KR102216084B1 - 복수의 소정 라인들을 따라 대상 샘플을 결합할 수 있도록 평판형 도파관의 외부 표면을 제조하기 위한 방법 및 평판형 도파관 - Google Patents

복수의 소정 라인들을 따라 대상 샘플을 결합할 수 있도록 평판형 도파관의 외부 표면을 제조하기 위한 방법 및 평판형 도파관 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르면, 복수의 소정 라인(4)들을 따라 대상 샘플들을 결합하기 위한 평판형 도파관(1)의 외면(11)을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다. 링커 분자(2)의 헤드 그룹(21)을 외면(11)에 부착하도록 적용된 외면(11)을 구비한 평판형 도파관(1)을 제공하는 단계. 적어도 하나의 복수의 링커 분자(2, 5)들을 외면(11)에 순차적으로 도포하는 단계. 적어도 하나의 복수의 링커 분자(2, 5)들 중 각자의 복수 개는 회합(assemble)하여 링커 분자(2, 5)들의 개별 층을 형성하며, 개별 층은 평판형 도파관(1)의 외면(11)에서부터 시작하여 각자의 위에 형성된다. 각자의 링커 분자(2, 5)는 작용기(22, 52) 및 평판형 도파관(1)의 외면(11)에 부착되거나 링커 분자(2)의 이전 층의 작용기(22)들에 부착될 수 있는 헤드 그룹(21, 51)을 포함한다. 최상위층의 복수의 링커 분자(5; 2)의 작용기(52)들은 광분해성 보호기(3)들에 결합됨으로써 상기 광분해성 보호기(3)에 결합된 각자의 작용기(52)는 추가 분자의 임의의 상보 작용기에 결합할 수 없다. 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 최상위층의 광분해성 보호기(3)들을 소정 파장의 광에 노출하여 노출된 광분해성 보호기(3)들을 작용기(52)들로부터 제거하여 이들 작용기(52)들이 추가 분자의 임의의 상보 작용기에 결합할 수 있도록 만드는 단계

Description

복수의 소정 라인들을 따라 대상 샘플을 결합할 수 있도록 평판형 도파관의 외부 표면을 제조하기 위한 방법 및 평판형 도파관{Method for preparing an outer surface of a planar waveguide to be capable of binding target samples along a plurality of predetermined lines and a planar waveguide}
본 발명은 각각의 독립항에 따른, 복수의 소정 라인들을 따라 대상 샘플을 결합할 수 있도록 평판형 도파관의 외부 표면을 제조하기 위한 방법 및 평판형 도파관에 관한 것이다.
도파관과 연관되지 않은 원격 기술 분야들에서, 천연 티타늄과 같은 금속 표면 상에 나노구조체를 패턴화하는 것이 공지되어 있다(예를 들어, "Large area nanopatterning of alkylphosphonate self-assembled monolayers on titanium oxide surfaces by interferometric photo-lithography"(Tizazu et al., Nanoscale, 2011, 3, 2511, http://pubs.rsc.org, doi:10.1039/C0NR00994F에 2011년 3월 23일 공개). 일반적으로 금속은 평판형 도파관의 형성에 적합하지 않다. 금속 표면의 제조는 평판형 도파관의 외부 표면의 제조에 대해서는 어떠한 암시도 제공하지 않는다. 특히, 천연 티타늄은 평판형 도파관 내의 사용에 적합한 재료가 아니다.
본 발명의 응용 분야는 결합 이벤트(binding event)의 검출에 관한 것이다. 공지된 장치들은 여기(excitation)되면 형광을 발광할 수 있는 표지(label)를 사용함으로써, 포획 분자(capture molecule)를 이용하여 대상 샘플의 결합 이벤트를 검출한다. 예를 들어, 대상 샘플을 표지화하기 위한 표지로서 형광 태그들이 사용될 수 있다. 여기되면 형광 태그들은 특성 발광 스펙트럼을 가진 형광을 발광하게 된다. 이러한 특성 발광 스펙트럼을 특정 부위(spot)에서 검출한다는 것은 표지화된 목표 분자가 평판형 도파관의 외부 표면상의 각각의 특정 부위에 존재하는 특정 유형의 포획 분자와 결합하였음을 나타낸다. 표지화된 대상 샘플의 검출을 위한 센서가 논문에 개시되어 있다(Zeptosens' protein microarrays: A novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis, Proteomics 2002, 2, S. 383-393, Wiley-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, Germany).
결합 이벤트의 광학적 검출을 위한 새로운 장치는 포획 분자에서 대상 샘플의 존재를 직접적으로 검출함으로써 표지에 대한 필요를 극복할 수 있는 장점을 제공한다. 이 장치는 평판형 도파관을 포함하며, 광학 커플러에 의해 내부로 광이 커플링됨으로써 평판형 도파관의 외부 표면을 따라 전파되는 간섭광(coherent light)의 소실장(evanescent field)을 이용하여 간섭광이 평판형 도파관을 관통하여 전파될 수 있다. 평판형 도파관의 외부 표면을 제조함에 있어서, 복수의 소정 라인들을 따라 대상 샘플들의 결합이 가능하게 함으로써 소실장의 광이 복수의 소정 라인들을 따라 배열된 대상 샘플들에 의해 산란되도록 제조한다. 산란된 광은 소정 검출 위치에서 보강간섭(constructively interfere)됨으로써 대상 샘플로부터의 중첩된 산란광에서의 검출가능한 신호에 기여한다.
이러한 새로운 장치는 복수의 소정 라인들을 따라 배열된 대상 샘플들에 산란된 간섭광의 중첩에 의해 높은 검출 강도를 달성하며, 이러한 물리적 현상을 "회절(diffraction)"이라 칭한다. 산란광은 예를 들어 소정 검출 위치에서 최대 강도까지 보강 간섭하며, 그 이유는 복수의 소정 라인들의 배열에 있어서, 소정 검출 위치에서 상이한 라인들 상에서 산란된 광이 평탄형 도파관을 관통하여 전파되는 광의 파장의 정수 배의 길이로 광 경로의 차이점을 갖도록 배열되기 때문이다. 소정 검출 위치는 보강간섭의 필수사항들을 만족할 수 있는 복수의 소정 라인들에 대하여 배열되어야 한다. 추가적 예들에서, 광은 복수의 소정 라인들에서 회절됨으로써 평판형 도파관에서 소정 방향들로 간섭할 수 있도록 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 복수의 소정 라인들을 따라 대상 샘플들을 결합할 수 있도록 평판형 도파관의 외부 표면을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 추가적 목적은 복수의 소정 라인들을 따라 대상 샘플들을 결합할 수 있도록 제조된 평판형 도파관의 외부 표면을 가진 평판형 도파관을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법의 유리한 실시예들은 각각의 독립항들에 따른다.
본 발명에 따르면, 복수의 소정 라인들을 따라 대상 샘플들을 결합할 수 있도록 평판형 도파관의 외부 표면을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다.
링커 분자의 헤드 그룹(head group)을 외면에 결합시키도록 적용된 외면을 가진 평판형 도파관을 제공하는 단계가 있다.
다음으로, 적어도 하나의 복수의 링커 분자들을 외면에 순차적으로 적용하는 단계가 있다. 적어도 하나의 복수의 링커 분자의 각자의 복수 개는 회합되어 링커 분자들의 개별 층들을 형성하며, 개별 층들은 평판형 도파관의 외면에서 시작하여 서로 위에 형성된다. 각자의 링커 분자는 적어도 하나의 작용기, 및 공유 결합의 형성을 통해 평판형 도파관의 외면 또는 링커 분자의 이전 층의 작용기들에 결합하거나 정전기 반응을 통해 흡수되는 헤드 그룹을 포함한다. 최상위층의 복수의 링커 분자들의 작용기들은 광분해성 보호기(photo-labile protecting group)에 결합됨으로써, 상기 광분해성 보호기에 의해 보호받는 각자의 작용기는 추가 분자의 상호 보완적 작용기에 결합할 수 없게 된다.
다음으로, 복수의 소정 라인들을 따라 배열된 최상위층의 이러한 광분해성 보호기를 소정 파장의 광에 노출시켜 작용기들로부터 노출된 광분해성 보호기들을 제거함으로써 이러한 작용기들이 추가의 분자의 상보 작용기에 결합할 수 있도록 하는 단계가 있다.
그 결과, 작용기들로부터 노출된 광분해성 보호기는 추가 분자의 상보 작용기에 결합할 수 있는 이러한 작용기들의 기하학적 위치를 규정(define)한다. 작용기들의 위치는 복수의 소정 라인들이 되도록 선택된다. 도입부에서 기술된 바와 같이, 이들 라인 상의 대상 샘플들에서 산란된 간섭광은 소정 검출 위치에서 보강간섭한다. 기술적으로 볼 때, 인접한 라인들 사이에 점차 감소하는 거리를 가진 복수의 소정의 곡선형 라인들 상의 배열이 바람직하다. 인접한 라인들 사이의 거리가 점차 감소하는 곡선형 라인들을 배열함으로써 소정 검출 위치 내로 회절광의 집속이 허용된다. 복수의 소정의 곡선형 라인들의 배열는 일련의 복수의 소정 라인들의 반복적 배열을 포함함으로써(예를 들어, 앞선 복수의 소정 라인들에 대해 다음의 각각의 복수의 소정 라인들을 약간 회전시킴으로써), 추가적인 별도의 집속이 없도록 한다. 이러한 일련의 복수의 소정 라인들 각각은 상이한 화학적, 생물학적 또는 약학적 특성을 가질 수 있다. 대안적으로, 평판형 도파관의 평면 내의 광을 회절시키고, 회절된 광이 평판형 도파관 내부의 소정 방향들로 간섭하도록 직선형 라인들 상에 배열하는 것이 바람직하다. 복수의 소정 라인을 따라 배열된 이러한 광분해성 보호기들의 노출은 다양한 포토리소그래피 방법(예를 들어, 접촉 모드 또는 원거리 포토리소그래피)를 이용하여 전체적으로(이상적으로는 모든 광분해성 보호기들이 제거됨) 또는 부분적으로(광분해성 보호기의 소정 부분이 제거됨, 예를 들어 10%, 20%) 수행될 수 있으나, 바람직하게는 주변장 포토리소그래피에 의해 수행되어 포토리소그래피 마스크가 도파관과 접촉하지 않으면서 다만 마스크와 도파관의 외면 사이에 작은 간격을 형성한다(링커 분자의 노출된 광분해성 보호기는 도파관의 외면에 부착된 링커 분자 상의 광분해성 보호기들의 노출 도중 액체로 채워질 수 있음). 포토리소그래피 방법의 노출은 포토리소그래피 방식으로 생산된 도구들, 예를 들어 주변장 접촉 모드 포토리소그래피용 탄성 중합체 위상 마스크와 같은 사용을 포함하며, 이는 Generating ∼90 nanometer features using near-field contact-mode photo-lithography with an elastomeric phase mask(John A. Rogers et al., J. Vac. Sci. Technol. B 16(1), Jan/Feb 1998, page 59 et seq.)에 상세히 기술된 바와 같다.
적어도 하나의 복수의 링커 분자의 순차적 도포는 이하 자세히 기술되는 두 개의 바람직한 실시예들을 포함한다. 하나의 변형예의 경우, 하나의 복수의 링커 분자가 평판형 도파관의 외면에 직접적으로 도포되고 단일 개별층으로 회합(assemble)한다. 다른 변형예의 경우, 제1 복수의 링커 분자가 외면으로 도포되고, 이어서 제2 복수의 링커 분자가 그곳으로 도포됨으로써 각자 위에 형성된 단지 두 개의 개별층으로 회합한다. 각자의 실시예에서, 링커 분자의 최상층에 모인 링커 분자들의 작용기가 광분해성 보호기에 결합된다. 이는 최상층의 복수의 링커 분자의 도포 이전 또는 이후에 이루어질 수 있다. 최상층, 또는 달리 말해 최외곽층(outermost layer)은 포토리소그래피 마스크의 배열을 허용함으로써 최상층은 직접적으로 관통하여 포토리소그래피 방식으로 조명될 수 있다.
본 발명의 문맥에 따라 "분자"는 넓은 의미를 포함하나, 원칙적으로는 화학 결합에 의해 함께 결합된 두 개 이상 원자의 결합을 나타낸다. 원자의 유형과 수는 한정되지 않으며, 분자라는 용어는 두 개 이상 분자의 합성을 명시적으로 포함한다. 분자라는 용어는 특정 유형의 분자 간의, 그리고 분자 내의 결합은 물론 특정한 화학, 약학 또는 물리학적 특성들에 한정되지 않는다. 특히, 거대분자 및 분자회합이 본 용어에 명시적으로 포함된다(예를 들어, 중합체, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 단백질, 리포솜 및 펩타이드). 원칙적으로, 분자라는 용어는 임의의 합성 또는 천연의 안정적인 다원자 결합을 나타낸다.
본 발명의 범위 내에서, 화학 결합이란 예를 들어, 이온성 상호작용, 소수성 상호작용, 복합체 형성, 수소 결합, 불소 상결합 등등의 해당 분야의 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 다른 안정적인 특정한 분자 상호작용의 회합에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 문맥에 따라 "작용기"는 특정 모이어티 또는 분자, 상세하게는 추가의 분자의 상보 작용기가 결합할 수 있는 모이어티(분자의 일부(sections of molecules)) 및 분자(생체 분자 포함)를 나타낸다. 예를 들어, 링커 분자는 적어도 하나의 작용기를 포함한다. 작용기의 예로는 보편적(ordinary) 작용기로서, 예를 들어, 아미노-, 카르복실산-, 카르복실산 에스테르, 티오에스테르, 하이드록실-, 메르캅토-, 보론산-, 알킨-, 아지도-, 시클로옥틴-, 말레인이미도-, 요오드아세틸-, 알데하이드-, 케토-, 하이드록실아미노-, 시아노-, 에폭시-, 술폰산 기들이 있다. 다른 예로는 이작용기들로서, 예를 들어, 인접 디올, 아로마틱 오쏘 디알데하이드 또는 알파 메르캅토 아미노 알칸(예를 들어, N 말단 시스테인) 및 유기 또는 펩타이드 금속 킬레이트 흡착제, 예를 들어, 니트릴로트리아세트산(NTA) 또는 Ni2 +와의 폴리-히스티딘 형성 안정 착물, 한 가닥 사슬 DNA, 스트렙타비딘, 비오틴, 수용체 또는 그 리간드가 있다. 작용기의 추가적 예로는 "태그(tag)"로서, 효소에 의해 인지되어 태그와 상보 "태그" 사이에 공유결합을 형성한다. 그 예로는 스냅(Snap) 태그, 클립(Clip) 태그 및 소타아제(Sortase) 태그가 있다.
복수의 링커 분자와 추가적 분자의 상보 작용기의 다중 상호작용이 또한 포함된다. 다중 상호작용은 공유결합이나 비공유결합일 수 있으며, 소수성 상호작용을 포함할 수 있으며, 이 의미는 작용기라는 용어에 추가 분자의 소수성 개체와 상호작용할 수 있는 소수성 모이어티가 또한 포함됨을 나타낸다.
따라서, 추가 분자의 고정화(immobilization)를 가져올 수 있는 작용기와 상보 작용기의 모든 종류의 상호작용이 포함된다.
본 발명의 문맥에서 "상보 작용기를 가진 추가 분자(further molecule having a complementary functional group)"라 함은 포착분자, 개질 포획 분자 또는 적용된 추가의 복수의 링커 분자의 헤드 그룹을 포함하는 링커 분자를 나타낸다. 상보 작용기는 링커 분자의 작용기와 반응 또는 상호작용할 수 있다.
본 발명의 문맥에서 "상보 작용기(complementary functional group)"라 함은 특정 모이어티 또는 분자가 결합할 수 있는 모이어티(분자의 일부), 분자 또는 생체 분자를 말한다. 예를 들어, 추가 분자의 상보 작용기는 링커 분자의 헤드 그룹은 물론 이전 층의 링커 분자의 작용기에 결합할 수 있는 포획 분자의 일부를 나타낸다. 예를 들어, 상보 한 가닥 DNA는 수소 결합에 의해 이중 나선 구조를 형성할 수 있으며, 따라서 직교 결합 화학반응(orthogonal coupling chemistry)를 수행할 수 있다. 다른 선택으로는 단백질 리간드 상호작용을 이용함으로써 안정적 비공유 결합을 형성하는 것이 있다. 상보 작용기의 예로는 보편적 작용기, 예를 들어, NH2-, COOH-, OH-, SH-, 술폰산, 유기 또는 펩타이드 금속 킬레이트 흡착제, 예를 들어, 니트릴로트리아세트산(NTA) 또는 Ni2 +와의 폴리-히스티딘 형성 안정 착물, 한 가닥 사슬 DNA, 스트렙타비딘, 비오틴, 수용체 또는 이의 리간드가 있다. 일반적으로, 상보 작용기는 작용기와 동일한 유형일 수 있으므로, 언급된 바 있는 작용기의 예들이 상보 작용기에 적용된다.
"포획 분자(capture molecules)"는 결합 이벤트의 검출을 위해 대상 샘플이 결합할 수 있는 약학, 생물학 또는 화학적 분자 대상이다. 예를 들어, 생물학적 수용체, 단백질, 리포좀, 나노반응기 등이다. 일반적으로, "대상 샘플(target sample)"이라 함은 결합 이벤트의 검출을 위해 포획 분자에 결합할 수 있는 샘플 내의 대상 분자이다.
본 발명의 문맥에서 "결합(bind)" 및 "결합 이벤트(binding event)"란 임의의 종류의 분자 인지(molecular recognition), 및 임의의 종류의 포획 분자 또는 그 결합 부위와 임의의 종류의 대상 샘플 사이의 임의의 종류의 분자 상호작용을 나타낸다. 이는 두 개 이상의 결합 파트너(binding partner)의 실제 결합은 물론 분자생물적 상호작용 파트너(채널 단백질을 가진 타르 리포(tar lipo))의 축적 또한 포함한다.
"부착(attach)"이란 용어는 결합(coupling)과 유사하게 사용되며 일반적으로 화학 또는 물리학적 부착(또는 결합)의 각자의 유형에 관련된 것이므로, 하나의 분자(예를 들어, 링커 분자 또는 포획 분자의 헤드 그룹)이 공유결합의 형성, 또는 반 데르 발스 또는 정전기 또는 이온 상호작용 또는 수소 결합 또는 불소 상 형성을 통한 화학 흡착 또는 물리 흡착을 통해 평판형 도파관의 외면 또는 링커 분자 작용기에 부착된다. 일반적으로, 각 유형의 화학적 부착은 하나의 결합 파트너가 추가의 바인딩 파트너에 결합하는 경우를 포함한다. 이는 양 화학적 파트너들이 각각의 부착된 분자 각각의 결합 능력에 대한 임의의 전제 조건 없이 서로에 대해 부착되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 작용기가 포획 분자에 부착되는 것은 포획 분자가 작용기에 부착되거나, 양측이 서로에 부착되는 것과 동일하다.
본 발명의 평판형 도파관의 재료는 링커 분자의 헤드 그룹이 부착될 수 있는 것이다. 본 발명의 적합한 도파관 재료는 높은 굴절률을 가진 재료로서, 예를 들어, Ta2O5, TiO2, Nb2Os, 또는 Si3N4와 같이 도파관 특성을 가진 매끈한 광필름의 제조에 박막증착 기술을 사용할 수 있는 것들이 있다. 광학적 격자 결합기(optical grating coupler)가 형성되어 있는 유리 및 고분자 기판 상의 고 굴절률 도파관을 위한 효율적 제조 공정이 "Bidiffractive grating coupler: Universal transducer for optical interface analytics"(Fattinger et al., OPTICAL ENGINEERING, Vol. 34 No. 9, page 2744-2753, September 1995)에 상세히 기술된다. 평판형 도파관은 다층을 포함할 수 있는데, 이들 중 적어도 하나는 고 굴절률을 갖는다. 제시된 평판형 도파관은 평판형 도파관의 상측을 형성하고 있는 외면상의 매질에 대해 높은 굴절률을 갖는다. 예를 들어, 평판형 도파관의 굴절률은 1.7 내지 2.8 범위 내일 수 있는 반면, 평판형 도파관 표면에서의 매질의 굴절률은 일반적으로 1 내지 1.5 범위, 상세하게는 물 또는 수성 분석 버퍼는 1.33 내지 1.4, 그리고 공기는 1이다. 광 커플러를 통과한 간섭광이 평판형 도파관 내로 입사하면서 도파관의 외면에서 소실장(evanescent field)으로 전파된다. 외면 밖으로 관통된 소실장은 도파관 외면의 복수의 소정 라인들을 따라 결합된 대상 샘플에서 굴절된다. 도파막의 두께는 60 내지 200 nm 범위가 선호된다. 도파관 외면에서 소실장의 매질 내 관통 깊이는 150 nm 미만이 선호된다.
본 방법의 제1 변형예에서, 적어도 하나의 복수의 링커 분자를 순차적으로 도포하는 전술된 단계는 다만 두 개의 복수의 링커 분자를 도포하는 것으로 구성된다. 두 개의 복수의 링커 분자가 결합되어 평탄형 도파관 외면에서 시작하여 각자의 위에 형성된 링커 분자의 두 개의 개별 층을 형성한다.
제1 변형예의 태양에 따르면, 방법은 다음 단계들을 추가로 포함한다. 포획 분자의 상보 작용기를 복수의 소정 라인들을 따라 배열된 작용기에 부착하는 단계. 각자의 포획 분자는 대상 샘플에 결합할 수 있다. 다음으로 복수의 소정 라인들 사이에 배열된 광분해성 보호기를 노출함으로써 노출된 광분해성 보호기를 작용기로부터 제거시켜 이들 작용기가 상기 추가 분자의 상보 작용기에 부착할 수 있도록 하는 단계가 있다. 다음으로, 개질된 포획 분자(modified capture molecules)의 상보 작용기를 복수의 소정 라인들 사이에 배열된 작용기에 부착시키는 단계. 각자의 개질된 포획 분자는 1차 포획 분자가 결합할 수 있는 대상 샘플에는 결합하지 못하도록 선택된다.
복수의 소정 라인들 사이에 배열된 광분해성 보호기의 노출(2차 노출)이 나머지 광분해성 보호기가 배열된 전체 층에서 그림자 지역(shadow region) 없이 수행된다. 사실상, 복수의 소정 라인 사이에 배열된 광분해성 보호기는 다만 복수의 소정 라인을 따라 배열된 광분해성 보호기의 1차 포토리소그래피 노출 이후에 남은 광분해성 보호기들이다. 개질된 포획 분자는 포획 분자와 비교할 때 간섭광이 유사하게 산란되는 분자들이다. 유용하게는, 포획 분자에서 산란된 광과 개질된 포획 분자는 부합되는 진폭과 광경로 길이 상의 차이를 가짐으로써 소정 검출 위치에서 파괴적으로 간섭하게 된다. 따라서, 소정 검출 위치에서의 최소 신호(minimum signal)는 광분해성 보호기가 제거되는 작용기의 양과 관련된 각각의 노출 시간을 개질함에 의해 조절될 수 있다. 대상 샘플의 도포 이후에 검출 위치의 신호 변화는 대상 샘플이 포획 분자에 결합함으로써 주로 발생함을 감안할 때 최소 신호가 유용하다. 따라서, 대상 샘플이 부재한 포획 분자로부터의 신호와 비교할 때, 즉, 다만 포획 분자 만으로부터 산란된 광에 비교할 때, 검출 위치에서의 대상 샘플이 신호에 주는 기여도(contribution)는 증가한다. 포획 분자, 또는 개질된 포획 분자는 침지(immersion), 디핑(dipping), 스폿팅(spotting), 인쇄 또는 유체 장치 등의 사용에 의해 도포된다.
본 발명의 제2 변형예에 따르면, 적어도 하나의 복수의 링커 분자를 순차적으로 도포하는 전술된 단계는 다만 하나의 복수의 링커 분자를 도포하는 것으로 구성된다.
제2 변형예의 태양에 따르면, 상기 추가의 분자가 복수의 소정 라인을 따라 배열된 (비보호된 작용기를 가진) 링커 분자의 이전 층의 작동기에 대한 상보 작용기를 가지고 있으므로, 상기 방법은 (바람직하게는 작용기를 통해 부분적 또는 전적으로 포획 분자에 이미 결합되어 있는) 추가의 복수의 링커 분자의 헤드 그룹을 부착하는 단계를 포함한다. 추가의 복수의 링커 분자의 링커 분자의 작용기는 광분해성 보호기에 결합되어 있지 않으며(본 변형예에서, 추가의 복수의 링커 분자의 링커 분자는 광분해성 보호기에 실제로 결합한 적이 없음), 추가 분자의 상보 작용기에 부착될 수 있다. 추가의 복수의 링커 분자의 링커 분자는 이전 층의 링커 분자와는 상이하므로, 평판형 도파관의 외면 상에 포획 분자의 고정화를 위해 상이한 특성들, 예를 들어, 신축성, 친수성, 비특이적 결합 및 최적 길이를 제공한다. 이러한 단계 이후에, 추가의 복수의 링커 분자의 링커 분자와 추가의 복수의 링커 분자에 결합된 포획 분자가 단지 복수의 소정 라인을 따라 배열된다.
제2 변형예의 다른 태양에 따르면, 방법은 다음 단계들을 추가로 포함한다. 포획 분자의 상보 작용기를 복수의 소정의 라인을 따라 배열된 추가의 복수의 링커 분자의 링커 분자의 작용기에 포획 분자의 상보 작용기를 부착하는 단계(본 단계는 링커 분자를 포획 분자와 함께 도포함을 통해 수행될 수 있다). 다음으로, 복수의 소정 라인들 사이에 배열된 이러한 광분해성 보호기를 소정 파장의 광에 노출시킴으로써 작용기들로부터 노출된 광분해성 보호기들을 제거하고, 이들 작용기들이 추가의 분자의 상보 작용기를 부착시킬 수 있도록 하는 단계. 그 이후로는, 링커 분자의 다른 추가의 복수의 링커 분자의 상보 작용기(헤드 그룹)를 복수의 소정 라인들 사이에 배열된 링커 분자의 이전 층의 작용기로 부착하는 단계. 추가의 복수의 링커 분자의 링커 분자의 작용기는 광분해성 보호기에 결합되지 않으며 - 실제로 결코 결합되지 않음 - 추가 분자의 상보 작용기에 부착할 수 있다. 그 이후로, 복수의 소정 라인들 사이에 배열된 링커 분자의 작용기에 상보 작용기를 가진 추가 분자로서, 다른 추가의 복수의 개질된 포획 분자의 상보 작용기를 부착하는 단계.
본 제2 변형예에서는 제1 변형예에서 얻어진 것과 동일한 장점들이 얻어지며, 상세하게는 소정의 검출 위치에서의 포획 분자와 개질된 포획 분자로부터 산란된 빛의 파괴적 간섭에 대해서 얻어진다. 추가의 복수의 링커 분자의 도포와 포획 분자 또는 개질된 포획 분자의 도포가 함께 수행되면 바람직하다. 이는 포획 분자와 변경된 포획 분자가 추가 링커 분자에 의해 부분적으로 둘러싸여(enclose) 도포될 수 있다는 장점을 제공한다. 이러한 방식으로 링크 분자는 그 안에 포획 분자가 매립된 느슨하게 채워진(loosely packed) 매트릭스(예를 들어, 덱스트란(DEXTRAN) 또는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과 같은 고분자)를 제공할 수 있다. 이러한 장점에 대해 아래에 상세히 설명한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 복수의 소정 라인들을 따라 배열된 이들 광분해성 보호기의 노출 단계는 1차 노출 시간 동안 수행되고, 복수의 소정 라인 사이에 배열된 이들 광분해성 보호기들의 노출 단계는 2차 노출 시간 동안 수행된다. 1차 노출 시간은 2차 노출 시간에 비해 상이하다. 일반적으로, 노출 시간은 복수의 링커 분자의 작용기에서 제거된 광분해성 보호기의 양과 관련된다. 이것이 포획 분자와 같은 추가 분자의 상보 작용기를 부착시킬 수 있는 작용기의 총 개수를 결정한다. 작용기에 결합된 포획 분자의 수는 검출 위치 내로 산란된 광의 신호를 결정한다. 따라서, 1차 및 2차 노출 시간은 복수의 소정 라인 사이에 배열된 포획 분자들과 비교할 때, 복수의 소정 라인을 따라 배열된 포획 분자들에서 산란된 광의 비교적 기여도(contribution)를 결정한다. 양측의 기여도가 파괴적으로 간섭하기 때문에, 검출 신호는 두 개의 노출 시간을 독립적으로 변동시켜 최소로 조절될 수 있다.
최대 노출 시간은 1 내지 10 Joules/cm2 사이에서 선택되는 최대 노출 에너지량과 대응함으로써, 라인을 따라서 광분해성 보호기들은 소정 라인들의 거리의 절반 미만의 폭을 가지고 이격된다. 바람직하게는, 1차 노출량과 2차 노출량은 2 Joules/cm2 미만으로서, 약 390 nm 파장의 표준 LED 광원을 사용할 경우 노출 시간이 60초 미만, 바람직하게는 1 내지 10초가 된다. 이러한 노출량은 높은 수율과 최소의 부반응(side reaction)의 과도적 생체접합 합성을 위해 디아릴설파이드 -NPPOC 백본을 가지고 광절단성 링크 분자로서 광분해성 보호기를 작용기들로부터 제거하기에 적합한 것으로 나타났다.
또 다른 실시예에서, "Triplet-sensitized photodeprotection of oligonucleotides in solution and on microarray chips"(D. Wll, S. Walbert, K.-P. Stengele, T. Albert, T. Richmond, J. Norton, M. Singer, R. Green, W. Pfleiderer, U.E. Steiner, Helv. Chim. Acta 2004, 87(1), 28-45)에 기술된 바와 같은 광-탈보호(photodeprotection)의 감광화는 방사가 일어나면 트리플렛-트리플렛 FRET 에너지 전송(triplet-triplet FRET energy transfer)을 통해 요구되는 파장으로 광-탈보호 단계를 수행하기에 유용할 수 있다.
유용한 태양에서, 복수의 소정 라인을 따라 배열된 광분해성 보호기의 노출 단계는 다음 단계들을 포함한다. 광분해성 보호기를 가진 평판형 도파관의 외면에 인접하게 위상 마스크를 배치하는 단계. 위상 마스크에는 제1 굴절률(n1)을 가진 재료로 형성된 복수의 돌출부가 있으며, 제1 굴절률(n1)은 위상 마스크와 평판형 도파관의 외면(각각 링커 분자의 최외곽층) 사이에 존재하는 매질의 제2 굴절률(n2)에 비교할 때 상이하다. 소정 파장의 광을 위상 마스크를 통해 투사함으로써 복수의 소정 라인을 따라 배열된 광분해성 보호기를 노출하기 위한 단계.
이러한 위상 마스크는 유리 기판 및 바람직하게는 고 굴절률의 적합한 재료(예를 들어, Ta2O5, TiO2, Nb2O5 또한 Si3N4)로 제조된 복수의 돌출부를 포함한다. 예를 들어, 위상 마스크는 바이너리 회절성(binary diffractive) 위상 마스크이다. 이러한 돌출부 각자는 소정 깊이와 인접 돌출부에 대해 소정 거리를 가짐으로써, 위상 마스크 돌출부 사이의 액체 매질을 통해 전파되는 광에 비해, 위상 마스크 돌출부를 통해 전파되는 광에 Π(즉, 반파장)의 위상 시프트를 제공한다. 위상 마스크를 통해 전파되는 광의 계면은 돌출부 에지를 따라 최소 광량으로 간섭 패턴을 생성한다. 따라서, 위상 마스크 뒤의 간섭 패턴은 위상 마스크 돌출부의 국부적 주기성에 비해 명-암(dark-bright) 패턴이 곱절이 된 주기성을 갖는다. 돌출부들의 폭과 형태는 위상 마스크를 따라 변동이 가능하다. 포토리소그래피 조명에는 홀로그래피 방법이 포함되며, 이는 "Fabrication of high-spatial-frequency gratings through computer-generated near-field holography"(Suleski, et al., Optics Letters, vol. 24, No. 9, pp. 602-604, May 1, 1999)에 기술된 바와 같다. 홀로그래피 방법, 예를 들어 주변장 홀로그래피는 복수의 소정 라인의 생성(또는 배열)에 사용될 수 있으므로, "몰로그램(mologramm)"이라는 용어가 만들어졌고, 이 용어는 대상 샘플이 결합할 수 있으며, 복수의 소정 라인을 따라 배열된 결합 부위를 지칭한다. 예를 들어, 복수의 소정 라인은 몰로그램 A로서 지칭되고, 복수의 소정 라인 사이에 위치된 라인들은 몰로그램 B로서 지칭될 수 있다. 유용한 응용에서, 검출기 상으로 충돌하여 몰로그램 A에서 회절된 광은 몰로그램 B에서 회절된 광에 비해, Π(즉, 반파장)으로 위상 시프트된다. 부가적으로, 위상 마스크는 간섭 패턴의 질을 증진시키도록 코팅될 수 있으며, 이는 "Coated phase mask for proximity printing of Bragg gratings"(Pasi Laakkonen et al., Optics Communications 192 (2001) 153-159, ELSEVIER)에 상세히 기술된 바와 같다. 위상 마스크를 통하여 광분해성 보호기의 노출을 전송하도록 사용되는 광은 예를 들어 390 nm 파장이다. 작용기에서 제거되어야 할 광분해성 보호기에 따라 다른 파장의 사용이 필요할 수도 있다. 노출은 직접적인 광화학 부착(예를 들어, 벤조페논- 또는 아릴아자이드- 또는 디아지린- 중재의 포토-라디칼 삽입 반응 또는 티오잔톤(Thioxanthones)과 같은 라디칼 개시제에 의한 감광화를 이용함)에 적합할 수 있음을 이해해야 한다. 원칙적으로, 돌출부들의 치수는 이러한 파장에 따라 선택되어야 한다.
바람직하게는, 자신의 헤드 그룹이 도파관 조립체의 외면에 부착된 복수의 링커 분자는 외면에서 외부 방향으로 0.5 nm 내지 10 nm 두께의 개별층을 형성하도록 회합된다. 제1 층 내의 링커 분자들의 평균 밀도는 추가로 도포된 분자와 도파관 외면과의 접촉을 방지할 수 있도록 선택된다. 예를 들어, 도포된 샘플 내의 포획 분자 및 추가 분자들과 도파관의 외면 사이의 비특이적 결합을 방지하는 것이 중요하다.
링커 분자의 제1 층은 평판형 도파관의 외면 상에 직접적으로 부착한다. 유용하게는, 제1 층은 고밀도와 낮은 높이를 갖는다. 이상적으로, 제1 층이 외면을 덮도록 하여 임의의 추가 분자와 외면 사이의 접촉이 불가능하도록 한다.
유용한 태양에 의하면, 자신의 헤드 그룹이 도파관의 외면에 부착된 복수의 링커 분자는 링커 분자의 단분자층을 형성하도록 회합된다. 검출 위치에서의 회절광의 신호의 품질은 제1 층이 외면 상에 규칙적으로 배열될 때 증가하여 도파관의 외면에서의 링커 분자에서 산란되는 광이 매우 작고 균일한 배경 광을 제공한다. 제1 층을 형성하는 복수의 링커 분자는 바람직하게는 자기회합 단분자층(self-assembled monolayer; SAM)이다. SAM은 광분해성 보호기를 보유함으로써 포토리소그래피 처리가 가능하다.
일 실시예에서, SAM은 10 내지 100% 아미노기를 작용기로서 포함하는 알케인의 혼합물로 구성될 수 있으며, 이어서 SAM의 형성 이전이나 SAM의 형성 이후에 광보호성 그룹에 의해 개질됨으로써 본 발명에 따른 광변조에 적합한 요구되는 SAM을 생성할 수 있다.
다른 실시예에서, SAM은 10 내지 100% 카르복시기를 포함하는 알케인의 혼합물로 구성될 수 있으며, 이어서 SAM의 형성 이전이나 SAM의 형성 이후에 광보호성 그룹에 의해 개질됨으로써 본 발명에 따른 광변조에 적합한 요구되는 SAM을 생성할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 의하면, 자신의 헤드 그룹이 링커 분자의 이전 층의 작용기들에 부착된 복수의 링커 분자들은 10 nm 내지 200 nm 두께의 최상 개별 층을 형성하도록 회합된다. 면적 당 링커 분자의 국소 평균 밀도는 그를 통한 포획 분자의 확산이나, 그 내부의 포획 분자의 부분적 포위(enclose)를 허용하도록 낮게 선택된다. 최상층은 제1 층의 분자들과 비교할 때 긴 링커 분자들을 포함하는 것이 바람직하다. 최상층은 낮은 공간밀도를 가짐으로써 대상 샘플 내의 분자들이 이를 측방향으로 통과하여 확산되도록 해야 한다. 이러한 링커 분자들은 형상에 적응할 수 있도록 유연(flexible)할 수 있다. 유용한 예에 의하면, 이러한 링커 분자들은 느슨하게 채워진 메트릭스(폴리머로서, 예를 들어, 덱스트란과 같은 폴리 사카라이드, 카르복시메틸화 덱스트란, 카르복시메틸화 히알루론산, 히알루론산 및 알긴산, 또는 폴리락틱산, 폴리아크릴산, 또는 친수성 3D-아크릴레이트 폴리머 등(D. Kyprianu et al., Talanta 103. 2013, 260-266에 기술됨), 또는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 또는 한 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
폴리머는 추가로 개질되어 백본 개질 폴리머 네트워크를 생성할 수 있으며, 백본 개질에는 이온기, 리피드, 펩타이드 올리고뉴클레오티드 등이 구성될 수 있다.
방법의 다른 태양에 따르면, 복수의 소정 라인들이 평판형 도파관의 외면에서 적어도 두 개의 개별적 회절 부위 내에 배열된다. 각자의 회절 부위의 면적은 25(㎛)2((㎛)2 = ㎛2)보다 크다. 복수의 소정 라인은 인접 라인과의 이격 거리가 1.5㎛ 미만으로, 상세하게는 1㎛ 미만이다. 이렇게 함으로써 상부에 산란된 광의 검출을 위한 회절 부위가 최소 크기를 갖게 되어 적절한 강도의 신호가 검출되도록 제공한다. 복수의 소정 라인은 인접 라인 사이에 최대 이격 거리를 가지며, 이는 회절 부위들에서 회절된 광에 의해 결정된다. 바람직하게는, 가시광이 사용된다. 이러한 이격 거리는 인접 라인 사이의 이격 거리가 평판형 도파관을 통해 전파되는 광의 파장의 배수인 소정 파장의 고조파를 포함한다.
또한 본 발명은 전술된 방법에 따라 제조된 외면을 구비한 평판형 도파관을 제공한다. 복수의 소정 라인이 외면에서의 적어도 두 개의 개별적 회절 부위에 배열된다. 각자의 회절 부위의 면적은 25 ㎛2 보다 크다. 복수의 소정 라인의 인접 라인 간의 이격 거리는 1.5 ㎛ 미만으로, 상세하게는 1 ㎛ 미만이다. 바람직하게는, 평판형 도파관은 복수의 회절 부위, 즉, 평방 센티미터 당 100, 10000, 100000, ... 에서 최대 4 × 106개의 회절 부위를 갖는다. 방법에 대해 기술된 유사한 장점들이 평판형 도파관에도 제공된다.
일 태양에 의하면, 복수의 소정 라인 각자는 만곡되고, 광 커플러를 통해 평판형 도파관에 커플링된 광의 전파 방향의 인접 라인 사이의 이격 거리가 감소하도록 배열된다. 인접 라인 간에 감소 이격 거리를 갖는 만곡 라인들의 배열는 대상 샘플에서 산란된 광을 소정 검출 위치(위상 격자 렌즈와 대비됨)로 집속(및 간섭)시킨다. 대안적인 구성에 따르면, 복수의 소정 라인은 직선형이고 도파관 내로 커플링되는 광의 전파 방향에 대해 각을 가지도록 배열된다. 복수의 소정 라인들이 광의 전파 방향에 대해 각을 가지도록 하는 대안적 구성의 경우, 소정 방향들로 보강간섭에 대한 요구를 충족시킨다(브랙 회절(Bragg diffraction)과 대비됨). 복수의 소정 직선 라인들은 평판형 도파관의 평면에서 광이 회절하도록 한다. 평판형 도파관 내에서 회절된 광은 추가의 광 커플러(위상 격자 렌즈)를 통해 평판형 도파관 외부의 검출 위치로 커플링된다.
본 발명의 추가적 태양에 따르면, 전술된 평판형 도파관 및 평판형 도파관의 외면을 제조하기 위한 위상 마스크를 제공하는 키트(kit)가 제공된다. 위상 마스크는 본 발명에 기술된 바와 같은 리소그래피 방법의 수행을 허용한다. 이와 같은 키트는 전술된 방법에 따라 평판형 도파관의 외면의 제조에 적합한 화학, 약학 및/또는 생물학적 시약을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 시약은 상이한 키트별로 달라질 수 있다.
본 발명의 추가적 유용한 태양에 대하여 다음의 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 기술함으로써 명백해질 것이다.
도 1은 평판형 도파관의 실시예를 도시한 것으로, 복수의 소정 라인과 포토리소그래피 마스크의 일부의 확대도이다.
도 2는 도 1에 예시된 것과 같은 평판형 도파관의 측단면도로서, 두 개의 복수의 링커 분자들이 그에 도포되어 있다.
도 3은 도 2의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 추가의 복수의 링커 분자의 링커 분자가 결합되지 않은 작용기들을 비활성화하는 단계를 도시한다.
도 4는 도 3의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 복수의 소정 라인을 따라 배열된 광분해성 보호기들을 광에 노출하는 단계를 도시한다.
도 5는 도 4의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 복수의 포획 분자를 도포하는 단계를 도시한다.
도 6은 도 5의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 포획 분자가 결합되지 않은 작용기들을 비활성화하는 단계를 도시한다.
도 7은 도 6의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 복수의 소정 라인 사이에 배열된 광분해성 보호기들을 광에 노출하는 단계를 도시한다.
도 8은 도 7의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 복수의 개질된 포획 분자를 도포하는 단계를 도시한다.
도 9는 도 8의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 개질된 포획 분자가 결합되지 않은 작용기들을 비활성화하는 단계를 도시한다.
도 10은 도 9의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 복수의 대상 샘플을 도포하는 단계를 도시한다.
도 11은 도 1에 예시된 평판형 도파관의 측면도로서, 추가적 실시예에 따라 링커 분자가 그 상에 배열되어 있으며, 광분해성 보호기를 구비한 링커 분자의 한 층을 도포하는 단계를 도시한다.
도 12는 도 11의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 복수의 소정 라인을 따라 배열된 광분해성 보호기들을 광에 노출하는 단계를 도시한다.
도 13은 도 12의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 작용기를 통해 포획 분자들에 부분적으로 결합된 추가의 복수의 링커 분자를 도포하는 단계를 도시하며, 여기서 추가의 복수의 링커 분자들은 복수의 소정 라인을 따라 배열되어 있다.
도 14는 도 13의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 복수의 소정 라인 사이에 배열된 광분해성 보호기들을 광에 노출하는 단계를 도시한다.
도 15는 도 14의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 개질된 포획 분자에게 작용기를 통해 부분적으로 결합된 추가의 복수의 링커 분자를 도포하는 단계를 도시하며, 여기서 추가의 복수의 링커 분자는 복수의 소정 라인 사이에 배열되어 있다.
도 16은 도 15의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 추가의 링커 분자가 결합되지 않은 링커 분자의 제1 층의 남은 작용기들, 포획 분자가 결합되지 않은 링커 분자의 제2 층의 남은 작용기들을 비활성화하는 단계를 도시하며, 개질된 포획 분자가 결합되지 않은 링커 분자의 제2 층의 남은 작용기들을 비활성화하는 단계를 도시한다.
도 17은 본 발명의 다른 변형예에 따라 분자 링커가 상부에 배열된 평판형 도파관의 측면도로서, 대안적인 분자 링크 및 대안적인 포획 분자들을 도시한다.
도 18은 단일의 회절 부위 내에 배열된 세 개의 복수의 소정 라인들을 구비한 본 발명의 추가적 태양을 도시한 것으로, 각자의 복수의 소정 라인은 상이한 검출 위치 내에 회절된 광을 집속시킨다.
도 19는 도 18의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 평판형 도파관의 외면 상의 전체 회절 부위 위에 도포된 두 개의 복수의 링커 분자를 구비하며, 여기서 최상측의 복수 개는 광분해성 보호기를 포함한다.
도 20은 도 19의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 제1 복수의 소정 라인을 따라 배열된 광분해성 보호기들을 부분적으로 광에 노출하는 단계를 도시한다.
도 21은 도 20의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 세 개의 부분적으로 노출된 복수의 소정 라인들에 배열되도록 뒤이어 도포된, 세 유형의 한 가닥 DNA를 도시한다.
도 22는 도 21의 평판형 도파관을 도시한 것으로, 세 개의 상이한 복수의 소정 라인에 배열된 세 개의 상이한 유형의 포획 분자를 도시한다.
도 23은 본 발명의 추가적 태양을 도시한 것으로, 단일 회절 부위 내에 배열된 두 개의 복수의 소정 라인들을 구비하며, 각자의 복수 개는 개별적 검출 위치에서 회절된 광을 집속한다.
도 24는 도 23의 두 개의 상이한 복수의 소정 라인에 배열된 전술된 예들과 대비하여, 상이한 종류의 두 개의 상이한 유형의 포획 분자를 구비한 평판형 도파관을 도시한다.
도 1은 본 발명에 따라 링커 분자들이 배열될 수 있는 외면(11)을 구비한 평판형 도파관(1)의 예에 대한 사시도를 도시한다. 구조적으로, 평판형 도파관(1)은 기판(미도시)의 상부 상에 배열되고, 외면(11) 상에 배열된 소정 개수(25개)의 개별적 회절 부위(41)들을 포함한다. 복수의 소정 라인(4)(도시된 라인 각자가 다수 라인을 대표함)이 이러한 회절 부위(41)들 각자 내에 배열된다. 도시된 예에서, 라인(4)들은 만곡되었으나, 다른 변형예에서는 직선형일 수 있다. 본 예에서 라인(4)은 인접 라인(4)들 사이의 이격 거리가 좌측에서 우측으로(평판형 도파관을 관통하여 전파되는 광의 방향) 감소함으로써 검출 신호를 개선한다. 대안적으로는, 라인(4)들은 등거리에 배열되거나, 상이한 복수의 소정 라인(4)들이 상기 회절 부위(41) 내에 배열될 수 있다. 더 나아가, 광 커플러(12)와 추가의 광 커플러(13)가 평판형 도파관(1)에 배열되어 간섭광을 평판형 도파관(1) 내부 및 각각 외부로 커플링한다. 두 개 모두 유리 또는 폴리머 재질로 제조된 기판의 표면에 형성될 수 있다. 추가의 광 커플러(13)는 대안적으로 또는 부가적으로 광흡수 수단일 수 있다. 도시된 평판형 도파관(1)을 포함하는 결합 이벤트의 검출을 위한 장치의 작동 원리에 따르면, 간섭광은 광 커플러(12)를 통해 평판형 도파관(1) 내부로 커플링됨으로써 외면(11)에서 손실장을 이용하여 전파된다. 간섭광의 손실장은 복수의 소정 라인(4)을 따라 외면(11) 상에 배열된 분자들(링커 분자, 포획 분자, 대상 샘플, 등등)에서 산란됨으로써, 산란된 간섭광이 소정의 검출 위치(미도시)에서 보강간섭한다.
도시된 원에는 그러한 부위(41) 내에 배열된 복수의 소정 라인(4) 중 일부를 확대하여 나타낸 것으로서, 흑색 라인(42)들 사이에 백색 라인(43)들이 위치한다. 흑색 라인(42)들을 따라 포획 분자들이 링커 분자들의 작용기에 배열되어 있다. 포획 분자들은 대상 샘플의 결합이 가능하다(장치의 크기에 비교해 작은 크기로 인해 분자들은 본 도면에 도시되지 않는다). 백색 라인(43)들은 포획 분자들이 결합 가능한 대상 샘플을 결합하지 못하는 개질된 포획 분자들을 포함한다. 평판형 도파관(1) 내부로 커플링된 간섭광의 손실장은 도시된 흑색 라인(1)들은 물론 백색 라인(43)들에 배열된 분자들에서 산란한다. 흑색 라인(42)들에 배열된 분자들에 의해 산란된 광은 검출 위치(미도시)에 대해 제1 광경로 길이를 가짐으로써 그 내부의 간섭은 최대 강도에 이른다. 흑색 라인(42)들 사이의 복수의 백색 라인(43)들에 배열된 분자들에서 산란된 간섭광은 검출 위치에 대해 제2 광경로 길이를 가짐으로써 그 내부의 간섭은 최대 강도에 이른다. 이 두 개의 최대치는 각자에 대하여 위상 시프트(Π)를 가짐으로써 전체 강도로 볼 때 최소의 상쇄적 간섭을 갖는다. 따라서 포획 분자들에 결합된 대상 샘플 외의 산란광에서 오는 배경 신호를 최소화할 수 있다. 최소 신호는 포획 분자와 개질된 포획 분자가 결합할 수 있는 각자의 작용기들의 탈보호를 위한 노출 시간을 변경함에 의해 조절될 수 있다. 이론적으로, 흑색 라인(42)들에 배열된 포획 분자와 백색 라인(43)들에 배열된 개질된 포획 분자들은 대상 샘플이 도포되기 전에는 단일의 검출 위치에서 자신 상에 산란된 광의 전반적 배경 신호를 제공하지 않는다.
확대도가 나타난 원의 위쪽으로 위상 마스크(9)의 일부가 도시되어 있으며, 이는 복수의 소정 라인(4)을 따라 배열된 광분해성 보호기의 포토리소그래피 조명을 설명하기 위함이다. 위상 마스크(9)는 유리 기판(92), 및 고 굴절률 재료, 예를 들어,Ta2O5, TiO2, Nb2Os, 또는 Si3N4와 같은 재료로 제조된 복수의 돌출부(91)를 포함한다. 돌출부(91)들의 두께(또는 깊이)는 돌출부(91)의 제1 굴절률(n1) 재료(예를 들어, Ta2O5), 및 위상 마스크(9)와 평판형 도파관(1)의 외면(11) 사이에 존재하는 매질의 제2 굴절률(n2)에 대응하도록 선택됨으로써 소정의 위상 시프트를 제공하도록 한다. Ta2O5의 제1 굴절률(n1)은 390 nm 파장에서, n1 = 2.246이다. 사용시, 위상 마스크(9)는 외면(11)과 근접한 돌출부(91)들을 갖도록 구성되어, 주변장 조명을 통해 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 광분해성 보호기를 노출한다. 광분해성 보호기를 구비한 링커 분자들(비교적 작은 크기로 인해 도시되지 않음)이 예를 들어 DMSO 용액(물 5%) 내의 외면(11)에 도포됨으로써 외면(11)과 위상 마스크(9) 사이의 공간을 채운다. DMSO 용액의 제2 굴절률(n2)은 다음과 같이 추정될 수 있다. 590 nm 파장에서 DMSO의 굴절률은 n2 = 1.477이다. 390 nm에서의 DMSO의 굴절률은 n2 = 1.50으로, 이는 Kozma, J. Opt. Soc. Am. B, 22(7), p 1479 (2005)에 상세히 설명되어 있다. 390 nm에서 DMSO (물 5%)의 굴절률의 추정치는 n2 = 1.494로서, 이에 대해 Le Bel and Goring, J. Chem. Eng. DATA 7(1), p 100 (1962)에 상세히 설명되어 있다. 변형예에 따르면, N-메틸-2-피롤리돈(NMP)을 분자 링커 및 광분해성 보호기들을 도포하기 위한 용액으로서 사용할 수 있다. 위상 마스크(9)는 위상 마스크(9)와 외면(11) 사이의 매질을 통과해 전파되는 광에 대비하여, 돌출부(91)들을 통해 전파되는 광을 위한 위상 시프트를 발생시킨다. 위상 마스크(9)의 패턴에 대비하여, 간섭으로 인해 배가된 주파수의 명암 패턴이 나타난다. 돌출부(91)의 높이는 Ta2O5 의 경우 d = 259 nm (d = λ/ 2(nTa2O5 - nDMSO))로 선택된다. 돌출부(91)들의 폭은 예를 들어 평판형 도파관(1)을 통한 광의 전파 방향을 따라 부위(41) 내에서 변동될 수 있다. 돌출부(91)들의 폭은 평판형 도파관(1)의 외면(11)의 소정 라인(4; 42, 43)의 이격 거리와 동일하도록, 또는 이와 근사하도록 선택되는 것이 바람직하다. 광분해성 보호기의 포토리소그래피 조명은 그에 근접하게 위상 마스크(9)를 위치시키고 위상 마스크(9)를 통해 전송되는 빛을 이용하여 흑색 라인(42)을 따라 배열된 광분해성 보호기들을 조명시킴에 의해 수행된다. 위상 마스크(9)를 통한 노출이 제1 노출 시간 동안 수행된다. 복수의 흑색 라인(42) 사이의 백색 라인(42)을 따라 배열된 광분해성 보호기의 제2 노출이 위상 마스크(9) 없이 수행된다.
흑색 라인(42) 위의 실선 프로파일(61)과 백색 라인(43) 아래의 쇄선 프로파일(62)은 위상 마스크(9)를 통해 전송된 광의 주변장에서의 광세기 프로파일(또는 간섭 패턴)을 나타낸다. 더 나아가 두 개의 프로파일 모두 링커 분자의 각각 노출된 작용기들에 결합된 포획 분자 또는 탈보호화 작용기(흑색 라인(42)) 및 개질 포획 분자(백색 라인(43))의 국소 평균 밀도를 나타내는 것으로 해석될 수 있다. 위에서 추가로 언급한 이상적인 경우에서, 흑색 라인(42) 상에 배열된 포획 분자는 물론, 백색 라인(43)을 따라 흑색 라인(42) 사이에 배열된 개질된 포획 분자들에서 산란된 광은 검출 위치에 최소(이상적으로는, 영(0))의 배경 신호에 기여한다. 이는 이론적으로는 포획 분자와 개질 포획 분자의 국소 평균 밀도를 동일하게 함에 의해 달성될 수 있다. 흑색 라인(42)과 백색 라인(43) 사이의 예리한 에지(edge)들은 흑색 및 백색 라인들 사이에 사인형태 천이(sinusoidal transition)에 근사하다(도면 형식을 맞추기 위하여 이러한 음영적 도시는 제공되지 않았으나, 이것이 보다 현실에 가까울 수 있다). 원칙적으로, 포획 분자들의 국소 밀도는 위상 마스크(9)를 통한 주변장의 사인형태의 세기 프로파일에 의해 나타난다.
본 발명의 수행을 가능케 하는 방법의 제1 실시예 및 제2 실시예에 대해 이하 도시한다. 양 실시예들은 도 1에 예시된 평판형 도파관을 채용한다. 이들 실시예에서, 포토리소그래피 단계는 동일한 방식으로, 다만 상이한 단계를 밟아 수행된다. 실제로, 광분해성 보호기의 노출은 포토그래피 마스크를 이용하여 다만 일 회 수행된다. 포토리소그래피 마스크의 재배치가 어렵고 실용적이지 않으므로, 2차 노출은 마스크를 이용하지 않고 수행되는, 남은 광분해성 보호기들의 노출에 해당한다.
다음의 도 2 내지 도 10에서, 본 발명에 따른 방법의 제1 실시예를 설명한다.
도 2는 복수의 링커 분자(2) 및 평판형 도파관(1)의 외면(11)에서 시작하여 뒤이어 도포되는 추가의 복수의 링커 분자들이 도포됨으로써 두 개의 개별적 층들로 회합되는 것을 도시한다. 복수의 링커 분자(2)의 링커 분자(2)들은 외면(11)에 직접적으로 회합됨으로써 자기회합 단분자층을 형성한다. 이들 링커 분자(2)들은 외면(11)에 부착하기 위한 헤드 그룹(21)(예를 들어, -(PO3)2-, -(O-PO3)2-, 트리알콕실란 또는 폴리(L-리신)) 및 추가 분자의 상보 작용기를 부착할 수 있는 작용기(22)를 포함한다. 전이 금속 산화물, 예를 들어, Ta2O5, TiO2, Nb2O5 상에 자기회합 단분자층(SAM)을 형성하기에 적합한 링커 분자(2)들은 예를 들어, NH2-말단 자기회합 분자 아미노-도데실-포스페이트(NH2-(CH2)12-(PO3)H2), COOH-말단 자기회합 분자 카르복시-펜타데실-포스페이트(COOH-(CH2)15-(PO4)H2) 또는 OH-말단 자기회합 분자 하이드록시-도데실-포스페이트 암모늄염(OH-(CH2)12-(PO4)(NH4)2)이 있다(비교. Samue1e Guido Pio Tosatti: FUNCTIONALIZED TITANIUM SURFACES FOR BIOMEDICAL ApPLICATIONS: PHYSICO-CHEMICA CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL IN VITRO EVALUATION, DISS. ETH NO. 15095). 작용기(22)는 보편적 작용기, 유기 또는 펩타이드 금속 킬레이트 흡착제, 한 가닥 DNA, 단백질 수용체 또는 이의 리간드일 수 있다. 특정 유형의 분자들로 한정되는 것은 아니나, 도시된 경우에서 추가 분자는, 상보 작용기(헤드 그룹)(51)(예를 들어, 뒤이어 도포된 복수의 링커 분자(5)의 링커 분자의 카르복시와 같은 부편적 작용기)과 작용화된, 느슨히 채워진 메트릭스(예를 들어, 덱트트란 또는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과 같은 폴리머)이다. 또한 뒤이어 도포된 복수의 링커 분자(5)의 링커 분자(5)들은 이전에 도포된 층의 작용기(22)들에 부착할 수 있는 헤드 그룹(51)들을 포함한다. 작용기(52)들은 추가 분자의 상보 작용기를 부착할 수 있다. 도시된 경우에서 작용기(52)들은 광분해성 보호기(3)에 의해 보호된다. 광분해성 보호기(3)가 작용기(52)를 보호함으로써 이에 결합할 수 있는 포획 분자와 같은 추가 분자의 상보 작용기가 없다. 따라서, 작용기(52)들은 아미노-, 메르캅토-, 하이드록실-, 카르복실기와 같은 광분해성 보호기에 의해 보호될 수 있는 작용기들로만 한정된다.
도 3에서, 추가의 복수의 링커 분자(5)의 헤드 그룹(51)이 결합하지 않은 복수의 링커 분자(2)의 작용기(22)들은, 예를 들어, 상보 작용기를 가진 추가 분자와 반응 또는 상호반응할 수 있는 작용기가 부재한 추가 분자와 반응시킴에 의해 비활성화된다. 비활성화된 작용기(221)들은 임의의 추가 결합을 할 수 없다.
도 4에서, 복수의 소정 라인(4)을 따라 배열된 추가의 복수의 링커 분자(5)의 작용기(52)들에 결합된 광분해성 보호기(3)들이 광에 노출되고 작용기(52)들로부터 제거된다. 따라서, 복수의 소정 라인(4)을 따라 배열된 작용기(52)들은 추가 분자, 예를 들어, 포획 분자의 상보 작용기를 부착할 수 있으며, 복수의 소정 라인(4) 사이에 배열된 작용기(52)들은 광분해성 보호기(33)를 포함한다. 노출은 위상 마스크에 의해 도 1에 대해 설명한 바와 같이 포토리소그래피 방식으로 달성될 수 있다. 도시된 단일 라인(4)은 복수의 소정 라인(4) 중 하나의 라인을 예시한 것으로, 이를 따라 광분해성 보호기(3)들이 광에 노출된다.
이론상으로는, 방법의 이러한 상태는 결합 이벤트의 검출을 위해 사용될 수 있는 평판형 도파관을 제공한다. 예를 들어, 도포된 대상 샘플이 복수의 소정 라인을 따라 배열된 복수의 링커 분자들의 작용기들에 직접적으로 결합한 경우.
도 5에서, 복수의 포획 분자(6)가 복수의 소정 라인(4)을 따라 배열된 작용기(52)들에 도포된다. 일반적으로, 이러한 포획 분자(6)는 분석을 위해 분자 링커(5)와 샘플 내의 대상 분자(도 10에 도시됨)에 동시적으로 결합할 수 있는 임의의 분자이다. 도시된 포획 분자(6)는 샘플 내의 대상 분자를 결합하기 위한 두 개의 결합 부위를 가진 단백질을 나타낸다. 링커 분자(5)는 링커 분자들 사이에 포획 분자(6)들로 채워질 수 있는 공간에 느슨히 쌓일 수 있다. 이러한 경우, 포획 분자(6)는 느슨히 쌓인 복수의 링커 분자 내에 매립되는 것이 바람직하다. 유용하게는, 이러한 복수의 느슨히 채워진 링커 분자(5)는 포획 분자(6) 및 도포된 샘플 내의 분자와 비특이적 상호작용이 없거나 최소인 느슨히 채워진 메트릭스(예를 들어 덱스트란 또는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG))로 구성될 수 있다.
각자의 링커 분자(5)는 링커 분자(5)를 따라 배열된 여러 개의(즉, 두 개 이상) 작용기(52)를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 제1 실시예의 본 변형예에서, 링커 분자(5)를 따라 배열된 모든 작용기(52)들은 작용기(52)로부터 보호기의 제거가 있기 전에 광에 대해 제1 노출됨에 의해 광분해성 보호기에 의해 보호된다.
도 6에서, 결합된 포획 분자(6)가 없는 추가의 복수의 링커 분자(5)의 작용기(52)들이 비활성화된다. 비활성화된 작용기(521)들은 임의의 추가 결합이 불가능하다.
이로 인해, 결합 이벤트의 검출에 사용될 수 있는 평판형 도파관이 제공된다. 복수의 소정 라인을 따라 배열된 포획 분자들에 의해 제공된 결합 부위들에 대상 샘플이 결합하여 그 위의 간섭광을 산란시킴으로써 소정 검출 위치에서의 간섭은 최대가 된다. 그러나, 실제로는, 포획 분자에서만 산란된 광에 의해(즉, 포획 분자에 결합된 대상 샘플 없이) 비교적 강한 배경 신호가 검출 위치에서의 신호에 기여한다. 검출 신호에 대해 배경 신호를 감소시키는 가능성이 다음에 도시되어 있다.
도 7에서, 광에 대한 노출로 인하여 복수의 소정 라인(4) 사이에 배열된 추가의 복수의 링커 분자(5)의 작용기(52)로부터 광분해성 보호기가 제거된다. 남은 광분해성 보호기가 1차 노출에 형성된 복수의 소정 라인(4)사이에 형성된 복수의 소정 라인을 따라 적절히 배열되어 있으므로, 이러한 2차 노출(1차 노출은 위상 마스크를 통해 수행됨)은 포토리소그래피 마스크를 필요로 하지 않는다.
도 8에서, 복수의 개질된 포획 분자(7)가 복수의 소정 라인(4) 사이에 배열된 추가의 복수의 링커 분자(5)의 작용기(52)들에 도포된다. 개질된 포획 분자(7)는 본 예에서 변종 단백질이다. 일반적으로, 개질된 포획 분자(7)는 포획 분자(6)와 구조적으로 유사하고, 돌연변이 또는 화학적 개질됨으로써 포획 분자(6)들이 결합할 수 있는 샘플 내의 대상 분자(미도시)를 결합하지 못하게 된다. 다시 말해, 개질된 포획 분자(7)들은 대상 샘플을 결합할 수 있는 결합 부위가 없는 반면, 포획 분자(6)들과 비교할 때 유사하게 간섭광을 산란한다.
도 9에서, 아무런 개질된 포획 분자(7)가 결합되지 않은 복수의 링커 분자(5)들의 작용기(52)가 비활성화된다. 비활성화된 작용기(52)들은 임의의 추가 결합이 불가능하다.
이로 인해, 결합 이벤트의 검출에 사용될 수 있는 평판형 도파관이 제공된다. 이러한 평판형 도파관의 장점은, 전술된 바와 같이, 포획 분자로부터의 산란광은 물론, 개질된 포획 분자로부터의 산란광의 기여로 인해 상쇄적 간섭이 최소 신호에 이른다는 것이다. 유용하게는, 노출 시간 및 결과적으로 포획 분자의 수나 탈보호화 작용기들에 부착된 개질된 포획 분자의 수를 변경함에 의해 최소 신호가 조절됨으로써 검출 위치에서 배경 신호를 최소화한다.
도 10은 샘플 내의 복수의 대상 분자(8)를 복수의 소정 라인(4)을 따라 배열된 포획 분자(6)들에 도포한 것을 도시한다. 도시된 바와 같이, 대상 샘플(8)들은 포획 분자(6)들에만 결합한다. 개질된 포획 분자(7)들은 대상 샘플(8)을 결합할 수 없다. 따라서, 검출 위치(미도시)에서의 광은 개질된 포획 분자(7)에서의 산란광에 대해 포획 분자(6)에서의 산란광의 기여도를 조절함에 의해 최소화되었다. 유용하게는, 대상 샘플(8)의 도포가 있고 난 후 검출 위치에서 검출광의 변화가 대상 샘플(8)과 포획 분자(6)의 실제 결합에서 유래된다.
결합 이벤트의 검출은 유용한데, 간섭광은 복수의 소정 라인(4)(도 1의 흑색 라인(42)과 대응함)을 따라 배열된 포획 분자(6)에 의해서 산란될 뿐 아니라, 개질된 포획 분자(7)(도 1의 백색 라인(43)과 대응함)에 의해 추가적으로 산란되기 때문이다. 포획 분자(6)와 개질된 포획 분자(7) 사이의 거리는 간섭광 파장의 절반(또는 파장의 배수와 파장 절반의 합)이 되도록 선택되므로, 이론적으로 검출 위치에서 산란광은 최소에 이른다. 실제로는, 검출 위치의 포획 분자(6) 및 개질된 포획 분자(7)의 기여와 광과의 간섭은 영(0)이며, 오히려 약간의 배경 광은 존재하게 된다. 대상 샘플의 결합으로 인해 최소 배경 신호에 대해 비교적 큰 상기 최소 신호에 변화를 일으킬 것이다.
다음의 도 11에서 제2 실시예를 기술함으로써 본 발명의 방법을 수행하는 다른 방식을 설명한다.
도 11에서, 복수의 링커 분자(2)가 도포되어 헤드 그룹(21)을 평판형 도파관(1)의 외면(11)에 부착시킨다. 복수의 링커 분자(2)는 작용기(덮인 상태이므로 도시되지 않음)를 포함하며, 이들은 광분해성 보호기(3)에 의해 보호되어 있다. 제2 실시예와 제1 실시예와의 차이점은 광분해성 보호기(3)를 포함한 단일의 복수의 링커 분자(2)가 제1 단계에서 도포된다는 점이다(SAM에만).
도 12에서, 복수의 소정의 라인(4)을 따라 배열된 광분해성 보호기(3)가 광에 노출되어 제거된다. 복수의 소정 라인(4)을 따른 노출이 포토리소그래피 방식으로 수행된다. 따라서, 링커 분자(2)들의 탈보호화된 작용기(22)들이 복수의 소정 라인(4)을 따라 배열된다.
도 13에서, 링커 분자(5)들의 작용기(52)들에 결합된 복수의 포획 분자(6)가 복수의 소정 라인(4)을 따라 함께 도포된다(각자에게 부착됨). 포획 분자(6)의 상보 작용기는 링커 분자(5)의 작용기(52)에 부착되고, 둘은 함께 헤드 그룹(52)을 통해 작용기(22)에 부착된다. 바람직한 예들에서, 이로 인해 포획 분자(6)가 부분적으로 상기 링커 분자(5) 내에 싸이고(예를 들어, 링커 분자(5)가 느슨히 쌓인 메트릭스(예를 들어, 덱스트란 또는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)와 같은 폴리머))를 형성하는 반면, 대상 샘플(미도시)은 포획 분자(6)들에 의해 제공된 결합 부위들에 결합되도록 허용된다.
도 14에서, 복수의 소정 라인(4) 사이에 배열된 광분해성 보호기들은 소정 파장의 광에 노출된다(포토리소그래피 마스크를 이용한 2차 노출). 탈보호화된 작용기(22)들은 추가 분자들, 예를 들어, 개질된 포획 분자들의 상보 작용기에 부착할 수 있다. 제2 실시예에서는 제1 실시예에서 설명된 바와 유사한 최소 배경 신호가 성취된다(도 7 참조).
도 15에서, 링커 분자(5)들의 작용기(52)들에 부착(결합)된 복수의 개질된 포획 분자(7)가 복수의 소정 라인(4) 사이에 배열된 작용기(22)들에 도포된다(도 13과 유사).
도 16에서, 개질된 포획 분자가 결합되지 않은 작용기(521)는 물론, 링커 분자의 헤드 그룹이 결합되지 않은 작용기(221)들이 비활성화된다. 이에 따라 도 10에 기술된 것과 같이 사용되도록 제조된 평판형 도파관을 제공할 수 있다.
도 17은 본 발명의 다른 변형예를 도시하며, 여기서 대안적인 헤드 그룹(511)과 함께 대안적인 작용기(522)들을 가진 대안적인 분자 링커들이 사용된다. 막형상의 상부구조(membrane-like superstructure)(예를 들어, 소포체 또는 리포좀)(61)와 개질된 막형상의 상부구조(예를 들어, 개질된 소포체 또는 개질된 리포좀)(71)가 대안적 작용기(522)들에 배열된다. 막형상의 상부구조(61)는 막수송 단백질(611)(운반체 또는 채널)을 포함 또는 재구성한 것으로, 개질된 포획성 포획 분자(captive capture molecule)를 나타낸다. 도 10 및 도 17에 대응하여, 막형상의 상부구조(61)와 개질된 막형상의 상부구조(71)가 복수의 소정 라인(4)을 따라서 복수의 소정 라인(4) 사이에 각각 배열된다. 대상 샘플(81)은 포획성 포획 분자 내에 포획될 수 있다(막형상의 상부구조들 내에 포획). 이러한 방식으로, 포획 분자라는 용어는 대상 샘플이 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 소정 개수의 개별적 결합 부위를 제공할 뿐 아니라, 막수송 단백질을 통해 대상 샘플을 포획하기에 적합한 것으로 보인다. 이에 따라 대상 샘플(81)을 일체적으로 검출하기 위한 시간적 기간에 걸쳐 포획된 대상 샘플(811)을 축적하기 위한 방법이 제공된다.
도 18은 본 발명의 추가적 태양을 도시한다. 세 개의 복수의 소정 라인(401, 402, 403)들이 평판형 도파관 상의 하나의 회절 부위(41)에 배열된다. 각자의 복수 개를 배열함에 있어, 광 커플러(12)를 통해 평판형 도파관 내부로 커플링된 광이 각자의 복수의 소정 라인(401, 402, 403)에서 회절됨으로써 개별적인 검출 위치들(421, 422, 423)에서 보강간섭하도록 한다. 세 개의 복수의 소정 라인(401, 402, 403)의 본 배열은 예시를 위한 것이며, 다른 수의 복수의 소정 라인들(401, 402, 403)이 배열될 수 있다. 이는 본 예시에서 광 커플러(12)를 통해 커플링된 광이 일렬로 배열된 세 개의 상이한 검출 위치들(421, 422, 423)에서 보강간섭하도록 하기 위한 라인들의 모양에도 동일하게 적용된다. 다수의 검출 위치를 갖는 회절 부위(41)는 다수 초점을 가진 몰로그램(mologram)으로 나타난다(또는 나타낸다).
이하에서는, (세 개중) 상이한 복수의 소정 라인 상에 각각 (세 개의) 상이한 유형의 포획 분자들을 도포하기 위한 방법에 대해 기술한다. 본 구성은 공정 케스케이드(process cascade)의 검출이 가능하다는 장점이 있다. 예를 들어, 대상 샘플이 제1 유형의 포획 분자에서 개별적 생성물들로 나뉘어서 제1 검출 위치에서 신호를 제공한다. 이러한 반응의 제1 생성물은 다음으로 제2 유형의 포획 분자들에 결합함으로써 제2 검출 위치에서 신호를 제공한다. 반응의 제2 생성물은 제3 유형의 포획 분자에 결합함으로써 제3 검출 위치에서 신호를 제공한다. 소정의 상이한 복수의 소정 라인들에 상이한 유형의 포획 분자들을 부착하는 것은, 예를 들어, 다음에 기술되는 것과 같은 한 가닥 DNA를 이용하여 달성될 수 있다(직교 화학반응(orthogonal chemistry)). 대안적으로, 광분해성 보호기들의 노출 및 제거를 위해 상이한 파장을 이용하는 직교 광화학반응이 수행되어, 다만 소정 유형의 포획 분자만이 상이한 부위에서 소정의 복수의 소정 라인들에 배열되도록 할 수 있다.
도 19는 두 개의 복수의 링커 분자(2, 5)가 그 위에 도포된 외면(11)을 가진 평판형 도파관(1)이다. 최상부의 복수의 링커 분자(5)가 광분해성 보호기(3)를 보유한다(도 3과 대비).
도 20은 제1 복수의 소정 라인(401)을 따라 배열된 광분해성 보호기(3)를 부분적으로 광에 노출하는 단계를 도시한다. "부분적 노출"이라 함은 그러한 라인(401)을 따라 다만 소정 개수의 광분해성 보호기(3)를 제거함을 말한다. 소정 개수는 복수의 제1 포획 분자에 결합된 대상 샘플을 위한 회절광의 검출가능한 신호를 제공할 수 있게 충분히 높다. 소정 개수는 추가적 (부분) 노출이 추가의 복수의 소정 라인들(402, 403)을 따라 수행될 수 있을 정도로 작아야 하며, 그 결과 동일한 회절 부위에서 추가 라인들(402, 403)을 따라 추가의 복수의 광분해성 보호기의 제거가 일어나야 한다. 이들 라인들(401, 402, 403)은 교차되거나, 달리 말하자면 소정 개수의 라인이 각자의 위에 형성될 수 있다. 도 18을 참조하면, 라인들(401, 402, 403)의 교차는 상이한 검출 위치들(421, 422, 423)에서의 신호에 기여한다. 도 20은 다수의 초점을 가진 몰로그램의 가능한 분자구조를 도시한다.
도 21은 도 20에 설명된 부분적 노출을 반복함으로써 뒤이어 도포된 세 유형의 한 가닥 DNA들(621)(유형I), (622)(유형 II), 623(유형 III)이 세 개의 복수의 소정 라인들에 배열된 것을 도시한다. 상이한 복수의 소정 라인들이 상이한 초점으로 광을 회절시킨다(이격된 검출 위치에서).
단일 가닥 DNA는 직교 화학반응의 수행을 가능케 함으로써 상이한 포획 분자들(6, 72, 73)이 상이한 상보 한 가닥 DNA들(631, 622, 623)에 선택적으로 결합하고, 따라서 소정 유형의 포획 분자만이 소정의 복수의 소정 라인에 배열된다. 도 22에 도시된 배열은 각각의 검출 위치(421, 422, 423)에서의 약학, 생물학 또는 화학적 반응의 개별적 검출을 가능케 한다.
도 23은 본 발명의 추가적 태양을 도시한다. 두 개의 복수의 소정 라인들(402, 403)이 평판형 도파관 상의 하나의 회절 부위(41) 내에 배열된다(도 18과 유사). 각자의 복수 개를 배열함에 있어서, 광 커플러(12)를 통해 평판형 도파관 내로 커플링된 광이 각자의 복수의 소정 라인(402, 403)에서 회절됨으로써 이격된 개별적 검출 위치들(422, 423)에서의 보강간섭이 일어나도록 한다.
도 24는 도 23의 평판형 도파관(1)으로서, 두 개의 복수의 소정 라인들(402, 403)의 라인들이 교차하는 외면(11)의 영역을 도시한다. 상이한 포획 분자들(본 예에서는 대상 샘플로서 도포된 단백질의 적어도 두 개 결합 부위 중 하나에 결합할 수 있는 분자들임)(75, 76)이 상이한 복수의 소정 라인들에 배열되며(도 23 참조; 402, 403), 이는 직교 화학반응에 의해 달성될 수 있다. 전술된 바와 같이, 직교 화학반응은 예를 들어, 상이한 한 가닥 DNA들(621, 622) 및 상이한 유형의 포획 분자들(75, 76)의 고정화를 위한 대응하는 상보 한 가닥 DNA들(631, 632)을 사용함으로써 동일한 회절 부위에서 상이한 복수의 소정 라인들에 배열되도록 한다(도 23 참조; 41). 대안적으로는, 광분해성 보호기의 노출을 위해 상이한 파장을 사용하는 직교 광화학반응이 있다. 대상 샘플(81)은 포획 분자(75, 76) 둘 모두에 결합할 수 있는 단백질로서, 다중 결합 상호작용을 통해 협동결합(cooperative binding)을 형성할 수 있다. 이러한 다중 결합 상호작용은 높은 세기를 갖는데, 둘 사이의 세기, 대상 샘플(81)과 포획 분자(75)의 결합은 물론, 대상 샘플(81)과 포획 분자(76) 사이의 결합이 합쳐지기 때문이다. 두 결합 모두 동시에 또는 짧은 시간 안에 순간적으로 형성될 수 있다. 다증 결합 상호작용은 두 개의 검출 위치들에서 광학적으로 검출되는데, 따라서 두 개의 검출 위치에서 상호연관 신호를 제공한다. 유용하게는, 이는 시분해 검출(time resolved detectoin)방법을 이용하여 달성될 수 있다.

Claims (16)

  1. 복수의 소정 라인(4)을 따라 대상 샘플들을 결합할 수 있도록 하는 평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법으로서,
    - 링커 분자(2)를 부착시킬 수 있는 외면(11)을 가지는 평판형 도파관(1)을 제공하는 단계;
    - 적어도 하나의 복수의 링커 분자(2, 5; 2)를 상기 외면(11)에 순차적으로 도포하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 복수의 링커 분자(2, 5; 2)의 각 복수 개는 링커 분자(2, 5; 2)의 개별층을 형성하도록 회합(assemble)되고, 개별 층들은 상기 평판형 도파관(1)의 상기 외면(11)에서부터 시작하여 서로 위아래로 형성되고, 각 링커 분자(2, 5; 2)는 작용기(22, 52; 22) 및 헤드 그룹(head group)(21, 51; 21)을 포함하고, 상기 헤드 그룹(21, 51; 21)은 상기 평판형 도파관(1)의 상기 외면(11), 또는 링커 분자(2)들의 이전 층(preceding layer)의 작용기(22)들에 부착할 수 있고, 또한 여기서 최상위층의 상기 링커 분자(5; 2)들의 상기 작용기(52; 22)들은 광분해성 보호기(3)들에 결합됨으로써 상기 광분해성 보호기(3)에 결합된 상기 최상위층의 각자의 작용기(52; 22)가 추가 분자의 상보(complementary) 작용기에 부착할 수 없는, 단계; 및
    - 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 상기 최상위층의 상기 광분해성 보호기(3)들을 소정 파장의 광에 노출시켜 상기 작용기(52; 22)들로부터 상기 노출된 광분해성 보호기(3)들을 제거하여 상기 작용기(52; 22)들이 추가 분자의 상보 작용기에 부착할 수 있도록 만드는 단계를 포함하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 복수의 링커 분자(2, 5)들을 순차적으로 도포하는 단계는, 단지 두 개의 복수의 링커 분자(2, 5)들을 도포하는 단계로 구성되며, 상기 두 개의 복수의 링커 분자(2, 5)들은 회합되어 평판형 도파관(1)의 상기 외면(11)에서부터 시작하여 서로 위아래로 형성되는 링커 분자(2, 5)들의 두 개의 개별 층들을 형성하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    - 포획 분자(6)들의 상보 작용기들을 상기 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 링커 분자들의 상기 최상위층의 상기 작용기(52)들에 부착하며, 각 포획 분자(6)가 대상 샘플(8)을 결합할 수 있는 단계;
    - 상기 복수의 소정 라인(4)들 사이에 배열된 상기 광분해성 보호기(3)들을 소정 파장의 광에 노출시켜 상기 작용기(52)들로부터 상기 노출된 광분해성 보호기(3)들을 제거하여, 상기 작용기(52)들이 상기 추가 분자의 상보 작용기에 부착할 수 있도록 하는 단계; 및
    - 개질된 포획 분자(7)들의 상보 작용기들을 상기 복수의 소정 라인(4)들 사이에 배열된 작용기(52)들에 부착하며, 각각의 개질된 포획 분자(7)는 상기 포획 분자(6)들이 결합할 수 있는 상기 대상 샘플(8)에는 결합할 수 없는 단계;를 더 포함하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 복수의 링커 분자(2)를 순차적으로 도포하는 단계는 단지 하나의 복수의 링커 분자(2)를 도포하는 단계로 구성되는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    추가의 복수의 링커 분자들의 헤드 그룹들을 상기 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 링커 분자(2)들의 상기 이전 층의 상기 작용기(22)들에 부착하는 단계로서, 상기 추가의 복수의 링커 분자(5)들의 상기 링커 분자(5)들의 상기 작용기(52)들은 광분해성 보호기(3)들에서 결합해제(unbound)되고, 추가 분자의 상보 작용기에 부착할 수 있는, 단계를 더 포함하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    - 포획 분자(6)들의 상보 작용기들을 상기 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 상기 추가의 복수의 링커 분자(5)들의 작용기(52)들에 부착하는 단계;
    - 상기 복수의 소정 라인(4)들 사이에 배열된 상기 광분해성 보호기(3)들을 소정 파장의 광에 노출시켜 상기 작용기(22)들로부터 상기 노출된 광분해성 보호기(3)들을 제거하여 상기 작용기(22)들이 추가 분자의 상보 작용기에 부착할 수 있도록 만드는 단계;
    - 다른 추가의 복수의 링커 분자(5)들의 상보 작용기들을 상기 복수의 소정 라인(4)들 사이에 배열된 링커 분자(2)들의 상기 이전 층의 상기 작용기(22)들에 부착하는 단계로서, 상기 다른 추가의 복수의 링커 분자(5)들의 상기 링커 분자(5)들의 상기 작용기(52)들은 광분해성 보호기(3)에서 결합해제되고 상기 추가 분자의 상보 작용기에 부착할 수 있는, 단계; 및
    - 개질된 포획 분자(7)들의 상보 작용기들을 상기 복수의 소정 라인(4)들 사이에 배열된 상기 추가의 복수의 링커 분자(5)들의 링커 분자(5)들의 상기 작용기(52)들에 부착하는 단계를 더 포함하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 상기 광분해성 보호기(3)들을 노출하는 단계는 제1 노출량(first exposure dose)을 위해 수행되고, 상기 복수의 소정 라인(4)들 사이에 배열된 상기 광분해성 보호기(3)들을 노출하는 단계는 제2 노출량(second exposure dose)을 위해 수행되며, 상기 제1 노출량은 상기 제2 노출량과 상이한,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제1 노출량과 상기 제2 노출량은 10 Joules/㎠ 미만인,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 상기 광분해성 보호기(3)들을 노출하는 단계는,
    - 상기 광분해성 보호기(3)들에 근접하게 위상 마스크(9)를 배치하는 단계로서, 상기 위상 마스크(9)는 제1 굴절률(n1)을 갖는 복수의 돌출부(91)를 가지며, 상기 제1 굴절률(n1)은 상기 위상 마스크(9)와 상기 평판형 도파관(1)의 상기 외면(11) 사이에 배열된 매질의 제2 굴절률(n2)과 상이한, 단계; 및
    - 소정 파장의 광을 상기 위상 마스크(9)를 통해 전송하여 상기 복수의 소정 라인(4)들을 따라 배열된 상기 광분해성 보호기(3)들을 노출하는 단계를 포함하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤드 그룹(21)들이 상기 외면(11)에 부착된 상기 복수의 링커 분자(2)가 회합하여 0.5 nm 내지 10 nm의 두께를 가진 개별 층을 형성하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤드 그룹(21)들이 상기 외면(11)에 부착된 상기 복수의 링커 분자(2)들이 회합하여 링커 분자(2)들의 단분자층을 형성하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤드 그룹(51)들이 링커 분자(2)들의 이전 층의 상기 작용기(22)들에 부착된 상기 복수의 링크 분자(5)들이 회합하여 10 nm 내지 200 nm의 두께를 가진 최상위 개별 층을 형성하는,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 소정 라인(4)들은 상기 평판형 도파관(1)의 상기 외면(11)의 적어도 두 개의 개별적 회절 부위(41) 내에 배열되며, 각자의 회절 부위(41)는 25㎛2 초과의 면적을 가지고, 상기 복수의 소정 라인(4)들은 인접 라인(4)들 사이의 이격 거리가 1.5 ㎛ 미만인,
    평판형 도파관(1)의 외면(11)의 제조 방법.
  14. 복수의 소정 라인(4)들을 따라 대상 샘플들에 결합이 가능하도록 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 외면(11)을 가진 평판형 도파관(1)으로서, 상기 복수의 소정 라인(4)들은 상기 외면(11)의 적어도 두 개의 개별적 회절 부위(41)에 배열되고, 각 회절 부위(41)는 25㎛2 초과의 면적을 가지며, 상기 복수의 소정 라인(4)들은 인접 라인(4)들 사이의 이격 거리가 1.5 ㎛ 미만인, 평판형 도파관(1).
  15. 제14항에 있어서,
    상기 복수의 소정 라인(4)들은 광 커플러를 통해, 상기 평판형 도파관(1) 내부로 커플링 된 광의 전파 방향에 대해, 인접한 소정 라인(4)들 사이의 상기 광의 전파 방향의 이격 간격이 감소하도록 배열되거나, 상기 광의 전파 방향에 대해 각도를 가지고 배열되는, 평판형 도파관(1).
  16. 삭제
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