SK286776B6

SK286776B6 - Amycomycin, spôsob jeho prípravy a farmaceutická kompozícia, ktorá ho obsahuje

Info

Publication number: SK286776B6
Application number: SK787-2002A
Authority: SK
Inventors: Cordula Hopmann; Michael Kurz; Heinrich Decker; Beller Dominique Le; Jozsef Aszodi
Original assignee: Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-11-25
Publication date: 2009-05-07
Also published as: HRP20020497A2; HUP0203593A3; KR20020063205A; DE60021109D1; IL149904A0; SI1237866T1; US6642391B2; HRP20020497B1; JP4750993B2; HUP0203593A2; AU2001901A; US20010018450A1; ES2243332T3; IL149904A; CA2393518C; EP1106604A1; EP1237866A1; RU2002118116A; BR0016223A; DE60021109T2

Abstract

Amycomycin, zlúčenina vzorca (I), a jeho farmaceuticky prijateľné soli a deriváty vo všetkých ich stereoizomérnych a tautomérnych formách, ktorý je možné získať kultiváciou mikroorganizmu Amycolatopsis sp. a môže sa použiť ako liečivo, hlavne ako antibiotikum.

Description

Predkladaný vynález sa týka zlúčeniny nazvanej amycomycin, ktorú je možné získať kultiváciou mikroorganizmov Amycolatopsis sp., ST101170 (DSM 12216), a jej farmaceutický prijateľných solí a derivátov. Ďalej sa predkladaný vynález týka spôsobu prípravy amycomycinu, použitia amycomycinu a jeho farmaceutický prijateľných soli a derivátov ako liečiv, hlavne ich použitia ako antibiotík, a farmaceutických kompozícií obsahujúcich amycomycin alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ alebo derivát.

Doterajší stav techniky

O infekciách spôsobených kmeňmi Staphylococcus aureus rezistentnými proti meticilínu je známe, že prevládajú pri určitých stavoch, ako napr. ranách a popáleninách. Vankomycín a teikoplanín, ktoré patria do glykopeptidovej skupiny antibiotík, sú jedinými dvomi antibiotikami klinicky používanými na liečbu infekcií spôsobených kmeňmi Staphylococcus aureus rezistentnými proti teikoplanínu, sa tieto infekcie považujú sa nebezpečné a smrteľné. Preto začalo intenzívne hľadanie štrukturálne odlišnej skupiny zlúčenín účinnej proti týmto kmeňom rezistentným proti vankomycínu a teikoplanínu. Skôr bol, ako antibiotikum účinné proti kmeňom rezistentným proti vankomycínu a teikoplanínu, opísaný napríklad cyklický tiopeptid metylsulfomycín I (EP-A-0818539 zo dňa 11. júla 1996).

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, že nová zlúčenina nazvaná amycomycin má antibiotickú účinnosť. Predkladaný vynález sa preto týka zlúčeniny vzorca:

a jej farmaceutický prijateľných soli a derivátov, ako sú estery a étery, čo zahŕňa aj všetky stereoizoméme formy a všetky tautomérne formy.

Amycomycin obsahuje charakteristický zvyšok kyseliny tetramovej s vysoko oxygenovaným bočným reťazcom obsahujúcim 45 uhlíkových atómov. Ich molekulový vzorec je C₆5H|_I5NO₁₈, dá sa získať kultiváciou mikroorganizmu Amycolatopsis species ST101170 (DSM 12216) v aeróbnych podmienkach v živnom médiu obsahujúcom zdroje uhlíka a dusíka, nasledovnej izolácii a purifikácii známymi spôsobmi. Mikroorganizmus STÍ01170 patrí do raáviActinomycetales, rodu Amycolatopsis a bol uložený 4. júna 1998 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Braunschweig, Nemecko a bolo mu udelené číslo DSM č. 12216.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob prípravy zlúčeniny nazvanej amycomycin pomocou mikroorganizmu Amycolatopsis species STÍ 01170, jeho mutáciou a variáciou, v aeróbnych podmienkach v živnom médiu obsahujúcom jeden alebo viac zdrojov uhlíka a jeden alebo viac zdrojov dusíka a prípadne živné anorganické soli a/alebo stopové prvky, následnou izoláciou uvedenej zlúčeniny a purifikáciou obvyklými spôsobmi.

Mutácia a variácia mikroorganizmu ST101170 môžu byť takisto schopné syntetizovať zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu. Tieto mutácie je možné vytvoriť známymi spôsobmi pomocou fyzikálnych prostriedkov, napríklad žiarenia, ako sú ultrafialové žiarenie a lúče X, alebo pomocou chemických mutagénov, ako sú etylmetylansulfonát (EMS), 2-hydroxy-4-benzofenón (MOB), alebo ŕV-metyl-7V'-nitro-7V-nitrózoguanidín (MNNG).

Vyhľadávanie vhodných mutácií a variácií, ktoré môžu vytvárať zlúčeninu podľa predkladaného vynále zu, je možné uskutočňovať pomocou stanovovania biologickej účinnosti účinných zlúčenín hromadiacich sa v kultivačnom roztoku, napríklad pomocou testovania antibakteriálneho účinku, hlavne proti kmeňom rezistentným proti vankomycínu (pozri tabuľka 2).

Výhodnými zdrojmi uhlíka vhodnými na aeróbnu fermentáciu sú asimilovateľné uhľovodíky a cukomé alkoholy, ako sú glukóza, laktóza alebo D-manitol, a rovnako aj prírodné produkty obsahujúce uhľovodíky, ako je sladový výťažok. Vhodnými zdrojmi dusíka sú napríklad aminokyseliny, peptidy a proteíny, čo zahŕňa aj ich degradačné produkty, ako sú peptóny a tryptóny, mäsový výťažok, mleté semená, napríklad kukurice, bielej fazule, sóje alebo bavlníka, destilačné zvyšky z výroby alkoholu, mastná močka a kvasnicové extrakty, ale tiež amóniové soli a nitráty. Vhodnými anorganickými soľami, ktoré môže živný roztok obsahovať, sú napríklad chloridy, uhličitany, sírany a fosforečnany alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín, iónov, zinku, kobaltu alebo horčíka.

Tvorba amycomycinu prebieha obzvlášť dobre napríklad v živnom médiu obsahujúcom približne 0,5 až 5 % škrobu (rozpustného), výhodne 1 až 2 %, približne 0,5 až 5 % glukózy, výhodne 1 až 3 %, približne 0,5 až 5 % glycerínu, výhodne 1 až 2 %, približne 0,1 až 0,5 % kukuričného výluhu, výhodne 0,2 až 0,3 %, približne 0,2 až 1 % peptónu, výhodne 0,4 až 0,6 %, približne 0,1 až 0,5 % kvasnicového extraktu, výhodne 0,2 až 0,4 %, približne 0,05 až 0,2 % chloridu sodného, výhodne 0,1 až 0,2 % a približne 0,1 až 0,5 % uhličitanu vápenatého, výhodne 0,2 až 0,3 %. Tieto množstvá sú hmotnostné a vzťahujú sa na celé živné médium.

Kultivácia STÍ01170 sa uskutočňuje v aeróbnych podmienkach, napríklad submerzne pomocou pretrepávania alebo miešania v pretrepávacích nádobách alebo laboratórnych fermentačných nádobách, prípadne so zavedením vzduchu alebo kyslíka. Kultivácia sa pomocou fermentácie môže uskutočňovať napríklad v sterilných nádobách so širokých hrdlom alebo nádobách s kruhovým dnom rozličných objemov, v sklenených fermentačných nádobách alebo V₂A-oceľových nádržiach.

Kultivácia ST101170 sa môže uskutočňovať pri teplotách, ktoré sa pohybujú približne medzi 20 a 35°C, výhodne medzi približne 25 a približne 30°C, a pH pohybujúcom sa medzi 4 a 10, výhodne medzi 6 a 8. V týchto podmienkach sa mikroorganizmy kultivujú obvykle počas 20 až 200 hodín, výhodne 24 až 150 hodín.

Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v niekoľkých stupňoch. Najskôr sa môže pripraviť jedna alebo viac predkultúr v kvapalnom živnom médiu. Hlavná kultúra, t. j. aktuálne produkčné médium sa potom inokuluje predkultúrou napríklad v objemovom pomere 1 : 10. Predkultúra sa získa napríklad inokuláciou živného média sporifikovaným mycéliom a kultiváciou počas približne 20 až 120 hodín, výhodne 24 až 90 hodín. Sporifikované mycclium sa môže získať napríklad rastom mikroorganizmov počas približne 1 až 40 dní, výhodne 5 až 12 dní, na pevnom alebo kvapalnom živnom médiu, ako je kvasnicovo-sladový agar alebo zemiakovodextrózový agar.

Priebeh fermentácie a tvorbu amycomycinu je možné monitorovať spôsobmi odborníkovi známymi, ako napríklad pomocou merania biologickej aktivity kultivačného roztoku v bioanalýzach alebo pomocou chromatografických metód, ako sú tenkovrstvová chromatografia (DC) alebo vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

Zlúčenina nazvaná amycomycin sa nachádza v kultivačnom filtráte a rovnako aj v mycéliu. Obyčajne sa však významné množstvo nachádza v mycéliu. Zlúčenina sa môže izolovať pomocou známych separačných techník. Z kultivačného filtrátu sa teda môže získať napríklad filtráciou alebo odstreďovaním. Filtrát je možné získať pomocou rozpúšťadla nemiešateľného s vodou, ako sú 1 -butanol, etylacetát, chloroform, dichlórmetanol a pod., výhodne butanol alebo etylacetát.

Extrakciu kultivačného filtrátu je možné uskutočňovať v širokom rozmedzí pH. Je však výhodné uskutočňovať extrakciu v neutrálnom alebo slabo kyslom prostredí, výhodne pri pH pohybujúcom sa medzi 4 a 9. Organický extrakt je možné koncentrovať vo vákuu a sušiť za vzniku účinnej surovej látky.

Izolácia a purifikácia zlúčeniny nazvanej amycomycin sa môže uskutočňovať známymi spôsobmi, ktoré berú do úvahy chemické, fyzikálne a biologické vlastnosti prírodnej zlúčeniny.

Jednou z metód izolácie amycomycinu podľa vynálezu je delenie roztoku spôsobmi, ktoré samy osebe sú známe.

Inou metódou purifikácie amycomycinu je chromatografia na adsorpčných živiciach ako Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), na Amberlite® XAD 7 (Rohmand Haas, USA), na Amberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA) alebo na podobných živiciach. Separácia sa môže uskutočňovať v širokom rozmedzí pH. Výhodné je toto rozmedzie pH 1 až 9, výhodnejšie je 2 až 8. Vhodné sú aj početné nosiče na chromatografiu s reverznou fázou, napríklad RP_g a RPig, ktoré boli publikované v spojení s vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). Ďalšia z možností purifikácie zlúčeniny podľa vynálezu spočíva v použití tzv. nosičov na chromatografiu s normálnou fázou, ako sú silikagél alebo A1₂O₃ (oxid hlinitý) alebo iné, spôsoby, ktoré sú samy osebe známe. Na tento účel sú vhodné mnohé eluenty, ako sú dichlórmetán, chloroform, metanol, etylacetát, acetón, petroléter alebo ich kombinácia. Hodnotu pH je možné upravovať napríklad pridaním trietylamínu.

Alternatívnym spôsobom izolácie zlúčeniny nazvanej amycomycin je použitie molekulárnych sít, ako sú

Fractogel® TSK HW-40, Sephadex® LH-20 a iné, spôsoby, ktoré sú samy osebe známe. Ďalej je takisto možné získať zlúčeninu nazvanú amycomycin zo surového materiálu kryštalizáciou. Na to sú vhodné napríklad organické rozpúšťadlá a ich zmesi, bezvodé alebo s prídavkom vody.

Ďalším spôsobom izolácie a purifikácie zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu spočíva v použití aniónových meničov, výhodne v rozmedzí pH 7 až 10, a katiónových meničov, výhodne v rozmedzí pH od 3 do 7. Obzvlášť vhodné na tento účel je použitie tlmivých roztokov, ku ktorým sa pridá určité množstvo organického rozpúšťadla.

Ďalším možným spôsobom purifikácie je protismemá chromatografia s použitím dvojfázových elučných systémov zhotovených z dvoch alebo viacerých rozpúšťadiel, ako sú voda, metanol, etanol, butanol, izopropanol, acetón, dichlórmetán, etylacetát alebo petroléter.

Zlúčeninu nazvanú amycomycin alebo jej chemické deriváty je možné premeniť na zodpovedajúce farmakologicky prijateľné soli spôsobmi odborníkovi v odbore známymi.

Farmakologicky prijateľnými soľami zlúčenín podľa vynálezu sú anorganické soli alebo organické soli ako napríklad tie opísané vRemington's Pharmaceutical Sciences (17. vydanie, str. 1418, 1985). Možnými soľami sú soli alkalických kovov, amóniové soli, soli kovov alkalických zemín, soli s fyziologicky prijateľnými amínmi a soli s anorganickými a organickými kyselinami, ako sú kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselina maleínová a kyselina fumarová.

Medzi deriváty amycomicinu patria aj odvoditeľné chemické ekvivalenty zlúčenín podľa tohto vynálezu, ktorými sú zlúčeniny s drobnými chemickými odlišnosťami, ktoré však majú zhodné alebo podobné účinky, alebo zlúčeniny, ktoré je možné ľahko premeniť na zlúčeniny podľa vynálezu. Príklady odvoditeľných ekvivalentov sú estery, étery, aminoderiváty, komplexy alebo addukty zlúčenín podľa vynálezu alebo so zlúčeninami podľa vynálezu.

Estery sa môžu pripraviť napríklad reakciou amycomycinu s karboxylovými kyselinami v prítomnosti činidiel, ako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC), alebo podrobením tejto zlúčeniny pôsobeniu acylačného činidla, ako je chlorid kyseliny.

Étery je možné z amycomycinu pripraviť napríklad reakciou s alkylačnými činidlami v bázických podmienkach.

Ďalšie spôsoby prípravy esterov a éterov sú opísané v literatúre, napríklad v Advanced Organic Synthesis, 4. vydanie, J. March, John Wiley & Sons., 1992.

Chemickými ekvivalentmi môžu byť stabilné komplexy s iónmi kovov, napr. prechodných kovov, ako sú La³, Sm³⁺, Eu³⁺, Gd³⁺, ktoré sú typické pre deriváty kyseliny tetramovej a je možné ich pripraviť spôsobmi opísanými v literatúre (K. Tanaka a kol., Chem. Pharm. Bull. 1979, 27, 1901, K. Matsuo, Chem. Pharm. Bull. 1980,28, 2494).

Dvojité väzby bočných reťazcov sa môžu redukovať spôsobmi, ktoré sú opísané v literatúre, napríklad v P. N. Rylander, „Hydrogenation Methods“, Academic Press, New York, 1985, kapitola 2, alebo je možné ich hydrohalogenovať spôsobmi opísanými v H. O. House, „Modem Synthetic Reactions, W. A. Benjymin, Inc., New York, 1972, str. 446 až 452. Hydroxylované deriváty sa môžu pripravovať reakciou dvojitých väzieb s činidlami ako je OsO₄, ako je opísané v literatúre, napr. v Chem. Rev. 1980, 80, 187.

Deriváty je možné vytvoriť tiež konverziou dvojitých väzieb na cpoxidy pomocou oxidácie, napr. m-chlorperoxybenzoovou kyselinou (MCPBA), ako je opísané v Advanced Organic Synthesis, 4. vydanie,

J. March, John Wiley & Sons., 1992.

Fyzikálno-chemické a rovnako aj spektroskopické charakteristiky zlúčeniny nazvanej amycomycin podľa predkladaného vynálezu sú nasledujúce:

Vzhľad: bezfarebná pevná látky, rozpustná v metanole, dimetylsulfoxide (DMSO), pyridíne Molekulový vzorec: C_6íH|₁₅NO_h

HPLC (vysokoúčinná kvapalinová chromatografia): Stĺpec: Purospher Star RP.18e (Merck), 55 x 4 mm, 3 pm Eluent: CH₃CN/0,01 % H₃PO₄ (85%)

Gradient:

Čas (min.)	% ch₃cn
0,00	5,0
3,00	95,0
5,00	95,0
6,00	5,0
10,00	5,0

Tok: 2 ml/min.

Teplota: 40 °C

Detekcia: 210 nm, 254, 280, 320, 380 t_R: 2,67 min.

Molekulová hmotnosť: 1198,64

Hmotnostná spektrometria (HR-FAB-MS): 1220,801187 [M+Na]⁺ 'H- a ^l3C-NMR: viď tabuľka 1

U V/VIS (viditeľné svetlo):

metanol (MeOH), _max(log) = 229 nm (3,29), 281 (3,16)

Tabuľka 1

Chemický posun amycomycinu v deuterometanole (MeOD) pri 300 K

		¹³c

1	0.86	14.76
2	fr97	20.83
3	1.89	31.20
4	3.41	82.20
5	1.70	39.55

6	0.77	13.63
7	3.54	80.19
8	1.65	36.32
9	0.86	12.71
10	1.43	31.20
11	1.44	36.46
12	3.75	71.98
13	1.62/1.54	44.79
14	3.74	72.22
15	1.58/1.37	36.46
16	1.63/1.14	29.27
17	1.51	40.69
18	0.90	15.70
19	3.70	72.90
27	1.51/1.46	42.12
28	4.07	66.31
29	1.52	42.12
30	3.80	72.54
31	4.33	73.26
32	6.62	142.18
33	-	138.47
34	1.83	12.75
35	-	206.04
36	4.21	41.00
37	1.14	17.77
38	5.36	128.37
39	-	138.72
40	1.69	12.75
41	3.98	80.54
42	1.64	41.25
43	0.88	8.02

44	3.59	73.88
45	1.49	36.46
46	1.62/1.32	23.50
47	1.55/1.32	33.34
48	3.80	75.09
49	1.74	42.71
50	0.77	11.92
51	3.41	77.87
52	1.61	36.46
53	0.86	12.75
54	1.55/1.32	31.37
55	1.61/1.44	36.46
56	3.77	71.83
57	1.67	44.53
58	3.92	71.12
59	2.30	37.54
60	5.84 (b)	-131.7 (c)
61	-	(c)
62	1.82	13.81
63	-	(c)
64	-	(C)
65	3.24 (b)	27.91
66	-	(c)
67	-	(c)
68	-	(c)
69	5.50 (b)	-119.3 (c)
70	3.09	26.52
71	1.10	24.31
72	1.10	24.31

b) široké signály

c) Tieto signály nie sú viditeľné. C60 a C69 je možné určiť len spektrom HMQC.

Amycomycin má mimoriadne antibakteriálne účinky, hlavne proti grampozitívnym baktériám, ako sú napríklad stafylokoky a enterokoky. Minimálne mhibičné koncentrácie amycomycinu proti širokému spektru baktérií sú uvedené v tabuľke 2. U týchto kmeňov sa hlavne v poslednom čase stále viac ukazuje, že sú kmeňmi problematickými, t. j., že sú mikroorganizmy, ktoré sa stali rezistentnými proti existujúcim antibiotikám. Lepšie účinky zlúčeniny podľa vynálezu v porovnaní s inými antibiotikami ukazuje napríklad inhibí10 cia kmeňov rezistentných proti vankomycínu a teikoplanínu, ako sú napríklad E. faecalis, E. Faecium alebo E. gallinarium.

Grampozltivny kmeň	Kód	Amycomycin	Vanccmycin
S.aureus	011HT3	oxa S ery S	0.03	0.3
S.aureus	011HT18	ATCC 1.3709 Smitfi	0.08	0.3
S.epidermidis	012G020	oxa S ery S tet R	0.3	0.6
S.aureus	011HT1	nov R	<=0.04	0.08
S.aureus	011DU5	nov R tet R	0.08	0.15
S.aureus	011CB20	oxa R ery Rc tet R	0.08	0.15
S.aureus	011GO71	ofl S oxa R ery S tet R	0.15	0.6
S.aureus	011GO64	ofl R oxa R ery Rc tet R	0.3	1.2
S.epidermidis	012GO42	oxa R	0.3	1.2
Staph.coag. negatíve	012HT5	ofl R oxa R tet R	0.15	0.5
S.aureus	011GR91	pri R oxa R ery R nov R	1.2	1.2
S.pyogenes	O2A1SJ1	van S ery Rc	0.3	0.15
S.pyogenes	O2A1UC1	van S ery S	0.6	0.15
S.pyogenes	O2A1F15	ery R	0.6	0.08
Sírepto gr.G	O2G0CB2	tet R ríf R nov R	0.6	0.15
S.pneumoniae	030BI2	ery R	0.15	0.15
S.milleri	O2milGR12	ery S van S	1.2	0.3
S.mitis	O2mitGR16	ery Ri van S	1.2	0.3
E.faecium	O2D3AP9	nov S van R ery S tei R	06	>40
E.faecium	O2D3HT12	tei R van R ery R tet R	06	>40
E.faecium	O2D3IP2	tei R van R ery R tet R	ND	>40
E.faecium	O2D3HM3	nov S van A ery R tei R	1.2	>40
E.gallinaríum	O2D0HM8	van C tet R ery S	1.2	>40
E.faecalís	O2D2HM9	nov R van B ery R tei S	2.5	>40
E.faecalis	O2D2UC5	ATCC 29212 nov R	2.5	2.5
E.faecalís	O2D2DU18	tet R nov R	1.2	0.3
E.faecalis	O2D2HT10	nov R van S tet R	1.2	0.6
iramnegacivne krr.ene	Kód
E.coli	DB10 250IP5	ery S fuc S nov S	NO	>40
P.aeruginosa	1771 391HT2		>40	>40
P.aeruginosa	1771m 391HT3	prístupný mutant	>40	>40

Amycomycin a jeho farmaceutický prijateľné soli a deriváty sa môžu podávať zvieratám, výhodne cicavcom, a hlavne ľuďom ako farmaceutiká samotné, v zmesiach s inými liečivami, a vo forme farmaceutických 5 kompozícií, ktoré umožňujú parenterálne alebo iné spôsoby podávania. Preto sa predkladaný vynález takisto týka amycomycinu a jeho farmaceutický prijateľných solí a derivátov na použitie ako liečivo, a použitie amycomycinu a jeho farmaceutický prijateľných solí a derivátov na prípravu liečiv s antibakteriálnymi účinkami. Predkladaný vynález sa ďalej týka farmaceutických kompozícií obsahujúcich účinné množstvo amycomycinu a/alebo jednej lebo viacerých jeho farmaceutický prijateľných solí a/alebo jeho derivátov, spoločne 10 s farmaceutický prij ateľným nosičom.

Amycomycin je možné podávať enterálne (orálnou cestou), patenterálne (intravenózne alebo intramuskuláme), rektálne či lokálne (topicky). Farmaceutické kompozície obsahujúce amycomycin alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ alebo jeho derivát s ďalšími farmaceutický účinnými látkami sa môžu pripraviť zmiešaním účinných zlúčenín s jednou alebo viacerými farmakologicky tolerovanými pomocnými látkami a/alebo 15 excipientmi, a potom prevedením zmesi do vhodnej farmaceutickej formy vhodnej na podávanie, ako sú roztoky, prášky (tablety, kapsuly vrátane mikrokapsúl), masti (krémy alebo gély), lipozómové prípravky, lipido7 vé komplexy, koloidné disperzie alebo čapíky.

Možnými pomocnými látkami a/alebo excipientmi na prípravky tohto typu sú farmaceutické, kvapalné alebo pevné plnidlá a extendery, rozpúšťadlá, emulzifikátory, lubrikanty, činidlá upravujúce chuť, farbivá a/alebo tlmiace látky.

Ako je obvyklé, konkrétny galenický prípravok a konkrétny spôsob podávania a rovnako aj konkrétne rozmedzie dávok, ktorc sú vhodné v určitom prípade, závisí od druhu, ktorý sa má liečiť, a od štádia dotyčného stavu alebo ochorenia, a je možné optimalizovať spôsobmi v odbore známymi. Ako príklad môže byť vhodná dávka pohybujúca sa v rozmedzí 0,001 až 10 mg, výhodne 0,1 až 5 mg, výhodnejšie 1,0 mg, na telesnú hmotnosť približne 75 kg. Dávka by mala byť dostatočná aspoň na dosiahnutie požadovaného účinku.

Nasledujúce príklady uskutočnenia predkladaného vynálezu slúžia na ilustráciu vynálezu, a v žiadnom prípade nijako neobmedzujú jeho rozsah.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava očkovacieho materiálu

100 ml živného roztoku (4 g/1 kvasnicového extraktu, 15 g/1 rozpustného škrobu, 1 g/1 K₂HPO₄, 0,5 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, doplnené vodou na 1000 ml, pH 7,0 pred sterilizáciou) v sterilnej 300 ml Erlenmeyerovej banke sa inokuluje kmeňom Amycolatopsis sp. (DSM 12216) a potom inkubuje počas 5 dní pri 28 °C a na rotačnom pretrepávadle pri 180 otáčkach za minútu. Následne sa 1,5 ml tejto kultúry rozriedi 1,5 ml 99 % glycerínu a uchováva pri 20 °C.

Príklad 2

Príprava kultúry alebo predkultúry Amycolatopsis sp., STÍ01170 (DSM 12216) v Erlenmeyerovýchbankách

Sterilná Erlenmeyerova banka obsahujúca 100 ml nasledujúceho živného média: 10 g/1 roztoku škrobu, 10 g/1 glukózy, 10 g/1 99 % glycerínu, 2,5 g/1 kukuričného výluhu, 5 g/1 peptónu, 2 g/1 kvasnicového extraktu, 1 g/1 NaCI a 3 g/1 CaCO₃, sa inokuluje kľučkou s narastenou kultúrou (rovnaký živný roztok, ale s 2 % agaru) alebo 1 ml glycerínovej kultúry (pozri príklad 1), a potom sa inkubuje na pretrepávadle pri 180 otáčkach za minútu a 28 °C. Maximálna tvorba zlúčeniny nazvanej amycomycin sa dosiahne po 72 hodinách.

Submerzná kultúra stará 72 hodín (pripravená podľa spôsobu opísaného na pretrepávané kultúry, príklad 1, ale s nasledujúcim médiom: 15 g/1 glukózy, 15 g/1 sójovej múčky, 3 g/1 CaCO₃ a 5 g/1 NaCI, pH 7,5) postačuje na inokuláciu 10 a 200 1 fermentačných nádob pri mokulačnom množstve 10 %.

Príklad 3

Príprava zlúčeniny nazvanej amycomycin

V 200 1 fermentačnej nádobe sa spustí fermentácia s nasledujúcimi parametrami:

Živné médium:	10 g/1 škrobu 10 g/1 glukózy 10 g/1 99 % glycerínu 2,5 g/1 kukuričného výluhu 5 g/1 peptónu 2 g/1 kvasnicového extraktu 7 g/1 NaCI 3 g/1 CaCO₃ pH 7,2 (pred sterilizáciou)
Inokulum:	10 % objemu fermentačnej nádoby
Inkubačný čas:	60 až 80 hodín
Inkubačná teplota:	28 °C
Pretrepávanie:	50 otáčok za minútu
Prevzdušňovanie:	1501/min.

Pridaním 1 až 2 ml etanolového polyolového roztoku sa môže obmedziť tvorenie peny. Maximálna tvorba sa dosiahne po 69 hodinách.

Príklad 4

Izolácia zlúčeniny nazvanej amycomycin

200 ml roztoku kultúry získaného v príklade 3 sa odstred’uje a mycélium sa úplne extrahuje pomocou metanolu. Metanolový extrakt sa potom koncentruje na pomer približne 1 ku 10 a získa sa bezfarebný precipitát, ktorý sa vyfiltruje. Táto procedúra sa opakuje, kým je možné látku nazvanú amycomycin detegovať vo filtráte (HPLC). Zvyšok sa suší zmrazením a následne purifikuje pomocou HPLC:

L Stĺpec: Eluent:	Fractogel® TSK-HW 40 (4 1, 500x100 mm) metanol
Rýchlosť toku:	20 ml/min.
Detekcia:	204 a 236n nm

Frakcie obohatené amycomycinom eluujú po 125 minútach. Frakcie sa spoja na základe HPLC (v podmienkach uvedených predtýmto). Spojené účinné frakcie s požadovanou zlúčeninou sa koncentrujú vo vákuu

a sušia mrazením. 2. Stĺpec: Eluent:	Fractogel® TSK-HW 40 (1 1, 500x50 mm) metanol
Rýchlosť toku:	5 ml/min.
Detekcia:	204 a 236 nm

Účinná zložka nazvaná amycomycin sa eluuje po 112 minútach.

Z 200 1 fermentačného živného roztoku je možné podľa už uvedených spôsobov získať 110 mg amycomycinu.

Claims

1. Zlúčenina vzorca a jej farmaceutický prijateľné soli, estery a étery vo všetkých ich stereoizomémych a tautomérnych formách.

2. Spôsob prípravy zlúčeniny podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu mikroorganizmu Amycolatopsis species ST101170 (DSM 12216) v aeróbnych podmienkach v živnom médiu obsahujúcom zdroje uhlíka a dusíka, následnú izoláciu a purifikáciu zlúčeniny obvyklými spôsobmi.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa konverziu zlúčeniny na farmakologicky tolerovateľnú soľ, ester alebo éter.

4. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, ester alebo éter na použitie ako liečivo.

5. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné množstvo zlúčeniny podľa nároku 1 a/alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ, ester alebo éter a farmaceutický prijateľný nosič.

6. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, ester alebo éter na použitie ako antibiotikum.