SK142497A3 - Recombinant dna molecule, vector, transformed host, an antibody, cell culture and cell system, transgenic mammals, pharmaceutical composition, method of testing drug, assay system suitable for such method, and use of pharmaceutical composition - Google Patents

Abstract

The invention features a method for promoting neural growth in vivo in the mammalian central nervous system by administering a neural cell adhesion molecule which can overcome inhibitory molecular cues found on glial cells and myelin to promote neural growth. Also featured active fragments, cognates, congeners, mimics, analogs, secreting cells and soluble molecules thereof, as well as antibodies thereto, and DNA molecules, vectors and transformed cells capable of expressing them. The invention also includes transgenic mouse lines expressing a neural adhesion molecule in differentiated astrocytes, and cells and tissues derived therefrom. The expression of the neural adhesion molecule enhances neurite outgrowth on central nervous system tissue derived from these transgenic mice. The invention also features methods for enhancing neuronal outgrowth of CNS neurons, for enhancing memory and for increasing synaptic efficacy. Also featured are methods of testing drugs which modulate the effects of the neural adhesion molecule, and assay systems suitable for such methods.

Description

Je opísaná rekombinantná molekula DNA na podporu rastu in vivo v centrálnej nervovej sústave (CNS) cicavca obsahujúca látku vybranú zo skupiny skladajúcej sa z Ll, N-CAM a glykoproteinu asociovaného s myelínom, látku odvodenú z molekúl, ktoré obsahujú štruktúrne motívy podobné homológnym opakovaniam 1 až 2 vo fibronektíne typu III a doménam podobným imunoglobfnu I až II, III až IV a V až VI, ktoré sú spojené s expresnou kontrolnou sekvenciou, modulácia rastu neurónov v CNS, spôsoby a sprievodné látky, konštrukcie a prostriedky prispievajúce k zlepšeniu rastu neurónov v CNS. Ďalej je opísané používanie bunkových adhéznych molekúl, predovšetkým nervových adhéznych molekúl, ako aj L1 na podporu a zlepšenie takého rastu neurónov.A recombinant DNA molecule for promoting in vivo growth in the central nervous system (CNS) of a mammal comprising a substance selected from the group consisting of L1, N-CAM and a myelin-associated glycoprotein, a substance derived from molecules comprising structural motifs similar to homologous repeats is described. to 2 in fibronectin type III and immunoglobulin-like domains I to II, III to IV and V to VI associated with an expression control sequence, modulation of neuronal growth in the CNS, methods and accompanying agents, constructions, and means contributing to improving neuronal growth in CNS. The use of cellular adhesion molecules, in particular neural adhesion molecules, as well as L1, for promoting and improving such neuronal growth is described.

PťPT

Rekombinantná molekula DNA, vektor, transformovaný hostite!, protilátka, bunková kultúra a bunkový systém, transgénne cicavce, farmaceutický prostriedok, spôsob testovania látky a skúškový systém tohto testovania a použitie farmaceutického prostriedkuRecombinant DNA molecule, vector, transformed host, antibody, cell culture and cell system, transgenic mammals, pharmaceutical composition, method of testing the substance and assay system for such testing, and use of the pharmaceutical composition

Oblasť technikyTechnical field

Preložený vynález sa všeobecne týka modulácie rastu neurónov (nervových buniek) v centrálnej nervovej sústave a zvlášť spôsobov a sprievodných látok, konštrukcií a prostriedkov prispievajúcich k zlepšeniu rastu neurónov v centrálnej nervovej sústave. Predložený vynález sa týka najmä používania bunkových adhéznych molekúl a predovšetkým nervových adhéznych molekúl, ako je L1, za účelom podpory a zlepšenia takéhoto rastu neurónov.The present invention relates generally to the modulation of the growth of neurons (nerve cells) in the central nervous system, and in particular to methods and concomitants, constructions and means contributing to improving the growth of neurons in the central nervous system. In particular, the present invention relates to the use of cellular adhesion molecules, and in particular neural adhesion molecules such as L1, in order to promote and improve such neuronal growth.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Schopnosť neurónov predlžovať neurity je veľmi dôležitá pre tvorbu nervových spojení počas vývoja nervovej sústavy. Táto schopnosť je tiež potrebná na tvorbu nových spojení počas regenerácie, ak bola nervová sústava poškodená v dôsledku poranenia.The ability of neurons to prolong neurites is very important for the formation of neural connections during the development of the nervous system. This ability is also needed to establish new connections during regeneration if the nervous system has been damaged as a result of injury.

Neurity sa predlžujú predovšetkým počas vývoja centrálnej a periférnej nervovej sústavy všetkých druhov vyšších organizmov (Cajal (1928) Degeneration and regeneration in nervous systém, Oxford University Press, London). Táto vlastnosť prislúcha axónom a dendritom. Avšak u dospelých organizmov je obnovený rast axónov a dendritov v centrálnej nervovej sústave zastavený.Neurites extend mainly during the development of the central and peripheral nervous systems of all kinds of higher organisms (Cajal (1928) Degeneration and regeneration in the nervous system, Oxford University Press, London). This property belongs to axons and dendrites. However, the adult growth of axons and dendrites in the central nervous system is stopped.

V periférnej nervovej sústave sú axóny všetkýchIn the peripheral nervous system there are axons of all

r.r.

11211 stavovcov schopné po spôsobenom poranení opäť rásť (Cajal (1928); Martini (1994) J.Neurocytol. 23:1-28). Avšak u cicavcov je obnovený rast neuritov po poranení obmedzený len na neuritové výbežky. Obnovený rast v nervových procesoch je však možný u nižších druhov stavovcov (Stuermer et al. (1992) J.Neurobiol. 23:537-550). Naopak v centrálnej nervovej sústave má potenciál pre obnovený rast neuritov väčšina, ak nie všetky neuróny dospelých vyšších aj nižších stavovcov (Aguayo (1995) Axonal regeneration from injured neurons in the adult mamina lián centrál nervous systém. In:Synaptic Plasticity (Cotman, C. W.,ed.,) New York, The Guildford Press, pp.457-484).11211 vertebrates capable of growing again after injury (Cajal (1928); Martini (1994) J. Neurocytol. 23: 1-28). However, in mammals, restored neurite outgrowth after injury is limited to neurite outcrops only. However, restored growth in nerve processes is possible in lower vertebrate species (Stuermer et al. (1992) J. Neurobiol. 23: 537-550). Conversely, in the central nervous system, most, if not all, of adult and upper vertebrate neurons have the potential for restored neurite outgrowth (Aguayo (1995).): Synaptic Plasticity (Cotman, CW, ed., New York, The Guildford Press, pp.457-484).

Gliové bunky sú rozhodujúce determinanty kontrolujúce obnovený rast axónov. Gliové bunky cicavcov všeobecne umožňujú rast neuritov v centrálnej nervovej sústave počas vývoja (Silver et al. (1982) J. Comp. Neurol. 210:10-29; Niller et al. (1985) Develop. Biol. 111:35-41; Pollerberg et al. (1985) J. Celí. Biol. 101:1921-1929 a v periférnej nervovej sústave dospelých jedincov (Fawcett et al. (1990) Annu. Rev. Neuroscí. 13:43-60). Gliové bunky dospelej periférnej nervovej sústavy cicavcov môžu po spôsobenom poranení revertovať do určitého rozsahu na ich predchádzajúci rastový potenciál, čo im umožňuje podporovať regeneráciu (Kalderon (1988) J. Neurosci. Res. 21:501-512; Kliot et al. Included regeneration of dorsal root fibres into the adult mammalian spínal cord, In: Current Issues in Neural Regeneration, New York, pp. 311-328; Calstedt et al. (1989) Brain Res. Bull. 22:93-102). Gliové bunky centrálnej nervovej sústavy niektorých nižších stavovcov zostávajú permisívne na rast neuritov v dospelosti (Stuermer et al. (1992) J. Neurobiol. 23:537-550). Naopak gliové bunky centrálnej nervovej sústavy dospelých cicavcov nie sú schopné podporovať obnovenie rastu neuritov po poranení.Glial cells are critical determinants controlling renewed axonal growth. Mammalian glial cells generally allow neurite outgrowth in the central nervous system during development (Silver et al. (1982) J. Comp. Neurol. 210: 10-29; Niller et al. (1985) Develop. Biol. 111: 35-41; Pollerberg et al (1985) J. Cell Biol 101: 1921-1929 and in the adult peripheral nervous system (Fawcett et al. (1990) Annu. Rev. Neurosci. 13: 43-60). Adult peripheral nerve glial cells. mammalian systems may revert to some extent to their previous growth potential following injury, allowing them to promote regeneration (Kalderon (1988) J. Neurosci. Res. 21: 501-512; Kliot et al.) adult mammalian switch cord, In: Current Issues in Neural Regeneration, New York, pp. 311-328; Calstedt et al. (1989) Brain Res. Bull. 22: 93-102) .Glial cells of the central nervous system of some lower vertebrates remain permissive for adult neurite outgrowth (Stuermer et al. (1992) J. Neurobiol. 23: 537-550) In contrast, glial cells of the central nervous system of adult mammals are unable to promote the recovery of neurite outgrowth after injury.

Niekoľko rozpoznávacích molekúl, ktoré vydávajú pokyn na podporu alebo zastavenie rastu neuritov bolo identifikovaných (Martini (1996)). Medzi rozpoznávacímiSeveral recognition molecules that instruct or support neurite outgrowth have been identified (Martini (1996)). Between recognition

11211 molekulami podporujúcimi rast neuritov má prominentný význam nervová bunková adhézna molekula L1 (Schachner (1990) Seminars in the Neurosciences 2:497-507). Rast neuritov závislý na molekule L1 je sprostredkovaný homofilnou interakciou. L1 zosilňuje rast neuritov na neuritoch a Schwannových bunkách, ktoré exprimujú fibroblastoch transfekovaných molekulou L1The neurite cell adhesion molecule L1 is of prominent importance in the 11111 neurite growth promoting molecules (Schachner (1990) Seminars in the Neurosciences 2: 497-507). L1-dependent neurite outgrowth is mediated by homophilic interaction. L1 enhances neurite outgrowth on neurites and Schwann cells that express L1-transfected fibroblasts

Ll, a na (Bixby et al.L1, and na (Bixby et al.

Natl. Acad. Sci (1982) Proc et al. (1987)Natl. Acad. Sci. (1982) Proc et al. (1987)

U. S. A 84:2555-2559; Chang (1987) J. Celí Biol. 104:355-362; Lagenaur et al.U.S. A 84: 2555-2559; Chang (1987) J. Cell Biol. 104: 355-362; Lagenaur et al.

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84:7753-7757;Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 84: 7753-7757;

Seiheimer et al. (1988) J. Celí Biol. 107:341-351; Kadmon et al. (1990a) J. Celí Biol. 110:193-208; Wililams et al. (1992) J. Celí Biol. 119:883-892). Expresia Ll je značne zosilnená u dospelých myší po prerušení periférnych nervov (Nieke et al. (1985) Differentiation 30:141-151; Martini et al (1994a) Glia 10:70-74). Počas dvoch dní sa Ll nahromadí v miestach kontaktu medzi neurónmi a Schwannovými bunkami, kde sú koncentrované hlavne na bunkovom povrchu Schwannových buniek, a nie neurónov (Martini et al. (1994a)). Schopnosť homofilickej väzby molekuly Ll je ďalej zosilnená molekulárnou asociáciou s nervovou bunkovou adhéznou molekulou N-CAM (Kadmon et al. (1990a); Kadmon et al. (1990b) J. Celí Biol. 110:209-218 a 110:193-208; Horstkorte et al. (1993) J. Celí Biol. 121:1409-1421). Okrem svojich vlastností, ktoré podporujú rast neuritov, sa Ll zúčastňuje tiež na bunkovej adhézii (Rathjen et al. (1984) EMBO J. 3:1-10; .Kadmon et al. (1990b) J. Celí Biol.Seiheimer et al. (1988) J. Cell Biol. 107: 341-351; Kadmon et al. (1990a) J. Cell Biol. 110: 193-208; Wililams et al. (1992) J. Cell Biol. 119: 883-892). L1 expression is greatly enhanced in adult mice after peripheral nerve disruption (Nieke et al. (1985) Differentiation 30: 141-151; Martini et al (1994a) Glia 10: 70-74). Within two days, L1 accumulates at the sites of contact between neurons and Schwann cells, where they are mainly concentrated on the cell surface of Schwann cells and not neurons (Martini et al. (1994a)). The homophilic binding capability of the L1 molecule is further enhanced by molecular association with the nerve cell adhesion molecule N-CAM (Kadmon et al. (1990a); Kadmon et al. (1990b) J. Cell Biol. 110: 209-218 and 110: 193-208). Horstkorte et al (1993) J. Cell Biol. 121: 1409-1421). In addition to its neurite-enhancing properties, L1 also participates in cell adhesion (Rathjen et al. (1984) EMBO J. 3: 1-10; Kadmon et al. (1990b) J. Cell Biol.

110:209-218; Appel et al. (1993) J. Neurosci.110: 209-218; Appel et al. (1993) J. Neurosci.

13:4764-4775), ďalej na migrácii granulových buniek (Lindner et al. (1983) Náture 305:427-430) a tiež na myelinácii axónov (Vood et al.(1990) J. Neurosci. 10:3635-3645).13: 4764-4775), further on granular cell migration (Lindner et al. (1983) Nature 305: 427-430) and also on axon myelination (Vood et al. (1990) J. Neurosci. 10: 3635-3645) .

Ll obsahuje šesť imunoglohulínových domén a päť homológnych opakovaní podobných fibronektínu typu III. Ll pôsobí ako signálový prevodník, pričom proces rozpoznávania je prvým krokom v komplexnej sérii udalostí vedúcich ku zmenám v ustálenej úrovni intracelulárnych poslov. TýchtoL1 contains six immunoglohulin domains and five type III fibronectin-like homologous repeats. L1 acts as a signal transducer, the recognition process being the first step in a complex series of events leading to changes in the steady state level of intracellular messengers. these

11211 poslov zahŕňajú inozitol fosfáty, Ca^z+ , pH a cyklické nukleotidy. (Schuch et al. (1990) Neurón 3:13-20; von Bohlen a Hallbach et al. (1992) Eur. J. Neurosci. 4:896-909; Doherty et al. (1990) Curr. Opin. Neurobiol. 2:595-601), rovnako ako zmeny v aktivitách proteín kináz, ako sú proteín kináza C a pp60^c“^erc (Schuch et al. (1990) Neurón 3:13-20; átashi et al. (1992) Neurón 8:831-842). Ll je tiež asociovaná s kazeín kinázou typu II a inými neidentifikovanými kinázami, ktoré Ll fosforizujú (Sadoul et al. (1989) J. Neurochem. 328:251-254). Rast neuritov sprostredkovaný molekulou Ll je citlivý na blokovanie kanálu Ca^{2 +} typu L a na toxíne čierneho kašla (pertussis). Tieto nálezy ukazujú na dôležitosť kanálu Ca^{2 +} a proteinov G pri raste neuritov sprostredkovanom molekulou Ll (Williams et al. (1992) J. Celí Biol. 119:883-892). Molekula Ll je tiež prítomná na proliferujúcich, nezrelých astrocytoch v kultúre. Neuritový rast je na týchto bunkách podporovaný ovela lepšie na nediferencovaných, Ll imunonegatívnych, astrocytoch (Saad et al. (1991) J. Celí Biol. 115:473-484). Avšak v podmienkach in vivo bolo zistené, že astrocyty exprimujú Ll počas akéhokolvek vývojového stavu začínajúc 13. dňom embryonálneho vývoja až do dospelosti (Bartsch et al. (1989) J. Comp. Neurol. 284:451-462; a nepublikované údaje).11211 messengers include inositol phosphates, Ca ^{z +} , pH and cyclic nucleotides. (Schuch et al. (1990) Neuron 3: 13-20; von Bohlen and Hallbach et al. (1992) Eur. J. Neurosci. 4: 896-909; Doherty et al. (1990) Curr. Opin. Neurobiol. 2: 595-601), as well as changes in the activities of protein kinases such as protein kinase C, pp60 ^{c "tert} (Schuch et al. (1990) Neuron 3: 13-20; atashi et al. (1992) Neuron 8: 831-842). L1 is also associated with casein kinase type II and other unidentified kinases that phosphory L1 (Sadoul et al. (1989) J. Neurochem. 328: 251-254). L1-mediated neurite outgrowth is sensitive to L-type Ca ²⁺ channel blocking and pertussis toxin. These findings demonstrate the importance of the Ca ²⁺ channel and G proteins in L1-mediated neurite outgrowth (Williams et al. (1992) J. Cell Biol. 119: 883-892). The L1 molecule is also present on proliferating, immature astrocytes in culture. Neurite growth is promoted much better on these cells on undifferentiated, L1 immunonegative, astrocytes (Saad et al. (1991) J. Cell Biol. 115: 473-484). However, in vivo conditions, astrocytes have been found to express L1 during any developmental state beginning on day 13 of embryonic development until adulthood (Bartsch et al. (1989) J. Comp. Neurol. 284: 451-462; and unpublished data).

Ak má Ll kapacitu podporovať rast neuritov, je nutné zistiť, či expresia Ll a iných členov imunoglobulínovej rodiny v astrocytoch môže obísť potenciálne inhibičné molekulárne cesty, ktoré sa uvádzajú, že sú prítomné na gliových bunkách a myelíne v dospelej centrálnej nervovej sústave Schachner et al., Perspectives in Developm. Neurobiol. in Press: Schwab et al. (1993) ann. Rev. Neurosci. 16:565-595). Toto má zvláštny význam pre vývoj účinných stratégií slúžiacich na liečbu slabosti spôsobenej porušením alebo poranením nervových tkanív CNS a týka sa to podstaty tohoto vynálezu.If L1 has the capacity to promote neurite outgrowth, it is necessary to determine whether expression of L1 and other immunoglobulin family members in astrocytes can bypass potential inhibitory molecular pathways reported to be present on glial cells and myelin in the adult central nervous system Schachner et al. , Perspectives in Developm. Neurobiol. in Press: Schwab et al. (1993) ann. Rev. Neurosci. 16: 565-595). This is of particular importance for the development of effective strategies for the treatment of weakness caused by CNS nerve tissue damage or injury and relates to the nature of the present invention.

1121111211

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

V súlade s predloženým vynálezom a príslušné spôsoby vedúce k modulácii a najmä k takému rastu, ktorý môže v centrálnej nervovej sústave (CNS) v myelínovanom nervovom predloženého vynálezu, je opísaná látka nervového rastu byt podporovaný a predovšetkým tkanive. Látky, ktoré sú predmetom sú význačné vo svojej schopnosti podporovať taký nervový rast v prostredí, na ktoré sa tradične pozeralo ako na inhihujúce známe rastové faktory. Toto inhihujúce prostredie zahŕňa hlavne tie inhibičné molekuly, ktoré sú prítomné na gliových bunkách a myelíne centrálnej nervovej sústavy.In accordance with the present invention and associated methods leading to modulation, and in particular to such growth that can be in the central nervous system (CNS) in the myelinated nerve of the present invention, the described nerve growth agent is promoted and in particular tissue. The substances of interest are distinguished in their ability to promote such neural growth in an environment traditionally regarded as inhaling known growth factors. This inhibitory environment mainly includes those inhibitory molecules that are present on the glial cells and myelin of the central nervous system.

Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, patria do skupiny nervových bunkových adhéznych molekúl. Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, sú vybrané zo skupiny molekúl patriacich do imunoglohulínovej rodiny, obzvlášť tých členov, ktorí sprostredkovávajú nervovú bunkovú adhéziu nezávislú na Ca^{2 +}. Do tejto skupiny patria L1, N-CAM a glykoproteín asociovaný s myelínom. Iné bunkové adhézne molekuly, ktoré môžu tiež ovplyvňovať nervový rast v CNS sú laminín, fihronektín, N-cadhedrín, BSP-2 (myši N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NÍLE, Nr-CAM, TAG-1 (axonín), Ng-CAM a F3/F11.The compounds of the present invention belong to the group of nerve cell adhesion molecules. The compounds of the present invention are selected from the group of molecules belonging to the immunoglohulin family, particularly those members that mediate Ca ²⁺ independent neural cell adhesion. This group includes L1, N-CAM and myelin-associated glycoprotein. Other cell adhesion molecules that may also affect nerve growth in the CNS are laminin, fihronectin, N-cadhedrin, BSP-2 (N-CAM mice), D-2, 224-1A6-A1, L1-CAM, NIL, Nr- CAM, TAG-1 (axonin), Ng-CAM and F3 / F11.

Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, patria do novej rodiny tu uvádzanej ako rodina L1 nervových rekogničných molekúl. Táto rodina zahŕňa Ll, NgCAM, neurofascín, neuroglian z Drosophily, Ll.1 a L1.2 zo zehričky a iné molekuly. Táto skupina látok obsahuje domény podobné imunoglohulínu a opakovanie podobné fihronektínu, ktoré sú charakteristické u Ll a v tejto súvislosti vykazujú pozoruhodnú kolinearitu, vysoký stupeň N-glykozidicky spojených karbohydrátov, ktoré zahŕňajú karbohydrátovú štruktúru HNK-1, a vykazujú vzor proteínových fragmentov obsahujúcich hlavný pruh 185 kD a menšie pruhy 165 a 125 kD.The compounds of the present invention belong to a new family referred to herein as the L1 family of neural recognitive molecules. This family includes L1, NgCAM, neurofascin, neuroglian from Drosophila, L1.1 and L1.2 from ragwort and other molecules. This group of substances contains immunoglohulin-like domains and fihronectin-like repeats that are characteristic of L1 and show remarkable colinearity in this respect, a high degree of N-glycosidically linked carbohydrates that include the carbohydrate structure of HNK-1, and smaller lanes 165 and 125 kD.

Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, tiežThe compounds of the present invention, too

11211 zahŕňajú fragmenty bunkových adhéznych molekúl a ich napodobeniny, ktoré modulujú rast neuritov v CNS. Tieto látky zahŕňajú zvlášť molekuly, ktoré obsahujú štruktúrne motívy charakteristické pre extracelulárny matrix, najmä opakovania podobné fibronektinu typu III a doménam podobným imunoglobulínu. Tieto štruktúrne motívy zahŕňajú predovšetkým tie, ktoré sú štruktúrne podobné opakovaniam 1 až 2 u fibronektinu typu III a doménam podobným imunoglobulínu I až II, III až IV a V až VI.11211 include fragments of cell adhesion molecules and imitations thereof that modulate neurite outgrowth in the CNS. These include, in particular, molecules which contain structural motifs characteristic of extracellular matrix, in particular fibronectin-like type III repeats and immunoglobulin-like domains. These structural motifs include, in particular, those that are structurally similar to repeats 1 to 2 of fibronectin type III and immunoglobulin-like domains I to II, III to IV and V to VI.

Predložený vynález sa týka spôsobov podporujúcich a zosilňujúcich nervovú regeneráciu in vivo a príslušných genetických konštrukcií, ako sú plazmidy, vektory, transgény, apod., a tiež farmaceutických prostriedkov, ktoré môžu byť použité na zvládnutie podstaty týchto spôsobov. Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu byť pripravené najmä ako vektory alebo plazmidy a vnesené do nervových buniek centrálnej nervovej sústavy, teda tam, kde je regenerácia potrebná, napr. technikami génovej terapie tak, aby došlo k podpore požadovaného nervového rastu. Iná stratégia má za ciel formuláciu jednej alebo viacerých látok v prostriedku, ktorý môže byť podobne priamo dopravený na miesto CNS, ako je parenterálne podanie. Podanie takéhoto prostriedku môže skôr slúžiť za účelom inhibície než podpory nervového rastu vplyvom homofilickej väzby. Tento efekt môže byť potrebný v zvláštnych prípadoch, kde sa môže objaviť alebo sa už objavuje nežiadúci alebo nekontrolovateíný rast, čoho sa rozšírené týka tento vynález.The present invention relates to methods for promoting and enhancing neural regeneration in vivo and related genetic constructs, such as plasmids, vectors, transgenes, and the like, as well as pharmaceutical compositions that can be used to master the nature of these methods. In particular, the compounds of the present invention can be prepared as vectors or plasmids and introduced into nerve cells of the central nervous system, i.e., where regeneration is needed, e.g. gene therapy techniques to promote the desired neural growth. Another strategy aims to formulate one or more substances in a composition that can similarly be delivered directly to the CNS site, such as parenteral administration. Administration of such a composition may serve to inhibit rather than promote neural growth due to homophilic binding. This effect may be desirable in special cases where undesirable or uncontrolled growth may occur or is already occurring, to which the present invention extends.

V zhode s tým schopnosť látok podielať sa na homofilickej väzbe spôsobuje schopnosť antagonistov k týmto látkam, vrátane protilátok, pôsobiť ako aktivátory a tým participovať na podpore nervového rastu a regenerácii. Tento vynález sa tak rozšírené týka aj prípravy vhodných konštrukcií a prípravkov obsahujúcich protilátky k týmto látkam za účelom terapeutického použitia. Protilátky k L1 môžu tiež, napr., napomáhať sčasti ku skúškam vedúcim k objavu týchto látok alebo k identifikácii ďalších látok,Accordingly, the ability of substances to participate in homophilic binding causes the ability of antagonists to these substances, including antibodies, to act as activators and thereby participate in promoting nerve growth and regeneration. Thus, the present invention also extends to the preparation of suitable constructs and compositions containing antibodies thereto for therapeutic use. Antibodies to L1 may also, for example, assist in part in the tests leading to the discovery of these substances or the identification of other substances,

11211 ktoré môžu mat aktivitu a využitie ako v diagnostike, tak aj v terapii, v zhode s predloženým vynálezom. Hlavne, ako je opísané nižšie s odkazom na izoláciu a charakterizáciu CHL1, čo je analóg L1, protilátky ako polyklonálne protilátky môžu byt použité na identifikáciu ďalších členov rodiny L1 CAM molekúl. Predložený vynález sa teda rozšírené týka aj takýchto členov CAM, ktoré sú izolované použitím týchto protilátok. Tento vynález tiež zahŕňa diagnostické aplikácie, kde je napríklad potrebné určiť potenciál pre nervový rast, alebo pre aktuálny vývoj tohoto rastu v CNS pomocou detekcie a merania prítomnosti, množstva a aktivity jednej alebo viacerých látok, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu. Podobne, ako je opísané nižšie, tento vynález sa týka skúšok, vrátane skúšok vedúcich k objavu týchto látok, ktoré aktivujú látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu. Napr., nejaké látky môžu byt testované na moduláciu pomocou skúšky obsahujúcej látku, ktorá je predmetom predloženého vynálezu, alebo bunkovú líniu alebo kultúru vyvinutú v spojení s ňou.11211 which may have activity and use in both diagnostics and therapy, in accordance with the present invention. In particular, as described below with reference to the isolation and characterization of CHL1, which is an L1 analogue, antibodies such as polyclonal antibodies can be used to identify other members of the L1 family of CAM molecules. Thus, the present invention also extends to such CAM members that are isolated using these antibodies. The invention also encompasses diagnostic applications where, for example, it is necessary to determine the potential for neural growth or the actual development of this growth in the CNS by detecting and measuring the presence, amount and activity of one or more substances of the present invention. Similarly, as described below, the present invention relates to assays, including assays leading to the discovery of these substances, which activate the substances of the present invention. For example, some agents may be tested for modulation by an assay comprising the agent of the present invention, or a cell line or culture developed in conjunction therewith.

Krátko opísané, predložený vynález tiež zahŕňa transgénne myšie línie exprimujúce nervovú adhéznu molekulu v diferencovaných astrocytoch a gliových bunkách a v bunkách a v tkanivách z nich odvodených. Toto sa týka obzvlášť nervovej adhéznej molekuly L1. Astrogliálna expresia L1 zosilňuje rast neuritov v tkanive centrálnej nervovej sústavy odvodenej z týchto transgénnych myší.Briefly described, the present invention also encompasses transgenic mouse lines expressing a neural adhesion molecule in differentiated astrocytes and glial cells and in cells and tissues derived therefrom. This is particularly true of the nerve adhesion molecule L1. Astroglial L1 expression enhances neurite outgrowth in central nervous system tissue derived from these transgenic mice.

Tiež, ako je opísané, tento vynález zahŕňa spôsoby vedúce k zosilneniu rastu neurónov CNS, k zlepšeniu pamäti a ku zvýšeniu synaptickej výkonnosti, ako je to merané pomocou stabilizácie dlhodobej potenciácie a inými podobne užitočnými metódami. Zahrnuté sú tiež spôsoby testovania látok a iné manipulácie, ktoré upravujú pôsobenie tejto nervovej adhéznej molekuly.Also, as described, the present invention encompasses methods leading to enhancing CNS neuronal growth, improving memory, and increasing synaptic performance as measured by stabilizing long-term potentiation and other similarly useful methods. Also included are methods of testing substances and other manipulations that modulate the action of this neural adhesion molecule.

V zhode s tým je hlavnou podstatou tohoto vynálezu poskytnúť transgénny organizmus cicavca, ktorého gliové bunky exprimujú exogénne nervové adhézne molekuly.Accordingly, it is a main object of the present invention to provide a transgenic organism of a mammal whose glial cells express exogenous neural adhesion molecules.

1121111211

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť bunkovú kultúru obsahujúcu gliové bunky transgénneho organizmu cicavca.It is another object of the present invention to provide a cell culture comprising glial cells of a transgenic mammalian organism.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť systém bunkovej kultúry obsahujúci poškodené alebo nepoškodené optické neuróny alebo iné časti nervového systému transgénneho organizmu cicavca.It is another object of the present invention to provide a cell culture system comprising damaged or undamaged optical neurons or other parts of the nervous system of a transgenic mammal.

Ešte ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako posilniť nervový rast neurónov CNS, ktorý zahŕňa pestovanie týchto neurónov na systéme kultúry gliových buniek.Yet another object of the present invention is to provide a method for enhancing the neural growth of CNS neurons, which involves growing these neurons on a glial cell culture system.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob ako posilniť nervový rast neurónov CNS, ktorý zahŕňa pestovanie týchto neurónov na optických neurónoch alebo iných častiach nervového systému umiestnenom v systéme bunkovej kultúry.It is a further object of the present invention to provide a method for enhancing the nerve growth of CNS neurons, which comprises culturing these neurons on optical neurons or other parts of the nervous system located in a cell culture system.

Ešte ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako posilniť rast neurónov CNS, ktorý zahŕňa sekréciu nervovej adhéznej molekuly implantovanou bunkou.Yet another object of the present invention is to provide a method of enhancing CNS neuronal growth, which involves secretion of a nerve adhesion molecule by an implanted cell.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť pamäť, čo zahŕňa aplikáciu množstva buniek optického nervu alebo iných častí nervového systému umiestnených v systéme bunkovej kultúry do mozgu cicavca za účelom zlepšenia pamäti.It is a further object of the present invention to provide a method for improving memory, which comprises applying a plurality of optic nerve cells or other parts of the nervous system located in a cell culture system to a mammalian brain to improve memory.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť pamäť, zahŕňajúce dopravenie vektoru, ktorý umožňuje expresiu nervovej adhéznej molekuly v gliových bunkách, ku gliovým bunkám mozgu cicavca, ktorý má potrebu takéhoto zlepšenia pamäti.It is another object of the present invention to provide a method for improving memory, comprising delivering a vector that allows expression of a neural adhesion molecule in glial cells to glial cells of a mammalian brain in need of such memory improvement.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť pamäť, čo zahŕňa sekréciu nervovej adhéznej molekuly implantovanou bunkou.It is a further object of the present invention to provide a way to improve memory, which includes secretion of a neural adhesion molecule by an implanted cell.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť synaptickú účinnosť v CNS cicavca, ktorý má túto potrebu, zahŕňajúci podávanie množstva buniek systému gliovej bunkovej kultúry do mozgu cicavca.It is another object of the present invention to provide a method for improving synaptic efficacy in a mammalian CNS in need thereof, comprising administering a plurality of cells of the glial cell culture system to the mammalian brain.

1121111211

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť synaptickú výkonnosť v CNS cicavca, ktorý má túto potrebu, zahŕňajúci podávanie množstva buniek optického nervu alebo iných častí nervového systému umiestnených v systéme bunkovej kultúry do mozgu cicavca.It is a further object of the present invention to provide a method of improving synaptic performance in a mammalian CNS in need thereof, comprising administering to the mammalian brain the plurality of optic nerve cells or other parts of the nervous system located in the cell culture system.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť synaptickú účinnosť v CNS cicavca, ktorý má túto potrebu, čo zahŕňa dopravenie vektoru, ktorý umožňuje expresiu nervovej adhéznej molekuly v gliových bunkách, do gliových buniek mozgu cicavca.It is another object of the present invention to provide a method for improving synaptic efficacy in a mammalian CNS in need thereof, comprising delivering a vector that allows expression of a neural adhesion molecule in glial cells to glial cells of the mammalian brain.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť synaptickú výkonnosť, čo zahŕňa sekréciu nervovej adhéznej molekuly implantovanou bunkou.It is another object of the present invention to provide a way to improve synaptic performance, which includes secretion of a neural adhesion molecule by an implanted cell.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob testovania schopnosti látky alebo inej entity modulovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa pridanie neurónov CNS do systému gliovej bunkovej kultúry; pridanie testovanej látky do systému bunkovej kultúry; meranie neuronálneho rastu neurónov CNS; korelovanie rozdielu v úrovni neuronálneho rastu buniek v prítomnosti tejto látky voči kontrolnej kultúre, do ktorej nebola pridaná žiadna látka.It is another object of the present invention to provide a method for testing the ability of a substance or other entity to modulate the activity of a neural adhesion molecule, which comprises adding CNS neurons to the glial cell culture system; adding the test substance to the cell culture system; measuring neuronal growth of CNS neurons; correlating the difference in the level of neuronal growth of cells in the presence of this substance to a control culture to which no substance was added.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob testovania schopnosti látky alebo inej entity modulovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa pridanie neurónov CNS do optického nervu alebo iných častí nervového systému bunkovej kultúry; pridanie testovanej látky do systému bunkovej kultúry merania neuronálneho rastu neurónov CNS; korelovanie rozdielu v úrovni neuronálneho rastu buniek v prítomnosti tejto látky voči kontrolnej kultúre, do ktorej nebola pridaná žiadna látka.It is another object of the present invention to provide a method for testing the ability of a substance or other entity to modulate the activity of a neural adhesion molecule, which involves adding CNS neurons to the optic nerve or other parts of the nervous system of the cell culture; adding the test substance to the cell culture system of measuring the neuronal growth of CNS neurons; correlating the difference in the level of neuronal growth of cells in the presence of this substance to a control culture to which no substance was added.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť testovací systém na skúšanie látok na ich schopnosť modulovať produkciu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa systém gliovej bunkovej kultúry a neurónov CNS pridaných do tohoto systému.It is another object of the present invention to provide a test system for testing substances for their ability to modulate the production of a neural adhesion molecule, which includes a glial cell culture system and CNS neurons added to the system.

1121111211

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť testovací systém na skúšanie schopnosti látok modulovať produkciu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa pestovanie systému gliovej bunkovej kultúry zaočkovanej týmito látkami; pridanie neurónov CNS do systému bunkovej kultúry; a sledovanie neuronálneho rastu za účelom stanovenia vplyvu látky.It is a further object of the present invention to provide a test system for testing the ability of substances to modulate the production of a neural adhesion molecule, which includes culturing a glial cell culture system inoculated with these substances; adding CNS neurons to the cell culture system; and monitoring neuronal growth to determine the effect of the substance.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť testovací systém na skúšanie schopnosti látok modulovať produkciu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa pestovanie optického nervu alebo iných častí nervového systému umiestneného v systéme bunkovej kultúry zaočkovanej týmito látkami; pridanie neurónov CNS do systému bunkovej kultúry; a sledovanie neuronálneho rastu za účelom stanovenia vplyvu látky.It is another object of the present invention to provide a test system for testing the ability of a substance to modulate the production of a neural adhesion molecule, which comprises growing an optical nerve or other parts of the nervous system located in a cell culture system inoculated with such substances; adding CNS neurons to the cell culture system; and monitoring neuronal growth to determine the effect of the substance.

Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť testovací systém na skúšanie schopnisti látok modulovať produkciu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa neurónov CNS týmito látkami; pridanie adhéznej molekuly; a sledovanie neuronálneho rastu za účelom stanovenia vplyvu látky.It is another object of the present invention to provide a test system for testing the ability of agents to modulate the production of a neural adhesion molecule, which includes CNS neurons by these agents; adding an adhesion molecule; and monitoring neuronal growth to determine the effect of the substance.

Iné podstaty a výhody sa stanú zjavnými odborníkom v odbore z prehľadu následného podrobného opisu uvedeného s odkazom na obrázky.Other features and advantages will become apparent to those skilled in the art from a review of the following detailed description given with reference to the drawings.

zaočkovanie kultúry rozpustnej nervovejinoculation of a soluble nerve culture

1121111211

Prehľad obrázkov na výkreseOverview of the figures in the drawing

Obr.l ukazuje mapu chimérického transgénu GFAP-L1. Myšia cDNA Ll dlhá 4,05 kb bola vnesená do exónu 1 upraveného génu GFAB pomocou linkerov Nôti. V tejto konštrukcii je pred cDNA Ll miesto zostrihu neskorého génu SV40 (V) a za cDNA Ll je polyadenylačné signálové miesto (pA) SV40. Umiestnenie kodónu ATG od L1 a polyadenylačný signál sú znázornené. Exóny sú znázornené ako obdĺžniky.Fig. 1 shows a map of the chimeric transgene of GFAP-L1. A 4.05 kb L1 mouse cDNA was inserted into exon 1 of the engineered GFAB gene using Note linkers. In this construction, the L40 cDNA is downstream of the SV40 (V) late gene, and the L40 cDNA is the polyadenylation signal site (pA) of SV40. The AT1 codon location from L1 and the polyadenylation signal are shown. Exons are shown as rectangles.

Obr.2 ukazuje analýzu Nothern blot RNA z mozgu pochádzajúcu z rôznych transgénnych línií. 10 ug celkovej RNA z celého dospelého mozgu bolo nanesených do každej dráhy a bolo próbovaných myšou cDNA L1. Doba expozície bola 3 dni. Dráhy 1 až 3, mozgy od rôznych transgénnych mláďat (dráha 1: línia 3426; dráha 2: línia 3427; dráha 3: línia 3418; dráha 4: mozog z netransgénnej kontroly). Je vidieť, že hladina transgénnej mRNA Ll (šípka) je rôzna pri troch transgénnych líniách, pričom najvyššia je pri línii 3426, stredná pri línii 3427 a najnižšia pri línii 3418. Pozícia rRNA 28S a 18S je ukázaná na pravom okraj i.Fig. 2 shows analysis of Northern blot of RNA from brain derived from different transgenic lines. 10 µg of total adult brain RNA was loaded into each lane and probed with mouse L1 cDNA. The exposure time was 3 days. Lanes 1-3, brains from various transgenic pups (lane 1: lane 3426; lane 2: lane 3427; lane 3: lane 3418; lane 4: brain from non-transgenic control). It can be seen that the level of transgenic L1 mRNA (arrow) varies across the three transgenic lines, with the highest being at 3426, intermediate at 3427, and lowest at 3418. The position of rRNA 28S and 18S is shown to the right margin i.

Obr.3 ukazuje umiestnenie mRNA L1 v dospelých nepoškodených (A, C a E) a poškodených (15 dní po poškodení, Ba D) optických nervoch z netransgénnej (A, B a E) a transgénnej myši (C a D) z línie 3426 metódou hybridizácie in situ. U zvierat divokého typu je mRNA L1 detekovateľná len v neuronálnych bunkách sietnice, ale nie v gliových bunkách optického nervu (A a B). U transgénnych zvierat sú viditeľné bunky obsahujúce transkripty Ll v optickom nerve (C a D). Hustota buniek pozitívnych na Ll je najvyššia v nemyelínovej bližšej časti nervu. Hustota buniek pozitívnych na Ll v nerve je mierne zvýšená po poškodení (porovnajte C a D). Rozmiestnenie buniek exprimujúcich Ll (C a D) je v optickom nerve podobné ako u buniekFigure 3 shows the placement of L1 mRNA in adult intact (A, C and E) and injured (15 days after injury, Ba D) optical nerves from non-transgenic (A, B and E) and transgenic mice (C and D) from line 3426 in situ hybridization method. In wild-type animals, L1 mRNA is detectable only in retinal neuronal cells but not in optic nerve glial cells (A and B). In transgenic animals, cells containing L1 transcripts in the optic nerve (C and D) are visible. The density of L1-positive cells is highest in the non-myelin closer part of the nerve. The density of L1-positive cells in the nerve is slightly increased after injury (compare C and D). The distribution of L1-expressing cells (C and D) in the optic nerve is similar to that of cells

11211 exprimujúcich GFAB (E). Meradlo u E je 100 um (pre A až E).11211 expressing GFAB (E). The scale at E is 100 µm (for A to E).

Obr.4 ukazuje lokalizáciu L1 (A a poškodených (28 z dospelých transgénnych a zvierat divokého typu (C) dvojitú imunofluorescenčnú mikroskopickú a B) a GFAP (C) nepoškodených (A a C) dní po poškodení, B) optických nervov zvierat (línia 3426, A a B) Imunoreaktivita Ll v optických nervoch transgénnych zvierat je podstatne zvýšená po poškodení (porovnajte Ä a B). Vzor imunoreaktivity L1 pri poškodených transgénnych nervoch je podobný vzoru imunofarbenia GFAP v nepoškodených nervoch divokého typu. Gandliónové axóny nemyelínovaných sietnicových buniek pozitívnych na Ll sú prítomné v nepoškodenom nerve divokého typu (A). Meradlo u C je 50 um (pre A až C).Fig. 4 shows the localization of L1 (A and injured (28 of adult transgenic and wild-type animals (C) by double immunofluorescence microscopy and B) and GFAP (C) intact (A and C) days after injury, B) optical nerves of animals (line 3426, A and B) L1 immunoreactivity in the optic nerves of transgenic animals is significantly increased after injury (compare A and B). The L1 immunoreactivity pattern in damaged transgenic nerves is similar to that of GFAP immunostaining in intact wild-type nerves. Gandlion axons of non-myelinated L1-positive retina cells are present in the intact wild-type nerve (A). The scale at C is 50 µm (for A to C).

Obr.5 ukazuje dvojitú imunofluorescenčnú mikroskopickú lokalizáciu L1 (A a D) a GFAP (B a E) v pestovaných astrocytoch z transgénnych zvierat línie 3426 (A, B a C) a zvierat divokého typu (D, E a F). Je vidieť, že len bunky z transgénnych zvierat exprimujú Ll, a astrocyty zo zvierat divokého typu sú negatívne na Ll. Meradlo u F je 30 um (pre A až F).Figure 5 shows the dual immunofluorescence microscopic localization of L1 (A and D) and GFAP (B and E) in cultured astrocytes from transgenic line 3426 (A, B and C) and wild type (D, E and F) animals. It can be seen that only cells from transgenic animals express L1, and astrocytes from wild-type animals are L1 negative. The scale at F is 30 µm (for A to F).

Obr.6 ukazuje (A) analýzu Western blot poškodených (15 dní po poškodení) a nepoškodených optických nervov z transgénnych zvierat a zvierat divokého typu. 25 UW celkového proteínu poškodených (dráhy 1, 3 a 5) alebo nepoškodených nervov a detekovaných pomocou purifikovaných proti Ll z myšej transgénnej (dráhy 3 a 4) a vidieť zvýšenie v porovnaní s netransgénnymi kontrolami, optického nervu sa zvýšenie množstva u transgénnych zvierat, a naopak množstvo línie 3426 zo zvierat divokého v expresii Ll u (dráhy 2, 4 a 6) bolo nanesených polyklonálnych protilátok afinitne Proteínové extrakty boli pripravené (dráhy 1 a 2), 3427 typu (dráhy 5 a 6). Je transgénnych zvierat Po poškodeníFigure 6 shows (A) Western blot analysis of injured (15 days post-injury) and intact optic nerves from transgenic and wild-type animals. 25 UW of total protein damaged (lanes 1, 3 and 5) or intact nerves and detected using L1 purified from mouse transgenic (lanes 3 and 4) and see an increase compared to non-transgenic controls, optic nerve increase in transgenic animals, and in contrast, a plurality of line 3426 from wild-type L1 u expression (lanes 2, 4 and 6) was loaded with polyclonal antibodies affinity. Protein extracts were prepared (lanes 1 and 2), type 3427 (lanes 5 and 6). Is Transgenic Animals After Damage

Llll

Ll objavilo u zvieratL1 appeared in animals

11211 divokého typu kleslo. Molekulové hmotnosti (v kD) sú vyznačené na ľavom okraji.11211 wild type dropped. Molecular weights (in kD) are indicated on the left margin.

Obr.7 ukazuje príklady rastu neuritov z myších cerebelárnych neurónov pestovaných na kryostatových sekciách optických nervov divokého typu (Ä a B) a transgénnych (C a D) zvierat (línia 3426). A a C predstavujú nepoškodené optické nervy, B a D reprezentujú poškodené optické nervy. Meradlo u D je 50 μπ> (pre Ά až D).Figure 7 shows examples of neurite outgrowth from mouse cerebellar neurons grown on cryostat sections of wild-type (A and B) and transgenic (C and D) optic nerve animals (line 3426). A and C represent intact optic nerves, B and D represent damaged optic nerves. The meter at D is 50 μπ> (for Ά to D).

Obr.8 ukazuje a porovnáva dĺžky neuritov cerebelárnych neurónov udržiavaných na kryostatových sekciách nepoškodených (c) a poškodených (1) optických nervoch (28 dní po poškodení) zo zvierat divokého typu (WT) a transgénnych zvierat (línia 3426, 3427 a 3418). Je vidieť, že dĺžka neuritov na sekciách z transgénnych zvierat je väčšia než na sekciách zo zvierat divokého typu. Neurity transgénnych línií sú vždy dlhšie na poškodených než na nepoškodených nervoch. Na druhej strane dĺžky neuritov na nepoškodených alebo poškodených nervoch zvierat divokého typu nevykazujú významný rozdiel. Je vidieť, že dĺžka neuritov koreluje pozitívne s hladinou expresie Ll pri rôznych transgénnych líniách (viď tiež údaje z analýzy Western blot). Stredná hodnota ± štandardná odchýlka priemeru od jedného reprezentatívneho pokusu (z 12) je znázornená.Figure 8 shows and compares neurite lengths of cerebellar neurons maintained on cryostat sections intact (c) and damaged (1) optic nerves (28 days after injury) from wild type (WT) and transgenic animals (lines 3426, 3427 and 3418). It can be seen that the length of neurites in sections from transgenic animals is greater than in sections from wild-type animals. The neurites of the transgenic lines are always longer on the damaged than on the damaged nerves. On the other hand, neurite lengths on undamaged or damaged nerves of wild-type animals do not show a significant difference. It can be seen that neurite length correlates positively with the level of L1 expression in various transgenic lines (see also data from Western blot analysis). The mean ± standard deviation of the mean from one representative experiment (of 12) is shown.

Obr.9 je graf znázorňujúci dĺžky neuritov cerebelárnych neurónov udržiavaných na kryostatových sekciách nepoškodených (c) a poškodených (1) optických nervov (28 dní po poškodení) zo zvierat divokého typu (WT) a transgénnych zvierat bez preinkuhácie a po preinkubácii sekcii s afinitne purifikovanými polyklonálnymi protilátkami proti L1 (anti Ll) a proti myším pečeňovým membránam (anti pečeň). Neuritové dĺžky na neurónoch bez preinkuhácie s akýmikoľvek protilátkami boli vzané. ako 100% a neuritové dĺžky na sekciách tých istých neurónov získaných po pôsobeníFig. 9 is a graph showing neurite lengths of cerebellar neurons maintained on cryostat sections intact (c) and damaged (1) optic nerves (28 days after injury) from wild type (WT) and transgenic animals without preincubation and after preincubation with affinity purified sections. polyclonal antibodies against L1 (anti L1) and against mouse liver membranes (anti liver). Neurite lengths on neurons without preincubation with any antibodies were taken. as 100% and neurite lengths on sections of the same neurons obtained after treatment

11211 protilátky boli vyjadrené v pomere k tejto hodnote. Významné zníženie (60JK) dĺžky neuritov pôsobením protilátok proti Ll bolo zistené na kryostatových sekciách z transgénnych zvierat. Čísla hore predstavujú celkový počet neurónov meraných pre každú hodnotu. Stredné hodnoty ± štandardná odchýlka sú z najmenej štyroch nezávislých experimentov vykonaných vo dvojici.11211 antibodies were expressed relative to this value. A significant decrease (60 JK) of neurite length by anti-L1 antibodies was found in cryostat sections from transgenic animals. The numbers above represent the total number of neurons measured for each value. The mean ± standard deviation is from at least four independent experiments performed in pairs.

neuritové dĺžky myších (B) neurónov na povrchuneurite lengths of mouse (B) neurons on the surface

Obr.10 ukazuje a porovnáva cerebelárnych (A) a kuracích DRG astrocytov pripravených zo zvierat divokého typu (WT) a transgénnych zvierat (línia 3426) v neprítomnosti protilátok a po preinkubácii sekcií s afinitne purifikovanými polyklonálnymi protilátkami proti L1 (anti Ll) a proti myším pečeňovým membránam (anti pečeň). Neuritové dĺžky na astrocytoch bez preinkubácie s akýmikoľvek protilátkami boli vzaté ako 100* a neuritové dĺžky na povrchu astrocytov získaných po pôsobení protilátky boli vyjadrené v pomere k tejto hodnote. Významné zníženie (približne 40*) dĺžky neuritov je vidieť len na transgénnych astrocytoch po preinkubácii povrchov s protilátkami proti Ll. Stredná hodnota ± štandardná odchýlka sú vzaté z najmenej 100 neurónov z dvoch nezávislých experimentov vykonaných v štvorici. * uvádza stredné hodnoty, ktoré sa podstatne líšili (p < 0,05, Mann-ffhitney U test) z kontroly (astrocyty divokého typu alebo transgénne bez pôsobenia protilátok).Figure 10 shows and compares cerebellar (A) and chicken DRG astrocytes prepared from wild type (WT) and transgenic animals (line 3426) in the absence of antibodies and after preincubating sections with affinity purified polyclonal anti-L1 and anti-L1 polyclonal antibodies liver membranes (anti liver). Neurite lengths on astrocytes without preincubation with any antibodies were taken as 100 * and neurite lengths on the surface of astrocytes obtained after antibody treatment were expressed in proportion to this value. Significant decreases (approximately 40 *) in neurite length are seen only in transgenic astrocytes after preincubation of L1 antibody surfaces. The mean ± standard deviation is taken from at least 100 neurons from two independent experiments performed in a quadruplicate. * reports the mean values that differed significantly (p <0.05, Mann-fhitney U test) from control (wild-type or transgenic astrocytes without antibody treatment).

Obr.11 demonštruje obnovený rast axónov in vivo v optickom nerve (0 až 2000 um). 6 až 8 týždňov staré transgénne myši GFÄP Ll a myši divokého typu boli poranené a po 14 dňoch sledované na biotínový ester značený fluoresceínom za účelom označenia gangliónových axónov anterostupňovým značením. Každý bod reprezentuje jedno zviera.Figure 11 demonstrates the renewed growth of axons in vivo in the optic nerve (0 to 2000 µm). 6-8 week old transgenic GFÄP L1 mice and wild-type mice were wounded and monitored for 14 days for fluorescein-labeled biotin ester to label ganglion axons with an anterior label. Each point represents one animal.

1121111211

Obr.12 ukazuje obnovený rast axónov in vivo v optickom nerve (0 až 800 um). 6 až 8 týždňov staré transgénne myši GFAP L1 a myši divokého typu boli poranené a po 14 dňoch sledované na biotínový ester značený fluoresceínom za účelom označenia gangliónových axónov anterostupňovým značením. Každý bod reprezentuje jedno zviera.Fig. 12 shows the renewed growth of axons in vivo in the optic nerve (0 to 800 µm). 6-8 week old transgenic GFAP L1 mice and wild-type mice were wounded and monitored 14 days later for fluorescein-labeled biotin ester to label the ganglion axons with an anterior label. Each point represents one animal.

Obr.13 ukazuje vplyv injekovania kuracích protilátok proti L1 do IMHV na vyhýbacom teste (strata pamäti) v jednoskúškovom pasívnom vyhýbacom cvičení. Každý bod reprezentuje skupinu vtákov, ktoré dostali injekcie protilátok proti L1 (anti Ll) (uzavreté kruhy) alebo fyziologického roztoku (otvorené štvorce) v čase vzhľadom na uvedené cvičenie. Všetky zvieratá boli testované 24 hodín po cvičení (*, p < 0,05 medzi fyziologickým roztokom a skupinou protilátok, ksi²).Figure 13 shows the effect of injecting chicken anti-L1 antibodies into IMHV on the avoidance test (memory loss) in a single passive avoidance exercise. Each point represents a group of birds that received injections of anti-L1 (anti-L1) antibodies (closed circles) or saline (open squares) over time with respect to the exercise. All animals were tested 24 hours after exercise (*, p <0.05 between saline and antibody group, ksi ² ).

Obr.14 porovnáva dva grafy ukazujúce vplyv injekcií Ig I až IV a fragmentov FN v čase -30 min. a +5,5 hod. na udržanie pamäte pri pasívnom vyhýbacom cvičení. Všetky zvieratá boli testované 24 hodín po cvičení. Počet zvierat v každej skupine je znázornený na histogramoch (*, P < 0,05, **, p < 0,005).Figure 14 compares two graphs showing the effect of injections of Ig I to IV and FN fragments at -30 min. and +5.5 hrs. to maintain memory during passive avoidance exercises. All animals were tested 24 hours after exercise. The number of animals in each group is shown on histograms (*, P <0.05, **, p <0.005).

Obr.15 porovnáva sériu grafov ukazujúcich vplyv protilátok proti Ll (anti Ll) na LTP v pyramidálnych neurónoch v oblasti CA1 krysích hypokampálnych rezov.Figure 15 compares a series of graphs showing the effect of anti-L1 antibodies on LTP in pyramidal neurons in the CA1 region of rat hypocampal sections.

a) Priemerné (n=4) EPSP zaznamenané pred a 50 min. po (šípka) TBS v kontrolnom mieste, ktoré nebolo injekované protilátkou.a) Mean (n = 4) EPSP recorded before and 50 min. to (arrow) TBS at the control site that was not injected with antibody.

b) Priemerné (n=4) EPSP zaznamenané pred a 50 min. po TBS (šípka) za prítomnosti králičích polyklonálnych protilátok proti Ll (Rathjen et al. (1984)).b) Mean (n = 4) EPSP recorded before and 50 min. after TBS (arrow) in the presence of rabbit polyclonal antibodies against L1 (Rathjen et al. (1984)).

c) Časový sled EPSP počiatočného sklonu pred a po TBS za prítomnosti protilátok proti Ll (frakcia IgG, koncentrácia 6,2 mg/ml) alebo polyklonálnych protilátokc) Initial slope of the EPSP initial slope before and after TBS in the presence of anti-L1 antibodies (IgG fraction, concentration 6.2 mg / ml) or polyclonal antibodies

11211 imunoglobulínovým doménam I až IV rekombinantne exprimovaným v bunkách CHO (Hynes (1992) Celí 369:11-25) (antisérum obsahujúce približne 1 mg/ml špecifických protilátok) a nasledujúcich kontrôl:11211 immunoglobulin domains I to IV recombinantly expressed in CHO cells (Hynes (1992) Cell 369: 11-25) (antisera containing approximately 1 mg / ml specific antibodies) and the following controls:

(1) Kontrola LTP (žiadne protilátky), (2) za prítomnosti frakcie IgG polyklonálnych protilátok proti myším pečeňovým membránam (3,5 mg/ml), ktoré silne reagujú s krysími hypokampálnymi rezmi (Lindner et al. (1983) Náture 305:427-430), (3) v prítomnosti králičieho neimúnneho séra a (4) za prítomnosti protilátok proti L1 bez indukcie LTP s TBS (6,2 mg/ml; viď tiež e,f). Výsledky sú vyjadrené ako stredné hodnoty ± S.E.M z percent počiatočného sklonu EPSP zo základnej hodnoty zaznamenanej počas 20 min. pred TBS (n=5) z rezu z najmenej 3 zvierat; hodnoty LTP za(1) LTP control (no antibodies), (2) in the presence of an IgG fraction of polyclonal antibodies against mouse liver membranes (3.5 mg / ml) that strongly react with rat hypocampal sections (Lindner et al. (1983) Nature 305: (3) in the presence of rabbit non-immune serum; and (4) in the presence of anti-L1 antibodies without LTP induction with TBS (6.2 mg / ml; see also e, f). Results are expressed as mean ± S.E.M of the percent initial EPSP slope from baseline recorded over 20 min. before TBS (n = 5) from a section of at least 3 animals; LTP values for

L1 sa líšia od kontrol LTP proti L1 a v p < 0,01 pre proti imunoglobulínovým doménam I až IV.L1 differs from L1 controls against L1 and at p < 0.01 for immunoglobulin domains I to IV.

d) Koncentračná závislosť poklesu v LTP pôsobením frakcie IgG polyklonálnych protilátok proti L1 (koncentrácia 6,2 mg/ml); 2 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,06 mg/ml; p < 0,0001. Ako kontrola sú uvedené výsledky z polyklonálnych protilátok proti membránam pečene (3,5 mg/ml).d) Concentration dependence of the decrease in LTP by the IgG fraction of anti-L1 polyclonal antibodies (concentration 6.2 mg / ml); 2 mg / ml; 0.6 mg / ml; 0.06 mg / ml; p <0.0001. As a control, results from polyclonal antibodies against liver membranes (3.5 mg / ml) are shown.

e) Priemerné (n=4) EPSP zaznamenanej pred pred a 60 min. po (šípka) podanie oproti L1 bez prítomnosti intracelulárne excitačné postsynaptické prúdy (EPSP) zaznamenané pred a 30 min. po (šípka) podanie polyklonálnych protilátok proti L1 bez prítomnosti TBS.e) Mean (n = 4) EPSP recorded before and 60 min. after (arrow) administration versus L1 in the absence of intracellular excitatory postsynaptic currents (EPSP) recorded before and 30 min. after (arrow) administration of polyclonal anti-L1 antibodies in the absence of TBS.

protilátok proti pre protilátky prítomnosti v p < 0,001 protilátky polyklonálnych protilátok TBS. f) Priemerné (n=4)antibodies against for antibodies present in p <0.001 of polyclonal TBS antibody. f) Mean (n = 4)

Obr.16 demonštruje vplyv imunoglobulínových domén I až IV, polyklonálnych protilátok proti NCAM a oligomanosidových glykopeptidov na LTP.Figure 16 demonstrates the effect on LTP of immunoglobulin domains I to IV, polyclonal anti-NCAM antibodies, and oligomanoside glycopeptides.

a) časový sled počiatočného sklonu EPSP pred a po TBS za prítomnosti imunoglobulínových domén I až IV (216 pg/ml; 3,2 mM; v 20 mM Tris/HCl pH 7,6; p < 0,01)a) Initial slope of EPSP before and after TBS in the presence of immunoglobulin domains I to IV (216 pg / ml; 3.2 mM; in 20 mM Tris / HCl pH 7.6; p <0.01)

11211 a fibronektínových (FN) homológnych opakovaniach I až V (225 ug/ml; 3,8 mM; v 20 mM Tris/HCl pH 7,6) od L1 v porovnaní s kontrolnou LTP (20 mM Tris/HCl pH 7,6).11211 and fibronectin (FN) homologous repeats I to V (225 µg / ml; 3.8 mM; in 20 mM Tris / HCl pH 7.6) from L1 compared to control LTP (20 mM Tris / HCl pH 7.6 ).

b) časový sled počiatočného sklonu EPSP pred a po TBS za prítomnosti protilátok proti NCAM (frakcia IgG,(b) the time sequence of the initial slope of EPSP before and after TBS in the presence of antibodies to NCAM (IgG fraction;

3,9 mg/ml), antiséra proti axonínu-1, a nasledujúce kontroly:3.9 mg / ml), anti-axonin-1 antisera, and the following controls:

(1) neimúnne králičie sérum, (2) frakcia IgG neimúnneho králičieho séra a (3) za prítomnosti protilátok proti NCAM p < 0,06) bez indukcie LTP s TBS. c) časový sled počiatočného EPSP pred a po TBS za prítomnosti oligomannozidových glykopeptidov, kontrolných glykopeptidov odvodených z azialofetuínu (približne 100 μΜ) a bez prítomnosti glykopeptidov. Výsledky sú vyjadrené ako stredné hodnoty ±S.E.M z percent počiatočného sklonu EPSP zo základnej hodnoty zaznamenanej počas 20 min. pred TBS (n-5 alebo 6) z rezov z najmenej 3 zvierat.(1) non-immune rabbit serum, (2) the IgG fraction of non-immune rabbit serum, and (3) in the presence of anti-NCAM antibodies (p <0.06) without induction of LTP with TBS. (c) time sequence of initial EPSP before and after TBS in the presence of oligomannoside glycopeptides, control glycopeptides derived from azialofetuin (approximately 100 μΜ) and in the absence of glycopeptides. Results are expressed as mean ± S.E.M of the percent initial EPSP slope from baseline recorded over 20 min. before TBS (n-5 or 6) from sections from at least 3 animals.

(3,0 mg/ml) (3,9 mg/ml,(3.0 mg / ml) (3.9 mg / ml,

Obr.17 graficky ukazuje vplyv protilátok proti L1 a oligomannozidových karbohydrátov na predtým stanovenú LTP a na synaptickú transmisiu sprostredkovanú receptormi NMDA.Figure 17 graphically shows the effect of L1 antibodies and oligomannoside carbohydrates on previously determined LTP and on NMDA receptor-mediated synaptic transmission.

a) časový sled počiatočného sklonu EPSP pred a po TBS za prítomnosti protilátok proti L1 aplikovaných ako počas pokusu (6,2 mg/ml), tak aj po 10 min. od TBS (6,2 mg/ml).(a) time series of initial EPSP slope before and after TBS in the presence of anti-L1 antibodies administered both during the experiment (6.2 mg / ml) and after 10 min. from TBS (6.2 mg / ml).

h) časový sled počiatočného EPSP pred prítomnosti oligomannozidových karbohydrátov a po TBS za aplikovaných ako počas pokusu (100 μΜ), tak aj po 20 min. od TBS (100 μΜ).(h) Initial EPSP timeline sequence prior to the presence of oligomannoside carbohydrates and after TBS, applied both during the experiment (100 μΜ) and after 20 min. from TBS (100 μΜ).

c) Priemerný (n=4) EPSP receptora NMDA zaznamenaný za prítomnosti CNQX (30 μΜ) pred a po 30 min. (šípka) aplikácii protilátok proti L1. d) Priemerný (n=4) EPSP receptora NMDA zaznamenaný za prítomnosti CNQX (10 μΜ) pred a po 60 min. (šípka) aplikácii oligomannozidových karbohydrátov. Výsledky v a) ah) sú vyjadrené ako stredné hodnoty ± S.E.M z percent počiatočného sklonu EPSP zo základnej hodnoty zaznamenanejc) Mean (n = 4) NMDA EPSP receptor recorded in the presence of CNQX (30 μΜ) before and after 30 min. (arrow) application of anti-L1 antibodies. (d) Mean (n = 4) NMDA EPSP receptor recorded in the presence of CNQX (10 μΜ) before and after 60 min. (arrow) application of oligomannoside carbohydrates. The results in (a) and (h) are expressed as mean ± S.E.M of the percent initial EPSP slope from the baseline recorded

11211 počas 20 min. pred TBS (n=5 z rezov z najmenej 3 zvierat).11211 for 20 min. before TBS (n = 5 of sections from at least 3 animals).

Obr.18 ukazuje nukleotidovú sekvenciu 4,43 kb dlhého inzertu cDNA v klone pX#2 a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu myší CHL1. Najdlhší otvorený čítací rámec (bp 296 až bp 3922) obsahuje 1209 aminokyselín a je zakončený terminačným kodónom TGÄ. Dve hydrofóbne oblasti predstavujú signálny peptid (aminokyseliny 1 až 24) a transmembránovú oblasť (1082 až 1104) sú podtrhnuté. Dve šípky ukazujú 5' a 3' konce klonu 311 izolovaného z knižnice lambda gtll. Potenciálne miesta pre glykozidáciu na asparagíne (Hubbart a Ivatt, 1981) sú označené pod aminokyselinovou sekvenciou plnými znakmi diamantu. Imunoglobulínové domény sú číslované rímskymi číslovkami od I do VI pod konzervovaným tryptofánom. Charakteristické cysteíny sú označené krúžkom. Opakovania podobné FN sú číslované F1 až F5 a charakteristické tryptofány (chýbajúce v Fl, F2; W 732, F3 : W 830, F4: W 936, F5: W1053) a tyrozíny/fenylalaníny (Fl: Y 682, F2: Y 781, F3: F 888, F4: Y989, chýba u F5) sú zarámované. Zátvorka zvýrazňuje sekvencie RGD a DGEA (aminokyselinové zvyšky 185 až 187 a 555 až 558). Netranslatované sekvencie sú označené číslami kurzívou. Sekvenčné údaje sú dostupné z EMBL/Genebank/DDBJ pod číslom X94310.Figure 18 shows the nucleotide sequence of the 4.43 kb long cDNA insert in clone pX # 2 and the deduced amino acid sequence of murine CHL1. The longest open reading frame (bp 296 to bp 3922) contains 1209 amino acids and is terminated by the termination codon TGA. The two hydrophobic regions represent the signal peptide (amino acids 1 to 24) and the transmembrane region (1082 to 1104) are underlined. Two arrows show the 5 'and 3' ends of clone 311 isolated from the lambda gt11 library. Potential sites for glycosidation on asparagine (Hubbart and Ivatt, 1981) are indicated below the amino acid sequence filled with diamond features. The immunoglobulin domains are numbered with Roman numerals from I to VI under conserved tryptophan. The characteristic cysteines are marked with a circle. FN-like repeats are numbered F1 through F5 and characteristic tryptophanes (missing in F1, F2; W 732, F3: W 830, F4: W 936, F5: W1053) and tyrosines / phenylalanines (Fl: Y 682, F2: Y 781, F3: F888, F4: Y989, missing in F5) are framed. The bracket highlights the RGD and DGEA sequences (amino acid residues 185-187 and 555-558). Untranslated sequences are indicated in italics. Sequence data are available from EMBL / Genebank / DDBJ under number X94310.

Obr.19 ukazuje doménovú štruktúru, kódujúcu oblasť bakteriálne exprimovaného proteínového fragmentu a graf hydrofobicity myší CHL1.Figure 19 shows the domain structure encoding a region of a bacterially expressed protein fragment and a hydrophobicity graph of murine CHL1.

(a) diagram znázorňuje štrukturálne rysy odvodené z primárnej sekvencie CHL1. Čísla uvádzajú aminokyselinovú sekvenciu od miesta počiatku translácie. Imunoglobulínové domény I až IV sú označené polovičnými krúžkami (čísla aminokyselín uvádzajú cysteíny tvoriace disulfidové mostíky). Opakovania podobné FN 1 až 5 sú symbolizované orámovaním (čísla aminokyselín uvádzajú hranice domény). Potenciálne miesta pre N-glykosidáciu sú označené plnými(a) the diagram depicts structural features derived from the primary CHL1 sequence. The numbers indicate the amino acid sequence from the translation origin site. The immunoglobulin domains I to IV are indicated by half circles (amino acid numbers indicate cysteines forming disulfide bridges). Repeats similar to FN 1 to 5 are symbolized by a frame (amino acid numbers indicate domain boundaries). Potential sites for N-glycosidation are indicated in full

11211 krúžkami. Signálny peptid a transmembránová oblasť je vyznačená zubatým orámovaním.11211 rings. The signal peptide and transmembrane region are indicated by a jagged border.

(b) Podčiarknutie vyznačuje pozíciu cDNÄ kódujúca rekombinantný proteín produkovaný v E. coli.(b) The underline indicates the position of the cDNÄ encoding recombinant protein produced in E. coli.

(c) Graf hydrofobicity (Kyte a Doolittle, 1982) odvodenej aminokyselinovej sekvencie ukazuje charakteristické rysy integrálneho membránového proteínu s putatívnou fidrofóbnou signálnou sekvenciou a transmembránovou doménou (*). Pozitívne hodnoty označujú hydrofobicitu. Číslovanie v súradniciach uvádza pozíciu aminokyseliny.(c) The hydrophobicity graph (Kyte and Doolittle, 1982) of the deduced amino acid sequence shows the characteristics of an integral membrane protein with a putative fidrophobic signal sequence and a transmembrane domain (*). Positive values indicate hydrophobicity. Coordinate numbering indicates the amino acid position.

Obr.20 ukazuje porovnanie intracelulárnych domén molekúl rodiny L1. Sekvencia intracelulárnych domén začínajúcich prvým aminokyselinovým zvyškom po putatívnych transmembránových oblastiach sú porovnané pre myší CHL1, myší L1, kurací Nr-CAM, kurací Ng-CAM, kurací neurofascín, Drosophilia neuroglia a L1.2 zo zehričky. Čísla uvádzajú pozície aminokyselín u CHL1 a šedé orámovanie vyznačuje medzery vykonané do sekvencie CHL1. Totožné aminokyseliny, ktoré sú vo väčšine sekvencií, sú vyznačené čiernou farbou. Tri zátvorky (I, II a III) vyznačujú vysoko konzervované úseky.Figure 20 shows a comparison of the intracellular domains of L1 family molecules. The sequences of the intracellular domains beginning with the first amino acid residue after the putative transmembrane regions are compared for murine CHL1, murine L1, chicken Nr-CAM, chicken Ng-CAM, chicken neurofascin, Drosophilia neuroglia and L1.2 from the mollusk. The numbers indicate the amino acid positions of CHL1 and the gray border indicates the gaps made into the CHL1 sequence. Identical amino acids, which are in most sequences, are marked in black. The three brackets (I, II and III) indicate the highly conserved sections.

Obr.21 je analýza Northern blot mRNA CHL1 a L1 z rôznych tkanív myši a krysy.Figure 21 is a Northern blot analysis of CHL1 and L1 mRNA from various mouse and rat tissues.

(a) Poly (A) RNA (2pg) z mozgu bez cerebella (dráhy 1 až 5), miechy (dráhy 3, 7) a dorzálnych koreňových ganglií (dráhy 4, 8) a celkovej RNA (10pg) z cerebella (dráhy 2, 8) z deväť dní starej myši hybridizované s ribopróbami CHL1 (dráhy 1 až 4) alebo L1 (dráhy 5 až 8). Poly (A) RNA (1 pg) z ľadvín (dráha 9), slinivky (dráha 10), pečene (dráha 11), týmusu (dráha 12) a poly (Ä) RNA (0.5 pg) z čriev (dráha 13) a pl'úc (dráha 14) z deväť dní starej myši boli hybridizované s ribopróbou CHL1.(a) Poly (A) RNA (2pg) from cerebellum-free brain (lanes 1 to 5), spinal cord (lanes 3, 7) and dorsal root ganglia (lanes 4, 8) and total RNA (10pg) from cerebella (lane 2 , 8) nine-day-old mice hybridized with CHL1 ribosomes (lanes 1-4) or L1 (lanes 5-8). Poly (A) RNA (1 pg) of kidney (lane 9), pancreas (lane 10), liver (lane 11), thymus (lane 12), and poly ()) RNA (0.5 pg) of intestines (lane 13), and lung (lane 14) from nine day old mice were hybridized with the riboprobe CHL1.

(b) Celková RNA (20 pg) PC12 buniek indukovaných(b) Total RNA (20 µg) of PC12 cells induced

11211 (dráha 1) a neindukovaných (dráha 2) s NGF, buniek COS-1 (dráha 3) a celková RNÄ (30 pg) z cerebella deväť (dráha 4) a šesť (dráha 5) dní starých krýs boli hybridizované s ribopróbou CHL1. Značky RNA sú uvedené na ľavom okraji.11211 (lane 1) and non-induced (lane 2) with NGF, COS-1 cells (lane 3) and total RNA (30 µg) from cerebellum nine (lane 4) and six (lane 5) days old rats were hybridized with CHL1 riboprotein . RNA markers are shown at the left margin.

Obr.22 demonštruje špecifičnosť polyklonálnych protilátok proti CHL1 a expresiu CHL1 v rôznych tkanivách.Figure 22 demonstrates the specificity of polyclonal antibodies against CHL1 and the expression of CHL1 in various tissues.

(a) Analýza Northern blot mozgu z imunopurifikovaného s L1 (dráha 1 (2 Mg)), N-CAM (dráha 2 (2 Mg)), MAG (dráha 3 (2 Mg)) a proteínového fragmentu purifikovaného rekombinantnou aniónovou výmennou chromatografiou (dráha 4 (0,1 pg)) pomocou protilátok proti CHL1.(a) Northern Blot analysis of immunopurified with L1 (lane 1 (2 Mg)), N-CAM (lane 2 (2 Mg)), MAG (lane 3 (2 Mg)), and protein fragment purified by recombinant anion exchange chromatography ( lane 4 (0.1 µg)) with antibodies against CHL1.

(b) Analýza Northern blot rozpustných (S) a nerozpustných (M) frakcií detergentových lyzátov hrubých membrán z mozgu (dráha 1), pečene (dráha 2), pľúc (dráha 3), ľadvín (dráha 4) a čriev (dráha 5) deväť dní starých myší. Čísla naľavo (b) uvádzajú molekulové hmotnosti imunoreaktívnych prúžkov CHL1 z mozgu (dráha 1) a pečene (dráha 2). Štandardy molekulových hmotností sú uvedené na ľavom a pravom okraji.(b) Northern blot analysis of soluble (S) and insoluble (M) fractions of thick membrane detergent lysates from brain (lane 1), liver (lane 2), lung (lane 3), kidney (lane 4) and intestines (lane 5) nine day old mice. The numbers on the left (b) indicate the molecular weights of the immunoreactive bands of CHL1 from brain (lane 1) and liver (lane 2). Molecular weight standards are listed on the left and right margins.

Obr.23 ukazuje detekciu CHL1 na tranzientne transfekovaných bunkách COS-1. Povrchové kultúry COS-1 buniek transfekovaných CHL1 (a) a netransfekovaných (c) boli imunofarbené polyklonálnymi protilátkami proti CHL1. (b,d) zodpovedajúce mikrografie fázového kontrastu pre (a,c). Čiarka v d = 30 pre a až d.Figure 23 shows the detection of CHL1 on transiently transfected COS-1 cells. Surface cultures of COS-1 cells transfected with CHL1 (a) and untransfected (c) were immunostained with polyclonal antibodies against CHL1. (b, d) corresponding phase contrast micrographs for (a, c). Comma at d = 30 for a to d.

Obr.24 ukazuje lokalizáciu mRNA CHL1 a L1 v sekciách myšej sietnice, optického nervu a cerebelárneho kortexu pomocou hybridizačnej analýzy in situ. V sietnici 7 dní starej starej myši je mRNA L1 detekovateľná v gangliónových bunkách lokalizovaných v gangliónovej bunkovej vrstve (1 v a) a v amakrinových a horizontálnych bunkách lokalizovaných vo vnútornej pečeňovej vrstve (2. v l). Iné bunkové typy v sietnici alebo gliových bunkách v optickomFigure 24 shows the localization of CHL1 and L1 mRNA in mouse retina, optic nerve, and cerebellar cortex sections by in situ hybridization analysis. In the retina of a 7 day old mouse, L1 mRNA is detectable in ganglion cells located in the ganglion cell layer (1 in a) and in amacrine and horizontal cells located in the inner liver layer (2 in 1). Other cell types in retina or glial cells in optical

11211 nerve neobsahujú detekovateľné hladiny transkriptov L1 (a). mRNA CHL1 je po týždni detekovateľná v gangliónových bunkách a v niekoľkých bunkách lokalizovaných na vnútornom okraji vo vnútornej vrstve pečene (b). Gliové bunky lokalizované v bližších (t.j. blízko sietnice) oblastiach optického nervu sú silne značené próbou z antisense cRNA CHL1, naopak gliové bunky lokalizované vo vzdialenejších oblastiach sú viditeľné až po týždni (b). V cerehelárnom kortexe dva dni starých myší sú transkripty L1 detekovateľné vo hviezdicových a košíčkových bunkách v molekulárnej vrstve (mol) bunkách v internej granulovej L1 sú rozmiestnené v podobnom vzore, s jedinou výnimkou, že akékoľvek značenie je ťažko viditeľné v tenkých častiach molekulárnej vrstvy (b). Sekcie hybridizované próbou sense cRNA CHL1 nie sú označené (pre 7 dní starú sietnicu a optický nerv, pozri c).11211 nerves do not contain detectable levels of L1 (a) transcripts. CHL1 mRNA is detectable after a week in ganglion cells and several cells located on the inner edge in the inner layer of the liver (b). Glial cells located in the nearer (i.e. near the retina) regions of the optic nerve are strongly labeled with a probe from the CHL1 antisense cRNA, while glial cells located in the more distal regions are not visible until a week (b). In the cereal cortex of two-day-old mice, L1 transcripts are detectable in star and basket cells in the molecular layer (mol) of cells in the internal granular L1, distributed in a similar pattern, except that any labeling is difficult to see in thin portions of the molecular layer (b). ). Sections hybridized with the CHL1 sense cRNA probe are not labeled (for 7 days old retina and optic nerve, see c).

a v Golgiho a granulových vrstve (iGl:d). Transkriptyand in the Golgi and granule layers (iG1: d). transcripts

Obr.25 ilustruje imunofluorescenčnú mikroskopickú lokalizáciu CHL1 v kultúrach astrocytov. Dvojité imunoznačenie pestovaných myších astrocytov bolo vykonané s polyklonálnymi protilátkami proti CHL1 (a,d) a s polyklonálnymi protilátkami proti GFAB (b,e), (c,f) sú zodpovedajúce mikrografie fázového kontrastu pre (a,b) a (d,e). Čiarka v c a F - 20 um pre a až c a d až f.Figure 25 illustrates immunofluorescence microscopic localization of CHL1 in astrocyte cultures. Double immunostaining of cultured mouse astrocytes was performed with polyclonal antibodies against CHL1 (a, d) and polyclonal antibodies against GFAB (b, e), (c, f) are corresponding phase contrast micrographs for (a, b) and (d, e) . The dash in c and F - 20 µm for a to c and d to f.

Obr.26 je analýza Western blot deglykozilovanej CHL1 rozpustných (S) a nerozpustných (M) frakcií detergentových lyzátov hrubých membrán z mozgu sedem dní starých myší boli (N), 0-glykozidázou (0), bez enzýmu (-) a zlúčené Western blote. Štandardy v kD na pravom okraji.Fig. 26 is a Western blot analysis of deglycosylated CHL1 soluble (S) and insoluble (M) fractions of thick membrane detergent lysates from the brain of seven day old mice were (N), O-glycosidase (0), no enzyme (-) and pooled Western blot . Standards in kD on the right margin.

inkubované s N-glykozidázou F obidvoma enzýmami (N+0) alebo s protilátkami proti CHL1 vo molekulovej hmotnosti sú uvedenéincubated with N-glycosidase F by both enzymes (N + 0) or with antibodies against CHL1 in molecular weight are given

Molekulové hmotnosti glykozilovaných a deglykozilovaných proteínových komponentov CHL1 sú uvedené v kD v rámčeku nižšie.The molecular weights of the glycosylated and deglycosylated CHL1 protein components are shown in kD in the box below.

1121111211

Obr.27 ukazuje prítomnosť karbohydrátu MNK-1 v imunoprecipitátoch CHL1 z mozgového tkaniva. CHL1 bola imunoprecipitovaná z detergentových lyzátov z celého mozgového tkaniva z deväť dní starého myšieho mozgu pomocou protilátok proti CHL1. Mozgové lyzáty (dráha 1) a imunoprecipitáty (dráhy 2,3) boli rozdelené na SDS-PAGE, blotované a inkubované s monoklonálnou protilátkou 312 proti epitopu HNK-1 (dráhy 1,2) alebo protilátkami proti CHL1 (dráha 3). Štandardy molekulových hmotností sú uvedené v kD na pravom okraji.Figure 27 shows the presence of MNK-1 carbohydrate in brain tissue CHL1 immunoprecipitates. CHL1 was immunoprecipitated from detergent lysates from whole brain tissue from nine day old mouse brain with antibodies against CHL1. Brain lysates (lane 1) and immunoprecipitates (lane 2,3) were resolved on SDS-PAGE, blotted and incubated with monoclonal antibody 312 against HNK-1 epitope (lanes 1,2) or antibodies against CHL1 (lane 3). Molecular weight standards are given in kD at the right margin.

Obr.28: Rast neuritov hipokampálnych neurónov v spoločnej kultúre s transfektantmi L929.Figure 28: Neurite growth of hippocampal neurons in co-culture with L929 transfectants.

Hipokampálne neuróny odvodené od krýs embryonálneho dňa 18 boli pestované v subkonfluentnej monovrstve transfektantov L929 alebo rodičovských buniek L929. Po 11 až 12 hod. spoločnej kultivácie boli bunky fixované a označené monoklonálnou protilátkou 412 (rozpoznávajúci epitop karbohydrátu HNK-+) alebo polyklonálnou protilátkou proti NCAM. Pre meranie dĺžky celého neuritu bol určený len najdlhší neurit na každej vetvi kvôli veľmi rozvetvenému charakteru neurónov v tejto kultúre.Hippocampal neurons derived from embryonic day 18 rats were grown in a subconfluent monolayer of L929 transfectants or parental L929 cells. After 11 am to 12 pm By co-culture, cells were fixed and labeled with monoclonal antibody 412 (recognizing the HNK- + carbohydrate epitope) or polyclonal anti-NCAM antibody. Only the longest neurite on each branch was determined to measure the length of the entire neurite due to the highly branched nature of the neurons in this culture.

(Ä) Rast neuritov je podporovaný CHL1 a inhibovaný protilátkami. Neuróny boli pestované s transfektantmi CHL1 (CHL1) alebo bunkami L929 (L929) s (+AB) alebo bez polyklonálnych protilátok proti rekombinantnej CHL1 (500 ug/ml purifikovaného IgG, pridaného 45 min. po naplátovaní) a na transfektantoch L1. Priemerná celková dĺžka neuritov z 4 až 5 nezávislých experimentov je uvedená. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.(Ä) Neurite growth is promoted by CHL1 and inhibited by antibodies. Neurons were grown with CHL1 (CHL1) transfectants or L929 cells (L929) with (+ AB) or without polyclonal antibodies against recombinant CHL1 (500 µg / ml purified IgG, added 45 min after plating) and on L1 transfectants. The mean total neurite length of 4-5 independent experiments is shown. Deviations are standard diameter errors.

(B) Rôzne línie CHL1 podporujú rast neuritov lepšie než L1. Neuróny boli pestované na dvoch rôznych transfektantoch CHL1 (línia CHL1 1, línia CHL1 2) s mierne rôznymi hladinami expresie, na rodičovských L929 (L929) a na transfektantoch L1 (Ll). Celková dĺžka neuritov je podaná ako percento buniek L929 z kontroly (ctr). Odchýlky sú štandardné chyby(B) Different CHL1 lines support neurite outgrowth better than L1. Neurons were grown on two different CHL1 transfectants (line CHL1 1, line CHL1 2) with slightly different expression levels, on parental L929 (L929) and on L1 (L1) transfectants. The total length of neurites is given as a percentage of L929 cells from the control (ctr). Deviations are standard errors

11211 priemeru.11211 avg.

(C) Podpora dĺžky neuritov ovplyvňuje dĺžky všetkých tried neuritov. Graf kumulatívnej frekvenčnej distribúcie celkovej dĺžky neuritov hipokampálnych neurónov pestovaných spoločne s transfektantmi CHL1 (línie CHL1 la 2) a s rodičovskými bunkami L929 (L929) s (+AB) alebo bez pôsobenia protilátok je podaný v (A). Percento neurónov s neuritmi dlhšími alebo rovnako dlhými ako daná dĺžka x (vertikálna os) boli vyznačené ako funkcia dĺžky neuritov x (horizontálna os). Hodnoty pochádzajú z jedného reprezentatívneho experimentu.(C) Neurite length support affects the length of all neurite classes. A graph of cumulative frequency distribution of the total neurite length of hippocampal neurons grown together with CHL1 transfectants (lines CHL1 and 2) and with parental L929 cells (L929) with (+ AB) or without antibody treatment is given in (A). The percentage of neurons with neurites longer or equal to a given length x (vertical axis) was plotted as a function of the length of neurites x (horizontal axis). Values are from one representative experiment.

Obr.29: Rast neuritov malých cereberálnych neurónov v spoločnej kultúre s transfektantmi L929.Figure 29: Neurite growth of small cerebral neurons in co-culture with L929 transfectants.

Cerebelárne neuróny odvodené z 6 až 7 dní starých myší boli pestované 20 hod. na transfektantoch CHL1 (CHL1), CHL1 transfekovaných neexprimujúcich bunkách L929 (slepá vzorka), rodičovských bunkách L929 (L929) a na transfektantoch L1 (Ll). Farbenie látok bolo vykonané, ako už bolo opísané na obr.7.Cerebellar neurons derived from 6-7 days old mice were cultured for 20 hours. on CHL1 (CHL1) transfectants, CHL1 transfected non-expressing L929 cells (blank), parental L929 cells (L929), and L1 transfectants (L1). The dyeing of the fabrics was performed as already described in Fig. 7.

(A) CHL1 podporuje rast neuritov malých cerebelárnych neurónov. Je uvedená priemerná celková dĺžka neuritov z troch experimentov. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.(A) CHL1 promotes neurite outgrowth of small cerebellar neurons. The mean total length of neurites from three experiments is shown. Deviations are standard diameter errors.

(B) CHL1 podporuje tiež rast neuritov malých cerebelárnych neurónov lepšie než Ll. Celková dĺžka neuritov je podaná ako percento buniek L929 z kontroly (ctr). Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.(B) CHL1 also promotes neurite outgrowth of small cerebellar neurons better than L1. The total length of neurites is given as a percentage of L929 cells from the control (ctr). Deviations are standard diameter errors.

(C) Zvýšenie rastu neuritov cerebelárnych neurónov vplyvom CHL1 ovplyvňuje všetky triedy neuritov. Graf kumulatívnej frekvenčnej distribúcie celkovej dĺžky neuritov percenta neurónov s neuritmi dlhšími alebo rovnako dlhými ako daná dĺžka x (vertikálna os) boli vyznačené ako funkcia dĺžky neuritov x (horizontálna os). Hodnoty pochádzajú z jedného reprezentatívneho experimentu.(C) The increase in cerebellar neuron neurite outgrowth by CHL1 affects all neurite classes. The graph of the cumulative frequency distribution of the total neurite length of a percentage of neurons with neurites longer or equal to the given length x (vertical axis) was plotted as a function of the length of neurites x (horizontal axis). Values are from one representative experiment.

Obr.30: Rast neuritov hipokampálnych neurónov poFigure 30: Neurite growth of hippocampal neurons after

11211 pestované na miskách s pridaním supernatantov hrubých membránových pôsobení rozpustnej CHL1.11211 grown on plates with the addition of coarse membrane treated supernatants of soluble CHL1.

Hipokampálne neuróny boli potiahnutých poly-L-lyzínom 12 hod (40 ug/ml celkového proteínu) preparácií transfektantov CHL1 (CHL1), rodičovských buniek L929 (L929) alebo transfektantov Ll (Ll). Farbenie a meranie dĺžky neuritov bolo vykonané, ako už bolo opísané (obr.7).Hippocampal neurons were coated with poly-L-lysine for 12 hours (40 µg / ml total protein) by preparation of CHL1 (CHL1) transfectants, L929 (L929) parental cells, or L1 (L1) transfectants. Staining and measurement of neurite length were performed as described (Fig. 7).

(A) Rozpustná CHL1 z transfektantov L929 podporuje rast najlepšie. Absolútna dĺžka najdlhšieho neuritu a celková dĺžka neuritov sú uvedené. Hodnoty sú priemerom z troch experimentov. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.(A) Soluble CHL1 from L929 transfectants promotes growth best. The absolute length of the longest neurite and the total length of the neurites are given. Values are the average of three experiments. Deviations are standard diameter errors.

(B) Rozpustná CHL1 podporuje mierne zvýšenie počtu neuritov. Celková dĺžka neuritov dĺžky hipokampálnych neurónov po odvodených z rodičovských buniek v percentách neuritovej pôsobení transfektantov L929 (ctr) je uvedená.(B) Soluble CHL1 promotes a slight increase in neurite counts. The total neurite length of hippocampal neurons length derived from parental cells as a percentage of the neurite action of L929 transfectants (ctr) is shown.

Hodnoty sú priemerom z štandardné chyby priemeru, (C) Rozpustná CHL1 všetkých tried neuritov, distribúcie celkovej reprezentatívneho experimentu sú uvedené.The values are the average of the standard error of the mean, (C) The soluble CHL1 of all classes of neurites, the distributions of the total representative experiment are given.

troch experimentov. Odchýlky sú tiež ovplyvňuje rast neuritov Grafy kumulatívnej frekvenčnej dĺžky neuritov z jednéhothree experiments. Variations are also influenced by neurite outgrowth Cumulative frequency length neurite graphs from one

Obr.31: Kvantitatívna agregačná analýza a stabilita proteínov CHL1 a Ll v transfektantoch L929.Fig.31: Quantitative aggregation analysis and stability of CHL1 and L1 proteins in L929 transfectants.

agregacie detekovania (ctr) a Ll bunkových agregácie (Ll) boli (A) Kvantitatívna analýza transfektantov S2. Za účelom transfekovanej bunky CHL1 (CHL1) pestované (v hustotách približne 3 x 10⁶ buniek/ml) 18 hod. v médiu s (+ind) alebo bez (-ind) indukcie transgénovej expresie pomocou CuSO*. Počet častíc bol spočítaný na hemacytometre na začiatku a na konci inkubácie. Percento agregácie bolo vypočítané pomocou indexu (1-N/N0)xl00. N18 s NO predstavujú počet častíc na konci alebo na začiatku inkubačnej periódy. Hodnoty sú priemerom zo štyroch nezávislých experimentov. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.aggregation of detection (ctr) and L1 cell aggregation (L1) were (A) Quantitative analysis of S2 transfectants. For transfected CHL1 cells (CHL1) grown (at densities of approximately 3 x 10 ⁶ cells / ml) for 18 hours. in medium with (+ ind) or without (-ind) induction of transgene expression by CuSO *. The number of particles was counted on a hemacytometer at the beginning and end of the incubation. The percentage of aggregation was calculated using the index (1-N / NO) x100. N18 with NO represents the number of particles at the end or beginning of the incubation period. Values are the average of four independent experiments. Deviations are standard diameter errors.

11211 (B) Kinetiká agregácie transfektantov L929.11211 (B) Kinetics of L929 transfectant aggregation.

Transfekované CHL1 (CHL1), transfekované CHL1 neexprimujúce L929 (slepá vzorka), rodičovské L929 (L929) a transfekované Ll (Ll) bunky boli odmyté z tkanivovej kultúry pôsobením roztoku trypsín-EDTA s nízkou koncentráciou, premyté a inkubované v 37°C v polystyrénových skúmavkách. Časť každej vzorky bola odobraná každých 30 min. Počet častíc bol . spočítaný na hemacytometre. Výsledky sú vyjadrené, ako je to opísané v (A). Hodnoty sú priemerom z troch nezávislých * experimentov. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.Transfected CHL1 (CHL1), transfected CHL1 not expressing L929 (blank), parental L929 (L929), and transfected L1 (L1) cells were washed from tissue culture with low concentration trypsin-EDTA solution, washed and incubated at 37 ° C in polystyrene. tubes. A portion of each sample was taken every 30 min. The number of particles was. calculated on a hemacytometer. The results are expressed as described in (A). Values are the average of three independent * experiments. Deviations are standard diameter errors.

Spôsob uskutočnenia vynálezuEmbodiments of the invention

Predložený vynález sa týka použitia určitých látok tu označovaných ako neurálne rastové modulátory CNS” (CNGM) a zvlášť triedy neurálnych bunkových adhéznych molekúl tak, ako sú tu definované a ich schopnosti podporovať rast neuritov v centrálnej nervovej sústave (CNS). Všeobecne sú neuróny vyvinutej centrálnej nervovej sústavy považované za neschopné obnoveného rastu, čo je spôsobené inhibítorovými molekulárnymi mechanizmami prítomnými na gllových bunkách. Látky a spôsoby predloženého vynálezu môžu byť použité na prekonanie tejto inhibície a na podporu rastu neuritov v CNS.The present invention relates to the use of certain substances referred to herein as neural growth modulators of the CNS '(CNGM) and in particular to the class of neural cell adhesion molecules as defined herein and their ability to promote neurite outgrowth in the central nervous system (CNS). Generally, the neurons of the developed central nervous system are considered incapable of regrowth, which is caused by the inhibitory molecular mechanisms present on gloll cells. The compounds and methods of the present invention can be used to overcome this inhibition and to promote neurite outgrowth in the CNS.

Látky podľa tohoto vynálezu zahŕňajú a môžu byť selektované z akejkoľvek bunkovej adhéznej molekuly, ktorá ja schopná modulovania a podporovania rastu neuritov v CNS a zvlášť potom molekúl patriacich do imunoglobulínovej rodiny. Molekuly sú vyberané predovšetkým z členov imunoglobulínovej rodiny, ktorí sprostredkovávajú neuronálnu bunkovú adhéziu nezávislú na Ca²⁺, vrátane Ll, N-CAM a glykoproteínu asociovaného s myelínom. Vynález taktiež zahŕňa fragmenty týchto molekúl, analógy a príbuzné molekuly, ktoré majú aktivitu podporujúce neurity. Zvlášť výhodné štruktúrne motívy pre tieto fragmenty a analógyThe compounds of the invention include and can be selected from any cell adhesion molecule that is capable of modulating and promoting neurite outgrowth in the CNS, and in particular molecules belonging to the immunoglobulin family. In particular, the molecules are selected from members of the immunoglobulin family that mediate Ca ²⁺ independent neuronal cell adhesion, including L1, N-CAM, and myelin-associated glycoprotein. The invention also includes fragments of these molecules, analogs, and related molecules having neurite-promoting activity. Particularly preferred structural motifs for these fragments and analogs

11211 zahŕňajú domény podobné k homológnym opakovaniam k fibronektínu typu III (zvlášť opakovania 1 a 2) a imunoglobulínovým doménam (zvlášť doménam I-II, III-IV a V-VI). Pretože látky podlá tohoto vynálezu a najmä členovia rodiny Ll a CAM vykazujú homofilickú väzbu, ako tieto látky, tak aj ich antagonisti a zvlášť protilátky k nim, môžu slúžiť ako aktivátory s ohľadom na receptory pre tieto látky, a môžu tak byť využité ako na diagnostické, tak aj na terapeutické aplikácie rovnakým spôsobom a na ten istý účel ako pôvodné látky. Ll pôsobí ako receptor a protilátka proti nej môže byť využitá ako aktivátor k rastu neuritov, ako je to opísané nižšie, a na nervovú regeneráciu, najmä v CNS. Táto schopnosť je ďalej demonštrovaná možnosťou protilátok proti Ll slúžiť spôsobom, ako identifikovať ďalších členov rodiny nervových rekogničných molekúl Ll a CAM, ktoré tu slúžia ako látky, a vynález sa tak rozširuje na molekuly, ktoré sú identifikované, izolované a charakterizované pomocou týchto protilátok. Z týchto identifikovaná ako modulátory považovaná za zahŕňajúcu aj rodiny CAM, ako je Ll a jej dôvodov je trieda látok, nervového rastu v CNS, protilátky proti molekulám zosilňujú astrocytov analógy, ako je CHL1, opísané nižšie.11211 include domains similar to homologous repeats to fibronectin type III (especially repeats 1 and 2) and immunoglobulin domains (especially domains I-II, III-IV and V-VI). Since the compounds of the invention, and in particular members of the L1 and CAM family, exhibit homophilic binding, both these compounds and their antagonists, and in particular antibodies thereto, can serve as activators with respect to receptors for these compounds and can thus be used as diagnostic , and for therapeutic applications in the same way and for the same purpose as the parent substances. L1 acts as a receptor and the antibody against it can be used as an activator for neurite outgrowth as described below and for nerve regeneration, especially in the CNS. This ability is further demonstrated by the ability of anti-L1 antibodies to serve as a way of identifying other members of the L1 and CAM neural recognitive molecule family that serve as agents, and the invention extends to molecules that are identified, isolated and characterized by these antibodies. Of these identified as modulators considered to include CAM families such as L1 and its reasons are the class of substances, nerve growth in the CNS, antibodies against molecules enhance astrocyte analogs such as CHL1, described below.

Predložený vynález sa týka v jednom aspekte ektopickej expresie neurálnych rastových modulátorov CNS (CNGM) alebo neurálnych bunkových adhéznych molekúl na diferencovaných astrocytoch in vivo. Bolo zistené, že tieto molekuly rast neuritov na jednovrstvových kultúrach a kryostatových sekcií nepoškodených a poškodených dospelých myších optických nervov, a tiež in vivo, v experimentoch s deformáciou optického nervu u transgénnych zvierat. Zvýšená schopnosť rastu neuritov je úmerná hladine ektopickej expresie CNGM. Toto je demonštrované porovnávaním odlišných transgénnych línií podlá tohoto vynálezu, ktoré exprimujú rôzne bazálne hladiny CNGM kódovaných transgénom, a koreláciami následnej zvýšenej expresie CNGM po porušení optického nervu.The present invention relates in one aspect to ectopic expression of neural CNS growth modulators (CNGM) or neural cell adhesion molecules on differentiated astrocytes in vivo. These molecules have been found to grow neurites in monolayer cultures and cryostat sections of intact and damaged adult mouse optical nerves, as well as in vivo, in experiments with optical nerve deformation in transgenic animals. The increased neurite outgrowth is proportional to the level of CNGM ectopic expression. This is demonstrated by comparing different transgenic lines of the invention that express different basal levels of CNGM encoded by the transgene, and correlating subsequent CNGM expression after optic nerve disruption.

1121111211

Malo by byť uznané, že aj keď optické nervy, ako porušené, tak aj neporušené, sú vhodné na použitie podľa predloženého vynálezu, môžu byť podobne použitá akákoľvek časť nervovej sústavy, vrátane častí mozgu a miechy.It should be appreciated that although optical nerves, both broken and intact, are suitable for use in the present invention, any part of the nervous system, including parts of the brain and spinal cord, may similarly be used.

Rast neuritov je závislý na hladinách expresie CNGM v astrocytoch, čo demonštruje špecifický efekt spôsobený CNGM v podpore rastu neuritov v transgénnych zvieratách. Inhibícia rastu neuritov polyklonálnymi protilátkami proti CNGM, ale nie protilátkami proti myším membránam pečene, ďalej podporuje túto špecificitu, zvlášť, pretože obidve protilátky reagujú dobre s bunkovými povrchmi neurónov a astrocytov transgénnych zvierat.Neurite growth is dependent on levels of CNGM expression in astrocytes, demonstrating the specific effect caused by CNGM in promoting neurite outgrowth in transgenic animals. Inhibition of neurite outgrowth by polyclonal antibodies against CNGM, but not by antibodies against mouse liver membranes, further promotes this specificity, especially since both antibodies respond well to cell surfaces of neurons and astrocytes of transgenic animals.

Vo výhodnom vyhotovení je CNGM molekula Ll. Biologické efekty Ll môžu byť inhibované protilátkami proti Ll, čo ukazuje, že Ll je homofilicky aktívna v konfigurácii trans v bunkovom povrchu transgénnych astrocytov. Ďalej druhovo špecifické protilátky proti Ll, ktoré nereagujú s kuracími dorzálnymi koreňovými gangliónovými neurónmi, inhibujú neuritový rast v tomto type neuronálnej bunky na transgénnych astrocytoch. Tieto zistenia jednoznačne identifikujú Ll ako aktívnu molekulu pôsobiacu trans a ukazujú, že ektopická expresia Ll gliovými bunkami, ktorým normálne chýba expresia Ll, zosilňuje rast neuritov in vitro.In a preferred embodiment, the CNGM is an L1 molecule. The biological effects of L1 can be inhibited by anti-L1 antibodies, indicating that L1 is homophilically active in the trans configuration in the cell surface of transgenic astrocytes. Furthermore, species-specific anti-L1 antibodies that do not react with chicken dorsal root ganglion neurons inhibit neurite growth in this type of neuronal cell on transgenic astrocytes. These findings unequivocally identify L1 as an active trans-acting molecule, and show that ectopic expression of L1 by glial cells, normally lacking L1 expression, enhances neurite outgrowth in vitro.

Zosilnenie sprostredkované podporujú rast (1986) J. Comp.Enhancement mediated promoting growth (1986) J. Comp.

rastu neuritov na gliových bunkách transgénom, ktoré normálne neexprimujú Ll in vivo, ukazuje, že gliové bunky dospelej centrálnej nervovej sústavy cicavca môžu byť viac prispôsobené na neuritový rast. Strata molekúl, ktoré neuritov cez gliové bunky (Smith et alneurite outgrowth on glial cells by transgenes that do not normally express L1 in vivo, shows that glial cells of the adult mammalian central nervous system may be more adapted to neurite outgrowth. Loss of molecules by neurites through glial cells (Smith et al

Neurol. 251:23-43; Smith et al. (1990) Dev. Biol. 138:377-390) sa preto ukazuje byť kompenzovaná expresiou rekogničnej molekuly, ktorá je normálne veľmi exprimovaná v gliových bunkách v dospelej periferálnej nervovej sústave cicavca (Niecke et al. (1985); Bixby et al. (1988) J. Celí. Biol. 107:353-362; Seilheimer et al. (1988) J. Celí. Biol.Neurol. 251: 23-43; Smith et al. (1990) Dev. Biol. 138: 377-390) therefore appears to be compensated by the expression of a recombinant molecule that is normally highly expressed in glial cells in the adult peripheral nervous system of a mammal (Niecke et al. (1985); Bixby et al. (1988) J. Cell. Biol. 107: 353-362, Seilheimer et al (1988) J. Cell Biol.

1121111211

107:341-351).107: 341-351).

Fenotyp dospelých astrocytov z predložených transgénnych línií môže byt modifikovaný smerom k schopnosti obnoviť expresiu Ll Schwannovými bunkami po spôsobení poškodenia. Zvýšenie expresie Ll Schwannovými bunkami je pravdepodobne sprostredkované neurotropínmi aktivovanými po poškodení autokrinnými mechanizmami (Seilheimer et al. (1987) EMBO J. 6:1611-1616). Podobne môže byť expresia Ll astrocytmi v kultúre aktivovaná TGF-beta a NGF (Saad et al. (1991)). Vytvorením myší s transgénom GFAB-L1 je neschopnosť zrelých astrocytov odpovedať na nervové poranenie prekonaná aktiváciou molekuly Ll. Expresia Ll môže byť zvlášť výhodná pre rast neuritov v myelínovaných dráhach centrálnej nervovej sústavy, ktoré normálne obsahujú niekoľko molekúl, ktoré inhibujú rast neuritov (Schachner et al., Perspectives in Developm. Neurobiol. in Press; Schwab et al. (1995) Ann. Rev. Neurosci. 16:565-595).The phenotype of adult astrocytes from the present transgenic lines may be modified towards the ability to restore L1 expression by Schwann cells after causing damage. The increase in L1 expression by Schwann cells is probably mediated by neurotropins activated after damage by autocrine mechanisms (Seilheimer et al. (1987) EMBO J. 6: 1611-1616). Similarly, expression of L1 by astrocytes in culture can be activated by TGF-beta and NGF (Saad et al. (1991)). By creating mice with the GFAB-L1 transgene, the inability of mature astrocytes to respond to nerve injury is overcome by activation of the L1 molecule. L1 expression may be particularly advantageous for neurite outgrowth in myelinated central nervous system pathways that normally contain several molecules that inhibit neurite outgrowth (Schachner et al., Perspectives in Develop. Neurobiol. In Press; Schwab et al. (1995) Ann. Rev. Neurosci. 16: 565-595).

Predložený vynález demonštruje, že ínhibičné pôsobenie astrogliálnych a oligodendrogliálnych buniek môže byť prekonané, prinajmenšom sčasti, rast neuritov je umožnený podporujúcimi vlastnosťami látok tu definovanými a zvlášť ako je ilustrované aktivitou ektopicky exprimovanej Ll. Expresia Ll v astrocytoch sa dá tiež kompenzovať inhibičnými efektami vykonávanými oligodendrocytmi. Permisívne a nepermisívne molekulárne mechanizmy preto nemusia byť lokalizované na tom istom type bunky, aby sa objavil rast neuritov. Namiesto toho môžu byť tieto molekulárne mechanizmy zdieľané medzi rôznymi typmi buniek. Bunková a molekulárna manipulácia Ll a iných molekúl podporujúcich rast neuritov môže preto umožniť zosilnenie regeneratívnej kapacity dospelej centrálnej nervovej sústavy po poranení alebo chorobe.The present invention demonstrates that the inhibitory action of astroglial and oligodendroglial cells can be overcome, at least in part, by neurite outgrowth by the promoting properties of the substances defined herein, and particularly as exemplified by the activity of ectopically expressed L1. L1 expression in astrocytes can also be compensated for by the inhibitory effects exerted by oligodendrocytes. Therefore, permissive and non-permissive molecular mechanisms do not need to be located on the same cell type to detect neurite outgrowth. Instead, these molecular mechanisms can be shared between different cell types. Cellular and molecular manipulation of L1 and other neurite-enhancing molecules may therefore allow enhancing the regenerative capacity of the adult central nervous system following injury or disease.

Ako bolo ukázané vyššie, predložený vynález sa týka podpory neurálneho rastu v CNS, vrátane takého rastu, ktorý je potrebný pre regeneráciu štruktúr, k strate ktorých došlo vplyvom poranenia alebo choroby, rovnako ako tých štruktúrAs shown above, the present invention relates to promoting neural growth in the CNS, including such growth that is necessary to regenerate structures lost due to injury or disease, as well as those structures.

11211 a tkanív vykazujúcich nekompletnú alebo nehotovú formáciu. Látky podľa tohoto vynálezu tiež vykazujú neuroprotektívny alebo nervovo ochranný efekt, ako je to ilustrované nižšie, a napr., môžu byť podávané za účelom inhibovania neurálnej degenerácie alebo straty rôznej povahy.11211 and tissues exhibiting incomplete or incomplete formation. The compounds of the invention also exhibit a neuroprotective or neuroprotective effect, as illustrated below, and, for example, may be administered to inhibit neural degeneration or loss of a different nature.

Vynález sa tiež týka konštrukcií a prostriedkov obsahujúcich alebo dopravujúcich látky podľa tohoto vynálezu, huď podporovaním expresie istých látok prostredníctvom génovej terapie a podobne, alebo exogénnym podávaním týchto látok, kde je to vhodné alebo potrebné, vo forme farmaceutických prostriedkov za účelom liečenia poranených alebo chorých štruktúr CNS. V tomto spojení je uvažované, že isté látky sú schopné vykonávať rast podporujúci efekt, keď sú takto podávané, aj keď je známe, že členovia uvedenej skupiny, ako je L1 a N-CAM, sa viažu homofilicky a môžu tak byť viac účinné, keď sú podávané pomocou expresie. Vynález sa týka obidvoch typov ciest a protokolov, kde je to možné.The invention also relates to constructions and compositions containing or delivering the agents of the invention, either by promoting the expression of certain agents by gene therapy and the like, or by exogenously administering such agents, where appropriate or necessary, in the form of pharmaceutical compositions for the treatment of injured or diseased structures. CNS. In this connection, it is contemplated that certain substances are capable of exerting a growth promoting effect when so administered, although it is known that members of said group, such as L1 and N-CAM, bind homophilically and may thus be more effective when are administered by expression. The invention relates to both road types and protocols where possible.

Malo by byť tiež uvedené, že sa predložený vynález týka použitia sekrétujúcich buniek CNGM za účelom modulácie nervového rastu, regenerácie a prežívania nervov v CNS. Určité rozpustné CNGM a jej fragmenty a príbuzné molekuly sú tiež predmetom vynálezu.It should also be noted that the present invention relates to the use of CNGM secreting cells to modulate nerve growth, regeneration and nerve survival in the CNS. Certain soluble CNGM and fragments thereof and related molecules are also within the scope of the invention.

Nasledujúce pojmy budú definované nižšie.The following terms will be defined below.

Pojem látka, nervový rastový modulátor CNS, CNGM, nervová rekogničná molekula, rekogničný faktor, rekogničný faktorový proteín, nervová adhézna molekula a akékoľvek varianty, ktoré tu nie sú zvlášť uvedené, môžu byť použité zameniteľné a ako také použité v predloženej žiadosti a nárokoch, ktoré sa týkajú proteínového materiálu vrátane jednoduchých alebo komplexných proteínov a týkajú sa tiež tých proteínov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu predtým opísanú a profil aktivít uvedený tu a v nárokoch. Tieto pojmy tiež zahŕňajú aktívne fragmenty týchto proteínov, príbuzné molekuly a analógy, vrátane malých molekúl, ktoré sa chovajú podobne ako uvedené látky.The term substance, nerve growth modulator CNS, CNGM, neural recognitive molecule, recognitive factor, recognitive factor protein, neural adhesion molecule and any variants not specifically mentioned herein may be used interchangeably and as such used in the present application and claims that they relate to proteinaceous material, including single or complex proteins, and also to those having the amino acid sequence previously described and the activity profile set forth herein and in the claims. These terms also include active fragments of these proteins, related molecules and analogs, including small molecules, which behave similarly to said agents.

11211 faktorový proteín, uvádzané, že zahŕňajú podstatné homológy uvádzané11211 factor protein, reported to include the essential homologues disclosed

V zhode s tým sú proteíny vykazujúce rovnakú alebo pozmenenú aktivitu podobne mienené. Za tieto modifikácie môžu byť považované cielené mutagenézy alebo môžu byť náhodné, rovnako ako tie, ktoré sú získané vplyvom mutácií v hostiteľoch, ktorí ich produkujú. Pojmy nervový rastový modulátor CNS”, CNGM, nervová rekogničná molekula, rekogničný faktor, rekogničný nervová adhézna molekula sú tiež proteíny tu citované rovnako ako a alelické variácie.Accordingly, proteins exhibiting the same or altered activity are similarly intended. Targeted mutagenesis may be considered or may be randomized, as well as those obtained by mutations in the hosts producing them. The terms nerve growth modulator CNS, CNGM, neural recognitive molecule, recognitive factor, recognitive neural adhesion molecule are also proteins cited herein as well as and allelic variations.

Aminokyselinové zvyšky tu opísané sú v izomérovej forme L. Avšak zvyšky v izomérovej forme D môžu byť zamenené za akýkoľvek zvyšok v izomérovej forme L pokiaľ je polypeptidom udržiavaná funkčná vlastnosť väzby imunoglohulínu. NH2 uvádza voľnú aminoskupinu prítomnú na konci polypeptidu. COOH uvádza voľnú karboxylovú skupinu prítomnú na konci polypeptidu. Podľa štandardnej polypeptidovej nomenklatúry, J. Biol. Chem.The amino acid residues described herein are in isomeric form L. However, residues in isomeric form D can be replaced with any residue in isomeric form L as long as the functional property of immunoglohulin binding is maintained by the polypeptide. NH 2 lists the free amino group present at the end of the polypeptide. COOH indicates the free carboxyl group present at the end of the polypeptide. According to the standard polypeptide nomenclature, J. Biol. Chem.

(1969) sú uvedené skratky aminokyselín v tabuľke:(1969), amino acid abbreviations are given in the table:

243:3552-59 nasledujúcej243: 3552-59

1121111211

TABUĽKA SKRATIEK AMINOKYSELÍN TABLE OF ABBREVIATIONS OF AMINO ACIDS AMINOKYSELINA Amino acids SYMBOL SYMBOL Jedno písmeno One letter Tri písmená Three letters Y Y Tyr Tyr tyrozín tyrosine G G Gly Gly glycín glycine F F Phe Phe fenylalanín phenylalanine M M Met Met metionín methionine A A Ala Ala alanín alanine S WITH Ser Ser serín serine I I íle Ile izoleucín isoleucine L L Leu Leu leucín leucine T T Thr Thr treonín threonine V IN Val wall valín valine P P Pro for prolín proline K The Lys Lys lyzín lysine H H His His histidín histidine Q Q Gin gin glutamín glutamine E E Glu Glu kys. glutámová acid. glutamic W W Trp Trp tryptofán tryptophan R R Arg Arg arginín arginine D D Asp Asp kys. asparágová acid. aspartic N N Asn same time asparagín asparagine C C Cys Cys cysteín cysteine Malo by It should byť poznamenané be noted , že všetky sekvencie that all the sequences aminokyse1inových aminokyse1inových zvyškov sú tu residues are here vo forme, ktorých ľavá in the form of the left a pravá orientácia je konvenčný smer od konca amino ku koncu and the right orientation is a conventional direction from amino to terminal karboxy. Ďalej carboxy. Further by malo byť poznamenané, že pomlčka na It should be noted that the dash to začiatku alebo na start or at konci sekvencie end of the sequence aminokyselinových zvyškov amino acid residues uvádza peptidovú reports peptide väzbu na ďalšiu sekvenciu alebo jeden binding to another sequence or one a viac aminokyselinových zvyškov and more amino acid residues . Horeuvedená tabuľka je . The above table is uvedená kvôli given because of prevodu trojpísmenového zápisu na convert a three - letter entry to jednopísmenový, pretože sa tu môžu because they can be here tieto zápisy striedať. alternate these listings. Replikon replicon je akýkolvek is any genetický element (napr. a genetic element (e.g.

11211 plazmid, chromozóm, vírus), ktorý funguje ako autonómna jednotka replikácie DNA in vivo; t.j. je schopná replikácie pod vlastnou kontrolou.11211 plasmid, chromosome, virus), which functions as an autonomous unit of DNA replication in vivo; i is capable of replication under its own control.

Vektor je replikon, ako je plazmid, fág alebo kozmid, ku ktorému môže byť pripojený iný segment DNA za účelom vyhotovenia replikácie pripojeného segmentu.The vector is a replicon, such as a plasmid, phage, or cosmid, to which another DNA segment may be attached to effect replication of the linked segment.

Molekula DNA označuje polymérovú formu deoxyribonukleotidov (adenín, guanín, tymín a cytozin) v jej jednovláknovej forme alebo vo forme dvojvláknovej skrutkovice. Tento pojem označuje len primárnu a sekundárnu štruktúru molekuly a neobmedzuje ju na akékoľvek zvláštne terciárne formy. Tento pojem zahŕňa dvojvláknovú DNA nachádzajúcu sa, inter alia, v lineárnych molekulách DNA (napr. reštrikčné fragmenty), vírusoch, plazmidoch a chromozómoch. Pri opisovaní štruktúry špeciálnych dvojvláknových molekúl DNA môžu byť sekvencie opísané podľa normálnej konvencie tak, že uvádzajú len sekvenciu v smere od 5'k 3' pozdĺž netranskribovaného vlákna DNA (t.j. vlákna, ktoré má sekvenciu homológnu k mRNA).A DNA molecule denotes the polymer form of deoxyribonucleotides (adenine, guanine, thymine and cytosine) in its single-stranded or double-stranded helix form. This term refers only to the primary and secondary structure of the molecule and is not limited to any particular tertiary forms. The term includes double-stranded DNA found, inter alia, in linear DNA molecules (e.g., restriction fragments), viruses, plasmids, and chromosomes. In describing the structure of special double-stranded DNA molecules, sequences may be described according to normal convention by referring only to a sequence 5'k to 3 'along the untranscribed strand of DNA (i.e. strands having a sequence homologous to the mRNA).

Počiatok replikácie označuje tie sekvencie DNA, ktoré sa zúčastňujú na syntéze DNA.The origin of replication refers to those DNA sequences that are involved in DNA synthesis.

Kódujúca sekvencia” DNA je dvojvláknová sekvencia DNA, ktorá je transkribovaná a translatovaná do polypeptidu in vivo, kde je umiestnená pod kontrolu vhodnej regulačnej sekvencie. Hranice kódujúce sekvencie sú určené iniciačným kodónom na 5' konci amino a translačným terminačným kodónom na 3' konci karboxy. Kódujúca sekvencia môže zahŕňať, ale nie obmedzená na, prokaryontové sekvencie, cDNA z eukaryontovej mRNA, genómové sekvencie DNA z eukaryontovej (napr. cicavčej) DNA a tiež syntetické sekvencie DNA. Polyadenylačný signál a transkripčné terminačné sekvencie budú zvyčajne umiestnené na 3' konci vzhľadom na kódujúcu sekvenciu.The DNA coding sequence is a double-stranded DNA sequence that is transcribed and translated into a polypeptide in vivo, where it is placed under the control of a suitable regulatory sequence. The boundaries of the coding sequence are determined by the initiation codon at the 5 'end of the amino and by the translation termination codon at the 3' end of the carboxy. The coding sequence may include, but is not limited to, prokaryotic sequences, cDNAs from eukaryotic mRNA, genomic DNA sequences from eukaryotic (e.g., mammalian) DNA, as well as synthetic DNA sequences. The polyadenylation signal and transcription termination sequences will usually be located at the 3 'end of the coding sequence.

Transkripčné a translačné kontrolné sekvencie sú regulačné sekvencie DNA, ako promotory, zosilňovače, polyadenylačné signály, terminátory a podobne, ktoré slúžiaTranscriptional and translational control sequences are DNA regulatory sequences, such as promoters, enhancers, polyadenylation signals, terminators, and the like, which serve

11211 na expresiu kódujúcej sekvencie v hostiteľskej bunke.11211 for expressing the coding sequence in a host cell.

Promotorová sekvencia je regulačná oblasť DNA schopná väzby s RNA polymerázou v bunke a zahájenia transkripcie smerom k 3' koncu kódujúcemu sekvencie. Za účelom definovania predloženého vynálezu je promotorová sekvencia obmedzená na svojom 3' konci transkripčným iniciačným miestom a presahuje smerom k 5* koncu tak, že zahŕňa minimálny počet báz alebo elementov nutných na zahájenie transkripcie na úrovni detekovateľnej na pozadí. Vnútri promotorovej sekvencie sa bude nachádzať transkripčné iniciačné miesto (vhodne definované mapovaním pomocou nukleázy SI), rovnako ako proteínové väzbové domény (konsesné sekvencie) zodpovedné za väzbu RNA polymerázy. Eukaryontové promotory budú často, ale nie vždy, obsahovať úseky TATA a CAT. Prokaryontové promotory obsahujú Shine-Dalgarnové sekvencie spoločne s konsesnými sekvenciami -10 a -35.A promoter sequence is a DNA regulatory region capable of binding to RNA polymerase in a cell and initiating transcription towards the 3 'end of the coding sequence. For the purpose of defining the present invention, the promoter sequence is restricted at its 3 'end by a transcription initiation site and extends towards the 5' end to include the minimum number of bases or elements necessary to initiate transcription at a level detectable in the background. Within the promoter sequence there will be a transcriptional initiation site (suitably defined by SI nuclease mapping) as well as the protein binding domains (consensus sequences) responsible for RNA polymerase binding. Eukaryotic promoters will often, but not always, contain TATA and CAT regions. Prokaryotic promoters contain Shine-Dalgarno sequences together with the consensus sequences -10 and -35.

Expresná kontrolná sekvencia je sekvencia DNA, ktorá kontroluje a reguluje transkripciu a transláciu inej sekvencie DNA. Kódujúca sekvencia je pod kontrolou transkripčných a translačných kontrolných sekvencií v bunke, kde RNA polymeráza prepisuje kódujúcu sekvenciu do mRNA, ktorá je potom preložená do proteínu kódovaného kódujúcou sekvenciou.An expression control sequence is a DNA sequence that controls and regulates the transcription and translation of another DNA sequence. The coding sequence is under the control of transcriptional and translational control sequences in the cell, where the RNA polymerase transcribes the coding sequence into mRNA, which is then translated into the protein encoded by the coding sequence.

Pojem oligonukleotid, ako je tu používaný uvádzajúc próby, je definovaný ako molekula zložená z jedného alebo viacerých ribonukleotidov, s výhodou viac než troch. Jeho presná veľkosť bude záležať na mnohých faktoroch, ktoré na naopak záležia oli gonukleot i du.The term oligonucleotide, as used herein, referring to probes, is defined as a molecule composed of one or more ribonucleotides, preferably more than three. Its exact size will depend on many factors, which in turn depend on the oligonucleotide.

Pojem primér, oligonukleotid, ktorý v purifikovanom reštrikčnom konečnej funkcii a použití ako sa je tu používaný, označuje buď vyskytuje prirodzene digeste alebo je vyrobený synteticky, ktorý je schopný pôsobiť ako miesto zahájenia syntézy, keď je umiestnený do podmienok, v ktorých je syntéza indukovaná a to predĺžením priméru, t. j.The term primer, oligonucleotide, which, in the purified restriction end function and use as used herein, denotes either occurs naturally by digestion or is produced synthetically, capable of acting as a site of synthesis when placed under conditions in which synthesis is induced and by primer extension, i. j.

11211 v prítomnosti polymerázy a nukleotidov vo vhodnej a indukujúcej teplote a pH.11211 in the presence of a polymerase and nucleotides at a suitable and inducing temperature and pH.

látky ako DNA Primár je buď jednovláknový alebo dvojvláknový a na zahájenie syntézy potrebného indukujúcej látky. Presná dĺžka mnohých faktoroch, vrátane musí byť dostatočne dlhý produktu v prítomnosti priméru bude záležať na teploty, zdroja priméru a použitého spôsobu. Napríklad v diagnostických aplikáciách obsahuje oligonukleotidový primér typicky 15-25 alebo viac aj menej nukleotidov, v závislosti na komplexnosti cieíovej sekvencie.substances such as DNA The primary is either single stranded or double stranded and to initiate the synthesis of the necessary inducing substance. The exact length of many factors, including the sufficiently long product in the presence of the primer, will depend on the temperature, the source of the primer, and the method used. For example, in diagnostic applications, the oligonucleotide primer typically contains 15-25 or more or less nucleotides, depending on the complexity of the target sequence.

Priméry tu selektované sú v podstate*' komplementárne k rôznym vláknam cieľovej sekvencie DNA. To znamená, že byť dostatočne komplemetárne, aby príslušnými vláknami. Preto sekvencie zodpovedať presnej sekvencii predlohy.The primers selected herein are substantially complementary to the various strands of the target DNA sequence. This means being sufficiently complementary to the appropriate fibers. Therefore, the sequences correspond to the exact sequence of the template.

Napríklad, nekomplementárny nukleotidový fragment je pripojený k 5' koncu priméru s tým, že zvyšok sekvencie priméru je komplementárny ku vláknu. Naopak, nekomplementárna báza alebo ďalšia sekvencia sú vsunuté do medzier*¹ do vnútra priméru, za predpokladu, že sekvencia priméru má dostatočnú komplementaritu so sekvenciou vlákna, aby hybridizovala a tým utvorila templát pre syntézu pnmery musia hybridizovali s priméru nemusia predĺženého produktu.For example, a non-complementary nucleotide fragment is attached to the 5 'end of the primer, with the remainder of the primer sequence being complementary to the strand. Conversely, the non-complementary base or other sequence is inserted into the gaps * ¹ inside the primer, provided that the primer sequence has sufficient complementarity with the strand sequence to hybridize and thereby form a template for synthesis synthesis.

Ako je použité tu, pojmy reštrikčné endonukleázy a reštrikčné enzýmy sa týkajú bakteriálnych enzýmov, ktoré štiepia dvojvláknovú DNA v mieste alebo blízko miesta špecifickej nukleotidovej sekvencie.As used herein, the terms restriction endonucleases and restriction enzymes refer to bacterial enzymes that cleave double stranded DNA at or near the site of a specific nucleotide sequence.

Bunka je transformovaná exogénna alebo heterológová DNA, kde je takáto DNA vnesená do vnútra bunky. Transformujúca DNA je alebo nie je integrovaná (kovalentne spojená) do chromozomálnej DNA tvoriacej genóm bunky. Napríklad u prokaryontov, kvasiniek a buniek cicavcov je transformujúca DNA udržiavaná na epizómových elementoch ako sú plazmidy. S ohľadom na eukaryontové bunky je stabilne transformovaná bunka taká, v ktorej bola transformujúca DNA integrovaná do chromozómu tak, že je dedená dcérskymiThe cell is transformed with exogenous or heterologous DNA, where such DNA is introduced into the interior of the cell. The transforming DNA is or is not integrated (covalently linked) into the chromosomal DNA forming the genome of the cell. For example, in prokaryotes, yeast and mammalian cells, transforming DNA is maintained on episomal elements such as plasmids. With respect to eukaryotic cells, a stably transformed cell is one in which the transforming DNA has been integrated into the chromosome so that it is inherited by daughter cells.

11211 bunkami počas demonštrovaná bunkové línie buniek, ktoré replikácie chromozómu. Táto stabilita je schopnosťou eukaryontovej bunky vytvoriť alebo klony obsahujúce populáciu dcérskych obsahujú transformujúcu DNA. Kloň“ je populácia buniek odvodených z jedinej bunky alebo spoločného predka mitózou. Bunková línia je kloň primárnej bunky, ktorý je schopný stabilného rastu in vitro mnoho generácií.11211 cells during the demonstrated cell line of cells that replicate the chromosome. This stability is the ability of a eukaryotic cell to create or clones containing a population of daughter cells containing transforming DNA. Clone 'is a population of cells derived from a single cell or common ancestor by mitosis. A cell line is a primary cell clone that is capable of stable in vitro growth for many generations.

Dve sekvencie DNA sú “v podstate homológne, keď sa zhoduje najmenej 75% (výhodne najmenej 80% a najvýhodnejšie najmenej 90 alebo 95%) nukleotidov v definovanej dĺžke sekvencií DNA. Sekvencie, ktoré sú v podstate homológne, sú identifikované porovnaním sekvencií dostupných v sekvenčných databankách pomocou štandardného softvéru alebo v hybridizačných experimentoch typu Sothern za, napr. stringentných podmienok, ako je to definované pre príslušný systém. Definovanie vhodných hybridizačných podmienok je odbornou vecou, viď napr. Naniatis et al. supra; DNA cloning, Vols. I a II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.The two DNA sequences are substantially homologous when at least 75% (preferably at least 80%, and most preferably at least 90 or 95%) nucleotides in the defined length of the DNA sequences coincide. Sequences that are substantially homologous are identified by comparing the sequences available in sequence databases using standard software or in Sothern type hybridization experiments, e.g. stringent conditions as defined for the system. The definition of suitable hybridization conditions is a matter of skill, see e.g. Naniatis et al. supra; DNA Cloning, Vols. I and II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

“Heterológová oblasť konštrukcie DNA je identifikovaný segment DNA vnútri dlhej molekuly DNA, ktorý sa nenachádza v spojení s ďalšou molekulou v prírode. Keď heterológová oblasť kóduje gén cicavca, tento gén bude zvyčajne ohraničený DNA, ktorá neohraničuje genómovú DNA cicavca v genóme východzieho organizmu. Iný príklad heterológovej kódujúcej sekvencie je konštrukcia, kde kódujúca sekvencia samotná sa nenachádza v prírode (napr. cDNA, kde genómová kódujúca sekvencia obsahuje intróny, alebo syntetické sekvencie, ktoré majú kodóny iné než u prirodzeného génu). Alelické variácie alebo prirodzene sa vyskytujúce mutačné udalosti nie sú príčinou vzniku heterológových oblastí DNA, ako je tu definované.“The heterologous region of DNA construction is an identified segment of DNA inside a long DNA molecule that is not found in association with another molecule in nature. When the heterologous region encodes a mammalian gene, this gene will usually be flanked by DNA that does not delimit the mammalian genomic DNA in the genome of the parent organism. Another example of a heterologous coding sequence is a construct wherein the coding sequence itself is not found in nature (e.g., a cDNA wherein the genomic coding sequence comprises introns, or synthetic sequences having codons other than the natural gene). Allelic variations or naturally occurring mutation events do not cause heterologous DNA regions as defined herein.

Protilátka je akýkolvek imunoglobulín, vrátane protilátok a fragmentov z nej pochádzajúcich, ktorý viaže špecifický epitop. Pojem zahŕňa polyklonálne, monoklonálne a chimerické protilátky, posledne menované sú opísanéAn antibody is any immunoglobulin, including antibodies and fragments derived therefrom, that binds a specific epitope. The term includes polyclonal, monoclonal and chimeric antibodies, the latter being described

11211 proteolytickou reakciou pôvodné imunoglobulínové detailne v U.S. Patent No. 4,816,397 a 4,816,567.11211 by the proteolytic reaction of the original immunoglobulin in detail in U.S. Pat. Patent No. 4,816,397 and 4,816,567.

Spoločné proti látkové miesto je taká štruktúrna časť molekuly protilátky obsiahnutá v ťažkom a ľahkom reťazci variabilných a hypervariabiIných oblastí, ktorá špecificky viaže antigén.A common antibody site is that structural portion of an antibody molecule contained within the heavy and light chains of the variable and hypervariable regions that specifically bind the antigen.

Pojem molekula protilátky” vo svojich rôznych gramatických formách, ako je to tu použité, sa týka ako intaktnej imunoglobulínovej molekuly, tak imunologický aktívnej časti imunoglobulínovej molekuly.The term antibody molecule ”in its various grammatical forms, as used herein, refers to both the intact immunoglobulin molecule and the immunologically active portion of the immunoglobulin molecule.

Príkladné molekuly protilátky sú pôvodné imunoglobulínové molekuly, skutočné sú pôvodné imunoglobulínové molekuly a tie ich časti známe v odbore ako Fab, Fab', F(ab') a F(v), ktoré sú uprednostnené pre použitie v terapeutických spôsoboch tu opísaných.Exemplary antibody molecules are the original immunoglobulin molecules, the true are the original immunoglobulin molecules and those portions thereof known in the art as Fab, Fab ', F (ab') and F (v), which are preferred for use in the therapeutic methods described herein.

Časti protilátok Fab a F(ab') sú pripravované papaínu a pepsínu na skutočné molekuly spôsobmi, ktoré sú dobre známe. Viď napr. U. S. Patent No. 4,342,566, Theofilopolous et. al. Časti protilátok Fab* sú dobre známe a sú produkované z častí F(ab') následnou redukciou merkaptoetanolom disulfidových väzieb dva ťažké reťazce a následnou alkyláciou výsledného bielkovinového merkaptánu činidlom akým je iódoacetamid. Uprednostnené sú intaktné molekuly protilátok.Fab and F (ab ') antibody portions are prepared by papain and pepsin to the actual molecules by methods well known. See e.g. U.S. Pat. No. 4,342,566, Theofilopolous et. al. Fab * antibody portions are well known and are produced from the F (ab ') portions by subsequent reduction of the mercaptoethanol disulfide bonds by two heavy chains and subsequent alkylation of the resulting protein mercaptan with an agent such as iodoacetamide. Intact antibody molecules are preferred.

Pojem monoklonálna protilátka vo svojich rôznych gramatických formách sa vzťahuje na protilátku, ktorá má len jeden druh väzbového miesta, ktoré imunogénne reaguje s príslušným antigénom. Monoklonálna protilátka tak typicky vykazuje jedinú väzbovú afinitu pre antigén, s ktorým imúnne reaguje. Monoklonálna protilátka tak obsahuje molekulu, ktorá má pluralitu vzájomných miest, každé imunošpecifické na iný antigén; napr. dvojito špecifickú (chimérnu) monoklonálnu protilátku.The term monoclonal antibody in its various grammatical forms refers to an antibody that has only one kind of binding site that immunogenically reacts with the respective antigen. Thus, a monoclonal antibody typically exhibits a single binding affinity for the antigen with which it reacts immune. Thus, the monoclonal antibody comprises a molecule having a plurality of mutual sites, each immunospecific for a different antigen; e.g. double specific (chimeric) monoclonal antibody.

Pojem farmaceutický prijateľný sa týka molekulárnych entít a prostriedkov, ktoré sú fyziologicky tolerantné a nespôsobujú alergické alebo podobné reakcie, ako súThe term pharmaceutically acceptable refers to molecular entities and compositions that are physiologically tolerant and do not cause allergic or similar reactions such as

- 37 11211 žalúdočná nevoľnosť, závrat a podobne, keď sú podávané človeku.- 37 11211 stomach upset, dizziness and the like when administered to a human.

Pojem terapeuticky účinné množstvo tu znamená množstvo dostatočné na zabránenie a s výhodou na zníženie najmenej o 30 percent a ešte výhodnejšie o 50 percent a najvýhodnejšie o 90 percent klinicky významnej zmene vo fáze aktivity S cieľovej bunkovej masy alebo iného patologického stavu, ako napr. zvýšeného krvného tlaku, horúčky alebo množstva bielych krviniek.The term therapeutically effective amount herein means an amount sufficient to prevent, and preferably reduce, at least about 30 percent, and more preferably about 50 percent, and most preferably about 90 percent, of a clinically significant change in the S-phase activity of the target cell mass or other pathological condition, e.g. increased blood pressure, fever, or a number of white blood cells.

Sekvencia DNA je operatívne spojená k expresnej kontrolnej sekvencii, keď expresná kontrolná sekvencia riadi a reguluje transkripciu a transláciu tej sekvencie DNA. Pojem operatívne spojená zahŕňa sekvenciu, ktorá má vhodný počiatočný signál (napr. ÄTG) na jej začiatku, ktorá slúži na expresiu a udržiavanie správneho čítacieho rámca, ktorý umožňuje expresiu sekvencie DNA pod riadením expresnej kontrolnej sekvencie a produkciu požadovaného produktu kódovaného touto sekvenciou DNA. V prípade, že gén, ktorý je požadovaný kvôli vneseniu do rekombinantnej molekuly DNA, neobsahuje vhodný počiatočný signál, je taký počiatočný signál dodatočne vnesený na začiatok tohoto génu.The DNA sequence is operably linked to an expression control sequence when the expression control sequence directs and regulates the transcription and translation of that DNA sequence. The term operably linked includes a sequence having a suitable start signal (e.g., TG) at the beginning thereof that serves to express and maintain the correct reading frame that allows expression of the DNA sequence under the control of the expression control sequence and production of the desired product encoded by that DNA sequence. Where the gene required for introduction into the recombinant DNA molecule does not contain a suitable start signal, such start signal is additionally introduced at the beginning of the gene.

Pojem štandardné hybridizačné podmienky sa týka koncentrácie soli a teplotných podmienok, ktoré sa v podstate rovnajú 5xSSC a 65°C pre hybridizáciu a premývanie.The term standard hybridization conditions refers to salt concentration and temperature conditions substantially equal to 5xSSC and 65 ° C for hybridization and washing.

V jednom aspekte sa predložený vynález týka transgénnych zvierat, ktoré exprimujú CNGM alebo neurálnu rozpoznávaciu molekulu, zvlášť L1, a to výhodne v astrocytoch. Tieto zvieratá majú zvýšenú schopnosť nervového rastu v centrálnej nervovej sústave.In one aspect, the present invention relates to transgenic animals that express CNGM or a neural recognition molecule, particularly L1, preferably in astrocytes. These animals have an increased capacity for nerve growth in the central nervous system.

Vynález tiež zahŕňa skúšku na testovanie potenciálnych prostriedkov, ktoré sú účinné pri modulácii nervového rastu cieľových buniek cicavcov prerušením alebo potenciáciou nervovej rozpoznávacej aktivity CNGM. Ako nervová rozpoznávacia aktivita alebo nervová adhézna aktivita je mienený akýkoľvek biologický efekt, ktorý je výsledkom väzbyThe invention also encompasses an assay to test for potential agents that are effective in modulating the nerve growth of mammalian target cells by disrupting or potentiating the CNGM's nerve cognitive activity. By neural cognitive activity or neural adhesion activity is meant any biological effect resulting from binding

11211 chemickej vzorke alebo s kontrolou. Určujúce vyhotovení domény Ll,11211 chemical sample or with control. Defining Ll domain

CNGM na inú molekulu, vrátane intracelulárnych efektov na druhých prenášačov. V jednom prípade je testovaný prostriedok podávaný do bunkovej vzorky s ligandom, ktorý aktivuje nervový rastový modulátor CNS, alebo transgénnemu zvieraťu exprimujúcemu nervový rastový modulátor CNS, to všetko za účelom stanovenia vplyvu modulátoru na väzbovú aktivitu modulátoru na akejkoľvek testovanom prostriedku porovnávaním charakteristiky najmenej jedného z predložených nervových rastových modulátorov CNS, zvlášť L1, je ich účasť na zmenách v ustálených hladinách intracelulárnych prenášačov, zahŕňajúcich Ca²⁺, pH a cyklické nukleotidy, rovnako ako zmeny v aktivitách proteín kináz, ako sú proteín kináza c, pp60^c*^Brc, kazeín kináza typu II a iná kináza, ktorá fosforyluje L1.CNGM on another molecule, including intracellular effects on second transporters. In one instance, the test composition is administered to a cell sample with a ligand that activates a nerve growth modulator CNS, or a transgenic animal expressing a nerve growth modulator CNS, all to determine the effect of the modulator on modulator binding activity on any test composition by comparing the characteristics of at least one of the present. CNS nerve growth modulators, especially L1, are involved in changes in steady state intracellular transporter levels, including Ca ²⁺ , pH and cyclic nucleotides, as well as changes in protein kinase activities such as protein kinase c, pp60 ^c * ^Brc , casein kinase type II and another kinase that phosphorylates L1.

Systém skúšky je adaptovaný na identifikáciu látok alebo iných entít, ktoré sú schopné viazať sa na CNGN alebo proteíny v cytoplazme alebo v jadre a tým sú schopné inhibovať alebo potencovať transkripčnú aktivitu. Také skúšky sú užitočné pri vývoji látok, ktoré sú špecifické na danú bunkovú aktivitu, ako je nervový rast alebo zvýšenie synaptickej pôsobivosti alebo ktoré potencujú takú aktivitu v čase alebo hladine aktivity. Také látky sú používané napríklad na modulovanie nervového rastu pri zranení alebo na liečbu iných patológií, napríklad na liečbu neurodegeneratívnych chôrob, akými sú Parkinsonova choroba, ALS, Huntingtonova choroba a Alzheimerova choroba.The assay system is adapted to identify substances or other entities that are capable of binding to CNGN or proteins in the cytoplasm or nucleus and thereby being able to inhibit or potentiate transcriptional activity. Such assays are useful in developing substances that are specific to a given cellular activity, such as neural growth or enhancement of synaptic activity, or which potentiate such activity at a time or level of activity. Such agents are used, for example, to modulate nerve growth in an injury or to treat other pathologies, for example, to treat neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, ALS, Huntington's disease, and Alzheimer's disease.

V ešte ďalšom vyhotovení sa vynález týka agonistov a antagonistov aktivity nervového rastového modulátoru CNS. Zvlášť látka alebo molekula, ktorá inhibuje schopnosť neurónov rozpoznávať CNGN ako L1 je používaná na zamedzenie nervového rastu tam, kde je taký rast kontraindikatívny, a ako je opísané vyššie, farmaceutický prípravok obsahujúci takú látku je podávaný priamo do cieľového miesta. V inom je agonistom peptid, ktorý má sekvenciu časti zvlášť tie domény medzi fibronektínovýmiIn yet another embodiment, the invention relates to agonists and antagonists of nerve growth modulator activity of the CNS. In particular, a substance or molecule that inhibits the ability of neurons to recognize CNGN as L1 is used to prevent neural growth where such growth is contraindicated, and as described above, a pharmaceutical composition containing such substance is administered directly to the target site. In another, the agonist is a peptide having a sequence portion of particularly those of the fibronectin domain

11211 opakovaniami 2 a 3 alebo je agonistom protilátka proti tejto oblasti. Obidve tieto molekuly sú potenciálne použité tam, kde má daný CNGM ako Ll schopnosť homolytickej väzby (t.j. jedna molekula Ll viaže inú molekulu Ll a preto obidve protilátky proti Ll a proti fragmentom Ll sú schopné väzby na Ll).11211 is repeated 2 and 3, or the agonist is an antibody against this region. Both of these molecules are potentially used where a given CNGM has the ability of homolytic binding as L1 (i.e., one L1 molecule binds another L1 molecule and therefore both L1 and anti L1 fragments are capable of binding to L1).

Jedno z diagnostických využití predloženého vynálezu sa týka použitia prítomných CNGM v skúškach na testovanie inhibítorov proteín kinázy. Pretože molekuly CNGM sú v aktívnom stave fosforylované, sú tiež defosforylované špecifickými fosfatázami. Blokovanie špecifickej kinázy alebo fosfatázy je preto cesta k farmakologickému pôsobeniu, ktoré moduluje aktivitu týchto nervových rozpoznávacích proteínov.One diagnostic use of the present invention relates to the use of CNGM present in assays to test protein kinase inhibitors. Since CNGM molecules are phosphorylated in the active state, they are also dephosphorylated by specific phosphatases. Blocking a specific kinase or phosphatase is therefore a pathway for pharmacological action that modulates the activity of these neural recognition proteins.

Predložený vynález sa podobne týka vývoja protilátok proti CNGM vrátane prirodzene vyvolaných a rekombinantne pripravených protilátok. Protilátky sú napríklad použité na testovanie expresných knižníc za účelom získania génov, ktoré kódujú CNGM. Také protilátky zahŕňajú polyklonálne a monoklonálne protilátky pripravené známymi genetickými technikami, rovnako ako zahŕňajú dvoj ito špecifické (chimérne) protilátky a tiež protilátky obsahujúce iné vlastnosti prispôsobujúce ich pre ďalšie diagnostické použitie spojené s ich schopnosťou modulovať nervový rast.The present invention likewise relates to the development of antibodies against CNGM, including naturally produced and recombinantly produced antibodies. For example, the antibodies are used to screen expression libraries to obtain genes that encode CNGM. Such antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies prepared by known genetic techniques, as well as include dual specific (chimeric) antibodies, as well as antibodies containing other properties adapting them for further diagnostic use associated with their ability to modulate neural growth.

Protilátky proti nervovým rastovým modulátorom CNS sú zvlášť selektované a zahrnuté do rozsahu predloženého vynálezu pre ich zvláštnu schopnosť väzby proteínu. Aktivita nervových rastových modulátorov alebo špecifických polypeptidov je sledovaná priamo pomocou uvedených testovacích skrz použitie vhodne značeného množstva rastového modulátoru alebo protilátky alebo ich nervového analógu.Antibodies against CNS nerve growth modulators are particularly selected and included within the scope of the present invention because of their particular protein binding ability. The activity of neural growth modulators or specific polypeptides is monitored directly by said assays through the use of a suitably labeled amount of a growth modulator or antibody or a nerve analog thereof.

CNGM, ich analógy a akékoľvek inhibítory alebo protilátky, ktoré sú vyvolané, sú schopné použitia v spojení s rôznymi diagnostickými technikami, vrátane imunoskúšky ako je rádioimunoskúška, s použitím, napríklad, protilátky protiThe CNGMs, their analogs, and any inhibitors or antibodies that are elicited are capable of use in conjunction with various diagnostic techniques, including immunoassays such as radioimmunoassays, using, for example, antibodies against

1121111211

CNGM, ktorá bola označená rádioaktívnou adíciou, redukciou bórohydridom sodným alebo rádiojodináciou.CNGM that has been labeled by radioactive addition, sodium borohydride reduction, or radio iodination.

Kontrolné množstvo inhibítorov alebo protilátok v imunoskúške je vnesené do kontrolnej vzorky. Po tom, čo má značený materiál alebo jeho väzbový partner možnosť reagovať s miestami vnútri vzorky, je výsledné množstvo zmerané známymi technikami, ktoré sú rôzne podlá povahy pripojenej značky. Protilátky proti CNGM sú použité v prípade protokolu.A control amount of inhibitors or antibodies in the immunoassay is introduced into the control sample. After the labeled material or its binding partner has the ability to react with sites within the sample, the resulting amount is measured by known techniques, which vary according to the nature of the attached label. Anti-CNGM antibodies are used for the protocol.

V prípade, keď sú použité rádioaktívne značky v podobe izotopov ³H, ¹⁴C, ³²P, ³®C1, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ^5BCo, ⁵⁹Fe, ®°Y, ¹²⁵1, 131 j _a ιβββ_β/ použité súčasné meracie techniky. V prípade, keď je značkou enzým, je detekcia vykonaná akoukoívek zo súčasne používaných kolorimetrických, spektrofotometrických, fluórospektrofotometrických, ampérometrických a gazometrických techník, ktoré sú v odbore známe.When ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³ CC1, ⁵¹ Cr, ⁵⁷ Co, ^5B Co, ⁵⁹ Fe, ° ° Y, ¹²⁵ 1, 131 j _and ιβββ _{β /} radioactive labels are used current measurement techniques. Where the label is an enzyme, detection is accomplished by any of the currently used colorimetric, spectrophotometric, fluorospectrophotometric, amperometric and gazometric techniques known in the art.

Predložený vynález sa týka skúšky, ktorá je vykonaná vo forme testovacej súpravy pre kvantitatívnu analýzu na prítomnosť nervových rastových modulátorov alebo na identifikáciu látok alebo iných činidiel, ktoré napodobňujú alebo blokujú ich aktivitu. Systém testovacej súpravy obsahuje značený komponent pripravený jednou z rádioaktívnych alebo enzýmových techník tu opísaných, zahŕňa pripojenie značky na nervové rastové modulátory ich agonistami alebo inhibítormi, a obsahuje ďalšie imunochemické činidlá, najmenej jedným z nich je voíný alebo imobilizovaný ligand schopný väzby s označeným komponentom alebo jeho väzbovým partnerom a určením príslušného.The present invention relates to an assay that is performed in the form of a test kit for quantitative analysis for the presence of nerve growth modulators or for the identification of substances or other agents that mimic or block their activity. The test kit system comprises a labeled component prepared by one of the radioactive or enzyme techniques described herein, comprising attaching the label to the nerve growth modulators by their agonists or inhibitors, and comprising additional immunochemical agents, at least one of which is a free or immobilized ligand capable of binding to the labeled component or its binding partners and designating the relevant.

V ďalšom vyhotovení sa predložený vynález týka určitých terapeutických spôsobov, ktoré sú založené na aktivite nervových rastových modulátorov CNS, ich podjednotiek alebo ich aktívnych fragmentov, alebo na činidlách a iných látkach, ktoré tú istú aktivitu. Prvý terapeutický spôsob je spojený s podporou nervového rastu v CNS, ktorý je spôsobený prítomnosťou a aktivitou CNGM, ich aktívnych fragmentov,In another embodiment, the present invention relates to certain therapeutic methods that are based on the activity of the CNS nerve growth modulators, their subunits or active fragments thereof, or on agents and other agents having the same activity. The first therapeutic method is associated with promoting nerve growth in the CNS, which is due to the presence and activity of CNGM, their active fragments,

11211 analógov a príbuzných látok, a ktorý zahŕňa podávanie látky schopnej modulovania produkcie alebo aktivity CNGM, v množstve účinnom na dosiahnutie podpory vývinu CNS, obnoveného rastu alebo rehabilitácie u pacienta. Naopak iné látky alebo iní neutralizujúci väzboví partneri CNGM sú podávané za účelom inhibície alebo zabránenia nežiadúceho nervového rastu. Tiež modulácia pôsobenia špecifických kináz a fosfatáz, ktoré sa zúčastňujú fosforylácie a defosforylácie CNGM, sa týka tohoto spôsobu a umožňuje terapie založené na aktivácii CNGM.11211 analogs and related substances, and which comprises administering a substance capable of modulating the production or activity of CNGM, in an amount effective to achieve support for CNS development, restored growth, or rehabilitation in the patient. Conversely, other agents or other neutralizing CNGM binding partners are administered to inhibit or prevent unwanted nerve growth. Also, modulation of the action of specific kinases and phosphatases involved in CNGM phosphorylation and dephosphorylation relates to this method and allows therapies based on CNGM activation.

Terapeutický spôsob, ktorý je tu všeobecne opísaný, zahŕňa spôsob liečby rôznych chorôb a iných bunkových disfunkcií a porúch podávaním farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú účinné inhibítory alebo aktivátory nervového rastového modulátoru CNS alebo jeho podjednotiek alebo iných rovnako účinných látok vyvinutých napríklad pomocou skúšky na testovanie látok, ktorá je pripravená a používaná v zhode s ďalším aspektom predloženého vynálezu. Napríklad látky alebo ich väzboví partneri k nervovým rastovým modulátorom CNS a proteínom sú podávané, aby inhibovali alebo potencovali naviazanie a aktivitu druhého prenášača.The therapeutic method generally described herein includes a method of treating a variety of diseases and other cellular dysfunctions and disorders by administering pharmaceutical compositions comprising potent inhibitors or activators of the nerve growth modulator CNS or its subunits or other equally active agents developed, for example, by a drug testing assay, which is prepared and used in accordance with another aspect of the present invention. For example, agents or their binding partners to nerve growth modulators of the CNS and proteins are administered to inhibit or potentiate binding and activity of the second transporter.

Ako je uvedené vyššie, vynález sa týka objavu celej rodiny molekúl Ll CAM a zvlášť analógu k Ll známeho ako CHL1. CHL1 obsahuje terminálnu signálnu sekvenciu na konci N, šesť imunoglobulínových domén, fibronektínu podobné opakovania, transmembránovú doménu a intracelulárnu doménu na konci C, ktorá je dlhá približne 100 aminokyselín. CHL1 je najviac podobná vo svojej extracelulárnej doméne na kuraciu Ng-CAM (40* aminokyselinovej identity), potom na myšiu Ll, kurací neurofascín, kurací Nr-CAM, drozofilí neuroglián a Ll.1 zebričky (37 až 28* aminokyselinovej identity), na myšiu F3, krysiu TAG-1 a králičiu BIG-1 (približne 27* aminokyselinovej identity). Podobnosť s inými členmi rodiny Ig (napr. N-CAM, DCC, HLAR, rse) je 16 až 11*. Intracelulárna doména sa najviac podobá na myšiu a kuraciu Nr-CAM, na myší a krysí neurofascín 1 (približneAs mentioned above, the invention relates to the discovery of a whole family of L1 CAM molecules, and in particular an analogue to L1 known as CHL1. CHL1 contains a terminal signal sequence at the N-terminus, six immunoglobulin domains, fibronectin-like repeats, a transmembrane domain, and an intracellular domain at the C-terminus that is approximately 100 amino acids long. CHL1 is most similar in its extracellular domain to chicken Ng-CAM (40 * amino acid identity), then to mouse L1, chicken neurofascin, chicken Nr-CAM, Drosophila neuroglian, and L1.1 ribs (37-28 * amino acid identity), mouse F3, rat TAG-1, and rabbit BIG-1 (approximately 27 * amino acid identity). Similarity to other Ig family members (e.g., N-CAM, DCC, HLAR, rse) is 16-11 *. The intracellular domain most closely resembles mouse and chicken Nr-CAM, mouse and rat neurofascin 1 (approximately

1121111211

50% aminokyselinovej identity), potom na kurací neurofascín Ng-CAM, drozofilí neuroglián a Ll.l a L1.2 zebričky (približne 40% aminokyselinovej identity). Okrem celkovej vysokej homológie a zachovalej modulárnej štruktúry medzi predtým uvedenými členmi rodiny Ll (myšia/ľudská Ll/krysia NÍLE; kuracia/Ng-CAM; kuracia/myšia Nr-CAM; drozofilí neuroglián; Ll.l a L1.2 zebričky; kurací/myší neuroglián/krysí ADGP). Charakteristické vlastnosti L1 holi určené s ohľadom na počet aminokyselín medzi konzervovaných aminokyselinových zvyškov, ktoré definujú vzdialenosti vnútri a medzi dvoma priľahlými doménami pôdobnými Ig a opakovaniami podobnými FN. Tieto vykazujú kolinearitu v šiestich doménach podobných Ig a priľahlých štyroch opakovaniach podobných FN, ktorá je značne konzervovaná medzi L1 a molekulami obsahujúcimi tieto moduly (pomenovaná súbor rodiny Ll) a zahŕňa formy so spojením GFI podskupiny F3 (myšia F3/kuracia Fll/ľudská CNTN1; krysia BIG-l/myšia PANG; krysia TAG-l/myšia TAX-l/kurací axonín-1). Molekula rakoviny konečníku (DCC) predtým uvedená ako molekula podobná N-CAM prináleží do súboru rodiny Ll. Inými štruktúrnymi znakmi CHL1 zdieľanými medzi členmi rodiny Ll sú vysoký stupeň N-glykozidicky naviazaných karbohydrátov (približne 20% ich molekulovej hmotnosti), obsahuje karbohydrátovú štruktúru HMK-1 a vzorku proteínových fragmentov obsahujúcu hlavný pruh 185 kD a menšie fragmenty 100 a 125 kD. Rovnako ako pre ostatných členov rodiny Ll je prevažná expresia Ll pozorovaná v nervovom systéme v neskorších vývojových štádiách.50% amino acid identity), then on chicken neurofascin Ng-CAM, Drosophile neuroglian and L1.1 and L1.2 ribs (approximately 40% amino acid identity). In addition to the overall high homology and well-preserved modular structure between the aforementioned L1 family members (mouse / human L1 / rat NIL; chicken / Ng-CAM; chicken / mouse Nr-CAM; Drosophile Neuroglian; L1.1 and L1.2 ribs; chicken / mouse neuroglian / rat ADGP). The L1 characteristics were determined with respect to the number of amino acids between the conserved amino acid residues that define the distances within and between two adjacent Ig-Ig domains and FN-like repeats. These exhibit colinearity in six Ig-like domains and four adjacent FN-like repeats that are extensively conserved between L1 and molecules containing these modules (named L1 family) and include forms with GFI subgroup F3 junction (mouse F3 / chicken F11 / human CNTN1; rat BIG-1 / mouse PANG; rat TAG-1 / mouse TAX-1 / chicken axonin-1). The rectal cancer molecule (DCC) previously referred to as an N-CAM-like molecule belongs to the L1 family. Other structural features of CHL1 shared between L1 family members are a high degree of N-glycosidically bound carbohydrates (approximately 20% of their molecular weight), containing the carbohydrate structure of HMK-1 and a protein fragment sample containing a 185 kD major band and smaller 100 and 125 kD fragments. As with other members of the L1 family, predominant expression of L1 is observed in the nervous system at later developmental stages.

Nasledujúce príklady sú uvedené v poradí tak, aby plne ilustrovali výhodné vyhotovenie vynálezu. Nemali by byť žiadnym spôsobom upravené tak, aby neobmedzovali široký rozsah vynálezu.The following examples are given in order to fully illustrate the preferred embodiment of the invention. They should not be modified in any way so as not to limit the broad scope of the invention.

1121111211

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1 a kódujúca translačnýmExample 1 and coding translational

Transgén GFAP-L1 a vytvorenie transgénnej myšiGFAP-L1 transgene and generation of a transgenic mouse

Gliový fibrilárny kyslý proteín (GFAP, Eng et al. (1971) Brain Res. 28:351-354) je prednostne exprimovaný astrocytmi v neskorších štádiách vývoja myšej centrálnej nervovej sústavy (Landry et al. (1990) J. Neurosci. Res. 25:194-203). Preto boli regulačné sekvencie génu GFAP použité, aby riadili expresiu nervovej bunkovej adhéznej molekuly L1 v zrelých astrocytoch transgénnych myší. Transgén GFAP-L1 (Obr.l) kóduje len nervovú bunkovú adhéznu molekulu Ll, pretože kodón ATG génu GFAP bol mutovaný sekvencia Ll je nasledovaná na 3' konci signálom pre zastavenie a polyadenylačným signálom (Toggas et al. (1994) Náture 367:188-193). Táto konštrukcia bola použitá na vytvorenie troch rôznych línii transgénnych myší, označených 3418, 3426 a 3427.Glial fibrillary acidic protein (GFAP, Eng et al. (1971) Brain Res. 28: 351-354) is preferably expressed by astrocytes at a later stage of mouse central nervous system development (Landry et al. (1990) J. Neurosci. Res. 25 : 194-203). Therefore, the regulatory sequences of the GFAP gene were used to direct the expression of the nerve cell adhesion molecule L1 in mature astrocytes of transgenic mice. The GFAP-L1 transgene (Fig. 1) encodes only the nerve cell adhesion molecule L1 because the ATG codon of the GFAP gene has been mutated by the L1 sequence is followed at the 3 'end by a stop signal and polyadenylation signal (Toggas et al. (1994) Nature 367: 188 -193). This construct was used to create three different lines of transgenic mice, designated 3418, 3426 and 3427.

Myšia CDNA Ll (Moos et al. (1988) Náture 334:701-703) bola vnesená do exónu 1 myšieho génu pre gliový fibrilárny kyslý proteín (GFAP), ktorý bol modifikovaný, ako je uvedené (Toggas et al. (1994) Náture 367:188-193). Myšia cDNÄ Ll dlhá 4,05 kh obsahujúca celú kódujúcu sekvenciu proteínu a 250 netranslatovaných nukleotidov na 3' konci bola spojená s modifikovaným transgénom GFAP-L1.Mouse CDNA L1 (Moos et al. (1988) Nature 334: 701-703) was introduced into exon 1 of the mouse glial fibrillar acid protein (GFAP) gene, which was modified as described (Toggas et al. (1994) Nature) 367: 188-193). A 4.05 kh long cDNA L1 containing the entire coding sequence of the protein and 250 untranslated nucleotides at the 3 'end was linked to the modified GFAP-L1 transgene.

Transgén GFAP-L1 dlhý 14,5 kb bol vyštiepený z modifikovaného klonovacieho vektora digesciou s Sci I, potom bola vykonaná elektroforéza z agarózového gélu. Purifikovaná DNA konečnú koncentráciu 2 ug/ml v pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Približne mikroinjekované do samčieho jadra oplodnených vajíčok odobraných od sainičiek CB6F1 (s veľkou ovuláciou), ktoré boli spárené so samcami C57/B1/6J. Vajíčka, ktoré prežili a elektroeluácia bola nariedená na TsEo.i (5 mM Tris-HCl, 2 pl nariedené DNA boliThe 14.5 kb GFAP-L1 transgene was excised from the modified cloning vector by digestion with Sci I, followed by agarose gel electrophoresis. Purified DNA final concentration of 2 µg / ml at pH 7.4, 0.1 mM EDTA). Approximately microinjected into the male nucleus of fertilized eggs taken from CB6F1 (with large ovulation) cyanobacteria that were mated with male C57 / B1 / 6J. Surviving eggs and electroelution were diluted to TsEo.i (5 mM Tris-HCl, 2 µl of diluted DNA was

11211 mikromanipuláclu, boli prenesené do vajcovodu umelo oplodnenej samičky podľa opísaných spôsobov bola (Hogan et al. (1986) Hanipulating Mouse Embryo, Cold Spring Harbour Laboratory, New York).11211 micromanipules were transferred to the fallopian tube of an artificially fertilized female according to the methods described (Hogan et al. (1986) Hanipulating Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).

Príklad 2Example 2

Analýza Southern blotSouthern blot analysis

Myši boli analyzované na integráciu transgénu do myšieho genómu pomocou analýzy Southern blot genómovej DNA izolovanej z hiopsií chvostu (Southern (1975) J. Mol. Biol. 98:503-517). Transgénne zakladateľské myši boli párené a mláďatá boli testované rovnakým spôsobom kvôli vytvoreniu transgénnych línií. Vzorky DNA s hmotnosťou 10 yg boli Eco RI a Xba I a potom boli separácii na agarózovom gél i štiepené enzýmmi Bam, Hl, podrobené elektroforetickej s koncentráciou 0,7% a DNA bola prenesená na membránu Hybond N+ (Amersham) v alkalickom prostredí. Fragment Eco RI dlhý 3,3 kb z cDNA L1 alebo fragment Hind III dlhý 330 ph z neskoršieho zostrihu SV40 a z polyadenylačného miesta puriflkovaného z plazmidu Äl,5 (Maxwell et al. (1989) Biotechnigues 7:276-280) bol označený náhodným primérovaním s ³²pí-alfa-CTP (Boehringer Mannheim) za účelom použitia ako próby. Prehyhridizácia bola vykonaná pri 65^eC jednu hodinu v 5x SSPE, 5x Denhardtov roztok, 0,5% (w/v) SDS a 0,1 mg/ml sonifikovanej nehomológovej DNA. Hybridizácia bola vykonaná cez noc. Konečné podmienky premývania pre všetky Southernové bloty boli 0,lx SSPE a 0,1% SDS (w/v) pri 65^eC.Mice were analyzed for integration of the transgene into the mouse genome by Southern blot analysis of genomic DNA isolated from tail hiopsies (Southern (1975) J. Mol. Biol. 98: 503-517). The transgenic founder mice were mated and the pups were tested in the same manner to create transgenic lines. DNA samples weighing 10 µg were Eco RI and Xba I, and were then electrophoresed at 0.7% electrophoretic on an agarose gel i digestion with Bam, H1 and transferred to Hybond N + (Amersham) in an alkaline medium. A 3.3 kb Eco RI fragment from L1 cDNA or 330 ph Hind III Hind III fragment from a later SV40 splice and polyadenylation site purified from plasmid Ä 1.5 (Maxwell et al. (1989) Biotechnigues 7: 276-280) was labeled by random primer with ³² µ-alpha-CTP (Boehringer Mannheim) for use as a probe. Prehyhridizácia was carried out at 65 ^e C for one hour in 5 x SSPE, 5 x Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS and 0.1 mg / ml sonicated nonhomologous DNA. Hybridization was performed overnight. The final wash conditions for all Southern blots were 0.1x SSPE and 0.1% SDS (w / v) at 65 ^e C.

Príklad 3Example 3

Analýza Northern blotNorthern blot analysis

Anestetizované dospelé myši (12 týždňov staré) holi utratené smrteľnou dávkou chlóralhydrátu a odobrané mozgyAnesthetized adult (12 weeks old) canes sacrificed with lethal dose of chloral hydrate and brain drain

11211 boli okamžite zmrazené v tekutom dusíku. Celková bunková RNA bola izolovaná rozdrvením tkaniva v tekutom dusíku. Štvormolárny guanídium tiocyanát bol pridaný k rozdrvenému tkanivu. Izolácia celkovej RNA bola vykonaná ako je opísané (Chomczynski et al. (1987) Anál. Biochem. 162:156-159; Pagliusi et al. (1989) AMOG. J. Neurosci. Res. 22:113-119). Výťažky RNA boli odhadnuté z absorbancie pri 360 nm. 10 pg RNA bolo frakcionovaných na 1% agarózových a formamidovýcb géloch kvôli analýze Northern hlot (Thomas (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:201-205).11211 were immediately frozen in liquid nitrogen. Total cellular RNA was isolated by crushing the tissue in liquid nitrogen. Four-molar guanidium thiocyanate was added to the crushed tissue. Isolation of total RNA was performed as described (Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159; Pagliusi et al. (1989) AMOG. J. Neurosci. Res. 22: 113-119). RNA yields were estimated from absorbance at 360 nm. 10 µg of RNA was fractionated on 1% agarose and formamide gels for Northern blot analysis (Thomas (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 201-205).

Náhodne primérované próby cDNA Ll boli použité na súčasnú detekciu endogénnej mRNA Ll s dĺžkou 6 kb (Tácke et al. (1987) Neurosci. Lett. 82:89-94) a tiež z transgénu odvodenej mRNA Ll s dĺžkou 4,2 kb. Denzitometrická analýza Northern blotov bola vykonaná na skenovacích obrázkoch (Arcus scanner, Agfa-Gavaert) z originálnych filmov pomocou programu Image (NIH, Research Serveces Branch, NIMH).Randomly primed L1 cDNA probes were used to simultaneously detect endogenous L kb mRNA of 6 kb (Tácke et al. (1987) Neurosci. Lett. 82: 89-94) as well as a 4.2 kb L1 mRNA-derived transgene. Northern blots densitometric analysis was performed on scanning images (Arcus scanner, Agfa-Gavaert) from the original films using Image (NIH, Research Serveces Branch, NIMH).

Analýza Nothern blot celkovej RNA z celých mozgov transgénnych zvierat odhalila transkripty odhadovanej velkosti (4,2 kb) pre mRNA odvodenú z transgénu (Obr.2). Tieto transkripty sú jasne odlišné od endogénnej mRNA Ll, ktorá je dlhá 6 kb a pochádza z postmitotických neurónov. Denzitometrická analýza odhalila, že hladiny mRNA Ll odvodenej z transgénu boli 34%, 13% a 8% v líniách 3426, 3427 a 3418, ako to bolo porovnané s hladinami endogénnej mRNA Ll (100%).Northern blot analysis of total RNA from whole brains of transgenic animals revealed estimated size transcripts (4.2 kb) for mRNA derived from the transgene (Fig. 2). These transcripts are clearly different from 6 kb long and endogenous L1 mRNA derived from post-mitotic neurons. Densitometric analysis revealed that transgenic derived L1 mRNA levels were 34%, 13%, and 8% in lines 3426, 3427, and 3418, respectively, as compared to endogenous L1 mRNA levels (100%).

Príklad 4Example 4

ZvieratáThe animals

Pre kultúry na kryostatických rezoch a experimenty v imunocytochémii a hybridizácii in situ boli kontrolné zvieratá brané zo zásoby rovnako starých normálnych myší C57hl/6J alebo iných netransgénnych potomkov. Pre izoláciu malých cereberálnych neurónov a pre prípravu kultúrFor cryostatic section cultures and experiments in immunocytochemistry and in situ hybridization, control animals were taken from a stock of equally old normal C57h1 / 6J mice or other non-transgenic offspring. For the isolation of small cerebral neurons and for the preparation of cultures

11211 astrocytov boli používané šesť dní staré netransgénne mláďatá ICR. Neuróny dorzálneho koreňového gangliónu (DRG) boli pripravené z osem dní starých kuracích embryí.11211 astrocytes were used six day old non-transgenic chicks ICR. Dorsal root ganglion (DRG) neurons were prepared from eight days old chicken embryos.

Príklad 5Example 5

Hybridizácia in situIn situ hybridization

Kvôli overeniu, že astrocyty transgénnych zvierat exprimovali Ll in vivo boli analyzované optické nervy pomocou hybridizácie in situ. Bol vybraný optický nerv, pretože obsahuje len gliové bunky a neobsahuje neuronálne bunkové telieska. Astrocytom in vivo normálne chýba expresia Ll vo všetkých vývojových štádiách (nepublikované údaje).To verify that astrocytes of transgenic animals expressed L1 in vivo, optical nerves were analyzed by in situ hybridization. The optic nerve was selected because it contains only glial cells and does not contain neuronal cell bodies. Astrocyte normally lacks L1 expression at all developmental stages in vivo (unpublished data).

Kvôli detekcii mRNA Ll v kryostatických rezoch čerstvo zmrazených mozgových rezov boli vytvorené dioxigenínom označené cRNA pomocou transkripcie in vitro (Dôrries et al. (1993) Histochemistry 99:251-262). Sekvencia kódujúca extracelulárnu časť Ll (Hoos et al. (1988)) bola subklonovaná do vektora pBluescript KS+ (Stratagene). Próby cRNA v zmysle a proti zmyslu čítania boli vytvorené prepisom inzertu Ll po linearizácii výsledného plazmidu s Xho I a/alebo Xba I pomocou promotorov T7 a T3. Kvôli vytvoreniu prób cRNA GFAB bol subklonovaný fragment cDNA GFAP (Lewis et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2743-2745;To detect L1 mRNA in cryostat sections of freshly frozen brain sections, dioxigenin-labeled cRNA was generated by in vitro transcription (Dorries et al. (1993) Histochemistry 99: 251-262). The sequence encoding the extracellular portion of L1 (Hoos et al. (1988)) was subcloned into the pBluescript KS + vector (Stratagene). The sense and counter reading cRNA probes were generated by transcribing the L1 insert after linearizing the resulting plasmid with Xho I and / or Xba I using the T7 and T3 promoters. To generate GFAB cRNA probes, a GFAP cDNA fragment was subcloned (Lewis et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2743-2745;

N. J. Cowanom) dlhý 1,2 kb a kódujúci vektora pBluescript KS+. Próby cRNA proti zmyslu čítania boli vytvorené prepisom plazmidu, linearizáciou s Eco RI a Xho I láskavo poskytnutý Dr. koniec N proteínu do v zmysle a výsledného z promotorov T3 a T7. Kvôli zlepšeniu prenikania do tkaniva boli próby cRNA v zmysle a proti zmyslu čítania zrovnané za podmienok alkalickej hydrolýzy, aby sa získala priemerná dĺžka fragmentov približne 300 nukleotidov. Hybridizácia in situ na rezoch optických nervov pripravených z dospelých zvierat (12 dní starých) bola vykonaná ako je opísané (Dôrries et al. (1993); Bartsch et al., J. Neurosci.,N. J. Cowan) 1.2 kb long and encoding the pBluescript KS + vector. Antisense cRNA probes were generated by plasmid transcription, linearization with Eco RI and Xho I, kindly provided by Dr. end of the N protein into and resulting from the T3 and T7 promoters. To improve tissue penetration, cRNA probes in terms of sense and sense of reading were aligned under alkaline hydrolysis conditions to obtain an average fragment length of approximately 300 nucleotides. In situ hybridization of optic nerve sections prepared from adult animals (12 days old) was performed as described (Dôrries et al. (1993); Bartsch et al., J. Neurosci.,

11211 v tlači ) .11211 in print).

V netransgénnych kontrolách boli transkripty detekované len v nervových bunkách sietnice, ale nie v optickom nerve, ani pred (0br.3A) ani po poškodení (0br.3B). Naopak, mRNA Ll boli exprimované gliovými bunkami optických nervov z transgénnych myší (0br.3C). Bunky pozitívne na mRNA Ll boli detekovatelné ako vo vzdialených myelínovaných, tak aj v bližších nemyelínovaných častiach nervu. Intenzita hybridizačného signálu bola vyššia v nemyelínovanej bližšej časti v porovnaní s myelínovanou vzdialenejšou častou nervu.In non-transgenic controls, transcripts were detected only in retinal nerve cells, but not in the optic nerve, either before (Fig. 3A) or after injury (Fig. 3B). In contrast, L1 mRNAs were expressed by optic nerve glial cells from transgenic mice (Fig. 3C). L1 mRNA positive cells were detectable in both the distant myelinated and proximal unmyelinated parts of the nerve. The intensity of the hybridization signal was higher in the unmyelinated nearer part compared to the myelinated far part of the nerve.

Podobné rozmiestnenie pozitívnych buniek a podobné rozdiely v intenzite značenia medzi nemyelínovanými a myelínovanými oblasťami boli pozorované pomocou próby cRNA GFAP (porovnajte Obr.3C a E). Počet buniek pozitívnych na mRNA Ll v optickom nerve transgénnych zvierat však bol vždy významne menší než počet buniek pozitívnych na GFAP, pravdepodobne kvôli nižšej citlivosti próby cRNA Ll.Similar placement of positive cells and similar differences in labeling intensity between unmyelinated and myelinated regions were observed using the GFAP cRNA probe (compare Fig. 3C and E). However, the number of L1 mRNA-positive cells in the optic nerve of transgenic animals was always significantly less than the number of GFAP-positive cells, probably due to the lower sensitivity of the L1 cRNA probe.

Detekovatelné hladiny mRNA Ll sú alternatívne dosiahnuté v astrocytoch s vysokou hladinou expresie GFAP. Taký prahový efekt môže byt spôsobený navrhnutím transgénu GFÄP-L1, ktorý obsahuje len 2 kb zo sekvencie GFAP v smere 5' konca. Štúdie in vitro dokazujú, že oblast medzi 2a 6 kb v protismere k miestu počiatku transkripcie obsahuje sekvenčné elementy posilňujúce expresiu GFAP riadených spojených génov (1991) J. Neurosci. 28:217-228).Alternatively, detectable levels of L1 mRNA are achieved in astrocytes with a high level of GFAP expression. Such a threshold effect may be due to the design of the GFAP-L1 transgene, which contains only 2 kb of the GFAP sequence in the 5 'end. In vitro studies show that the region between 2a and 6 kb upstream of the transcription start site contains sequence elements enhancing the expression of GFAP-driven fusion genes (1991) by J. Neurosci. 28: 217-228).

exónu 1 génu GFAP vrátane vnesenia znížit stabilitu chimérovej mRNA v porovnaní s mRNA GFAP a meniť efekty spôsobené regulačnými sekvenciami GFAP umiestnenými v obidvoch smeroch v modifikovanej oblasti.exon 1 of the GFAP gene, including introducing to reduce the stability of the chimeric mRNA as compared to the GFAP mRNA and to alter the effects caused by GFAP regulatory sequences located in both directions in the modified region.

Po poškodení optického nervu bola pozorovaná zvýšená expresia Ll v transgénnych (0br.3D), ale nie v netransgénnych (0br.3B) optických nervoch. Počet buniek, ktoré exprimovali Ll a intenzita hybridizačného signálu Ll boli podobné u rôznych zvierat rovnakej, transgénnej línie, ale líšil sa medzi rôznymi transgénnymi líniami. V zhode v bunkách C6 (Sarid Nakoniec, modifikácia velkej cDNA Ll môžeAfter optic nerve injury, L1 expression was observed in transgenic (Fig.3D), but not in non-transgenic (Fig.3B) optical nerves. The number of cells that expressed L1 and the intensity of the L1 hybridization signal were similar in different animals of the same transgenic line, but differed between different transgenic lines. Consistent in C6 cells (Sarid Finally, modification of the large L1 cDNA can

11211 s výsledkami získanými pomocou analýzy Northern blot (viď vyššie) boli bunky pozitívne na mRNA Ll najpočetnejšie v línii 3426, potom v línii 3427 a najmenej početné v línii 3418. Táto rozdielnosť v hladine expresie transgénu u rôznych línií môže byť odvodená z mnohých faktorov, zvlášť vplyvom okolitých oblastí hostiteľského chromatínu, ktoré ohraničujú rôzne transgénne integračné miesta (Proudfoot (1986) Náture 322:562-565; Reik et al. (1987) Náture 328:248-251; Sapienze et al. (1987) Náture 328:248-254).11211 with results obtained by Northern blot analysis (see above), L1-positive mRNA cells were most abundant in line 3426, then in line 3427 and least numerous in line 3418. This difference in transgene expression levels across different lines can be derived from many factors, particularly due to the surrounding regions of the host chromatin that border the different transgenic integration sites (Proudfoot (1986) Nature 322: 562-565; Reik et al. (1987) Nature 328: 248-251; Sapienze et al. (1987) Nature 328: 248 -254).

Príklad 6Example 6

Protilátkyantibody

Výroba polyklonálnych králičích protilátok proti myšej Ll a purifikácia na imunoafinitnej kolóne na Ll (Rathjen et al. (1984); Martini et al. (1988) a polyklonálnych protilátok proti myšej pečeňovej membráne (Lindner et al. (1983); Pollerberg et al. (1985) boli opísané. Myšia polyklonálna protilátka proti GFAP bola kúpená (Boehringer Mannheim).Production of polyclonal rabbit antibodies against mouse L1 and purification on an immunoaffinity column on L1 (Rathjen et al. (1984); Martini et al. (1988) and polyclonal antibodies against mouse liver membrane (Lindner et al. (1983); Pollerberg et al. (1985) have been described A mouse polyclonal anti-GFAP antibody was purchased (Boehringer Mannheim).

Kvôli analýze Western blot boli polyklonálne a monoklonálne protilátky zviditeľnené pomocou peroxidázy z reďkovky konjugovanej s kozími protimyšími a/alebo králičími protilátkami (Dianova, Hamburg, Nemecko). Kvôli imunocbémii boli primárne protilátky detekované pomocou konjugovaných kozích protimyších a králičích protilátok značených fluoresceínom, izotiocyanátom alebo tetrametylrodamid izotiocyanátom (Dianova). Digoxigenínom značené próby cRNA pre hybridizáciu in situ boli zviditeľnené pomocou s alkalickou fosfatázou konjugovaných fragmentov Fab k digoxigenínu (Boehringer Mannheim).For Western blot analysis, polyclonal and monoclonal antibodies were visualized with radish peroxidase conjugated to goat anti-mouse and / or rabbit antibodies (Dianova, Hamburg, Germany). For immunocbemia, primary antibodies were detected using conjugated goat anti-mouse and rabbit antibodies labeled with fluorescein, isothiocyanate or tetramethylrodamide isothiocyanate (Dianova). Digoxigenin-labeled cRNA probes for in situ hybridization were visualized with alkaline phosphatase-conjugated Fab fragments to digoxigenin (Boehringer Mannheim).

1121111211

Príklad 7Example 7

Udržovanie neurónov na kryostatických rezochMaintenance of neurons on cryostat sections

Pre analýzu, ak sú optické nervy z transgénnych zvierat viac vodivé do rastu neuritov, než optické nervy z divokého typu zvierat, boli cerebelárne neuróny udržiavané na kryostatických rezoch poškodených a nepoškodených optických nervov (Obr 7).For analysis, if optical nerves from transgenic animals are more conductive to neurite outgrowth than optical nerves from wild-type animals, cerebellar neurons were maintained on cryostat sections of damaged and undamaged optical nerves (Figure 7).

Optické nervy z 6 až 16 týždňov starých myší boli pripravené ako je opísané (Bartsch et al. (1989) J. Comp. Neurol. 284:451-462. Krátke, poškodené a nepoškodené optické nervy boli zakotvené a zmrazené v hormonálne definovanom médiu bez séra (Fischer (1986) Neurosci. Lett. 28:325-329) pomocou tekutého dusíku. Tkanivové rezy (14 ym hrubé) boli pozdĺžne rozrezané na kryostate Frigocut 270 (Jung-Reichardt), upevnené do sterilného podložného sklíčka potiahnutého poly-L-lyzínom (Sigma, 0,001% vo vode) a vysušené 2 až 3 hodiny v sterilnom bloku. Potom bolo vykonané premytie rezov v médiu 5 min. Malé cereberálne neuróny purifikované cez gradient perkolu (Keilhauer et al. (1985) Náture 316:728-730) získané zo šesť dní starých myší ICR (6 x 10⁴ buniek v 100 yl média) boli nanesené na každé sklíčko. Bunky boli udržiavané v inkubátore pri 37°C vo zvlhčenej atmosfére 5% CO2 a 95% vzduchu.Optical nerves from 6-16 week old mice were prepared as described (Bartsch et al. (1989) J. Comp. Neurol. 284: 451-462. Short, damaged and intact optical nerves were anchored and frozen in hormone-defined medium without sera (Fischer (1986) Neurosci. Lett. 28: 325-329) using liquid nitrogen Tissue sections (14 µm thick) were cut longitudinally on a Frigocut 270 cryoplate (Jung-Reichardt), mounted in a sterile poly-L-coated slide. lysine (Sigma, 0.001% in water) and dried for 2-3 hours in a sterile block, followed by washing of sections in medium for 5 min., Small cerebral neurons purified through a percol gradient (Keilhauer et al. (1985) Nature 316: 728-730 ) obtained from six day old ICR mice (6 x 10 ⁴ cells in 100 µl medium) were plated on each slide and maintained in an incubator at 37 ° C in a humidified atmosphere of 5% CO 2 and 95% air.

Rast neuritov bol tiež meraný za prítomnosti protilátok. Rezy boli predinkubované s polyklonálnymi protilátkami proti Ll alebo polyklonálnymi protilátkami proti myším pečeňovým membránam (100 yg/ml, intenzívne dialyzované a nariedené v médiu) po 1 hod. pri 37°C. Po odstránení protilátok boli rezy opatrne premyté médiom (5 krát, každé premytie 5 min. pri izbovej teplote) a potom boli pridané v Perkolovom gradiente purifikované malé cereberálne neuróny. Po dvoch dňoch boli kryostatové kultúry fixované v 4% paraformaldehyde v PBS počas doby 30 min. pri izbovej teplote a potom boli odmerané dĺžky neuritov. Aby sa vyhlo okrajovým efektom pri meraní, nevydnocovali sa rezy,Neurite growth was also measured in the presence of antibodies. Sections were preincubated with polyclonal antibodies against L1 or polyclonal antibodies against mouse liver membranes (100 µg / ml, vigorously dialyzed and diluted in medium) for 1 hour. at 37 ° C. After removal of the antibodies, the sections were carefully washed with medium (5 times, each wash for 5 min at room temperature) and then purified small cerebral neurons were added in a Perkol gradient. After two days, cryostat cultures were fixed in 4% paraformaldehyde in PBS for 30 min. at room temperature and then neurite lengths were measured. To avoid edge effects in measurements, sections were not exposed,

11211 ktoré boli umiestnené na vnútornej hrane obnášajúcej 20% zo sklíčka. Pomocou programu na semiautomatický výpočet obrazovej analýzy (IBAS, Kontron, Zeiss) boli zmerané dĺžky všetkých neuritov, ktoré vyrástli na týchto rezoch a priemerná dĺžka neuritov vzhľadom na telo nervovej bunky bola vypočítaná. Pre každý experiment a optický nerv (poškodený alebo nepoškodený) bola priemerná dĺžka neuritov, ktoré rástli na nervoch transgénnych zvierat, braná vzhľadom na príslušné hodnoty kontrolných zvierat. Dvanásť nezávislých experimentov bolo vykonaných s poškodenými a nepoškodenými nervami pomocou najmenej dvoch transgénnych zvierat.11211 which were placed on the inner edge of 20% of the slide. Using the semiautomatic image analysis program (IBAS, Kontron, Zeiss), the lengths of all neurites that grew on these sections were measured and the average length of neurites relative to the nerve cell body was calculated. For each experiment and optic nerve (damaged or undamaged), the average length of neurites that grew on the nerves of transgenic animals was taken relative to the respective values of the control animals. Twelve independent experiments were performed with damaged and intact nerves using at least two transgenic animals.

Pre transgénne zvieratá bolo pozorované predĺženie dĺžky neuritov na poškodených nervoch v porovnaní s nepoškodenými nervami. Na rozdiel od toho neboli dĺžky neuritov na poškodených a nepoškodených optických nervoch zvierat divokého typu významne odlišné (Obr.8). Neurity pestovaných neurónov na nepoškodených optických nervoch z transgénnych zvierat boli konzistentne dlhšie než neurity pestovaných neurónov na nepoškodených nervoch zo zvierat divokého typu. Maximálne zväčšenie dĺžky neuritov na 300% holo pozorované, keď boli použité rezy z línie 3426. Podobne bola zväčšená dĺžka neuritov na poškodených nervoch transgénnych línií až na 400%, keď sa porovnali s poškodenými nervami zo zvierat divokého typu.For transgenic animals, an extension of the neurite length on the damaged nerves compared to the intact nerves was observed. In contrast, neurite lengths on the damaged and intact optical nerves of wild-type animals were not significantly different (Fig. 8). The neurites of cultured neurons on intact optic nerves from transgenic animals were consistently longer than those of cultured neurons on intact nerves from wild type animals. The maximum increase in neurite length to 300% holo was observed when 3426 sections were used. Similarly, the neurite length on the damaged nerves of the transgenic lines was increased to 400% when compared to the damaged nerves from wild-type animals.

Aktivita podporujúca rast neuritov transgénnych optických nervov korelovala pozitívne s hladinou expresie Ll (Obr. 8). Nepoškodené optické nervy línie 3426, ktoré exprimujú najvyššiu hladinu proteínu Ll, boli potentnejšíe v predĺžení neuritovej dĺžky než línie 3427 a 3418, ktoré exprimovali nižšiu hladinu Ll. Na poškodených optických nervoch línií 3426 a 3427 (28 dní po poškodení) bola dĺžka neuritov 4 krát väčšia než na poškodených optických nervoch zvierat divokého typu. Zistenie, že zväčšenie dĺžky neuritov v poškodených optických nervoch holo podobné pre línie 3426 a 3427 (aj keď línia 3426 vykazuje 25% zvýšenie expresieThe neurite outgrowth activity of transgenic optic nerves correlated positively with the level of L1 expression (Fig. 8). The intact optic nerves of line 3426, which express the highest level of L1 protein, were more potent in neurite lengthening than lines 3427 and 3418, which expressed a lower level of L1. On the damaged optic nerves of lines 3426 and 3427 (28 days after injury), the neurite length was 4 times greater than on the damaged optic nerves of wild-type animals. Finding that the increase in neurite length in damaged optic nerves holo-like for lines 3426 and 3427 (although line 3426 shows a 25% increase in expression

11211 proteínu Ll po poškodení v porovnaní s líniou 3427) indikuje, že hladina proteínu Ll v línii 3427 už stačí na maximálnu indukciu rastu neuritov na malých cerebelárnych neurónoch.11211 of L1 protein after injury compared to line 3427) indicates that the level of L1 protein in line 3427 is sufficient to maximize induction of neurite outgrowth on small cerebellar neurons.

Preinkubácia nepoškodených optických nervov zo zvierat divokého typu s polyklonálnymi protilátkami proti Ll alebo proti myším pečeňovým membránam významne neovplyvnila dĺžky neuritov (Obr. 9). Naopak, dĺžky neuritov boli redukované o viac než 50%, keď boli kryostatické rezy nepoškodených a poškodených optických nervov z transgénnej línie 3426 preinkubované s protilátkami proti Ll (Obr. 9). Protilátky proti pečeňovým membránam, ktoré silne viažu optické nervy a malé cerebelárne neuróny (údaje nevykazujú podobné inhibičné efekty preinkubácia poškodených optických divokého typu s protilátkami proti Ll indukovala predĺženie dĺžky neuritov v porovnaní s poškodenými nervami zo zvierat divokého typu bez predchádzajúcej preinkuhácie s protilátkami proti Ll. Protilátky proti myším pečeňovým membránam nevykazujú významné zvýšenie za rovnakých podmienok, čo ukazuje, že pridanie bunkových povrchových reaktívnych protilátok nenaruší rast neuritov.Preincubation of intact optic nerves from wild-type animals with polyclonal antibodies against L1 or mouse liver membranes did not significantly affect neurite lengths (Fig. 9). In contrast, neurite lengths were reduced by more than 50% when cryostatic sections of intact and damaged optic nerves from transgenic line 3426 were preincubated with anti-L1 antibodies (Fig. 9). Antibodies against liver membranes that strongly bind optic nerves and small cerebellar neurons (data do not show similar inhibitory effects by preincubation of damaged wild-type optical cells with anti-L1 antibodies induced neurite lengthening as compared to damaged nerves from wild-type animals without prior preincubation with anti-L1 antibodies. Antibodies against mouse liver membranes do not show a significant increase under the same conditions, suggesting that the addition of cell surface reactive antibodies does not interfere with neurite outgrowth.

nie sú ukázané), Je zaujímavé, že nervov zo zvieratnot shown) Interestingly, the nerves of the animals

Príklad 8Example 8

Udržiavanie neurónov na jednovrstvových kultúrach astrocytov Na prípravu jednovrstvových astrocytov boli vyčistené predné mozgy zo šesť dni starých myší od iného, než nervového tkaniva a boli disociované ako bolo opísané (Schnitzer et al. (1981) J. Neuroimmunol. 1:429-456; Fischer et al. (1982) Neurosci. Lett. 29:297-302; Keilhauer et al. (1985). Bunky boli udržiavané na poly-L-lyzínom potiahnutých (Sigma, 0,001% vo vode) tkanivových miskách v médiu BME (Gibco) obsahujúcich 10% konské sérum a 2 mM glutamín počas doby 14 až 21 dní. Kontaminujúce oligodendrocyty a neurónyMaintaining Neurons on Single-Layer Astrocyte Cultures To prepare single-layer astrocytes, the forebrain of six-day-old mice from non-nerve tissue was cleaned and dissociated as described (Schnitzer et al. (1981) J. Neuroimmunol. 1: 429-456; Fischer et al (1982) Neurosci Lett 29: 297-302, Keilhauer et al (1985) Cells were maintained on poly-L-lysine coated (Sigma, 0.001% in water) tissue dishes in BME medium (Gibco) containing 10% horse serum and 2 mM glutamine for 14 to 21 days. Contaminating oligodendrocytes and neurons

11211 boli odstránené pretrepaním misiek pri každej výmene média a ďalším pestovaním buniek v intervaloch štyroch dní. Imunologické farbenie GFÄP počas 14 dní udržiavania ukázalo, že viac než 90% buniek boli astrocyty. Po 14 dfioch v kultúre boli bunky skontaktované s trypsínom a udržiavané ako jedna vrstva päť dní na sklíčkach potiahnutých poly-L-lyzínom. Malé cerebelárne neuróny purifikované v gradiente Perkolu (Schnitzer et al. (1981)) zo šesť dní starých myší a dorzálne koreňové gangliónové neuróny (DRG) (Seilheimer et al. (1988) J. Celí. Biol. 107:341-351) z osem dní starých kuracích embryí boli potom pridané na jednu vrstvu astrocytov. Po 6 hodinách spoločnej kultúry pre cerebelárne a po 12 hodinách pre neuróny DRG boli bunky fixované 2% paraformaldehydom v PBS a dĺžky neuritov boli analyzované, ako je opísané v Príklade 7.11211 were removed by shaking the dishes at each medium change and further growing the cells at four day intervals. Immunological staining of GFÄP for 14 days of maintenance showed that more than 90% of the cells were astrocytes. After 14 days in culture, cells were contacted with trypsin and maintained as one layer for five days on poly-L-lysine coated slides. Small cerebellar neurons purified in a Perkol gradient (Schnitzer et al. (1981)) from six day old mice and dorsal root ganglion neurons (DRG) (Seilheimer et al. (1988) J. Cell. Biol. 107: 341-351) from Eight days old chicken embryos were then added to one layer of astrocytes. After 6 hours of co-culture for cerebellar and after 12 hours for DRG neurons, cells were fixed with 2% paraformaldehyde in PBS and neurite lengths were analyzed as described in Example 7.

Rast neuritov z myších malých cerebelárnych alebo kuracích dorzálnych koreňových gangliónových (DRG) neurónov bol tiež študovaný v jednovrstvových kultúrach astrocytov odvodených z transgénnych (línia 3426) alebo netransgénnych kontról (Obr. 10, Tabuľka 1).Neurite outgrowth from mouse small cerebellar or chicken dorsal root ganglion (DRG) neurons was also studied in monolayer cultures of astrocytes derived from transgenic (line 3426) or non-transgenic control (Fig. 10, Table 1).

1121111211

Tabuľka 1Table 1

DÍžky neuritov cerebelárnych a dorzálnych koreňových gangliónových (DRG) neurónov udržiavaných na astrocytických jednovrstvách pripravených z myší divokého typu (WT) a transgénnej línie 3426.Neurite lengths of cerebellar and dorsal root ganglion (DRG) neurons maintained on astrocytic monolayers prepared from wild-type (WT) and transgenic line 3426 mice.

Cerebelárne neuróny cerebellar neurons DRG neuróny DRG neurons WT WT 65±34 mm 65 ± 34 mm 90±10 mm 90 ± 10 mm WT + anti Ll WT + anti L1 72±30 mm 72 ± 30 mm 105+14 mm 105 + 14mm WT + anti pečeň WT + anti liver 57±24 mm 57 ± 24 mm 107±12 mm 107 ± 12mm 3426 3426 75+41 mm 75 + 41mm 137±10 mm 137 ± 10mm 3426 + anti Ll 3426 + anti L1 45±25 mm 45 ± 25 mm 88± 8 mm 88 ± 8mm 3426 + anti pečeň 3426 + anti liver 58±31 mm 58 ± 31 mm 124±15 mm 124 ± 15mm

DÍžky neuritov na astrocytoch bez preinkuhácie s akoukoľvek protilátkou alebo po pôsobení bez polyklonálnych protilátok proti Ll (anti Ll) alebo protilátok proti myším pečeňovým membránam (anti pečeň) sú uvedené. Priemerné hodnoty ± štandardná odchýlka sú z najmenej 100 neurónov z dvoch nezávislých experimentov vykonaných dvakrát.Neurite lengths on astrocytes without preincubation with any antibody or after treatment without polyclonal antibodies against L1 (anti L1) or antibodies against mouse liver membranes (anti liver) are shown. The mean ± standard deviation is from at least 100 neurons from two independent experiments performed twice.

Dĺžka neuritov cerebelárnych neurónov alebo neurónov DRG na transgénnych astrocytoch bola približne o 15% až 50% dlhšia v porovnaní s dĺžkou neuritov u astrocytov divokého typu (Tabuľka 1). Protilátky proti pečeňovým membránam neovplyvnili dĺžku neuritov zo zvierat divokého typu (Obr. 10, Tabuľka 1).The neurite length of cerebellar neurons or DRG neurons on transgenic astrocytes was approximately 15% to 50% longer compared to the neurite length of wild-type astrocytes (Table 1). Antibodies against liver membranes did not affect neurite length from wild-type animals (Fig. 10, Table 1).

na astrocytických jednovrstvách alebo z transgénnych zvierat Preinkuhácia astrocytických jednovrstiev s protilátkami proti Ll neovplyvnila významne dĺžku neuritov na bunkách zo zvierat divokého typu. Naopak, znížila dĺžku neuritov cerebelárnych neurónov a neurónov DRG pestovaných na bunkách z transgénnych zvierat približne o 40%. V tomto ohľade je pozoruhodné, že polyklonálneon astrocytic monolayers or from transgenic animals Preincubation of astrocytic monolayers with anti-L1 antibodies did not significantly affect neurite length on cells from wild-type animals. In contrast, it reduced the neurite length of cerebellar neurons and DRG neurons grown on cells from transgenic animals by approximately 40%. In this respect, it is noteworthy that polyclonal

11211 protilátky proti myšej Ll použité v tejto štúdii nereagujú s neurónmi z kurčiat (Martini et al., 1994; údaje nie sú uvedené). Na imunofluorescenčnej analýze je však preukázané, že tieto protilátky sa viažu rovnako efektívne ako protilátky proti Ll na astrocyty z transgénnych zvierat a na malé cerehelárne myšie neuróny (údaje nie sú uvedené).The 11211 anti-mouse L1 antibodies used in this study do not react with chicken neurons (Martini et al., 1994; data not shown). However, immunofluorescence analysis shows that these antibodies bind as effectively as anti-L1 antibodies to astrocytes from transgenic animals and to small cerebellar mouse neurons (data not shown).

Príklad 9Example 9

Imunofluorescencia a mikroskopia Aurion-GP immunogoldImmunofluorescence and microscopy Aurion-GP immunogold

Imunologické farbenie Ll a GFAP čerstvo zmrazených priečne a pozdĺžne rezaných optických nervov alebo astrocytických jednovrstiev divokého typu a transgénnych zvierat boli vykonané ako je opísané (Bartsch et al. (1989)). Pre dvojité značenie sme najprv inkubovali astrocyty ako živé bunky s protilátkami proti Ll (2 ug/ml v 1% BSA v PBS) pri 4^eC počas doby 30 min. Po permeabilizácii buniek pomocou 70% metanolu pri -20^eC počas doby 10 min. boli bunky inkubované s protilátkami proti GFAP počas doby 30 min pri 4’C.Immunological staining of L1 and GFAP freshly frozen transverse and longitudinally cut optic nerves or astrocytic monolayers of wild-type and transgenic animals was performed as described (Bartsch et al. (1989)). For double labeling, we first incubated astrocytes as living cells with anti-L1 antibodies (2 µg / ml in 1% BSA in PBS) at 4 ^e C for 30 min. After permeabilization of the cells with 70% methanol at -20 ^e C for 10 min. cells were incubated with anti-GFAP antibodies for 30 min at 4 ° C.

Pre výpočet dĺžky neuritov v experimentoch s kryostatovou kultúrou bolo použité zosilnené farbenie Aurion immuno R-Gent striebro podľa pokynov výrobcu (Aurion, Immuno Gold Reagents & Accesories Custom labelling, Wageningen, Holandsko)) s malými modifikáciami. Kultúry boli fixované 4% paraformaldehydom v PBS na 10 min. pri izbovej teplote, inkubované v 50 mM glycínu v PBS počas doby 10 min. a potom boli ponechané 15 min. v blokovacom pufri (BB, 0,5% BSA v PBS). Po troch premytiach v BB, každé premytie 5 min., boli bunky inkubované s protilátkami proti Ll nariedenými do BB (2 um/ml) počas 30 min. pri izbovej teplote. Potom boli kultúry premyté 3 krát v BB, každé premytie 5 min., boli pridané sekundárne protilátky nariedené 1:20 v BB na 1 hod. pri izbovej teplote. Po troch premytiach v destilovanej vode boli kultúry fixované v 2%For the calculation of neurite length in cryostat culture experiments, enhanced Aurion immuno R-Gent silver staining according to the manufacturer's instructions (Aurion, Immuno Gold Reagents & Accesories Custom Labeling, Wageningen, The Netherlands) was used with minor modifications. Cultures were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 min. at room temperature, incubated in 50 mM glycine in PBS for 10 min. and then left for 15 min. in blocking buffer (BB, 0.5% BSA in PBS). After three washes in BB, each wash for 5 min, cells were incubated with anti-L1 antibodies diluted into BB (2 µm / ml) for 30 min. at room temperature. Then the cultures were washed 3 times in BB, each wash for 5 min., Secondary antibodies diluted 1:20 in BB for 1 hour were added. at room temperature. After three washes in distilled water, the cultures were fixed in 2%

11211 glutaraldehyde v PBS na 10 min. pri izbovej teplote a boli znovu premyté 3 krát destilovanou vodou. Zmes zosilňovača a vývojky v pomere 1:1 bola potom pridaná pri izbovej teplote. Po objavení reakčného produktu boli sklíčka premyté 3 krát destilovanou vodou a uložené do glycerolu.11211 glutaraldehyde in PBS for 10 min. at room temperature and were washed again 3 times with distilled water. The 1: 1 enhancer / developer mixture was then added at room temperature. After discovery of the reaction product, slides were washed 3 times with distilled water and stored in glycerol.

Imunoreaktivita na Ll v optických nervoch netransgénnych myší bola obmedzená na nemyelínované sietnicové gangliónové bunkové axóny (Bartsch et al. (1989)). V nepoškodených optických nervoch z transgénnych zvierat bola tiež nájdená slabá imunoreaktivita na Ll v spojení s bunkovými telieskami a procesmi v radiálne orientovaných bunkách (Obr. 4A).L1 immunoreactivity in the optic nerves of non-transgenic mice was limited to unmyelinated retinal ganglion cell axons (Bartsch et al. (1989)). Weak immunoreactivity to L1 was also found in intact optic nerves from transgenic animals in conjunction with cell bodies and processes in radially oriented cells (Fig. 4A).

imunoreaktivity na Ll v transgénnych poškodení (Obr imunoreaktivitaimmunoreactivity to L1 in transgenic lesions

Intenzita tejto optických nervoch sa 4B) a bola podobná na GFAP zistená značne zosilnila po v rozmiestnení ako v nepoškodených (Obr nervoch divokého typu.The intensity of this optic nerve was 4B) and was similar to GFAP found to be greatly enhanced after in deployment as in intact (Giant wild type nerves).

Expresia Ll bola ďalej analyzovaná v kultúrach astrocytov pripravených z predných mozgov šesť dní starých transgénnych zvierat. Žiadna imunoreaktivita na Ll nebola detekovaná na astrocytoch zo zvierat divokého typu Naopak, bunky pozitívne na Ll boli prítomné z transgénnych zvierat (Obr. 5A). Ako je demonštrované pri dvojitom imunologickom farbení, tie isté bunky sa ukázali byť pozitívne na GFAP (Obr. 5B a E), čo ukazuje, že bunky exprimujúce Ll sú skutočne astrocyty. Pretože imunologické farbenie Ll bolo vykonané na živých bunkách, zdá sa pravdepodobné, že Ll je v transgénnych zvieratách tiež exponovaná na bunkovom povrchu astrocytov in vivo.L1 expression was further analyzed in astrocyte cultures prepared from the forebrain of six day old transgenic animals. No immunoreactivity to L1 was detected on astrocytes from wild-type animals In contrast, L1-positive cells were present from transgenic animals (Fig. 5A). As demonstrated by double immunostaining, the same cells have been shown to be positive for GFAP (Fig. 5B and E), indicating that cells expressing L1 are indeed astrocytes. Since immunostaining of L1 was performed on living cells, it appears likely that L1 is also exposed to the cell surface of astrocytes in vivo in transgenic animals.

4B) alebo poškodených (neznázornené) (Obr. 5D). v kultúrach4B) or damaged (not shown) (Fig. 5D). in cultures

1121111211

Príklad 10Example 10

Analýza Western blotWestern blot analysis

Kvôli ďalšiemu výpočtu množstva expresie Ll v transgénnych myšiach GFAP-L1 boli analyzované pomocou analýzy Western blot detergentové extrakty homogenátov nepoškodených a poškodených (15 dní po poškodení) optických nervov z myší divokého typu a transgénnych dospelých myší (Obr. 6).To further calculate the amount of L1 expression in GFAP-L1 transgenic mice, detergent extracts of homogenates of intact and damaged (15 days after injury) optical nerves from wild-type and transgenic adult mice were analyzed by Western blot analysis (Fig. 6).

Poškodené (15 dní po poškodení) a kontralaterálne nepoškodené optické nervy z 8 dní starých zvierat boli vyčistené od iných tkanív a potom boli zmrazené v tekutom dusíku. Dbalo sa, aby boli použité len myelínované distálne, a nie imunoreaktívne na Ll nemyelínované a čiastočne myelínované proximálne oblasti nervov. Nervy boli zmrazené a rozmrazené 10 krát pred sonikáciou v sonikátore Branson B15 pri 4*C počas doby 5 min. Tkanivá boli potom homogenizované v homogenizátore Dounce v homogenizačnom pufri (1% Triton X-100, 2 M močovina, 5 mM benzamidín, 0,1 mM jódoacetamid, 1 mM fenylmetánsulfonylfluorid, 5 mM Na-p-tozyl-L-lyzínchlóro-metyl ketón v PBS). Homogenity boli vyčistené centrifugáciou pri 16000 g pri 4”C počas doby 15 min. Supernatanty boli ponechané s metanol/chloroformom, aby sa vyzrážali proteíny ako bolo opísané vo Wessel et al. (1984). Proteínová zložka bola stanovená v supernatante (Pierce). Po vykonaní SDS-PAGE na 7% plochých géloch pri redukčných podmienkach boli proteíny (25 ug) analyzované pomocou analýzy Western blot s polyklonálnymi protilátkami proti Ll (0,4 pg/ml). Sekundárne protilátky konjugované s peroxidázou z reďkovky (2 pg/ml) boli detekované pomocou blotovacej detekčnej súpravy ECL (Amersham). Denzitometrická analýza imunoblotov ukázala, že expresia Ll v nepoškodených optických nervoch transgénnych zvierat bola približne o 40% a 13% (línie 3426 a 3427) vyššie než v nepoškodených optických nervoch zvierat divokého typu. Expresia Ll v poškodených transgénnych nervoch bola o 310% a 200% (líniaDamaged (15 days after injury) and contralaterally intact optic nerves from 8 day old animals were cleaned from other tissues and then frozen in liquid nitrogen. Care was taken to use only myelinated distal, and not immunoreactive, L1 non-myelinated and partially myelinated proximal nerve regions. Nerves were frozen and thawed 10 times prior to sonication in a Branson B15 sonicator at 4 ° C for 5 min. The tissues were then homogenized in a Dounce homogenizer in homogenization buffer (1% Triton X-100, 2 M urea, 5 mM benzamidine, 0.1 mM iodoacetamide, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 5 mM Na-p-tosyl-L-lysine-chloromethyl ketone in PBS). Homogeneities were clarified by centrifugation at 16000 g at 4 ° C for 15 min. Supernatants were left with methanol / chloroform to precipitate proteins as described by Wessel et al. (1984). The protein component was determined in the supernatant (Pierce). Following SDS-PAGE on 7% flat gels under reducing conditions, proteins (25 µg) were analyzed by Western blot analysis with polyclonal anti-L1 antibodies (0.4 µg / ml). Secondary radish peroxidase-conjugated antibodies (2 µg / ml) were detected using an ECL blot detection kit (Amersham). Densitometric analysis of immunoblots showed that L1 expression in the intact optic nerves of transgenic animals was approximately 40% and 13% (lines 3426 and 3427) higher than in the intact optic nerves of wild-type animals. The expression of L1 in the damaged transgenic nerves was 310% and 200%, respectively

1121111211

3426 a 3427) vyššia než u poškodených nervoch zvierat divokého typu. Porovnanie medzi poškodenými a kontralaterálnymi nepoškodenými optickými nervami zo zvierat divokého typu odhalilo zníženú expresiu proteínu L1 o 40% na poškodenej strane. Naopak, množstvo proteínu L1 v poškodených nervoch línií 3427 a 3426 stúplo o približne 30% v porovnaní s nepoškodenými kontralaterálnymi stranami. Hladina expresie L1 v línii 3426 bola približne o 35% a 25% vyššia než v línii 3427 pre nepoškodené a poškodené optické nervy.3426 and 3427) higher than the damaged nerves of wild-type animals. Comparison between injured and contralateral intact optic nerves from wild-type animals revealed reduced L1 protein expression by 40% on the injured side. In contrast, the amount of L1 protein in the damaged nerves of lines 3427 and 3426 increased by approximately 30% compared to the intact contralateral sides. L1 expression level in line 3426 was approximately 35% and 25% higher than in line 3427 for intact and damaged optic nerves.

Príklad 11Example 11

Obnovený rast axónov v optickom nerve in vitro až 8 týždňov staré transgénne myši GFAP-L1 a myši divokého typu boli utratené a po 14 dňoch boli sledované na fluoresceinom značený biotín ester za účelom označenia sietnicových gangliónových bunkových axónov postupným značením. Výsledky sú znázornené na Obr. 11 a 12. Každý bod predstavuje jedno zviera.Renewed axonal growth in the optic nerve in vitro up to 8 weeks old transgenic GFAP-L1 mice and wild-type mice were sacrificed and after 14 days fluorescein-labeled biotin ester was monitored to label retinal ganglion cell axons by sequential labeling. The results are shown in FIG. 11 and 12. Each point represents one animal.

Príklad 12Example 12

Identifikácia hranice medzi homológnymi opakovaniami 2 a 3 fibrínového typu III v nervovej bunkovej adhéznej molekule L1 ako neuritový rast podporujúci a signál prenášajúci doményIdentification of the borderline between fibrin type III homologous repeats 2 and 3 in the nerve cell adhesion molecule L1 as neurite growth promoting and signal transduction domains

Kvôli stanoveniu domén v nervovej bunkovej adhéznej molekule L1 zodpovedných za rast neuritov boli vytvorené monoklonálne protilátky proti L1 a ich vplyv na rast neuritov malých cerebelárnych neurónov v kultúre bol sledovaný. Keď bolo 11 protilátok použitých ako substráty, len protilátka 557.B6, ktorá rozoznáva epitop reprezentovaný syntetickým peptidom obsahujúcim aminokyseliny 818 až 832 naTo determine the domains in the neurite cell adhesion molecule L1 responsible for neurite outgrowth, monoclonal antibodies to L1 were generated and their effect on neurite outgrowth of small cerebellar neurons in culture was investigated. When 11 antibodies were used as substrates, only antibody 557.B6 that recognizes an epitope represented by a synthetic peptide comprising amino acids 818 to 832 for

11211 hranici medzi homológnymi opakovaniami 2 a 3 fibrínového typu III, bola rovnako účinná ako Ll v podpore rastu neuritov, zvýšení hladiny intracelulárneho Ca2+ a stimulácii spotreby inositol fosfátov. Tieto zistenia dokazujú, že rast neuritov a zmeny v týchto druhých prenášačoch sú zhodné. Táto zhoda bola potvrdená schopnosťou antagonistov kanálov Ca2+ a toxínu čierneho kašla inhibovať rast neuritov na Ll a protilátke 557.B6. Tieto pozorovania ukazujú na odlišné miesto na Ll viazané na bunkovom povrchu ako na prominentný signál prenášajúci doménu, cez ktorú prebiehajú rozpoznávacie deje na spustenie rastu neuritov, zvýšenie spotreby inozitol fosfátov a zvýšenie hladiny intracelulárneho Ca2+.The 11211 border between homologous repeats 2 and 3 of fibrin type III was as effective as L1 in promoting neurite outgrowth, increasing intracellular Ca 2+ levels, and stimulating inositol phosphate uptake. These findings demonstrate that neurite outgrowth and changes in these second carriers are consistent. This agreement was confirmed by the ability of Ca 2+ channel antagonists and pertussis toxin to inhibit neurite outgrowth on L1 and antibody 557.B6. These observations point to a different cell surface bound L1 site as a prominent signal transduction domain through which recognition events run to trigger neurite outgrowth, increase inositol phosphate uptake, and increase intracellular Ca 2+ levels.

Príklad 13Example 13

Imunoreaktivita L2/HNK-1 v reinervovanom periférnom nerve: prednostná expresia v motorových s axónom asociovaných Schwannových bunkáchImmunoreactivity of L2 / HNK-1 in reinerved peripheral nerve: preferential expression in motor axon-associated Schwann cells

Karbohydrátový epitop L2/HNK-1 (ďalej uvádzaný L2) je exprimovaný v dospelej myši myelínovanými Schwannovými bunkami ventrálnych koreňov a svalových nervov, ale zriedka dorzálnych koreňov a/alebo kožných nervov. Pretože substrátovo potiahnuté glykolipidy L2 podporujú rast pestovaných motorových, ale nie zmyslových neurónov, L2 tak ovplyvňujú preferenčné reinervovanie svalových nervov skrz regeneráciu motorových axónov in vivo.The L2 / HNK-1 carbohydrate epitope (hereafter referred to as L2) is expressed in adult mice by myelinated Schwann cells of the ventral roots and muscle nerves, but rarely dorsal roots and / or skin nerves. Since L2-coated substrate glycolipids promote the growth of cultured motor but not sensory neurons, L2 thus affects the preferential reinervation of muscle nerves through motor axon regeneration in vivo.

Vplyv regenerujúcich sa axónov na expresiu L2 spôsobenú reinervovanými Schwannovými bunkami bol preto analyzovaný vedením motorových a zmyslových axónov do svalových a kožných vetiev femorálnych nervov osem týždňov starých myší. Regenerujúce sa axóny z kožných vetiev neviedli k imunocytochemicky detekovatelnej expresi i L2 vo svalových alebo kožných nervových vetvách. Axóny regenerujúce sa zo svalových vetiev viedli k slabej expresii L2 od niekoľkýchThe effect of regenerating axons on L2 expression caused by reinerved Schwann cells was therefore analyzed by guiding motor and sensory axons into the muscle and skin branches of the femoral nerves of eight week old mice. Regenerating axons from the cutaneous branches did not result in immunocytochemically detectable expression of L2 in muscle or cutaneous nerve branches. Axons regenerating from muscle branches led to poor expression of L2 by several

1121111211

Schwannových buniek kožnej vetvy, ale vyvolali silnú expresiu L2 od mnohých Schwannových buniek svalovej vetvy. Myelínové Schwannove bunky predtým asociované s motorovými axónmi sa potom odlišovali od predchádzajúcich zmyslových s axónom asociovaných myelínových Schwannových buniek v ich schopnosti exprimovať L2, keď sú spojené s motorovými axónmi. Toto zvýšenie expresie L2 počas rozhodujúcich štádií reinervácie spôsobujú motorové axóny regenerujúce sa do vhodnej, svalovej dráhy s výhodou oproti tým, ktoré sa regenerujú do nevhodnej, zmyslovej dráhy.Schwann cells of the cutaneous branch, however, induced strong L2 expression from many Schwann cells of the muscle branch. Myelin Schwann cells previously associated with motor axons then differed from prior sensory axon-associated myelin Schwann cells in their ability to express L2 when associated with motor axons. This increase in L2 expression during the critical stages of reinervation is caused by motor axons regenerating into a suitable muscle pathway, preferably over those that regenerate into an inappropriate, sensory pathway.

Príklad 14Example 14

Ll v spevnení pamäti pri pasívnom vyhýbacom teste u kurčiatL1 in memory reinforcement in a passive avoidance test in chickens

Cvičenie jednodenných pasívnom vyhýbacom teste, potláčať tendenciu ďobať do napustená horko chutiacim kurčiat pri jednej skúške na pri ktorom sa kurčatá učia malej lesklej guľôčky, ktorá je metylántranilátom, má za následok časovo závislú bunkovú a molekulárnu kaskádu kulminujúcu až do pretvorenia presynaptických a postsynaptických elementov na dve diskrétne oblasti predného mozgu, stredný mediálny hyperstriatum ventrale (IMHV) a Lobus parolfactorius (LOP) (Rose (1991) Trends In Heurosciences 14:390-397). Kaskáda zahŕňa dve odlišné vlny glykoproteínovej syntézy, ako je to zrejmé zo zvýšenej inkorporácie fukózy, vyskytujúce sa ako v IMHV tak aj LPO v rôznych časoch po cvičení. Obidve vlny sú nutné pre dlhotrvajúce (t.j. 24 hodín a dlhšie) udržanie pamäti vo vyhýbacom teste, v ktorom je zrejmé oslabenie u kurčiat, ktoré by sa inak vyhli predchádzajúcej horkej guľôčke a ďobali do suchej guľôčky v teste.Exercise of a one-day passive avoidance test, suppressing the tendency to pee in impregnated hot-tasting chicks in a single test in which chicks learn a small shiny ball that is methylantranilate, results in a time-dependent cellular and molecular synaptic cascade culminating in two to discrete areas of the forebrain, middle medial hyperstriatum ventrale (IMHV), and Lobus parolfactorius (LOP) (Rose (1991) Trends In Heurosciences 14: 390-397). The cascade involves two distinct waves of glycoprotein synthesis, as evidenced by the increased incorporation of fucose occurring in both IMHV and LPO at different times after exercise. Both waves are required for prolonged (i.e., 24 hours or more) memory retention in the avoidance test, which reveals a weakening in the chickens that would otherwise avoid the previous hot ball and punch the dry ball in the test.

Za predpokladu úlohy Ll pri sprostredkovávaní medzibunkového kontaktu bola predložená štúdia, ktorá mala stanoviť, či Ll patrí medzi glykoproteíny spájané s učením, ktoré sa zúčastňujú na tvorbe vín syntézy glykoproteínov, a sú tak nutné pre tvorbu pamäti. Ak je tomu tak, protilátkyAssuming the role of L1 in mediating intercellular contact, a study was presented to determine whether L1 is one of the learning-associated glycoproteins involved in the production of glycoprotein synthesis wines and is thus required for memory formation. If so, the antibodies

11211 proti Ll, ktoré sú podávané vo vhodnom čase vzhľadom na cvičenie, by mali zabrániť synaptickej prestavbe nutnej pre dlhotrvajúcu pamäť a preto by mali produkovať zoslabenie vykonávania cvičenia. Podobne, ak extracelulárne domény molekuly Ll majú nejaký význam v rekogničných a adhéznych procesoch, ktoré sú potrebné pre synaptickú prestavbu a stabilizáciu, exogénne podávané fragmenty extracelulárnej domény, ktoré sa budú viazať homofilne na endogénne molekuly, budú narúšať tento proces.11211 against L1, which are administered at an appropriate time with respect to the exercise, should avoid the synaptic remodeling required for long-term memory and therefore should produce a reduction in exercise performance. Similarly, if the extracellular domains of the L1 molecule have any significance in the recognitive and adhesion processes required for synaptic rearrangement and stabilization, exogenously administered fragments of the extracellular domain that will bind homophilically to the endogenous molecules will disrupt this process.

Protilátky a fragmentyAntibodies and fragments

Polyklonálne protilátky boli pripravené v králikoch imunizáciou s imunoafinitne purifikovanou Ll (Ng-CAM, 8D9) nasledovanou vykonaným imunizačným postupom (Rathjen et al. (1984)). Ll bola izolovaná z jednodenných kuracích mozgov pomocou monoklonálnej proti látkovéj kolóny 8D9 (Lagenaur a Lemmon (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7753-7757) opäť podľa zavedeného postupu (Rathjen et al. (1984)). Protilátky boli izolované zo séra získaného po tretej imunizácii pomocou Proteín G Sefarózy (Pharmacia LKB) podľa pokynov výrobcu. Rekombinantne exprimované fúzované proteíny v E. coli reprezentujúce šesť imunoglobulinových (Ig-I-VI) a päť fibronektínových (FN1-5) opakovaní boli pripravené ako bolo opísané v Appel et al. (1993).Polyclonal antibodies were prepared in rabbits by immunization with immunoaffinity purified L1 (Ng-CAM, 8D9) followed by an immunization procedure performed (Rathjen et al. (1984)). L1 was isolated from overnight chicken brains using a monoclonal anti-8D9 column (Lagenaur and Lemmon (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7753-7757) again according to established procedures (Rathjen et al. (1984)). Antibodies were isolated from serum obtained after the third immunization with Protein G Sepharose (Pharmacia LKB) according to the manufacturer's instructions. Recombinantly expressed fusion proteins in E. coli representing six immunoglobulin (Ig-I-VI) and five fibronectin (FN1-5) repeats were prepared as described in Appel et al. (1993).

Sódium dodecylsulfátová elektroforéza v polyakrylovom gél i (SDS-PAGE) a imunobloty kuracích subcelulárnych frakcií 50 μΐ proteínu z mozgového homogenátu, z hrubých membrán, z rozpustných frakcií (Burchuladye et al. (1990) Brain Res. 535:131-138 a z postsynaptických nahromadení (Murakami et al. (1986) J. Neurochem. 46:340-348), všetko z jednodenných kuracích mozgov, bolo separovaných na SDS-PAGE za redukujúcich podmienok na 5 až 15% polyakrylovom gradientovom géli (Laemmli (1970) Náture 227:131-138, a potom bolo všetko prenesené na nitrocelulózu (Burnette (1981) Anál. Biochem. 112:195-203). Po inkubácii cez nocSodium dodecylsulfate electrophoresis in polyacrylic gel i (SDS-PAGE) and immunoblots of chicken subcellular fractions of 50 μΐ of protein from brain homogenate, thick membranes, soluble fractions (Burchuladye et al. (1990) Brain Res. 535: 131-138 and post-sennaptic) (Murakami et al. (1986) J. Neurochem. 46: 340-348), all of the day-old chicken brains were separated on SDS-PAGE under reducing conditions on a 5-15% polyacrylic gradient gel (Laemmli (1970) Nature 227: 131-138, and then everything was transferred to nitrocellulose (Burnette (1981) Anal. Biochem. 112: 195-203).

11211 s protilátkami proti Ll pri neriedení 1:1000 v Trisom pufrovanom roztoku, pH 7,2, obsahujúcim 5% sušené mlieko bez tuku, holi detekované imunoreaktívne prúžky podlá predtým opísaného spôsobu (Scholey et al. (1993) Neurosciences 55:499-509).11211 with anti-L1 antibodies at 1: 1000 dilution in Tris buffered solution, pH 7.2, containing 5% fat-free milk powder, immunoreactive strips detected according to the method previously described (Scholey et al. (1993) Neurosciences 55: 499-509 ).

Cvičebné a testovacie postupyExercise and test procedures

Jednodenné Rossove kurčatá obidvoch pohlaví, vyliahnuté v inkubátoroch, boli premiestnené v pároch do malých klietok a boli predbežne (2,5 mm) chrómovej guľôčky ako holo opísané v Lossner 41:1357-1363. Vtáci, ktorí cvičené na ďobanie do malej namočenej do metylántranilátu, a Rose (1983) J. Neurosciences ďobali do horkej guľôčky, osvedčili stereotypnú zápornú odpoveď tým, že mohutne potriasali hlavou a vracali sa späť od guľôčky. 24 hodín po cvičení boli zvieratá testované na prítomnosť suchej chrómovej guľôčky zhodnej s tou predchádzajúcou. Zadržanie pasívneho učenia sa vyhýbať guľôčke holo vidieť u zvierat, ktoré sa vyhýbali testovanej guľôčke. Pri každom opakovaní tohoto protokolu bolo cvičených a testovaných 24 až 36 kurčiat. Viac než 80% cvičených, neinjekovaných kurčiat sa normálne vyhýbalo guľôčke v teste za týchto podmienok, aj keď tu bolo niekedy zníženie vyhýbania sa u vtákov injekovaných kontrolným roztokom. Naopak, vtáci, ktorí sú cvičení na namočenú guľôčku do vody, často ďobali do suchej guľôčky a ich výsledok vyhýbania bol ledva nad 5 až 10%. Celý test a cvičenie bolo vykonávané rutinne experimentátorom, ktorý nevedel, ktoré zvieratá sú ktoré.Ross's day-old chicks of both sexes, hatched in incubators, were transferred in pairs into small cages and were preliminarily (2.5 mm) chrome pellets as described holo in Lossner 41: 1357-1363. Birds trained to pee in a small soaked in methylantranilate, and Rose (1983) J. Neurosciences punched a bead into a bead, proved a stereotypical negative response by shaking their heads vigorously and returning back from the bead. 24 hours after exercise, the animals were tested for the presence of a dry chrome bead identical to the previous one. Withholding passive learning to avoid the holo see ball in animals that have avoided the test ball. 24 to 36 chickens were trained and tested with each repetition of this protocol. More than 80% of trained, uninjected chickens normally avoided the bead in the test under these conditions, although there was sometimes a reduction in avoidance in birds injected with control solution. Conversely, birds who are drenched in a soaked water ball often plowed into a dry ball and their avoidance results were barely above 5-10%. The whole test and exercise was performed routinely by an experimenter who did not know which animals were which.

Injekciainjection

Protilátky Ll a fragmenty FN1-5 a Ig I-IV boli dializované cez noc proti 0,9% fyziologickému roztoku a koncentrácia bola upravená na 1 mg/ml pre Ll a 250 ug/ml pre fragmenty. Kurčatá dostali dvojstranné intrakraniálne injekcie do stredného mediálneho hyperstriata ventrale (IMHV) 10 μ! protilátok Ll na jednu hemisféru; kontrolnéL1 antibodies and FN1-5 and Ig I-IV fragments were dialyzed overnight against 0.9% saline, and the concentration was adjusted to 1 mg / ml for L1 and 250 µg / ml for fragments. The chickens received bilateral intracranial injections into a medial hypertrial ventrale (IMHV) of 10 μ! L1 antibodies per hemisphere; inspection

11211 (1993)), že protilátok zvieratá dostali podobné injekcie fyziologického roztoku. Presné dopravenie do IMHV bolo vykonané pomocou špeciálne navrhnutého držiaku hlavy a zapúzdrenej Hamiltonovéj striekačky (Davis et al. (1982) Pharm. Biochem. Behav.11211 (1993)) that antibody animals received similar saline injections. Accurate delivery to IMHV was accomplished using a specially designed head holder and encapsulated Hamilton syringe (Davis et al. (1982) Pharm. Biochem. Behav.

17:893-896. Kurčatá, ktoré dostali zo striekačky ako fyziologický roztok tak aj protilátky pred cvičením alebo testom, nevykázali žiadnu významnú zmenu chovania a ďobali do guľôčky počas cvičenia podľa predpokladu. Veľký extracelulárny objem mozgu novo vyliahnutých kurčiat znamená, že injekovaná dávka je dohre tolerovaná. Predchádzajúce oznámenie ukázalo (Schley et al, po injekcii môže dôjsť k malej difúzii z injekovaného miesta. Presnosť umiestnenia injekcie bola rutinne monitorovaná vizuálnou kontrolou mozgov post mortem. Pri každom opakovaní experimentu bola vyhodnotená rovnako veľká skupina kurčiat, ktorá bola injekovaná huď fyziologickým roztokom a protilátkou alebo fragmentom.17: 893-896. Chickens that received both saline and antibodies prior to exercise or test from the syringe showed no significant change in behavior and pawed the ball during exercise as expected. The large extracellular brain volume of newly hatched chicks means that the injected dose is perfectly tolerated. The previous announcement showed (Schley et al, there may be little diffusion from the injection site after injection. The accuracy of injection placement was routinely monitored by visual brain drain post mortem. An equal sized group of chickens that were injected with saline and antibody were evaluated every time. or fragment.

V experimente s Ll boli skupiny kurčiat injekované fyziologickým roztokom alebo protilátkou v jednom z ôsmich časových bodov vzhľadom na cvičenie; 2 hod. alebo 30 min. pred cvičením, alebo +1 hod., +3 hod., +4 hod., +5,5 hod., +8 hod., +12 hod. po cvičení. Na základe predchádzajúcich pozorovaní bolo predvídané, že akékoľvek efekty budú pozorované u vtákov ako po 30 min., tak aj po 5,5 hod. po cvičení, a počet opakovaní týchto časových bodov bol podľa toho väčší (N=17, 28, 17, 19, 18, 21, 19 a 18 zvlášť pre injekcie protilátky). Fragmenty FN1-5 a Ig I-IV Ll boli injekované buď po 30 min. alebo po 5,5 hod. a retenčný test bol vykonaný po 24 hod. Retencia v skupinách kurčiat s injekciami fyziologického roztoku a protilátok proti Ll alebo fragmentov Ll bola porovnaná štatisticky cez chĺ². Výsledky sú znázornené na Obr. 13 a 14.In the L1 experiment, groups of chickens were injected with saline or antibody at one of eight time points relative to exercise; 2 hrs or 30 min. before exercise, or +1 hours, +3 hours, +4 hours, +5.5 hours, +8 hours, +12 hours after exercise. Based on previous observations, it was predicted that any effects would be seen in birds both after 30 min and 5.5 hr. after exercise, and the number of repetitions of these time points was greater (N = 17, 28, 17, 19, 18, 21, 19 and 18 separately for antibody injections). FN1-5 and Ig I-IV L1 fragments were injected for either 30 min. or after 5.5 hours. and retention test was performed after 24 h. Retention in groups of chickens injected with saline and anti-L1 antibodies or L1 fragments was compared statistically across CH ² . The results are shown in FIG. 13 and 14.

1121111211

Príklad 15 platinovými umiestnenýmiExample 15 Platinum Placed

StimulačnýPacing

Účasť Ll a NCAM na dlhotrvajúcu potenciáciuParticipation of L1 and NCAM in long term potentiation

Transverzné hypokampálne rezy (400 pm) z haloténom anestéziovaných samčích krýs kmeňa Wistar (180-220 g) boli pripravené podľa štandardných techník. Rezy boli udržiavané v malých komôrkach a spočiatku oživované 45 min. v hypermolárnej (320 mOsm/kg) umelej cerebrospinálnej tekutine (ACSF) pri izbovej teplote. Teplota kúpeľa bola potom zvýšená na 30°C a médium bolo vymenené na normotonické ACSF (307 mOsm/kg) obsahujúce (v mM): NaCl 124,0; KC1 2,5; Mg2SO4 2,0; CaCl2 2,5; KH2PO4 1,25; NaHC03 26,0;Transverse hypocampal sections (400 µm) from halothene-anesthetized male Wistar rats (180-220 g) were prepared according to standard techniques. Sections were kept in small chambers and initially revived for 45 min. in hypermolar (320 mOsm / kg) artificial cerebrospinal fluid (ACSF) at room temperature. The bath temperature was then raised to 30 ° C and the medium was changed to normotonic ACSF (307 mOsm / kg) containing (in mM): NaCl 124.0; KCl 2.5; Mg2SO4 2.0; CaCl2 2.5; KH2PO4 1.25; NaHCO 3 26.0;

glukóza 10; sacharóza 4; prebublávané 95% 02/5% CO2 (pH 7,4); množstvo perfúzie: 0,75 ml/min. Schafferové kolaterálne spojovacie vlákna boli stimulované stočenými a irídiovými drôtikmi (50 pm v priemere) v oblasti striatum radiatum v oblasti CA1. test pozostával z monofázových impulzov trvajúcich 100 ps každých 30 sekúnd a sila stimulácie bola upravená, aby sa získalo 30% maximálnej amplitúdy EPSP (maximálny EPSP bez posunutého populačného tŕňa). Hodnoty EPSP boli zaznamenané z oblasti CA1 stratum radiatum pomocou dvoch sklenených mikropipiet (2M NaCl, 1 až 5 MOhm) umiestnenej približne 300 pH od stimulačnej elektródy na každej strane.glucose 10; sucrose 4; 95% O2 / 5% CO2 bubbled (pH 7.4); perfusion amount: 0.75 ml / min. Schaffer collateral connective fibers were stimulated with coiled and iridium wires (50 µm in diameter) in the striatum radiatum region of the CA1 region. the test consisted of monophasic pulses lasting 100 ps every 30 seconds and the stimulation strength was adjusted to obtain 30% of the maximum EPSP amplitude (maximum EPSP without shifting population thorn). EPSP values were recorded from the CA1 stratum radiatus region using two glass micropipettes (2M NaCl, 1 to 5 MOhm) located approximately 300 pH from the stimulation electrode on each side.

Po stabilnom zázname počas doby najmenej 15 min. boli injekované protilátky a proteínové fragmenty do dendritického poľa CA1 v blízkosti (50 až 75 pm) jednej záznamovej elektródy (elektróda nastavená na 30%) pomocou modifikovaného mikroinjekčného systému (Nanolitrový injektor, WPI) kontinuálne dopravujúceho 5 nl každých 10 sekúnd až do konca experimentu pokiaľ nie je uvedené inak. Premytie protilátok s následnou indukciou LTP nebolo možné kvôli zrejmým dôvodom, ale bolo overené, či sa LTP môže indukovať vnútri každého rezu záznamom z druhej elektródy, kde neboli protilátky aplikované. Aj keďAfter stable recording for at least 15 min. antibodies and protein fragments were injected into the dendritic field of CA1 near (50-75 µm) one recording electrode (electrode set to 30%) using a modified microinjection system (Nanoliter Injector, WPI) continuously delivering 5 µl every 10 seconds until the end of the experiment until unless otherwise stated. Washing of antibodies with subsequent LTP induction was not possible for obvious reasons, but it was verified whether LTP can be induced inside each section by recording from a second electrode where the antibodies were not applied. Even though

11211 neprenikol hrot injekčnej mikropipety do rezu, bola niekedy pozorovaná malá redukcia s injekciou začínalo. Tento v amplitúde EPSP, keď sa objemový artefakt bol nezávislý na druhu injektovanej látky. Proteíny boli dialyzované proti 20 mM PBS pri pH 7,4 pokiaľ nie je uvedené inak a koncentrácie boli vzhľadom na koncentrácie v pipete.11211 did not penetrate the tip of the injection micropipette into the incision, a small reduction was sometimes observed starting with injection. This in the amplitude of the EPSP when the bulk artifact was independent of the type of substance injected. Proteins were dialyzed against 20 mM PBS at pH 7.4 unless otherwise indicated and concentrations were relative to pipette concentrations.

min. po začiatku mikroinjekovania bola indukovaná LTP s vypuknutím stimulácie teta (TBS) pozostávajúcu z troch sledov po 4 sekundách; každý sled pozostával z desiatich vysokofrekvenčných nárazov 5 pulzov pri 100 Hz a nárazy boli oddelené 200 ms (Reichardt et al. (1991) Annu. Rev.min. upon initiation of microinjection, aunt stimulation-induced LTP (TBS) consisting of three sequences of 4 seconds was induced; each sequence consisted of ten high-frequency bursts of 5 pulses at 100 Hz and the bursts were separated by 200 ms (Reichardt et al. (1991) Annu.

Neurosci. 14:531-570). Trvanie stimulačných pulzov bolo zdvojnásobené počas TBS. Indukcii LTP mohlo byt úplne zabránené perfúziou 10 μΜ D(-)-2-amino-5-fosfonopentanoovou kyselinou (D-AP5; Tocris). Záznamy z celých buniek boli získané z neurónov CA1 pomocou slepého” svorkového systému so svorkovým amplifikátorom EPC-9. Teplota kúpeľa bola 30°C. Svorkové elektródy boli vytiahnuté z 1,5 mm bórosiUkovaného skla OD a mali rezistancie medzi 3 a 8 MOhm. Pipety neboli ani vyžíhané plameňom ani potiahnuté. Elektródy boli rutinne namočené do roztoku obsahujúceho (v mM): glukonát draselný 129; KC1 5; MgCl2 1; CaClí 1; N-(l-hydroxyetyl)-piperazín-N'-(2-etánsulfónovú kyselinu) (HEPES) 5; 1,2-bis-(2-aminofenoxy)etán-N,N,N', N'-tetraoctovú kyselinu (BAPTÄ) 5; Na-ATP 10 a Na-GTP 0,3, s pH upraveným na 7,3 ROH. Sériová rezistencia nebola kompenzovaná. Odpovede boli spriemerované z troch až štyroch signálov. Boli vytlačené pre vizuálnu analýzu alebo uložené na disk pre neskoršiu analýzu. Štatistické vyhodnotenia boli vykonané pomocou analýzy variácií s plánovitými porovnávaniami a kontrastnou analýzou; čas bol uvažovaný ako závislá premenná s jednou úrovňou opakovaných meraní. Anti-Ll (Rathjen et al. (1984)), anti-Ig I-VI (Hynes et al. (1992)) a anti-pečeňové membránové protilátky (Linder et al. (1983)) boli vyrobené tak, ako bolo predtým opísané. Výsledky sú znázornené na Obr. 15.Neurosci. 14: 531-570). The duration of pacing pulses was doubled during TBS. LTP induction could be completely prevented by perfusion with 10 μ 10 D (-) - 2-amino-5-phosphonopentanoic acid (D-AP5; Tocris). Whole cell recordings were obtained from CA1 neurons using a blind terminal system with a terminal amplifier of EPC-9. The bath temperature was 30 ° C. The terminal electrodes were pulled from 1.5 mm borosilicate OD glass and had resistances between 3 and 8 MOhm. Pipettes were neither flame ignited nor coated. The electrodes were routinely soaked in a solution containing (in mM): potassium gluconate 129; KC1 5; MgCl2 1; CaCl2; N- (1-hydroxyethyl) -piperazine-N '- (2-ethanesulfonic acid) (HEPES) 5; 1,2-bis- (2-aminophenoxy) ethane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid (BAPTA) 5; Na-ATP 10 and Na-GTP 0.3, with a pH adjusted to 7.3 ROH. Serial resistance was not compensated. Responses were averaged from three to four signals. They were printed for visual analysis or saved to disk for later analysis. Statistical evaluations were performed by analysis of variations with planned comparisons and contrast analysis; time was considered as a dependent variable with one level of repeat measurements. Anti-L1 (Rathjen et al. (1984)), anti-Ig I-VI (Hynes et al. (1992)) and anti-liver membrane antibodies (Linder et al. (1983)) were made as previously. described. The results are shown in FIG. 15th

1121111211

Domény I-VI podobné Ig a homológne opakovania I-V typu FN III boli exprimované v baktériách a purifikované ako bolo opísané VI (Hynes et al. (1992)). Protilátky proti NCAM a axonínu-1 boli vyrobené, ako bolo opísané (Larson et al. (1986) Science 232:985-988; Bailey et al. (1992) Science 256:645-649). Produkcia oligomanozidových glykopeptidov z ribonukleázy B a kontrolných glykopeptidov z azialofetuínu bola opísaná (Larson et al. (1986)). Výsledky sú znázornené na Obr. 17.Ig-like domains I-VI and FN III type I-V homolog repeats were expressed in bacteria and purified as described by VI (Hynes et al. (1992)). Antibodies against NCAM and axonin-1 have been produced as described (Larson et al. (1986) Science 232: 985-988; Bailey et al. (1992) Science 256: 645-649). The production of oligomanoside glycopeptides from ribonuclease B and control glycopeptides from azialofetuin has been described (Larson et al. (1986)). The results are shown in FIG. 17th

Príklad 16Example 16

Ll má nervovo ochranný efektL1 has a nerve protective effect

Bol vykonaný experiment na ďalšie vysvetlenie aktivityAn experiment was performed to further explain the activity

Ll v nervovom tkanive CNS. Alikvóty vzoriek myších mesencefalónových buniek boli natreté a pestované na štyroch separátnych miskách s médiami pripravenými, ako je uvedené nižšie: prvá kontrolná miska bola natretá len poly-L-lyzínom; druhá miska bola natretá poly-L-lyzínom a Ll; tretia kontrolná miska bola natretá poly-L-lyzínom a laminínom; štvrtá miska bola natretá poly-L-lyzínom, laminínom a Ll. Všetky misky dostali alikvotné množstvo buniek a boli inkubované za rovnakých podmienok. Po 7 dňoch boli všetky misky sfarbené na prítomnosť dopamínu a výsledok bol pozorovaný. Misky, ktoré boli natreté Ll vykazovali rast o 200% až 400% väčší než kontroly. Misky natreté laminínom vykazovali väčší rast neuritov, ale nie viac než u misiek s Ll. Výsledky ukazujú, že Ll má velký nervovo ochranný efekt, pretože životnosť buniek meraná na počet buniek, ktoré rástli, bola velmi zvýšená proti kontrolám.L1 in CNS nerve tissue. Aliquots of mouse mesencephalon cell samples were coated and grown on four separate plates with media prepared as follows: the first control plate was coated with poly-L-lysine only; the second dish was coated with poly-L-lysine and L1; a third control dish was coated with poly-L-lysine and laminin; the fourth dish was coated with poly-L-lysine, laminin and L1. All plates were aliquoted and incubated under the same conditions. After 7 days, all plates were stained for dopamine and the result was observed. Plates that were coated with L1 showed growth 200% to 400% greater than controls. Plates coated with laminin showed greater neurite outgrowth, but no more than L1 plates. The results show that L1 has a great neuroprotective effect since cell viability measured on the number of cells that grew was greatly increased over controls.

1121111211

Príklad 17Example 17

Rozpustná forma Ll (Ll-Fc) je funkčne aktívna a je silné činidlo v udržiavaní živých nervovThe soluble form of L1 (L1-Fc) is functionally active and is a potent agent in the maintenance of living nerves

Rozpustná forma Ll bola vytvorená v bunkách COS ako rekombinantný spojený proteín Ll-Fc postupom opísaným v Neurón 14:57-66, 1995. Rekombinantný proteín bol purifikovaný afinitnou chromatografiou s proteínom Ä a bol použitý ako substrát natretý na plastický materiál a/alebo ako rozpustná molekula pridaná do kultivačného média v l až 10 pg/ml. Rast neuritov a prežívanie mesencefalických neurónov odo dna 17 krysích embryí bol skúšaný v kultúre po 7 dňoch udržiavania in vitro. Dopaminergické neuróny boli rozlíšené imunologickým farbením na dopamín-beta-hydrolázu (DBH) a boli spočítané pomocou morfometrického vybavenia IBAS. Kultúry s pridanou rozpustnou Ll-Fc boli udržiavané na poly-DL-otnitíne (PORN) a substrátovo potiahnutej Ll-Fc boli pridané na vrch predtým potiahnutých PORN (za podmienok opísaných v Appel et al., J. Neuroscience 13:4764-4775, 1993. NCAM-Fc bola použitá ako kontrola.The soluble form of L1 was generated in COS cells as a recombinant linked L1-Fc protein by the procedure described in Neuron 14: 57-66, 1995. The recombinant protein was purified by affinity chromatography with protein Ä and used as a substrate coated on plastic material and / or as soluble molecule added to the culture medium in 1 to 10 µg / ml. Neurite growth and survival of mesencephalic neurons from the bottom of 17 rat embryos were examined in culture after 7 days of in vitro maintenance. Dopaminergic neurons were resolved by immunostaining for dopamine-beta-hydrolase (DBH) and were calculated using IBAS morphometric equipment. Cultures with added soluble L1-Fc were maintained on poly-DL-otnithine (PORN) and substrate coated L1-Fc were added on top of previously coated PORN (under the conditions described in Appel et al., J. Neuroscience 13: 4764-4775, 1993. NCAM-Fc was used as a control.

Tabuľka - Prežívanie 7 dní in vitro Table - Survival 7 days in vitro a rast neuritov neurónov DBH počas and neurite outgrowth of DBH neurons during počet neurónov number of neurons dĺžka neuritov~ neurite length ~ substrátovo natreté Ll substrate coated Ll 129±20 ± 20 129 179±40 179 ± 40 rozpustná Ll soluble L1 98± 7 98 ± 7 135+27 27 + 135 len PORN (kontrola) only PORN (control) 14+ 2 14+ 2 37+ 9 37+ 9 Stredné hodnoty sú z Mean values are z aspoň troch nezávislých experimentov at least three independent experiments

± SEM± SEM

Počty sú z jednotky poleCounts are from unit of array

Dĺžky všetkých neuritov (celková dĺžka neuritov) na 'jeden neurón boli stanovené (v pm)The lengths of all neurites (total neurite length) per 'neuron were determined (in pm)

- 67 11211 imunoglobulínov a bunkových molekuly sa zúčastňujú procesov (Edelman, 1970).67,112,111 immunoglobulins and cellular molecules are involved in the process (Edelman, 1970).

Rozpoznávanie medzi nervovými bunkami je dôležitá podmienka pre vývoj funkčnej nervovej sústavy. Rozpoznávacie molekuly sú exprimované na bunkovom povrchu, kde sprostredkovávajú interakcie medzi susediacimi bunkami, napr. sú to cadhedríny, alebo interakcie medzi bunkovým povrchom a extracelulárnym matrixom, napr. sú to integríny (Takeichi, 1991; Ruoslahti, 1988; Hynes, 1992). Najdôležitejšiu rodinu rozpoznávacích molekúl zastupujú imunoglobulínu (Ig) podobné domény. Ig podobné domény reflektujú spoločného predka adhéznych molekúl, obidve špecifických rozpoznávacíchRecognition between nerve cells is an important condition for the development of a functional nervous system. Recognizing molecules are expressed on the cell surface, where they mediate interactions between neighboring cells, e.g. they are cadhedrins, or interactions between cell surface and extracellular matrix, e.g. these are integrins (Takeichi, 1991; Ruoslahti, 1988; Hynes, 1992). The most important family of recognition molecules are immunoglobulin (Ig) -like domains. Ig-like domains reflect a common ancestor of adhesion molecules, both specific recognition patterns

V nervovej sústave obsahuje rodina Ig viac než 24 rôznych molekúl. Niektoré molekuly obsahujúce Ig podobné domény majú mnoho funkcií v extracelulárnej doméne: receptory pre cytokíny a neurotropíny majú vysoké afinitné funkcie rovnako ako rozpoznávacie vlastnosti (Tannahill et al., 1995; Fulido et al., 1992). Trojrozmerná štruktúra Ig podobných domén je podobná FN podobným opakovaniam (Main et al., 1992; Leathy et al., 1992), čo sú tiež štruktúrne motívy v niekoľkých molekulách extracelulárneho matrixu, ako je fibronektín, členovia tenascínovej rodiny a iné (Williams a Barclay, 1988; Barón et al., 1992; Erickson, 1993). Nervové rozpoznávacie molekuly rodiny Ig majú charakteristický časový, priestorový a bunkovo typový expresný profil (prehladné články, viď Edelman, 1988; Schachner, 1991; Rathjen a Josseli, 1991; Rutiehauser, 1993). Rozpoznávajúce molekuly tejto rodiny sa funkčne prekrývajú v tom, že všetky podporujú adhéziu buniek a rast neuritov. Niektoré rozpoznávajúce molekuly sú silne homofilické, t.j. navzájom sa viažúce, a naopak iné sú predovšetkým heterofilické, t.j. viažu sa na nerovnakých partnerov, ktorými sú často iní členovia rodiny Ig alebo molekuly extracelulárneho matrixu (Briimmendorf a Rathjen, 1993, 1994). Súčasná znalosť funkčných vlastností individuálnych Ig podobných domén a FN podobných opakovaní vervových rozpoznávacích molekúl ukazujeIn the nervous system, the Ig family contains more than 24 different molecules. Some molecules containing Ig-like domains have many functions in the extracellular domain: receptors for cytokines and neurotropins have high affinity functions as well as recognition properties (Tannahill et al., 1995; Fulido et al., 1992). The three-dimensional structure of Ig-like domains is similar to FN-like repeats (Main et al., 1992; Leathy et al., 1992), which are also structural motifs in several extracellular matrix molecules such as fibronectin, tenascin family members and others (Williams and Barclay , 1988; Baron et al., 1992; Erickson, 1993). Nerve recognition molecules of the Ig family have a characteristic temporal, spatial and cell type expression profile (for review articles, see Edelman, 1988; Schachner, 1991; Rathjen and Josseli, 1991; Rutiehauser, 1993). Recognizing molecules of this family functionally overlap in that they all promote cell adhesion and neurite outgrowth. Some recognition molecules are strongly homophilic, i. they bind to each other and, on the other hand, others are primarily heterophilic, i. they bind to unequal partners, often other members of the Ig family or extracellular matrix molecules (Briimmendorf and Rathjen, 1993, 1994). Current knowledge of the functional properties of individual Ig-like domains and FN-like repetitions of verve recognition molecules shows

11211 na rôzne a prekrývajúce sa funkčné vlastnosti pri rozpoznávaní, raste neuritov a odpudzovaní (Gennarini et al., 1991; Frel et al., 1992; Taylor et al., 1993; Appel et al., 1993, 1995; Pesheva et al., 1993; Feisenfeld et al., 1994; Hoim et al., 1995).11211 for various and overlapping functional properties in recognition, neurite outgrowth and repulsion (Gennarini et al., 1991; Frel et al., 1992; Taylor et al., 1993; Appel et al., 1993, 1995; Pesheva et al. (1993; Feisenfeld et al., 1994; Hoim et al., 1995).

Medzi nervovými rozpoznávacími molekulami rodiny Ig, rodiny molekúl podobných nervovej rozpoznávacej molekule Ll sa ukazuje veľká podobnosť vo funkcii a štruktúre. Sú to silné promotory rastu neuritov a sú primerane exprimované počas neskoršieho vývoja, najviac v dobe prvého výskytu axogenézy. Sú prednostne exprimované v neurónoch, aj keď niektorí členovia rodiny Ll sa tiež vyskytujú v gliových bunkách, ktoré sami o sebe sú podporné pre neurity (Martini a Schachner, 1986; Bixby et al., 1988; Seilheimer a Schachner, 1988).Among the neuronal recognition molecules of the Ig family, a family of molecules similar to the nerve recognition molecule L1, there is a great similarity in function and structure. They are potent neurite growth promoters and are adequately expressed during later development, at most at the time of the first occurrence of axogenesis. They are preferentially expressed in neurons, although some members of the L1 family also occur in glial cells that themselves support neurites (Martini and Schachner, 1986; Bixby et al., 1988; Seilheimer and Schachner, 1988).

V experimentoch, ktoré nasledujú, je identifikovaný a charakterizovaný iný člen rodiny Ll, ktorému je blízky homológ Ll, a to je CHL1. CHL1 obsahuje šesť Ig podobných domén a FN podobných opakovaní, z ktorých štyri sú vysoko homológne k FN podobným opakovaniam iných členov rodiny Ll. Neúplné FN podobné opakovaniam je umiestnené v oblasti ležiacej blízko membrány, čo je najviac variabilná oblasť medzi molekulami podobnými s Ll. Iné vlastnosti CHL1 zdieľané s členmi rodiny Ll sú: expresia v neskorom vývojom štádiu v nervovej sústave a vysoká miera N-glykozidácie, vrátane expresie karbohydrátu HNX-1.In the experiments that follow, another member of the L1 family that is close to the L1 homolog, i.e., CHL1, is identified and characterized. CHL1 contains six Ig-like domains and FN-like repeats, four of which are highly homologous to FN-like repeats of other L1 family members. Incomplete repeat-like FNs are located in a region lying close to the membrane, which is the most variable region between L1-like molecules. Other properties of CHL1 shared with members of the L1 family are: late-stage expression in the nervous system and a high degree of N-glycosidation, including HNX-1 carbohydrate expression.

Príklad 18Example 18

Myši ICR a krysy Wistar boli používané na tkanivové preparácieICR mice and Wistar rats were used for tissue preparations

Protilátkyantibody

Polyklonálne protilátky vyvolané proti rekombinantne exprimovanej extracelulárnej časti CHL1 (aminokyseliny 499 až 1063 (Obr. 18 a 19)) a Ll (aminokyseliny 126 až 1981Polyclonal antibodies raised against the recombinantly expressed extracellular portion of CHL1 (amino acids 499 to 1063 (Figures 18 and 19)) and L1 (amino acids 126 to 1981)

11211 (Appel et al., 1993)) boli vyvolané v králikoch, ako bolo opísané (Rathjen a Schachner, 1984). Za účelom vyvolania protilátok proti CHL1 bolo do králika injekované 200 pg purifikovaného peptidu a potom ešte 4 ďalšie injekcie po 100 pg v intervaloch troch týždňov. Protilátky proti Ll boli skoncentrované zo séra vyzrážaním amónium sulfátom (13,5 mg/ml). Monoklonálna krysia protilátka 412 bola použitá na identifikáciu karbohydrátového epitopu HNK-1 (Kruse et al., 1984). Honoklonálne protilátky proti gliovému fibrilárnemu kyslému proteínu (GFAP) boli získané od Boehringera (Mannheim). Monoklonálne protilátky proti antigénu 01 boli opísané (Sommer a Schachner, 1981).11211 (Appel et al., 1993)) were induced in rabbits as described (Rathjen and Schachner, 1984). In order to elicit antibodies against CHL1, 200 µg of purified peptide was injected into the rabbit, followed by 4 additional injections of 100 µg at three week intervals. Anti-L1 antibodies were concentrated from serum by ammonium sulfate precipitation (13.5 mg / ml). Monoclonal rat antibody 412 was used to identify the carbohydrate epitope of HNK-1 (Kruse et al., 1984). Honoclonal antibodies to glial fibrillar acidic protein (GFAP) were obtained from Boehringer (Mannheim). Monoclonal antibodies against antigen 01 have been described (Sommer and Schachner, 1981).

Purifikácia nervových adhéznych molekúlPurification of neural adhesion molecules

Ll, N-CAG a MAG boli imunoafinitne purifikované z detergentových extraktov hrubých bunkových frakcií z dospelého myšieho mozgu pomocou kolón s monoklonálnymi protilátkami (Rathjen a Schachner, 1984; Falssner et al., 1985; Poltorak et al., 1987).L1, N-CAG and MAG were immunoaffinity purified from adult mouse brain gross cell fraction detergent extracts using monoclonal antibody columns (Rathjen and Schachner, 1984; Falssner et al., 1985; Poltorak et al., 1987).

Knižnice cDNA a ich testovanieCDNA libraries and their testing

Preparácia knižnice lambda gtll odvodenej z poly(A)*Preparation of poly (A) lambda gtll library *

RNA z mozgu z 8 dní starých myší a testovanie tejto knižnice imunoafinitne purifikovanými polyklonálnymi protilátkami proti Ll boli vykonané podľa (Tácke et al., 1987). Za účelom získania ďalších klonov cDNA bola vytvorená nová knižnica DNA: RNA bola purifikovaná z mozgov 6 až 14 dní starých myší spôsobom cez guanídium tiocyanát/kyslý fenol (Chomezynski a Sacchi, 1987). Poly(A)* RNA bola obohatená cez dve po sebe nasledujúce pasáže cez kolónu s oligo(dT) celulózou (Sambrook et al., 1989). 8 pg poly(A)* RNA bolo použité na syntézu oligo(dT) primérovanej dvojvláknovej cDNA pomocou súpravy na syntézu cDNA (Amersham). cDNA bola vybratá podľa veľkosti a bola ligovaná do plazmidu pXNDl s adaptormi DralII obsahujúcimi miesto Sali (Kluxen et al., 1992). Za účelom propagácie a amplifikácie knižnice bol použitý kmeňBrain RNA from 8 day old mice and testing this library with immunoaffinity purified polyclonal anti-L1 antibodies were performed according to (Tácke et al., 1987). To obtain additional cDNA clones, a new DNA library was generated: RNA was purified from the brains of 6-14 day old mice by guanidium thiocyanate / acid phenol (Chomezynski and Sacchi, 1987). Poly (A) * RNA was enriched through two consecutive passages through an oligo (dT) cellulose column (Sambrook et al., 1989). 8 µg of poly (A) * RNA was used to synthesize oligo (dT) primed double stranded cDNA using a cDNA synthesis kit (Amersham). The cDNA was selected by size and ligated into plasmid pXND1 with DraIII adapters containing a SalI site (Kluxen et al., 1992). A strain was used to propagate and amplify the library

1121111211

E. coli TOP10 (Invitrogen, Holandsko). Pri testovaní boli alikvóty priamo nanesené na nylonové membrány (BIODYNE™ Pall) s hustotou 2xl0⁴ baktérií na filter (138 cm²). Replikované filtre boli inkubované cez noc pri 37’C. Potom boli baktérie lyzované (0,5M NaOH; 1,5M NaCl), filtre boli neutrál izované (3M NaCl; 0,5M Tris-HCl pH 8,0), premyté v 2xSSC, vysušené a zapekané 2 hod. pri 80°C. Silonové membrány boli prehybridizované, potom bybridizované s fragmentom dlhým 1 kb (HincII/KpnI) z CHL1 (odvodené z knižnice lambda gtll), boli rádioaktívne označené náhodným primérovaním (Boehringer Nannheim) podľa pokynov výrobcu, premyté za silne stringentných podmienok pri 42°C a potom exponované na film, ako bolo opísané (Sambrook et al., 1989). Šesť pozitívnych klonov bolo ďalej charakterizovaných reštrikčným mapovaním a sekvencovaním podľa štandardných protokolov (Sambrook et al., 1989). Jeden kloň (pX#2), ktorý obsahoval inzert CHL1 dlhý 4,43 kb, bol ďalej charakterizovaný.E. coli TOP10 (Invitrogen, The Netherlands). For testing, aliquots were directly applied to nylon membranes (BIODYNE ™ Pall) with a density of 2x10 ⁴ bacteria per filter (138 cm ² ). Replicated filters were incubated overnight at 37 ° C. Then the bacteria were lysed (0.5M NaOH; 1.5M NaCl), the filters were neutralized (3M NaCl; 0.5M Tris-HCl pH 8.0), washed in 2xSSC, dried and baked for 2 hours. at 80 ° C. The nylon membranes were prehybridized, then hybridized with a 1 kb fragment (HincII / KpnI) from CHL1 (derived from the lambda gt11 library), were radioactively labeled by random primer (Boehringer Nannheim) according to the manufacturer's instructions, washed under strongly stringent conditions at 42 ° C and then exposed to film as described (Sambrook et al., 1989). Six positive clones were further characterized by restriction mapping and sequencing according to standard protocols (Sambrook et al., 1989). One clone (pX # 2), which contained a 4.43 kb CHL1 insert, was further characterized.

Sekvencovanie DNA a sekvenčná analýzaDNA sequencing and sequence analysis

Nukleotidové sekvencie boli určené reťazovou terminačnou metódou dideoxy (Sanger et al., 1977) pomocou dvojvláknovej DNA ako predlohy pre T7 DNA polymerázu (Pharmacia) a syntetických oligonukleotidov ako primérov. Sekvencia cDNA boli zostavené a analyzované programom DNASTAR (DNASTAR, Inc., Londýn). Pokiaľ nie je uvedené inak, boli aminokyselinové sekvencie porovnané pomocou Jolun Heinovej metódy (Heín, 1990) (veľkosť medzier = 11, dĺžka medzier = 5, hodnota K = 2).Nucleotide sequences were determined by the dideoxy chain termination method (Sanger et al., 1977) using double stranded DNA as a template for T7 DNA polymerase (Pharmacia) and synthetic oligonucleotides as primers. The cDNA sequences were assembled and analyzed by the DNASTAR program (DNASTAR, Inc., London). Unless otherwise indicated, amino acid sequences were compared using the Jolun Hein method (Hein, 1990) (gap size = 11, gap length = 5, K = 2).

Porovnanie proteínových sekvenciíProtein sequence comparison

Kvôli výpočtu indexu podobnosti (%) na porovnanie vzdialeností medzi konzervovanými aminokyselinovými zvyškami bolo niekoľko rozdielnych proteínov obsahujúcich šesť Ig podobných domén a aspoň 4 FN podobné domény porovnané v konzervovaných aminokyselinových zvyškoch v Ig podobnýchTo calculate the similarity index (%) to compare distances between conserved amino acid residues, several different proteins containing six Ig-like domains and at least 4 FN-like domains were compared in conserved amino acid residues in Ig-like residues.

11211 doménach (cysteíny, kde sú mostíky S-S) a v FN podobných opakovaniach (tryptofán a tyrozín/fenylalanín). Počet aminokyselinových zvyškov medzi týmito konzervovanými miestami bol určený. Tento počet je uvedený ako konzervovaná vzdialenosť. Priemerná hodnota vzdialenosti, t.j. konsezné vzdialenosti a štandardné odchýlky (SD) medzi členmi rodiny L1 bola vypočítaná. Hodnota SD bola zaokrúhlená na najbližšie vyššie celé číslo. Vzdialenosť pre každý proteín bola porovnaná s priemernou vzdialenosťou a považovaná za zhodnú, pokiaľ sa hodnota vzdialenosti rovnala priemernej hodnote ± SD (=konsenzná vzdialenosť). Počet zhôd až do 18 konsenzných vzdialeností bol vypočítaný pre každý individuálny proteín (index podobnosti = počet zhôd / 19 x 100). Napríklad: V proteíne CHL1 sa zhoduje 16 hodnôt vzdialenosti aj keď tri zo všetkých kritérií sa nezhodujú. To dáva index podobnosti 16 - 19 alebo 84% pre CHL1.11211 domains (cysteines with bridges S-S) and FN-like repeats (tryptophan and tyrosine / phenylalanine). The number of amino acid residues between these conserved sites was determined. This number is given as the preserved distance. The average distance value, i. the consecutive distances and standard deviations (SD) between L1 family members were calculated. SD has been rounded to the next higher integer. The distance for each protein was compared to the average distance and considered equal if the distance value was equal to the mean ± SD (= consensus distance). The number of matches up to 18 consensus distances was calculated for each individual protein (similarity index = number of matches / 19 x 100). For example: In the CHL1 protein, 16 distance values match, although three of all criteria do not match. This gives a similarity index of 16-19 or 84% for CHL1.

Príklad 19Example 19

Bunková kultúra a expresia CHLI a L1 v bunkách COS-1Cell culture and expression of CHLI and L1 in COS-1 cells

Inzert klonu pX#2 dlhý 4,43 kb bol ligovaný do pXKDl štiepeného Sali (Kluxen et al., 1992; Kluxen a Lobbert,The 4.43 kb long pX # 2 insert was ligated into SalI-digested pXKD1 (Kluxen et al., 1992; Kluxen and Lobbert,

1993). Subfragment EcoRI (plazmid polylinker)/PvulI pb 4048) myší cDNA L1 (Noos et al. , 1968) bol ošetrený T4 DNA polymerázou a ligovaný do pXMDl.1993). EcoRI (plasmid polylinker) / PvulI pb 4048) mouse L1 cDNA (Noos et al., 1968) was treated with T4 DNA polymerase and ligated into pXMD1.

Bunky COS-1 udržiavané v DNEN (0,1% glukóza) a doplnené 10% (v/v) fetálnym teľacím sérom pri 37°C vo zvlhčenej atmosfére s 5% CO2. DEAE dextránom sprostredkovaná transfekcia DNA bola vykonaná, ako bolo opísané (Kluxen et al., 1992) s niektorými modifikáciami. Krátko, bunky boli stočené na hustotu 10000 buniek na cm². 0 jeden deň neskôr, po dvoch premytiach s DMEN (0,45% glukóza), holo médium nahradené transfekčným roztokom zloženým z DMEM doplneným 10% (v/v) Nu-sérom (Becton Dickinson, Švajčiarsko),COS-1 cells maintained in DNEN (0.1% glucose) and supplemented with 10% (v / v) fetal calf serum at 37 ° C in a humidified atmosphere of 5% CO 2. DEAE dextran mediated transfection of DNA was performed as described (Kluxen et al., 1992) with some modifications. Briefly, cells were spun to a density of 10,000 cells per cm ² . 0 one day later, after two washes with DMEN (0.45% glucose), holo medium replaced with a transfection solution composed of DMEM supplemented with 10% (v / v) Nu-serum (Becton Dickinson, Switzerland),

0,4 mg/ml (w/v) DEAE-dextránom (Pharmacia), 50 μΗ0.4 mg / ml (w / v) with DEAE-dextran (Pharmacia), 50 μΗ

11211 chlóroquinónom a 1,25 pd/ml DNA (w/v) (4 ml na misku s priemerom 10 cm). Bunky boli inkubované 4 hod. pri 37°C a v 5% CO2. Potom bolo médium odstránené a bunky boli inkubované 2 min. vo fosfonátovom pufri (pS 7,3, obsahujúcom 10% dimetylsulfoxid (v/v)). Po dvoch premytiach s DMEM (0,45% glukóza) bol pridaný DMEM doplnený 10% (v/v) fetálnym teľacím sérom a 20 yg/ml gentamycínu a bunky boli inkubované v tomto médiu. 0 24 hodín neskôr boli bunky oddelené od steny po inkubácii s 0,01% trypsínom a 0,0004% EDTA v Eanksovom rovnovážnom soľnom roztoku (HBSS) počas doby 5 min. a pri 37°C., boli znovu rozotreté kvôli imunochémii pri hustote 20000 buniek na cm² v 24 komôrkových miskách (falkon) obsahujúcich poly-L-lyzínom natreté sklenené otvory (11 mm v priemere) a boli inkubované ďalších 24 hodín. Pre analýzu Western blot boli bunky znovu rozotreté na misky s tkanivovou kultúrou a inkubované ďalších 48 hod.11211 chloroquinone and 1.25 pd / ml DNA (w / v) (4 ml per 10 cm dish). The cells were incubated for 4 hours. at 37 ° C and 5% CO2. The medium was then removed and the cells were incubated for 2 min. in phosphonate buffer (pS 7.3, containing 10% dimethylsulfoxide (v / v)). After two washes with DMEM (0.45% glucose), DMEM supplemented with 10% (v / v) fetal calf serum and 20 µg / ml gentamycin was added and the cells were incubated in this medium. 24 hours later, cells were detached from the wall after incubation with 0.01% trypsin and 0.0004% EDTA in Eanks Equilibrium Saline (HBSS) for 5 min. and at 37 ° C, they were re-spread for immunochemistry at a density of 20,000 cells per cm ² in 24-well plates (falcon) containing poly-L-lysine-coated glass holes (11 mm in diameter) and incubated for an additional 24 hours. For Western blot analysis, cells were re-plated on tissue culture dishes and incubated for an additional 48 hours.

Bunky PC12 boli udržiavané v DMEM doplneným 10% (v/v) fetálnym teľacím sérom a 5% (v/v) konským sérom na kolagénom potiahnutých miskách pre tkanivové kultúry. Pre indukciu buniek s nervovým rastovým hormónom (NGF) bolo médium odstránené z jednovrstvy pri 50% zhlukovaní a nahradené séra (5% konské sérum) doplneným Švajčiarsko). Po dvoch dfioch inkubácie boli bunky oddelené od steny po inkubácii s 0,01% trypsínom a 0,04% EDTA, boli stočené a podrobené extrakcii RNA.PC12 cells were maintained in DMEM supplemented with 10% (v / v) fetal calf serum and 5% (v / v) horse serum on collagen coated tissue culture dishes. To induce nerve growth hormone (NGF) cells, the medium was removed from the monolayer at 50% confluency and replaced with sera (5% horse serum) supplemented with Switzerland). After two days of incubation, cells were detached from the wall after incubation with 0.01% trypsin and 0.04% EDTA, centrifuged, and subjected to RNA extraction.

médiom so zníženým obsahom 100 ng/ml 7s-NGF (Sigma,100 ng / ml 7s-NGF (Sigma,

Primárne kultúry astrocytov boli pripravené podľa McCartby a De Vellis (1980) s modifikáciami (Guénard et al., 1994) a použité na imunologické farbenie po jednom až dvoch dňoch in vitro. Primárne kultúry oligodendrocytov boli pripravené, ako bolo opísané v Laeng et al., (1994) a udržiavané in vitro počas doby 12 dní.Primary astrocyte cultures were prepared according to McCartby and De Vellis (1980) with modifications (Guénard et al., 1994) and used for immunostaining after one to two days in vitro. Primary oligodendrocyte cultures were prepared as described in Laeng et al. (1994) and maintained in vitro for 12 days.

1121111211

Príklad 20Example 20

Výroba protizmyslovej RNAProduction of antisense RNA

Inzert klonu pX#2 dlhý 4,43 kb bol ligovaný do pBS II SK štiepeného Sali (Stratagene) a potom sa vystrihol fragment Apal (vektor)/AvrII (pb3330 (Obr. 18)) za účelom získania fragmentu cDNA CHL1 kódujúceho extracelulárnu časť proteínu (viď Obr. 18 a 19). Podobná konštrukcia pre L1 bola pripravená ligáciou fragmentu EcoNI (plazmid polylinker)/EcoRI (pb 3304) cDNA L1 (Moos et al., 1988) ošetreného T4 DNA polymerázou a ligovaného do pBS II SK-štiepeného Smal. Plazmidy boli Štiepené Xbal a použité na syntézu protizmyslovéj RNA označenej ³²P pomocou T7 RNA polymerázy, ako bolo opísané (Melton et al., 1984).The 4.43 kb long pX # 2 insert was ligated into SalI-digested pBS II SK (Stratagene), and then the Apal (vector) / AvrII fragment (pb3330 (Fig. 18)) was cut to obtain a CHL1 cDNA fragment encoding the extracellular portion of the protein. (see Figures 18 and 19). A similar construct for L1 was prepared by ligating an EcoNI (plasmid polylinker) / EcoRI (pb3304) fragment of L1 cDNA (Moos et al., 1988) treated with T4 DNA polymerase and ligated into pBS II SK-digested SmaI. The plasmids were digested with XbaI and used to synthesize ³² P-labeled antisense RNA using T7 RNA polymerase as described (Melton et al., 1984).

Analýza Nothern blotNorthern blot analysis

Poly(Ä)* mRNA bola pripravená z rôznych tkanív práve narodených a 9 dní starých myši pomocou súpravy Oligotex™ Direct mRNA (QIAGEN Inc., Diisseldorf, Nemecko) podlá pokynov výrobcu. Poly(A)* mRNA a značka RNA (rebrík RNA, GIBCO/BRL) bola podrobená elektroforéze na 0,8% formadid/agarózovom géli a potom bola prenesená na membránu Hybond-N (Amersham) pomocou kapilárneho prenosu (Southern, 1975) v 20xSSC. PoPoly ()) * mRNA was prepared from various tissues of just born and 9 day old mice using the Oligotex ™ Direct mRNA kit (QIAGEN Inc., Diisseldorf, Germany) according to the manufacturer's instructions. Poly (A) * mRNA and RNA tag (RNA ladder, GIBCO / BRL) was electrophoresed on a 0.8% formadide / agarose gel and then transferred to a Hybond-N membrane (Amersham) by capillary transfer (Southern, 1975) in 20xSSC. After

UV (OV-Stratalinker” 1800, bolo množstvo DNA prenesené skontrolované farbením metylénovouUV (OV-Stratalinker) 1800, the amount of DNA transferred was checked by methylene staining

1989). Po prehybridizácii 2 hod.1989). After prehybridization 2 hr.

väzbovom spojení pomocou Stratagene, La Jolla, CA), a naviazané na membránu modrou (Sambrook et al.by Stratagene, La Jolla, CA), and membrane bound blue (Sambrook et al.

pri 65’C bola membrána hybridizovaná cez noc s CHL1 a L1 špecifickými ³²P označenými protizmyslovými próbami RNA v hybridizačnom pufri (5xSSC, 2,5x Denhartov roztok, 50 mM NazPOz (pH 6,5), 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 2 yg/ml DNA z lososieho mlieka, 50% formamid) pri 65°C. Filter bol potom 3 krát premytý pri 65°C v 0,lx SSC, 0,1% SDS počas doby hod. a bol exponovaný na film.at 65 ° C, the membrane was hybridized overnight with CHL1 and L1 specific ³² P labeled antisense RNA probes in hybridization buffer (5xSSC, 2.5x Denhart's solution, 50 mM Na 2 PO 2 (pH 6.5), 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 2 µg / ml salmon milk DNA, 50% formamide) at 65 ° C. The filter was then washed 3 times at 65 ° C in 0.1x SSC, 0.1% SDS for hours. and was exposed to film.

- 74 11211- 74 11211

Príklad 21Example 21

Expresia a purifikácia rekombinantného proteínu CHL1 v E. coli cDNA-fragment CHL1 dlhý 1,7 kh (MscI; pb 1791 (ktorý pochádza z klonovacieho miesta vektoru a 5'konca klonu CHL1 odvodeného z lambda gtll) a BsmAI; ph 3494) kódujúci šiestou Ig podobnú doménu (Ig VI) a FN podobné opakovania 1, 4, 5 (viď Obr. 18 a 19b) bol subklonovaný do unikátneho reštrikčného miesta BamHI vektora pET (Studier a Moffatt, 1986). Správna sekvencia plazmidu bola potvrdená sekvencovaním. Kmeň E. coli BL21 (DE3) bol transformovaný týmto plazmidom. Expresia a purifikácia rekombinantného proteínu cez iónovo výmennú chromatografiu bola vykonaná podlá Appel et al. (1993). SDS-PAGE a farbenie Coomassie ukázalo hlavný prúžok s predpokladanou molekulovou hmotnosťou (70 kD), ktorý obsahoval aspoň 80% celkového proteínu (nie je ukázané).Expression and purification of recombinant CHL1 protein in E. coli 1.7 kh long CH1 cDNA fragment (MscI; pb 1791 (which originates from the vector cloning site and the 5 'end of the lambda gt11 derived clone CHL1) and BsmAI; ph 3494) encoding the sixth The Ig-like domain (Ig VI) and FN-like repeats 1, 4, 5 (see Figures 18 and 19b) were subcloned into the unique BamHI restriction site of the pET vector (Studier and Moffatt, 1986). The correct plasmid sequence was confirmed by sequencing. The E. coli strain BL21 (DE3) was transformed with this plasmid. Expression and purification of the recombinant protein by ion exchange chromatography was performed according to Appel et al. (1993). SDS-PAGE and Coomassie staining showed a major band of predicted molecular weight (70 kD) that contained at least 80% total protein (not shown).

Tkanivové frakcieTissue fractions

Detergentové lyzáty celého tkaniva boli pripravené homogenizáciou tkaniva v 40 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1% Triton X100 a boli udržiavané v 4’C počas 3 hodín za neustáleho miešania. Rozpustná frakcia bola oddelená od nerozpustného materiálu centrifugáciou pri 100 000 g.Whole tissue detergent lysates were prepared by homogenizing the tissue in 40 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1% Triton X100 and were maintained in the 4 ' C for 3 hours with stirring. The soluble fraction was separated from the insoluble material by centrifugation at 100,000 g.

Za účelom prípravy detergentových lyzátov membránových frakcií boli tkanivá homogenizované v l mM NaHC02 (pH 7,9, 0,2 mM MgCl2, 1 mM spermidín, 5 pg/ml aprotonín, 10 pg/ml trypsínový inhibítor zo sójových bôbov, 1 mM PMSF a 0,5 mM jódoacetamid pri 4°C. Membránové a rozpustné frakcie boli potom oddelené a membránový sediment bol rozsuspendovaný v solubilizačnom roztoku (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 0,15 MTo prepare detergent lysates of membrane fractions, tissues were homogenized in 1 mM NaHCO 2 (pH 7.9, 0.2 mM MgCl 2, 1 mM spermidine, 5 µg / ml aprotonin, 10 µg / ml soybean trypsin inhibitor, 1 mM PMSF and 0 mM). 5 mM iodoacetamide at 4 ° C. Membrane and soluble fractions were then separated and the membrane sediment was suspended in solubilization solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 0.15 M).

NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X100, 5 pm/ml aprotonín, 10 ug/ml trypsínový inhibítor zo sójových bôbov, mM PMSF a 0,5 mM jódoacetamid).NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.5% Triton X100, 5 µm / ml aprotonin, 10 µg / ml trypsin inhibitor from soybeans, mM PMSF and 0.5 mM iodoacetamide).

1121111211

Tranzientne transfekované bunky COS-1 boli dvakrát premyté s HBSS a inkubované v 1 mM EDTÄ v HBSS počas doby 10 minút pri 37^eC. Bunky boli potom odstránené pomocou opálenej Pasteurovej pipety a stočené centrifugáciou pri 200 g 10 min. pri 4*C. Bunky boli lyzované v 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTÄ, 1 mM EGTÄ, 1 mM jódoacetamid, 1 mM PMSF a 1% MP-40 a supernatant bol prečistený centrifugáciou (13000 g). Určenie proteínov bolo vykonané ako je opísané v Bradford (1976).Transiently transfected COS-1 cells were washed twice with HBSS and incubated in 1 mM EDTA in HBSS for 10 minutes at 37 ^e C. The cells were removed by Pasteur pipette and tan centrifuged by centrifugation at 200 g for 10 minutes. at 4 ° C. Cells were lysed in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM iodoacetamide, 1 mM PMSF and 1% MP-40, and the supernatant was clarified by centrifugation (13000 g) . Protein determination was performed as described in Bradford (1976).

Analýza Western blotWestern blot analysis

Proteíny boli oddelené pomocou SDS-PAGE (Laemmil, 1970) na 8% alebo 10% plochých géloch za redukčných podmienok a prenesené na nitrocelulózové filtre (0,45 um, BA 85; Schleicher & Schuell, Dassel, Nemecko) kvôli imunodetekcii podľa Faissner et al., (1985) pomocou antiséra CHL1 (nariedené 1:500, 1:10000 pre ECL), polyklonálne protilátky proti Ll (nariedené 1:1000, 1:15000 pre ECL), monoklonálne protilátky 412 (nariedené 1:1000, 1:10000 pre ECL) a alkalické s fosfatázou spojené sekundárne protikrysie a protikráličie IgG. Naviazané protilátky boli detekované buď zosilnenou chemiluminiscenciou (ECL) podľa pokynov výrobcu pomocou blotovacích detekčných činidiel (Amersham) a filmov alebo pomocou BCIP a NBT ako chromogénnych substrátov.Proteins were separated by SDS-PAGE (Laemmil, 1970) on 8% or 10% flat gels under reducing conditions and transferred to nitrocellulose filters (0.45 µm, BA 85; Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) for immunodetection by Faissner et al. al., (1985) using antisera CHL1 (diluted 1: 500, 1: 10000 for ECL), polyclonal anti-L1 antibodies (diluted 1: 1000, 1: 15000 for ECL), monoclonal antibodies 412 (diluted 1: 1000, 1: 10000 for ECL) and alkaline phosphatase-linked secondary anti-rats and anti-rabbit IgGs. Bound antibodies were detected either by enhanced chemiluminescence (ECL) according to the manufacturer's instructions using blotting detection reagents (Amersham) and films, or by using BCIP and NBT as chromogenic substrates.

Príklad 22Example 22

Enzýmová spojovacia imunosorbentná skúškaEnzyme-linked immunosorbent assay

Enzýmová spojovacia imunosorbentná skúška (ELISA) bola vykonaná ako bolo opísané v Husmann et al., (1992) s tou výnimkou, že proteíny boli natreté v koncentráciách 100 ng/ml. Antisérum CHL1 bolo použité v niekoľkých zriedeniach medzi 1:250 a 1:2x10®.An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed as described by Husmann et al., (1992) except that the proteins were coated at concentrations of 100 ng / ml. CHL1 antiserum was used in several dilutions between 1: 250 and 1: 2x10®.

- 76 11211- 76 11211

Deglykozilácia CHL1Deglycosylation of CHL1

Detergentové lyzáty homogenátu (200 μΐ, s proteínovou koncentráciou starých myší boli oddelené na a nerozpustný materiál centrifugáciou mozgového tkaniva 6 mg/ml) zo 7 dní rozpustnú frakciu (viď Tkanivové frakcie) a boli inkubované s 0,5 jednotkami N-glykozidázy F alebo 2,5 jednotkami O-glykozidázy alebo s obidvoma enzýmami v rovnakých koncentráciách podľa pokynov výrobcu (Boehringer Mannheim, Nemecko). Lyzáty boli rozdelené na 10% géloch SDS-PAGE. Proteíny boli prenesené na nitrocelulózu a boli inkubované s antisérom CHL1 (1:500 nariedené) vyvolaným proti rekombinantnému fragmentu proteínu CHL1 (viď Obr. 18).Detergent lysates of homogenate (200 μΐ, protein concentration of old mice were separated into and insoluble material by centrifugation of brain tissue 6 mg / ml) from a 7 day soluble fraction (see Tissue Fractions) and were incubated with 0.5 units of N-glycosidase F or 2 , 5 units of O-glycosidase or with both enzymes at the same concentrations according to the manufacturer's instructions (Boehringer Mannheim, Germany). Lysates were run on 10% SDS-PAGE gels. The proteins were transferred to nitrocellulose and incubated with CHL1 antisera (1: 500 diluted) raised against the recombinant fragment of the CHL1 protein (see Fig. 18).

ImunoprecipitáclaImmunoprecipitation

Rozpustná frakcia detergentových lyzátov homogenátu z mozgových tkanív (s proteínovou koncentráciou 300 mg/ml) z 9 dní starých myší (viď Tkanivové frakcie) bola inkubovaná s 10 μΐ antiséra CHL1 alebo s polyklonálnymi protilátkami proti Ll cez noc pri 5°C v 5 ml pufra (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) obsahujúcim 1% NP40 a 30 μΐ G-Sefarózy (Pharmacia/LKB). Po postupnom premytí v pufroch obsahujúcich 0,1% NP40, 0,05% SDS a potom 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) boli guľôčky Sefarózy povarené na 10 min. v 5x koncentrovanom nanášacom pufri (250 mM Tris-HCl (pH 6,6), 10% SDS, 50% glycerolu, 0,5% brómfenolová modrá, 25% B-merkaptoetanol) a supernatant bol rozdelený na 10% géloch SDS-PAGE. Proteíny boli prenesené na nitrocelulózu a detekované polyklonálnymi protilátkami proti Ll, antisérom CHL1 alebo monoklonálnou protilátkou 412 pomocou analýzy Western blot.Soluble brain tissue homogenate detergent lysate fraction (300 mg / ml protein concentration) from 9 day old mice (see Tissue Fractions) was incubated with 10 μΐ of CHL1 antisera or polyclonal anti-L1 antibodies overnight at 5 ° C in 5 ml buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) containing 1% NP40 and 30 μΐ G-Sepharose (Pharmacia / LKB). After sequential washing in buffers containing 0.1% NP40, 0.05% SDS and then 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), Sepharose beads were boiled for 10 min. in 5x concentrated loading buffer (250 mM Tris-HCl (pH 6.6), 10% SDS, 50% glycerol, 0.5% bromophenol blue, 25% B-mercaptoethanol) and the supernatant was resolved on 10% SDS-PAGE gels . Proteins were transferred to nitrocellulose and detected by polyclonal anti-L1 antibodies, CHL1 antisera or monoclonal antibody 412 by Western blot analysis.

Nepriama imunofluorescenciaIndirect immunofluorescence

Za účelom sfarbenia bunkového a Schachner, 1981) boli bunky COS-1 povrchu (Schnitzer transfekované CHL1 a slepo (len vektor) nanesené do komôrok a inkubovanéFor staining of cell and Schachner, 1981), COS-1 surface cells (Schnitzer transfected with CHL1 and blind (vector only) were plated and incubated

11211 min. pri izbovej teplote spoločne s primárnymi protilátkami (antisérum CHL1 (nariedené 1:100) alebo polyklonálnymi protilátkami proti Ll (nariedenými 1:200)) v DMEM obsahujúcom 10% fetálne teľacie sérum, 10 mM HEPES (pH 7,3) a 0,02% NaN3 a potom so sekundárnymi protilátkami. Po imunologickom farbení holi bunky fixované 4% paraformaldehydom vo fosfátovom pufri (pH 7,3) a boli ponechané v Moviolu (Hoechst) obsahujúcom 2,5% jodid draselný. Pre dvojité imunofluorescenčné farbenie astrocytov a oligodendrocytov bola vykonaná inkubácia primárnych protilátok s povrchovými bunkovými antigénmi ako bolo opísané pre transfekované bunky COS-1. Potom bola vykonaná inkubácia buniek s primárnymi protilátkami proti medzibunkovým antigénom po permeabilizácii buniek metanolom pri -20*C.11211 min. at room temperature together with primary antibodies (CHL1 antiserum (diluted 1: 100) or polyclonal anti-L1 antibodies (diluted 1: 200)) in DMEM containing 10% fetal calf serum, 10 mM HEPES (pH 7.3) and 0.02 % NaN3 and then with secondary antibodies. After immunostaining, the holi cells were fixed with 4% paraformaldehyde in phosphate buffer (pH 7.3) and were left in Moviol (Hoechst) containing 2.5% potassium iodide. For double immunofluorescent staining of astrocytes and oligodendrocytes, incubation of primary antibodies with surface cell antigens was performed as described for transfected COS-1 cells. The cells were then incubated with primary antibodies against intracellular antigens after permeabilization of the cells with methanol at -20 ° C.

Príklad 23Example 23

Hybridizácia in situIn situ hybridization

Za účelom vytvorenia protizmyslových prób cRNA označených digoxigenžnom s rovnakou veľkosťou z príslušných častí CHL1 a Ll boli použité rovnaké konštrukcie ako pre analýzu Northern blot. Zmyslové próby boli vytvorené z podobných konštrukcií s inzertami v opačnej orientácii. Všetky próby cRNA boli vytvorené pomocou T7 RNÄ polymerázy nasledované alkalickým pôsobením kvôli získaniu priemernej dĺžky fragmentov 250 nukleotidov. Hybridizácia in situ bola vykonaná ako bolo opísané (Bartsch et al., 1992; Dorries et al., 1994).The same constructs as for Northern blot analysis were used to generate antisense probes of cDNA tagged with the same size from the respective portions of CHL1 and L1. The sensory probes were formed from similar constructions with inserts in the opposite orientation. All cRNA probes were generated by T7 RNA polymerase followed by alkaline treatment to obtain an average fragment length of 250 nucleotides. In situ hybridization was performed as described (Bartsch et al., 1992; Dorries et al., 1994).

Výsledky a diskusiaResults and discussion

Identifikácia cDNA CHL1Identification of CHL1 cDNA

Testovanie expresnej knižnice lambda gtll na klony cDNA kódujúce bunkovú adhéznu molekulu Ll cez polyklonálne protilátky vyvolané proti imunopurifikovanej Ll z mozguTesting of lambda gt11 expression library for cDNA clones encoding L1 cell adhesion molecule via polyclonal antibodies raised against immunopurified L1 from brain

11211 (Tácke et al., 1987) identifikovalo kloň 311. Tento kloň obsahoval neúplnú cDNA homológnu k Ll (34,1* podľa Lipman a Pearson (1985)) a otvorený čítací rámec dlhý 2112 párov báz (pb) kódujúci 704 aminokyselín vrátane cytoplazmovej časti. Kvôli izolácii klonov cDNA s úplnou dĺžkou bol použitý fragment DNA tohoto klonu na testovanie inej knižnice cDNA. Bolo izolovaných šesť nezávislých klonov. Dva klony obsahovali inzerty dlhé 4,2 a 4,4 kb, ktoré obsahovali úplnú kódujúcu oblasť blízkeho homológu Ll (CHL1). Kloň obsahujúci inzert dlhý 4,4 kb bol ďalej skúmaný.11211 (Tecky et al., 1987) identified clone 311. This clone contained an incomplete L1 homologous cDNA (34.1 * according to Lipman and Pearson (1985)) and an 2112 base pair (pb) open reading frame encoding 704 amino acids including the cytoplasmic section. To isolate full-length cDNA clones, the DNA fragment of this clone was used to test another cDNA library. Six independent clones were isolated. The two clones contained 4.2 and 4.4 kb inserts that contained the complete coding region of the close L1 homolog (CHL1). The clone containing the 4.4 kb insert was further investigated.

DNA a odvodené aminokyselinové sekvencie a štruktúrne vlastnostiDNA and deduced amino acid sequences and structural properties

Inzert, ktorý je dlhý 4,4 kb, kóduje 5*netransplantovanú oblasť dlhú 295 pb, otvorený čítací rámec dlhý 3627 pb a 3'netransplantovanú oblasť dlhú 518 pb (Obr. 18). Aj keď je na 3'konci úsek oligo(A), jasný konsezný polyadenylačný signál chýba. Sekvencia okolo štartovacieho kodónu ATG (pozícia 296, Obr. 18) nemá optimálnu konsenznú sekvenciu pre inicializáciu translácie (Kozák, 1987). Ale tento kodón ATG je vzatý ako štartovací kodón pre transláciu na základe dvoch dôkazov. Proti smeru translácie je predchádzaný terminačnými kodónmi vo všetkých troch čítacích rámcoch a po fiom nasleduje potenciálna signálna sekvencia s miestom štiepenia predpokladaným po zvyškoch 24 alebo 25 (hodnoty 8,65 a 6,40 podľa algoritmu von Heijne (1986)) (Obr. 18).The insert, which is 4.4 kb long, encodes a 5 * untransplanted region of 295 bp, an open reading frame of 3627 bp, and a 3 'untransplanted region of 518 bp (Fig. 18). Although there is an oligo (A) region at the 3 'end, a clear consensus polyadenylation signal is missing. The sequence around the ATG start codon (position 296, Fig. 18) does not have an optimal consensus sequence for translation initiation (Kozák, 1987). However, this ATG codon is taken as a two-proof translation start codon. The translational direction is preceded by stop codons in all three reading frames, followed by a fusion signal sequence with a cleavage site predicted of residues 24 or 25 (values 8.65 and 6.40 according to von Heijne algorithm (1986)) (Fig. 18) .

Translácia otvoreného čítacieho rámca dáva proteín s dĺžkou 1209 aminokyselín s vypočítanou molekulovou hmotnosťou 134,9 kD a profil charakteristický pre integrálny membránový glykoproteín. Pravdepodobná extracelulárna doména je zložená z 1081 aminokyselín s 18 potenciálnymi miestami pre N-glykozidáciu (Obr. 18 a 19a) a viac než 60 O-glykozilačných konsenzných miest (nie je ukázané) (Pisano et al·., 1993), po nej nasleduje ťransmembránová doména dlhá 23 aminokyselín, ako je usudzované z hydropatickej analýzyTranslation of the open reading frame yields a protein of 1209 amino acids with a calculated molecular weight of 134.9 kD and a profile characteristic of an integral membrane glycoprotein. The likely extracellular domain is composed of 1081 amino acids with 18 potential N-glycosidation sites (Figs. 18 and 19a) and more than 60 O-glycosylation consensus sites (not shown) (Pisano et al., 1993), followed by a 23 amino acid long transmembrane domain as judged by hydropathic analysis

11211 podľa Kyte a Doolittle (1982) (Obr. 19c). Táto doména je na svojom N-terminálnom konci ohraničená polárnym zvyškom a na svojom N-terminálnom konci ohraničená zásaditou aminokyselinou, čo súhlasí pre transférový signál terminázy (Obr. 18). Intracelulárna oblasť je zložená zo 105 aminokyselinových zvyškov.11211 according to Kyte and Doolittle (1982) (Fig. 19c). This domain is flanked by a polar residue at its N-terminal end and flanked by a basic amino acid at its N-terminal end, which agrees for the transferase terminase signal (Fig. 18). The intracellular region is composed of 105 amino acid residues.

Extracelulárna oblasť obsahuje dva hlavné motívy opakovaných domén, ktoré sú charakteristické pre rodinu Ll: úsek dlhý 685 aminokyselín s homológiou k doménam podobným Ig a úsek dlhý 472 aminokyselín s homológiou k opakovaniam podobným FN (Obr.l a 2a). Všetkých šesť domén podobných Ig obsahuje charakteristický pár cysteínových zvyškov, ktoré sú umiestnené vo vzdialenostiach 47 až 54 aminokyselín od seba (Obr. 19). Konzervovaný prolín (s výnimkou šiestej domény podobnej Ig) na konci štruktúry beta B v spojení s úsekom typu C2 konzervovaných aminokyselín okolo druhého cysteínového zvyšku v každej doméne (DXGXYXCXAXN) porovnáva domény podobné Ig podľa sady C2 (Wiliams a Barclay, 1988). Medzi doménami podobnými Ig a transmembránovou oblasťou sú štyri domény, ktoré sú homológne k opakovaniam podobným FN vo fibronektíne (Kornblihtt et al., 1985). Každá z týchto domén, približne 100 aminokyselín, obsahuje veľmi konzervovaný tryptofán (s výnimkou prvého opakovania podobného FN) a tyrozínové/fenylalanínové zvyšky v N- a C-terminálnych oblastiach. Je zaujímavé, že piate opakovanie podobné FN je len polovičné na rozdiel od iných členov rodiny Ll (Obr. 18). Ak toto polovičné opakovanie podobné FN predstavuje jednu z niekoľkých alternatívnych zostrihových foriem, z ktorých jedna obsahuje úplnú doménu podobnú FN, môže sa určiť spôsobmi inými ako je analýza Northern blot. V tomto kontexte je dôležité, že nebol nájdený žiadny dôkaz pre alternatívny zostrih pomocou reštrikčnej analýzy šiestich nezávisle izolovaných klonov (nie je ukázané). Alternatívny zostrih tejto domény podobnej FN bol pozorovaný u CAM/BRAVO, kde beli izolované izoformy cDNA, ktorým fhýba piate opakovanie podobné FN (Grumet et al., 1991; KayyemThe extracellular region contains two major repeat domain motifs that are characteristic of the L1 family: a 685 amino acid stretch with homology to Ig-like domains and a 472 amino acid stretch with FN-like repeats (Figs. 1 and 2a). All six Ig-like domains contain a characteristic pair of cysteine residues that are spaced 47 to 54 amino acids apart (Figure 19). The conserved proline (except for the sixth Ig-like domain) at the end of the beta B structure in conjunction with the C2 conserved amino acid region around the second cysteine residue in each domain (DXGXYXCXAXN) compares the Ig-like domains according to the C2 set (Wiliams and Barclay, 1988). Between Ig-like domains and the transmembrane region there are four domains that are homologous to FN-like repeats in fibronectin (Kornblihtt et al., 1985). Each of these domains, approximately 100 amino acids, contains highly conserved tryptophan (except for the first FN-like repeat) and tyrosine / phenylalanine residues in the N- and C-terminal regions. Interestingly, the fifth FN-like repeat is only half that of other L1 family members (Fig. 18). If this FN-like half-repeat is one of several alternative splicing forms, one of which contains a full FN-like domain, it can be determined by methods other than Northern blot analysis. In this context, it is important that no evidence was found for alternative splicing by restriction analysis of six independently isolated clones (not shown). Alternative splicing of this FN-like domain has been observed in CAM / BRAVO, where isolated cDNA isoforms harboring a fifth FN-like repeat (Grumet et al., 1991; Kayyem)

11211 et al., 1992). Neprítomnosť piatej domény podobnej FN v kuracom neurofascíne (Volkmer et al., 1992) je najpravdepodobnejšie tiež spôsobená alternatívnym zostrihom, pretože jeho krysí homológ, ankyrín väzbový glykoproteín (ABGP) (Davis et al., 1993), obsahuje piatu doménu podobnú FN. Takže CHL1 vnáša nový štruktúrny rys do rodiny Ll: len štyri a jedno polovičné opakovanie podobné FN je exprimované (Obr. 19).11211 et al., 1992). The absence of a fifth FN-like domain in chicken neurofascin (Volkmer et al., 1992) is most likely also due to alternative splicing because its rat homologue, the ankyrin-binding glycoprotein (ABGP) (Davis et al., 1993) contains a fifth FN-like domain. Thus, CHL1 introduces a new structural feature to the L1 family: only four and one half repeats similar to FN are expressed (Fig. 19).

Iným štruktúrnym rysom CHL1 je prítomnosť sekvencie RGD (aminokyseliny 185 až 187) v druhej doméne podobnej Ig (Obr. 18). Tento tripeptid bol pôvodne identifikovaný ako miesto bunkového prichytenia vnútri desiatej domény fibronektínu typu III (Pietschbacher a Rusolahti, 1984) a prispieva k väzbe na integrín (pre prehlad viď Rusolahti a Pietschbacher, 1987). Trojrozmerná štruktúrna analýza opakovaní podobných FN ukázala, že motív RGD je umiestnený medzi štruktúrami beta F a G (Main et al., 1992). Tento motív sa tiež nachádza u iných členov rodiny Ll. Pri treťom opakovaní podobnom FN kuracej Ng-CAH (Burgoon et al., 1991) a druhových homológoch kuracieho neurofascínu a krysej ABGP sa nachádza sekvencia RGD na rovnakom mieste, t.j. medzi štruktúrami beta F a G. Motívy RGD sa tiež nachádzajú pri Ll (dva pri myšej Ll a krysej (NÍLE) a jeden pri ľudskej Ll (Moos et al., 1988; Hlavin a Lemmon, 1991; Prince et al. , 1991). Všetky sekvencie RGD pri Ll sa nachádzajú v šiestej Ig podobnej doménam, ale v rôznom aminokyselinovom zložení ako RGD v FN podobných moduloch fibronektínu. Rovnako ako pri Ll je tripeptid u CHLI umiestnený v štruktúre beta E druhej Ig podobnej domény. Nie je v súčasnosti známe, či sú sekvencie RGD u týchto proteínov funkčne aktívne. V tomto kontexte je zaujímavé, že predĺženie neuritov indukované molekulou TAG-1 (Furley et al., 1992), členom rodiny F3/F11 (Bríimmendorf a Rathjen, 1993, 1994), ktorý obsahuje motív RGD v druhej FN podobnej doméne, závisí na B, integríne a Ll (Feisenfeld et al., 1994). Toto pozorovanie zvyšuje možnosť priamej fyzickej interakcie medzi druhým opakovaním podobnýmAnother structural feature of CHL1 is the presence of the RGD sequence (amino acids 185-187) in the second Ig-like domain (Fig. 18). This tripeptide was originally identified as a cellular attachment site within the 10th fibronectin type III domain (Pietschbacher and Rusolahti, 1984) and contributes to integrin binding (for review, see Rusolahti and Pietschbacher, 1987). A three-dimensional structural analysis of FN-like repeats showed that the RGD motif is located between beta F and G structures (Main et al., 1992). This theme is also found in other members of the Ll family. In a third repeat similar to chicken Ng-CAH FN (Burgoon et al., 1991) and species homologues of chicken neurofascin and rat ABGP, the RGD sequence is located at the same site, i. between beta F and G structures. RGD motifs are also found in L1 (two in mouse L1 and rat (NIL) and one in human L1 (Moos et al., 1988; Hlavin and Lemmon, 1991; Prince et al., 1991) All of the L1 RGD sequences are found in the sixth Ig-like domains, but in a different amino acid composition as the RGDs in FN-like fibronectin modules.Like the L1, the tripeptide of CHLI is located in the beta E structure of the second Ig-like domain. In this context, it is interesting that the neurite outgrowth induced by the TAG-1 molecule (Furley et al., 1992), a member of the F3 / F11 family (Brimmendorf and Rathjen, 1993, 1994), contains an RGD motif in a second FN-like domain, depending on B, integrin, and L1 (Feisenfeld et al., 1994) This observation increases the possibility of a direct physical interaction between the second repeat similar to

1121111211

FN a integrínom betal.FN and betaine integrin.

CHL1 tiež obsahuje sekvenciu DGEA (aminokyseliny 555 až 558) v štruktúre beta C šiestej Ig podobnej domény (Obr. 18). Táto sekvencia sa nenachádza u ostatných členov rodiny Ll. Sekvencia DGEA sa tiež zúčastňuje pri rozpoznávaní integrínu alfa2 betal a kolagénu typu I, ktorý obsahuje tento motív (Staatz et al., 1991).CHL1 also contains the DGEA sequence (amino acids 555 to 558) in the beta C structure of the sixth Ig-like domain (Fig. 18). This sequence is not found in other members of the L1 family. The DGEA sequence is also involved in the recognition of integrin alpha2 betal and type I collagen containing this motif (Staatz et al., 1991).

Štruktúrna podobnosť CHL1 s inými rozpoznávacími molekulami rodiny IgStructural similarity of CHL1 to other Ig family recognition molecules

Porovnanie aminokyselinovej sekvencie CHL1 s translatovanou génovou sekvenčnou databankou EMBL ukázalo, že CHL1 je z 87,2% identická k 109 aminokyselín dlhému úseku a z 79,6% identická k 93 aminokyselín dlhému úseku predtým identifikovanému v ludskom mozgu (príjmové číslo HS2431 a HSXT02610 (Adams et al., 1992, 1993)). Takže sa ukazuje, že u človeka existuje velmi konzervovaná molekula CHL1. Sekvencie myšej, ludskej a krysej Ll/NILE, kuracej Ng-CAM, kuracej Nr-CAM, Ll.l zebričky (Tongiorgi et al., 1995), kuracieho neurofascínu/krysej ABGP, Drozofilieho neurogliánu (Bieber et al., 1989), myšej F3/kuracej Fl/Iudskej CNTN1 (Gennarini et al., 1989; Ranscht, 1988; Brummendorf et al., 1989; Berglund a Ranscht, 1994), krysej TAG-l/kuracieho axonínu-1/Iudskej TAX-1 (Furley et al., 1990; Hasler et al., 1993; Tsiotra et al., 1993) a krysej BIG-l/myšej PANG (Yoshihara et al., 1994; Connely et al., 1994) nájdené v translatovanej génovej sekvenčnej databanke ENBL boli porovnané s CHL1. Porovnanie je znázornené v Tabuľke l, ktorá je uvedená nižšie.Comparison of the amino acid sequence of CHL1 with the translated EMBL gene sequence database revealed that CHL1 was 87.2% identical to the 109 amino acid long region and 79.6% identical to the 93 amino acid long region previously identified in the human brain (receipt numbers HS2431 and HSXT02610 (Adams) et al., 1992, 1993)). Thus, it appears that there is a highly conserved CHL1 molecule in man. Sequences of mouse, human and rat L1 / NILE, chicken Ng-CAM, chicken Nr-CAM, L1.1 ribs (Tongiorgi et al., 1995), chicken neurofascin / rat ABGP, Drosophilia neuroglian (Bieber et al., 1989), mouse F3 / chicken F1 / human CNTN1 (Gennarini et al., 1989; Ranscht, 1988; Brummendorf et al., 1989; Berglund and Ranscht, 1994), rat TAG-1 / chicken axonin-1 / human TAX-1 (Furley et al., 1990; Hasler et al., 1993; Tsiotra et al., 1993) and rat BIG-1 / mouse PANG (Yoshihara et al., 1994; Connely et al., 1994) found in the translated gene sequence database ENBL were compared with CHL1. The comparison is shown in Table 1 below.

CHL1 je najpodobnejší na kuraciu Ng-CAM (37% aminokyselinovej identity v extracelulárnej doméne, Tabulka 1) a na myšiu Nr-CAM (64% aminokyselinovej identity v extracelulárnej doméne, Tabulka 2). Ale stupeň identity, zvlášť v extracelulárnej časti, nie je dostatočný pre úvahu, že tieto proteíny sú druhové homológy. Nedávno bol identifikovaný neúplný kloň cDNA myšej Nr-CAM (MoscosoCHL1 is most similar to chicken Ng-CAM (37% amino acid identity in the extracellular domain, Table 1) and mouse Nr-CAM (64% amino acid identity in the extracellular domain, Table 2). However, the degree of identity, especially in the extracellular portion, is not sufficient to consider that these proteins are species homologues. Recently an incomplete cDNA clone of mouse Nr-CAM (Moscoso

11211 a Sanes, 1995). Myší Nr-CAM je takmer identický (99%) s kuracím Nr-CAM (viď Tabuľka 2). Preto nie je CHL1 pravdepodobne homológom Nr-CAM u myší. CHL1 je štvrtým členom rodiny Ll u myší spoločne s Ll, Nr-CAM, neurofascínom (Moscoso a Sanes, 1995) a spoločne s veľmi konzervovanými druhovými homológmi u človeka (Adams et al., 1992, 1993).11211 and Sanes, 1995). Mouse Nr-CAM is almost identical (99%) to chicken Nr-CAM (see Table 2). Therefore, CHL1 is probably not an Nr-CAM homolog in mice. CHL1 is the fourth member of the L1 family in mice along with L1, Nr-CAM, neurofascin (Moscoso and Sanes, 1995) and together with highly conserved species homologues in humans (Adams et al., 1992, 1993).

Keď uvažujeme podobnosť intracelulárnych sekvencií kuracej a myšej Nr-CAM a kuracieho a myšieho neurofascínu (99% a 87%, Tabuľka 2), je veľmi nepravdepodobné, že sú myší Ll a kurací Ng-CAM druhové homológy, pretože vykazujú len 10% sekvenčnú identitu v intracelulárnej doméne (Tabuľka 2). Existencia Ng-CAM ako piateho člena rodiny Ll u myší s veľmi konzervovanou intracelulárnou doménou je skôr očakávaná. Je zaujímavé, že myšia Ll podporuje rast neuritov cez heterofilnú interakciu s kuracou Ng-CAM (Lemmon et al., 1989), čo implikuje, že členovia rodiny Ll môžu interagovať so sebou navzájom.Considering the similarity of the intracellular sequences of chicken and mouse Nr-CAM and chicken and mouse neurofascin (99% and 87%, Table 2), it is highly unlikely that mouse L1 and chicken Ng-CAM are species homologues as they show only 10% sequence identity in the intracellular domain (Table 2). The existence of Ng-CAM as the fifth member of the L1 family in mice with a highly conserved intracellular domain is more likely to be expected. Interestingly, mouse L1 promotes neurite outgrowth through heterophilic interaction with chicken Ng-CAM (Lemmon et al., 1989), implying that members of the L1 family can interact with each other.

Okrem podobností v celkovej štruktúre členov rodiny Ll (Tabuľka 1 a Tabuľka 3) sú identifikované najviac konzervované oblasti v cytoplazmovej oblasti (Obr. 20). Nápadná homológia je evidentná pre členov rodiny Ll u všetkých druhov doteraz identifikovaných, ktoré obsahujú intracelulárnu doménu: Ll, CHL1, Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascín, neuroglián a Ll.1 zebričky a tiež neúplné sekvencie L1.2 zebričky (Tongiorgi et al., 1995) a myší Nr-CAM a neurofascín (Moscoso a Sanes, 1995) (Tabuľka 2). Vnútri tejto oblasti sú dva úseky takmer identické, jeden umiestnený blízko pri a čiastočne vnútri segmentu prechádzajúceho plazmatickou membránou a druhý na jeho C-terminálnom konci (I, III v Obr 20). Iný aminokyselinový úsek, ktorý je konzervovaný u Ll, Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascíne, Ll.l a L1.2, ale nie u CHL1 (Tabuľka 2), obsahuje motív RSLE (II v Obr. 3), ktorý pochádza z alternatívneho zostrihu a je exprimovaný len v neurónoch (Grumet et al., 1991; Miura et al., 1991; Volkmer et al., 1992). Pretože je intracelulárna oblasť najviac konzervovanáIn addition to the similarities in the overall structure of L1 family members (Table 1 and Table 3), the most conserved regions in the cytoplasmic region are identified (Figure 20). Striking homology is evident for the L1 family members in all species identified so far that contain the intracellular domain: L1, CHL1, Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascin, neuroglian and L1.1 ribs, as well as incomplete zebra L1.2 sequences (Tongiorgi et al. al., 1995) and mouse Nr-CAM and neurofascin (Moscoso and Sanes, 1995) (Table 2). Within this region, two sections are nearly identical, one located close to and partially inside the segment passing through the plasma membrane and the other at its C-terminal end (I, III in Fig. 20). Another amino acid region that is conserved in L1, Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascin, L1.1 and L1.2, but not CHL1 (Table 2), contains the RSLE motif (II in Fig. 3), which originates from alternative splicing and is expressed only in neurons (Grumet et al., 1991; Miura et al., 1991; Volkmer et al., 1992). Because the intracellular region is most conserved

11211 medzi týmito proteínmi, všetci členovia rodiny Ll môžu používať tie isté signálne transdukčné cesty na aktiváciu predĺženia neuritov. Bolo demonštrované, že cytoplazmové domény u ÄBGP, Ll a Nr-CÄM interagujú s ankyrínom prepájajúcim bunkovú rekogníciu s cytoskeletálnym lešením (Davis et al., 1993; Davis a Bennett, 1994).11211 among these proteins, all members of the L1 family can use the same signal transduction pathways to activate neurite outgrowth. It has been demonstrated that the cytoplasmic domains of ÄBGP, L1, and Nr-CÄM interact with the ankyrin-linking cell recogni- zation with the cytoskeletal scaffold (Davis et al., 1993; Davis and Bennett, 1994).

Príklad 24Example 24

Identifikácia štruktúrnych požiadaviek v extracelulárnej doméne za účelom klasifikovania členov rodiny LlIdentifying structural requirements in the extracellular domain to classify L1 family members

Pre ďalšie štúdium všeobecných kritérií rodiny Ll sme skúmali umiestnenie veľmi konzervovaných aminokyselín v doménach podobných Ig (cysteínov, ktoré sa zúčastňujú mostíkov S-S) a opakovaní podobných FN (tryptofán, tyrozín/fenylalanín) pre niektorých členov rodiny Ig (Tabuľka 3). Molekuly obsahujúce šesť domén podobných Ig a aspoň štyri opakovania podobné FM (rodina Ll a nižšia rodina F3/F11 s kotvou GPI (Briimmendorf a Rathjen, 1993)) odhalili velmi konštantný počet aminokyselín, ktoré oddelujú tieto konzervované aminokyseliny. Do úvahy bolo zobraných päť rôznych parametrov vzdialenosti:For further study of general L1 family criteria, we examined the location of highly conserved amino acids in Ig-like domains (cysteines participating in S-S bridges) and FN-like repeats (tryptophan, tyrosine / phenylalanine) for some Ig family members (Table 3). Molecules containing six Ig-like domains and at least four FM-like repeats (L1 family and lower F3 / F11 family with GPI anchor (Briimmendorf and Rathjen, 1993)) revealed a very constant number of amino acids that separate these conserved amino acids. Five different distance parameters were taken into account:

1) počet aminokyselín oddeľujúcich konzervované cysteíny, ktoré tvoria cysteínové mostíky (S-S) v každej doméne podobnej Ig (Tabuľka 3, stĺpce Igl, Ig2, Ig4, Ig5 a Ig6);1) the number of amino acids separating the conserved cysteines that form cysteine bridges (S-S) in each Ig-like domain (Table 3, columns Ig1, Ig2, Ig4, Ig5 and Ig6);

2) počet aminokyselín medzi druhým cysteínom v jednej doméne podobnej Ig a prvým cysteínom nasledujúcej domény podobné Ig, ktorý odráža vzdialenosť medzi dvoma susediacimi doménami podobnými Ig (Tabuľka 3, stĺpce 1-2, 2-3, 3-4, 4-5 a 5-6);2) the number of amino acids between the second cysteine in one Ig-like domain and the first cysteine of the next Ig-like domain reflecting the distance between two adjacent Ig-like domains (Table 3, columns 1-2, 2-3, 3-4, 4-5; and 5-6);

3) počet aminokyselín medzi posledným konzervovaným cysteínom šiestej domény podobnej Ig a konzervovaným tryptofánom prvého opakovania podobného FN, ktorý odráža vzdialenosť medzi modulom domény podobnej Ig a modulom opakovania podobného FN Tabuľka 3, stĺpce IgG-FNl);3) the number of amino acids between the last conserved cysteine of the sixth Ig-like domain and the conserved tryptophan of the first FN-like repeat that reflects the distance between the Ig-like domain module and the FN-like repeat module (Table 3, IgG-FN1 columns);

1121111211

4) počet aminokyselín medzi konzervovaným tryptofánom, tyrozínom/fenylalanínom každého jednotlivého opakovania podobného FN (Tabuľka 3, FN1, FN, FN3 a FN4);4) the number of amino acids between the conserved tryptophan, tyrosine / phenylalanine of each individual FN-like repeat (Table 3, FN1, FN, FN3 and FN4);

5) počet aminokyselín medzi tyrozínom/fenylalanínom jedného opakovania podobného FN a tryptofánom nasledujúceho opakovania podobného FN, ktorý odráža vzdialenosť medzi dvoma susediacimi opakovaniami podobnými FN (Tabuľka 3,5) the number of amino acids between tyrosine / phenylalanine of one FN-like repeat and tryptophan of a subsequent FN-like repeat that reflects the distance between two adjacent FN-like repeats (Table 3,

FN1-FN2, FN2-FN3, FN3-FN4).FN1-FN2, FN2-FN3, FN3-FN4).

Pre získanie vysoko stringentných podmienok pre porovnanie molekúl podobných Ll sme nezahŕňali do výpočtu priemerných vzdialeností a štandardných odchýlok niekoľko málo hodnôt, ktoré sa jasne odchyľovali od priemeru, najpravdepodobnejšie v dôsledku alternatívneho zostrihu (neuroglián: Ig2, 2-3; Nr-CÄM a ABGP: Ig6-FN1; F3: Ig4, FN3; Ng-CAM: FN2, FN3 Tabuľka 3, označené *)). Aj keď počet aminokyselín medzi mostíkmi S-S pre prvú a šiestu doménu podobnú Ig (Igl; štandardná odchýlka (SD) = 3; Ig6: SD = 4) a počet aminokyselín medzi konzervovaným tryptofánom, tyrozínom/fenylalanínom opakovaní podobných FN tri a štyri (FN3: SD = 4; FN4: SD = š) sú mierne rozdielne, všetky ostatné parametre vzdialeností zostávajú pozoruhodne konštantné pre rôzne molekuly (FN1-FN2: SD = 0; FN2 a 2-3: SD = 2 (Tabuľka 3)). Na základe týchto kritérií sme vypočítali index podobnosti (viď Materiál niekoľko molekúl podobných Ig vo vzťahu hodnotám v zozname Tabuľky 3. Pre Ll, CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, ABGP, Ll.l, TAG-1 a BIG-1 bol získaný index podobnosti 74 až 95% (Tabuľka 3). Pre drozofilí neuroglián bola určená mierne nižšia hodnota (66%), zrejme preto, že je tu evolučná vzdialenosť medzi stavovcami a hmyzom. F3 a jeho druhové homológy sú menej konzervovaní, zvlášť v ich doménach podobných Ig, ale stále vykazujú index podobnosti 63%. Avšak niektoré úseky konzervovaných aminokyselín, ktoré sú základom silne konzervovanej kolinearity (napr.To obtain highly stringent conditions for comparing L1-like molecules, we did not include in the calculation of mean distances and standard deviations a few values that clearly deviated from the mean, most likely due to alternative splicing (neuroglian: Ig2, 2-3; Nr-CÄM and ABGP: Ig6-FN1; F3: Ig4, FN3; Ng-CAM: FN2, FN3. Although the number of amino acids between SS bridges for the first and sixth Ig-like domains (Ig1; standard deviation (SD) = 3; Ig6: SD = 4) and the number of amino acids between conserved tryptophan, tyrosine / phenylalanine repeats similar to FN three and four (FN3): SD = 4; FN4: SD = w) are slightly different, all other distance parameters remain remarkably constant for different molecules (FN1-FN2: SD = 0; FN2 and 2-3: SD = 2 (Table 3)). Based on these criteria we calculated the similarity index (see Material of several Ig-like molecules in relation to the values in the list of Table 3. For L1, CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, ABGP, L1.1, TAG-1 and BIG-1 was obtained a similarity index of 74 to 95% (Table 3) A slightly lower value (66%) has been determined for Drosophilia Neuroglian, probably because there is an evolutionary distance between vertebrate and insect F3 and its species homologues are less conserved, especially in their however, some regions of conserved amino acids that underlie strongly conserved collinearity (e.g.

FxVxAxNxxG(8x)TxxAxPxxxP na konci prvého opakovania podobného FN alebo NxxGxGPxS medzi poslednými dvoma a Metódy) pre k priemernýmFxVxAxNxxG (8x) TxxAxPxxxP at the end of the first repetition similar to FN or NxxGxGPxS between the last two and Methods) for k average

11211 čo ukazuje, že je dôležitým štruktúrami beta tretieho opakovania podobného FN (nie je ukázané), podporujú myšlienku, že F3 patrí do rodiny L1. Je zaujímavé, že počet aminokyselín medzi susednými doménami (domény podobné Ig alebo opakovania podobné FN) je dokonca viac konzervovaný medzi týmito molekulami, vzdialenosť medzi jednotlivými doménami štruktúrnym rysom, t.j. rozhodujúcim pre funkciu nervových rozlišovacích molekúl (Tabuľka 3, stĺpce 1-2, 2-3, 3-4,11211, which shows that it is an important beta structure of the third repeat similar to FN (not shown), supports the idea that F3 belongs to the L1 family. Interestingly, the number of amino acids between neighboring domains (Ig-like domains or FN-like repeats) is even more conserved between these molecules; decisive for the function of neural resolution molecules (Table 3, columns 1-2, 2-3, 3-4,

4-5, 5-6, FN1-FN2, FN2-FN3 a FN3-FN4). Táto vysoká konzervácia tohoto zoradenia (kolinearity) a vzdialeností je použitá na všeobecnejšie definovanie extracelulárnej domény členov rodiny L1. Na základe týchto práve definovaných kritérií obsahujú tieto extracelulárne domény modul šiestich domén podobných Ig na konci N, po ktorom nasledujú štyri FN. Tento štruktúrny rys budeme nazývať opakovania podobné kazetou rodiny L1.4-5, 5-6, FN1-FN2, FN2-FN3, and FN3-FN4). This high conservation of this collinearity and distance is used to more generally define the extracellular domain of L1 family members. Based on these just defined criteria, these extracellular domains contain a module of six Ig-like domains at the N-terminus followed by four FNs. This structural feature will be called L1 family cassette repeats.

Takže všetci charakteristické rysy konzervované aminokyseliny tieto molekuly odvodené molekuly, ktorá obsahovala členovia rodiny Ll zdieľajú kazety rodiny L1 a tiež veľmi Tieto výsledky navrhujú, že od spoločnej predchádzajúcej kazetu rodiny Ll, ktorá mohla rozšíriť svoj funkčný potenciál cez génovú duplikáciu pre účely najrôznejších bunkových interakcií v zložitejších nervových sústavách. Hlavná rodina Ll tak môže byť rozdelená na •klasických členov rodiny Ll (Ll, CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, neurofascín, neuroglián, Ll.l), ktorí obsahujú variabilné šieste opakovanie podobné FN, transmembránovú doménu a veľmi konzervovanú intracelulárnu doménu, a na podskupinu F3/F11 (F3/F11/CNTN1, BIG-l/PANG a TAG-l/Äxonín-l/TAX-1), ktorej spoločným rysom je spojenie s membránou skrz skupinu GPI a v ktorej nebolo zatiaľ identifikované žiadne variabilné piate opakovanie podobné FN. Extracelulárne domény obidvoch podskupín obsahujú kazetu rodiny Ll.So all the characteristics of the conserved amino acid these molecules derived molecules that contained L1 family members share the L1 family cassettes as well. These results suggest that from a common previous L1 family cassette that could expand its functional potential through gene duplication for a variety of cellular interactions in more complex nervous systems. Thus, the main L1 family can be divided into • classical L1 family members (L1, CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, neurofascin, neuroglian, L1.1), which contain variable six repeats similar to FN, transmembrane domain and very conserved intracellular domain , and to the F3 / F11 subgroup (F3 / F11 / CNTN1, BIG-1 / PANG, and TAG-1 / Oxonin-1 / TAX-1), which have a common feature of membrane bonding through the GPI group and in which no variable has yet been identified fifth repeat similar to FN. The extracellular domains of both subgroups contain a L1 family cassette.

Ostatní členovia veľkej rodiny Ig, napr. N-CÄM (Cunningham et al., 1987; Barthels et al.,* 1987), MAG (Arquint et al., 1987; Lai et al., 1987; Salzor et al. ,Other members of the large Ig family, e.g. N-CAM (Cunningham et al., 1987; Barthels et al., * 1987), MAG (Arquint et al., 1987; Lai et al., 1987; Salzor et al.,

1121111211

1987), neuromuskulín (Kania et al., 1993) a rse (Mark et al., 1994) alebo fibronektín (Kornblihtt et al., 1985), ktorí obsahujú domény podobné Ig a alebo opakovania podobné FN, vykazujú jasne odlišné parametre vzdialeností, čo ukazujú, že sú oveľa menej príbuzné medzi sebou a k členom rodiny Ll (Tabuľka 3). Je zaujímavé, že gén kódujúci ľudský príbuzný leukocytárny spoločný antigén (HLAR) (Streull et al., 1988) a produkt génu potláčajúceho nádory (DCC), ktorý je deletovaný u rakoviny konečníka (Fearson et al., 1990), sú blízko príbuzní k rodine Ll podľa parametrov vzdialenosti (index podobnosti 42% a 50%). Rozbor konzervovaných aminokyselín odhalil, že DCC je naozaj oveľa bližší k rodine Ll než k N-CAM, ako bolo skôr navrhnuté vo Fearson et al., (1990) a Pierceall et al., (1994), aj keď sa zdá, že stratili piatu a šiestu doménu podobnú Ig. Nedávne štúdie ukazujú, že DCC je exprimovaný prednostne v mozgu a že rast neuritov krysích buniek PC12 je stimulovaný na substráte fibroblastov transfekovaných DCC, ktoré exprimujú tento proteín na svojom povrchu (Pierceall et al., 1994). Aj keď HLAR tiež vykazuje tiež relatívne vysoký index podobnosti, jeho príbuznosť k rodine Ll nie je tak zrejmá.1987), neuromusculin (Kania et al., 1993) and rse (Mark et al., 1994) or fibronectin (Kornblihtt et al., 1985), which contain Ig-like and / or FN-like repeats, exhibit distinctly different distance parameters, indicating that they are much less related to each other and to members of the L1 family (Table 3). Interestingly, the gene encoding the human related leukocyte common antigen (HLAR) (Streull et al., 1988) and the tumor suppressor gene (DCC) product that is deleted in rectal cancer (Fearson et al., 1990) are closely related to L1 family according to distance parameters (similarity index 42% and 50%). Analysis of conserved amino acids revealed that DCC is indeed much closer to the L1 family than to N-CAM, as previously suggested by Fearson et al. (1990) and Pierceall et al. (1994), although they appear to have lost the fifth and sixth Ig-like domains. Recent studies show that DCC is expressed preferentially in the brain and that neurite outgrowth of rat PC12 cells is stimulated on a DCC-transfected fibroblast substrate that expresses this protein on its surface (Pierceall et al., 1994). Although HLAR also shows a relatively high index of similarity, its affinity with the L1 family is not so obvious.

Príklad 25Example 25

Tkanivové rozšírenie mRNA CHL1 a proteínuTissue extension of CHL1 and protein mRNA

Pre určenie, či CHL1 zdieľa prednostnú expresiu v nervovej sústave spolu s inými členmi rodiny Ll, sme analyzovali expresiu CHL1 v rôznych tkanivách na úrovni mRNA a proteínu. V analýze Northern blot hybridizovala ribopróba CHL1 so silným prúžkom mRNA s veľkosťou 8 kb (Obr. 21), ktorý je o dosť väčší než veľkosť mRNA detekovanej próbou Ll (6 kb) (Tácke et al., 1987). Menší a tenší prúžok mRNA (Obr. 21a, dráha 3) je najpravdepodobnejšie spôsobený hybridizáciou k ribozomálnej RNA. RNA dlhá 8 kb bola detekovaná v mozočku, mozgu bez mozočku a v mieche, ale nie v dorzálnom koreňovom gangliu (DRG) (Obr. 21a). Naopak,To determine whether CHL1 shares preferential expression in the nervous system with other members of the L1 family, we analyzed CHL1 expression in various tissues at the mRNA and protein levels. In a Northern blot analysis, the rib1 probe CHL1 hybridized with a strong 8 kb mRNA band (Fig. 21), which is considerably larger than the mRNA detected by the 6 kb L1 probe (Tácke et al., 1987). The smaller and thinner mRNA band (Fig. 21a, lane 3) is most likely due to hybridization to ribosomal RNA. RNA of 8 kb was detected in cerebellum, cerebellum and spinal cord, but not in the dorsal root ganglia (DRG) (Fig. 21a). Vice versa,

11211 analyzované a ľadviny), iónovej chromatografie. ELISA (nie je ukázané) ribopróba Ll ukázala silný signál s RNA z DRG (Obr. 21a). mRNA CHL1 bola tiež detekovaná v mozočku deväť dní starej krysy a v mieche šesť dní starej krysy, ale nie v krysích bunkách PC12 udržiavaných s a bez NFG alebo v bunkách COS-1 (Obr. 21b). Vo všetkých ostatných tkanivách, ktoré boli (detská žľaza, pľúca, pečeň, črevá, slinivka nebol detekovaný žiadny signál (Obr. 21a). Na identifikáciu proteínu CHL1 boli vytvorené protilátky proti bakteriálne exprimovanému fragmentu. 1,7 kb dlhý fragment cDNA reprezentujúci časť šiestej domény podobnej Ig a štyri opakovania podobné FN (Obr. 18 a 19b), ale nie transmembránovú alebo intracelulárnu oblasť, bol naklonovaný do expresného vektora pET. Expresia výsledného proteínového fragmentu viedla k detekcii prúžku s veľkosťou 70 kD pomocou farbenia Coomassie modrou po SDS-PAGE, ktorý bol purifikovaný pomocou výmennej11211 analyzed and kidney), ion chromatography. ELISA (not shown) of the riboprobe L1 showed a strong signal with RNA from DRG (Fig. 21a). CHL1 mRNA was also detected in the cerebellum of a nine-day-old rat and in the spinal cord of a six-day-old rat, but not in PC12 rat cells maintained with and without NFG or COS-1 cells (Fig. 21b). No signal was detected in all other tissues that were (gland, lung, liver, intestine, pancreas) (Fig. 21a) Antibodies against the bacterially expressed fragment were generated to identify the CHL1 protein. 1.7 kb long cDNA fragment representing part of the sixth Ig-like domains and four FN-like repeats (Figures 18 and 19b), but not the transmembrane or intracellular region, were cloned into the pET expression vector The expression of the resulting protein fragment resulted in the detection of a 70 kD band by Coomassie blue staining after SDS-PAGE which was purified by exchange

Analýza Western blot (Obr. 22a) a preukázali, že antiséra z dvoch králikov reagovali s proteínovým fragmentom CHL1, ale nie s purifikovanými Ll, N-CAM a MAG. Niektoré reakcie s bakteriálnymi proteínmi, ktoré putovali spoločne s peptidom CHL1 alebo s degradačnými produktami fragmentu CHL1, boli pozorované (Obr. 22a, dráha 4).Western blot analysis (Fig. 22a) showed that antisera from two rabbits reacted with the CHL1 protein fragment but not with purified L1, N-CAM and MAG. Some reactions with bacterial proteins that traveled together with the CHL1 peptide or with the degradation products of the CHL1 fragment were observed (Fig. 22a, lane 4).

Pre dalšie preskúmanie špecifickosti protilátok a určenie, či tieto protilátky rozpoznávajú na bunkovom povrchu exprimovanú CHL1, boli tranzientne transfekované bunky COS-1 preskúmané týmito protilátkami. Imunocytochémia odhalila povrchovú expresiu CHL1 na bunkách transfekovaných CHL1, ale nie na bunkách transfekovaných samotným vektorom (Obr. 23). Tieto výsledky tiež ukazujú, že signálna sekvencia je funkčná a že otvorený čítací rámec je správny.To further examine the specificity of the antibodies and to determine whether these antibodies recognize CHL1-expressed cell surface, transiently transfected COS-1 cells were screened with these antibodies. Immunocytochemistry revealed surface expression of CHL1 on cells transfected with CHL1, but not on cells transfected with the vector alone (Fig. 23). These results also show that the signal sequence is functional and that the open reading frame is correct.

Aj keď bol prvý kloň cDNA CHL1 izolovaný z expresnej knižnice pomocou testovania s imunoafinitne purifikovanými protilátkami proti Ll z mozgu, reakcie rôznych preparátov 'protilátok proti rekombinantne exprimovaným doménam podobným Ig Ll s bunkami transfekovanými CHL1 neboli pozorované (nieAlthough the first clone of CHL1 cDNA was isolated from the expression library by screening with immunoaffinity purified anti-L1 antibodies from the brain, reactions of various antibody preparations against recombinantly expressed Ig L1-like domains with CHL1-transfected cells were not observed (no

11211 použité ako kontrola, prúžky 185, 165 a je ukázané). Tiež protilátky proti CHL1 vyvolané proti extracelulárnej časti tejto molekuly (Obr. 19) nereagovali s bunkami transfekovanými Ll (nie je ukázané). Je preto pravdepodobné, že polyklonálne protilátky proti Ll použité na testovanie expresnej knižnice boli reaktívne s intracelulárnou časťou CHLI na konci C, ktorý je najviac homológny medzi CHL1 a Ll.11211 used as control, strips 185, 165 and shown). Also, antibodies against CHL1 raised against the extracellular portion of this molecule (Fig. 19) did not react with L1 transfected cells (not shown). Therefore, it is likely that polyclonal anti-L1 antibodies used to test the expression library were reactive with the intracellular portion of CHLI at the C-end that is most homologous between CHL1 and L1.

Antiséra CHL1 boli použité na identifikáciu imunoreaktívnych proteínov v niekoľkých tkanivách (mozog, pečeň, pľúca, ľadviny a črevá z deväť dní starých myší, Obr. 23b). Hrubé membránové frakcie, rozpustné alebo nerozpustné v 0,5% Tritone X-100, boli analyzované pomocou analýzy Western blot. Polyklonálne protilátky proti Ll boli Protilátky CHL1 rozpoznávajú tri rôzne 125 kD v nerozpustných a rozpustných frakciách membrán z mozgu. Prúžok 185 kD bol detekovaný len slabo v rozpustnej frakcii a prúžok 125 kD bol menej zastúpený v nerozpustnej frakcii (Obr. 23b, dráhy 1 a 2), čo ukazuje, že prúžok 185 kD je pravdepodobne membránovo viazaná forma CHL1, naopak prúžky 185 kD a 165 kD sú pravdepodobne proteolyticky štiepené fragmenty. Podobné rozloženie imunoreaktívnych prúžkov bolo pozorované po analýze Western blot buniek COS-1 transfekovaných CHL1 a celého mozgového tkaniva (nie je ukázané). Podobné rozloženie prúžkov bolo pozorované pre Ll (Faissner et al., 1985; Sadoul et al., 1988), Ng-CAM (Grumet et al., 1984) a Nr-CAM (Xayyem et al., 1992). Avšak dvojbázová konsezná sekvencia pre proteolytické štiepenie v tretej doméne podobné FN (Ll: SKR; Ng-CAM: SRR; Nr-CAM: SRR; Nr-CAM: “SRRSKR) sa nenachádza u CHL1. Podobne, ako iní členovia rodiny Ll, bolo u CHL1 zistené, že je exprimované len v neskorých štádiách vývoja. CHL1 nebola detekovateľná v mozgu pred embryonickým dňom 15 pomocou analýzy Western blot (nie je ukázané). Imunoreaktívny prúžok 50 kD bol detekovaný v detergentovej rozpustnej fralccii celého tkaniva pečene. Tento prúžok je najpravdepodobnejšie spôsobenýCHL1 antisera were used to identify immunoreactive proteins in several tissues (brain, liver, lung, kidney and intestine from nine day old mice, Fig. 23b). Coarse membrane fractions, soluble or insoluble in 0.5% Triton X-100, were analyzed by Western blot analysis. Polyclonal antibodies to L1 were CHL1 antibodies recognize three different 125 kD in the insoluble and soluble fractions of membranes from the brain. The 185 kD band was detected only weakly in the soluble fraction and the 125 kD band was less represented in the insoluble fraction (Fig. 23b, lanes 1 and 2), indicating that the 185 kD band is probably a membrane-bound form of CHL1, and the 185 kD band 165 kD are probably proteolytically cleaved fragments. A similar pattern of immunoreactive bands was observed after Western blot analysis of CHL1 transfected COS-1 cells and whole brain tissue (not shown). Similar strip layout was observed for L1 (Faissner et al., 1985; Sadoul et al., 1988), Ng-CAM (Grumet et al., 1984) and Nr-CAM (Xayyem et al., 1992). However, a two-base FN-like consensus sequence for proteolytic cleavage in the third domain (L1: SKR; Ng-CAM: SRR; Nr-CAM: SRR; Nr-CAM: "SRRSKR) is not found in CHL1. Like other members of the L1 family, CHL1 was found to be expressed only at late stages of development. CHL1 was not detectable in the brain before embryonic day 15 by Western blot analysis (not shown). The 50 kD immunoreactive band was detected in the detergent soluble fraction of whole liver tissue. This strip is most likely caused

11211 nejakou reaktivitou protilátok CHL1 s proteínom podobných CHL1, pretože žiadna mRNA, ktorá by zodpovedala CHL1, nebola vidieť v pečeni pri analýze Northern blot (Obr. 22a). Žiadna imunoreaktivita na CHL1 nebola detekovaná v iných tkanivách, ktoré boli skúšané (Obr. Členovia rodiny v neurónoch CNS. Preto rezy (Obr.11211 by some reactivity of CHL1 antibodies with CHL1-like protein, since no mRNA that would correspond to CHL1 was seen in the liver by Northern blot analysis (Fig. 22a). No immunoreactivity to CHL1 was detected in other tissues that were tested (Fig. Family members in CNS neurons. Therefore sections (Fig.

23b).23b).

Ll sú prednostne exprimovaní sme sa zaujímali, Či má tiež CHL1 tento profil expresie. Experimenty hybridizácie in situ boli vykonané za účelom identifikácie buniek syntetizujúcich Ll a CHLI v sietnici, optickom nerve a v cerebelárnom kortexe mladých práve narodených myší. V sietnici 7 dní starých myší sú exprimované mRNA Ll (Obr. 24a) a CHL1 (Obr. 24b) gangliónovými bunkami. Transkripty Ll boli ďalej detekovateľné v amakrínových a horizontálnych bunkách umiestnených na vnútornej jadrovej vrstve (Obr. 24a). mRNA CHL1 bola naopak detekovatelná len príležitostne v niekoľko málo bunkách umiestnených na vnútornej hrane vnútornej jadrovej vrstvy (Obr. 24b). Gliové bunky v optickom nerve neobsahovali detekovateľné hladiny transkriptov Ll (Obr. 24a). Naopak, mRNA CHL1 bola silne exprimovaná v gliových bunkách umiestnených v bližších oblastiach optického nervu (Obr. 24b) a nízke hladiny expresie CHL1 boli viditeľné v gliových bunkách umiestnených vo vzdialenejších oblastiach tohoto nervu (Obr. 24b).L1 are preferentially expressed we were interested in whether CHL1 also has this expression profile. In situ hybridization experiments were performed to identify cells synthesizing L1 and CHLI in the retina, optic nerve, and cerebellar cortex of young just born mice. In the retina of 7 day old mice, mRNAs of L1 (Fig. 24a) and CHL1 (Fig. 24b) are expressed by ganglion cells. L1 transcripts were further detectable in amacrine and horizontal cells located on the inner core layer (Fig. 24a). In contrast, CHL1 mRNA was detectable only occasionally in a few cells located on the inner edge of the inner core layer (Fig. 24b). Glial cells in the optic nerve did not contain detectable levels of L1 transcripts (Fig. 24a). In contrast, CHL1 mRNA was strongly expressed in glial cells located in the nearer regions of the optic nerve (Fig. 24b) and low levels of CHL1 expression were visible in glial cells located in the distal regions of the nerve (Fig. 24b).

V cerebelárnom kortexe dva dni starých myší bola mRNA Ll detekovateľná vo hviezdicových a košíčkových bunkách umiestnených v molekulárnej vrstve a v Golgiho a granulových bunkách umiestnených vo vnútornej granulárnej vrstve (Obr. 24d). Tie isté bunkové typy boli označené, keď boli hybridizované s protizmyslovou próbou cRNA CHL1 24e), s tou výnimkou, že transkripty CHL1 boli sotva detekovateľné v bunkách umiestnených vo vnútornej časti molekulárnej vrstvy (porovnajte Obr. 24d a e). Ako negatívna kontrola boli rezy hybridizované s príslušnými zmyslovými próbami cRNA a nebolo pozorované žiadne označenie buniek (pre sietnicu a optický nerv, ktorý bol hybridizovaný soIn the cerebellar cortex of two day old mice, L1 mRNA was detectable in star and basket cells located in the molecular layer and in Golgi and granule cells located in the inner granular layer (Fig. 24d). The same cell types were labeled when they hybridized to the antisense probe (cDNA (24e)), except that CHL1 transcripts were barely detectable in cells located inside the molecular layer (cf. Figs. 24d and e). As a negative control, sections were hybridized to the appropriate sensory cRNA probes and no cell labeling was observed (for the retina and optic nerve that had hybridized to

11211 z predných pripravené zmyslovou próbou cRNA CHL1, viď Obr. 24c). Kvôli odpovedi na otázku, či gliové bunky exprimujú CHL1 in vitro, boli mozgov práve narodených myší alebo krýs kultúry purifikovaných astrocytov alebo oligodendrocytov. Tie isté polyklonálne protilátky proti CHL1, ktoré špecificky detekovali CHLI na bunkovom povrchu transfekovaných buniek COS-1, boli použité. Astrocyty a oligodendrocyty boli identifikované protilátkami proti GFAP alebo s protilátkami proti antigénu 01. Kultúry astrocytov obsahovali niektoré bunky, ktoré boli označené dvojito polyklonálnymi protilátkami proti CHL1 (Obr. 25a, d) a monoklonálnymi protilátkami proti GFAP (Obr. 25b, e). Analýza kultúr oligodendrocytov však neodhalila žiadnu spoločnú lokalizáciu CHL1 a antigénu 01, čo znamená, že zrelé oligodendrocyty neexprimujú in vitro detekovateíné hladiny CHL1. Kombinované pozorovania ukazujú, že CHL1 a Ll vykazujú prekrývajúce sa, ale tiež rôzne profily expresie. Najnápadnejšie je, že CHL1, ale nie Ll, je exprimovaná v určitých gliových bunkách nervovej sústavy in vivo, čo naznačuje, že rôzni členovia rodiny Ll vykonávajú rôzne funkcie.11211 from the front, prepared by the sensory probe CHL1 cRNA, see FIG. 24c). To answer the question whether glial cells express CHL1 in vitro, the brains of just born mice or rats were cultured purified astrocytes or oligodendrocytes. The same polyclonal antibodies against CHL1 that specifically detected CHLI on the cell surface of transfected COS-1 cells were used. Astrocytes and oligodendrocytes were identified by anti-GFAP or anti-01 antibodies. Astrocyte cultures contained some cells that were labeled with double polyclonal anti-CHL1 antibodies (Fig. 25a, d) and monoclonal anti-GFAP antibodies (Fig. 25b, e). However, analysis of oligodendrocyte cultures revealed no co-localization of CHL1 and antigen 01, meaning that mature oligodendrocytes do not express in vitro detectable levels of CHL1. Combined observations show that CHL1 and L1 show overlapping, but also different expression profiles. Most notably, CHL1, but not L1, is expressed in certain glial cells of the nervous system in vivo, suggesting that different members of the L1 family perform different functions.

modifikácie.modifications.

Analýza glykozilácie a detekcie karbohydrátu HNK-1 u glykoproteínu CHL1Glycosylation analysis and detection of HNK-1 carbohydrate in glycoprotein CHL1

Pretože pozorovaná molekulová hmotnosť CHL (185 kD) je podstatne väčšia než vypočítaná molekulová hmotnosť (134,9 kD), bol analyzovaný príspevok karbohydrátov k molekulovej hmotnosti a tiež typ karbohydrátovejSince the observed molecular weight of CHL (185 kD) is significantly greater than the calculated molecular weight (134.9 kD), the contribution of carbohydrates to molecular weight and also the type of carbohydrate was analyzed

Detergentové rozpustné a nerozpustné frakcie dní starých myší boli mozgových membrán sedem z hrubých podrobené enzýmovej deglykozilácii. Po pôsobení N-glykozidázy F (PNGázaF) bola molekulová hmotnosť všetkých imunoreaktívnych proteínov CHL1 (Obr. 26): prúžok 185 kD sa posunul na 150 kD, prúžok 165 kD na 135 kD a prúžok 125 kD na 110 kD. Výsledkom pôsobenia O-glykozidázy, enzýmu, ktorý štiepi na serín/treonín pripojené galaktozylDetergent soluble and insoluble fractions of day-old mice were seven of the thick membranes subjected to enzyme deglycosilization. After treatment with N-glycosidase F (PNGaseF), the molecular weight of all immunoreactive proteins was CHL1 (Fig. 26): the 185 kD band shifted to 150 kD, the 165 kD band to 135 kD, and the 125 kD band to 110 kD. As a result of the action of O-glycosidase, an enzyme that cleaves the serine / threonine attached galactosyl

11211 beta(l-3)N-acetylgalaktozaminyl disacharidy (Glasgow et al., 1977), bola a 165 kD sa posunuli neposunul. Tieto ľahko zvýšená pohyblivosť: prúžky 185 na 180 a 160 kD, ale prúžok 125 kD sa pozorovania ukazujú, že väčšina karbohydrátovej molekulovej hmotnosti je spôsobená N-pripojenými karbohydrátmi. Pôsobenie obidvoch enzýmov spoločne (Obr. 26) viedlo k väčšiemu posunu než bolo vidieť u jednotlivých enzýmov, čo naznačuje, že nie všetky glykozilačné miesta, najskôr 0-glykozilačné miesta, boli štiepené O-glykozidázou samotnou. Výsledky ukazujú, že CHL1 obsahujú približne 30% svojej molekulovej hmotnosti ako N-glykozidicky pripojené karbohydráty.11211 beta (1-3) N-acetylgalactosaminyl disaccharides (Glasgow et al., 1977) was and the 165 kD shift did not shift. These slightly increased mobility: bands 185 at 180 and 160 kD, but the band of 125 kD observations show that most of the carbohydrate molecular weight is due to N-linked carbohydrates. The action of the two enzymes together (Fig. 26) resulted in a greater shift than seen with the individual enzymes, suggesting that not all glycosylation sites, first the O-glycosylation sites, were cleaved by O-glycosidase alone. The results show that CHL1 contains approximately 30% of its molecular weight as N-glycosidically linked carbohydrates.

Niekoľko nervových bunkových adhéznych molekúl nesie karbohydrát HNK-1, ako napr. Ll (Kruse et al., 1984), TAG-1 (Dodd et al., 1988), Nr-CAM (Grumet et al., 1991), F3 (Gennarini et al., 1989), N-CAM (Kruse et al., 1984), glykoproteín asociovaný s myelínom MAG (McGarry et al., 1983; Kruse et al., 1984), a Po (Bollenson a Schachner, 1987). Preto sme analyzovali, či nesie CHL1 karbohydrát HNK-1. CHL1 bola imunoprecipitovaná z detergentových lyzátov celého mozgového tkaniva z deväť dní starých myší protilátkami proti Ll. Ako kontrola bola Ll podobne imunoprecipitovaná polyklonálnymi protilátkami z toho istého mozgového extraktu. Analýza Western blot s monoklonálnymi protilátkami 412 vyvolanými proti karbohydrátovému epitopu HNK-1 ukázala, že obidva imunoprecipitáty obsahovali prúžky, ktoré boli rozpoznané monoklonálnou protilátkou 412 v molekulových hmotnostiach očakávaných pre CHL1 (Obr. 27) alebo Ll (nie je ukázané). Pretože karbohydrát HNK-1 sa zúčastňuje bunkovej adhézie a viaže sa na laminín (Keilhauer et al. , 1985; Kiinemund et al. , 1988; Halí et al., 1993,Several nerve cell adhesion molecules carry HNK-1 carbohydrate, such as e.g. L1 (Kruse et al., 1984), TAG-1 (Dodd et al., 1988), Nr-CAM (Grumet et al., 1991), F3 (Gennarini et al., 1989), N-CAM (Kruse et al. al., 1984), a myelin-associated glycoprotein MAG (McGarry et al., 1983; Kruse et al., 1984), and Po (Bollenson and Schachner, 1987). Therefore, we analyzed whether CHL1 carries HNK-1 carbohydrate. CHL1 was immunoprecipitated from whole brain tissue detergent lysates from nine day old mice with anti-L1 antibodies. As a control, L1 was similarly immunoprecipitated with polyclonal antibodies from the same brain extract. Western blot analysis with monoclonal antibodies 412 elicited against the carbohydrate epitope HNK-1 showed that both immunoprecipitates contained bands that were recognized by monoclonal antibody 412 at the molecular weights expected for CHL1 (Fig. 27) or L1 (not shown). Because HNK-1 carbohydrate is involved in cell adhesion and binds to laminin (Keilhauer et al., 1985; Kiinemund et al., 1988; Hali et al., 1993,

1995), môže CHL1, podobne ako ostatní členovia rodiny Ll, interagovať s laminínom skrz karbohydrát HNK-1.1995), CHL1, like other members of the L1 family, can interact with laminin through HNK-1 carbohydrate.

1121111211

Záverconclusion

Vyššie opísané experimenty pridali CHL1 do rodiny Ll nervových rozpoznávacích molekúl, ktoré sa vyskytujú u takých rôznych druhov, ako sú človek, krysa, myš, sliepka, zehrička a Drozofila, a tak určujú filogeneticky konzervovanú rodinu molekúl, ktorej všetci členovia sú exprimovaní neskôr vo vývoji pri nástupe axogenézy v neurónoch a podmnožine neurónov. Skutočnosť, že existuje mnoho molekúl podobných Ll, ukazuje požiadavka prírody na štruktúrne podobné, ale funkčne rôzne molekuly podporujúce rast neuritov, a ukazuje na evolúciu rodiny Ll ako na skupinu molekúl, ktorá môže určovať reguláciu vedenia axónov.The above experiments have added CHL1 to the L1 family of neural recognition molecules that occur in such different species as human, rat, mouse, hen, hamster, and Drozophila, and thus determine a philogenetically conserved family of molecules, all members of which are expressed later in development upon onset of axogenesis in neurons and a subset of neurons. The fact that there are many L1-like molecules demonstrates the demand of nature for structurally similar, but functionally different, molecules supporting neurite outgrowth, and points to the evolution of the L1 family as a group of molecules that can determine axonal conduction regulation.

Aj keď bol vynález opísaný a ilustrovaný prostredníctvom odkazov na rôzne špecifické materiály, postupy a príklady, rozumie sa, Že vynález nie je obmedzený na zvláštne kombinácie materiálu a postupov vybratých pre ten účel. Mnohé variácie takýchto detailov môžu byť zahrnuté, čo bude odborne vítané.While the invention has been described and illustrated by reference to various specific materials, processes and examples, it is to be understood that the invention is not limited to particular combinations of material and processes selected for that purpose. Many variations of such details may be included, which will be appreciated by the skilled artisan.

Nasleduje abecedný zoznam citácií uvedených v Príkladoch 18 až 25.The following is an alphabetical list of references cited in Examples 18 to 25.

Tabuľka 1: Porovnanie podobností sekvencií extracelulámych častí CHL1 a iných molekúl podobných LlTable 1: Comparison of sequence similarities of extracellular portions of CHL1 and other L1-like molecules

ŕ-< ' 1 o — w k CO — ŕ- <' 1 o - w to CO - an •4 an • 4 ^4 ^4 ^ 4 ^ 4 •*e d • * e D 1S 1S O ABOUT d D in and OJ OJ m m X *4 ΗΊ· X * 4 · «» «» w w •4 • 4 d D •4 • 4 •4 • 4 *í * s tb tb d D d D an an d e •m d e • m in and •v •in »4 »4 »4 »4 *4 * 4 *4 * 4 c C - - « « ^4 ^ 4 O* ABOUT* •4 • 4 d D w w O ABOUT d D d D d D r4. r4. ^4 ^ 4 »4 »4 •4 • 4 S O Ό c WITH O Ό c ^4 ^ 4 • • 00 00 40 40 irt IRT r* r * tO tO d D to it •4 U U • 4 U U d D d D d D d D »4 »4 d D »4 »4 •4 • 4 C C 4 4 o about « « o about 4» 4 » t* t * an an in and TT TT d D d D an an O 3 — «I O C ** ABOUT 3 - «I O C ** d D d D d D d D ď ï »4 »4 r4' r4 ' »4 »4 *4 * 4 5 o — 5 about - ď ï t0 t0 to it m m r- r- m m d D W W u u z —- u u z —- d D d D n n d D m m d D *4 * 4 •4 • 4 «-4 «-4 •4 • 4 5 o — 5 about - tft TFT r» r » o about to it r*· r * · to it r* r * r4 r4 d D r* r * o* u £ o * u £ d D d D m m d D d D d D *4 * 4 •4 • 4 d D v4 v4 r* r * d D «Ο «Ο <o <o «Ο «Ο 00 00 r* r * σ» σ » d D in and Wl wl -í E J — -í E J - tn tn d D d D m m d D d D d D r4 r4 r4 r4 *4 * 4 «4 «4 »4 »4 r* r * o* about* m m tO tO 00 00 d D r* r * p* p * r* r * •4 • 4 tn tn to it sa the d D n n d D d D d D d D d D d D d D c4 c4 •4 • 4 d D •4 • 4 o about XJ XJ c C —4 -4 c C 4—. 4. «»«, «» « o about «0 «0 O ABOUT u at (D (D Mu him u at lu lu ·—· · - · <0 <0 N N «-4 «-4 «»» «» » JZ JZ E E «*«. «*«. MU MU Ρ» Ρ » X X E E «Μ» «Μ» E E x x x x o about o about E E 4 4 ^4 ^ 4 2 2 Λ Λ M M »4 »4 u at 1 1 1 1 CC CC X X υ υ O ABOUT a and • • 3 3 o about o about u at ^4 ^ 4 «c «c 2 2 •4 • 4 θ’ θ ' U U « « 4 4 O ABOUT d D < < •4 • 4 o about X X u at u at J J Z FROM z from c C J J C C u· u · H H ffi ffi o about x x z from z from

sú uvedené v zátvorkách: c = kurča, d = Drozofila, h = človek, m = myš, r = krysa a zf= zebrička.are shown in brackets: c = chicken, d = Drosophila, h = human, m = mouse, r = rat and zf = zebra.

-97Tabuľka 2: Porovnanie podobností sekvencii extracelulárnych častí molekúl podobných LlTable 2: Sequence Comparison of Extracellular Parts of L1-like Molecules

£ M «4 £ M «4 o* about* «·» «·» - - •k • to •n • n g 3 g 3 3 3 M- M- r* r * o about s with c* c * Ϊ í Ϊ s 2 2 S WITH = = e*ť e * t «1 «1 ** ** £ J í £ J s r- r- e* w e * w <* Λ <* Λ •M • M r* r * - - ΒΛ ΒΛ «n «n s J) 1 with J) 1 BO BO •n w • n w s with o w about w •n • n O <*· ABOUT <* · o about ΒΛ ΒΛ Brt Brt •c* K s < • c * The with < 8 8 r* r * O «r ABOUT «r w w K The r* r * O ABOUT o about ΒΛ ΒΛ V» IN" s δ £ with δ £ ·*» · » Φ·» w Φ · » w o about 2 2 s with r»· r »· «· «· Ok OK o about ·»» · »» B© © B S 2 í X WITH 2 s X •*1 «r • * 1 «r 3 3 «Λ Μ» «Λ Μ » 8 8 O ABOUT ΒΛ ΒΛ «· «· m m = = ₌₌ r* r * ** ä 2 i ** ä 2 and S WITH · · 3 3 3 3 <1 <1 w w bo w bo w o* about* •o •about s with - - r* r * <M <M 2« *ľ i 3 2 ' * l and 3 •rt • rt 2 2 ts ts 3 3 2 2 v* in* 3 3 Zo from 2 2 r- r- o about r- r- *O *ABOUT 3 i 3 and r* *** r * *** 3 3 •x o • x about Λ w Λ w Ο» *> Ο » *> r* *0 r * * 0 2 2 «k «to •n • n X» v*k X » * in the - - r* r * • ŕ 3 • à 3 5 2 < y z 5 2 < y from v 2 $ Z in 2 $ FROM M 2 < U M Z M 2 < U M FROM «L S < «L WITH < 1 Λ X é 9 a 1 Λ X s 9 and V .B X i i IN .B X and and g J y i g J y and 5 3 5 3 S r* 3 WITH r * 3 S WITH <s .s 3 x <a .with 3 x «*· r- b. O í «* · r- b. ABOUT s g o •v 5 < u z g about •in 5 < at from J o O. J about ABOUT.

£ U ifl-s t β·«·§£ Ifl-s t β · «· §

Tabuľka 3: Štruktúrna príbuznosť medzi členmi rodiny Ll a inými členmi rodiny Ig obsahujúcimi domény C2Table 3: Structural relationship between L1 family members and other Ig family members containing C2 domains

<M ·*» <M · » •n • n •k *r • to * r Ok *r OK * r Ok •o OK •about 40 40 w •O w •ABOUT τ- ο* τ- ο * 3 3 ·» _ *o · » _ *about •Λ •O • Λ •ABOUT 40 40 n n =— = - 2 2 **· *r. ** · * R. <«· W < «· W es w· es w · Π w Π w r· *r r · * r O ABOUT «*· •o «* · •about r· r · w w O· W ABOUT· W ' x> d 'x> d Ok W OK W 40’ jr 40 ' jr ·«' · '' 4T 4T ·> w ·> w Ok W _ OK W _ •k' 40 ' • k ' 40 ' «k «to r* w r * w w w - - Ok , OK , ·* d · * D Ok ok OK OK 3 3 3 3 •3 • 3 3 3 3 3 3 3 w w **» ** » 40 4» 40 4 » Ok O OK ABOUT 3 3 40 d. 40 d. w w O 4r. ABOUT 4r. ao' 4» and on ' 4 » W Jf W jf s with «k w «to w Ok OK S WITH Si Are you e •o e •about o' 40 about' 40 τ- ο τ- ο r* 4» r * 4 » • OC ••k • OC •• the Ok «V OK "IN •o •about «· 4T «· 4T 40 40 40 40 40 4Γ 40 4Γ Ok OK T •o T •about c* *r c * * r W. W. wr wr C* w C * w r*a w and r * w •o •about r· w r · w r*· o r * · about ·*· * · · r· o r · about •o d •about D <*· •r _ <* · • r _ T4 4T T4 4T TM TM r*· o r * · about •o Jt •about Others w w 40 40 o about «· «· w w o» about" to o it about *» w » w r- 4r r- 4r w w ’ **2 ** 2 Ο» or Ο » or 40 40 Ok Ο» OK Ο » 3 3 3 3 <íi <II V» IN" *k * to 40 40 40 40 40 40 *40 Ok * 40 OK «e •o «e •about • • 3 3 e* wo e * wo T4 *k T4 * to 40 40 40 40 e-ζ e-ζ Ok o OK about 40 O 40 ABOUT 40 o 40 about 3 3 Ό ' Ό ' r* •JT r * • JT «Ο «Ο 40 40 *k * to •k • to 55 55 • •o 40 • •about 40 JT« •o JT ' •about •M 40 • M 40 •o 40 •about 40 40 40 r* d r * D Ok OK 4» 4 » S WITH •O •ABOUT Ok 40 OK 40 «*· «* · 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 •n • n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 m d m D 3 3 Ok 4» OK 4 » Ο» w Ο » w Ok .40 4 t OK .40 4 T •O 4» •ABOUT 4 » 5 5 S WITH CAMi Cami Σ3 Σ3 3 x u 3 x at 3 δ «· x 3 δ «· x 3 $ Z 3 $ FROM a. S < a. WITH < □ □ .3 i .3 and Ú < B- OJ < B- Ó S ABOUT WITH C C <1 J > < <1 J > < a va and va u 8 at 8 OC 5 X OC 5 X s with 2 < z 2 < from T o 2 T about 2 .9 3 X 3 S š .9 3 X 3 WITH with c- B -S 1 Jft c- B -WITH 1 JFT

V IN

- - -y-td -J------»n- - -y-td -J ------ »n

| | «Κ 3 «Κ 3 vt 3 vt 3 vt r* vt r * * S * WITH vt S vt WITH w 3 w 3 M· 3 M · 3 M 3 M 3 Wt 3 Wt 3 « 3 « 3 wt s wt with CM © CM © w m m w m m WK WK M M Mt. •m Mt. • m Mt © Mt © š with ©k © k ©k © k cm' V» cm 'V » ©Z © Z CM ©k CM © k 3 3 r- © r- © r* © r * © ©k © k k© •M the © • M ©k © k •n ©k • n © k 3 3 I I r- r- mc mc © © w w w w T*· mc T * · mc - - © © s with © © © © ©» O © » ABOUT ©» © » © © © © C* MC C * MC •n £ • n £ *ϊ * ϊ ©k © k • P • P ** ** ©k © k cm cm ©k ©k © k © k ©k © k r· ©» r · © » • ' © • ' © 3 3 ©i © i ©k © k k© © the © © 3 3 š with ο» ΜΤ ο » ΜΤ © mt © mt ©k © k © mt © mt © W © W «X © «X © «X © «X © © © © © «* © «* © <x <x «e o «e about ©k © © k © © © ·· © · · © g g © «τ © «τ «X *» «X » • t* ©k • t * © k Si Are you 3 3 3 3 CM CM ©k © k •n «1 • n «1 *» •k » • to ©k © k © © k© © the © © O ©k ABOUT © k © © © © «V "IN kO MC kO MC š i with and s with - - s with 3 3 3 3 3 3 3 3 s with O ©k ABOUT © k O ©k ABOUT © k o ©» about © » O O ABOUT ABOUT o ©k about © k ©k © © k © *r * r k© •O the © •ABOUT CM © CM © e e s with ·» · » s? with? 3 3 O ©k ABOUT © k S WITH O ©k ABOUT © k ©k © k ©i ©k © i © k ©» ©k © » © k MC MC <x © <x © «Ο © «Ο © © © © © ©k ck © k ck ©k MC © k MC É j, Λ É j. Λ 3 3 W W s with • «n • «n • 3 • 3 - - e e - - - - - - - - CM CM 5 < o 5 < about 3 3 3 z u 3 from at 2 < u M Z 2 < at M FROM 2 < V Z 2 < IN FROM K § < The § < 3 3 J y □ x J y □ x ó < »- about < »- ô £ about £ c C v y > < in y > < C ©> C ©> U E U E OL 3 OL 3 s with 3 < U Z 3 < U FROM o 5 about 5 .5 5 St 9 C β S w e .5 5 Wed 9 C β WITH w e C 5 a S J5 tZ C 5 and WITH J5 tZ

fV - 97fV-97

Claims (21)

1. Rekombinantná molekula DNA na podporu rastu in vivo v centrálnej nervovej sústave cicavca obsahujúca látku vybranú zo skupiny skladajúcej sa z Ll, N-CAM a glykoproteínu asociovaného s myelínom, látku odvodenú z molekúl, ktoré obsahujú štruktúrne motívy podobné homológnym opakovaniam 1 až 2 vo fibronektíne typu III a doménam podobným imunoglobínu I až II, III až IV a V až VI, ktoré sú spojené s expresnou kontrolnou sekvenciou.A recombinant DNA molecule for in vivo growth in a mammalian central nervous system comprising a substance selected from the group consisting of L1, N-CAM and a myelin-associated glycoprotein, a substance derived from molecules comprising structural motifs similar to homologous repeats 1 to 2 in fibronectin type III and immunoglobin-like domains I to II, III to IV and V to VI, which are associated with an expression control sequence. 2. Vektor obsahujúci rekombinantnú molekulu DNA podľa nároku 1.A vector comprising the recombinant DNA molecule of claim 1. 3. Transformovaný hostiteľ obsahujúci vektor podľa nároku 2.A transformed host comprising the vector of claim 2. 4. Protilátka vyvolaná proti látke podľa nároku 1 až 3 obsahujúca polyklonálnu alebo monoklonálnu protilátku.An antibody raised against a substance according to claims 1 to 3 comprising a polyclonal or monoclonal antibody. 5. Bunková kultúra obsahujúca gliové bunky transgénnych cicavcov podľa jedného z nárokov 1 až 4.A cell culture comprising glial cells of transgenic mammals according to one of claims 1 to 4. 6. Bunkový tkanivový systém podľa nároku 5 obsahujúci tkanivo z nervovej centrálnej sústavy bunky transgénnych cicavcov.The cell tissue system of claim 5 comprising tissue from the nerve central system of a transgenic mammalian cell. 7. Transgénne cicavce podľa nároku 6 obsahujúce gliové bunky, ktoré exprimujú exogénnu nervovú adhéznu molekulu.The transgenic mammal of claim 6 comprising glial cells that express an exogenous neural adhesion molecule. 8. Transgénne cicavce podľa nároku 7, kde gliovými bunkami sú astrocyty.The transgenic mammal of claim 7, wherein the glial cells are astrocytes. 9. Transgénne cicavce podľa nároku 7, kde nervovou adhéznou molekulou je Ll.The transgenic mammal of claim 7, wherein the neural adhesion molecule is L1. 10. Farmaceutický prostriedok na úpravu nervového rastu v centrálnej nervovej sústave cicavca podľa nárokov 1 až 6,A pharmaceutical composition for treating nerve growth in a mammalian central nervous system according to claims 1 to 6, - 9«- 9 « 11211 vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo látky, protilátky a farmaceutický prijateľných nosičov.11211, characterized in that it comprises a therapeutically effective amount of the agent, the antibody and pharmaceutically acceptable carriers. 11. Spôsob testovania schopnosti látky alebo inej entity upravovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že obsahujeA method for testing the ability of a substance or other entity to modify the activity of a neural adhesion molecule according to claims 1 to 10, comprising: a) pridávanie neurónov CNS do bunkového tkanivového systému podľa nároku 5;a) adding CNS neurons to the cell tissue system of claim 5; b) pridávanie testovanej látky do bunkového tkanivového systému;b) adding the test substance to the cell tissue system; c) meranie nervového rastu neurónov CNS; ac) measuring nerve growth of the CNS neurons; and d) korelovanie rozdielu v hladine nervového rastu buniek obsahujúcich túto látku vzhľadom na kontrolnú kultúru, do ktorej nebola žiadna taká látka pridaná.(d) correlating the difference in the level of nerve growth of cells containing the substance with respect to a control culture to which no such substance has been added. 12. Spôsob testovania schopnosti látky alebo inej entity upravovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že obsahujeA method for testing the ability of a substance or other entity to modify the activity of a neural adhesion molecule according to claims 1 to 10, comprising: a) pridávanie neurónov CNS do bunkového tkanivového systému podľa nároku 6;a) adding CNS neurons to the cell tissue system of claim 6; b) pridávanie testovanej látky do bunkového tkanivového systému;b) adding the test substance to the cell tissue system; c) meranie nervového rastu neurónov CNS; ac) measuring nerve growth of the CNS neurons; and d) korelovanie rozdielu v hladine nervového rastu buniek obsahujúcich túto látku vzhľadom na kontrolnú kultúru, do ktorej nebola žiadna taká látka pridaná.(d) correlating the difference in the level of nerve growth of cells containing the substance with respect to a control culture to which no such substance has been added. 13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že nervovou adhéznou molekulou je Ll.The method of claim 11, wherein the neural adhesion molecule is L1. 14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že nervovou adhéznou molekulou je Ll.14. The method of claim 12, wherein the neural adhesion molecule is L1. 15. Skúškový systém na testovanie látok a iných činidiel na schopncjsť upravovať produkciu nervovej adhéznej molekuly podľa nárokov 11 až 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuj eAn assay system for testing substances and other agents for the ability to modulate the production of a neural adhesion molecule according to claims 11 to 14, comprising: 1121111211 a) pestovanie bunkového tkanivového systému podľa nároku 5 zaočkovaného látkou alebo činidlom;a) culturing the cell tissue system of claim 5 inoculated with a substance or agent; b) pridávanie neurónov CNS do bunkového tkanivového systému kroku a); ab) adding CNS neurons to the cell tissue system of step a); and c) meranie nervového rastu za účelom určenia vplyvu látky na vyššie uvedené.(c) measuring nerve growth to determine the effect of the substance on the above. 16. Skúškový sysxém na testovanie látok a iných činidiel na schopnosť upravovať produkciu nervovej adhéznej molekuly podľa nárokov 11 až 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuj eAn assay system for testing substances and other agents for the ability to modulate the production of a neural adhesion molecule according to claims 11 to 14, comprising: a) pestovanie bunkového tkanivového systému podľa nároku 6 zaočkovaného látkou alebo činidlom;a) culturing the cell tissue system of claim 6 inoculated with a substance or agent; b) pridávanie neurónov CNS do bunkového tkanivového systému kroku a); ab) adding CNS neurons to the cell tissue system of step a); and c) meranie nervového rastu za účelom určenia vplyvu látky na vyššie uvedené.(c) measuring nerve growth to determine the effect of the substance on the above. 17. Skúškový systém podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že nervová adhézna molekula je vybratá zo skupiny skladajúcej sa z laminínu, fibronekxínu, N-cadhedrínu, BSP-2 (myší N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NÍLE, Nr-CAM, TAG-1 (axonín-1), Ng-CAM a F3/F11.The assay system of claim 15, wherein the neural adhesion molecule is selected from the group consisting of laminin, fibronecxin, N-cadhedrin, BSP-2 (mouse N-CAM), D-2, 224-1A6-A1 , L1-CAM, NIL, Nr-CAM, TAG-1 (axonin-1), Ng-CAM, and F3 / F11. 18. Skúškový systém podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že nervovou adhéznou molekulou je Ll.The assay system of claim 15, wherein the neural adhesion molecule is L1. 19. Skúškový systém podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že nervová adhézna molekula je vybratá zo skupiny skladajúcej sa z laminínu, fibronektínu, N-cadhedrínu, BSP-2 (myší N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NÍLE, Nr-CAM, TAG-1 (axonín-1), Ng-CAM a F3/F11.The assay system of claim 16, wherein the neural adhesion molecule is selected from the group consisting of laminin, fibronectin, N-cadhedrin, BSP-2 (mouse N-CAM), D-2, 224-1A6-A1 , L1-CAM, NIL, Nr-CAM, TAG-1 (axonin-1), Ng-CAM, and F3 / F11. 20. Skúškový systém podľa nároku 16,vyznačujúci sa tým, že nervovou adhéznou molekulou je Ll.20. The assay system of claim 16, wherein the neural adhesion molecule is L1. 21. Použitie farmaceutického prostriedku podľa nároku 10 naUse of a pharmaceutical composition according to claim 10 for - -’ÍC 11211 prípravu liečiva na zvýšenie synaptickej výkonnosti centrálnej nervovej sústavy, na posilňovanie nervového rastu neurónov, posilňovanie pamäte, na testovanie schopnosti látky alebo inej entity upravovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly.- 11211, the preparation of a medicament for enhancing the synaptic performance of the central nervous system, enhancing neuronal growth of neurons, enhancing memory, testing the ability of a substance or other entity to modulate the activity of a neural adhesion molecule. i ii i hTQhTQ 7>ť ?··?7>?? ··? I—hI-h 1kb1 kilobyte