilavuzu gösterilmektedir.

Sekil 1'de, baglayici moleküllerin bu bulusa göre düzenlenebildigi bir dis yüzeye (ll) sahip bir düzlemsel dalga kilavuzunun (1) bir örneginin perspektif bir görünümü gösterilmektedir. Yapisal olarak, düzlemsel dalga kilavuzu (1) bir alt tabakanin (gösterilmemistir) üst kisminda düzenlenir ve dis yüzeyde (ll) düzenlenmis 25 adet ayri difraksiyon noktasi (41) içerir. Çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) (gösterilen çizgilerin her biri, çok sayida çizgiyi temsil eder), bu difraksiyon noktalarinin (41) her birinde düzenlenir. Gösterilen örnekteki çizgiler (4) egimlidir, ancak bir baska varyantta düz olabilir. Mevcut örnekteki çizgiler (4), yan yana çizgiler (4) arasinda, saptanan sinyali arttirmak için soldan saga dogru (düzlemsel dalga kilavuzunun içinden yayilan isigin yönü) azalan bir mesafeye sahiptir. Alternatif olarak, çizgiler (4) esit mesafede düzenlenebilir veya önceden belirlenmis çizgilerin (4) farkli çokluklari, bahsedilen difraksiyon noktasinda (41) düzenlenebilir. Ayrica, esevreli isigi düzlemsel dalga kilavuzunun (1) içine (uygun sekilde disina) bagdastirmak için, düzlemsel dalga kilavuzunda (1) bir optik bagdastirici (12) ve bir ilave optik bagdastirici (13) düzenlenir. Her ikisi de, cam veya bir polimer malzemeden yapilmis bir alt tabakanin yüzeyinde olusturulabilir. Ilave optik bagdastirici (13), alternatif veya ilave olarak isik emici bir araç olabilir. Baglanma olaylarinin saptanmasi için, gösterilen düzlemsel dalga kilavuzunu (l) içeren bir aygitin çalisma prensibine göre, esevreli isik, dis yüzeyde (1 1) azalan bir dalga alaniyla yayilmak üzere, optik bagdastiricidan (12) düzlemsel dalga kilavuzuna (1) bagdastirilir. Esevreli isigin azalan dalga alani, saçilan esevreli isigin önceden belirlenmis bir saptama konumunda (gösterilmemistir) yapici olarak girisime yol açacagi sekilde, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca dis yüzey (1 1) üzerinde düzenlenmis moleküllerde (baglayici moleküller, yakalama molekülleri, hedef numuneler vs.) saçilir.

Gösterilen çember, siyah çizgiler (42) ve onlarin arasinda beyaz çizgiler (43) içeren bir noktada (41) düzenlenen çok sayidaki önceden belirlenmis çizgiden (4) birkaçinin büyütülmüs bir görünümünü saglamaktadir. Siyah çizgiler (42) boyunca, yakalama molekülleri, baglayici moleküllerin fonksiyonel gruplarinda düzenlenir. Yakalama molekülleri, bir hedef numuneyi baglama kabiliyetine sahiptir (aygitin boyutuna kiyasla küçük boyuttan dolayi, mevcut çizimde moleküller gösterilmemistir). Beyaz çizgiler (43), yakalama moleküllerinin baglama kabiliyetine sahip oldugu hedef numuneyi baglama kabiliyetine sahip olmayan modifiye edilmis yakalama moleküllerini içerir. Düzlemsel dalga kilavuzuna (l) bagdastirilmis bir esevreli isigin bir azalan dalga alani, gösterilen siyah çizgilerin (42) yani sira beyaz çizgilerde de (43) düzenlenmis moleküllerde saçilir.

Siyah çizgilerde (42) düzenlenmis moleküller tarafindan saçilan isik, içindeki siddette bir maksimuma kadar girisime yol açmak üzere, bir saptama konumuna (gösterilmemistir) göre bir birinci optik yol uzunluguna sahiptir. Siyah çizgilerin (42) arasindaki çok sayida beyaz çizgide (43) düzenlenmis moleküllerde saçilan esevreli isik, içindeki siddette bir maksimuma kadar girisime yol açmak üzere, saptama konumuna göre ikinci bir optik yol uzunluguna sahiptir. Her iki maksimum, genel siddette bir minimuma kadar yikici biçimde girisime yol açmak üzere, birbirine göre 7: seviyesinde bir faz kaymasina sahiptir. Bu, yakalama moleküllerine bagli hedef numuneler disinda saçilan isiktan gelen arka plan sinyalini en aza indirmeye imkan verir. Minimum sinyal, yakalama moleküllerinin ve modifiye edilmis yakalama moleküllerinin baglanabildigi ilgili fonksiyonel gruplarin korumalarini kaldirmak için maruz kalma süresini degistirme yoluyla düzenlenebilir.

Teorik olarak, siyah çizgilere (42) göre düzenlenen yakalama molekülleri ve beyaz çizgilere (43) göre düzenlenen modifiye edilmis yakalama molekülleri, bir hedef numune uygulanmadan önce, tek saptama konumunda, üzerine saçilan isigin genel arka plan sinyalini saglamaz.

Büyütülmüs görünümü saglayan dairenin üstünde, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin fotolitografik olarak aydinlatilmasini açiklamak için bir faz maskesinin (9) bir bölümü gösterilmektedir. Faz indeksli bir malzemeden yapilmis çok sayida çikinti (91) içerir. Çikintilarin (91) kalinligi (veya derinligi), önceden belirlenmis bir faz kaymasi saglamak üzere, çikintilarin (91) malzemesinin (örnegin, Tazûs) bir birinci kirilma indeksine (ni) ve faz maskesi (9) ile düzlemsel dalga kilavuzunun (l) dis yüzeyi (11) arasinda mevcut ortamin ikinci bir indeksine (112) mütekabil olarak seçilir. Ta205'in birinci kirilma indeksi (ni), 390 nm dalga boyunda ni = 2.246 degerine sahiptir. Kullanimda, faz maskesi (9), yakin alan aydinlatmasi vasitasiyla, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenmis isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini isiga maruz birakmak üzere, dis yüzeyin (11) yakininda çikintilarla (91) düzenlenir. Isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini içeren baglayici moleküller (nispeten küçük boyuttan dolayi gösterilmemistir), dis yüzey (11) ile faz maskesi (9) arasindaki boslugu dolduracak sekilde, bir solüsyon (örnegin, %5 su içeren DMSO) içinde dis yüzeye (11) uygulanir. DMSO solüsyonunun ikinci kirilma indeksi ([12) asagidaki sekilde tahmin edilebilir. DMSO, 590 nm dalga boyunda nz = 1.477 seviyesinde bir kirilma indeksine sahiptir. 390 nm dalga boyu için hesaplanan kirilma indeksi, Kozma, varyanta göre, moleküler baglayicilar ve onlarin isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini uygulamak için bir solüsyon olarak N-Metil-2-pirolidon (NMP) kullanilabilir. Faz maskesi (9), çikintilardan (91) yayilan isik için, faz maskesi (9) ile dis yüzey (11) arasindaki ortamdan yayilan isiga kiyasla bir faz kaymasina neden olur. Girisim, faz maskesinin (9) desenine kiyasla frekansi ikiye katlanmis bir karanlik-aydinlik desen meydana getirir. Çikintilarin (91) yüksekligi, Ta olacagi sekilde seçilir. Çikintilarin (91) genisligi, noktanin (41) içinde, örnegin isigin düzlemsel dalga kilavuzunun (1) içinden yayilma yönü boyunca degisebilir. Çikintilarin (91) genisligi tercihen düzlemsel dalga kilavuzunun (1) dis yüzeyinde (l 1) önceden belirlenmis çizgilerin(4; 42, 43) mesafesine esit veya yakin olarak seçilir. Isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin fotolitografik aydinlatmasi, faz maskesinin (9) bunun yakininda düzenlenmesi ve siyah çizgiler (42) boyunca düzenlenmis isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin, faz maskesinden (9) iletilen isikla aydinlatilmasi yoluyla gerçeklestirilir. Faz maskesinden (9) isiga maruz birakma, birinci maruz birakma süresi boyunca yürütülür. Çok sayida siyah çizgi (42) arasindaki beyaz çizgiler (43) boyunca düzenlenmis bu isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin ikinci maruz birakilmasi, faz maskesi (9) olmadan gerçeklestirilir.

Siyah çizgilerin (42) üstündeki gösterilen kalin profil (61) ve beyaz çizgilerin (43) altindaki noktali profil (62), faz maskesinden (9) iletilen isigin yakin alanindaki isik siddeti profilini (veya girisim desenini) temsil eder.

Her iki profil ayrica, baglayici moleküllerin uygun sekilde isiga maruz birakilmis fonksiyonel gruplarina bagli yakalama moleküllerinin veya korumasi kaldirilmis fonksiyonel gruplarin (siyah çizgiler (42)) ve modifiye edilmis yakalama moleküllerinin (beyaz çizgiler (43)) lokal ortalama yogunlugunu temsil edecek sekilde yorumlanabilir.

Yukarida ayrica söz edilen ideal durumda, siyah çizgilerin (42) üstünde düzenlenen yakalama moleküllerinde ve ayrica beyaz çizgiler (43) boyunca siyah çizgilerin (42) arasinda düzenlenen modifiye edilmis yakalama moleküllerinde saçilan isik, saptama konumunda minimum (ideal olarak sifir) arka plan sinyaline katkida bulunur. Bu, teorik olarak, yakalama moleküllerinin ve modifiye edilmis yakalama moleküllerinin özdes lokal ortalama yogunluklariyla elde edilir. Siyah çizgiler (42) ile beyaz çizgiler (43) arasindaki keskin kenarlar, siyah ve beyaz çizgiler arasindaki sinüsoidal geçisi yaklasik olarak ortaya koyar (sekille ilgili kosullar nedeniyle, gölgelendirilmis çizim gösterilmemistir, ancak daha gerçekçi olacaktir). Prensip olarak, yakalama moleküllerinin lokal yogunlugu, faz maskesinden (9) yakin alan aydinlatmasinin sinüsoidal siddet profilinden kaynaklanir.

Bundan sonra, bu usulün, her ikisi de bulusun gerçeklestirilmesini saglayan bir birinci düzenlemesi ve bir ikinci düzenlemesi gösterilmektedir. Her iki düzenlemede de, Sekil `1'de ömeklendirildigi gibi bir düzlemsel dalga kilavuzu kullanilmaktadir. Bu düzenlemelerde, fotolitografik asama ayni sekilde, ancak farkli asamalarda yürütülür. Uygulamada, bu isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakilmasi, fotolitografik maske kullanilarak, sadece bir kez gerçeklestirilir. Fotolitografik maskenin tekrar hizalanmasi zordur ve pratik degildir, dolayisiyla ikinci maruz birakma, geri kalan isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin, bir maske kullanilmadan gerçeklestirilen bir maruz birakma islemidir.

Asagidaki Sekil 2 ila Sekil 10'da, bu bulusa uygun usulün birinci düzenlemesi açiklanmaktadir.

Sekil 2'de, çok sayida baglayici inolekülün (2) ve sonradan, iki ayri katman halinde birlesmek üzere bir düzlemsel dalga kilavuzunun (1) bir dis yüzeyinden (11) baslayarak uygulanan bir diger çok sayidaki baglayici molekülün (5) uygulanmasi gösterilmektedir. Çok sayidaki baglayici inolekülden (2) baglayici moleküller (2), kendiliginden olusan tek katman (SAM) meydana getirmek üzere dis yüzey (11) üzerinde dogrudan birlesir. Bu baglayici moleküller (2), dis yüzeye (l 1) eklenmek için bir bas grup (21) (örnegin, -(P03)2` fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip bir fonksiyonel grup (22) içerir. Geçis metali oksitlerinde (örnegin Ta205, T102, Nb205) kendiliginden olusan tek katmanin (SAM) meydana gelmesi için uygun baglayici moleküller (2), örnegin NH2 uçlu kendiliginden olusan molekül amino-dodesil-fosfonat (NHz-(CH2)12-(P03)H2), COOH uçlu kendiliginden olusan molekül karboksi-pentadesilfosfat (COOH-(CH2)15-(PO4)H2) veya OH uçlu kendiliginden olusan molekül hidroksi-dodesil-fosfat amonyum tuzudur (OH- (CH2)12-(PO4)(NH4)2). (Samuele Guido Pio Tosatti: FUNCTIONALIZED TITANIUM SURFACES FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS: PHYSICO-CHEMICA CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL IN VITRO EVALUATION, DISS. ETH NO. 15095 ile karsilastiriniz). Fonksiyonel grup (22); siradan bir fonksiyonel grup, bir organik veya peptidik metal selat adsorban, tek Zincirli bir DNA, bir protein reseptörü veya onun ligandi olabilir. Ilave molekül, spesifik tipte moleküllerle sinirli degildir, ancak gösterilen durumda, tamamlayici bir fonksiyonel grupla (bas grup) (51) (örnegin, sonradan uygulanan çok sayidaki baglayici molekülden (5) baglayici moleküllerin (5) bir karboksili gibi siradan bir fonksiyonel grup) fonksiyonel hale getirilen, gevsek biçimde istiflenmis bir matristir (örnegin, dekstran veya poli (etilen glikol) (PEG) gibi polimer). Ayrica, sonradan uygulanan çok sayidaki baglayici molekülden (5) baglayici moleküller (5), önceden uygulanmis katmanin fonksiyonel gruplarina (22) eklenme kabiliyetine sahip bas gruplari (51) içerir. Fonksiyonel gruplar (52), bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahiptir. Fonksiyonel gruplar (52), gösterilen durumda, isiga karsi dayaniksiz bir koruma grubu (3) ile korunmaktadir. Isiga karsi dayaniksiz koruma grubu (3), bir yakalama molekülü gibi bir baska molekülün hiçbir tamamlayici fonksiyonel grubunun baglanamayacagi sekilde, fonksiyonel grubu (52) korur. Dolayisiyla, fonksiyonel gruplar (52), amino- , merkapt0-, hidroksil, karboksilat grubu gibi isiga karsi dayaniksiz bir koruma grubu tarafindan korunabilen fonksiyonel gruplarla sinirlidir.

Sekil 3'te, diger çok sayidaki baglayici molekülün (5) bir bas grubunun (51) baglanmis olmadigi çok sayidaki baglayici molekülün (2) fonksiyonel gruplari (22), örnegin, tamamlayici bir fonksiyonel grup içeren bir diger molekülle reaksiyona veya etkilesime girme kabiliyetine sahip herhangi bir fonksiyonel grup içermeyen bir diger molekülle reaksiyona sokularak deaktive edilir. Deaktive edilen fonksiyonel gruplar (221), ayrica bir baglanma kabiliyetine sahip degildir.

Sekil 4'te, çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen diger çok sayidaki baglayici molekülün (5) fonksiyonel gruplarina (52) bagli isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari (3) isiga maruz birakilir ve fonksiyonel gruplardan (52) çikarilir. Bu nedenle, çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen fonksiyonel gruplar (52), yakalama molekülü gibi bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahiptir, ve çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda düzenlenen fonksiyonel gruplar (52), isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) tasir. Isiga maruz birakma, bir faz maskesi vasitasiyla, Sekil 1 için açiklandigi gibi fotolitografik olarak gerçeklestirilebilir. Gösterilen tek çizgi (4), bu isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin (3) isiga maruz birakildiklari çok sayidaki önceden belirlenmis çizgiden (4) bir adet çizgiyi örneklemektedir.

Teorik olarak, usulün bu asamasinda, baglanma olaylarinin saptanmasi için kullanilabilen bir düzlemsel dalga kilavuzu saglanmaktadir. (Örnegin, uygulanan bir hedef numunenin, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen çok sayidaki baglayici molekülün fonksiyonel gruplarina dogrudan baglanmasi halinde).

Sekil 5'te, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen fonksiyonel gruplara (52) çok sayida yakalama molekülü (6) uygulanmaktadir. Genel olarak bu tip bir yakalama molekülü (6), eszamanli olarak moleküler baglayicinin (5) fonksiyonel grubuna (52) ve arastirilacak bir nuinunedeki bir hedef moleküle (Sekil 10'da gösterilmektedir) baglanma kabiliyetine sahip herhangi bir moleküldür. Gösterilen yakalama molekülleri (6), bir numunedeki hedef molekülü baglamak için iki baglayici bölgeye sahip bir proteini temsil eder. Baglayici moleküller (5), baglayici moleküller arasinda yakalama molekülleriyle (6) doldurulabilen boslukla birlikte, gevsek biçimde istiflenebilir. Bu durumda yakalama molekülleri (6) tercihen gevsek biçimde istiflenmis çok sayidaki baglayici moleküle (5) gömülür. Avantajli biçimde, bu tip gevsek biçimde istiflenmis çok sayida baglayici molekül (5), yakalama molekülüyle (6) ve uygulanan numunedeki moleküllerle spesifik olmayan bir etkilesime sahip olmayan veya minimum seviyede sahip olan, gevsek biçimde istiflenmis bir matris (örnegin, DEXTRAN veya poli(etilen glikol) (PEG) gibi bir polimer) içerir.

Her baglayici molekül (5), baglayici molekül (5) boyunca düzenlenmis birkaç (yani iki veya daha çok) fonksiyonel grup (52) tasiyabilir. Bu bulusa uygun usulün birinci düzenlemesinin bu varyantinda, baglayici moleküller (5) boyunca düzenlenmis tüm fonksiyonel gruplar (52), koruma gruplarinin birinci isiga maruz birakma yoluyla fonksiyonel gruplardan (52) çikarilinasindan önce, isiga karsi dayaniksiz bir koruma grubu ile korunur.

Sekil 6'da, hiçbir yakalama molekülünün (6) bagli olmadigi diger çok sayida baglayici molekülün (5) fonksiyonel gruplari (52) deaktive edilmektedir. Deaktive edilen fonksiyonel gruplar (521), ayrica bir baglanma kabiliyetine sahip degildir.

Bu, baglanma olaylarinin saptanmasi için kullanilabilen bir düzlemsel dalga kilavuzu saglar. Bir hedef numune, önceden belirlenmis bir saptama konumunda bir maksimuma kadar girisime yol açacak sekilde üzerine esevreli isik yaymak için çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzenlenen yakalama molekülleri tarafindan saglanmis baglayici bölgelere baglanabilir. Bununla birlikte, uygulamada, karsilastirilabilir ölçüde güçlü bir arka plan sinyali, tek basina yakalama molekülleri tarafindan (yani yakalama molekülüne bir hedef numune bagli olinadan) saçilan isikla saptaina konumunun sinyaline katkida bulunur. Saptaina sinyaline kiyasla arka plan sinyalini azaltma imkani, asagida gösterilmektedir.

Sekil 7'de, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari, isiga maruz birakma yoluyla çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda düzenlenen diger çok sayidaki baglayici molekülün (5) fonksiyonel grubundan (52) çikarilir. Geri kalan isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin, birinci maruz birakmada olusan çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda olusturulan çok sayida önceden belirlenmis çizgi boyunca düzgün bir sekilde düzenlenmeleri nedeniyle, bu ikinci maruz birakma (birinci maruz birakma, faz maskesinin içinden gerçeklestirilir), fotolitografik bir maskeye ihtiyaç duymaz.

Sekil 8'de, çok sayida önceden belirlenmis çizginin (4) arasinda düzenlenen diger çok sayidaki baglayici molekülün (5) fonksiyonel gruplarina (52) çok sayida modifiye edilmis yakalama molekülü (7) uygulanmaktadir. Modifiye edilmis yakalama molekülleri (7), mevcut örnekte mutasyona ugratilmis bir proteindir. Genel olarak, modifiye edilmis yakalama molekülleri (7), yapisal olarak yakalama moleküllerine (6) benzer ve yakalama moleküllerinin (6) baglama kabiliyetine sahip oldugu bir numunede (gösterilineinistir) bir hedef molekülü baglama kabiliyetine sahip olmamak üzere mutasyon yoluyla veya kimyasal olarak modifiye edilmistir. Bir baska ifadeyle, modifiye edilmis yakalama molekülleri (7), yakalama moleküllerine (6) kiyasla benzer sekilde esevreli isik saçtiklari halde, bir hedef molekülü baglayabilen bir baglayici bölgeye sahip degildir.

Sekil 9'da, hiçbir modifiye edilmis yakalama molekülünün (7) bagli olmadigi çok sayida baglayici inolekülün (5) fonksiyonel gruplari (52) deaktive edilmektedir. Deaktive edilen fonksiyonel gruplar (52), ayrica bir baglanma kabiliyetine sahip degildir.

Bu, baglanma olaylarinin saptanmasinda kullanilabilen bir düzlemsel dalga kilavuzu meydana getirir. Bu tip bir düzlemsel dalga kilavuzunun amaci, yukarida açiklandigi gibi, yakalama moleküllerinin yani sira modifiye edilmis yakalama moleküllerinden saçilan isigin katkisinin, minimum bir sinyale yikici biçimde girisime yol açmasidir. Avantajli bir sekilde minimum sinyal, saptama konumundaki arka plan sinyalini en aza indirmek üzere, maruz kalma süresinin ve sonuç olarak korumasi kaldirilmis fonksiyonel gruplara eklenen yakalama moleküllerinin veya modifiye edilmis yakalama moleküllerinin sayisinin degismesine bagli olarak düzenlenir.

Sekil IO'da, bir numunedeki çok sayida hedef molekülün (8), çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen yakalama moleküllerine (6) uygulanmasi gösterilmektedir. Görülebildigi gibi, hedef numuneler (8) sadece, yakalama moleküllerine (6) baglanir. Modifiye edilmis yakalama molekülleri (7), hedef numuneyi (8) baglama kabiliyetine sahip degildir. Bu nedenle, modifiye edilmis yakalama moleküllerinde (7) saçilan isiga göre, yakalama moleküllerinde (6) saçilan isigin katilimlarinin ayarlanmasiyla, saptama konumundaki (gösterilmemistir) isik en aza indirilmistir.

Avantajli bir sekilde, hedef numunelerin (8) uygulanmasindan sonra, saptama konumunda saptanan isigin degisimleri, hedef numunelerin (8) yakalama moleküllerine (6) gerçek baglanmasindan kaynaklanir.

Esevreli isigin, sadece, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) (Sekil 1'in siyah çizgilerine (42) tekabül eder) boyunca düzenlenen yakalama molekülleri (6) tarafindan saçilmayip, ayrica modifiye edilmis yakalama molekülleri (7) (Sekil 1'in beyaz çizgilerine (43) tekabül eder) tarafindan da saçilmasi açisindan, baglanma olaylarinin saptanmasi avantajlidir. Yakalama molekülleri (6) ile modifiye edilmis yakalama molekülleri (7) arasindaki mesafenin, esevreli isigin dalga boyunun yarisi (veya dalga boyunun bir kati arti dalga boyunun yarisi) olacak sekilde seçilmesinden dolayi, saçilan isik, teorik olarak bir minimuma kadar bir saptama konumunda girisime yol açar. Uygulamada, saptama konumunda yakalama moleküllerinden (6) ve modifiye edilmis yakalama moleküllerinden (7) katilim, sifir isiga kadar girisime yol açmaz, aksine bir miktar arka plan isigi mevcut olacaktir. Hedef numunenin baglanmasi, minimum arka plan sinyaline göre karsilastirilabilir sekilde büyük olan söz konusu minimum sinyalde bir degisiklige yol açacaktir.

Asagidaki Sekil 11 ila Sekil 16'da, bu bulusa uygun usulün yerine getirilmesine yönelik bir baska yöntemi tarif etmek üzere ikinci düzenleme açiklanmaktadir.

Sekil ll'de, düzlemsel dalga kilavuzunun (l) dis yüzeyine (l 1) bas gruplarla (21) bitismek için çok sayida baglayici molekül (2) uygulanmaktadir. Çok sayida baglayici molekül (2), isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari (3) tarafindan korunan fonksiyonel gruplar (örtülü olmalari nedeniyle gösterilmemistir) içerir. Ikinci düzenleme, birinci asamada isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) tasiyan tek bir baglayici molekül (2) çoklugunun (sadece SAM) uygulanmasi açisindan, birinci düzenlemeye göre farklidir.

Sekil l2'de, çok sayida Önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruina gruplari (3) isiga maruz birakilir ve çikarilir. Çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca isiga maruz birakina, fotolitografik olarak gerçeklestirilir. Bu nedenle, baglayici moleküllerin (2) korumasi kaldirilmis fonksiyonel gruplari (22), çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenir.

Sekil 13'te, baglayici moleküllerin (5) fonksiyonel gruplarina (52) baglanmis çok sayida yakalama molekülü (6), çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca birlikte (birbirine eklenmis olarak) uygulanir. Yakalama molekülünün (6) tamamlayici fonksiyonel grubu, yakalama molekülünün (5) fonksiyonel grubuna (52) eklenir ve her ikisi, bas grubu (51) vasitasiyla, birlikte fonksiyonel gruba (22) eklenir. Bu, tercih edilen örneklerde, bir hedef numunenin (gösterilmemistir) yakalama molekülleri (6) tarafindan saglanan baglayici bölgelere baglanmasina izin verirken, yakalama moleküllerini (6) kismen söz konusu baglayici moleküllerin (5) içinde kapatmaya da imkan verir (örnegin, baglayici moleküller (5), gevsek biçimde istiflenmis bir matris (örnegin, dekstran veya poli(etilen glikol) (PEG) gibi bir polimer) olusturur).

Sekil l4'te, çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplari, önceden belirlenmis dalga boyunda isiga maruz birakilir (ikinci maruz birakma, fotolitografik maske kullanilmadan). Korumasi kaldirilan fonksiyonel gruplar (22), modifiye edilmis yakalama molekülleri gibi diger moleküllerin tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahiptir. Minimum arka plan sinyali, ikinci düzenlemede, birinci düzenleme için açiklanana benzer sekilde gerçeklestirilir (bakiniz, Sekil 7).

Sekil l5'te, baglayici moleküllerin (5) fonksiyonel gruplarina (52) eklenen (baglanan) çok sayida modifiye edilmis yakalama molekülü (7), çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda düzenlenen fonksiyonel gruplara (22) uygulanir (Sekil 13'e benzer biçimde).

Sekil l6'da, hiçbir modifiye edilmis yakalama molekülünün baglanmadigi fonksiyonel gruplar (521) ve bir yakalama molekülünün hiçbir bas grubunun baglanmadigi fonksiyonel gruplar (221) deaktive edilir. Bu, Sekil 10'da açiklandigi gibi kullanilmak üzere hazirlanmis bir düzlemsel dalga kilavuzu saglar.

Sekil 17'de, bu bulusun, alternatif bas gruplarinin (511) yani sira alternatif fonksiyonel gruplara (522) sahip alternatif moleküler baglayicilarin kullanildigi bir baska varyanti gösterilmektedir. Membran benzeri üst yapilar (örnegin, veziküller veya lipozomlar) (61) ve modifiye edilmis membran benzeri üst yapilar (örnegin, modifiye edilmis veziküller veya modifiye edilmis lipozomlar) (71), alternatif fonksiyonel gruplarda (522) düzenlenir.

Birlestirilmis veya yeniden olusturulmus bir membran tasiina proteinine (611) (tasiyici veya kanal) sahip membran benzeri üst yapi (61), kisitlanmis bir yakalama molekülünü temsil eder. Birlestirilmis veya yeniden olusturulmus bir modifiye edilmis membran tasima proteinine (711) (modifiye edilmis tasiyici veya modifiye edilmis kanal) sahip modifiye edilmis membran benzeri üst yapilar (71), modifiye edilmis bir kisitlanmis yakalama molekülünü temsil eder. Sekil 10 ve Sekil 17'ye tekabül eden membran benzeri üst yapilar (61) ve modifiye edilmis membran benzeri üst yapilar (71), sirasiyla çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca ve çok sayida önceden belirlenmis çizginin (4) arasinda düzenlenir. Bir hedef` numune (81), kisitlanmis yakalama molekülünde yakalanabilir (membran benzeri üst yapilarda yakalanabilir). Bu sekilde, yakalama molekülü terimi, sadece bir hedef numunenin baglanabildigi veya baglanamadigi ayri ayri birkaç baglayici bölge saglama kapsaminda görülemez; bir membran tasima proteini vasitasiyla bir hedef numuneyi yakalamak için de gayet uygundur. Bu, bir hedef nuinuneyi (81) bütünüyle saptamak üzere, yakalanan hedef numuneleri (811) bir süre boyunca biriktirmek için bir usul saglar.

Sekil 18'de bulusun bir diger özelligi gösterilmektedir. Önceden belirlenmis çizgilerin üç adet çoklugu (401, 402, 403), bir düzlemsel dalga kilavuzu üzerindeki bir adet difraksiyon olarak girisime yol açmak üzere, bir optik bagdastirici (12) vasitasiyla düzlemsel dalga kilavuzuna bagdastirilan isigin, önceden belirlenmis çizgilerin (401, 402, 403) her çoklugunda saptirilacagi sekilde düzenlenir. Önceden belirlenmis çizgilerin üç adet çoklugunun (401, 402, 403) mevcut düzenlemesi, bir örnek olarak görülmelidir; ancak önceden belirlenmis çizgilerin (401, 402, 403) baska çesitli çokluklari da düzenlenebilir.

Ayni durum, gösterilen çizgilerin, mevcut örnekte, optik bagdastirici (12) vasitasiyla bagdastirilmis isigin, bir çizgi boyunca düzenlenmis üç farkli saptama konumunda (421, 422, 423) yapici olarak girisime yol açmak üzere seçilen geometrisi için de geçerlidir.

Birden çok saptama konumuna sahip difraksiyon noktasi (41), birden çok odakli bir mologram olarak gösterilir (veya bir molo grami temsil eder).

Asagida, her biri önceden belirlenmis çizgilerin (üç adedinden) farkli bir çoklugunda olmak üzere (üç) farkli tipteki yakalama moleküllerinin uygulanmasi için bir usul açiklanmaktadir. Bu düzenleme, islem kademelerinin saptanabilir olmasi açisindan avantajlidir. Örnegin bir hedef numune, birinci saptaina konumunda bir sinyal saglamak üzere birinci tip yakalama molekülünde ayri ürünler halinde bölünür. Daha sonra bu reaksiyonun bir birinci ürünü, ikinci saptama konumunda bir sinyal saglamak üzere ikinci tip yakalama moleküllerine baglanir. Reaksiyonun ikinci bir ürünü, üçüncü saptama konumunda bir sinyal saglamak üzere üçüncü tip yakalama molekülüne baglanir. Farkli tiplerdeki yakalama moleküllerinin, önceden belirlenmis çizgilerin farkli önceden belirlenmis çokluklarina eklenmesi, örnegin asagida açiklandigi gibi tek Zincirli DNA'larin kullanimiyla gerçeklestirilebilir (ortogonal kimya). Alternatif olarak, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakilmasi ve kaldirilmasi için farkli dalga boylarinin kullanildigi ortogonal fotokimya, difraksiyon noktasinda önceden belirlenmis çizgilerin önceden belirlenmis bir çoklugunda sadece önceden belirlenmis tipte bir yakalama molekülünün düzenlenmesini saglamak üzere yürütülebilir.

Sekil 19, üzerine baglayici moleküllerinin iki adet çoklugunun (2, 5) uygulandigi bir dis yüzeye (1 l) sahip bir düzleinsel dalga kilavuzudur (l). Baglayici moleküllerin en üstteki çoklugu (5), isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) tasir (Sekil 3 ile karsilastirilabilir).

Sekil 20'de, önceden belirlenmis çizgilerin bir birinci çoklugu (401) boyunca düzenlenmis isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin (3) kismen isiga maruz birakildigi bir asama gösterilmektedir. "Kismen maruz birakma", bu tip bir çizgi (401) boyunca sadece bazi isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin (3) çikarilmasidir. Bunlarin sayisi, bir birinci yakalama molekülünün çokluguna bagli hedef numuneler için saptirilmis isigin saptanabilir bir sinyalini saglamak için yeterince yüksektir. Bu sayi, önceden belirlenmis çizgilerin (402, 403) diger çokluklari boyunca, ayni difraksiyon noktasindaki diger çizgiler (402, 403) boyunca isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin diger çokluklarinin çikarilinasina yol açan ilave (kismi) maruz birakmalarin gerçeklestirilebilecegi kadar küçük olmalidir. Bu tip çizgiler (401, 402, 403) kesisebilir, ya da bir baska ifadeyle, bazi çok odakli bir mologramin muhtemel bir moleküler yapisi gösterilmektedir.

Sekil 21'de, önceden belirlenmis çizgilerin üç adet çoklugunda düzenlenmek üzere, sonradan Sekil 20'de açiklanan kismi maruz birakmanin tekrarlanmasi vasitasiyla uygulanan üç tip tek Zincirli DNA ( gösterilmektedir. Önceden belirlenmis çizgilerin farkli çokluklari, isigi farkli odaklarda (ayri saptama konumlarinda) saptirir. Önceden belirlenmis çizgilerin önceden belirlenmis bir çoklugunda sadece önceden belirlenmis tipte bir yakalama molekülünün düzenlenmesi için, tek Zincirli DNA, farkli yakalama moleküllerinin (6, 72, 73) seçici biçimde farkli tamamlayici tek Zincirli DNA'lara (631, 622, 623) baglanacagi sekilde ortogonal kimya gerçeklestirilmesine imkan farmasötik, biyolojik veya kimyasal reaksiyonlarin ayri ayri saptanmasina imkan verir.

Sekil 23'te bulusun bir diger özelligi gösterilmektedir. Önceden belirlenmis çizgilerin iki adet çoklugu (402, 403), bir düzlemsel dalga kilavuzu üzerindeki bir adet difraksiyon noktasinda (41) düzenlenir (Sekil 18`e benzer biçimde). Her çokluk, ayri ayri saptama konumlarinda (422, 423) yapici olarak girisime yol açmak üzere, bir optik bagdastirici (12) vasitasiyla düzlemsel dalga kilavuzuna bagdastirilan isigin, önceden belirlenmis çizgilerin (402, 403) her çoklugunda saptirilacagi sekilde düzenlenir.

Sekil 24, dis yüzeyin (ll), önceden belirlenmis çizgilerin (402, 403) iki çoklugunun çizgilerinin kesistigi bir alanini gösterilen Sekil 23'ün düzleinsel dalga kilavuzudur (1).

Farkli yakalama molekülleri (mevcut örnekte, hedef numune olarak uygulanan bir proteinin en az iki baglayici bölgesinden birine baglanma kabiliyetine sahip moleküller) düzenlenir; bu, ortogonal kimya ile gerçeklestirilebilir. Yukarida açiklandigi gibi, ortogonal kimya, ayni difraksiyon noktasinda önceden belirlenmis çizgilerin farkli çokluklarinda düzenlenmek üzere, farkli tiplerde yakalama moleküllerinin (75, 76) sabit hale getirilmesi için, örnegin farkli tek Zincirli DNA'lari (621, 622) ve mütekabil isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin isiga maruz birakilmasi için farkli dalga boylarinin kullanildigi ortogonal fotokimyadir. Her iki yakalama molekülüne (75, 76) baglanma kabiliyetine sahip bir protein olan bir hedef numune (81), çoklu bag etkilesimi vasitasiyla karsilikli olarak baglaninalar olusturabilir. Bu tip çoklu bag etkilesimi, her ikisinin birlesik dayanimi, hedef numunenin (81) yakalama molekülüne (75) baglanmasi ve hedef numunenin (81) yakalama molekülüne (76) baglanmasi nedeniyle yüksek bir dayanima sahiptir. Her iki baglanma eszamanli olarak veya hemen, kisa sürede olusabilir. Çoklu bag etkilesimleri, her iki saptama konumunda iliskilendirilmis sinyaller saglayan her iki saptama konumu vasitasiyla optik olarak saptanir. Bu, avantajli bir sekilde, zaman çözümlü bir saptama usulü kullanilarak gerçeklestirilebilir.

Claims

ISTEMLER

1. Bir düzlemsel dalga kilavuzunun (1) bir dis yüzeyinin (11), çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca hedef nuinuneleri baglayabilecek sekilde hazirlanmasina yönelik usul olup, önceden belirlenmis çizgiler (4), önceden belirlenmis bir saptaina konumunda, düzlemsel dalga kilavuzundan yayilan esevreli isigin dalga boyunun bir tamsayi kati olan optik yol uzunlugunda bir farkla yapici olarak girisime yol açmak için, çalisma sirasinda, düzlemsel dalga kilavuzuna (1) bagdastirilan ve içinden yayilan esevreli isigin bir azalan dalga alaninin, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen hedef nuinunelerde saçilacagi sekilde düzenlenir, ya da önceden belirlenmis çizgiler (4), düzlemsel dalga kilavuzu (1) içindeki önceden belirlenmis yönlerde girisime yol açmak için, çalisma sirasinda, düzlemsel dalga kilavuzuna (l) bagdastirilan ve içinden yayilan esevreli isigin azalan dalga alaninin, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen hedef numunelerde saçilacagi sekilde düzenlenir; bu usul asagidaki asamalari içerir: - bir baglayici inolekülün (2) dis yüzeye (11) eklenmesi için uyarlanmis bir dis yüzeye (l 1) sahip bir düzlemsel dalga kilavuzu (1) saglama; - baglayici moleküllerin (2, 5; 2) en az bir adet çoklugunu sirali olarak dis yüzeye (ll) uygulama; baglayici moleküllerin (2, 5; 2) en az bir adet çoklugundan her çokluk, baglayici moleküllerden (2, 5; 2) meydana gelen ayri bir katman olusturmak üzere birlesir ve ayri ayri katmanlar, düzlemsel dalga kilavuzunun (1) dis yüzeyinden (11) baslayarak birbirinin üstünde olusur; her baglayici molekül (2, (21, 51; 21), düzlemsel dalga kilavuzunun (1) dis yüzeyine (11) veya baglayici moleküllerin (2) önceki katmaninin fonksiyonel gruplarina (22) eklenme kabiliyetine sahiptir; ve burada en üstteki katmanin baglayici moleküllerinin (5; 2) fonksiyonel gruplari (52; 22), söz konusu isiga karsi dayaniksiz koruma grubuna (3) bagli en üstteki katmanin her fonksiyonel grubunun (52; 22), bir diger molekülün bir tamamlayici fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip olmayacagi sekilde, isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina (3) baglanir; ve - bu fonksiyonel gruplari (52; 22), bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip hale getirmek üzere, çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen en üstteki katmanin isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3), fonksiyonel gruplardan (52; 22) isiga maruz birakilan isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) çikarmak için önceden belirlenmis bir dalga boyunda isiga maruz birakma.

2. Istem l'e uygun usul olup, burada baglayici moleküllerin (2, 5) en az bir adet çoklugunu art arda uygulama asamasi, baglayici moleküllerinin (2, 5) sadece iki adet çoklugunun uygulanmasini içerir, ve baglayici moleküllerin (2, 5) iki adet çoklugu, baglayici moleküllerin (2, 5) iki ayri katmanini olusturmak üzere, düzlemsel dalga kilavuzunun (1) dis yüzeyinden (11) baslayarak üst üste birlesir.

3. Istem 1 veya 2'ye uygun usul olup, ayrica asagidaki asamalari içerir: - yakalama moleküllerinin (6) tamamlayici fonksiyonel gruplarini, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen baglayici moleküllerin en üstteki katmaninin fonksiyonel gruplarina (52) ekleme; her yakalama molekülü (6) bir hedef nuinuneyi (8) baglama kabiliyetine sahiptir; - bu fonksiyonel gruplari (52) bahsedilen bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip hale getirmek üzere, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3), fonksiyonel gruplardan (52) isiga maruz birakilmis isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) çikarmak için önceden belirlenmis dalga boyunda isiga maruz birakma; ve - modifiye edilmis yakalama moleküllerinin (7) tamamlayici fonksiyonel gruplarini, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda düzenlenen fonksiyonel gruplara (52) ekleme; her bir modifiye edilmis yakalama molekülü (7), yakalama moleküllerinin (6) baglama kabiliyetine sahip oldugu hedef numuneyi (8) baglama kabiliyetine sahip degildir.

4. Istem l'e uygun usul olup, burada baglayici moleküllerin (2) en az bir adet çoklugunu art arda uygulama asamasi, baglayici moleküllerin (2) sadece bir adet çoklugunun uygulanmasini içerir.

5. Istem 4'e uygun usul olup, ayrica bir diger çok sayida baglayici molekülün bas gruplarini, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen baglayici moleküllerin (2) önceki katinaninin fonksiyonel gruplarina (22) ekleme asamasini içerir; diger çok sayidaki baglayici molekülden (5) baglayici moleküllerinin (5) fonksiyonel gruplari (52), isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina (3) bagli degildir ve bir diger molekülün bir tamamlayici fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahiptir.

6. Istein 5'e uygun usul olup, ayrica asagidaki asamalari içerir: - yakalama moleküllerinin (6) tamamlayici fonksiyonel gruplarini, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen diger çok sayidaki baglayici molekülden (5) baglayici moleküllerin (5) fonksiyonel gruplarina (52) ekleme; - bu fonksiyonel gruplari (22) bir diger molekülün tamamlayici bir fonksiyonel grubunu ekleme kabiliyetine sahip hale getirmek üzere, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3), fonksiyonel gruplardan (22) isiga maruz birakilmis isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) çikartmak için önceden belirlenmis dalga boyunda isiga maruz birakma; - bir diger çok sayida baglayici inolekülün (5) tamamlayici fonksiyonel gruplarini, çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) arasinda düzenlenen baglayici moleküllerin (2) önceki katmaninin fonksiyonel gruplarina (22) ekleme; bir diger çok sayidaki baglayici molekülden (5) baglayici moleküllerin (5) fonksiyonel gruplari (52), isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarina (3) bagli degildir ve bahsedilen bir diger molekülün bir tamamlayici fonksiyonunu ekleme kabiliyetine sahiptir; ve - modifiye edilmis yakalama moleküllerinin (7) tamamlayici fonksiyonel gruplarini, çok sayidaki önceden belirlenmis çizginin (4) arasinda düzenlenen diger çok sayidaki baglayici molekülden (5) baglayici moleküllerin (5) fonksiyonel gruplarina (52) ekleme.

7. Istein 3 ila 6'dan herhangi birine uygun usul olup, burada çok sayida önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) isiga maruz birakma asamasi, bir birinci maruz birakma dozu için gerçeklestirilir; burada çok sayidaki önceden belirlenmis çizginin (4) arasinda düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) isiga maruz birakma asamasi, ikinci bir maruz birakma dozu için gerçeklestirilir; ve birinci maruz birakma dozu, ikinci maruz birakma dozundan farklidir.

8. Istem 7'ye uygun usul olup, burada birinci maruz birakma dozu ve ikinci maruz birakma dozu 10 J ul/cmzden düsüktür.

9. Önceki istemlerden herhangi birine uygun usul olup, burada çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarini (3) isiga maruz birakma asamasi, asagidaki asamalari içerir: - isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin (3) yakinina bir faz maskesi (9) yerlestirme, faz maskesi (9), bir birinci kirilma indeksine (nl) sahip çok sayida çikinti (91) içerir; ve birinci kirilma indeksi (ni) ikinci kirilma indeksinden (nz) farkli olmak üzere, faz maskesi (9) ile düzlemsel dalga kilavuzunun dis yüzeyi (11) arasinda ikinci bir kirilma indeksine (nz) sahip bir ortam düzenleme; ve - çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4) boyunca düzenlenen isiga karsi dayaniksiz koruma gruplarinin (3) isiga maruz birakilmasi için, önceden belirlenmis dalga boyundaki isigi faz maskesinin (9) içinden iletme.

10. Önceki istemlerden herhangi birine uygun usul olup, burada bas gruplarin (21) dis yüzeye (l 1) eklendigi çok sayida baglayici molekül (2), 0.5 nm ila 10 nm kalinliga sahip ayri bir katman meydana getirmek üzere birlesir.

11. Önceki istemlerden herhangi birine uygun usul olup, burada bas gruplarin (21) dis yüzeye (11) eklendigi çok sayida baglayici molekül (2), baglayici inoleküllerden (2) olusan bir tek katman meydana getirmek üzere birlesir.

12. Önceki istemlerden herhangi birine uygun usul olup, burada bas gruplarin (51) baglayici moleküllerin (2) önceki katmaninin fonksiyonel gruplarina (22) eklendigi çok sayidaki baglayici molekül (5), 10 nm ila 200 nm kalinliga sahip olan en üstteki ayri katmani meydana getirmek için birlesir.

13. Önceki istemlerden herhangi birine uygun usul olup, burada çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4), düzlemsel dalga kilavuzunun (1) dis yüzeyinde (11) en az iki ayri difraksiyon noktasinda (41) düzenlenir; her difraksiyon noktasi (41) 25 (um)2den genis bir alana sahiptir ve burada çok sayidaki önceden belirlenmis çizgi (4), yan yana çizgiler (4) arasinda 1.5 pm'den az bir mesafeye sahiptir.

14. Istem 13'e uygun usul olup, burada çok sayidaki önceden belirlenmis çizgiden (4) yan yana çizgiler (4) arasindaki mesafe I pm'den azdir.