SK279719B6 - Fragment dna, rekombinantná dna a spôsob výroby l- - Google Patents
Fragment dna, rekombinantná dna a spôsob výroby l- Download PDFInfo
- Publication number
- SK279719B6 SK279719B6 SK1228-90A SK122890A SK279719B6 SK 279719 B6 SK279719 B6 SK 279719B6 SK 122890 A SK122890 A SK 122890A SK 279719 B6 SK279719 B6 SK 279719B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- pcs2
- lysine
- corynobacterium
- dna
- plasmid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka fragmentu DNA, ktorý sa nachádza v plazmide, rekombinantnej DNA odvodenej od tohto plazmidu a spôsobu výroby L-lyzínu s použitím mikroorganizmu obsahujúceho uvedený plazmid alebo z neho odvodenú rekombinantnú DNA.
Doterajší stav techniky
Corynobacterium glutamicum a príbuzné rody, ako sú napríklad Brevibacterium lactofermentum a Brevibacterium flavum, sú známe ako mikroorganizmy tvoriace aminokyseliny.
Aby sa produktivita zvýšila, uskutočňujú sa umelé mutácie.
Príkladmi takto pripravených umelých mutantov sú napríklad lyzín produkujúce kmene Corynobacterium ghitamicum, ktoré okrem rezistencie AEC (AEC = S-2-aminoetylcysteín) preukazujú s ňou spojenú homoserínovú a leucínovú auxotrofiu (US patentový spis č. 3 708 395) alebo sú citlivé na metionín (US patentový spis č. 3 871 960).
Okrem týchto klasických metód boli objavené vektorové systémy, ktoré umožňujú transformáciu mikroorganizmov rodov Corynobacterium a Brevibacterium (DE-OS č. 37 37 719, DE-OS č. 38 41 453, Thierbach G., Schwarzer A., Piihlcr A., Appl. Microbiol. Biotechnol. 29 (1988) 356-362).
VEP-A-0219 027 sa opisuje spôsob výroby rôznych aminokyselín, pri ktorom sa rekombinantnou DNA transformujú rody Corynobacterium a Brevibacterium, a tak sa zvyšujú produkované množstvá aminokyselín.
Rekombinantná DNA obsahuje pritom fragment DNA, kódujúci syntézu aspartátsemialdehyddehydrogenázy alebo aspartátaminotransferázy.
Z US patentového spisu č. 4 346 170 je známe klonovanie genetickej informácie riadiacej tvorbu lyzínu v Escherichia coli, ktorá pochádza z kmeňa toho istého rodu s rezistenciou proti analógom L-lyzínu, ako je napríklad AEC.
Predmet US patentového spisu č 4 560 654 sa týka tej istej oblasti. V tomto prípade sa však v lyzín-auxotrofnom kmeni Corynobacterium glutamicum klonuje genetická informácia z AEC-rezistentného kmeňa toho istého rodu z toho dôvodu, aby sa vylučoval lyzín.
Identita klonovaného fragmentu DNA nie je zrejmá.
Tiež zEP č. 88 166 je možné iba vyrozumieť, že kmeň Corynobacterium glutamicum vylučuje lyzín, keď transformáciou získal fenotyp AEC rezistencie.
Rekombinantný plazmid pAec5 použitý na tento účel obsahuje 3,9 kb fragment chromozómovej DNA, vsadený na štiepne miesto BglII vektora pCG 11.
Úlohou predloženého vynálezu je zmeniť regulovateľnosť dôležitého enzýmu biosyntézy lyzínu v mikroorganizme rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium tak, aby sa získal producent lyzínu alebo aby sa zvýšila schopnosť produkcie lyzínu.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je fragment DNA, ktorý sa skladá z nukleotidovej sekvencie s dĺžkou 2,1 kb, ohraničený PstI a Xhol miestami štiepenia, ktorého podstata spočíva v tom, že aminokyselinová sekvencia uvedená na obr. 5 kóduje produkciu proteínov, vedúcich k aktivite aspartyl-P-semial dehyddehydrogenázy (asd) a k deregulácii aspartátkinázy (lysC), je obsiahnutý v plazmide pCS2, ktorého delečná mapa je uvedená na obr. 3, uloženom v Corynobacterium glutamicum pod číslom DSM 5086.
Predmetom vynálezu je ďalej aj rekombinantná DNA odvodená z plazmidu pCS2, charakterizovaná delečnou mapou zodpovedajúcou označeniu pCS26, uvedenou na obr. 3.
Predmetom vynálezu je ďalej aj rekombinatná DNA odvodená z plazmidu pCS2, charakterizovaná delečnými mapami zodpovedajúcimi označeniam pCS23 alebo pCS233 na obr. 3.
Predmetom vynálezu je ďalej aj spôsob výroby L-lyzínu fcrmcntáciou mikroorganizmov rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium produkujúcich túto aminokyselinu, ktorého podstata spočíva v tom, že mikroorganizmy obsahujú uvedený plazmid alebo niektorú z uvedených rekombinantných DNA.
Pri výhodnom uskutočnení opísaného spôsobu sa používa mikroorganizmus Corynobacterium DMS 5086.
Vynález sa teda okrem iného týka spôsobu výroby L-lyzínu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa rekombinantná DNA, ktorá pochádza z fragmentu DNA, ktorý má kódovanú genetickú sekvenciu na produkciu proteínov, ktoré vedú k aspartyl-P-semialdehyddehydrogenázovej (asd) aktivita a/alebo k deregulácii aspartátkinázy a skladá sa z vektora DNA, inzeruje do mikroorganizmu rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium produkujúceho lyzín, takto získané transformanty sa kultivujú vo vhodnom osebe známom médiu a vytvorený lyzín sa známymi metódami izoluje.
Ako donorové kmene môžu slúžiť všetky kmene, výhodne baktérie rodu Brevibacterium a Corynobacterium produkujúce lyzín, ktoré obsahujú príslušné sekvencie DNA, najmä však Corynobacterium glutamicum DM 58-1, ktorý bol vyvinutý mutagenézou Corynobacterium ATCC 13032 etylmetánsulfátom a preukazuje AEC-rezistenciu.
Tento kmeň je uložený pod číslom DSM 4697, pričom slúži ako hostiteľská baktéria pre plazmid pDM6. Tento môže odborník známymi spôsobmi oddeliť a tak získať kmeň DM58-1 (FEMS Microbiology Review 32 (1986) 149-157)
Chromozómová DNA sa z donoru extrahuje známym spôsobom a spracuje sa restikčnou endonukleázou.
Po konštrukcii rekombinantnej DNA zavedením chromozómového fragmentu DNA do vektora prebieha transformácia mikroorganizmu s takto získaným plazmidom, podľa predloženého vynálezu napríklad pCS2, ktorého reštrikčná schéma je znázornená na obr. 2 a ktorý je v kmeni Corynobacterium glutamicum DM2-l/pCS2 uložený podľa Budapeštianskej zmluvy pod číslom DSM 5086 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových štruktúr.
Výhodný vektorový systém predstavuje pZl (uložený v Corynobacterium glutamicum DM 274-2 pod číslom DSM 4241) alebo i pCV34, pCVX4, pCVXlO, pCVX15, pZ9 a pZ8-l (DE-OS 38 41 454.6) alebo pCV35, pECM3 a pECMl (DE-OS 38 41 453.8).
Použiteľné sú však aj zložené plazmidy, známe z EP-A-93 611, ak samy replikujú v rodoch Corynobacterium alebo Brevibacterium, najmä pAJ 655, pAJ 611, p AJ 440, p AJ 1844 a pAJ 3148 alebo tiež pCG 11, pCE 54 (pozri EP-A 0 233 581), a taktiež pUL33O (Santamaria, R. I. a kol., J. Bacteriology 162, (1958) 463-467).
Predmetom prihlášky sú aj mikroorganizmy rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium obsahujúce rekombinantnú DNA a ich použitie na výrobu L-lyzínu fermentáciou.
Klonovaný fragment DNA (pozri obr. 2) obsahuje len časť génu aspartátkinázy (LysC), ako aj úplný gén aspartyl-β-semialdehyddehydrogenázy (asd), čo je možné zistiť sekvenčnou analýzou.
Časť tohto génu aspartátkinázy má homologickú sekvenciu DNA k β-podjednotke aspartátkinázy II z Bacillus substilis.
Všetky transformanty, ktorých plazmid má túto sekvenciu (pCS2, pCS22, pCS23, pCS24, pCS26 a pCS233), obsahujú v porovnaní s chromozómovo kódovaným enzýmom z ATCC 13032 vo vzťahu k feed-back inhibitorom L-lyzínu a L-treonínu značne desenzibilizovanú aspartátkinázu a majú AEC-rezistenciu.
Závery odvodzované z porovnaní homológie, podľa ktorých fragment génu PstI - Xhol z DM58-1 obsahuje len časť génu LysC (AK), ale úplný gén asd, môžu byť jednoznačne potvrdené pomocou enzýmových meraní.
Žiadny kmeň Corynobacterium glutamicum ATCC 13032, transformovaný derivátom pCS2 alebo pCS2 neobsahuje prekvapivo zvýšenú aktivitu aspartátkinázy v porovnaní s pôvodným kmeňom (tabuľka 4. stĺpec 3).
Naproti tomu vo všetkých transformantoch, ktorých plazmidy obsahujú štruktúrny gén asd, sa dá zistiť silná superexpresia aspartyl^-semialdehyddehydrogenázy (ASA-DH), (tabuľka 4, stĺpec 2, obr. 3 a 4). Plazmidy pCS23 a deriváty pCS23 nevedú podľa očakávania k superexpresii ASA-DH.
Silná superexpresia ASA-DH, nastávajúca pri klonovaní podľa vynálezu fragmentu DNA pomocou pCS2 a z neho odvodených derivátov, zaručuje účinnú reakciu produktu aspartátkinázovej reakcie, β-aspartylfosfátu, čím dochádza k urýchleniu už neinhibovanej aspartátkinázovej reakcie.
Na základe vysokej lability ASA-DH kolísajú faktory superexpresie, kalkulovateľné zo špecifických aktivít v rozmedzí 31 až 65.
V porovnaní so súčasným stavom techniky dochádza k podstatnému zjednodušeniu tým, že sa po prvé musí izolovať len časť génu LysC, ktorý vedie k deregulácii aspartátkinázy, aby sa dosiahlo alebo zlepšilo vylučovanie lyzínu, apo druhé na základe organizácie LysC a asd v jednom operóne sa môže izolovať gén asd bez dodatočných experimentálnych nákladov spojených s AEC-rezistenciou, nastávajúcou s mutáciou génu LysC, spoločne s génom LysC. Naopak sa môže pomocou mutantov asd izolovať fragment DNA obsahujúci LysC + asd, a to nezávisle od toho, či je LysC mutovaný alebo nie.
1. Charakteristika donora génu DM58-1 a príjemcu génu ATCC 13032
1.1 Získanie a fenotyp kmeňa DM58-1
Kmeň DM58-1 sa získal mutagenézou kmeňa Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 bežnou koncentráciou etylmetánsulfonátu.
Selekcia prebieha kultiváciou takto získanej zmesi mutantov na minimálnom agare so zložením:
glukóza | 20 g |
síran amónny | 10g |
močovina | 2,5 g |
dihydrogenfosforečnan draselný | 1 g |
heptahydrát síranu horečnatého | 0,4 g |
heptahydrát síranu železnatého | 2 mg |
monohydrát síranu mangánatého | 1,5 mg |
biotín | 300 pg |
tiamín | 900 pg |
agar | 20 g |
destilovaná voda 1 liter (ph 7,0), ktorý obsahoval vhodnú koncentráciu S-aminoetyl-D,L-cysteínu (AEC). Kloň izolovaný z tohto selekčného média a schopný delenia na tomto médiu, neskôr označený ako DM58-1, nenesie okrem svojej AEC-rezistencie žiadne ďalšie genetické znaky.
1.2 Enzymatické obsahy aspartátkinázy a aspartyl-β-semialdehyddehydrogenázy v ATCC 13032 aDM58-l
Kmene ATCC 13032 a DM58-1 sa kultivujú za priamo porovnateľných podmienok v Štandard I Bouillon (Merck Art. Nr. 7882) s prídavkom 4 g/1 glukózy a 1 mM chloridu horečnatého pri 30 °C a 150 otáčok za minútu až do dosiahnutia včasné stacionárnej fázy a centrifugáciou sa od kultivačného média oddelia. Premyjú sa trikrát 100 mM Tris/HCl (pH 7,5); 1 mM DTT a vlhká bunková masa sa suspenduje v jednom objemovom diele rovnakého tlmivého roztoku.
Takto suspendované bunky sa dezintegrujú v guľovom mlyne (B. Braun Melsungen - MSK-Homogenisator, IMA-Disintegrator S) rozmiešaním s vhodným množstvom sklených guľôčok na sklenom filtri a centrifuguje sa 30 minút pri 30 000 x g do vyčírenia.
Po 15-hodinovej dialýze v tlmivom roztoku stabilizujúcom enzým sa určila enzýmová aktivita v nasledujúcich testovacích zmesiach:
Test aspartátkinázy:
Tris/HCl (pH 7,5) | 100 mM |
DTT | 1 mM |
síran amónny | 400 mM |
chlorid horečnatý | 20 mM |
NH2OH.HC1 | 400 mM |
L-aspartát | 300 mM |
ATP | 40 mM a |
rôzne množstvá enzýmových preparátov. |
Prídavkom 150 μΐ roztoku z 10 % hexahydrátu chloridu železitého; 3,3 % TCA; 0,7 N HCI na 500 μΐ testovanej enzýmovej zmesi sa enzýmová reakcia po tridsaťminútovej inkubácii pri teplote 37 °C zastaví. Z koncentrácie aspartyl-β-hydroxamátu, zistenej fotometrický (ΔΕ54ο J pomocou kalibračnej krivky, sa kalkuluje enzymatická aktivita v pmol/mg.min (U/mg). Príslušné koncentrácie proteinov sa určovali podľa metódy Lowryho a kolektívu (Lowry a kol. J. Biol. Chem. 193, 265 (1951) alebo Bradforda (Bradford Anál. Biochem. 72, 248 (1976)).
Test aspartyl- β-semialdehyddehydrogenázy:
dietanolamín (ph 9,0) | 120 mM |
NaAsO4 | 40 mM |
NADP+ | 1 mM |
L-treonín | 5 mM |
aspartyl-O-semialdehyd | 1,3 mM a |
rôzne množstvá enzýmových preparátov v celkovom objeme 1 ml.
Aktivita udávaná v pmol/ mg.min (U/mg) sa počíta cez fotometrický stanovenú (AE540 mn) rýchlosť syntézy NADPH.
Tabuľka 1 obsahuje špecifické enzýmové aktivity obidvoch enzýmov v surových extraktoch identicky pestovaných a spracovaných buniek Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 a DM58-1. Okrem porovnateľných obsahov aspartátkinázyu obidvoch kmeňov obsahuje AEC-rezistentný mutant DM58-1 v porovnaní s divým typom približne päťnásobne zvýšenú aktivitu asparty!-|j-semialdchyddehydrogenázy.
SK 279719 Β6
1.3 Inhibícia aspartátkinázy z Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 aDM58-l in vitro
Tabuľka 1 ukazuje, že už K. Nakayamom a kol. (K. Nakayama a kol., Agr. Biol. Chem. 30, 611 (1966)) naznačená a S. N. Kara-Murzom a kol. (S. N. Kara-Murza Prikladnaya Biokhimiya; Mikrobiológia 14, 345 (1978)) presnejšie preskúmaná inhibícia enzýmov divého typu Corynobacterium glutamicum je schopná reprodukcie. V porovnaní s tým je značne rozdielny charakter enzýmu AEC-rezistentných mutantov DM58-1, ktorých aspartátkináza už nie je koncentrovane inhibovateľná L-lyzinom + L-treonínom. Látkou S-aminoetyl-D,L-cysteínom, pôsobiacim na enzým z ATCC 13032 ako analóg lyzínu, je enzým mutantov taktiež len nepatrne ovplyvňovaný.
Tabuľka 1
Obsah enzýmov a vlastnosti aspartátkinázy (AK) a aspartyl-P-semialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) z Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 a DM58-1
Kmeň | ATCC13032 | DM58-1 |
AK (U/me) | 0.016 | 0,011 |
ASA-DH (U/rnoi | 0.06 | 0.33 |
Kombinácie | Inhibícia | |
inhibítorov | AK W | |
10 mM L-Ľy* i mM | 99 | 1 2 |
10 eiH L-Lys 10 mM L-Thr | 95 | 2 |
100 mM L-Lys 10 mM L-Thr | 99 | 21 |
10 mM AEC 1 nifl L-Thr | 1 2 | 0 |
10 mM AEC 10 mM L-Thr | 61 | 0 |
100 mM AEC 10 mM L-Thr---- | 95 | T |
AEC: S-(aminoetyl)-D,L-cysteín
2. Klonovanie fragmentu DNA kmeňa Corynobacterium glutamicum DM58-1, ktorý kóduje pre feed-back rezistentnú aspartátkinázu
3. Klonovanie
Izoluje sa celková DNA z kmeňa Corynobacterium glutamicum DM58-1 spôsobom opísaným Charterom a kol. (Charter a kol. Curr. Topics Microb. Immunol. 96, 69 (1982)) a parciálne sa naštiepi reštrikčným enzýmom Pstl. Vektor pZl (obr. 1), ktorý je opísaný v nemeckej patentovej prihláške č. 37 37 729.9, sa linearizuje pomocou Pstl a spracovaním alkalickou fosfatázou sa defosforyluje. Vektor DNA a DM58-1 DNA sa zmiešajú a spracujú sa T4 DNA-ligázou, ako sa opisuje Maniatisom a kol. (Maniatis T. a kol., Molecular Cloning A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982).
Transformácia Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 ligačnou zmesou sa uskutočňuje spôsobom opísaným Thierbachom a kol. (Thierbach G. a kol., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356 (1988)).
Na obr. 1 je znázornená reštrikčná schéma plazmidu pZl. Hrubá čiara znázorňuje podiel pHM1519 a tenká čiara znázorňuje podiel pACYC177. Označenie ApR = gén ampicilínovej rezistencie a Km3 = gén kanamycínovej rezistencie.
Transformačná zmes sa zaočkuje na agarové platne s RCG/E agarom s 300 pg/ml kanamycínu a tieto platne sa inkubujú jeden týždeň pri teplote 30 °C. Potom sa tieto agarové platne prepečiatkujú na agarové platne s agarom MM (Katasumata, R. a kol., J. Bact. 159, 306 (1984)) s 50 mM AEC a 50 mM L-treonínu a tieto sa kultivujú jeden deň pri teplote 30 °C. Kolónie, ktoré na tomto agare mohli rásť, sa preočkujú na agar MM, ktorý dodatočne obsahuje AEC, L-treonín a 10 pg/ml kanamycínu, aby sa získali jednobunkové kolónie. Plazmid DNA sa izoluje z takéhoto klonu, označeného ako pCS2, a použije sa na transformáciu Corynobacterium glutamicum ATCC 13032. 59 zo 62 preskúšaných transformantov rezistentných na kanamycín sa javilo rezistentných proti inhibícii 50 mM AEC a 50 mM L-treionínu. Plazmid pCS2 sa ďalej charakterizoval pomocou reštrikčnej analýzy. Obsahuje asi 9,9 kb dlhú inzerciu v štiepnom mieste Pstl vektora pZl, ktorý má dĺžku 6,9 kb.
Na obr. 2 je znázornená reštrikčná schéma plazmidu pCS2 v linearizovanej forme.
V hornej časti obr. 2 sú uvedené pozície rôznych reštrikčných štiepnych miest. V dolnej časti obrázka sú znázornené rôzne oblasti plazmidu pCS2. Inzercia DM58-1 DNA je znázornená ako prázdny pás. Gén ampicilínovej rezistencie pZl je znázornený ako čierne pole, gén kanamycínovej rezistencie je znázornený ako bodkované pole. Ostatné podiely pZl plazmidu pCS2 sú vyšrafované. Použité skratky sú nasledovné:
BamHI - B; Beli - C; Sali - S; Sca - A; Smal - M; Xhol - X.
2.2 Charakteristika aktivity aspartátkinázy
Aspartátkinázová aktivita sa merala u kmeňa ATCC 13032/pCS2, ako pozitívna kontrola u kmeňa DM58-1 a ako negatívna kontrola u kmeňa ATCC 13032. Kmene sa kultivovali na Štandard I Boillon, pričom táto pôda bola doplnená 4 g/1 glukózy, 10 μΐ/ml kanamycínu a 1 mM chloridu horečnatého. Kultivačné podmienky, izolácia buniek, rozloženie buniek a stanovenie aspartátkinázy sú opísané a uskutočňujú sa podľa odseku 1.2. Efektory L-lyzín, L-treonín a AEC sa vždy pridávajú ako základné roztoky v 100 mM Tris/HCl tlmivom roztoku s hodnotou pH 7,5.
Obsah aspartátkinázy a inhibovateľnosť enzýmu z ATCC 13032/pCS2 sú uvedené v tabuľke 4. Aj keď kmeň nepreukazuje žiadne zvýšenie špecifickej aktivity, mohla byť zistená zreteľná desenzibilizácia proti uvedeným inhibičným látkam, ktorých miera stupňa deregulácia enzýmu z poskytovateľa génu DM58-1 však nebola dosiahnutá (parciálna deregulácia).
2.3 Stanovenie vylučovania L-lyzínu
Schopnosť vylučovania lyzínu sa stanovila u kmeňa ATCC 13032/pCS2 a ako negatívna kontrola u kmeňa ATCC 13032/pZl. Po prídavku 10 pg/ml kanamycínu sa kultivácia uskutočňovala spôsobom opísaným a získané výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Vylučovanie L-lyzínu rôznymi kmeňmi Corynobacterium glutamicum
Kmeft C. glutamicum Koncentrácia vylúčeného
L-lyzín.HCI (g/1)
ATCC 13032/pZl 0,0
ATCC 13032/pCS2 (= DM 2-l/pCS2) 7,1
Erlenmeyerova banka s objemom 100 ml kultivačného média s nasledovným zložením:
síran amónny 12 g/1 melasa 240 g/1
SK 279719 Β6 sójový hydrolyzát 60 ml/1 uhličitan vápenatý 10 g/1.
Po zaočkovaní sa kultúra inkubuje 72 hodín pri teplote 30 °C a 300 otáčkach za minútu. Stanovenie lyzínu sa uskutočňuje v kvapaline po centrifugácii pomocou analyzátora aminokyselín.
3. Prehľad odštiepovania fragmentu DNA pCS2, ktorý kóduje pre feed-back rezistentnú aspartátkinázu
Úplným alebo parciálnym štiepením pCS2 rôznymi reštrikčnými enzýmami a nasledujúcim spracovaním T4 DNA-ligázou pri nízkych koncentráciách DNA sa konštruujú rôzne odštiepne deriváty. Výroba rôznych odštiepnych derivátov je zhrnutá v nasledujúcej tabuľke 3 a pozícia odštiepenia v rôznych derivátoch je znázornená na obr. 3. Na obr. 3 je taktiež nanesená schopnosť rezistencie kmeňov odvodených od Corynobacterium glutamicum ATCC 13032 voči AEC. Týmto spôsobom mohla byť ohraničená oblasť DNA, sprostredkujúca AEC-rezistenciu, na fragment DNA dlhý približne 1,5 kb, ktorá je obmedzená v plazmide pCS233 klonovacím štiepnym miestom Pstl a štiepnym miestom EcoRl.
Aktivita aspartátkinázy a inhibovateľnosť enzýmovej aktivity zmesami lyzínu, prípadne AEC a treonínu, sa stanovovala v konštruovaných klonoch. Pestovanie, izolácia a stanovenie aktivity sa uskutočňovali opísaným spôsobom. Okrem toho sa skúmala schopnosť rôznych klonov vylučovať L-lyzín. Na to sa používal difúzny test na agarových platniach s L-lyzín-auxotrofným indikačným kmeňom Corynobacterium glutamicum. Z tabuľky 4 je zrejmé, že všetky AEC-rezistentné kmene majú parciálne deregulovanú aktivitu aspartátkinázy a že sú schopné vylučovať L-lyzín.
Tabuľka 3
Výroba a AEC^-fenotyp rôznych štiepnych derivátov plazmidu pCS2
Plazmid Konštrukcia AECk/:i-fenotyp
pCS21 | vyrobený štiepením pCS2 pomocou BamHl | R |
PCS22 | vyrobený štiepením pCS2 pomocou BamHl a Bclľ | R |
pCS2 3 | vyrobený parciálnym štiepením pCS2 pomocou Sali | R |
pCS24 | vyrobený parciálnym štiepením. pCS2 pomocou Xhol | R |
pCS26 | vyrobený štiepením pCS2 pomocou Scal | R |
pCS231 | vyrobený parciálnym štiepenin pCS23 pomocou Pstl | S |
PCS232 | vyrobený parciálnym štiepením pCS23 pomocou Dral | s |
PCS233 | vyrobený parciálnym Štiepením pCS23 pomocou EcoRl | R |
Vysvetlivky: R = rezistencia
S = citlivosť
Na obr. 3 je znázornená schéma štiepenia plazmidu pCS2. V hornej časti obrázka sú znázornené deriváty odvodené od pCS2 a v dolnej časti obrázka deriváty odvodené od pCS23. Hranice ampicilínovej rezistencie pZl sú znázornené čierno; hranice kanamycínovej rezistencie sú znázornené bodkované a ostatné časti pZl plazmidu pCS2 sú vyšrafované. Inzercie DM58-1 DNA sú znázornené ako voľné pásy. Štiepenia sú označené čiarou. Vysvetlenia použitých skratiek:
B - BamHl, G - Beli, D - Dral, E - EcoRl, S - Sali,
A - Scal, M - Smal, X - Xhol.
Tabuľka 4
Mikrobiologické a biochemické charakteristiky rekombinantných kmeňov Corynobacterium glutamicum
Kmeň
ASA-DH AK | Reaktivita AK v pritoonosti | (Ϊ) aecr | Vylučovanie Lyzínu |
(11/ (U/ | 10mH 10mM lOOmM | 1 OOmH | |
mg 1 mg) | Lyi Lys Ly· | AEC | |
1mM 10mH 1OmM | 10mM | ||
rnr Thr Thr | Thr |
ATCC13032 0 (pZl J | 06 | 0.016 | 9 | S | 7 | - | |||
ATCC13032 1pCS21 | 3 | 9 | 0.013 | 55 | 55 | 28 | 56 | • | - |
ATCC13032 IpCS21) | n | 0.016 | 46 | 50 | 24 | · | • | - | |
ATCC13032 PCS2Z | n | 0.015 | 4 0 | 41 | 22 | n. | - | - | |
ATCC13032 (pCS23 í | 0 | 03 | 0.014 | 5 1 | 57 | 30 | 56 | • | • |
ATCC13O3Z <pCS24 > | 2 | 07 | 0.011 | 65 | 55 | 40 | 62 | • | • |
ATCC13O32 (DCSZ6) | 1 | aa | 0,015 | 64 | 53 | 39 | 60 | • | • |
ATCC13032 lPCS231) | 0 | 060 | 0,013 | 1 1 | 14 | 10 | - | - | |
ATCC13032 1pCS232) | n. | n. | n. | · | - | - | |||
ATCC13D32 1PCS233) | n | 0.011 | 56 | 62 | 36 | 57 | - | ||
DM5Í-1 IpZI) | 0 | 330 | 0.009 | 83 | 100 | 79 | 93 | • | • |
Použité skratky: ASA-DH: aspartyl-P-semialdehyddehydrogenáza
AK: aspartátkináza
n.: nezistené.
4. Sekvenovanie fragmentu DNA plazmidu pCS24, ktorý sprostredkuje fenotyp AEC-rezistencie
4.1 Metóda sekvenovania
Sekvencia nukleotidov 2,1 kb Pstl-Xhol-fragmetnu DNA sa zisťovala metódou Maxama a Gilberta (Maxam, A. M. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)) s modifikáciou podľa Arnolda a Puhlera (Arnold W. a kol, Gene, 70, 171 ff (1988)). Subklonovanie k sekvenovaniu pritom vychádzalo z plazmidu pCS24 (pozri obr. 4). Tento sa transformuje podľa Escherichia coli MM 294 (Merelson, M. a kol, Náture 217, 1110-1114 (1968)) a príslušné fragmenty sa klonujú do sekvenčných vektorov pSVB21, 25 a 26 (Arnold W. a kol., Gene, 70, 171 ff (1988)). V kmeni Escherichia coli JM83 (Mesing J., Recombinant DNA Technical Bulletin NIH Publication No. 79-99, 2, 43-48 (1979)) je možné dokázať aktiváciu inzercie pomocou testu Xgal (5-bróm-4-chlórindolyl-p-D-galaktipyranozid).
Stratégia sekvenovania je znázornená na obr. 4. Sekvencia nukleotidov sa zisťovala na obidvoch vetvách DNA s prekrývajúcimi sa klonmi.
Na obr. 4 je znázornená odštiepovacia analýza a stratégia sekvenovania chromozómového fragmentu plazmidu pCS2. Odštiepovacia analýza: Plazmidy pCS23 a pCS24 sprostredkovávajú taktiež ako kloň pCS2 AEC-rezistenciu a produkciu lyzínu. Šrafované pásy predstavujú podiel vektora v plazmide.
SK 279719 Β6
Stratégia sekvenovania: 2,1 kb Pstl-Xhol-fragment plazmidu pCS24 sa subklonoval so znázornenými reštrikčným štiepnymi miestami. Šípky vždy udávajú sekvenčný rozsah a smer čítania. Označené sú reštrikčné štiepne miesta enzýmov Dral (D), EcoRI (E), BglII (O), HindlII (H), Nael (A), PstI (P), Sali (S) a Xhol (X). Dolu sú znázornené dva čítacie rastre, ktoré kódujú pre podjednotky aspartátkinázy a pre aspartát-P-semialdehyddehydrogenázu (pozri text).
4.2 Sekvencia DNA 2,1 kb Pstľ-Xhol-fragmetnu DNA
Sekvenovaný úsek DNA je dlhý 2112 bp. Nesie reštrikčné štiepne miesta pre enzýmy BglII, Dral, EcoRI, Hindll, Nael, PstI, Sali a Xhol, s ktorými boli vyrobené aj subklony.
Sekvencia nukleotidov sa spracovala sekvenčnou analýzou podľa programového zväzku ANALYSEQ (Staden, R. a kol., Nucl. Acids Res. 14, 217-323 (1986)).
Na sekvenovanom úseku DNA sa nachádzajú dva otvorené čítacie rastre (ORF). Obidva sú usporiadané od štiepneho miesta PstI smerom k štiepnemu miestu Xhol. Medzi obidvoma sa nachádza len malá oblasť 26 bp. Pred 2. ORF sa nachádza miesto väzby ribozómov (RBS) (806-809 AGGA nasleduje štartkodón ATG). Vnútri 1. ORF bola lokalizovaná aj jedna RBS (AGGA, 268-271 so štartovacím kodónom GTG).
ORF 1 dĺžku 264 aminokyselín (AS), počítajúc od PstI miesta a 172 aminokyselín (zodpovedá 18,6 k Dals) od internej RBS. ORF 2 má dĺžku 342 aminokyselín (36,1 k Dals).
Priamo za ORF 2 sa nachádza možná transkripčná terminančná štruktúra, takzvaná vlasová ihlová slučka prebiehajúca od viacerých tymínových zvyškov (1864-1900). Toto usporiadanie je charakteristické pre p-nezávislé terminančné signály v Escherichia coli a iných bakteriálnych druhoch (Ahyda a kol., Ann. Rev. Biochem. 47, 967-996 (1978)). Tu predložený terminátor má stabilitu viac ako -40 kcal/mol pri 30 °C.
Možný promótor pre ORF 2 sa zistil vnútri ORF 1 (409-437), (TTGACA-17 bp-TATTCT). Oblasť -35 a vzdialenosť k oblasti -10 zodpovedajú presne E. coliConsensus-Promotor (Hawley, D. K. a kol., Nucl. Acids Res. 11, 2237-2255 (1983)), oblasť -10 je veľmi podobná E. coli-Consensusregion (TATAAT).
Ďalej je uvedená sekvencia DNA a odvodená sekvencia aminokyselín 2,1 kb Pstl-Xhol-fragmetnu.
u á S
Str li
Iis * o < n u w »
O iľ <3 .Sít
O cn
O co 00 r—t
O r*, co
O XD «Ο r-4
O CM
CO
Sekvencia aminokyselín ORF 1(1 až 794) a ORF 2 (821 až 1846) sa udávajú v trojpísmenovom kóde. Číslovanie pod linajkou sa týka sekvencie DNA. Názvy klonovacích štiepnych miest využitých pri sekvenovaní sú tiež uvedené pod linajkou. Miesta väzby ribozómov sú označené hviezdičkou. Štartovací kodón je označený šípkou a štruktúra terminátora plnou čiarou.
4.3 Analýza sekvencie aminokyselín
Sekvencia aminokyselín prenášaná pomocou ORF 1 a ORF 2 sa porovnávala so známymi sekvenciami aspartátkinázy AK I (Cassan, M. a kol., J. Biol. Chem. 261, 1052-1057 (1986)) z Escherichia coli a AK II z Bacillus subtilis (Chen, N. Y. a kol., J. Biol. Chem. 262, 8737-2255 (1987)), prípadne so sekvenciami aminokyselín aspartátsemialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) z Escherichia coli (Haziza C. a kol., Embo J. 1, 379-384 (1982)) a Streptococcus mutans (Cardineau G. A. a kol., J. Biol. Chem. 262, 7, 3344-3353 (1987)). Na to sa využili programy MALIGN (Sobel E. a kol., Nucl. Acids Res. 14, 363-374, (1986)) a DIAGON (Staden R. a kol., Nucl. Acid Res. 14, 217-232 (1986)). Ukázala sa signifikantná zhodnosť medzi ORF 1 a sekvenciou AK na jednej strane a medzi ORF 2 a sekvenciou ASA-DH zo Streptococcus mutans na druhej strane. Pre Escherichia coli sa ukázala v prípade ASA-DH len slabá homológia, najmä však v oblasti aktívneho centra (Haziza, C. a kol., Embo J. 1, 379-384 (1982)).
Z počítačovej analýzy vyplýva nasledovné:
- ORF 1 zodpovedá C-koncu aspartátkinázy, to znamená, že chýba asi 160 aminokyselín N-konca, ako i kompletná oblasť promótora.
- ORF 2 zodpovedá aspartátsemialdehyddehydrogenáze.
Homológia ORF 1 a AK II z Bacillus subtilis je odborníkom zrejmá. AK II pozostáva z prekrývajúcich sa podjednotiek (Chen, N. Y. a kol., J. Biol. Chem. 262, 8787-8798 (1987)). Pritom zodpovedá β-podjednotka C-konca α-podjednotky. Vzhľadom na to, že RBS zistená v ORF 1 sa zhoduje vo svojej polohe presne s RBS tejto aspartátkinázy, môže sa analogicky odvodiť, že tu existuje klonovaná β-podjednotka aspartátkinázy Corynobacterium glutamicum.
5. Skúmanie expresie
5.1 Komplementácia asd- a lysC-negatívnych kmeňov Escherichia coli
Identitu ORF 2 s génom asd je možné doložiť komplementáciou asd-negatívneho kmeňa Escherichia coli RASA 6 (Richaud, F. a kol., C. R. Acad. Sc. Paríš, 293, 507-512 (1981)) pomocou plazmidov pCS2 a pCS24. Plazmid pCS23, pri ktorom asi 30 aminokyselín C-konca ASA-DH chýba, nekomplementuje. Žiadny z týchto plazmidov nie je schopný komplementovať AKI-III negatívny kmeň Escherichia coli Gif 106 Ml (Boy, E. a kol., Biochémie 61, 1151-1160 (1979)).
5.2 Stanovenie špecifickej aspartátkinázy (AK) a aspartylβ-semialdehyddehydrogenázy (ASA-DH) v transformantoch ATCC 13032 s rôznymi štiepnymi derivátmi pCS2
Analogické závery odvodené v odseku 4.3 z porovnania homológií, podľa ktorých fragment génu Pstl-Xhol z DM58-1 obsahuje len časť génu lysC (AK), ale úplný gén asd, je možné jednoznačne potvrdiť enzýmovými meraniami.
Žiadny kmeň Corynobacterium glutamicum transformovaný pomocou pCS2 alebo derivátom pCS2 neobsahuje zvýšenú aspartátkinázovú aktivitu proti rodičovskému kmeňu (tabuľka 4, stĺpec 3).
SK 279719 Β6
Naproti tomu vo všetkých prípadoch transformantov, ktorých plazmidy obsahovali asd-štruktúmy gén, bola dokázateľná silná superexpresia aspartyl-p-scmialdchyddehydrogenázy (tabuľka 4, stĺpec 2, obr. 3 a 4). Plazmidy pCS23 a deriváty pCS23 nevedú podľa predpokladu k superexpresii aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy. Na základe vysokej lability aspartyl-P-semialdehyddehydrogenázy kolíšu faktory superexpresie, ktoré sa dajú vypočítať zo špecifickej aktivity, medzi hodnotami 31 až 65.
6. Enzymatické vlastnosti a vylučovanie L-lyzínu
Vylučovanie L-lyzínu v množstve 7,1 g/1 za 72 hodín dokázané pre ATCC 13032 pCS2 (pozri tabuľka 2) sa dá odvodiť na základe dvoch geneticky realizovaných zmien.
a) Klonovanie regulačnej podjednotky aspartátkinázy z DM58-1 bez zvýšenia bunkového obsahu enzýmu.
b) Klonovanie aspartyl-p-semialdehyddehydrogenázy zDM58-l, ktoré vedie k 31 až 65-násobnému zvýšeniu bunkového obsahu enzýmu.
Claims (5)
1. DNA-fragment, ktorý sa skladá z nukleotidovej sekvencie s dĺžkou 2,1 kb, ohraničený PstI- a Xhol- miestami štiepenia, vyznačujúci sa tým, že kóduje aminokysclinovú sekvenciu, uvedenú na obr. 5, a tým zabezpečuje produkciu proteínov vedúcich k aktivite aspartyl-P-semialdehyddehydrogenázy (asd) a kderegulácii aspartátkinázy (lysC) a je obsiahnutý v plazmide pCS2, ktorého delečná mapa je uvedená na obr. 3, uloženom v Corynobacterium glutamicum pod číslom DSM 5086.
2. Rekombinantná DNA odvodená z plazmidu pCS2 podľa nároku 1, charakterizovaná delečnou mapou zodpovedajúcou označeniu pCS26, uvedenou na obr. 3.
3. Rekombinantná DNA, odvodená z plazmidu pCS2 podľa nároku 1, charakterizovaná delečnými mapami zodpovedajúcimi označením pCS23 alebo pCS233 na obr. 3.
4. Spôsob výroby L-lyzínu fermentáciou mikroorganizmov rodu Corynobacterium alebo Brevibacterium, produkujúcich túto aminokyselinu, vyznačujúci sa t ý m , že mikroorganizmy obsahujú plazmid podľa nároku 1 alebo z nej odvodenú rekombinantnú DNA podľa nárokov 2 a 3.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že mikroorganizmom je Corynobacterium glutamicum DMS 5086.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3908201A DE3908201A1 (de) | 1989-03-14 | 1989-03-14 | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK279719B6 true SK279719B6 (sk) | 1999-02-11 |
SK122890A3 SK122890A3 (en) | 1999-02-11 |
Family
ID=6376268
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1228-90A SK122890A3 (en) | 1989-03-14 | 1990-03-14 | Dna fragment, recombinant dna and process for producing l-lysine |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0387527B1 (sk) |
JP (1) | JP3000087B2 (sk) |
AT (1) | ATE107699T1 (sk) |
DE (2) | DE3908201A1 (sk) |
ES (1) | ES2056263T3 (sk) |
SK (1) | SK122890A3 (sk) |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3943117A1 (de) * | 1989-12-27 | 1991-07-04 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
JPH07108228B2 (ja) * | 1990-10-15 | 1995-11-22 | 味の素株式会社 | 温度感受性プラスミド |
JP3473042B2 (ja) * | 1992-04-28 | 2003-12-02 | 味の素株式会社 | 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子 |
JP3783065B2 (ja) * | 1994-03-04 | 2006-06-07 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
JP4075087B2 (ja) | 1996-12-05 | 2008-04-16 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
DE19924364A1 (de) * | 1999-05-27 | 2000-11-30 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
US6927046B1 (en) | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
EP1307476A1 (en) * | 2000-08-02 | 2003-05-07 | Degussa AG | Nucleotide sequences which code for the mete gene |
EP1307477A2 (en) * | 2000-08-02 | 2003-05-07 | Degussa AG | Nucleotide sequences which code for the metf gene |
US6942996B2 (en) | 2000-08-02 | 2005-09-13 | Degussa Ag | Isolated polynucleotide from Corynebacterium encoding a homocysteine methyltransferase |
US6958228B2 (en) | 2000-08-02 | 2005-10-25 | Degussa Ag | Nucleotide sequence which code for the metH gene |
EP1307475A1 (en) * | 2000-08-02 | 2003-05-07 | Degussa AG | Nucleotide sequences which code for the meth gene |
DE10109690A1 (de) * | 2000-09-02 | 2002-03-14 | Degussa | Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
US6812016B2 (en) | 2000-09-02 | 2004-11-02 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the metY gene |
DE10044681A1 (de) * | 2000-09-09 | 2002-03-21 | Degussa | Neue für das lldD2-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
AU2001295470A1 (en) * | 2000-09-09 | 2002-03-22 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences which code for the gpmb gene |
AU2001287682A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-26 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences coding for the ftsx gene |
WO2002022668A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-21 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the roda gene |
DE10046625A1 (de) * | 2000-09-20 | 2002-04-11 | Degussa | Neue für das ndkA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
DE10047864A1 (de) * | 2000-09-27 | 2002-04-11 | Degussa | Neue für das truB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
US7026158B2 (en) | 2000-09-27 | 2006-04-11 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the mikE17 gene |
WO2002034775A2 (en) * | 2000-10-28 | 2002-05-02 | Degussa Ag | Nucleotide sequences encoding the hemd and hemb genes |
CA2437656C (en) | 2001-02-08 | 2009-06-30 | Archer-Daniels-Midland Company | Polynucleotide constructs for increased lysine production |
DE10155505A1 (de) | 2001-11-13 | 2003-05-22 | Basf Ag | Gene die für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Proteine codieren |
DE10210527A1 (de) | 2002-03-09 | 2003-09-18 | Degussa | Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien |
JP2008522609A (ja) | 2004-12-06 | 2008-07-03 | セージ バイオサイエンセズ インコーポレイテッド | 反芻動物の腸へ生物活性化合物を供給するための細菌の培養方法 |
DE102014208199A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
EP2940143B1 (de) | 2014-04-30 | 2020-02-05 | Evonik Operations GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
EP2940039A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-04 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems |
JP6720538B2 (ja) * | 2016-01-08 | 2020-07-08 | 日本製鉄株式会社 | 横架材、横架材を用いた面材の取り付け構造、及び横架材を用いた面材と枠材との取り付け構造 |
EP3467099A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-10 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
RU2019128538A (ru) | 2018-09-26 | 2021-03-11 | Эвоник Оперейшенс ГмбХ | Способ ферментативного получения l-лизина |
WO2022191357A1 (ko) * | 2021-03-09 | 2022-09-15 | 대상 주식회사 | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
WO2023222505A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
WO2023222510A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof |
WO2023222515A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
JPH0655149B2 (ja) * | 1985-03-12 | 1994-07-27 | 協和醗酵工業株式会社 | L―リジンの製造法 |
JPH06102028B2 (ja) * | 1985-10-04 | 1994-12-14 | 協和醗酵工業株式会社 | アミノ酸の製造法 |
-
1989
- 1989-03-14 DE DE3908201A patent/DE3908201A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-02-12 DE DE59006167T patent/DE59006167D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-02-12 ES ES90102685T patent/ES2056263T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-12 EP EP90102685A patent/EP0387527B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-12 AT AT90102685T patent/ATE107699T1/de active
- 1990-03-14 SK SK1228-90A patent/SK122890A3/sk unknown
- 1990-03-14 JP JP2061308A patent/JP3000087B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0387527A1 (de) | 1990-09-19 |
DE3908201A1 (de) | 1990-09-27 |
JP3000087B2 (ja) | 2000-01-17 |
JPH03219885A (ja) | 1991-09-27 |
EP0387527B1 (de) | 1994-06-22 |
ATE107699T1 (de) | 1994-07-15 |
SK122890A3 (en) | 1999-02-11 |
DE59006167D1 (de) | 1994-07-28 |
ES2056263T3 (es) | 1994-10-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SK279719B6 (sk) | Fragment dna, rekombinantná dna a spôsob výroby l- | |
Cremer et al. | Control of the lysine biosynthesis sequence in Corynebacterium glutamicum as analyzed by overexpression of the individual corresponding genes | |
RU2207376C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) | |
ES2314076T3 (es) | Bacterias corineformes que producen los compuestos quimicos ii. | |
US5661012A (en) | Method for the production of L-threonine by fermentation, using mutated DNA encoding aspartokinase III | |
KR100630604B1 (ko) | 아미노산 생산균의 작제 방법 및 작제된 아미노산생산균을 사용하는 발효법에 의한 아미노산의 제조 방법 | |
Rossmann et al. | Mechanism of regulation of the formate‐hydrogenlyase pathway by oxygen, nitrate, and pH: definition of the formate regulon | |
JP5756259B2 (ja) | L−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたl−リジン生産方法 | |
EP0358940B1 (en) | DNA fragment coding for phosphoenolpyruvat corboxylase, recombinant DNA carrying said fragment, strains carrying the recombinant DNA and method for producing L-aminino acids using said strains | |
US7604979B2 (en) | Method for producing an L-amino acid using a bacterium with an optimized level of gene expression | |
US7011961B2 (en) | Method for L-threonine production | |
JP2926991B2 (ja) | 発酵法によるl−リジン及びl−グルタミン酸の製造方法 | |
JPS6279788A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
KR19990077974A (ko) | L-글루타민산을생산하는박테리아및l-글루타민산을생산하는방법 | |
JP2003164297A (ja) | 新規変異型グルタミンシンテターゼ、およびアミノ酸の生産方法 | |
KR100505797B1 (ko) | 염색체 상의 fadR 유전자가 불활성화된 L-쓰레오닌 생성 변이 미생물과 이를 이용한 L-쓰레오닌의 제조방법 | |
KR970001238B1 (ko) | L-트립토판의 제조방법 | |
JP2000270888A (ja) | L−アミノ酸の製造方法 | |
DE60036615T2 (de) | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren durch verstärkung des tkt-gens | |
JPS62186795A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
SK16692000A3 (sk) | Spôsob fermentačnej výroby l-lyzínu použitím koryneformných baktérií | |
JP4120269B2 (ja) | メタノール資化性菌を用いたl−リジン又はl−アルギニンの製造法 | |
AU2001253134B2 (en) | Method for the production of bacterial toxins | |
RU2215785C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) | |
JPS63105688A (ja) | L−フエニルアラニンの製造法 |