SK279959B6 - Dna sequence, a plasmid, vector, host cell, polypeptide of an erythropoietin-type, method of its production and pharmaceutical composition based thereon - Google Patents
Dna sequence, a plasmid, vector, host cell, polypeptide of an erythropoietin-type, method of its production and pharmaceutical composition based thereon Download PDFInfo
- Publication number
- SK279959B6 SK279959B6 SK4438-85A SK443885A SK279959B6 SK 279959 B6 SK279959 B6 SK 279959B6 SK 443885 A SK443885 A SK 443885A SK 279959 B6 SK279959 B6 SK 279959B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- dna
- polypeptide
- dna sequence
- erythropoietin
- sequence
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Oblasť technikyTechnical field
Vynález sa týka sekvencie DNA, plazmidu, vektora, hostiteľskej bunky, polypeptidu typu erytropoetínu, spôsobu jeho výroby a farmaceutického prostriedku na jeho báze. Osobitne sa vynález týka sekvencie DNA na použitie na zaistenie expresie polypcptidového produktu, ktorého štruktúra aspoň sčasti zodpovedá primárnej štruktúre erytropoetínu na zaistenie jeho biologických vlastností, v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách, prokaryotickej a eukaryotickej hostiteľskej bunky transformovanej touto sekvenciou DNA, plazmidu alebo vektora obsahujúceho túto sekvenciu DNA, charakterizovaného polypeptidu a spôsobu jeho výroby a farmaceutického prostriedku na jeho báze. Pojem „sekvencia DNA“ sa používa zameniteľné s pojmami „reťazec DNA“ alebo „sled DNA“.The invention relates to a DNA sequence, a plasmid, a vector, a host cell, an erythropoietin-like polypeptide, a method for its manufacture, and a pharmaceutical composition based thereon. In particular, the invention relates to a DNA sequence for use in providing expression of a polypeptide product whose structure at least partially corresponds to the primary structure of erythropoietin to confer its biological properties in prokaryotic or eukaryotic host cells, a prokaryotic and eukaryotic host cell transformed with that DNA sequence, plasmid or vector a DNA sequence, a characterized polypeptide, and a process for its manufacture; and a pharmaceutical composition based thereon. The term "DNA sequence" is used interchangeably with the terms "DNA strand" or "DNA sequence".
Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
A. Manipulácia s genetickými materiálmiA. Handling of genetic materials
Genetické materiály je možné v širšom význame definovať ako tie chemické štruktúry, ktoré plánujú a uskutočňujú výrobu zložiek buniek a vírusov. Polyméme látky s dlhým reťazcom, kyseliny dezoxyribonukleové (DNA) nesú genetický materiál všetkých živých buniek a vírusov s výnimkou niektorých vírusov, ktorých genetický materiál nesie kyselina ribonukleová (RNA). Opakujúcimi sa jednotkami v polymémej molekule DNA sú štyri rôzne nukleotidy, z ktorých každý je tvorený purínom (adenín alebo guanín) alebo pyrimidínom (tymín alebo cytozín), viazaným na dezoxyribózu s naviazanou fosfátovou skupinou. Väzba nukleotidov v lineárnej polymémej forme sa uskutočňuje prostredníctvom 5'-fosfátu nukleotidu na jednej strane a prostredníctvom 3’-hydroxylovej skupiny na strane druhej. Funkčná DNA sa vyskytuje vo forme dvojitých stálych reťazcov, ktoré vznikajú z jednoduchých reťazcov nukleotidov (nazývaných deoxyoligonukleotidy), reťazce sú spojené vodíkovou väzbou medzi purínovými a pyrimidínovými bázami (ide teda o „komplementárne“ spojenie medzi adenínom (A) a tymínom (T) alebo guanínom (G) a cytozínom (C)). Nukleotidy sú obyčajne nazývané podľa jednotlivých purínových a pyrimidínových báz a komplementárne spojenie nukleotidov v DNA s dvojitým reťazcom (tzn. A-T a G-C) je nazývané „páry báz“. Ribonukleová kyselina je polynukleotid, ktorý obsahuje adenín, guanín, cytozín a miesto tymínu uracil (U) viazaný na ribózu a fosfátovú skupinu.Genetic materials can be broadly defined as those chemical structures that plan and carry out the production of cell and virus components. Long-chain polymeric substances, deoxyribonucleic acids (DNA) carry genetic material of all living cells and viruses, with the exception of some viruses whose genetic material carries ribonucleic acid (RNA). The repeating units in the polymeric DNA molecule are four different nucleotides, each consisting of a purine (adenine or guanine) or a pyrimidine (thymine or cytosine) bound to a phosphate-linked desoxyribose. Binding of the nucleotides in linear polymeric form is effected via the 5'-phosphate nucleotide on the one hand and through the 3'-hydroxyl group on the other. Functional DNA occurs in the form of double-stranded chains, which arise from single strands of nucleotides (called deoxyoligonucleotides), the chains being linked by a hydrogen bond between the purine and pyrimidine bases (i.e., a "complementary" link between adenine (A) and thymine (T) or guanine (G) and cytosine (C)). Nucleotides are commonly referred to as individual purine and pyrimidine bases, and the complementary linkage of nucleotides in double-stranded DNA (i.e., A-T and G-C) is termed "base pairs". A ribonucleic acid is a polynucleotide that contains adenine, guanine, cytosine, and a urine (U) thymine site bound to a ribose and phosphate moiety.
Veľmi krátko uvedené, plánovacia funkcia DNA je obyčajne uskutočňovaná postupom, pri ktorom dochádza k „prepisu“ sledu nukleotidov (génu) do pomerne nestálej mRNA. Táto mRNA slúži ako templát na tvorbu štruktúrnych, riadiacich a katalytických bielkovín z aminokyselín. Proces „translácie“ za účinnosti mRNA v sebe zahŕňa interakcie malých reťazcov RNA (tRNA), ktoré sú kľúčom na prenos jednotlivých aminokyselín v priebehu reťazca mRNA, aby tak mohlo dôjsť k tvorbe polypeptidov so správnym sledom aminokyselín. Toto „posolstvo“ mRNA, odvodenej od DNA a zaisťujúcej interakciu tRNA a orientáciu ktorejkokoľvek z dvadsiatich aminokyselín je podkladom pre „expresiu“ na základe tripletov (kodónov), tzn. sledov troch po sebe idúcich nukleotidov. Tvorba bielkoviny je vrcholnou formou expresie plánovaného genetického posolstva, ktoré je ukryté v slede nukleotidov určitého génu.Very briefly, the DNA planning function is usually performed by a procedure that "transcribes" the nucleotide sequence (gene) into a relatively unstable mRNA. This mRNA serves as a template for the production of structural, control and catalytic proteins from amino acids. The process of 'translation' under mRNA efficiency involves the interactions of small RNAs (tRNAs), which are key to the transfer of individual amino acids along the mRNA strand, so that polypeptides with the correct amino acid sequence can be produced. This "message" of mRNA, derived from DNA and ensuring the interaction of tRNA and orientation of any of the twenty amino acids, is the basis for "expression" based on triplets (codons); sequences of three consecutive nucleotides. Protein formation is the ultimate form of expression of a planned genetic message that is hidden in the nucleotide sequence of a particular gene.
Promótory sú sledy DNA, ktoré sú obyčajne uložené pred génom v polyméri DNA a predstavujú miesto, v kto rom začína transkripcia do mRNA. Riadiacim sledom DNA, nachádzajúcim sa obyčajne tiež „pred“ génom v danom polyméri DNA zahŕňa bielkovinu, ktorá určuje častosť alebo rýchlosť počiatku transkripcie.Promoters are sequences of DNA that are usually placed upstream of a gene in a DNA polymer and represent the point at which the transcription into mRNA begins. A DNA control sequence, usually also upstream of a gene in a given DNA polymer, includes a protein that determines the frequency or rate of the transcription start.
Systém „promótor/riadiaci sled“ alebo len „riadiaci systém“ je teda sled, ktorý je uložený pred génom (alebo pred génmi) vo funkčnom polyméri DNA a ktorý určuje či dôjde k transkripcii a prípadne k expresii určitého génu. Sledy DNA, ktoré sú uložené „za“ génom alebo za génmi v polymémej DNA znamenajú signál na ukončenie transkripcie do mRNA, ide teda o „terminačné“ sledy.Thus, a "promoter / control sequence" or "control system" is a sequence that is inserted upstream of a gene (or genes) in a functional DNA polymer and that determines whether a particular gene will be transcribed and possibly expressed. DNA sequences that are located downstream or downstream of the genes in the polymeric DNA are a signal to terminate transcription into mRNA, i.e. they are "termination" sequences.
Stredom pozornosti mikrobiológov v poslednom desaťročí bolo úsilie o priemyselnú výrobu látok, dôležitých z priemyselného alebo farmaceutického hľadiska pri použití organizmov, ktoré vo svojom genetickom materiáli pôvodne nemali zahrnutú informáciu, týkajúcu sa požadovaného produktu alebo (v prípade cicavčích buniek v tkanivovej kultúre) pri nich obyčajne nedochádza k expresii chromozomálneho génu vo väčšom meradle. V tomto prípade sa gén, ktorý je špecifický pre štruktúru požadovaného polypeptidu buď izoluje z organizmu, ktorý tento gén obsahuje, alebo sa vyrobí chemicky a potom sa nastálo včlení do iného organizmu, ktorým je obvykle normálnym spôsobom sa rozmnožujúci jednobunkový organizmus, napríklad baktéria, kvasinka alebo cicavčia bunka v tkanivovej kultúre. Len čo nato raz dôjde, dôjde aj k bežnej činnosti existujúceho mechanizmu bunky v tejto „transformovanej“ bunke po „transfekcii“ ku konštrukcii požadovaného produktu, pričom exogénna DNA sa používa ako templát na transkripciu mRNA s nasledujúcou transláciou za vzniku kontinuálneho sledu aminokyselinových zvyškov.The focus of microbiologists in the last decade has been the effort to industrially produce substances important from an industrial or pharmaceutical point of view, using organisms that did not initially have information in their genetic material regarding the desired product or (in the case of mammalian cells in tissue culture) there is no large-scale expression of the chromosomal gene. In this case, a gene that is specific for the structure of the polypeptide of interest is either isolated from the organism containing the gene, or is produced chemically and then continuously incorporated into another organism, which is normally a normal single-cell multiplying organism, such as bacteria, yeast. or a mammalian cell in tissue culture. Once this occurs, the normal functioning of the existing cell mechanism in this "transformed" cell after "transfection" to construct the desired product occurs, with exogenous DNA being used as a template for transcription of mRNA followed by translation to produce a continuous sequence of amino acid residues.
V odbore je známy celý rad publikácií, ktoré sa týkajú metód s použitím „rekombinantnej DNA“ na izoláciu, syntézu, čistenie a množenie genetického materiálu na použitie k transformácii zvoleného hostiteľského organizmu. V US patentovom spise č. 4 237 224 (Cohen a ďalšie) sa napríklad opisuje transformácia jednobunkového hostiteľa pôsobením „hybridnej“ vírusovej alebo cirkulámej plazmidovej DNA, ktorá obsahuje zvolené sledy exogénnej DNA. Pri vykonávaní spôsobu, ktorý je zahrnutý v uvedenom patentovom spise sa postupuje tak, že sa najskôr získa vektor pre transformáciu enzymatickým rozštiepením vírusovej alebo cirkulámej plazmidovej DNA za vzniku lineárnych reťazcov DNA. Použitím obdobných enzýmov sa potom pripravia vybrané „exogénne“ alebo „heterológne“ reťazce, ktoré obyčajne obsahujú kódovú oblasť pre požadovaný produkt, a to tiež v lineárnej forme. Lineárna vírusová alebo plazmidová DNA sa potom inkubuje s exogénnou DNA v prítomnosti enzýmov pre väzbu, ktoré umožňujú opätovné naviazanie fragmentov za vzniku „hybridných“ vektorov, ktoré obsahujú zvolený segment exogénnej DNA, ktorý je „vsunutý“ do vírusovej alebo cirkulámej plazmidovej DNA.A number of publications are known in the art regarding methods using "recombinant DNA" for the isolation, synthesis, purification and propagation of genetic material for use in transforming a selected host organism. U.S. Pat. No. 4,237,224 (Cohen et al.) Describes, for example, the transformation of a single-cell host by treatment with a "hybrid" viral or circular plasmid DNA that contains selected sequences of exogenous DNA. In carrying out the method encompassed by said patent, the first step is to obtain a vector for transformation by enzymatic cleavage of viral or circular plasmid DNA to form linear DNA strands. Using similar enzymes, selected "exogenous" or "heterologous" chains are then prepared, which usually contain the coding region for the desired product, also in linear form. The linear viral or plasmid DNA is then incubated with exogenous DNA in the presence of binding enzymes that allow the fragments to be re-ligated to form "hybrid" vectors containing a selected segment of exogenous DNA that is "inserted" into viral or circular plasmid DNA.
Transformácia vhodného jednobunkového hostiteľa takto získaným hybridným vektorom vedie k tvorbe mnohopočetných kópií exogénnej DNA v populácii hostiteľských buniek. V niektoiých prípadoch je požadovaným výsledkom prosté namnoženie cudzorodej DNA a získaným „produktom“ je teda samotná táto DNA. Častejšie je však cieľom celej transformácie expresia exogénnej DNA bunkami hostiteľa vo väčšom meradle, takže je možné získať izolovateľné množstvá komerčne významných fragmentov bielkovín alebo polypeptidov, pre ktorých je kódom exogénna DNA. Podobné postupy boli opísané tiež v ďalších patentových spisoch, napríklad v US patentových spisoch č. 4 264 731, (Shine), 4 273 875 (Manis), 4 293 652 (Cohen) a v európskom patentovom spise č. 93 619 z 9. novembra 1983.Transformation of a suitable one-cell host with the hybrid vector thus obtained results in the generation of multiple copies of exogenous DNA in the host cell population. In some cases, the desired result is a simple multiplication of foreign DNA, and thus the "product" obtained is that DNA itself. More often, however, the goal of the entire transformation is to express host-scale exogenous DNA on a larger scale so that it is possible to obtain isolable amounts of commercially significant fragments of proteins or polypeptides encoded by exogenous DNA. Similar procedures have also been described in other patents, for example US Pat. No. 4,264,731, (Shine), 4,273,875 (Manis), 4,293,652 (Cohen), and in European Patent Publication No. 5,167,144. 93 619 of November 9, 1983.
Vývoj špecifických sledov DNA na včlenenie do vektorov DNA je možné uskutočniť najrôznejšími spôsobmi, ktoré do značnej miery závisia od „cudzorodosti“ „darcu“ vzhľadom na predpokladaný hostiteľ a na veľkosť molekuly polypeptidu, ku ktorého expresii má v organizmu hostiteľa dôjsť. Vo veľkom zjednodušení je možné uviesť základné tri spôsoby, a toThe development of specific DNA sequences for incorporation into DNA vectors can be accomplished in a variety of ways, which depend largely on the "donor" "foreign" nature of the host envisaged and the size of the polypeptide molecule to be expressed in the host organism. In a great simplification, three basic ways can be mentioned, namely
1. spôsob, ktorý spočíva v izolácii sledu DNA s dvojitým reťazcom z genómu darcu,1. a method of isolating a double-stranded DNA sequence from the donor genome,
2. spôsob, ktorý spočíva v chemickej výrobe sledu DNA, ktoiý je kódom pre požadovaný polypeptid a2. A method comprising chemically producing a DNA sequence encoding a polypeptide of interest; and
3. syntéza DNA s dvojitým reťazcom in vitro pri použití enzýmu takzvanou reverznou transkripciou mRNA, ktorá bola izolovaná z buniek darcu.3. Synthesis of double-stranded DNA in vitro using an enzyme called reverse transcription of mRNA isolated from donor cells.
Spôsoby, pri ktorých dochádza k tvorbe DNA, ktorá je „komplementárna“ príslušnej mRNA sa obyčajne uvádzajú ako spôsoby s použitím cDNA.Methods that produce DNA that is "complementary" to the mRNA of interest are commonly referred to as cDNA methods.
Výroba sledu DNA je často metódou voľby v prípade, že je známy celý sled zvyškov aminokyselín požadovaného polypeptidu. Tento postup je opísaný napríklad v US patentovej prihláške č. 483 451 (Alton), ktorá bola podaná 15. apríla 1983 a zverejnená 24. novembra 1983 ako WO83/O4053). V tejto publikácii sa opisujú prostriedky, ktoré dovoľujú dosiahnuť veľmi dobré výsledky, ako: možnosť zavedenia altemačných kodónov, ktoré sa obyčajne v génoch nachádzajú, najmä v tých, ku ktorých vysokej expresii dochádza λ' organizme hostiteľa (ide napríklad o „preferenčné“ kodóny pre prípad použitia určitého hostiteľa, napríklad kvasiniek alebo E. coli), ďalej zaistenie neprítomnosti neprenášaného „intrónu“, tzn. vnútri uloženého sledu, ktorý je často a bežne prítomný v genómickej DNA cicavcov a tiež v príslušnej mRNA a nie je ďalej spracovávaný bunkou prokaryotického hostiteľa, ďalej zábrana expresie nepožadovaných „vedúcich“ sledov polypeptidov, ktoré sú bežne prítomné, ale nie sú ľahko odštepované z výsledného polypeptidu bunkami baktérií alebo kvasiniek, ďalej zaistenie dobrého včlenenia DNA do vhodného vektora pre expresiu v spojení s požadovaným systémom promótor/regulátor (riadiaci sled) a so sledom na ukončenie prenosu a konečne konštrukcie génov, ktoré sú kódom pre fragmenty polypeptidov a pre analógy požadovaných polypeptidov.The production of a DNA sequence is often a method of choice when the entire sequence of amino acid residues of the desired polypeptide is known. This procedure is described, for example, in U.S. Pat. No. 483,451 (Alton), filed April 15, 1983 and published November 24, 1983 as WO83 / O4053). This publication describes the means for achieving very good results, such as: the possibility of introducing alternative codons that are commonly found in genes, especially those that are highly expressed by the λ 'organism of the host (such as' preferential' codons for in the case of the use of a particular host (e.g. yeast or E. coli), further ensuring the absence of a non-transmitted "intron"; within a deposited sequence that is frequently and commonly present in mammalian genomic DNA as well as in the respective mRNA and is not further processed by a prokaryotic host cell, further preventing expression of unwanted "leader" polypeptide sequences that are commonly present but not readily cleaved from the resulting of the polypeptide by the bacteria or yeast cells, further ensuring good incorporation of the DNA into a suitable expression vector in conjunction with the desired promoter / regulator system (control sequence), and a sequence to terminate the transfer and finally construct genes encoding the polypeptide fragments and analogs of the polypeptides of interest .
V prípade, že nie je známy celý sled aminokyselinových zvyškov v požadovanom polypeptide, nie je možné vyrobiť sled DNA priamo a metódou voľby sa potom stáva izolácia sledu DNA, ktorý' je kódom pre požadovaný polypeptid metódou s použitím cDNA cez potenciálne nevýhody. Týmto spôsobom je možné získať vektory pre expresiu, zaisťujúce vysokú úroveň mikrobiálnej expresie tak, ako to bolo uvedené. Jedným zo štandardných postupov na izoláciu sledu cDNA požadovaného výsledného produktu je príprava cDNA plazmidov, získaných reverznou transkripciou mRNA, ktorá sa vo veľkom množstve nachádza v bunkách „darcu“. Ide napríklad o celú skupinu vzoriek cDNA, odvodených z buniek hypofýzy, pri ktorých použití dochádza k expresii pomerne značných množstiev rastového hormónu ako výsledného produktu. Tam, kde sú známe podstatné časti sledu aminokyselinových zvyškov polypeptidu, je možné použiť značené sledy DNA s jedným reťazcom, ktoré sa spojujú na sledy, pravdepodobne prítomné v „cieľovej“ cDNA. Tieto sledy sa potom používajú na hybridizačné postupy DNA/DNA, ktoré sú vykonávané na klonovaných kópiách cDNA, denaturovaných na formu s jedným reťazcom. Tieto postupy boli opísané napríklad v US patentovom spise č. 4 394 443 (Weisman a ďalšie) a v celom rade publikácií, napríklad Wallace a ďalšie, Nuc. Acids. Res. 6, str. 3543 až 3557 (1979), Reyes a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 79, str. 3270 až 3274 (1982) a Jaye a ďalšie, Nuc.If the entire sequence of amino acid residues in the desired polypeptide is not known, it is not possible to produce the DNA sequence directly and then isolating the DNA sequence coding for the desired polypeptide by the cDNA method is a method of choice despite potential disadvantages. In this way, it is possible to obtain expression vectors ensuring a high level of microbial expression as described above. One standard procedure for isolating the cDNA sequence of the desired end product is to prepare cDNA plasmids obtained by reverse transcription of mRNA, which is found in large numbers in "donor" cells. For example, a whole group of cDNA samples derived from pituitary cells express relatively large amounts of growth hormone as a resultant product. Where substantial portions of the amino acid residue sequence of a polypeptide are known, labeled single-stranded DNA sequences that link to sequences likely to be present in the "target" cDNA may be used. These sequences are then used for DNA / DNA hybridization procedures performed on cloned copies of cDNA denatured to a single stranded form. These processes have been described, for example, in U.S. Pat. No. 4,394,443 (Weisman et al.) And numerous publications such as Wallace et al., Nuc. Acids. Res. 6, p. 3543-3557 (1979); Reyes et al., P. N.A. S. (USA) 79, p. 3270-3274 (1982) and Jaye et al., Nuc.
Acids Res. 11, str. 2325 až 2335 (1983). Tiež v US patentovom spise č. 4 358 535 (Falkow a ďalšie) sa opisuje hybridizácia typu DNA/DNA pri uskutočňovaní diagnóz, v uverejnenej európskej patentovej prihláške č. 70685 a 70687 sa opisuje spôsob značenia polynukleotidov s jedným reťazcom. Davis a ďalšie v „A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics“ Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1980) str. 55 až 58 a 174 až 176 opisujú hybridizáciu kolónií a povlakov a v brožúre New England Nuclear (Boston, Mass.) pre membránové materiály, určené na vyhľadávanie génov je možné nájsť inštrukcie na prenos a hybridizáciu DNA a RNA (Katalógové číslo NEF-972).Acids Res. 11, p. 2325-2335 (1983). Also, U.S. Pat. U.S. Patent No. 4,358,535 to Falkow et al. 70685 and 70687 disclose a method for labeling single-stranded polynucleotides. Davis et al., "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980) p. 55-58 and 174-176 describe the hybridization of colonies and coatings, and instructions for transferring and hybridizing DNA and RNA (Catalog No. NEF-972) can be found in the New England Nuclear (Boston, Mass.) Brochure for gene finding materials.
Z významnejších noviniek hybridizačných postupov pri rekombinantnom klonovani je nutné uviesť napríklad použitie značených zmiešaných vzoriek syntetických oligonukleotidov, z ktorých každá je potenciálnym úplným doplnkom špecifického sledu DNA v hybridizačnej vzorke vrátane heterogénnej zmesi RNA alebo DNA s jednoduchým reťazcom. Tieto postupy sú najmä dobre použiteľné pri vyhľadávaní klonov cDNA, odvodených zo zdrojov, v ktorých je k dispozícii veľmi malé množstvo mRNA pre požadovaný polypeptid. Zmysel postupu spočíva v tom, že sa volia obmedzené hybridizačné podmienky tak, aby pokiaľ možno nedochádzalo k nešpecifickým väzbám pri následnej autorádiografickej vizualizácii špecifického klonu cDNA pri hybridizácii cieľovej DNA na túto jedinú vzorku, ktorá je v zmesi úplným komplematom uvedeného sledu. Tieto postupy boli opísané v rôznych publikáciách, napríklad Wallace a ďalšie, Nuc. Acids Res. 9, str. 879 až 897 (1981), Suggs a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 78, str. 6613 až 6617 (1981), Choo a ďalšie, Náture 299, str. 178 až 180 (1982), Kurachi a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 79, str. 6461 až 6464 (1982), Ohkubo a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 80, str. 2196 až 2200 (1983) a Komblihtt a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 80, str. 3218 až 3222 (1983). Všeobecne je možné uviesť, že postupy s použitím zmiešaných vzoriek tak, ako boli uvedené v publikácii Wallace a ďalších (1981) boli ďalej rozpracovávané rôznymi pracovníkmi tak, že bolo možné dosiahnuť uspokojivé výsledky pri izolácii klonov cDNA pri použití zmesi 32 reťazcov s dĺžkou 16 báz s rôznym sledom báz spolu s jedným reťazcom s dĺžkou 11 báz na uskutočnenie obojstranného „potvrdenia“ prítomnosti požadovanej cDNA, ako to bolo opísané v publikácii Singer-Sam a ďalšie P. N. A. S. (USA) 80, str. 802 až 806 (1983).Among the more significant novelizations of recombinant cloning hybridization procedures, for example, the use of labeled mixed synthetic oligonucleotide samples, each of which is a potential complete complement to a specific DNA sequence in a hybridization sample, including a heterogeneous mixture of RNA or single stranded DNA. In particular, these methods are useful for screening cDNA clones derived from sources in which a very small amount of mRNA is available for the polypeptide of interest. The purpose of the procedure is to select limited hybridization conditions so as to avoid, as far as possible, non-specific binding during subsequent autoradiographic visualization of a specific cDNA clone upon hybridization of the target DNA to this single sample, which is a complete complication of the sequence. These procedures have been described in various publications, for example, Wallace et al., Nuc. Acids Res. 9, p. 879-897 (1981), Suggs et al., P. N.A. S. (USA) 78, p. 6613-6617 (1981); Choo et al., Nature 299, p. 178-180 (1982), Kurachi et al., P. N.A. S. (USA) 79, p. 6461-6464 (1982), Ohkubo et al., P. N.A. S. (USA) 80, p. 2196-2200 (1983) and Komblihtt et al., P. N.A. S. (USA) 80, p. 3218-3222 (1983). In general, mixed sample procedures as described by Wallace et al. (1981) were further elaborated by various personnel to obtain satisfactory results in isolation of cDNA clones using a mixture of 32 strands of 16 bases in length. with a different base sequence along with a single 11-base chain to perform two-way "confirmation" of the presence of the desired cDNA as described by Singer-Sam et al. PNAS (USA) 80, p. 802-806 (1983).
Použitie DNA izolovanej z genómov je spoločným znakom aspoň troch uvedených postupov získania sledov DNA, špecifických pre použitie v rekombinantných postupoch. Osobitne to platí pri postupoch, ktoré majú zaistiť mikrobiálnu expresiu polypeptidov cicavcov, kde je hlavným problémom komplexnosť DNA genómu cicavcov. Existujú pomerne vhodné postupy pre fágom nesené zmesi DNA genómu človeka a ďalších cicavcov, ako to bolo opísané napríklad v Lawn a ďalšie, Celí 15, str. 1157 až 1174 (1978), kde sa opisuje postup na získanie „knižnice“ ľudského genómu, nazývanej „Maniatis Library“, Kam a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 77, str. 5172 až 5176 (1980), publikácia sa vzťahuje k ľudskej genómovej „knižnici“ založenej na štiepení endonukleázami a Blattner a ďalšie, Science 196, str. 161 až 169 (1977), kde sa opisuje konštrukcia „knižnice“ genómu hovädzieho dobytka. Na druhej strane bolo uskutočnených len veľmi málo úspešných pokusov s hybridizačnými postupmi pri získavaní DNA genómu v prípade, že nebol vopred dobre známy sled aminokyselín alebo sled báz príslušnej DNA. Príkladom môže byť publikácia Fiddes a ďalšie, J. Mol. and Appl. Genetics 1, str. 3 až 18 (1981), kde sa opisuje úspešná izolácia génu, ktorý je kódom pre podjednotku a ľudského pituitámeho glyko proteínu (hormónu) z „Maniatis Library“ pri použití vzorky s „plnou dĺžkou“ 621 párov báz z vopred izolovaného sledu cDNA pre podjednotku a. Ďalším príkladom môže byť publikácia Das a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 80, str. 1531 až 1535 (1983), kde sa opisuje izolácia klonov ľudského genómu pre ľudský HLA-DR pri použití syntetického oligonukleotidu so 175 pármi báz. Konečne Anderson a ďalšie v P. N. A. S. (USA) 80, str. 6838 až 6842 (1983) opisujú izoláciu klonu z genómu pre pankreatický inhibítor trypsínu hovädzieho dobytka (BPTI) pri použití jedinej vzorky s dĺžkou 86 párov báz, vzorka bola konštruovaná podľa známeho sledu aminokyselín v BPTI. Autori uvádzajú nedostatoční metódy na izoláciu mRNA, ktorá by bola vhodná na získanie zbierky cDNA v dôsledku zjavne príliš nízkej hladiny mRNA v slinnej žľaze a v pľúcnom tkanive, ktoré boli zdrojom tejto kyseliny a opisujú tiež možnosti sledovania genómu pri použití zmesi značených vzoriek, pričom uvádzajú, že:The use of DNA isolated from genomes is a common feature of at least the three procedures described above to obtain DNA sequences specific for use in recombinant procedures. This is particularly true in procedures designed to ensure microbial expression of mammalian polypeptides where the main problem is the complexity of the mammalian genome DNA. There are relatively suitable procedures for phage-borne mixtures of the DNA genome of human and other mammals, as described, for example, in Lawn et al., Cell 15, p. 1157-1174 (1978), which describes a procedure for obtaining a "library" of the human genome called the "Maniatis Library", Kam et al., P. N.A.S (USA) 77, p. 5172-5176 (1980), the publication relates to a human genomic "library" based on endonuclease cleavage, and Blattner et al., Science 196, p. 161-169 (1977), which describes the construction of a "library" of the bovine genome. On the other hand, very few successful attempts have been made with hybridization procedures to obtain the DNA genome if the amino acid sequence or base sequence of the DNA in question was not well known in advance. An example is Fiddes et al., J. Mol. and Appl. Genetics 1, p. 3-18 (1981), which describes the successful isolation of a gene coding for a subunit and a human pituitary glyco protein (hormone) from the "Maniatis Library" using a "full-length" sample of 621 base pairs from a pre-isolated cDNA sequence for the subunit a. Another example is Das et al., P. N.A. S. (USA) 80, p. 1531-1535 (1983), which describes the isolation of human human HLA-DR genome clones using a synthetic 175 base pair oligonucleotide. Finally, Anderson et al., P. N.A. S. (USA) 80, p. 6838-6842 (1983) describe the isolation of a clone from the pancreatic bovine trypsin inhibitor (BPTI) genome using a single 86 base pair sample, the sample was constructed according to a known sequence of amino acids in BPTI. The authors report inadequate methods for isolating mRNA that would be suitable for obtaining a cDNA collection due to apparently too low levels of mRNA in the salivary gland and lung tissue that were the source of the acid, and also describe genome tracking options using a mixture of labeled samples, that:
„všeobecnejšie povedané, boli použité vzorky, ktoré obsahovali zmes sledov oligonukleotidov na izoláciu bielkovinových génov s neznámym sledom zo zmesi cDNA. Tieto vzorky majú obyčajne formu zmesi 8 až 32 oligonukleotidov s dĺžkou 14 až 17 nukleotidov, ktoré predstavujú najrôznejšie možné kombinácie kodónov pre malé sledy (5 až 6 zvyškov) aminokyselín. Za obmedzených podmienok hybridizácie, ktoré obmedzujú vznik vzoriek s nesprávnymi pármi báz môžu tieto vzorky pomôcť k zisteniu špecifického sledu génu v zmesi klonov, ktorá nie je príliš komplexná. Vzhľadom na svoju malú dĺžku a na svoju heterogenitu však vzorka nemá špecifickosť, ktorá by bola potrebná na zistenie tak komplexných sledov, akými sú sledy v genóme cicavca. Týmto spôsobom je tento postup nepoužiteľný pri izolácii bielkovinových génov cicavcov v prípade, že nie je možné získať zodpovedajúcu mRNA.“More generally, samples were used that contained a mixture of oligonucleotide sequences to isolate protein genes of unknown sequence from the cDNA mixture. These samples typically take the form of a mixture of 8 to 32 oligonucleotides with a length of 14 to 17 nucleotides, which represent the most diverse possible codon combinations for small sequences (5 to 6 residues) of amino acids. Under limited hybridization conditions that limit the formation of samples with incorrect base pairs, these samples can help to detect a specific sequence of the gene in a clone mixture that is not very complex. However, due to its small length and heterogeneity, the sample does not have the specificity that would be required to detect sequences as complex as those in the mammalian genome. In this way, this procedure is unsuitable for the isolation of mammalian protein genes in the event that the corresponding mRNA cannot be obtained. '
Je teda zrejmé, že existuje trvalá potreba navrhnúť zlepšené metódy na uskutočnenie rýchlej a účinnej izolácie klonov cDNA v prípadoch, kde nie sú k dispozícii dostatočné informácie, týkajúce sa sledu aminokyselín polypeptidu, pre ktorý má gén byť kódom a kde nie sú k dispozícii „obohatené“ tkanivá ako zdroj mRNA na konštrukciu zmesi cDNA. Takto zlepšené metódy by boli osobitne užitočné v prípade, že by ich bolo možné aplikovať na izoláciu génov genómu cicavcov, pri ktorých sú k dispozícii len obmedzené informácie, týkajúce sa sledov aminokyselín v polypeptidoch, pte ktoré sú kódom hľadané gény.Thus, there is a continuing need to devise improved methods for performing rapid and efficient isolation of cDNA clones in cases where insufficient information is available regarding the amino acid sequence of the polypeptide for which the gene is to be coded and where "enriched" is not available. Tissues as a source of mRNA for the construction of a cDNA mixture. Such improved methods would be particularly useful if they could be applied to the isolation of genes of the mammalian genome for which limited information is available regarding amino acid sequences in polypeptides encoded by the genes sought.
B. Etytropoetín ako cieľový polypeptidB. Etythropoietin as a target polypeptide
Erytropoéza, tzn. tvorba červených krviniek prebieha kontinuálne po celý život na náhradu buniek, ktoré podľahli deštrukcii. Ide o veľmi presne riadený fyziologický pochod, ktorý umožňuje, aby bolo k dispozícii dostatočné množstvo červených krviniek v krvi na dobré okysličenie tkanív, krviniek však nesmie byť toľko, aby bol obmedzený obeh krvi. Červené krvinky sa vytvárajú v kosťovej dreni a ich tvorba je riadená hormónom erytropoetínom.Erythropoiesis, ie. the production of red blood cells occurs continuously throughout the life to replace cells that have undergone destruction. This is a very well-controlled physiological process that allows enough red blood cells to be available in the blood to properly oxygenate the tissues, but the blood cells must not be enough to limit blood circulation. Red blood cells are formed in the bone marrow and their production is controlled by the hormone erythropoietin.
Erytropoetín je kyslý glykoproteín s molekulou hmotnosťou približne 34 000 jednotiek a môže sa vyskytovať v troch formách: α, β a asialo. Formy a a β sa od seba trocha líšia v uhľohydrátovej zložke, ale majú rovnakú účinnosť, biologický účinok aj molekulovú hmotnosť. Forma asialo je forma a alebo β, z ktorej je odstránená koncová uhľohydrátová skupina. Erytropoetín je prítomný v plazme vo veľmi nízkych koncentráciách v prípade, že tkanivá pri plnom zdraví sú dostatočne prevzdušňované pri existujúcom množstve erytrocytov. Táto normálna nizka koncentrácia je dostatočná na stimuláciu náhrady červených krviniek, ktoré normálne v priebehu svojho starnutia podliehajú fyziologickému rozpadu.Erythropoietin is an acidic glycoprotein with a molecular weight of approximately 34,000 units and can occur in three forms: α, β, and asialo. Forms a and β differ somewhat in the carbohydrate component, but have the same potency, biological effect and molecular weight. The asialo form is a or β form from which the terminal carbohydrate group is removed. Erythropoietin is present in plasma at very low concentrations when tissues in good health are adequately aerated with existing levels of erythrocytes. This normal low concentration is sufficient to stimulate the replacement of red blood cells that normally undergo physiological breakdown during their aging.
Množstvo erytropoetínu v obehu sa zvyšuje pri nedostatku kyslíka v prípade, že je znížený prenos kyslíka červenými krvinkami krvného obehu. Hypoxia môže byť spôsobená stratou veľkého množstva krvi krvácaním, deštrukciou červených krviniek pri vystavení vplyvu žiarenia, znížením príjmu kyslíka vo veľkých výškach alebo v dôsledku dlhého bezvedomia alebo v prípade rôznych foriem anémie. Ako odpoveď na stres hypoxického tkaniva erytropoetín zvýši produkciu červených krviniek stimuláciou premeny primitívnych zárodočných buniek v kosťovej dreni na proerytroblasty, ktoré postupne dozrievajú, syntetizujú hemoglobín a sú uvoľňované do krvného obehu ako červené krvinky. V prípade, že množstvo červených krviniek v obehu je väčšie, ako je potrebné pre normálne požiadavky tkanív na kyslík, zníži sa hladina erytropoetínu v obehu.The amount of erythropoietin in the circulation increases when there is a lack of oxygen when the oxygen transfer by the red blood cells in the bloodstream is reduced. Hypoxia may be caused by the loss of large amounts of blood by bleeding, destruction of red blood cells when exposed to radiation, reduced oxygen intake at high altitudes or due to long unconsciousness or in the case of various forms of anemia. In response to hypoxic tissue stress, erythropoietin will increase red blood cell production by stimulating the conversion of primitive germ cells in the bone marrow into proerythroblasts that gradually mature, synthesize hemoglobin and are released into the bloodstream as red blood cells. If the circulating red blood cell count is greater than necessary for normal tissue oxygen requirements, the circulating erythropoietin level will decrease.
Tieto pomery sú opísané napríklad v publikáciách Testa a ďalšie, Extp. Hematol., B (Supp. 8), 144 až 152 (1980), Tong a ďalšie, J. Biol. Chem. 256 (24), 12666 až 12672 (1981), Goldwasser, J. Celí. Physiol. 110 (Supp. 1) 133 až 135 (1982), Finch, Blood, 60 (6), 1241 až 1246 (1982), Sytowski a ďalšie, Expt. Hematol., 8, (Supp. 8), 52 až 64 (1980), Naughton, Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (5), 432 až 438 (1983), Weiss a ďalšie, Am. J. Vet. Res. 44 (10), 1832 až 1835 (1983), Lappin a ďalšie, Exp. Hematol., 11 (7), 661 až 666 (1983), Baciu a ďalšie, Ann. N. Y. Acad. Sci. 414, 66 až 72 (1983), Murphy a ďalšie, Acta Haematologica Japonica 46 (7), 1380 až 1396 (1983), Dessypris a ďalšie, Brit. J. Haematol., 56, 295 až 306 (1983), Emannouel a ďalšie, Am. J. Physiol 247 (lPt 2) F 168-76 (1984).These ratios are described, for example, in Testa et al., Extp. Hematol., B (Supp. 8), 144-152 (1980); Tong et al., J. Biol. Chem. 256 (24), 12666-12672 (1981); Goldwasser, J. Cell. Physiol. 110 (Supp. 1) 133-135 (1982), Finch, Blood, 60 (6), 1241-1246 (1982), Sytowski et al., Expt. Hematol., 8, (Supp. 8), 52-64 (1980), Naughton, Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (5), 432-438 (1983), Weiss et al., Am. J. Vet. Res. 44 (10), 1832-1835 (1983); Lappin et al., Exp. Hematol., 11 (7), 661-666 (1983); Baciu et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 414, 66-72 (1983); Murphy et al., Acta Haematologica Japonica 46 (7), 1380-1396 (1983); Dessypris et al., Brit. J. Haematol., 56, 295-306 (1983); Emannouel et al., Am. J. Physiol 247 (Ip 2) F 168-76 (1984).
Pretože erytropoetín je podstatným faktorom pre tvorbu červených krviniek, je tento hormón potenciálne užitočný na diagnostiku aj na liečbu krvných porúch, ktoré sú charakterizované nízkou alebo defektnou tvorbou červených krviniek. Tieto skutočnosti boli opísané v publikáciách Pennartur-Das a ďalšie, Blood 63 (5), 1168 až 71 (1984) a Haddy, Am. J. Ped. Hematol./Oncol. 4, 191 až 196 (1982), publikácie sa týkajú erytropoetínu ako možného lieku pre chorobu, pri ktorej majú červené krvinky kosákový tvar a Esbach a ďalšie, J. Clin. Invest. 74 (2), str. 434 až 441, 1984), kde sa opisuje spôsob liečby pri uremickej ovci a vplyv infúzií plazmy, bohatej na etytropoetín, pričom sa navrhujú dávky 10 jednotiek erytropoetínu (EPO)/kg a deň počas 15 až 40 dní na úpravu anémie, ktorá sa vyskytuje pri chronickom zlyhaní obličiek. Podobný problém rozoberá tiež autor publikácie Krane, Henry Ford Hosp. Med. J., 31 (3), 177 až 181 (1983).Because erythropoietin is an essential factor in the production of red blood cells, this hormone is potentially useful for both diagnosis and treatment of blood disorders that are characterized by low or defective red blood cell production. This has been described in Pennartur-Das et al., Blood 63 (5), 1168-71 (1984) and Haddy, Am. J. Ped. Hematol./Oncol. 4, 191-196 (1982), publications refer to erythropoietin as a possible drug for a disease in which the red blood cells have a crescent shape and Esbach et al., J. Clin. Invest. 74 (2), p. 434-441 (1984), which describes a method of treatment in uremic sheep and the effect of plasma infusion of rich in ethythropoietin, suggesting doses of 10 erythropoietin (EPO) / kg per day for 15 to 40 days to correct the anemia that occurs in chronic renal failure. A similar problem is also discussed by Krane, Henry Ford Hosp. Med. J., 31 (3), 177-181 (1983).
V poslednom čase bolo preukázané, že v prípade, že by bol erytropoetín k dispozícii v dostatočnom množstve, bolo by možné ročne liečiť anémiu 1 600 000 chorých le USA, ako to bolo opísané v publikácii Morrison, „Bioprocessing in Space - an overview“, str. 557 až 571 v The World Biotech. Report 1984, zväzok 2, USA (Online Publications, New York, N. Y., 1984). Štúdie v poslednom čase boli základom pre odhad účinnosti erytropoetínu pri rôznych chorobných stavoch, porúch a hematologických nepravidelností, ako to bolo opísané v publikáciách Vedovato a ďalšie, Acta Haematol. 71, 211 až 213 (1984) (Btlassemia), Vichinsky a ďalšie, J. Pediatr. 105 (1), 15 až 21, 1984 (cystická fibróza), Cotes a ďalšie, Brit. J. Obstet. Gyneacol. 90 (4), 304 až 311 (1983) (ťarchavosť, menštruačné ťažkosti), Haga a ďalšie, Acta Pediatr. Scand. 72, 827 až 831, 1983 (časná anémia pri nezrelosti), Claus-Walker a ďalšie, Árch. Phys. Med. Rehabil. 65, 370 až 374, 1984 (poranenie chrbtice), Dunn a ďalšie, Eur J. Appl. Physiol. 52, 178 až 182, 1984 (kozmické lety), Miller a ďalšie, Brit. J. Haematol. 52, 545 až 590, 1982 (akútna strata krvi), Udupa a ďalšie, J. Lab. Clin. Med. 103 (4), 574 až 580 a 581Recently, it has been shown that if erythropoietin was available in sufficient quantities, 1,600,000 anemia patients could be treated annually as described in Morrison, "Bioprocessing in Space - an overview", p. 557-571 in The World Biotech. Report 1984, Volume 2, USA (Online Publications, New York, N.Y., 1984). Recent studies have been the basis for estimating the efficacy of erythropoietin in various disease states, disorders and haematological irregularities, as described in Vedovato et al., Acta Haematol. 71, 211-213 (1984) (Btlassemia), Vichinsky et al., J. Pediatr. 105 (1), 15-21, 1984 (cystic fibrosis), Cotes et al., Brit. J. Obstet. Gyneacol. 90 (4), 304-311 (1983) (abusiveness, menstrual complaints), Haga et al., Acta Pediatr. Scand. 72, 827-831 (1983) (early anemia of immaturity), Claus-Walker et al., Ar. Phys. Med. Rehab. 65, 370-374, 1984 (spinal injuries), Dunn et al., Eur J. Appl. Physiol. 52, 178-182, 1984 (space flights), Miller et al., Brit. J. Haematol. 52, 545-590, 1982 (acute blood loss), Udupa et al., J. Lab. Clin. Med. 103 (4), 574-580 and 581
SK 279959 Β6 až 588 (1984), a Lipschitz a ďalšie, Blood, 63 (3), 502 až 509, 1983 (starnutie) a Daniak a ďalšie, Cancer 51 (6), 1101 až 1106 (1983) a Schwartz a ďalšie, Otolaryng. 109, 269 až 272 (1983) (rôzne neoplastické ochorenia, spojené s abnormálnou erytropoézou).SK 279959-6-588 (1984), and Lipschitz et al., Blood, 63 (3), 502-509, 1983 (aging) and Daniak et al., Cancer 51 (6), 1101-1106 (1983) and Schwartz et al. , Otolaryng. 109, 269-272 (1983) (various neoplastic diseases associated with abnormal erythropoiesis).
Predchádzajúce pokusy získať erytropoetín v dobrom výťažku z plazmy alebo z moču boli pomerne neúspešné. Jc potrebné zložité laboratórne zariadenie a aj v tomto prípade je obyčajne možné získať iba malé množstvá nečistého a nestáleho extraktu, ktorý obsahuje erytropoetín.Previous attempts to obtain erythropoietin in good plasma or urine yields have been relatively unsuccessful. A complex laboratory equipment is required, and even in this case it is usually possible to obtain only small amounts of impure and volatile extract containing erythropoietin.
V US patentovom spise č. 3 033 753 je opísaný spôsob čiastočného čistenia erytropoetínu z krvnej plazmy oviec. Týmto spôsobom je možné získať v malom výťažku surový pevný extrakt, ktorý obsahuje erytropoetín.U.S. Pat. No. 3,033,753 discloses a method for partially purifying erythropoietin from sheep blood plasma. In this way, a crude solid extract containing erythropoietin can be obtained in a small yield.
Prvé pokusy o izoláciu erytropoetínu z moču viedli k získaniu nestálych, biologicky neúčinných prípravkov uvedeného hormónu. V US patentovom spise č. 3 865 801 sa opisuje spôsob stabilizácie biologickej účinnosti surovej látky, ktorá obsahuje erytropoetín izolovaný z moču. Výsledný surový produkt tohto spôsobu obsahuje 90 % účinnosti erytropoetínu a je stály.Initial attempts to isolate erythropoietin from urine have led to the recovery of unstable, biologically inactive formulations of the hormone. U.S. Pat. No. 3,865,801 discloses a method of stabilizing the biological activity of a crude material comprising erythropoietin isolated from urine. The resulting crude product of this process contains 90% erythropoietin activity and is stable.
Ďalší spôsob čistenia ľudského erytropoetínu z moču nemocných s aplastickou anémiou je opísaný v publikácii Miyake a ďalšie, J. Biol. Chem. zv. 252, č. 15 (10. augusta 1977), str. 5558 až 5564. Spôsob sa vykonáva v siedmich stupňoch, ktoré zahŕňajú chromatografiu na iónomeničoch, zrážanie etanolom, filtráciu na géli, adsorpčnú chromatografiu a poskytuje čistý erytropoetín s účinnosťou 70 400 jednotiek/mg bielkoviny vo výťažku 21 %.Another method for purifying human erythropoietin from the urine of patients with aplastic anemia is described by Miyake et al., J. Biol. Chem. Vol. 252, no. 15 (August 10, 1977), p. The process is carried out in seven steps, including ion exchange chromatography, ethanol precipitation, gel filtration, adsorption chromatography, and yields pure erythropoietin with an efficacy of 70,400 units / mg protein in 21% yield.
V US patentovom spise č. 4 397 840 (Takezawa a ďalšie) sa opisuje spôsob výroby „erytropoetínového produktu“ z moču zdravých ľudí pomocou slabo alkalických iónomeničov a opisuje sa, že získané produkty s nízkou molekulovou hmotnosťou nemajú žiadne inhibičné účinky na erytropoetín.U.S. Pat. No. 4,397,840 (Takezawa et al.) Describes a process for producing a " erythropoietin product " from urine of healthy humans using weakly alkaline ion exchangers, and it is reported that the low molecular weight products obtained have no inhibitory effects on erythropoietin.
V britskom patentovom spise č. 2 085 887 (Sugimoto a ďalšie) z 6. mája 1982 sa opisuje spôsob výroby ľudských hybridných lymfoblastoidných buniek, pri ktorých použití je možné dosiahnuť produkciu 3 až 420 jednotiek erytropoetínu v 1 ml bunkovej suspenzie v kultúre po namnožení cicavčích hostiteľských buniek na množstvo 107 buniek/ml. Pri najvyššej produkcii je možné rýchlosť tvorby erytropoetínu vyjadriť ako 40 až 4000 jednotiek/106 buniek/48 hodín v kultúre in vitro pri prenesení zo živých buniek. Odkázať v tomto zmysle je možné tiež na US patentový spis č. 4 377 513. Na izoláciu erytropoetínu z tkanív bol navrhovaný rad spôsobov vrátane použitia nádorových buniek, ale výťažky boli veľmi malé, ako je zrejmé napríklad z publikácií Jelkman a ďalšie, Expt. Hematol. 11 (7), 581 až 588 (1983), Tambourin a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 80, 6269 až 6273 (1983), Katsuoka a ďalšie, Gann, 74, 534 až 541 (1983), Hagiwara a ďalšie, Blood, 63 (4), 828 až 835 (1984) a Choppin a ďalšie, Blood 64(2), 341 až 347 (1984).In British Pat. No. 2,085,887 (Sugimoto et al.), May 6, 1982, discloses a method for producing human hybrid lymphoblastoid cells which can produce from 3 to 420 units of erythropoietin per ml of cell suspension in culture after multiplication of mammalian host cells to 10 7. cells / ml. At peak production, the erythropoietin production rate can be expressed as 40-4000 units / 10 6 cells / 48 hours in in vitro culture when transferred from viable cells. Reference may also be made in this regard to U.S. Pat. A number of methods have been proposed for isolating erythropoietin from tissues, including the use of tumor cells, but yields were very small, as is evident from, for example, Jelkman et al., Expt. Hematol. 11 (7), 581-588 (1983), Tambourin et al., PNAS (USA) 80, 6269-6273 (1983), Katsuoka et al., Gann, 74, 534-541 (1983), Hagiwara et al., Blood, 63 (4), 828-835 (1984) and Choppin et al., Blood 64 (2), 341-347 (1984).
Ďalším možným spôsobom izolácie čisteného erytropoctínu sú imunologické postupy. Postupuje sa tak, že sa injekciou ľudského erytropoetínu zvieratám, najlepšie potkanom alebo králikom vyvolá tvorba protilátok v sére proti ľudskému erytropoetínu. Ľudský erytropoetín, vstrieknutý injekčné zvierati je rozoznávaný ako cudzorodá látka, tzn. ako antigén pre imunitný systém zvieraťa a vyvolá teda tvorbu protilátok proti tomuto antigénu. Rôzne bunky, ktoré zodpovedajú na stimuláciu antigénom produkujú protilátky, ktoré sa od sebe trocha líšia. Pri odobratí krvi zostáva protilátka v krvnom sére. Na detekciu a tvorbe komplexu s ľudským erytropoetínom jc možné použiť tak nečistené sérum, ako čistenú protilátku, napríklad frakciu imunoglobulínu G zo séra, ale tieto materiály majú zásadnú nevýhodu v tom, že ide o polyklonálne protilátky, odvodené od rôznych buniek a viažu sa preto okrem na erytropoetín ešte na ďalšie zložky surových extraktov.Another possible way of isolating purified erythropoctin is by immunological methods. This is done by injecting human erythropoietin into animals, preferably rats or rabbits, to induce serum antibodies to human erythropoietin. Human erythropoietin injected into an injection animal is recognized as a foreign substance, i. as an antigen for the animal's immune system and thus elicits antibodies against the antigen. Various cells that respond to antigen stimulation produce antibodies that differ slightly from each other. When blood is taken, the antibody remains in the blood serum. For the detection and complexing of human erythropoietin, both unclean serum and purified antibody can be used, such as serum immunoglobulin G fraction, but these materials have the fundamental disadvantage of being polyclonal antibodies derived from different cells and therefore bind in addition to to erythropoietin to other ingredients of the crude extracts.
Zaujímavé sú tiež súčasné pokusy vyvinúť kontinuálne bunkové kultúry, schopné produkcie rovnorodej protilátky, ktorá reaguje špecificky s jediným antigénom. Tento postup bol všeobecne opísaný v publikácii Chisholm, High Technology Vol. 3, č. 1, str. 57 až 63 (1983). Boli tiež uskutočnené pokusy použiť fúziu buniek a hybridizáciu na získanie „monoklonálnych“ protilátok proti erytropoetínu a použiť tieto protilátky na izoláciu a na kvantitatívne stanovenie ľudského erytropoetínu. Ako príklad je možné uviesť úspešný vývoj bunkových línií myšieho hybridómu, ktoré vylučujú monoklonálne protilátky proti ľudskému erytropoetínu tak, ako bol opísaný v publikácii Lee-Huang, Abstrakt č. 1463 v Fed. Proc. 41, 520 (1982). Ďalším príkladom môže byť detailný opis prípravy a použitia monoklonálnej protilátky proti ľudskému erytropoetínu podľa publikácie Weiss a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 79, 5465 až 5469 (1982) a tiež v Sasaki, Biomed. Biochim. Acta 42 (11/12), str. 202 až 206 (1983), Yanagawa a ďalšie, Blood, 64 (2), 357 až 364 (1984), Yanagawa a ďalšie, J. Biol. Chem. 259 (5), 2707 až 2710 (1984) a US patentový spis č. 4 465 624.Also of interest are current attempts to develop continuous cell cultures capable of producing a homogeneous antibody that reacts specifically with a single antigen. This procedure has been generally described in Chisholm, High Technology Vol. 3, no. 1, p. 57-63 (1983). Attempts have also been made to use cell fusion and hybridization to obtain "monoclonal" antibodies against erythropoietin and to use these antibodies for isolation and for quantitative determination of human erythropoietin. By way of example, the successful development of murine hybridoma cell lines that secrete monoclonal antibodies against human erythropoietin as described in Lee-Huang, Abstract no. 1463 in Fed. Proc. 41, 520 (1982). Another example may be a detailed description of the preparation and use of a monoclonal antibody against human erythropoietin according to Weiss et al., P. N.A.S. (USA) 79, 5465-5469 (1982), and also in Sasaki, Biomed. Biochim. Acta 42 (11/12), p. 202-206 (1983); Yanagawa et al., Blood, 64 (2), 357-364 (1984); Yanagawa et al., J. Biol. Chem. 259 (5), 2707-2710 (1984) and U.S. Pat. 4,465,624.
Zaujímavé sú tiež všetky správy, ktoré sa týkajú imunologickej účinnosti syntetických peptidov, ktoré v podstate napodobujú sled aminokyselín, ktorý existuje v prírodné sa vyskytujúcich bielkovinách, glykoproteinoch a nukleoproteinoch. Je možno uviesť, že bielkoviny s nižšou molekulovou hmotnosťou sa zúčastnia imunologických reakcií, ktoré majú podobný rozsah a trvanie ako pri fyziologicky významných bielkovinách, napríklad vírusových antigénoch, hormónoch typu polypeptidov a podobne. Medzi imunologickými reakciami týchto polypeptidov je nutné uviesť tiež vyvolanie tvorby špecifických protilátok pri zvieratách ako to bolo opísané napríklad v publikáciách Lemer a ďalšie, Celí, 23, 309 až 310, 1981, Ross a ďalšie, Náture 294, str. 654 až 656, 1981, Walter a ďalšie, PNAS (USA) Π, str. 5197 až 5200, 1980, Lerner a ďalšie, PNAS (USA), 78,3403 až 3407 (1981), Walter a ďalšie, PNAS (USA) 78, 4882 až 4886, 1981, Wong a ďalšie, PNAS (USA), 78, 7412 až 7416, 1981, Green a ďalšie, Celí, 28, 477 až 487, 1982, Nigg a ďalšie, PNAS (USA) 79, 5322 až 5326 (1982), Barón a ďalšie, Celí 28, 395 až 404 (1982), Dreesman a ďalšie, Náture 295, 158 až 160 (1982), Lemer, Scientific Američan 248, č. 2. 66 až 74 (1983). Podobný postup je opísaný tiež v publikácii Kaiser a ďalšie, Science 223, str. 249 až 255 (1984), kde ide najmä o biologickú a imunologickú účinnosť syntetických peptidov, ktoré majú približne rovnaké sekundárne štruktúry s peptidovými hormónmi, ale nemusia mať rovnakú primárnu štruktúru. Uvedené štúdie sa však vzťahujú väčšinou na aminokyselinové sledy iných bielkovín ako erytropoetínu, pre ktoré ešte nebola publikovaná žiadna podstatná informácia, týkajúca sa sledu aminokyselín v tejto látke. V US patentovej prihláške č. 463 724, podanej 4. februára 1983 (J. Egrie), uverejnenej 22. augusta 1984 ako európska prihláška č. 0 116 446 sa opisuje bunková línia myšieho hybridómu (ATCC č. HB 8209), ktorá produkuje vysoko špecifický typ protilátky, ktorá je súčasne špecificky reaktívna na polypeptid, ktorý sa skladá z nasledujúceho sledu aminokyselín: NlU-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.Also of interest are all reports regarding the immunological efficacy of synthetic peptides that essentially mimic the amino acid sequence that exists in naturally occurring proteins, glycoproteins and nucleoproteins. It is noted that lower molecular weight proteins will participate in immunological reactions that are of similar magnitude and duration to that of physiologically important proteins, for example, viral antigens, polypeptide-like hormones and the like. The immunological responses of these polypeptides also include the induction of specific antibody production in animals as described, for example, in Lemer et al., Cell 23: 309-310 (1981), Ross et al., Nature 294, p. 654-656, 1981, Walter et al., PNAS (USA) Π, p. 5197-500, 1980, Lerner et al., PNAS (USA), 78,3403-3407 (1981), Walter et al., PNAS (USA) 78, 4882-4886, 1981, Wong et al., PNAS (USA), 78 7412-7416, 1981, Green et al., Cell, 28, 477-487, 1982; Nigg et al., PNAS (USA) 79, 5322-5326 (1982), Baron et al., Cell 28, 395-404 (1982) Dreesman et al., Nature 295: 158-160 (1982); Lemer, Scientific American 248, no. 2. 66-74 (1983). A similar procedure is also described in Kaiser et al., Science 223, p. 249-255 (1984), in particular the biological and immunological efficacy of synthetic peptides having approximately the same secondary structures with peptide hormones, but need not have the same primary structure. However, these studies relate mostly to amino acid sequences of proteins other than erythropoietin for which no substantial information has yet been published regarding the amino acid sequence of this substance. U.S. Pat. No. 463,724, filed Feb. 4, 1983 (J. Egrie), published Aug. 22, 1984, as European Application Ser. 0 116 446 describes a mouse hybridoma cell line (ATCC No. HB 8209) that produces a highly specific type of antibody that is also specifically reactive to a polypeptide consisting of the following amino acid sequence: N11-Ala-Pro-Pro-Arg- Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Arg-Glu-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.
Tento sled zodpovedá sledu, ktorý sa predpokladá pre prvých dvadsať aminokyselín úplného ľudského erytropoetínu, izolovaného spôsobom podľa publikácie Miyake a ďalšie. J. Biol. Chem. 252, 5558 až 5564 (1977), kde analýza sledu aminokyselín bola uskutočnená v plynovej fáze (Ap plied Biosystems Inc.) spôsobom podľa publikácie Hewick M. a ďalšie, J. Biol. Chem. 256, 7990 až 7997 (1981). Podobný postup je opísaný tiež v publikácii Sue a ďalšie, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80, str. 3651 až 3655 (1983), publikácia sa týka tvorby polyklonálnych protilátok proti syntetickému sledu 26 aminokyselín a v publikácii Sytowski a ďalšie, J. Immunol. Methods 69, str. 181 až 186 (1984).This sequence corresponds to that envisaged for the first twenty amino acids of full human erythropoietin isolated by the method of Miyake et al. J. Biol. Chem. 252, 5558-5564 (1977), wherein amino acid sequence analysis was performed in gas phase (Ap plied Biosystems Inc.) according to the method of Hewick M. et al., J. Biol. Chem. 256, 7990-7997 (1981). A similar procedure is also described in Sue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, p. 3651-3655 (1983), the publication of which relates to the generation of polyclonal antibodies against a synthetic sequence of 26 amino acids, and Sytowski et al., J. Immunol. Methods 69, p. 181-186 (1984).
Opísané polyklonálne a monoklonálne protilátky predstavujú vysoko užitočné materiály na použitie v imunológii na detekciu a kvantitatívne stanovenie erytropoetínu a môžu byť užitočné aj na afinitné čistenie erytropoetínu, je však nepravdepodobné, že by tieto materiály bolo možné použiť na izoláciu veľkých množstiev erytropoetínu z cicavcov v množstve, dostatočnom na ďalšiu analýzu, klinické pokusy a liečebné použitie tejto látky napríklad v prípade chronických ochorení obličiek, pri ktorých tkanivo nestačí udržať dostatočnú produkciu erytrocytov. V dôsledku týchto skutočností je možné predpokladať, že najlepšie vyhliadky na plnú charakterizáciu erytropoetínu cicavcov a na získanie veľkých množstiev tejto látky pre potenciálne diagnostické a klinické použitia má úspešná aplikácia rekombinantných postupov na zaistenie mikrobiálnej syntézy uvedeného materiálu vo veľkom množstve.The polyclonal and monoclonal antibodies described are highly useful materials for use in immunology for the detection and quantitative determination of erythropoietin, and may also be useful for affinity purification of erythropoietin, but these materials are unlikely to be used to isolate large amounts of erythropoietin from mammals in amounts, sufficient for further analysis, clinical trials and therapeutic use of the substance, for example, in the case of chronic kidney diseases in which the tissue is not sufficient to maintain sufficient erythrocyte production. Consequently, it is believed that the best prospects for fully characterizing mammalian erythropoietin and for obtaining large amounts of this substance for potential diagnostic and clinical uses have been successfully applied by recombinant techniques to ensure microbial synthesis of said material in large quantities.
Boli vyvinuté veľké snahy izolovať sled DNA, ktorý je kódom pre ľudský erytropoetín a pre obdobné látky u iných cicavcov, ale dosiaľ bez úspechu. Tento neúspech je zjavne zavinený tým, že je k dispozícii veľmi malé množstvo tkanív ako zdrojov tejto látky, najmä u človeka, ide najmä o materiály, obohatené mRNA, ktoré by mohli dovoliť konštrukciu radu cDNA, z ktorých by potom bolo možné izolovať bežným spôsobom sled, ktorý je kódom pre erytropoetín. Popri tom je o kontinuálnom slede aminokyselín v erytropoetínu zatiaľ známe tak málo, že nie je možné konštruovať napríklad dlhšie vzorky polynukleotidov, ktoré by bolo ďalej možné použiť pri hybridizácii DNA/DNA pri použití cDNA a najmä na získanie zostavy určitého genómu. Napríklad uvedený sled dvadsiatich aminokyselín, ktorý bol použitý· na získanie monoklonálnej protilátky, produkovanej ATCC č. HB 8209 nedovoľuje konštrukciu oligonukleotidovej vzorky s 60 bázami spôsobom opísaným v uvedenej publikácii Andersona a ďalších. Je pravdepodobné, že sa ľudský gén pre erytropoetín môže vyskytovať ako Jediná kópia génu“ v ľudskom genóme a v každom prípade ľudský materiál, ktorý je kódom pre ľudský erytropoetín tvorí menej ako 0,00005 % celkovej DNA ľudského genómu.Great efforts have been made to isolate the DNA sequence that encodes human erythropoietin and the like in other mammals, but so far without success. Obviously, this failure is due to the fact that very little tissue is available as a source of this substance, especially in humans, especially mRNA-enriched materials that could allow the construction of a series of cDNAs from which the sequence could then be isolated , which is the code for erythropoietin. In addition, the continuous sequence of amino acids in erythropoietin is so little known that it is not possible to construct, for example, longer samples of polynucleotides which could further be used in DNA / DNA hybridization using cDNA and in particular to obtain a genome assembly. For example, the twenty amino acid sequence used was used to obtain the monoclonal antibody produced by ATCC No. 5 and No. 5, respectively. HB 8209 does not permit the construction of a 60 base oligonucleotide sample as described by Anderson et al. It is likely that the human erythropoietin gene may appear as a single copy of the gene 'in the human genome, and in any case human material that encodes human erythropoietin accounts for less than 0.00005% of the total DNA of the human genome.
Aj najlepšie dosiaľ opisované výsledky, dosiahnuté pri použití rekombinantných metód s cieľom získania sledov DNA, pri ktorých expresii v mikroorganizme by bolo možné získať izolovateľné množstvá erytropoetínu cicavcov, mali ďaleko do skutočného úspechu. Napríklad v publikácii Farber a ďalšie, Exp. Hematol. 11, Suppl. 14, Abstrakt 101 (1983) sa opisuje extrakcia mRNA z obličkového tkaniva paviána po pôsobení fenylhydrazínu s následnou injekciou mRNA do oocytov Xenopus laevis, pričom bola in vitro dosiahnutá priechodná tvorba zmesi „produktov translácie“, ktoré majú okrem iného určitú účinnosť typu eiytropoetinu. V publikácii Farber a ďalšie, Blood 62, č. 5, Supp. č. 1, Abstrakt 392 na str. 122a (1983) sa opisuje translácia mRNA z ľudskej obličky do oocytov žaby. Výsledná zmes translačných produktov obsahovala 220 m jednotiek translačného produktu s účinnosťou erytropoetínu na mg mRNA. Táto úroveň translácie exogénneho kódu mRNA pre erytropoetín in vitro je veľmi nízka (aj v porovnaní so skôr uvádzanými výsledkami s transláciou mRNA paviána), výsledky však zjavne potvrdzujú, že ľudská oblička je miestom, v ktorom dochádza k expresii erytropoetínu, takže by malo byť mož né z obličiek získať zostavu cDNA, obohatenú o požadovaný gén (Farber, Clin. Res. 31 (4), 769A (1983).Even the best results so far achieved using recombinant methods to obtain DNA sequences in which the expression in a microorganism could be obtained with isolable amounts of mammalian erythropoietin have been far from successful. For example, Farber et al., Exp. Hematol. 11, Suppl. 14, Abstract 101 (1983) describes the extraction of mRNA from baboon kidney tissue after phenylhydrazine treatment followed by injection of mRNA into Xenopus laevis oocytes, providing in vitro transient formation of a mixture of "translation products" having, inter alia, some eiytropoetin-like activity. In Farber et al., Blood 62, no. 5, Supp. no. 1, Abstract 392 at p. 122a (1983) describes the translation of mRNA from the human kidney into frog oocytes. The resulting translation product mixture contained 220 m units of translation product with erythropoietin activity per mg mRNA. This level of translation of the exogenous mRNA code for erythropoietin in vitro is very low (even compared to the previously reported baboon mRNA translation results), but the results clearly confirm that the human kidney is a site where erythropoietin is expressed, so it should be possible cDNA assembly enriched for the gene of interest (Farber, Clin. Res. 31 (4), 769A (1983)).
Až do podania US patentových prihlášok č. 561 024 a 582 185 bola známa iba jediná správa o klonovaní a expresii cDNA ľudského erytropoetínu v E. coli Do plazmidov E. coli bolo včlenené väčšie množstvo klonov cDNA a produkty po fúzii s β-laktamázou boli imunoreaktívne s monoklonálnou protilátkou k nešpecifickému „epitopu“ ľudského erytropoetínu, postup bol opísaný v publikácii Lee-Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, str. 2708 až 2712 (1984).Pending the filing of U.S. Pat. 561,024 and 582,185, only one report on cloning and expression of human erythropoietin cDNA in E. coli was known human erythropoietin, the procedure of Lee-Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, p. 2708-2712 (1984).
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Do rozsahu tohto vynálezu spadajú nasledujúce aspekty:The following aspects are within the scope of this invention:
1. Sekvencia DNA na použitie na zaistenie expresie polypeptidového produktu, ktorého štruktúra aspoň sčasti zodpovedá primárnej štruktúre erytropoetínu na zaistenie jeho biologických vlastností spočívajúcich v zvyšovaní produkcie retikulocytov a červených krviniek v bunkách kosťovej drene a zvyšovaní syntézy hemoglobínu alebo príjmu železa, v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách, pričom táto sekvencia DNA sa volí zo súboru zahŕňajúcehoDNA sequence for use in providing expression of a polypeptide product whose structure at least partially corresponds to the primary structure of erythropoietin to confer its biological properties of increasing reticulocyte and red blood cell production in bone marrow cells and enhancing hemoglobin synthesis or iron uptake, in prokaryotic or eukaryotic hosts cells, wherein said DNA sequence is selected from the group consisting of
a) sekvencie DNA uvedené v tabuľke V a VI a ich komplementárne reťazce;(a) the DNA sequences listed in Tables V and VI and their complementary strands;
b) sekvencie DNA hybridizujúce za stringentných podmienok k sekvenciám DNA definovaným v odseku (a) alebo ich fragmentom; ab) DNA sequences hybridizing under stringent conditions to the DNA sequences defined in paragraph (a) or fragments thereof; and
c) sekvencie DNA, ktoré by hybridizovali k sekvenciám DNA definovaným v odseku (a) alebo (b), keby nebola degenerácia genetického kódu.(c) DNA sequences that would hybridize to the DNA sequences defined in (a) or (b) if there were no degeneracy of the genetic code.
2. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 kódujúca ľudský erytropoetin.2. The DNA sequence of aspect 1 encoding human erythropoietin.
3. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 kódujúca opičí erytropoetín.3. The DNA sequence of aspect 1 encoding monkey erythropoietin.
4. Sekvencia DNA podľa aspektu 3 obsahujúca oblasť kódujúcu proteín uvedenú v tabuľke V.4. The DNA sequence of aspect 3 comprising the protein coding region set forth in Table V.
5. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 alebo 2, ktorou je sekvencia genómovej DNA.5. The DNA sequence of aspect 1 or 2, which is a genomic DNA sequence.
6. Sekvencia DNA podľa aspektu 5 kódujúca ľudský eiytropoetín.6. The DNA sequence of aspect 5 encoding human eiythropoietin.
7. Sekvencia DNA podľa aspektu 6 obsahujúca oblasť kódujúcu proteín uvedenú v tabuľke VI.7. The DNA sequence of aspect 6 comprising the protein coding region set forth in Table VI.
8. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 alebo 2, ktorá je kovalentne pripojená k detegovateľnej značiacej látke.8. The DNA sequence of aspect 1 or 2, which is covalently linked to a detectable marker.
9. Sekvencia DNA podľa aspektu 8, kde detegovateľná značiaca látka je rádioaktívna.9. The DNA sequence of aspect 8, wherein the detectable label is radioactive.
10. Sekvencia DNA podľa aspektu 8 alebo 9, ktorá je jednoreťazcová.10. The DNA sequence of aspect 8 or 9, which is single stranded.
11. Sekvencia DNA podľa aspektu 1 kódujúca [Phe15]hEPO, [Phe49]hEPO, [Phe145]hEPO, [His’jhEPO, [Asn2-des-Pro2 až Ile6]hEPO, [des-Thr163 až Arg166]hEPO alebo [delta 27-55]hEPO.11. The DNA sequence of aspect 1 encoding [Phe 15 ] hEPO, [Phe 49 ] hEPO, [Phe 145 ] hEPO, [His'jhEPO, [Asn 2 -des-Pro 2 to Ile 6 ] hEPO, [des-Thr 163 to Arg 166 ] hEPO or [delta 27-55] hEPO.
12. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná sekvenciou DNA podľa niektorého z aspektov 1, 2, 3, 6, 7 a 8 spôsobom umožňujúcim tejto hostiteľskej bunke exprimovať uvedený polypeptidový produkt.12. A prokaryotic or eukaryotic host cell transformed or transfected with the DNA sequence of any one of aspects 1, 2, 3, 6, 7, and 8 in a manner allowing said host cell to express said polypeptide product.
13. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka podľa aspektu 13, ktorá je schopná glykozylovať uvedený polypeptid.13. The prokaryotic or eukaryotic host cell of aspect 13, which is capable of glycosylating said polypeptide.
14. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka podľa aspektu 13, ktorou je cicavčia bunka.14. The prokaryotic or eukaryotic host cell of aspect 13, which is a mammalian cell.
15. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka podľa aspektu 13, ktorou je bunka COS.15. The prokaryotic or eukaryotic host cell of aspect 13, which is a COS cell.
SK 279959 Β6SK 279959 Β6
16. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka podľa aspektu 13, ktorou je bunka CHO.16. The prokaryotic or eukaryotic host cell of aspect 13, which is a CHO cell.
17. Biologicky funkčný cirkulámy plazmid alebo vírusový DNA vektor obsahujúci sekvenciu DNA podľa niektorého z aspektov 1, 2, 3, 5, 6, 7 alebo 11.17. A biologically functional circulating plasmid or viral DNA vector comprising the DNA sequence of any one of aspects 1, 2, 3, 5, 6, 7 or 11.
18. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA vektorom podľa aspektu 17.18. A prokaryotic or eukaryotic host cell stably transformed or transfected with the DNA vector of aspect 17.
19. Rekombinantný polypeptid majúci celú primárnu štruktúrnu konformáciu ľudského alebo opičieho erytropoetínu, ako je uvedená v tabuľke VI alebo V, alebo jej časť alebo akýkoľvek jeho alelový variant alebo derivát majúci biologickú účinnosť spočívajúcu v zvyšovaní produkcie retikulocytov a červených krviniek v bunkách kosťovej drene a zvyšovaní syntézy hemoglobínu alebo príjmu železa. Tento polypeptid je produktom eukaryotickej expresie exogénnej sekvencie DNA a má molekulovú hmotnosť podľa SDS-PAGE vyššiu ako erytropoetín izolovaný z moču.19. A recombinant polypeptide having all of the primary structural conformation of human or simian erythropoietin as set forth in Table VI or V, or a portion thereof, or any allelic variant or derivative thereof, having a biological activity of increasing reticulocyte and red blood cell production in bone marrow cells and increasing hemoglobin synthesis or iron uptake. This polypeptide is the product of eukaryotic expression of an exogenous DNA sequence and has a molecular weight by SDS-PAGE higher than erythropoietin isolated from urine.
20. Polypeptid podľa aspektu 19, ktorým je glykoproteín, ktorého priemerné sacharidové zloženie sa líši od ľudského erytropoetínu izolovaného z moču.20. The polypeptide of aspect 19, which is a glycoprotein whose average carbohydrate composition differs from human erythropoietin isolated from urine.
21. Polypeptid podľa aspektu 19 alebo 20, kde exogénnou sekvenciou DNA je sekvencia cDNA.21. The polypeptide of aspect 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is a cDNA sequence.
22. Polypeptid podľa aspektu 19 alebo 20, kde exogénnou sekvenciou DNA je sekvencia genómovej DNA.22. The polypeptide of aspect 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is a genomic DNA sequence.
23. Polypeptid podľa aspektu 19 alebo 20, kde exogénna sekvencia DNA je súčasťou autonómne sa replikujúceho cirkulámeho DNA plazmidu alebo vírusového vektora.23. The polypeptide of aspect 19 or 20, wherein the exogenous DNA sequence is part of an autonomously replicating circular DNA plasmid or viral vector.
24. Polypeptid podľa niektorého z aspektov 19 až 23, ktorý je kovalentne pripojený k detegovateľnej značiacej látke.24. The polypeptide of any one of aspects 19 to 23, which is covalently attached to a detectable label.
25. Polypeptid podľa aspektu 24, kde detegovateľná značiaca látka je rádioaktívna.25. The polypeptide of aspect 24, wherein the detectable label is radioactive.
26. Polypeptidový produkt pripraviteľný expresiou sekvencie DNA podľa niektorého z aspektov 1, 2, 3, 5, 6 a 7 v eukaryotickej hostiteľskej bunke.26. A polypeptide product obtainable by expressing the DNA sequence of any one of aspects 1, 2, 3, 5, 6 and 7 in a eukaryotic host cell.
27. Spôsob výroby polypeptidu majúceho aspoň časť primárnej štruktúrnej konformácie erytropoetínu na umožnenie biologickej účinnosti spočívajúci v zvyšovaní produkcie retikulocytov a červených krviniek v bunkách kosťovej drene a zvyšovaní syntézy hemoglobínu alebo príjmu železa, ktorého podstata spočíva v tom, že sa prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná sekvenciou DNA podľa niektorého z aspektov 1, 2, 3, 5, 6 a 7 spôsobom umožňujúcim hostiteľskej bunke exprimovať tento polypeptid kultivuje za vhodných živných podmienok a prípadne sa požadovaný polypeptidový produkt expresie tejto sekvencie DNA izoluje.27. A method of producing a polypeptide having at least a portion of the primary structural conformation of erythropoietin to enable biological efficacy by increasing reticulocyte and red blood cell production in bone marrow cells and enhancing hemoglobin synthesis or iron uptake, characterized in that a prokaryotic or eukaryotic host cell is transformed. or transfected with the DNA sequence of any one of aspects 1, 2, 3, 5, 6 and 7 in a manner allowing the host cell to express the polypeptide is cultured under appropriate nutrient conditions and optionally the desired polypeptide product of expression of the DNA sequence is isolated.
28. Spôsob podľa aspektu 27, pri ktorom sa kultivuje hostiteľská bunka podľa niektorého z aspektov 12 až 16.28. The method of aspect 27, wherein the host cell of any one of aspects 12 to 16 is cultured.
29. Spôsob podľa aspektu 27 alebo 28 na výrobu polypeptidu podľa niektorého z aspektov 19 až 23 a 26, pri ktorom sa postupuje za podmienok vedúcich k týmto polypeptidov.29. The method of aspect 27 or 28 for producing a polypeptide according to any of aspects 19 to 23 and 26, wherein the process is conducted under conditions resulting in said polypeptides.
30. Farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje polypeptid pripraviteľný spôsobom podľa aspektu 27, 28 alebo 29 a farmaceutický vhodné riedidlo, pomocnú látku alebo nosič.30. A pharmaceutical composition comprising a polypeptide obtainable by the method of aspect 27, 28 or 29 and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier.
31. Farmaceutický prostriedok podľa aspektu 30, obsahujúci polypeptid podľa niektorého z aspektov 19 až 23 a 26.31. The pharmaceutical composition of aspect 30, comprising the polypeptide of any of aspects 19 to 23 and 26.
Vertebrata (napríklad COS-1 a CHO) poskytli pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu vôbec prvé bunky, ktoré je možné množiť kontinuálne in vitro a ktoré pri raste v kultúre sú schopné produkovať do prostredí, v ktorom rastú viac ako 100 jednotiek (výhodne viac ako 500 jednotiek, najmä 1000 až 5000 jednotiek) erytropoetínu na 106 buniek v priebehu 48 hodín, ako bolo stanovené rádioimunologicky.Vertebrates (e.g., COS-1 and CHO) have provided the first ever cell that can be propagated continuously in vitro and which, when grown in culture, are able to produce into an environment in which they grow more than 100 units (preferably more than 500 units) units, in particular 1000 to 5000 units of erythropoietin per 10 6 cells over 48 hours as determined by radioimmunoassay.
Spôsobom podľa vynálezu je možné tiež získať syntetické polypeptidy, ktoré úplne alebo sčasti svojou štruktú rou zodpovedajú kontinuálnemu sledu aminokyselinových zvyškov erytropoetínu, ktoré tak boli po prvýkrát osvetlené. Tieto sledy, ktoré môžu mať spoločné primáme, sekundárne alebo terciáme štrukturálne vlastnosti s prírodné sa vyskytujúcim erytropoetínom, môžu mať tiež biologickú účinnosť a/alebo imunologické vlastnosti spoločné s prírodné sa vyskytujúcim produktom, takže ich je možné použiť ako biologicky alebo imunologický účinné náhradky erytropoetínu na liečebné a imunologické účely. Zodpovedajúcim spôsobom je možné získať tiež monoklonálne a polyklonálne protilátky, ktoré sú imunoreaktívne vzhľadom na uvedené polypeptidy a výhodne imunoreaktívne tiež k prírodné sa vyskytujúcemu erytropoetínu.It is also possible by the method according to the invention to obtain synthetic polypeptides which, in whole or in part, correspond to the continuous sequence of amino acid residues of erythropoietin, which were thus first illuminated. These sequences, which may have common primary, secondary or tertiary structural properties with naturally occurring erythropoietin, may also have biological activity and / or immunological properties in common with the naturally occurring product, so that they can be used as biologically or immunologically active erythropoietin substitutes for medical and immunological purposes. Correspondingly, it is also possible to obtain monoclonal and polyclonal antibodies which are immunoreactive to said polypeptides and preferably also immunoreactive to naturally occurring erythropoietin.
Príkladom látok, získaných spôsobom podľa vynálezu môžu byť klonované sledy DNA ľudského alebo opičieho pôvodu a polypeptidové sledy, získané pri použití týchto materiálov, ktoré sú prvým potvrdením štruktúry erytropoetínu opíc a ľudí.Examples of substances obtained by the method of the invention may be cloned DNA sequences of human or monkey origin and polypeptide sequences obtained using these materials, which are the first confirmation of the structure of erythropoietin in monkeys and humans.
Spôsobom podľa vynálezu je tiež možné získať nové biologicky funkčné vírusové a cirkuláme vektory pre plazmidovú DNA, do ktorých je možné včleniť sledy DNA podľa vynálezu a mikrobiálne (napríklad bakteriálne, kvasinkové a cicavčie) bunky ako hostiteľské organizmy, stabilne transformované alebo podrobené transfekcii pri použití uvedených vektorov. Týmto spôsobom je podľa vynálezu možné získať cenné polypeptidy tak, že sa pestuje v kultúre transformovaný mikrobiálny hostiteľ za podmienok, ktoré umožňujú alebo uľahčujú expresiu exogénnej, do vektora včlenenej DNA vo veľkom množstve s následnou izoláciou požadovaných polypeptidov z rastového prostredia, lyzátu buniek alebo frakcií bunkovej membrány.It is also possible by the method of the invention to obtain novel biologically functional viral and circulating plasmid DNA vectors into which DNA sequences of the invention and microbial (e.g. bacterial, yeast and mammalian) cells can be incorporated as host organisms stably transformed or transfected using said methods. vectors. In this way, it is possible according to the invention to obtain valuable polypeptides by culturing in a culture a transformed microbial host under conditions which allow or facilitate expression of exogenous, vector-incorporated DNA in large quantities, followed by isolation of the desired polypeptides from growth media, cell lysate or cell fractions membrane.
Izoláciu a čistenie polypeptidov, získaných mikrobiálnou expresiou je možné vykonávať bežným spôsobom vrátane napríklad preparatívnej deliacej chromatografie a imunologického delenia pri použití monoklonálnych a/alebo polyklonálnych protilátok.Isolation and purification of polypeptides obtained by microbial expression can be accomplished by conventional means, including, for example, preparative separation chromatography and immunological separation using monoclonal and / or polyclonal antibodies.
Po osvetlení sledu aminokyselinových zvyškov v erytropoetínu je možné zostaviť tiež úplný a/alebo čiastočný sled DNA, ktorá je kódom pre erytropoetín vrátane výhodných vlastností tohto sledu, napríklad včlenenie kodónov, ktoré sú „výhodné“ na dosiahnutie expresie pri použití hostiteľa odlišného od cicavca, začlenenie miest pre štiepenie reštrikčnými endonukleázami a pridaním počiatočných terminálnych alebo vmedzerených sledov DNA, ktoré môžu uľahčovať konštrukciu alebo umožniť ľahšiu expresiu vektora. Spôsobmi opísanými v príkladoch rozpracovania je možné získať (a špecifickou mutagenézou cDNA a DNA genómu ďalej rozvíjať) sledy DNA, ktoré sú kódom pre mikrobiálnu expresiu polypeptidových analógov alebo derivátov erytropoetínu, ktoré sa odlišujú od prírodné sa vyskytujúcej formy identitou alebo umiestnením jedného alebo väčšieho počtu aminokyselinových zvyškov, ide teda napríklad o analógy vzniknuté vynechaním menej ako všetkých zvyškov, špecifických pre erytropoetín (EPO) a/alebo vzniknuté substitúciou, pri ktorej jeden alebo väčší počet zvyškov je nahradený inými zvyškami a/alebo vzniknuté adíciou, pri ktorej sa pridáva jeden alebo väčší počet aminokyselinových zvyškov k terminálnej alebo mediálnej časti polypeptidu, pričom všetky tieto formy môžu mať časť alebo všetky vlastnosti prírodné sa vyskytujúcich foriem.After illuminating the sequence of amino acid residues in erythropoietin, it is also possible to assemble a full and / or partial DNA sequence coding for erythropoietin, including the beneficial properties of this sequence, such as the incorporation of codons that are "preferred" to achieve expression using a non-mammalian host. restriction endonuclease cleavage sites and the addition of initial terminal or restricted DNA sequences that may facilitate construction or facilitate expression of the vector. By the methods described in the Examples, it is possible to obtain (and further develop by specific mutagenesis of cDNA and DNA genome) DNA sequences that encode microbial expression of erythropoietin polypeptide analogs or derivatives that differ from the naturally occurring form by the identity or location of one or more amino acid sequences. residues, e.g. analogues resulting from the deletion of less than all erythropoietin-specific residues (EPO) and / or from substitution in which one or more residues are replaced by other residues and / or by an addition in which one or more residues are added the number of amino acid residues to the terminal or media portion of the polypeptide, all of which forms may have part or all of the properties of naturally occurring forms.
Polypeptidy, ktoré sú produktom uvedeného postupu je možné „označiť“ tak, že sa na ne kovalentnou väzbou naviaže zistiteľný materiál. Môže napríklad ísť o rádioaktívne označenie izotopom 125I, čím je možné získať reakčné činidlo, ktoré sa dá použiť na detekciu a na kvantatívne stanovenie erytropoetínu v pevných tkanivách a tiež vo vzorkách kvapalín, napríklad v moči alebo v krvi. DNA podľa vynálezu je tiež možné označiť, a to rádioaktívne alebo napríklad biotínom a potom použiť pri hybridizácii na určenie polohy erytropoetínového génu a/alebo polohy akéhokoľvek príbuzného génu u ľudí, opíc a ďalších cicavcov v ich chromozomálnej mape. Týmto spôsobom je tiež možné preukázať poruchy génu pre erytropoetín na úrovni DNA alebo poruchy príbuzných génov.Polypeptides resulting from this process can be "labeled" by binding a detectable material to them by covalent bonding. For example, it may be radiolabelled with the 125 I isotope to provide a reagent that can be used to detect and quantify erythropoietin in solid tissues as well as in fluid samples such as urine or blood. The DNA of the invention may also be radiolabeled or biotin-labeled and then used in hybridization to determine the position of the erythropoietin gene and / or the position of any related gene in humans, monkeys and other mammals in their chromosomal map. In this way, it is also possible to demonstrate DNA-level erythropoietin gene disorders or related gene disorders.
Ako bude ďalej podrobnejšie uvedené, znamená vynález podstatné zlepšenie detekcie špecifického polynukleotidu s jedným reťazcom s neznámym sledom v heterogénnej bunkovej alebo vírusovej vzorke vrátane mnohopočetných polynukleotidov s jednoduchým reťazcom tak, že saAs will be described in more detail below, the invention means substantially improving the detection of a specific single-chain polynucleotide of unknown sequence in a heterogeneous cellular or viral sample, including multiple single-chain polynucleotides by
a) pripraví zmes značených polynukleotidových vzoriek s jednoduchými reťazcami s uniformné sa meniacim sledom báz, pričom každá z týchto vzoriek je potenciálne špecificky komplementárna k sledu, ktorý sa vyskytuje vo vzorke a náleží polynukleotidu, ktorý má byť zistený,(a) prepare a mixture of labeled single-stranded single-stranded polynucleotide samples with uniformly changing base sequences, each of which is potentially specifically complementary to the sequence that occurs in the sample and belongs to the polynucleotide to be detected;
b) vzorka sa fixuje na pevný substrát,(b) the sample is fixed to a solid substrate;
c) substrát s fixovanou vzorkou sa spracováva tak, aby bola znížená ďalšia vzájomná možnosť väzby polynukleotidov s výnimkou hybridizácie na polynukleotide uvedenej vzorky,c) the substrate with the fixed sample is treated in such a way as to further reduce the possibility of binding to each other of the polynucleotides except for hybridization to the polynucleotide of said sample;
d) spracovaný substrát s fixovanou vzorkou sa na prechodný čas uvedie do styku so zmesou značených vzoriek za podmienok, ktoré uľahčujú hybridizáciu len medzi úplne komplementárnymi polynukleotidmi a(d) contacting the treated substrate with the fixed sample temporarily with a mixture of labeled samples under conditions which facilitate hybridization only between completely complementary polynucleotides; and
e) špecifický polynukleotid sa zistí zistením prítomnosti hybridizačnej reakcie polynukleotidu s úplnou komplementárnou vzorkou zo zmesi značených vzoriek, ako je možné preukázať prítomnosťou väčšej hustoty značeného materiálu na substráte v mieste prítomnosti špecifického polynukleotidu v porovnaní s ostatnými miestami substrátu, kde došlo iba k nešpecifickej väzbe značenej vzorky na substrát.(e) the specific polynucleotide is detected by detecting the presence of a hybridization reaction of the polynucleotide with a complete complementary sample from the labeled sample, as evidenced by the presence of greater density of labeled material on the substrate at the specific polynucleotide samples per substrate.
Tento spôsob je osobitne účinný v situáciách, keď je potrebné použiť 64, 128, 256, 512, 1024 alebo viac vzoriek polynukleotidov s dĺžkou 17 až 20 báz pri hybridizácii DNA/DNA, RNA/RNA alebo DNA/RNA.This method is particularly effective in situations where 64, 128, 256, 512, 1024 or more polynucleotide samples of 17 to 20 bases in length need to be used for DNA / DNA, RNA / RNA or DNA / RNA hybridization.
Ako už bolo uvedené, umožnil tento postup identifikáciu klonov DNA, ktoré sú kódom pre erytropoetín opičieho pôvodu zo skupiny sledov, pripravených z mRNA buniek obličiek anemických opíc. V tomto prípade bolo použitých 128 uniformné variabilných vzoriek s dĺžkou 20 nukleotidov podľa informácií a sledu aminokyselín frakcií ľudského erytropoetínu pri hybridizácii kolónii, čím bolo možné preukázať sedem „pozitívnych“ klonov opičej cDNA z celkového počtu 200 000 kolónií. Ďalej bolo možné rýchlo izolovať tri pozitívne klony z 1 500 000 povlakov fágu ľudského genómu. I v tomto prípade bola použitá zmes 128 vzoriek polynukleotidov s 20 bázami spolu s druhou zostavou 128 nukleotidov s 17 bázami podľa analýzy aminokyselín v inom kontinuálnom slede ľudského erytropoetínu.As mentioned above, this procedure allowed the identification of DNA clones that encode monkey erythropoietin from a sequence of sequences prepared from anemic monkey kidney cell mRNA. In this case, 128 uniform variable samples of 20 nucleotides in length were used, according to the information and amino acid sequence of the fractions of human erythropoietin fractions in colony hybridization, thereby demonstrating seven "positive" monkey cDNA clones out of a total of 200,000 colonies. In addition, three positive clones could be rapidly isolated from 1,500,000 human genome phage coatings. Again, a mixture of 128 samples of 20 base polynucleotides was used along with a second set of 128 nucleotides of 17 bases according to amino acid analysis in another continuous sequence of human erythropoietin.
Uvedené postupy znamenajú prvé použitie zmiešaných vzoriek oligonukleotidov pri hybridizácii DNA/DNA s cieľom izolácie klonov cicavčieho genómu, pričom súčasne bola po prvýkrát použitá zmes viac ako 32 vzoriek oligonukleotidov pri izolácii klonov cDNA.These methods involve the first use of mixed oligonucleotide samples in DNA / DNA hybridization to isolate mammalian genome clones, wherein a mixture of more than 32 oligonucleotide samples for the first time is used to isolate cDNA clones for the first time.
Ďalšie výhody spôsobu podľa vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu výhodných rozpracovaní tohto spôsobu. Spôsobom podľa vynálezu je možné izolovať a charakterizovať sledy DNA, ktoré sú kódom pre časť alebo pre úplný polypeptidový sled erytropoetínu človeka a opice. Ďalej bolo možné podrobiť DNA človeka a opice expresii v eukaryotických i prokaryotických bunkách a získať tak izolovateľné množstvá polypeptidov s biologickou (napríklad imunologickou) účinnosťou prírodné sa vyskytujúceho EPO tak in vivo, ako in vitro.Further advantages of the process of the invention will be apparent from the following detailed description of preferred embodiments of the process. By the method of the invention, it is possible to isolate and characterize DNA sequences which encode a portion or a complete polypeptide sequence of human and monkey erythropoietin. Furthermore, it was possible to express human and monkey DNA in eukaryotic and prokaryotic cells to obtain isolable amounts of polypeptides with the biological (e.g., immunological) efficacy of naturally occurring EPO both in vivo and in vitro.
DNA opica bola izolovaná zo skupiny cDNA, ktorá bola vytvorená pomocou mRNA z obličkového tkaniva o pice s chemicky vyvolanou anémiou, sérum tejto opice obsahovalo vysokú hladinu EPO v porovnaní so sérom normálnych opíc. Izolácia požadovaných klonov cDNA s obsahom DNA, ktorá je kódom pre erytropoetín bola uskutočnená použitím DNA/DNA hybridizácie kolónii pri použití zmesi 128 rádioaktívne značených oligonukleotidov s 20 bázami s rýchlym vyhodnotením 200 000 vzniknutých kolónii. Stavba oligonukleotidových vzoriek bola určená podľa informácií o slede aminokyselín pri enzymatickej fragmentácii a určenia sledu v malej časti ľudského EPO.The DNA monkey was isolated from the cDNA group, which was generated by kidney tissue mRNA from chemically induced anemia, the monkey's serum containing a high level of EPO compared to that of normal monkeys. Isolation of the desired cDNA clones containing the DNA encoding erythropoietin was performed using colony DNA / DNA hybridization using a mixture of 128 radiolabeled oligonucleotides with 20 bases with a rapid evaluation of 200,000 colonies formed. The construction of the oligonucleotide samples was determined according to the amino acid sequence information in enzymatic fragmentation and the sequence determination in a small portion of human EPO.
DNA človeka bola izolovaná z ľudského genómu. Izolácia klonov s obsahom DNA, ktorá je kódom pre EPO bola uskutočnená hybridizáciou povlakov pri použití uvedenej zmesi 128 oligonukleotidov s 20 bázami a druhej zmesi s 128 rádioaktívne značených oligonukleotidov s 17 bázami podľa informácií, získaných o slede aminokyselín z iného enzymaticky získaného fragmentu ľudského EPO.Human DNA was isolated from the human genome. Isolation of EPO-encoded DNA clones was accomplished by hybridization of the coatings using said mixture of 128 base 20 oligonucleotides and a second mixture of 128 radiolabeled 17 base oligonucleotides according to the amino acid sequence information from another enzymatically obtained fragment of human EPO.
Pozitívne klony a povlaky boli overené zistením sledu DNA klonu pri použití pomocnej zostavy 16 sledov pre zmes vzoriek s 20 bázami a vybrané klony boli podrobené zisteniu sledu nukleotidov, ktorej výsledkom bolo odvodenie primárnej štruktúry polypeptidov typu EPO, pre ktoré bola táto DNA kódom. Takto preukázaný sled polypeptidu bol vysoko homológny s čiastočným sledom aminokyselín, zisteným analýzou aminokyselín fragmentov ľudského EPO.Positive clones and coatings were verified by detecting the DNA sequence of the clone using a 16-sequence subassembly for a 20 base sample mix, and selected clones were subjected to a nucleotide sequence resulting in the deduction of the primary structure of EPO-type polypeptides for which this DNA code was coded. The polypeptide sequence thus demonstrated was highly homologous to a partial amino acid sequence as determined by amino acid analysis of human EPO fragments.
Vybraný pozitívny kloň cDNA opice a vybraný pozitívny kloň cDNA človeka boli včlenené do vektora na prenos DNA, ktorý bol namnožený v E. coli a potom použitý na transfekciu buniek cicavcov v kultúre. Tieto bunky potom boli ďalej pestované, pričom v supernatante kultúry bolo možno preukázať až 3000 mjednotiek EPO v 1 ml.The selected monkey cDNA positive clone and the selected human cDNA positive clone were incorporated into a DNA transfer vector that was amplified in E. coli and then used to transfect mammalian cells in culture. These cells were then cultured, and up to 3000 EPO units per ml could be detected in the culture supernatant.
Vynález bude osvetlený nasledujúcimi príkladmi a jednotlivé príklady sú špecificky zamerané na postupy, ktoré boli uskutočnené pred identifikáciou klonov cDNA, ktoré sú kódom pre EPO opice a klonov ľudského genómu, na postupy, ktoré boli zamerané na identifikáciu a určenie sledu, na vývoj systému pre expresiu a na imunologické overenie expresie EPO v týchto systémoch.The invention will be illustrated by the following examples, and the specific examples are specifically directed to procedures that have been performed prior to the identification of cDNA clones that encode EPO monkeys and human genome clones, procedures that have been identified and identified, and the development of an expression system and to immunologically verify EPO expression in these systems.
Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Príklad 1 je zameraný na určenie sledu aminokyselín vo fragmentoch ľudského EPO a na konštrukciu zmesi rádioaktívne značených vzoriek na základe výsledkov určenia sledu.Example 1 is aimed at determining the amino acid sequence in human EPO fragments and constructing a mixture of radiolabeled samples based on the sequence determination results.
Príklad 2 je zameraný na postupy, vedúce k identifikácii pozitívnych klonov cDNA opice a poskytuje informáciu na ošetrenie zvierat a na predbežnú rádioimunologickú analýzu (RIA) živočíšnych sér.Example 2 is directed to procedures leading to the identification of positive monkey cDNA clones and provides information for animal treatment and preliminary radioimmunoassay (RIA) of animal sera.
Príklad 3 je zameraný na prípravu zmesi a zostavy cDNA, na hybridizáciu kolónií, vyhľadávanie pozitívnych kolónií a overovanie pozitívnych klonov, na zistenie sledu DNA v pozitívnom cDNA klone a na potvrdenie primárnej štruktúry EPO opice (stanovenie sledu aminokyselín).Example 3 is directed to the preparation of a cDNA mix and assembly, to colonization, search for positive colonies, and to verify positive clones, to detect DNA sequence in a positive cDNA clone, and to confirm the primary structure of an EPO monkey (amino acid sequence determination).
Príklad 4 je zameraný na postupy, zahŕňajúce identifikáciu pozitívnych klonov ľudského genómu a zaisťuje informáciu o zdroji genómickej „knižnice“, hybridizáciu povlakov a overenie pozitívnych klonov.Example 4 is directed to procedures involving the identification of positive clones of the human genome and provides information about the genomic "library" source, hybridization of coatings, and verification of positive clones.
Príklad 5 je zameraný na zistenie sledu DNA v pozitívnom klone genómu a na získanie informácie o slede aminokyselín v ľudskej EPO,vrátane jeho porovnania so sledom EPO opice.Example 5 is aimed at detecting the DNA sequence in a positive clone of the genome and at obtaining information about the amino acid sequence in human EPO, including its comparison with that of the monkey EPO.
V príklade 6 sú uvedené postupy konštrukcie vektora s včlenenou DNA, ktorá je kódom pre EPO, odvodeného od pozitívneho klonu cDNA opice, použitie tohto vektora na transfekciu buniek COS-1 a pestovanie týchto buniek po transfekcii.Example 6 shows the procedures for constructing a vector with the incorporated DNA encoding EPO derived from a positive cDNA monkey clone, using the vector to transfect COS-1 cells, and culturing the cells after transfection.
SK 279959 Β6SK 279959 Β6
Príklad 7 je zameraný na konštrukciu vektora s včlenenou DNA, ktorá je kódom pre EPO, získanou z pozitívneho klonu ľudského genómu, použitie tohto vektora na transfekciu buniek COS-1 a pestovanie týchto buniek po transfekcii.Example 7 is directed to the construction of a vector incorporating DNA encoding EPO derived from a positive clone of the human genome, the use of the vector to transfect COS-1 cells, and culturing these cells after transfection.
Príklad 8 sa týka imunologických postupov, pri ktorých bol použitý supematant z kultúr buniek po transfekcii podľa príkladov 6 a 7.Example 8 relates to immunological procedures in which the supernatant from the transfected cell cultures according to Examples 6 and 7 was used.
Príklad 9 je zameraný na sledovanie biologickej účinnosti in vivo a in vitro pre EPO, získaný mikrobiálnou expresiou v príkladoch 6 a 7.Example 9 is aimed at monitoring the biological activity in vivo and in vitro for EPO, obtained by microbial expression in Examples 6 and 7.
Príklad 10 sa týka vývoja systémov na expresiu u cicavcov pre cDNA EPO opice a pre DNA ľudského genómu, vrátane použitia ovária čínskeho chrčka (bunky CHO) a tiež imunologického a biologického sledovania účinnosti produktov, získaných expresiou pri použití týchto systémov a vlastností týchto produktov.Example 10 relates to the development of mammalian expression systems for EPO monkey cDNA and human genome DNA, including the use of Chinese Hamster Ovary (CHO cells) as well as immunological and biological monitoring of the efficacy of the expression products and the properties of these products.
Príklad 11 je zameraný na prípravu génov, ktoré sú kódom pre ľudský EPO a jeho analógy, pričom tieto gény môžu obsahovať rad preferenčných kodónov, ktoré umožňujú alebo uľahčujú expresiu v E. coli alebo v kvasinkách. Príklad sa tiež týka príslušných systémov na expresiu týchto génov.Example 11 is directed to the production of genes that encode human EPO and its analogs, which genes may contain a number of preferential codons that allow or facilitate expression in E. coli or yeast. The example also relates to appropriate systems for the expression of these genes.
Príklad 12 sa vzťahuje na imunologickú a biologickú účinnosť produktov, získaných spôsobom expresie podľa príkladu 11.Example 12 refers to the immunological and biological efficacy of the products obtained by the expression method of Example 11.
Vynález bude osvetlený nasledujúcimi príkladmi.The invention will be illustrated by the following examples.
Príklad 1Example 1
A. Stanovenie sledu aminokyselín vo fragmente ľudského erytropoetínuA. Determination of amino acid sequence in a fragment of human erythropoietin
Ľudský EPO bol izolovaný z moču a rozštiepený trypsínom, čím vzniklo a bolo izolovaných 17 oddelených fragmentov v množstvách približne 100 až 150 pmolov.Human EPO was isolated from urine and digested with trypsin to produce and isolate 17 separated fragments in amounts of about 100 to 150 pmoles.
Tieto fragmenty boli skusmo očíslované a potom boli analyzované na sled aminokyselín mikroanalýzou sledu pri použití zariadenia, ktoré pracuje s plynovou fázou (Biosystems Applied), čím bola získaná informácia, ktorá je uvedená v nasledujúcej tabuľke I. V tejto tabuľke sú ako kódy použité jednotlivé písmená a „X“ znamená zvyšok, ktorý nebol jednoznačne určený.These fragments were bite-numbered and then analyzed for amino acid sequence by sequence microanalysis using a gas-phase apparatus (Biosystems Applied) to obtain the information shown in Table I. In this table, the individual letters are used as codes and "X" means a residue that has not been clearly identified.
Tabuľka ITable I
B. Zloženie a konštrukcia zmesi vzoriek oligonukleotidovB. Composition and construction of a mixture of oligonucleotide samples
Sledy aminokyselín, uvedené v tabuľke I boli použité vzhľadom na možnú degeneráciu genetického kódu na zistenie, či by bolo možné použiť postup s využitím zmiešanej vzorky pre DNA/DNA hybridizáciu na cDNA a/alebo na DNA z „knižnice“ genómu. Táto analýza umožnila zistiť, že vo ľragmente č. T35 sa nachádzal sled siedmich zvyškov aminokyselín (Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys), pre ktorý by mohol byť kódom jeden zo 128 možných sledov DNA s obsahom 20 párov báz. Bol preto zostavený prvý súhrn 128 sledov s 20 pármi báz štandardným fosfoamiditovým spôsobom podľa publikácie Beaucage a ďalšie, Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1862 (1981) na pevnom nosiči podľa nasledujúcej tabuľky II.The amino acid sequences shown in Table I were used with respect to the possible degeneracy of the genetic code to determine whether a mixed DNA / DNA hybridization procedure could be used for cDNA and / or DNA from a genome 'library'. This analysis made it possible to find that in the fragment no. T35 was a sequence of seven amino acid residues (Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys) which could be coded for by one of the 128 possible 20 base-pair DNA sequences. Therefore, a first summary of 128 sequences with 20 base pairs was constructed using the standard phosphoamidite method of Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1862 (1981) on a solid support according to the following Table II.
Tabuľka IITable II
Ďalšou analýzou bolo možné preukázať, že vo fragmente č. T38 existuje sled šiestich zvyškov aminokyselín (Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu), na základe tohto sledu bolo možné pripraviť zmes 128 oligonukleotidov so 17 pármi báz podľa nasledujúcej tabuľky III.Further analysis showed that in fragment no. T38 exists a sequence of six amino acid residues (Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu), based on which sequence a mixture of 128 oligonucleotides with 17 base pairs was prepared according to the following Table III.
Tabuľka IIITable III
Vzorky oligonukleotidov boli označené na 5'-zakončení pomocou 32P-ATP, 7500 až 8000 Ci/mol (ICN) pri použití T4-polynukleotidkinázy (NEN).Oligonucleotide samples were labeled at the 5'-end with 32 P-ATP, 7500 to 8000 Ci / mol (ICN) using T 4 -polynucleotide kinase (NEN).
Príklad 2Example 2
A. Predbežné ošetrenie opíc a analýza RIAA. Monkey pretreatment and RIA
Samiciam opice Macac fascicularis s hmotnosťou 2.5 až 3 kg vo veku 1,5 až 2 roky bol podkožné podaný roztok s pH 7 s obsahom 12,5 mg/kg fenylhydrazínu vo forme hydrochloridu v deň 1, 3 a 5. Pred každou injekciou bol kontrolovaný hematokrit. V deň 7 alebo kedykoľvek, keď poklesla hodnota hematokritu na 25 % hodnoty pôvodnej, bolo izolované krvné sérum a obličky po podaní 25 mg/kg ketamínhydrochloridu. Materiál bol okamžite zmrazený v kvapalnom dusíku a skladovaný pri teplote - 70 °C.Maca fascicularis monkeys weighing 2.5 to 3 kg aged 1.5 to 2 years received a pH 7 solution containing 12.5 mg / kg of phenylhydrazine hydrochloride subcutaneously on days 1, 3 and 5. Prior to each injection, it was checked hematocrit. On day 7 or at any time when the hematocrit value dropped to 25% of the original value, blood serum and kidneys were isolated following administration of 25 mg / kg ketamine hydrochloride. The material was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
B. RIA pre EPOB. RIA for EPO
Rádioimunologické skúšky na kvantitatívne stanovenie erytropoetínu vo vzorkách boli vykonávané nasledujúcim spôsobom:Radioimmunoassays for the quantitative determination of erythropoietin in the samples were performed as follows:
Štandard erytropoetínu alebo neznáma vzorka bol inkubovaný spolu s antisérom dve hodiny pri teplote 37 “C. Po dvoch hodinách inkubácie boli schladené skúmavky so vzorkami v ľade, bol pridaný erytropoetín, značený 125I a skúmavky boli inkubované pri teplote 0 °C aspoň 15 hodín. Každá zo skúmaviek obsahovala 500 μΐ inkubačnej zmesi, skladajúcej sa z 50 μΐ zriedeného imúnneho séra, 10 000 impulzov za minútu 125-erytropoetinu, 5 μΐ trasylolu a 0 - 250 μΐ štandardu EPO alebo neznámej vzorky, zvyšok objemu bol doplnený použitím PBS s obsahom 0,1 % BSA. Použité antisérum bolo z druhého pokusného odberu krvi králikov, imunizovaných 1 % čistým prípravkom erytropoetínu z ľudského moču. Konečné riedenie antiséra bolo v priebehu pokusu upravené tak, aby množstvo 125I-EPO, viazané na protilátku bolo najvyššie 10 až 20% možných vstupných impulzov, čo je všeobecne konečné riedenie antiséra v rozmedzí 1 : 50 000 až 1 : 100 000.The erythropoietin standard or unknown sample was incubated with the antiserum for two hours at 37 ° C. After two hours of incubation, the tubes with ice samples were cooled, 125 L-labeled erythropoietin was added, and the tubes were incubated at 0 ° C for at least 15 hours. Each tube contained 500 μ 500 of incubation mixture consisting of 50 μΐ of diluted immune serum, 10,000 counts per minute of 125- erythropoietin, 5 μΐ of Trasylol and 0-250 μΐ of EPO standard or unknown sample, the rest of the volume was supplemented using PBS containing 0 , 1% BSA. The antiserum used was from a second experimental blood sample of rabbits immunized with 1% pure preparation of erythropoietin from human urine. The final dilution of the antiserum was adjusted during the experiment so that the amount of 125 I-EPO bound to the antibody was at most 10-20% of the possible input pulses, which is generally the final dilution of the antiserum in the range of 1: 50,000 to 1: 100,000.
Protilátka, viazaná na ,25I-erytropoetín bola vyzrážaná pridaním 150 μ[ Staph A. Po 40 minútach inkubácie boli vzorky odstredené a pelety boli dvakrát premyté 0,75 ml 10 mM Tris-HCl s pH 8,2 s obsahom 0,15 M chloridu sodného, 2 mM EDTA a 0,05 % Tritonu X-100. V premytých peletách bol stanovený počet impulzov na stanovenie perThe 25 I-erythropoietin-bound antibody was precipitated by the addition of 150 μ [Staph A. After 40 min incubation, the samples were centrifuged and the pellets were washed twice with 0.75 ml of 10 mM Tris-HCl pH 8.2 containing 0.15 M. sodium chloride, 2 mM EDTA and 0.05% Triton X-100. The number of pulses to determine pens was determined in the washed pellets
SK 279959 Β6 centuálneho množstva viazaného značeného erytropoetínu. Impulzy, získané pre sérum pred imunizáciou boli od získaných hodnôt odčítané na vylúčenie vplyvu nešpecifickej precipitácie. Množstvo erytropoetínu v neznámej vzorke bolo vyrátané porovnaním so štandardnou krivkou.276 of the central amount of bound labeled erythropoietin. Pulses obtained for serum prior to immunization were subtracted from the values obtained to exclude the effect of non-specific precipitation. The amount of erythropoietin in the unknown sample was calculated by comparison with the standard curve.
Uvedený postup bol aplikovaný na sérum opíc, získané v časti A a na sérum zdravých opíc. Normálne sérum obsahovalo približne 36 mJ/ml, zatiaľ čo sérum opíc vopred ošetrených obsahovalo množstvo v rozmedzí 1000 až 1700 mJ/ml.The procedure was applied to the serum of monkeys obtained in Part A and to the serum of healthy monkeys. Normal serum contained approximately 36 mJ / ml, while serum from pretreated monkeys contained between 1000 and 1700 mJ / ml.
Príklad 3Example 3
A. Konštrukcia „knižnice“ cDNA opiceA. Construction of a monkey cDNA library
Z obličiek normálnych a anemických opíc bola izolovaná mRNA pomocou guanidíniumtiokyanátu podľa publikácie Chirgwin a ďalšie, Biochemistry 18, str. 5294 (1979) a poly (A)+ mRNA bola čistená dvojitým priechodom stĺpcom s náplňou oligo(dT)-celulózy spôsobom podľa publikácie Maniatis a ďalšie, „Molecular cloning, a laboratory manual“ (Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N. Y. 1982), str. 197 až 198. „Knižnica“ cDNA bola konštruovaná podľa modifikácie všeobecného postupu, opísaného v publikácii Okayama a ďalšie, Mol. and Celí. Biol. 2, str. 161 až 170 (1982). Kľúčové stupne výhodného postupu sú nasledujúce:MRNA was isolated from the kidneys of normal and anemic monkeys using guanidinium thiocyanate according to Chirgwin et al., Biochemistry 18, p. 5294 (1979) and poly (A) + mRNA was purified by double-pass the oligo (dT) -cellulose column using the method of Maniatis et al., "Molecular cloning, a laboratory manual" (Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY) 1982), p. 197-198. The cDNA "library" was constructed according to a modification of the general procedure described by Okayama et al., Mol. and Cell. Biol. 2, p. 161-170 (1982). The key steps of the preferred process are as follows:
1. ako jediný vektor sa použije pUC8, štiepený enzýmom PstI s následným naviazaním oligo dT s dĺžkou 60 až 80 báz,1. pUC8 digested with PstI followed by oligo dT binding of 60 to 80 bases is used as the sole vector;
2. na odstránenie oligo dT z jedného zakončenia vektora sa použije enzým Hinc II,2. The enzyme Hinc II is used to remove oligo dT from one end of the vector.
3. syntéza prvého reťazca a naviazanie oligo dT bolo vykonané podľa uvedenej publikácie,3. first-chain synthesis and oligo dT binding were performed as described above,
4. štiepenie BamHI bolo použité na odstránenie oligo dG z jedného zakončenia vektora a4. BamHI digestion was used to remove oligo dG from one end of vector a
5. náhrada reťazca RNA reťazcom DNA bola uskutočnená v prítomnosti dvoch pomocných väzbových reťazcov, a to GATCTAAGACCGTCCCCCCCCC a ACGGTCTTTA v trojnásobnom molámom prebytku, vztiahnuté na vektor so zakončením oligo dG.5. Replacement of the RNA strand with the DNA strand was performed in the presence of two helper binding chains, GATCTAAGACCGTCCCCCCCCC and ACGGTCTTTA, in triple molar excess, relative to the oligo dG-terminated vector.
B. Hybridizácia kolónií s cieľom vyhľadať sled v zostave cDNA opiceB. Colonization hybridization to look for sequence in monkey cDNA assembly
Transformovaný mikroorganizmus E. coli bol nanesený pri hustote 9000 kolónií na platne živnej pôdy s rozmerom 10 x 10 cm s obsahom 50 mikrogramov ampicilínu. Filtre GeneScreen (New England Nuclear katalógové č. Nef-972) boli vopred zvlhčené na platne BHI-CAM (Bacto brain heart infusion 37 g/1, kasaminokyseliny 2 g/1 a agar 15g/l s obsahom 500 mikrogramov chloramfenikolu) a potom boli použité na odstránenie kolónií z platne. Kolónie boli pestované v rovnakom prostredí 12 hodín alebo dlhšie na získanie väčšieho počtu kópií plazmidu. Potom boli kolónie (kolóniami smerom hore) spracovávané tak, že filtre boli postupne ukladané na dve vrstvy papiera Whatman 3 MM, nasýtené nasledujúcimi roztokmi:The transformed E. coli microorganism was plated at a density of 9000 colonies on 10 x 10 cm culture plates containing 50 micrograms of ampicillin. GeneScreen filters (New England Nuclear Catalog No. Nef-972) were pre-wetted on BHI-CAM plates (Bacto brain heart infusion 37 g / l, casamino acid 2 g / l and agar 15g / l containing 500 micrograms of chloramphenicol) and then used to remove colonies from the plate. Colonies were grown in the same medium for 12 hours or longer to obtain multiple copies of the plasmid. Thereafter, the colonies (colonies upwards) were processed so that the filters were successively deposited on two layers of Whatman 3 MM paper saturated with the following solutions:
L 50 mM glukózy, 25 mM Tris-HCl s pH 8,0, 10 mM EDTA s pH 8,0 na päť minút,L 50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0 for five minutes,
2. 0,5 M NaOH na desať minút a potom2. 0.5 M NaOH for ten minutes and then
3. 1,0 M Tris-HCl s pH 7,5 na tri minúty.3. 1.0 M Tris-HCl pH 7.5 for three minutes.
Potom boli filtre usušené na vzduchu vo vákuu dve hodiny pri teplote 80 °C.The filters were then air dried under vacuum at 80 ° C for two hours.
Ďalej boli filtre podrobené štiepeniu pôsobením proteinázy K pôsobením roztoku s obsahom 50 mikrogramov/ml tohto enzýmu v tlmivom roztoku K [0,1 M Tris-HCl s pH 8,0, 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA s pH 8,2 a 0,2 % SDS], Na každý filter sa pridá 5 ml roztoku a štiepenie sa vykonáva 30 minút pri teplote 55 °C, potom sa roztok odstráni.Furthermore, the filters were digested with proteinase K with a solution containing 50 micrograms / ml of this enzyme in K buffer [0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.2 and 0.2% SDS], 5 ml of the solution are added to each filter and the cleavage is carried out at 55 ° C for 30 minutes, then the solution is removed.
K filtrom sa potom pridá 4 ml predhybridizačného tlmivého roztoku (5 x SSPE, 0,5 % SDS, 100 mikrogra mov/liter SS E. coli DNA a 5x BFP). Tlmivý roztok sa nechá pôsobiť pri teplote 55 °C obyčajne 4 hodiny alebo dlhšie a potom sa odstráni.4 ml of prehybridization buffer (5 x SSPE, 0.5% SDS, 100 micrograms / liter SS E. coli DNA and 5x BFP) are then added to the filters. The buffer is allowed to act at 55 ° C for typically 4 hours or longer and then discarded.
Hybridizácia sa potom vykonáva nasledujúcim spôsobom: Ku každému filtru sa pridajú 3 ml hybridizačného tlmivého roztoku (5x SSPE, 0,5% SDS, 100 mikrogramov/liter tRNA kvasiniek) s obsahom 0,025 pikomolov každého zo 128 vzoriek, uvedených v tabuľke II (táto zmes sa označuje ako EPV zmes) a potom sa filtre udržujú 20 hodín na teplote 48 °C. Táto teplota je o 2 °C nižšia ako najnižšia vypočítaná teplota pre disociáciu (Td) pre každú z uvedených vzoriek.Hybridization was then performed as follows: To each filter was added 3 ml hybridization buffer (5x SSPE, 0.5% SDS, 100 microgram / liter yeast tRNA) containing 0.025 picomoles of each of the 128 samples listed in Table II (this mixture). is referred to as EPV mixture) and then the filters are kept at 48 ° C for 20 hours. This temperature is 2 ° C lower than the lowest calculated dissociation temperature (Td) for each of the samples.
Po hybridizácii sa filtre trikrát premyjú na trepačke vždy 10 minút pri použití 6x SSC a 0,1 % SDS pri teplote miestnosti, potom sa premyjú ešte dvakrát až trikrát 6x SSC s 1 % SDS pri teplote hybridizácie 48 °C.After hybridization, the filters were washed three times on a shaker for 10 minutes each using 6x SSC and 0.1% SDS at room temperature, then washed two to three times 6x SSC with 1% SDS at a hybridization temperature of 48 ° C.
Autorádiografiou filtrov bolo možné preukázať, že z pôvodného počtu 200 000 kolónií je sedem kolónií pozitívnych.It was shown by autoradiography of the filters that out of the original 200,000 colonies, seven were positive.
Potom bola vykonaná analýza sledu jedného z klonov cDNA opice (označeného ako kloň 83) modifikáciou postupu, uvedeného v publikácii Wallace a ďalšie, Gene 16, str. 21 až 26 (1981). Postup bol urobený tak, že plazmidová DNA opičieho klonu 83 cDNA bola linearizovaná pôsobením reštrikčného enzýmu EcoRI a potom denaturovaná zahriatím vo vriacom kúpeli. Sled dezoxynukleotidov bol stanovený spôsobom podľa publikácie Sanger a ďalšie, P. N. A. S. (USA) 74, str. 5463 až 5467 (1977). Ako prajmer pre túto reakciu bola použitá podskupina EPV zmesi, skladajúca sa z 16 sledov.The sequence of one of the monkey cDNA clones (designated as clone 83) was then analyzed by modifying the procedure of Wallace et al., Gene 16, p. 21-26 (1981). The procedure was carried out by plasmid DNA of monkey clone 83 cDNA linearized with EcoRI and then denatured by heating in a boiling bath. The sequence of the deoxynucleotides was determined by the method of Sanger et al., P. N.A. S. (USA) 74, p. 5463-5467 (1977). A subset of the EPV mixture consisting of 16 sequences was used as a primer for this reaction.
C. Stanovenie sledu cDNA opice pre EPOC. Determination of monkey cDNA sequence for EPO
Analýza nukleotidov klonu 83 bola vykonávaná podľa publikácie Messing, Methods in Enzymology 101, str. 20 až 78 (1983). V tabuľke IV je zhrnutá analýza reštrikčnými enzýmami približne 1600 párov báz fragmentu klonu 83, štiepeného enzýmom EcoRI/Hind 111. Približné uloženie miest pre pôsobenie uvedených reštrikčných endonukleáz bolo stanovené tak, že bol určený počet báz od zakončenia 3' k miestu pre pôsobenie enzýmu EcoRI v blízkosti 51zakončenia tohto fragmentu. Analýza sledu nukleotidov bola vykonaná stanovením sledu jednotlivých fragmentov po pôsobení jednotlivých reštrikčných enzýmov tak, že bolo možné zistiť tiež fragmenty, ktoré sa prekrývajú. Tak bolo zistené napríklad prekrytie pri analýze sledu nukleotidov v prípade reštrikčného fragmentu, označeného C113 (Sau3A pri približne 11/Smal pri približne 324) a obrátený sled v prípade fragmentu, označeného ako C73 (Alul pri približne 424/BstEII pri približne 203).Nucleotide analysis of clone 83 was performed according to Messing, Methods in Enzymology 101, p. 20-78 (1983). Table IV summarizes the restriction enzyme analysis of approximately 1600 base pairs of the fragment of clone 83 digested with EcoRI / Hind III. The approximate placement of the restriction endonuclease sites was determined by determining the number of bases from the 3 'end to the EcoRI site. 5 near one terminus of the fragment. Nucleotide sequence analysis was performed by determining the sequence of individual fragments after treatment with individual restriction enzymes so that fragments that overlap could also be detected. Thus, for example, an overlap was detected in a nucleotide sequence analysis for a restriction fragment designated C113 (Sau3A at about 11 / SmaI at about 324) and an inverted sequence for a fragment designated C73 (Alu1 at about 424 / BstEII at about 203).
V nasledujúcej tabuľke IV je uvedené približné miesto na pôsobenie jednotlivých reštrikčných endonukleáz.Table IV shows the approximate site of action of the individual restriction endonucleases.
Tabuľka IVTable IV
Stanovenie sledu úseku s 1342 pármi báz (v oblasti od miesta pôsobenia enzýmu Sau3A v blízkosti 3'-zakončenia do miesta pôsobenia enzýmu EcoRI a HindlII) a analýza smeru odčítania dovolila získať informácie o slede aminokyselín a o príslušnej DNA tak, ako sú uvedené v tabuľke V. V tejto tabuľke je počiatočná aminokyselina úplného EPO (ako to bolo overené koreláciou s vopred uvedeným sledom s 20 terminálnymi aminokyselinami) označená číslom + 1. Prítomnosť kodónu ATG, špecifického pre tvorbu metionínu (a označeného číslom -27) „smerom hore“ od terminálneho alanínového zvyšku ako prvého zvyšku pre úplný EPO napovedá, že k expresii EPO dochádza najskôr v cytoplazme vo forme prekurzora, ktorý obsahuje „vedúcu“ oblasť s 27 zvyškami aminokyselín, ktorá sa odštepuje pred vstupom EPO do krvného obehu. Potenciálne miesta pre glykozláciu sú v polypeptide označené hviezdičkami. Stanovená molekulová hmotnosť prenesenej oblasti bola stanovená ako 21 117 jednotiek a molekulová hmotnosť 165 polypeptidových zvyškov, tvoriacich úplný EPO opice bola stanovená ako 18 236 jednotiek.The determination of the 1342 base pair sequence (in the region from the Sau3A site near the 3'-end to the EcoRI and HindIII sites) and the subtraction direction analysis allowed to obtain information about the amino acid sequence and the corresponding DNA as shown in Table V In this table, the initial amino acid of full EPO (as verified by correlation with the above 20 terminal amino acid sequence) is indicated by + 1. The presence of the methionine-specific ATG codon (and denoted by -27) from the terminal alanine residue as the first residue for full EPO suggests that EPO expression first occurs in the cytoplasm in the form of a precursor containing a 27-amino acid leader region that cleaves before EPO enters the bloodstream. Potential glycosylation sites are indicated by asterisks in the polypeptide. The determined molecular weight of the transferred region was determined to be 21 117 units and the molecular weight of 165 polypeptide residues constituting the complete EPO monkey was determined to be 18 236 units.
Tabuľka VTable V
Translácie opičej cDNA pre EPOTranslation of monkey cDNA for EPO
Sau3ASau3A
GÄTČCCGCGCCCCCTGGACAGCCGCCCTCTCCTCCAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCCCGÄTČCCGCGCCCCCTGGACAGCCGCCCTCTCCTCCAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCCC
CGCTGAACTTCCCCGGATGAGGACTCCCGGTGTGGTCACCGCGCGCCTAGGTCGCTGAGCGCTGAACTTCCCCGGATGAGGACTCCCGGTGTGGTCACCGCGCGCCTAGGTCGCTGAG
-27 -20-27 -20
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp GGACCCCGGCCAGGCGCGGAGATG GGG GTG CAC GAA TGT CCT GCC TGGGly Val His Glu Cys Pro Ala Trp GGACCCCGGCCAGGCGCGGAGATG GGG GTG CAC GAA TGT CCT GCC TGG
100100
Tabuľka V - pokračovanieTable V - continued
150 160150 160
Leu Aig Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg ArgAlu Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr
CTC CGG GGA AAG CTG AAG CTG TAC ACG GGG GAG GCC TGC AGG AGACTC CGG GAG AAG CTG AAG CTG TAC ACG GGG
165165
Gly Asp Arg OPGly Asp Arg OP
GGG GAC AGA TGA CCAGGTGCGTCCAGCTGGGCACATCCACCACCTCCCTCACCAACAGGG GAC AGA TGA CCAGGTGCGTCCAGCTGGGCACATCCACCACCTCCCTCACCAACA
CTGCCTGTGCCACACCCTCCCTCACCACTCCCGAACCCCATCGAGGGGCTCTCAGCTAAGCTGCCTGTGCCACACCCTCCCTCACCACTCCCGAACCCCATCGAGGGGCTCTCAGCTAAG
CGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCAGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAAC TGTCCAGAGCACAACTCTGAGATCTAAGGATGTCGCAGGGCCAACTTGAGGGCCCAGAGC AGGAAGCATTCAGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGAGCAGAGACAATGCAGGGAAAACACCT GAGCTCACTCGGCCACCTGCAAAATTTGATGCAGGACACGCTTTGGAGGCAATTTACCTG TTTTTGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTT CTCAAGGCCTCACGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACTGAGAGAATATT TTGCAATCTGCAGCAGGAAAAATTACGGACAGGTTTTGGAGGTTGGAGGGTACTTGACAG GTGTGTGGGGAAGCAGGGCGGTAGGGGTGGAGCTGGGATGCGAGTGAGAACCGTGAAGAC AGGATGGGGGCTGGCCTCTGGTTCTCGTGGGGTCCAAGCTTCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCCAGTGCCAGCAATGACATCTCAGGGGCCAGAGGAAC TGTCCAGAGCACAACTCTGAGATCTAAGGATGTCGCAGGGCCAACTTGAGGGCCCAGAGC AGGAAGCATTCAGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGAGCAGAGACAATGCAGGGAAAACACCT GAGCTCACTCGGCCACCTGCAAAATTTGATGCAGGACACGCTTTGGAGGCAATTTACCTG TTTTTGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTT CTCAAGGCCTCACGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACTGAGAGAATATT TTGCAATCTGCAGCAGGAAAAATTACGGACAGGTTTTGGAGGTTGGAGGGTACTTGACAG GTGTGTGGGGAAGCAGGGCGGTAGGGGTGGAGCTGGGATGCGAGTGAGAACCGTGAAGAC AGGATGGGGGCTGGCCTCTGGTTCTCGTGGGGTCCAAGCTT
HindlIIHind III
Polypeptidový sled, uvedený v tabuľke V, je možné ľahko podrobiť analýze na prítomnosť vysoko hydrofilných oblastí a/alebo analýze na sekundárne štruktúrne vlastnosti, ktoré sú tiež napríklad potenciálnymi vysoko imunogénnymi oblasťami, napríklad spôsobom podľa publikácie Hopp a ďalšie, PNAS (USA) 78, str. 3824 až 3828 (1981) a podľa publikácie Kyte a ďalšie, J. Mol. Biol. 157, str. 105 až 132 (1982) a/alebo Chou a ďalšie, Biochem. 13, str. 222 až 245 (1974) a Advances in Enzymology 47, str. 45 až 47 (1978). Analýzu s pomocou počítača je možné zaistiť pri využití ponuky PEP Reference Section 6.7, Intelligenetics Inc., 124 Univcrsity Avenue, Palo Alto, Califomia, USA (spôsob podľa Hoppeho a ďalších).The polypeptide sequence shown in Table V is readily subjected to analysis for the presence of highly hydrophilic regions and / or for analysis of secondary structural properties, which are also, for example, potential highly immunogenic regions, for example, by the method of Hopp et al., PNAS (USA) 78. p. 3824-3828 (1981) and Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, p. 105-132 (1982) and / or Chou et al., Biochem. 13, p. 222-245 (1974) and Advances in Enzymology 47, p. 45-47 (1978). Computer-aided analysis can be performed using the PEP Reference Section 6.7, Intelligenetics Inc., 124 Univcrsity Avenue, Palo Alto, Califomia, USA (Hoppe et al. Method).
Príklad 4Example 4
A. Zostava ľudského genómuA. Human genome assembly
Bola získaná zostava genómu ľudskej fetálnej pečene, nesená fágom Ch4A spôsobom, opísaným v publikácii Lawn a ďalšie, Celí 18, str. 533 až 543 (1979), zostava potom bola udržovaná na použitie pri hybridizácii povlakov.The human fetal liver genome assembly, carried by the phage Ch4A, was obtained as described by Lawn et al., Cell 18, p. 533-543 (1979), the assembly was then maintained for use in coating hybridization.
B. Hybridizácia povlakov ako metóda na vyhľadávanie sledov v zostave ľudského genómuB. Hybridization of coatings as a method for screening sequences in the human genome assembly
Častice fágu boli rozrušené a DNA bola fixovaná na filtre v množstve 50 000 povlakov na filter spôsobom, opísaným v publikácii Woo, Methods in Enzymology 68, str. 389 až 395 (1979) s tým rozdielom, že boli použité filtre GeneScreen Plus (New England Nuclear katalógové č. NEF-976) a platní NZYAM (NaCl 5 g, MgCl2.6 H2O 2 g, NZ-Amin A 10 g, extrakt z kvasníc 5 g, kasaminokyseliny 2 g, maltóza 2 g a agar 15 g na liter).The phage particles were disrupted and the DNA was fixed to the filters in an amount of 50,000 filter coatings as described in Woo, Methods in Enzymology 68, p. 389-395 (1979) except that GeneScreen Plus filters (New England Nuclear Catalog No. NEF-976) and NZYAM plates (NaCl 5 g, MgCl 2 .6 H 2 O 2 g, NZ-Amin A 10) were used. g, yeast extract 5 g, casamino acid 2 g, maltose 2 g and agar 15 g per liter).
Filtre, usušené na vzduchu boli zahrievané 1 hodinu na teplotu 80 °C a potom boli štiepené proteinázou K spôsobom podľa príkladu 3, časť B. Predbežná hybridizácia bola vykonávaná pri použití 1 M NaCl, 1 % SDS tlmivého roztoku 4 hodiny pri teplote 55 °C alebo o niečo dlhšie a potom bol tlmivý roztok odstránený. Hybridizácia a spracovanie po hybridizácii bolo vykonané obdobným spôsobom ako v príklade 3, časť B. Bola použitá tak zmes 128 vzoriek s 20 pármi báz, označená EPV, ako zmes 128 vzoriek s 17 pármi báz z tabuľky III, označená ako zmes EPQ. Hybridizácia bola vykonávaná pri použití zmesi EPV pri teplote 48 °C a pri použití zmesi EPQ pri teplote 46 °C, tzn. 4 stupne pod najnižšiu vyrátanú hodnotou Td pre zložky zmesi. Odstránenie hybridizovanej vzorky pre «hybridizáciu bolo uskutočnené varom s lx SSC, 0,1 % SDS na dve minúty. Autorádiografía filtrov preukázala prítomnosť troch pozitívnych klonov (ktoré reagovali s obidvoma vzorkami) zo skupiny pôvodných 1 500 000 fágov. Potom bola overená skutočnosť, že tieto pozitívne klony sú kódom pre EPO stanovením sledu DNA a v elektrónovom mikroskope, kde je možné preukázať štruktúru cDNA opice z príkladu 3. Týmto postupom bolo tiež možné preukázať prítomnosť intrónov v slede DNA genómu.The air-dried filters were heated at 80 ° C for 1 hour and then digested with Proteinase K by the method of Example 3, Part B. Preliminary hybridization was performed using 1 M NaCl, 1% SDS buffer at 55 ° C for 4 hours. or slightly longer and then the buffer was removed. Hybridization and post-hybridization treatment was carried out in a similar manner to Example 3, Part B. Both a mixture of 128 samples with 20 base pairs, designated EPV, and a mixture of 128 samples with 17 base pairs of Table III, referred to as EPQ, were used. Hybridization was carried out using an EPV mixture at 48 ° C and an EPQ mixture at 46 ° C; 4 degrees below the lowest calculated Td for the components of the mixture. Removal of the hybridized sample for hybridization was performed by boiling with 1x SSC, 0.1% SDS for two minutes. Filter autoradiography showed the presence of three positive clones (which reacted with both samples) from the original 1,500,000 phage group. It was then verified that these positive clones encode EPO by determining the DNA sequence and in an electron microscope where the monkey cDNA structure of Example 3 can be demonstrated. This procedure also demonstrated the presence of introns in the DNA sequence of the genome.
Príklad 5Example 5
Bola uskutočnená analýza sledu nukleotidov v jednom z pozitívnych klonov (označenom lambdahEl). Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke VI.Nucleotide sequence analysis was performed on one of the positive clones (designated lambdahE1). The results are shown in Table VI below.
Tabuľka VITable VI
AAGCTTCTGGGCTTCCAGACCCAGCTACTTTGCGGAACTCAGCAACCCAGGCATCTCTGAGTCTCCGCCCA agaccgggatgccccccacgggaggtgtccgggagcccagcctttcccagatagcacgctccgccagtcccAAGCTTCTGGGCTTCCAGACCCAGCTACTTTGCGGAACTCAGCAACCCAGGCATCTCTGAGTCTCCGCCCA agaccgggatgccccccacgggaggtgtccgggagcccagcctttcccagatagcacgctccgccagtccc
AAGGGTGCGCAACCGGCTCCACTCCCCTCCCGCGACCCAGGGCCCGGGAGCACCCCCCATGACCCACACGCAAGGGTGCGCAACCGGCTCCACTCCCCTCCCGCGACCCAGGGCCCGGGAGCACCCCCCATGACCCACACGC
ACGTCTGCAGCAGCCCCGCTCACGCCCCGGCGAGCCTCAACCCAGGCGTCCTGCCCCTGCTCTGACCCCGGACGTCTGCAGCAGCCCCGCTCACGCCCCGGCGAGCCTCAACCCAGGCGTCCTGCCCCTGCTCTGACCCCGG
GTCCCCCCTACCCCTGGCGACCCCTCACGCACACAGCCTCTCCCCCACCCCCACCCCCCCACCCACACATGGTCCCCCCTACCCCTGGCGACCCCTCACGCACACAGCCTCTCCCCCACCCCCACCCCCCCACCCACACATG
CAGATAACAGCCCCGACCCCCGCCCAGAGCCGXAGAGTCCCTGGGCCACCCCGGCCGCTCGCCTGCCGCTGCAGATAACAGCCCCGACCCCCGCCCAGAGCCGXAGAGTCCCTGGGCCACCCCGGCCGCTCGCCTGCCGCTG
CGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCCGAGCCGGACCGGGGCCACCGCGCCCXGCTCTGCTCCGACACCGCGCCCCGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCCGAGCCGGACCGGGGCCACCGCGCCCXGCTCTGCTCCGACACCGCGCCC
CTTGGACAGCCGCCCTCTCCTCTAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCACCGCCGAGCTTCCCGGGATGAGGXXCTTGGACAGCCGCCCTCTCCTCTAGGCCCGTGGGGCTGGCCCTGCACCGCCGAGCTTCCCGGGATGAGGXX
-27 -24-27 -24
Het Gly Val His CCCGGTGACCGGCGCGCCCCAAGTCGCTGAGGGACCCCGGCCAAGCGCGGAG ATG GGG GTG CAC GHet Gly Val His CCCGGTGACCGGCGCGCCCCAAGTCGCTGAGGGACCCCGGCCAAGCGCGGAG ATG GGG GTG CAC G
GTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCT ATTGGCCAAGAGGTGGCTGGGTTCAAGGACCGGCGACTTGTCAAGGACCCCGGAAGGGGGAGGGGGGTGGG GCAGCCTCCACGTGCCGCGGGGACTTGGGGGAGTTCTTGGGGATGGCAAAAACCTGGCCTGTTGAGGGGCA cagtttggggttggggaggaggtttggggttctgctgtgcagttgtgtcgttgtcagtgtctcgLi.5.] TTGCACACCCACACATCAATftAGCCACACGCAGCACCTGAGTGCTTGCATGGTTGGGACAGGAAGGACGAG ctggggcagagacctggggatgaaggaagctgtccttccacagccacccttctccccccccgcctgactctGTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCT ATTGGCCAAGAGGTGGCTGGGTTCAAGGACCGGCGACTTGTCAAGGACCCCGGAAGGGGGAGGGGGGTGGG GCAGCCTCCACGTGCCGCGGGGACTTGGGGGAGTTCTTGGGGATGGCAAAAACCTGGCCTGTTGAGGGGCA cagtttggggttggggaggaggtttggggttctgctgtgcagttgtgtcgttgtcagtgtctcgLi.5.] TTGCACACCCACACATCAATftAGCCACACGCAGCACCTGAGTGCTTGCATGGTTGGGACAGGAAGGACGAG ctggggcagagacctggggatgaaggaagctgtccttccacagccacccttctccccccccgcctgactct
Thr acg gtgagaccccttccccagcacattccacagaactcacgctcagggcttcagggaactcctcccagat ccaggaacctggcacttggtttggggtggagttgggaagctägacactgcccccctacataagaataagtc tggtggccccaaaccatacctgaaactaggcaaggagcaaagccagcagatcctacgcctgtgggccagggThr acg gtgagaccccttccccagcacattccacagaactcacgctcagggcttcagggaactcctcccagat ccaggaacctggcacttggtttggggtggagttgggaagctägacactgcccccctacataagaataagtc tggtggccccaaaccatacctgagccgg
5555
Ala Trp Lys Arg Het GluAla Trp Lys Arg Het Glu
GCC TGG AAG AGG ATG GAG GTGAGTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCTTTTGGAGAATCTCATTGCC TGG AAG AGG ATG GAG GTGAGTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCTTTTGGAGAATCTCATT
TGCGAGCCTGATTTTGGATGAAAGGGAGAATGATCGGGGCAAAGGTAAAATGGAGCAGCAGAGATGAGGCTTGCGAGCCTGATTTTGGATGAAAGGGAGAATGATCGGGGCAAAGGTAAAATGGAGCAGCAGAGATGAGGCT
GCCTGGGCGCAGAGGCTCACGTCTATAATCCCAGGCTGAGATGGCCGAGATGGGAGAATTGCTTGAGCCCTGCCTGGGCGCAGAGGCTCACGTCTATAATCCCAGGCTGAGATGGCCGAGATGGGAGAATTGCTTGAGCCCT
GGAGTTTCAGACCAACCTAGGCAGCATAGTGAGATCCCCCATCTCTACAAACATTTAAAAAAATTAGTCAG GTGAAGTGGTGCAľGGTGGTAGTCCCAGATATTTGGAAGGCTGAGGCGGCACGATCGCTTGAGCCCAGGAA TTTGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCACACCACTGCACTCCAGCCTCAGTGACAGAGTGAGGCCCTGrCTCAGGAGTTTCAGACCAACCTAGGCAGCATAGTGAGATCCCCCATCTCTACAAACATTTAAAAAAATTAGTCAG GTGAAGTGGTGCA1GGTGGTAGTCCCAGATATTTGGAAGGCTGAGCCGGTCACCCCCGCTTGACCCCCAGGAA TT
Tabuľka VI - pokračovanie aaaaagaaaagaaaaaagaaaaataatgagggctgtatggaatacattcattattcattcactcactcact cactcattcattcattcattcattcaacaagtcttattgcataccttctgtttgctcagcttggtgcttcgTable VI - continued aaaaagaaaagaaaaaagaaaaataatgagggctgtatggaatacattcattattcattcactcactcact cactcattcattcattcattcattcaacaagtcttattgcataccttctgtttgctcagcttggtgcttcg
GGCTGCTGAGGGGCAGGAGCGAGAGGCTGACATGCGTCAGCTCCACTCCCACAGTCCACTCCCTCTAGGGCTGCTGAGGGGCAGGAGCGAGAGGCTGACATGCGTCAGCTCCACTCCCACAGTCCACTCCCTCTAG
GAAGGGTCTTGCTAAGGAGTACAGGAACTGTCCGTATTCCTTCCCTTTCTGTGGCACTGCAGCCACCTCCTGAAGGGTCTTGCTAAGGAGTACAGGAACTGTCCGTATTCCTTCCCTTTCTGTGGCACTGCAGCCACCTCCT
166166
Asp Arg OPAsp Arg OP
GAC AGA TCA CCAGGTCTGTCCACCTGGGCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTGCTTGTGCCACAGAC AGA TCA CCAGGTCTGTCCACCTGGGCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTGCTTGTGCCACA
CCCTCCCCCGCCACTCCTGAACCCCGTCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCC AGTGCCAGCAATCACATCTCAGGGGCCAGAGGAACTGTCCAGAGAGCAACTCTGAGATCTAAGGATGTCAC agcgccaacttgaacggcccagagcaggaagcattcagagagcagctttaaactcagggacagagccatgc TGGGAAGACGCCTGAGCTCACTCGGCACCCTGCAAAATTTGATGCCAGGACACGCTTTGGAGGCGATTTAC ctgttttcgcacctaccatcagggacaggatgacctggagaacttaggtggcaagctgtgacttctccagc tctcacgggcatgggcactcccttggtggcaagagcccccttgacaccggggtggtgggaaccatgaagac axgatxggggctggcctctggctctcatggggtccaagttttgtgtattctcaacctattcacagactgaa acacaatatgacCCCTCCCCCGCCACTCCTGAACCCCGTCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCC AGTGCCAGCAATCACATCTCAGGGGCCAGAGGAACTGTCCAGAGAGCAACTCTGAGATCTAAGGATGTCAC agcgccaacttgaacggcccagagcaggaagcattcagagagcagctttaaactcagggacagagccatgc TGGGAAGACGCCTGAGCTCACTCGGCACCCTGCAAAATTTGATGCCAGGACACGCTTTGGAGGCGATTTAC ctgttttcgcacctaccatcagggacaggatgacctggagaacttaggtggcaagctgtgacttctccagc tctcacgggcatgggcactcccttggtggcaagagcccccttgacaccggggtggtgggaaccatgaagac axgatxggggctggcctctggctctcatggggtccaagttttgtgtattctcaacctattcacagactgaa acacaatatgac
V tabuľke VI je počiatočným kontinuálnym sledom DNA horný sled s 620 bázami, ktorý je zrejme nepreneseným sledom, bezprostredne predchádzajúcim prenesenej časti génu pre ľudský EPO. Sled zrejme obsahuje 5'-zakončenie génu a potom prenesenú oblasť DNA, ktorá je kódom pre prvé štyri aminokyseliny (-27 až -24) vedúceho alebo „predbežného“ sledu. Štyri páry báz v slede pred sledom, ktorý je kódom pre začiatok vedúceho sledu neboli jednoznačne stanovené a sú preto označené ako „X“. Potom nasleduje intrón so 639 pármi báz (439 párov báz z tohto sledu bolo preukázaných, zvyšných 200 je označených „I. S.“) a potom kodón pre glutamín, ktorý bol označený polohou 23 v prenesenom polypeptide. Sled exónu, ktorý bezprostredne nasleduje je kódom pre zvyšky aminokyselín od alanínového zvyšku (označeného ako zvyšok +1 sledu aminokyselín úplného ľudského EPO) do kodónu pre treonín v polohe +26, potom nasleduje druhý intrón, skladajúci sa zIn Table VI, the initial continuous DNA sequence is the 620 bases upper sequence, which is apparently a non-transferred sequence, immediately preceding the transferred portion of the human EPO gene. The sequence appears to contain the 5'-end of the gene and then the transferred region of DNA that encodes the first four amino acids (-27 to -24) of the leader or "preliminary" sequence. The four base pairs in the sequence before the leader sequence start code have not been unambiguously determined and are therefore designated "X". This is followed by an intron of 639 base pairs (439 base pairs from this sequence has been demonstrated, the remaining 200 being designated "I.S.") followed by a glutamine codon, which was designated at position 23 in the transferred polypeptide. The exon sequence immediately following is the code for amino acid residues from the alanine residue (designated +1 residue of the full length EPO amino acid sequence) to the threonine codon at position +26, followed by a second intron consisting of
256 báz, ako je označené. Za týmto intrónom nasleduje exón pre zvyšky aminokyselín v polohe 27 až 55 a potom tretí intrón s 612 pármi báz. Nasledujúci exón je kódom pre zvyšky 56 až 115 ľudského EPO a potom nasleduje štvrtý intrón s 134 bázami, ako je uvedené. Za ním nasleduje exón, ktorý je kódom pre zvyšky 116 až 166 a „stop“ kodón (TGA). V tabuľke Vije uvedený sled 568 párov báz, v ktorom sa zrejme nachádza neprenesená 3’-oblasť ľudského EPO-génu a dva páry báz v tomto géne („X“) ešte neboli úplne identifikované.256 bases as indicated. This intron is followed by an exon for amino acid residues at positions 27-55 and then by a third intron with 612 base pairs. The following exon encodes residues 56-115 of human EPO, followed by a fourth intron of 134 bases as indicated. It is followed by an exon that encodes residues 116-166 and a stop codon (TGA). The table shows the sequence of 568 base pairs, which appears to contain the untranslated 3'-region of the human EPO gene and the two base pairs in this gene ("X") have not yet been fully identified.
Tabuľka VI teda slúži na identifikáciu primárnej štruktúry (sledu aminokyselín) úplného ľudského EPO vrátane 166 úplne špecifikovaných aminokyselinových zvyškov (stanovená molekulová hmotnosť 18 399). Ako je v tabuľke uvedené, je sled DNA kódom pre signálny sled s 27 zvyškami spolu s 5'- a 3'- DNA sledmi, ktoré môžu byť významné pre funkciu promótor/operátor operónu ľudské14 ho génu. Miesta pre potenciálnu glykozyláciu úplného ľudského EPO polypeptidu sú v tabuľke označené hviezdičkami. Je nutné uviesť, že špecifický sled aminokyselín, uvedený v tabuľke VI pravdepodobne predstavuje sled prírodné sa vyskytujúcej alelovej formy ľudského erytropoetínu. Podporu pre toto tvrdenie je možné nájsť vo výsledkoch sústavných výskumov sledov ľudského erytropoetínu, izolovaného z moču, ktorými bolo preukázané, že podstatné množstvo molekúl erytropoetínu obsahuje metionín v polohe 126 na rozdiel od serínu, ktorý je uvedený v tabuľke.Thus, Table VI serves to identify the primary structure (amino acid sequence) of full human EPO, including 166 fully specified amino acid residues (MW 18 399). As shown in the table, the DNA sequence is a code for a 27-residue signal sequence along with 5'- and 3'-DNA sequences that may be significant for the promoter / operator function of the human14 gene. The sites for potential glycosylation of the full length human EPO polypeptide are indicated by asterisks in the table. It should be noted that the specific amino acid sequence shown in Table VI is likely to represent the sequence of the naturally occurring allele form of human erythropoietin. Support for this assertion can be found in the results of continuous studies of human urinary erythropoietin sequences that have shown that a significant amount of erythropoietin molecules contain methionine at position 126, unlike the serine shown in the table.
V tabuľke VII je uvedený rozsah homológie sledu medzi ľudským a opičím erytropoetínom. V hornej kontinuálnej línii tabuľky sú použité jednotlivé písmená na označenie sledu ľudského polypeptidu po translácii, začína sa po lohou -27, spodné kontinuálne línie uvádzajú sled pre opičí erytropoetin, začína sa opäť miestom, označeným polohou 27. Na osvetlenie homológie jednotlivých sledov sú použité hviezdičky. Je potrebné sa zmieniť o tom, že sledy ľudského a opičieho EPO preukazujú „prídavný“ lyzínový (K) zvyšok v polohe 116 ľudského erytropoetínu. Pri porovnaní s tabuľkou VI je zrejmé, že tento zvyšok leží na hranici spojenia v slede genómu (mRNA). Prítomnosť lyzinového zvyšku v slede ľudského polypeptidu bola ďalej overená zistením sledu ľudskej cDNA v klone, získanom pomocou mRNA, izolovanej z buniek COS-1, transformovaných pomocou DNA ľudského genómu tak, ako je uvedená v príklade 7, ktorý bude ďalej prezentovaný.Table VII shows the extent of sequence homology between human and monkey erythropoietin. In the upper continuous line of the table, single letters are used to indicate the sequence of the human polypeptide after translation, starting at foot -27, the lower continuous lines indicating the sequence for monkey erythropoietin, starting again at the location indicated by position 27. . It should be noted that the sequences of human and simian EPO show an "additional" lysine (K) residue at position 116 of human erythropoietin. By comparison with Table VI, it is evident that this residue lies at the junction boundary in the genome sequence (mRNA). The presence of the lysine residue in the human polypeptide sequence was further verified by detecting the human cDNA sequence in the clone obtained by mRNA isolated from COS-1 cells transformed with human genome DNA as shown in Example 7, which will be presented below.
Tabuľka VIITable VII
Porovnanie ľudského a opičieho EPO . ,. -20 -10 +1 10 20 3040Comparison of human and monkey EPO. ,. -20 -10 +1 10 20 3040
Iudský MGVHECPAWLWĽĽĽSLLSLPLCĽPVLGAPPRLICOSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPOTK ·444·***4«····«· ···«···· **··*«*«·«**«·«·*««·«4·4* 4 44 4 4444444444444Human MGVHECPAWLWLLLLLPLPLCLPVLGAPPRLICOSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPOTK · 444 · *** 4 «····« · ··· «···· ** ··· 44 4 4444444444444
Opičí MGVHECPAWLWLLLSLVSLPĽGLPVPGAPPRLICDSRVLERyLLEAKEAENVTMGCSESCSLNENITVPOTK . 50 <0 70 80 20 100110Monkey MGVHECPAWLWLLLSLVSLPLGLPVPGAPPRLICDSRVLERyLLEAKEAENVTMGCSESCSLNENITVPOTK. 50 <0 70 80 20 100100
Ľudský VNFYAWKRHEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLqLHVDKAVSGLRSLTrĽĽRALGAGKEHuman VNFYAWKRHEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLqLHVDKAVSGLRSLTrĽĽRALGAGKE
44444444444444444444444444444(4444 * 44444 4444·* 4*4*« ·*·*·44··· ·44444444444444444444444444444 (4444 * 44444 4444 · * 4 * 4 *
Opičí VNFyAWKRHEVGqqAVEVWQGLALLSEAVLRGqAVLANSSqPFEPLQLHMOKAISGLRSITTLLRALGAe-E , 120 130 140 1501Í0Monkey VNFyAWKRHEVGqqAVEVWQGLALLSEAVLRGqAVLANSSqPFEPLQLHMOKAISGLRSITTLLRALGAe-E, 120 130 140 1501I0
WSSký AISPPOAASAAPLRTITAOTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRWSSký AISPPOAASAAPLRTITAOTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR
Opici aisupoaasaaplrtitaotfcklfrvysnflrgklklytgeacrrgorMonkey aisupoaasaaplrtitaotfcklfrvysnflrgklklytgeacrrgor
Príklad 6Example 6
Systém pre expresiu, ktorý bol zvolený na počiatočné pokusy uskutočniť mikrobiálnu syntézu izolovateľných množstiev erytropoetínu, pre ktorý je kódom opičia príslušná cDNA a ktorý je uvedený v príklade 3 bol systém, pri ktorom boli použité ako hostiteľ cicavčie bunky (tzn. bunky COS-1, ATCC č. CRL-1650). Tieto bunky boli podrobené transfekcii vektorom, ktorý umožňoval aj autonómnu replikáciu v E. coli ako hostiteľovi (vzhľadom na prítomnosť DNA, odvodenej od plazmidu pBR322) aj replikáciu v bunkách cicavcov (vzhľadom na prítomnosť DNA, odvodenej od vírusu SV40).The expression system chosen for the initial attempts to perform microbial synthesis of isolable amounts of erythropoietin coded for by the corresponding cDNA and shown in Example 3 was a system in which mammalian cells (i.e., COS-1 cells, ATCC No. CRL-1650). These cells were transfected with a vector that allowed both autonomous replication in E. coli as a host (due to the presence of DNA derived from plasmid pBR322) and replication in mammalian cells (due to the presence of DNA derived from SV40 virus).
Podrobnejšie uvedené, vektor pre expresiu bol konštruovaný nasledujúcim spôsobom. Kloň 83 plazmidu, v príklade 3 bol podrobený amplifikácii v E. coli s DNA s približne 1,4 kilobázami, ktorá je kódom pre opičí erytropoetín a bola izolovaná pomocou štiepenia enzýmami EcoRI a HmdlII. Oddelene bol izolovaný fragment z pBR322 s veľkosťou približne 4,0 kilobáz pomocou enzýmov HindlII a Sali. Z DNA Ml3mpl0 RF (P a L Laboratorics) bol pôsobením enzýmov EcoRI a Sali získaný „väzbový“ fragment s veľkosťou približne 30 párov báz. Tento fragment obsahoval postupne zakončenie po štiepení EcoRI, schopné opätovnej väzby, potom nasledovali miesta pre štiepenie enzýmami SstI, Smal, BamHI a Xbal a zakončenie po štiepení enzýmom Sali, schopné opätovnej väzby. Všetky tri uvedené fragmenty boli naviazané, čím bol ako medziprodukt získaný plazmid („pERS“) s približne 5,4 kilobáz, v ktorom DNA pre erytropoetin bola na jednej strane ohraničená skupinou miest pre pôsobenie rôznych reštrikčných enzýmov. Plazmid pERS bol potom štiepený enzýmami HindlII a Sali, čím bola získaná DNA pre EPO a väzbový reťazec EcoRI až Sali (M13mpl0). Fragment s 1,4 pármi báz bol naviazaný na fragment plazmidu pBR322 so 4,0 kilobázami po štiepení enzýmami BamlII a Sali a na ďalší väzbový reťazec, získaný štiepením M13mpl0 RF enzý mami HindlII a BamHI s približne 30 pármi báz. Tento druhý väzbový reťazec z M13 mal na jednom zakončení miesto po pôsobení enzýmu HindlII s možnosťou opätovnej väzby, toto miesto bolo nasledované miestami pre pôsobenie reštrikčných enzýmov PstI, Sali, Xbal a potom nasledovalo zakončenie po štiepení enzýmom BamHI s možnosťou opätovnej väzby. Produktom väzby bol opäť užitočný plazmid („pBR-EPO“), ktorý’ obsahoval DNA pre erytropoetín, ktorý bol na obidvoch stranách ohraničený reťazcami s celým radom miest pre pôsobenie rôznych reštrikčných enzýmov.In more detail, the expression vector was constructed as follows. The plasmid clone 83 in Example 3 was subjected to amplification in E. coli with approximately 1.4 kilobase DNA encoding monkey erythropoietin and isolated by digestion with EcoRI and HmdIII. Separately, a fragment of approximately 4.0 kilobases was isolated from pBR322 using the HindIII and SalI enzymes. Approximately 30 base pairs of " binding " fragments were obtained from M13mp10 RF DNA (P and L Laboratorics) by EcoRI and SalI. This fragment contained sequentially Ecolable digestion sites capable of re-binding, followed by SstI, SmaI, BamHI and XbaI digestion sites, and SalI digested sites. All three fragments were ligated, yielding an intermediate plasmid (" pERS ") of approximately 5.4 kilobases, in which erythropoietin DNA was flanked by a group of sites for the action of various restriction enzymes. Plasmid pERS was then digested with HindIII and SalI to obtain DNA for EPO and EcoRI-SalI binding chain (M13mp10). The 1.4 base pair fragment was ligated to the 4.0 kilobase pBR322 plasmid fragment after digestion with BamIIII and SalI and another binding chain obtained by digesting the M13m10 RF enzyme with HindIII and BamHI of approximately 30 base pairs. This second binding chain of M13 had a HindIII digestion site at one end, followed by a PstI, SalI, XbaI restriction site, and then a BamHI digestion site. Again, the binding product was a useful plasmid ("pBR-EPO") containing DNA for erythropoietin, which was flanked on both sides by chains with a variety of restriction enzyme sites.
Vektor, ktorý bol použitý na expresiu DNA pre erytropoetín v bunkách COS-1 („pDSVLl“) bol konštruovaný tak, aby dovoľoval selekciu a autonómnu replikáciu v E. coli. Tieto vlastnosti uvedeného vektora sú zaisťované počiatkom replikácie a sledom DNA, ktorý je kódom pre odolnosť proti ampicilínu, ktorý je uložený medzi nukleotidmi 2448 a 4362 v slede plazmidu pBR322. Tento sled bol štruktúrne modifikovaný pridaním pomocného väzbového reťazca tak, aby vzniklo miesto pre pôsobenie reštrikčného enzýmu HindlII bezprostredne v susedstve nukleotidu 2448 pred včlenením do vektora. Z užitočných vlastnosti zvoleného vektora je potrebné uviesť najmä schopnosť autonómnej replikácie v bunkách COS-1 a prítomnosť sledu promótora vírusu, funkčného v bunkách cicavcov. Tieto vlastnosti sú zaisťované sledom DNA pre počiatok replikácie a sledom vírusového promótora, ktorého dĺžka je 342 párov báz a zasahuje od polohy 5171 sledu do polohy 270 genómu SV40. Vo vektore sa nachádza jediné miesto na pôsobenie reštrikčného enzýmu (BamHI) a v tesnej blízkosti vírusového promótora je naviazaný bežne dodávaný väzbový sled (Collaborative Research). Vo vektore je včlenený tiež sled s 237 pármi báz (poloha nukleotidov 2553 až 2770 SV40) s obsahom mRNA vírusového polyadenylačného signálu (obyčajne uvádzaný ako terminátor transkripcie). Tento fragment bol do vektora uložený v správnej orientácii vzhľadom na vírusový promótor pomocou jediné ho miesta pre pôsobenie reštrikčného enzýmu BamHI. Vo vektore je tiež prítomný ďalší gén cicavca v polohe, ktorá nie je rozhodujúca pre potenciálnu transkripciu génu, včleneného v jedinom mieste pôsobenia BamHI, medzi vírusovým promótorom a terminačným sledom (týmto génom bol gén s približne 2500 pármi báz pre myší dihydrofolátreduktázu (DHRF), izolovaný z plazmidu pMG-1 spôsobom, opísaným v publikácii Gasser a ďalšie, PNAS (USA) 79, str. 6522 až 6526 (1982)). Hlavné operatívne zložky plazmidu pDSVLI sú v nukleotidoch 2448 až 4362 plazmidu pBR322 spolu s nukleotidmi 5171 až 270 (342 párov báz) a 2553 až 2770 (237 párov báz) DNA SV40.The vector that was used to express DNA for erythropoietin in COS-1 cells ("pDSVL1") was constructed to allow selection and autonomous replication in E. coli. These properties of the vector are assured by the origin of replication and the DNA sequence which encodes ampicillin resistance, which is deposited between nucleotides 2448 and 4362 in the sequence of plasmid pBR322. This sequence was structurally modified by the addition of a helper binding chain to create a HindIII restriction enzyme site immediately adjacent to nucleotide 2448 prior to incorporation into the vector. Among the useful properties of the vector selected, the ability to replicate autonomously in COS-1 cells and the presence of a virus promoter sequence functional in mammalian cells should be noted. These properties are assured by the DNA sequence for the origin of replication and the viral promoter sequence, which is 342 base pairs in length and extends from position 5171 of the sequence to position 270 of the SV40 genome. A single restriction enzyme (BamHI) site is located in the vector, and a commercially available binding sequence (Collaborative Research) is coupled in close proximity to the viral promoter. Also included in the vector is a 237 base pair sequence (nucleotide position 2553 to 2770 of SV40) containing a mRNA of a viral polyadenylation signal (commonly referred to as a transcription terminator). This fragment was inserted into the vector in the correct orientation relative to the viral promoter using a single BamHI restriction enzyme site. Also present in the vector is another mammalian gene at a position that is not critical for the potential transcription of the gene incorporated at a single BamHI site between the viral promoter and the termination sequence (this gene was a gene of approximately 2500 base pairs for mouse dihydrofolate reductase (DHRF), isolated from plasmid pMG-1 as described in Gasser et al., PNAS (USA) 79, pp. 6522-6526 (1982)). The main operative components of plasmid pDSVLI are at nucleotides 2448 to 4362 of plasmid pBR322 together with nucleotides 5171 to 270 (342 base pairs) and 2553 to 2770 (237 base pairs) of SV40 DNA.
Podľa uvedených postupov, opísaných napríklad v uvedenej publikácii Maniatis a ďalšie bola izolovaná DNA, ktorá je kódom pre erytropoetín z plazmidu pBR-EPO ako fragment po štiepení enzýmom BamHI a potom bola včlenená do plazmidu pDSVLI po jeho rozštiepení enzýmom BamHI. Analýza reštrikčnými enzýmami bola použitá na potvrdenie včlenenia génu pre erytropoetín v správnej orientácii v dvoch z výsledných klonovaných vektorov (vektory H a L). Tieto skutočnosti sú zrejmé aj z obr. 2, kde je znázornený plazmid pDSVL-MkE. Vektory s génmi EPO v nesprávnej orientácii boli uchované ako negatívne kontroly pre pokusy s transfekciou, pri ktorých ide o stanovenie úrovne expresie EPO v hostiteľovi, transformovanom vektormi, ktoré obsahujú DNA pre erytropoetín v správnej orientácii.Following the procedures described, for example, in Maniatis et al., DNA encoding erythropoietin from pBR-EPO was isolated as a fragment after BamHI digestion, and then inserted into the plasmid pDSVLI after digestion with BamHI. Restriction enzyme analysis was used to confirm the incorporation of the erythropoietin gene in the correct orientation in two of the resulting cloned vectors (vectors H and L). These facts are also evident from FIG. 2, where plasmid pDSVL-MkE is shown. Vectors with EPO genes in the wrong orientation were retained as negative controls for transfection experiments to determine the level of EPO expression in a host transformed with vectors containing DNA for erythropoietin in the correct orientation.
Príklad 7Example 7
A. Počiatočný systém pre expresiu EPO, bunky COS-1A. Initial EPO Expression System, COS-1 Cells
Systém, ktorý bol zvolený na počiatočné pokusy s mikrobiálnou syntézou izolovateľných množstiev ľudského erytropoetínu, pre ktoré je kódom DNA ľudského genómu tiež zahŕňal expresiu v bunkách cicavcov ako v hostiteľských bunkách (tzn. v bunkách COS-1, ATCC č. CRL-1650). Gén pre ľudský EPO bol najskôr podrobený počiatočnému klonovaniu vo vektore, ktorý je schopný autonómnej replikácie v obidvoch hostiteľoch E. coli (vzhľadom na prítomnosť DNA z plazmidu pBR322) aj v bunkovej línii cicavcov COS-1 (vzhľadom na prítomnosť DNA, odvodenej od vírusu SV40). Tento vektor s obsahom génu pre erytropoetín bol potom vnesený do buniek COS-1. Polypeptidový materiál typu EPO bol potom bunkami po vykonaní transfekcie produkovaný a vylučovaný do prostredí, v ktorom boli bunky pestované.The system that was chosen for initial experiments with microbial synthesis of isolatable amounts of human erythropoietin for which the human genome DNA code is also involved expression in mammalian cells as host cells (i.e., COS-1 cells, ATCC No. CRL-1650). The human EPO gene was first subjected to initial cloning in a vector capable of autonomous replication in both E. coli hosts (due to the presence of DNA from plasmid pBR322) and the mammalian cell line COS-1 (due to the presence of DNA derived from SV40 virus) ). This erythropoietin gene containing vector was then introduced into COS-1 cells. The EPO-type polypeptide material was then produced and secreted by the cells after transfection into the environment in which the cells were grown.
Vektor pre expresiu bol teda skonštruovaný nasledujúcim spôsobom: DNA, izolovaná z lambda klonu λ hEl s obsahom génu pre EPO ľudského genómu bol rozštiepený pôsobením reštrikčných enzýmov BamHI a HindlII a bol izolovaný fragment s 5,6 kbázami, o ktorom bolo známe, že obsahuje úplný gén pre erytropoetín. Tento fragment bol naviazaný na bakteriálny plazmid pUC8 (Betesda Research Laboratories Inc.), ktorý bol rozštiepený obdobným spôsobom, čim vznikol intermediámy plazmid (pUC8-Hu), ktorý sa tak stal vhodným zdrojom uvedeného reštrikčného fragmentu.Thus, the expression vector was constructed as follows: DNA isolated from the λ hE1 clone containing the human genome EPO gene was digested with the restriction enzymes BamHI and HindIII and the 5.6 kb fragment known to contain the complete fragment was isolated. the erythropoietin gene. This fragment was ligated to the bacterial plasmid pUC8 (Betesda Research Laboratories Inc.), which was digested in a similar manner to give the intermediate plasmid (pUC8-Hu), thus becoming a suitable source of said restriction fragment.
Vektor, ktorý bol zvolený pre expresiu DNA pre EPO v bunkách COS-1 (pSV4SEt) bol skonštruovaný už skôr. Ide o plazmid, ktorý obsahuje sled DNA, dovoľujúci selekciu a autonómnu replikáciu v bunkách E. coli. Tieto vlastnosti sú zaisťované sledmi DNA pre počiatok replikácie a pre odolnosť proti ampicilínu, ktoré sú prítomné v oblasti, ktorá zasahuje od nukleotidu v polohe 2448 do nukleotidu v polohe 4362 bakteriálneho plazmidu pBR322, tento sled bol potom štruktúrne modifikovaný pridaním väzbového reťazca s miestom na pôsobenie reštrikčného enzýmu HindlII bezprostredne v blízkosti polohy 2448. Plazmid pSV4SEt je tiež schopný autonómnej replikácie v bunkách COS-1. Táto vlastnosť je zaisťovaná fragmentom s 342 pármi báz s obsahom počiatku pre replikáciu z vírusu SV40 (nukleotidy v polohách 5171 až 270). Tento fragment bol potom modifikovaný pridaním väzbového reťazca s miestom pre pôsobenie reštrikčného enzýmu EcoRl v bezprostrednej blízkosti nukleotidu 270 a väzbového reťazca s miestom pre pôsobenie Sali v bezprostrednej blízkosti nukleotidu 5171. V tomto vektore je včlenený tiež fragment s 1061 pármi báz z vírusu SV40 (nukleotidy 1711 až 2772 s väzbovým reťazcom s miestom pre pôsobenie enzýmu Sali v bezprostrednej blízkosti nukleotidu 2772). V tomto fragmente sa nachádza jediné miesto na pôsobenie reštrikčného enzýmu BamHI. Celkove je možno uviesť, že plazmid pSV4SEt obsahuje jediné miesto na pôsobenie BamHI a HindlII a dovoľuje tak včlenenie génu pre ľudský erytropoetín, sledov, dovoľujúcich replikáciu a selekciu v E. coli a sledy, dovoľujúce replikáciu v bunkách COS-1.The vector that was chosen for the expression of EPO DNA in COS-1 cells (pSV4SEt) was constructed previously. It is a plasmid that contains a DNA sequence allowing selection and autonomous replication in E. coli cells. These properties are provided by the DNA sequences for the origin of replication and for ampicillin resistance present in the region that extends from the nucleotide at position 2448 to the nucleotide at position 4362 of the bacterial plasmid pBR322, which sequence was then structurally modified by adding a linker with a site The HindIII restriction enzyme immediately near position 2448. Plasmid pSV4SEt is also capable of autonomous replication in COS-1 cells. This property is provided by a 342 base pair fragment containing an origin of replication from the SV40 virus (nucleotides at positions 5171 to 270). This fragment was then modified by adding an EcoR1 restriction enzyme site in the immediate vicinity of nucleotide 270 and a SalI site binding site in the immediate vicinity of nucleotide 5171. Also included in this vector is a 1061 base pair fragment from SV40 virus (nucleotides) 1711 to 2772 with a SalI binding site in the immediate vicinity of nucleotide 2772). There is a single BamHI restriction enzyme site in this fragment. Overall, the plasmid pSV4SEt contains a single BamHI and HindIII site and allows the insertion of the human erythropoietin gene, the sequences allowing replication and selection in E. coli, and the sequences allowing replication in COS-1 cells.
Aby bolo možné včleniť gén pre ľudský erytropoetín do plazmidu pSV4SEt, bol plazmid pUC8-HuE rozštiepený pôsobením enzýmov BamHI a HindlII a bol izolovaný fragment s 5,6 kbázami s DNA pre ľudský erytropoetín. Plazmid pSV4SEt bol tiež rozštiepený enzýmami BamHI a HindlII a bol izolovaný hlavný fragment s 2513 pármi báz, ktorý obsahoval všetky nutné funkcie. Tieto fragmenty boli zmiešané a vzájomne naviazané, čím vznikol výsledný vektor „pSVgHuEPO“ tak, ako je to znázornené na obr. 3. Tento vektor bol propagovaný v E. coli a bola izolovaná DNA tohto vektora. Potom bola použitá analýza pomocou reštrikčných enzýmov na potvrdenie včlenenia génu pre EPO.In order to insert the human erythropoietin gene into plasmid pSV4SEt, the plasmid pUC8-HuE was digested with BamHI and HindIII and the 5.6 kb DNA fragment was isolated with human erythropoietin DNA. Plasmid pSV4SEt was also digested with BamHI and HindIII, and a 2513 base pair main fragment containing all the necessary functions was isolated. These fragments were mixed and bound together to give the resulting vector "pSVgHuEPO" as shown in FIG. 3. This vector was propagated in E. coli and the DNA of the vector was isolated. Restriction enzyme analysis was then used to confirm the incorporation of the EPO gene.
Plazmid pSVgHuEPO bol použitý na expresiu ľudského EPO v bunkách COS-1. DNA tohto plazmidu bola kombinovaná s nosnou DNA a bola vykonaná transfekcia vždy v trojnásobnom opakovaní na platniach s bunkami COS-1 s rozmermi 60 mm. Ako kontrola bola použitá nosná DNA, pri ktorej bola tiež uskutočnená transfekcia do buniek COSl. Prostredie kultúr bolo odoberané po piatich a po siedmich dňoch a bolo skúmané na prítomnosť polypeptidov s vlastnosťami prírodné sa vyskytujúceho ľudského EPO, najmä pokiaľ ide o vlastnosti imunologické.Plasmid pSVgHuEPO was used to express human EPO in COS-1 cells. The DNA of this plasmid was combined with carrier DNA and transfected in triplicate on 60 mm COS-1 cells each time. Carrier DNA was also used as a control and transfected into COS1 cells. The culture medium was harvested after five and seven days and examined for the presence of polypeptides with properties of naturally occurring human EPO, especially for immunological properties.
B. Druhý systém na expresiu EPO pri použití buniek COS-1B. Second EPO Expression System Using COS-1 Cells
Bol konštruovaný ešte ďalší systém pre zlepšenú produkciu ľudského erytropoetínu, pre ktorý je kódom DNA pre EPO ľudského genómu v bunkách COS-1 (ATCC č. CRL-1650).Yet another system for the improved production of human erythropoietin has been constructed for which it encodes DNA for the EPO human genome in COS-1 cells (ATCC No. CRL-1650).
V predchádzajúcom systéme bola dosiahnutá expresia EPO v bunkách COS-1 pri použití jeho vlastného promótora, nachádzajúceho sa v oblasti reštrikčného fragmentu po pôsobení enzýmu BamHI a HindlII s veľkosťou 5,6 kbáz. Pri nasledujúcej konštrukcii bol gén pre EPO pozmenený tak, že k jeho expresii dochádza použitím promótora vírusu SV40.In the previous system, EPO expression was achieved in COS-1 cells using its own promoter, located in the restriction fragment region after treatment with the BamHI and HindIII enzymes of 5.6 kbases. In the following construction, the EPO gene has been altered so that it is expressed using the SV40 virus promoter.
Klonovaný reštrikčný fragment EPO ľudského genómu s 5,6 bázami po štiepení enzýmami BamHI až HindlII bol modifikovaný nasledujúcim spôsobom. Plazmid pUC8-HuE, opísaný, bol rozštiepený enzýmom BamHI a BstEII. Reštrikčný enzým BstEII štiepi fragment EPO s 5,6 kbázami v polohe, ktorá sa nachádza 44 párov báz 5' k počiatku ATG kódu pre predbežný peptid a približne 680 párov báz 3' k miestu pre štiepenie reštrikčným enzýmom Hin -dlll. Bol izolovaný fragment s približne 4900 pármi báz. Bol tiež syntetizovaný a čistený väzbový fragment so zakončeniami, schopnými väzby v miestach po štiepení enzýmami Sali a BstEII s miestom pre štiepenie enzýmom BamHI vnútri fragmentu. Obidva fragmenty boli zmiešané a viazané na plazmid pBR322, ktorý bol rozštiepený reštrikčnými enzýmami Sali a BamHI za vzniku intermediárThe cloned 5.6 base human genome restriction fragment EPO after digestion with BamHI to HindIII was modified as follows. The plasmid pUC8-HuE described above was digested with BamHI and BstEII. The restriction enzyme BstEII cleaves a 5.6 kbase EPO fragment at a position of 44 base pairs 5 'to the start of the ATG code for the preliminary peptide and approximately 680 base pairs 3' to the restriction enzyme cleavage site Hin-dll1. A fragment of approximately 4900 base pairs was isolated. A binding fragment with ends capable of binding at SalI and BstEII cleavage sites with a BamHI cleavage site within the fragment was also synthesized and purified. Both fragments were mixed and ligated to the plasmid pBR322, which had been digested with the restriction enzymes SalI and BamHI to form intermediates.
SK 279959 Β6 neho plazmidu pBRgHE. Gén pre EPO ľudského genómu bol potom izolovaný ako fragment s 4900 pármi báz po štiepení enzýmom BamHI, fragment obsahoval úplný štrukturálny gén s jediným ATG v mieste 44 párov báz 3' od miesta pôsobenia enzýmu BamHI v blízkosti zakončenia kódovej oblasti s aminoskupinou na konci.The plasmid pBRgHE. The human genome EPO gene was then isolated as a 4900 base pair fragment after BamHI digestion, containing the complete structural gene with a single ATG at 44 base pairs 3 'of the BamHI site near the end of the amino-terminus coding region.
Tento fragment bol izolovaný a včlenený ako fragment schopný väzby po štiepení enzýmom BamHI do plazmidu pDSVLI, opísaného v príklade 6 ako do vektora na expresiu, rozštiepenom enzýmom BamHI. Výsledný plazmid pSVLgHuEPO, ktorý je znázornený na obr. 4 bol použitý na expresiu polypeptidového materiálu typu EPO v bunkách COS-1 spôsobom podľa príkladov 6 a 7A.This fragment was isolated and incorporated as a fragment capable of binding after BamHI digestion into the plasmid pDSVLI described in Example 6 as a BamHI digested expression vector. The resulting plasmid pSVLgHuEPO, which is shown in FIG. 4 was used to express EPO-type polypeptide material in COS-1 cells by the method of Examples 6 and 7A.
Príklad 8Example 8
Živné prostredie, v ktorom boli pestované bunky COS-1 (šesť kultúr po transfekcii podľa príkladu 6) bolo analyzovaných rádioimunologicky spôsobom podľa príkladu 2. časť B. Jednotlivé vzorky obsahovali 250, 125, 50 a 25 μΐ uvedeného prostredia. Supematanty kultúr, ktoré obsahovali vektory s nesprávnou orientáciou génu EPO boli jednoznačne negatívne. Pre vzorky dvoch supematantov z kultúr buniek COS-1 po transfekcii vektormi (H a L), ktoré obsahovali DNA pre EPO v správnej orientácii sa pohybovalo percento inhibície l2~I-EPO viazaného na protilátku v rozmedzí 72 až 88 %, všetky hodnoty sa teda pohybovali na vrchole štandardnej krivky. Presná koncentrácia EPO v kultúre nemohla byt ľahko presne stanovená. Zo vzorky s obsahom 250 μΐ supernatantu bolo odhadnuté, že obsah EPO je minimálne 300 mjednotiek/ml.The culture medium in which COS-1 cells were grown (six cultures after transfection according to Example 6) was analyzed by radioimmunology according to Example 2, Part B. Individual samples contained 250, 125, 50 and 25 μΐ of the medium. Culture supernatants containing vectors with incorrect orientation of the EPO gene were clearly negative. For samples of two supernatants from cultures of COS-1 cells transfected with vectors (H and L) containing DNA for EPO in the correct orientation, the percent inhibition of 12 -I-EPO bound to antibody ranged from 72 to 88%, all values therefore moved on top of the standard curve. The exact concentration of EPO in culture could not be easily determined. From a sample containing 250 μΐ of supernatant, it was estimated that the EPO content was at least 300 units / ml.
Supematant, získaný z kultúry podľa príkladu 6 a z päť a sedem dní starej kultúry podľa príkladu 7A boli skúmané RIA, aby bolo možné porovnať účinnosť rekombinantného opičieho a ľudského EPO a prírodné sa vyskytujúceho EPO ako štandardu, výsledky sú uvedené v grafickej forme na obr. 1. Ako bolo možné očakávať, došlo ku kompetícii rekombinantného opičieho EPO vzhľadom na protilátku proti ľudskému EPO, napriek tomu, že inhibícia nebola za podmienok pokusu úplná. Maximálne hodnoty inhibície v percentách pre rekombinantný ľudský EPO sa však blížili hodnotám pre štandardný ľudský EPO. Pretože krivky pre dávku a odpoveď majú paralelný priebeh, je možné súdiť na imunologickú identita sledov (epitopov). Pôvodné výsledky pre opičí EPO boli opäť vyhodnotené a boli získané hodnoty v rozmedzí 2,91 až 3,12 jednotiek/ml. Zistené množstvá ľudského EPO boli vo vzorke po päťdennom pestovaní 392 m jednotiek v ml a 567 m jednotiek/ml vo vzorke, ktorá bola pestovaná 7 dní. Stanovené množstvá opičieho EPO podľa príkladu 7B mali rovnaký rád alebo o niečo vyšší.The supernatant obtained from the culture of Example 6 and the five- and seven-day-old culture of Example 7A were examined by RIA to compare the efficacy of recombinant monkey and human EPO and naturally occurring EPO as a standard, the results are shown graphically in FIG. As expected, recombinant monkey EPO was competed against the anti-human EPO antibody, although inhibition was incomplete under the experimental conditions. However, the maximum percent inhibition values for recombinant human EPO were close to those for standard human EPO. Because dose and response curves are parallel, it is possible to judge the immunological identity of sequences (epitopes). The original results for monkey EPO were re-evaluated and values ranging from 2.91 to 3.12 units / ml were obtained. The observed amounts of human EPO were in the sample after a five-day cultivation of 392 m units per ml and 567 m units / ml in a sample that was grown for 7 days. The determined amounts of monkey EPO according to Example 7B were of the same order or slightly higher.
Príklad 9Example 9
Živné prostredie z kultúr pripravených podľa príkladu 6 a 7 bolo podrobené skúškam in vitro na účinnosť EPO spôsobom, opísaným v publikácii Goldwasser a ďalšie, Endocrinology 97, č. 2, str. 315 až 323 (1975). Stanovené hodnoty pre opičí EPO v živnom prostredí skúmaných kultúr boli v rozmedzí 3,2 až 4,3 jednotiek/ml. Živné prostredie kultúr s obsahom ľudského EPO bolo tiež pri tomto sledovaní účinné a okrem toho účinnosť týchto prostredí mohla byť neutralizovaná protilátkou proti EPO. Živné prostredie z rekombinantných kultúr opičieho EPO podľa príkladu 6 bolo tiež skúmané na biologickú účinnosť in vivo spôsobom, opísaným v publikácii Cotes a ďalšie, Náture, 191, str. 1065 až 1067 (1961) a podľa publikácie Hammond a ďalšie, Ann. N. Y. Acad, Sci. 149, str. 516 až 527 (1968) a bola zistená účinnosť 0,94 až 1,24 jednotiek/ml.The culture medium from the cultures prepared according to Examples 6 and 7 was subjected to in vitro assays for EPO activity as described by Goldwasser et al., Endocrinology 97, no. 2, p. 315-323 (1975). The values determined for monkey EPO in the culture medium of the investigated cultures ranged from 3.2 to 4.3 units / ml. The culture medium of cultures containing human EPO was also effective in this study and, in addition, the efficacy of these environments could be neutralized by an anti-EPO antibody. The culture medium from recombinant monkey EPO cultures according to Example 6 was also examined for in vivo biological activity as described by Cotes et al., Nature, 191, p. 1065-1067 (1961) and according to Hammond et al., Ann. N.Y. Acad, Sci. 149, p. 516-527 (1968) and found to be 0.94-1.24 units / ml.
Príklad 10Example 10
V predchádzajúcich príkladoch bol rekombinantný ľudský alebo opičí materiál typu EPO získaný pomocou vektorov, použitých na transfekciu buniek COS-1. Dochádza pritom k replikácii týchto vektorov v bunkách COS-1 vzhľadom na prítomnosť T-antigénu SV40 v bunke a počiatku replikácie SV40 vo vektore. Napriek tomu, že je možné pri použití týchto vektorov získať použiteľné množstvá EPO z buniek COS-1, je táto expresia len prechodná (7 až 14 dní), pretože po čase dochádza k strate vektora. Okrem toho iba malé percentuálne množstvo COS-1 je po transfekcii schopné produkovať príslušný materiál. Ďalej bude opísaný systém expresie s použitím ovariálnych buniek [CHO] DHFR’ čínskeho chrčka a selekcie schopného označenia, DHFR. Opis príbuzných systémov na expresiu je uvedený v U. S. Letters Patent č. 4 399 216 a v európskych patentových spisoch č. 117 057, 117 059 a 117 060, uverejnených 29. augusta 1984.In the previous examples, recombinant human or monkey EPO-type material was obtained using vectors used to transfect COS-1 cells. These vectors replicate in COS-1 cells due to the presence of the SV40 T antigen in the cell and the SV40 origin of replication in the vector. Although usable amounts of EPO from COS-1 cells can be obtained using these vectors, this expression is only transient (7 to 14 days) as the vector is lost over time. Furthermore, only a small percentage of COS-1 is capable of producing the appropriate material after transfection. The expression system using the Chinese hamster ovary [CHO] DHFR ’and selectable selection, DHFR, will be described below. A description of related expression systems is given in U.S. Pat. And U.S. Pat. 117 057, 117 059 and 117 060, published August 29, 1984.
Bunky CHO DHFR’ [bunky (DuX-Bll) CHO Kl] boli opísané v publikácii Urlaub a ďalšie, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, zv. TI, 4461 (1980), tieto bunky nemajú enzým dihydrofolátreduktázu (DHFR) vzhľadom na mutácie štrukturálneho génu a preto vyžadujú prítomnosť glycínu, hypoxantínu a tymidínu v živnom prostredí. Plazmidy pDSVL-MkE (príklad 6) alebo pDSVL-gHuEPO (príklad 7B) boli podrobené transfekcii spolu s nosnou DNA do buniek CHO DHFR rastúcich v prostredí s obsahom hypoxantínu, tymidínu a glycínu na platniach s rozmermi 60 mm. Plazmid pSVgHuEPO (príklad 7A) bol zmiešaný s plazmidom pMG2 s obsahom génu pre myšiu dihydrofolátreduktázu, klonovaného v bakteriálnom plazmide pBR322 ako vektore (podľa uvedenej publikácie Gassera a ďalších). Zmes plazmidu a nosnej DNA bola prenesená do buniek CHO DHFR' (bunky s obsahom tohto plazmidu obyčajne obsahujú aj druhý plazmid). Po troch dňoch boli bunky dispergované pôsobením trypsínu na niekoľko platní s rozmerom 100 mm v prostredí bez obsahu hypoxantínu a tymidínu. Len tie bunky, ktoré boli nastálo transformované génom DHFR, a tým aj génom EPO na tomto prostredí prežívajú. Po 7 až 21 dňoch je možné pozorovať kolónie prežívajúcich buniek. Tieto kolónie transformantov je možné po disperzii trypsinizáciou kontinuálne pestovať na prostrediach bez hypoxantínu a tymidínu, čím sa získajú nové bunkové kmene (napríklad CHO pDSVLMkEPO, CHO pSVgHuEPO, CHO-pDSVL-gHuEPO).CHO DHFR 'cells (DuX-B11) CHO K1 cells have been described in Urlaub et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. TI, 4461 (1980), these cells do not have the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) due to structural gene mutations and therefore require the presence of glycine, hypoxanthine and thymidine in the culture medium. Plasmids pDSVL-MkE (Example 6) or pDSVL-gHuEPO (Example 7B) were transfected together with carrier DNA into CHO DHFR cells grown in hypoxanthine, thymidine and glycine containing media on 60 mm plates. Plasmid pSVgHuEPO (Example 7A) was mixed with plasmid pMG2 containing the mouse dihydrofolate reductase gene cloned in the bacterial plasmid pBR322 as a vector (as described by Gasser et al.). The mixture of plasmid and carrier DNA was transferred to CHO DHFR 'cells (cells containing this plasmid usually also contain a second plasmid). After three days, cells were dispersed by trypsin treatment on several 100 mm plates in a hypoxanthine and thymidine free environment. Only those cells that have been permanently transformed with the DHFR gene and hence the EPO gene survive in this environment. After 7 to 21 days, colonies of surviving cells can be observed. These colonies of transformants can be continuously grown in hypoxanthine and thymidine free media after dispersion by trypsinization to yield new cell strains (e.g. CHO pDSVLMkEPO, CHO pSVgHuEPO, CHO-pDSVL-gHuEPO).
Kvapalný materiál z pestovania uvedených kmeňov buniek bol skúšaný RIA na prítomnosť rekombinantného opičieho alebo ľudského EPO. Prostredie pre kmeň CHO pDSVL-MkEPO obsahovalo EPO s imunologickými vlastnosťami obdobnými materiálu, ktorý bol získaný z buniek COS-1 po transfekcii plazmidom pDSVL-MkEPO. Kvapalný materiál, odobratý z kultúry po pestovaní 65 hodín, obsahoval EPO opice v koncentrácii 0,60 jednotiek/ml.The liquid material from the culturing of said cell strains was examined by RIA for the presence of recombinant monkey or human EPO. The environment for the CHO strain pDSVL-MkEPO contained EPO with immunological properties similar to that obtained from COS-1 cells after transfection with the plasmid pDSVL-MkEPO. The liquid material taken from the culture after 65 hours cultivation contained EPO monkeys at a concentration of 0.60 units / ml.
Kvapalný materiál z CHO pSVgHuEPO a CHO pDSVL-gHuEPO obsahoval ľudský EPO s imunologickými vlastnosťami obdobnými materiálu, ktorý bol získaný pri použití buniek COS-1 po transfekcii plazmidom pSVgHuEPO alebo pDSVL-gHuEPO. Kvapalný podiel 3 dni starej kultúry CHO pSVgHuEPO obsahoval 2,99 jednotiek/ml ľudského EPO a 5,5 dní pestovaná vzorka CHO pDSVL-gHuEPO obsahoval 18,2 jednotiek/ml ľudského EPO, merané RIA.Liquid material from CHO pSVgHuEPO and CHO pDSVL-gHuEPO contained human EPO with immunological properties similar to that obtained with COS-1 cells transfected with plasmid pSVgHuEPO or pDSVL-gHuEPO. A liquid fraction of a 3 day old culture of CHO pSVgHuEPO contained 2.99 units / ml human EPO and a 5.5 day cultured CHO sample pDSVL-gHuEPO contained 18.2 units / ml human EPO as measured by RIA.
Množstvo EPO, produkované uvedenými bunkovými kmeňmi je možné zväčšiť amplifikáciou génu za vzniku nového bunkového kmeňa s vyššou produktivitou. Enzým dihydrofolátreduktáza (DHFR), ktorý je produktom, pre ktorý je kódom gén DHFR môže byť inhibovaný metotre xátom (MTX). Bunky, pestované v prostredí bez hypoxantínu a tymidínu je teda možné zbrzdiť v raste až usmrtiť MTX. Za vhodných podmienok (napríklad minimálnej koncentrácie MTX) sa môžu bunky' stať odolné a schopné rásť v prítomnosti MTX. Odolnosť týchto buniek proti MTX je spôsobená amplifikáciou počtu ich génov DHFR, a tým i vyššou produkciou enzýmu DHFR. Prežívajúce bunky je potom možné spracovávať pôsobením stúpajúceho množstva MTX, čím je možné získať bunkové kmene, ktoré obsahujú väčší počet génov DHFR. Gén, „nesený“ vektorom pre expresiu (napríklad gén pre EPO) súčasne s génom DHFR alebo transformovaným génom DHFR obyčajne tiež zvýši počet svojich kópií.The amount of EPO produced by said cell strains can be increased by gene amplification to produce a new cell strain with higher productivity. The enzyme dihydrofolate reductase (DHFR), which is the product encoded by the DHFR gene, can be inhibited by methotrexate (MTX). Thus, cells grown in hypoxanthine-free and thymidine-free media can be inhibited in growth to kill MTX. Under appropriate conditions (e.g., minimum MTX concentration), the cells may become resistant and able to grow in the presence of MTX. The resistance of these cells to MTX is due to the amplification of the number of their DHFR genes and thus to the higher production of the DHFR enzyme. Surviving cells can then be treated with increasing amounts of MTX to obtain cell strains that contain multiple DHFR genes. Generally, a gene carried by an expression vector (e.g., an EPO gene) along with a DHFR gene or a transformed DHFR gene also increases its copy number.
Ako praktický príklad tejto amplifikácie je možné uvíesť prípad, pri ktorom bol bunkový kmeň CHO pDSVLMkE podrobený vplyvu stúpajúcej koncentrácie MTX (0 nM, 30 nM a 100 nM). Po 65 hodinách pôsobenia jednotlivých koncentrácií boli kultúry sledované RIA a bolo možné preukázať, že kvapalný materiál obsahuje 0,60,2,45 a 6,10 jednotiek v ml. Bunkový kmeň CHO pDSVL-gHuEPO bol potom podrobený pôsobeniu stúpajúcich koncentrácií MTX 30 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 1 μΜ, 5 μΜ MTX. Po troch dňoch pestovania obsahoval kvapalný materiál z kultúry, na ktorú sa pôsobilo 100 nM MTX ľudského EPO v koncentrácii 3089 ± 129 jednotiek/ml podľa stanovenia RIA. 48 hodín pestované vzorky po pôsobení 100 nM a 1 μΜ MTX obsahovali ľudský EPO v množstve 466 a 1352 jednotiek/ml podľa stanovenia RIA (priemer z troch stanovení). Pri vykonávaní týchto postupov bola použitá koncentrácia 1 x 106 buniek v 5 ml prostredí pri použití platní s priemerom 60 mm. Po 24 hodinách bolo prostredie odstránené a nahradené 5 ml prostredia bez séra (DMEM s vysokou koncentráciou glukózy a 0,1 mM neesenciálnych aminokyselín a L-glutamínu). Po 48 hodinách bolo sledované nahromadenie EPO v prostredí bez séra. Prostredie bolo odobraté pre analýzu RIA a bunky boli podrobené pôsobeniu trypsínu a počítané. Priemerné hodnoty RIA boli 467 jednotiek/ml a 1352 jednotiek/ml, pre bunky, pestované pri koncentrácii 100 nM a 1 μΜ MTX boli hodnoty 2335 jednotiek/platňa a 6750 jednotiek/platňa. Priemerný počet buniek na platni bol 1,94 x 106 a 3,12 x 106. Účinnosť produkcie teda bola 1264 a 2167 jednotiek/106 buniek za 48 hodín.As a practical example of this amplification, a case in which the CHO cell strain pDSVLMkE was subjected to increasing MTX concentrations (0 nM, 30 nM and 100 nM) was exemplified. After 65 hours of exposure to each concentration, the cultures were monitored by RIA and it was shown that the liquid material contained 0.60, 2.45 and 6.10 units per ml. The CHO pDSVL-gHuEPO cell strain was then treated with increasing MTX concentrations of 30 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 1 μΜ, 5 μΜ MTX. After three days of culture, the liquid material from the culture was treated with 100 nM MTX of human EPO at a concentration of 3089 ± 129 units / ml as determined by RIA. For 48 hours, 100 nM and 1 μΜ MTX treated samples contained 466 and 1352 units / ml human EPO as determined by RIA (mean of three determinations). A concentration of 1 x 10 6 cells in 5 ml medium was used using 60 mm diameter plates. After 24 hours, the medium was removed and replaced with 5 ml serum-free medium (DMEM with high glucose concentration and 0.1 mM non-essential amino acids and L-glutamine). After 48 hours, the accumulation of EPO in serum free environment was monitored. The medium was collected for RIA analysis and cells were trypsinized and counted. Mean RIA values were 467 units / ml and 1352 units / ml, for cells grown at 100 nM and 1 μΜ MTX, the values were 2335 units / plate and 6750 units / plate. The average number of cells per plate was 1.94 x 10 6 and 3.12 x 10 6 . Thus, production efficiency was 1264 and 2167 units / 10 6 cells per 48 hours.
Bunky, obsiahnuté v uvedených kultúrach sú geneticky heterogénne populácie. Boli použité štandardné postupy na izoláciu geneticky homogénnych klonov s najvyššou produkčnou kapacitou. Tieto postupy sú uvedené v „Points to Consider in the Characterization of Celí Lines used to Pradúce Biologics“, Oddiel A, časť 2, 1. júna 1984, OfTice of Biologics Research Review, Center for Drugs and Biologics, U. S. Food and Drug Administration.The cells contained in said cultures are genetically heterogeneous populations. Standard procedures were used to isolate genetically homogeneous clones with the highest production capacity. These procedures are outlined in "The Characterization of Cell Lines Used to Falling Biologics", Section A, Part 2, June 1, 1984, OfTice of Biologics Research Review, Center for Drugs and Biology, U. S. Food and Drug Administration.
Produktivita bunkových línií EPO produkujúcich buniek CHO môže byť zlepšená príslušným zásahom do pestovaní kultúr. Pestovanie cicavčích buniek v kultúre obyčajne vyžaduje prítomnosť séra v živnom prostredí. Spôsob produkcie buniek cicavcov v kultúre obyčajne vyžaduje prítomnosť séra v rastovom prostredí. Spôsob produkcie erytropoetínu z buniek CHO v prostredí, ktoré sérum neobsahuje, podstatne uľahči izoláciu erytropoetínu zo živného prostredia. Tento spôsob teda zaručuje hospodárne získavanie erytropoetínu v prostrediach, ktoré neobsahujú sérum vo veľkých množstvách.The productivity of the CHO-producing EPO cell lines can be improved by appropriately interfering with the cultivation of cultures. Cultivation of mammalian cells in culture usually requires the presence of serum in the culture medium. The method of producing mammalian cells in culture usually requires the presence of serum in the growth medium. The method of producing erythropoietin from CHO cells in a serum-free environment will substantially facilitate the isolation of erythropoietin from the culture medium. Thus, this method ensures economical recovery of erythropoietin in environments that do not contain serum in large quantities.
Bunky kmeňa CHO pDSVL-gHuEPO, pestované za štandardných podmienok sa použijú na naočkovanie baní, vhodných na priame odstredenie v prostredí, ktoré sa skladá zo zmesi 50 : 50 z prostredia DMEM s vysokým množstvom glukózy a z prostredia Hamova F12, doplneného 5 % fetálneho séra, L-glutaminom a tiež penicilínom, streptomycínom, 0,05 mM neesenciálnych aminokyselín a príslušnou koncentráciou metotrexátu. Pestovanie buniek v suspenzii dovoľuje využiť veľký objem buniek CHO, produkujúcich EPO. Bunky CHO, pestované v suspenzii, sa potom použijú na naočkovanie väčších baní s objemom 850 ml a s objemom 200 ml prostredia. Bunky sa ponechajú rásť až do vzniku súvislej vrstvy vo forme k stene prilipnutej vrstvy počas troch dní. Prostredie, použité v tejto fáze je rovnaké ako prostredie, použité na rast buniek v suspenzii. Na konci trojdenného obdobia rastu sa prostredie obsahujúce sérum odstráni a nahradí sa 100 ml prostredia, ktoré je bez séra. Ide o zmes 50 : 50 prostredie DMEM s vysokým obsahom glukózy a Hamovho prostredia F12, doplneného 0,05 nM neesenciálnych aminokyselín a glutamínu. Banky sa opäť vrátia do inkubačného zariadenia na 1 až 3 hodiny, prostredie sa opäť odstráni a nahradí sa 100 ml čerstvého prostredia, bez séra. Inkubácia s prostredím bez séra počas 1 až 3 hodín zníži koncentráciu kontaminujúcich sérových bielkovín. Potom sa banky opäť vrátia do inkubátora na sedem dní, v tento čas sa hromadí erytropoetín v živnom prostredí, bez séra. Na konci sedemdenného obdobia sa prostredie odstráni a nahradí sa čerstvým prostredím, bez séra pre druhý produkčný cyklus. Po siedmich dňoch môže obsahovať takto získaná vzorka napríklad 3892 ± 409 jednotiek/ml ľudského erytropoetínu podľa údajov RIA. Vzhľadom na stanovenú hustotu buniek 0,9 až 1,8 x 105 buniek v ml obsahuje každá banka 0,75 ažCells of the strain CHO pDSVL-gHuEPO grown under standard conditions are used to inoculate mines suitable for direct centrifugation in an environment consisting of a 50:50 mixture of DMEM with a high amount of glucose and a Ham's F12 medium supplemented with 5% fetal serum, L-glutamine as well as penicillin, streptomycin, 0.05 mM non-essential amino acids and the appropriate methotrexate concentration. Growing the cells in suspension allows a large volume of EPO producing CHO cells to be utilized. CHO cells grown in suspension are then used to inoculate larger 850 ml mines with 200 ml medium. The cells are allowed to grow until a continuous layer is formed in the form of a wall adhering layer for three days. The medium used in this phase is the same as the medium used to grow the cells in suspension. At the end of the three-day growth period, the serum-containing medium is removed and replaced with 100 ml of serum-free medium. It is a 50:50 mixture of DMEM with a high glucose content and Ham's F12 medium supplemented with 0.05 nM non-essential amino acids and glutamine. The flasks are returned to the incubation apparatus for 1 to 3 hours, the medium is removed again and replaced with 100 ml of fresh medium, serum-free. Incubation with serum-free media for 1 to 3 hours will reduce the concentration of contaminating serum proteins. The flasks are then returned to the incubator for seven days, at which time erythropoietin accumulates in serum-free medium. At the end of the seven-day period, the medium is removed and replaced with fresh medium, serum-free for the second production cycle. After seven days, the sample thus obtained may contain, for example, 3892 ± 409 units / ml human erythropoietin according to RIA data. Based on the determined cell density of 0.9 to 1.8 x 10 5 cells per ml, each flask contains 0.75 to 1.5
1.5 x 108 buniek a produkcia EPO v 100 ml kultúry teda bola750 až 1470 jednotiek/106 buniek za 48 hodín.Thus, 1.5 x 10 8 cells and EPO production in 100 ml culture were 750 to 1470 units / 10 6 cells per 48 hours.
Živné prostredie z pestovania bunkového kmeňa CHO pDSVLMkEPO v prítomnosti 10 nM MTX bolo podrobené RIA in vitro a bola sledovaná tiež účinnosť in vivo. Vzorka prostredia obsahovala 41,2 ± 1,4 jednotiek/ml MkEPO pri meraní RIA, 41,2 ± 0,064 jednotiek/ml pri meraní účinnosti in vitro a 42,5 ± 5 jednotiek/ml pri meraní biologickej účinnosti in vivo. Sledovanie polypeptidového reťazca produktov preukázalo prítomnosť látok typu EPO, šlo o látky s obsahom troch zvyškov „signálneho sledu“ za aminoterminálnom zvyškom alanínu. Zatiaľ nie je jasné, či ide o nesprávnu výrobu polypeptidu v membráne buniek CHO alebo 0 odraz rôznosti štruktúry aminoterminálneho zakončenia opičieho a ľudského EPO.The culture medium from the cultivation of the CHO pDSVLMkEPO cell strain in the presence of 10 nM MTX was subjected to RIA in vitro and the in vivo efficacy was also monitored. The environmental sample contained 41.2 ± 1.4 units / ml MkEPO when measured by RIA, 41.2 ± 0.066 units / ml when measured in vitro and 42.5 ± 5 units / ml when measured in vivo biological activity. Monitoring of the polypeptide chain of the products showed the presence of EPO-type substances, consisting of three residues of the "signal sequence" after the amino-terminal residue of alanine. It is not yet clear whether this is a misproduction of the polypeptide in the CHO cell membrane or a reflection of the variation in the amino-terminal termination structure of monkey and human EPO.
Prostredí z pestovania kmeňa CHO pDSVL-gHuEPO bolo podrobené trom typom skúšok. Vzorka po pestovaníThe CHO pDSVL-gHuEPO culture medium was subjected to three types of tests. Sample after cultivation
5.5 dní obsahovala rekombinantný ľudský EPO v prostredí v koncentrácii 18,2 jednotiek/ml pri stanovení RIA, 15,8 ±5.5 days contained 18.2 units / ml recombinant human EPO in an RIA, 15.8 ±
4.6 jednotiek/ml pri stanovení in vitro a 16,8 ± 3,0 jednotiek/ml pri stanovení in vivo.4.6 units / ml in the in vitro assay and 16.8 ± 3.0 units / ml in the in vivo assay.
Prostredí z pestovania buniek CHO pDSVL-gHuEPO s aplifikovaným génom po použití 100 nM MTX bolo tiež podrobené všetkým trom skúškam. Po pestovaní 3 dni obsahovala vzorka rekombinantný ľudský EPO v koncentrácii 3089 ± 129 jednotiek/ml pri stanovení RIA, 2589 ± 71,5 jednotiek/ml pri stanovení in vitro a 2040 ± 160 jednotiek/ml pri stanovení in vivo. Pri stanovení sledu aminokyselín bolo možno preukázať aminoterminálne zakončenie, znázornené v tabuľke VI.Growth medium of pDSVL-gHuEPO gene-loaded CHO cells after using 100 nM MTX was also subjected to all three assays. After growing for 3 days, the sample contained recombinant human EPO at a concentration of 3089 ± 129 units / ml in an RIA, 2589 ± 71.5 units / ml in an in vitro assay, and 2040 ± 160 units / ml in an in vivo assay. The amino-terminal termination shown in Table VI could be demonstrated in the amino acid sequence determination.
Prostredie z pestovaní buniek CHO po transfekcii plazmidom pDSVL-MkE v prítomnosti 10 nM MTX bolo zliate a MTX bol dialyzovaný niekoľko dní, čím bolo získané prostredie s koncentráciou EPO 221 ± 5,1 jednotiek/ml (EPO/CCM), aby bolo možné stanoviť účinnosť EPO/CCM in vivo na úroveň hematokritu pri normálnych myšiach Balc/C bol uskutočnený nasledujúci pokus: Prostredie z pestovania buniek CHO (CCM) a EPO-CCM bolo upravené pridaním PBS. CCM bol použitý pre kontrolnú skupinu troch myší a pre experimentálne skupiny (2 myši v skupine) boli použité dve koncentrácie, a to 4 jednotky a 44 jednotiek v jednej dávke. V priebehu 5 týždňov bola táto dávka podávaná myšiam 3x týždne intraperitoneálne. Po ôsmej injekcii bola priemerná hodnota hematokritu pre kontrolnú skupinu 50,4 %, pre skupinu s podávaním 4 jednotiek 55,1 % a pre skupinu s podávaním 44 jednotiek 67,9 %.The medium from culturing CHO cells transfected with plasmid pDSVL-MkE in the presence of 10 nM MTX was decanted and MTX dialyzed for several days to obtain an EPO concentration of 221 ± 5.1 units / ml (EPO / CCM) to determine The in vivo efficacy of EPO / CCM to hematocrit level in normal Balc / C mice was performed as follows: CHO cell culture (CCM) and EPO-CCM medium was adjusted by addition of PBS. CCM was used for a control group of three mice and two concentrations were used for the experimental groups (2 mice per group), 4 units and 44 units per dose. Within 5 weeks, this dose was administered to mice 3 times intraperitoneally. After the eighth injection, the mean hematocrit was 50.4% for the control group, 55.1% for the 4-dose group, and 67.9% for the 44-dose group.
Produkty expresie buniek cicavcov je možné ľahko izolovať v podstate v čistej forme zo živného prostredia pri použití vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (C4) a etanolového gradientu, výhodne pri pH 7.Mammalian cell expression products can be readily isolated in substantially pure form from the culture medium using high pressure liquid chromatography (C4) and an ethanol gradient, preferably at pH 7.
Produkty expresie buniek cicavcov je možné ľahko izolovať v podstate v čistej forme z živného prostredia pri použití vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (C4) a etanolového gradientu, výhodne pri pH 7.Mammalian cell expression products can be readily isolated in substantially pure form from the culture medium using high pressure liquid chromatography (C 4 ) and an ethanol gradient, preferably at pH 7.
Boli uskutočnené predbežné pokusy na stanovenie vlastností rekombinantných glykoproteínových produktov z upraveného prostredia po expresii bunkami COS-1 a CHO ľudského génu pre EPO v porovnaní s izolátmi ľudského EPO z moču pri použití rôznych typov analýzy (SDSPAGE). Tieto štúdie ukazujú, že EPO, produkovaný bunkami CHO má trocha vyššiu molekulovú hmotnosť ako produkt expresie bunkami COS-1, ktorý mal molekulu o voľačo väčšiu ako produkt, získaný z moču. Všetky produkty boli sčasti heterogénne. Po pôsobení enzýmu neuraminidázy na odstránenie kyseliny sialovej boli získané rekombinantné produkty expresie bunkami COS-1 a CHO s približne rovnakou molekulovou hmotnosťou, ktoré však mali väčšiu molekulovú hmotnosť ako asialoprodukt z ľudského moču. Pôsobením endoglykozidázy F (EC 3.2.1) naPreliminary experiments were performed to determine the properties of recombinant glycoprotein products from conditioned media after expression by COS-1 and CHO cells of the human EPO gene compared to human EPO isolates from urine using various types of analysis (SDSPAGE). These studies show that the EPO produced by CHO cells has a slightly higher molecular weight than the product of expression by COS-1 cells, which had a molecule that is larger in size than the product obtained from urine. All products were partially heterogeneous. Recombinant expression products of COS-1 and CHO cells of approximately the same molecular weight but having a higher molecular weight than the asialoproduct from human urine were obtained after neuraminidase removal of sialic acid by the enzyme. By the action of endoglycosidase F (EC 3.2.1) on
Tabuľka VIII Oligonukleotidy ECEPO úsek 1Table VIII Oligonucleotides ECEPO Region 1
1. AATTCTAGAAACCATGAGCGTAATAAAATA1. AATTCTAGAAACCATGAGCGTAATAAAATA
2. CCATTArTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG2. CCATTArTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG
3. ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC3. ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC
4. CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG4. CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG
5. TCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTG5. TCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTG
6. CTTCCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT6. CTTCCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT
7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC
8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTrAG8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTrAG
9. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC9. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC
10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA
11. TTTCAACGAAAACATTACCGrACCG11. TTTCAACGAAAACATTACCGrACCG
12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT
Tabuľka IX ECEPO úsek 1Table IX ECEPO section 1
Xbal EcoRI 1 . 3Xbal EcoRI 1. 3
AATrCTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA TWTGGCrCC GČCGCGTCIG GATC TTTCCTACTC CCATTATTTT ATTÄČ3GAGG CCGCGCAGAC 2 4 atctgcgacIt ccagagTtct ggaacgttac ctgctÍaac CTAAAGAAGC TAGACGCTGA CCTC|tCAAGA CCTTGCAATG GACCACCTTČ] CATTTCTTCC rekombinantný produkt z buniek CHO a na produkt z moču (na úplné odstránenie uhľohydrátov z obidvoch produktov) bol získaný v podstate homogénny produkt v obidvoch prípadoch s identickou molekulovou hmotnosťou.AATrCTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA TWTGGCrCC GČCGCGTCIG GATC TTTCCTACTC CCATTATTTT ATTÄČ3GAGG CCGCGCAGAC 2 4 atctgcgacIt ccagagTtct ggaacgttac ctgctÍaac CTAAAGAAGC TAGACGCTGA CCTC | tCAAGA CCTTGCAATG GACCACCTTČ] CATTTCTTCC recombinant product from cells CHO and the product of urine (the complete removal of the carbohydrate of the two products) to obtain a substantially homogeneous product in both cases with identical molecular weight.
Je teda zrejmé, že glykoproteíny podľa vynálezu zodpovedajú svojou štruktúrou prírodné sa vyskytujúcemu erytropoetínu a majú tiež jednu alebo väčší počet jeho biologických vlastností pri zložení uhľohydrátov, ktoré je od prírodné sa vyskytujúceho erytropoetínu trocha odlišné.Thus, it is clear that the glycoproteins of the invention correspond in structure to the naturally occurring erythropoietin and also have one or more of its biological properties in the carbohydrate composition, which is somewhat different from the naturally occurring erythropoietin.
Príklad 11Example 11
Boli vykonávané pokusy s úplnou konštrukciou nukleotidových báz dvoch štrukturálnych génov, ktoré, ako je zrejmé z tabuľky VI, sú kódom pre ľudský EPO za súčasného včlenenia „výhodných“ kodónov na expresiu v E. coli a na expresiu v kvasinkách 5. cerevisiae. Na základe týchto stanovení je možné skonštruovať gény, ktoré sú kódmi pre analógy ľudského EPO. Realizácia zodpovedala spôsobu, opísanému Altonom a ďalšími (WO 83/04053). Gény boli zostavené ako mnohopočetné dvojice, ktoré bolo možné rozdeliť do troch skupín. Tieto skupiny boli určené na amplifikáciu a bolo z nich možné zostaviť mnohonásobnou väzbou fragmentov vhodný vektor na expresiu.Experiments were carried out to completely construct the nucleotide bases of the two structural genes, which, as shown in Table VI, code for human EPO while incorporating "preferred" codons for expression in E. coli and for expression in yeast 5. cerevisiae. Based on these assays, it is possible to construct genes that code for analogs of human EPO. The implementation was in accordance with the method described by Alton et al. (WO 83/04053). The genes were assembled as multiple pairs that could be divided into three groups. These groups were designed for amplification, and it was possible to construct a suitable expression vector by multiple fragment binding.
V nasledujúcich tabuľkách VIII až XIV sú znázornené konštrukcie takto získaného génu, ktorý je kódom pre ľudský EPO ako pre produkt translácie bez signálneho alebo predbežného sledu, ale s počiatočným metionínovým zvyškom v polohe -1. Okrem toho sú do génu včlenené z podstatnej časti kodóny, ktoré sú preferenčné pre E. coli, preto bol tento gén nazvaný „ECEPO“.The following Tables VIII to XIV show the construction of the gene thus obtained, which encodes human EPO as a translation product without a signal or preliminary sequence, but with an initial methionine residue at the -1 position. In addition, codons that are preferential for E. coli are incorporated into the gene to a large extent, so this gene was called "ECEPO".
Tabuľka XTable X
Oligonukleotidy ECEPO úsek 2Oligonucleotides ECEPO region 2
1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT
2. GTTAACCTTCCTCTCTCGTACCG2. GTTAACCTTCCTCTCTCGTACCG
3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT
4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA
5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT
6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC
7. TTGCCAGGGTCTGGCACTGCTCAGCG7. TTGCCAGGGTCTGGCACTGCTCAGCG
B. GCCTCCCTCACCAGTGCCAGACCCTGB. GCCTCCCTCACCAGTGCCAGACCCTG
9. AGGCTGTACTGCGTGGCCAGGCA9. AGGCTGTACTGCGTGGCCAGGCA
10. GCAGTCCCTGGCCACGCAGTACA10. GCAGTCCCTGGCCACGCAGTACA
11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT
12. TTCCCACGGCTGAGACGAGTTTACCA12. TTCCCACGGCTGAGACGAGTTTACCA
13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGrTGAC13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGrTGAC
14. GCTľTGTCAACArGCAGCTGCAGCGG14. GCT1TGTCAACArGCAGCTGCAGCGG
15. AAAGCAGTATCTGGCCTGflGATCTG15. AAAGCAGTATCTGGCCTGflGATCTG
16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT
Tabuľka XITable XI
ECEPO úsek 2ECEPO section 2
EcoRI KpnI 1EcoRI KpnI 1
ÄÁTTCG(*TÄCC AGACACCAAG GCCATGG TCTGTGGTTC 2 gtItaacttct acgcTtggaa acgtatÍgaa cŕaTTí^aga tgcgaacctt tgcatacCTT|TCATTCG (* TÄCC AGACACCAAG GCCATGG TCTGTGGTTC 2 gtItaacttct acgcTtggaa acgtatIgaa càaTT ^ aga tgcgaacctt tgcatacCTT |
GTTGGTCAAC AAGCAGTTGA AGľlrrGGCAG GGTCTGGCAC TGCTGACCCh CAACCAGTTG TTCGTCAACT TCAAÄľ^TC CCAGACCGTG ACGACTCGCTGTTGGTCAAC AAGCAGTTGA AGllrrGGCAG GGTCTGGCAC TGCTGACCCh CAACCAGTTG TTCGTCAACT TCAAÄ ^ TC CCAGACCGTG ACGACTCGCT
TGAAAACÄ7C IaCCACTCGTT CrGCTGAACA CTCTTC[TTTG AACGAÄÄACA ACTTTTGTAG TGGTGhCCAA CACGACTTGT GACAAGAÄÁČ] TTGCTTTTGT 8 10 1 TGAAAACÄ7C IaCCACTCGTT CrGCTGAACA CTCTTC [TTTG AACGAÄÄACA ACTTTTGTAG TGGTGhCCAA CACGACTTGT GACAAGAAC] TTGCTTTTGT 8 10 1
KpnI BamHIKpnI BamHI
TTACGGTACC GTTACGGTACC G
AATGCCATGG CCTAGAATGCCATGG CCTAG
CGCTCTACTCCGCTCTACTC
C^ŽjACATGAC cgYgcccagg GCACCGGTCCC ^ ZATATGAC cgYgcccagg GCACCGGTCC
CAÍTGCTGGT gtgäc3accaCAÍTGCTGGT gtgäc3acca
AAACTCCTCTAAACTCCTCT
TTTGAGGAGATTTGAGGAGA
CAGCCGTbGG GTCCGCACČČCAGCCGTbGG GTCCGCACNo
AACCCCTGCA TíjGGCGACGTAACCCCTGCA TíjGGCGACGT
GCTGCATGTT CGACGTACAA gacIaaagcag ctgtttcg|tcGCTGCATGTT CGACGTACAA gacIaaagcag ctgtttcg | tc
BglII BamHI tatcTggcct GAGATCTG ATAGACCGGA CTCTAGACCTACBglII BamHI tatcTggcct GAGATCTG ATAGACCGGA CTCTAGACCTAC
Tabuľka XIITable XII
ECEPO úsek 3ECEPO section 3
1. AATTCGGTACCACACACCAAGCT1. AATTCGGTACCACACACCAAGCT
2. GTTAACCTTCCTCTCTGCTACCG2. GTTAACCTTCCTCTCTGCTACCG
J. TAACTTCTACGCITGGAAACGTATJ. TAACTTCTACGCITGGAAACGTAT
4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA
5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT
í. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAACd. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC
7. ttggcagggtctggcactgctgagcg7. ttggcagggtctggcactgctgagcg
8. GCCTCGCTCAGCAGTGCCAGACCCTG8. GCCTCGCTCAGCAGTGCCAGACCCTG
9. AGCCTGTACTGCGTGGCCAGGCA9. AGCCTGTACTGCGTGGCCAGGCA
10. GCAGTGCCTCGCCACGCAGTACA10. GCAGTGCCTCGCCACGCAGTACA
11. CTGCTCGTAAACTCCTCTCAGCCGT11. CTGCTCGTAAACTCCTCTCAGCCGT
12. TTCCCACGGCTGAGAGGAGTTTACCA12. TTCCCACGGCTGAGAGGAGTTTACCA
13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTTCAC13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTTCAC
14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG
15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG
1«. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT1 ". GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT
Tabuľka XIII ECEPO úsek 3Table XIII ECEPO section 3
BlflHI BqlII (HlTCCAGATCTCTG GTCTACAGAC actacTctcc Itccctcctct čggtgcacag TGATGAGACG ACGCífcGAGA CCCACCTGTC 2 4 aaagaggLta tctctccgcc TTTCTCCClO^GAGGCGGBlflHI BqlII (HlTCCAGATCTCTG GTCTACAGAC actacTctcc Itccctcctct cggtgcacag TGATGAGACG ACGCífcGAGA CCCACCTGTC 2 4 aaagaggLta tctctccgcc TTTCTCCClO ^ GAGGCGG
GGATGCTGCA TCTÍCTGCAC CGCTGCCTAC CATCACTgEt GATACCTTľC CCTACGACGT AGACffÄČpTG GCGACGCATG GTAGTGAČCA CT^TGGAAGGGGATGCTGCA TCTÍCTGCAC CGCTGCCTAC CATCACTgEt GATACCTT1C CCTACGACGT AGACffÄČpTG GCGACGCATG GTAGTGAČCA CT ^ TGGAAGG
GCAAACTGTT TCGtGTATAC TCTÄÄCTTCC TGCGTGGTAh ACTGAAACTG CGTTTGACAA AGCACAťÄlTG AGATTGAAGG ACGCACCATT fČAdTTTGAC 10 12 Ί GCAAACTGTT TCGtGTATAC TCTÄÄCTTCC TGCGTGGTAh ACTGAAACTG CGTTTGACAA AGCACAtÄlTG AGATTGAAGG ACGCACCATT fČAdTTTGAC 10 12 Ί
SaliSali
TATACTGGCG AAGCPTGCCG TACTCCTCAC CGCTAATAG ATATGACCGC TTCGlÄČíífc ATGACCACTG GCGATTATC ACCT 14 Ί 16TATACTGGCG AAGCPTGCCG TACTCCTCAC CGCTAATAG ATATGACCGC TTCGlÄČíífc ATGACCACTG GCGATTATC ACCT 14 Ί 16
Tabuľka XIV Gén ECEPO xbalTable XIV Gene ECEPO xbal
Cľlí AAACCATGAG GCTAATAAAA TTTGGTACTC CCATTATTTTAAACCATGAG GCTAATAAAA TTTGGTACTC CCATTATTTT
-1 1-1 1
MetAl* TAATCGCTCC ATTACCGAGGMetAl * TAATCGCTCC ATTACCGAGG
CCCGCCTCrc CGGCGCAGACCCCGCCTCrc CGGCGCAGAC
ATCTGCGACT CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC TACACGCTGA GCTCTCAAGA CCTTGCAATC GACGACCTTC GATTTCTTCGATCTGCGACT CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC TACACGCTGA GCTCTCAAGA CCTTGCAATC GACGACCTTC GATTTCTTCG
TGAAAACATC ACCACTGGTT GTGCTGAACA CTCTTCTTTC AACCAAAACA ACT1TTGTAG IGGIGACCAA CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGTTGAAAACATC ACCACTGGTT GTGCTGAACA CTCTTCTTTC AACCAAAACA ACT1TTGTAG IGGIGACCAA CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT
TTACGGTACC AGACACCAAG GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA AATGCCATGG TCTGTGGTTC CAATTGAAGA TGCCAACCTT TGCATACCTTTTACGGTACC AGACACCAAG GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA AATGCCATGG TCTGTGGTTC CAATTGAAGA TGCCAACCTT TGCATACCTT
GTTGGTCAAC AAGCAGTTGA AGTTTGGCAG GGTCTGGCAC TGCTGACCGA CAACCAGTTG TTCGTCAACT TCAAACCGTC CCACACCGTG ACGACTCGCTGTTGGTCAAC AAGCAGTTGA AGTTTGGCAG GGTCTGGCAC TGCTGACCGA CAACCAGTTG TTCGTCAACT TCAAACCGTC CCACACCGTG ACGACTCGCT
GGCTGTACTG CGTGGCCACG CACTGCTGGT AAACTCCTCT CAGCCGTGGG CCGACATGAC GCACCGGTCC GTGACGACCA TTTGAGGAGA GTCGGCACCCGGCTGTACTG CGTGGCCACG CACTGCTGGT AAACTCCTCT CAGCCGTGGG CCGACATGAC GCACCGGTCC GTGACGACCA TTTGAGGAGA GTCGGCACCC
AACCGCTGCA GCTGCATGTT GACAAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTCTG TTGGCCACCT CGACGTACAA CTGTTTCGTC ATAGACCGGA CTCTAGAGACAACCGCTGCA GCTGCATGTT GACAAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTCTG TTGGCCACCT CGACGTACAA CTGTTTCGTC ATAGACCGGA CTCTAGAGAC
ACTACTCTCC TGCCTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGCTA TCTCTCCGCC TGATGAGACG ACGCACGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAŤ AGAGAGGCGGACTACTCTCC TGCCTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGCTA TCTCTCCGCC TGATGAGACG ACGCACGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGG AGAGAGGCGG
GGATGCTGCA TCTCCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGCt GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGACGTG GCGACGCATG GTAGTGACGA CTATGGAACGGGATGCTGCA TCTCCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGCt GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGACGTG GCGACGCATG GTAGTGACGA CTATGGAACG
GCAAACTGTT TCGTCTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAA ACTCAAACTG CGTTTGACAA AGCACATATG AGATTGAAGG ACGCACCATT TGACTTTGACGCAAACTGTT TCGTCTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAA ACTCAAACTG CGTTTGACAA AGCACATATG AGATTGAAGG ACGCACCATT TGACTTTGAC
TATACTGGCG AAGCATGCCC TACTGGTGAC ATATGACCGC TTCGTACGCC ATGACCACTGTATACTGGCG AAGCATGCCC TACTGGTGAC ATATGACCGC TTCGTACGCC ATGACCACTG
SaliSali
CGCTAATAG GCCATTATCA GCTCGCTAATAG GCCATTATCA GCT
V tabuľke VIII sú znázornené oligonukleotidy, použité na výstavbu úseku 1 génov ECEPO, ide o kód aminoterminálnych zvyškov ľudského polypeptidu. Oligonukleotidy boli zostavené ako dvojice, tzn. 1 a 2, 3 a 4 atď. a tieto dvojice potom boli naviazané za vzniku úseku 1 génu ECEPO, ako je to zrejmé z tabuľky IX. Je nutné upozorniť na to, že tento úsek obsahuje miesta po štiepení enzýmami EcoRI a BamHI, potom smerom „dolu“ od zakončenia po pôsobení EcoRI sa nachádza miesto po pôsobení enzýmu Xbal a smerom „hore“ od miesta pre pôsobenie enzýmu BamHI sa nachádzajú miesta pre pôsobenie enzýmu KpnI. Úsek I je možné ľahko podrobiť amplifikácii pri použití fágu M13 ako vektora na overenie sledu. Niektoré ťažkosti boli spojené s izoláciou tohto úseku ako fragmentu po pôsobení enzýmov XBal/KpnI z DNA, vzniknuté v E. coli, príčinou bola zjavne metylácia miesta po pôsobení enzýmu KpnI v hostiteľovi. Z tohto dôvodu bola izolovaná DNA fágu s jednoduchým reťazcom a bola potom in vitro zmenená na DNA s dvojitým reťazcom, potom bol izolovaný požadovaný fragment s dvojitým reťazcom.Table VIII shows the oligonucleotides used to construct region 1 of the ECEPO genes, which is the code for the amino-terminal residues of the human polypeptide. Oligonucleotides were assembled as pairs, i. 1 and 2, 3 and 4, etc. and these pairs were then coupled to form region 1 of the ECEPO gene, as shown in Table IX. It should be noted that this section contains EcoRI and BamHI digestion sites, then downstream of EcoRI and Xbal and upstream of BamHI sites treatment with KpnI. Region I can easily be amplified using M13 phage as a sequence verification vector. Some difficulties have been associated with the isolation of this region as a fragment after treatment with XBal / KpnI enzymes from E. coli DNA, apparently due to methylation of the KpnI site in the host. For this reason, the DNA of the single-stranded phage was isolated and then changed in vitro to double-stranded DNA, then the desired double-stranded fragment was isolated.
Gény ECEPO, úseky 2 a 3 tak, ak sú znázornené v tabuľkách XI a XIII, boli konštruované obdobným spôsobom z oligonukleotidov, uvedených v tabuľkách X a XII. Každá sekcia bola podrobená amplifikácii vo vektore M13 na overenie sledu a potom bola izolovaná z DNA-fágu. Ako je zrejmé z tabuľky XI, úsek 2 ECEPO bol konštruovaný s miestami po pôsobení enzýmov EcoRI a BamHI s možnosťou opätovnej väzby a mohol byť izolovaný ako fragment po pôsobení KpnI/BglII. Obdobne úsek 3 ECEPO bol pripravený s miestami po pôsobení BamHI a Sali, schopnými opätovnej väzby na konci a mohol byť izolovaný z DNA fágu ako fragment BglII/ Sali. Takto získané 3 úseky je možné ľahko spojiť na kontinuálny sled DNA tak, ak je to znázornené v tabuľke XIV, ktoiý je kódom pre celý ľudský polypeptid EPO s aminoterminálnym kodónom pre metionín (ATG) pre počiatok translácie v E. coli. Je nutné tiež upozorniť na to, že smerom „hore“ od počiatočného kodónu ATG sa nachádza skupina párov báz, ktorá v podstate opakuje sled pre väzbu ribozómu pri expresii génu OMP-f E. coli.The ECEPO genes, Sections 2 and 3, as shown in Tables XI and XIII, were constructed similarly from the oligonucleotides listed in Tables X and XII. Each section was amplified in an M13 vector to verify the sequence and then isolated from DNA phage. As can be seen from Table XI, ECEPO region 2 was constructed with EcoRI and BamHI sites capable of re-binding and could be isolated as a KpnI / BglII-treated fragment. Similarly, region 3 of ECEPO was prepared with BamHI and SalI-treated sites capable of reclosing at the end and could be isolated from the phage DNA as a BglII / SalI fragment. The 3 regions thus obtained can be readily linked to a continuous DNA sequence, as shown in Table XIV, which encodes the entire human EPO polypeptide with an amino terminal methionine (ATG) codon for translation initiation in E. coli. It should also be noted that upstream of the ATG start codon, there is a base pair that essentially repeats the ribosome binding sequence in the expression of the E. coli OMP-f gene.
Ako nosný vektor pre ECEPO je možné použiť akýkoľvek vhodný vektor na dosiahnutie expresie. Vektorom, zvoleným na tento účel bol „na teplotu citlivý“ plazmid pCFM536, čo je derivát plazmidu pCFM414 (ATCC 40076), ktorý bol opísaný v US patentovej prihláške č. 636 727, podanej 6. augusta 1984 (Charles F. Morris). Gén pCFM536 bol potom rozštiepený enzýmami Xbal a Hin-dlll. Veľký fragment bol izolovaný a použitý' na väzbu s génom ECEPO. Úseky 1 (Xbal/KpnI), 2 (KpnI/BglII) a 3 (BglII/SalI) boli vopred zaradené v správnom poradí v Ml3 a gén pre EPO, bol potom izolovaný ako jediný fragment (Xbal/ HindlII). Tento fragment obsahoval časť väzbového reťazca z fágu Ml 3 mp9 medzi miestami pre pôsobenie enzýmov Sali až HindlII. Pri overení expresie výsledného plazmidu p536 bol použitý promótor lambda PL, ktorý samotný môže byť podriadený represorického génu Ο|857 tak, ako sa nachádza v kmeni E. coli K12 A Htrp .Any suitable vector for expression can be used as a carrier vector for ECEPO. The vector selected for this purpose was the " temperature-sensitive " plasmid pCFM536, which is a derivative of plasmid pCFM414 (ATCC 40076), which has been described in U.S. Pat. No. 636,727, filed Aug. 6, 1984 (Charles F. Morris). The pCFM536 gene was then digested with XbaI and Hin-dIII. The large fragment was isolated and used for binding to the ECEPO gene. Sections 1 (XbaI / KpnI), 2 (KpnI / BglII) and 3 (BglII / SalI) were pre-aligned in the correct order in M13 and the EPO gene was then isolated as a single fragment (XbaI / HindIII). This fragment contained part of the M1 3 mp9 binding chain between the SalI to HindIII sites. The lambda P L promoter was used to verify expression of the resulting plasmid p536, which itself may be subjected to the repressor gene Ο | 857 as found in E. coli strain K12 A Htrp.
Získaný gén pre ECEPO je potom možné rôznym spôsobom modifikovať, čim sa získajú kódy pre analógy erytropoetínu, napríklad [Asn2, des-Pro2 až Ile6]hEPO a [His7]hEPO, ako už bolo uvedené.The obtained ECEPO gene can then be modified in various ways to obtain codes for erythropoietin analogs, such as [Asn 2 , des-Pro 2 to Ile 6 ] hEPO and [His 7 ] hEPO, as mentioned above.
A. [Asn2, des-Pro2 až Ile6]hEPOA. [Asn 2 , des-Pro 2 to Ile 6 ] hEPO
Plazmid 536, ktorý nesie skonštruovaný gén ECEPO z tabuľky XIV ako včlenený úsek, zakončený miestami pre pôsobenie Xbal a HindlII bol rozštiepený enzýmami Hin-dlll a Xhol. Druhá z uvedených endonukleáz štiepi uvedený gén v mieste, ktoré sa nachádza 6 párov báz od kodónu, ktorý je kódom pre Asp8 až Arg“. Potom bol produkovaný väzbový reťazec Xbal/Xhola nasledujúcim sledom:Plasmid 536, which carries the engineered ECEPO gene of Table XIV as an inserted region, terminated with the XbaI and HindIII sites, was digested with Hin-dIII and XhoI. The other endonuclease cleaves said gene at a site 6 bp away from the codon encoding Asp 8 to Arg '. The XbaI / Xhola binding chain was then produced in the following sequence:
Väzbový reťazec Xbal/Xhol a fragment so sledom génu ECEPO Xhol/HindlII sa včlení do veľkého fragmentu, ktorý vznikne tak, že sa pomocou enzýmov Xbal a HindlII rozštiepi plazmid pCFM526, čo je derivát plazmidu pCFM414 (ATCC 40076) tak, ako bol opísaný v US patentovej prihláške č. 636 727, podanej 6. augusta 1984 (Charles F. Morris), čím sa získa sled DNA, ktorý je kódom pre Met'1 formu požadovaného analógu pri expresii v E. coli.The XbaI / XhoI binding chain and the ECEPO XhoI / HindIII gene sequence fragment were inserted into a large fragment resulting from the digestion of plasmid pCFM526, a derivative of plasmid pCFM414 (ATCC 40076), using the XbaI and HindIII enzymes, as described in U.S. Pat. No. 636,727, filed Aug. 6, 1984 (Charles F. Morris) to obtain a DNA sequence that encodes a Met ' 1 form of the desired analog when expressed in E. coli.
B. [His’jhEPOB. [His'jhEPO
Plazmid 536 bol rozštiepený enzýmami HindlII a Xhol ako v odseku A. Väzbový reťazec Xbal/Xhol bol skonštruovaný s nasledujúcim sledom:Plasmid 536 was digested with HindIII and XhoI as in paragraph A. The XbaI / XhoI chain was constructed with the following sequence:
Väzbový reťazec a fragment ECEPO (Xhol/HindlII) bol potom včlenený do plazmidu pCFM526, čim bol získaný sled DNA, nesený plazmidom, ktorý je kódom pre Met'1 formu požadovaného analógu pri expresii v E. coli.The binding chain and the ECEPO fragment (XhoI / HindIII) were then inserted into plasmid pCFM526 to obtain a DNA sequence carried by a plasmid encoding the Met ' 1 form of the desired analogue when expressed in E. coli.
Konštrukcia génu „SCEPO“, ktorý má v sebe včlenené kodóny, uľahčujúce expresiu v kvasinkách, je opísaná v nasledujúcich tabuľkách XV až XXI. Rovnako ako v prípade génu ECEPO, zahŕňa v sebe celá konštrukcia tvorbu troch skupín oligonukleotidov tak, ako sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách XV, XVII a XIX, ide o dvojice báz, ktoré sú potom usporiadané do úsekov, ktoré sú znázornené na tabuľkách XVI, XVIII a XX, je potrebné uviesť, že syntézu je možné čiastočne uľahčiť tak, že sa použijú niektoré suboptimálne kodóny pri konštrukcii SCEPO i ECEPO, tzn. v prípade obidvoch génov sú identické oligonukleotidy 7 až 12 v úseku 1 a tiež v úseku 2 sú totožné v obidvoch génoch oligonukleotidy 1 až 6.The construction of the "SCEPO" gene, which incorporates codons that facilitate expression in yeast, is described in the following Tables XV to XXI. As in the case of the ECEPO gene, the entire construct involves the formation of three groups of oligonucleotides as shown in Tables XV, XVII and XIX below, which are pairs of bases, which are then arranged into sections as shown in Tables XVI, XVIII and XX, it should be noted that the synthesis can be partially facilitated by using some suboptimal codons in both SCEPO and ECEPO construction, i. in the case of both genes, identical oligonucleotides 7 to 12 in region 1 are identical, and also in region 2, oligonucleotides 1 to 6 are identical in both genes.
Tabuľka XVTable XV
Oligonukleotidy SCEPO úsek 1Oligonucleotides SCEPO region 1
1. AATTCAAGCTTGGÄTÄÄflflGRGCT1. AATTCAAGCTTGGÄTÄÄflflGRGCT
2. GTGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG2. GTGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG
3. CCACCAAGATTGATCTGTGACTC3. CCACCAAGATTGATCTGTGACTC
*. TCTCGAGTCACAGATCAATCTTG*. TCTCGAGTCACAGATCAATCTTG
5. GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTTG5. GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTTG
¢. CTTCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC¢. CTTCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC
7. GAAGCTAAAGAACCTCAAAACATC7. GAAGCTAAAGAACCTCAAAACATC
8. GTGGTGATGTTT1CAGCTTCTTTAG8. GTGGTGATGTTT1CAGCTTCTTTAG
9. ACCACTGGTTCTGCTGAACACTCTTC9. ACCACTGGTTCTGCTGAACACTCTTC
10. CAAAGAACACTGTTCAGCACAACCA10. CAAAGAACACTGTTCAGCACAACCA
11. TTTGAACGAAAACA7TACCGTACCG11. TTTGAACGAAAACA7TACCGTACCG
12. GATCCGGTACCGTAAIGTTTTCGTT12. GATCCGGTACCGTAAIGTTTTCGTT
Tabuľka XVITable XVI
SCEPO úsek 1SCEPO section 1
EcoRI HindlII 1 ääTtca ÄgčTtggaTaEcoRI HindIII 1 ääTtca ÄgčTtggaTa
GT TCCAACCTATGT TCCAACCTAT
AAAGAGCrbc ACCAAGATTG ATCTGTGACT ctAGAGTTTT TTTCTCGAGČ TGpTTCTAAC TAGACACTGA GCTCT]CAAAAAAAGAGCrbc ACCAAGATTG ATCTGTGACT ctAGAGTTTT TTTCTCGAG TGpTTCTAAC TAGACACTGA GCTCT] CAAAA
Tabuľka XVIITable XVII
Oligonukleotidyoligonucleotides
SCEPO úsek 2SCEPO section 2
1. AATTCCGTACCAGACACCAAGGT1. AATTCCGTACCAGACACCAAGGT
2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG
3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT
4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA
5. GGAAGTTGGrCAACAAGCAGTTGAAGT5. GGAAGTTGGrCAACAAGCAGTTGAAGT
6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC
7. TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATCľG7. TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATC1G
8. CCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG8. CCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG
9. AAGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCCT9. AAGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCCT
10. AACAAGGCTTGACCTCTCAAAACA10. AACAAGGCTTGACCTCTCAAAACA
11. TGTTGGTTAACTCTTCTCAACCATGGG11. TGTTGGTTAACTCTTCTCAACCATGGG
12. TGGTTCCCATGGTTGAGAAGAGTTAACC12. TGGTTCCCATGGTTGAGAAGAGTTAACC
13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT
14. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA14. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA
15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG
16. CATCCACATCTCAAACCAGAGACGG16. CATCCACATCTCAAACCAGAGACGG
Tabuľka XVIIITable XVIII
SCEPO úsek 2SCEPO section 2
KpnIKpnI
EcoRI 1 nrTTCGGTffCC AGACACCAAGEcoRI 1 nrTTCGGTffCC AGACACCAAG
GCCATGG TCTGTGGTTCGCCATGG TCTGTGGTTC
GTlrAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATbGAA GTTCGTCAAC CAKtT^AGA TGCGAACCTT TGCAIACtTŤj CAACCAGTTGGTlrAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATbGAA GTTCGTCAAC CAKtT ^ AGA TGCGAACCTT TGCAIACtTj CAACCAGTTG
AGTlTTGGCAAAGTlTTGGCAA
TCAAÄľ^3TTTCAA ^ 3TT
GGTTTGGCCT CCAAACCGGAGGTTTGGCCT CCAAACCGGA
BB
TGTTATCTcb agctgttTtc acaatagactT^caaaacTGTTATCTcb agctgttTtc acaatagactT ^ caaaac
AAGCTCTTGA TTCCACAACT é agaggtcaag 7CTCCAGTTC 10AAGCTCTTGA TTCCACAACT é agaggtcaag 7CTCCAGTTC 10
GGAAÁGATAC TTGTTGbflAG CTAAACAACC CCTTTCTATG AACAACCrra GArTTCTTCG 6 1 βGGAAAGATAC TTGTTGbflAG CTAAACAACC CCTTTCTATG AACAACCrra GArTTCTTCG 6 1 β
TGAAAACATC frCCACTGGTT ACTTTľGTAG TtľET^CCŔATGAAAACATC frCCACTGGTT ACTTT'GTAG Tt'ET ^ CCŔA
CCÚGTTGGT gcarTO^caCCGTTGGT gcarTO ^ ca
U u UU u U
TAACTCTTCT caaccatggg paccattgca attgcacgtc ATTGAGAAGA GTTGGTACCC ITGGThACGT TAACGTGCAG 12 ’ 14TAACTCTTCT caaccatggg paccattgca attgcacgtc ATTGAGAAGA GTTGGTACCC ITGGThACGT TAACGTGCAG 12 ’14
11 KpnI BanHI11 KpnI BanHI
GVGCTGAÄCA CTGnClTTTG AACCAAAACA TTACGGTACC G CACCACTTGT GACAAGAÄÄČ1 TTGCTTTTCT AATGCCATGC CCTAG ! 12GVGCTGAÄCA CTGnClTTTG AACCAAAACA TTACGGTACC G CACCACTTGT GACAAGAÄÄ1 TTGCTTTTCT AATGCCATGC CCTAG! 12
BglII BatnHIBglII BatnHI
GAThAAGCCG TCTCTGGTTT GAGA7C7C CTATTTČbGC AGAGACCAAA CTCTAGACCTA G léGAThAAGCCG TCTCTGGTTT GAGA7C7C CTATTTBbC AGAGACCAAA CTCTAGACCTA G lé
Tabuľka XIXTable XIX
Oligonukleotidy SCEPO úsek 3Oligonucleotides SCEPO region 3
Tabuľka XXI Gén SCEPOTable XXI SCEPO gene
19. CAACAGTGTAGATGTAACAAAG19. CAACAGTGTAGATGTAACAAAG
20. TCGACTTTGTTACATCTACACT20. TCGACTTTGTTACATCTACACT
Tabuľka XXTable XX
SCEPO sek 3SCEPO sec 3
BamHI Balil 1BamHI Balil 1
GATC CAGATCTTlff actactttgt tcagagcttt GTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTtGAAAGATC CAGATCTTlff actactttgt tcagagcttt GTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTtGAAA
GGGTGCTCAA AAGGAACbCA TTTCCCČACC AGACGCTGCT TCTGCCGCTCGGGTGCTCAA AAGGAACbCA TTTCCCČACC AGACGCTGCT TCTGCCGCTC
CCCACGAGTT TTCCTTCGGT A|AAGGGGTGG TCTGCGACGA AČÄČÍGCGAGCCCACGAGTT TTCCTTCGGT A | AAGGGGTGG TCTGCGACGA AČÄČÍGCGAG
4«4 '
CATTGAGijAC CATCfcCTCCT GATAČCTTCA GAAAGTTfcTT CAGAGTTTAC GTAACTCTTG GTAGTGÄČfcA CtATGGAAGT CTTTCAATAA GlľCTCAAATCCATTGAGijAC CATCfcCTCCT GATHCTCTCA GAAAGTTfcTT CAGAGTTTAC GTAACTCTTG GTAGTGÄČfcA CtATGGAAGT CTTTCAATAA GlCTCTAAATC
10 12.10 12.
13151315
TCCAACTTCT IľGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACÍGGTG AAGCCTGTAG AGGTTGAAGA ACtSTCCATT TAACTTCAAC ATGTGGČČÍt TTCGGŔCAXC Ί 14 Γ16TCCAACTTCT ILGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACACÍGGTG AAGCCTGTAG AGGTTGAAGA ACtSTCCATT TAACTTCAAC ATGTGGRead TTCGGŔCAXC Ί 14 Γ 16
AACTCGTŕAC AGATAAGCCC TTGACCACrC'ÍCjrATTCGGC ' 18 gactgataaí aacagtgtag CTGACTATTG fTOTCACATCAACTCGTàAC AGATAAGCCC TTGACCACrC'ÍCjrATTCGGC '18 gactgataaí aacagtgtag CTGACTATTG fTOTCACATC
Sali ATGTAACAAA G TACATTGTTT CAGCT 20Sali ATGTAACAAA G TACATTGTTT CAGCT
Celý úsek SCEPO bol podrobený expresii v M13 a úseky 1, 2 a 3 boli izolovateľné z fágu ako fragmenty Hin -dlII/Kpnl, Kpnl/BglII a BglII/Sall.The entire SCEPO region was expressed in M13, and sections 1, 2 and 3 were isolated from phage as Hin-dlII / Kpnl, Kpnl / BglII and BglII / SalI fragments.
Systém pre expresiu génu SCEPO, ktorý je v súčasnosti pokladaný za výhodný, je založený na sekrécii α-faktora S. cerevisiae tak, ako to bolo opísané v U. S. patentovej prihláške č. 487 753, podanej 22. apríla 1983 (Grant A. Bitter), a uverejnenej 31. októbra 1984 ako európska patentová prihláška č. 0 123 294. Tento systém zahŕňa konštrukcie, v ktorých DNA, ktorá je kódom pre vedúci sled génu pre α-faktor kvasiniek sa uloží do polohy tesne 5' za kódovú oblasť exogénneho génu, ku ktorého expresii má dôjsť. V dôsledku toho produkt po translácii obsahuje vedúci alebo signálny sled, ktorý je odstránený endogénnym enzýmom kvasiniek v priebehu sekrécie zvyšku produktu. Pretože sa pri konštrukcii používa kodón ATG, ktorý je kodónom pre počiatok translácie α-faktora, nie je potrebné zaradiť tento kodón do polohy -1 génu SCEPO. Ako jc zrejmé z tabuľky XXI, nachádza sa pred kódom pre alanín (+1) väzbový reťazec, ktorý dovoľuje priame včlenenie do plazmidu vrátane DNA pre prvých 80 zvyškov signálneho sledu pre α-faktora s nasledujúcim promótorom pre a-faktor. Špecifická konštrukcia na expresiu génu SCEPO v sebe zahŕňa štvorstupňovú väzbu vrátane uvedených fragmentov a veľkého fragmentu po štiepení plazmidu paC3 enzýmami HindlII/Sall. Z výsledného plazmidu pctC3/SCEPO je možné izolovať promótor pre a-faktor, signálny sled a gén SCEPO štiepením enzýmom BamHI a väzbou do plazmidu pYE po štiepení enzýmom BamHI, čím vzniká plazmid pYE/SCEPO.The SCEPO gene expression system, which is currently considered to be advantageous, is based on the secretion of S. cerevisiae α-factor as described in U.S. Pat. No. 487,753, filed April 22, 1983 (Grant A. Bitter), and published October 31, 1984 as European Patent Application no. This system includes constructs in which DNA which encodes the yeast α-factor gene leader sequence is inserted just 5 'after the coding region of the exogenous gene to be expressed. As a result, the translation product contains a leader or signal sequence that is removed by the endogenous yeast enzyme during secretion of the remainder of the product. Since the ATG codon, which is the codon for the α-factor translation translation initiation codon, is used in construction, it is not necessary to position this codon at the -1 position of the SCEPO gene. As can be seen in Table XXI, there is a binding chain upstream of the alanine (+1) code that permits direct incorporation into the plasmid, including DNA, for the first 80 residues of the α-factor signal sequence followed by the α-factor promoter. A specific construct for the expression of the SCEPO gene involves a four-step binding including the above fragments and a large fragment after digestion of the paC3 plasmid with HindIII / SalI. From the resulting plasmid pctC3 / SCEPO, the α-factor promoter, signal sequence and SCEPO gene can be isolated by digestion with BamHI and binding to pYE after digestion with BamHI to give plasmid pYE / SCEPO.
SK 279959 Β6SK 279959 Β6
Príklad 12Example 12
Expresiu rekombinantných produktov pri použití konštruovaných génov ECEPO a SCEPO systémom na expresiu z príkladu 11 je možné dosiahnuť nasledujúcim spôsobom:Expression of recombinant products using the engineered ECEPO and SCEPO genes by the expression system of Example 11 can be achieved as follows:
Plazmid p536 z príkladu 11 sa transformuje do buniek AM7 £. coli, ktoré už boli transformované vhodným plazmidom pMWl s génom CI837. Kultúry buniek v prostredí LB (ampicilín 50 gg/ml a kanamycín 5 gg/ml, výhodne s 10 mM síranu horečnatého) sa udržujú na teplote 28 °C a bunky sa pestujú do hustoty 0,1 (optická hustota), expresia EPO sa vyvolá zvýšením teploty na 42 °C. Dochádza k produkcii EPO v množstve približne 5 mg/liter.Plasmid p536 of Example 11 is transformed into AM7β cells. coli, which had already been transformed with the appropriate plasmid pMW1 with gene C1837 . Cell cultures in LB medium (ampicillin 50 gg / ml and kanamycin 5 gg / ml, preferably with 10 mM magnesium sulfate) are maintained at 28 ° C and the cells are grown to a density of 0.1 (optical density), EPO expression is induced by raising the temperature to 42 ° C. EPO is produced in an amount of approximately 5 mg / liter.
Bunky sa izolujú, rozrušia a potom sa na nich pôsobí lyzozýmom a namáčadlom NP-40. Peleta po odstredení (24 000 g) sa potom solubilizuje guanidínhydrochloridom a ďalej sa čistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou v reverznej fáze (C4 - Vydac), 0 až 80 % etanolu, 50 mM octanu amónneho, pH 4,5. Pri stanovení sledu bielkoviny je možné preukázať, že čistota produktu je vyššia ako 95 % a získaný produkt má 2 možné zakončenia na aminoterminálnom konci, a to A-P-P-R alebo P-P-R v pomernom množstve 3:1. Toto pozorovanie produktov, ktoré zodpovedajú ľudskému hEPO a rovnakému produktu bez alanínu v polohe 1 ukazuje na „spracovanie“ hostiteľskými bunkami, ktoré odstraňuje terminálny metionín a v niektorých prípadoch tiež počiatočný alanín. Rádioimunologická účinnosť izolátov bola 150 000 až 160 000 jednotiek/mg, účinnosť in vitro 30 000 až 62 000 jednotiek/mg a účinnosť in vivo 120 až 720 jednotiek/mg. (Porovnanie bolo vykonané s materiálom, izolovaným z ľudského moču s účinnosťou 70 000 jednotiek/mg). Krivka závislosti účinku od dávky pre rekombinantný produkt in vivo sa podstatne líšila od rovnakej krivky pre EPO z ľudského moču.Cells are harvested, disrupted, and then treated with lysozyme and NP-40 wetting agent. The pellet after centrifugation (24 000 g) was solubilized guanidine hydrochloride, and further purified by HPLC reverse phase (C 4 - Vydac), from 0 to 80% ethanol, 50 mM ammonium acetate, pH 4.5. When determining the protein sequence, it can be shown that the purity of the product is greater than 95% and the product obtained has 2 possible amino terminal terminations, APPR or PPR in a 3: 1 ratio. This observation of products that correspond to human hEPO and the same alanine-free product at position 1 indicates "processing" by host cells that removes terminal methionine and, in some cases, initial alanine. The radioimmunological activity of the isolates was 150,000 to 160,000 units / mg, the in vitro activity was 30,000 to 62,000 units / mg, and the in vivo activity was 120 to 720 units / mg. (Comparison was made with material isolated from human urine with an efficiency of 70,000 units / mg). The dose-response curve for the recombinant product in vivo was significantly different from the same curve for EPO from human urine.
Plazmidy pre analógy EPO, vytvorené v častiach A a B v príklade 11 boli jednotlivo transformované do buniek AM7 E. coli, ktoré už boli transformované pMWl a bunky boli pestované uvedeným spôsobom. Čistené izoláty boli skúmané RIA in vitro. Obidve hodnoty pre produkty expresie [Asn2, des-Pro2 až Ile6]hEPO boli približne 11 000 jednotiek/mg a 6000 jednotiek/mg bielkoviny, zatiaľ čo rovnaké hodnoty pre [His7]hEPO boli 41 000 jednotiek/mg a 14 000 jednotiek/mg bielkoviny, čo ukazuje na to, že analogické produkty mali účinnosť 1/4 až 1/10 ako úplné produkty expresie.The plasmids for the EPO analogs generated in Parts A and B of Example 11 were individually transformed into E. coli AM7 cells that had already been transformed with pMW1 and the cells were cultured as described above. Purified isolates were examined by RIA in vitro. Both values for [Asn 2 , des-Pro 2 to Ile 6 ] hEPO expression products were approximately 11,000 units / mg and 6000 units / mg protein, while the same values for [His 7 ] hEPO were 41,000 units / mg and 14 000 units / mg protein, indicating that analogous products had a potency of 1/4 to 1/10 as full expression products.
V systéme na expresiu, určenom na použitie v hostiteľských bunkách S. eerevisiae, bol plazmid pYE/SCEPO transformovaný do dvoch rôznych kmeňov, a to YSDP4 (genotyp a pep4-3 trpí) a RK81 (genotyp aa pep4-3 trpí). Transformované hostiteľské bunky YSDP4 boli pestované v prostredí SD (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., p. 62 (1983)), doplnenom aminokyselinami kazeínu v koncentrácii 0,5 %, pH 6,5 pri 30 °C. Prostredie bolo oddelené pri optickej hustote buniek 36 a obsahovalo EPO v koncentrácii 244 jednotiek/ml (97 gg/liter podľa RIA). Transformované bunky RK81 boli pestované do optickej hustoty 6,5 alebo 60, koncentrácia EPO bola 80 až 90 jednotiek/ml (34 gg/liter podľa RIA). Predbežná analýza preukázala heterogenitu produktov, zjavne na základe rôznej glykozylácie bielkovín a pomerne vysoký obsah manózy.In an expression system for use in S. eerevisiae host cells, plasmid pYE / SCEPO was transformed into two different strains, YSDP4 (genotype and pep4-3 suffer) and RK81 (genotype aa pep4-3 suffer). Transformed YSDP4 host cells were grown in SD medium (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p. 62 (1983)) supplemented with casein amino acids at a concentration of 0.5%, pH 6.5 at 30 ° C. C. The medium was separated at an optical cell density of 36 and contained 244 units / ml EPO (97 gg / liter according to RIA). The transformed RK81 cells were grown to an optical density of 6.5 or 60, with an EPO concentration of 80 to 90 units / ml (34 gg / liter according to RIA). Preliminary analysis showed the heterogeneity of the products, apparently due to the different protein glycosylation and relatively high mannose content.
Plazmidy PaC3 a pYE v HB101 E. coli boli uloženéPlasmids PaC3 and pYE in HB101 E. coli were deposited
27. septembra 1984 do Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland pod číslami ATCC 39881 a ATCC 39882. Plazmidy’pCFM526 vAM7, pCFM536 v bunkách JM103 a pMWl v bunkách JM103 boli tiež uložené 21. novembra 1984 pod číslami ATCCSeptember 27, 1984 to American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland under ATCC 39881 and ATCC 39882. Plasmids'pCFM526 vAM7, pCFM536 in JM103 cells and pMW1 in JM103 cells were also deposited on November 21, 1984 under ATCC numbers.
33932, 33934 a 33933. Saccharomyces eerevisiae kmene YSPD4 a RK81 boli uložené 21. novembra 1984 pod číslami ATCC 20734 a 20733.33932, 33934 and 33933. Saccharomyces eerevisiae strains YSPD4 and RK81 were deposited on November 21, 1984 under ATCC numbers 20734 and 20733.
Je zrejmé, žc spôsobom podľa vynálezu jc možné získať početné výnimočne cenné produkty.It is clear that numerous exceptionally valuable products can be obtained by the process according to the invention.
Polypeptidy, získané spôsobom podľa vynálezu, sú užitočné materiály, nech už ide o produkty mikrobiálnej expresie, alebo o syntetické produkty, primárna, sekundárna a terciáma štruktúra týchto produktov bola po prvýkrát poznaná realizáciou spôsobu podľa vynálezu.Polypeptides obtained by the process of the invention are useful materials, whether microbial expression products or synthetic products, the primary, secondary and tertiary structures of these products were first recognized by the implementation of the method of the invention.
Ako už bolo uvedené, rekombinantné produkty a syntetické produkty majú v rôznom stupni spoločnú biologickú účinnosť in vitro tak pre izoláty EPO z prírodných zdrojov, ako pre produkty expresie a môžu teda byť použité ako náhradky pre izoláty EPO v živnom prostredí pre krvné bunky. V určitej miere majú polypeptidy, vyrobené spôsobom podľa vynálezu tiež účinnosť in vivo, podobnú prírodným izolátora EPO a je teda možne ich použiť na liečbu erytropoetínom u cicavcov vrátane ľudí, napríklad tam, kde je potrebné dosiahnuť stimuláciu retikulocytov, vznik ferokinetických účinkov, napríklad výmeny železa medzi plazmou a kostnou dreňou, tam kde je potrebné dosiahnuť zmenu počtu erytrocytov, stimuláciu vzniku hemoglobínu C (Eschbach a ďalšie) a zvýšenie hodnoty hematokritu, u cicavcov, ako to bolo uvedené v príklade 10. Ide teda o pacientov, ktorí obyčajne vyžadujú krvnú transfúziu, napríklad pri úrazoch, v prípade chirurgických chorôb, pri chorobách obličiek vrátane použitia umelej obličky a pri pacientoch s rôznymi typmi porúch v zložení krvi, ako sú hemofília, poruchy tvaru krviniek, fyziologické anémie, kosákovitá anémia a podobne. Týmto spôsobom je možné znížiť nutnosť transfúzií, a tým využiť EPO na zníženie materiálov, ktorými sa môžu prenášať infekčné choroby. Produkty podľa vynálezu vzhľadom na výrobu rekombinantnými spôsobmi sú zbavené pyrogénov, prírodných inhibičných látok a podobne, a sú teda veľmi účinné v porovnaní s prírodnými produktmi. Je možné ich použiť tiež tam, kde je nutné zlepšiť prenos kyslíka, napríklad pri pobyte v prostredí s jeho zníženým množstvom a v prípade obehových ochorení.As mentioned above, recombinant products and synthetic products share, to varying degrees, the in vitro biological activity for both EPO isolates from natural sources and expression products and can thus be used as substitutes for EPO isolates in blood cell culture media. To some extent, the polypeptides produced by the method of the invention also have in vivo activity similar to the natural EPO isolator and can therefore be used to treat erythropoietin in mammals, including humans, for example where reticulocyte stimulation is desired, ferokinetic effects such as iron exchange between plasma and bone marrow where changes in erythrocyte counts, stimulation of hemoglobin C (Eschbach et al.) and hematocrit elevation in mammals, as described in Example 10, should be achieved. Thus, these are patients who usually require blood transfusion , for example, injuries, surgical diseases, kidney diseases, including the use of an artificial kidney, and in patients with various types of blood composition disorders such as hemophilia, blood cell disorders, physiological anemia, sickle cell anemia and the like. In this way, it is possible to reduce the need for transfusions, thereby utilizing EPO to reduce the materials by which infectious diseases can be transmitted. The products of the invention are devoid of pyrogens, natural inhibitory substances and the like with respect to production by recombinant methods, and are therefore very effective in comparison with natural products. They can also be used where oxygen transfer needs to be improved, for example when staying in a reduced amount environment and in circulatory diseases.
Výhodným spôsobom podania týchto polypeptidov je parenterálne podanie, látky sa obyčajne podávajú s prijateľnými riedidlami, nosičmi a/alebo pomocnými látkami. Predbežné farmakokinetické štúdie preukazujú dlhší polčas in vivo pre opičí EPO pri vnútrosvalovom podaní ako pri vnútrožilovom podaní. Účinné dávky sa podstatne odlišujú od seba navzájom podľa ochorenia, pohybujú sa však v rozmedzí 0,1 až 100 gg/kg, tzn. približne 7 až 7000 jednotiek/kg. Je možné použiť bežné riedidlá, napríklad ľudský sérový albumín a štandardné nosiče, napríklad fyziologický roztok chloridu sodného.A preferred route of administration for these polypeptides is parenteral administration, the agents usually being administered with acceptable diluents, carriers, and / or excipients. Preliminary pharmacokinetic studies have shown a longer in vivo half-life for simian EPO by intramuscular administration than by intravenous administration. Effective doses differ substantially from one another according to disease, but are in the range of 0.1 to 100 gg / kg, i. about 7 to 7000 units / kg. Conventional diluents such as human serum albumin and standard carriers such as saline may be used.
V prostriedkoch je možné použiť aj ďalšie pomocné látky, napríklad testosteróny, stimulátory zárodočných buniek, rastové faktory podobné inzulínu, prostaglandínu, serotonínu, cyklickému AMP, prolaktínu a trijódtyronínu, použiť je možné tiež látky užívané pri liečbe aplastických anémií, ako metenolén, stanozol a nandrolón (Resegotti a ďalšie, Panminerva Medica 23, 243 až 248 (1981), McGonigle a ďalšie, Kidney Int. 25 (2), 437 až 444 (1984), Pavlovic-Kantera a ďalšie, Expt. Hematol. 8 (Supp. 8), 283 až 291 (1980) a Kurtz, FEBS Letters, 14a (1), 105 až 108 (1982)). Ako pomocné látky je možné použiť tiež zlúčeniny, o ktorých je známe, že zvyšujú účinok erytropoetínu alebo asialo-EPO, napríklad adrenergné látky, hormóny štítnej žľazy, androgény alebo BPA, ako to bolo opísané v publikáciách Dunn, „Current Concepts in Erythropoiesis“, John Wiley and Sons (Chichester, England, 1983), Weiland a ďalšie, Blut, 44 (3), 173 až 175 (1982), Kalmanti, Kidney Int., 22, 383 až 391 (1982), Shahidi, New. Eng. J. Meď, 289, 72 až 80 (1973), Fischer a ďalšie, Steroids, 30 (6), 833 až 845 (1977), Urabe a ďalšie, J. Exp. Med., 149, 1314 až 1325 (1979) a Billat a ďalšie, Expt. Hematol., 10 (1), 133 až 140 (1982) a zlúčeniny, ktoré sú označované ako „pečeňové faktory pre tvorbu krvi“, ako to bolo opísané v publikáciách Naughton a ďalšie, Acta Haemat., 69, 171 až 179 (1983) a „erytrotropiny“, opísané v publikáciách Congote a ďalšie v Abstract 364, Proceedings 7t Intemational Congress of Endocrinology (Quebec City, Quebec, júl 1 - 7, 1984), Congote, Biochem. Biophys. Res. Comm, 115 (2), 447 až 483 (1983) a Congote, Anál. Biochem., 140, 428 až 433 (1984) a „erytrogeniny“, opísané v publikácii Rothman a ďalšie, J. Surg. Oncol, 20, 105 až 108 (1982). Predbežné sledovanie ukazuje na hypoxických polycytemických myšiach, vopred ošetrených 5-a-dihydrotestosterónom alebo nandrolónom a potom erytropoetínom sľubné výsledky.Other adjuvants such as testosterones, germ cell stimulators, insulin-like growth factors, prostaglandin, serotonin, cyclic AMP, prolactin, and triiodothyronine may also be used in the compositions, as well as agents used in the treatment of aplastic anemias such as metenolene, stanozol and nandrolone (Resegotti et al., Panminerva Medica 23, 243-248 (1981), McGonigle et al., Kidney Int. 25 (2), 437-444 (1984), Pavlovic-Kantera et al., Expt. Hematol. 8 (Supp. 8 , 283-291 (1980) and Kurtz, FEBS Letters, 14a (1), 105-108 (1982). Compounds known to enhance the effect of erythropoietin or asialo-EPO, for example, adrenergic agents, thyroid hormones, androgens or BPA, as described in Dunn, " Current Concepts in Erythropoiesis " John Wiley and Sons (Chichester, England, 1983), Weiland et al., Blut, 44 (3), 173-175 (1982), Kalmanti, Kidney Int., 22, 383-391 (1982), Shahidi, New. Eng. J. Copper, 289, 72-80 (1973), Fischer et al., Steroids, 30 (6), 833-845 (1977), Urabe et al., J. Exp. Med., 149, 1314-1325 (1979) and Billat et al., Expt. Hematol., 10 (1), 133-140 (1982) and compounds referred to as " liver factors for blood production " as described in Naughton et al., Acta Haemat., 69, 171-179 (1983). ) and "erythropropins", described in Congote et al., Abstract 364, Proceedings 7t, Intemational Congress of Endocrinology (Quebec City, Quebec, Jul. 1-7, 1984), Congote, Biochem. Biophys. Res. Comm., 115 (2), 447-483 (1983) and Congote, Anal. Biochem., 140, 428-43 (1984) and the "erythrogenins" described by Rothman et al., J. Surg. Oncol., 20, 105-108 (1982). Preliminary screening shows promising results in hypoxic polycythaemic mice pretreated with 5-α-dihydrotestosterone or nandrolone and then erythropoietin.
Diagnostické použitie polypeptidov, vyrobených spôsobom podľa vynálezu, je tiež veľmi široké a zahŕňa použitie značených aj neznačených foriem v rôznych imunologických skúškach vrátane RIA, ELISA a podobne, rovnako ako celý rad skúšok in vitro a in vivo. Tieto postupy sú opísané v publikáciách Dunn a ďalšie, Expt. Hematol., 11 (7), 590 až 600 (1983), Gibson a ďalšie, Pathology, 16, 155 až 156 (1984), Expt. Hematol, 11 (7), 649 až 660 (1983), Saito a ďalšie, Jap. J. Med., 23 (1), 16 až 21 (1984), Natan a ďalšie, New Eng. J. Med., 308 (9), 520 až 522 (1983) a tiež v rôznych článkoch, na ktoré sú v týchto publikáciách odkazy. Polypeptidy podľa vynálezu vrátane syntetických peptidov so sledmi alebo zvyškami EPO sú tiež vysoko užitočnými čistými látkami pre polyklonálne protilátky a „bankami“ monoklonálnych protilátok, špecifických pre rozoznávanie kontinuálnych a diskontinuálnych epitopov EPO. Príkladom môže byt predbežná analýza sledu aminokyselín z tabuľky VI podľa publikácie Hopp a ďalšie, PNAS (USA), 78, strany 3824 až 3828 (1981) a analýza sekundárnej štruktúry podľa publikácie Chou a ďalšie, Ann. Rev. Biochem, 47, str. 251 (1978) preukázala, že syntetické peptidy, ktorých štruktúra zodpovedá kontinuálnym sledom prírodných peptidov v oblastiach 41 až 57, 116 až 118 a 144 až 166 vždy vrátane, sú schopné vyvolať vysoko antigénnu odpoveď, a tým aj vznik monoklonálnych a polyklonálnych protilátok, ktoré reagujú so syntetickým peptidom aj s celou bielkovinou. Tieto protilátky by mohli byť užitočné pre detekciu a čistenie EPO a príbuzných produktov.The diagnostic use of the polypeptides produced by the method of the invention is also very broad and involves the use of both labeled and unlabeled forms in various immunoassays including RIA, ELISA and the like, as well as a variety of in vitro and in vivo assays. These procedures are described in Dunn et al., Expt. Hematol., 11 (7), 590-600 (1983); Gibson et al., Pathology, 16, 155-156 (1984), Expt. Hematol., 11 (7), 649-660 (1983); Saito et al., Jap. J. Med., 23 (1), 16-21 (1984), Natan et al., New Eng. J. Med., 308 (9), 520-522 (1983) and also in various articles referred to in these publications. Polypeptides of the invention, including synthetic peptides with sequences or residues of EPO, are also highly useful pure polyclonal antibody substances and monoclonal antibody "banks" specific for recognizing continuous and discontinuous EPO epitopes. Examples include preliminary analysis of the amino acid sequence of Table VI by Hopp et al., PNAS (USA), 78, pp. 3824-3828 (1981) and secondary structure analysis by Chou et al., Ann. Rev. Biochem, 47, p. 251 (1978) has shown that synthetic peptides whose structure corresponds to continuous sequences of natural peptides in regions 41-57, 116-118 and 144-166 inclusive are all capable of eliciting a highly antigenic response and thereby producing monoclonal and polyclonal antibodies which react with both the synthetic peptide and the whole protein. These antibodies could be useful for the detection and purification of EPO and related products.
Boli pripravené nasledujúce tri syntetické peptidy:The following three synthetic peptides were prepared:
1. hEPO 41-57, V-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G,1. hEPO 41-57, V-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-R-M-E-V-G,
2. hEPO 116-126, K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A,2. HEPO 116-126, K - E - A - I - S - P - D - A - A - A - A,
3. hEPO 144-166, V-Y-S-H-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.HEPO 144-166, V-Y-S-H-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.
Predbežná štúdia, týkajúca sa imunizácie, s použitím uvedených polypeptidov ukázala pomerne slabú pozitívnu odpoveď pre hEPO 41 až 57, takmer žiadnu odpoveď pre hEPO 116 až 128 a silnú pozitívnu odpoveď na hEPO 144 až 166, merané schopnosťou protilátok králičieho séra zrážok izolátu EPO z ľudského moču, značenom l25I. Predbežné štúdie in vivo všetkých troch peptidov nepreukázali takmer žiadnu účinnosť jednotlivo ani v zmesi.A preliminary immunization study using said polypeptides showed a relatively weak positive response for hEPO 41-57, almost no response for hEPO 116-128, and a strong positive response to hEPO 144-166, measured by the ability of rabbit serum antibodies to precipitate EPO isolate from human urine, No. l25 I. Preliminary in vivo studies of the three peptides did not show practically no force individually or as a mixture.
Sled aminokyselinových zvyškov EPO cicavcov tak, ako bol preukázaný v príkladoch, definuje primárnu štruktúru úplného EPO, ale špecifický sled 165 aminokyselín opičieho EPO v tabuľke V a 166 zvyškov ľudského EPO v tabuľke VI neobmedzuje rozsah použiteľných polypeptidov podľa vynálezu. Spôsobom podľa vynálezu je možné zís kať rôzne alelové formy EPO, ktoré podľa výsledkov skorších výskumov existujú, napríklad ľudský gamainterferón, ako je možné porovnať s údajmi, ktoré hovoria o argenínovom zvyšku v polohe č. 140 EPO alebo glutamínovom zvyšku v polohe 140 v publikácii Gray a ďalšie, Náture, 295, strany 503 až 508 (1982). Vždy však ide o „úplný“ sled ľudského gama-interferónu. Alelové formy úplného EPO sa môžu líšiť od seba navzájom a od sledov v tabuľkách V a VI dĺžkou sledu alebo tým, že niektoré zvyšky sú vynechané, nahradené, členené alebo pridané s následnými zmenami účinku a zmenami glykozylácie. Ako už bolo uvedené, jedna alelová forma ľudského EPO zjavne obsahuje zvyšok metionínu v polohe 126. Je možné očakávať, že zjavne existujú ešte DNA genómu a sledycDNA, ktoré sú kódom pre alelové polypeptidy alebo proste obsahujú odlišné kodóny na označenie rovnakého polypeptidu.The mammalian EPO amino acid sequence as demonstrated in the examples defines the primary structure of full EPO, but the specific sequence of monkey EPO 165 amino acids in Table V and the 166 human EPO residues in Table VI do not limit the range of useful polypeptides of the invention. By the method according to the invention, it is possible to obtain various allele forms of EPO which, according to the results of earlier studies, exist, for example human gamainterferon, as can be compared with the data suggesting the argenine residue at position no. 140 EPO or a glutamine residue at position 140 in Gray et al., Nature 295, pp. 503-508 (1982). However, it is always a "complete" sequence of human gamma-interferon. The allelic forms of full EPO may differ from each other and from the sequences in Tables V and VI by the sequence length or by the fact that some residues are omitted, replaced, segmented or added with subsequent changes in activity and changes in glycosylation. As mentioned above, one allele form of human EPO apparently contains a methionine residue at position 126. It can be expected that genomic DNA and sledycDNA still exist that encode allelic polypeptides or simply contain different codons to designate the same polypeptide.
Okrem prírodné sa vyskytujúcich alelových foriem úplného EPO zahŕňa vynález tiež ďalšie „EPO-produkty“, napríklad polypeptidové analógy EPO a jeho fragmenty. Spôsobom podľa uverejnených prihlášok Altona a ďalších (napríklad WO/83/04053/) je možné navrhnúť a skonštruovať gény pre mikrobiálnu expresiu polypeptidov, ktorých štruktúra sa líši od úplného EPO v jednom alebo vo väčšom počte zvyškov, a to ich substitúciou, pridaním uprostred alebo na konci alebo vynechaním. Je tiež možné uskutočniť modifikácie opičej cDNA a génov pre EPO v genóme dobre známou miestne orientovanou mutagenézou a tak získať analógy a deriváty EPO. Tieto produkty môžu mať niektoré biologické vlastnosti, ale líšia sa v ďalších vlastnostiach EPO. Niektoré produkty vynechávajú aminokyseliny [Asn2, des-Pro2 až Ile6]hEPO, [des-Thr163 až Argl66]hEPO a „delta27-55hEP0“, pričom posledná látka má vypustený celý exón. Niektoré deriváty sú stálejšie proti hydrolýze a tým majú dlhší účinok, alebo je vypustené jedno alebo väčší počet miest pre glykozyláciu, čo môže viesť k väčšej účinnosti v prípade produkcie kvasinkami, alebo môže byť zvyšok cysteínu nahradený napríklad histidínom alebo serínom, ako v analógu [His’jhEPO a je možné ich ľahšie izolovať alebo majú tyrozín nahradený fenylalanínom, ako [Phe15]hEPO, [Phe49]hEPO a [Phe'45]hEPO a môžu sa horšie alebo ľahšie viazať na receptory v cieľových bunkách. Môže tiež ísť o fragmenty obsahujúce len časť sledu úplného EPO a len časť účinnosti tejto látky, napríklad väzbu na receptory a nie erytropoetickú účinnosť. Osobitne významné sú potenciálne fragmenty' sledu DNA ľudského genómu z tabuľky VI, ktoré sú špeciálnymi doménami biologickej účinnosti. Je nutné uviesť, že neúčinnosť in vivo nemusí znamenať liečebný nezdar alebo nedostatok antagonizmu. Tento antagonizmus môže byť užitočný v liečbe polycytémií pri prebytku EPO, ako to bolo opísané v publikáciách Adamson, Hosp. Practice, 18 (12), 49 až 57 (1983), a Hellmann a ďalšie, Clin. Lab. Haemat., 5, 335 až 342 (1983).In addition to the naturally occurring allele forms of full length EPO, the invention also includes other "EPO products", for example, EPO polypeptide analogs and fragments thereof. By the method of published applications of Alton et al. (E.g. WO / 83/04053), it is possible to design and construct genes for microbial expression of polypeptides whose structure differs from full EPO in one or more residues by substitution, addition in the middle or at the end or omitted. It is also possible to make modifications to the monkey cDNA and EPO genes in the genome by well-known site-directed mutagenesis to obtain analogs and derivatives of EPO. These products may have some biological properties but differ in other EPO properties. Some products omit the amino acids [Asn 2 , des-Pro 2 to Ile 6 ] hEPO, [des-Thr 163 to Arg 1666 ] hEPO and "delta 27-55hEP0", the latter having the entire exon deleted. Some derivatives are more stable against hydrolysis and thus have a longer effect, or one or more glycosylation sites are omitted, which may lead to greater efficacy in yeast production, or the cysteine residue may be replaced by, for example, histidine or serine as in [His 'jhEPO and can be easily isolated or be replaced with phenylalanine, tyrosine, as [Phe 15] hEPO [Phe 49] hEPO and [Phe 45] hEPO and may be worse or easier to bind to receptors in target cells. They may also be fragments containing only part of the sequence of full EPO and only part of the activity of the substance, for example, binding to receptors and not erythropoietic activity. Of particular importance are potential DNA sequence fragments of the human genome of Table VI, which are special domains of biological activity. It should be noted that in vivo ineffectiveness may not indicate therapeutic failure or lack of antagonism. This antagonism may be useful in the treatment of polycythaemias in excess of EPO as described in Adamson, Hosp. Practice, 18 (12), 49-57 (1983), and Hellmann et al., Clin. Lab. Haemat., 5, 335-34 (1983).
Podľa ďalšieho aspektu podľa vynálezu je možné získať klonované sledy DNA, ktoré sú kódom pre ľudský a opičí EPO a ktoré sú cenné vzhľadom na informácie, ktoré podávajú o slede aminokyselín erytropoetínu cicavcov, ktoré predtým nebolo možné získať napriek desaťročiam analytických výskumov prírodné sa vyskytujúcich produktov. Sledy DNA je možné použiť tiež na syntézu erytropoetínu rekombinantným spôsobom. Okrem toho je možné ich použiť na konštrukciu vírusových a cirkulámych plazmidov, hostiteľských buniek, a to prokaryotických aj eukaryotických po transfekcii alebo transformácii a buniek kvasiniek aj cicavcov v kultúre, takže ide o nové a cenné metódy pestovania uvedených buniek, ktoré sú schopné produkovať EPO a EPO-produkty. Sledy DNA sú tiež použiteľné ako značené vzorky pri izolácii EPO a DNA genómu, vrátane cDNA, ktorá je kódom pre tieto produkty. Zatiaľ nie je možné odhadnúť, v akom rozsahu je možné použiť sledy DNA podľa vynálezu v syntéze bielkovín, napríklad pri hmyze. Tieto sledy môžu dať vzniknúť rôznym typom buniek cicavcov, ktoré potom môžu byť eukaryotickými hostiteľmi na výrobu erytropoetínu a podobných produktov, ak to bolo opísané v publikácii Palmiter a ďalšie, Science, 222 (4625), 809 až 814 (1983).According to another aspect of the invention, it is possible to obtain cloned DNA sequences that encode human and simian EPO and which are valuable with respect to the information they provide about the mammalian erythropoietin amino acid sequence that had not previously been obtained despite decades of analytical research on naturally occurring products. DNA sequences can also be used for the synthesis of erythropoietin by recombinant means. In addition, they can be used to construct viral and circulating plasmids, host cells, both prokaryotic and eukaryotic after transfection or transformation, and both yeast and mammalian cells in culture, making these new and valuable methods of growing said cells capable of producing EPO and EPO-products. DNA sequences are also useful as labeled samples in the isolation of EPO and the genome DNA, including the cDNA that encodes these products. It is not yet possible to estimate to what extent the DNA sequences of the invention can be used in protein synthesis, for example in insects. These sequences may give rise to various types of mammalian cells, which may then be eukaryotic hosts for the production of erythropoietin and the like, as described in Palmiter et al., Science, 222 (4625), 809-814 (1983).
Je teda zrejmé, že príklady, uvedené v príkladovej časti prihlášky, nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu, pretože je zásadne možný rad modifikácií a variácií, vzhľadom na to, že sledy DNA zahŕňajú cDNA a sledy DNA genómu. Môžu teda byť kódom pre EPO, ako v príklade 12, aj pre jeho fragmenty a analógy, tzn. „EPO-produkty“, ktoré môžu mať totožné niektoré biologické vlastnosti s prírodným produktom, iné však nie.Thus, it is to be understood that the examples set forth in the Examples section of the application are not intended to limit the scope of the invention since many modifications and variations are possible in principle, since DNA sequences include cDNA and genome DNA sequences. Thus, they can be coded for EPO, as in Example 12, for fragments and analogs thereof, i. 'EPO products', which may have some biological properties identical to the natural product, but not others.
Je teda zrejmé, že DNA sledy podľa vynálezu zahŕňajú všetky sledy, dovoľujúce expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách, pričom produktom tejto expresie je polypeptid, ktorý má aspoň časť primárnej štruktúry EPO a jednu alebo väčší počet jeho vlastností, môže teda ísť o:Thus, it is understood that the DNA sequences of the invention encompass all sequences permitting expression in prokaryotic or eukaryotic host cells, wherein the expression product is a polypeptide having at least a portion of the primary structure of EPO and one or more of its properties, such as:
a) sledy DNA z tabuliek V a VI,(a) DNA sequences from Tables V and VI;
b) sledy DNA, ktoré hybridizujú so sledmi v odseku a) alebo ich fragmenty a(b) DNA sequences that hybridize to the sequences in paragraph (a) or fragments thereof; and
c) sledy DNA, ktoré hybridizujú so sledmi z odseku a) a b) z iných dôvodov ako vzhľadom na degeneráciu genetického kódu.(c) DNA sequences which hybridize with the sequences of (a) and (b) for reasons other than the degeneracy of the genetic code.
Je nutné sa zmieniť o tom, že existujúce alelové opičie a ľudské sledy génu pre EPO pravdepodobne hybridizujú so sledmi z tabuliek V a VI alebo s ich fragmentmi. Okrem toho gény SCEPO a ECEPO a sledy cDNA alebo DNA genómu, ktoré sú kódom pre rôzne fragmenty a analógy EPO, môžu tiež hybridizovať s uvedenými sledmi DNA. Túto hybridizáciu je možno uskutočniť za podmienok, ktoré boli opísané, vrátane obmedzujúcich podmienok.It should be noted that the existing allele monkey and human sequences of the EPO gene are likely to hybridize to the sequences of Tables V and VI or fragments thereof. In addition, the SCEPO and ECEPO genes and cDNA or DNA genome sequences coding for various EPO fragments and analogs can also hybridize to said DNA sequences. This hybridization can be performed under the conditions described, including limiting conditions.
Uvedené príklady osvetľujú mikrobiálnu expresiu EPO a expresiu v bunkách cicavcov, pričom DNA je včlenená do hybridného vektora bakteriálneho plazmidu a vírusu, bolo by však možné použiť širokú škálu podobných systémov. Mohlo by ísť napríklad o vektory homogénneho pôvodu, vnesené do celého radu buniek baktérií, kvasiniek a cicavcov v kultúre alebo o systémy, v ktorých sa nepoužívajú vektory, napríklad pri použití fosforečnanu vápenatého. Je zrejmé, že expresia napríklad DNA opičieho pôvodu sa vykonáva v kultúre buniek opice alebo človeka a aj keď v tom prípade ide o expresiu „exogénnej“ DNA, je možné dosiahnuť vysokú úroveň expresie, napriek tomu, že nejde o DNA, ktorá má svoj pôvod v genóme hostiteľa. Systémy expresie podľa vynálezu ďalej uvažujú o tvorbe EPO a podobných produktov v cytoplazme alebo membráne s následným nahromadením, prípadne aj v periplazmatickom priestore baktérií alebo v supematante živného prostredia uvedených kultúr alebo v menej bežných systémoch, napríklad tých, ktoré využívajú P. aeruginosa podľa publikácie Gray a ďalšie, Biotechnology, 2, strany 161 až 165 (1984).The examples exemplify microbial expression of EPO and expression in mammalian cells, wherein the DNA is incorporated into a hybrid bacterial plasmid and virus vector, but a wide variety of similar systems could be used. These could be, for example, vectors of homogeneous origin introduced into a variety of cells of bacteria, yeast and mammals in culture, or systems in which vectors are not used, for example using calcium phosphate. Obviously, expression of, for example, monkey-derived DNA is carried out in a culture of monkey or human cells, and even if it is the expression of "exogenous" DNA, a high level of expression can be achieved even though it is not DNA of its origin. in the host genome. The expression systems of the invention further contemplate the formation of EPO and the like products in the cytoplasm or membrane with subsequent accumulation, possibly also in the periplasmic space of the bacteria or in the culture supernatant of said cultures or in less common systems, such as those utilizing P. aeruginosa according to Gray et al., Biotechnology, 2, pp. 161-165 (1984).
Zlepšené metódy hybridizácie podľa vynálezu boli aplikované na DNA/DNA, je možné ich aplikovať však tiež na RNA/RNA a RNA/DNA. Zmesové vzorky môžu umožniť veľké zlepšenie hybridizácie s rýchlejšou izoláciou polynukleotidu. Môže ísť napríklad o zlepšený prenos kolónií, o použitie filtrov, podložených nylonom, napríklad GeneScreen a GeneScreen Plus, ktoré dovoľujú opakované použitie, použitie nových proteáz podľa publikácie Taub a ďalšie, Anál. Biochem, 126, str. 222 až 230 (1982), použitie veľmi nízkych koncentrácií rádovo 0,025 pikomolov celého radu zmesových vzoriek, napríklad s obsahom viac ako 32 odlišných sledov a uskutočňovanie hybridizácie a ďalšieho spracovania za obmedzujúcich podmienok, tzn. 4, výhodne 2 °C od najnižšej vyrátanej teploty pre každú vzorku. Tieto zlepšenia môžu zaistiť výsledky, ktoré nebolo možné skôr očakávať. Je teda zrejmé, že zlepšenie, dosiahnuté spôsobom podľa vynálezu, je veľmi podstatné vzhľadom na to, že zmesové vzorky, ktoré obsahujú štvornásobný počet rôznych sledov, v porovnaní s tým, čo bolo až dosiaľ vykonané, bolo možné s úspechom použiť na izoláciu jediného sledu génu zo zmesi, ktorá obsahovala 1 500 000 povlakov fágu. Tento výsledok bol dosiahnutý v podstate súbežne s publikovaným názorom Andersona a ďalších v uvedenom článku, totiž že „ ... tento spôsob je nepraktický a neprevediteľný pre izoláciu génu pre bielkoviny cicavcov v prípade, že nie je k dispozícii zodpovedajúca RNA“.The improved hybridization methods of the invention have been applied to DNA / DNA, but can also be applied to RNA / RNA and RNA / DNA. Mixed samples can allow great improvement in hybridization with faster isolation of the polynucleotide. These may include, for example, improved colony transfer, the use of nylon-based filters such as GeneScreen and GeneScreen Plus that allow reuse, the use of novel proteases according to Taub et al., Anal. Biochem., 126, p. 222-230 (1982), the use of very low concentrations of the order of 0.025 picomoles of a number of mixed samples, for example containing more than 32 different sequences, and carrying out hybridization and further processing under restrictive conditions, i. 4, preferably 2 ° C from the lowest calculated temperature for each sample. These improvements can deliver results that could not have been expected earlier. Thus, it is clear that the improvement achieved by the method of the invention is very important given that the mixed samples containing four times the number of different sequences, compared to what has been done hitherto, could be successfully used to isolate a single sequence gene from a mixture containing 1,500,000 phage coatings. This result was achieved essentially in parallel with the published opinion of Anderson et al. In that article that "... this method is impractical and inconvenient for the isolation of the mammalian protein gene in the absence of the corresponding RNA".
Claims (31)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65584184A | 1984-09-28 | 1984-09-28 | |
| US06/675,298 US4703008A (en) | 1983-12-13 | 1984-11-30 | DNA sequences encoding erythropoietin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK443885A3 SK443885A3 (en) | 1999-06-11 |
| SK279959B6 true SK279959B6 (en) | 1999-06-11 |
Family
ID=27097052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK4438-85A SK279959B6 (en) | 1984-09-28 | 1985-06-18 | Dna sequence, a plasmid, vector, host cell, polypeptide of an erythropoietin-type, method of its production and pharmaceutical composition based thereon |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1016795B (en) |
| CZ (1) | CZ281542B6 (en) |
| FI (1) | FI93470C (en) |
| GE (1) | GEP19991639B (en) |
| GR (1) | GR852245B (en) |
| HU (1) | HU204889B (en) |
| NO (1) | NO852384L (en) |
| PT (1) | PT81213B (en) |
| SK (1) | SK279959B6 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106608906A (en) * | 2015-10-22 | 2017-05-03 | 天津药物研究院有限公司 | Preparation of annular polypeptide with function of stimulating erythrocyte generation and application thereof |
-
1985
- 1985-06-13 NO NO852384A patent/NO852384L/en unknown
- 1985-06-14 FI FI852377A patent/FI93470C/en not_active IP Right Cessation
- 1985-06-18 HU HU852404A patent/HU204889B/en unknown
- 1985-06-18 CZ CS854438A patent/CZ281542B6/en not_active IP Right Cessation
- 1985-06-18 SK SK4438-85A patent/SK279959B6/en unknown
- 1985-06-19 CN CN85106191A patent/CN1016795B/en not_active Expired
- 1985-09-16 GR GR852245A patent/GR852245B/el unknown
- 1985-09-27 PT PT81213A patent/PT81213B/en unknown
-
1993
- 1993-07-09 GE GEAP1993984A patent/GEP19991639B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT81213B (en) | 1987-09-30 |
| FI852377A0 (en) | 1985-06-14 |
| FI93470B (en) | 1994-12-30 |
| NO852384L (en) | 1986-04-01 |
| FI93470C (en) | 1995-04-10 |
| GEP19991639B (en) | 1999-03-23 |
| CN85106191A (en) | 1987-07-29 |
| CZ443885A3 (en) | 1996-09-11 |
| CN1016795B (en) | 1992-05-27 |
| FI852377L (en) | 1986-03-29 |
| HUT40694A (en) | 1987-01-28 |
| CZ281542B6 (en) | 1996-11-13 |
| HU204889B (en) | 1992-02-28 |
| SK443885A3 (en) | 1999-06-11 |
| GR852245B (en) | 1986-01-17 |
| PT81213A (en) | 1985-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5547933A (en) | Production of erythropoietin | |
| US4703008A (en) | DNA sequences encoding erythropoietin | |
| CA1339047C (en) | Production of erythropoietin | |
| EP0668351B1 (en) | Erythropoietin analogs | |
| FI113372B (en) | Method for Preparation of a LIF Polypeptide (LIF = Leukemia Inhibiting Factor) | |
| AU629176B2 (en) | Recombinant fibroblast growth factors | |
| SK279959B6 (en) | Dna sequence, a plasmid, vector, host cell, polypeptide of an erythropoietin-type, method of its production and pharmaceutical composition based thereon | |
| RU2261276C2 (en) | Isolated dna molecule encoding human erythropoietin (variants), expressing plasmid or viral dna-vector, glycoprotein erythropoietin (variants) and method for its preparing, pharmaceutical composition (variants), mammalian cell line (variants) | |
| CA1341607C (en) | Production of erythropoietin | |
| AU4252400A (en) | Production of erythropoietin | |
| DK172611B1 (en) | DNA sequence encoding erythropoietin, vector which includes the sequence, host which is transformed or transfected with the sequence, polypeptide product of the expression of the sequence in such a host, process for preparing the polypeptide product, a pharmaceutical preparation which comprises the polypeptide product, and the use of the polypeptide product for producing a pharmaceutical for erythropoietin therapy. | |
| AU1974001A (en) | Production of erythropoietin | |
| LT4012B (en) | Process for the preparation of polipeptides | |
| DD251786A5 (en) | Process for the preparation of a polypeptide |