SK443885A3 - Dna sequence, a plasmid, vector, host cell, polypeptide of an erythropoietin-type, method of its production and pharmaceutical composition based thereon - Google Patents

Description

Sekvencia DNA, plazmid, vektor, hostitelská bunka, polypeptid typu erytropoietínu, spôsob jeho výroby a farmaceutický prostriedok na jeho bázeDNA sequence, plasmid, vector, host cell, erythropoietin-type polypeptide, process for its manufacture and pharmaceutical composition based thereon

Oblasť; technikyArea; technique

Vynález sa týka sekvencie DNA, plazmidu, vektoru, hostitelskej bunky, polypeptidu typu erytropoietínu, spôsob jeho výroby a farmaceutického prostriedku na jeho báze. Osobitne sa vynález týka sekvencie DNA na použitie k zaisteniú/expresie polypeptidového produktu, ktorého štruktúra aspoň sčasti zodpovedá primárnej štruktúre erytropoietínu na zaistenie jeho.The invention relates to a DNA sequence, a plasmid, a vector, a host cell, an erythropoietin type polypeptide, a process for its manufacture, and a pharmaceutical composition based thereon. In particular, the invention relates to a DNA sequence for use in securing / expressing a polypeptide product, the structure of which at least in part corresponds to the primary structure of erythropoietin to assure it.

„ h ic· L biologických vlastnosti, v prokaryorftných alebo eukaryontnych » * c L i cT. , hostiteťských bunkách, prokary<3htnej a eukaryogtpej hostitelskej bunkj£ transformovanej touto sekvenciou DNA, plazmidu alebo vektoru obsahujúceho túto sekvenciu DNA, hore charakterizovaného polypeptidu a spôsobu jeho výroby a farmaceutického prostriedku na jeho báze. Pojem sekvencia DNA sa používa zamenitelne s pojmami reťazec DNA alebo sled DNA."H ic · L biological properties, either prokaryorphic or eukaryotic". , host cells, prokaryotes and eukaryogenic host cells transformed with the DNA sequence, a plasmid or a vector comprising the DNA sequence, the above-described polypeptide, and a process for its manufacture, and a pharmaceutical composition based thereon. The term DNA sequence is used interchangeably with the terms DNA strand or DNA sequence.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

A. Manipulácia s genetickými materiálmiA. Handling of genetic materials

Genetické materiály je možné v širšom význame definovať; ako tie chemické štruktúry, ktoré plánujú a uskutočňujú výrobu zložiek buniek a vírusov. Polymérne látky s dlhým reťazcom, kyseliny desoxyribonukleové (DNA) nesú genetický materiál všetkých živých buniek a vírusov s výnimkou niektorých vírusov, ktorých genetický materiál nesie kyselina ribonukleová (RNA). Opakujúcimi sa jednotkami v polymérnej molekule DNA sú štyri rôzne nukleotidy, z ktorých každý je tvorený purínom (adenín alebo guanín) alebo pyrimidínom (tymín alebo cytozín), viazaným na desoxyribózu s naviazanou fosfátovou skupinou. Väzba nukleotidov v lineárnej polymérnej forme sa uskutočňuje prost\ϊ redníctvom 5'-fosfátu nukleotidu na jednej strane a prostredníctvom 3'-hydroxylovej skupiny na strane druhej. Funkčná DNA sa vyskytuje vo forme dvojitých stálych reťazcov, ktoré vznikajú z jednoduchých reťazcov nukleotidov (nazývaných deoxyoligonukleotidy), reťazce sú spojené vodíkovou väzbou medzi purínovými a pyrimidínovými bázami (ide teda o komplementárne spojenie medzi adenínom (A) a tymínom (T) alebo guanínom (G) a cytozínom (C)). Nukleotidy sú obyčajne nazývané podlá jednotlivých purínových a pyrimidínových báz a komplementárne spojenie nukleotidov v DNA s dvojitým reťazcom (tzn. A-T a G-C) je nazývané páry báz. Ribonukleová kyselina je polynukleotid, ktorý obsahuje adenín, guanín, cytozín a miesto tymínu uracil (U) viazaný na ribózu a fosfátovú skupinu.Genetic materials can be broadly defined; as those chemical structures that plan and carry out the production of cell and virus components. Long-chain polymeric substances, deoxyribonucleic acids (DNA) carry genetic material of all living cells and viruses, with the exception of some viruses whose genetic material is carried by ribonucleic acid (RNA). The repeating units in the polymeric DNA molecule are four different nucleotides, each consisting of a purine (adenine or guanine) or a pyrimidine (thymine or cytosine) bound to a phosphate-linked desoxyribose. Binding of nucleotides in linear polymeric form is effected by means of ϊ 5'-phosphate nucleotide on the one hand and via a 3'-hydroxyl group on the other. Functional DNA occurs in the form of double stable strands, which arise from single strands of nucleotides (called deoxyoligonucleotides), the strands being linked by a hydrogen bond between the purine and pyrimidine bases (ie, a complementary link between adenine (A) and thymine (T) or guanine ( G) and cytosine (C)). Nucleotides are commonly referred to as individual purine and pyrimidine bases, and the complementary association of nucleotides in double-stranded DNA (i.e., A-T and G-C) is called base pairs. A ribonucleic acid is a polynucleotide that contains adenine, guanine, cytosine, and a urine (U) thymine site bound to a ribose and phosphate moiety.

Veľmi krátko uvedené, plánovacia funkcia DNA je obyčajne uskutočňovaná postupom, pri ktorom dochádza k prepisu sledu nukleotidov (génu) do pomerne nestálej mRNA. Táto mRNA slúži ako templát na tvorbu štruktúrnych, riadiacich a katalytických bielkovín z aminokyselín. Proces translácie za účinnosti mRNA v sebe zahŕňa interakcie malých reťazcov RNA (tRNA), ktoré sú kľúčom pre prenos jednotlivých aminokyselín v priebehu reťazca mRNA, aby tak mohlo dôjsť k tvorbe polypeptidov so správnym sledom aminokyselín. Toto posolstvo mRNA, odvodenej od DNA a zaisťujúcej interakciu tRNA a orientáciu ktorejkokoľvek z dvadsiatich aminokyselín je podkladom pre expresiu na základe tripletov (kodónov), tzn. sledov troch po sebe idúcich nukleotidov. Tvorba bielkoviny je vrcholnou formou expresie plánovaného genetického posolstva, ktoré je ukryté v slede nukleotidov určitého génu.Very briefly, the DNA scheduling function is usually accomplished by a process that transcribes the nucleotide sequence (gene) into a relatively unstable mRNA. This mRNA serves as a template for the production of structural, control and catalytic proteins from amino acids. The translation process under mRNA efficiency involves the interactions of small RNA strands (tRNAs), which are key to the transfer of individual amino acids along the mRNA strand, so that polypeptides with the correct amino acid sequence can be produced. This DNA-derived mRNA message providing tRNA interaction and orientation of any of the twenty amino acids is the basis for triplet (codon) expression; sequences of three consecutive nucleotides. Protein formation is the ultimate form of expression of a planned genetic message that is hidden in the nucleotide sequence of a particular gene.

Promotory sú sledy DNA, ktoré sú obyčajne uložené pred génom v polyméri DNA a predstavujú miesto, v ktorom začína transkripcia do mRNA. Riadiacim sledom DNA, nachádzajúcim sa obyčajne tiež pred génom v danom polyméri DNA zahŕňa bielko- 3 vinu, ktorá určuje častost alebo rýchlosť, počiatku transkripcie.Promoters are sequences of DNA that are usually inserted upstream of a gene in a DNA polymer and represent the site at which transcription into mRNA begins. The DNA control sequence, usually also upstream of the gene in a given DNA polymer, includes a protein guideline that determines the frequency or rate of the transcription start.

Systém promotor/riadiaci sled alebo len riadiaci systém je teda sled, ktorý je uložený pred génom (alebo pred génmi) vo funkčnom polyméri DNA a ktorý určuje či dôjde k transkripcii a prípadne k expresii určitého génu. Sledy DNA, ktoré sú uložené za génom alebo za génmi v polymérnej DNA znamenajú signál pre ukončenie transkripcie do mRNA, ide tedy o terminačné sledy.Thus, a promoter / control sequence or control system alone is a sequence that is inserted upstream of a gene (or genes) in a functional DNA polymer and that determines whether a particular gene will be transcribed and optionally expressed. The DNA sequences that are located downstream of the gene (s) in the polymeric DNA provide a signal to terminate transcription into mRNA, i.e., termination sequences.

Stredom pozornosti mikrobiológov v poslednom desaťročí bolo úsilie o priemyslovú výrobu látok, dôležitých z priemyslového alebo farmaceutického híadiska pri použití organizmov, ktoré vo svojom genetickom materiáli pôvodne nemali zahrnutú informáciu, týkajúcu sa požadovaného produktu alebo (v prípade cicavčích buniek v tkanivovej kultúre) pri nich obyčajne nedochádza k expresii chromozomálneho génu vo väčšom meradle.The focus of microbiologists in the last decade has been the industrial production of substances important from an industrial or pharmaceutical point of view, using organisms that did not initially have information in their genetic material regarding the desired product or (in the case of mammalian cells in tissue culture) there is no large-scale expression of the chromosomal gene.

V tomto prípade sa gén, ktorý je špecifický pre štruktúru požadovaného polypeptidu buď izoluje z organizmu, ktorý tento gén obsahuje, alebo sa vyrobí chemicky a potom sa nastálo včlení do iného organizmu, ktorým je obvykle normálnym spôsobom sa rozmnožujúci jednobunkový organizmus, napríklad baktéria, kvasinka alebo cicavčia bunka v tkanivovej kultúre.In this case, a gene that is specific for the structure of the polypeptide of interest is either isolated from the organism containing the gene, or is produced chemically and then continuously incorporated into another organism, which is normally a normal single-cell multiplying organism, such as bacteria, yeast. or a mammalian cell in tissue culture.

Ako náhle k tomu raz dôjde, dôjde aj k bežnej činnosti existujúceho mechanizmu bunky v tejto transformovanej bunke po transfekcii ku konštrukcii požadovaného produktu, pričom exogénna DNA sa používa ako templát na transkripciu mRNA s nasledujúcou transláciou za vzniku kontinuálneho sledu aminokyselinových zvyškov.Once this occurs, the normal operation of the existing cell mechanism in this transformed cell after transfection to construct the desired product occurs, whereby exogenous DNA is used as a template for transcription of mRNA followed by translation to produce a continuous sequence of amino acid residues.

V odbore je známy celý rad publikácií, ktoré sa týkajú metód s použitím rekombinantnej DNA na izoláciu, syntézu, čistenie a množenie genetického materiálu na použitie k transformácii zvoleného hostitelského organizmu. V US patentovom spise č. 4 237 224 (Cohen a ďalšie) sa napríklad opisuje transformácia jednobunkového hostiteľa pôsobením hybridnej vírusovej alebo cirkulárnej plazmidovej DNA, ktorá obsahuje zvolené sledy exogénnej DNA; Pri vykonávaní spôsobu, ktorý je zahrnutý v uvedenom patentovom spise sa postupuje tak, že sa najskôr získa vektor pre transformáciu enzymatickým rozštiepením vírusovej alebo cirkulárnej plazmidovej DNA za vzniku ^s lineárnych reťazcov DNA. Použitím obdobných enzýmov sa potom pripravia vybrané exogénne alebo heterologné reťazce, ktoré obyčajne obsahujú kódovú oblasť pre požadovaný produkt, a to tiež v lineárnej forme. Lineárna vírusová alebo plazmidová DNA sa potom inkubuje s exogénnou DNA v prítomnosti enzýmov pre väzbu, ktoré umožňujú opätovné naviazanie fragmentov za vzniku hybridných vektorov, ktoré obsahujú zvolený segment exogénnej DNA, ktorý je vsunutý do vírusovej alebo cirkulárnej plazmidovej DNA.A number of publications are known in the art regarding methods using recombinant DNA for the isolation, synthesis, purification and propagation of genetic material for use in transforming a selected host organism. U.S. Pat. No. 4,237,224 (Cohen et al.) Describes, for example, the transformation of a single-cell host by treatment with hybrid viral or circular plasmid DNA which comprises selected sequences of exogenous DNA; In carrying out the method encompassed by said patent, one proceeds by first obtaining a vector for transformation by enzymatic digestion of viral or circular plasmid DNA to form ^s linear DNA strands. Using similar enzymes, selected exogenous or heterologous chains are then prepared which usually contain the coding region for the desired product, also in linear form. The linear viral or plasmid DNA is then incubated with exogenous DNA in the presence of binding enzymes which allow the fragments to be recombined to produce hybrid vectors containing a selected segment of exogenous DNA that is inserted into the viral or circular plasmid DNA.

Transformácia vhodného jednobunkového hostiteľa takto získaným hybridným vektorom vedie k tvorbe mnohopočetných kópií exogénnej DNA v populácii hostiteľských buniek. V niektorých prípadoch je požadovaným výsledkom prosté namnoženie cudzorodej DNA a získaným produktom je teda samotná táto DNA. Častejšie je však cieľom celej transformácie expresia exogénnej DNA bunkami hostiteľa vo väčšom meradle, takže je možné získať izolovateľné množstvá komerčne významných fragmentov bielkovín alebo polypeptidov, pre ktorých je kódom exogénna DNA. Podobné postupy boli opísané tiež v dalších patentových spisoch, napríklad v US patentových spisoch č. 4 264 731, (Shine), 4 273 875 (Manis), 4 293 652 (Cohen) a v európskom patentovom spise č.Transformation of a suitable one-cell host with the hybrid vector thus obtained results in the generation of multiple copies of exogenous DNA in the host cell population. In some cases, the desired result is a simple multiplication of the foreign DNA and the product obtained is thus the DNA itself. More often, however, the goal of the entire transformation is to express host-scale exogenous DNA on a larger scale so that it is possible to obtain isolable amounts of commercially significant fragments of proteins or polypeptides encoded by exogenous DNA. Similar procedures have also been described in other patents, for example U.S. Pat. No. 4,264,731, (Shine), 4,273,875 (Manis), 4,293,652 (Cohen), and in European Patent Publication No. 5,167,144.

619 z 9. novembra 1983.619 of November 9, 1983.

Vývoj špecifických sledov DNA pre včlenenie do vektorovDevelopment of specific DNA sequences for incorporation into vectors

DNA je možné uskutočniť najrôznejšími spôsobmi, ktoré do značnej miery závisia od cudzorodosti darca vzhľadom na predpokládaný hostiteľ a na velikosť molekuly polypeptidu, k ktorého expresii má v organizmu hostiteľa dôjsť. Vo veľkom zjednodušení je možné uviesť, základné tri spôsoby, a toThe DNA can be performed in a variety of ways, which largely depend on the donor's strangeness with respect to the putative host and the size of the polypeptide molecule to be expressed in the host organism. In a great simplification can be stated the basic three ways, namely

1) spôsob, ktorý spočíva v izolácii sledu DNA s dvojitým reťazcom z genómu darca,(1) the method of isolating a double-stranded DNA sequence from the donor genome;

2) spôsob, ktorý spočíva v chemickej výrobe sledu DNA, ktorý je kódom pre požadovaný polypeptid a2) a method comprising chemically producing a DNA sequence encoding a polypeptide of interest; and

3) syntéza DNA s dvojitým reťazcom in vitro pri použití enzýmu tak zvanou reverznou transkripciou mRNA, ktorá bola izolovaná z buniek darca.3) synthesis of double-stranded DNA in vitro using an enzyme called so-called reverse transcription of mRNA that has been isolated from donor cells.

Spôsoby, pri ktorých dochádza k tvorbe DNA, ktorá je komplementárna príslušnej mRNA sa obyčajne uvádzajú ako spôsoby s použitím cDNA.Methods that produce DNA that is complementary to the mRNA of interest are commonly referred to as cDNA methods.

Výroba sledu DNA je často metódou voľby v prípade, že je známy celý sled zvyškov aminokyselín požadovaného polypeptidu. Tento postup je opísaný napríklad v US patentovej prihláške č. 483 451 (Alton), ktorá bola podaná 15. apríla 1983 a zverejnená 24. novembra 1983 ako W083/04053). V tejto publikácii sa opisujú prostriedky, ktoré dovoľujú dosiahnuť veľmi dobré výsledky, ako: možnosť zavedenia alternačných kodónov, ktoré sa obyčajne v génoch nachádzajú, najmä v tých, ku ktorých vysokej expresii dochádza v organizmu hostiteľa (ide napríklad o preferenčné kodóny pre prípad použitia určitého hostiteľa, napríklad kvasiniek alebo E. coli), ďalej zaistenie neprítomnosti neprenášaného intrónu, tzn. vnútri uloženého sledu, ktorý je často a bežne prítomný v genómickej DNA cicavcov a tiež v príslušnej mRNA a nie je ďalej spracovávaný bunkou prokaryotického hostiteľa, ďalej zábrana expresie nepožadovaných vedúcich sledov polypeptidov, ktoré sú bežne prítomné, ale nie sú lahko odštepované z výsledného polypeptidu bunkami baktérií alebo kvasiniek, ďalej zaistenie dobrého včlenenia DNA do vhodného vektoru pre expresiu v spojení s požadovaným systémom promotor/regulátor (riadiaci sled) a so sledom pre ukončenie prenosu a konečne konštrukcie génov, ktoré sú kódom pre fragmenty polypeptidov a pre analógy požadovaných polypeptidov.The production of a DNA sequence is often a method of choice when the entire sequence of amino acid residues of the desired polypeptide is known. This procedure is described, for example, in U.S. Pat. No. 483,451 (Alton), filed April 15, 1983 and published November 24, 1983 as WO83 / 04053). This publication describes the means of achieving very good results, such as: the possibility of introducing alteration codons, which are commonly found in genes, especially those that are highly expressed in the host organism (for example, preferential codons for the use of certain a host, such as yeast or E. coli), further ensuring the absence of a non-transmitted intron, i. within a deposited sequence that is frequently and commonly present in mammalian genomic DNA and also in the respective mRNA and is not further processed by a prokaryotic host cell, further preventing expression of unwanted polypeptide leader sequences that are commonly present but are not readily cleaved from the resulting polypeptide by cells bacteria or yeast, further ensuring good incorporation of the DNA into a suitable expression vector in conjunction with the desired promoter / regulator system (control sequence), and a sequence for terminating the transfer and finally constructing genes encoding the polypeptide fragments and analogs of the polypeptides of interest.

V prípade, ženie je známy celý sled aminokyselinových zvyškov v požadovanom polypeptide, nie je možné vyrobiť sled DNA priamo a metódou volby sa potom stáva izolácia sledu DNA, ktorý je kódom pre požadovaný polypeptid metódoxi s použitím cDNA cez potenciálne nevýhody. Týmto spôsobom je možné získať vektory pre expresiu, zaisťujúce vysokú úroveň mikrobiálnej expresie tak, ako to bolo uvedené hore. Jedným zo štandardných postupov pre izoláciu sledu cDNA požadovaného výsledného produktu je príprava cDNA plazmidov, získaných reverznou transkripcií mRNA, ktorá sa vo veľkom množstve nachádza v bunkách darca. Ide napríklad o celú skupinu vzoriek cDNA, odvodených z buniek hypofýzy, pri ktorých použití dochádza k expresii pomerne. značných množstiev rastového hormónu ako výsledného produktu. Tam, kde sú známe podstatné časti sledu aminokyselinových zvyškov polypeptidu, je možné použiť značené sledy DNA s jedným reťazcom, ktoré sa spojujú na sledy, pravdepodobne prítomné v cieľovej cDNA. Tieto sledy sa potom používajú na hybridizačné postupy DNA/DNA, ktoré sú vykonávané na klonovaných kópiách cDNA, denaturovaných na formu s jedným reťazcom. Tieto postupy boli opísané napríklad v US patentovom spise č.If the entire sequence of amino acid residues in the desired polypeptide is known, it is not possible to produce the DNA sequence directly and then the method of choice is to isolate the DNA sequence coding for the desired polypeptide by using cDNA despite potential disadvantages. In this way, it is possible to obtain expression vectors ensuring a high level of microbial expression as described above. One standard procedure for isolating the cDNA sequence of the desired end product is to prepare cDNA plasmids obtained by reverse transcription of mRNA, which is found in large quantities in donor cells. For example, a whole group of cDNA samples derived from pituitary cells are expressed relatively when used. significant amounts of growth hormone as the final product. Where substantial portions of the amino acid residue sequence of a polypeptide are known, labeled single-stranded DNA sequences that link to sequences likely to be present in the target cDNA may be used. These sequences are then used for DNA / DNA hybridization procedures performed on cloned copies of cDNA denatured to a single stranded form. These processes have been described, for example, in U.S. Pat.

394 443 (Weisman a ďalšie) a v celom radu publikácií, napríklad Wallace a ďalšie, Nuc. Acids. Res. 6, str. 3543 až 3557 (1979), Reyes a ďalšie, P.N.A.S. (USA) 79, str. 3270 až 3274 (1982) a Jaye a ďalšie, Nuc. Acids Res. 11, str. 2325 až 2335 (1983). Tiež v US patentovom spise č. 4 358 535 (Falkow a ďalšie) sa opisuje hybridizácia typu DNA/DNA pri uskutočňovaní diagnóz, v uverejnenej európskej patentovej prihláške č. 70685 a 70687 sa opisuje spôsob značenia polynukleotidov s jedným reťazcom. Davis a ďalšie v A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1980) str. 55 až 58 a 174 až 176 opisujú hybridizáciu kolónií a povlakov a v brožúre New England Nuclear394,443 (Weisman et al.) And in a number of publications, for example, Wallace et al., Nuc. Acids. Res. 6, p. 3543-3557 (1979); Reyes et al., P.N.A.S. (USA) 79, p. 3270-3274 (1982) and Jaye et al., Nuc. Acids Res. 11, p. 2325-2335 (1983). Also, U.S. Pat. U.S. Patent No. 4,358,535 to Falkow et al. 70685 and 70687 disclose a method for labeling single-stranded polynucleotides. Davis et al. In A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980) p. 55-58 and 174-176 describe the hybridization of colonies and coatings and in the New England Nuclear brochure

- 7 (Boston, Mass.) pre membránové materiály, určené na vyhladávanie génov je možné nájsť inštrukcie pre prenos a hybridizáciu DNA a RNA (Katalógové číslo NEF-972).- 7 (Boston, Mass.) For gene-finding membrane materials, instructions for transfer and hybridization of DNA and RNA can be found (Catalog No. NEF-972).

Z významnejších noviniek hybridizačných postupov pri rekombinantnom klonovaní je nutné uviesť napríklad použitie značených zmiešaných vzoriek syntetických oligonukleotidov, z ktorých každá je potenciálnym úplným doplnkom špecifického sledu DNA v hybridizačnej vzorke vrátane heterogénnej zmesi RNA alebo DNA s jednoduchým reťazcom. Tieto postupy sú najmä dobre použitelné pri vyhľadávaní klonov cDNA, odvodených zo zdrojov, v ktorých je k dispozícii velmi malé množstvo mRNA pre požadovaný polypeptid. Zmysel postupu spočíva v tom, že sa volia obmedzené hybridizačné podmienky tak, aby pokial možno nedochádzalo k nešpecifickým väzbám pri následnej autorádiografickej vizualizácii špecifického klonu cDNA pri hybridizácii cielovej DNA na túto jedinú vzorku, ktorá je v zmesi úplným , komplematom uvedeného sledu. Tieto postupy boli opísané v rôznych publikáciách, napríklad Wallace a ďalšie, Nuc. Acids Res. 9, str. 879 až 897 (1981), Suggs a ďalšie, P.N.A.S. (USA) 78, str. 6613 až 6617 (1981), Choo a ďalšie, Náture 299, str.Among the most significant novelty in recombinant cloning hybridization procedures, for example, labeled mixed synthetic oligonucleotide samples, each of which is a potential complete complement to a specific DNA sequence in a hybridization sample, including a heterogeneous mixture of RNA or single stranded DNA, should be mentioned. In particular, these methods are useful in screening for cDNA clones derived from sources in which a very small amount of mRNA is available for the polypeptide of interest. The purpose of the procedure is to select limited hybridization conditions so that, as far as possible, non-specific binding may not occur with subsequent autoradiographic visualization of a specific cDNA clone upon hybridization of the target DNA to this single sample, which is a complete complication of the sequence. These procedures have been described in various publications, for example, Wallace et al., Nuc. Acids Res. 9, p. 879-897 (1981), Suggs et al., P.N.A.S. (USA) 78, p. 6613-6617 (1981); Choo et al., Nature 299, p.

178 až 180 (1982), Kurachi a ďalšie, P.N.A.S. (USA) 79, str.178-180 (1982), Kurachi et al., P.N.A.S. (USA) 79, p.

6461 až 6464 (1982), Ohkubo a ďalšie, P.N.A.S. (USA) 80, str. 2196 až 2200 (1983) a Kornblihtt a ďalšie, P.N.A.S. (USA) 80, str. 3218 až 3222 (1983). Všeobecne je možné uviesť, že postupy s použitím zmiešaných vzoriek tak, ako boli uvedené v publikácii Wallace a ďalších (1981) boli ďalej rozpracovávané rôznymi pracovníkmi tak, že bolo možné dosiahnuť uspokojivé výsledky pri izolácii klonov cDNA pri použití zmesi 32 reťazcov s dĺžkou 16 báz s rôznym sledom báz spolu s jedným reťazcom s dĺžkou 11 báz na uskutočnenie obojstranného potvrdenia prítomnosti požadovanej cDNA, ako to bolo opísané v publikácii Singer-Sam a ďalšie P.N.A.S. (USA) 80, str. 802 až 806 (1983) .6461-6464 (1982), Ohkubo et al., P.N.A.S. (USA) 80, p. 2196-2200 (1983) and Kornblihtt et al., P.N.A.S. (USA) 80, p. 3218-3222 (1983). In general, mixed sample procedures as described by Wallace et al. (1981) were further elaborated by various personnel to obtain satisfactory results in isolation of cDNA clones using a mixture of 32 strands of 16 bases in length. with a different base sequence along with a single 11 base chain to carry out a two-way confirmation of the presence of the desired cDNA as described by Singer-Sam and other PNASs (USA) 80, p. 802-806 (1983).

- 8 Použitie DNA izolovanej z genómov je spoločným znakom aspoň troch hore uvedených postupov získania sledov DNA, špecifických pre použitie v rekombinantných postupoch. Osobitne to platí pri postupoch, ktoré majú zaistiť¹ mikrobiálnu expresiu polypeptidov cicavcov, kde je hlavným problémom komplexnosť DNA genómu cicavcov. Existujú pomerne vhodné postupy pre fágom nesené zmesi DNA genómu človeka a ďalších cicavcov, ako to bolo opísané napríklad v Lawn a ďalšie, Celí 15, str. 1157 až 1174 (1978), kde sa opisuje postup na získanie knižnice ludského genómu, nazývanej Maniatis Library, Karn a ďalšie, P.N.A.S. (USA) 77, str. 5172 až 5176 (1980), publikácia sa vzťahuje k ludskej genómovej knižnici založenej na štiepení endonukleázami a Blattner a ďalšie, Science 196, str. 161 až 169 (1977), kde sa opisuje konštrukcia knižnice genómu hovädzieho dobytka. Na druhej strane bolo uskutočnených len velmi málo úspešných pokusov s hybridizačnými postupmi pri získavaní DNA genómu v prípade, že nebol vopred dobre známy sled aminokyselín alebo sled báz príslušnej DNA. Príkladom môže byť publikácia Fiddes a dalšie, J. Mol. and Appl. Genetics 1, str. 3 až 18 (1981), kde sa opisuje úspešná izolácia génu, ktorý je kódom pre podjednotku a ludského pituitárneho glykoproteínu (hormónu) z Maniatis Library pri použití vzorky s plnou dĺžkou 621 párov báz z vopred izolovaného sledu cDNA pre podjednotku a. Ďalším príkladom môže byt publikácia Das a ďalšie,The use of DNA isolated from genomes is a common feature of at least the above three procedures for obtaining DNA sequences specific for use in recombinant procedures. This is particularly true in procedures designed to ensure ¹ microbial expression of mammalian polypeptides where the main problem is the complexity of the mammalian genome DNA. There are relatively suitable procedures for phage-borne mixtures of the DNA genome of human and other mammals, as described, for example, in Lawn et al., Cell 15, p. 1157-1174 (1978), which describes a procedure for obtaining a human genome library called Maniatis Library, Karn et al., PNAS (USA) 77, p. 5172-5166 (1980), the publication relates to a human genomic library based on endonuclease cleavage, and Blattner et al., Science 196, p. 161-169 (1977), which describes the construction of a bovine genome library. On the other hand, very few successful attempts have been made with hybridization procedures to obtain the DNA genome if the amino acid sequence or base sequence of the DNA in question was not well known in advance. An example is Fiddes et al., J. Mol. and Appl. Genetics 1, p. 3-18 (1981), which describes successful isolation of a gene encoding a subunit and a human pituitary glycoprotein (hormone) from the Maniatis Library using a 621 base pair full length sample from a pre-isolated cDNA sequence for the α subunit. Another example is Das et al.

P.N.A.S. (USA) 80, str. 1531 až 1535 (1983), kde sa opisuje izolácia klonov ludského genómu pre ludský HLA-DR pri použití syntetického oligonukleotidu s 175 pármi báz. Konečne Anderson a ďalšie v P.N.A.S. (USA) 80, str. 6838 až 6842 (1983) opisujú izoláciu klonu z genómu pre pankreatický inhibítor trypsínu hovädzieho dobytka (BPTI) pri použití jedinej vzorky s dĺžkou 86 párov báz, vzorka bola konštruovaná podlá známeho sledu aminokyselín v BPTI. Autori uvádzajú nedostatočné metódy na izoláciu mRNA, ktorá by bola vhodná pre získanie zbierky cDNA v dôsledku zjavne príliš nízkej hladiny mRNA v slinnej žlaze a v plúcnom tkanivu, ktoré boli zdrojom tejto kyseliny a opisujú tiež možnosti sledovania genómu pri použití zmesi značených vzoriek, pričom uvádzajú, že:A. S. (USA) 80, p. 1531-1535 (1983), which describes the isolation of human human HLA-DR genome clones using a 175 bp synthetic oligonucleotide. Finally, Anderson et al., P.N.A.S. (USA) 80, p. 6838-6842 (1983) describe the isolation of a clone from the pancreatic bovine trypsin inhibitor (BPTI) genome using a single 86 base pair sample, constructed according to a known amino acid sequence in BPTI. The authors report inadequate methods for isolating mRNA that would be suitable for obtaining a cDNA collection due to apparently too low levels of salivary gland and lung tissue mRNAs that were the source of this acid, and also describe genome tracking options using a mixture of labeled samples, that:

všeobecnejšie povedané, boli použité vzorky, ktoré obsahovali zmes sledov oligonukleotidov na izoláciu bielkovinových génov s neznámym sledom zo zmesi cDNA. Tieto vzorky majú obyčajne formu zmesi 8 až 32 oligonukleotidov s dĺžkou 14 až 17 nukleotidov, ktoré predstavujú najrôznejšie možné kombinácie kodónov pre malé sledy (5 až 6 zvyškov) aminokyselín. Za obmedzených podmienok hybridizácie, ktoré obmedzujú vznik vzoriek s nesprávnymi pármi báz môžu tieto vzorky pomôcť k zisteniu špecifického sledu génu v zmesi klonov, ktorá nie je príliš komplexná. S ohíadom na svoju malú dĺžku a na svoju heterogenitu však vzorka nemá špecifickosť, ktorá by bola potrebná na zistenie tak komplexných sledov, akými sú sledy v genóme cicavca. Týmto spôsobom je tento postup nepoužiteíný pri izolácii bielkovinových génov cicavcov v prípade, že nie je možné získať zodpovedajúcu mRNA.more generally, samples were used that contained a mixture of oligonucleotide sequences to isolate protein genes of unknown sequence from the cDNA mixture. These samples typically take the form of a mixture of 8 to 32 oligonucleotides with a length of 14 to 17 nucleotides, which represent the most diverse possible codon combinations for small sequences (5 to 6 residues) of amino acids. Under limited hybridization conditions that limit the formation of samples with incorrect base pairs, these samples can help to detect a specific sequence of the gene in a clone mixture that is not very complex. However, due to its small length and heterogeneity, the sample does not have the specificity that would be required to detect as complex sequences as those in the mammalian genome. In this way, this procedure is unsuitable for the isolation of mammalian protein genes when the corresponding mRNA cannot be obtained.

Je teda zrejmé, že existuje trvalá potreba navrhnúť zlepšené metódy na uskutočnenie rýchlej a účinnej izolácie klonov cDNA v prípadoch, kde nie sú k dispozícii dostatočné informácie, týkajúce sa sledu aminokyselín polypeptidu, pre ktorý má gén byt kódom a kde nie sú k dispozícii obohatené tkanivá ako zdroj mRNA na konštrukciu zmesi cDNA. Takto zlepšené metódy by boli osobitne užitočné v prípade, že by ich bolo možné aplikovať na izoláciu génov genómu cicavcov, pri ktorých sú k dispozícii len obmedzené informácie, týkajúce sa sledov aminokyselín v polypeptidoch, pre ktoré sú kódom híadané gény.Thus, there is a continuing need to devise improved methods for performing rapid and efficient isolation of cDNA clones in cases where insufficient information is available regarding the amino acid sequence of a polypeptide for which the gene is to be encoded and where enriched tissues are not available. as a source of mRNA to construct a cDNA mixture. Such improved methods would be particularly useful if they could be applied to the isolation of genes in the mammalian genome for which only limited information is available regarding the amino acid sequences of the polypeptides encoded by the genes.

B. Erytropoietín ako cieíový polypeptidB. Erythropoietin as a target polypeptide

Erytropoéza, tzn. tvorba červených krviniek prebieha kontinuálne po celý život na náhradu buniek, ktoré podíahli deštrukcii. Ide o veími presne riadený fyziologický pochod, ktorý umožňuje, aby bolo k dispozícii dostatočné množstvo červených krviniek v krvi na dobré okysličenie tkanív, krviniek však nesmie byť toľko, aby bol obmedzený obeh krvi. Červené krvinky sa vytvárajú v kostovej dreni a ich tvorba je riadená hormónom erytropoietínom.Erythropoiesis, ie. the production of red blood cells is carried out continuously throughout the life to replace cells that have been destroyed. It is a very well-controlled physiological process that allows sufficient red blood cells to be available in the blood to properly oxygenate the tissues, but the blood cells must not be enough to limit blood circulation. Red blood cells are formed in the bone marrow and their production is controlled by the hormone erythropoietin.

Erytropoietín je kyslý glykoproteín s molekulou hmotnosťou približne 34 000 jednotiek a môže sa vyskytovať v troch formách: α, β a asialo. Formy a a β sa od seba trocha líšia v uhľohydrátovej zložke, ale majú rovnakú účinnosť, biologický účinok aj molekulovú hmotnosť. Forma asialo je forma a alebo β, z ktorej je odstránená koncová uhľohydrátová skupina. Erytropoietín je prítomný v plazme vo veľmi nízkych koncentráciách v prípade, že tkanivá pri plnom zdraví sú dostatočne prevzdušňované pri existujúcom množstve erytrocytov. Táto normálna nízka koncentrácia je dostatočná na stimuláciu náhrady červených krviniek, ktoré normálne v priebehu svojho starnutia podliehajú fyziologickému rozpadu.Erythropoietin is an acidic glycoprotein with a molecular weight of approximately 34,000 units and can occur in three forms: α, β, and asialo. Forms a and β differ somewhat in the carbohydrate component, but have the same potency, biological effect and molecular weight. The asialo form is a or β form from which the terminal carbohydrate group is removed. Erythropoietin is present in plasma at very low concentrations when tissues in good health are sufficiently aerated with the existing amount of erythrocytes. This normal low concentration is sufficient to stimulate red blood cell replacement that is normally subject to physiological breakdown during aging.

Množstvo erytropoietínu v obehu sa zvyšuje pri nedostatku kyslíka v prípade, že je znížený prenos kyslíka červenými krvinkami krvného obehu. Hypoxia môže byť spôsobená stratou veľkého množstva krvi krvácaním, deštrukciou červených krviniek ’ pri vystavení vplyvu žiarenia, znížením príjmu kyslíka vo veľkých výškach alebo v dôsledku dlhého bezvedomia alebo v prípade rôznych foriem anémie. Ako odpoveď na stres hypoxického tkaniva erytropoietín zvýši produkciu červených krviniek stimuláciou premeny primitívnych zárodočných buniek v kosťovej dreni na proerytroblasty, ktoré postupne dozrievajú, syntetizujú hemoglobín a sú uvoľňované do krvného obehu ako červené krvinky. V prípade, že množstvo červených krviniek v obehu je väčšie, ako je potrebné pre normálne požiadavky tkanív na kyslík, zníži sa hladina erytropoietínu v obehu.The amount of erythropoietin in the circulation increases when there is a lack of oxygen when the oxygen transfer of the red blood cells in the bloodstream is reduced. Hypoxia can be caused by the loss of large amounts of blood by bleeding, destruction of red blood cells' when exposed to radiation, reduced oxygen intake at high altitudes or due to long unconsciousness or various forms of anemia. In response to hypoxic tissue stress, erythropoietin will increase red blood cell production by stimulating the conversion of primitive germ cells into bone marrow into proerythroblasts that gradually mature, synthesize hemoglobin and are released into the bloodstream as red blood cells. If the circulating red blood cell count is greater than necessary for normal tissue oxygen requirements, the circulating erythropoietin level will decrease.

Tieto pomery sú opísané napríklad v publikáciách Testa a ďalšie, Extp. Hematol., B (Supp. 8), 144 až 152 (1980), Tong a ďalšie, J. Biol. Chem. 256 (24), 12666 až 12672 (1981), Gold· wasser, J. Celí. Physiol. 110 (Supp. 1) 133 až 135 (1982), Finch, Blood, 60 (6), 1241 až 1246 (1982), Sytowski a ďalšie, Expt. Hematol., 8, (Supp. 8), 52 až 64 (1980), Naughton, Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (5), 432 až 438 (1983), Weiss a ďalšie, Am. J. Vet. Res. 44 (10), 1832 až 1835 (1983), Lappin a ďalšie, Exp. Hematol., 11 (7), 661 až 666 (1983), Baciu a ďalšie, Ann. N. Y. Acad. Sci. 414, 66 až 72 (1983), Murphy a ďalšie, Acta Haematologica Japonica 46 (7), 1380 až 1396 (1983), Dessypris a ďalšie, Brit. J. Haematol., 56, 295 až 306 (1983), Emannouel a ďalšie, Am. J. Physiol 247 (lPt 2) F 168-76 (1984).These ratios are described, for example, in Testa et al., Extp. Hematol., B (Supp. 8), 144-152 (1980); Tong et al., J. Biol. Chem. 256 (24), 12666-12672 (1981); Goldabsser, J. Cell. Physiol. 110 (Supp. 1) 133-135 (1982), Finch, Blood, 60 (6), 1241-1246 (1982), Sytowski et al., Expt. Hematol., 8, (Supp. 8), 52-64 (1980), Naughton, Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (5), 432-438 (1983), Weiss et al., Am. J. Vet. Res. 44 (10), 1832-1835 (1983); Lappin et al., Exp. Hematol., 11 (7), 661-666 (1983); Baciu et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 414, 66-72 (1983); Murphy et al., Acta Haematologica Japonica 46 (7), 1380-1396 (1983); Dessypris et al., Brit. J. Haematol., 56, 295-306 (1983); Emannouel et al., Am. J. Physiol 247 (Ip 2) F 168-76 (1984).

Pretože erytropoietín je podstatným faktorom pre tvorbu červených krviniek, je tento hormón potenciálne užitočný na diagnostiku aj na liečbu krvných porúch, ktoré sú charakterizované nízkou alebo defektnou tvorbou červených krviniek. Tieto skutočnosti boli opísané v publikáciách Pennartur-Das a ďalšie, Blood 63 (5), 1168 až 71 (1984) a Haddy, Am. J. Ped. Hematol./Oncol. 4, 191 až 196 (1982), publikácie sa týkajú erytropoietínu ako možného lieku pre chorobu, pri ktorej majú červené krvinky kosákový tvar a Esbach a ďalšie, J. Clin. Invest. 74 (2), str. 434 až 441, 1984), kde sa opisuje spôsob liečby u uremickej ovce a vplyv infúzií plazmy, bohatej na erytropoietín, pričom sa navrhujú dávky 10 jednotiek erytropoe tínu (EPO)/kg a deň počas 15 až 40 dní na úpravu anémie, ktorá sa vyskytuje pri chronickom zlyhaní obličiek. Podobný problém rozoberá tiež autor publikácie Krane, Henry Ford Hosp. Med.Because erythropoietin is an essential factor in the production of red blood cells, this hormone is potentially useful for both diagnosis and treatment of blood disorders that are characterized by low or defective red blood cell production. This has been described in Pennartur-Das et al., Blood 63 (5), 1168-71 (1984) and Haddy, Am. J. Ped. Hematol./Oncol. 4, 191-196 (1982), publications refer to erythropoietin as a possible drug for a disease in which the red blood cells have a crescent shape and Esbach et al., J. Clin. Invest. 74 (2), p. 434-441 (1984), which describes a treatment method in uremic sheep and the effect of erythropoietin-rich plasma infusions, suggesting doses of 10 erythropoietin (EPO) / kg per day for 15 to 40 days to correct anemia that occurs in chronic kidney failure. A similar problem is also discussed by Krane, Henry Ford Hosp. Med.

J., 31 (3), 177 až 181 (1983).J., 31 (3), 177-181 (1983).

V poslednom čase bolo preukázané, že v prípade, že by bol erytropoietín k dispozícii v dostatočnom množstve, bolo by možné ročne liečit anémiu 1 600 000 chorých len v USA, ako to bolo opísané v publikácii Morrison, Bioprocessing in SpaceRecently, it has been shown that if erythropoietin was available in sufficient quantities, anemia of 1,600,000 patients could only be treated annually in the US, as described in Morrison, Bioprocessing in Space

- 12 - an overview, str. 557 až 571 v The World Biotech. Report 1984, zväzok 2, USA (Online Publications, New York, N. Y., 1984). Štúdie v poslednom čase boli základom pre odhad účinnosti erytropoietínu pri rôznych chorobných stavoch, porúch a hematologických nepravidelností, ako to bolo opísané v publikáciách Vedovato a ďalšie, Acta Haematol. 71, 211 až 213 (1984) (β-tlassemia), Vichinsky a ďalšie, J. Pediatr. 105 (1), 15 až 21, 1984 (cystická fibróza), Cotes a ďalšie, Brit.- 12 - an overview, p. 557-571 in The World Biotech. Report 1984, Volume 2, USA (Online Publications, New York, N.Y., 1984). Recently, studies have been the basis for estimating the efficacy of erythropoietin in various disease states, disorders and haematological irregularities, as described in Vedovato et al., Acta Haematol. 71, 211-213 (1984) (β-tlassemia), Vichinsky et al., J. Pediatr. 105 (1), 15-21, 1984 (cystic fibrosis), Cotes et al., Brit.

J. Obstet. Gyneacol. 90 (4), 304 až 311 (1983) (ťarchavosť, menštruačné obtaže), Haga a ďalšie, Acta Pediatr. Scand. 72,J. Obstet. Gyneacol. 90 (4), 304-311 (1983) (abusiveness, menstrual distress), Haga et al., Acta Pediatr. Scand. 72.

827 až 831, 1983 (časná anémia pri nezrelosti), Claus-Walker a ďalšie, Árch. Phys. Med. Rehabil. 65, 370 až 374, 1984 (poranenie pátére), Dunn a ďalšie, Eur J. Appl. Physiol. 52, 178 až 182, 1984 (kozmické lety), Miller a ďalšie, Brit. J. Haematol. 52, 545 až 590, 1982 (akútna strata krvi), Udupá a ďalšie, J. Lab. ciin. Med. 103 (4), 574 až 580 a 581 až 588 (1984), a Lipschitz a ďalšie, Blood, 63 (3), 502 až 509, 1983 (stárnutie) a Daniak a ďalšie, Cancer 51 (6), 1101 až 1106 (1983) a Schwartz a ďalšie, Otolaryng. 109, 269 až 272 (1983) (rôzne neoplastické ochorenia, spojené s abnormálnou erytropoézou).827-831, 1983 (early anemia of immaturity), Claus-Walker et al., Ar. Phys. Med. Rehab. 65, 370-374 (1984) (injuries to the palate), Dunn et al., Eur J. Appl. Physiol. 52, 178-182, 1984 (space flights), Miller et al., Brit. J. Haematol. 52, 545-590, 1982 (acute blood loss), Udupa et al., J. Lab. CIIN. Med. 103 (4), 574-580 and 581-588 (1984), and Lipschitz et al., Blood, 63 (3), 502-509, 1983 (aging) and Daniak et al., Cancer 51 (6), 1101-1106 (1983) and Schwartz et al., Otolaryng. 109, 269-272 (1983) (various neoplastic diseases associated with abnormal erythropoiesis).

Predchádzajúce pokusy získať erytropoietín v dobrom výťažku z plazmy alebo z moča boli pomerne neúspešné. Je potrebné zložité laboratórne zariadenie a aj v tomto prípade je obyčajne možné získať iba malé množstvá nečistého a nestáleho extraktu, ktorý obsahuje erytropoietín.Previous attempts to recover erythropoietin in good plasma or urine yields have been relatively unsuccessful. A complicated laboratory equipment is needed, and even in this case it is usually possible to obtain only small amounts of impure and unstable extract containing erythropoietin.

V US patentovom spise č. 3 033 753 je opísaný spôsob čiastočného čistenia erytropoietínu z krvnej plazmy oviec. Týmto spôsobom je možné získať v malom výťažku surový pevný extrakt, ktorý obsahuje erytropoietín.U.S. Pat. No. 3,033,753 discloses a method for partially purifying erythropoietin from sheep blood plasma. In this way, a crude solid extract containing erythropoietin can be obtained in a small yield.

Prvé pokusy o izoláciu erytropoietínu z moča viedli k získaniu nestálych, biologicky neúčinných prípravkov uvedeného hormónu. V US patentovom spise č. 3 865 801 sa opisuje spôsob stabilizácie biologickej účinnosti surovej látky, ktorá obsahuje erytropoietín izolovaný z moča. Výsledný surový produkt tohto spôsobu obsahuje 90 % účinnosti erytropoietínu a je stályInitial attempts to isolate erythropoietin from urine have led to the recovery of unstable, non-biologically inactive formulations of the hormone. U.S. Pat. No. 3,865,801 discloses a method of stabilizing the biological activity of a crude material comprising urinary erythropoietin. The resulting crude product of this process contains 90% erythropoietin activity and is stable

Ďalší spôsob čistenia ludského erytropoietínu z moča nemocných s aplastickou anémiou je opísaný v publikácii Miyake a d’alšie, J. Biol. Chem. zv. 252, č. 15 (10. augusta 1977), str. 5558 až 5564. Spôsob sa vykonáva v siedmich stupňoch, ktoré zahŕňajú chromatografiu na iónomeničoch, zrážanie etanolom, filtráciu na géli, adsorpčnú chromatografiu a poskytuje čistý erytropoietín s účinnosťou 70 400 jednotiek/mg bielkoviny vo výťažku 21 %.Another method for purifying human erythropoietin from the urine of patients with aplastic anemia is described in Miyake et al., J. Biol. Chem. Vol. 252, no. 15 (August 10, 1977), p. The process is carried out in seven stages, including ion exchange chromatography, ethanol precipitation, gel filtration, adsorption chromatography, and yields pure erythropoietin with an efficiency of 70,400 units / mg protein in 21% yield.

ís

V US patentovom spise č. 4 397 840 (Takezawa a ďalšie) sa opisuje spôsob výroby erytropoietínového produktu z moča zdravých ludí pomocou slabo alkalických iónomeničov a opisuje sa, že získané produkty s nízkou molekulovou hmotnosťou nemajú žiadne inhibičné účinky na erytropoietín.U.S. Pat. No. 4,397,840 (Takezawa et al.) Discloses a process for producing an erythropoietin product from the urine of healthy humans using weakly alkaline ion exchangers, and it is reported that the low molecular weight products obtained have no inhibitory effects on erythropoietin.

V britskom patentovom spise č. 2 085 887 (Sugimoto a ďalšie) z 6. mája 1982 sa opisuje spôsob výroby ludských hybridných lymfoblastoidných buniek, pri ktorých použití je možné dosiahnuť produkciu 3 až 420 jednotiek erytropoietínu v 1 ml bunkovej suspenzie v kultúre po namnožení cicavčích hostite!n ských buniek na množstvo 10 buniek/ml. Pri najvyššej produkcii je možné rýchlosť tvorby erytropoietínu vyjadriť ako 40 až 4000 jednotiek/10⁶ buniek/48 hodín v kultúre in vitro pri prenesení z živých buniek. Odkázať v tomto zmysle je možné tiež na US patentový spis č. 4 377 513. Na izoláciu erytropoietínu z tkanív bol navrhovaný rad spôsobov vrátane použitia nádorových buniek, avšak výťažky boli velmi malé, ako je zrejmé napríklad z publikácií Jelkman a ďalšie, Expt. Hematol. ll (7), 581 až 588 (1983), Tambourin a ďalšie, P.N.A.S. (USA) 80,In British Pat. No. 2,085,887 to Sugimoto et al., Issued May 6, 1982, discloses a method for producing human hybrid lymphoblastoid cells that can produce 3-440 erythropoietin units in a 1 ml cell suspension in culture after multiplication of mammalian host cells per culture. 10 cells / ml. The highest production rate can be expressed as a form of erythropoietin 40-4000 units / 10 ⁶ cells / 48 hours in culture in vitro for transferring the living cells. Reference may also be made in this regard to U.S. Pat. A number of methods have been proposed for isolating erythropoietin from tissues, including the use of tumor cells, but yields were very low, as is evident from, for example, Jelkman et al., Expt. Hematol. 11 (7), 581-588 (1983), Tambourin et al., PNAS (USA) 80,

6269 až 6273 (1983), Katsuoka a ďalšie, Gann, 74, 534 až 541 (1983), Hagiwara a ďalšie, Blood, 63 (4), 828 až 835 (1984) a Choppin a ďalšie, Blood 64 (2), 341 až 347 (1984).6269-6273 (1983), Katsuoka et al., Gann, 74, 534-541 (1983), Hagiwara et al., Blood, 63 (4), 828-835 (1984) and Choppin et al., Blood 64 (2), 341-347 (1984).

Ďalším možným spôsobom izolácie čisteného erytropoietínuAnother possible method for isolating purified erythropoietin

I sú imunologické postupy. Postupuje sa tak, že sa injekciou ľudského erytropoietínu zvieratám, najlepšie potkanom alebo krá likom vyvolá tvorba protilátok v séru proti ľudskému erytropoietínu. Ľudský erytropoietín, vstrieknutý injekčné zvierati j rozoznávaný ako cudzorodá látka, tzn. ako antigén pre imunitný systém zvieraťa a vyvolá teda tvorbu protilátok proti tomuto antigénu. Rôzne bunky, ktoré zodpovedajú na stimuláciu antigénom produkujú protilátky, ktoré sa od sebe trocha líšia. Pri odobraní krvi zostáva protilátka v krvnom sére. Na detekciu a tvorbe komplexu s ludským erytropoietínom je možné použit ako nečistené sérum, tak čistenú protilátku, napríklad frakciu imunoglobulínu G zo séra, avšak tieto materiály majú zásadnú nevýhodu v tom, že ide o polyklonálne protilátky, odvodené od rôznych buniek a viažu sa preto okrem na erytropoietín ešte na ďalšie zložky surových extraktov.I are immunological procedures. This is done by injecting human erythropoietin into animals, preferably rats or rabbits, to induce serum antibody formation against human erythropoietin. Human erythropoietin, injected into an injection animal, is recognized as a foreign substance, i. as an antigen for the animal's immune system and thus elicits antibodies against the antigen. Various cells that respond to antigen stimulation produce antibodies that differ slightly from each other. When blood is drawn, the antibody remains in the blood serum. Both unclean serum and purified antibody, such as serum immunoglobulin G fraction, can be used to detect and complex with human erythropoietin, but these materials have the major drawback of being polyclonal antibodies derived from different cells and therefore bind in addition to to erythropoietin to other ingredients of the crude extracts.

Zaujímavé sú tiež súčasné pokusy vyvinúť kontinuálne bunkové kultúry, schopné produkcie rovnorodej protilátky, ktorá reaguje špecificky s jediným antigénom. Tento postup bol všeobecne opísaný v publikácii Chisholm, High Technology Vol.Also of interest are current attempts to develop continuous cell cultures capable of producing a homogeneous antibody that reacts specifically with a single antigen. This procedure has been generally described in Chisholm, High Technology Vol.

3, č. 1, str. 57 až 63 (1983). Boli tiež uskutočnené pokusy použiť fúziu buniek a hybridizáciu na získanie monoklonálnych protilátok proti erytropoietínu a použiť tieto protilátky na izoláciu a na kvantitatívne stanovenie ľudského erytropoietínu. Ako príklad je možné uviesť úspešný vývoj bunkových línií myšieho hybridómu, ktoré vylučujú monoklonálne protilátky proti ľudskému erytropoietínu tak, ako bol opísaný v publikácii Lee-Huang, Abstrakt č. 1463 v Fed. Proc. 41, 520 (1982). Ďalším príkladom môže byť detailný opis prípravy a použitia monoklonálnej protilátky proti ľudskému erytropoietínu podľa publikácie Weiss a ďalšie, P.N.A.S. (USA) 79, 5465 až 5469 (1982) a tiež v Sasaki, Biomed. Biochim. Acta 42 (11/12), str. 202 až 206 (1983), Yanagawa a dalšie, Blood, 64 (2), 357 až 364 (1984), Yanagawa a dalšie, J. Biol. Chem. 259 (5), 2707 až 2710 (1984) a US patentový spis č. 4 465 624.3, no. 1, p. 57-63 (1983). Attempts have also been made to use cell fusion and hybridization to obtain monoclonal antibodies against erythropoietin and to use these antibodies to isolate and quantitate human erythropoietin. By way of example, the successful development of mouse hybridoma cell lines that secrete monoclonal antibodies against human erythropoietin as described in Lee-Huang, Abstract no. 1463 in Fed. Proc. 41, 520 (1982). Another example may be a detailed description of the preparation and use of a monoclonal antibody against human erythropoietin according to Weiss et al., P.N.A.S. (USA) 79, 5465-5469 (1982) and also in Sasaki, Biomed. Biochim. Acta 42 (11/12), p. 202-206 (1983); Yanagawa et al., Blood, 64 (2), 357-364 (1984); Yanagawa et al., J. Biol. Chem. 259 (5), 2707-2710 (1984) and U.S. Pat. 4,465,624.

Zaujímavé sú tiež všetky správy, ktoré sa týkajú imunologickej účinnosti syntetických peptidov, ktoré v podstate napodobujú sled aminokyselín, ktorý existuje v prírodné sa vyskytujúcich bielkovinách, glykoproteínoch a nukleoproteínoch. Je možno uviesť, že bielkoviny s nižšou molekulovou hmotnostou sa účastnia imunologických reakcií, ktoré majú podobný rozsah a trvanie ako pri fyziologicky významných bielkovinách, napríklad vírusových antigénoch, hormónoch typu polypeptidov a podobne. Medzi imunologickými reakciami týchto polypeptidov je nutné uviesť tiež vyvolanie tvorby špecifických protilátok u zvierat, ako to bolo opísané napríklad v publikáciách Lerner ,a dalšie, Celí, 23, 309 až 310, 1981, Ross a dalšie, Náture 294, str. 654 až 656, 1981, Walter a dalšie', PNAS (USA) 77, str. 5197 až 5200, 1980, Lerner a dalšie, PNAS (USA), 78,Also of interest are all reports regarding the immunological efficacy of synthetic peptides that essentially mimic the amino acid sequence that exists in naturally occurring proteins, glycoproteins and nucleoproteins. It is noted that lower molecular weight proteins are involved in immunological responses that are similar in magnitude and duration to physiologically important proteins, for example, viral antigens, polypeptide-like hormones, and the like. Immunological reactions of these polypeptides also include induction of specific antibody production in animals, as described, for example, in Lerner, et al., Cell, 23, 309-310, 1981, Ross et al., Nature 294, p. 654-656, 1981, Walter et al., PNAS (USA) 77, p. 5197-500, 1980, Lerner et al., PNAS (USA), 78,

3403 až 3407 (1981), Walter a dalšie, PNAS (USA) 78, 4882 až 4886, 1981, Wong a dalšie, PNAS (USA), 78, 7412 až 7416,3403-3407 (1981), Walter et al., PNAS (USA) 78, 4882-4886, 1981, Wong et al., PNAS (USA), 78, 7412-7416,

1981, Green a dalšie, Celí, 28, 477 až 487, 1982, Nigg a dalšie, PNAS (USA) 79, 5322 až 5326 (1982), Barón a dalšie, Celí 28, 395 až 404 (1982), Dreesman a dalšie, Náture 295, 158 až 160 (1982), Lerner, Scientific American 248, č. 2. 66 až 74 (1983). Podobný postup je opísaný tiež v publikácii Kaiser á dalšie, Science 223, str. 249 až 255 (1984), kde ide najmä o biologickú a imunologickú účinnosť syntetických peptidov, ktoré majú približne rovnaké sekundárne štruktúry s peptidovými hormónmi, avšak nemusia mat rovnakú primárnu štruktúru. Hore uvedené štúdie sa však vzťahujú väčšinou na aminokyselinové sledy iných bielkovín ako erytropoietínu, pre ktoré ešte nebola publikovaná žiadna podstatná informácia, týkajúca sa sledu aminokyselín v tejto látke. V US patentovej prihláške č. 463 724, podanej 4. februára 1983 (J. Egrie), uverejnenej 22.1981, Green et al., Cell, 28, 477-487, 1982; Nigg et al., PNAS (USA) 79, 5322-5326 (1982), Baron et al., Cell 28, 395-404 (1982), Dreesman et al. Nature 295: 158-160 (1982); Lerner, Scientific American 248, no. 2. 66-74 (1983). A similar procedure is also described in Kaiser et al., Science 223, p. 249-255 (1984), in particular the biological and immunological efficacy of synthetic peptides having approximately the same secondary structures with peptide hormones but need not have the same primary structure. However, the above studies mostly relate to amino acid sequences of proteins other than erythropoietin, for which no relevant information regarding the amino acid sequence of this substance has been published yet. U.S. Pat. No. 463,724, filed Feb. 4, 1983 (J. Egrie), published May 22, 1983;

augusta 1984 ako európska prihláška č. 0 116 446 sa opisuje bunková línia myšieho hybridómu (ATCC č. HB 8209), ktorá produkuje vysoko špecifický typ protilátky, ktorá je súčasne špecificky reaktívna na polypeptid, ktorý sa skladá z nasledujúceho sledu aminokyselín:August 1984 as European application no. 0 116 446 describes a mouse hybridoma cell line (ATCC No. HB 8209) that produces a highly specific type of antibody that is also specifically reactive to a polypeptide consisting of the following amino acid sequence:

NH₂“Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-ArgTyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.NH ₂ Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.

Tento sled zodpovedá sledu, ktorý sa predpokladá pre prvých dvadsať aminokyselín úplného ludského erytropoietínu, izolovaného spôsobom podlá publikácie Miyake a dalšie, J.This sequence corresponds to that envisaged for the first twenty amino acids of full human erythropoietin, isolated by the method of Miyake et al., J.

Biol. Chem. 252, 5558 až 5564 (1977), kde analýza sledu aminokyselín bola uskutočnená v plynovej fáze (Applied Biosystems Inc.) spôsobom podlá publikácie Hewick M. a dalšie, J. Biol. Chem. 256, 7990 až 7997,(1981). Podobný postup je opísaný tiež v publikácii Sue a dalšie, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80, str. 3651 až 3655 (1983), publikácia sa týka tvorby polyklonálnych protilátok proti syntetickému sledu 26 aminokyselín a v publikácii Sytowski a dalšie, J. Immunol. Methods 69, str. 181 až 186 (1984).Biol. Chem. 252, 5558-5564 (1977), wherein amino acid sequence analysis was performed in gas phase (Applied Biosystems Inc.) according to the method of Hewick M. et al., J. Biol. Chem. 256, 7990-7997, (1981). A similar procedure is also described in Sue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, p. 3651-3655 (1983), the publication of which relates to the generation of polyclonal antibodies against a synthetic sequence of 26 amino acids, and Sytowski et al., J. Immunol. Methods 69, p. 181-186 (1984).

Hore opísané polyklonálne a monoklonálne protilátky predstavujú vysoko užitočné materiály pre použitie v imunológii na detekciu a kvantitatívne stanovenie erytropoietínu a môžu byt užitočné aj na afinitné čistenie erytropoietínu, je však nepravdepodobné , že by tieto materiály bolo možné použit na izoláciu velkých množstiev erytropoietínu z cicavcov v množstve, dostatočnom na dalšiu analýzu, klinické pokusy a liečebné použitie tejto látky napríklad v prípade chronických ochorení obličiek, pri ktorých tkanivo nestačí udržat dostatočnú produkciu erytrocytov. V dôsledku týchto skutočností je možné predpokladať, že najlepšie vyhliadky na plnú charakterizáciu erytropoietínu cicavcov a na získanie velkých množstiev tejto látky pre potenciálne diagnostické a klinické použitia má úspešná aplikácia rekombinantných postupov na zaistenie mikrobiálnej syntézy uvedeného materiálu vo velkom množstve.The polyclonal and monoclonal antibodies described above are highly useful materials for use in immunology for the detection and quantitative determination of erythropoietin and may also be useful for affinity purification of erythropoietin, but it is unlikely that these materials can be used to isolate large amounts of erythropoietin from mammals in amounts , sufficient for further analysis, clinical trials and therapeutic use of the compound, for example, in the case of chronic kidney diseases in which the tissue is not sufficient to maintain sufficient erythrocyte production. Consequently, it is believed that the best prospects for fully characterizing mammalian erythropoietin and for obtaining large amounts of this substance for potential diagnostic and clinical uses have been successfully applied by recombinant techniques to ensure microbial synthesis of said material in large quantities.

Byli vyvinuté velké snahy izoloval, sled DNA, ktorý je kódom pre ludský erytropoietín a pre obdobné látky u iných cicav cov, avšak dosial bez úspechu. Tento neúspech je patrne zavinený tým, že je k dispozícii velmi malé množstvo tkanív ako zdrojov tejto látky, najmä u človeka, ide najmä o materiály, obohatené mRNA, ktoré by mohli dovolil konštrukciu radu cDNA, z ktorých by potom bolo možné izoloval bežným spôsobom sled, ktorý je kódom pre erytropoietín. Popri tom je o kontinuálnom slede aminokyselín v erytropoietínu zatial známe tak málo, že nie je možné konštruoval napríklad dlhšie vzorky polynukleotidov, ktoré by bolo dalej možné použit pri hybridizácii DNA/DNA pri použití cDNA a najmä na získanie zostavy určitého genómu. Napríklad hore uvedený sled dvadsiatich aminokyselín, ktorý bol použitý na získanie monoklonálnej protilátky, produkovanej ATCC č. HB 8209 nedovoluje konštrukciu oligonukleotidovej vzorky s 60 bázami spôsobom opísaným v hore uvedenej publikácii Andersona a dalších. Je pravdepodobné, že sa ludský gén pre erytropoietín môže vyskytoval ako jediná kópia génu v ludskom genóme a v každom prípade ludský materiál, ktorý je kódom pre ludský erytropoietín tvorí menej ako 0,00005 % celko vej DNA ludského genómu.Great efforts have been made to isolate, a DNA sequence that encodes human erythropoietin and the like in other mammals, but has so far been unsuccessful. This failure is likely to be due to the very small amount of tissue available as a source of this substance, especially in humans, especially mRNA-enriched materials that could allow the construction of a series of cDNAs, from which the sequence could then be isolated , which is the code for erythropoietin. In addition, the continuous sequence of amino acids in erythropoietin is so little known that it is not possible, for example, to construct longer samples of polynucleotides that could further be used in DNA / DNA hybridization using cDNA and in particular to obtain a genome assembly. For example, the aforementioned sequence of twenty amino acids used to obtain the monoclonal antibody produced by ATCC no. HB 8209 does not permit the construction of a 60 base oligonucleotide sample as described in Anderson et al., Supra. It is likely that the human erythropoietin gene may occur as a single copy of the gene in the human genome, and in any case the human material that encodes the human erythropoietin accounts for less than 0.00005% of the total DNA of the human genome.

Aj najlepšie dosial opisované výsledky, dosiahnuté pri použití rekombinantných metód za účelom získania sledov DNA, pri ktorých expresii v mikroorganizmu by bolo možné získal izolovatelné množstvá erytropoietínu cicavcov mali ďaleko do skutočného úspechu. Napríklad v publikácii Farber a ďalšie, Exp. Hematol. 11, Suppl. 14, Abstrakt 101 (1983) sa opisuje extrakcia mRNA z obličkového tkaniva paviána po pôsobení fenylhydrazínu s následnou injekciou mRNA do oocytov Xenopus laevis, pričom bola in vitro dosiahnutá priechodná tvorba zmesi produktov translácie, ktoré majú okrem iného určitú účinnosť typu erytropoietínu. V publikácii Farber a ďalšie, Blood 62, č. 5, Supp. č. 1, Abstrakt 392 na str. 122a (1983) sa opisuje translácia mRNA z ludskej obličky do oocytov žaby. Výsledná zmes translačných produktov obsahovala 220 m jednotiek translačného produktu s účinnosťou erytropoietínu na mg mRNA. Táto úroveň translácie exogénneho kódu mRNA pre erytropoietín in vitro je velmi nízka (aj v porovnaní so skôr uvádzanými výsledkami s transláciou mRNA paviána), výsledky však patrne potvrdzujú, že ludská oblička je miestom, v ktorom dochádza k expresii erytropoietínu, takže by malo byt možné z obličiek získať zostavu cDNA, obohatenú o požadovaný gén (Farber, Clin. Res. 31 (4), 769A (1983).Even the best results so far achieved using recombinant methods to obtain DNA sequences in which expression in a microorganism could be obtained with isolable amounts of mammalian erythropoietin were far from being successful. For example, Farber et al., Exp. Hematol. 11, Suppl. 14, Abstract 101 (1983) describes the extraction of mRNA from baboon kidney tissue after phenylhydrazine treatment followed by injection of mRNA into Xenopus laevis oocytes, providing in vitro transient formation of a mixture of translation products having, inter alia, some erythropoietin-like activity. In Farber et al., Blood 62, no. 5, Supp. no. 1, Abstract 392 at p. 122a (1983) describes the translation of mRNA from the human kidney into frog oocytes. The resulting translation product mixture contained 220 m units of translation product with erythropoietin activity per mg mRNA. This level of translation of the exogenous mRNA code for erythropoietin in vitro is very low (even compared to the previously reported baboon mRNA translation results), but the results seem to confirm that the human kidney is a site where erythropoietin is expressed, so it should be possible obtain a cDNA assembly enriched for the gene of interest from the kidney (Farber, Clin. Res. 31 (4), 769A (1983)).

Až do podania US patentových prihlášok č. 561 024 a 582 185 bola známa iba jediná správa o klonovaní a expresii cDNA ludského erytropoietínu v E. coli. Do plazmidov E. coli bolo včlenené väčšie množstvo klonov cDNÄ a produkty po fúzii s β-laktamázou boli imunoreaktívne s monoklonálnou protilátkou k nešpecifickému epitopu ludského erytropoietínu, postup bol opísaný v publikácii Lee-Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, str. 2708 až 2712 (1984).Pending the filing of U.S. Pat. Only one report on cloning and expression of human erythropoietin cDNA in E. coli was known from 561,024 and 582,185. A plurality of cDNA clones were incorporated into E. coli plasmids and the β-lactamase fusion products were immunoreactive with a monoclonal antibody to a non-specific epitope of human erythropoietin, as described by Lee-Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, p. 2708-2712 (1984).

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Do rozsahu tohto vynálezu spadajú nasledujúce aspekty:The following aspects are within the scope of this invention:

1. Sekvencia DNA na použitie pre zaistenie expresie polypeptidového produktu, ktorého štruktúra aspoň sčasti zodpovedá primárnej štruktúre erytropoietínu na zaistenie jeho biologických vlastností spočívajúcich v zvyšovaní produkcie retikulocytov a červených krviniek v bunkách kosťovej drene a zvyšovaní syntézy hemoglobínu alebo príjmu železa, v prokaryontných alebo eukaryontných hostitelských bunkách, pričom táto sekvencia DNA sa volí zo súboru zahŕňajúceho (a) sekvencie DNA uvedené v tabuľke V a VI a ich komplementárne reťazce;A DNA sequence for use in providing expression of a polypeptide product whose structure at least partially corresponds to the primary structure of erythropoietin to provide its biological properties consisting in increasing reticulocyte and red blood cell production in bone marrow cells and enhancing hemoglobin synthesis or iron uptake in prokaryotic or eukaryotic cells, wherein the DNA sequence is selected from the group consisting of (a) the DNA sequences set forth in Tables V and VI and their complementary strands;

(b) sekvencie DNA hybridižujúce za stringentných podmienok k sekvenciám DNA definovaným v odseku (a) alebo ich fragmentom; a (c) sekvencie DNA, ktoré by hybridizovali k sekvenciám DNA definovaným v odseku (a) alebo (b), keby nebola degenerácia genetického kódu.(b) DNA sequences hybridizing under stringent conditions to the DNA sequences defined in (a) or fragments thereof; and (c) DNA sequences that would hybridize to the DNA sequences defined in (a) or (b) if there were no degeneracy of the genetic code.

2. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 kódujúca ľudský erytropoietín.2. The DNA sequence of aspect 1 encoding human erythropoietin.

3. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 kódujúca opičí erytropoietín.3. The DNA sequence of aspect 1 encoding monkey erythropoietin.

4. Sekvencia DNA podľa aspektu 3 obsahujúca oblasť kódujúcu proteín uvedenú v tabuľke V.4. The DNA sequence of aspect 3 comprising the protein coding region set forth in Table V.

5. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 alebo 2, ktorou je sekvencia genómovej DNA.5. The DNA sequence of aspect 1 or 2, which is a genomic DNA sequence.

6. Sekvencia DNA podľa aspektu 5 kódujúca ľudský erytropoietín.6. The DNA sequence of aspect 5 encoding human erythropoietin.

7. Sekvencia DNA podľa aspektu 6 obsahujúca oblasť kódujúcu proteín uvedenú v tabuľke VI.7. The DNA sequence of aspect 6 comprising the protein coding region set forth in Table VI.

8. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 alebo 2, ktorá je kovalentne pripojená k detegovateľnej značiacej látke.8. The DNA sequence of aspect 1 or 2, which is covalently linked to a detectable marker.

9. Sekvencia DNA podľa aspektu 8, kde detegovateľná značiaca látka je rádioaktívna.9. The DNA sequence of aspect 8, wherein the detectable label is radioactive.

10. Sekvencia DNA podľa aspektu 8 alebo 9, ktorá je jednoretazcová.10. The DNA sequence of aspect 8 or 9, which is single stranded.

11. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 kódujúca [Phe¹⁵]hEPO, [Phe⁴⁹]hEP0, [Phe¹⁴⁵]hEP0, [His⁷]hEP0, [Asn²-des-Pro² až Ile⁶]hEPO, [des-Thr¹⁶³ až Arg¹⁶⁶]hEP0 alebo [delta 27-55]hEPO.11. The DNA sequence of aspect 1 encoding [Phe ¹⁵ ] hEPO, [Phe ⁴⁹ ] hEP0, [Phe ¹⁴⁵ ] hEP0, [His ⁷ ] hEP0, [Asn ² -des-Pro ² to Ile ⁶ ] hEPO, [des-Thr ¹⁶³ to Arg ¹⁶⁶ ] hEP0 or [delta 27-55] hEPO.

12. Prokaryontná alebo eukaryontná hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná sekvenciou DNA podľa niektorého z aspektov 1, 2, 3, 6, 7a 8 spôsobom umožňujúcim tejto hostiteľskej bunke exprimovať uvedený polypeptidový produkt.12. A prokaryotic or eukaryotic host cell transformed or transfected with the DNA sequence of any one of aspects 1, 2, 3, 6, 7, and 8 in a manner allowing said host cell to express said polypeptide product.

13. Prokaryontná alebo eukaryontná hostiteľská bunka podľa aspektu 13, ktorá je schopná glykozylovat uvedený polypeptid.13. The prokaryotic or eukaryotic host cell of aspect 13, which is capable of glycosylating said polypeptide.

14. Prokaryontná alebo eukaryontná hostiteľská bunka podľa aspektu 13, ktorou je cicavčia bunka.14. The prokaryotic or eukaryotic host cell of aspect 13, which is a mammalian cell.

15. Prokaryontná alebo eukaryontná hostiteľská bunka podľa aspektu 13, ktorou je bunka COS.15. The prokaryotic or eukaryotic host cell of aspect 13, which is a COS cell.

16. Prokaryontná alebo eukaryontná hostiteľská bunka podľa aspektu 13, ktorou je bunka CHO.16. The prokaryotic or eukaryotic host cell of aspect 13, which is a CHO cell.

17. Biologicky funkčný cirkulárny plazmid alebo vírusový DNA vektor obsahujúci sekvenciu DNA podľa niektorého z aspektov 1,17. A biologically functional circular plasmid or viral DNA vector comprising the DNA sequence of any one of aspects 1;

2, 3, 5, 6, 7 alebo 11.2, 3, 5, 6, 7 or 11.

18. Prokaryontná alebo eukaryontná hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA vektorom podľa aspektu 17.18. A prokaryotic or eukaryotic host cell stably transformed or transfected with the DNA vector of aspect 17.

19. Rekombinantný polypeptid vykazujúci celú primárnu štruktúrnu konformáciu ľudského alebo opičieho erytropoietínu, ako je uvedená v tabulke VI alebo V, alebo jej časť alebo aký- 21 kolvek jeho alelový variant alebo derivát vykazujúci biologickú účinnosť spočívajúcu v zvyšovaní produkcie retikulocytov a červených krviniek v bunkách kosťovej drene a zvyšovaní syntézy hemoglobínu alebo príjmu železa. Tento polypeptid je produktom eukaryontnej expresie exogénnej sekvencie DNA a má molekulovú hmotnosť podlá SDS-PAGE vyššiu ako erytropoietín izolovaný z moča.19. A recombinant polypeptide having all or part of the primary structural conformation of human or simian erythropoietin as shown in Table VI or V, or any portion thereof, or any derivative thereof, or a derivative thereof exhibiting biological activity by increasing reticulocyte and red blood cell production in bone cells. and increase hemoglobin synthesis or iron uptake. This polypeptide is the product of eukaryotic expression of an exogenous DNA sequence and has a molecular weight by SDS-PAGE higher than erythropoietin isolated from urine.

20. Polypeptid podlá aspektu 19, ktorým je glykoproteín, ktorého priemerné sacharidové zloženie sa líši od ludského erytropoietínu izolovaného z moča.20. The polypeptide of aspect 19, which is a glycoprotein whose average carbohydrate composition differs from human erythropoietin isolated from urine.

21. Polypeptid podlá aspektu 19 alebo 20, kde exogénnou sekvenciou DNA je sekvencia cDNA.21. The polypeptide of aspect 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is a cDNA sequence.

22. Polypeptid podlá aspektu 19 alebo 20, kde exogénnou sekvenciou DNA je sekvencia genómovej DNA.22. The polypeptide of aspect 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is a genomic DNA sequence.

II

23. Polypeptid podlá aspektu 19 alebo 20, kde exogénna sekvencia DNA je súčasťou autonómne sa replikujúceho cirkulárneho DNA plazmidu alebo vírusového vektoru.23. The polypeptide of aspect 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is part of an autonomously replicating circular DNA plasmid or viral vector.

24. Polypeptid podlá niektorého z aspektov 19 až 23, ktorý je kovalentne pripojený k detegovatelnej značiacej látke.24. The polypeptide of any one of aspects 19 to 23, which is covalently attached to a detectable label.

25. Polypeptid podlá aspektu 24, kde detegovatelná značiaca látka je rádioaktívna.25. The polypeptide of aspect 24, wherein the detectable label is radioactive.

26. Polypeptidový produkt pripravitelný expresiou sekvencie DNA podlá niektorého z aspektov 1, 2, 3, 5, 6a7v eukaryontnej hostiteľskej bunke.26. A polypeptide product obtainable by expressing the DNA sequence of any one of aspects 1, 2, 3, 5, 6, and 7 in a eukaryotic host cell.

27. Spôsob výroby polypeptidu vykazujúceho aspoň časť primárnej štruktúrnej konformácie erytropoietínu na umožnenie biologickej účinnosti spočívajúci v zvyšovaní produkcie re22 tikulocytov a červených krviniek v bunkách kostovej drene a zvyšovaní syntézy hemoglobínu alebo príjmu železa, ktorého podstata spočíva v tom, že sa prokaryontná alebo eukaryontná hostiteľská bunka transformovaná alebo traňsfekovaná sekvenciou DNA podľa niektorého z aspektov 1, 2, 3, 5, 6 a 7 spôsobom umožňujúcim hostiteľskej bunke exprimovať tento polypeptid kultivuje za vhodných živných podmienok a prípadne sa požadovaný polypeptidový produkt expresie tejto sekvencie DNA izoluje.27. A method of producing a polypeptide having at least a portion of the primary structural conformation of erythropoietin to enable biological efficacy by increasing the production of re22 ticulocytes and red blood cells in bone marrow cells and increasing the synthesis of hemoglobin or iron uptake by procaryotic or eukaryotic host cell. transformed or transfected with the DNA sequence of any one of aspects 1, 2, 3, 5, 6 and 7 in a manner allowing the host cell to express the polypeptide is cultured under appropriate nutrient conditions and optionally the desired polypeptide product of expression of the DNA sequence is isolated.

28. Spôsob podľa aspektu 27, pri ktorom sa kultivuje hostiteľská bunka podľa niektorého z aspektov 12 až 16.28. The method of aspect 27, wherein the host cell of any one of aspects 12 to 16 is cultured.

II

29. Spôsob podľa aspektu 27 alebo 28 na výrobu polypeptidu podľa niektorého z aspektov 19 až 23 a 26, pri ktorom sa postupuje za podmienok vedúcich k týmto polypeptidom.29. The method of aspect 27 or 28 for producing a polypeptide according to any of aspects 19 to 23 and 26, wherein the process is conducted under conditions resulting in said polypeptides.

II

30. Farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje polypeptid pripravíteľný spôsobom podľa aspektu 27, 28 alebo 29 a farmaceutický vhodné riedidlo, pomocnú látku alebo nosič.30. A pharmaceutical composition comprising a polypeptide obtainable by the method of aspect 27, 28 or 29 and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier.

31. Farmaceutický prostriedok podľa aspektu 30, obsahujúci polypeptid podľa niektorého z aspektov 19 až 23 a 26.31. The pharmaceutical composition of aspect 30, comprising the polypeptide of any of aspects 19 to 23 and 26.

Vertebrata (napríklad COS-1 a CHO) poskytli pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu vôbec prvé bunky, ktoré je možné množiť kontinuálne in vitro a ktoré pri rastu v kultúre sú schopné produkovať do prostredí, v ktorom rastú viac ako 100 jednotiek (s výhodou viac ako 500 jednotiek, najmä 1000 až 5000 jednotiek) erytropoietínu na 10⁶ buniek v priebehu 48 hodín, ako bolo stanovené rádioimunologicky.Vertebrates (e.g., COS-1 and CHO) have provided the first ever cell that can be propagated continuously in vitro and which, when grown in culture, are capable of producing into an environment in which they grow more than 100 units (preferably more than 500 units, in particular 1000 to 5000 units) of erythropoietin per 10 ⁶ cells over 48 hours as determined by radioimmunoassay.

Spôsobom podľa vynálezu je možné tiež získať syntetické polypeptidy, ktoré úplne alebo sčasti svojou štruktúrou zodpo23 vedajú kontinuálnemu sledu aminokyselinových zvyškov erytropoietínu, ktoré tak boli poprvýkrát osvetlené. Tieto sledy, ktoré môžu mat spoločné primárne, sekundárne alebo terciárne štrukturálne vlastnosti s prírodné sa vyskytujúcim erytropoetínom môžu mat tiež biologickú účinnost a/alebo imunologické vlastnosti spoločné s prírodné sa vyskytujúcim produktom, takže je môže byt možné použiť ako biologicky alebo imunologický účinné náhražky erytropoietínu na liečebné a imunologické účely. Zodpovedajúcim spôsobom je možné získať tiež monoklonálne a polyklonálne protilátky, ktoré sú imunoreaktívne vzhíadom na hore uvedené polypeptidy a s výhodou imunoreaktívne tiež k prírodné sa vyskytujúcemu erytropoietínu.It is also possible with the method according to the invention to obtain synthetic polypeptides which, wholly or partially, by virtue of their structure, lead to a continuous sequence of amino acid residues of erythropoietin, which were thus illuminated for the first time. These sequences, which may have common primary, secondary or tertiary structural properties with naturally occurring erythropoietin, may also have biological activity and / or immunological properties common to the naturally occurring product, so that they may be used as biologically or immunologically effective substitutes for erythropoietin for medical and immunological purposes. Correspondingly, it is also possible to obtain monoclonal and polyclonal antibodies which are immunoreactive to the aforementioned polypeptides and preferably also immunoreactive to naturally occurring erythropoietin.

ís

Príkladom látok, získaných spôsobom podía vynálezu môžu byt klonované sledy DNA íudského alebo opičieho pôvodu a polypeptidové sledy, získané pri použití týchto materiálov, ktoré sú prvým potvrdením štruktúry erytropoietínu opíc a íudí.Examples of substances obtained by the method of the invention may be cloned DNA sequences of human or monkey origin and polypeptide sequences obtained using these materials, which are the first confirmation of the structure of erythropoietin in monkeys and humans.

Spôsobom podía vynálezu je tiež možné získať nové biologicky funkčné vírusové a cirkulárne vektory pre plazmidovú DNA, do ktorých je možné včleniť sledy DNA podía vynálezu a mikrobiálne (napríklad bakteriálne, kvasinkové a cicavčie) bunky ako hostiteľské organizmy, stabilne transformované alebo podrobené transfekcii pri použití hore uvedených vektorov.It is also possible with the method of the invention to provide novel biologically functional viral and circular vectors for plasmid DNA into which the DNA sequences of the invention and microbial (e.g. bacterial, yeast and mammalian) cells as host organisms stably transformed or transfected using the above can be incorporated. of the vectors.

Týmto spôsobom je podľa vynálezu možné získať cenné polypeptidy tak, že sa pestuje v kultúre transformovaný mikrobiálny hostiteľ za podmienok, ktoré umožňujú alebo uľahčujú expresiu exogénnej, do vektoru včlenenej DNA vo veľkom množstve s následnou izoláciou požadovaných polypeptidov z rastového prostredia, lyzátu buniek alebo frakcií bunkovej membrány.In this way, it is possible according to the invention to obtain valuable polypeptides by culturing in a culture a transformed microbial host under conditions which allow or facilitate expression of exogenous, vector-incorporated DNA in large quantities, followed by isolation of the desired polypeptides from growth media, cell lysate or cell fractions membrane.

Izoláciu a čistenie polypeptidov, získaných mikrobiálnou expresiou je možné vykonávať bežným spôsobom vrátane napríklad preparatívnej deliacej chromatografie a imunologického delenia pri použití monoklonáIných a/alebo polyklonálnych protilátok.Isolation and purification of polypeptides obtained by microbial expression can be accomplished by conventional means, including, for example, preparative separation chromatography and immunological separation using monoclonal and / or polyclonal antibodies.

Po osvetlení sledu aminokyselinových zvyškov v erytropoetínu je možné zostaviť tiež úplný a/alebo čiastočný sled DNA, ktorá je kódom pre erytropoietín vrátane výhodných vlastností tohto sledu, napríklad včlenenie kodónov, ktoré sú výhodné na dosiahnutie expresie pri použití hostitela odlišného od cicavca, začlenenie miest pre štiepenie reštrikčnými endonukleázami a pridaním počiatočných terminálnych alebo vmedzerených sledov DNA, ktoré môžu uľahčovať konštrukciu alebo umožniť ľahšiu expresiu vektoru. Spôsobmi opísanými v príkladoch rozpracovania je možné získať (a špecifickou mutagenézou cDNA a DNA genómu ďalej rozvíjať) sledy DNA, ktoré sú kódom pre mikrobiálnu;expresiu polypeptidových analógov alebo derivátov erytropoietínu, ktoré sa odlišujú od prírodné sa vyskytujúcej formy identitou alebo umiestnením jedného alebo väčšieho počtu aminokyselinových zvyškov, ide teda napríklad o analógy vzniknuté vynechaním menej ako všetkých zyyškov, špecifických pre erytropoietín (EPO) a/alebo vzniknuté substitúciou, pri ktorej jeden alebo väčší počet zvyškov je nahradený inými zvyškami a/alebo vzniknuté adíciou, pri ktorej sa pridáva jeden alebo väčší počet aminokyselinových zvyškov k terminálnej alebo mediálnej časti polypeptidu, pričom všetky tieto formy môžu mať časť alebo všetky vlastnosti prírodné sa vyskytujúcich foriem.After illuminating the erythropoietin amino acid sequence, it is also possible to construct a complete and / or partial DNA sequence coding for erythropoietin, including the beneficial properties of this sequence, such as the incorporation of codons that are advantageous to achieve expression using a non-mammalian host, restriction endonuclease digestion and addition of initial terminal or restricted DNA sequences that may facilitate construction or facilitate expression of the vector. By the methods described in the Examples, it is possible to obtain (and further develop by specific mutagenesis of cDNA and DNA genome) DNA sequences coding for microbial expression of polypeptide analogs or erythropoietin derivatives that differ from the naturally occurring form by the identity or location of one or more amino acid residues, i.e., analogs resulting from the deletion of less than all erythropoietin-specific residues (EPOs) and / or from substitution in which one or more residues are replaced by other residues and / or by an addition in which one or more amino acids are added. a plurality of amino acid residues to the terminal or media portion of the polypeptide, all of which forms may have part or all of the properties of naturally occurring forms.

Polypeptidy, ktoré sú produktom hore uvedeného postupu je možné označiť tak, že sa na ne kovalentnou väzbou naviaže zistiteľný materiál. Môže napríklad ísť o rádioaktívne označenie izotopom ¹²⁵I, čím je možné získať reakčné činidlo, ktoré sa dá použiť na detekciu a na kvantatívne stanovenie erytropoietínu v pevných tkanivách a tiež vo vzorkách kvapalín, napríklad v moču alebo v krvi. DNA podľa vynálezu je tiež možné označiť, a to rádioaktívne alebo napríklad biotínom a potom použiť pri hybridizácii na určenie polohy erytropoietínového génu a/alebo polohy akéhokoľvek príbuzného génu u ľudí, opíc a ďalších cicavcov v ich chromozomálnej mape. Týmto spôsobom je tiež možné preukázať poruchy génu pre erytropoietín na úrovni DNA alebo poruchy príbuzných génov.Polypeptides resulting from the above process may be labeled by binding a detectable material to them by covalent bonding. For example, it may be radiolabelled with the ¹²⁵ I isotope to provide a reagent that can be used to detect and quantify erythropoietin in solid tissues as well as in fluid samples such as urine or blood. The DNA of the invention may also be radiolabeled or biotin-labeled and then used in hybridization to determine the position of the erythropoietin gene and / or the position of any related gene in humans, monkeys and other mammals in their chromosomal map. In this way, it is also possible to demonstrate DNA erythropoietin gene disorders or related gene disorders.

Ako bude ďalej podrobnejšie uvedené, znamená vynález podstatné zlepšenie detekcie špecifického polynukleotidu s jedným reťazcom s neznámym sledom v heterogénnej bunkovej alebo vírusovej vzorke vrátane mnohopočetných polynukleotidov s jednoduchým reťazcom tak, že saAs will be described in more detail below, the invention means substantially improving the detection of a specific single-chain polynucleotide of unknown sequence in a heterogeneous cellular or viral sample, including multiple single-chain polynucleotides by

a) pripraví zmes značených polynukleotidových vzoriek s jednoduchými reťazcami s uniformné sa meniacim sledom báz, pričom každá z týchto vzoriek je potenciálne špecificky komplementárna k sledu, ktorý sa vyskytuje vo vzorke a náleží polynukleotidu, ktorý má byt zistený,(a) prepare a mixture of labeled single-stranded polynucleotide samples with uniformly varying base sequences, each of which is potentially specifically complementary to the sequence that occurs in the sample and belongs to the polynucleotide to be detected;

b) vzorka sa fixuje na pevný substrát,(b) the sample is fixed to a solid substrate;

c) substrát s fixovanou vzorkou sa spracováva tak, aby bola znížená ďalšia vzájomná možnosť väzbý polynukleotidov s výnimkou hybridizácie na polynukleotide uvedenej vzorky,c) the substrate with the fixed sample is treated so as to reduce the additional possibility of binding to the polynucleotides, except for hybridization to the polynucleotide of said sample,

d) spracovaný substrát s fixovanou vzorkou sa na prechodný čas uvedie do styku so zmesou značených vzoriek za podmienok, ktoré uľahčujú hybridizáciu len medzi úplne komplementárnymi polynukleotidmi a(d) contacting the treated substrate with the fixed sample temporarily with a mixture of labeled samples under conditions which facilitate hybridization only between completely complementary polynucleotides; and

e) špecifický polynukleotid sa zistí zistením prítomnosti hybridizačnej reakcie polynukleotidu s úplnou komplementárnou vzorkou zo zmesi značených vzoriek, ako je možné preukázať prítomnosťou väčšej hustoty značeného materiálu na substráte v mieste prítomnosti špecifického polynukleotidu v porovnaní s ostatnými miestami substrátu, kde došlo iba k nešpecifickej väzbe značenej vzorky na substrát.(e) the specific polynucleotide is detected by detecting the presence of a hybridization reaction of the polynucleotide with a complete complementary sample from the labeled sample, as evidenced by the presence of greater density of labeled material on the substrate at the specific polynucleotide samples per substrate.

Tento spôsob je osobitne účinný v situáciách, keď je potrebné použiť 64, 128, 256, 512, 1024 alebo viac vzoriek polynukleotidov s dĺžkou 17 až 20 báz pri hybridizácii DNA/DNA,This method is particularly effective in situations where 64, 128, 256, 512, 1024 or more polynucleotide samples of 17 to 20 bases in length need to be used for DNA / DNA hybridization,

RNA/RNA alebo DNA/RNA.RNA / RNA or DNA / RNA.

- 26 Ako už bolo uvedené, umožnil tento postup identifikáciu klonov DNA, ktoré sú kódom pre erytropoietín opičieho pôvodu zo skupiny sledov, pripravených z mRNA buniek obličiek anemických opíc. V tomto prípade bolo použitých 128 uniformné variabilných vzoriek s dĺžkou 20 nukleotidov podía informácií a sledu aminokyselín frakcií íudského erytropoietínu pri hybridizácii kolónií, čím bolo možné preukázať sedem pozitívnych klonov opičej cDNA z celkového počtu 200 000 kolónií. Ďalej bolo možné rýchlo izolovať tri pozitívne klony z 1 500 000 povlakov fágu íudského genómu. I v tomto prípade bola použitá zmes 128 vzoriek polynukleotidov s 20 bázami spolu s druhou zostavou 128 nukleotidov s 17 bázami podía analýzy aminokyselín v inom kontinuálnom slede íudského erytropoietínu.As mentioned above, this procedure allowed the identification of DNA clones coding for monkey erythropoietin from a sequence of sequences prepared from mRNA of kidney anemic monkey cells. In this case, 128 uniform variable samples of 20 nucleotides in length were used according to the information and amino acid sequence of the fractions of human erythropoietin fractions in colony hybridization, thus demonstrating seven positive monkey cDNA clones out of a total of 200,000 colonies. Furthermore, it was possible to rapidly isolate three positive clones from 1,500,000 phage coatings of the human genome. Again, a mixture of 128 samples of 20 base polynucleotides was used along with a second set of 128 nucleotides of 17 bases according to amino acid analysis in another continuous sequence of human erythropoietin.

Hore uvedené postupy znamenajú prvé použitie zmiešaných vzoriek oligonukleotidov pri hybridizácii DNA/DNA za účelom izolácie klonov cicavčieho genómu, pričom súčasne bola poprvýkrát použitá zmes viac ako 32 vzoriek oligonukleotidov pri izolácii klonov cDNA.The above procedures involve the first use of mixed oligonucleotide samples for DNA / DNA hybridization to isolate mammalian genome clones, wherein a mixture of more than 32 oligonucleotide samples for the first time is used to isolate cDNA clones.

Ďalšie výhody spôsobu podía vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu výhodných rozpracovaní tohto spôsobu.Further advantages of the process of the invention will be apparent from the following detailed description of preferred embodiments of the process.

Spôsobom podía vynálezu je možné izolovať a charakterizovať sledy DNA, ktoré sú kódom pre časť alebo pre úplný polypeptidový sled erytropoietínu človeka a opice. Ďalej bolo možné podrobiť DNA človeka a opice expresii v eukaryotických i prokaryotických bunkách a získať tak izolovateíné množstvá polypeptidov s biologickou (napríklad imunologickou) účinnosťou prírodné sa vyskytujúceho EPO ako in vivo, tak in vitro.By the method of the invention, it is possible to isolate and characterize DNA sequences which encode a portion or a complete polypeptide sequence of human and monkey erythropoietin. Furthermore, it was possible to express human and monkey DNA in eukaryotic and prokaryotic cells to obtain isolable amounts of polypeptides with the biological (e.g., immunological) efficacy of naturally occurring EPO both in vivo and in vitro.

DNA opice bola izolovaná zo skupiny cDNA, ktorá bola vytvorená pomocou mRNA z obličkového tkaniva opice s chemicky vyvolanou anémiou, sérum tejto opice obsahovalo vysokú hladinuThe monkey DNA was isolated from a cDNA group that was generated by mRNA from kidney tissue of a chemically induced monkey, the serum of the monkey contained a high level of

EPO v porovnaní so sérom normálnych opíc. Izolácia požadovaných klonov cDNA s obsahom DNA, ktorá je kódom pre erytropoietín bola uskutočnená použitím DNA/DNA hybridizácie kolónií pri použití zmesi 128 rádioaktívne značených oligonukleotidov s 20 bázami s rýchlym vyhodnotením 200 000 vzniknutých kolónií. Stavba oligonukleotidových vzoriek bola určená podlá informácií o slede aminokyselín pri enzymatickej fragmentácii a určenia sledu v malej časti ludského EPO.EPO compared to normal monkey serum. Isolation of the desired cDNA clones containing the DNA encoding erythropoietin was performed using colony DNA / DNA hybridization using a mixture of 128 radiolabeled oligonucleotides with 20 bases with a rapid evaluation of 200,000 colonies formed. The construction of the oligonucleotide samples was determined according to the amino acid sequence of enzymatic fragmentation and the sequence determination in a small portion of human EPO.

DNA človeka bola izolovaná z ludského genómu. Izolácia klonov s obsahom DNA, ktorá je kódom pre EPO bola uskutočnená hybridizáciou povlakov pri použití hore uvedenej zmesi 128 oligonukleotidov s 20 bázami a druhej zmesi s 128 rádioaktívne značených oligonukleotidov s 17 bázami podlá informácií, získaných o slede aminokyselín z iného enzymaticky získaného fragmentu ludského EPO.Human DNA was isolated from the human genome. Isolation of EPO-encoded DNA clones was performed by hybridization of coatings using the above mixture of 128 base 20 oligonucleotides and a second mixture of 128 radiolabeled 17 base oligonucleotides according to the amino acid sequence from another enzymatically obtained fragment of human EPO .

i Ii I

Pozitívne klony a povlaky boli overené zistením sledu DNA klonu pri použití pomocnej zostavy 16 sledov pre zmes vzoriek s 20 bázami a vybrané klony boli podrobené zisteniu sledu nukleotidov, ktorej výsledkom bolo odvodenie primárnej štruktúry polypeptidov typu EPO, pre ktoré bola táto DNA kódom. Takto preukázaný sled polypeptidu bol vysoko homológny s čiastočným sledom aminokyselín, zisteným analýzou aminokyselín fragmentov ludského EPO.Positive clones and coatings were verified by detecting the DNA sequence of the clone using a 16-sequence subassembly for a 20 base sample mix, and selected clones were subjected to a nucleotide sequence resulting in the deduction of the primary structure of EPO-type polypeptides for which this DNA code was coded. The polypeptide sequence thus demonstrated was highly homologous to a partial amino acid sequence as determined by amino acid analysis of human EPO fragments.

Vybraný pozitívny kloň cDNA opice a vybraný pozitívny kloň cDNA človeka boli včlenené do vektoru na prenos DNA, ktorý bol namnožený v E. coli a potom použitý na transfekciu buniek cicavcov v kultúre. Tieto bunky potom boli ďalej pestované, pričom v supernatante kultúry bolo možno preukázať, až 3000 mjednotiek EPO v 1 ml.The selected monkey cDNA positive clone and the selected human cDNA positive clone were incorporated into a DNA transfer vector that was amplified in E. coli and then used to transfect mammalian cells in culture. These cells were then cultured, and up to 3000 EPO units per ml could be detected in the culture supernatant.

Vynález bude osvetlený nasledujúcimi príkladmi a jednotlivé príklady sú špecificky zamerané na postupy, ktoré boli uskutočnené pred identifikáciou klonov cDNA, ktoré sú kódom pre EPO opice a klonov ľudského genómu, na postupy, ktoré boli zamerané na identifikáciu a určenie sledu, na vývoj systému pre expresiu a na imunologické overenie expresie EPO v týchto systémoch.The invention will be illustrated by the following examples, and the specific examples are specifically directed to procedures that have been performed prior to the identification of cDNA clones that encode EPO monkeys and human genome clones, procedures that have been identified and identified, and the development of an expression system and to immunologically verify EPO expression in these systems.

'PirrL.lú.cíy us'k'U/oČhej'i/G. tynokiHPirrL.lú.cíy us'k'U / oČhej'i / G. tynokiH

Príklad 1 je zameraný na určenie sledu aminokyselín vo fragmentoch ľudského EPO a na konštrukciu zmesi rádioaktívne značených vzoriek na základe výsledkov určenia sledu.Example 1 is aimed at determining the amino acid sequence in human EPO fragments and constructing a mixture of radiolabeled samples based on the sequence determination results.

Príklad 2 je zameraný na postupy, vedúce k identifikácii pozitívnych klonov cDNA opice a poskytuje informáciu pre ošetrenie zvierat a na predbežnú rádioimunologickú analýzu (RIA) živočíšnych sér.Example 2 is directed to procedures leading to the identification of positive monkey cDNA clones and provides information for animal treatment and preliminary radioimmunoassay (RIA) of animal sera.

Príklad 3 je zameraný na prípravu zmesi a zostavy cDNA, na hybridizáciu kolónií, vyhľadávanie pozitívnych kolónií a overovanie pozitívnych klonov, na zistenie sledu DNA v pozitívnom cDNA klone a na potvrdenie primárnej štruktúry EPO opice (stanovenie sledu aminokyselín).Example 3 is directed to the preparation of a cDNA mix and assembly, to colonization, search for positive colonies, and to verify positive clones, to detect DNA sequence in a positive cDNA clone, and to confirm the primary structure of an EPO monkey (amino acid sequence determination).

Príklad 4 je zameraný na postupy, zahŕňajúce identifikáciu pozitívnych klonov ľudského genómu a zaisťuje informáciu o zdroji genómickej knižnice, hybridizáciu povlakov a overenie pozitívnych klonov.Example 4 is directed to procedures involving the identification of positive clones of the human genome and provides information about the genomic library source, hybridization of coatings, and verification of positive clones.

Príklad 5 je zameraný na zistenie sledu DNA v pozitívnom klone genómu a na získanie informácie o slede aminokyselín v ľudskej EPO vrátane jeho porovnania so sledom EPO opice.Example 5 is aimed at detecting the DNA sequence in a positive clone of the genome and obtaining information about the amino acid sequence in human EPO, including its comparison with the monkey EPO sequence.

V príklade 6 sú uvedené postupy konštrukcie vektoru s včlenenou DNA, ktorá je kódom pre EPO, odvodeného od pozitívneho klonu cDNA opice, použitie tohto vektoru na transfekciu buniek COS-l a pestovanie týchto buniek po transfekcii.Example 6 shows the procedures for constructing a vector incorporating DNA encoding EPO derived from a positive cDNA monkey clone, using the vector to transfect COS-1 cells, and culturing the cells after transfection.

Príklad 7 je zameraný na konštrukciu vektoru s včlenenou DNA, ktorá je kódom pre EPO, získanou z pozitívneho klonu ludského genómu, použitie tohto vektoru na transfekciu buniek COS-l a pestovanie týchto buniek po transfekcii.Example 7 is directed to the construction of a vector incorporating DNA encoding EPO derived from a positive clone of the human genome, using the vector to transfect COS-1 cells and culturing these cells after transfection.

Príklad 8 sa týka imunologických postupov pri ktorých bol použitý supernatant z kultúr buniek po transfekcii podlá príkladov 6 a 7.Example 8 relates to immunological procedures in which the supernatant from the transfected cell cultures according to Examples 6 and 7 was used.

Príklad 9 je zameraný na sledovanie biologickej účinnosti in vivo a in vitro pre EPO, získaný mikrobiálnou expresiou v príkladoch 6 a 7.Example 9 is aimed at monitoring the biological activity in vivo and in vitro for EPO, obtained by microbial expression in Examples 6 and 7.

Príklad 10 sa týka vývoja systémov na expresiu u cicavcov pre cDNA EPO opice a pre DNA ludského genómu vrátane použitia ovária čínskeho chrčka (bunky CHO) a tiež imunologického a bio logického sledovania účinnosti produktov, získaných expresiou pri použití týchto systémov a vlastností týchto produktov.Example 10 relates to the development of mammalian expression systems for EPO monkey cDNA and human genome DNA, including the use of Chinese Hamster Ovary (CHO cells) as well as immunological and biological monitoring of the efficacy of the expression products and the properties of these products.

Príklad 11 je zameraný na prípravu génov ktoré sú kódom pre ludský EPO a jeho analógy, pričom tieto gény môžu obsahovať rad preferenčných kodónov, ktoré umožňujú alebo ulahčujú expresiu v E. coli alebo v kvasinkách. Príklad sa tiež týka príslušných systémov na expresiu týchto génov.Example 11 is directed to the production of genes that encode human EPO and analogs thereof, which genes may contain a number of preferential codons that allow or facilitate expression in E. coli or yeast. The example also relates to appropriate systems for the expression of these genes.

Príklad 12 sa vzťahuje na imunologickú a biologickú účinnosť produktov, získaných spôsobom expresie podlá príkladu 11.Example 12 refers to the immunological and biological activity of the products obtained by the expression method of Example 11.

Vynález bude osvetlený nasledujúcimi príkladmi.The invention will be illustrated by the following examples.

Príklad 1Example 1

A. Stanovenie sledu aminokyselín vo fragmente ľudského erytroJ poietínu ,A. Determination of amino acid sequence in human erythroJ fragment of poetin,

Dudský EPO bol izolovaný z moču a rozštiepený trypsínom, čím vzniklo a bolo izolovaných 17 oddelených fragmentov v množstvách približne 100 až 150 pmolov.Human EPO was isolated from urine and digested with trypsin to produce and isolate 17 separated fragments in amounts of about 100 to 150 pmoles.

Tieto fragmenty boli skusmo očíslované a potom boli analyzované na sled aminokyselín mikroanalýzou sledu pri použití zariadenia, ktoré pracuje s plynovou fázou (Biosystems Applied), čím bola získaná informácia, ktorá je uvedená v nasledujúcej tabuľke I. V tejto tabuľke sú ako kódy použité jednotlivé písmená a X znamená zvyšok, ktorý nebol jednoznačne určený.These fragments were bit-numbered and then analyzed for amino acid sequence by sequence microanalysis using a gas-phase apparatus (Biosystems Applied) to obtain the information shown in Table I. In this table, the individual letters are used as codes and X is a residue that has not been clearly identified.

Tabuľka ITable I

Vzorka č. Sample no. Výsledok analýzy sledu Sequence analysis result T4a T4A A-P-P-R A-P-P-R T4b T4b G-K-L-K G-K-L-K T9 T9 A-L-G-A-Q-K A-L-A-G-Q-K T13 T13 V-L-E-R W-L-E-R T16 T16 A-V-S-G-L-R A-V-S-G-L-R T18 T18 L-F-R L-F-R T21 T21 K-L-F-R K-L-F-R T25 T25 Y-L-L-E-A-K Y-L-L-E-A-K T26a T26A L-I-C-D-S-R L-I-C-D-S-R T26b T26B L-Y-T-G-E-A-C-R L-Y-T-G-E-C-A-R T27 T27 T-I-T-A-D-T-F-R T-I-T-A-T-D-F-R T28 T28 E-A-I-S-P-P-D-A-A-M-A-A-P-L-R E-A-I-S-P-P-D-A-A-A-M-A-P-L-R T30 T30 E-A-E-X-I-T-T-G-X-A-E-H-X-S-L-N-E-X-I-T-V-P E-A-E-X-I-T-T-G-X-A-H-E-X-S-L-N-E-X-I-T-V-L T31 T31 V-Y-S-N-F-L-R W-Y-S-C-F-L-R T33 T33 S-L-T-T-L-L-R S-L-T-T-L-L-R T35 T35 V-N-F-Y-A-W-K The F-N-Y-A-N-C T38 T38 G-q-a-L-L-V-X-S-S-Q-P-W-E-P-L-Q-L-H-V-D-K G-Q-L-L-W-X-S-S-Q-P-W-E-L-L-Q-L-H-W-D-K

B. Zloženie a konštrukcia zmesi vzoriek oligonukleotidovB. Composition and construction of a mixture of oligonucleotide samples

Sledy aminokyselín, uvedené v tabulke I boli použité s ohladom na možnú degeneráciu genetického kódu na zistenie, či by bolo možné použit postup s využitím zmiešanej vzorky pre DNA/DNA hybridizáciu na cDNA a/alebo na DNA z knižnice genómu. Táto analýza umožnila zistit, že vo fragmente č. T35 sa nachádzal sled siedmich zvyškov aminokyselín (Val-Asn-PheTyr-Ala-Trp-Lys), pre ktorý by mohol byt kódom jeden zo 128 možných sledov DNA s obsahom 20 párov báz. Bol preto zostavený prvý súhrn 128 sledov s 20 pármi báz štandardným fosfoamiditovým spôsobom podlá publikácie Beaucage a dalšie, Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1862 (1981) na pevnom nosiči podlá nasledujúcej tabulky II.The amino acid sequences shown in Table I were used with respect to the possible degeneracy of the genetic code to determine whether a mixed DNA / DNA hybridization procedure could be used for cDNA and / or DNA from a genome library. This analysis revealed that in fragment no. T35 was a sequence of seven amino acid residues (Val-Asn-PheTyr-Ala-Trp-Lys) for which one of the 128 possible 20 bp DNA sequences could be coded. Therefore, a first summary of 128 sequences with 20 base pairs was constructed using the standard phosphoamidite method of Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1862 (1981) on a solid support according to the following Table II.

Tabulka IITable II

Zvyšok - Val The rest - Val - Asn - Asn - Phe - - Phe - Tyr - Tyr - Ala Ala Trp  Trp - Lys - Lys 3 ’ 3 ’ CAA CAA TTG TTG AAG AAG ATG ATG CGA CGA AAC AAC TT -5 TT -5 T T A A A A A A T T

G GG G

C CC C

Ďalšou analýzou bolo možné preukázat, že vo fragmente č. T38 existuje sled šiestich zvyškov aminokyselín (Gln-ProTrp-Glu-Pro-Leu), na základe tohto sledu bolo možné pripravit zmes 128 oligonukleotidov s 17 pármi báz podlá nasledujúcej tabulky III.Further analysis showed that in fragment no. T38 exists a sequence of six amino acid residues (Gln-ProTrp-Glu-Pro-Leu), based on which sequence it was possible to prepare a mixture of 128 oligonucleotides with 17 base pairs according to the following Table III.

Tabulka IIITable III

Zvyšok - Gin - Pro - Trp - Glu - Pro - LeuThe rest - Gin - Pro - Trp - Glu - Pro - Leu

3' GTT GGA ACC CTT GGA GA -5’3 'GTT GGA ACC CTT GGA GA -5'

Vzorky oligonukleotidov boli označené na 5'-zakončení pomocou ³²P-ATP, 7500 až 8000 Ci/mol (ICN) pri použití T₄polynukleotidkinázy (NEN).Oligonucleotide samples were labeled at the 5'-end with ³² P-ATP, 7500 to 8000 Ci / mol (ICN) using T ₄ polynucleotide kinase (NEN).

Príklad 2Example 2

A. Predbežné ošetrenie opíc a analýza RIAA. Monkey pretreatment and RIA

Samiciam opice Macac fascicularis s hmotnostou 2,5 až 3 kg vo veku 1,5 až 2 roky bol podkožné podaný roztok s pH 7 s obsahom 12,5 mg/kg fenylhydrazínu vo forme hydrochloridu v deň 1, 3 a 5. Pred každou injekciou bol kontrolovaný hematokrit. V deň 7 alebo kedykoľvek, ked poklesla hodnota hematokritu na 25 % hodnoty pôvodnej bolo izolované krvné sérum a obličky po podaní 25 mg/kg ketamínhydrochloridu. Materiál bol okamžite zmrazený v kvapalnom dusíku a skladovaný pri te plote -70’C.Macac fascicularis monkeys weighing 2.5 to 3 kg aged 1.5 to 2 years were treated with a pH 7 solution containing 12.5 mg / kg of phenylhydrazine hydrochloride on days 1, 3, and 5 subcutaneously. hematocrit was controlled. On day 7 or at any time when the hematocrit value dropped to 25% of the original value, blood serum and kidney were isolated after administration of 25 mg / kg ketamine hydrochloride. The material was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -70'C.

B. RIA pre EPOB. RIA for EPO

Rádioimunologické skúšky pre kvantitatívne stanovenie erytropoietínu vo vzorkách boli vykonávané nasledujúcim spôsobom:Radioimmunoassays for the quantitative determination of erythropoietin in samples were performed as follows:

Štandard erytropoietínu alebo neznáma vzorka bol inkubo vaný spolu s antisérom dve hodiny pri teplote 37’C. Po dvoch hodinách inkubácie boli schladené skúmavky so vzorkami v ľade, bol pridaný erytropoietín, značený a skúmavky boli inkubované pri teplote 0°C aspoň 15 hodín. Každá zo skúmaviek obsahovala 500 μΐ inkubačnej zmesi, skladajúcej sa z 50 μΐ zriedeného imúnneho séra, 10 000 impulzov za minútu ¹²^-erytropoietínu, 5 μΐ trasylolu a 0 - 250 μΐ štandardu EPO alebo neznámej vzorky, zvyšok objemu bol doplnený použitím PBS s obsahom 0,1 % BSA. Použité antisérum bolo z druhého pokusného odberu krvi králikov, imunizovaných 1% čistým prípravkom erytropoietínu z ľudského moča. Konečné riedenie antiséra bolo v priebehu pokusu upravené tak, aby množstvo ¹²⁵I-EPO, viazané na protilátku bolo najvyššie 10 až 20 % možných vstupných impul zov, čo je všeobecne konečné riedenie antiséra v rozmedzí 1 : 50 000 až 1 : 100 000.The erythropoietin standard or unknown sample was incubated with the antiserum for two hours at 37 ° C. After two hours of incubation, the tubes with ice samples were cooled, erythropoietin was added, labeled, and the tubes were incubated at 0 ° C for at least 15 hours. Each tube contained 500 μΐ incubation mixture consisting of 50 μΐ of diluted immune serum, 10,000 cpm -erytropoietínu ¹² ^ 5 μΐ trasylol and 0-250 μΐ EPO standard or unknown sample, the volume of the residue was added with PBS containing 0.1% BSA. The antiserum used was from a second experimental blood sample of rabbits immunized with 1% pure preparation of erythropoietin from human urine. The final dilution of the antiserum was adjusted during the experiment so that the amount of ¹²⁵ I-EPO bound to the antibody was at most 10-20% of the possible input pulses, which is generally the final dilution of the antiserum in the range of 1: 50,000 to 1: 100,000.

Protilátka, viazaná na ¹²⁵I-erytropoietín bola vyzrážaná pridaním 150 μΐ Staph A. Pp 40 minútach inkubácie boli vzorky odstredené a pelety boli dvakrát premyté 0,75 ml 10 mM TrisHCl s pH 8,2 s obsahom 0,15 M chloridu sodného, 2 mM EDTA a 0,05 % Tritonu X-100. V premytých peletách bol stanovený počet impulzov na stanovenie percentuálneho množstva viazaného značeného erytropoietínu. Impulzy, získané pre sérum pred imunizáciou boli od získaných hodnôt odčítané na vylúčenie vplyvu nešpecifickej precipitácie. Množstvo erytropoietínu v neznámej vzorke bolo vyrátané porovnaním so štandardnou krivkou.The ¹²⁵ I-erythropoietin-bound antibody was precipitated by the addition of 150 μΐ Staph A. Pp for 40 minutes incubation, the samples were centrifuged and the pellets were washed twice with 0.75 ml of 10 mM TrisHCl pH 8.2 containing 0.15 M sodium chloride, 2. mM EDTA and 0.05% Triton X-100. The number of pulses was determined in the washed pellets to determine the percentage of bound labeled erythropoietin. Pulses obtained for serum prior to immunization were subtracted from the values obtained to exclude the effect of non-specific precipitation. The amount of erythropoietin in the unknown sample was calculated by comparison with a standard curve.

Hore uvedený postup bol aplikovaný na sérum opíc, získané v časti A a na sérum zdravých opíc. Normálne sérum obsahovalo približne 36 mJ/ml, zatial čo sérum opíc vopred ošetrených obsahovalo množstvo v rozmedzí 1000 až 1700 mJ/ml.The above procedure was applied to the serum of monkeys obtained in Part A and to the serum of healthy monkeys. Normal serum contained approximately 36 mJ / ml, while serum from monkeys pretreated contained between 1000 and 1700 mJ / ml.

Príklad 3Example 3

A. Konštrukcia knižnice cDNA opiceA. Construction of monkey cDNA library

Z obličiek normálnych a anemických opíc bola izolovaná mRNA pomocou guanidíniumtiokyanátu podľa publikácie Chirgwin a ďalšie, Biochemistry 18, str. 5294 (1979) a poly (A)⁺ mRNA bola čistená dvojitým priechodom stĺpcom s náplňou oligo(dT)celulózy spôsobom podľa publikácie Maniatis a ďalšie, Molecular cloning, a laboratory manual (Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N. Y. 1982), str. 197 až 198. Knižnica cDNA bola konštruovaná podľa modifikácie všeobecného postupu, opísaného v publikácii Okayama a ďalšie, Mol. and Celí. Biol. 2, str. 161 až 170 (1982). Kľúčové stupne výhodného postupu sú nasledujúce:MRNA was isolated from the kidneys of normal and anemic monkeys using guanidinium thiocyanate according to Chirgwin et al., Biochemistry 18, p. 5294 (1979) and poly (A) ⁺ mRNA was purified by double-pass the oligo (dT) cellulose packed column according to the method of Maniatis et al., Molecular Cloning, and Laboratory Manual (Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY 1982). p. The cDNA library was constructed according to a modification of the general procedure described by Okayama et al., Mol. and Cell. Biol. 2, p. 161-170 (1982). The key steps of the preferred process are as follows:

1) ako jediný vektor sa použije pUC8, štiepený enzýmom PstI s následným naviazaním oligo dT s dĺžkou 60 až 80 báz,1) pUC8 digested with PstI followed by oligo dT with a length of 60 to 80 bases is used as the sole vector,

2) na odstránenie oligo dT z jedného zakončenia vektoru sa použije enzým Hinc II,2) the enzyme Hinc II is used to remove oligo dT from one end of the vector,

3) syntéza prvého reťazca a naviazanie oligo dT bolo vykonané¹ podľa uvedenej publikácie,3) first chain synthesis and oligo dT binding were performed ¹ according to said publication,

4) štiepenie BamHI bolo použité na odstránenie oligo dG z jedného zakončenia vektoru a4) BamHI digestion was used to remove oligo dG from one end of vector a

5) náhrada reťazca RNA reťazcom DNA bola uskutočnená v prítomnosti dvoch pomocných väzných reťazcov, a to GATCTAAGACCGTCCCCCCCCC a ACGGTCTTTA v trojnásobnom molárnom prebytku, vztiahnuté na vektor so zakončením oligo dG.5) Replacement of the RNA strand with the DNA strand was performed in the presence of two helper binding chains, GATCTAAGACCGTCCCCCCCCC and ACGGTCTTTA, in triple molar excess, based on the oligo dG-terminated vector.

B. Hybridizácia kolónií za účelom vyhľadania sledu v zostave cDNA opice ‘ ' i 'B. Colonization Hybridization for Sequence Sequence in Monkey ‘'i'

Transformovaný mikroorganizmus E. coli bol nanesený pri hustote 9000 kolónií na platne živnej pôdy s rozmerom 10 x 10 cm s obsahom 50 mikrogramov ampicilínu. Filtre GeneScreen (New England Nuclear katalógové č. Nef-972) boli vopred zvlhčené na platne BHI-CAM (Bacto brain heart infusion 37 g/l, kasaminokyseliny 2 g/l a agar 15g/l s obsahom 500 mikrogramov chloramfenikolu) a potom boli použité na odstránenie kolónií z platne.The transformed E. coli microorganism was plated at a density of 9000 colonies on 10 x 10 cm culture plates containing 50 micrograms of ampicillin. GeneScreen filters (New England Nuclear Catalog No. Nef-972) were pre-wetted on BHI-CAM plates (Bacto brain heart infusion 37 g / l, 2 g / l casamino acid and 15 g / l agar containing 500 micrograms of chloramphenicol) and then used on removing colonies from the plate.

Kolónie boli pestované v rovnakom prostredí 12 hodín alebo dlhšie na získanie väčšieho počtu kópií plazmidu. Potom boli kolónie (kolóniami smerom hore) spracovávané tak, že filtre boli postupne ukladané na dve vrstvy papieru Whatman 3 MM, nasýtené nasledujúcimi roztokmi:Colonies were grown in the same medium for 12 hours or longer to obtain multiple copies of the plasmid. Thereafter, the colonies (colonies upwards) were treated by sequentially depositing the filters on two layers of Whatman 3 MM paper, saturated with the following solutions:

1) 50 mM glukózy, 25 mM Tris-HCl s pH 8,0, 10 mM EDTA s pH 8,0 na pät minút,1) 50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl at pH 8.0, 10 mM EDTA at pH 8.0 for five minutes,

2) 0,5 M NaOH na desat minút a potom2) 0.5 M NaOH for ten minutes and then

3) 1,0 M Tris-HCl o pH 7,5 na tri minúty.3) 1.0 M Tris-HCl pH 7.5 for three minutes.

Potom boli filtre usušené na vzduchu vo vákuu dve hodiny pri teplote 80 'C.The filters were then air dried under vacuum at 80 ° C for two hours.

Ďalej boli filtre podrobené štiepeniu pôsobením proteinázy K pôsobením roztoku s obsahom 50 mikrogramov/ml tohto enzýmu v tlmivom roztoku K [0,1 M Tris-HCl s pH 8,0, 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA s pH 8,2 a 0,2% SDS]. Na každý filter sa pridá 5 ml roztoku a štiepenie sa vykonáva 30 minút pri teplote 55°C, potom sa roztok odstráni.Furthermore, the filters were digested with proteinase K with a solution containing 50 micrograms / ml of this enzyme in K buffer [0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.2 and 0.2% SDS]. 5 ml of the solution are added to each filter and the cleavage is carried out at 55 ° C for 30 minutes, then the solution is removed.

K filtrom sa potom pridá 4 ml predhybridizačného tlmivého roztoku (5x SSPE, 0,5% SDS, 100 mikrogramov/liter SS E. coli DNA a 5x BFP). Tlmivý roztok sa nechá pôsobil; pri teplote 55°C obyčajne 4 hodiny alebo dlhšie a potom sa odstráni.4 ml of prehybridization buffer (5x SSPE, 0.5% SDS, 100 micrograms / liter SS E. coli DNA and 5x BFP) are then added to the filters. The buffer is allowed to act; at 55 ° C, typically 4 hours or longer and then discarded.

Hybridizácia sa potom vykonáva nasledujúcim spôsobom:The hybridization is then performed as follows:

Ku každému filtru sa pridajú 3 ml hybridizačného tlmivého roztoku (5x SSPE, 0,5% SDS, 100 mikrogramov/liter tRNA kvasiniek) s obsahom 0,025 pikomolov každého zo 128 vzoriek, uvedených v tabulke II (táto zmes sa označuje ako EPV zmes) a potom sa filtre udržujú 20 hodín na teplote 48°C. Táto teplota je o 2°C nižšia ako najnižšia vypočítaná teplota pre disociáciu (Td) pre každú z uvedených vzoriek.Add 3 ml of hybridization buffer (5x SSPE, 0.5% SDS, 100 micrograms / liter of yeast tRNA) containing 0.025 picomoles of each of the 128 samples listed in Table II (referred to as EPV mixture) to each filter, and then the filters are kept at 48 ° C for 20 hours. This temperature is 2 ° C lower than the lowest calculated dissociation temperature (Td) for each of the samples.

Po hybridizácii sa filtre trikrát premyjú na trepačke vždy 10 minút pri použití 6x SSC a 0,1% SDS pri teplote miestnosti, potom sa premyjú ešte dvakrát až trikrát 6x SSC s 1%After hybridization, the filters were washed three times on a shaker for 10 minutes each using 6x SSC and 0.1% SDS at room temperature, then washed two to three more times 6x SSC with 1%.

SDS pri teplote hybridizáce 48 °C.SDS at 48 ° C hybridization temperature.

Autorádiografiou filtrov bolo možné preukázať, že z pôvodného počtu 200 000 kolónií je sedem kolónií pozitívnych.It was shown by autoradiography of the filters that out of the original 200,000 colonies, seven were positive.

Potom bola vykonaná analýza sledu jedného z klonov cDNA opice (označeného ako kloň 83) modifikáciou postupu, uvedeného v publikácii Wallace a dalšie, Gene 16, str. 21 až 26 (1981). Postup bol urobený tak, že plazmidová DNA opičieho klonu 83 cDNA bola linearizovaná pôsobením reštrikčného enzýmu EcoRI a potom denaturovaná zahriatím vo vriacom kúpeli. Sled desoxynukleotidov bol stanovený spôsobom podlá publikácie Sanger a dalšie, P.N.A.S. (USA) 74, Str. 5463 až 5467 (1977). Ako prajmer pre túto reakciu bola použitá podskupina EPV zmesi, skladajúca sa z 16 sledov. iThe sequence of one of the monkey cDNA clones (designated as clone 83) was then analyzed by modification of the procedure of Wallace et al., Gene 16, p. 21-26 (1981). The procedure was carried out by plasmid DNA of monkey clone 83 cDNA linearized with EcoRI and then denatured by heating in a boiling bath. The sequence of desoxynucleotides was determined by the method of Sanger et al., P.N.A.S. (United States) 74, Str. 5463-5467 (1977). A subset of the EPV mixture consisting of 16 sequences was used as a primer for this reaction. and

J ' 'J ''

C. Stanovenie sledu cDNA opice pre EPOC. Determination of monkey cDNA sequence for EPO

Analýza nukleotidov klonu 83 bola vykonávaná podlá publikácie Messing, Methods in Enzymology 101, str. 20 až 78 (1983). V tabulke IV je zhrnutá analýza reštrikčnými enzýmami približne 1600 párov báz fragmentu klonu 83, štiepeného enzýmom EcoRI/Hind III. Približné uloženie miest pre pôsobenie hore uvedených reštrikčných endonukleáz bolo stanovené tak, že bol určený počet báz od zakončenia 3' k miestu pre pôsobenie enzýmu EcoRI v blízkosti 5'-zakončenia tohto fragmentu. Analýza sledu nukleotidov bola vykonaná stanovením sledu jednotlivých fragmentov po pôsobení jednotlivých reštrikčných enzýmov tak, že bolo možné zistiť tiež fragmenty, ktoré sa prekrývajú. Tak bolo zistené napríklad prekrytie pri analýze sledu nukleotidov v prípade reštrikčného fragmentu, označeného C113 (Sau3A pri približne 11/SmaX pri približne 324) a obrátený sled v prípade fragmentu, označeného ako C73 (Alul pri približne 424/BstEII pri približne 203).Nucleotide analysis of clone 83 was performed according to Messing, Methods in Enzymology 101, p. 20-78 (1983). In Table IV, restriction enzyme analysis of approximately 1600 base pairs of the fragment of clone 83, digested with EcoRI / Hind III, is summarized. The approximate placement of the restriction endonuclease sites was determined by determining the number of bases from the 3 'end to the EcoRI site near the 5' end of the fragment. Nucleotide sequence analysis was performed by determining the sequence of individual fragments after treatment with individual restriction enzymes so that fragments that overlap could also be detected. Thus, for example, an overlap was detected in the nucleotide sequence analysis for the restriction fragment designated C113 (Sau3A at about 11 / SmaX at about 324) and the reverse sequence for the fragment designated C73 (Alu1 at about 424 / BstEII at about 203).

V nasledujúcej tabulke IV je uvedené približné miesto pre pôsobenie jednotlivých reštrikčných endonukleáz.Table IV shows the approximate site of action of each restriction endonuclease.

Tabulka IVTable IV

Reštrikčný enzým Približné umiestnenieRestriction enzyme Approximate location

Miesto pre pôsobeniePlace of action

EcoRI EcoRI 1 1 Sau3A Sau3A 111 111 Smal Smal 180 180 BstEII BstEII 203 203 Smal Smal 324 324 Kpnl KpnI 371 371 Rsal RsaI 372 372 Alul alul 424 424 PstI Pst 426 426 Alul alul 430 430 Hpal HpaI 466 466 Alul alul 546 546 PstI Pst 601 601 PvuII PvuII 604 604 Alul alul 605 605 Alul alul 782 782 Alul alul 788 788 Rsal RsaI 792 792 PstI Pst 807 807 Alul alul 841 841 Alul alul 927 927 Ncol ncol 946 946 Sau3A Sau3A 1014 1014

Alul alul 1072 1072 Alul alul 1115 1115 Alul alul 1223 1223 PstI Pst 1301 1301 Rsal RsaI 1343 1343 Alul alul 1384 1384 HindlII Hind III 1449 1449 Alul alul 1450 1450 HindlII Hind III 1585 1585

Stanovenie sledu úseku s 1342 pármi báz (v oblasti od miesta pôsobenia enzýmu Sau3A v blízkosti 3'-zakončenia do miesta pôsobenia enzýmu EcoRI a HindlII) a analýza smeru odčítania dovolila získať informácie o slede aminokyselín a o príslušnej DNA tak, ako sú uvedené v tabulke V. V tejto tabuľke je počiatočná aminokyselina úplného EPO (ako to bolo overené koreláciou s vopred uvedeným sledom s 20 terminálnymi aminokyselinami) označená číslom +1. Prítomnosť kodónu ATG, špecifického pre tvorbu metionínu (a označeného číslom -27) smerom hore od terminálneho alanínového zvyšku ako prvého zvyšku pre úplný EPO napovedá, že k expresii EPO dochádza najskôr v cytoplazme vo forme prekurzoru, ktorý obsahuje vedúcu oblast s 27 zvyškami aminokyselín, ktorá sa odštepuje pred vstupom EPO do krvného obehu. Potenciálne miesta pre glykozláciu sú v polypeptide označené hviezdičkami. Stanovená molekulová hmotnosť prenesenej oblasti bola stanovená ako 21 117 jednotiek a molekulová hmotnosť 165 polypeptidových zvyškov, tvoriacich úplný EPO opice bola stanovená ako 18 236 jednotiek.The determination of the 1342 base pair sequence (in the region from the Sau3A site near the 3'-end to the EcoRI and HindIII sites) and the subtraction direction analysis allowed to obtain information about the amino acid sequence and the corresponding DNA as shown in Table V In this table, the initial amino acid of full EPO (as verified by correlation with the above 20 amino acid terminal sequence) is indicated by +1. The presence of a methionine-specific ATG codon (designated by -27) upstream of the terminal alanine residue as the first residue for full EPO suggests that EPO expression occurs first in the cytoplasm as a precursor containing a 27 amino acid leader region, which cleaves before EPO enters the bloodstream. Potential glycosylation sites are indicated by asterisks in the polypeptide. The determined molecular weight of the transferred region was determined to be 21 117 units and the molecular weight of 165 polypeptide residues constituting the complete EPO monkey was determined to be 18 236 units.

Tabuľka VTable V

Translácie opičej cDNA pre EPOTranslation of monkey cDNA for EPO

Sau3ASau3A

GATCCCGCGCCCCCTGGACAGCCGCCCTCTCCTCCAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCCCGATCCCGCGCCCCCTGGACAGCCGCCCTCTCCTCCAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCCC

CGCTGAACTTCCCGGGATGAGGACTCCCGGTGTGGTCACCGCGCGCCTAGGTCGCTGAGCGCTGAACTTCCCGGGATGAGGACTCCCGGTGTGGTCACCGCGCGCCTAGGTCGCTGAG

-27 -20-27 -20

Met GGACCCCGGCCAGGCGCGGAGATG Met GGACCCCGGCCAGGCGCGGAGATG Gly Val His GGG GTG CAC Gly Val His GGG GTG CAC Glu GAA Glu GAA Cys Pro TGT CCT Cys For TGT CCT Ala GCC Ala GCC Trp TGG Trp TGG Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Trp Leu Leu Leu Ser -10 Leu Val Ser -10 Leu Val Ser Leu Leu Pro Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu Pro CTG TGG CTT CTC CTG TCT CTG TGG CCT CTG TCT CTC GTG TCG CTC GTG TCG CTC CTC CCT CTG CCT CTG GGC GGC CTC CCA CTC CCA -1 *1 Val Pro Gly Ala Pro Pro -1 * 1 Gly Ala Pro Pro Arg Leu íle Arg Leu White Cys Cys Asp Ser Asp Ser 10 Arg 10 Arg Val Leu Val Leu GTC CCG GGC GCC CCA CCA GTC CCG CGC CTC ATC CGC CTC ATC TGT TGT GAC AGC GAC AGC CGA CGA GTC CTG GTC CTG 1 Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 1 Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 20 Ala Lys Glu 20 Ala Lys Glu Ala Ala * Glu Asn * Glu Asn Val wall Thr Met Thr Met GAG AGG TAC CTC TTG GAG GAG AGG TAC CTC TTG GAG GCC AAG GAG GCC AAG GAG GCC GCC GAG AAT GAG AAT GTC GTC ACG ATG ACG ATG 30 Gly Cys Ser^- Glu Ser Cys30 Gly Cys ^- Glu Ser Cys Ser Leu Asn Ser Leu Asn Glu Glu ♦ Asn íle ♦ Asn ile 40 Thr 40 Thr Val Pro Val Pro GGC TGT TCC GAA AGC TGC GCG TGT TCC GAA AGC TGC AGC TTG AAT AGC TTG AAT GAG GAG AAT ATC AAT ATC ACC ACC GTC CCA GTC CCA Asp Thr Lys Val Asn Phe Asp Lys Val Asn Phe 50 Tyr Ala Trp 50 Tyr Ala Trp Lys Lys Arg Met Arg Met Glu Glu Val Gly Val Gly GAC ACC AAA GTT AAC TTC GAC ACC AAA GTT TAT GCC TGG TAT GCC TGG AAG AAG AGG ATG AGG ATG GAG GAG GTC GGG GTC GGG 60 Gin Gin Ala Val Glu Val 60 Gin Gin Ala Val Trp Gin Gly Gin Gly Leu Leu Ala Leu Ala Leu 70 Leu 70 Leu Ser Glu Ser Glu CAG CAG GCT GTA GAA GTC CAG CAG GCT GAA GTC TGG CAG GGC TGG CAG GGC CTG CTG GCC CTG GCC CTG CTC CTC TCA GAA TCA GAA Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Val Leu 80 Ala Val Leu 80 Ala Val Leu Ala Ala * Asn Ser * Asn Ser Ser Ser Gin Pro Gin Pro GCT GTC CTG CGG GGC CAG GCT GTC GGC CAG GCC GTG TTG GCC GTG TTG GCC GCC AAC TCT AAC TCT TCC TCC CAG CCT CAG CCT 90 Phe Glu Pro Leu Gin Leu 90 Phe Glu For Leu Gin Leu His Met Asp His Met Asp Lys Lys Ala íle Ala ile 100 Ser 100 Ser Gly Leu Gly Leu TTC GAG CCC CTG CAG CTG TTC GAG CCC CTG CAC ATG GAT CAC ATG GAT AAA AAA GCC ATC GCC ATC AGT AGT GGC CTT GGC CTT Arg Ser íle Thr Thr Leu Arg Ser ile Thr Thr Leu 110 Leu Arg Ala 110 Leu Arg Ala Leu Leu Gly Ala Gly Ala Gin gin Glu Ala Glu Ala CGC AGC ATC ACC ACT CTG CGC AGC ATC ACC ACT CTT CGG GCG CTT CGG GCG CTG CTG GGA GCC GGA GCC CAG CAG GAA GCC GAA GCC 120 íle Ser Leu Pro Asp Ala 120 Ser Leu Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Pro Leu 130 Arg 130 Arg Thr íle Thr ile ATC TCC CTC CCA GAT GCG ATC TCC CTC GCA GAT GCG GCC TCG GCT GCC TCG GCT GCT GCT CCA CTC CCA CTC CGA CGA ACC ATC ACC ATC Thr Ala Asp Thr Phe Cys Thr Ala Asp Thr Phe Cys 140 Lys Leu Phe 140 Lys Leu Phe Arg Arg Val Tyr Val Tyr Ser Ser Asn Phe Asn Phe ACT GCT GAC ACT TTC TGC ACT GCT ACT TTC TGC AAA CTC TTC AAA CTC TTC CGA CGA GTC TAC GTC TAC TCC TCC AAT TTC AAT TTC

Tabuľka V - pokračovanieTable V - continued

150 150 Gly GGG Gly GGG 160 Glu Ala Cys Arg Arg 160 Glu Ala Cys Arg Arg Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr CTC CGG GGA AAG CTG AAG CTG TAC Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr CTC CGG GGA AAG CTG Thr ACG Thr ACG GAG GAG GCC TGC GCC TGC AGG AGG AGA AGA 165 Gly Asp Arg OP GGG GAC AGA TGA CCAGGTGCGTCCAGCTGGGCACATCCACCACCTCCCTCACCAACA 165 Gly Asp Arg OP GGG GAC AGA TGA CCAGGTGCGTCCAGCTGGGCACATCCACCACCTCCCTCACCAACA

CTGCCTGTGCCACACCCTCCCTCACCACTCCCGAACCCCATCGAGGGGCTCTCAGCTAAGCTGCCTGTGCCACACCCTCCCTCACCACTCCCGAACCCCATCGAGGGGCTCTCAGCTAAG

CGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCAGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAACCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCAGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAAC

TGTCCAGAGCACAACTCTGAGATCTAAGGATGTCGCAGGGCCAACTTGAGGGCCCAGAGCTGTCCAGAGCACAACTCTGAGATCTAAGGATGTCGCAGGGCCAACTTGAGGGCCCAGAGC

AGGAAGCATTCÁGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGAGCAGAGACAATGCAGGGAAAACACCTAGGAAGCATTCÁGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGAGCAGAGACAATGCAGGGAAAACACCT

GAGCTCACTCGGCCACCTGCAAAATTTGATGCAGGACACGCTTTGGAGGCAATTTACCTGGAGCTCACTCGGCCACCTGCAAAATTTGATGCAGGACACGCTTTGGAGGCAATTTACCTG

TTTTTGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTTTTTTTGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTT

CTCAAGGCCTCACGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACTGAGAGAATATTCTCAAGGCCTCACGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACTGAGAGAATATT

TTGCÄATCTGCAGCAGGAAAAATTACGGACAGGTTTTGGAGGTTGGAGGGTACTTGACAGTTGCÄATCTGCAGCAGGAAAAATTACGGACAGGTTTTGGAGGTTGGAGGGTACTTGACAG

GTGTGTGGGGAAGCAGGGCGGTAGGGGTGGAGCTGGGATGCGAGTGAGAACCGTGAAGACGTGTGTGGGGAAGCAGGGCGGTAGGGGTGGAGCTGGGATGCGAGTGAGAACCGTGAAGAC

AGGATGGGGGCTGGCCTCTGGTTCTCGTGGGGTCCAAGCTTAGGATGGGGGCTGGCCTCTGGTTCTCGTGGGGTCCAAGCTT

HindlIIHind III

Polypeptidový sled, uvedený v tabulke V, je možné lahko podrobiť analýze na prítomnosť vysoko hydrofilných oblastí a/alebo analýze na sekundárne štruktúrne vlastnosti, ktoré sú tiež napríklad potenciálnymi vysoko imunogénnymi oblasťami, napríklad spôsobom podlá publikácie Hopp a dalšie, PNAS (USA) 78, str. 3824 až 3828 (1981) a podlá publikácie Kyte a dalšie, J. Mol. Biol. 157, str. 105 až 132 (1982) a/alebo Chou a ďalšie, Biochem. 13, str. 222 až 245 (1974) a Advances in Enzymology 47, str. 45 až 47 (1978). Analýzu s pomocou počítača je možné zaistiť pri využití ponuky PEP Reference Section 6.7, Intelligenetics Inc., 124 University Avenue, Palo Alto, California, USA (spôsob podlá Hoppeho a ďalších).The polypeptide sequence set forth in Table V can readily be assayed for the presence of highly hydrophilic regions and / or for secondary structural properties, which are also, for example, potential highly immunogenic regions, for example by the method of Hopp et al., PNAS (USA) 78, p. 3824-3828 (1981) and Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, p. 105-132 (1982) and / or Chou et al., Biochem. 13, p. 222-245 (1974) and Advances in Enzymology 47, p. 45-47 (1978). Computer-aided analysis can be performed using PEP Reference Section 6.7, Intelligenetics Inc., 124 University Avenue, Palo Alto, California, USA (method by Hoppe et al.).

Príklad 4Example 4

A. Zostava ludského genómuA. Human genome assembly

Bola získaná zostava genómu ludskej fetálnej pečene, nesená fágom Ch4A spôsobom, opísaným v publikácii Lawn a dalšie, Celí 18, str. 533 až 543 (1979), zostava potom bola udržovaná na použitie pri hybridizácii povlakov.The human fetal liver genome assembly, carried by the phage Ch4A, was obtained as described by Lawn et al., Cell 18, p. 533-543 (1979), the assembly was then maintained for use in coating hybridization.

B. Hybridizácia povlakov ako metóda pre vyhladávanie sledov v zostave ludského genómuB. Hybridization of Coatings as a Method for Sequencing Sequences in the Human Genome Assembly

Častice fágu boli rozrušené a DNA bola fixovaná na filtre v množstve 50 000 povlakov na filter spôsobom, opísaným v publikácii Woo, Methods in Enzymology 68, str. 389 až 395 (1979) s tým rozdielom, že boli použité filtre GeneScreen Plus (New England Nuclear katalógové č. NEF-976) a platní NZYAM (NaCl 5 g, MgCl₂ . 6 H₂O 2 g, NZ-Amin A 10 g, extrakt z kvasníc 5 g, kasaminokyseliny 2 g, maltóza 2 g a agar 15 g na liter).The phage particles were disrupted and the DNA was fixed to the filters in an amount of 50,000 filter coatings as described in Woo, Methods in Enzymology 68, p. 389-395 (1979) except that GeneScreen Plus filters (New England Nuclear Catalog No. NEF-976) and NZYAM plates (NaCl 5 g, MgCl ₂ .6 H ₂ O 2 g, NZ-Amin A 10) were used. g, yeast extract 5 g, casamino acid 2 g, maltose 2 g and agar 15 g per liter).

Filtre, usušené na vzduchu boli zahrievané 1 hodinu na teplotu 80°C a potom boli štiepené proteinázou K spôsobom podía príkladu 3, časť B. Predbežná hybridizácia bola vykonávaná pri použití 1 M NaCl, 1% SDS tlmivého roztoku 4 hodiny pri teplote 55°C alebo o niečo dlhšie a potom bol tlmivý roztok' odstránený. Hybridizácia a spracovanie po hybridizácii bolo vykonané obdobným spôsobom ako v príklade 3, časť B. Bola použitá ako zmes 128 vzoriek s 20 pármi báz, označená EPV, tak zmes 128 vzoriek s 17 pármi báz z tabulky III, označená ako zmes EPQ. Hybridizácia bola vykonávaná pri použití zmesi EPV pri teplote 48°C a pri použití zmesi EPQ pri teplote 46 °C, tzn. 4 stupne pod najnižšiu vyrátanú hodnotou Td pre zložky zmesi. Odstránenie hybridizovanej vzorky pre rehybridizáciu bolo uskutočnené varom s lx SSC, 0,1% SDS na dve minúty. Autorádiografia filtrov preukázala prítomnosť troch pozitívnych klonov (ktoré reagovali s obidvoma vzorkami) zo skupiny pôvodných 1 500 000 fágov. Potom bola overená skutočnosť, že tieto pozitívne klóny sú kódom pre EPO stanovením sledu DNÁ a v elektrónovom mikroskope, kde je možné preukázať štruktúru cDNA opice z príkladu 3. Týmto postupom bolo tiež možné preukázať prítomnosť intrónov v slede DNA genómu.The air-dried filters were heated at 80 ° C for 1 hour and then digested with proteinase K according to Example 3, Part B. Preliminary hybridization was performed using 1 M NaCl, 1% SDS buffer at 55 ° C for 4 hours. or slightly longer, and then the buffer was removed. Hybridization and post-hybridization treatment was carried out in a similar manner to Example 3, Part B. Both a mixture of 128 samples with 20 base pairs, designated EPV, and a mixture of 128 samples with 17 base pairs from Table III, referred to as EPQ, were used. Hybridization was carried out using an EPV mixture at 48 ° C and an EPQ mixture at 46 ° C; 4 degrees below the lowest calculated Td for the components of the mixture. Removal of the hybridized sample for rehybridization was performed by boiling with 1x SSC, 0.1% SDS for two minutes. Filter autoradiography showed the presence of three positive clones (which reacted with both samples) from the original 1 500 000 phage group. It was then verified that these positive clones code for EPO by determining the DNA sequence and in an electron microscope where the monkey cDNA structure of Example 3 could be demonstrated. This procedure also demonstrated the presence of introns in the DNA genome sequence.

Príklad 5Example 5

Bola uskutočnená analýza sledu nukleotidov v jednom z pozitívnych klonov (označenom lambdahEl). Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabulke VI.Nucleotide sequence analysis was performed on one of the positive clones (designated lambdahE1). The results are shown in Table VI below.

Tabulka VI aagcttctgggcttccagacccagctactttgcggaactcagcaacccaggcatctctgagtctccgcccaTable VI aagcttctgggcttccagacccagctactttgcggaactcagcaacccaggcatctctgagtctccgccca

AGACCGGGATGCCCCCCAGGGGAGGTGTCCGGGAGCCCAGCCTTTCCCAGATAGCACGCTCCGCCAGTCCCAGACCGGGATGCCCCCCAGGGGAGGTGTCCGGGAGCCCAGCCTTTCCCAGATAGCACGCTCCGCCAGTCCC

AAGGGTGCGCAACCGGCTGCACTCCCCTCCCGCGACCCAGGGCCCGGGAGCAGCCCCCATGACCCACACGCAAGGGTGCGCAACCGGCTGCACTCCCCTCCCGCGACCCAGGGCCCGGGAGCAGCCCCCATGACCCACACGC

ACGTCTGCAGCAGCCCCGCTCACGCCCCGGCGAGCCTCAACCCAGGCGTCCTGCCCCTGCTCTGACCCCGGACGTCTGCAGCAGCCCCGCTCACGCCCCGGCGAGCCTCAACCCAGGCGTCCTGCCCCTGCTCTGACCCCGG

GTGGCCCCTACCCCTGGCGACCCCTCACGCACAC AGCCTCTCCCCCACCCCC ACCCGCGCACGCACACATGGTGGCCCCTACCCCTGGCGACCCCTCACGCACAC AGCCTCTCCCCCACCCCC ACCCGCGCACGCACACATG

CAGATAACAGCCCCGACCCCCGGCCAGAGCCGXAGAGTCCCTGGGCCACCCCGGCCGCTCGCCTGCCGCTGCAGATAACAGCCCCGACCCCCGGCCAGAGCCGXAGAGTCCCTGGGCCACCCCGGCCGCTCGCCTGCCGCTG

CGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCGGAGCCGGACCGGGGCCACCGCGCCCXGCTCTGCTCCGACACCGCGCCCCGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCGGAGCCGGACCGGGGCCACCGCGCCCXGCTCTGCTCCGACACCGCGCCC

CTTGGACAGCCGCCCTCTCCTCTAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCACCGCCGAGCTTCCCGGGATGAGGXXCTTGGACAGCCGCCCTCTCCTCTAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCACCGCCGAGCTTCCCGGGATGAGGXX

-27 -24-27 -24

Met Gly Val HisMet Gly Val His

CCCGGTGACCGGCGCGCCCCAAGTCGCTGAGGGACCCCGGCCAAGCGCGGAG ATG GGG GTG CAC GCCCGGTGACCGGCGCGCCCCAAGTCGCTGAGGGACCCCGGCCAAGCGCGGAG ATG GGG GTG CAC G

GTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCTGTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCT

Tabulka VI - pokračovanieTable VI - continued

ATTGGCCAAGAGGTGGCTGGGTTCAAGGACCGGCGACTTGTCAAGGACCCCGGAAGGGGGAGGGGGGTGGG gcagcctccacgtgccgcggggacttgggggagttcttggggatggcaaaaacctggcctgttgaggggcaATTGGCCAAGAGGTGGCTGGGTTCAAGGACCGGCGACTTGTCAAGGACCCCGGAAGGGGGAGGGGGGTGGG gcagcctccacgtgccgcggggacttgggggagttcttggggatggcaaaaacctggcctgttgaggggca

CAGTTTGGGGTTGGGGAGGAGGTTTGGGGTTCTGCTGTGCAGTTGTGTCGTTGTCAGTGTCTCGÍI.S.TCAGTTTGGGGTTGGGGAGGAGGTTTGGGGTTCTGCTGTGCAGTTGTGTCGTTGTCAGTGTCTCGÍI.S.T

TTGCACACGCACAGATCAATAAGCCAGAGGCAGCACCTGAGTGCTTGCATGGTTGGGACAGGAAGGACGAGTTGCACACGCACAGATCAATAAGCCAGAGGCAGCACCTGAGTGCTTGCATGGTTGGGACAGGAAGGACGAG

CTGGGGCAGAGACGTGGGGATGAAGGAAGCTGTCCTTCCACAGCCACCCTTCTCCCCCCCCGCCTGACTCTCTGGGGCAGAGACGTGGGGATGAAGGAAGCTGTCCTTCCACAGCCACCCTTCTCCCCCCCCGCCTGACTCT

CAGCCTGGCTATCTGTTCTAG CAGCCTGGCTATCTGTTCTAG -23 Glu Cys Pro -23 Glu Cys Pro -20 Ala GCC -20 Ala GCC Trp Leu Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu AA AA TGT TGT CCT CCT TGG TGG CTG CTG TGG TGG CTT CTT CTC CTC CTG CTG TCC TCC CTG CTG -10 -10 -1 -1 +1 +1 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Ser Leu For Leu Gly Leu Leu Pro for Val wall Leu Leu Gly Gly Ala Ala Pro for Pro for Arg Arg Leu Leu Íle Ile Cys Cys CTG TCG CTC CCT CTG GGC CTG TCG CTC CTC CTC CCA CCA GTC GTC CTG CTG GGC GGC GCC GCC CCA CCA CCA CCA CGC CGC CTC CTC ATC ATC TGT TGT 10 ’ 10 ’ 20 20 « « Asp Ser Arg Val Leu Glu Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Arg Tyr Tyr Leu Leu Leu Leu Glu Glu Ala Ala Lys Lys Glu Glu Ala Ala Glu Glu Asn same time Íle Ile GAC AGC CGA GTC CTG GAG GAC AGC CGA GTC AGG AGG TAC TAC CTC CTC TTG TTG GAG GAG GCC GCC AAG AAG GAG GAG GCC GCC GAG GAG AAT AAT ATC ATC

ThrThr

ACG GTGAGACCCCTTCCCCAGCACATTCCACAGAACTCACGCTCAGGGCTTCAGGGAACTCCTCCCAGATACG GTGAGACCCCTTCCCCAGCACATTCCACAGAACTCACGCTCAGGGCTTCAGGGAACTCCTCCCAGAT

CCAGGAACCTGGCACTTGGTTTGGGGTGGAGTTGGGAAGCTAGACACTGCCCCCCTACATAAGAATAAGTCCCAGGAACCTGGCACTTGGTTTGGGGTGGAGTTGGGAAGCTAGACACTGCCCCCCTACATAAGAATAAGTC

TGGTGGCCCCAAACCATACCTGAAACTAGGCAAGGAGC'AAAGCCAGCAGATCCTACGCCTGTGGGCCAGGG 27 30TGGTGGCCCCAAACCATACCTGAAACTAGGCAAGGAGC'AAAGCCAGCAGATCCTACGCCTGTGGGCCAGGG 27 30

CCAGAGCCTTCAGGGACCCTTGACTCCCCGGGCTGTGTGCATTTCAG CCAGAGCCTTCAGGGACCCTTGACTCCCCGGGCTGTGTGCATTTCAG Thr ACG Thr ACG Gly GGC Gly GGC Cys TGT Cys TGT Ala GCT Ala GCT Glu GAA Glu GAA * 40 His Cys Ser Leu Asn Glu Asn íle Thr Val Pro Asp * 40 His Cys Ser Leu Asn Glu Asn White Thr Val Pro Asp Thr Thr Lys Lys Val wall Asn same time Phe Phe Tyr Tyr CAC TGC AGC TTG AAT GAG AAT ATC ACT GTC CCA GAC CAC TGC AGC TTG AAT GAG ACC ACC AAA AAA GTT GTT AAT AAT TTC TTC TAT TAT 50 55 Ala Trp Lys Arg Het Glu GČC TGG AAG AGG ATG GAG GTGAGTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCTTTTGGAGAATCTCATT 50 55 Ala Trp Lys Arg Het Glu GCC TGG AAG AGG ATG GAG GTGAGTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCTTTTGGAGAATCTCATT

TGCGAGCCTGATTTTGGATGAAAGGGAGAATGATCGGGGGAAAGGTAAAATGGAGCAGCAGAGATGAGGCTTGCGAGCCTGATTTTGGATGAAAGGGAGAATGATCGGGGGAAAGGTAAAATGGAGCAGCAGAGATGAGGCT

GCCTGGGCGCAGAGGCTCACGTCTATAATCCCAGGCTGAGATGGCCGAGATGGGAGAATTGCTTGAGCCCTGCCTGGGCGCAGAGGCTCACGTCTATAATCCCAGGCTGAGATGGCCGAGATGGGAGAATTGCTTGAGCCCT

GGAGTTTCAGACCAACCTAGGCAGCATAGTGAGATCCCCCATCTCTACAAACATTTAAAAAAATTAGTCAGGGAGTTTCAGACCAACCTAGGCAGCATAGTGAGATCCCCCATCTCTACAAACATTTAAAAAAATTAGTCAG

GTGAAGTGGTGCATGGTGGTAGTCCCAGATATTTGGAAGGCTGAGGCGGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAAGTGAAGTGGTGCATGGTGGTAGTCCCAGATATTTGGAAGGCTGAGGCGGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAA

TTTGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCACACCACTGCACTCCAGCCTCAGTGACAGAGTGAGGCCCTGTCTCATTTGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCACACCACTGCACTCCAGCCTCAGTGACAGAGTGAGGCCCTGTCTCA

Tabulka VI - pokračovanieTable VI - continued

AAAAAGAAAAGAAAAAAGAAAAATAATGAGGGCTGTATGGAÁTACATTCATTATTCATTCACTCACTCACTAAAAAGAAAAGAAAAAAGAAAAATAATGAGGGCTGTATGGAÁTACATTCATTATTCATTCACTCACTCACT

ČACTCATTCATTCATTCATTCATTCAACAAGTCTTATTGCATACCTTCTGTTTGCTCAGCTTGGTGCTTGGČACTCATTCATTCATTCATTCATTCAACAAGTCTTATTGCATACCTTCTGTTTGCTCAGCTTGGTGCTTGG

GGCTGCTGAGGGGCAGGAGGGAGAGGGTGACATGGGTCAGCTCGACTCCCAGAGTCCACTCCCTGTAGGGCTGCTGAGGGGCAGGAGGGAGAGGGTGACATGGGTCAGCTCGACTCCCAGAGTCCACTCCCTGTAG

56 Val 56 wall Gly Gly Gin gin Gin gin 60 Ala 60 Ala Val wall Glu Glu Val wall Trp Trp Gin gin Gly Gly Leu Leu Ala Ala Leu Leu 70 Leu 70 Leu Ser Ser Glu Glu Ala Ala GTC GTC GGG GGG CAG CAG CAG CAG GCC GCC GTA GTA GAA GAA GTC GTC TGG TGG CAG CAG GGC GGC CTG CTG GCC GCC CTG CTG CTG CTG TCG TCG GAA GAA GCT GCT Val wall Leu Leu Arg Arg Gly Gly Gin gin Ala Ala 80 Leu 80 Leu Leu Leu Val wall * Asn * same time Ser Ser Ser Ser Gin gin Pro for Trp Trp Glu Glu 90 Pro 90 for Leu Leu GTC GTC CTG CTG CGG CGG GGC GGC CAG CAG GCC GCC CTG CTG TTG TTG GTC GTC AAC AAC TCT TCT TCC TCC CAG CAG CCG CCG TGG TGG GAG GAG CCC CCC CTG CTG Gin gin Leu Leu His His Val wall Asp Asp Lys Lys Ala Ala Val wall 100 Ser 100 Ser Gly Gly Leu Leu Arg Arg Ser Ser Leu Leu Thr Thr Thr Thr Leu Leu Leu Leu CAG CAG CTG CTG CAT CAT GTG GTG GAT GAT AAA AAA GCC GCC GTC GTC AGT AGT GGC GGC CTT CTT CGC CGC AGC AGC CTC CTC ACC ACC ACT ACT CTG CTG CTT CTT

110 115110 115

Arg Ala Leu Gly Ala GinArg Ala Leu Gly Ala Gin

CGG GCT CTG GGA GCC CAG GTGAGTAGGAGCGGACACTTCTGCTTGCCCTTTCTGTAAGAAGGGGACGG GCT CTG GGA CCC GTGAGTAGGAGCGGACACTTCTGCTTGCCCTTTCTGTAAGAAGGGGA

GAAGGGTCTTGCTAAGGAGTACAGGAACTGTCCGTATTCCTTCCCTTTCTGTGGCACTGCAGCGACCTCCTGAAGGGTCTTGCTAAGGAGTACAGGAACTGTCCGTATTCCTTCCCTTTCTGTGGCACTGCAGCGACCTCCT

GTTTTCTCCT.TGGCAG GTTTTCTCCT.TGGCAG 116 Lys AAG 116 Lys AAG Glu Ala Glu Ala 120 120 íle Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala GCT Ala GCT GAA GAA GCC GCC ATC ATC TCC TCC CCT CCA CCT CCA GAT GAT GCG GCG GCC GCC TCA TCA GCT GCT 130 130 140 140 Pro Leu Arg Thr íle For Leu Arg Thr White Thr Thr Ala Ala Asp Asp Thr Thr Phe Phe Arg Lys Arg Lys Leu Leu Phe Phe Arg Arg Val wall Tyr Tyr Ser Ser CCA CTC CGA ACA ATC CCA CTC AGA ATC ACT ACT GCT GCT GAC GAC ACT ACT TTC TTC CGC AAA CGC AAA CTC CTC TTC TTC CGA CGA GTC GTC TAC TAC TCC TCC 150 150 160 160 Asn Phe Leu Arg Gly Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Glu Glu Ala Ala Cys Cys Arg Arg Thr Thr Gly Gly AAT TTC CTC CGG GGA AAT TTC CTC CGG GGA AAG AAG CTG CTG AAG AAG CTG CTG TAC TAC ACA GGG ACA GGG GAG GAG GCC GCC TGC TGC AGG AGG ACA ACA GGG GGG

166166

Asp Arg OPAsp Arg OP

GAC AGA TGA CCAGGTGTGTCCACCTGGGCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTGCTTGTGCCACAGAC AGA TGA CCAGGTGTGTCCACCTGGGCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTGCTTGTGCCACA

CCCTCCCCCGCCACTCCTGAACCCCGTCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCCCCTCCCCCGCCACTCCTGAACCCCGTCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCC

AGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAACTGTCCAGAGAGCAACTCTGAGATCTAAGGATGTCACAGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAACTGTCCAGAGAGCAACTCTGAGATCTAAGGATGTCAC

AGGGCCAACTTGAAGGGCCCAGAGCAGGAAGCATTCAGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGGACAGAGCCATGCAGGGCCAACTTGAAGGGCCCAGAGCAGGAAGCATTCAGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGGACAGAGCCATGC

TGGGAAGACGCCTGAGCTCACTCGGCACCCTGCAAAATTTGATGCCAGGACACGCTTTGGAGGCGATTTACTGGGAAGACGCCTGAGCTCACTCGGCACCCTGCAAAATTTGATGCCAGGACACGCTTTGGAGGCGATTTAC

CTGTTTTCGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACCTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTTCTCCAGGCTGTTTTCGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACCTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTTCTCCAGG

TCTCACGGGCATGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACCGGGGTGGTGGGAACCATGAAGACTCTCACGGGCATGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACCGGGGTGGTGGGAACCATGAAGAC

AXGATXGGGGCTGGCCTCTGGCTCTCATGGGGTCCAAGTTTTGTGTATTCTCAACCTATTGACAGACTGAAAXGATXGGGGCTGGCCTCTGGCTCTCATGGGGTCCAAGTTTTGTGTATTCTCAACCTATTGACAGACTGAA

ACACAATATGACACACAATATGAC

V tabulke VI je počiatočným kontinuálnym sledom DNA horný sled s 620 bázami, ktorý je zrejme nepreneseným sledom, bezprostredne predchádzajúcim prenesenej časti génu pre ludský EPO. Sled zrejme obsahuje 5'-zakončenie génu a potom prenesenú oblasť DNA, ktorá je kódom pre prvé štyri aminokyseliny (-27 až -24) vedúceho alebo predbežného sledu. Štyri páry báz v slede pred sledom, ktorý je kódom pre začiatok vedúceho sledu neboli jednoznačne stanovené a sú preto označené ako X. Potom nasleduje intrón s 639 pármi báz (439 párov báz z tohto sledu bolo preukázaných, zvyšných 200 je označených I.S.) a potom kodón pre glutamín, ktorý bol označený polohou -23 v prenesenom polypeptide. Sled exónu, ktorý bezprostredne nasleduje je kódom pre zvyšky aminokyselín od alanínového zvyšku (označeného ako zvyšok +1 sledu aminokyselín úplného ludského EPO) do kodónu pre treonín v polohe +26, potom nasleduje druhý intrón, skladajúci sa z 256 báz, ako je označené. Za týmto intrónom nasleduje exón pre zvyšky aminokyselín v polohe 27 až 55 a potom tretí intrón s 612 pármi báz. Nasledujúci exón je kódom pre zvyšky 56 až 115 ludského EPO a potom nasleduje štvrtý intrón s 134 bázami, ako je uvedené. Za ním nasleduje exón, ktorý je kódom pre zvyšky 116 až 166 a stop kodón (TGA). V tabuíke VI je uvedený sled 568 párov báz, v ktorom sa zrejme nachádza neprenesená 3’-oblasť ludského EPO-génu a dva páry báz v tomto géne (X) ešte neboli úplne identifikované.In Table VI, the initial continuous DNA sequence is the 620 bases upper sequence, which is apparently a non-transferred sequence, immediately preceding the transferred portion of the human EPO gene. The sequence appears to contain the 5'-end of the gene and then the transferred DNA region, which encodes the first four amino acids (-27 to -24) of the leader or preliminary sequence. The four base pairs in sequence before the leader sequence code were not unambiguously determined and are therefore designated X. This is followed by an intron of 639 base pairs (439 base pairs from this sequence have been shown, the remaining 200 are labeled IS) and then a glutamine codon that was designated at position -23 in the transferred polypeptide. The exon sequence that immediately follows is the code for amino acid residues from the alanine residue (designated as +1 residue of the full length EPO amino acid sequence) to the threonine codon at position +26, followed by a second intron consisting of 256 bases as indicated. This intron is followed by an exon for amino acid residues at positions 27-55 and then by a third intron with 612 base pairs. The following exon codes for residues 56-115 of human EPO, followed by a fourth intron of 134 bases as indicated. It is followed by an exon that encodes residues 116-166 and a stop codon (TGA). Table VI shows the sequence of 568 base pairs, which appears to contain the untranslated 3'-region of the human EPO gene and the two base pairs in this gene (X) have not yet been fully identified.

Tabulka VI teda slúži na identifikáciu primárnej štruktúry (sledu aminokyselín) úplného ludského EPO vrátane 166 úplne špecifikovaných aminokyselinových zvyškov (stanovená molekulová hmotnosť 18 399). Ako je v tabulke uvedené, je sled DNA kódom pre signálny sled s 27 zvyškami spolu s 5'- a 3'- DNA sledmi, ktoré môžu byť významné pre funkciu promotor/operátor operónu ludského génu. Miesta pre potenciálnu glykozyláciu úplného ludského EPO polypeptidu sú v tabulke označené hviezdičkami.Thus, Table VI serves to identify the primary structure (amino acid sequence) of full human EPO, including 166 fully specified amino acid residues (MW 18 399). As shown in the table, the DNA sequence is a code for a 27-residue signal sequence along with 5'- and 3'-DNA sequences that may be significant for the promoter / operator function of the human gene. The sites for potential glycosylation of the full length human EPO polypeptide are indicated by asterisks in the table.

Je nutné uviesť, že špecifický sled aminokyselín, uvedený v tabulke VI pravdepodobne predstavuje sled prírodné sa vysky47 tu j úcej alelovej formy ľudského erytropoietínu.. Podporu pre toto tvrdenie je možné nájsť. vo výsledkoch sústavných výskumov sledov ľudského erytropoietínu, izolovaného z moča, ktorými bolo preukázané, že podstatné množstvo molekúl erytropoietínu obsahuje metionín v polohe 126 na rozdiel od serínu, ktorý je uvedený v tabuľke.It should be noted that the specific amino acid sequence shown in Table VI is likely to be the sequence of the naturally occurring allele form of human erythropoietin. Support for this claim can be found. in the results of continuous studies of urine-isolated human erythropoietin sequences that have shown that a significant amount of erythropoietin molecules contain methionine at position 126, unlike the serine shown in the table.

V tabuľke VII je uvedený rozsah homológie sledu medzi ľudským a opičím erytropoietínom. V hornej kontinuálnej línii tabuľky sú použité jednotlivé písmená na označenie sledu ľudského polypeptidu po translácii, začína sa polohou -27, spodné kontinuálne línie uvádzajú sled pre opičí erytropoietín, začína sa opäť miestom, označeným polohou -27. Na osvetlenie homológie jednotlivých sledov sú použité hviezdičky. Je nutno sa zmieniť o tom, že sledy ľudského a opičieho EPO preukazujú prídavný lyzínový (K) zvyšok v polohe 116 ľudského erytropoietínu. Pri porovnaní s tabuľkou VI je zrejmé, že tento zvyšok leží na hranici spojenia v slede genómu (mRNA). Prítomnosť lyzínového zvyšku v slede ľudského polypeptidu bola ďalej overená zistením sledu ľudskej cDNA v klone, získanom pomocou mRNA, izolovanej z buniek COS-1, transformovaných pomocou DNA ľudského genómu tak, ako je uvedená v príklade 7, ktorý bude ďalej prezentovaný.Table VII shows the extent of sequence homology between human and monkey erythropoietin. In the upper continuous line of the table, individual letters are used to indicate the sequence of the human polypeptide after translation, beginning at position -27, the lower continuous lines indicating the sequence for monkey erythropoietin, starting at the position indicated by position -27 again. Asterisks are used to illuminate the homology of individual sequences. It should be noted that sequences of human and simian EPO show an additional lysine (K) residue at position 116 of human erythropoietin. By comparison with Table VI, it is evident that this residue lies at the junction boundary in the genome sequence (mRNA). The presence of the lysine residue in the human polypeptide sequence was further verified by detecting the human cDNA sequence in the clone obtained by mRNA isolated from COS-1 cells transformed with the human genome DNA as set forth in Example 7, which will be presented below.

Tabuľka VIITable VII

Porovnanie ľudského a opičieho EPOComparison of human and monkey EPO

V , ,. -20 -10 +1 10 20 30 40IN , ,. -20 -10 +1 10 20 30 40

LÍdsky MGVHECPAWLHLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLlCOSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENirVPDTK' «*«««·«*««·*«««· «·««««·· « «c « ·β·«·«·«·β·β«Inhuman MGVHECPAWLHLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLlCOSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENirVPDTK '«*« «» · «*« «·» «« · ·

Opičí MGVHECPAWLWLLLSLVSLPLGLPVPGAPPRLICOSRVLERYLLEAKEAENVTMGCSESCSLNENITVPOTK _v . 50 60 70 80 90 100 110Monkey MGVHECPAWLWLLLSLVSLPLGLPVPGAPPRLICOSRVLERYLLEAKEAENVTMGCSESCSLNENITVPOTK _v . 50 60 70 80 90 100 110

I|dsky VNPYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLOLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAqKE «*·««*·*··**·«««·«««··««««·«««···« * ««««« «·«««« ««« «·««« «I | dsky VNPYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLOLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAqKE «* ·« «* · * ·· ** ·« «« «· ·« «« ««

Opičí VNFYAHKRMEVGqQAVEVWQGLALLSEAVLRGQAVLANSSQPFEPLQLHMOKAISGLRSITTLLRALGAQ-E íMonkey VNFYAHKRMEVGqQAVEVWQGLALLSEAVLRGQAVLANSSQPFEPLQLHMOKAISGLRSITTLLRALGAQ-E í

V, 120 130 140 150 160V, 120 130 140 150 160

IÄdSfcy AISPPDAASAAPLRTITAOTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGOR a«« ee««eoee««e«e««ee «««IÄdSfcy AISPPDAASAAPLRTITAOTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGOR and «« ee «« eoee «« e «e« «ee« ««

Opičí aislpoaasaaplrtitaotfcklfrvysnflrgklklytgeacrrgorMonkey aislpoaasaaplrtitaotfcklfrvysnflrgklklytgeacrrgor

Príklad 6Example 6

Systém pre expresiu, ktorý bol zvolený na počiatočné pokusy uskutočniť mikrobiálnu syntézu izolovateľných množstiev erytropoietínu, pre ktorý je kódom opičia príslušná cDNA a ktorý je uvedený v príklade 3 bol systém, pri ktorom boli použité ako hostiteľ cicavčie bunky (tzn. bunky COS-1, ATCC č. CRL-1650) Tieto bunky boli podrobené transfekcii vektorom, ktorý umožňoval aj autonómnu replikáciu v E. coli ako hostiteľovi (vzhľadom na prítomnosť DNA, odvodenej od plazmidu pBR322) aj replikáciu v bunkách cicavcov (vzhľadom na prítomnosť DNA, odvodenej od vírusu SV40).The expression system chosen for the initial attempts to perform microbial synthesis of isolatable amounts of erythropoietin coded for by the corresponding cDNA and shown in Example 3 was a system in which mammalian cells (i.e., COS-1 cells, ATCC No. CRL-1650) These cells were transfected with a vector that allowed both autonomous replication in E. coli as a host (due to the presence of pBR322-derived plasmid) and replication in mammalian cells (due to the presence of virus-derived DNA) SV40).

Podrobnejšie uvedené, vektor pre expresiu bol konštruovaný nasledujúcim spôsobom. Kloň 83 plazmidu, v príklade 3 bol podrobený amplifikácii v E. coli s DNA s približne 1,4 kilobázami, ktorá je kódom pre opičí erytropoietín a bola izolovaná pomocou štiepenia enzýmami EcoRI a HindlII. Oddelene bol izolovaný fragment z pBR322 s veľkosťou približne 4,0 kilobáz pomocou enzýmov HindlII a Sali. Z DNA M13mpl0 RF (P a L Laboratories) bol pôsobením enzýmov EcoRI a Sali získaný väzný fragment s veľkosťou približne 30 párov báz. Tento fragment obsahoval postupne zakončenie po štiepení EcoRI, schopné opätovnej väzby, potom nasledovali miesta pre štiepenie enzýmami SstI, Smal, BamHI a Xbal a zakončenie po štiepení enzýmom Sali, schopné opätovnej väzby. Všetky tri hore uvedené fragmenty boli naviazané, čím bol ako medziprodukt získaný plazmid (pERS) s približne 5,4 kilobáz, v ktorom DNA pre erytropoietín bola na jednej strane ohraničená skupinou miest pre pôsobenie rôznych reštrikčných enzýmov. Plazmid pERS bol potom štiepený enzýmami HindlII a Sali, čím bola získaná DNA pre EPO a väzný reťazec EcoRI až Sali (M13mpl0). Fragment s 1,4 pármi báz bol naviazaný na fragment plazmidu pBR322 s 4,0 kilobázami po štiepení enzýmami BamHI a Sali a na ďalší väzný reťazec, získaný štiepením M13mpl0 RF enzýmami HindlII a BamHI s približne 30 pármi báz. Tento druhý väzný reťazec z M13 mal na jednom zakončení miesto po pôsobení enzýmu HindlII s možnosťou opätovnej väzby, toto miesto bolo nasledované miestami pre pôsobenie reštrikčných enzýmov PstI, Sali, Xbal a potom nasledovalo zakončenie po štiepení enzýmom BamHI s možnosťou opätovnej väzby. Produktom väzby bol opäť užitočný plazmid (pBR-EPO), ktorý obsahoval DNA pre erytropoietín, ktorý bol na obidvoch stranách ohraničený reťazcami s celým radom miest pre pôsobenie rôznych reštrikčných enzýmov.In more detail, the expression vector was constructed as follows. The plasmid clone 83 in Example 3 was subjected to amplification in E. coli with approximately 1.4 kilobase DNA encoding monkey erythropoietin and isolated by digestion with EcoRI and HindIII. Separately, a fragment of approximately 4.0 kilobases was isolated from pBR322 using the HindIII and SalI enzymes. A binding fragment of approximately 30 base pairs was obtained from M13mp10 RF DNA (P and L Laboratories) by EcoRI and SalI. This fragment contained sequentially Ecolable digestion sites capable of re-binding, followed by SstI, SmaI, BamHI and XbaI digestion sites, and SalI digested sites. All three of the above fragments were ligated, yielding an intermediate plasmid (pERS) of approximately 5.4 kilobases, in which erythropoietin DNA was flanked by a group of sites for the action of various restriction enzymes. Plasmid pERS was then digested with HindIII and SalI to obtain the DNA for EPO and the EcoRI-SalI binding chain (M13mp10). The 1.4 base pair fragment was ligated to the 4.0 kilobase plasmid pBR322 fragment after digestion with BamHI and SalI, and to another binding strand obtained by cleavage of M13mp10 RF enzymes with HindIII and BamHI of approximately 30 base pairs. This second binding chain of M13 had a HindIII digestion site at one end, followed by a PstI, SalI, XbaI restriction site, followed by a BamHI digestion site. The binding product was again a useful plasmid (pBR-EPO) containing DNA for erythropoietin, which was flanked on both sides by chains with a variety of restriction enzyme sites.

Vektor, ktorý bol použitý na expresiu DNA pre erytropoietín v bunkách COS-1 (pDSVLl) bol konštruovaný tak, aby dovoľoval selekciu a autonómnu replikáciu v E. coli. Tieto vlastnosti uvedeného vektoru sú zaisťované počiatkom replikácie a sledom DNA, ktorý je kódom pre odolnosť proti ampicilínu, ktorý je uložený medzi nukleotidmi 2448 a 4362 v slede plazmidu pBR322. Tento sled bol štruktúrne modifikovaný pridaním pomocného väzného reťazca tak, aby vzniklo miesto pre pôsobenie reštrikčného enzýmu HindlII bezprostredne v susedstve nukleotidu 2448 pred včlenením do vektoru. Z užitočných vlastností zvoleného vektoru je potrebné uviesť najmä schopnosť autonómnej replikácie v bunkách COS-1 a prítomnosť sledu promotoru vírusu, funkčného v bunkách cicavcov. Tieto vlastnosti sú zaisťované sledom DNA pre počiatok replikácie a sledom vírusového promotoru, ktorého dĺžka je 342 párov báz a zasahuje od polohy 5171 sledu do polohy 270 genómu SV40. Vo vektore sa nachádza jediné miesto pre pôsobenie reštrikčného enzýmu (BamHI) a v tesnej blízkosti vírusového promotoru je naviazaný bežne dodávaný väzný sled (Collaborative Research). Vo vektore je včlenený tiež sled s 237 pármi báz (poloha nukleotidov 2553 až 2770 SV40) s obsahom mRNA vírusového polyadenylačného signálu (obyčajne uvádzaný ako terminátor transkripcie) Tento fragment bol do vektoru uložený v správnej orientácii vzhladom na vírusový promotor pomocou jediného miesta pre pôsobenie reštrikčného enzýmu BamHI. Vo vektore je tiež pri50 tomný další gén cicavca v polohe, ktorá nie je rozhodujúca pre potenciálnu transkripciu génu, včleneného v jedinom mieste pôsobenia BamHI, medzi vírusovým promotorom a terminačným sledom (týmto génom bol gén s približne 2500 pármi báz pre myší dihydrofolátreduktázu (DHRF), izolovaný z plazmidu pMG-1 spôsobom, opísaným v publikácii Gasser a dalšie, PNAS (USA)The vector that was used to express erythropoietin DNA in COS-1 cells (pDSVL1) was constructed to allow selection and autonomous replication in E. coli. These properties of the vector are assured by the origin of replication and the DNA sequence coding for ampicillin resistance that is deposited between nucleotides 2448 and 4362 in the sequence of plasmid pBR322. This sequence was structurally modified by the addition of a helper binding chain to provide a site for the action of the HindIII restriction enzyme immediately adjacent to nucleotide 2448 prior to incorporation into the vector. Among the useful properties of the vector selected, the ability to replicate autonomously in COS-1 cells and the presence of a viral promoter sequence functional in mammalian cells should be mentioned. These properties are assured by the DNA sequence for the origin of replication and the sequence of the viral promoter, which is 342 base pairs in length and extends from position 5171 of the sequence to position 270 of the SV40 genome. The vector has a single restriction enzyme site (BamHI) and a commercially available binding sequence (Collaborative Research) is coupled in close proximity to the viral promoter. Also included in the vector is a 237 base pair sequence (nucleotide position 2553 to 2770 of SV40) containing viral polyadenylation signal mRNA (commonly referred to as a transcription terminator). This fragment was inserted into the vector in the correct orientation relative to the viral promoter using a single restriction site. of the BamHI enzyme. Also present in the vector is another mammalian gene at a position that is not critical to the potential transcription of a gene incorporated at a single BamHI site between the viral promoter and the termination sequence (this gene was a gene of approximately 2500 base pairs for mouse dihydrofolate reductase (DHRF) isolated from plasmid pMG-1 as described by Gasser et al., PNAS (USA)

79, str. 6522 až 6526 (1982)). Hlavné operatívne zložky plazmidu pDSVLl sú v nukleotidoch 2448 až 4362 plazmidu pBR322 spolu s nukleotidmi 5171 až 270 (342 párov báz) a 2553 až 2770 (237 párov báz) DNA SV40.79, p. 6522-6526 (1982)). The main operative components of plasmid pDSVL1 are at nucleotides 2448 to 4362 of plasmid pBR322 together with nucleotides 5171 to 270 (342 base pairs) and 2553 to 2770 (237 base pairs) of SV40 DNA.

Podlá hore uvedených postupov, opísaných napríklad v uvedenej publikácii Maniatis a dalšie bola izolovaná DNA, ktorá je kódom pre erytropoietín z plazmidu pBR-EPO ako fragment po štiepení enzýmom BamHI a potom bola včlenená do plazmidu pDSVLl po jeho rozštiepení enzýmom BamHI. Analýza reštrikčnými enzýmami bola použitá na potvrdenie včlenenia génu pre erytropoietín v správnej orientácii v dvoch z výsledných klonovaných vektorov (vektory H a L). Tieto skutočnosti sú zrejmé aj z obr. 2, kde je znázornený plazmid pDSVL-MkE. Vektory s génmi EPO v nesprávnej orientácii boli uchované ako negatívne kontroly pre pokusy s transfekciou, pri ktorých ide o stanovenie úrovne expresie EPO v hostitelovi, transformovanom vektormi, ktoré obsahujú DNA pre erytropoietín v správnej orientácii.The DNA coding for erythropoietin from plasmid pBR-EPO as a fragment after digestion with BamHI was isolated according to the procedures described, for example, in Maniatis et al., And then inserted into plasmid pDSVL1 after digestion with BamHI. Restriction enzyme analysis was used to confirm the incorporation of the erythropoietin gene in the correct orientation in two of the resulting cloned vectors (vectors H and L). These facts are also evident from FIG. 2, where plasmid pDSVL-MkE is shown. Vectors with EPO genes in the wrong orientation were retained as negative controls for transfection experiments to determine the level of expression of EPO in a host transformed with vectors containing erythropoietin DNA in the correct orientation.

Príklad 7Example 7

A. Počiatočný systém pre expresiu EPO, bunky COS-1A. Initial EPO Expression System, COS-1 Cells

Systém, ktorý bol zvolený na počiatočné pokusy s mikrobiálnou syntézou izolovatelných množstiev ludského erytropoetínu, pre ktoré je kódom DNA ludského genómu tiež zahŕňal expresiu v bunkách cicavcov ako v hostiteľských bunkách (tzn. v bunkách COS-1, ATCC č. CRL-1650). Gén pre ludský EPO bol najskôr podrobený počiatočnému klonovaniu vo vektore, ktorý je schopný autonómnej replikácie v obidvoch hostiteloch E. coli (vzhladom na prítomnosť DNA z plazmidu pBR322) aj v bunkovej línii cicavcov COS-1 (vzhladom na prítomnosť DNA, odvodenej od vírusu SV40). Tento vektor s obsahom génu pre erytropoietín bol potom vnesený do buniek COS-1. Polypéptidový materiál typu EPO bol potom bunkami po vykonaní transfekcie produkovaný a vylučovaný do prostredí, v ktorom boli bunky pestované.The system that was chosen for initial experiments with microbial synthesis of isolable amounts of human erythropoietin for which the DNA of the human genome is encoded also included expression in mammalian cells as host cells (i.e., COS-1 cells, ATCC No. CRL-1650). The human EPO gene was first subjected to initial cloning in a vector capable of autonomous replication in both E. coli hosts (both due to the presence of DNA from plasmid pBR322) and the mammalian cell line COS-1 (due to the presence of SV40-derived DNA) ). This erythropoietin gene containing vector was then introduced into COS-1 cells. The EPO-type polypeptide material was then produced and secreted by the cells after transfection into the environment in which the cells were grown.

Vektor pre expresiu bol teda skonštruovaný nasledujúcim spôsobom: DNA, izolovaná z lambda klonu A. hEl s obsahom génu pre EPO ludského genómu bol rozštiepený pôsobením reštrikčných enzýmov BamHI a HindlII a bol izolovaný fragment s 5,6 kbázami, o ktorom bolo známe, že obsahuje úplný gén pre erytropoietín. Tento fragment bol naviazaný na bakteriálny plazmid pUC8 (Betesda Research Laboratories Inc.), ktorý bol rozštiepený obdobným spôsobom, čím vznikol intermediárny plazmid (pUC8-HuE, ktorý sa tak stal vhodným zdrojom uvedeného reštrikčného fragmentu. :Thus, the expression vector was constructed as follows: DNA isolated from the lambda clone A. hEl containing the human genome EPO gene was digested with the restriction enzymes BamHI and HindIII, and a 5.6 kb fragment known to contain a fragment was isolated. the complete erythropoietin gene. This fragment was ligated to the bacterial plasmid pUC8 (Betesda Research Laboratories Inc.), which was digested in a similar manner to give an intermediate plasmid (pUC8-HuE, which thus became a suitable source of said restriction fragment.):

Vektor, ktorý bol zvolený pre expresiu DNA pre EPO v bunkách COS-1 (pSV4SEt) bol skonštruovaný už skôr. Ide o plazmid, ktorý obsahuje sled DNA, dovolujúci selekciu a autonómnu replikáciu v bunkách E. coli. Tieto vlastnosti sú zaisťované sledmi DNA pre počiatok replikácie a pre odolnosť proti ampicilínu, ktoré sú prítomné v oblasti, ktorá zasahuje od nukleotidu v polohe 2448 do nukleotidu v polohe 4362 bakteriálneho plazmidu pBR322, tento sled bol potom štruktúrne modifikovaný pridaním väzného reťazca s miestom pre pôsobenie reštrikčného enzýmu HindlII bezprostredne v blízkosti polohy 2448. Plazmid pSV4SEt je tiež schopný autonómnej replikácie v bunkách COS-1. Táto vlastnosť je zaisťovaná fragmentom s 342 pármi báz s obsahom počiatku pre replikáciu z vírusu SV40 (nukleotidy v polohách 5171 až 270). Tento fragment bol potom modifikovaný pridaním väzného reťazca s miestom pre pôsobenie reštrikčného enzýmu EcoRI v bezprostrednej blízkosti nukleotidu 270 a väz52 ného reťazca s miestom pre pôsobenie Sali v bezprostrednej blízkosti nukleotidu 5171. V tomto vektore je včlenený tiež fragment s 1061 pármi báz z vírusu SV40 (nukleotidy 1711 až 2772 s väzným reťazcom s miestom pre pôsobenie enzýmu Sali v bezprostrednej blízkosti nukleotidu 2772). V tomto fragmente sa nachádza jediné miesto pre pôsobení reštrikčného enzýmu BamHI. Celkove je možno uviesť, že plazmid pSV4SEt obsahuje jediné miesto pre pôsobenie BamHI a HindlII a dovoluje tak včlenenie génu pre ludský erytropoietín, sledov, dovolujúcich replikáciu a selekciu v E. coli a sledy, dovolujúce replikáciu v bunkách COS-1.The vector that was chosen for the expression of EPO DNA in COS-1 cells (pSV4SEt) was constructed previously. It is a plasmid that contains a DNA sequence allowing selection and autonomous replication in E. coli cells. These properties are provided by the DNA sequences for the origin of replication and for ampicillin resistance present in the region that extends from the nucleotide at position 2448 to the nucleotide at position 4362 of the bacterial plasmid pBR322, which sequence was then structurally modified by adding a linker with a site The HindIII restriction enzyme immediately near position 2448. Plasmid pSV4SEt is also capable of autonomous replication in COS-1 cells. This property is provided by a 342 base pair fragment containing an origin of replication from the SV40 virus (nucleotides at positions 5171 to 270). This fragment was then modified by adding the EcoRI restriction site in the immediate vicinity of nucleotide 270 and the SalI binding site in the immediate vicinity of nucleotide 5171. Also included in this vector is a 1061 base pair fragment from SV40 ( nucleotides 1711 to 2772 with a binding chain having a SalI site in the immediate vicinity of nucleotide 2772). In this fragment there is a single BamHI restriction enzyme site. Overall, the plasmid pSV4SEt contains a single BamHI and HindIII site and thus allows the insertion of the human erythropoietin gene, sequences allowing replication and selection in E. coli, and sequences allowing replication in COS-1 cells.

Aby bolo možné včleniť gén pre ludský erytropoietín do plazmidu pSV4SEt, bol plazmid pUC8-HuE rozštiepený pôsobením enzýmov BamHI a HindlII a bol izolovaný fragment s 5,6 kbázami s DNA pre ludský erytropoietín. Plazmid pSV4SEt bol tiež rozštiepený enzýmami BamHI a HindlII a bol izolovaný hlavný fragment s 2513 pármi báz, ktorý obsahoval všetky nutné funkcie. Tieto fragmenty boli zmiešané a vzájomne naviazané, čím vznikol výsledný vektor pSVgHuEPO tak, ako je to znázornené na obr.In order to incorporate the human erythropoietin gene into plasmid pSV4SEt, the plasmid pUC8-HuE was digested with BamHI and HindIII and the 5.6 kb DNA fragment for human erythropoietin was isolated. Plasmid pSV4SEt was also digested with BamHI and HindIII, and a 2513 base pair main fragment containing all the necessary functions was isolated. These fragments were mixed and bound together to give the resulting vector pSVgHuEPO as shown in FIG.

3. Tento vektor bol propagovaný v E. coli a bola izolovaná DNA tohto vektoru. Potom bola použitá analýza pomocou reštrikčných enzýmov na potvrdenie včlenenia génu pre EPO.3. This vector was propagated in E. coli and the DNA of the vector was isolated. Restriction enzyme analysis was then used to confirm the incorporation of the EPO gene.

Plazmid pSVgHuEPO bol použitý na expresiu ludského EPO v bunkách COS-1. DNA tohto plazmidu bola kombinovaná s nosnou DNA a bola vykonaná transfekcia vždy v trojnásobnom opakovaní na platniach s bunkami COS-1 s rozmermi 60 mm. Ako kontrola bola použitá nosná DNA, pri ktorej bola tiež uskutočnená transfekcia do buniek COS-1. Prostredie kultúr bolo odoberané po piatich a po siedmich dňoch a bolo skúmané na prítomnosť polypeptidov s vlastnosťami prírodné sa vyskytujúceho ludského EPO, najmä pokial ide o vlastnosti imunologické.Plasmid pSVgHuEPO was used to express human EPO in COS-1 cells. The DNA of this plasmid was combined with carrier DNA and transfected in triplicate on 60 mm COS-1 cells each time. Carrier DNA was also used as a control and transfected into COS-1 cells. The culture medium was harvested after five and seven days and examined for the presence of polypeptides with properties of naturally occurring human EPO, particularly for immunological properties.

B. Druhý systém na expresiu EPO pri použití buniek COS-1B. Second EPO Expression System Using COS-1 Cells

Bol konštruovaný ešte ďalší systém pre zlepšenú produkciu ludského erytropoietínu, pre ktorý je kódom DNA pre EPO ludského genómu v bunkách COS-1 (ATCC č. CRL-1650).Yet another system for the improved production of human erythropoietin has been constructed for which it encodes DNA for the EPO of the human genome in COS-1 cells (ATCC No. CRL-1650).

V predchádzajúcom systému bola dosiahnutá expresia EPO v bunkách COS-1 pri použití jeho vlastného promotóru, nachádzajúceho sa v oblasti reštrikčného fragmentu po pôsobení enzýmu BamHI a Hindlll s velkostou 5,6 kbáz. Pri nasledujúcej konštrukcii bol gén pre EPO pozmenený tak, že k jeho expresii dochádza použitím promotoru vírusu SV40.In the previous system, EPO expression was achieved in COS-1 cells using its own promoter, located in the restriction fragment region after treatment with the BamHI and HindIII enzymes of 5.6 kbases. In the following construction, the EPO gene has been altered so that it is expressed using the SV40 virus promoter.

Klonovaný reštrikčný fragment EPO ludského genómu s 5,6 bázami po štiepení enzýmami BamHI až Hindlll bol modifikovaný nasledujúcim spôsobom. Plazmid pUC8-HuE, opísaný hore bol rozštiepený enzýmom BamHI a BstEII. Reštrikčný enzým BstEII štiepi fragment'EPO s 5,6 kbázami v polohe, ktorá sa nachádza 44 párov báz 5' k počiatku ATG kódu pre predbežný peptid a približne 680 párov báz 3' k miestu pre štiepenie reštrikčným enzýmom Hindlll. Bol izolovaný fragment s približne 4900 pármi báz.The cloned 5.6 base human EPO restriction fragment of BamHI to HindIII was digested as follows. The pUC8-HuE plasmid described above was digested with BamHI and BstEII. The restriction enzyme BstEII cleaves the 5.6 kb EPO fragment at a position that is 44 base pairs 5 'to the start of the ATG code for the preliminary peptide and approximately 680 base pairs 3' to the restriction enzyme HindIII cleavage site. A fragment of approximately 4900 base pairs was isolated.

Bol tiež syntetizovaný a čistený väzný fragment so zakončeniami, schopnými väzby v miestach po štiepení enzýmami Sali a BstEII s miestom pre štiepenie enzýmom BamHI vnútri fragmentu. Obidva fragmenty boli zmiešané a viazané na plazmid pBR322, ktorý bol rozštiepený reštrikčnými enzýmami Sali a BamHI za vzniku intermediárneho plazmidu pBRgHE. Gén pre EPO ludského genómu bol potom izolovaný ako fragment s 4900 pármi báz po štiepení enzýmom BamHI, fragment obsahoval úplný štrukturálny gén s jediným ATG v mieste 44 párov báz 3' od miesta pôsobenia enzýmu BamHI v blízkosti zakončenia kódovej oblasti s aminoskupinou na konci.A binding fragment with ends capable of binding at SalI and BstEII cleavage sites with a BamHI cleavage site within the fragment was also synthesized and purified. Both fragments were mixed and ligated to the plasmid pBR322, which had been digested with the restriction enzymes SalI and BamHI to form the intermediate plasmid pBRgHE. The human genome EPO gene was then isolated as a 4900 base pair fragment after BamHI digestion, containing the complete structural gene with a single ATG at 44 base pairs 3 'of the BamHI site near the end of the amino-terminus coding region.

Tento fragment bol izolovaný a včlenený ako fragment schopný väzby po štiepení enzýmom BamHI do plazmidu pDSVLl, opísaného v príklade 6 ako do vektoru na expresiu, rozštiepenom enzýmom BamHI. Výsledný plazmid pSVLgHuEPO, ktorý je znázornený na obr. 4 bol použitý na expresiu polypeptidového materiálu typu EPO v bunkách COS-1 spôsobom podlá príkladov 6 a 7A.This fragment was isolated and incorporated as a fragment capable of binding after BamHI digestion into the plasmid pDSVL1 described in Example 6 as an expression vector digested with BamHI. The resulting plasmid pSVLgHuEPO, which is shown in FIG. 4 was used to express EPO-type polypeptide material in COS-1 cells according to Examples 6 and 7A.

Príklad 8Example 8

Živné prostredie, v ktorom boli pestované bunky COS-l (šesť kultúr po transfekcii podlá príkladu 6) bolo analyzovaných rádioimunologicky spôsobom podlá príkladu 2, časť. B. Jednotlivé vzorky obsahovali 250, 125, 50 a 25 μΐ uvedeného prostredia. Supernatanty kultúr, ktoré obsahovali vektory s nesprávnou orientáciou génu EPO boli jednoznačne negatívne. Pre vzorky dvoch supernatantov z kultúr buniek COS-1 po transfekci vektormi (H a L), ktoré obsahovali DNA pre EPO v správnej orientácii sa pohybovalo percento inhibície ^XZ3I-EPO viazaného na protilátku v rozmedzí 72 až 88 %, všetky hodnoty sa teda pohybovali na vrchole štandardnej krivky. Presná koncentrácia EPO v kultúre nemohla byt lahko presne stanovená. Zo vzorky s obsahom 250 μΐ supernatantu bolo odhadnuté, že obsah EPO je minimálne 300 mjednotiek/ml.The culture medium in which COS-1 cells (six cultures after transfection according to Example 6) were grown was analyzed by radioimmunology according to Example 2, part. B. Individual samples contained 250, 125, 50 and 25 μΐ of the medium. Culture supernatants containing vectors with incorrect orientation of the EPO gene were clearly negative. For samples of two supernatants from cultures of COS-1 cells transfected with vectors (H and L) containing DNA for EPO in the correct orientation, the percent inhibition of ^antibody -bound ^XZ3 I-EPO ranged from 72 to 88%, thus all values were at the top of the standard curve. The exact concentration of EPO in the culture could not be easily determined. From a sample containing 250 μΐ of supernatant, it was estimated that the EPO content was at least 300 units / ml.

Supernatant, získaný z kultúry podlá príkladu 6 a z pät a sedem dní starej kultúry podlá príkladu 7A boli skúmané RIA, aby bolo možné porovnať účinnosť rekombinantného opičieho a ludského EPO a prírodné sa vyskytujúceho EPO ako štandardu, výsledky sú uvedené v grafickej forme na obr. 1. Ako bolo možné očakávať, došlo ku kompetícii rekombinantného opičieho EPO vzhladom k protilátke proti ludskému EPO, napriek tomu, že inhibícia nebola za podmienok pokusu úplná. Maximálne hodnoty inhibície v percentách pre rekombinantný ludský EPO sa však blížili hodnotám pre štandardný ludský EPO. Pretože krivky pre dávku a odpoveď majú paralelný priebeh, je možné súdiť na imunologickú identitu sledov (epitopov). Pôvodné výsledky pre opičí EPO boli opäť vyhodnotené a boli získané hodnoty v rozmedzí 2,91 až 3,12 jednotiek/ml. Zistené množstvá ľudského EPO boli vo vzorke po pätdennom pestovaní 392 m jednotiek v ml a 567 m jednotiek/ml vo vzorke, ktorá bola pestovaná 7 dní. Stanovené množstvá opičieho EPO podľa príkladu 7B mali rovnaký rád alebo o niečo vyšší.The supernatant obtained from the culture of Example 6 and the five and seven day old culture of Example 7A were examined by RIA to compare the efficacy of recombinant monkey and human EPO and naturally occurring EPO as a standard, the results are shown in graphical form in FIG. As expected, recombinant simian EPO was competed against the anti-human EPO antibody, although inhibition was incomplete under the experimental conditions. However, the maximum percent inhibition values for recombinant human EPO were close to those for standard human EPO. Because dose and response curves are parallel, it is possible to judge the immunological identity of sequences (epitopes). The original results for monkey EPO were re-evaluated and values ranging from 2.91 to 3.12 units / ml were obtained. The observed amounts of human EPO were in the sample after a five-day cultivation of 392 m units / ml and 567 m units / ml in a sample that was grown for 7 days. The determined amounts of monkey EPO according to Example 7B were of the same order or slightly higher.

Príklad 9Example 9

Živné prostredie z kultúr pripravených podlá príkladu 6 a 7 bolo podrobené skúškam in vitro na účinnosť EPO spôsobom, opísaným v publikácii Goldwasser a ďalšie, Endocrinology 97. č. 2, str. 315 až 323 (1975). Stanovené hodnoty pre opičí EPO v živnom prostredí skúmaných kultúr boli v rozmedzí 3,2 ažThe culture medium from the cultures prepared according to Examples 6 and 7 was subjected to in vitro assays for EPO efficacy as described by Goldwasser et al., Endocrinology 97. 2, p. 315-323 (1975). The values determined for monkey EPO in the culture medium of the cultures studied ranged from 3.2 to 2.0

4,3 jednotiek/ml. Živné prostredie kultúr s obsahom ľudského EPO bolo tiež pri tomto sledovaní účinné a okrem toho účinnosť týchto prostredí mohla byť neutrálizovaná protilátkou proti EPO. Živné prostredie ,z rekombinantných kultúr opičieho EPO podlá príkladu 6 bolo tiet skúmané na biologickú účinnosť in vivo spôsobom, opísaným v publikácii Cotes a ďalšie, Náture,4.3 units / ml. The culture medium of cultures containing human EPO was also effective in this study and, in addition, the efficacy of these environments could be neutralized by an anti-EPO antibody. The culture medium, from recombinant monkey EPO cultures according to Example 6, was examined for in vivo biological activity as described in Cotes et al.

191. str. 1065 až 1067 (1961) a podlá publikace Hammond a ďalšie, Ann. N. Y. Acad, Sci. 149, str. 516 až 527 (1968) a bola zistená účinnosť 0,94 až 1,24 jednotiek/ml.191. p. 1065-1067 (1961) and Hammond et al., Ann. N.Y. Acad, Sci. 149, p. 516-527 (1968) and found to be 0.94-1.24 units / ml.

Príklad 10Example 10

V predchádzajúcich príkladoch bol rekombinantný ludský alefyo opičí materiál typu EPO získaný pomocou vektorov,¹ použitých na transfekciu buniek COS-1. Dochádza pritom k replikácii týchto vektorov v bunkách COS-1 vzhladom na prítomnosť T-antigénu SV40 v bunke a počiatku replikácie SV40 vo vektore. Napriek tomu, že je možné pri použití týchto vektorov získať použiteľné množstvá EPO z buniek COS-1, je táto expresia len prechodná (7 až 14 dní), pretože po čase dochádza k strate vektoru. Okrem toho iba malé percentuálne množstvo COS-1 je po \In the previous examples, recombinant human alephyo monkey EPO-type material was obtained using vectors ¹ used to transfect COS-1 cells. These vectors replicate in COS-1 cells due to the presence of the SV40 T antigen in the cell and the SV40 origin of replication in the vector. Although usable amounts of EPO from COS-1 cells can be obtained using these vectors, this expression is only transient (7 to 14 days) because the vector is lost over time. In addition, only a small percentage of COS-1 is \

- 56 transfekcii schopné produkovať príslušný materiál. Ďalej bude opísaný systém expresie s použitím ovariálnych buniek [CHO]- 56 transfection capable of producing the relevant material. An ovarian cell expression system [CHO] will now be described

DHFR^- čínskeho chrčka a selekcie schopného označenia, DHFR.DHFR ^- Chinese Hamster and Selectable Labeling, DHFR.

Opis príbuzných systémov na expresiu je uvedený v U. S. Letters Patent č. 4 399 216 a v európskych patentových spisoch č. 117 057, 117 059 a 117 060, uverejnených 29. augusta 1984.A description of related expression systems is given in U.S. Pat. And U.S. Pat. 117 057, 117 059 and 117 060, published August 29, 1984.

Bunky CHO DHFR [bunky (DuX-Bll) CHO Kl] boli opísané v publikácii Urlaub a ďalšie, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, zv.CHO DHFR cells [cells (DuX-B11) CHO K1] have been described by Urlaub et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol.

77, 4461 (1980), tieto bunky postrádajú enzým dihydrofolátreduktázu (DHFR) vzhladom na mutácie štrukturálneho génu a preto vyžadujú prítomnosť glycínu, hypoxantínu a tymidínu v živnom prostredí. Plazmidy pDSVL-MkE (príklad 6) alebo pDSVL-gHuEPO (príklad 7B) boli podrobené transfekcii spolu s nosnou DNA do buniek CHO DHFR“ rastúcich v prostredí s obsahom hypoxantínu, tymidínu a glycínu na platniach s rozmermi 60 mm. Plazmid pSVgHuEPO (príklad 7A) bol zmiešaný s plazmidom pMG2 s obsahom génu pre myšiu dihydrofolátreduktázu, klonova- , ného v bakteriálnom plazmide pBR322 ako vektore (podlá hore uvedenej publikácie Gassera a ďalších). Zmes plazmidu a nosnej DNA bola prenesená do buniek CHO DHFR” (bunky s obsahom tohto plazmidu obyčajne obsahujú aj druhý plazmid). Po troch dňoch boli bunky dispergované pôsobením trypsínu na niekolko platní s rozmerom 100 mm v prostredí bez obsahu hypoxantínu a tymidínu. Len tie bunky, ktoré boli nastálo transformované génom DHFR, a tým aj génom EPO na tomto prostredí prežívajú. Po 7 až 21 dňoch je možné pozorovať kolónie prežívajúcich buniek. Tieto kolónie transformantov je možné po disperzii trypsinizáciou kontinuálne pestovať na prostrediach bez hypoxantínu a tymidínu, čím sa získajú nové bunkové kmene (napríklad CHO pDSVLMkEPO, CHO pSVgHuEPO, CHO-pDSVL-gHuEPO).77, 4461 (1980), these cells lack the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) due to structural gene mutations and therefore require the presence of glycine, hypoxanthine and thymidine in the culture medium. Plasmids pDSVL-MkE (Example 6) or pDSVL-gHuEPO (Example 7B) were transfected together with carrier DNA into CHO DHFR 'cells grown in hypoxanthine, thymidine and glycine containing media on 60 mm plates. Plasmid pSVgHuEPO (Example 7A) was mixed with plasmid pMG2 containing the mouse dihydrofolate reductase gene cloned in the bacterial plasmid pBR322 as a vector (according to Gasser et al., Supra). The mixture of plasmid and carrier DNA was transferred to CHO DHFR cells (cells containing this plasmid usually also contain a second plasmid). After three days, cells were dispersed by trypsin treatment on several 100 mm plates in a hypoxanthine and thymidine free environment. Only those cells that have been permanently transformed with the DHFR gene and hence the EPO gene survive in this environment. After 7 to 21 days, colonies of surviving cells can be observed. These colonies of transformants can be continuously grown in hypoxanthine and thymidine free media after dispersion by trypsinization to yield new cell strains (e.g. CHO pDSVLMkEPO, CHO pSVgHuEPO, CHO-pDSVL-gHuEPO).

Kvapalný materiál z pestovanie hore uvedených kmeňov buniek bol skúšaný RIA na prítomnosť rekombinantného opičieho alebo ludského EPO. Prostredie pre kmeň CHO pDSVL-MkEPO obsa57 hovalo EPO s imunologickými vlastnosťami obdobnými materiálu, ktorý bol získaný z buniek COS-1 po transfekcií plazmidom pDSVL-MkEPO. Kvapalný materiál, odobraný z kultúry po pestovaní 65 hodín obsahoval EPO opice v koncentrácii 0,60 jednoťiek/ml.Liquid material from culturing the above-mentioned cell strains was assayed by RIA for the presence of recombinant monkey or human EPO. The environment for the CHO strain pDSVL-MkEPO contained57 EPO with immunological properties similar to that obtained from COS-1 cells after transfection with the plasmid pDSVL-MkEPO. The liquid material taken from the culture after 65 hours of culture contained EPO monkeys at a concentration of 0.60 units / ml.

Kvapalný materiál z CHO pSVgHuEPO a CHO pDSVL-gHuEPO obsahoval ľudský EPO s imunologickými vlastnosťami obdobnými materiálu, ktorý bol získaný pri použití buniek COS-1 po transfekcii plazmidom pSVgHuEPO alebo pDSVL-gHuEPO. Kvapalný podiel 3 dni starej kultúry CHO pSVgHuEPO obsahoval 2,99 jednotiek/ml ľudského EPO a 5,5 dní pestovaná vzorka CHO pDSVL-gHuEPO obsahoval 18,2 jednotiek/ml ľudského EPO, merané RIA.Liquid material from CHO pSVgHuEPO and CHO pDSVL-gHuEPO contained human EPO with immunological properties similar to that obtained with COS-1 cells transfected with plasmid pSVgHuEPO or pDSVL-gHuEPO. A liquid fraction of a 3 day old culture of CHO pSVgHuEPO contained 2.99 units / ml human EPO and a 5.5 day cultured CHO sample pDSVL-gHuEPO contained 18.2 units / ml human EPO as measured by RIA.

Množstvo EPO, produkované hore uvedenými bunkovými kmeňmi je možné zväčšiť amplifikáciou génu za vzniku nového bunkového kmeňa s vyšší produktivitou. Enzým dihydrofolátreduktáza (DHFR), ktorý je produktom, pre ktorý je kódom gén DHFR môže byt inhibovaný métotrexátom (MTX). Bunky, pestované v prostredí bez hypoxantínu a tymidínu je teda možné zbrzdiť v raste až usmrtiť MTX. Za vhodných podmienok (napríklad minimálnej koncentrácie MTX) sa môžu bunky stať odolné a schopné rásť v prítomnosti MTX. Odolnosť týchto buniek proti MTX je spôsobená amplifikáciou počtu ich génov DHFR, a tým i vyššou produkciou enzýmu DHFR. Prežívajúce bunky je potom možné spracovávať pôsobením stúpajúceho množstva MTX, čím je možné získať bunkové kmene, ktoré obsahujú väčší počet génov DHFR. Gén, nesený vektorom pre expresiu (napríklad gén pre EPO) súčasne s génom DHFR alebo transformovaným génom DHFR obyčajne tiež zvýši počet svojich kópií.The amount of EPO produced by the above-mentioned cell strains can be increased by gene amplification to produce a new cell strain with higher productivity. The enzyme dihydrofolate reductase (DHFR), which is a product encoded by the DHFR gene, can be inhibited by methotrexate (MTX). Thus, cells grown in hypoxanthine-free and thymidine-free media can be inhibited in growth to kill MTX. Under appropriate conditions (e.g., minimum MTX concentration), cells may become resistant and able to grow in the presence of MTX. The resistance of these cells to MTX is due to the amplification of the number of their DHFR genes and thus to the higher production of the DHFR enzyme. Surviving cells can then be treated with increasing amounts of MTX to obtain cell strains that contain multiple DHFR genes. A gene carried by an expression vector (e.g., an EPO gene) concomitantly with the DHFR gene or the transformed DHFR gene usually also increases its copy number.

Ako praktický príklad tejto amplifikácie je možné uviesť prípad, pri ktorom bol bunkový kmeň CHO pDSVL-MkE podrobený vplyvu stúpajúcej koncentrácie MTX (0 nM, 30 nM a 100 nM). Po hodinách pôsobenia jednotlivých koncentrácií boli kultúry sledované RIA a bolo možné preukázať, že kvapalný materiál obsahuje 0,60, 2,45 a 6,10 jednotiek v ml. Bunkový kmeň CHO pDSVL-gHuEPO bol potom podrobený pôsobeniu stúpajúcich koncentrácií MTX 30 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 1 μΜ, 5 μΜ MTX. Po troch dňoch pestovania obsahoval kvapalný materiál z kultúry, na ktorú sa pôsobilo 100 nM MTX ludského EPO v koncentrácii 3089 ± 129 jednotiek/ml podlá stanovenia RIA. 48 hodín pestované vzorky po pôsobení 100 nM a 1 μΜ MTX obsahovali ludský EPO v množstve 466 a 1352 jednotiek/ml podlá stanovenia RIA (priemer z troch stanovení). Pri vykonávaní týchto postupov bola použitá koncentrácia 1 x 10⁶ buniek v 5 ml prostredí pri použití platní s priemerom 60 mm. Po 24 hodinách bolo prostredie odstránené a nahradené 5 ml prostredia bez séra (DMEM s vysokou koncentráciou glukózy a 0,1 mM neesenciálnych aminokyselín a L-glutamínu). Po 48 hodinách bolo sledované nahromadenie EPO v prostredí bez séra. Prostredie bolo odobrané pre analýzu RIA a bunky boli podrobené pôsobeniu trypsínu a počítané. Priemerné hodnoty RIA boli 467 jednotiek/ml a 1352 jednotiek/ml, pre bunky, pestované pri koncentrácii 100 nM a 1 μΜ MTX boli hodnoty 2335 jednotiek/platňa a 6750 jednotiek/platňa. Priemerný počet buniek na platni bol 1,94 x 10⁶ a 3,12 x 10⁶. Účinnosť produkcie teda bola 1264 a 2167 jednotiek/10⁶ buniek za 48 hodín.A practical example of this amplification is the case in which the CHO cell strain pDSVL-MkE was subjected to increasing MTX concentrations (0 nM, 30 nM and 100 nM). After hours of exposure to each concentration, the cultures were monitored by RIA and the liquid material could be shown to contain 0.60, 2.45 and 6.10 units per ml. The CHO pDSVL-gHuEPO cell strain was then treated with increasing MTX concentrations of 30 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 1 μΜ, 5 μΜ MTX. After three days of culture, the liquid material from the culture was treated with 100 nM MTX of human EPO at a concentration of 3089 ± 129 units / ml as determined by RIA. For 48 hours, 100 nM and 1 μΜ MTX treated samples contained 466 and 1352 units / ml human EPO as determined by an RIA (average of three determinations). A concentration of 1 x 10 ⁶ cells in 5 ml medium was used using 60 mm diameter plates. After 24 hours, the medium was removed and replaced with 5 ml serum-free medium (DMEM with high glucose concentration and 0.1 mM non-essential amino acids and L-glutamine). After 48 hours, the accumulation of EPO in serum free environment was monitored. The medium was collected for RIA analysis and cells were trypsinized and counted. Mean RIA values were 467 units / ml and 1352 units / ml, for cells grown at 100 nM and 1 μΜ MTX, the values were 2335 units / plate and 6750 units / plate. The average number of cells per plate was 1.94 x 10 ⁶ and 3.12 x 10 ⁶ . Thus, production efficiency was 1264 and 2167 units / 10 ⁶ cells per 48 hours.

Bunky, obsiahnuté v hore uvedených kultúrach sú geneticky heterogénne populácie. Boli použité štandardné postupy na izoláciu geneticky homogénnych klonov s najvyššou produkčnou kapacitou. Tieto postupy sú uvedené v Points to Consider in the Characterization of Celí Lines used to Produce Biologics, Oddiel A, časť 2, 1. júna 1984, Office of Biologics Research Review, Center for Drugs and Biologics, U. S. Food and Drug Administration.The cells contained in the above cultures are genetically heterogeneous populations. Standard procedures were used to isolate genetically homogeneous clones with the highest production capacity. These procedures are outlined in the Characterization of Cell Lines used to Produce Biologics, Section A, Part 2, June 1, 1984, Office of Biologics Research Review, Center for Drugs and Biologics, U. S. Food and Drug Administration.

Produktivita bunkových línií EPO produkujúcich buniek CHO môže byť zlepšená príslušným zásahom do pestovaní kultúr. Pe- 59 stovanie cicavčích buniek v kultúre obyčajne vyžaduje prítomnosť séra v živnom prostredí. Spôsob produkcie buniek cicavcov v kultúre obyčajne vyžaduje prítomnosť séra v rastovom prostredí. Spôsob produkcie erytropoietínu z buniek CHO v prostre dí, ktoré sérum neobsahuje podstatne ulahčí izoláciu erytropoietínu z živného prostredia. Tento spôsob teda zaručuje hospodárne získavanie erytropoietínu v prostrediach, ktoré neobsa hujú sérum vo velkých množstvách.The productivity of the CHO-producing EPO cell lines can be improved by appropriately interfering with the cultivation of cultures. Cultivation of mammalian cells in culture usually requires the presence of serum in the culture medium. The method of producing mammalian cells in culture usually requires the presence of serum in the growth medium. A method for producing erythropoietin from CHO cells in a serum-free environment substantially facilitates the isolation of erythropoietin from the culture medium. Thus, this method ensures the economical recovery of erythropoietin in environments that do not contain large quantities of serum.

Bunky kmeňa CHO pDSVL-gHuEPO, pestované za štandardných podmienok sa použijú na naočkovanie baní, vhodných na priame odstredenie v prostredí, ktoré sa skladá zo zmesi 50 : 50 z prostredia DMEM s vysokým množstvom glukózy a z prostredia Hamova F12, doplneného 5 % fetálneho séra, L-glutamínom a tiež penicilínom, streptomycínom, 0,05 mM neesenciálnych aminokyselín a príslušnou koncentráciou metotrexátu. Pestovanie buniek v suspenzii dovoluje využiť velký objem buniek CHO, produkujúcich EPO. Bunky CHO, pestované v suspenzii sa potom použijú na naočkovanie väčších baní s objemom 850 ml a s objemom 200 ml prostredia. Bunky sa ponechajú rásť až do vzniku súvislej vrstvy vo forme k stene prilipnutej vrstvy počas troch dní. Prostredie, použité v tejto fáze je rovnaké ako prostredie, použité na rastu buniek v suspenzii. Na konci trojdenného obdobia rastu sa prostredie obsahujúce sérum odstráni a nahradí sa 100 ml prostredia, ktoré je bez séra. Ide o zmes 50 : 50 prostredie DMEM s vysokým obsahom glukózy a Hamovho prostredia F12, doplneného 0,05 nM neesenciálnych aminokyselín a glutamínu. Banky sa opäť vrátia do inkubačného zariadenia na 1 až 3 hodiny, prostredie sa opäť odstráni a nahradí sa 100 ml čerstvého prostredia, bez séra. Inkubácia s prostredím bez séra počas 1 až 3 hodín zníži koncentráciu kontaminujúcich sérových bielkovín. Potom sa banky opäť vrátia do inkubátoru na sedem dní, v tento čas sa hromadí erytropoietín v živnom prostredí, bez séra. Na konci sedemdenného obdobia sa prostredie odstráni a nahradí sa čerstvým prostredím, bez séra pre druhý produkčný cyklus. Po siedmich dňoch môže obsahovať takto získaná vzorka napríklad 3892 ± 409 jednotiek/ml ludského erytropoietínu podlá údajov RIA. Vzhladom na stanovenú hustotu buniek 0,9 až 1,8 x 10⁵ buniek v ml obsahuje každá banka 0,75 až 1,5 x 10⁸ buniek a produkcia EPO v 100 ml kultúry teda bola 750 až 1470 jednotiek/10⁶ buniek za 48 hodín.CHO pDSVL-gHuEPO cells grown under standard conditions are used to inoculate mines suitable for direct centrifugation in an environment consisting of a 50:50 mixture of DMEM with high glucose and Ham's F12 medium supplemented with 5% fetal serum, L-glutamine as well as penicillin, streptomycin, 0.05 mM non-essential amino acids and the appropriate concentration of methotrexate. Growing cells in suspension allows the use of a large volume of EPO-producing CHO cells. Suspended CHO cells are then used to inoculate larger 850 ml mines with 200 ml medium. The cells are allowed to grow until a continuous layer is formed in the form of a wall adhering layer for three days. The medium used in this phase is the same as that used to grow the cells in suspension. At the end of the three-day growth period, the serum-containing medium is removed and replaced with 100 ml of serum-free medium. It is a 50:50 mixture of DMEM with a high glucose content and Ham's F12 medium supplemented with 0.05 nM non-essential amino acids and glutamine. The flasks are returned to the incubation apparatus for 1 to 3 hours, the medium is removed again and replaced with 100 ml of fresh medium, serum-free. Incubation with serum-free media for 1 to 3 hours will reduce the concentration of contaminating serum proteins. The flasks are then returned to the incubator for seven days at which time erythropoietin accumulates in the culture medium, without serum. At the end of the seven-day period, the medium is removed and replaced with fresh medium, serum-free for the second production cycle. After seven days, the sample thus obtained may contain, for example, 3892 ± 409 units / ml human erythropoietin according to RIA data. Based on the determined cell density of 0.9 to 1.8 x 10 ⁵ cells per ml, each flask contains 0.75 to 1.5 x 10 ⁸ cells and thus EPO production in 100 ml culture was 750 to 1470 units / 10 ⁶ cells per ml. 48 hours.

Živné prostredie z pestovania bunkového kmeňa CHO pDSVLMkEPO v prítomnosti 10 nM MTX bolo podrobené RIA in vitro a bola sledovaná tiež účinnosť in vivo. Vzorka prostredia obsahoval 41,2 ± 1,4 jednotiek/ml MkEPO pri meraní RIA, 41,2 ± 0,064 jednotiek/ml pri meraní účinnosti in vitro a 42,5 ± 5 jednotiek/ml pri meraní biologickej účinnosti in vivo. Sledovanie polypeptidového reťazca produktov preukázalo prítomnosť látok typu EPO, šlo o látky s obsahom troch zvyškov signálneho sledu za aminoterminálnom zvyškom alanínu. Zatial nie je jasné, či ide o nesprávnu výrobu polypeptidu v membráne buniek CHO alebo o odraz rôznosti štruktúry aminoterminálneho zakončenia opičieho a ludského EPO.The culture medium from the cultivation of the CHO pDSVLMkEPO cell strain in the presence of 10 nM MTX was subjected to RIA in vitro and the in vivo efficacy was also monitored. The environmental sample contained 41.2 ± 1.4 units / ml MkEPO when measured by RIA, 41.2 ± 0.066 units / ml when measured in vitro and 42.5 ± 5 units / ml when measured in vivo biological activity. Monitoring of the polypeptide chain of the products showed the presence of EPO-type substances, containing three residues of the signal sequence after the amino-terminal residue of alanine. It is not yet clear whether it is a misproduction of the polypeptide in the CHO cell membrane or a reflection of the variation in the amino-terminal termination structure of monkey and human EPO.

Prostredí z pestovania kmeňa CHO pDSVL-gHuEPO bolo podrobené trom typom skúušek. Vzorka po pestovaní 5,5 dní obsahovala rekombinantný ludský EPO v prostredí v koncentrácii 18,2 jednotiek/ml pri stanovení RIA, 15,8 ± 4,6 jednotiek/ml pri stanovení in vitro a 16,8 ± 3,0 jednotiek/ml pri stanovení in vivo.The CHO pDSVL-gHuEPO culture medium was subjected to three types of assay. After 5.5 days, the sample contained recombinant human EPO at 18.2 units / ml in an RIA assay, 15.8 ± 4.6 units / ml in vitro, and 16.8 ± 3.0 units / ml in an in vivo assay.

Prostredí z pestovania buniek CHO pDSVL-gHuEPO s aplifikovaným génom po použití 100 nM MTX bolo tiež podrobené všetkým trom skúškam. Po pestovaní 3 dni obsahovala vzorka rekombinantný ludský EPO v koncentrácii 3089 ± 129 jednotiek/ml pri stanovení RIA, 2589 ± 71,5 jednotiek/ml pri stanovení in vitro a 2040 + 160 jednotiek/ml pri stanovení in vivo. Pri stanovení sledu aminokyselín bolo možno preukázať aminoterminální zakončení, znázornené v tabulke VI.Growth medium of pDSVL-gHuEPO gene-loaded CHO cells after using 100 nM MTX was also subjected to all three assays. After growing for 3 days, the sample contained recombinant human EPO at 3089 ± 129 units / ml in an RIA assay, 2589 ± 71.5 units / ml in an in vitro assay, and 2040 ± 160 units / ml in an in vivo assay. The amino-terminal termination shown in Table VI could be demonstrated in the amino acid sequence assay.

Prostredie z pestovaní buniek CHO po transfekcii plazmidom pDSVL-MkE v prítomnosti 10 nM MTX bolo zlité a MTX bol dialyzovaný niekoľko dní, čím bolo získané prostredie s koncentráciou EPO 221 ± 5,1 jednotiek/ml (EPO/CCM), aby bolo možné stanoviť účinnosť EPO/CCM in vivo na úroveň hematokritu pri normálnych myšiach Balc/C bol uskutočnený nasledujúci pokus: Prostredie z pestovania buniek CHO (CCM) a EPO-CCM bolo upravené pridaním PBS. CCM bol použitý pre kontrolnú skupinu troch myší a pre experimentálne skupiny (2 myši v skupine) boli použité dve koncentrácie, a to 4 jednotky a 44 jednotiek v jednej dávke. V priebehu 5 týždňov bola táto dávka podávaná myšiam 3x týždne intraperitoneálne. Po ôsmej injekcii bola priemerná hodnota hematokritu pre kontrolnú skupinu 50,4 %, pre skupinu s podávaním 4 jednotiek 55,1 % a pre skupinu s s podávaním 44 jednotiek 67,9 %.The medium from culturing CHO cells transfected with plasmid pDSVL-MkE in the presence of 10 nM MTX was decanted and MTX was dialyzed for several days to obtain an EPO concentration of 221 ± 5.1 units / ml (EPO / CCM) to determine The in vivo efficacy of EPO / CCM to hematocrit level in normal Balc / C mice was performed as follows: CHO cell culture (CCM) and EPO-CCM medium was adjusted by addition of PBS. CCM was used for a control group of three mice and two concentrations were used for the experimental groups (2 mice per group), 4 units and 44 units per dose. Within 5 weeks, this dose was administered to mice 3 times intraperitoneally. After the eighth injection, the mean hematocrit was 50.4% for the control group, 55.1% for the 4-dose group, and 67.9% for the 44-dose group.

Produkty expresie buniek cicavcov je možné ľahko izolovať v podstate v čistej forme z živného prostredia pri použití vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (C₄) a etanolového gradientu, s výhodou pri pH 7.Mammalian cell expression products can be readily isolated in substantially pure form from the culture medium using high pressure liquid chromatography (C ₄ ) and an ethanol gradient, preferably at pH 7.

Boli uskutočnené predbežné pokusy pre stanovenie vlastností rekombinantných glykoproteínových produktov z upraveného prostredia po expresii bunkami COS-1 a CHO ľudského génu pre EPO v porovnaní s izolátmi ľudského EPO z moča pri použití rôznych typov analýzy (SDS-PAGE). Tieto štúdie ukazujú, že EPO, produkovaný bunkami CHO má trocha vyššiu molekulovú hmotnosť ako produkt expresie bunkami COS-1, ktorý mal molekulu o voľačo väčšiu ako produkt, získaný z moča. Všetky produkty boli sčasti heterogénne. Po pôsobení enzýmu neuraminidázy na odstránenie kyseliny sialovej boli získané rekombinantné produkty expresie bunkami COS-1 a CHO s približne rovnakou molekulovou hmotnosťou, ktoré však mali väčšiu molekulovú hmotnosť ako asialoprodukt z ľudského moča. Pôsobením endoglykozidázyPreliminary experiments were performed to determine the properties of recombinant glycoprotein products from conditioned media after expression by COS-1 and CHO cells of the human EPO gene compared to human EPO isolates from urine using various types of analysis (SDS-PAGE). These studies show that the EPO produced by CHO cells has a slightly higher molecular weight than the product of expression by COS-1 cells, which had a molecule that is larger in size than the product obtained from urine. All products were partially heterogeneous. Recombinant expression products of COS-1 and CHO cells of approximately the same molecular weight but having a greater molecular weight than the asialoproduct from human urine were obtained after the neuraminidase enzyme was treated to remove sialic acid. Endoglycosidase treatment

F (EC 3.2.1) na rekombinantný produkt z buniek CHO a na produkt z moča (na úplné odstránenie uhlohydrätov z obidvoch produktov) bol získaný v podstate homogénny produkt v obidvoch prípadoch s identickou molekulovou hmotnosťou.F (EC 3.2.1) to the recombinant product from CHO cells and to the urine product (to completely remove carbohydrates from both products), a substantially homogeneous product was obtained in both cases with identical molecular weight.

Je tedy zrejmé, že glykoproteíny podlá vynálezu zodpovedajú svojou štruktúrou prírodné sa vyskytujúcemu erytropoietínu a majú tiež jednu alebo väčší počet jeho biologických vlastností pri zložení uhlohydrätov, ktoré je od prírodné sa vyskytujúceho erytropoietínu trocha odlišné.Thus, it is clear that the glycoproteins of the invention correspond in structure to the naturally occurring erythropoietin and also possess one or more of its biological properties in the carbohydrate composition, which is slightly different from the naturally occurring erythropoietin.

Príklad 11Example 11

Boli vykonávané pokusy s úplnou konštrukciou nukleotidových báz dvoch štrukturálnych génov, ktoré, ako je zrejmé z tabulky VI, sú kódom pre ludský EPO za súčasného včlenenia výhodných kodónov na expresiu v E. coli a na expresiu v kvasinkách S. cerevisiae. Na základe týchto stanovení je možné skonštruovať gény, ktoré sú kódmi pre analógy ludského EPO. Realizácia zodpovedala spôsobu, opísanému Altonom a ďalšími (WO 83/04053). Gény boli zostavené ako mnohopočetné dvojice, ktoré bolo možné rozdeliť do troch skupín. Tieto skupiny boli určené na amplifikáciu a bolo z nich možné zostaviť mnohonásobnou väzbou fragmentov vhodný vektor na expresiu.Attempts have been made to fully construct the nucleotide bases of the two structural genes, which, as shown in Table VI, encode human EPO while incorporating preferred codons for expression in E. coli and for expression in S. cerevisiae. Based on these assays, it is possible to construct genes that code for analogs of human EPO. The implementation was in accordance with the method described by Alton et al. (WO 83/04053). The genes were assembled as multiple pairs that could be divided into three groups. These groups were designed for amplification, and it was possible to construct a suitable expression vector by multiple fragment binding.

V nasledujúcich tabulkách VIII až XIV sú znázornené konštrukcie takto získaného génu, ktorý je kódom pre ludský EPO ako pre produkt translácie bez signálneho alebo predbežného sledu, avšak s počiatočným metionínovým zvyškom v polohe -1. Okrem toho sú do génu včlenené z podstatnej časti kodóny, ktoré sú preferenčné pre E. coli, preto bol tento gén nazvaný ECEPO.The following Tables VIII to XIV show the constructs of the gene thus obtained which encode human EPO as a translation product without a signal or preliminary sequence but with an initial methionine residue at the -1 position. In addition, codons that are preferential for E. coli are incorporated into the gene to a large extent, hence this gene was called ECEPO.

Tabulka VIIITable VIII

Oligonukleotidy ECEPO úsek 1ECEPO Oligonucleotides Region 1

1.First

2.Second

3.Third

Aoand

5.5th

6.6th

7.7th

8.8th

9.9th

10.10th

11.11th

12.12th

AATTCTAGAAACCATGAGGGTAATAAAATAAATTCTAGAAACCATGAGGGTAATAAAATA

CCATTATTTTATTACCCTCATGGTTTCTAGCCATTATTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG

ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGACATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC

CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAGCTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG

TCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTGTCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTG

CTTCCAGCAGGTAACGTTCCAGAACTCTTCCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT

GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATCGAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC

GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAGGTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG

ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTCACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC

CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCACAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA

TTTGAACGAAAACATTACGGTACCGTTTGAACGAAAACATTACGGTACCG

GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTTGATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT

Tabulka IX ECEPO úsek 1Table IX ECEPO section 1

XbalXbaI

Eco RII , 3Eco RII, 3

AATTCTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA TAflTGGCTCC GCCGCGTCTGAATTCTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA TAflTGGCTCC GCCGCGTCTG

GATC TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTÄČ^GAGG CGGCGCAGAC 4GATC TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTÄ ^ GAGG CGGCGCAGAC 4

ATCTGCGAck CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGfcAAG TAGACGCTGA GCTCjľCAAGA CCTTGCAATG GACGACCTTČjATCTGCGAck CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGfcAAG

TGAAAACÄTC IACCACTGGTT GTGCTGAACA CTGTTc(rTTG ACTTTTGTAG TGGŤGÄCCAA CACGACTTGT GACAAGAÄÄČ]TGAAAACÄTC IACCACTGGTT GTGCTGAACA CTGTTc (rTTG ACTTTTGTAG TGGTGÄCCAA CACGACTTGT GACAAGAÄÄČ]

CTAAAGAAGCCTAAAGAAGC

GATTľCTTCGGATTľCTTCG

AACGAAAACAAACGAAAACA

TTGCTTTTGTTTGCTTTTGT

KpnI BamHI TTACGGTACC G AATGCCATGG CCTAGKpnI BamHI TTACGGTACC G AATGCCATGG CCTAG

Tabulka XTable X

Oligonukleotidy ECEPO úsek 2Oligonucleotides ECEPO region 2

1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT

2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG

3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT

4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA

5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT

6. CCAAACTJCAACTGCTTGTTGACCAAC6. CCAAACTJCAACTGCTTGTTGACCAAC

7. ' TTGGCAGGGTCTGGCACTGCTGAGCG7. 'TTGGCAGGGTCTGGCACTGCTGAGCG

8. GCCTCGCTCAGCAGTGCCAGACCCTG8. GCCTCGCTCAGCAGTGCCAGACCCTG

9. - AGGCTGTACTGCGTGGCCAGGCA9. - AGGCTGTACTGCGTGGCCAGGCA

10. GCAGTGCCTGGCCACGCAGTACA10. GCAGTGCCTGGCCACGCAGTACA

11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT

12. TTCCCACGGCTGAGAGGAGTTTACCA12. TTCCCACGGCTGAGAGGAGTTTACCA

13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTTGAC13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTTGAC

14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG

15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG

16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT

Tabuíka XI ECEPO úsek 2Table XI ECEPO section 2

EcoRI KpnI 1, , 3 . pTATTCGGTACC AGACACCAAG GTfTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAAEcoRI KpnI 1, 3. pTATTCGGTACC AGACACCAAG GTfTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA

GCCATGG TCTGTGGTTC CAÄŤŤGjQAGA TGCGAACCTT TGCATACČTŤ]GCCATGG TCTGTGGTTC CAČŤGjQAGA TGCGAACCTT TGCATACČŤ]

GTTGGTCAACGTTGGTCAAC

CAACCAGTTGCAACCAGTTG

AAGCAGTTGA AGTtľTGGCAG GGTCTGGCAC TTCGTCAACT TCAAÄÍCtTG CCAGACCGTGAAGCAGTTGA AGTtTGGCAG GGTCTGGCAC TTCGTCAACT TCAAÄÍCtTG CCAGACCGTG

TGCTGAGCGfcTGCTGAGCGfc

ACGACTCGCTACGACTCGCT

GGCTGTACTGGGCTGTACTG

UČGjACATGAC'UČGjACATGAC '

CGTGGCCAGGCGTGGCCAGG

GCACCGGTCCGCACCGGTCC

CAÍ3TGCTGGT gtgäčg|accaCAÍ3TGCTGGT accg

AAACTCCTCTAAACTCCTCT

TTTGAGGAGATTTGAGGAGA

CAGCCGTfcGGCAGCCGTfcGG

GTCGGCACÚČ . 15 BglU BamHIGTCGGCACÚČ. 15 BglU BamHI

AACCGCTGCA GCTGCATGTT GACftAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTG TljGGCGACGT CGACGTACAA CTGTTTCGjľC ATAGACCGGA CTCTAGACCTACAACCGCTGCA GCTGCATGTT GACftAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTG TljGGCGACGT CGACGTACAA CTGTTTCGJC ATAGACCGGA CTCTAGACCTAC

Tabulka XII ECEPO úsek 3Table XII ECEPO section 3

1.First

2.Second

3.Third

4.4th

5.5th

6.6th

7.7th

8.8th

9.9th

10.10th

11.11th

12.12th

13.13th

14.14th

15.15th

16.16th

GATCCAGATCTCTGACTACTCTGC iGATCCAGATCTCTGACTACTCTGC i

ACGCAGCAGAGTAGTCAGAGATCTGACGCAGCAGAGTAGTCAGAGATCTG

TGCGTGCTCTGGGTGCACAGAAAGAGGTGCGTGCTCTGGGTGCACAGAAAGAGG

GATAGCCTCTTTCTGTGCACCCAGAGCGATAGCCTCTTTCTGTGCACCCAGAGC

CTATCTCTCCGCCGGATGCTGCATCTCTATCTCTCCGCCGGATGCTGCATCT

CAGCAGATGCAGCATCCGGCGGAGACAGCAGATGCAGCATCCGGCGGAGA

GCTGCACCGCTGCGTACCATCACTGGCTGCACCGCTGCGTACCATCACTG

ATCAGCAGTGATGGTACGCAGCGGTGATCAGCAGTGATGGTACGCAGCGGTG

CTGATACCTTCCGCAAACTGTTTCGCTGATACCTTCCGCAAACTGTTTCG

ATACACGAAACAGTTTGCGGAAGGTATACACGAAACAGTTTGCGGAAGGT

TGTATACTCTAACTTCCTGCGTGGTATGTATACTCTAACTTCCTGCGTGGTA

CAGTTTACCACGCAGGAAGTTAGAGTCAGTTTACCACGCAGGAAGTTAGAGT

AACTGAAACTGTATACTGGCGAAGCAACTGAAACTGTATACTGGCGAAGC

GGCATGCTTCGCCAGTATACAGTTTGGCATGCTTCGCCAGTATACAGTTT

ATGCCGTACTGGTGACCGCTAATAGATGCCGTACTGGTGACCGCTAATAG

TCGACTATTAGCGGTCACCAGTACTCGACTATTAGCGGTCACCAGTAC

- 67 Tabulka XIII ECEPO úsek 3- 67 Table XIII ECEPO section 3

BamHX BglII GA TCCAGATCTCTGBamHX BglII GA TCCAGATCTCTG

GTCTAGAGACGTCTAGAGAC

ACTACTCTGC IľGCGTGCTCT TGATGAGACG ACGCA^GAGAACTACTCTGC IIIGCGTGCTCT TGATGAGACG ACGCA ^ GAGA

GGGTGCACAGGGGTGCACAG

CCCACGTGTC aaagaggI:ta tctctccgccCCCACGTGTC aaagaggI: ta tctctccgcc

TTTCTCCGAT ÁGjAGAGGCGGTTTCTCCGAT ÁGjAGAGGCGG

GGATGCTGCA TCľbcTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTC^T GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGÄČfíTG GCGACGCATG GTAGTGACGA CT^TGGAAGGGGATGCTGCA TC1bcTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTC ^ T GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGÄČfíTG GCGACGCATG GTAGTGACGA CT ^ TGGAAGG

88

II , 13 GCAAACTGTT TCG^GTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAJA ACTGAAAČTG CGTTTGACAA AGCACATA|ľG AGATTGAAGG ACGCACCATT TGACfľTTGACII, 13 GCAAACTGTT TCG ^ GTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAJA ACTGAAAČTG CGTTTGACAA AGCACATA |

1212

SaliSali

TATACTGGCG AAGCfrTGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG ATATGACCGC TTCGTACGGjC ATGACCACTG GCGATTATC AGCT ^Ί 16TATACTGGCG AAGCfrTGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG ATATGACCGC TTCGTACGGjC ATGACCACTG GCGATTATC AGCT ^Ί 16

Tabuíka ΧΓ7 Gen ECEPO Table ΧΓ7 ECEPO gene - - • • Xbal cTag XbaI CTAG AAACCATGAG AAACCATGAG GGTAATAAAA GGTAATAAAA -1 1 MetAla TAATGGCTCC -1 1 MetAla TAATGGCTCC GCCGCGTCTG GCCGCGTCTG TTTGGTACTC TTTGGTACTC CCATTATTTT CCATTATTTT ATTACCGAGG ATTACCGAGG CGGCGCAGAC CGGCGCAGAC ATCTGCGACT ATCTGCGACT CGAGAGTTCT CGAGAGTTCT GGAACGTTAC GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC CTAAAGAAGC TAGACGCTGA TAGACGCTGA GCTCTCAAGA GCTCTCAAGA CCTTGCAATG CCTTGCAATG GACGACCTTC GACGACCTTC GATTTCTTCG GATTTCTTCG TGAAAACATC TGAAAACATC ACCACTGGTT ACCACTGGTT GTGCTGAACA GTGCTGAACA CTGTTCTTTG CTGTTCTTTG AACGAAAACA AACGAAAACA ACTTTTGTAG ACTTTTGTAG TGGTGACCAA TGGTGACCAA CACGACTTGT CACGACTTGT GACAAGAAAC GACAAGAAAC TTGCTTTTGT TTGCTTTTGT TTACGGTACC TTACGGTACC AGACACCAAG AGACACCAAG GTTAACTTCT GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGCTTGGAA ACGTATGGAA ACGTATGGAA AATGCCATGG AATGCCATGG TCTGTGGTTC TCTGTGGTTC CAATTGAAGA CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCGAACCTT TGCATACCTT TGCATACCTT GTTGGTCAAC GTTGGTCAAC AAGCAGTTGA AAGCAGTTGA AGTTTGGCAG AGTTTGGCAG GGTCTGGCAC GGTCTGGCAC TGCTGAGCGA TGCTGAGCGA CAACCAGTTG CAACCAGTTG TTCGTCAACT TTCGTCAACT TCAAACCGTC TCAAACCGTC CCAGACCGTG CCAGACCGTG ACGACTCGCľ ACGACTCGCľ GGCTGTACTG GGCTGTACTG CGTGGCCAGG CGTGGCCAGG CACTGCTGGT CACTGCTGGT AAAČTCCTCT AAAČTCCTCT CAGCCGTGGG CAGCCGTGGG CCGACATGAC CCGACATGAC GCACCGGTCC GCACCGGTCC GTGACGACCA GTGACGACCA TTTGAGGAGA TTTGAGGAGA GTCGGCAGCC GTCGGCAGCC AACCGCTGCA AACCGCTGCA GCTGCATGTT GCTGCATGTT GACAAAGCAG GACAAAGCAG TATCTGGCCT TATCTGGCCT GAGATCTCTG GAGATCTCTG TTGGCGACGT TTGGCGACGT CGACGTACAA CGACGTACAA CTGTTTCGTC CTGTTTCGTC ATAGACCGGA ATAGACCGGA CTCTAGAGAC CTCTAGAGAC ACTACTCTGC ACTACTCTGC TGCGTGCTCT TGCGTGCTCT GGGTGCACAG GGGTGCACAG AAAGAGGCTA AAAGAGGCTA TCTCTCCGCC TCTCTCCGCC TGATGAGACG TGATGAGACG ACGCACGAGA ACGCACGAGA CCCACGTGTC CCCACGTGTC TTTCTCCGAT TTTCTCCGAT AGAGAGGCGG AGAGAGGCGG GGATGCTGCA GGATGCTGCA TCTGCTGCAC TCTGCTGCAC CGCTGCGTAC CGCTGCGTAC CATCACTGCT CATCACTGCT GATACCTTCC GATACCTTCC CCTACGACGT CCTACGACGT AGACGACGTG AGACGACGTG GCGACGCATG GCGACGCATG GTAGTGACGA GTAGTGACGA CTATGGAAGG CTATGGAAGG GCAAACTGTT GCAAACTGTT TCGTGTATAC TCGTGTATAC TCTAACTTCC TCTAACTTCC TGCGTGGTAA TGCGTGGTAA ACTGAAACTG ACTGAAACTG CGTTTGACAA CGTTTGACAA AGCACATATG AGCACATATG AGATTGAAGG AGATTGAAGG ACGCACCATľ ACGCACCATľ TGACTTTGAC TGACTTTGAC TATACTGGCG TATACTGGCG AAGCATGCCG AAGCATGCCG TACTGGTGAC TACTGGTGAC Si CGCTAATAG Are you CGCTAATAG all all ATATGACCGC ATATGACCGC TTCGTACGGC TTCGTACGGC ATGACCACTG ATGACCACTG GCGATTATCA GCGATTATCA GCT GCT

V tabulke VIII sú znázornené oligonukleotidy, použité na výstavbu úseku 1 génov ECEPO, ide o kód aminoterminálnych zvyškov ludského polypeptidu. Oligonukleotidy boli zostavené ako dvojice, tzn. 1 a 2, 3 a 4, atď. a tieto dvojice potom boli naviazané za vzniku úseku 1 génu ECEPO, ako je to zrejmé z tabulky IX. Je nutné upozorniť na to, že tento úsek obsahuje miesta po štiepení enzýmami EcoRI a BamHI, potom smerom dolu od zakončenia po pôsobení EcoRI sa nachádza miesto po pôsobení enzýmu Xbal a smerom hore od miesta pre pôsobenie enzýmu BamHI sa nachádzajú miesta pre pôsobenie enzýmu KpnI. Úsek I je možné lahko podrobiť amplifikácii pri použití fágu M13 ako vektoru na overenie sledu. Niektoré obťaže boli spojené s izoláciou tohto úseku ako fragmentu po pôsobení enzýmov XBal/KpnI z DNA, vzniknuté v E. coli, príčinou bola patrne metylácia miesta po pôsobení enzýmu KpnI v hostiteľovi. Z tohto dôvodu bola izolovaná DNA fágu s jednoduchým reťazcom a bola potom in vitro zmenená na DNA s dvojitým reťazcom, potom bol izolovaný požadovaný fragment s dvojitým reťazcom.Table VIII shows the oligonucleotides used to construct region 1 of the ECEPO genes, which is the code for the amino-terminal residues of the human polypeptide. Oligonucleotides were assembled as pairs, i. 1 and 2, 3 and 4, etc. and these pairs were then coupled to form region 1 of the ECEPO gene, as shown in Table IX. Note that this region contains EcoRI and BamHI digestion sites, then downstream from the EcoRI treatment site is an XbaI site, and upstream of the BamHI site an KpnI site is located. Section I can easily be amplified using M13 phage as a sequence verification vector. Some difficulties have been associated with the isolation of this region as a fragment after treatment with XBal / KpnI enzymes from E. coli DNA, possibly due to methylation of the KpnI site in the host. For this reason, the DNA of the single-stranded phage was isolated and then changed in vitro to double-stranded DNA, then the desired double-stranded fragment was isolated.

Gény ECEPO, úseky 2 a 3 tak, ak sú znázornené v tabulkách XI a XIII, boli konštruované obdobným spôsobom z oligonukleotidov, uvedených v tabulkách X a XII. Každá sekcia bola podrobená amplifikácii vo vektore M13 na overenie sledu a potom bola izolovaná z DNA-fágu. Ako je zrejmé z tabulky XI, úsek 2 ECEPO bol konštruovaný s miestami po pôsobení enzýmov EcoRI a BamHI s možnosťou opätovnej väzby a mohol byt izolovaný ako fragment po pôsobení KpnI/BglII. Obdobne úsek 3 ECEPO bol pripravený s miestami po pôsobení BamHI a Sali, schopnými opätovnej väzby na konci a mohol byt izolovaný z DNA fágu ako fragment BglII/ Sali. Takto získané 3 úseky je možné lahko spojiť na kontinuálny sled DNA tak, ak je to znázornené v tabulke XIV, ktorý je kódom pre celý ludský polypeptid EPO s aminoterminálnym kodónom pre metionxn (ATG) pre počiatok translácie v E. coli. Je nutné tiež upozorniť na to, že smerom hore od počiatočného kodónu ATG sa nachádza skupina párov báz, ktorá v podstate opakuje sled pre väzbu ribozómu pri expresii génu OMP-f E. coli.The ECEPO genes, Sections 2 and 3, as shown in Tables XI and XIII, were constructed in a similar manner from the oligonucleotides listed in Tables X and XII. Each section was amplified in an M13 vector to verify the sequence and then isolated from DNA phage. As shown in Table XI, ECEPO region 2 was constructed with EcoRI and BamHI digestion sites and could be isolated as a KpnI / BglII-treated fragment. Similarly, ECEPO region 3 was prepared with BamHI and SalI-treated sites capable of reclosing at the end and could be isolated from phage DNA as a BglII / SalI fragment. The 3 regions thus obtained can be readily linked to a continuous DNA sequence as shown in Table XIV, which encodes the entire human EPO polypeptide with an amino terminal methionine (ATG) codon for translation initiation in E. coli. It should also be noted that upstream of the ATG start codon, there is a base pair that essentially repeats the ribosome binding sequence in the expression of the E. coli OMP-f gene.

Ako nosný vektor pre ECEPO je možné použiť akýkolvek vhodný vektor na dosiahnutie expresie. Vektorom, zvoleným na tento účel bol na teplotu citlivý plazmid pCFM536, čo je derivát plazmidu pCFM414 (ATCC 40076), ktorý bol opísaný v US patentovej prihláške č. 636 727, podanej 6. augusta 1984 (Charles F. Morris). Gén pCFM536 bol potom rozštiepený enzýmami Xbal a HindlII. Velký fragment bol izolovaný a použitý na väzbu s génom ECEPO. Úseky 1 (Xbal/KpnI), 2 (KpnI/BglII) a 3 (BglII/Sall) boli vopred zaradené v správnom poradí v M13 a gén pre EPO,bol potom izolovaný ako jediný fragment (Xbal/ HindlII). Tento fragment obsahoval časť väzného reťazca z fágu M13 mp9 medzi miestami pre pôsobenie enzýmov Sali až HindlII. Pri overení expresie výsledného plazmidu p536 bol použitý promotor lambda P_L, ktorý samotný môže byt podriadený represorického génu Cj₈^₇ tak, ako sa nachádza v kmeni E. coli K12^Htrp.Any suitable vector for expression can be used as a carrier vector for ECEPO. The vector selected for this purpose was the temperature-sensitive plasmid pCFM536, which is a derivative of the plasmid pCFM414 (ATCC 40076), which has been described in U.S. Patent Application Ser. No. 636,727, filed Aug. 6, 1984 (Charles F. Morris). The pCFM536 gene was then digested with XbaI and HindIII. The large fragment was isolated and used for binding to the ECEPO gene. Sections 1 (XbaI / KpnI), 2 (KpnI / BglII), and 3 (BglII / SalI) were preceded in the correct order in M13 and the EPO gene was then isolated as a single fragment (XbaI / HindIII). This fragment contained a portion of the binding chain from phage M13 mp9 between the SalI to HindIII sites. To verify expression of the plasmid P536 was used promoter, the lambda P _L, which itself may be subject to repressor gene C ₈ & ₇ as is the E. coli strain K12 ^ HTRP.

Hore získaný gén pre ECEPO je potom možné rôznym spôsobom modifikovať, čím sa získajú kódy pre analógy erytropoietínu, napríklad [Asn², des-Pro² až Ile⁶]hEPO a [His^JhEPO, ako už bolo uvedené.The above-mentioned ECEPO gene can then be modified in various ways to obtain codes for erythropoietin analogs, for example, [Asn ² , des-Pro ² to Ile ⁶ ] hEPO and [His 1 JhEPO], as mentioned above.

A. [Asn², des-Pro² až Ilé⁶]hEPOA. [Asn ² , des-Pro ² to Ile ⁶ ] hEPO

Plazmid 536, ktorý nesie skonštruovaný gén ECEPO z tabulky XIV ako včlenený úsek, zakončený miestami pre pôsobenie Xbal a HindlII bol rozštiepený enzýmami HindlII a Xhol. Druhá z uvedených endonukleáz štiepi uvedený gén v mieste, ktoré sa nachádza 6 párov báz od kodónu, ktorý je kódom pre Asp⁸ až Arg¹⁰. Potom bol produkovaný väzný reťazec Xbal/Xhola nasledujúcim sledom:Plasmid 536, which carries the engineered ECEPO gene of Table XIV as an inserted region, terminated with the XbaI and HindIII sites, was digested with HindIII and XhoI. The other endonuclease cleaves said gene at a site 6 bp away from the codon encoding Asp ⁸ to Arg ¹⁰ . The XbaI / Xhola binding chain was then produced in the following sequence:

+1 +1 2 2 7 7 8 8 9 9 Xbal XbaI Met Met Ala Ala Asn same time Cys Cys Asp Asp Xhol XhoI 5'-CTAG 5'-CTAG ATG ATG GCT GCT AAT AAT TGC TGC GAC-3 GAC-3 1 1 3' - 3 '- TAC TAC CGA CGA TTA TTA ACG ACG CTG CTG AGCT-5' AGCT-5 '

Väzný reťazec Xbal/Xhol a fragment so sledom génu ECEPO Xhol/HindlII sa včlení do velkého fragmentu, ktorý vznikne tak, že sa pomocou enzýmov Xbal a Hindlll rozštiepi plazmid pCFM526, čo je derivát plazmidu pCFM414 (ATCC 40076) tak, ako bol opísaný v US patentovej prihláške č. 636 727, podanej 6. srpna 1984 (Charles F. Morris), čím sa získa sled DNA, ktorý je kódom pre Met^-1 formu požadovaného analógu pri expresii v E. coli.The XbaI / XhoI binding chain and the ECEPO XhoI / HindIII gene sequence fragment were inserted into a large fragment resulting from the digestion of plasmid pCFM526, a derivative of plasmid pCFM414 (ATCC 40076), using the XbaI and HindIII enzymes, as described in U.S. Pat. No. 636,727, filed Aug. 6, 1984 (Charles F. Morris) to obtain a DNA sequence that encodes the Met- ¹ form of the desired analog when expressed in E. coli.

B. [His⁷]hEPOB. [His ⁷ ] hEPO

Plazmid 536 bol rozštiepený enzýmami Hindlll a Xhol ako v odseku A. Väzný reťazec Xbal/Xhol bol skonštruovaný s nasledujúcim sledom:Plasmid 536 was digested with HindIII and XhoI as in paragraph A. The XbaI / XhoI chain was constructed with the following sequence:

+1 +1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 9 8 9 Xbal XbaI Met Met Ala Ala Pro for Pro for Arg Arg Leu Leu íle Ile His His Asp Xhol Asp Xhol 5'-CTAG - 5'-CTAG ATG ATG GCT GCT CCG CCG CCA CCA CGT CGT CTG CTG ATC ATC CAT CAT GAC-3' GAC-3 ' 3 ’- 3 ’- TAC TAC CGA CGA GGC GGC GGT GGT GCA GCA GAC GAC TAG TAG GTA GTA CTG AGCT-5' CTG AGCT-5 '

Väzný reťazec a fragment ECEPO (Xhol/HindlII bol potom včlenený do plazmidu pCFM526, čím bol získaný sled DNA, nesený plazmidom, ktorý je kódom pre Met“¹ formu požadovaného analógu pri expresii v E. coli.A chain monovalent fragment ECEP (XhoI / HindIII, was then incorporated into a plasmid pCFM526 to obtain the DNA sequence carried by the plasmid coding for Met ^"1 form the desired analog when expressed in E.

Konštrukcia génu SCEPO, ktorý má v sebe včlenené kodóny, ulahčujúce expresiu v kvasinkách, je opísaná v nasledujúcich tabulkách XV až XXI. Rovnako ako v prípade génu ECEPO, zahŕňa v sebe celá konštrukcia tvorbu troch skupín oligonukleotidov tak, ako sú uvedené v nasledujúcich tabulkách XV, XVII a XIX, ide o dvojice báz, ktoré sú potom usporiadané do úsekov, ktoré sú znázornené na tabuľkách XVI, XVIII a XX, je nutno uviesť, že syntézu je možné čiastočne ulahčit tak, že sa použijú niektoré suboptimálne kodóny pri konštrukcii SCEPO i ECEPO, tzn. v prípade obidvoch génov sú identické oligonukleotidy 7 až 12 v úseku 1 a tiež v úseku 2 sú totožné v obidvoch génoch oligonukleotidy 1 až 6.The construction of the SCEPO gene, which incorporates codons that facilitate expression in yeast, is described in the following Tables XV to XXI. As in the case of the ECEPO gene, the entire construct involves the formation of three groups of oligonucleotides as shown in Tables XV, XVII and XIX below, which are base pairs which are then arranged into sections as shown in Tables XVI, XVIII and XX, it should be noted that the synthesis may be partially facilitated by the use of some suboptimal codons in both SCEPO and ECEPO construction, i. in the case of both genes, identical oligonucleotides 7 to 12 in region 1 are identical, and also in region 2, oligonucleotides 1 to 6 are identical in both genes.

Tabulka XVTable XV

Oligonukleotidy SCEPO úsek 1Oligonucleotides SCEPO region 1

1. AATTCAAGCTTGGATAAAAGAGCT1. AATTCAAGCTTGGATAAAAGAGCT

2. GTGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG2. GTGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG

3. CCACCAAGATTGATCTGTGACTC3. CCACCAAGATTGATCTGTGACTC

4. TCTCGAGTCACAGATCAATCTTG4. TCTCGAGTCACAGATCAATCTTG

5. GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTTG5. GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTTG

6. CTTCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC6. CTTCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC

7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC

8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG

9. ¹ ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC9. ¹ ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC

10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA

11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG

12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT i12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT i

Tabulka XVITable XVI

SCEPO úsek 1SCEPO section 1

EcoRI Hindlll 1 AATTCA AGCTTGGATAEcoRI HindIII 1 AATTCA AGCTTGGATA

GT TCGAACCTAT 2GT TCGAACCTAT 2

AAAGAGCTfcc ACCAAGATTG ATCTGTGACT cfcAGAGTTTT TTTCTCGAGG TG^TTCTAAC TAGACACTGA GCTČŤJCAAAA , 7AAAGAGCTfcc ACCAAGATTG ATCTGTGACT cfcAGAGTTTT TTTCTCGAGG TG ^ TTCTAAC TAGACACTGA GCTCJCAAAA, 7

GGAAAGATAC TTGTTGpAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC ftCCACTGGTTGGAAAGATAC TTGTTGpAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC ftCCACTGGTT

CCTTTCTATG AACAACtľTTČ] GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGT'tyCCAA _| 11 Kpnl BamHICCTTTCTATG AACAACtľTTČ] GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGT'tyCCAA _| 11 Kpnl BamHI

GTGCTGAACA CTGTTCjTTTG AACGAAAACA TTACGGTACC GGTGCTGAACA CTGTTCjTTTG AACGAAAACA TTACGGTACC G

CACGACTTGT GACAAGAÄAČl TTGCTTTTGT AATGCCATGG CCTAGCACGACTTGT GACAAGAÄAl TTGCTTTTGT AATGCCATGG CCTAG

Tabuľka XVIITable XVII

Oligonukleotidy SCEPO úsek 2Oligonucleotides SCEPO region 2

1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT

2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG

3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT

4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA

5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT

6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC

7. < TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATCTG7. <TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATCTG

8. GCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG8. GCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG

9. AAGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCCT9. AAGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCCT

10. AACAAGGCTTGACCTCTCAAAACA10. AACAAGGCTTGACCTCTCAAAACA

11. TGTTGGTTAACTCTTCTCAACCÄTGGG11. TGTTGGTTAACTCTTCTCAACCÄTGGG

12. TGGTTCCCATGGTTGAGAAGAGTTAACC12. TGGTTCCCATGGTTGAGAAGAGTTAACC

13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT

14. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA14. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA

15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG

16. GATCCAGATCTCAAACCAGAGACGG16. GATCCAGATCTCAAACCAGAGACGG

- 75 TabuJka XVIII SCEPO úsek 2- 75 TABLE XVIII SCEPO section 2

KpnIKpnI

EcoRI 1EcoRI 1

TTÄTTCGGTffCC AGACACCAAG GCCATGG TCTGTGGTTCTTÄTTCGGTffCC AGACACCAAG GCCATGG TCTGTGGTTC

GTkAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTAThGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA CAAŤTGhAGA TGCGAACCTT TGCATACČTŤÍ CAACCAGTTG TTCGACAACT . 6 agtJttggcaaGTkAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTAThGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA CAAŤTGhAGA TGCGAACCTT TGCATACCT CAACCAGTTG TTCGACAACT. 6 agtJttggcaa

TCAAÄČC|jTTTCAAÄČC | JTT

GGTTTGGCCTGGTTTGGCCT

CCAAACCGGACCAAACCGGA

TGTTATCTGA AGCTGTTTTG AGAGGTCAAG ACAATAGACT TCGhCAAAAC TCTCCAGTTC cctItgttggtTGTTATCTGA AGCTGTTTTG AGAGGTCAAG ACAATAGACT TCGhCAAAAC TCTCCAGTTC cctItgttggt

GGAÄČÄ/^CA , 13GGAÄÄÄ / ^ CA, 13

TAACTCTTCT CAACCATGGG pACCATTGCA ATTGCACGTC ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGTjAACGľ TAACGTGCAG ’ 14TAACTCTTCT CAACCATGGG pACCATTGCA ATTGCACGTC ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGTjAACG 'TAACGTGCAG' 14

GAThAAGCCGGAThAAGCCG

CTATŤŤČpGCCTATŤŤČpGC

TCTCTGGTTTTCTCTGGTTT

AGAGACCAAAAGAGACCAAA

BglII BamHI GAGATCTG CTCTAGACCTA GBglII BamHI GAGATCTG CTCTAGACCTA G

Tabuíka XIXTable XIX

Oliganukíeotidy SCEPO úsek 3Oliganucide SCEPO section 3

1. GATCCAGATCTTTGACTACTTTGTT1. GATCCAGATCTTTGACTACTTTGTT

2. TCTCAACAAAGTAGTCAAAGATCTG2. TCTCAACAAAGTAGTCAAAGATCTG

3. GAGAGCTTTGGGTGCTCAAAAGGAAG3. GAGAGCTTTGGGTGCTCAAAAGGAAG

4. ATGGCTTCCTTTTGAGCACCCAAAGC4. ATGGCTTCCTTTTGAGCACCCAAAGC

5. CCATTTCCCCACCAGACGCTGCTT5. CCATTTCCCCACCAGACGCTGCTT

6. GCAGAAGCAGCGTCTGGTGGGGAA6. GCAGAAGCAGCGTCTGGTGGGGAA

7. CTGCCGCTCCATTGAGAACCATC7. CTGCCGCTCCATTGAGAACCATC

8. ! CAGTGATGGTTCTCAATGGAGCG8.! CAGTGATGGTTCTCAATGGAGCG

9. ACTGCTGATACCTTCAGAAAGTT9. ACTGCTGATACCTTCAGAAAGTT

10. GAATAACTTTCTGAAGGTATCAG10. GAATAACTTTCTGAAGGTATCAG

11. ATTCAGAGTTTACTCCAACTTCT11. ATTCAGAGTTTACTCCAACTTCT

12. CTCAAGAAGTTGGAGTAAACTCT12. CTCAAGAAGTTGGAGTAAACTCT

13. TGAGAGGTAAATTGAAGTTGTACAC13. TGAGAGGTAAATTGAAGTTGTACAC

14. ACCGGTGTACAACTTCAATTTACCT14. ACCGGTGTACAACTTCAATTTACCT

15. CGGTGAAGCCTGTAGAACTGGT15. CGGTGAAGCCTGTAGAACTGGT

16. CTGTCACCAGTTCTACAGGCTTC16. CTGTCACCAGTTCTACAGGCTTC

17. GACAGATAAGCCCGACTGATAA17. GACAGATAAGCCCGACTGATAA

18. GTTGTTATCAGTCGGGCTTAT18. GTTGTTATCAGTCGGGCTTAT

19. CAACAGTGTAGATGTAACAAAG19. CAACAGTGTAGATGTAACAAAG

20. TCGACTTTGTTACATCTACACT20. TCGACTTTGTTACATCTACACT

Tabuťká XX SCEPO úsek 3Tables XX SCEPO section 3

BamHI BqIII 1^BamHI BqIII 1 ^

GATC CAGATCTTTG ACTACTTTGT TGAGAGCTTT GTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCT^GAAAGATC CAGATCTTTG ACTACTTTGT TGAGAGCTTT GTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCT ^ GAAA

55

GGGTGCTCAA AAGGAAGfcCA TTTCCCČACC AGACGCTGCT CCCACGAGTT TTCCTTCGČt tyAGGGGTGG TCTGCGACGAGGGTGCTCAA AAGGAAGfcCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT CCCACGAGTT TTCCTTCGt tyAGGGGTGG TCTGCGACGA

66

TCTGCCGCTCTCTGCCGCTC

AÍÄCTľGCGAGAÍÄCTľGCGAG

11

CATTGAGAAC CATCf\CTGCT GATACCTTCA GTAACTCTTG GTAGTGÄČfcA CTATGGAAGT ' 10CATTGAGAAC CATCf \ CTGCT GATACCTTCA GTAACTCTTG GTAGTGÄČfcA CTATGGAAGT '10

GAAAGTThľTGAAAGTThľT

CTTTCAATÄÄCTTTCAATÄÄ

TCCAACTTCT IíGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACfcGGTG AGGTTGAAGA AČTČ|ľCCATT TAACTTCAAC ATGTGGČČÄJ:TCCAACTTCT IAGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACfcGGTG AGGTTGAAGA ACCT |

1919

AACTGGTfcAC AGATAAGCCC GACTGATAAp AACAGTGTAG TTGACCAClG fČjľATTCGGG CTGACTATTG TTGpTACATC iiAACTGGTfcAC AGATAAGCCC GACTGATAAp AACAGTGTAG TTGACCACIG fJjATTCGGG CTGACTATTG TTGpTACATC ii

CAGAGTTTACCAGAGTTTAC

GÍTCTCAAATGGÍTCTCAAATG

AAGCCTGTAGAAGCCTGTAG

TTCGGACATCTTCGGACATC

SaliSali

ATGTAACAAA G TACATTGTTT CAGCTATGTAACAAA G TACATTGTTT CAGCT

Tabuľka XXITable XXI

Gen SCEPOGen SCEPO

-1 +1-1 +1

Hindlll ArgAlaHindlll ArgAla

ÄSUTtggata aaagagctcc accaagattg atctgtgact cgagagttttÄSUTtggata aaagagctcc accaagattg atctgtgact cgagagtttt

ACCTAT TTTCTCGAGG TGGTTCTAAC TAGACACTGA GCTCTCAAAAACCTAT TTTCTCGAGG TGGTTCTAAC TAGACACTGA GCTCTCAAAA

GGAAAGATAC TTGTTGGAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC ACCACTGGTT CCTTTCTATG AACAACCTTC GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGTGACCAAGGAAAGATAC TTGTTGGAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC ACCACTGGTT CCTTTCTATG AACAACCTTC GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGTGACCAA

GTGCTGAACA CTGTTCTTTG AACGAAAACA TTACGGTACC AGACACCAAG CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT AATGCCATGG TCTGTGGTTCGTGCTGAACA CTGTTCTTTG AACGAAAACA TTACGGTACC AGACACCAAG CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT AATGCCATGG TCTGTGGTTC

GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTT CAACCAGTTG TTCGACAACTGTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTT CAACCAGTTG TTCGACAACT

AGTTTGGCAA GGTTTGGCCT TGTTATCTGA AGCTGTTTTG AGAGGTCAAG TCAAACCGTT CCAAACCGGA ACAATAGACT TCGACAAAAC TCTCCAGTTCAGTTTGGCAA GGTTTGGCCT AGTGTTTTG AGAGGTCAAG TCAAACCGTT CCAAACCGGA ACAATAGACT TCGACAAAAC TCTCCAGTTC

CCTTGTTGGT TAACTCTTCT CAACCATGGG AACCATTGCA ATTGCACGTC GGAACAACCA ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGTAACGT TAACGTGCAGCCTTGTTGGT TAACTCTTCT CAACCATGGG AACCATTGCA ATTGCACGTC GGAACAACCA ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGTAACGT TAACGTGCAG

GATAAAGCCG TCTCTGGTTT GAGATCTTTG ACTACTTTGT TGAGAGCTTT CTATTTCGGC AGAGACCAAA CTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTCGAAAGATAAAGCCG TCTCTGGTTT GAGATCTTTG ACTACTTTGT TGAGAGCTTT CTATTTCGGC AGAGACCAAA CTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTCGAAA

GGGTGCTCAA AAGGAAGCCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT TCTGCCGCTC CCCACGAGTT TTCCTTCGGT AAAGGGGTGG TCTGCGACGA AGACGGCGAGGGGTGCTCAA AAGGAAGCCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT TCTGCCGCTC CCCACGAGTT TTCCTTCGGT AAAGGGGTGG TCTGCGACGA AGACGGCGAG

CATTGAGAAC CATCACTGCT GATACCTTCA GAAAGTTATT CAGAGTTTAC GTAACTCTTG GTAGTGACGA CTATGGAAGT CTTTCAATAA GTCTCAAATGCATTGAGAAC CATCACTGCT GATACCTTCA GAAAGTTATT CAGAGTTTAC GTAACTCTTG GTAGTGACGA CTATGGAAGT CTTTCAATAA GTCTCAAATG

TCCAACTTCT TGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACCGGTG AAGCCTGTAG AGGTTGAAGA ACTCTCCATT TAACTTCAAC ATGTGGCCAC TTCGGACATCTCCAACTTCT TGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACCGGTG AAGCCTGTAG AGGTTGAAGA ACTCTCCATT TAACTTCAAC ATGTGGCCAC TTCGGACATC

AACTGGTGAC AGATAAGCCC GACTGATAAC AACAGTGTAG TTGACCACTG TCTATTCGGG CTGACTATTG TTGTCACATCAACTGGTGAC AGATAAGCCC GACTGATAAC AACAGTGTAG TTGACCACTG TCTATTCGGG CTGACTATTG TTGTCACATC

SaliSali

ATGTAACAAA GATGTAACAAA G

TACATTGTTT CAGCTTACATTGTTT CAGCT

Celý úsek SCEPO bol podrobený expresii v M13 a úseky 1, a 3 boli izolovatelné z fágu ako fragmenty HindlII/KpnI, KpnI/BglII a BglII/Sall.The entire region of SCEPO was expressed in M13 and regions 1, and 3 were isolated from phage as HindIII / KpnI, KpnI / BglII and BglII / SalI fragments.

Systém pre expresiu génu SCEPO, ktorý je v súčasnosti pokladaný za výhodný, je založený na sekrécii α-faktoru S. cerevisiae tak, ako to bolo opísané v U. S. patentovej prihláške č. 487 753, podanej 22. apríla 1983 (Grant A. Bitter), a uverejnenej 31. októbra 1984 ako európska patentová prihláška č.The system for expression of the SCEPO gene, which is currently believed to be advantageous, is based on the secretion of S. cerevisiae α-factor as described in U.S. Pat. No. 487,753, filed April 22, 1983 (Grant A. Bitter), and published October 31, 1984 as European Patent Application no.

123 294. Tento systém zahŕňa konštrukcie, v ktorých DNA, ktorá je kódom pre vedúci sled génu pre α-faktor kvasiniek sa uloží do polohy tesne 5'za kódovú oblasť exogénneho génu, ku ktorého expresii má dôjsť. V dôsledku toho produkt po translácii obsahuje vedúci alebo signálny sled, ktorý je odstránený endogénnym enzýmom kvasiniek v priebehu sekrécie zvyšku produktu. Pretože sa pri konštrukcii používa kodón ATG, ktorý je kodónom pre počiatok translácie α-faktoru, nie je potrebné zaradiť tento kodón do polohy -1 génu SCEPO. Ako je zrejmé z tabulky XXI, nachádza sa pred kódom pre alanín (+1) väzný reťazec ktorý dovoľuje priame včlenenie do plazmidu vrátane DNA pre prvých 80 zvyškov signálneho sledu pre α-faktor s nasledujúcim promotorom pre α-faktor. Špecifická konštrukcia na expresiu génu SCEPO v sebe zahŕňa štvorstupňovú väzbu vrátane hore uvedených fragmentov a veľkého fragmentu po štiepení plazmidu paC3 enzýmami HindlII/Sall. Z výsledného plazmidu paC3/SCEPO je možné izolovať promotor pre α-faktor, signálny sled a gén SCEPO štiepením enzýmom BamHI a väzbou do plazmidu pYE po123 294. This system includes constructs in which the DNA encoding the yeast α-factor gene leader sequence is inserted just 5 ' of the coding region of the exogenous gene to be expressed. As a result, the translation product contains a leader or signal sequence that is removed by the endogenous yeast enzyme during secretion of the remainder of the product. Since the ATG codon, which is the codon for the α-factor translation translation initiation codon, is used in construction, it is not necessary to position this codon at the -1 position of the SCEPO gene. As shown in Table XXI, there is a binding chain upstream of the alanine (+1) code that allows direct insertion into the plasmid, including DNA, for the first 80 residues of the α-factor signal sequence, followed by the α-factor promoter. The specific construction for the expression of the SCEPO gene involves a four-step binding including the above fragments and a large fragment after digestion of the paC3 plasmid with HindIII / SalI. From the resulting plasmid paC3 / SCEPO, the α-factor promoter, the signal sequence and the SCEPO gene can be isolated by digestion with BamHI and binding to the plasmid pYE after

I štiepení enzýmom BamHI, čím vzniká plazmid pYE/SCEPO.I digested with BamHI to give plasmid pYE / SCEPO.

Príklad 12Example 12

Expresiu rekombinantných produktov pri použití konštruovaných génov ECEPO a SCEPO systémom na expresiu z príkladu 11 je možné dosiahnuť nasledujúcim spôsobom:Expression of recombinant products using the engineered ECEPO and SCEPO genes by the expression system of Example 11 can be achieved as follows:

Plazmid p536 z príkladu 11 sa transformuje do buniek AM7Plasmid p536 of Example 11 is transformed into AM7 cells

E. coli, ktoré už boli transformované vhodným plazmidom pMWl s génom C_I857. Kultúry buniek v prostredí LB (ampicilín 50 μg/lnl a kanamycín 5 μς^Ι, s výhodou s 10 mM síranu horečnatého) sa udržujú na teplote 28° C a bunky sa pestujú do hustoty 0,1 (optická hustota), expresia EPO sa vyvolá zvýšením teploty na 42°C. Dochádza k produkcii EPO v množstve približne 5 mg/liter.E. coli, which have already been transformed with the appropriate plasmid pMW1 with the _C857 gene. Cell cultures in LB medium (ampicillin 50 μg / lnl and kanamycin 5 μς ^ Ι, preferably with 10 mM magnesium sulfate) are maintained at 28 ° C and the cells are grown to a density of 0.1 (optical density), EPO expression is maintained. caused by raising the temperature to 42 ° C. EPO is produced in an amount of approximately 5 mg / liter.

Bunky sa izolujú, rozrušia a potom sa na nich pôsobí lysozýmom a namáčadlom NP-40. Peleta po odstredení (24 000 g) sa potom solubilizuje guanidínhydrochloridom a ďalej sa čistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou v reverznej fáze (C^ - Vydac), 0 až 80 % etanolu, 50 mM octanu amónneho, pH 4,5. Pri stanovení sledu bielkoviny je možné preukázať, že čistota produktu je vyššia ako 95 % a získaný produkt má 2 možné zakončenia na aminoterminálnom konci, a to A-P-P-R alebo P-P-R v pomernom množstve 3:1. Toto pozorovanie produktov, ktoré zodpovedajú ludškému hEPO a rovnakému produktu bez alanínu v polohe 1 ukazuje na spracovanie hostitelskými bunkami, ktoré odstraňuje terminálny metionín a v niektorých prípadoch tiež počiatočný alanín. Rádioimunologická účinnosť izolátov bola 150 000 až 160 000 jednotiek/mg, účinnosť in vitro 30 000 až 62 000 jednotiek/mg a účinnosť in vivo 120 až 720 jednotiek/mg. (Porovnanie bolo vykonané s materiálom, izolovaným z ludského moča s účinnosťou 70 000 jednotiek/mg). Krivka závislosti účinku od dávky pre rekombinantný produkt in vivo sa podstatne líšila od rovnakej krivky pre EPO z ludského moča.Cells are harvested, disrupted and then treated with NP-40 lysozyme and wetting agent. The centrifuged pellet (24,000 g) is then solubilized with guanidine hydrochloride and further purified by reverse phase high pressure liquid chromatography (C? - Vydac), 0-80% ethanol, 50 mM ammonium acetate, pH 4.5. When determining the sequence of the protein, it can be shown that the purity of the product is greater than 95% and that the product obtained has 2 possible amino terminal ends, namely A-P-P-R or P-P-R in a relative amount of 3: 1. This observation of products that correspond to human hEPO and the same alanine-free product at position 1 indicates treatment with host cells that removes terminal methionine and, in some cases, initial alanine. The radioimmunological activity of the isolates was 150,000 to 160,000 units / mg, the in vitro activity was 30,000 to 62,000 units / mg, and the in vivo activity was 120 to 720 units / mg. (Comparison was made with material isolated from human urine with an efficiency of 70,000 units / mg). The dose-response curve for the recombinant product in vivo was significantly different from the same curve for EPO from human urine.

‘ I‘I

Plazmidy pre analógy EPO, vytvorené v častiach A a B v príklade 11 boli jednotlivo transformované do buniek AM7 E. coli, ktoré už boli transformované pMWl a bunky boli pestované hore uvedeným spôsobom. Čistené izoláty boli skúmané RIA in vitro. Obidve hodnoty pre produkty expresie [Asn², des-Pro² až Ile⁶]hEPO boli približne 11 000 jednotiek/mg a 6000 jednotiek/mg bielkoviny, zatial čo rovnaké hodnoty pre [His⁷]hEPO boli 41 000 jednotiek/mg a 14 000 jednotiek/mg bielkoviny, čo ukazuje na to, že analogické produkty mali účinnosť 1/4 až 1/10 ako úplné produkty expresie.The plasmids for the EPO analogs generated in Parts A and B of Example 11 were individually transformed into E. coli AM7 cells that had already been transformed with pMW1 and the cells were cultured as described above. Purified isolates were examined by RIA in vitro. Both values for [Asn ² , des-Pro ² to Ile ⁶ ] hEPO expression products were approximately 11,000 units / mg and 6000 units / mg protein, while the same values for [His ⁷ ] hEPO were 41,000 units / mg and 14 000 units / mg protein, indicating that analogous products had a potency of 1/4 to 1/10 as full expression products.

V systému na expresiu, určenom na použitie v hostitelskýóh bunkách S. cervisiae, bol plazmid pYE/SCEPO transformovaný do dvoch rôznych kmeňov, a to YSDP4 (genotyp a pep4-3 trpí) a RK81 (genotyp αα pep4-3 trpí). Transformované hostitelské bunky YSDP4 boli pestované v prostredí SD (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,In an expression system for use in S. cervisiae host cells, the plasmid pYE / SCEPO was transformed into two different strains, YSDP4 (genotype and pep4-3 suffer) and RK81 (αα pep4-3 suffer genotype). Transformed YSDP4 host cells were grown in SD (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

N. Y., p. 62 (1983)), doplnenom aminokyselinami kazeínu v koncentrácii 0,5 %, pH 6,5 pri 30C. Prostredie bolo oddelené pri optickej hustote buniek 36 a obsahovalo EPO v koncentrácii 244 jednotiek/ml (97 μg/liter podlá RIA). Transformované bunky RK81 boli pestované do optickej hustoty 6,5 alebo 60, koncentrácia EPO bola 80 až 90 jednotiek/ml (34 vg/liter podlá RIA). Predbežná analýza preukázala heterogenitu produktov, patrne na základe rôznej glykozylácie bielkovín a pomerne vysoký obsah manózy.N.Y., p. 62 (1983)), supplemented with casein amino acids at a concentration of 0.5%, pH 6.5 at 30C. The medium was separated at an optical cell density of 36 and contained EPO at a concentration of 244 units / ml (97 µg / liter according to RIA). Transformed RK81 cells were grown to an optical density of 6.5 or 60, with an EPO concentration of 80-90 units / ml (34 µg / liter according to RIA). Preliminary analysis showed the heterogeneity of the products, presumably due to different protein glycosylation and relatively high mannose content.

Plazmidy PaC3 a pYE v HB101 E. coli boli uložené 27. septembra 1984 do American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland pod číslami ATCC 39881 a ATCC 39882. Plazmidy pCFM526 vAM7, pCFM536 v bunkách JM103 a pMWl v bunkách JM103 boli tiež uložené 21. novembra 1984 pod číslami ATCC 33932, 33934 a 33933. Saccharomyces cerevisiae kmene YSPD4 a RK81 boli uložené 21. novembra 1984 pod číslami ATCC 20734 a 20733.The plasmids PaC3 and pYE in HB101 E. coli were deposited on September 27, 1984 in American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland under the numbers ATCC 39881 and ATCC 39882. Plasmids pCFM526 in AM7, pCFM536 in JM103 cells and pMW1 in JM103 cells were also deposited on November 21, 1984 under ATCC Nos. 33932, 33934 and 33933. Saccharomyces cerevisiae strains YSPD4 and RK81 were deposited on November 21, 1984 under ATCC Nos. 20734 and 20733.

Je zrejmé, že spôsobom podlá vynálezu je možné získať početné výnimočne cenné produkty.It is clear that numerous exceptionally valuable products can be obtained by the process of the invention.

Polypeptidy, získané spôsobom podlá vynálezu, sú užitočné materiály, nech už ide o produkty mikrobiálnej expresie, alebo o syntetické produkty, primárna, sekundárna a terciárna štru- 82 ktúra týchto produktov bola poprvýkrát poznaná realizáciou spôsobu podlá vynálezu.Polypeptides obtained by the method of the invention are useful materials, whether they are microbial expression products or synthetic products, the primary, secondary and tertiary structures of these products being first recognized by the implementation of the method of the invention.

Ako už bolo uvedené, rekombinantné produkty a syntetické produkty majú v rôznom stupni spoločnú biologickú účinnosť in vitro ako pre izoláty EPO z prírodných zdrojov, tak pre produkty expresie a môžu teda byt použité ako náhražky pre izoláty EPO v živnom prostredí pre krvné bunky. V určitej miere majú polypeptidy, vyrobené spôsobom podlá vynálezu tiež účinnosť in vivo, podobnú prírodným izolátom EPO a je teda možné ich použiť na liečbu erytropoietínom u cicavcov vrátane ludí, napríklad tam, kde je potrebné dosiahnuť stimuláciu retikulocytov, vznik ferokinetických účinkov, napríklad výmeny železa medzi plazmou a kostovou dreňou, tam kde je potrebné dosiahnuť zmenu počtu erytrocytov, stimuláciu vzniku hemoglobínu C (Eschbach a ďalšie, hore) a zvýšenie hodnoty hematokritu, u cicavcov, ako to bolo uvedené v príklade 10. Ide teda o pacienty, ktorí obyčajne vyžadujú krvnú transfúziu, napríklad pri úrazoch,.v prípade chirurgických chorôb, pri chorobách obličiek vrátane použitia umelej obličky a pri pacientoch s rôznymi typmi porúch v zložení krvi, ako sú hemofília, poruchy tvaru krviniek, fyziologické anémie, kosákovitá anémia a podobne. Týmto spôsobom je možné znížiť nutnosť transfúzií, a tým využiť EPO na zníženie materiálov, ktorými sa môžu prenášať infekčné choroby. Produkty podlá vynálezu vzhladom na výrobu rekombinantnými spôsobmi sú zbavené pyrogénov, prírodných inhibičných látok a podobne, a sú teda velmi účinné v porovnaní s prírodnými produktmi. Je možné ich použiť tiež tam, kde je nutné zlepšiť prenos kyslíka, napríklad pri pobyte v prostredí s jeho zníženým množstvom a v prípade obehových ochorení.As mentioned above, recombinant products and synthetic products share, to varying degrees, the in vitro biological activity of both EPO isolates from natural sources and expression products and can thus be used as substitutes for EPO isolates in blood cell culture media. To a certain extent, the polypeptides produced by the method of the invention also have in vivo efficacy similar to the natural EPO isolate and can therefore be used to treat erythropoietin in mammals including humans, for example where reticulocyte stimulation is desired, ferokinetic effects such as iron exchange between plasma and bone marrow where it is necessary to achieve a change in erythrocyte numbers, stimulation of hemoglobin C (Eschbach et al., supra) and an increase in hematocrit in mammals, as shown in Example 10. Thus, these are patients who usually require blood transfusion, for example in trauma, in the case of surgical diseases, in kidney diseases, including the use of artificial kidney, and in patients with various types of blood composition disorders such as hemophilia, blood cell disorders, physiological anemia, sickle cell anemia and the like. In this way, it is possible to reduce the need for transfusions, thereby utilizing EPO to reduce the materials by which infectious diseases can be transmitted. The products according to the invention with respect to production by recombinant methods are devoid of pyrogens, natural inhibitory substances and the like and are therefore very effective in comparison with natural products. They can also be used where oxygen transfer needs to be improved, for example when staying in a reduced amount environment and in circulatory diseases.

Výhodným spôsobom podania týchto polypeptidov je parenterálne podanie, látky sa obyčajne podávajú s prijateľnými riedidlami, nosičmi a/alebo pomocnými látkami. Predbežné farmakokinetické štúdie preukazujú dlhší polčas in vivo pre opičíA preferred route of administration for these polypeptides is parenteral administration, the agents usually being administered with acceptable diluents, carriers, and / or excipients. Preliminary pharmacokinetic studies have shown a longer half-life in vivo for monkeys

EPO pri vnútrosvalovom podaní ako pri vnútrožilnom podaní. Účinné dávky sa podstatne odlišujú od seba navzájom podlá ochorenia, pohybujú sa však v rozmedzí 0,1 až 100 ug/kg, tzn. približne 7 až 7000 jednotiek/kg. Je možné použit bežné riedidlá, napríklad ludský sérový albumín a štandardné nosiče, napríklad fyziologický roztok chloridu sodného.EPO by intramuscular administration than by intravenous administration. Effective doses vary substantially from disease to disease, but are in the range of 0.1 to 100 µg / kg, i. about 7 to 7000 units / kg. Conventional diluents such as human serum albumin and standard carriers such as saline may be used.

V prostriedkoch je možné použit aj dalšie pomocné látky, napríklad testosteróny, stimulátory zárodočných buniek, rastové faktory podobné inzulínu, prostaglandínu, serotonínu, cyklickému AMP, prolaktínu a trijódtyronínu, použit je možné tiež látky užívané pri liečbe aplastických anémií, ako metenolén, stanozol a pandrolón (Resegotti a dalšie, Panminerva Medica 23, 243 až 248 (1981), McGonigle a dalšie, Kidney Int. 25 (2), 437 až 444 (1984), Pavlovic-Kantera a dalšie, Expt. Hematol.Other adjuvants such as testosterones, germ cell stimulators, insulin-like growth factors, prostaglandin, serotonin, cyclic AMP, prolactin, and triiodothyronine may also be used in the compositions, as well as agents used in the treatment of aplastic anemias such as metenolene, stanozol and pandrolone (Resegotti et al., Panminerva Medica 23, 243-248 (1981), McGonigle et al., Kidney Int. 25 (2), 437-444 (1984), Pavlovic-Kantera et al., Expt. Hematol.

(Supp. 8), 283 až 291 (1980) a Kurtz, FEBS Letters, 14a (1), 105 až 108 (1982)). Ako pomocné látky je možné použit tiež zlúčeniny, o ktorých je známe, že zvyšujú účinok erytropoietínu alebo asialo-EPO, napríklad adrenergné látky, hormóny štítnej žlazy, androgény alebo BPA, ako to bolo opísané v publikáciách Dunn, Current Concepts in Erythropoiesis, John Wiley and Sons (Chichester, England, 1983), Weiland a dalšie, Blut, 44 (3), 173 až 175 (1982), Kalmanti, Kidney Int., 22,(Supp. 8), 283-291 (1980) and Kurtz, FEBS Letters, 14a (1), 105-108 (1982). Compounds known to enhance the effect of erythropoietin or asialo-EPO, such as adrenergic agents, thyroid hormones, androgens or BPA, as described in Dunn, Current Concepts in Erythropoiesis, John Wiley, may also be used as adjuvants. and Sons (Chichester, England, 1983), Weiland et al., Blut, 44 (3), 173-175 (1982), Kalmanti, Kidney Int., 22,

383 až 391 (1982), Shahidi, New. Eng. J. Med., 289, 72 až 80 (1973), Fischer a dalšie, Steroids, 30 (6), 833 až 845 (1977), Urabe a dalšie, J. Exp. Med., 149, 1314 až 1325 (1979) a Billat a dalšie, Expt. Hematol., 10 (1), 133 až 140 (1982) a zlúčeniny, ktoré sú označované ako pečeňové faktory pre tvorbu krvi, ako to bolo opísané v publikáciách Naughton a dalšie, Acta Haemat. , 69, 171 až 179 (1983) a erytrotropiny, opísané v publikáciách Congote a dalšie v Abstract 364, Proceedings 7t International Congress of Endocrinology (Quebec City, Quebec, júl 1-7, 1984), Congote, Biochem. Biophys.383-391 (1982), Shahidi, New. Eng. J. Med., 289, 72-80 (1973), Fischer et al., Steroids, 30 (6), 833-845 (1977), Urabe et al., J. Exp. Med., 149, 1314-1325 (1979) and Billat et al., Expt. Hematol., 10 (1), 133-140 (1982) and compounds which are referred to as liver factors for blood production, as described in Naughton et al., Acta Haemat. 69, 171-179 (1983) and the erythropropins described in Congote et al. In Abstract 364, Proceedings 7th International Congress of Endocrinology (Quebec City, Quebec, Jul 1-7, 1984), Congote, Biochem. Biophys.

Res. Comm, 115 (2), 447 až 483 (1983) a Congote, Anál. Biochem., 140, 428 až 433 (1984) a erytrogeniny, opísané v pu84 blikácii Rothman a ďalšie, J. Surg. Oncol, 20, 105 až 108 (1982). Predbežné sledovanie ukazuje na hypoxických polycytemických myšiach, vopred ošetrených 5-a-dihydrotestosterónom alebo nandrolónom a potom erytropoietínom slubné výsledky.Res. Comm., 115 (2), 447-483 (1983) and Congote, Anal. Biochem., 140, 428-43 (1984) and the erythrogenins described in Pu84 flashing Rothman et al., J. Surg. Oncol., 20, 105-108 (1982). Preliminary screening shows promising results in hypoxic polycythaemic mice pretreated with 5-α-dihydrotestosterone or nandrolone and then erythropoietin.

Diagnostické použitie polypeptidov, vyrobených spôsobom podlá vynálezu, je tiež velmi široké a zahŕňa použitie značených aj neznačených foriem v rôznych imunologických skúškach vrátane RIA, ELISA a podobne, rovnako ako celý rad skúšok in vitro a in vivo. Tieto postupy sú opísané v publikáciách Dunn a ďalšie, Expt. Hematol., 11 (7), 590 až 600 (1983), Gibson a ďalšie, Pathology, 16, 155 až 156 (1984), Expt. Hematol, 11 (7), 649 až 660 (1983), Saito a ďalšie, Jap. J. Med., 23 (1), až 21 (1984), Natan a ďalšie, New Eng. J. Med., 308 (9),The diagnostic use of the polypeptides produced by the method of the invention is also very broad and involves the use of both labeled and unlabeled forms in various immunoassays, including RIA, ELISA, and the like, as well as a variety of in vitro and in vivo assays. These procedures are described in Dunn et al., Expt. Hematol., 11 (7), 590-600 (1983); Gibson et al., Pathology, 16, 155-156 (1984), Expt. Hematol., 11 (7), 649-660 (1983); Saito et al., Jap. J. Med., 23 (1) to 21 (1984), Natan et al., New Eng. J. Med., 308 (9).

520 až 522 (1983) a tiež v rôznych článkoch, na ktoré sú v týchto publikáciách odkazy. Polypeptidy podlá vynálezu vrátane syntetických peptidov so sledmi alebo zvyškami EPO sú tiež vysoko užitočnými čistými látkami pre polyklonálne protilátky a bankami monoklonálnych protilátok, špecifických pre rozoznávanie kontinuálnych a diskontinuálnych epitopov EPO. Príkladom môže byt predbežná analýza sledu aminokyselín z tabulky VI podlá publikácie Hopp a ďalšie, PNAS (USA), 78, strany 3824 až 3828 (1981) a analýza sekundárnej štruktúry podlá publikácie Chou a ďalšie, Ann. Rev. Biochem, 47, str. 2.51 (1978) preukázala, že syntetické peptidy, ktorých štruktúra zodpovedá kontinuálnym sledom prírodných peptidov v oblastiach 41 až 57, 116 až 118 a 144 až 166 vždy vrátane, sú schopné vyvolať vysoko antigénnu odpoveď, a tým aj vznik monoklonálnych a polyklonálnych protilátok, ktoré reagujú so syntetickým peptidom aj s celou bielkovinou. Tieto protilátky by mohli byt užitočné pre detekciu a čistenie EPO a príbuzných produktov.520-522 (1983) and also in various articles referred to in these publications. Polypeptides of the invention, including synthetic peptides with sequences or residues of EPO, are also highly useful pure polyclonal antibody substances and monoclonal antibody banks specific for recognition of continuous and discontinuous EPO epitopes. Examples include preliminary analysis of the amino acid sequence of Table VI by Hopp et al., PNAS (USA), 78, pp. 3824-3828 (1981) and secondary structure analysis by Chou et al., Ann. Rev. Biochem, 47, p. 2.51 (1978) has shown that synthetic peptides whose structure corresponds to continuous sequences of natural peptides in regions 41-57, 116-118 and 144-166 inclusive each time are capable of eliciting a highly antigenic response and thereby producing monoclonal and polyclonal antibodies which react with both the synthetic peptide and the whole protein. These antibodies could be useful for the detection and purification of EPO and related products.

Boli pripravené nasledujúce tri syntetické peptidy:The following three synthetic peptides were prepared:

1) hEPO 41-57, V-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G,(1) hEPO 41-57, V-P-D-T-K-V-N-F-Y-W-K-R-M-E-V-G,

2) hEPO 116-128, K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A,2) hEPO 116-128 K-E-A-I-S-P-D-A-A-S-A-A

3) hEPO 144-166, V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.3) hEPO 144-166; V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.

Predbežná štúdia, týkajúca sa imunizácie, s použitím uvedených polypeptidov ukázala pomerne slabú pozitívnu odpoveď pre hEPO 41 až 57, takmer žiadnu odpoveď pre hEPO 116 až 128 a silnú pozitívnu odpoveď na hEPO 144 až 166, merané schopnosťou protilátok králičieho séra zrážok izolátu EPO z ludskom moču, značenom ¹²⁵I. Predbežné štúdie in vivo všetkých troch peptidov nepreukázali takmer žiadnu účinnost jednotlivo ani v zmesi.A preliminary immunization study using these polypeptides showed a relatively weak positive response for hEPO 41-57, almost no response for hEPO 116-128, and a strong positive response to hEPO 144-166, measured by the ability of rabbit serum antibodies to precipitate EPO isolate from human urine, No. ¹²⁵ I. Preliminary in vivo studies of the three peptides did not show practically no activity, either individually or in admixture.

Sled aminokyselinových zvyškov EPO cicavcov, tak, ako bol preukázaný v príkladoch, definuje primárnu štruktúru úplného EPO, avšak špecifický sled 165 aminokyselín opičieho EPO v tabulke V a 166 zvyškov ludského EPO v tabulke VI neobmedzuje rozsah použiteľných polypeptidov podlá vynálezu. Spôsobom podlá vynálezu je možné získať rôzne alelové formy EPO, ktoré podlá výsledkov skorších výskumov existujú, napríklad ludský gamainterferón, ako je možné porovnať s údajmi, ktoré hovoria o argenínovom zvyšku v polohe č. 140 EPO alebo glutamínovom zvyšku v polohe 140 v publikácii Gray a ďalšie, Náture, 295, strany 503 až 508 (1982). Vždy však beží o úplný” sled ludského gama-interferónu. Alelové formy úplného EPO sa môžu líšiť od seba navzájom a od sledov v tabulkách V a VI dĺžkou sledu alebo tým, že niektoré zvyšky sú vynechané, nahradené, členené alebo pridané s následnými zmenami účinku a zmenami glykozilácie. Ako už bolo uvedené, jedna alelová forma ludského EPO patrné obsahuje zvyšok metionínu v polohe 126. Je možné očakávať, že patrné existujú ešte DNA genómu a sledy cDNA, ktoré sú kódom pre alelové polypeptidy alebo proste obsahujú odlišné kodóny na označenie rovnakého polypeptidu.The amino acid sequence of mammalian EPO residues, as demonstrated in the examples, defines the primary structure of full EPO, but the specific sequence of monkey amino acid 165 amino acids in Table V and 166 human EPO residues in Table VI do not limit the range of useful polypeptides of the invention. According to the method of the invention, it is possible to obtain various allele forms of EPO which, according to the results of earlier investigations, exist, for example human gamainterferon, as can be compared with data suggesting an argenine residue at position no. 140 EPO or a glutamine residue at position 140 in Gray et al., Nature 295, pp. 503-508 (1982). However, it is always a complete sequence of human gamma-interferon. The allelic forms of full EPO may differ from each other and from the sequences in Tables V and VI by the sequence length or by the fact that some residues are omitted, replaced, segmented or added with subsequent changes in activity and changes in glycosilization. As mentioned above, one allele form of human EPO appears to contain the methionine residue at position 126. It is expected that there are still genome DNAs and cDNA sequences that encode allele polypeptides or simply contain different codons to designate the same polypeptide.

Okrem prírodné sa vyskytujúcich alelových foriem úplného EPO zahŕňa vynález tiež ďalšie EPO-produkty, napríklad polypeptidové analógy EPO a jeho fragmenty. Spôsobom podlá uverejnených prihlášok Altona a ďalších (napríklad WO/83/04053/) je možné navrhnúť a skonštruovať gény pre mikrobiálnu expresiu polypeptidov, ktorých štruktúra sa líši od úplného EPO v jednom alebo vo väčšom počtu zvyškov, a to ich substitúciou, pridaním uprostred alebo na konci alebo vynechaním. Je tiež možné uskutočniť modifikácie opičej cDNA a génov pre EPO v genóme dobre známou miestne orientovanou mutagenézou a tak získať analógy a deriváty EPO. Tieto produkty môžu mat niektoré biologické vlastnosti, avšak líšia sa v ďalších vlastnostiach EPO. Niektoré produkty vynechávajú aminokyseliny [Asn², des-Pro² až Ile⁶]hEPO, [des-Thr¹⁶³ až Arg¹⁶⁶]hEPO a delta27-55hEPO, pričom posledná látka má vypustený celý exón. Niektoré deriváty sú stálejšie proti hydrolýze a tým majú dlhší účinok, alebo je vypustené jedno alebo väčší počet miest pre glykozyláciu, čo môže viest k väčšie účinnosti v prípade produkcie kvasinkami, alebo môže byť zvyšok cysteínu nahradený napríklad histidínom alebo serínom, ako v analógu [His⁷]hEPO a je možné ich lahšie izolovať alebo majú tyrozín nahradený fenylalanínom, ako [Phe¹⁵]hEPO, [Phe⁴⁹]hEPO a [Phe¹⁴⁵]hEPO a môžu sa špatnejšie alebo lahšie viazať na receptory v cielových bunkách. Môže tiež ísť o fragmenty obsahujúce len čast sledu úplného EPO a len čast účinnosti tejto látky, napríklad väzbu na receptory a nie erytropoetickú účinnosť. Osobitne významné sú potenciálne fragmenty sledu DNA ludského genómu z tabulky VI, ktoré sú špeciálnymi doménami biologickej účinnosti. Je nutné uviesť, že neúčinnosť in vivo nemusí znamenať liečebný nezdar alebo nedostatok antagonizmu. Tento antagonizmus môže byt užitočný v liečbe polycytémií pri prebytku EPO, ako to bolo opísané v publikáciách Adamson, Hosp. Practice, 18 (12), 49 až 57 (1983), a Hellmann a ďalšie, Clin. Lab. Haemat., 5, 335 až 342 (1983).In addition to the naturally occurring allele forms of full length EPO, the invention also includes other EPO products, such as EPO polypeptide analogs and fragments thereof. By the method of published applications of Alton et al. (E.g. WO / 83/04053), it is possible to design and construct genes for microbial expression of polypeptides whose structure differs from full EPO in one or more residues by substitution, addition in the middle or at the end or omitted. It is also possible to make modifications to the monkey cDNA and EPO genes in the genome by well-known site-directed mutagenesis to obtain analogs and derivatives of EPO. These products may have some biological properties but differ in other EPO properties. Some products omit the amino acids [Asn ² , des-Pro ² to Ile ⁶ ] hEPO, [des-Thr ¹⁶³ to Arg ¹⁶⁶ ] hEPO, and delta 27-55hEPO, the latter having the entire exon deleted. Some derivatives are more stable against hydrolysis and thus have a longer effect, or one or more glycosylation sites are omitted, which may lead to greater efficacy in yeast production, or the cysteine residue may be replaced by, for example, histidine or serine as in [His ⁷ ] hEPO and can be more easily isolated or have phenylalanine-substituted tyrosine, such as [Phe ¹⁵ ] hEPO, [Phe ⁴⁹ ] hEPO, and [Phe ¹⁴⁵ ] hEPO, and may bind poorly or more readily to receptors in target cells. They may also be fragments containing only part of the sequence of full EPO and only part of the activity of the substance, for example, binding to receptors and not erythropoietic activity. Of particular importance are potential fragments of the human genome DNA sequence of Table VI, which are special domains of biological activity. It should be noted that in vivo ineffectiveness may not indicate therapeutic failure or lack of antagonism. This antagonism may be useful in the treatment of polycythaemia in excess of EPO as described in Adamson, Hosp. Practice, 18 (12), 49-57 (1983), and Hellmann et al., Clin. Lab. Haemat., 5, 335-34 (1983).

Podlá ďalšieho aspektu podlá vynálezu je možné získať klonované sledy DNA, ktoré sú kódom pre ludský a opičí EPO a ktoré sú cenné vzhladom na informácie, ktoré podávajú o slede aminokyselín erytropoietínu cicavcov, ktoré predtým nebolo možné získať napriek desaťročiam analytických výskumov prírodné sa vyskytujúcich produktov. Sledy DNA je možné použiť tiež na syntézu erytropoietínu rekombinantným spôsobom. Okrem toho je možné ich použiť na konštrukciu vírusových a cirkulárnych plazmidov, hostitelských buniek, a to prokaryotických aj eukaryotických po transfekcii alebo transformácii a buniek kvasiniek aj cicavcov v kultúre, takže ide o nové a cenné metódy pestovania uvedených buniek, ktoré sú schopné produkovať EPO a EPO-produkty. Sledy DNA sú tiež použitelné ako značené vzorky pri izolácii EPO a DNA genómu, vrátane cDNA, ktorá je kódom pre tieto produkty. Zatial nie je možné odhadnúť, v akom rozsahu je možné použiť sledy DNA podlá vynálezu v syntéze bielkovín, napríklad u hmyzu. Tieto sledy môžu dať vzniknúť rôznym typom buniek cicavcov, ktoré potom môžu byť eukarytickými hostitelmi na výrobu erytropoietínu a podobných produktov, ak to bolo opísané v publikácii Palmiter a ďalšie, Science, 222 (4625), 809 až 814 (1983).According to another aspect of the invention, it is possible to obtain cloned DNA sequences which encode human and simian EPO and which are valuable with respect to information that they report on the mammalian erythropoietin amino acid sequence that had previously not been obtained despite decades of analytical research on naturally occurring products. DNA sequences can also be used for the synthesis of erythropoietin by recombinant means. In addition, they can be used to construct viral and circular plasmids, host cells, both prokaryotic and eukaryotic after transfection or transformation, and yeast and mammalian cells in culture, making them novel and valuable methods of growing said cells capable of producing EPO and EPO-products. The DNA sequences are also useful as labeled samples in the isolation of EPO and the genome DNA, including the cDNA that encodes these products. While it is not possible to estimate to what extent the DNA sequences of the invention can be used in protein synthesis, for example in insects. These sequences can be generated by different types of mammalian cells, which can then be eukarytic hosts for the production of erythropoietin and the like, as described in Palmiter et al., Science, 222 (4625), 809-814 (1983).

Je teda zrejmé, že príklady, uvedené v príkladovej časti prihlášky, nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu, pretože je zásadne možný rad modifikácií a variácií, vzhladom na to, že sledy DNA zahŕňajú cDNA a sledy DNA genómu. Môžu teda byt kódom pre EPO, ako v príklade 12, aj pre jeho fragmenty a analógy, tzn. EPO-produkty, ktoré môžu mat totožné niektoré biologické vlastnosti s prírodným produktom, iné však nie.Thus, it is to be understood that the examples set forth in the Examples section of the application are not intended to limit the scope of the invention since many modifications and variations are possible in principle, since the DNA sequences include cDNA and genomic DNA sequences. Thus, they may also code for EPO, as in Example 12, for fragments and analogs thereof, i. EPO products which may have some biological properties identical to the natural product, others not.

Je teda zrejmé, že DNA sledy podlá vynálezu zahŕňajú všetky sledy, dovoľujúce expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách, pričom produktom tejto expresie je polypeptid, ktorý má aspoň čast primárnej štruktúry EPO a jednu alebo väčší počet jeho vlastností, môže teda íst o:Thus, it is understood that the DNA sequences of the invention include all sequences allowing expression in prokaryotic or eukaryotic host cells, wherein the expression product is a polypeptide having at least a portion of the primary structure of EPO and one or more of its properties, such as:

a) sledy DNA z tabuliek V a VI,(a) DNA sequences from Tables V and VI;

b) sledy DNA, ktoré hybridižujú so sledmi v odseku a) alebo ich fragmenty a(b) DNA sequences which hybridize to the sequences in paragraph (a) or fragments thereof; and

c) sledy DNA, ktoré hybridizujú so sledmi z odseku a) a b) z iných dôvodov ako vzhladom na degeneráciu genetického kódu.(c) DNA sequences which hybridize with the sequences of (a) and (b) for reasons other than the degeneracy of the genetic code.

Je nutné sa zmieniť o tom, že existujúce alelové opičie a ludské sledy génu pre EPO pravdepodobne hybridizujú so sledmi z tabuliek V a VI alebo s ich fragmentmi.. Okrem toho gény SCEPO a ECEPO a sledy cDNA alebo DNA genómu, ktoré sú kódom pre rôzne fragmenty a analógy EPO, môžu tiež hybridizovat s hore uvedenými sledmi DNA. Túto hybridizáciu je možno uskutočniť za podmienok, ktoré boli hore opísané, vrátane obmedžujúcich podmienok.It should be noted that existing allele monkeys and human EPO gene sequences are likely to hybridize to sequences from Tables V and VI or fragments thereof. In addition, the SCEPO and ECEPO genes and cDNA or DNA genome sequences coding for different fragments and analogs of EPO can also hybridize to the above DNA sequences. This hybridization can be carried out under the conditions described above, including limiting conditions.

Hore uvedené príklady osvetľujú mikrobiálnu expresiu EPO a expresiu v bunkách cicavcov, pričom DNA je včlenená do hybridného vektoru bakteriálneho plazmidu a vírusu, bolo by však možné použiť širokú škálu podobných systémov. Mohlo by ísť napríklad o vektory homogénneho pôvodu, vnesené do celého radu buniek baktérií, kvasiniek a cicavcov v kultúre alebo o systémy, v ktorých sa nepoužívajú vektory, napríklad pri použití fosforečnanu vápenatého. Je zrejmé, že expresia napríklad DNA opičieho pôvodu sa vykonáva v kultúre buniek opice alebo človeka a aj keď v tom prípade beží o expresiu exogénnej DNA, je možné dosiahnuť vysokú úroveň expresie, napriek tomu, že neide o DNA, ktorá má svoj pôvod v genóme hostitela. Systémy expresie podlá vynálezu ďalej uvažujú o tvorbe EPO a podobných produktov v cytoplazme alebo membráne s následným nahromade89 ním, prípadne aj v periplazmatickom priestore baktérií alebo v supernatante živného prostredia hore uvedených kultúr alebo v menej bežných systémoch, napríklad tých, ktoré využívajúThe above examples illustrate microbial expression of EPO and expression in mammalian cells, wherein the DNA is incorporated into a hybrid bacterial plasmid and virus vector, but a wide variety of similar systems could be used. These could be, for example, vectors of homogeneous origin introduced into a variety of cells of bacteria, yeast and mammals in culture, or systems in which vectors are not used, for example using calcium phosphate. Obviously, expression of, for example, monkey-derived DNA is carried out in a culture of monkey or human cells, and although in this case it is an expression of exogenous DNA, a high level of expression can be achieved even though not DNA of genomic origin. host. The expression systems of the invention further contemplate the formation of EPO and similar products in the cytoplasm or membrane with subsequent accumulation89, possibly also in the periplasmic space of the bacteria or in the culture supernatant of the above cultures or in less common systems, for example those using

P.aeruginosa podlá publikácie Gray a ďalšie, Biotechnology,P.aeruginosa according to Gray et al., Biotechnology,

2, strany 161 až 165 (1984).2, pages 161-165 (1984).

Zlepšené metódy hybridizácie podlá vynálezu boli aplikované na DNA/DNA, je možné ich aplikovať však tiež na RNA/RNA a RNA/DNA. Zmesové vzorky môžu umožniť velké zlepšenie hybridizácie s rýchlejšou izoláciou polynukleotidu. Môže ísť napríklad o zlepšený prenos kolónií, o použitie filtrov, podložených nylonom, napríklad GeneScreen a GeneScreen Plus, ktoré dovolujú opakované použitie, použitie nových proteáz podlá publikácie Taub a ďalšie, Anál. Biochem, 126, str. 222 až 230 (1982), použitie velmi nízkych koncentrácií rádovo 0,025 pikomolov celého radu zmesových vzoriek, napríklad s obsahom viac ako 32 odlišných sledov a uskutočňovanie hybridizácie a ďalšieho spracovania za obmedzujúcich podmienok, tzn. 4, s výhodou 2°C od najnižšej vyrátanej teploty pre každú vzorku. Tieto zlepšenia môžu zaistiť výsledky, ktoré nebolo možné skôr očakávať. Je teda zrejmé, že zlepšenie, dosiahnuté spôsobom podlá vynálezu, je velmi podstatné s ohľadom na to, že zmesové vzorky, ktoré obsahujú štvornásobný počet rôznych sledov, v porovnaní s tým, čo bolo až dosial vykonané, bolo možné s úspechom použiť na izoláciu jediného sledu génu zo zmesi, ktorá obsahovala 1 500 000 povlakov fágu. Tento výsledok bol dosiahnutý v podstate súbežne s publikovaným názorom Andersona a ďalších v hore uvedenom článku, totiž že ... tento spôsob je nepraktický a nepreveditelný pre izoláciu génu pre bielkoviny cicavcov v prípade, že nie je k dispozícii zodpovedajúca RNA.The improved hybridization methods of the invention have been applied to DNA / DNA, but can also be applied to RNA / RNA and RNA / DNA. Mixed samples can allow for greatly improved hybridization with faster isolation of the polynucleotide. These may include, for example, improved colony transfer, the use of nylon-based filters, such as GeneScreen and GeneScreen Plus, which allow reuse, the use of new proteases according to Taub et al., Anal. Biochem., 126, p. 222-230 (1982), the use of very low concentrations of the order of 0.025 picomoles of a number of mixed samples, for example containing more than 32 different sequences, and carrying out hybridization and further processing under restrictive conditions, i. 4, preferably 2 ° C from the lowest calculated temperature for each sample. These improvements can deliver results that could not have been expected earlier. Thus, it is clear that the improvement achieved by the method of the invention is very important in view of the fact that the mixed samples containing four times the number of different sequences compared to what has been done hitherto could be successfully used to isolate a single of the gene sequence from a mixture containing 1,500,000 phage coatings. This result was achieved essentially in parallel with the published opinion of Anderson and others in the above article, that ... this method is impractical and inconvenient for the isolation of the mammalian protein gene in the absence of the corresponding RNA.

Claims (31)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Sekvencia DNA na použitie pre zaistenie expresie polypeptidového produktu, ktorého štruktúra aspoň sčasti zodpovedá primárnej štruktúre erytropoietínu na zaistenie jeho biologických vlastností spočívajúcich v zvyšovaní produkcie retikulocytov a červených krviniek v bunkách kostovej drene a zvysovaní syntézy hemoglobínu alebo príjmu železa, v prokaryoatnych ífi· » alebo eukaryontpých hostitelských bunkách, pričom táto sekvencia DNA sa volí zo súboru zahŕňajúceho (a) sekvencie DNA uvedené v tabulke V a VI a ich komplementárne reŕazce;1. A DNA sequence for use in providing expression of a polypeptide product whose structure at least partially corresponds to the primary structure of erythropoietin to provide its biological properties of enhancing reticulocyte and red blood cell production in bone marrow cells and enhancing hemoglobin synthesis or iron uptake in prokaryotes. or eukaryotic host cells, wherein said DNA sequence is selected from the group consisting of (a) the DNA sequences set forth in Tables V and VI and their complementary strands; (b) sekvencie DNA hybridižujúce za stringentných podmienok k sekvenciám DNA definovaným v odseku (a) alebo ich fragmentom; a (c) sekvencie DNA, ktoré by hybridizovali k sekvenciám DNA definovaným v odseku (a) alebo (b), keby neó>sW; degenerácia genetického kódu.(b) DNA sequences hybridizing under stringent conditions to the DNA sequences defined in (a) or fragments thereof; and (c) DNA sequences that would hybridize to the DNA sequences defined in (a) or (b) if not> sW; degeneracy of the genetic code. 2. Sekvencia DNA podlá nároku 1 kódujúca ludský erytropoietín.The DNA sequence of claim 1 encoding human erythropoietin. 3. Sekvencia DNA podlá nároku 1 kódujúca opičí erytropoietín.The DNA sequence of claim 1 coding for monkey erythropoietin. 4. Sekvencia DNA podlá nároku 3 obsahujúca oblast kódujúcu proteín uvedenú v tabulke V.DNA sequence according to claim 3 comprising a protein coding region shown in Table V. 5. Sekvencia DNA podlá nároku 1 alebo 2, ktorou je sekvencia genómovej DNA.DNA sequence according to claim 1 or 2, which is a genomic DNA sequence. 6. Sekvencia DNA podlá nároku 5 kódujúca ludský erytropoietín.The DNA sequence of claim 5 encoding human erythropoietin. 7. Sekvencia DNA podlá nároku 6 obsahujúca oblasť kódujúcu proteín uvedenú v tabulke VI.7. The DNA sequence of claim 6 comprising the protein coding region shown in Table VI. 8. Sekvencia DNA podlá nároku 1 alebo 2, ktorá je kovalentne pripojená k detegovatelnej značiacej látke.The DNA sequence of claim 1 or 2, which is covalently linked to a detectable label. 9. Sekvencia DNA podlá nároku 8, kde detegovatelná značiaca látka je rádioaktívna.The DNA sequence of claim 8, wherein the detectable marker is radioactive. 10. Sekvencia DNA podlá nároku 8 alebo 9, ktorá je jednoretazcová.The DNA sequence of claim 8 or 9, which is single stranded. 11. Sekvencia DNA podlá nároku 1 kódujúca [Phe¹⁵]hEPO, [Phe⁴⁹]hEPO, [Phe¹⁴⁵]hEPO, [His⁷]hEPO, [Asn²-des-Pro² až Ile⁶]hEPO, [des-Thr¹⁶³ až Arg¹⁶⁶]hEPO alebo.[delta 27-55]hEPO.The DNA sequence of claim 1 encoding [Phe ¹⁵ ] hEPO, [Phe ⁴⁹ ] hEPO, [Phe ¹⁴⁵ ] hEPO, [His ⁷ ] hEPO, [Asn ² -des-Pro ² to Ile ⁶ ] hEPO, [des-Thr ¹⁶³ to Arg ¹⁶⁶ ] hEPO or [delta 27-55] hEPO. íd, ,íd,, 12. Prokaryontiaa alebo eukaryojatna hostitelska bunka transformovaná alebo transfekovaná sekvenciou DNA podlá niektorého z nárokov 1, 2, 3, 6, 7 a 8 spôsobom umožňujúcim tejto hostitelskej bunke exprimovať uvedený polypeptidový produkt.A prokaryotic or eukaryotic host cell transformed or transfected with a DNA sequence according to any one of claims 1, 2, 3, 6, 7, and 8 in a manner allowing said host cell to express said polypeptide product. id idid id 13. Prokaryoijtpa alebo eukaryontna hostitelska bunka podlá nároku 13, ktorá je schopná glykozylovať uvedený polypeptid.A prokaryotic or eukaryotic host cell according to claim 13, which is capable of glycosylating said polypeptide. 14. Prokaryontha alebo eukaryontna hostitelska bunka podlá nároku 13, ktorou je cicavčia bunka.The prokaryotic or eukaryotic host cell of claim 13, which is a mammalian cell. - ’c-L- 'c-L 15. Prokaryontfia alebo eukaryoBtna hostitelska bunka podlá nároku 13, ktorou je bunka COS.The prokaryotic or eukaryotic host cell of claim 13, which is a COS cell. - 36 íok icL- 36 rpm icL 16. Prokaryontná alebo eukaryontná hostitelská bunka podlá nároku 13, ktorou je bunka CHO.The prokaryotic or eukaryotic host cell of claim 13, which is a CHO cell. 17. Biologicky funkčný cirkulárny plazmid alebo vírusový DNA vektor obsahujúci sekvenciu DNA podľa niektorého z nárokov 1, 2, 3, 5, 6, 7 alebo 11.A biologically functional circular plasmid or viral DNA vector comprising the DNA sequence of any one of claims 1, 2, 3, 5, 6, 7 or 11. iči. ¹ ,ichi. ¹ , 18. Prokaryojstna alebo eukaryontňa hostitelská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA vektorom podľa nároku 17.A prokaryotic or eukaryotic host cell stably transformed or transfected with the DNA vector of claim 17. 19. Rekombinantný polypeptid vykazujúci celú primárnu štruktúrnu konformáciu ľudského alebo opičieho erytropoietínu, ako je uvedená v tabulke VI alebo V, alebo jej časť alebo akýkoľvek jeho alelový variant alebo derivát vykazujúci biologickú účinnosť spočívajúcu v zvyšovaní produkcie retikulocytov a červených krviniek v bunkách kostovej drene a zvyšovaní syn. . . - pri 'cčm Wo tézy hemoglobínu alebo priamu zeleza./Tento polypeptid je proícL ' duktom eukaryqjatnej expresie exogénnej sekvencie DNA a má molekulovú hmotnosť podľa SDS-PAGE vyššiu ako erytropoietín izolovaný z moča.19. A recombinant polypeptide having all or part of the primary structural conformation of human or simian erythropoietin as set forth in Table VI or V, or any portion thereof, or any allelic variant or derivative thereof, exhibiting biological activity consisting in increasing reticulocyte and red blood cell production in bone marrow cells and a son. . . This polypeptide is a product of eukaryotic expression of an exogenous DNA sequence and has a molecular weight by SDS-PAGE higher than that of erythropoietin isolated from urine. 20. Polypeptid podľa nároku 19, ktorým je glykoproteín, ktorého priemerné sacharidové zloženie sa líši od ľudského erytropoietínu izolovaného z moča.The polypeptide of claim 19, which is a glycoprotein whose average carbohydrate composition differs from human erythropoietin isolated from urine. 21. Polypeptid podľa nároku 19 alebo 20, kde exogénnou sekvenciou DNA je sekvencia cDNA.The polypeptide of claim 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is a cDNA sequence. 22. Polypeptid podľa nároku 19 alebo 20, kde exogénnou sekvenciou DNA je sekvencia genómovej DNA.The polypeptide of claim 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is a genomic DNA sequence. 23. Polypeptid podľa nároku 19 alebo 20, kde exogénna sekvencia DNA je súčasťou autonómne sa replikujúceho cirkulárneho DNA plazmidu alebo vírusového vektord/The polypeptide of claim 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is part of an autonomously replicating circular DNA plasmid or viral vector. 24. Polypeptid podlá niektorého z aspektov 19 až 23, ktorý je kovalentne pripojený k detegovatelnej značiacej látke.24. The polypeptide of any one of aspects 19 to 23, which is covalently attached to a detectable label. 25. Polypeptid podlá nároku 24, kde detegovatelná značiaca látka je rádioaktívna.The polypeptide of claim 24, wherein the detectable label is radioactive. 26. Polypeptidový produkt pripravitelný expresiou sekvencie DNA podlá niektorého z nárokov 1, 2, 3, 5, 6a7v eukaiek ryoptpej hostitelskej bunke.A polypeptide product obtainable by expressing a DNA sequence according to any one of claims 1, 2, 3, 5, 6, and 7 in eucalypts of a host cell. 27. Spôsob výroby polypeptidu vykazujúceho aspoň časť primárnej štruktúrnej konformácie erytropoietínu na umožnenie biologickej účinnosti spočívajúci v zvyšovaní produkcie retikulocytov a červených krviniek v bunkách kosťovej drene a zvyšovaní syntézy hemoglobínu alebo príjmu železa, v y zna.čujuci sa t ý m , ze sa prokaryojatna alebo eukaryontriá hostitelská bunka transformovaná alebo transfekovaná sekvenciou DNA podlá niektorého z nárokov 1, 2, 3, 5, 6a 7 spôsobom umožňujúcim hostitelskej bunke exprimovať tento polypeptid kultivuje za vhodných živných podmienok a prípadne sa požadovaný polypeptidový produkt expresie tejto sekvencie DNA izoluje.27. A method of producing a polypeptide having at least a portion of the primary structural conformation of erythropoietin to enable biological efficacy of increasing reticulocyte and red blood cell production in bone marrow cells and enhancing hemoglobin synthesis or iron uptake, characterized in that it is prokaryotic or eukaryotic the host cell transformed or transfected with the DNA sequence of any one of claims 1, 2, 3, 5, 6 and 7 in a manner allowing the host cell to express the polypeptide is cultured under suitable nutrient conditions and optionally the desired polypeptide expression product of the DNA sequence is isolated. 28. Spôsob podlá nároku 27,vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje hostitelská bunka podlá niektorého z nárokov 12 až 16.28. The method of claim 27, wherein the host cell of any one of claims 12 to 16 is cultured. 29. Spôsob podlá nároku 27 alebo 28 na výrobu polypeptidu podlá niektorého z nárokov 19 až 23 a 26, vyznačuj úci sa t ý m , že sa postupuje za podmienok vedúcich k týmto poly peptidom.A method according to claim 27 or 28 for the production of a polypeptide according to any one of claims 19 to 23 and 26, characterized in that it is carried out under conditions resulting in said poly peptides. 30. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že že obsahuje polypeptid pripravítelný spôsobom podlá nároku 27, 28 alebo 29 a farmaceutický vhodné riedidlo, pomocnú látku alebo nosič.30. A pharmaceutical composition comprising a polypeptide obtainable by a process according to claim 27, 28 or 29 and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier. 31. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 30, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid podlá niektorého z nárokov 19 až 23 a 26.A pharmaceutical composition according to claim 30, characterized in that it comprises a polypeptide according to any one of claims 19 to 23 and 26.