SU905787A1 - Способ определени аденозинтрифосфорной кислоты в крови - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к технике определени  аденозинтрифосфорной киспоты (АТФ) в крови и может быть использовано в биохимических анализах в научно-исследовательских и клинических лаборатори х, преимущественно при изучении отдельных звеньев адениловой системы.

Наиболее близким решением к изобретению  вл етс  способ определени  АТФ в крови путем приготовлени  безбелкового центрифугата пробы с последук цим добавлением в реакционную смесь гексокиназы. Точность известного способа 10-15% U.

Недостатком известного способа  вл етс  его сложность, так как методика определени  АТФ основана да многостадийности приемов и на многократном измерении оптических плотностей . Кроме того, дл  определени  АТФ требуютс  дорогосто щие реактивы и оборудование.

Цель изобретени  - упрощение способа .

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу определени  АТФ в крови путем приготовлени  безбелкового центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы, в реакционной смеси определ ют глюкозу ,глюкозооксидаз:шм методом после добавлени  гексокиназы и без ее добавлени ,- полученные образцы колорш трируют со стандартным раствором глюкозы, а АТФ определ ют по формуле

,

ti

F

ст

где С - концентраци  АТФ, мг.% , К - коэффициент пересчета АТФ; зКстинкци  контрольной пробы Eg- экстинкци  пробы после добавлени  гексокиназы. Е..- экстинкци  стандартного раствора . Способ осуществл ют следук цим образом . Количественное определение ЛТФ проводитс  по уменьшению содержани  глюкозы в эритроцитах, происход щее вследствие реакции глюкоза + АТФ - -у глюкозо-6-фосфат + АТФ. Процесс катализируетс  ферментом гексокиназой . Концентрацию АТФ вычисл  эт по фор муле где С - количество АТФ, мг %, К - коэффициент пересчета АТФ} экстинкци  контрольной пробы Е - экстинкци  пробы после добавлени  гексокиназы; EL.- экстинкци  стандартного ра створа Количество глюкозы определ ют г козооксидазньм методом. Определение содержани  АТФ в эр троцитах проводитс  следукщим образом . Вз тую кровь перенос т в охлажденную до 2-4С пробирку, содержащую 3-4 капли раствора гепарина. Ц трифугируют при 4-2°С Ш мин при 2500-3000 об/мин. Плазма отсасываетс  и выбрасываетс . Пробирки пом щаютс  в лед ную баню. К уплотненн му осадку эритроцитов в пробирке добавл етс  двукратный объект 15%го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ. Через 0 мин вторично центрифугируют 10 мин при 3000 об/м Последукнцие этапы анализа провод т с надосадочной жидкостью. В опытную пробу берут 4 мл 0,05 М раство ра триэтаноламиновогоСТЭА буфера (рН 7,5-7,6), 0,35 мл 0,1 М раствора MgClj, 0,4 мл беэбелкового центрифугата. Содержимое пробирок довод т, до рН 7,4 1-2-м  кагш ми 5 М раствора КлСО. Затем добавл ют 0,05 мл I,О-1,5%-ного раствора гексокиназы. Аналогичную процедуру провод т с контрольной пробой, где вместо раствора гексокиназы берут 0,05 мл ТЭА-буфера. Контрольную и опытную пробу став т в термостат на 20-30 мин при 37 С. Затем в пробах определ ют со90 4 держание глюкозы. Дл  этого в две i пробирки (контроль и опыт) берут 4,5 мл дистиллированной воды, добавл ют по 3 мл дианизидинового реактива (к 50 мл 0,4 М калий-фосфатного буфера при рН 5,9 приливают 1 мл }%-ного спиртового раствора 0-дианизидина и довод т водой до 100 мл, реактив готовитс  в день анализа), В контрольную и опытную пробирку приливают по 0,3 мл раствора из соответствующих пробирок предыдущего этапа анализа, добавл ют по 0,1 мл свежеприготовленного 0,1%-ного раствора глюкозооксидазы, 0,1 мл свежеприготовленного 0,1%-ного раствора пероксидазы или 0,5%-ного раствора гемоглобина и инкубируют 30 мин при 45°С. После инкубации в пробирки добавл ют по 2 мл 50%-ного раствора серной кислоты. Одновременно готов т стандартный раствор 4,7 мл дистиллированной воды, 3 мл дианизидинового реактива, 0,03 мл 100 мг%-ного раствора глюкозы, 0,1 мл 0,1%-ного раствора глюкозооксидазы,0,1 мл р,1%-ного раствора пероксидазы инкубируют 30 мин при 45С. После инкубации добавл етс  2 мл 50%-ного раствора серной кислоты. После охлаждени  содержимого пробирок до комнатной температуры измер етс  экстинкци  растворов на фотоэлектроколориметре в кювете с рассто нием между рабочими гран ми 10мм. Измерение оптической плотности ведетс  против компенсационной жидкости , содержащей 5 мл воды, 3 мл дианизидинового реактива и 2 мл 50%-ного раствора серной кислоты, при ,зеленом светофильтре. Расчет содержани  провод т по приведенной формуле, при этом минимальное содержание АТФ по предлагаемому способу равно 15% и точность определени  АТФ 12-14%. По предлагаемому способу проведено 65 исследований содержани  АТФ в эритроцитах крыс. Исследование проводилось с 13 здоровыми животными (контрольна  группа) и с 52 крысами, отравленными свинцом. В контрольной группе получено следук цее содержание АТФ в эритроцитах , мг%: 37,5; 44,5; 48,7; 50,5; 55,4; 60,8; 69,0; 70,9; 86,2; 94,0; 101,4; 111,5; 114,1. Среднее содержание АТФ 72,7 мг /%.

Средн   ошибка среднего арифметического ±7,4 мг %.

Среднеквадратическое отклонение ±26,5 мг %.

Коэффициент вариации 36,5%.

Отмеченную вариабельность следует отнести за счет индиврщуальных особенностей животного, в частности

за счет различного уровн  обмена в эритроцитах на момент декатизации крыс,

Результаты определени  содержани  АТФ в зритроцитах у крыс, отравленных свинцом, в различные периоды после окон ани  затравки приведены в таблице.

13 Примечани М - среднее арифметич ка среднего, арифметич квадратическое отклон Таким образом, концентраци  АТФ в зритроцитах крыс контрольной группы составл ет 77 мг %. В последние сроки развити  свинцовой интоксикации уровень АТФ в эритроцитах белых крыс повьшаетс . Пример. Свежевз тую кровь лабораторного животного (крысы) 4-8 мл помещают в охлажденную до и смоченную гепарином пробирку. Дл  выделени  эритроцитов пробу кро ви центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин. Отделившуюс  в результате центрифугировани  плазму отсасывают . Дл  осаждени  белков зритро циты смешивают с предварительно охлажденным 15%-ным раствором ТХУ в соотношении 1:1 (1,5 мл эритроцитов и 1,5 мл ТХУ), и пробирку помещают на 10 мин в лед ную баню, после чего вторично центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин. Полученный безбелковый центрифугат собирают в чистую пробирку . Дл  проведени  гексокиназной реaKiyiH в две пробирки (контроль и опыт) приливают реактивы. Затем обе пробирки помещают в термостат при 37 С на 20 мин. В результате до бавлени  раствора гексокиназы в опы ной пробирке протекает гексокина13

13 - число наблюдений; i m - средн   ошибо- , г - средне .. гексокиназа на  реакци : глюкоза + АТФ п-т-г люкозо-6-фосфат + АТФ, в результае которой расходуетс  глюкоза, соержаща с  в зритроцитах. В контрольт ой пробирке уровень глюкозы не изме етс , так как в реагирующей систее отсутствует гексокиназа. Используемый ТЭА-буфер (0,05 м, рН 7,5-7,6) готов т следующим образом . 4,65 г гидрохлорида триэтанол- амина раствор ют в 200 мл дистиллированной воды и добавл ют 11 мл 1н. раствора NaOH, затем полученный раствор довод т дистиллированной водой до 500 мл. После термостатировани  определ ют содержание глюкозы в контрольной и опытной пробирках глюкозооксидазным способом. Дл  этого из контрольной и опытной пробирок берут по 0,3 мл содержащегос  в них раствора и приливают в пробирки, в которые предварительно внесено по 4,5 мл дистиллированной воды и 3,0 мл-дианизидинового реактива. Затем провер ют рН и при необходимости довод т до 5,9, и приливают в обе пробирки по О,1 мл 0,1%-ного раствора глюкс)зооксидазы и 0,1%-ного раствора пероксидазы. Одновременно

Claims (1)

1. Формула изобретения __

   Способ определения аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ ) в крови путем приготовления безбелкового · центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы, отличающийс я тем, что, с целью упрощения способа, в реакционной смеси определяют глюкозу глюкозооксидазным методом после добавления гексокина-. зы и без ее добавления, полученные образцы колориметрируют со стандартным раствором глюкозы, а АТФ^определяют по формуле ”

   44-¾) .

   С - концентрация АТФ>

   К - коэффициент пересчета АТФ,мг%; Е^- экстинкция контрольной пробы·, Е_о- экстинкция пробы после добавления гексокиназы;

   Εςγ- экстинкция стандартного раствора.