SU1094346A1 - Штамм @ @ ВУД @ -2 N @ 203-продуцент амилолитических ферментов,используемых дл осахаривани крахмалсодержащего сырь при производстве спирта и способ получени амилолитических ферментов дл осахаривани - Google Patents

Abstract

1. Штамм Aspergilltis awamori ВУД Т-2 (коллекци  Музе  промьшшенных кольтур микроорганизмов ВНИИ Генетика, коллекционный № F 203) продуцент амилолитических ферментов, используемых дл  осахаривани  крах- малсодержащего сырь  при производстве спирта. 2. Способ получени  амилолитических ферментов дл  осахаривани  крахмалсодержащего сырь  при производстве спирта, предусматривающий выращивание посевного материала продуцента Aspergillus awamori, ириготрвление производственной питательной среды путем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальной об-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение; посев культуры продуцента, ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двум  дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокул цией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно в (Л процессе ферментации, о т л ич а ющ и и с   тем, что, с целью сокращес: ни  сроков культивировани  продуцента , повышени  активности ферментов и получени  нар ду с амилолитическими ферментами целлюлозы и протеазы, необходимых дл  осакаривани  при производстве спирта, в качестве проду цента используют штамм Aspergillus о awamori ВУД Т-2 № F 203, а в питасо тельную среду двум  дозами в соотно«lib шении .3:1- ввод т в качестве стабилиС затора рН углекислый калыщй или ломитовую муку в количестве от 1 до Ф 10%, причем большую дозу внос т на стадии получени  посевного материала в инокул тор, а меньшую - на стадии ферментации по истечении 20-24 ч от начала процесса совместно с диа 5монийфосфатом . 3. СпЬсоб по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что количество по- ; сёвного материала, вводимого на ферментацию , устанавливают равным 3-10%.

Description

Изобретение относитс  к микробиологической и спиртовой промышленности и касаетс  нового штамма-продуцен та амилолитических ферментов и способа получени  амилолитических фёрментов дл  осахаривани . Известны штаммы грибов из рода Aspergillus - продуценты амилолитических .ферментов lj . Из известных штаммов наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту  вл етс  термостабильный штамм Aspergillus awarao ri Т-1 № 464 - продуцент амилолитических ферментов zl , Существенным недостатком известно го штамма  вл етс  невысока  активность глюкоамилазы - 45-50 ед/мл и отсутствие других ферментов, необходимых дл  осахаривани . Известен способ получени  амилолитических ферментов, используемых дл  осахаривани  крахмалсодержащего сьтрь  при производстве спирта, преду сматривающий выращивание посевного материала, приготовление питательной среды, культивирование продуцентов на питательной среде,, содержащей гид ролизат кукурузной муки 3j . Недостатком этого способа  вл етс  длительность процесса получени  ферментов. Известен также способ культивиройани  Aspergillus awamori - 466 на питательной среде, содержащей гидролизованную солодом или альфа-амилазой кукурузную муку и в качестве ста билизатора рН доломитовую муку в количестве 1,5-3,0%. Активность амилолитических ферментов через 120-130 ч ферментации соответственно глюкоамилазы - 160 ед/мл, а ct амилазы 45 ед/мл. Способ обеспечивает выход спирта 65,5 дал/т усл. крахмала {4. Недостатком способа  вл етс  неспособность штамма-продуцента синтезировать комплекс ферментов, содержа щий помимо амилолитических ферментов целлюпазы и протеазы, необходимые дл  эффективного осахаривани  крахмалсодержащего сырь  при производстве спирта, а также неустойчивость продуцента к повьш1енным температурам Из известных способов наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту  вл  етс  способ получени  амилолитических ферментов дл  осахаривани  крахмалсодержащего сырь  при производстве спирта, предусматривающий вьфащивание продуцента Aspergillus awamori на. питательной среде, содержащей крахмал, азотнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислое железо и солодовые ростки, приготовление производственной питательной среды путем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальнойoi-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение, посев культуры продуцента, ферментацию и введение диаммонийфосфата двум  дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокул цией посевного материала с последующей стерилизацией и повторно - в процессе ферментации 5 . Известный способ,хот  и обеспечивает получение препарата с высокой глюкоамилазной активностью, однако содержит лишь следы ot-амилазы (до 4 ед/мб), что требует при осахаривании введени  дополнительньк источников о(,-амилазы. Целью изобретени  в части штамма  вл етс  получение термостабильного штамма - продуцента амилолитических ферментов, продуцирующего комплекс ферментов, необходимых дл  осахаривани  крахмалсодержащего сырь  при производстве спирта. Цель достигаетс  тем, что в качестве продуцента амилолитических ферментов используетс  термостабильный штамм Aspergillus awamori ВУД Т-2. Штамм зарегистрирован в коллекции Музе  промьшшенных культур микроорганизмов ВНИИ Генетика.; коллекционный номер F 203. Штамм Aspergillus awamori ВУД Т-2 № F 203 получен в результате двухступенчатой селекции исходного штамма Т-1. На первом этапе конидии обрабатывали химическим мутагеном-этиленимином в концентрации 1:1000 в течение 1 ч с последующим рассевом на среду Чапека с высокой концентрацией крахмала (6-8%). На втором этапе применен метод поддерживающей селекции с целью выбора и сохранени  наиболее активного продуцента Aspergillus awamori ВУД Т-2 N-F 203. Диаметр колонии на 5 сут 20-24 мм, зона гидролиза крахмала 10-15 мм. Конидии круглые с шипами.

На среде с мальтозой характеристика колонии аналогична предьщущей. Диаметр колонии 25-27 мм, конидиеобразование менее плотное.

На сахарозе - колони  кругла , слабо скаладчата , с обильным образованием конидий по всей поверхности. Центр колонии плоский, темно-коричневый с оливковым оттенком. В среду вьщел етс  коричнево-красный пигмент Размер колоний 18-20 мм.

На лактозе - колони  кругла , плоска  с очень слабым конидиеобразованием по всей поверхности колонии. Споры светло-коричневые. В среду выдел етс  слабо розовый пигмент. Размер колонии 10-15 мм.

Отношение к источникам углерода:

культура гидролизует К1захмал, дикстрины, мальтозу, паннрзу, изомальтозу , сахарозу с образованием глюкозы. Потребл ет без выделени  газа глюкозу, маннит, сорбит. Слабо растет на лактозе и ксилозе.

Отношение к источникам азота:

культура хорошо ассимилирует аммонийные соли органических кислот, нитраты. Потребл ет мочевину, аспарагин , пептон, каз.еин, аминокислоты.

Температурный оптимум роста штамма 35-40°С. Развиваетс  при концентШтамм-продуцент

рации водородных ионов от 2,8-8,0. Азроб. Не обладает токсическими свойствами .

Дл  проверки ферментативной активности предлагаемого штамма ВУД 1-2 № F 203 провод т опыты по глубинному культивированию его в качалочных колбах вместимостью 750 мл со 100 мл питательной среды на качалке, делающей 200-230. об/мин.

Дл  биосинтеза глюкоамилазы использовали питательную среду следующего состава, мас.%:

6,0

Крахмал картофельный 0,91

NaNO 0,1

0,05

КС1 0,05

MgS04 0,001

ГеЗОд 3,0

Солодовые ростки

Вода Остальное.

Вьфащивание осуществл ют в течение 72 ч при 35-40с. Глюкоамилазную активность определ ли по ГОСТ 20264. 4-74. Штамм синтезировал нар ду с глюкоамилазой протеазу, амилазу, целлюлазу и липоксигеназу.

Сравнение активностей предлагаемого штамма и прототипа приведены в табл. 1.,

Таблица 1

Активность, ед/мл

ГлА

Прототип Asp. awamori Предлагаемьй Asp. awamori № F 203 Из табл 1 видно, что глюкоамилазна  активность предлагаемого штамма превышает активность прототипа на полусинтетической среде в 1,5-2 раза (60-100%). Кроме того, предлагавмый продуцент синтезирует другие .ферменты:об-амилазу, протеазу, целлю лазу и липоксигеназу.

Сх

ПС

0,1-0,2

1,5-3,0 0,5-1,0 2-4

20-25 Целью изобретени  в части способа  вл етс  сокращение сроков культивировани  продуцента, повышение активности ферментов иполучение нар ду с амилолитическими ферментами целлют.зы и протеазы, необходимых дл  осахаривани  крахмалсодержащего сьфь  при производстве спирта. S1 Цель достигаетс  тем, что при спо собе получени  амилолитических ферме тов дл  осахаривани  крахмалеодержащего сырь  при производстве спирта, предусматривающем выращивание посевного материала продуцента Asp. awamo ri, приготовление производственной питательной среды путем гвдролиза: ку курузной муки солодом или бактериаль ной об-амилазой, разваривание, вакуум- охлалщение , посев культуры - продуцента , ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двум  дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокул цией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно - в процессе ферментации, в качестве продуцента используют щтамм Aspergillus awamori ВУД Т-2 № 203, а в питательную среДУ двум  дозами в соотнощении 3:1 ввод т в качестве стабилизатора рН углекислый кальций или доломитовую муку в количестве от 1 до 10%, причем большую, дозу внос т на стадии получени  посевного материала в инокул тор , а меньшую - на стадии фермента ции по истечении 20-24 ч от начала процесса совместно с диаммонийфосфатом . Согласно изобретению количество посевного материала, вводимого на ферментацию, устанавливают равным 3-10%. Предлагаемый способ получени  амилолитических ферментных препаратов дл  осахаривани  крахмалсодержащего сырь  заключаетс  в следующем. Посев ной материал в колбах готов т на жид кой питательной среде, содержащей картофельный крахмал, азотнокислый натрий, фосфорнокислый калий, сернокислый магний, хлористый калий, сернокислое железо и солодовые ростки. Вьфащивание осуществл ют в течение 20-24 ч при 28-30с, Подготовленную жидкую посевную культуру; передают на стадию культивировани  в инокул тор . Дл  культивировани  посевной культуры в инокул торе используетс  среда следующего состава, мас.%; Мука5-8 Кукурузный экстракт 1 Стабилизатор рН 0,75-7,5 Дл  ферментации в производственных услови х жидкую питательную среду готов т следующим образом. Куку узную муку смешивают с водой в. со6 отношении 1:3, разваривают при 148154 С в течение 30-50 мин охлаждают до 60, С и осахаривают солодовым молоком или бактериальной о -амилазой в течение 30-40 мин при 58-60с. .Затем ввод т диаммонийфосфат в количестве 0,2 мас.%, стерилизуют при 120-125°С в течение 30-40 мин и охлаждают до 35-40 С. После охлаждени  в подготовленную ю питательную среду ввод т посевной материал из инокул тора. Продолжительность кулитивированй  посевного материала в инокул торе составл ет 20-24 ч при 28-30°С, непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом. На стадию ферментации передают посевной материал в количестве 3-10% к объему среды. Ферментацию осуществл ют при 3540 С, непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом (3040 м/M среды в 1 ч) . Через 20-24 ч от начала процесса ферментации в среду ввод т оставшуюс  часть диаммонийфосфата (0,1 мас.% к объему среды ) совместно с оставшейс  частью стабилизатора рН (0,25-2,5%). Продолжительность ферментации 120-130 ч. Готова   культура имеет следующую активность :.--глюкоамилаза 125 130 ед/мл, -амилаза 20-25 ед/мл, протеаза 0,5-1,0 ед/мл, целлюлаза 24 ед/мл. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала. П р и м е р 1. Посевной материал spergillus awamori ВУД Т-2 № F 203 колбах выращивают на питательной реде следующего состава, мас,%: Крахмал картофельный 6,0 ,91 КНлРО 0,1 KCI, 0,05 ,05 FeS04 .0,01 Солодовые ростки .3,0 ВодаОстальное рН устанавливают равным 4,8. Выащивание осуществл ют в течение 0 ч при 30°С. . Дл  культивировани в инокул торе итательна  среда содержит следующие омпоненты мас.%: Кукурузна  мука 6,0 Кукурузный экстракт 1 Углекисльй кальций 0,75 Производственную среду готов т ледующим образом. Кукурузную муку мешивают с водой при 45°С в соотно 710 шении 1:3, полученную массу разваривают при 148°С в течение 30 мин. Разваренную массу охлаждают до 60 С, осахаривают солодовым молоком в течение 30 мин, ввод т 0,2 мас.% диаммонийфосфата , стерилизуют при 120 С в течение 30 мин, охлаждают до 35°С и ввод т посевной материал из инокул тора в количестве 10%, Ферментацию провод т при 35 С, давлении 0,03 МПа и аэрации стерильным воздухом в количестве 30-40 м/м среды в 1 ч при непрерывном перемешивании турбинной мешалкой с 150 об/мин. Через 24 ч после начала ферментации в среду ввод т вновь диаммонийфосфат в количестве 0,1 мас.% и угле кислый кальций CaCO-j в количестве 0,28 мас.%. Продолжительность фермен тации составл ет 130 ч. Активность ферментов составл ет: глюкоамилаза 120 ед/мл, 06 -амилаза 20 ед/мл, протеаза 1 ед/мл, целлюпаза 2 ед/мл. Пример 2. Посевной материал готов т аналогично примеру 1 и произ водственную питательную среду .готов  аналогично примеру 1. Только на стадии приготовлени  посевного материала ввод т стабилизатор рН. - доломито . вую муку в количестве 7,5 мас.% и диаммонийфосфат - 0,3%. Гидролиз (осахаривание) кукурузной муки прово д т бактериальной ix;-амилазой. Концен рацию сусла устанавливают 18 мас.% и провод т ферментацию. Ферментацию осуществл ют на производственной сре де следующего состава, мас.%: Кукурузна  мука25 ВодаОстальное. По истечении 24 ч от начала процесса ферментации в среду ввод т 0, диаммонийфосфата и 2,5% доломитовой муки. Ферментацию ведут в течение 120 ч. Культура имеет следующую активность (ед/мл):Об-амилаза 30, глю коамилаза 130, протеза 0,5, целлюла за 1,2. П р и м 6 р 3. Посевной материал Aspergillus awamori ВУД Т-2 № F 203 в колбах выращивают на питательной среде следующего состава, мас.%4 Крахмал картофельный 6,0 KHjPOi 6 СоЛодовые ростки 3,0 ВодаОстальное. рН устанавливают равным 4,8. Выращивание осуществл ют в течение 20 ч при 30 с. Дл  культивировани  в инокул торе питательна  среда содержит следующие компоненты, мас.%: Кукурузна  мука 6,0 Кукурузный экстракт 1,0 Углекислый кальций 3,75 Производственную среду готов т аналогично примеру 1 и ввод т посевной материал из инокул тора в количестве 6%. Ферментацию проводит при35°С , давлении 0,03 МПа и аэрации стерильным воздухом в количестве 3040 среды B.I ч при непрерьгоном перемешивании турбинной мешалкой с 150 об/мин. Через 24 ч после начала ферментации в среду ввод т вновь диаммонийфосфат в количестве 0,1 мас.%, углекислый кальций СаСОа в количестве 1,25 мас.%. Продол}| ительность ферментации составл ет 130 ч. Активность ферментов составл ет: глюкоамилаза 126 ед/мл, об-амилаза 22 ед/мл, протеаза 0,8 ед/мл, целлюлаза 3 ед/мл. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала. Пример 4. Посевной материал и/производственную питательную среду готов т аналогично примеру 1, только ввод т в количестве 3%. На стадии приготовлени  посевного материала ввод т стабилизатор рН - доломитовую муку 5,25% и диаммонийфосфат 0 ,5%. Гидролиз (-осахаривание) кукурузной муки провод т бактериальной i-амилазой. Концентрацию сусла устанавливают 18 мас.% и провод т ферментадаю .Ферментацию осуществл ют на производственной среде следующего состава, мас.%: кукурузна  мука 25, вода - остзльнс э. По истечение 24 ч от начала продесса ферментации в среду ввод т 0,2% диаммонийфосфата и 1,75% доломитовой муки. Ферментацию ведутв течение 120 ч. Культура имеет следующую активность, (ед/мл): ti6-амилаза 28, глюкоамилаза 128, протеаза 0,5, целлшггаза 1,6. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала. Пример 5. Способ осуществл  Сй .аналоги4но примеру 1, но стабилизр тор ввод т в соответствии со способом-протртипом - один раз в производ- и цеЛлюлазы не рбнаруживает ственную среду перед стерилизацией с ,

в количестве 3%. Активность глюкоами- Преимущества способа по сравнению лазы 100 ед/мл. Активность протеазы с прототипом представлены в табл.2.

: 5 . . Таким образом, изобретение обеспечивает сокращение сроков культивировани  продуцента, повьшение активноеТабли .ца 2 ти амилолитических ферментов и получение нар ду с амилолитическими ферментами целлкшазы и протеазы.

Claims (3)

1. ШТАММ ASPERGILLUS AWAMORI ВУД Т-2 № F 203 ПРОДУЦЕНТ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ СПИРТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ (57) 1. Штамм Aspergilliis awamori ВУД Т-2 (коллекция. Музея промышленных кольтур микроорганизмов ВНИИ ' Генетика, коллекционный № F 203) продуцент амилолитических ферментов, используемых для осахаривания крахмал содержащего сырья при производстве спирта.
2. 2. Способ получения амилолитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание посевного материала продуцента Aspergillus awamori, приготрвление производственной питательной среды путем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальной об-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение; посев культуры продуцента, ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двумя дозами соответственно в гидро лизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно в процессе ферментации, отличающийся тем, что, с целью сокращения сроков культивирования продуцента, повышения активности ферментов и получения наряду с амилолитическими ферментами целлюлозы и протеазы, необходимых для осахаривания при производстве спирта, в качестве продуцента используют штамм Aspergillus awamori ВУД Т-2 № F 203, а в питательную среду двумя дозами в соотношении .3:1- вводят в качестве стабилизатора pH углекислый кальций или доломитовую муку в количестве от 1 до 10%, причем большую дозу вносят на стадии получения посевного материала в инокулятор, а меньшую - на стадии ферментации по истечении 20-24 ч от начала процесса совместно с диаммонийфосфатом.
3. 3. Способ по п. ^отличающийся тем, что количество по- : сёвного материала, вводимого на ферментацию, устанавливают равным 3-10%.