SU1252336A1

SU1252336A1 - Штамм @ @ АТ-490 - продуцент целлюлаз

Info

Publication number: SU1252336A1
Application number: SU843755497A
Authority: SU
Inventors: Георгий Иванович Квеситадзе; Ламара Левановна Квачадзе; Тинатин Иосифовна Алексидзе; Любовь Гавриловна Логинова; Ирина Ивановна Иванова; Эмилия Павловна Гужова
Original assignee: Институт микробиологии АН СССР; Институт Биохимии Растений Ан Гсср
Priority date: 1984-06-27
Filing date: 1984-06-27
Publication date: 1986-08-23

Abstract

Штамм Aspergillus terreusAT- 490 (коллекци Центрального музе промышленных микроорганизмов ВНИИ- генетика, коллекционный номер ЦМПМ F-232) - продуцент целлюпаэ. (Л

Description

Изобретение относитс к микробиологической промьгашенности, в частности к получению целлюлолитических ферментов микробного происхождени , используемых в процессе осахарива- ни целлюлозы.

Цель изобретени - штамм микроскопического гриба т продуцент термостабильных высокоактивных целлюлаз, катализирующих превращение целлюлозы в глюкозу.

Предлагаемый штамм Aspergillus terreus АТ-490 получен в результате ультрафиолетового облучени исходного штамма Aspergillus terreus 17Р дозой 6400 Дж/м .

Чтамм депонирован в Центральном музее промьшшенных микроорганизмов Института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ F-232.

Предлагаемый штамм имеет следующу характеристику.

Культурально-морфологические признаки .

Культура хорошо развиваетс на среде Чапека-Докса, модифицированной среде Чапека-Докса с добавлением кукурузного экстракта и полоски фильтровальной бумаги на поверхности агара, сусло-агаре, а также на природных питательных субстратах.

Среда Чапека-Докса. На 5-е сутки колонии желтоватые, постепенно пёреход вще в бежевый цвет, бархатистые , плоские. Обратна сторона бес цветна . Мицелий гриба имеет тонкие гифы, слабо септированные или совсем не септированные. Средн толщина гиф 3-4 мк, Конидиеносцы гладкие, бесцветные, до I00 мк в длину и 6- 8 мк в ширину. Пузыри полусферические 15-18 мк в диаметре. Их верхн часть покрыта стеригмами. Стеригмы двухъ русные,обычно тесно прилегающие , стерип-ш первого руса (3-4) 2 мк, второго руса (5-6)-2 мк. Конидиии эллиптические, гладкие, встречаютс по отдельности или соединены в цепочки. Диаметр конидии 2- 3 мк.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм хорошо усваивает лактозу, глюкозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу и целлюлозу. Слабее усваивает араби- нозу, галактозу, юуахмал и маннит. Не усваивает рамиозу, рафинозу, ман- нозу и сорбит. Из источников азота хорошо усваивает органические и неорганические соединени азота. Наиболее интенсивный рост наблюдаетс на нитратах. Усваивает разнообразные фосфорные соединени , однако более

1Штенсивно одно- и двузамещенный фос форнокислый калий. Штамм высокую эн- доглюканазную (р-1 ,4-1 -глюкан-4- -глюканогидролазы) и целлобиазную активности вы вл ет в пределах рН

4,5 - 4,6. Оптимальна температура дл роста и биосинтеза . Штамм гидролизует целлюлозу (разные целлюлозные субстраты). Наблюдаетс высока эндоглюканазна и целлобиазна

активности на среде, содержащей сено в качестве единственного источника углерода.

Целлюлаза предлагаемого штамма термостабильна - после ведени ферментативной реакции при 70°С в течение часа активность почти полностью сохран етс .

Дл размножени штамма примен ют модифицированную агаризованную среду

Чапека-Докса состава, %: NaNOg 0,3; ,0,2; MgSO -yHjO 0,05; кукурузный экстракт 1,5; агар-агар 2,0, полоска фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды 6,3.

Посевным материалом служит суспензи 20- суточной культуры штамма, выращенной на модифицированной среде Чапека-Докса. Дл получени иеллюлаз используют жидкую питательную среду

состава, %: NaNO,0,30; КН,РО 0,2; MgSO, 0,05; сено 2; кукурузный экстракт 1,5, рН среды 4,5.

150 мл питательной среды в конических колбах емкостью 250 мп стерилизуют 40 мин при 0,7 атм. Максимальна активность целлюлаз отмечаетс при выращивании штамма на термостатированной качалке, делающей 270 об/мин при 40 С в течение 96 ч и равна:

активность эндоглюканазы по КМЦ

20 ед/мп, активность по фильтровальной бумаге 0,5 ед/мп, по целлобиа- зе 0,5 ед/мл.

Эндоглюканазную активность определ ют по действию фермента на Na КМЦ следующим образом, I мл 1,5%- ного раствора субстрата в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют в

течение 30 мин при 60 С. За единицу активности принимают количество фермента , образующее 1 мкмоль восста- навливакмцих Сахаров при 1%-ной кон3

центрации субстрата в минуту. Количество восстанавливающих сахароз определ ют по методу Сомоджи-Нель- сона.

Активность по фильтровальной бумаге определ ют следующим образом . 50 мг фильтровальной бумаги Ватман (16 см) в 1 мл 0,05 ацетатного буфера (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют течение часа при 55°С. За единицу активности принимают количество фемента , образующего 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров в минуту. Количество восстанавливающих сахароз определ ют по методу Сомоджи-Нель- сона.

Целлобиазную активность определ ют следующим образом. 0,2 мл моль целлобиазы, 1,6 мл 0,05М ацетатного буфера (рН 4,7) и 0,2 мл раствора культуральной жидкости инкубируют в течение

10 мин при 55 С. За единицу активности принимают количество фермента, образующее 2 мкмоль глюкозы за I мин при концентрации целлобиазы 2 10 моль. Определение глюкозы провод т глюкоэооксидазным методом.

Кроме высокоактивных целлюлаз предлагаемый продуцент образует богатую белком (35-40%) биомассу.

Пример 1. Штамм Aspergillus „terreus АТ-490 выращивают на агари- зованной среде, содержащей, %: кукурузный экстракт 1,5; NaNO 0,3; 0,2; MgSO -7H20 0,05, рН и полоску фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды 6,3. Культивирование провод т в течение 72 ч при 40 С. Суспензией спор, полученной смывом с указанной среды, засевают колбы емкостью 250 мл, содержащие 150 мл среды состава, %: сено 2,0, кукурузный экстракт 1,5; NaNO-j 0,3; KH-jP04 0,2; MgSO 7Н20 0,05, рН среды 4,5. Выращивание культуры провод т на круговой качалке (270 об/мин) в течение 72 ч при

s 0 5

0

5

0

5

0

5

70 С

40°С. Мицелий с остатками сена отдел ют , и в культуральной жидкости определ ют активности целлюлаз по указанным методам. Активность эндоглю- каназы по Na КМЦ 14,5 ед/мп, активность по фильтровальной бумаге 0,32 ед/мл; по целлобиозе 0,35 ед/мл.

Пример 2. Штамм Aspergillus terreus АТ-490 выращивают согласно примеру 1 в течение 96 ч. Активность целлюлаз определ ют аналогично примеру 1 .

Активности ферментов в культуральной жидкости составл ют, ед/мл: эндоглюконаза по Na КМЦ 20; активность по фильтровальной бумаге 0,5; по хлопку 0,9-1,0; целлобиаза 0,5 ед/мл; ксиланаза 7-8.

При выдерживании препарата при

в течение часа активности почти полностью сохран ютс .

Мутант Asp. terreus АТ-490 обладает не только набором всех ферментов целлюлазного комплекса, но также и высокой ксиланазной активностью. В препаратах целлюлаз ксиланаза обеспечивает более полное расщепление сельскохоз йственных отходов до глюкозы . Ксиланазы гидролизуют геми- целлгапо.зу, котора содержитс в растительных и природных субстратах, таких как солома, древесина и т.д.

Пример 3. Штамм Asp. terreus АТ-490 выращивают в колбах Эрленмей- ера емкостью 250 мл, содержащей 100 мл среды состава, г/л водопроводной воды: древесные опилки, измельченные на шаровой мельнице до размеров 0,2-1,0 мм 20,0; NaNO 3,0; 2,0; MgS0.7H,,0 0,5, рН„, 4,2- 4,6, в течение 96 ч, на круговой качалке (230 об/мин)при 40 С.

Культуральную жидкость отдел ют от биомассы центрифугированием и опре дел ют активность по указанным методам .

Активность ферментов представлена в таблице.

Claims

ШТАММ А5РЕКС1ЫЛ15 ТЕКНЕиЗ АТ490 - ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗ Штамм АарегегПиз ИеггеизАТ490 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ Р-232) - продуцент целлюлаэ.

«о

00

00

>

1252336
2