JP3071877B2 - 経口寛容誘導能を有する低アレルゲン性酵素分解ペプチド組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、乳蛋白質を蛋白加水分
解酵素で処理して得られる低アレルゲン性酵素分解ペプ
チド組成物及びその用途に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般に蛋白質やペプチドの抗原性はその
分子量と密接な関係があることが知られている。酵素分
解はこうした蛋白質やペプチドを低分子化して抗原性を
低下させる最も効果的な方法の１つである。実際、牛乳
アレルギーの原因物質と考えられているカゼインや乳清
蛋白質に対しても酵素分解による低アレルゲン化の試み
がなされており、分解ペプチドの分子量と抗原性および
免疫原性の関係などが報告されている（Ｔａｋａｓｅ，
Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｄａｉｒｙ Ｆｏｏｄ Ｓ
ｉｃ．，３３，Ａ５（１９８４）；Ｏｔａｎｉ，Ｈ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，４
５，２１７（１９９０）；Ａｓｓｅｌｍ，Ｊ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．，５３，１２０８（１９
８８））。しかし、抗原性および免疫原性に関するこれ
らの検討はすべて酵素分解ペプチドの未分解蛋白質抗原
に対する抗体とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの反応性あるいは
非経口投与によるｉｎ ｖｉｖｏ抗体産生能の結果に基
づいて行われており、経口投与時に特有な生体の免疫応
答（免疫寛容あるいは経口寛容）が全く考慮されていな
かった。

【０００３】すなわち、これまでの乳蛋白質の低アレル
ゲン化酵素分解ペプチド組成物は、乳蛋白質抗原の非経
口投与での抗体産生能あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗
体結合能を低下させることのみを考慮して開発されたも
のであった。乳蛋白質が経口投与された場合に生体内で
誘導されうる抗原特異的な抗体産生抑制機構（抗原特異
的抑制Ｔ細胞の誘導など）をアレルギー低減化食品の開
発に積極的に活用するための検討はこれまで全く行われ
ていない。ましてや、経口寛容誘導剤の開発についての
検討に至っては全く何も行われていないのが現状であ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】これまでの乳蛋白質の
低アレルゲン化方法は、抗原性をなくすために低分子量
のペプチドにまで酵素分解することであった。しかし、
極端に低分子化するとしばしば苦味ペプチドを生じ、風
味が損われる上に、未分解の乳蛋白質が本来有している
と考えられる生体の経口寛容誘導能が消失することが予
想される。実際、あらかじめ生体に投与して免疫寛容を
誘起できるような蛋白質の酵素分解ペプチドは、非経口
投与の場合は例（特開昭４９−１３３２４）があるもの
の、経口投与では全く知られていない。

【０００５】したがって本発明が解決しようとする課題
は、抗原性が低下し且つ風味にはすぐれ、更に経口寛容
誘導能を備えた酵素分解ペプチド組成物を新たに開発す
ることである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に各方面から検討の結果、本発明者らは牛乳由来の蛋白
質を蛋白加水分解酵素で処理し、分子量が１万以下のペ
プチドとすることにより、抗原性が低く、かつ経口寛容
誘導能を有する風味良好な低アレルゲン性酵素分解ペプ
チド組成物ができることを見いだし、本発明を完成する
に至った。以下、本発明について詳しく説明する。

【０００７】本発明に係るペプチド組成物の原料として
は、蛋白質を使用するが、それにはβ−ラクトグロブリ
ン、α−ラクトアルブミン等の乳清蛋白質、カゼインそ
の他の牛乳由来の蛋白質を各成分に分離しあるいは分離
することなく使用する。これら蛋白質は精製したものが
好都合であるが、最終製品を食品ないし経口投与薬剤等
として使用する場合には必らずしも純品にまで精製する
必要はない。

【０００８】本発明においては、上記した牛乳由来の蛋
白質を、必要あれば２種以上混合し、蛋白加水分解酵素
で処理し、分子量２万以下好ましくは１万以下の低分子
ペプチド化する。

【０００９】蛋白加水分解酵素としては、ペプチド結合
を加水分解する酵素を広く指し、プロテアーゼ、プロテ
イナーゼ、エンドペプチダーゼ等を広く包含するもので
あり、植物起源、動物起源、微生物起源の各酵素が適宜
使用できる。

【００１０】植物起源の蛋白加水分解酵素としては、パ
パイン、ブロメリン、フィシン等が挙げられ、動物起源
の酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、カリク
レイン、パンクレアチン等が挙げられ、とくにトリプシ
ン、α−キモトリプシンが好ましく、単用ないし２種以
上併用できる。微生物起源の酵素としては、アスペルギ
ルス属菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｄｒｙｚａ
ｅ ＩＦＯ３０１０５等）、枯草菌（例えばＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ１３７２２等）、放
線菌（例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕ
ｓ ＩＦＯ１３３０４等）等が生産する蛋白加水分解酵
素が単用ないし２種以上併用できる。

【００１１】本発明を実施するには、蛋白質の加水分解
処理の常法にしたがって実施すればよく、牛乳由来の蛋
白質を基質としてこれに蛋白加水分解酵素を加えて所定
のｐＨ、温度で必要時間インキューベートすればよい。
例えば、牛乳蛋白質水溶液にトリプシン、α−キモトリ
プシン、アスペルギルス属糸状菌由来の蛋白加水分解酵
素、枯草菌由来の蛋白加水分解酵素又は放線菌由来の蛋
白加水分解酵素を加えｐＨ６〜９、温度３０〜４０℃、
３０分〜２４時間の範囲において処理する。次に分子量
１万の限外ろ過膜、ＵＦ膜など分子ふるい効果を有する
膜を用いて、分子量１万以下の分解ペプチドのみを回収
する。そして更に必要あれば、得られたペプチドを常法
にしたがって精製してもよい。

【００１２】このようにして得られた分解ペプチド組成
物は、低アレルゲン性であり、一方経口寛容誘導能は未
分解の乳蛋白質とほぼ同様にすぐれており、他方低分子
化ペプチドには常に付随している苦味成分が除去されて
風味食感にすぐれているため、新しいアレルギー低減化
食品素材として、単独又は他の食品とともに自由に使用
することができる。

【００１３】また本発明に係る分解ペプチド組成物は、
後記する実施例からも明らかなように経口寛容誘導能に
きわめてすぐれているので、常用される佐薬を用いてあ
るいは用いることなく単独で錠剤、顆粒剤、カプセル
剤、粉剤、液剤等所望する剤型に製剤化して経口投与用
医薬として、経口寛容誘導及び／又はそのための補助的
処置のために使用することができる。本発明に係る分解
ペプチド組成物は、本来食品として用いることができる
ものであるので安全性に問題はなく、しかも経口的に投
与するので安全性については全く問題はないし、その用
量も適宜でよい。以下、本発明の実施例について述べ
る。

【００１４】［実施例１］乳清蛋白質の１つであるβ−
ラクトグロブリン（以下、β−ＬＧと略）を大友らの方
法（日本食品工業学会誌，３５，７５５（１９８８））
で牛乳ホエーから回収した。このβ−ＬＧの０．５重量
％水溶液５００ｌを調製し、これを１Ｎ水酸化ナトリウ
ムにてｐＨ８．０とした。これにウシトリプシン（Ｓｉ
ｇｍａ社、Ｔ−８００３）２．５×１０⁴ＢＡＥＥ ｕ
ｎｉｔ／ｇβ−ＬＧを添加し、ｐＨ８．０、３７℃で攪
拌しつつ１時間酵素反応を行った。反応終了後、β−Ｌ
Ｇ酵素分解液を分画分子量１万の限外ろ過膜を使用した
ろ過装置にかけ、分子量１万以下のβ−ＬＧの部分ペプ
チドを含む画分を得た。

【００１５】この画分を凍結乾燥した試料のＳＤＳ電気
泳動パターンを図１で示される第１図に、抗原性を図２
〜図６で示される第２図に示した。なお、抗原性はＫａ
ｍｉｎｏｇａｗａらが調製した５種類の抗β−ＬＧモノ
クローナル抗体（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
５１，７９７（１９８７））との反応性を競合法のＥＬ
ＩＳＡ法（酵素免疫測定法（第２版），ｐ３０，医学書
院）で検討した。その結果から明らかなように、β−Ｌ
ＧのＮ末端側８−２６あるいは１５−２６に特異性を示
すモノクローナル抗体（２１Ｂ３、３１Ａ４）は、若干
これらのペプチドと反応したけれども（図２、３で示さ
れる第２図Ａ、第２図Ｂ）、未変性β−ＬＧの立体構造
を認識するが変性したβ−ＬＧとは反応しないモノクロ
ーナル抗体（６１Ｃ１、６１Ｂ４、６２Ａ６）とは全く
反応せず（図４、５、６で示される第２図Ｃ、第２図
Ｄ、第２図Ｅ）、これらの点からして、分解物中ではβ
−ＬＧは完全に分解されていることが立証された。

【００１６】図１および図２〜６より、試料中には未分
解のβ−ＬＧはなく、その抗原性は減少していることが
わかる。また官能検査の結果、このβ−ＬＧ酵素分解ペ
プチド組成物に苦味を訴えた人は１５名中０名であっ
た。

【００１７】［実施例２］実施例１で調製した試料のβ
−ＬＧ酵素分解ペプチド組成物を蛋白質源とする固型飼
料を作製し、マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ，６Ｗ、雌性）を飼
育した（一群５匹、飼料組成はＡＩＮ−７６に準拠）。
飼育開始後３週間目に未分解のβ−ＬＧ１００μｇをフ
ロイントの完全アジュバントとともに各マウスに腹腔免
疫した。さらに２週間後、未分解のβ−ＬＧ１００μｇ
をフロイントの不完全アジュバントとともに各マウスに
腹腔免疫した。２次免疫して１０日目に各マウスの血清
を尾静脈から採取し、血清中のβ−ＬＧに対する抗体量
をＥＬＩＳＡ法で測定した。抗体産生の抑制に関するポ
ジティブコントロールは実施例１の試料作製の原料とし
た未分解β−ＬＧを蛋白質源とする固型飼料で飼育した
マウスに上記と同様の処理をして得た血清である。一
方、ネガティブコントロールは、乳由来の蛋白質を全く
含まないＭＦ飼料（オリエンタル酵母社製）で飼育した
マウスに上記と同様の処理をして得た血清である。

【００１８】上記の実験結果を図７で示される第３図に
示した。これによると、β−ＬＧ酵素分解ペプチド組成
物を投与したマウスでも未分解のβ−ＬＧを投与したマ
ウスとほぼ同等な強さの経口寛容が誘導され、β−ＬＧ
特異抗体の産生が抑制されていることがわかる。

【００１９】［実施例３］カゼイン（Ｓｉｇｍａ社）を
水に溶解して１．０重量％の水溶液１００ｌを調製し、
これを１Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨ８．０とした。こ
れにウシトリプシン（Ｓｉｇｍａ社、Ｔ−８００３）
５．０×１０⁴ＢＡＥＥ ｕｎｉｔ／ｇカゼインを添加
し、ｐＨ８．０、３７℃で攪拌しつつ２４時間酵素反応
を行った。反応終了後、カゼイン酵素分解液を凍結乾燥
し、カゼイン酵素分解ペプチド組成物を得た。このカゼ
イン酵素分解ペプチド組成物は図８で示される第４図に
示したように、ＨＰＬＣゲル濾過クロマトの結果、分子
量１万以下のペプチドから成るものであった。

【００２０】上記カゼイン酵素分解組成物が全蛋白質の
１０％を占める固型飼料を作製し、マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈ
ｅ，６ｗ，雌性）を飼育した（１群、５匹、飼料組成は
ＡＩＮ−７６に準拠）。飼育開始後、４週間目に未分解
のカゼイン１００μｇをフロイントの完全アジュバント
とともに各マウスに腹腔免疫した。さらに２週間後、未
分解のカゼイン１００μｇをフロイントの不完全アジュ
バントとともに各マウスに腹腔免疫した。２次免疫して
１０日目に各マウスの血清を尾静脈から採取し、血清中
のカゼイン（αｓ1−カゼイン）に対する抗体量をＥＬ
ＩＳＡ法で測定した。実施例２と同様、ポジティブコン
トロールは未分解のカゼインが全蛋白質の１０％を占め
る固型飼料で飼育したマウスの血清、ネガティブコント
ロールはＭＦ飼料で飼育したマウスの血清である。

【００２１】その結果、表１に示したように、カゼイン
酵素分解ペプチド組成物を投与したマウスでも未分解の
カゼインを投与したマウスと同等な強さの経口寛容が誘
導され、カゼイン特異抗体の産生が抑制されていること
がわかる。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【発明の効果】乳幼児に見られる食物アレルギーの原因
の１つとして、食物蛋白質の一部が消化酵素の分解を受
けずに腸管から吸収され、生体免疫系を刺激することが
指摘されている。この点に関して、本発明の酵素分解ペ
プチド組成物は、その分子量が１万以下であるので、も
との未分解の乳蛋白質の有する抗原性は低減される。一
方、本酵素分解ペプチド組成物は、経口寛容誘導能につ
いては未分解の乳蛋白質とほぼ同等であるので、生体の
有する潜在的なアレルギー防御機構を十分活性化でき
る。さらに、本酵素分解ペプチド組成物の酵素分解に伴
う風味の劣化は極めて少ない。

【００２４】したがって、本発明のペプチド組成物は新
しいアレルギー低減化食品素材として極めて有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】市販蛋白分解酵素（トリプシン）によるβ−Ｌ
Ｇの分解後のＳＤＳ電気泳動図（ドデシル硫酸ナトリウ
ム ポリアクリルアミドゲル電気泳動図）である。

【図２】β−ＬＧ酵素分解ペプチド組成物のβ−ＬＧモ
ノクローナル抗体（２１Ｂ３）との反応性を競合ＥＬＩ
ＳＡ法（イライザ法）で検討した図面（第２図Ａ）であ
る。

【図３】同じくβ−ＬＧモノクローナル抗体（３１Ａ
４）との反応性を示した図面（第２図Ｂ）である。

【図４】同じくβ−ＬＧモノクローナル抗体（６１Ｃ
１）との反応性を示した図面（第２図Ｃ）である。

【図５】同じくβ−ＬＧモノクローナル抗体（６１Ｂ
４）との反応性を示した図面（第２図Ｄ）である。

【図６】同じくβ−ＬＧモノクローナル抗体（６２Ａ
６）との反応性を示した図面（第２図Ｅ）である。

【図７】β−ＬＧ酵素分解ペプチド組成物の経口寛容誘
導能を抗β−ＬＧ抗体価の上昇から調査した図面であ
る。

【図８】カゼイン酵素分解ペプチド組成物をＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフィー）にかけた図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/06 Ａ６１Ｋ 37/18 (72)発明者 高 橋 毅 東京都東村山市廻田町２−21−35 (72)発明者 上 野 川 修 一 埼玉県春日部市増田新田400−８ (56)参考文献 特開 平２−2319（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−182155（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−5497（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−234642（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−220197（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−272694（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−320650（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−248959（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−176714（ＪＰ，Ａ) 酪農科学・食品の研究，Ｖｏｌ．39, Ｎｏ．４，ｐ．Ａ123−129（1990) 日本畜産学会報，Ｖｏｌ．52，Ｎｏ. １，ｐ．47−52（1981) Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆ ｔ，Ｖｏｌ．45，Ｎｏ．４，ｐ．217− 220（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/17 A61K 38/00 A61P 37/06 A23L 1/305 C07K 14/435 C12P 21/06 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 牛乳由来の蛋白質を蛋白加水分解酵素で
   処理し、分子量を１０，０００以下としてなる経口寛容
   誘導能を有する低アレルゲン性酵素分解ペプチド組成物
   を有効成分としてなることを特徴とする経口寛容誘導
   剤。