SK284245B6

SK284245B6 - Spôsob výroby proteínového hydrolyzátového prostriedku a jeho použitie

Info

Publication number: SK284245B6
Application number: SK1715-97A
Authority: SK
Inventors: Erika Isolauri; Leena Mets�Niitty; Hannu Korhonen; Seppo Salminen; Eeva-Liisa Syv�Oja
Original assignee: Valio Oy
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2004-12-01
Also published as: DK0833649T3; PL185123B1; SK171597A3; JPH11510791A; EE03424B1; EP0833649B1; FI104465B; RO120243B1; AU710126B2; EP0833649B2; DE69625690T3; US7172756B2; US20030113340A1; CN1154506C; KR100494741B1; ATE230606T1; AR003960A1; MX9710109A; NO975832D0; AU6127896A

Abstract

Spôsob prípravy proteínového hydrolyzátového prostriedku na tlmenie hypersenzitívnych reakcií a podporu imunitnej bariéry v črevách pozostáva z krokov hydrolýzy potravinových proteínov enzýmami odvodenými od bakteriálneho prípravku obsahujúceho kmeň Lactobacillus GG (ATCC 53103) a s pepsínom a/alebo trypsínom. Proteínový hydrolyzát sa používa najmä na potláčanie hypersenzitívnych reakcií vyvolaných jedlom, na podporu imunitnej bariéry v črevách a na prevenciu alebo liečenie alergií, najmä alergie na kravské mlieko u detí, odbúravaním kravského mlieka vhodnou probiotickou baktériou odvodenou z gastrointestinálneho traktu, najmä Lactobacillus GG (ATCC 53103).ŕ

Description

Predkladaný vynález sa týka spôsobu prípravy proteínového hydrolyzátového prostriedku na potláčanie hypersenzitivnych reakcií vyvolaných jedlom u pacientov, ktorí trpia alergiou najedlo. Vynález poskytuje aj použitie takto získaného prostriedku na prípravu liečiva na prevenciu alebo liečenie alergií, najmä alergie na kravské mlieko u detí.

Doterajší stav techniky

Alergia na kravské mlieko (cow's milk allergy - CMA) je definovaná ako imunitou spôsobená nepriaznivá reakcia na proteíny z kravského mlieka. Súčasný spôsob liečenia spočíva v úplnom odstránení antigénov z kravského mlieka. U detí s CMA je nevyhnutné, pokiaľ je ľudské mlieko nedostupné, použiť náhradný prostriedok. Hydrolyzovaný prostriedok, založený na kazeíne alebo syrovátke odvodených od kravského mlieka sa používa na poskytnutie zodpovedajúcej výživy so zníženým antigénnym zaťažením. Predbežná tepelná úprava kravského mlieka väčšinou ovplyvní konformáciu proteínov a jednoduchosť ich hydrolýzy. Následná enzymatická hydrolýza pepsínom, trypsínom, extraktmi zo slinivky a z intestinálnej sliznice vnútorností spôsobuje progresívny rozklad postupných epitopov a upravuje prostriedok do menej antigénnej a alergénnej formy.

Vo väčšine prípadov možno hydrolyzované prostriedky odvodené z kravského mlieka bezpečne podávať a tieto prostriedky sú účinné a klinicky a metabolický dobre tolerované. Enzymatická hydrolýza ale nevyhnutne nespôsobí, že je prostriedok nealergénny, pretože optimálny rozsah hydrolýzy nie je známy a v hydrolyzáte boli detegované stopy pôvodných proteínov. Preto musí byť podávanie týchto substituentov deťom s alergiou na kravské mlieko obozretné.

Dosiahnutie kontroly alergického zápalu elimináciou antigénu nebolo uspokojujúce, najmä u pacientov s niekoľkonásobnou alergiou najedlo (Sampson a kol., 1992). Títo pacienti často majú zvýšenú priechodnosť a narušenú funkciu intestinálnej ochrannej bariéry (Majamaa a kol., 1996, Majamaa a Isolauri, 1996). Tým sa zvyšuje riziko vzniku porúch a precitlivelosti na rôzne jedlá. Preto je potrebné na liečenie alergie na kravské mlieko dosiahnuť nový pokrok, ktorý by zlepšil náhradné prostriedky pri CMA.

Intestinálna antigénna manipulácia stanovuje následnú imunitnú reakciu na antigén. Pri normálnom stave sa antigény absorbujú ccz epitel dvoma funkčnými cestami. Hlavná cesta je degradatívna, ktorá znižuje imunogenicitu antigénu. Druhá cesta umožňuje transport intaktných proteínov, ktorý je nevyhnutne potrebný pre antigénne-špecifické imunitné reakcie. Nevhodný spôsob absorpcie zvyšuje proces precitlivenosti (Faergaes a kol., 1995).

Diferenciálna produkcia cytokínov pomocou T-pomocných (T-helper-Th) buniek v priebehu imunitnej reakcie má dôležitý regulačný vplyv na povahu imunitnej reakcie. Cytokínový profil prirodzenej imunitnej reakcie určuje fenotyp následnej špecifickej imunitnej reakcie. Okrem kontrolovanej syntézy IgE, je IL-4 zásadný pre rozvoj a maturáciu fenotypu Th2, charakteristického pre alergický zápal.

Tento proces sa javí byť zásadný pre rozvoj tolerancie na trávené proteíny. Orálna tolerancia je stav antigénno-Specifickej systemickej nereaktivnosti, vyznačujúci sa tým, že dochádza k miestnej antigénno-špecifickej IgA reakcii.

O izolovanom ľudskom intestinálnom kmeni, Lactobacillus kmeň GG (Lactobacillus GG, ATCC 53103) bolo najnovšie dokázané, že podporuje miestne IgA reakcie proti antigénom, na ktoré naráža v priebehu vstupu, a preto pomáha v eliminácii imunity (Isolauri a kol., 1993). Dosiaľ nie je známe, či konkrétne kmene intestinálnych baktérií môžu priamo upravovať imunogenicitu antigénov z jedla a následne tlmiť hypersenzitívne reakcie.

Lactobacily patria do mikrobiálnej flóry zdravých čriev. Predpokladá sa, že Lactobacily pôsobia v intestinálnom trakte súťažením o receptory a výživu proti patogénnym mikróbom na intestinálnej sliznici.

Probiotiká sú mikrobiálne preparáty schopné samostatnej existencie, ktoré podporujú zdravie udržiavaním prirodzenej mikroflóry vo vnútornostiach. Mikrobiálny preparát možno považovať za probiotikum, pokiaľ funkčné mikróby ktoré obsahuje, a spôsob ich účinku sú známe. Probiotiká pôsobia na intestinálnu sliznicu, kolonizujú ľudský intestinálny trakt a bránia pôsobeniu škodlivých mikróbov. Zásadným predpokladom je, že pôsobia na sliznicu vnútorností a nepoškodzujú hornú časť gastrointestinálneho traktu. Lactobacillus GG je jednou zo známych baktérii, ktorá má probiotické charakteristiky.

Podstata vynálezu

Predkladatelia vynálezu zistili, že určité baktérie gastrointestinálneho traktu, najmä Lactobacilly a najmä baktérie, ktoré majú probiotické charakteristiky možno použiť na zlepšenie účinnosti odbúravania potravy a na zlepšenie orálnej tolerancie, v prevencii alebo liečbe hypersenzitívnych reakcií u pacienta, vyvolaných jedlom.

Jedným aspektom predkladaného vynálezu je, že proteínové hydrolyzáty, získané hydrolýzou proteínov uvedenou gastrointestinálnou baktériou, možno tiež použiť na daný účel. Dokázali sme, že proteínové hydrolyzáty získané podľa predkladaného vynálezu majú imunologický vplyv na podporu hypoalergenicity. Hydrolyzáty tlmia hypersenzitívne reakcie a tým zlepšujú imunitnú bariérovú funkciu vnútorností, t. j. stabilizujú vnútomostnú sliznicovú bariéru.

Predkladaný vynález poskytuje zlepšený proteínový hydrolyzátový prostriedok, ktorý tlmí hypersenzitívnu reakciu a zlepšuje imunitnú bariérovú funkciu vnútorností. Hydrolyzátový prostriedok možno získať hydrolýzou proteínov enzýmami, odvodenými od probiotickej gastrointestinálnej baktérie, najmä Lactobacilla, ktoré majú adhezívne a kolonizačné vlastnosti a proteázovým enzýmovým systémom, ktorý je podobný kmeňu Lactobacillus GG (ATCC 53103) a trypsínom a/alebo pepsínom.

Alternatívne možno proteínový hydrolyzátový prostriedok podľa predkladaného vynálezu získať hydrolýzou proteínov trypsínom a/alebo pepsínom, a pridaním k takto získanému hydrolyzátu bakteriálneho prípravku, ktorý obsahuje probiotickú gastrointestinálnu baktériu, najmä Lactobacill, ktorý má adhezívne a kolonizačné vlastnosti a proteázový enzýmový systém, ktorý je podobný kmeňu Lactobacillus GG (ATCC 53103). Baktérie sú pridávané do hydrolyzátového prostriedku výhodne ako lyofilizovaný preparát.

Pri podávaní tohto hydrolyzátového prostriedku pacientovi je potrebné očakávať, že hydrolyzujúce enzýmy prítomných baktérií sa uvoľňujú in vivo, a tak sa dosahuje rovnaký účinok ako so zlepšeným hydrolyzátovým prostriedkom, ktorý už bol definovaný. Navyše, baktérie schop né samostatnej existencie stabilizujú vnútomostnú sliznicovú bariéru a tým zlepšujú lokálnu obranyschopnosť.

Uskutočnením predkladaného vynálezu je spôsob prevencie alebo liečenia hypersenzitívnych reakcií u detí vyvolaných jedlom, pričom tento spôsob zahrnuje krok podávania zlepšeného proteínového hydrolyzátového prostriedku podľa predkladaného vynálezu rizikovým deťom alebo alternatívne proteínového hydrolyzátového prostriedku spolu s bakteriálnym prípravkom, ktorý obsahuje probiotické gastrointestinálne baktérie, najmä Lactobacille, ktoré majú adhezívne a kolonizačné vlastnosti a proteázový enzýmový systém, ktorý je podobný kmeňu Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Ďalším uskutočnením predkladaného vynálezu je spôsob liečenia alergie na kravské mlieko u pacientov, ktorý zahrnuje podávanie zlepšeného proteínového hydrolyzátového prostriedku podľa predkladaného vynálezu pacientovi alebo alternatívne podávanie proteínového hydrolyzátového prostriedku spolu s bakteriálnym prípravkom, ktorý obsahuje probiotické gastrointestinálne baktérie, najmä Lactobacille, ktoré majú adhezívne a kolonizačné vlastnosti a proteázový enzýmový systém, ktorý je podobný kmeňu Lactobacillus GG (ATCC 53103).

Vynález tiež poskytuje spôsob podpory tolerogénnych imunitných reakcií na antigény zjedla u pacienta, ktorý zahrnuje orálne podávanie zlepšeného proteínového hydrolyzátového prostriedku podľa predkladaného vynálezu pacientovi alebo alternatívne bakteriálneho prípravku, ktorý obsahuje probiotické gastrointestinálne baktérie, najmä Lactobacille, ktoré majú adhezívne a kolonizačné vlastnosti a proteázový enzýmový systém, ktorý je podobný kmeňu Lactobacillus GG (ATCC 53103) alebo, alternatívne proteínový hydrolyzátový prostriedok spolu s bakteriálnym prípravkom, ktorý obsahuje probiotické gastrointestinálne baktérie, najmä Lactobacille, ktoré majú adhezívne a kolonizačné vlastnosti a proteázový enzýmový systém, ktorý je podobný kmeňu Lactobacillus GG (ATCC 53103).

V spôsoboch podľa predkladaného vynálezu tak, ako už bolo uvedené, pokiaľ sa proteínový hydrolyzátový prostriedok používa v kombinácii s vybranou probiotickou baktériou, ktorej definícia už bola uvedená, takým prostriedkom teda môže byť akýkoľvek vhodný proteínový hydrolyzátový prostriedok známy alebo nový. Môže ísť o čiastočný proteínový hydrolyzát alebo alternatívne o veľmi hydrolyzovaný prostriedok. Príprava proteínového hydrolyzátu vhodného na tieto účely je opísaná napríklad v európskej patentovej prihláške číslo 601 802.

Preferovaná baktéria, ktorá sa používa v prostriedkoch a spôsoboch podľa predkladaného vynálezu je Lactobacillus GG (ATCC 53103).

V predkladanom opise a pripojených nárokoch znamená fráza „baktérie, najmä Lactobacille, ktoré majú adhezívne a kolonizačné vlastnosti a proteázový anzýmový systém, ktorý je podobný kmeňu Lactobacillus GG (ATCC 53103)“, že definuje baktériu, ktorá má adhezívne a kolonizačné vlastnosti, ktoré sú porovnateľné s kmeňom LGG, napríklad, ako je definované v EP patente 199 535. O týchto baktériách sa tiež predpokladá, že majú rovnaký druh enzýmového systému ako LGG, čo znamená, že enzýmy odvodené od takých baktérií sú schopné odbúravať proteíny, čím vznikajú hydrolyzačné produkty s rovnakými účinkami ako tie, ktoré sa dosiahnu použitím enzýmov odvodených od LGG.

Skratky:

Cl interval spoľahlivosti (confidence interval)

IFN-γ interferón - γ

IgA imunoglobulín A

IgE imunoglobulín E

IL - 4 interleukin - 4

LGG Lactobacillus GG (ATCC 53103)

OKT3 anti - CD3 protilátka

PBMC jednojadrové bunky periférnej krvi (peripheral blood mononuclear cells)

TNF-α tumorový nekrosný faktor - α WF testovacia skupina, ktorá obdržala veľmi hydrolyzovaný syrovátkový prostriedok

WF-GG testovacia skupina, ktorá obdržala veľmi hydrolyzovaný syrovátkový prostriedok a LGG prípravok

P/T-kaseín = kaseín hydrolyzovaný pepsínom a trypsínom, P/T-a_SL-kaseín = a_SL - kaseín hydrolyzovaný pepsínom a trypsínom.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1A až ID

Mitogénom vyvolané proliferatívne reakcie PBMC in vitro na P/T-kaseín (1A), P/T-a_SL-kaseín (IB), P/T-kaseín, navyše hydrolyzovaný LGG odvodenými enzýmami (1C) a P/T-a_SL-kaseín navyše hydrolyzovaný LGG odvodenými enzýmami (ID). Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota počtu za minútu pre kultúry bez hydrolyzovaného produktu (PHA-RPMI1640) a s hydrolyzovaným produktom v troch koncentráciách (0,1 pg/ml, 10 pg/ml a 1000 pg/ml). Horizontálne línie predstavujú geometrický priemer počtu za minútu pri šiestich experimentoch, vyčíslené rovnako pre každý zvlášť.

Obr. 2

Klinické hodnotenie atopickej dermatitídy (SCORAD) u každého pacienta a stredné skóre rozsahu (A), intenzity (B) a subjektívneho hodnotenia (C) pre atopickú dermatitídu pred liečením (0) a o jeden mesiac neskôr (I) u detí, ktoré obdržali veľmi hydrolyzovaný syrovátkový prostriedok bez (WF) a/alebo s Lactobacillus GG (WF - GG).

Obr. 3

Vplyv kaseinu a Lactobacillom GG odbúravaného kaseínu na produkcii IL-4 a IFN-γ v PBMC u atopických pacientov (a, b) a u neatopických zdravých detí (c, d). Biele stĺpiky predstavujú strednú produkciu cytokínu v kontrolných kultúrach; čierne stĺpiky v kultúrach, ktoré obsahujú čistený kaseín; a šrafované stĺpiky v kultúrach obsahujúcich Lactobacillom GG odbúravaný kaseín. Priesečníkové čiary predstavujú horný a dolný kvartil.

Štatisticky významné párové porovnanie oproti kontrolným kultúram

Obr. 4

Vplyv a_SL-kaseínu a Lactobacillom GG odbúravaného a_SL-kaseínu na produkcii IL-4 a IFN-γ v PBMC u atopických pacientov (a, b) a u neatopických zdravých detí (c, d). Biele stĺpiky predstavujú strednú produkciu cytokínu v kontrolných kultúrach; čierne stĺpiky v kultúrach, ktoré obsahujú a_SL-kaseín; a šrafované stĺpiky v kultúrach obsahujúcich Lactobacillom GG odbúravaný a_SL-kaseín. Priesečníkové čiary predstavujú horný a dolný kvartil.

Štatisticky významné párové porovnanie oproti kontrolným kultúram

Nasledovné príklady ďalej ilustrujú vynález. Sú v nich opísané spôsoby prípravy zlepšeného hydrolyzátu rovnako ako experimenty, ktoré dokazujú užitočný terapeutický účinok pozorovaný v predkladaných štúdiách.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Potlačenie lymfocitovej proliferácie in vitro hovädzími kaseínmi, hydrolyzovanými enzýmami odvodenými od Lactobacillus GG.

l.a. Hydrolýza proteínov z kravského mlieka

Celkový hovädzí kaseín a kaseínové zložky (a_SL-kaseín) boli prečistené z kravského mlieka (Syväoja, 1992). Zvlášť na kaseíne a na a_SL-kaseíne bola uskutočnená hydrolýza zmesí enzýmov odvodených od Lactobacillus GG. Enzýmy boli izolované upraveným spôsobom podľa Exterkate a de Veer, 1985. Stručne povedané, enzýmy sa uvoľnia pôsobením ultrazvuku na zmrazené bakteriálne bunky. Supematant odstredených buniek bol oddelený a použitý na hydrolýzu kaseínu a a_SL-kaseínu. Hydrolýza bola uskutočňovaná pri teplote 34 °C počas 24 hodín.

Takto získané hydrolyzáty boli ďalej hydrolyzované pepsínom a trypsínom. Stručne povedané, vzorky boli najskôr hydrolyzované 0,1 % pepsínom v 0,1 mol/1 HCI počas 3 hodín pri teplote 37 °C pri pH 2,5. Po úprave pH pomocou 250 mg NaHCO₃ a 2 mol/1 NaOH, k vzorkám bol pridaný 0,1 % trypsín a vzorky boli hydrolyzované počas 5 hodín pri teplote 37 °C, pH 8,0.

P/T kaseínové a P/T-a_SL-kaseínové vzorky boli získané hydrolýzou čisteného kaseínu a a_SL-kaseínu len pepsínom a trypsínom spôsobom, ktorý bol už opísaný, bez GG-hydrolýzy.

.b. Test transformácie lymfocytu

Na transformáciu lymfocitu vyvolanú mitogénom bol použitý upravený mikrospôsob celkovej krvi. Šesť až osem zdravých dobrovoľníkov bolo využitých ako darcov krvi na tento experiment. Tzn. heparinizovaná žilová krv bola odobraná a zriedená v pomere 1 : 7 RPMI 1640 kultúrnym médiom (Grand Island Biological Co. NY, USA), obsahujúcim antibiotiká. Fytohemagglutinin (PHA) (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) bol zriedený RPMI 1640 obsahujúcim antibiotiká s rozsahom finálnych koncentrácií v kultúrach 5 pg/ml až 1250 pg/ml. Lyofilizované hydrolyzáty kaseínu a a_SL-kaseínu boli zriedené RPMI 1640 na finálne koncentráciu 0,1 pg/ml, (nízka), 10 pg/ml (stredná) a 1000 pg/ml (vysoká), ktorá je netoxická na T bunky, ako bolo dokázané pri štúdiách vylučovania farbiva s eozínom.

Uskutočnené boli dve súpravy experimentov na preskúmanie prcliferatívnych reakcií jednojadrových buniek periférnej krvi (PBMC) vyvolaných mitogénom na (A) kaseín hydrolizovaný pepsínom a trypsínom (= P/T-kaseín, (B) ct_SL-kaseín hydrolizovaný pepsínom a trypsínom (= P/T-a_SL-kaseín), (C) P/T-kascín ďalej hydrolizovaný enzýmami odvodenými od Lactobacillus GG a (D) P/T-a_SL-kaseín ďalej hydrolizovaný enzýmami odvodenými od Lactobacillus GG.

Experiment pozostáva zo štyroch kontrolných kultúr rôzneho zriedenia kultúrneho média a mitogénu rovnako, ako zodpovedajúce testovacie kultúry s 25 pl hydrolyzovaných produktov pri troch rôznych koncentráciách. Test bol uskutočnený postupom opísaným v Sútas a kol., 1996.

Mitogénom vyvolaná profilácia PBMC bola vyjadrená ako počet za minútu s vylúčením pozadia. Výsledky boli uvedené pre kontrolné kultúry obsahujúce 125 pg/ml PHA a RPMI 1640 a pre tri testovacie kultúry obsahujúce

125 pg/ml PHA a hydrolizované produkty pri nízkych, stredných a vysokých koncentráciách.

l.c. Štatistická analýza

Na porovnanie zmien hodnôt v počtoch za minútu pri každej z testovacích kultúr s počtami za minútu kontrolných kultúr bol použitý neparametrický párový test (Wilcoxonov test vyznačeného poradia). Hladina významnosti bolap< 0,05.

Významné výsledky párového porovnania boli uvedené ako potlačenie alebo stimulácia podľa zvýšenia alebo zníženia hodnôt v počtoch za minútu u testovacej kultúry.

1. d. Výsledky

V experimentoch uskutočnených s P/T-kaseínom a P/T-a_SL-kaseínom, navyše hydrolyzovaných enzýmami odvodenými od Lactobacillus GG, bola mitogénom vyvolaná proliferácia PBMC znateľne potlačená pri 0,1 pg/l, 10 pg/l a 1000 pg/l (p = 0,03, p = 0,03 a p = 0,03) obr. 1C a obr. ID) pri porovnaní s P/T-kaseínom a P/T-a_SL-kaseínom (obr. IA a obr. IB).

Príklad 2

Liečenie detí s atopickou dermatitídou proteínovým hydrolyzátovým prostriedkom doplneným mliečnou kyselinovou baktériou.

2. a. Pacienti a organizácia štúdie

Štúdia zahrnuje 31 deti vo veku 2,5 mesiaca až 15,7 mesiaca (hlavný vek 8 mesiacov), ktoré spĺňajú Hanifmove kritérium (Hanifin, 1987) pre atopický ekzém u detí. Deti boli odporučené na pediatrickú kliniku na základe atopického ekzému a očakávanej alergie na kravské mlieko. Stredný vek začiatku symptómu bol 2,4 mesiace. Celkové trvanie dojčenia bolo 5,9 mesiacov. Pozitívna prítomnosť atopického ochorenia (astma, atopický ekzém a alergická nádcha) alebo alergia na jedlo u najbližších príbuzných bola zaznamenaná u 26 (84 %) pacientov. Ekzemické lézie boli liečené emolientami a povrchovými kortikosteroidmi. Žiadny z pacientov nebol podrobený systemickej kortikosteroidovej terapii. Okrem atopického ekzému boli u 9 (19 %) pacientov pozorované gastrointestinálne poruchy, ako je hnačka alebo zvracanie. Po uskutočnení prvej štúdie boli pacienti podrobení dvojnásobne slepému placebom kontrolovanému pôsobeniu kravského mlieka. Len tí, ktorí mali pozitívne reakcie (27/31) boli zahrnutí do populácie na konečnú štúdiu. Pacienti boli náhodne rozdelení na obdobie jedného mesiaca do dvoch skupín. Jedna skupina (WF, n = 14) dostala veľmi hydrolyzovaný syrovátkový prostriedok (Valio Ltd., Helsinki, Fínsko, EP-A-601802) a druhá skupina (WF-GG, n = 13) dostala rovnaký prostriedok obsahujúci navyše Lactobacillus GG, prípravok (5 x 10⁸cfu/g) (dodávaný Valio Ltd., Helsinki, Fínsko). Po jednom mesiaci podávania príslušného prostriedku obidve skupiny ďalej dostávali počas jedného mesiaca veľmi hydrolyzovaný syrovátkový prostriedok (Valio Ltd.). U všetkých pacientov bola pred liečením stanovená celková sérová koncentrácia IgE, špecifického IgE na kravské mlieko (RAST, Pharmacia, Uppsala, Švédsko) a boli uskutočnené testy svrbenia kože. Test svrbenia bol uskutočnený na predlaktí pomocou komerčne dostupného alergénu kravského mlieka ALK (Allergologisk Laboratórium, Horsolm, Dánsko) a testovaný prostriedok bol zriedený na normálnu koncentráciu na používanie. Bola použitá 1 mm ihla s prekážkou proti hlbšiemu vpichnutiu (ALK) s dihydrochloridom histamínu v množstve 10 mg na mililiter (ALK) ako pozitívna kontrola. Reakcie boli zaznamenané po 15 minútach a re akcie zodpovedajúce polovici veľkosti reakcie na histamín alebo väčšie, boli zaznamenané ako pozitívne za predpokladu, že stredná hodnota priemeru vyrážky bola prinajmenšom 3 mm a súčasne negatívnej kontroly bola 0 mm.

Vzorky stolice pre stanovenie a-1 antitrypsínu a TNF-a boli zbierané pred začiatkom štúdie v čase, ktorý zodpovedá času trvania štúdie a o dva mesiace neskôr.

Prudkosť atopickej dermatitídy bola hodnotená podľa SCORAD spôsobu, zavedeného European Task Force on Atopic Dermatitis (1993). Stručne povedané, rozsah (hodnotenie A) dermatitídy sa stanovuje pomocou pravidla devätín. Intenzita (hodnotenie B) dermatitídy je súčtom jednotllivých hodnotení (0 až 3) erytému, edému, exkoriácie, lichenifikácie a suchosti. Subjektívne (hodnotenie C) prejavy (hodnotené 1 až 10) zahrnujú svrbenie a nespavosť boli stanovené podľa pozorovania rodičov. SCORAD bol získaný výpočtom:

A/5 + 3,5 x BB + C

Záznamy o štúdii boli overené Ethical Review Committee of Tampere University Hospital. Od rodičov bol získaný súhlas.

2.b. Stanovenie a-1 antitrypsínu v stolici

Zamrznutá stolica bola roztopená pri laboratórnej teplote a homogenizovaná. Do sklenej skúmavky bol vložený 1 g a bol lyofilizovaný. Výsledný suchý materiál bol zomletý a 50 mg bolo vložené do Eppendorfovej skúmavky. Bol pridaný 1 ml 0,15 M NaCl a a-1 antitrypsín bol extrahovaný prudkým miešaním vo Vortexovom mixéri počas 20 minút pri laboratórnej teplote. Získaná suspenzia bola odstreďovaná počas 10 minút pri 25 000 g, aby sa odstránil balast a supematant bol použitý na stanovenie a-1 antitrypsínu pomocou Behringovho BNA nefelometra podľa návodu výrobcu. Výsledky sú uvedené vo forme mg/g suchej hmotnosti lyofilizovanej stolice.

2.c. Stanovenie TNF-α v stolici

Zamrznutá stolica bola roztopená pri laboratórnej teplote, suspendovaná v pomere 1 : 1 (hmotnosť/objem) vo fyziologickom roztoku chloridu sodného a ponechaná usadnúť. Zo supematanta bolo 0,5 ml až 1,0 ml vložené do Eppendorfovej skúmavky a odstreďované počas 10 minút pri 25 000 g.

Supematant bol potom použitý na stanovenie TNF-a. Na stanovenie TNF-α v stolici bol použitý komerčný imunoenzýmový test (Human TNF-α ELISA sada, Endogen Inv., Boston, Massachusetts, USA) podľa návodu pre sérové vzorky.

2.d. Štatistika

Z dôvodu nerovnomernej distribúcie sérových koncentrácii IgE bola uskutočnená logaritmizácia (In) a údaje sú prezentované ako stredná hodnota s 95 % intervalom spoľahlivosti (Cl). Koncentrácia zápalových parametrov je uvádzaná ako stredná hodnota s dolným kvartilom a horným kvartilom. Na štatistické porovnanie bol použitý Wilcoxonov test označeného poradia a Mannov - Whitneyov U-test.

2.e. Výsledky

2.e.l Klinické údaje

Stredná hodnota (95 % Cl) celkového sérového IgE bol 31 kU/1 (15 kU/1 - 61 kU/1) u pacientov, ktorí dostávali hydrolyzátový prostriedok. RAST pre kravské mlieko bol pozitívny (> 0,4 kU/1) pri 10/31 (37 %) u pacientov s ato pickým ekzémom. Test svrbenia na kravské mlieko bol pozitívny u 8/31 (30 %) pacientov.

Prudkosť atopickej dermatitídy u každého pacienta pred liečbou a o jeden mesiac neskôr, t. j. po uskutočnení štúdie je uvedená na obrázku 2. Stredná hodnota (dolný kvartil -

- horný kvartil) SCORAD hodnotenie bola 21 (14 - 31) u skupiny WF a 26 (17 - 38) u skupiny WF-GG pred uskutočnením štúdie (p = 0,33). Po jednom mesiaci liečenia došlo k znateľnému zlepšeniu SCORAD hodnotenia u skupiny dostávajúcej Lactobacillus GG (p = 0,008), ale nie u tých, ktorí dostávali veľmi hydrolyzovaný prostriedok bez Lactobacillus GG (p = 0,89). SCORAD hodnotenie potom bolo 19 (13 - 31) u skupiny WF a 15 (7 - 28) u skupiny WF-GG. Zníženie SCORAD hodnotenia pri WF-GG bolo spôsobené zmenšením rozsahu (hodnotenie A, p = 0,004), intenzity (hodnotenie B, p = 0,05) a subjektívneho hodnotenia (hodnotenie C, p = 0,01) pri atopickej dermatitíde (obr. 2). Zlepšenie SCORAD hodnotenia bolo dosiahnuté po dvoch mesiacoch u skupiny WF a u skupiny WF-GG zostalo nezmenené aj po skončení podávania Lactobacillu GG. Po dvoch mesiacoch bola stredná hodnota (dolný kvartil -horný kvartil) SCORAD hodnotenia u skupiny WF 14 (2 - 38) a u skupiny WF-GG 16 (- 25).

2.e.2. Koncentrácia a-1 antitrypsínu a TNF-α v stolici

Pri zdravej kontrole (n = 9) boli stredné hodnoty (dolný kvartil - horný kvartil) koncentrácie a-1 antitrypsínu 0,5 mg/g (0,5 mg/g - 1,7 mg/g). Koncentrácia a-1 antitrypsínu bola porovnateľná medzi skupinami WF a WF-GG pred liečením (p = 0,22). Ako je uvedené v tabuľke 1, koncentrácia a-1 antitrypsínu sa v priebehu jedného mesiaca trvania štúdie znateľne znížila u skupiny WF-GG (p = = 0,03), ale nie u skupiny WF (p = 0,68).

Koncentrácia TNF-α v stolici bola pri zdravej kontrole 0 pg/g (0 pg/g - 0/08 pg/g). Koncentrácia TNF-α v stolici bola u atopických detí znateľne vyššia, p < 0,0001 (tabuľka 1). Koncentrácia TNF-α bola porovnateľná medzi skupinami WF a WF-GG pred liečením (p = 0,57). Koncentrácia TNF-α v stolici sa v priebehu jedného mesiaca trvania štúdie znateľne zvýšila u WF-GG (p = 0,003), ale nie u WF (p = 0,38) (tabuľka 1). Zníženie koncentrácie TNF-α bolo u skupiny WF dosiahnuté po dvoch mesiacoch, pričom u skupiny WF-GG, ktorá tiež dostávala veľmi hydrolyzovaný prostriedok bez Lactobacillu GG, bola zistená tendencia k zvyšovaniu koncentrácie TNF-α. Koncentrácia TNF-α potom bola 84 (25 - 129) u WF a 144 (20 - 338) u WF-GG.

Tabuľka 1

Koncentrácia a-1 antitrypsínu a TNF-α v stolici pred liečením (0) a o jeden mesiac neskôr (I) u detí, ktoré dostali veľmi hydrolyzovaný syrovátkový prostriedok (WF) alebo ten istý prostriedok obsahujúci baktériu Lactobacillus GG (WF-GG). Údaje udávajú strednú hodnotu (dolný kvartil -

- horný kvartil).

	WF	WF - GG
a-1 antitrypsín 0 (mg/g) a-1 antitrypsín 1 (mg/g) TNF-a 0 (pg/g) TNF-a 1 (pr/r)	1,7 (1,5 - 23) 1,7 (1,1 - 23) 632 (126 - 1880) 494 (147 - 1009)	1,4 (0,5 - 1,9) 0,5 (0,5 - 1,0) 709 (91 - 1131) 34 (19 - 103)

Príklad 3

Tlmenie produkcie cytokínu jednojadrovými bunkami periférnej krvi u atopických detí

3.a. Pacienti a metódy

Spolu bolo sledovaných 14 pacientov vo veku 5 mesiacov až 29 mesiacov (stredný vek 16 mesiacov), ktorí spĺňajú Hanifinove kritérium pre atopickú dermatitídu (Hanifin, 1987) a osem neatopických zdravých detí rovnakého veku. Žiadne z detí v čase štúdie nedostalo systemický kortikosteroidy.

0KT3 (anti-CD3-protilátka) obsahujúca ascitovú tekutinu bola darom od Dr. M. Kaartinena, katedra bakteriológie a imunológie, Univerzita v Helsinkách, Fínsko. Celkový hovädzí kasein bol prečistený z kravského mlieka, ako opisuje Syväoja, 1992. Čistený kasein bol hydrolyzovaný enzýmami odvodenými od Lactobacillus GG postupom opísaným v príklade 1. Čistený kasein alebo kasein naočkovaný Lactobacillom GG bol lyofilizovaný a skladovaný pri laboratórnej teplote. Pred experimentmi bol zriedený RPMI 1640 a bola použitá sterilizácia cez filter (0,1 pm, Millipore, Bedford, MA, USA).

Kultúrne médium, pozostávajúce z RPMI 1640 bolo doplnené 10 % sérom teľacích zárodkov, 10 mM pufrom Hepes, 2 mM L-glutamínom (Gibco Life Technologies, Paisley, UK), 50 U/ml bcnzylpenicilínom (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mg/ml gentamycinom (Roussel Laboratories LTD., Uxbridge, Middlesex, UK). Bola odobraná periférna žilová krv (5 ml). PBMC obsahujúce 90 % lymfoidných buniek boli izolované FicollPaque (Phaimacia Biotech, Uppsala, Sweden) gradientovým odstreďovaním a suspendované pri 1 x 10⁶ buniek/ml v kompletnom kultúrnom médiu. Kultúrne jamky boli dopredu pokryté anti-CD3 protilátkou obsahujúcou ascitovú tekutinu vyskúšanú optimálnym zriedením. Testovacia kultúra ďalej obsahovala kasein alebo Lactobacillom GG odbúravaný kasein vo finálnej koncentrácii 1 mg/ml. Tieto experimenty boli opakované s čisteným hovädzím a_SL-kaseínom alebo a_SL-kaseínom odbúravaným Lactobacillom GG. Po 24 hodinách inkubácie v humidifikovanej 5 % CO₂ atmosfére pri 37 °C, bol supematant odohraný a skladovaný pri -70 °C pre cytokínové testy. IL-4 a IFN-γ boli v supematantoch kultúr stanovované komerčne dostupnou ELISA súpravou podľa návodu výrobcu (IL-4: CLB, Compact Human Interleukin-4 súprava ELISA, Centrál Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Holandsko; IFN-γ: EIFING, Endogcn Inc., Cambridge, MA, USA). Výsledky rôznych pokusov boli porovnané pomocou štandardných kriviek a boli vyjadrené ako pg/ml. Citlivosť testov pre IL-4 bola 2,3 pg/ml a pre IFN-γ, 5 pg/ml. Na štatistické porovanie testovaných kultúr s kontrolnými kultúrami bol použitý Wilcoxonov test označeného poradia. Hladina významnosti bola p < 0,05.

3.b. Výsledky

U atopických pacientov bola produkcia IL-4 aj IFN-γ v porovnaní s kontrolnými kultúrami zvýšená v kultúrach obsahujúcich čistený kasein, p = 0,008 a p = 0,008 (obr. 3a a obr. 3b). Žiadny taký vplyv hovädzieho kaseínu nebol pozorovaný po jeho odbúraní enzýmami Laclobacillus GG. Naopak, produkcia IL-4 v kultúrach obsahujúcich kasein odbúraný Lactobacillom GG bola znateľne nižšia ako pri kontrolných kultúrach, p = 0,003 (obr. 3a) a produkcia IFN-γ bola v týchto kultúrach porovnateľná s kontrolnými kultúrami, p = 0,10 (obr. 3b).

U zdravých detí bola produkcia IL-4 aj IFN-γ v kultúrach obsahujúcich čistený kasein porovnateľná s kontrolnými kultúrami, p = 0,I0ap = 0,10 (obr. 3c a obr. 3d). Rovnako ako u atopických pacientov mali zdravé deti znateľne nižšiu produkciu IL-4 v kultúrach obsahujúcich kaseín odbúraný Lactobacillom GG oproti kontrolným kultú ram, p = 0,01 (obr. 3c) a produkcia IFN-γ v týchto kultúrach zostala porovnateľná s kontrolnými kultúrami, p = = 0,50 (obr. 3d). Rovnaké výsledky boli získané aj s ct_SL-kaseínom a Lactobacillom GG odbúraným a_SL-kaseínom (obr. 4).

Referencie

European task force on atopics dermititis. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD index. Dermatology 1993; 186:23 -31.

Exterkate F. a De Veer G. Partial isolation and degradation of caseins by celí wall proteinase(s) of Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol. 1985; 49: 328 - 32.

Fargeas M. J., Theodorou V., More J., Wal J. M., Fioramonti J., Bueno L. Boosted systemic immune and local responsiveness after intestinal inflammation in orally sensitized guinea pigs. Gastroenterology 1995; 109: 53 - 62.

Hanifin, J. M. Epidemiology of atopic dermatitis. Monografia Alergy 1987; 21: 116 -131.

Isolauri E., Majamaa H., Arvola T., Rantala L, Virtanen E., Arvilommi H., Lactobacillus casei strain GG reverses inereased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastoenterology 1993; 105: 1643 - 1650.

Majamaa H., Isolauri E. Evaluation of gut mucosal barrier: evidencia for inereased antigén transfer in children with atopic eezema. J. Allergy Clin. Immunol. 1996, v tlači.

Majamaa H., Miettinen, A., Laine S., Isolauri E. Intestinal inflammation in children with atopic eezema: faecal eosinophil cationic proteín and tumor necrosis factor-α as noninvasive indicators of food allergy. Clin. Exp. Allergy 1996; 26: 181 - 187.

Sampson H. A., James, M. J. a Bemhisel - Broadbent J. Safety of an amino acid - derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics 1992; 90: 463 - 465.

Sútas Y., Soppi E., Korhonen H., Syväoja E. L., Saxelin M., Rokka T., Isolauri E., Suppression of lymphocyte proliferation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG derived enzymes. J. Allergy Clin. Imunol. 1996, v tlači.

Syväoja E. L. Quantitative determination of the main casein components and purification of a_SL- and K-casein Írom bovine milk. Milchwissenschaft 1992; 47: 563 - 566.

Priemyselná využiteľnosť

Prostriedky podľa predkladaného vynálezu sú priemyselne využiteľné na výrobu liekov na liečenie alebo prevenciu alergie najedlo, najmä alergie na kravské mlieko.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy proteínového hydrolyzátového prostriedku na tlmenie hypersenzitívnych reakcií a podporu imunitnej bariéry v črevách, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z krokov hydrolýzy potravinových proteinov enzýmami, odvodenými od bakteriálneho prípravku obsahujúceho kmeň Lactobacillus GG (ATCC 53103) a s pepsínom a/alebo trypsínom.
2. Spôsob prípravy proteínového hydrolyzátového prostriedku na tlmenie hypersenzitívnych reakcii a podporu imunitnej bariéry v črevách podľa nároku 1, v y z n a čujúci sa tým, že pozostáva z krokov hydrolýzy potravinových proteinov pepsínom a/alebo trypsínom a pri6 daním hydrolyzátu bakteriálneho prípravku obsahujúceho kmeň Lactobacillus GG (ATCC 53103).
3. Proteínový hydrolyzátový prostriedok na tlmenie hypersenzitívnych reakcií a podporu imunitnej bariéry v črevách, vyznačujúci sa tým, že hydrolyzát sa získa spôsobom definovaným v nárokoch 1 a 2.
4. Použitie proteínového hydrolyzátu podľa nároku 3 na prípravu liečiva na orálne podávanie na zvýšenie tolerogénnych imunitných odpovedí na potravinové antigény u pacientov.
5. Použitie proetínového hydrolyzátu podľa nároku 4 na prípravu liečiva na liečenie alergie na kravské mlieko u pacientov.
6. Použitie proteínového hydrolyzátu podľa nároku 4 na prípravu liečiva na prevenciu alebo liečenie hypersenzitívnych reakcií u detí vyvolaných potravou.
7. Použitie bakteriálneho prípravku obsahujúceho kmeň Lactobacillus GG (ATCC 53103) alebo proteínového hydrolyzátu spolu s bakteriálnym prípravkom podľa nároku 2 na prípravu liečiva na zvýšenie tolerogénnych imunitných odpovedí na potravinové antigény u pacienta.
8. Použitie proteínového hydrolyzátu spolu s bakteriálnym prípravkom podľa nároku 7 na prípravu liečiva na liečenie alergie na kravské mlieko u pacientov.
9. Použitie proteínového hydrolyzátu spolu s bakteriálnym prípravkom podľa nároku 7 na prípravu liečiva na prevenciu alebo liečenie hypersenzitívnych reakcii u detí vyvolaných potravou.