SK142497A3 - Recombinant dna molecule, vector, transformed host, an antibody, cell culture and cell system, transgenic mammals, pharmaceutical composition, method of testing drug, assay system suitable for such method, and use of pharmaceutical composition - Google Patents

Recombinant dna molecule, vector, transformed host, an antibody, cell culture and cell system, transgenic mammals, pharmaceutical composition, method of testing drug, assay system suitable for such method, and use of pharmaceutical composition Download PDF

Info

Publication number
SK142497A3
SK142497A3 SK1424-97A SK142497A SK142497A3 SK 142497 A3 SK142497 A3 SK 142497A3 SK 142497 A SK142497 A SK 142497A SK 142497 A3 SK142497 A3 SK 142497A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cells
chl1
adhesion molecule
substance
cam
Prior art date
Application number
SK1424-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Melitta Schachner
Original Assignee
Acorda Therapeutics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acorda Therapeutics filed Critical Acorda Therapeutics
Publication of SK142497A3 publication Critical patent/SK142497A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

Je opísaná rekombinantná molekula DNA na podporu rastu in vivo v centrálnej nervovej sústave (CNS) cicavca obsahujúca látku vybranú zo skupiny skladajúcej sa z Ll, N-CAM a glykoproteinu asociovaného s myelínom, látku odvodenú z molekúl, ktoré obsahujú štruktúrne motívy podobné homológnym opakovaniam 1 až 2 vo fibronektíne typu III a doménam podobným imunoglobfnu I až II, III až IV a V až VI, ktoré sú spojené s expresnou kontrolnou sekvenciou, modulácia rastu neurónov v CNS, spôsoby a sprievodné látky, konštrukcie a prostriedky prispievajúce k zlepšeniu rastu neurónov v CNS. Ďalej je opísané používanie bunkových adhéznych molekúl, predovšetkým nervových adhéznych molekúl, ako aj L1 na podporu a zlepšenie takého rastu neurónov.
Pť
Rekombinantná molekula DNA, vektor, transformovaný hostite!, protilátka, bunková kultúra a bunkový systém, transgénne cicavce, farmaceutický prostriedok, spôsob testovania látky a skúškový systém tohto testovania a použitie farmaceutického prostriedku
Oblasť techniky
Preložený vynález sa všeobecne týka modulácie rastu neurónov (nervových buniek) v centrálnej nervovej sústave a zvlášť spôsobov a sprievodných látok, konštrukcií a prostriedkov prispievajúcich k zlepšeniu rastu neurónov v centrálnej nervovej sústave. Predložený vynález sa týka najmä používania bunkových adhéznych molekúl a predovšetkým nervových adhéznych molekúl, ako je L1, za účelom podpory a zlepšenia takéhoto rastu neurónov.
Doterajší stav techniky
Schopnosť neurónov predlžovať neurity je veľmi dôležitá pre tvorbu nervových spojení počas vývoja nervovej sústavy. Táto schopnosť je tiež potrebná na tvorbu nových spojení počas regenerácie, ak bola nervová sústava poškodená v dôsledku poranenia.
Neurity sa predlžujú predovšetkým počas vývoja centrálnej a periférnej nervovej sústavy všetkých druhov vyšších organizmov (Cajal (1928) Degeneration and regeneration in nervous systém, Oxford University Press, London). Táto vlastnosť prislúcha axónom a dendritom. Avšak u dospelých organizmov je obnovený rast axónov a dendritov v centrálnej nervovej sústave zastavený.
V periférnej nervovej sústave sú axóny všetkých
r.
11211 stavovcov schopné po spôsobenom poranení opäť rásť (Cajal (1928); Martini (1994) J.Neurocytol. 23:1-28). Avšak u cicavcov je obnovený rast neuritov po poranení obmedzený len na neuritové výbežky. Obnovený rast v nervových procesoch je však možný u nižších druhov stavovcov (Stuermer et al. (1992) J.Neurobiol. 23:537-550). Naopak v centrálnej nervovej sústave má potenciál pre obnovený rast neuritov väčšina, ak nie všetky neuróny dospelých vyšších aj nižších stavovcov (Aguayo (1995) Axonal regeneration from injured neurons in the adult mamina lián centrál nervous systém. In:Synaptic Plasticity (Cotman, C. W.,ed.,) New York, The Guildford Press, pp.457-484).
Gliové bunky sú rozhodujúce determinanty kontrolujúce obnovený rast axónov. Gliové bunky cicavcov všeobecne umožňujú rast neuritov v centrálnej nervovej sústave počas vývoja (Silver et al. (1982) J. Comp. Neurol. 210:10-29; Niller et al. (1985) Develop. Biol. 111:35-41; Pollerberg et al. (1985) J. Celí. Biol. 101:1921-1929 a v periférnej nervovej sústave dospelých jedincov (Fawcett et al. (1990) Annu. Rev. Neuroscí. 13:43-60). Gliové bunky dospelej periférnej nervovej sústavy cicavcov môžu po spôsobenom poranení revertovať do určitého rozsahu na ich predchádzajúci rastový potenciál, čo im umožňuje podporovať regeneráciu (Kalderon (1988) J. Neurosci. Res. 21:501-512; Kliot et al. Included regeneration of dorsal root fibres into the adult mammalian spínal cord, In: Current Issues in Neural Regeneration, New York, pp. 311-328; Calstedt et al. (1989) Brain Res. Bull. 22:93-102). Gliové bunky centrálnej nervovej sústavy niektorých nižších stavovcov zostávajú permisívne na rast neuritov v dospelosti (Stuermer et al. (1992) J. Neurobiol. 23:537-550). Naopak gliové bunky centrálnej nervovej sústavy dospelých cicavcov nie sú schopné podporovať obnovenie rastu neuritov po poranení.
Niekoľko rozpoznávacích molekúl, ktoré vydávajú pokyn na podporu alebo zastavenie rastu neuritov bolo identifikovaných (Martini (1996)). Medzi rozpoznávacími
11211 molekulami podporujúcimi rast neuritov má prominentný význam nervová bunková adhézna molekula L1 (Schachner (1990) Seminars in the Neurosciences 2:497-507). Rast neuritov závislý na molekule L1 je sprostredkovaný homofilnou interakciou. L1 zosilňuje rast neuritov na neuritoch a Schwannových bunkách, ktoré exprimujú fibroblastoch transfekovaných molekulou L1
Ll, a na (Bixby et al.
Natl. Acad. Sci (1982) Proc et al. (1987)
U. S. A 84:2555-2559; Chang (1987) J. Celí Biol. 104:355-362; Lagenaur et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84:7753-7757;
Seiheimer et al. (1988) J. Celí Biol. 107:341-351; Kadmon et al. (1990a) J. Celí Biol. 110:193-208; Wililams et al. (1992) J. Celí Biol. 119:883-892). Expresia Ll je značne zosilnená u dospelých myší po prerušení periférnych nervov (Nieke et al. (1985) Differentiation 30:141-151; Martini et al (1994a) Glia 10:70-74). Počas dvoch dní sa Ll nahromadí v miestach kontaktu medzi neurónmi a Schwannovými bunkami, kde sú koncentrované hlavne na bunkovom povrchu Schwannových buniek, a nie neurónov (Martini et al. (1994a)). Schopnosť homofilickej väzby molekuly Ll je ďalej zosilnená molekulárnou asociáciou s nervovou bunkovou adhéznou molekulou N-CAM (Kadmon et al. (1990a); Kadmon et al. (1990b) J. Celí Biol. 110:209-218 a 110:193-208; Horstkorte et al. (1993) J. Celí Biol. 121:1409-1421). Okrem svojich vlastností, ktoré podporujú rast neuritov, sa Ll zúčastňuje tiež na bunkovej adhézii (Rathjen et al. (1984) EMBO J. 3:1-10; .Kadmon et al. (1990b) J. Celí Biol.
110:209-218; Appel et al. (1993) J. Neurosci.
13:4764-4775), ďalej na migrácii granulových buniek (Lindner et al. (1983) Náture 305:427-430) a tiež na myelinácii axónov (Vood et al.(1990) J. Neurosci. 10:3635-3645).
Ll obsahuje šesť imunoglohulínových domén a päť homológnych opakovaní podobných fibronektínu typu III. Ll pôsobí ako signálový prevodník, pričom proces rozpoznávania je prvým krokom v komplexnej sérii udalostí vedúcich ku zmenám v ustálenej úrovni intracelulárnych poslov. Týchto
11211 poslov zahŕňajú inozitol fosfáty, Caz+ , pH a cyklické nukleotidy. (Schuch et al. (1990) Neurón 3:13-20; von Bohlen a Hallbach et al. (1992) Eur. J. Neurosci. 4:896-909; Doherty et al. (1990) Curr. Opin. Neurobiol. 2:595-601), rovnako ako zmeny v aktivitách proteín kináz, ako sú proteín kináza C a pp60c“erc (Schuch et al. (1990) Neurón 3:13-20; átashi et al. (1992) Neurón 8:831-842). Ll je tiež asociovaná s kazeín kinázou typu II a inými neidentifikovanými kinázami, ktoré Ll fosforizujú (Sadoul et al. (1989) J. Neurochem. 328:251-254). Rast neuritov sprostredkovaný molekulou Ll je citlivý na blokovanie kanálu Ca2 + typu L a na toxíne čierneho kašla (pertussis). Tieto nálezy ukazujú na dôležitosť kanálu Ca2 + a proteinov G pri raste neuritov sprostredkovanom molekulou Ll (Williams et al. (1992) J. Celí Biol. 119:883-892). Molekula Ll je tiež prítomná na proliferujúcich, nezrelých astrocytoch v kultúre. Neuritový rast je na týchto bunkách podporovaný ovela lepšie na nediferencovaných, Ll imunonegatívnych, astrocytoch (Saad et al. (1991) J. Celí Biol. 115:473-484). Avšak v podmienkach in vivo bolo zistené, že astrocyty exprimujú Ll počas akéhokolvek vývojového stavu začínajúc 13. dňom embryonálneho vývoja až do dospelosti (Bartsch et al. (1989) J. Comp. Neurol. 284:451-462; a nepublikované údaje).
Ak má Ll kapacitu podporovať rast neuritov, je nutné zistiť, či expresia Ll a iných členov imunoglobulínovej rodiny v astrocytoch môže obísť potenciálne inhibičné molekulárne cesty, ktoré sa uvádzajú, že sú prítomné na gliových bunkách a myelíne v dospelej centrálnej nervovej sústave Schachner et al., Perspectives in Developm. Neurobiol. in Press: Schwab et al. (1993) ann. Rev. Neurosci. 16:565-595). Toto má zvláštny význam pre vývoj účinných stratégií slúžiacich na liečbu slabosti spôsobenej porušením alebo poranením nervových tkanív CNS a týka sa to podstaty tohoto vynálezu.
11211
Podstata vynálezu
V súlade s predloženým vynálezom a príslušné spôsoby vedúce k modulácii a najmä k takému rastu, ktorý môže v centrálnej nervovej sústave (CNS) v myelínovanom nervovom predloženého vynálezu, je opísaná látka nervového rastu byt podporovaný a predovšetkým tkanive. Látky, ktoré sú predmetom sú význačné vo svojej schopnosti podporovať taký nervový rast v prostredí, na ktoré sa tradične pozeralo ako na inhihujúce známe rastové faktory. Toto inhihujúce prostredie zahŕňa hlavne tie inhibičné molekuly, ktoré sú prítomné na gliových bunkách a myelíne centrálnej nervovej sústavy.
Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, patria do skupiny nervových bunkových adhéznych molekúl. Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, sú vybrané zo skupiny molekúl patriacich do imunoglohulínovej rodiny, obzvlášť tých členov, ktorí sprostredkovávajú nervovú bunkovú adhéziu nezávislú na Ca2 +. Do tejto skupiny patria L1, N-CAM a glykoproteín asociovaný s myelínom. Iné bunkové adhézne molekuly, ktoré môžu tiež ovplyvňovať nervový rast v CNS sú laminín, fihronektín, N-cadhedrín, BSP-2 (myši N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NÍLE, Nr-CAM, TAG-1 (axonín), Ng-CAM a F3/F11.
Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, patria do novej rodiny tu uvádzanej ako rodina L1 nervových rekogničných molekúl. Táto rodina zahŕňa Ll, NgCAM, neurofascín, neuroglian z Drosophily, Ll.1 a L1.2 zo zehričky a iné molekuly. Táto skupina látok obsahuje domény podobné imunoglohulínu a opakovanie podobné fihronektínu, ktoré sú charakteristické u Ll a v tejto súvislosti vykazujú pozoruhodnú kolinearitu, vysoký stupeň N-glykozidicky spojených karbohydrátov, ktoré zahŕňajú karbohydrátovú štruktúru HNK-1, a vykazujú vzor proteínových fragmentov obsahujúcich hlavný pruh 185 kD a menšie pruhy 165 a 125 kD.
Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, tiež
11211 zahŕňajú fragmenty bunkových adhéznych molekúl a ich napodobeniny, ktoré modulujú rast neuritov v CNS. Tieto látky zahŕňajú zvlášť molekuly, ktoré obsahujú štruktúrne motívy charakteristické pre extracelulárny matrix, najmä opakovania podobné fibronektinu typu III a doménam podobným imunoglobulínu. Tieto štruktúrne motívy zahŕňajú predovšetkým tie, ktoré sú štruktúrne podobné opakovaniam 1 až 2 u fibronektinu typu III a doménam podobným imunoglobulínu I až II, III až IV a V až VI.
Predložený vynález sa týka spôsobov podporujúcich a zosilňujúcich nervovú regeneráciu in vivo a príslušných genetických konštrukcií, ako sú plazmidy, vektory, transgény, apod., a tiež farmaceutických prostriedkov, ktoré môžu byť použité na zvládnutie podstaty týchto spôsobov. Látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu byť pripravené najmä ako vektory alebo plazmidy a vnesené do nervových buniek centrálnej nervovej sústavy, teda tam, kde je regenerácia potrebná, napr. technikami génovej terapie tak, aby došlo k podpore požadovaného nervového rastu. Iná stratégia má za ciel formuláciu jednej alebo viacerých látok v prostriedku, ktorý môže byť podobne priamo dopravený na miesto CNS, ako je parenterálne podanie. Podanie takéhoto prostriedku môže skôr slúžiť za účelom inhibície než podpory nervového rastu vplyvom homofilickej väzby. Tento efekt môže byť potrebný v zvláštnych prípadoch, kde sa môže objaviť alebo sa už objavuje nežiadúci alebo nekontrolovateíný rast, čoho sa rozšírené týka tento vynález.
V zhode s tým schopnosť látok podielať sa na homofilickej väzbe spôsobuje schopnosť antagonistov k týmto látkam, vrátane protilátok, pôsobiť ako aktivátory a tým participovať na podpore nervového rastu a regenerácii. Tento vynález sa tak rozšírené týka aj prípravy vhodných konštrukcií a prípravkov obsahujúcich protilátky k týmto látkam za účelom terapeutického použitia. Protilátky k L1 môžu tiež, napr., napomáhať sčasti ku skúškam vedúcim k objavu týchto látok alebo k identifikácii ďalších látok,
11211 ktoré môžu mat aktivitu a využitie ako v diagnostike, tak aj v terapii, v zhode s predloženým vynálezom. Hlavne, ako je opísané nižšie s odkazom na izoláciu a charakterizáciu CHL1, čo je analóg L1, protilátky ako polyklonálne protilátky môžu byt použité na identifikáciu ďalších členov rodiny L1 CAM molekúl. Predložený vynález sa teda rozšírené týka aj takýchto členov CAM, ktoré sú izolované použitím týchto protilátok. Tento vynález tiež zahŕňa diagnostické aplikácie, kde je napríklad potrebné určiť potenciál pre nervový rast, alebo pre aktuálny vývoj tohoto rastu v CNS pomocou detekcie a merania prítomnosti, množstva a aktivity jednej alebo viacerých látok, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu. Podobne, ako je opísané nižšie, tento vynález sa týka skúšok, vrátane skúšok vedúcich k objavu týchto látok, ktoré aktivujú látky, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu. Napr., nejaké látky môžu byt testované na moduláciu pomocou skúšky obsahujúcej látku, ktorá je predmetom predloženého vynálezu, alebo bunkovú líniu alebo kultúru vyvinutú v spojení s ňou.
Krátko opísané, predložený vynález tiež zahŕňa transgénne myšie línie exprimujúce nervovú adhéznu molekulu v diferencovaných astrocytoch a gliových bunkách a v bunkách a v tkanivách z nich odvodených. Toto sa týka obzvlášť nervovej adhéznej molekuly L1. Astrogliálna expresia L1 zosilňuje rast neuritov v tkanive centrálnej nervovej sústavy odvodenej z týchto transgénnych myší.
Tiež, ako je opísané, tento vynález zahŕňa spôsoby vedúce k zosilneniu rastu neurónov CNS, k zlepšeniu pamäti a ku zvýšeniu synaptickej výkonnosti, ako je to merané pomocou stabilizácie dlhodobej potenciácie a inými podobne užitočnými metódami. Zahrnuté sú tiež spôsoby testovania látok a iné manipulácie, ktoré upravujú pôsobenie tejto nervovej adhéznej molekuly.
V zhode s tým je hlavnou podstatou tohoto vynálezu poskytnúť transgénny organizmus cicavca, ktorého gliové bunky exprimujú exogénne nervové adhézne molekuly.
11211
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť bunkovú kultúru obsahujúcu gliové bunky transgénneho organizmu cicavca.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť systém bunkovej kultúry obsahujúci poškodené alebo nepoškodené optické neuróny alebo iné časti nervového systému transgénneho organizmu cicavca.
Ešte ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako posilniť nervový rast neurónov CNS, ktorý zahŕňa pestovanie týchto neurónov na systéme kultúry gliových buniek.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob ako posilniť nervový rast neurónov CNS, ktorý zahŕňa pestovanie týchto neurónov na optických neurónoch alebo iných častiach nervového systému umiestnenom v systéme bunkovej kultúry.
Ešte ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako posilniť rast neurónov CNS, ktorý zahŕňa sekréciu nervovej adhéznej molekuly implantovanou bunkou.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť pamäť, čo zahŕňa aplikáciu množstva buniek optického nervu alebo iných častí nervového systému umiestnených v systéme bunkovej kultúry do mozgu cicavca za účelom zlepšenia pamäti.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť pamäť, zahŕňajúce dopravenie vektoru, ktorý umožňuje expresiu nervovej adhéznej molekuly v gliových bunkách, ku gliovým bunkám mozgu cicavca, ktorý má potrebu takéhoto zlepšenia pamäti.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť pamäť, čo zahŕňa sekréciu nervovej adhéznej molekuly implantovanou bunkou.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť synaptickú účinnosť v CNS cicavca, ktorý má túto potrebu, zahŕňajúci podávanie množstva buniek systému gliovej bunkovej kultúry do mozgu cicavca.
11211
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť synaptickú výkonnosť v CNS cicavca, ktorý má túto potrebu, zahŕňajúci podávanie množstva buniek optického nervu alebo iných častí nervového systému umiestnených v systéme bunkovej kultúry do mozgu cicavca.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť synaptickú účinnosť v CNS cicavca, ktorý má túto potrebu, čo zahŕňa dopravenie vektoru, ktorý umožňuje expresiu nervovej adhéznej molekuly v gliových bunkách, do gliových buniek mozgu cicavca.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob, ako zlepšiť synaptickú výkonnosť, čo zahŕňa sekréciu nervovej adhéznej molekuly implantovanou bunkou.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob testovania schopnosti látky alebo inej entity modulovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa pridanie neurónov CNS do systému gliovej bunkovej kultúry; pridanie testovanej látky do systému bunkovej kultúry; meranie neuronálneho rastu neurónov CNS; korelovanie rozdielu v úrovni neuronálneho rastu buniek v prítomnosti tejto látky voči kontrolnej kultúre, do ktorej nebola pridaná žiadna látka.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť spôsob testovania schopnosti látky alebo inej entity modulovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa pridanie neurónov CNS do optického nervu alebo iných častí nervového systému bunkovej kultúry; pridanie testovanej látky do systému bunkovej kultúry merania neuronálneho rastu neurónov CNS; korelovanie rozdielu v úrovni neuronálneho rastu buniek v prítomnosti tejto látky voči kontrolnej kultúre, do ktorej nebola pridaná žiadna látka.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť testovací systém na skúšanie látok na ich schopnosť modulovať produkciu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa systém gliovej bunkovej kultúry a neurónov CNS pridaných do tohoto systému.
11211
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť testovací systém na skúšanie schopnosti látok modulovať produkciu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa pestovanie systému gliovej bunkovej kultúry zaočkovanej týmito látkami; pridanie neurónov CNS do systému bunkovej kultúry; a sledovanie neuronálneho rastu za účelom stanovenia vplyvu látky.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť testovací systém na skúšanie schopnosti látok modulovať produkciu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa pestovanie optického nervu alebo iných častí nervového systému umiestneného v systéme bunkovej kultúry zaočkovanej týmito látkami; pridanie neurónov CNS do systému bunkovej kultúry; a sledovanie neuronálneho rastu za účelom stanovenia vplyvu látky.
Ďalšou podstatou tohoto vynálezu je poskytnúť testovací systém na skúšanie schopnisti látok modulovať produkciu nervovej adhéznej molekuly, čo zahŕňa neurónov CNS týmito látkami; pridanie adhéznej molekuly; a sledovanie neuronálneho rastu za účelom stanovenia vplyvu látky.
Iné podstaty a výhody sa stanú zjavnými odborníkom v odbore z prehľadu následného podrobného opisu uvedeného s odkazom na obrázky.
zaočkovanie kultúry rozpustnej nervovej
11211
Prehľad obrázkov na výkrese
Obr.l ukazuje mapu chimérického transgénu GFAP-L1. Myšia cDNA Ll dlhá 4,05 kb bola vnesená do exónu 1 upraveného génu GFAB pomocou linkerov Nôti. V tejto konštrukcii je pred cDNA Ll miesto zostrihu neskorého génu SV40 (V) a za cDNA Ll je polyadenylačné signálové miesto (pA) SV40. Umiestnenie kodónu ATG od L1 a polyadenylačný signál sú znázornené. Exóny sú znázornené ako obdĺžniky.
Obr.2 ukazuje analýzu Nothern blot RNA z mozgu pochádzajúcu z rôznych transgénnych línií. 10 ug celkovej RNA z celého dospelého mozgu bolo nanesených do každej dráhy a bolo próbovaných myšou cDNA L1. Doba expozície bola 3 dni. Dráhy 1 až 3, mozgy od rôznych transgénnych mláďat (dráha 1: línia 3426; dráha 2: línia 3427; dráha 3: línia 3418; dráha 4: mozog z netransgénnej kontroly). Je vidieť, že hladina transgénnej mRNA Ll (šípka) je rôzna pri troch transgénnych líniách, pričom najvyššia je pri línii 3426, stredná pri línii 3427 a najnižšia pri línii 3418. Pozícia rRNA 28S a 18S je ukázaná na pravom okraj i.
Obr.3 ukazuje umiestnenie mRNA L1 v dospelých nepoškodených (A, C a E) a poškodených (15 dní po poškodení, Ba D) optických nervoch z netransgénnej (A, B a E) a transgénnej myši (C a D) z línie 3426 metódou hybridizácie in situ. U zvierat divokého typu je mRNA L1 detekovateľná len v neuronálnych bunkách sietnice, ale nie v gliových bunkách optického nervu (A a B). U transgénnych zvierat sú viditeľné bunky obsahujúce transkripty Ll v optickom nerve (C a D). Hustota buniek pozitívnych na Ll je najvyššia v nemyelínovej bližšej časti nervu. Hustota buniek pozitívnych na Ll v nerve je mierne zvýšená po poškodení (porovnajte C a D). Rozmiestnenie buniek exprimujúcich Ll (C a D) je v optickom nerve podobné ako u buniek
11211 exprimujúcich GFAB (E). Meradlo u E je 100 um (pre A až E).
Obr.4 ukazuje lokalizáciu L1 (A a poškodených (28 z dospelých transgénnych a zvierat divokého typu (C) dvojitú imunofluorescenčnú mikroskopickú a B) a GFAP (C) nepoškodených (A a C) dní po poškodení, B) optických nervov zvierat (línia 3426, A a B) Imunoreaktivita Ll v optických nervoch transgénnych zvierat je podstatne zvýšená po poškodení (porovnajte Ä a B). Vzor imunoreaktivity L1 pri poškodených transgénnych nervoch je podobný vzoru imunofarbenia GFAP v nepoškodených nervoch divokého typu. Gandliónové axóny nemyelínovaných sietnicových buniek pozitívnych na Ll sú prítomné v nepoškodenom nerve divokého typu (A). Meradlo u C je 50 um (pre A až C).
Obr.5 ukazuje dvojitú imunofluorescenčnú mikroskopickú lokalizáciu L1 (A a D) a GFAP (B a E) v pestovaných astrocytoch z transgénnych zvierat línie 3426 (A, B a C) a zvierat divokého typu (D, E a F). Je vidieť, že len bunky z transgénnych zvierat exprimujú Ll, a astrocyty zo zvierat divokého typu sú negatívne na Ll. Meradlo u F je 30 um (pre A až F).
Obr.6 ukazuje (A) analýzu Western blot poškodených (15 dní po poškodení) a nepoškodených optických nervov z transgénnych zvierat a zvierat divokého typu. 25 UW celkového proteínu poškodených (dráhy 1, 3 a 5) alebo nepoškodených nervov a detekovaných pomocou purifikovaných proti Ll z myšej transgénnej (dráhy 3 a 4) a vidieť zvýšenie v porovnaní s netransgénnymi kontrolami, optického nervu sa zvýšenie množstva u transgénnych zvierat, a naopak množstvo línie 3426 zo zvierat divokého v expresii Ll u (dráhy 2, 4 a 6) bolo nanesených polyklonálnych protilátok afinitne Proteínové extrakty boli pripravené (dráhy 1 a 2), 3427 typu (dráhy 5 a 6). Je transgénnych zvierat Po poškodení
Ll
Ll objavilo u zvierat
11211 divokého typu kleslo. Molekulové hmotnosti (v kD) sú vyznačené na ľavom okraji.
Obr.7 ukazuje príklady rastu neuritov z myších cerebelárnych neurónov pestovaných na kryostatových sekciách optických nervov divokého typu (Ä a B) a transgénnych (C a D) zvierat (línia 3426). A a C predstavujú nepoškodené optické nervy, B a D reprezentujú poškodené optické nervy. Meradlo u D je 50 μπ> (pre Ά až D).
Obr.8 ukazuje a porovnáva dĺžky neuritov cerebelárnych neurónov udržiavaných na kryostatových sekciách nepoškodených (c) a poškodených (1) optických nervoch (28 dní po poškodení) zo zvierat divokého typu (WT) a transgénnych zvierat (línia 3426, 3427 a 3418). Je vidieť, že dĺžka neuritov na sekciách z transgénnych zvierat je väčšia než na sekciách zo zvierat divokého typu. Neurity transgénnych línií sú vždy dlhšie na poškodených než na nepoškodených nervoch. Na druhej strane dĺžky neuritov na nepoškodených alebo poškodených nervoch zvierat divokého typu nevykazujú významný rozdiel. Je vidieť, že dĺžka neuritov koreluje pozitívne s hladinou expresie Ll pri rôznych transgénnych líniách (viď tiež údaje z analýzy Western blot). Stredná hodnota ± štandardná odchýlka priemeru od jedného reprezentatívneho pokusu (z 12) je znázornená.
Obr.9 je graf znázorňujúci dĺžky neuritov cerebelárnych neurónov udržiavaných na kryostatových sekciách nepoškodených (c) a poškodených (1) optických nervov (28 dní po poškodení) zo zvierat divokého typu (WT) a transgénnych zvierat bez preinkuhácie a po preinkubácii sekcii s afinitne purifikovanými polyklonálnymi protilátkami proti L1 (anti Ll) a proti myším pečeňovým membránam (anti pečeň). Neuritové dĺžky na neurónoch bez preinkuhácie s akýmikoľvek protilátkami boli vzané. ako 100% a neuritové dĺžky na sekciách tých istých neurónov získaných po pôsobení
11211 protilátky boli vyjadrené v pomere k tejto hodnote. Významné zníženie (60JK) dĺžky neuritov pôsobením protilátok proti Ll bolo zistené na kryostatových sekciách z transgénnych zvierat. Čísla hore predstavujú celkový počet neurónov meraných pre každú hodnotu. Stredné hodnoty ± štandardná odchýlka sú z najmenej štyroch nezávislých experimentov vykonaných vo dvojici.
neuritové dĺžky myších (B) neurónov na povrchu
Obr.10 ukazuje a porovnáva cerebelárnych (A) a kuracích DRG astrocytov pripravených zo zvierat divokého typu (WT) a transgénnych zvierat (línia 3426) v neprítomnosti protilátok a po preinkubácii sekcií s afinitne purifikovanými polyklonálnymi protilátkami proti L1 (anti Ll) a proti myším pečeňovým membránam (anti pečeň). Neuritové dĺžky na astrocytoch bez preinkubácie s akýmikoľvek protilátkami boli vzaté ako 100* a neuritové dĺžky na povrchu astrocytov získaných po pôsobení protilátky boli vyjadrené v pomere k tejto hodnote. Významné zníženie (približne 40*) dĺžky neuritov je vidieť len na transgénnych astrocytoch po preinkubácii povrchov s protilátkami proti Ll. Stredná hodnota ± štandardná odchýlka sú vzaté z najmenej 100 neurónov z dvoch nezávislých experimentov vykonaných v štvorici. * uvádza stredné hodnoty, ktoré sa podstatne líšili (p < 0,05, Mann-ffhitney U test) z kontroly (astrocyty divokého typu alebo transgénne bez pôsobenia protilátok).
Obr.11 demonštruje obnovený rast axónov in vivo v optickom nerve (0 až 2000 um). 6 až 8 týždňov staré transgénne myši GFÄP Ll a myši divokého typu boli poranené a po 14 dňoch sledované na biotínový ester značený fluoresceínom za účelom označenia gangliónových axónov anterostupňovým značením. Každý bod reprezentuje jedno zviera.
11211
Obr.12 ukazuje obnovený rast axónov in vivo v optickom nerve (0 až 800 um). 6 až 8 týždňov staré transgénne myši GFAP L1 a myši divokého typu boli poranené a po 14 dňoch sledované na biotínový ester značený fluoresceínom za účelom označenia gangliónových axónov anterostupňovým značením. Každý bod reprezentuje jedno zviera.
Obr.13 ukazuje vplyv injekovania kuracích protilátok proti L1 do IMHV na vyhýbacom teste (strata pamäti) v jednoskúškovom pasívnom vyhýbacom cvičení. Každý bod reprezentuje skupinu vtákov, ktoré dostali injekcie protilátok proti L1 (anti Ll) (uzavreté kruhy) alebo fyziologického roztoku (otvorené štvorce) v čase vzhľadom na uvedené cvičenie. Všetky zvieratá boli testované 24 hodín po cvičení (*, p < 0,05 medzi fyziologickým roztokom a skupinou protilátok, ksi2).
Obr.14 porovnáva dva grafy ukazujúce vplyv injekcií Ig I až IV a fragmentov FN v čase -30 min. a +5,5 hod. na udržanie pamäte pri pasívnom vyhýbacom cvičení. Všetky zvieratá boli testované 24 hodín po cvičení. Počet zvierat v každej skupine je znázornený na histogramoch (*, P < 0,05, **, p < 0,005).
Obr.15 porovnáva sériu grafov ukazujúcich vplyv protilátok proti Ll (anti Ll) na LTP v pyramidálnych neurónoch v oblasti CA1 krysích hypokampálnych rezov.
a) Priemerné (n=4) EPSP zaznamenané pred a 50 min. po (šípka) TBS v kontrolnom mieste, ktoré nebolo injekované protilátkou.
b) Priemerné (n=4) EPSP zaznamenané pred a 50 min. po TBS (šípka) za prítomnosti králičích polyklonálnych protilátok proti Ll (Rathjen et al. (1984)).
c) Časový sled EPSP počiatočného sklonu pred a po TBS za prítomnosti protilátok proti Ll (frakcia IgG, koncentrácia 6,2 mg/ml) alebo polyklonálnych protilátok
11211 imunoglobulínovým doménam I až IV rekombinantne exprimovaným v bunkách CHO (Hynes (1992) Celí 369:11-25) (antisérum obsahujúce približne 1 mg/ml špecifických protilátok) a nasledujúcich kontrôl:
(1) Kontrola LTP (žiadne protilátky), (2) za prítomnosti frakcie IgG polyklonálnych protilátok proti myším pečeňovým membránam (3,5 mg/ml), ktoré silne reagujú s krysími hypokampálnymi rezmi (Lindner et al. (1983) Náture 305:427-430), (3) v prítomnosti králičieho neimúnneho séra a (4) za prítomnosti protilátok proti L1 bez indukcie LTP s TBS (6,2 mg/ml; viď tiež e,f). Výsledky sú vyjadrené ako stredné hodnoty ± S.E.M z percent počiatočného sklonu EPSP zo základnej hodnoty zaznamenanej počas 20 min. pred TBS (n=5) z rezu z najmenej 3 zvierat; hodnoty LTP za
L1 sa líšia od kontrol LTP proti L1 a v p < 0,01 pre proti imunoglobulínovým doménam I až IV.
d) Koncentračná závislosť poklesu v LTP pôsobením frakcie IgG polyklonálnych protilátok proti L1 (koncentrácia 6,2 mg/ml); 2 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,06 mg/ml; p < 0,0001. Ako kontrola sú uvedené výsledky z polyklonálnych protilátok proti membránam pečene (3,5 mg/ml).
e) Priemerné (n=4) EPSP zaznamenanej pred pred a 60 min. po (šípka) podanie oproti L1 bez prítomnosti intracelulárne excitačné postsynaptické prúdy (EPSP) zaznamenané pred a 30 min. po (šípka) podanie polyklonálnych protilátok proti L1 bez prítomnosti TBS.
protilátok proti pre protilátky prítomnosti v p < 0,001 protilátky polyklonálnych protilátok TBS. f) Priemerné (n=4)
Obr.16 demonštruje vplyv imunoglobulínových domén I až IV, polyklonálnych protilátok proti NCAM a oligomanosidových glykopeptidov na LTP.
a) časový sled počiatočného sklonu EPSP pred a po TBS za prítomnosti imunoglobulínových domén I až IV (216 pg/ml; 3,2 mM; v 20 mM Tris/HCl pH 7,6; p < 0,01)
11211 a fibronektínových (FN) homológnych opakovaniach I až V (225 ug/ml; 3,8 mM; v 20 mM Tris/HCl pH 7,6) od L1 v porovnaní s kontrolnou LTP (20 mM Tris/HCl pH 7,6).
b) časový sled počiatočného sklonu EPSP pred a po TBS za prítomnosti protilátok proti NCAM (frakcia IgG,
3,9 mg/ml), antiséra proti axonínu-1, a nasledujúce kontroly:
(1) neimúnne králičie sérum, (2) frakcia IgG neimúnneho králičieho séra a (3) za prítomnosti protilátok proti NCAM p < 0,06) bez indukcie LTP s TBS. c) časový sled počiatočného EPSP pred a po TBS za prítomnosti oligomannozidových glykopeptidov, kontrolných glykopeptidov odvodených z azialofetuínu (približne 100 μΜ) a bez prítomnosti glykopeptidov. Výsledky sú vyjadrené ako stredné hodnoty ±S.E.M z percent počiatočného sklonu EPSP zo základnej hodnoty zaznamenanej počas 20 min. pred TBS (n-5 alebo 6) z rezov z najmenej 3 zvierat.
(3,0 mg/ml) (3,9 mg/ml,
Obr.17 graficky ukazuje vplyv protilátok proti L1 a oligomannozidových karbohydrátov na predtým stanovenú LTP a na synaptickú transmisiu sprostredkovanú receptormi NMDA.
a) časový sled počiatočného sklonu EPSP pred a po TBS za prítomnosti protilátok proti L1 aplikovaných ako počas pokusu (6,2 mg/ml), tak aj po 10 min. od TBS (6,2 mg/ml).
h) časový sled počiatočného EPSP pred prítomnosti oligomannozidových karbohydrátov a po TBS za aplikovaných ako počas pokusu (100 μΜ), tak aj po 20 min. od TBS (100 μΜ).
c) Priemerný (n=4) EPSP receptora NMDA zaznamenaný za prítomnosti CNQX (30 μΜ) pred a po 30 min. (šípka) aplikácii protilátok proti L1. d) Priemerný (n=4) EPSP receptora NMDA zaznamenaný za prítomnosti CNQX (10 μΜ) pred a po 60 min. (šípka) aplikácii oligomannozidových karbohydrátov. Výsledky v a) ah) sú vyjadrené ako stredné hodnoty ± S.E.M z percent počiatočného sklonu EPSP zo základnej hodnoty zaznamenanej
11211 počas 20 min. pred TBS (n=5 z rezov z najmenej 3 zvierat).
Obr.18 ukazuje nukleotidovú sekvenciu 4,43 kb dlhého inzertu cDNA v klone pX#2 a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu myší CHL1. Najdlhší otvorený čítací rámec (bp 296 až bp 3922) obsahuje 1209 aminokyselín a je zakončený terminačným kodónom TGÄ. Dve hydrofóbne oblasti predstavujú signálny peptid (aminokyseliny 1 až 24) a transmembránovú oblasť (1082 až 1104) sú podtrhnuté. Dve šípky ukazujú 5' a 3' konce klonu 311 izolovaného z knižnice lambda gtll. Potenciálne miesta pre glykozidáciu na asparagíne (Hubbart a Ivatt, 1981) sú označené pod aminokyselinovou sekvenciou plnými znakmi diamantu. Imunoglobulínové domény sú číslované rímskymi číslovkami od I do VI pod konzervovaným tryptofánom. Charakteristické cysteíny sú označené krúžkom. Opakovania podobné FN sú číslované F1 až F5 a charakteristické tryptofány (chýbajúce v Fl, F2; W 732, F3 : W 830, F4: W 936, F5: W1053) a tyrozíny/fenylalaníny (Fl: Y 682, F2: Y 781, F3: F 888, F4: Y989, chýba u F5) sú zarámované. Zátvorka zvýrazňuje sekvencie RGD a DGEA (aminokyselinové zvyšky 185 až 187 a 555 až 558). Netranslatované sekvencie sú označené číslami kurzívou. Sekvenčné údaje sú dostupné z EMBL/Genebank/DDBJ pod číslom X94310.
Obr.19 ukazuje doménovú štruktúru, kódujúcu oblasť bakteriálne exprimovaného proteínového fragmentu a graf hydrofobicity myší CHL1.
(a) diagram znázorňuje štrukturálne rysy odvodené z primárnej sekvencie CHL1. Čísla uvádzajú aminokyselinovú sekvenciu od miesta počiatku translácie. Imunoglobulínové domény I až IV sú označené polovičnými krúžkami (čísla aminokyselín uvádzajú cysteíny tvoriace disulfidové mostíky). Opakovania podobné FN 1 až 5 sú symbolizované orámovaním (čísla aminokyselín uvádzajú hranice domény). Potenciálne miesta pre N-glykosidáciu sú označené plnými
11211 krúžkami. Signálny peptid a transmembránová oblasť je vyznačená zubatým orámovaním.
(b) Podčiarknutie vyznačuje pozíciu cDNÄ kódujúca rekombinantný proteín produkovaný v E. coli.
(c) Graf hydrofobicity (Kyte a Doolittle, 1982) odvodenej aminokyselinovej sekvencie ukazuje charakteristické rysy integrálneho membránového proteínu s putatívnou fidrofóbnou signálnou sekvenciou a transmembránovou doménou (*). Pozitívne hodnoty označujú hydrofobicitu. Číslovanie v súradniciach uvádza pozíciu aminokyseliny.
Obr.20 ukazuje porovnanie intracelulárnych domén molekúl rodiny L1. Sekvencia intracelulárnych domén začínajúcich prvým aminokyselinovým zvyškom po putatívnych transmembránových oblastiach sú porovnané pre myší CHL1, myší L1, kurací Nr-CAM, kurací Ng-CAM, kurací neurofascín, Drosophilia neuroglia a L1.2 zo zehričky. Čísla uvádzajú pozície aminokyselín u CHL1 a šedé orámovanie vyznačuje medzery vykonané do sekvencie CHL1. Totožné aminokyseliny, ktoré sú vo väčšine sekvencií, sú vyznačené čiernou farbou. Tri zátvorky (I, II a III) vyznačujú vysoko konzervované úseky.
Obr.21 je analýza Northern blot mRNA CHL1 a L1 z rôznych tkanív myši a krysy.
(a) Poly (A) RNA (2pg) z mozgu bez cerebella (dráhy 1 až 5), miechy (dráhy 3, 7) a dorzálnych koreňových ganglií (dráhy 4, 8) a celkovej RNA (10pg) z cerebella (dráhy 2, 8) z deväť dní starej myši hybridizované s ribopróbami CHL1 (dráhy 1 až 4) alebo L1 (dráhy 5 až 8). Poly (A) RNA (1 pg) z ľadvín (dráha 9), slinivky (dráha 10), pečene (dráha 11), týmusu (dráha 12) a poly (Ä) RNA (0.5 pg) z čriev (dráha 13) a pl'úc (dráha 14) z deväť dní starej myši boli hybridizované s ribopróbou CHL1.
(b) Celková RNA (20 pg) PC12 buniek indukovaných
11211 (dráha 1) a neindukovaných (dráha 2) s NGF, buniek COS-1 (dráha 3) a celková RNÄ (30 pg) z cerebella deväť (dráha 4) a šesť (dráha 5) dní starých krýs boli hybridizované s ribopróbou CHL1. Značky RNA sú uvedené na ľavom okraji.
Obr.22 demonštruje špecifičnosť polyklonálnych protilátok proti CHL1 a expresiu CHL1 v rôznych tkanivách.
(a) Analýza Northern blot mozgu z imunopurifikovaného s L1 (dráha 1 (2 Mg)), N-CAM (dráha 2 (2 Mg)), MAG (dráha 3 (2 Mg)) a proteínového fragmentu purifikovaného rekombinantnou aniónovou výmennou chromatografiou (dráha 4 (0,1 pg)) pomocou protilátok proti CHL1.
(b) Analýza Northern blot rozpustných (S) a nerozpustných (M) frakcií detergentových lyzátov hrubých membrán z mozgu (dráha 1), pečene (dráha 2), pľúc (dráha 3), ľadvín (dráha 4) a čriev (dráha 5) deväť dní starých myší. Čísla naľavo (b) uvádzajú molekulové hmotnosti imunoreaktívnych prúžkov CHL1 z mozgu (dráha 1) a pečene (dráha 2). Štandardy molekulových hmotností sú uvedené na ľavom a pravom okraji.
Obr.23 ukazuje detekciu CHL1 na tranzientne transfekovaných bunkách COS-1. Povrchové kultúry COS-1 buniek transfekovaných CHL1 (a) a netransfekovaných (c) boli imunofarbené polyklonálnymi protilátkami proti CHL1. (b,d) zodpovedajúce mikrografie fázového kontrastu pre (a,c). Čiarka v d = 30 pre a až d.
Obr.24 ukazuje lokalizáciu mRNA CHL1 a L1 v sekciách myšej sietnice, optického nervu a cerebelárneho kortexu pomocou hybridizačnej analýzy in situ. V sietnici 7 dní starej starej myši je mRNA L1 detekovateľná v gangliónových bunkách lokalizovaných v gangliónovej bunkovej vrstve (1 v a) a v amakrinových a horizontálnych bunkách lokalizovaných vo vnútornej pečeňovej vrstve (2. v l). Iné bunkové typy v sietnici alebo gliových bunkách v optickom
11211 nerve neobsahujú detekovateľné hladiny transkriptov L1 (a). mRNA CHL1 je po týždni detekovateľná v gangliónových bunkách a v niekoľkých bunkách lokalizovaných na vnútornom okraji vo vnútornej vrstve pečene (b). Gliové bunky lokalizované v bližších (t.j. blízko sietnice) oblastiach optického nervu sú silne značené próbou z antisense cRNA CHL1, naopak gliové bunky lokalizované vo vzdialenejších oblastiach sú viditeľné až po týždni (b). V cerehelárnom kortexe dva dni starých myší sú transkripty L1 detekovateľné vo hviezdicových a košíčkových bunkách v molekulárnej vrstve (mol) bunkách v internej granulovej L1 sú rozmiestnené v podobnom vzore, s jedinou výnimkou, že akékoľvek značenie je ťažko viditeľné v tenkých častiach molekulárnej vrstvy (b). Sekcie hybridizované próbou sense cRNA CHL1 nie sú označené (pre 7 dní starú sietnicu a optický nerv, pozri c).
a v Golgiho a granulových vrstve (iGl:d). Transkripty
Obr.25 ilustruje imunofluorescenčnú mikroskopickú lokalizáciu CHL1 v kultúrach astrocytov. Dvojité imunoznačenie pestovaných myších astrocytov bolo vykonané s polyklonálnymi protilátkami proti CHL1 (a,d) a s polyklonálnymi protilátkami proti GFAB (b,e), (c,f) sú zodpovedajúce mikrografie fázového kontrastu pre (a,b) a (d,e). Čiarka v c a F - 20 um pre a až c a d až f.
Obr.26 je analýza Western blot deglykozilovanej CHL1 rozpustných (S) a nerozpustných (M) frakcií detergentových lyzátov hrubých membrán z mozgu sedem dní starých myší boli (N), 0-glykozidázou (0), bez enzýmu (-) a zlúčené Western blote. Štandardy v kD na pravom okraji.
inkubované s N-glykozidázou F obidvoma enzýmami (N+0) alebo s protilátkami proti CHL1 vo molekulovej hmotnosti sú uvedené
Molekulové hmotnosti glykozilovaných a deglykozilovaných proteínových komponentov CHL1 sú uvedené v kD v rámčeku nižšie.
11211
Obr.27 ukazuje prítomnosť karbohydrátu MNK-1 v imunoprecipitátoch CHL1 z mozgového tkaniva. CHL1 bola imunoprecipitovaná z detergentových lyzátov z celého mozgového tkaniva z deväť dní starého myšieho mozgu pomocou protilátok proti CHL1. Mozgové lyzáty (dráha 1) a imunoprecipitáty (dráhy 2,3) boli rozdelené na SDS-PAGE, blotované a inkubované s monoklonálnou protilátkou 312 proti epitopu HNK-1 (dráhy 1,2) alebo protilátkami proti CHL1 (dráha 3). Štandardy molekulových hmotností sú uvedené v kD na pravom okraji.
Obr.28: Rast neuritov hipokampálnych neurónov v spoločnej kultúre s transfektantmi L929.
Hipokampálne neuróny odvodené od krýs embryonálneho dňa 18 boli pestované v subkonfluentnej monovrstve transfektantov L929 alebo rodičovských buniek L929. Po 11 až 12 hod. spoločnej kultivácie boli bunky fixované a označené monoklonálnou protilátkou 412 (rozpoznávajúci epitop karbohydrátu HNK-+) alebo polyklonálnou protilátkou proti NCAM. Pre meranie dĺžky celého neuritu bol určený len najdlhší neurit na každej vetvi kvôli veľmi rozvetvenému charakteru neurónov v tejto kultúre.
(Ä) Rast neuritov je podporovaný CHL1 a inhibovaný protilátkami. Neuróny boli pestované s transfektantmi CHL1 (CHL1) alebo bunkami L929 (L929) s (+AB) alebo bez polyklonálnych protilátok proti rekombinantnej CHL1 (500 ug/ml purifikovaného IgG, pridaného 45 min. po naplátovaní) a na transfektantoch L1. Priemerná celková dĺžka neuritov z 4 až 5 nezávislých experimentov je uvedená. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.
(B) Rôzne línie CHL1 podporujú rast neuritov lepšie než L1. Neuróny boli pestované na dvoch rôznych transfektantoch CHL1 (línia CHL1 1, línia CHL1 2) s mierne rôznymi hladinami expresie, na rodičovských L929 (L929) a na transfektantoch L1 (Ll). Celková dĺžka neuritov je podaná ako percento buniek L929 z kontroly (ctr). Odchýlky sú štandardné chyby
11211 priemeru.
(C) Podpora dĺžky neuritov ovplyvňuje dĺžky všetkých tried neuritov. Graf kumulatívnej frekvenčnej distribúcie celkovej dĺžky neuritov hipokampálnych neurónov pestovaných spoločne s transfektantmi CHL1 (línie CHL1 la 2) a s rodičovskými bunkami L929 (L929) s (+AB) alebo bez pôsobenia protilátok je podaný v (A). Percento neurónov s neuritmi dlhšími alebo rovnako dlhými ako daná dĺžka x (vertikálna os) boli vyznačené ako funkcia dĺžky neuritov x (horizontálna os). Hodnoty pochádzajú z jedného reprezentatívneho experimentu.
Obr.29: Rast neuritov malých cereberálnych neurónov v spoločnej kultúre s transfektantmi L929.
Cerebelárne neuróny odvodené z 6 až 7 dní starých myší boli pestované 20 hod. na transfektantoch CHL1 (CHL1), CHL1 transfekovaných neexprimujúcich bunkách L929 (slepá vzorka), rodičovských bunkách L929 (L929) a na transfektantoch L1 (Ll). Farbenie látok bolo vykonané, ako už bolo opísané na obr.7.
(A) CHL1 podporuje rast neuritov malých cerebelárnych neurónov. Je uvedená priemerná celková dĺžka neuritov z troch experimentov. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.
(B) CHL1 podporuje tiež rast neuritov malých cerebelárnych neurónov lepšie než Ll. Celková dĺžka neuritov je podaná ako percento buniek L929 z kontroly (ctr). Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.
(C) Zvýšenie rastu neuritov cerebelárnych neurónov vplyvom CHL1 ovplyvňuje všetky triedy neuritov. Graf kumulatívnej frekvenčnej distribúcie celkovej dĺžky neuritov percenta neurónov s neuritmi dlhšími alebo rovnako dlhými ako daná dĺžka x (vertikálna os) boli vyznačené ako funkcia dĺžky neuritov x (horizontálna os). Hodnoty pochádzajú z jedného reprezentatívneho experimentu.
Obr.30: Rast neuritov hipokampálnych neurónov po
11211 pestované na miskách s pridaním supernatantov hrubých membránových pôsobení rozpustnej CHL1.
Hipokampálne neuróny boli potiahnutých poly-L-lyzínom 12 hod (40 ug/ml celkového proteínu) preparácií transfektantov CHL1 (CHL1), rodičovských buniek L929 (L929) alebo transfektantov Ll (Ll). Farbenie a meranie dĺžky neuritov bolo vykonané, ako už bolo opísané (obr.7).
(A) Rozpustná CHL1 z transfektantov L929 podporuje rast najlepšie. Absolútna dĺžka najdlhšieho neuritu a celková dĺžka neuritov sú uvedené. Hodnoty sú priemerom z troch experimentov. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.
(B) Rozpustná CHL1 podporuje mierne zvýšenie počtu neuritov. Celková dĺžka neuritov dĺžky hipokampálnych neurónov po odvodených z rodičovských buniek v percentách neuritovej pôsobení transfektantov L929 (ctr) je uvedená.
Hodnoty sú priemerom z štandardné chyby priemeru, (C) Rozpustná CHL1 všetkých tried neuritov, distribúcie celkovej reprezentatívneho experimentu sú uvedené.
troch experimentov. Odchýlky sú tiež ovplyvňuje rast neuritov Grafy kumulatívnej frekvenčnej dĺžky neuritov z jedného
Obr.31: Kvantitatívna agregačná analýza a stabilita proteínov CHL1 a Ll v transfektantoch L929.
agregacie detekovania (ctr) a Ll bunkových agregácie (Ll) boli (A) Kvantitatívna analýza transfektantov S2. Za účelom transfekovanej bunky CHL1 (CHL1) pestované (v hustotách približne 3 x 106 buniek/ml) 18 hod. v médiu s (+ind) alebo bez (-ind) indukcie transgénovej expresie pomocou CuSO*. Počet častíc bol spočítaný na hemacytometre na začiatku a na konci inkubácie. Percento agregácie bolo vypočítané pomocou indexu (1-N/N0)xl00. N18 s NO predstavujú počet častíc na konci alebo na začiatku inkubačnej periódy. Hodnoty sú priemerom zo štyroch nezávislých experimentov. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.
11211 (B) Kinetiká agregácie transfektantov L929.
Transfekované CHL1 (CHL1), transfekované CHL1 neexprimujúce L929 (slepá vzorka), rodičovské L929 (L929) a transfekované Ll (Ll) bunky boli odmyté z tkanivovej kultúry pôsobením roztoku trypsín-EDTA s nízkou koncentráciou, premyté a inkubované v 37°C v polystyrénových skúmavkách. Časť každej vzorky bola odobraná každých 30 min. Počet častíc bol . spočítaný na hemacytometre. Výsledky sú vyjadrené, ako je to opísané v (A). Hodnoty sú priemerom z troch nezávislých * experimentov. Odchýlky sú štandardné chyby priemeru.
Spôsob uskutočnenia vynálezu
Predložený vynález sa týka použitia určitých látok tu označovaných ako neurálne rastové modulátory CNS” (CNGM) a zvlášť triedy neurálnych bunkových adhéznych molekúl tak, ako sú tu definované a ich schopnosti podporovať rast neuritov v centrálnej nervovej sústave (CNS). Všeobecne sú neuróny vyvinutej centrálnej nervovej sústavy považované za neschopné obnoveného rastu, čo je spôsobené inhibítorovými molekulárnymi mechanizmami prítomnými na gllových bunkách. Látky a spôsoby predloženého vynálezu môžu byť použité na prekonanie tejto inhibície a na podporu rastu neuritov v CNS.
Látky podľa tohoto vynálezu zahŕňajú a môžu byť selektované z akejkoľvek bunkovej adhéznej molekuly, ktorá ja schopná modulovania a podporovania rastu neuritov v CNS a zvlášť potom molekúl patriacich do imunoglobulínovej rodiny. Molekuly sú vyberané predovšetkým z členov imunoglobulínovej rodiny, ktorí sprostredkovávajú neuronálnu bunkovú adhéziu nezávislú na Ca2+, vrátane Ll, N-CAM a glykoproteínu asociovaného s myelínom. Vynález taktiež zahŕňa fragmenty týchto molekúl, analógy a príbuzné molekuly, ktoré majú aktivitu podporujúce neurity. Zvlášť výhodné štruktúrne motívy pre tieto fragmenty a analógy
11211 zahŕňajú domény podobné k homológnym opakovaniam k fibronektínu typu III (zvlášť opakovania 1 a 2) a imunoglobulínovým doménam (zvlášť doménam I-II, III-IV a V-VI). Pretože látky podlá tohoto vynálezu a najmä členovia rodiny Ll a CAM vykazujú homofilickú väzbu, ako tieto látky, tak aj ich antagonisti a zvlášť protilátky k nim, môžu slúžiť ako aktivátory s ohľadom na receptory pre tieto látky, a môžu tak byť využité ako na diagnostické, tak aj na terapeutické aplikácie rovnakým spôsobom a na ten istý účel ako pôvodné látky. Ll pôsobí ako receptor a protilátka proti nej môže byť využitá ako aktivátor k rastu neuritov, ako je to opísané nižšie, a na nervovú regeneráciu, najmä v CNS. Táto schopnosť je ďalej demonštrovaná možnosťou protilátok proti Ll slúžiť spôsobom, ako identifikovať ďalších členov rodiny nervových rekogničných molekúl Ll a CAM, ktoré tu slúžia ako látky, a vynález sa tak rozširuje na molekuly, ktoré sú identifikované, izolované a charakterizované pomocou týchto protilátok. Z týchto identifikovaná ako modulátory považovaná za zahŕňajúcu aj rodiny CAM, ako je Ll a jej dôvodov je trieda látok, nervového rastu v CNS, protilátky proti molekulám zosilňujú astrocytov analógy, ako je CHL1, opísané nižšie.
Predložený vynález sa týka v jednom aspekte ektopickej expresie neurálnych rastových modulátorov CNS (CNGM) alebo neurálnych bunkových adhéznych molekúl na diferencovaných astrocytoch in vivo. Bolo zistené, že tieto molekuly rast neuritov na jednovrstvových kultúrach a kryostatových sekcií nepoškodených a poškodených dospelých myších optických nervov, a tiež in vivo, v experimentoch s deformáciou optického nervu u transgénnych zvierat. Zvýšená schopnosť rastu neuritov je úmerná hladine ektopickej expresie CNGM. Toto je demonštrované porovnávaním odlišných transgénnych línií podlá tohoto vynálezu, ktoré exprimujú rôzne bazálne hladiny CNGM kódovaných transgénom, a koreláciami následnej zvýšenej expresie CNGM po porušení optického nervu.
11211
Malo by byť uznané, že aj keď optické nervy, ako porušené, tak aj neporušené, sú vhodné na použitie podľa predloženého vynálezu, môžu byť podobne použitá akákoľvek časť nervovej sústavy, vrátane častí mozgu a miechy.
Rast neuritov je závislý na hladinách expresie CNGM v astrocytoch, čo demonštruje špecifický efekt spôsobený CNGM v podpore rastu neuritov v transgénnych zvieratách. Inhibícia rastu neuritov polyklonálnymi protilátkami proti CNGM, ale nie protilátkami proti myším membránam pečene, ďalej podporuje túto špecificitu, zvlášť, pretože obidve protilátky reagujú dobre s bunkovými povrchmi neurónov a astrocytov transgénnych zvierat.
Vo výhodnom vyhotovení je CNGM molekula Ll. Biologické efekty Ll môžu byť inhibované protilátkami proti Ll, čo ukazuje, že Ll je homofilicky aktívna v konfigurácii trans v bunkovom povrchu transgénnych astrocytov. Ďalej druhovo špecifické protilátky proti Ll, ktoré nereagujú s kuracími dorzálnymi koreňovými gangliónovými neurónmi, inhibujú neuritový rast v tomto type neuronálnej bunky na transgénnych astrocytoch. Tieto zistenia jednoznačne identifikujú Ll ako aktívnu molekulu pôsobiacu trans a ukazujú, že ektopická expresia Ll gliovými bunkami, ktorým normálne chýba expresia Ll, zosilňuje rast neuritov in vitro.
Zosilnenie sprostredkované podporujú rast (1986) J. Comp.
rastu neuritov na gliových bunkách transgénom, ktoré normálne neexprimujú Ll in vivo, ukazuje, že gliové bunky dospelej centrálnej nervovej sústavy cicavca môžu byť viac prispôsobené na neuritový rast. Strata molekúl, ktoré neuritov cez gliové bunky (Smith et al
Neurol. 251:23-43; Smith et al. (1990) Dev. Biol. 138:377-390) sa preto ukazuje byť kompenzovaná expresiou rekogničnej molekuly, ktorá je normálne veľmi exprimovaná v gliových bunkách v dospelej periferálnej nervovej sústave cicavca (Niecke et al. (1985); Bixby et al. (1988) J. Celí. Biol. 107:353-362; Seilheimer et al. (1988) J. Celí. Biol.
11211
107:341-351).
Fenotyp dospelých astrocytov z predložených transgénnych línií môže byt modifikovaný smerom k schopnosti obnoviť expresiu Ll Schwannovými bunkami po spôsobení poškodenia. Zvýšenie expresie Ll Schwannovými bunkami je pravdepodobne sprostredkované neurotropínmi aktivovanými po poškodení autokrinnými mechanizmami (Seilheimer et al. (1987) EMBO J. 6:1611-1616). Podobne môže byť expresia Ll astrocytmi v kultúre aktivovaná TGF-beta a NGF (Saad et al. (1991)). Vytvorením myší s transgénom GFAB-L1 je neschopnosť zrelých astrocytov odpovedať na nervové poranenie prekonaná aktiváciou molekuly Ll. Expresia Ll môže byť zvlášť výhodná pre rast neuritov v myelínovaných dráhach centrálnej nervovej sústavy, ktoré normálne obsahujú niekoľko molekúl, ktoré inhibujú rast neuritov (Schachner et al., Perspectives in Developm. Neurobiol. in Press; Schwab et al. (1995) Ann. Rev. Neurosci. 16:565-595).
Predložený vynález demonštruje, že ínhibičné pôsobenie astrogliálnych a oligodendrogliálnych buniek môže byť prekonané, prinajmenšom sčasti, rast neuritov je umožnený podporujúcimi vlastnosťami látok tu definovanými a zvlášť ako je ilustrované aktivitou ektopicky exprimovanej Ll. Expresia Ll v astrocytoch sa dá tiež kompenzovať inhibičnými efektami vykonávanými oligodendrocytmi. Permisívne a nepermisívne molekulárne mechanizmy preto nemusia byť lokalizované na tom istom type bunky, aby sa objavil rast neuritov. Namiesto toho môžu byť tieto molekulárne mechanizmy zdieľané medzi rôznymi typmi buniek. Bunková a molekulárna manipulácia Ll a iných molekúl podporujúcich rast neuritov môže preto umožniť zosilnenie regeneratívnej kapacity dospelej centrálnej nervovej sústavy po poranení alebo chorobe.
Ako bolo ukázané vyššie, predložený vynález sa týka podpory neurálneho rastu v CNS, vrátane takého rastu, ktorý je potrebný pre regeneráciu štruktúr, k strate ktorých došlo vplyvom poranenia alebo choroby, rovnako ako tých štruktúr
11211 a tkanív vykazujúcich nekompletnú alebo nehotovú formáciu. Látky podľa tohoto vynálezu tiež vykazujú neuroprotektívny alebo nervovo ochranný efekt, ako je to ilustrované nižšie, a napr., môžu byť podávané za účelom inhibovania neurálnej degenerácie alebo straty rôznej povahy.
Vynález sa tiež týka konštrukcií a prostriedkov obsahujúcich alebo dopravujúcich látky podľa tohoto vynálezu, huď podporovaním expresie istých látok prostredníctvom génovej terapie a podobne, alebo exogénnym podávaním týchto látok, kde je to vhodné alebo potrebné, vo forme farmaceutických prostriedkov za účelom liečenia poranených alebo chorých štruktúr CNS. V tomto spojení je uvažované, že isté látky sú schopné vykonávať rast podporujúci efekt, keď sú takto podávané, aj keď je známe, že členovia uvedenej skupiny, ako je L1 a N-CAM, sa viažu homofilicky a môžu tak byť viac účinné, keď sú podávané pomocou expresie. Vynález sa týka obidvoch typov ciest a protokolov, kde je to možné.
Malo by byť tiež uvedené, že sa predložený vynález týka použitia sekrétujúcich buniek CNGM za účelom modulácie nervového rastu, regenerácie a prežívania nervov v CNS. Určité rozpustné CNGM a jej fragmenty a príbuzné molekuly sú tiež predmetom vynálezu.
Nasledujúce pojmy budú definované nižšie.
Pojem látka, nervový rastový modulátor CNS, CNGM, nervová rekogničná molekula, rekogničný faktor, rekogničný faktorový proteín, nervová adhézna molekula a akékoľvek varianty, ktoré tu nie sú zvlášť uvedené, môžu byť použité zameniteľné a ako také použité v predloženej žiadosti a nárokoch, ktoré sa týkajú proteínového materiálu vrátane jednoduchých alebo komplexných proteínov a týkajú sa tiež tých proteínov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu predtým opísanú a profil aktivít uvedený tu a v nárokoch. Tieto pojmy tiež zahŕňajú aktívne fragmenty týchto proteínov, príbuzné molekuly a analógy, vrátane malých molekúl, ktoré sa chovajú podobne ako uvedené látky.
11211 faktorový proteín, uvádzané, že zahŕňajú podstatné homológy uvádzané
V zhode s tým sú proteíny vykazujúce rovnakú alebo pozmenenú aktivitu podobne mienené. Za tieto modifikácie môžu byť považované cielené mutagenézy alebo môžu byť náhodné, rovnako ako tie, ktoré sú získané vplyvom mutácií v hostiteľoch, ktorí ich produkujú. Pojmy nervový rastový modulátor CNS”, CNGM, nervová rekogničná molekula, rekogničný faktor, rekogničný nervová adhézna molekula sú tiež proteíny tu citované rovnako ako a alelické variácie.
Aminokyselinové zvyšky tu opísané sú v izomérovej forme L. Avšak zvyšky v izomérovej forme D môžu byť zamenené za akýkoľvek zvyšok v izomérovej forme L pokiaľ je polypeptidom udržiavaná funkčná vlastnosť väzby imunoglohulínu. NH2 uvádza voľnú aminoskupinu prítomnú na konci polypeptidu. COOH uvádza voľnú karboxylovú skupinu prítomnú na konci polypeptidu. Podľa štandardnej polypeptidovej nomenklatúry, J. Biol. Chem.
(1969) sú uvedené skratky aminokyselín v tabuľke:
243:3552-59 nasledujúcej
11211
TABUĽKA SKRATIEK AMINOKYSELÍN AMINOKYSELINA
SYMBOL
Jedno písmeno Tri písmená
Y Tyr tyrozín
G Gly glycín
F Phe fenylalanín
M Met metionín
A Ala alanín
S Ser serín
I íle izoleucín
L Leu leucín
T Thr treonín
V Val valín
P Pro prolín
K Lys lyzín
H His histidín
Q Gin glutamín
E Glu kys. glutámová
W Trp tryptofán
R Arg arginín
D Asp kys. asparágová
N Asn asparagín
C Cys cysteín
Malo by byť poznamenané , že všetky sekvencie
aminokyse1inových zvyškov sú tu vo forme, ktorých ľavá
a pravá orientácia je konvenčný smer od konca amino ku koncu
karboxy. Ďalej by malo byť poznamenané, že pomlčka na
začiatku alebo na konci sekvencie aminokyselinových zvyškov
uvádza peptidovú väzbu na ďalšiu sekvenciu alebo jeden
a viac aminokyselinových zvyškov . Horeuvedená tabuľka je
uvedená kvôli prevodu trojpísmenového zápisu na
jednopísmenový, pretože sa tu môžu tieto zápisy striedať.
Replikon je akýkolvek genetický element (napr.
11211 plazmid, chromozóm, vírus), ktorý funguje ako autonómna jednotka replikácie DNA in vivo; t.j. je schopná replikácie pod vlastnou kontrolou.
Vektor je replikon, ako je plazmid, fág alebo kozmid, ku ktorému môže byť pripojený iný segment DNA za účelom vyhotovenia replikácie pripojeného segmentu.
Molekula DNA označuje polymérovú formu deoxyribonukleotidov (adenín, guanín, tymín a cytozin) v jej jednovláknovej forme alebo vo forme dvojvláknovej skrutkovice. Tento pojem označuje len primárnu a sekundárnu štruktúru molekuly a neobmedzuje ju na akékoľvek zvláštne terciárne formy. Tento pojem zahŕňa dvojvláknovú DNA nachádzajúcu sa, inter alia, v lineárnych molekulách DNA (napr. reštrikčné fragmenty), vírusoch, plazmidoch a chromozómoch. Pri opisovaní štruktúry špeciálnych dvojvláknových molekúl DNA môžu byť sekvencie opísané podľa normálnej konvencie tak, že uvádzajú len sekvenciu v smere od 5'k 3' pozdĺž netranskribovaného vlákna DNA (t.j. vlákna, ktoré má sekvenciu homológnu k mRNA).
Počiatok replikácie označuje tie sekvencie DNA, ktoré sa zúčastňujú na syntéze DNA.
Kódujúca sekvencia” DNA je dvojvláknová sekvencia DNA, ktorá je transkribovaná a translatovaná do polypeptidu in vivo, kde je umiestnená pod kontrolu vhodnej regulačnej sekvencie. Hranice kódujúce sekvencie sú určené iniciačným kodónom na 5' konci amino a translačným terminačným kodónom na 3' konci karboxy. Kódujúca sekvencia môže zahŕňať, ale nie obmedzená na, prokaryontové sekvencie, cDNA z eukaryontovej mRNA, genómové sekvencie DNA z eukaryontovej (napr. cicavčej) DNA a tiež syntetické sekvencie DNA. Polyadenylačný signál a transkripčné terminačné sekvencie budú zvyčajne umiestnené na 3' konci vzhľadom na kódujúcu sekvenciu.
Transkripčné a translačné kontrolné sekvencie sú regulačné sekvencie DNA, ako promotory, zosilňovače, polyadenylačné signály, terminátory a podobne, ktoré slúžia
11211 na expresiu kódujúcej sekvencie v hostiteľskej bunke.
Promotorová sekvencia je regulačná oblasť DNA schopná väzby s RNA polymerázou v bunke a zahájenia transkripcie smerom k 3' koncu kódujúcemu sekvencie. Za účelom definovania predloženého vynálezu je promotorová sekvencia obmedzená na svojom 3' konci transkripčným iniciačným miestom a presahuje smerom k 5* koncu tak, že zahŕňa minimálny počet báz alebo elementov nutných na zahájenie transkripcie na úrovni detekovateľnej na pozadí. Vnútri promotorovej sekvencie sa bude nachádzať transkripčné iniciačné miesto (vhodne definované mapovaním pomocou nukleázy SI), rovnako ako proteínové väzbové domény (konsesné sekvencie) zodpovedné za väzbu RNA polymerázy. Eukaryontové promotory budú často, ale nie vždy, obsahovať úseky TATA a CAT. Prokaryontové promotory obsahujú Shine-Dalgarnové sekvencie spoločne s konsesnými sekvenciami -10 a -35.
Expresná kontrolná sekvencia je sekvencia DNA, ktorá kontroluje a reguluje transkripciu a transláciu inej sekvencie DNA. Kódujúca sekvencia je pod kontrolou transkripčných a translačných kontrolných sekvencií v bunke, kde RNA polymeráza prepisuje kódujúcu sekvenciu do mRNA, ktorá je potom preložená do proteínu kódovaného kódujúcou sekvenciou.
Pojem oligonukleotid, ako je tu používaný uvádzajúc próby, je definovaný ako molekula zložená z jedného alebo viacerých ribonukleotidov, s výhodou viac než troch. Jeho presná veľkosť bude záležať na mnohých faktoroch, ktoré na naopak záležia oli gonukleot i du.
Pojem primér, oligonukleotid, ktorý v purifikovanom reštrikčnom konečnej funkcii a použití ako sa je tu používaný, označuje buď vyskytuje prirodzene digeste alebo je vyrobený synteticky, ktorý je schopný pôsobiť ako miesto zahájenia syntézy, keď je umiestnený do podmienok, v ktorých je syntéza indukovaná a to predĺžením priméru, t. j.
11211 v prítomnosti polymerázy a nukleotidov vo vhodnej a indukujúcej teplote a pH.
látky ako DNA Primár je buď jednovláknový alebo dvojvláknový a na zahájenie syntézy potrebného indukujúcej látky. Presná dĺžka mnohých faktoroch, vrátane musí byť dostatočne dlhý produktu v prítomnosti priméru bude záležať na teploty, zdroja priméru a použitého spôsobu. Napríklad v diagnostických aplikáciách obsahuje oligonukleotidový primér typicky 15-25 alebo viac aj menej nukleotidov, v závislosti na komplexnosti cieíovej sekvencie.
Priméry tu selektované sú v podstate*' komplementárne k rôznym vláknam cieľovej sekvencie DNA. To znamená, že byť dostatočne komplemetárne, aby príslušnými vláknami. Preto sekvencie zodpovedať presnej sekvencii predlohy.
Napríklad, nekomplementárny nukleotidový fragment je pripojený k 5' koncu priméru s tým, že zvyšok sekvencie priméru je komplementárny ku vláknu. Naopak, nekomplementárna báza alebo ďalšia sekvencia sú vsunuté do medzier*1 do vnútra priméru, za predpokladu, že sekvencia priméru má dostatočnú komplementaritu so sekvenciou vlákna, aby hybridizovala a tým utvorila templát pre syntézu pnmery musia hybridizovali s priméru nemusia predĺženého produktu.
Ako je použité tu, pojmy reštrikčné endonukleázy a reštrikčné enzýmy sa týkajú bakteriálnych enzýmov, ktoré štiepia dvojvláknovú DNA v mieste alebo blízko miesta špecifickej nukleotidovej sekvencie.
Bunka je transformovaná exogénna alebo heterológová DNA, kde je takáto DNA vnesená do vnútra bunky. Transformujúca DNA je alebo nie je integrovaná (kovalentne spojená) do chromozomálnej DNA tvoriacej genóm bunky. Napríklad u prokaryontov, kvasiniek a buniek cicavcov je transformujúca DNA udržiavaná na epizómových elementoch ako sú plazmidy. S ohľadom na eukaryontové bunky je stabilne transformovaná bunka taká, v ktorej bola transformujúca DNA integrovaná do chromozómu tak, že je dedená dcérskymi
11211 bunkami počas demonštrovaná bunkové línie buniek, ktoré replikácie chromozómu. Táto stabilita je schopnosťou eukaryontovej bunky vytvoriť alebo klony obsahujúce populáciu dcérskych obsahujú transformujúcu DNA. Kloň“ je populácia buniek odvodených z jedinej bunky alebo spoločného predka mitózou. Bunková línia je kloň primárnej bunky, ktorý je schopný stabilného rastu in vitro mnoho generácií.
Dve sekvencie DNA sú “v podstate homológne, keď sa zhoduje najmenej 75% (výhodne najmenej 80% a najvýhodnejšie najmenej 90 alebo 95%) nukleotidov v definovanej dĺžke sekvencií DNA. Sekvencie, ktoré sú v podstate homológne, sú identifikované porovnaním sekvencií dostupných v sekvenčných databankách pomocou štandardného softvéru alebo v hybridizačných experimentoch typu Sothern za, napr. stringentných podmienok, ako je to definované pre príslušný systém. Definovanie vhodných hybridizačných podmienok je odbornou vecou, viď napr. Naniatis et al. supra; DNA cloning, Vols. I a II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
“Heterológová oblasť konštrukcie DNA je identifikovaný segment DNA vnútri dlhej molekuly DNA, ktorý sa nenachádza v spojení s ďalšou molekulou v prírode. Keď heterológová oblasť kóduje gén cicavca, tento gén bude zvyčajne ohraničený DNA, ktorá neohraničuje genómovú DNA cicavca v genóme východzieho organizmu. Iný príklad heterológovej kódujúcej sekvencie je konštrukcia, kde kódujúca sekvencia samotná sa nenachádza v prírode (napr. cDNA, kde genómová kódujúca sekvencia obsahuje intróny, alebo syntetické sekvencie, ktoré majú kodóny iné než u prirodzeného génu). Alelické variácie alebo prirodzene sa vyskytujúce mutačné udalosti nie sú príčinou vzniku heterológových oblastí DNA, ako je tu definované.
Protilátka je akýkolvek imunoglobulín, vrátane protilátok a fragmentov z nej pochádzajúcich, ktorý viaže špecifický epitop. Pojem zahŕňa polyklonálne, monoklonálne a chimerické protilátky, posledne menované sú opísané
11211 proteolytickou reakciou pôvodné imunoglobulínové detailne v U.S. Patent No. 4,816,397 a 4,816,567.
Spoločné proti látkové miesto je taká štruktúrna časť molekuly protilátky obsiahnutá v ťažkom a ľahkom reťazci variabilných a hypervariabiIných oblastí, ktorá špecificky viaže antigén.
Pojem molekula protilátky” vo svojich rôznych gramatických formách, ako je to tu použité, sa týka ako intaktnej imunoglobulínovej molekuly, tak imunologický aktívnej časti imunoglobulínovej molekuly.
Príkladné molekuly protilátky sú pôvodné imunoglobulínové molekuly, skutočné sú pôvodné imunoglobulínové molekuly a tie ich časti známe v odbore ako Fab, Fab', F(ab') a F(v), ktoré sú uprednostnené pre použitie v terapeutických spôsoboch tu opísaných.
Časti protilátok Fab a F(ab') sú pripravované papaínu a pepsínu na skutočné molekuly spôsobmi, ktoré sú dobre známe. Viď napr. U. S. Patent No. 4,342,566, Theofilopolous et. al. Časti protilátok Fab* sú dobre známe a sú produkované z častí F(ab') následnou redukciou merkaptoetanolom disulfidových väzieb dva ťažké reťazce a následnou alkyláciou výsledného bielkovinového merkaptánu činidlom akým je iódoacetamid. Uprednostnené sú intaktné molekuly protilátok.
Pojem monoklonálna protilátka vo svojich rôznych gramatických formách sa vzťahuje na protilátku, ktorá má len jeden druh väzbového miesta, ktoré imunogénne reaguje s príslušným antigénom. Monoklonálna protilátka tak typicky vykazuje jedinú väzbovú afinitu pre antigén, s ktorým imúnne reaguje. Monoklonálna protilátka tak obsahuje molekulu, ktorá má pluralitu vzájomných miest, každé imunošpecifické na iný antigén; napr. dvojito špecifickú (chimérnu) monoklonálnu protilátku.
Pojem farmaceutický prijateľný sa týka molekulárnych entít a prostriedkov, ktoré sú fyziologicky tolerantné a nespôsobujú alergické alebo podobné reakcie, ako sú
- 37 11211 žalúdočná nevoľnosť, závrat a podobne, keď sú podávané človeku.
Pojem terapeuticky účinné množstvo tu znamená množstvo dostatočné na zabránenie a s výhodou na zníženie najmenej o 30 percent a ešte výhodnejšie o 50 percent a najvýhodnejšie o 90 percent klinicky významnej zmene vo fáze aktivity S cieľovej bunkovej masy alebo iného patologického stavu, ako napr. zvýšeného krvného tlaku, horúčky alebo množstva bielych krviniek.
Sekvencia DNA je operatívne spojená k expresnej kontrolnej sekvencii, keď expresná kontrolná sekvencia riadi a reguluje transkripciu a transláciu tej sekvencie DNA. Pojem operatívne spojená zahŕňa sekvenciu, ktorá má vhodný počiatočný signál (napr. ÄTG) na jej začiatku, ktorá slúži na expresiu a udržiavanie správneho čítacieho rámca, ktorý umožňuje expresiu sekvencie DNA pod riadením expresnej kontrolnej sekvencie a produkciu požadovaného produktu kódovaného touto sekvenciou DNA. V prípade, že gén, ktorý je požadovaný kvôli vneseniu do rekombinantnej molekuly DNA, neobsahuje vhodný počiatočný signál, je taký počiatočný signál dodatočne vnesený na začiatok tohoto génu.
Pojem štandardné hybridizačné podmienky sa týka koncentrácie soli a teplotných podmienok, ktoré sa v podstate rovnajú 5xSSC a 65°C pre hybridizáciu a premývanie.
V jednom aspekte sa predložený vynález týka transgénnych zvierat, ktoré exprimujú CNGM alebo neurálnu rozpoznávaciu molekulu, zvlášť L1, a to výhodne v astrocytoch. Tieto zvieratá majú zvýšenú schopnosť nervového rastu v centrálnej nervovej sústave.
Vynález tiež zahŕňa skúšku na testovanie potenciálnych prostriedkov, ktoré sú účinné pri modulácii nervového rastu cieľových buniek cicavcov prerušením alebo potenciáciou nervovej rozpoznávacej aktivity CNGM. Ako nervová rozpoznávacia aktivita alebo nervová adhézna aktivita je mienený akýkoľvek biologický efekt, ktorý je výsledkom väzby
11211 chemickej vzorke alebo s kontrolou. Určujúce vyhotovení domény Ll,
CNGM na inú molekulu, vrátane intracelulárnych efektov na druhých prenášačov. V jednom prípade je testovaný prostriedok podávaný do bunkovej vzorky s ligandom, ktorý aktivuje nervový rastový modulátor CNS, alebo transgénnemu zvieraťu exprimujúcemu nervový rastový modulátor CNS, to všetko za účelom stanovenia vplyvu modulátoru na väzbovú aktivitu modulátoru na akejkoľvek testovanom prostriedku porovnávaním charakteristiky najmenej jedného z predložených nervových rastových modulátorov CNS, zvlášť L1, je ich účasť na zmenách v ustálených hladinách intracelulárnych prenášačov, zahŕňajúcich Ca2+, pH a cyklické nukleotidy, rovnako ako zmeny v aktivitách proteín kináz, ako sú proteín kináza c, pp60c*Brc, kazeín kináza typu II a iná kináza, ktorá fosforyluje L1.
Systém skúšky je adaptovaný na identifikáciu látok alebo iných entít, ktoré sú schopné viazať sa na CNGN alebo proteíny v cytoplazme alebo v jadre a tým sú schopné inhibovať alebo potencovať transkripčnú aktivitu. Také skúšky sú užitočné pri vývoji látok, ktoré sú špecifické na danú bunkovú aktivitu, ako je nervový rast alebo zvýšenie synaptickej pôsobivosti alebo ktoré potencujú takú aktivitu v čase alebo hladine aktivity. Také látky sú používané napríklad na modulovanie nervového rastu pri zranení alebo na liečbu iných patológií, napríklad na liečbu neurodegeneratívnych chôrob, akými sú Parkinsonova choroba, ALS, Huntingtonova choroba a Alzheimerova choroba.
V ešte ďalšom vyhotovení sa vynález týka agonistov a antagonistov aktivity nervového rastového modulátoru CNS. Zvlášť látka alebo molekula, ktorá inhibuje schopnosť neurónov rozpoznávať CNGN ako L1 je používaná na zamedzenie nervového rastu tam, kde je taký rast kontraindikatívny, a ako je opísané vyššie, farmaceutický prípravok obsahujúci takú látku je podávaný priamo do cieľového miesta. V inom je agonistom peptid, ktorý má sekvenciu časti zvlášť tie domény medzi fibronektínovými
11211 opakovaniami 2 a 3 alebo je agonistom protilátka proti tejto oblasti. Obidve tieto molekuly sú potenciálne použité tam, kde má daný CNGM ako Ll schopnosť homolytickej väzby (t.j. jedna molekula Ll viaže inú molekulu Ll a preto obidve protilátky proti Ll a proti fragmentom Ll sú schopné väzby na Ll).
Jedno z diagnostických využití predloženého vynálezu sa týka použitia prítomných CNGM v skúškach na testovanie inhibítorov proteín kinázy. Pretože molekuly CNGM sú v aktívnom stave fosforylované, sú tiež defosforylované špecifickými fosfatázami. Blokovanie špecifickej kinázy alebo fosfatázy je preto cesta k farmakologickému pôsobeniu, ktoré moduluje aktivitu týchto nervových rozpoznávacích proteínov.
Predložený vynález sa podobne týka vývoja protilátok proti CNGM vrátane prirodzene vyvolaných a rekombinantne pripravených protilátok. Protilátky sú napríklad použité na testovanie expresných knižníc za účelom získania génov, ktoré kódujú CNGM. Také protilátky zahŕňajú polyklonálne a monoklonálne protilátky pripravené známymi genetickými technikami, rovnako ako zahŕňajú dvoj ito špecifické (chimérne) protilátky a tiež protilátky obsahujúce iné vlastnosti prispôsobujúce ich pre ďalšie diagnostické použitie spojené s ich schopnosťou modulovať nervový rast.
Protilátky proti nervovým rastovým modulátorom CNS sú zvlášť selektované a zahrnuté do rozsahu predloženého vynálezu pre ich zvláštnu schopnosť väzby proteínu. Aktivita nervových rastových modulátorov alebo špecifických polypeptidov je sledovaná priamo pomocou uvedených testovacích skrz použitie vhodne značeného množstva rastového modulátoru alebo protilátky alebo ich nervového analógu.
CNGM, ich analógy a akékoľvek inhibítory alebo protilátky, ktoré sú vyvolané, sú schopné použitia v spojení s rôznymi diagnostickými technikami, vrátane imunoskúšky ako je rádioimunoskúška, s použitím, napríklad, protilátky proti
11211
CNGM, ktorá bola označená rádioaktívnou adíciou, redukciou bórohydridom sodným alebo rádiojodináciou.
Kontrolné množstvo inhibítorov alebo protilátok v imunoskúške je vnesené do kontrolnej vzorky. Po tom, čo má značený materiál alebo jeho väzbový partner možnosť reagovať s miestami vnútri vzorky, je výsledné množstvo zmerané známymi technikami, ktoré sú rôzne podlá povahy pripojenej značky. Protilátky proti CNGM sú použité v prípade protokolu.
V prípade, keď sú použité rádioaktívne značky v podobe izotopov 3H, 14C, 32P, 3®C1, 51Cr, 57Co, 5BCo, 59Fe, ®°Y, 1251, 131 j a ιββββ/ použité súčasné meracie techniky. V prípade, keď je značkou enzým, je detekcia vykonaná akoukoívek zo súčasne používaných kolorimetrických, spektrofotometrických, fluórospektrofotometrických, ampérometrických a gazometrických techník, ktoré sú v odbore známe.
Predložený vynález sa týka skúšky, ktorá je vykonaná vo forme testovacej súpravy pre kvantitatívnu analýzu na prítomnosť nervových rastových modulátorov alebo na identifikáciu látok alebo iných činidiel, ktoré napodobňujú alebo blokujú ich aktivitu. Systém testovacej súpravy obsahuje značený komponent pripravený jednou z rádioaktívnych alebo enzýmových techník tu opísaných, zahŕňa pripojenie značky na nervové rastové modulátory ich agonistami alebo inhibítormi, a obsahuje ďalšie imunochemické činidlá, najmenej jedným z nich je voíný alebo imobilizovaný ligand schopný väzby s označeným komponentom alebo jeho väzbovým partnerom a určením príslušného.
V ďalšom vyhotovení sa predložený vynález týka určitých terapeutických spôsobov, ktoré sú založené na aktivite nervových rastových modulátorov CNS, ich podjednotiek alebo ich aktívnych fragmentov, alebo na činidlách a iných látkach, ktoré tú istú aktivitu. Prvý terapeutický spôsob je spojený s podporou nervového rastu v CNS, ktorý je spôsobený prítomnosťou a aktivitou CNGM, ich aktívnych fragmentov,
11211 analógov a príbuzných látok, a ktorý zahŕňa podávanie látky schopnej modulovania produkcie alebo aktivity CNGM, v množstve účinnom na dosiahnutie podpory vývinu CNS, obnoveného rastu alebo rehabilitácie u pacienta. Naopak iné látky alebo iní neutralizujúci väzboví partneri CNGM sú podávané za účelom inhibície alebo zabránenia nežiadúceho nervového rastu. Tiež modulácia pôsobenia špecifických kináz a fosfatáz, ktoré sa zúčastňujú fosforylácie a defosforylácie CNGM, sa týka tohoto spôsobu a umožňuje terapie založené na aktivácii CNGM.
Terapeutický spôsob, ktorý je tu všeobecne opísaný, zahŕňa spôsob liečby rôznych chorôb a iných bunkových disfunkcií a porúch podávaním farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú účinné inhibítory alebo aktivátory nervového rastového modulátoru CNS alebo jeho podjednotiek alebo iných rovnako účinných látok vyvinutých napríklad pomocou skúšky na testovanie látok, ktorá je pripravená a používaná v zhode s ďalším aspektom predloženého vynálezu. Napríklad látky alebo ich väzboví partneri k nervovým rastovým modulátorom CNS a proteínom sú podávané, aby inhibovali alebo potencovali naviazanie a aktivitu druhého prenášača.
Ako je uvedené vyššie, vynález sa týka objavu celej rodiny molekúl Ll CAM a zvlášť analógu k Ll známeho ako CHL1. CHL1 obsahuje terminálnu signálnu sekvenciu na konci N, šesť imunoglobulínových domén, fibronektínu podobné opakovania, transmembránovú doménu a intracelulárnu doménu na konci C, ktorá je dlhá približne 100 aminokyselín. CHL1 je najviac podobná vo svojej extracelulárnej doméne na kuraciu Ng-CAM (40* aminokyselinovej identity), potom na myšiu Ll, kurací neurofascín, kurací Nr-CAM, drozofilí neuroglián a Ll.1 zebričky (37 až 28* aminokyselinovej identity), na myšiu F3, krysiu TAG-1 a králičiu BIG-1 (približne 27* aminokyselinovej identity). Podobnosť s inými členmi rodiny Ig (napr. N-CAM, DCC, HLAR, rse) je 16 až 11*. Intracelulárna doména sa najviac podobá na myšiu a kuraciu Nr-CAM, na myší a krysí neurofascín 1 (približne
11211
50% aminokyselinovej identity), potom na kurací neurofascín Ng-CAM, drozofilí neuroglián a Ll.l a L1.2 zebričky (približne 40% aminokyselinovej identity). Okrem celkovej vysokej homológie a zachovalej modulárnej štruktúry medzi predtým uvedenými členmi rodiny Ll (myšia/ľudská Ll/krysia NÍLE; kuracia/Ng-CAM; kuracia/myšia Nr-CAM; drozofilí neuroglián; Ll.l a L1.2 zebričky; kurací/myší neuroglián/krysí ADGP). Charakteristické vlastnosti L1 holi určené s ohľadom na počet aminokyselín medzi konzervovaných aminokyselinových zvyškov, ktoré definujú vzdialenosti vnútri a medzi dvoma priľahlými doménami pôdobnými Ig a opakovaniami podobnými FN. Tieto vykazujú kolinearitu v šiestich doménach podobných Ig a priľahlých štyroch opakovaniach podobných FN, ktorá je značne konzervovaná medzi L1 a molekulami obsahujúcimi tieto moduly (pomenovaná súbor rodiny Ll) a zahŕňa formy so spojením GFI podskupiny F3 (myšia F3/kuracia Fll/ľudská CNTN1; krysia BIG-l/myšia PANG; krysia TAG-l/myšia TAX-l/kurací axonín-1). Molekula rakoviny konečníku (DCC) predtým uvedená ako molekula podobná N-CAM prináleží do súboru rodiny Ll. Inými štruktúrnymi znakmi CHL1 zdieľanými medzi členmi rodiny Ll sú vysoký stupeň N-glykozidicky naviazaných karbohydrátov (približne 20% ich molekulovej hmotnosti), obsahuje karbohydrátovú štruktúru HMK-1 a vzorku proteínových fragmentov obsahujúcu hlavný pruh 185 kD a menšie fragmenty 100 a 125 kD. Rovnako ako pre ostatných členov rodiny Ll je prevažná expresia Ll pozorovaná v nervovom systéme v neskorších vývojových štádiách.
Nasledujúce príklady sú uvedené v poradí tak, aby plne ilustrovali výhodné vyhotovenie vynálezu. Nemali by byť žiadnym spôsobom upravené tak, aby neobmedzovali široký rozsah vynálezu.
11211
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 a kódujúca translačným
Transgén GFAP-L1 a vytvorenie transgénnej myši
Gliový fibrilárny kyslý proteín (GFAP, Eng et al. (1971) Brain Res. 28:351-354) je prednostne exprimovaný astrocytmi v neskorších štádiách vývoja myšej centrálnej nervovej sústavy (Landry et al. (1990) J. Neurosci. Res. 25:194-203). Preto boli regulačné sekvencie génu GFAP použité, aby riadili expresiu nervovej bunkovej adhéznej molekuly L1 v zrelých astrocytoch transgénnych myší. Transgén GFAP-L1 (Obr.l) kóduje len nervovú bunkovú adhéznu molekulu Ll, pretože kodón ATG génu GFAP bol mutovaný sekvencia Ll je nasledovaná na 3' konci signálom pre zastavenie a polyadenylačným signálom (Toggas et al. (1994) Náture 367:188-193). Táto konštrukcia bola použitá na vytvorenie troch rôznych línii transgénnych myší, označených 3418, 3426 a 3427.
Myšia CDNA Ll (Moos et al. (1988) Náture 334:701-703) bola vnesená do exónu 1 myšieho génu pre gliový fibrilárny kyslý proteín (GFAP), ktorý bol modifikovaný, ako je uvedené (Toggas et al. (1994) Náture 367:188-193). Myšia cDNÄ Ll dlhá 4,05 kh obsahujúca celú kódujúcu sekvenciu proteínu a 250 netranslatovaných nukleotidov na 3' konci bola spojená s modifikovaným transgénom GFAP-L1.
Transgén GFAP-L1 dlhý 14,5 kb bol vyštiepený z modifikovaného klonovacieho vektora digesciou s Sci I, potom bola vykonaná elektroforéza z agarózového gélu. Purifikovaná DNA konečnú koncentráciu 2 ug/ml v pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Približne mikroinjekované do samčieho jadra oplodnených vajíčok odobraných od sainičiek CB6F1 (s veľkou ovuláciou), ktoré boli spárené so samcami C57/B1/6J. Vajíčka, ktoré prežili a elektroeluácia bola nariedená na TsEo.i (5 mM Tris-HCl, 2 pl nariedené DNA boli
11211 mikromanipuláclu, boli prenesené do vajcovodu umelo oplodnenej samičky podľa opísaných spôsobov bola (Hogan et al. (1986) Hanipulating Mouse Embryo, Cold Spring Harbour Laboratory, New York).
Príklad 2
Analýza Southern blot
Myši boli analyzované na integráciu transgénu do myšieho genómu pomocou analýzy Southern blot genómovej DNA izolovanej z hiopsií chvostu (Southern (1975) J. Mol. Biol. 98:503-517). Transgénne zakladateľské myši boli párené a mláďatá boli testované rovnakým spôsobom kvôli vytvoreniu transgénnych línií. Vzorky DNA s hmotnosťou 10 yg boli Eco RI a Xba I a potom boli separácii na agarózovom gél i štiepené enzýmmi Bam, Hl, podrobené elektroforetickej s koncentráciou 0,7% a DNA bola prenesená na membránu Hybond N+ (Amersham) v alkalickom prostredí. Fragment Eco RI dlhý 3,3 kb z cDNA L1 alebo fragment Hind III dlhý 330 ph z neskoršieho zostrihu SV40 a z polyadenylačného miesta puriflkovaného z plazmidu Äl,5 (Maxwell et al. (1989) Biotechnigues 7:276-280) bol označený náhodným primérovaním s 32pí-alfa-CTP (Boehringer Mannheim) za účelom použitia ako próby. Prehyhridizácia bola vykonaná pri 65eC jednu hodinu v 5x SSPE, 5x Denhardtov roztok, 0,5% (w/v) SDS a 0,1 mg/ml sonifikovanej nehomológovej DNA. Hybridizácia bola vykonaná cez noc. Konečné podmienky premývania pre všetky Southernové bloty boli 0,lx SSPE a 0,1% SDS (w/v) pri 65eC.
Príklad 3
Analýza Northern blot
Anestetizované dospelé myši (12 týždňov staré) holi utratené smrteľnou dávkou chlóralhydrátu a odobrané mozgy
11211 boli okamžite zmrazené v tekutom dusíku. Celková bunková RNA bola izolovaná rozdrvením tkaniva v tekutom dusíku. Štvormolárny guanídium tiocyanát bol pridaný k rozdrvenému tkanivu. Izolácia celkovej RNA bola vykonaná ako je opísané (Chomczynski et al. (1987) Anál. Biochem. 162:156-159; Pagliusi et al. (1989) AMOG. J. Neurosci. Res. 22:113-119). Výťažky RNA boli odhadnuté z absorbancie pri 360 nm. 10 pg RNA bolo frakcionovaných na 1% agarózových a formamidovýcb géloch kvôli analýze Northern hlot (Thomas (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:201-205).
Náhodne primérované próby cDNA Ll boli použité na súčasnú detekciu endogénnej mRNA Ll s dĺžkou 6 kb (Tácke et al. (1987) Neurosci. Lett. 82:89-94) a tiež z transgénu odvodenej mRNA Ll s dĺžkou 4,2 kb. Denzitometrická analýza Northern blotov bola vykonaná na skenovacích obrázkoch (Arcus scanner, Agfa-Gavaert) z originálnych filmov pomocou programu Image (NIH, Research Serveces Branch, NIMH).
Analýza Nothern blot celkovej RNA z celých mozgov transgénnych zvierat odhalila transkripty odhadovanej velkosti (4,2 kb) pre mRNA odvodenú z transgénu (Obr.2). Tieto transkripty sú jasne odlišné od endogénnej mRNA Ll, ktorá je dlhá 6 kb a pochádza z postmitotických neurónov. Denzitometrická analýza odhalila, že hladiny mRNA Ll odvodenej z transgénu boli 34%, 13% a 8% v líniách 3426, 3427 a 3418, ako to bolo porovnané s hladinami endogénnej mRNA Ll (100%).
Príklad 4
Zvieratá
Pre kultúry na kryostatických rezoch a experimenty v imunocytochémii a hybridizácii in situ boli kontrolné zvieratá brané zo zásoby rovnako starých normálnych myší C57hl/6J alebo iných netransgénnych potomkov. Pre izoláciu malých cereberálnych neurónov a pre prípravu kultúr
11211 astrocytov boli používané šesť dní staré netransgénne mláďatá ICR. Neuróny dorzálneho koreňového gangliónu (DRG) boli pripravené z osem dní starých kuracích embryí.
Príklad 5
Hybridizácia in situ
Kvôli overeniu, že astrocyty transgénnych zvierat exprimovali Ll in vivo boli analyzované optické nervy pomocou hybridizácie in situ. Bol vybraný optický nerv, pretože obsahuje len gliové bunky a neobsahuje neuronálne bunkové telieska. Astrocytom in vivo normálne chýba expresia Ll vo všetkých vývojových štádiách (nepublikované údaje).
Kvôli detekcii mRNA Ll v kryostatických rezoch čerstvo zmrazených mozgových rezov boli vytvorené dioxigenínom označené cRNA pomocou transkripcie in vitro (Dôrries et al. (1993) Histochemistry 99:251-262). Sekvencia kódujúca extracelulárnu časť Ll (Hoos et al. (1988)) bola subklonovaná do vektora pBluescript KS+ (Stratagene). Próby cRNA v zmysle a proti zmyslu čítania boli vytvorené prepisom inzertu Ll po linearizácii výsledného plazmidu s Xho I a/alebo Xba I pomocou promotorov T7 a T3. Kvôli vytvoreniu prób cRNA GFAB bol subklonovaný fragment cDNA GFAP (Lewis et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2743-2745;
N. J. Cowanom) dlhý 1,2 kb a kódujúci vektora pBluescript KS+. Próby cRNA proti zmyslu čítania boli vytvorené prepisom plazmidu, linearizáciou s Eco RI a Xho I láskavo poskytnutý Dr. koniec N proteínu do v zmysle a výsledného z promotorov T3 a T7. Kvôli zlepšeniu prenikania do tkaniva boli próby cRNA v zmysle a proti zmyslu čítania zrovnané za podmienok alkalickej hydrolýzy, aby sa získala priemerná dĺžka fragmentov približne 300 nukleotidov. Hybridizácia in situ na rezoch optických nervov pripravených z dospelých zvierat (12 dní starých) bola vykonaná ako je opísané (Dôrries et al. (1993); Bartsch et al., J. Neurosci.,
11211 v tlači ) .
V netransgénnych kontrolách boli transkripty detekované len v nervových bunkách sietnice, ale nie v optickom nerve, ani pred (0br.3A) ani po poškodení (0br.3B). Naopak, mRNA Ll boli exprimované gliovými bunkami optických nervov z transgénnych myší (0br.3C). Bunky pozitívne na mRNA Ll boli detekovatelné ako vo vzdialených myelínovaných, tak aj v bližších nemyelínovaných častiach nervu. Intenzita hybridizačného signálu bola vyššia v nemyelínovanej bližšej časti v porovnaní s myelínovanou vzdialenejšou častou nervu.
Podobné rozmiestnenie pozitívnych buniek a podobné rozdiely v intenzite značenia medzi nemyelínovanými a myelínovanými oblasťami boli pozorované pomocou próby cRNA GFAP (porovnajte Obr.3C a E). Počet buniek pozitívnych na mRNA Ll v optickom nerve transgénnych zvierat však bol vždy významne menší než počet buniek pozitívnych na GFAP, pravdepodobne kvôli nižšej citlivosti próby cRNA Ll.
Detekovatelné hladiny mRNA Ll sú alternatívne dosiahnuté v astrocytoch s vysokou hladinou expresie GFAP. Taký prahový efekt môže byt spôsobený navrhnutím transgénu GFÄP-L1, ktorý obsahuje len 2 kb zo sekvencie GFAP v smere 5' konca. Štúdie in vitro dokazujú, že oblast medzi 2a 6 kb v protismere k miestu počiatku transkripcie obsahuje sekvenčné elementy posilňujúce expresiu GFAP riadených spojených génov (1991) J. Neurosci. 28:217-228).
exónu 1 génu GFAP vrátane vnesenia znížit stabilitu chimérovej mRNA v porovnaní s mRNA GFAP a meniť efekty spôsobené regulačnými sekvenciami GFAP umiestnenými v obidvoch smeroch v modifikovanej oblasti.
Po poškodení optického nervu bola pozorovaná zvýšená expresia Ll v transgénnych (0br.3D), ale nie v netransgénnych (0br.3B) optických nervoch. Počet buniek, ktoré exprimovali Ll a intenzita hybridizačného signálu Ll boli podobné u rôznych zvierat rovnakej, transgénnej línie, ale líšil sa medzi rôznymi transgénnymi líniami. V zhode v bunkách C6 (Sarid Nakoniec, modifikácia velkej cDNA Ll môže
11211 s výsledkami získanými pomocou analýzy Northern blot (viď vyššie) boli bunky pozitívne na mRNA Ll najpočetnejšie v línii 3426, potom v línii 3427 a najmenej početné v línii 3418. Táto rozdielnosť v hladine expresie transgénu u rôznych línií môže byť odvodená z mnohých faktorov, zvlášť vplyvom okolitých oblastí hostiteľského chromatínu, ktoré ohraničujú rôzne transgénne integračné miesta (Proudfoot (1986) Náture 322:562-565; Reik et al. (1987) Náture 328:248-251; Sapienze et al. (1987) Náture 328:248-254).
Príklad 6
Protilátky
Výroba polyklonálnych králičích protilátok proti myšej Ll a purifikácia na imunoafinitnej kolóne na Ll (Rathjen et al. (1984); Martini et al. (1988) a polyklonálnych protilátok proti myšej pečeňovej membráne (Lindner et al. (1983); Pollerberg et al. (1985) boli opísané. Myšia polyklonálna protilátka proti GFAP bola kúpená (Boehringer Mannheim).
Kvôli analýze Western blot boli polyklonálne a monoklonálne protilátky zviditeľnené pomocou peroxidázy z reďkovky konjugovanej s kozími protimyšími a/alebo králičími protilátkami (Dianova, Hamburg, Nemecko). Kvôli imunocbémii boli primárne protilátky detekované pomocou konjugovaných kozích protimyších a králičích protilátok značených fluoresceínom, izotiocyanátom alebo tetrametylrodamid izotiocyanátom (Dianova). Digoxigenínom značené próby cRNA pre hybridizáciu in situ boli zviditeľnené pomocou s alkalickou fosfatázou konjugovaných fragmentov Fab k digoxigenínu (Boehringer Mannheim).
11211
Príklad 7
Udržovanie neurónov na kryostatických rezoch
Pre analýzu, ak sú optické nervy z transgénnych zvierat viac vodivé do rastu neuritov, než optické nervy z divokého typu zvierat, boli cerebelárne neuróny udržiavané na kryostatických rezoch poškodených a nepoškodených optických nervov (Obr 7).
Optické nervy z 6 až 16 týždňov starých myší boli pripravené ako je opísané (Bartsch et al. (1989) J. Comp. Neurol. 284:451-462. Krátke, poškodené a nepoškodené optické nervy boli zakotvené a zmrazené v hormonálne definovanom médiu bez séra (Fischer (1986) Neurosci. Lett. 28:325-329) pomocou tekutého dusíku. Tkanivové rezy (14 ym hrubé) boli pozdĺžne rozrezané na kryostate Frigocut 270 (Jung-Reichardt), upevnené do sterilného podložného sklíčka potiahnutého poly-L-lyzínom (Sigma, 0,001% vo vode) a vysušené 2 až 3 hodiny v sterilnom bloku. Potom bolo vykonané premytie rezov v médiu 5 min. Malé cereberálne neuróny purifikované cez gradient perkolu (Keilhauer et al. (1985) Náture 316:728-730) získané zo šesť dní starých myší ICR (6 x 104 buniek v 100 yl média) boli nanesené na každé sklíčko. Bunky boli udržiavané v inkubátore pri 37°C vo zvlhčenej atmosfére 5% CO2 a 95% vzduchu.
Rast neuritov bol tiež meraný za prítomnosti protilátok. Rezy boli predinkubované s polyklonálnymi protilátkami proti Ll alebo polyklonálnymi protilátkami proti myším pečeňovým membránam (100 yg/ml, intenzívne dialyzované a nariedené v médiu) po 1 hod. pri 37°C. Po odstránení protilátok boli rezy opatrne premyté médiom (5 krát, každé premytie 5 min. pri izbovej teplote) a potom boli pridané v Perkolovom gradiente purifikované malé cereberálne neuróny. Po dvoch dňoch boli kryostatové kultúry fixované v 4% paraformaldehyde v PBS počas doby 30 min. pri izbovej teplote a potom boli odmerané dĺžky neuritov. Aby sa vyhlo okrajovým efektom pri meraní, nevydnocovali sa rezy,
11211 ktoré boli umiestnené na vnútornej hrane obnášajúcej 20% zo sklíčka. Pomocou programu na semiautomatický výpočet obrazovej analýzy (IBAS, Kontron, Zeiss) boli zmerané dĺžky všetkých neuritov, ktoré vyrástli na týchto rezoch a priemerná dĺžka neuritov vzhľadom na telo nervovej bunky bola vypočítaná. Pre každý experiment a optický nerv (poškodený alebo nepoškodený) bola priemerná dĺžka neuritov, ktoré rástli na nervoch transgénnych zvierat, braná vzhľadom na príslušné hodnoty kontrolných zvierat. Dvanásť nezávislých experimentov bolo vykonaných s poškodenými a nepoškodenými nervami pomocou najmenej dvoch transgénnych zvierat.
Pre transgénne zvieratá bolo pozorované predĺženie dĺžky neuritov na poškodených nervoch v porovnaní s nepoškodenými nervami. Na rozdiel od toho neboli dĺžky neuritov na poškodených a nepoškodených optických nervoch zvierat divokého typu významne odlišné (Obr.8). Neurity pestovaných neurónov na nepoškodených optických nervoch z transgénnych zvierat boli konzistentne dlhšie než neurity pestovaných neurónov na nepoškodených nervoch zo zvierat divokého typu. Maximálne zväčšenie dĺžky neuritov na 300% holo pozorované, keď boli použité rezy z línie 3426. Podobne bola zväčšená dĺžka neuritov na poškodených nervoch transgénnych línií až na 400%, keď sa porovnali s poškodenými nervami zo zvierat divokého typu.
Aktivita podporujúca rast neuritov transgénnych optických nervov korelovala pozitívne s hladinou expresie Ll (Obr. 8). Nepoškodené optické nervy línie 3426, ktoré exprimujú najvyššiu hladinu proteínu Ll, boli potentnejšíe v predĺžení neuritovej dĺžky než línie 3427 a 3418, ktoré exprimovali nižšiu hladinu Ll. Na poškodených optických nervoch línií 3426 a 3427 (28 dní po poškodení) bola dĺžka neuritov 4 krát väčšia než na poškodených optických nervoch zvierat divokého typu. Zistenie, že zväčšenie dĺžky neuritov v poškodených optických nervoch holo podobné pre línie 3426 a 3427 (aj keď línia 3426 vykazuje 25% zvýšenie expresie
11211 proteínu Ll po poškodení v porovnaní s líniou 3427) indikuje, že hladina proteínu Ll v línii 3427 už stačí na maximálnu indukciu rastu neuritov na malých cerebelárnych neurónoch.
Preinkubácia nepoškodených optických nervov zo zvierat divokého typu s polyklonálnymi protilátkami proti Ll alebo proti myším pečeňovým membránam významne neovplyvnila dĺžky neuritov (Obr. 9). Naopak, dĺžky neuritov boli redukované o viac než 50%, keď boli kryostatické rezy nepoškodených a poškodených optických nervov z transgénnej línie 3426 preinkubované s protilátkami proti Ll (Obr. 9). Protilátky proti pečeňovým membránam, ktoré silne viažu optické nervy a malé cerebelárne neuróny (údaje nevykazujú podobné inhibičné efekty preinkubácia poškodených optických divokého typu s protilátkami proti Ll indukovala predĺženie dĺžky neuritov v porovnaní s poškodenými nervami zo zvierat divokého typu bez predchádzajúcej preinkuhácie s protilátkami proti Ll. Protilátky proti myším pečeňovým membránam nevykazujú významné zvýšenie za rovnakých podmienok, čo ukazuje, že pridanie bunkových povrchových reaktívnych protilátok nenaruší rast neuritov.
nie sú ukázané), Je zaujímavé, že nervov zo zvierat
Príklad 8
Udržiavanie neurónov na jednovrstvových kultúrach astrocytov Na prípravu jednovrstvových astrocytov boli vyčistené predné mozgy zo šesť dni starých myší od iného, než nervového tkaniva a boli disociované ako bolo opísané (Schnitzer et al. (1981) J. Neuroimmunol. 1:429-456; Fischer et al. (1982) Neurosci. Lett. 29:297-302; Keilhauer et al. (1985). Bunky boli udržiavané na poly-L-lyzínom potiahnutých (Sigma, 0,001% vo vode) tkanivových miskách v médiu BME (Gibco) obsahujúcich 10% konské sérum a 2 mM glutamín počas doby 14 až 21 dní. Kontaminujúce oligodendrocyty a neuróny
11211 boli odstránené pretrepaním misiek pri každej výmene média a ďalším pestovaním buniek v intervaloch štyroch dní. Imunologické farbenie GFÄP počas 14 dní udržiavania ukázalo, že viac než 90% buniek boli astrocyty. Po 14 dfioch v kultúre boli bunky skontaktované s trypsínom a udržiavané ako jedna vrstva päť dní na sklíčkach potiahnutých poly-L-lyzínom. Malé cerebelárne neuróny purifikované v gradiente Perkolu (Schnitzer et al. (1981)) zo šesť dní starých myší a dorzálne koreňové gangliónové neuróny (DRG) (Seilheimer et al. (1988) J. Celí. Biol. 107:341-351) z osem dní starých kuracích embryí boli potom pridané na jednu vrstvu astrocytov. Po 6 hodinách spoločnej kultúry pre cerebelárne a po 12 hodinách pre neuróny DRG boli bunky fixované 2% paraformaldehydom v PBS a dĺžky neuritov boli analyzované, ako je opísané v Príklade 7.
Rast neuritov z myších malých cerebelárnych alebo kuracích dorzálnych koreňových gangliónových (DRG) neurónov bol tiež študovaný v jednovrstvových kultúrach astrocytov odvodených z transgénnych (línia 3426) alebo netransgénnych kontról (Obr. 10, Tabuľka 1).
11211
Tabuľka 1
DÍžky neuritov cerebelárnych a dorzálnych koreňových gangliónových (DRG) neurónov udržiavaných na astrocytických jednovrstvách pripravených z myší divokého typu (WT) a transgénnej línie 3426.
Cerebelárne neuróny DRG neuróny
WT 65±34 mm 90±10 mm
WT + anti Ll 72±30 mm 105+14 mm
WT + anti pečeň 57±24 mm 107±12 mm
3426 75+41 mm 137±10 mm
3426 + anti Ll 45±25 mm 88± 8 mm
3426 + anti pečeň 58±31 mm 124±15 mm
DÍžky neuritov na astrocytoch bez preinkuhácie s akoukoľvek protilátkou alebo po pôsobení bez polyklonálnych protilátok proti Ll (anti Ll) alebo protilátok proti myším pečeňovým membránam (anti pečeň) sú uvedené. Priemerné hodnoty ± štandardná odchýlka sú z najmenej 100 neurónov z dvoch nezávislých experimentov vykonaných dvakrát.
Dĺžka neuritov cerebelárnych neurónov alebo neurónov DRG na transgénnych astrocytoch bola približne o 15% až 50% dlhšia v porovnaní s dĺžkou neuritov u astrocytov divokého typu (Tabuľka 1). Protilátky proti pečeňovým membránam neovplyvnili dĺžku neuritov zo zvierat divokého typu (Obr. 10, Tabuľka 1).
na astrocytických jednovrstvách alebo z transgénnych zvierat Preinkuhácia astrocytických jednovrstiev s protilátkami proti Ll neovplyvnila významne dĺžku neuritov na bunkách zo zvierat divokého typu. Naopak, znížila dĺžku neuritov cerebelárnych neurónov a neurónov DRG pestovaných na bunkách z transgénnych zvierat približne o 40%. V tomto ohľade je pozoruhodné, že polyklonálne
11211 protilátky proti myšej Ll použité v tejto štúdii nereagujú s neurónmi z kurčiat (Martini et al., 1994; údaje nie sú uvedené). Na imunofluorescenčnej analýze je však preukázané, že tieto protilátky sa viažu rovnako efektívne ako protilátky proti Ll na astrocyty z transgénnych zvierat a na malé cerehelárne myšie neuróny (údaje nie sú uvedené).
Príklad 9
Imunofluorescencia a mikroskopia Aurion-GP immunogold
Imunologické farbenie Ll a GFAP čerstvo zmrazených priečne a pozdĺžne rezaných optických nervov alebo astrocytických jednovrstiev divokého typu a transgénnych zvierat boli vykonané ako je opísané (Bartsch et al. (1989)). Pre dvojité značenie sme najprv inkubovali astrocyty ako živé bunky s protilátkami proti Ll (2 ug/ml v 1% BSA v PBS) pri 4eC počas doby 30 min. Po permeabilizácii buniek pomocou 70% metanolu pri -20eC počas doby 10 min. boli bunky inkubované s protilátkami proti GFAP počas doby 30 min pri 4’C.
Pre výpočet dĺžky neuritov v experimentoch s kryostatovou kultúrou bolo použité zosilnené farbenie Aurion immuno R-Gent striebro podľa pokynov výrobcu (Aurion, Immuno Gold Reagents & Accesories Custom labelling, Wageningen, Holandsko)) s malými modifikáciami. Kultúry boli fixované 4% paraformaldehydom v PBS na 10 min. pri izbovej teplote, inkubované v 50 mM glycínu v PBS počas doby 10 min. a potom boli ponechané 15 min. v blokovacom pufri (BB, 0,5% BSA v PBS). Po troch premytiach v BB, každé premytie 5 min., boli bunky inkubované s protilátkami proti Ll nariedenými do BB (2 um/ml) počas 30 min. pri izbovej teplote. Potom boli kultúry premyté 3 krát v BB, každé premytie 5 min., boli pridané sekundárne protilátky nariedené 1:20 v BB na 1 hod. pri izbovej teplote. Po troch premytiach v destilovanej vode boli kultúry fixované v 2%
11211 glutaraldehyde v PBS na 10 min. pri izbovej teplote a boli znovu premyté 3 krát destilovanou vodou. Zmes zosilňovača a vývojky v pomere 1:1 bola potom pridaná pri izbovej teplote. Po objavení reakčného produktu boli sklíčka premyté 3 krát destilovanou vodou a uložené do glycerolu.
Imunoreaktivita na Ll v optických nervoch netransgénnych myší bola obmedzená na nemyelínované sietnicové gangliónové bunkové axóny (Bartsch et al. (1989)). V nepoškodených optických nervoch z transgénnych zvierat bola tiež nájdená slabá imunoreaktivita na Ll v spojení s bunkovými telieskami a procesmi v radiálne orientovaných bunkách (Obr. 4A).
imunoreaktivity na Ll v transgénnych poškodení (Obr imunoreaktivita
Intenzita tejto optických nervoch sa 4B) a bola podobná na GFAP zistená značne zosilnila po v rozmiestnení ako v nepoškodených (Obr nervoch divokého typu.
Expresia Ll bola ďalej analyzovaná v kultúrach astrocytov pripravených z predných mozgov šesť dní starých transgénnych zvierat. Žiadna imunoreaktivita na Ll nebola detekovaná na astrocytoch zo zvierat divokého typu Naopak, bunky pozitívne na Ll boli prítomné z transgénnych zvierat (Obr. 5A). Ako je demonštrované pri dvojitom imunologickom farbení, tie isté bunky sa ukázali byť pozitívne na GFAP (Obr. 5B a E), čo ukazuje, že bunky exprimujúce Ll sú skutočne astrocyty. Pretože imunologické farbenie Ll bolo vykonané na živých bunkách, zdá sa pravdepodobné, že Ll je v transgénnych zvieratách tiež exponovaná na bunkovom povrchu astrocytov in vivo.
4B) alebo poškodených (neznázornené) (Obr. 5D). v kultúrach
11211
Príklad 10
Analýza Western blot
Kvôli ďalšiemu výpočtu množstva expresie Ll v transgénnych myšiach GFAP-L1 boli analyzované pomocou analýzy Western blot detergentové extrakty homogenátov nepoškodených a poškodených (15 dní po poškodení) optických nervov z myší divokého typu a transgénnych dospelých myší (Obr. 6).
Poškodené (15 dní po poškodení) a kontralaterálne nepoškodené optické nervy z 8 dní starých zvierat boli vyčistené od iných tkanív a potom boli zmrazené v tekutom dusíku. Dbalo sa, aby boli použité len myelínované distálne, a nie imunoreaktívne na Ll nemyelínované a čiastočne myelínované proximálne oblasti nervov. Nervy boli zmrazené a rozmrazené 10 krát pred sonikáciou v sonikátore Branson B15 pri 4*C počas doby 5 min. Tkanivá boli potom homogenizované v homogenizátore Dounce v homogenizačnom pufri (1% Triton X-100, 2 M močovina, 5 mM benzamidín, 0,1 mM jódoacetamid, 1 mM fenylmetánsulfonylfluorid, 5 mM Na-p-tozyl-L-lyzínchlóro-metyl ketón v PBS). Homogenity boli vyčistené centrifugáciou pri 16000 g pri 4”C počas doby 15 min. Supernatanty boli ponechané s metanol/chloroformom, aby sa vyzrážali proteíny ako bolo opísané vo Wessel et al. (1984). Proteínová zložka bola stanovená v supernatante (Pierce). Po vykonaní SDS-PAGE na 7% plochých géloch pri redukčných podmienkach boli proteíny (25 ug) analyzované pomocou analýzy Western blot s polyklonálnymi protilátkami proti Ll (0,4 pg/ml). Sekundárne protilátky konjugované s peroxidázou z reďkovky (2 pg/ml) boli detekované pomocou blotovacej detekčnej súpravy ECL (Amersham). Denzitometrická analýza imunoblotov ukázala, že expresia Ll v nepoškodených optických nervoch transgénnych zvierat bola približne o 40% a 13% (línie 3426 a 3427) vyššie než v nepoškodených optických nervoch zvierat divokého typu. Expresia Ll v poškodených transgénnych nervoch bola o 310% a 200% (línia
11211
3426 a 3427) vyššia než u poškodených nervoch zvierat divokého typu. Porovnanie medzi poškodenými a kontralaterálnymi nepoškodenými optickými nervami zo zvierat divokého typu odhalilo zníženú expresiu proteínu L1 o 40% na poškodenej strane. Naopak, množstvo proteínu L1 v poškodených nervoch línií 3427 a 3426 stúplo o približne 30% v porovnaní s nepoškodenými kontralaterálnymi stranami. Hladina expresie L1 v línii 3426 bola približne o 35% a 25% vyššia než v línii 3427 pre nepoškodené a poškodené optické nervy.
Príklad 11
Obnovený rast axónov v optickom nerve in vitro až 8 týždňov staré transgénne myši GFAP-L1 a myši divokého typu boli utratené a po 14 dňoch boli sledované na fluoresceinom značený biotín ester za účelom označenia sietnicových gangliónových bunkových axónov postupným značením. Výsledky sú znázornené na Obr. 11 a 12. Každý bod predstavuje jedno zviera.
Príklad 12
Identifikácia hranice medzi homológnymi opakovaniami 2 a 3 fibrínového typu III v nervovej bunkovej adhéznej molekule L1 ako neuritový rast podporujúci a signál prenášajúci domény
Kvôli stanoveniu domén v nervovej bunkovej adhéznej molekule L1 zodpovedných za rast neuritov boli vytvorené monoklonálne protilátky proti L1 a ich vplyv na rast neuritov malých cerebelárnych neurónov v kultúre bol sledovaný. Keď bolo 11 protilátok použitých ako substráty, len protilátka 557.B6, ktorá rozoznáva epitop reprezentovaný syntetickým peptidom obsahujúcim aminokyseliny 818 až 832 na
11211 hranici medzi homológnymi opakovaniami 2 a 3 fibrínového typu III, bola rovnako účinná ako Ll v podpore rastu neuritov, zvýšení hladiny intracelulárneho Ca2+ a stimulácii spotreby inositol fosfátov. Tieto zistenia dokazujú, že rast neuritov a zmeny v týchto druhých prenášačoch sú zhodné. Táto zhoda bola potvrdená schopnosťou antagonistov kanálov Ca2+ a toxínu čierneho kašla inhibovať rast neuritov na Ll a protilátke 557.B6. Tieto pozorovania ukazujú na odlišné miesto na Ll viazané na bunkovom povrchu ako na prominentný signál prenášajúci doménu, cez ktorú prebiehajú rozpoznávacie deje na spustenie rastu neuritov, zvýšenie spotreby inozitol fosfátov a zvýšenie hladiny intracelulárneho Ca2+.
Príklad 13
Imunoreaktivita L2/HNK-1 v reinervovanom periférnom nerve: prednostná expresia v motorových s axónom asociovaných Schwannových bunkách
Karbohydrátový epitop L2/HNK-1 (ďalej uvádzaný L2) je exprimovaný v dospelej myši myelínovanými Schwannovými bunkami ventrálnych koreňov a svalových nervov, ale zriedka dorzálnych koreňov a/alebo kožných nervov. Pretože substrátovo potiahnuté glykolipidy L2 podporujú rast pestovaných motorových, ale nie zmyslových neurónov, L2 tak ovplyvňujú preferenčné reinervovanie svalových nervov skrz regeneráciu motorových axónov in vivo.
Vplyv regenerujúcich sa axónov na expresiu L2 spôsobenú reinervovanými Schwannovými bunkami bol preto analyzovaný vedením motorových a zmyslových axónov do svalových a kožných vetiev femorálnych nervov osem týždňov starých myší. Regenerujúce sa axóny z kožných vetiev neviedli k imunocytochemicky detekovatelnej expresi i L2 vo svalových alebo kožných nervových vetvách. Axóny regenerujúce sa zo svalových vetiev viedli k slabej expresii L2 od niekoľkých
11211
Schwannových buniek kožnej vetvy, ale vyvolali silnú expresiu L2 od mnohých Schwannových buniek svalovej vetvy. Myelínové Schwannove bunky predtým asociované s motorovými axónmi sa potom odlišovali od predchádzajúcich zmyslových s axónom asociovaných myelínových Schwannových buniek v ich schopnosti exprimovať L2, keď sú spojené s motorovými axónmi. Toto zvýšenie expresie L2 počas rozhodujúcich štádií reinervácie spôsobujú motorové axóny regenerujúce sa do vhodnej, svalovej dráhy s výhodou oproti tým, ktoré sa regenerujú do nevhodnej, zmyslovej dráhy.
Príklad 14
Ll v spevnení pamäti pri pasívnom vyhýbacom teste u kurčiat
Cvičenie jednodenných pasívnom vyhýbacom teste, potláčať tendenciu ďobať do napustená horko chutiacim kurčiat pri jednej skúške na pri ktorom sa kurčatá učia malej lesklej guľôčky, ktorá je metylántranilátom, má za následok časovo závislú bunkovú a molekulárnu kaskádu kulminujúcu až do pretvorenia presynaptických a postsynaptických elementov na dve diskrétne oblasti predného mozgu, stredný mediálny hyperstriatum ventrale (IMHV) a Lobus parolfactorius (LOP) (Rose (1991) Trends In Heurosciences 14:390-397). Kaskáda zahŕňa dve odlišné vlny glykoproteínovej syntézy, ako je to zrejmé zo zvýšenej inkorporácie fukózy, vyskytujúce sa ako v IMHV tak aj LPO v rôznych časoch po cvičení. Obidve vlny sú nutné pre dlhotrvajúce (t.j. 24 hodín a dlhšie) udržanie pamäti vo vyhýbacom teste, v ktorom je zrejmé oslabenie u kurčiat, ktoré by sa inak vyhli predchádzajúcej horkej guľôčke a ďobali do suchej guľôčky v teste.
Za predpokladu úlohy Ll pri sprostredkovávaní medzibunkového kontaktu bola predložená štúdia, ktorá mala stanoviť, či Ll patrí medzi glykoproteíny spájané s učením, ktoré sa zúčastňujú na tvorbe vín syntézy glykoproteínov, a sú tak nutné pre tvorbu pamäti. Ak je tomu tak, protilátky
11211 proti Ll, ktoré sú podávané vo vhodnom čase vzhľadom na cvičenie, by mali zabrániť synaptickej prestavbe nutnej pre dlhotrvajúcu pamäť a preto by mali produkovať zoslabenie vykonávania cvičenia. Podobne, ak extracelulárne domény molekuly Ll majú nejaký význam v rekogničných a adhéznych procesoch, ktoré sú potrebné pre synaptickú prestavbu a stabilizáciu, exogénne podávané fragmenty extracelulárnej domény, ktoré sa budú viazať homofilne na endogénne molekuly, budú narúšať tento proces.
Protilátky a fragmenty
Polyklonálne protilátky boli pripravené v králikoch imunizáciou s imunoafinitne purifikovanou Ll (Ng-CAM, 8D9) nasledovanou vykonaným imunizačným postupom (Rathjen et al. (1984)). Ll bola izolovaná z jednodenných kuracích mozgov pomocou monoklonálnej proti látkovéj kolóny 8D9 (Lagenaur a Lemmon (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7753-7757) opäť podľa zavedeného postupu (Rathjen et al. (1984)). Protilátky boli izolované zo séra získaného po tretej imunizácii pomocou Proteín G Sefarózy (Pharmacia LKB) podľa pokynov výrobcu. Rekombinantne exprimované fúzované proteíny v E. coli reprezentujúce šesť imunoglobulinových (Ig-I-VI) a päť fibronektínových (FN1-5) opakovaní boli pripravené ako bolo opísané v Appel et al. (1993).
Sódium dodecylsulfátová elektroforéza v polyakrylovom gél i (SDS-PAGE) a imunobloty kuracích subcelulárnych frakcií 50 μΐ proteínu z mozgového homogenátu, z hrubých membrán, z rozpustných frakcií (Burchuladye et al. (1990) Brain Res. 535:131-138 a z postsynaptických nahromadení (Murakami et al. (1986) J. Neurochem. 46:340-348), všetko z jednodenných kuracích mozgov, bolo separovaných na SDS-PAGE za redukujúcich podmienok na 5 až 15% polyakrylovom gradientovom géli (Laemmli (1970) Náture 227:131-138, a potom bolo všetko prenesené na nitrocelulózu (Burnette (1981) Anál. Biochem. 112:195-203). Po inkubácii cez noc
11211 s protilátkami proti Ll pri neriedení 1:1000 v Trisom pufrovanom roztoku, pH 7,2, obsahujúcim 5% sušené mlieko bez tuku, holi detekované imunoreaktívne prúžky podlá predtým opísaného spôsobu (Scholey et al. (1993) Neurosciences 55:499-509).
Cvičebné a testovacie postupy
Jednodenné Rossove kurčatá obidvoch pohlaví, vyliahnuté v inkubátoroch, boli premiestnené v pároch do malých klietok a boli predbežne (2,5 mm) chrómovej guľôčky ako holo opísané v Lossner 41:1357-1363. Vtáci, ktorí cvičené na ďobanie do malej namočenej do metylántranilátu, a Rose (1983) J. Neurosciences ďobali do horkej guľôčky, osvedčili stereotypnú zápornú odpoveď tým, že mohutne potriasali hlavou a vracali sa späť od guľôčky. 24 hodín po cvičení boli zvieratá testované na prítomnosť suchej chrómovej guľôčky zhodnej s tou predchádzajúcou. Zadržanie pasívneho učenia sa vyhýbať guľôčke holo vidieť u zvierat, ktoré sa vyhýbali testovanej guľôčke. Pri každom opakovaní tohoto protokolu bolo cvičených a testovaných 24 až 36 kurčiat. Viac než 80% cvičených, neinjekovaných kurčiat sa normálne vyhýbalo guľôčke v teste za týchto podmienok, aj keď tu bolo niekedy zníženie vyhýbania sa u vtákov injekovaných kontrolným roztokom. Naopak, vtáci, ktorí sú cvičení na namočenú guľôčku do vody, často ďobali do suchej guľôčky a ich výsledok vyhýbania bol ledva nad 5 až 10%. Celý test a cvičenie bolo vykonávané rutinne experimentátorom, ktorý nevedel, ktoré zvieratá sú ktoré.
Injekcia
Protilátky Ll a fragmenty FN1-5 a Ig I-IV boli dializované cez noc proti 0,9% fyziologickému roztoku a koncentrácia bola upravená na 1 mg/ml pre Ll a 250 ug/ml pre fragmenty. Kurčatá dostali dvojstranné intrakraniálne injekcie do stredného mediálneho hyperstriata ventrale (IMHV) 10 μ! protilátok Ll na jednu hemisféru; kontrolné
11211 (1993)), že protilátok zvieratá dostali podobné injekcie fyziologického roztoku. Presné dopravenie do IMHV bolo vykonané pomocou špeciálne navrhnutého držiaku hlavy a zapúzdrenej Hamiltonovéj striekačky (Davis et al. (1982) Pharm. Biochem. Behav.
17:893-896. Kurčatá, ktoré dostali zo striekačky ako fyziologický roztok tak aj protilátky pred cvičením alebo testom, nevykázali žiadnu významnú zmenu chovania a ďobali do guľôčky počas cvičenia podľa predpokladu. Veľký extracelulárny objem mozgu novo vyliahnutých kurčiat znamená, že injekovaná dávka je dohre tolerovaná. Predchádzajúce oznámenie ukázalo (Schley et al, po injekcii môže dôjsť k malej difúzii z injekovaného miesta. Presnosť umiestnenia injekcie bola rutinne monitorovaná vizuálnou kontrolou mozgov post mortem. Pri každom opakovaní experimentu bola vyhodnotená rovnako veľká skupina kurčiat, ktorá bola injekovaná huď fyziologickým roztokom a protilátkou alebo fragmentom.
V experimente s Ll boli skupiny kurčiat injekované fyziologickým roztokom alebo protilátkou v jednom z ôsmich časových bodov vzhľadom na cvičenie; 2 hod. alebo 30 min. pred cvičením, alebo +1 hod., +3 hod., +4 hod., +5,5 hod., +8 hod., +12 hod. po cvičení. Na základe predchádzajúcich pozorovaní bolo predvídané, že akékoľvek efekty budú pozorované u vtákov ako po 30 min., tak aj po 5,5 hod. po cvičení, a počet opakovaní týchto časových bodov bol podľa toho väčší (N=17, 28, 17, 19, 18, 21, 19 a 18 zvlášť pre injekcie protilátky). Fragmenty FN1-5 a Ig I-IV Ll boli injekované buď po 30 min. alebo po 5,5 hod. a retenčný test bol vykonaný po 24 hod. Retencia v skupinách kurčiat s injekciami fyziologického roztoku a protilátok proti Ll alebo fragmentov Ll bola porovnaná štatisticky cez chĺ2. Výsledky sú znázornené na Obr. 13 a 14.
11211
Príklad 15 platinovými umiestnenými
Stimulačný
Účasť Ll a NCAM na dlhotrvajúcu potenciáciu
Transverzné hypokampálne rezy (400 pm) z haloténom anestéziovaných samčích krýs kmeňa Wistar (180-220 g) boli pripravené podľa štandardných techník. Rezy boli udržiavané v malých komôrkach a spočiatku oživované 45 min. v hypermolárnej (320 mOsm/kg) umelej cerebrospinálnej tekutine (ACSF) pri izbovej teplote. Teplota kúpeľa bola potom zvýšená na 30°C a médium bolo vymenené na normotonické ACSF (307 mOsm/kg) obsahujúce (v mM): NaCl 124,0; KC1 2,5; Mg2SO4 2,0; CaCl2 2,5; KH2PO4 1,25; NaHC03 26,0;
glukóza 10; sacharóza 4; prebublávané 95% 02/5% CO2 (pH 7,4); množstvo perfúzie: 0,75 ml/min. Schafferové kolaterálne spojovacie vlákna boli stimulované stočenými a irídiovými drôtikmi (50 pm v priemere) v oblasti striatum radiatum v oblasti CA1. test pozostával z monofázových impulzov trvajúcich 100 ps každých 30 sekúnd a sila stimulácie bola upravená, aby sa získalo 30% maximálnej amplitúdy EPSP (maximálny EPSP bez posunutého populačného tŕňa). Hodnoty EPSP boli zaznamenané z oblasti CA1 stratum radiatum pomocou dvoch sklenených mikropipiet (2M NaCl, 1 až 5 MOhm) umiestnenej približne 300 pH od stimulačnej elektródy na každej strane.
Po stabilnom zázname počas doby najmenej 15 min. boli injekované protilátky a proteínové fragmenty do dendritického poľa CA1 v blízkosti (50 až 75 pm) jednej záznamovej elektródy (elektróda nastavená na 30%) pomocou modifikovaného mikroinjekčného systému (Nanolitrový injektor, WPI) kontinuálne dopravujúceho 5 nl každých 10 sekúnd až do konca experimentu pokiaľ nie je uvedené inak. Premytie protilátok s následnou indukciou LTP nebolo možné kvôli zrejmým dôvodom, ale bolo overené, či sa LTP môže indukovať vnútri každého rezu záznamom z druhej elektródy, kde neboli protilátky aplikované. Aj keď
11211 neprenikol hrot injekčnej mikropipety do rezu, bola niekedy pozorovaná malá redukcia s injekciou začínalo. Tento v amplitúde EPSP, keď sa objemový artefakt bol nezávislý na druhu injektovanej látky. Proteíny boli dialyzované proti 20 mM PBS pri pH 7,4 pokiaľ nie je uvedené inak a koncentrácie boli vzhľadom na koncentrácie v pipete.
min. po začiatku mikroinjekovania bola indukovaná LTP s vypuknutím stimulácie teta (TBS) pozostávajúcu z troch sledov po 4 sekundách; každý sled pozostával z desiatich vysokofrekvenčných nárazov 5 pulzov pri 100 Hz a nárazy boli oddelené 200 ms (Reichardt et al. (1991) Annu. Rev.
Neurosci. 14:531-570). Trvanie stimulačných pulzov bolo zdvojnásobené počas TBS. Indukcii LTP mohlo byt úplne zabránené perfúziou 10 μΜ D(-)-2-amino-5-fosfonopentanoovou kyselinou (D-AP5; Tocris). Záznamy z celých buniek boli získané z neurónov CA1 pomocou slepého” svorkového systému so svorkovým amplifikátorom EPC-9. Teplota kúpeľa bola 30°C. Svorkové elektródy boli vytiahnuté z 1,5 mm bórosiUkovaného skla OD a mali rezistancie medzi 3 a 8 MOhm. Pipety neboli ani vyžíhané plameňom ani potiahnuté. Elektródy boli rutinne namočené do roztoku obsahujúceho (v mM): glukonát draselný 129; KC1 5; MgCl2 1; CaClí 1; N-(l-hydroxyetyl)-piperazín-N'-(2-etánsulfónovú kyselinu) (HEPES) 5; 1,2-bis-(2-aminofenoxy)etán-N,N,N', N'-tetraoctovú kyselinu (BAPTÄ) 5; Na-ATP 10 a Na-GTP 0,3, s pH upraveným na 7,3 ROH. Sériová rezistencia nebola kompenzovaná. Odpovede boli spriemerované z troch až štyroch signálov. Boli vytlačené pre vizuálnu analýzu alebo uložené na disk pre neskoršiu analýzu. Štatistické vyhodnotenia boli vykonané pomocou analýzy variácií s plánovitými porovnávaniami a kontrastnou analýzou; čas bol uvažovaný ako závislá premenná s jednou úrovňou opakovaných meraní. Anti-Ll (Rathjen et al. (1984)), anti-Ig I-VI (Hynes et al. (1992)) a anti-pečeňové membránové protilátky (Linder et al. (1983)) boli vyrobené tak, ako bolo predtým opísané. Výsledky sú znázornené na Obr. 15.
11211
Domény I-VI podobné Ig a homológne opakovania I-V typu FN III boli exprimované v baktériách a purifikované ako bolo opísané VI (Hynes et al. (1992)). Protilátky proti NCAM a axonínu-1 boli vyrobené, ako bolo opísané (Larson et al. (1986) Science 232:985-988; Bailey et al. (1992) Science 256:645-649). Produkcia oligomanozidových glykopeptidov z ribonukleázy B a kontrolných glykopeptidov z azialofetuínu bola opísaná (Larson et al. (1986)). Výsledky sú znázornené na Obr. 17.
Príklad 16
Ll má nervovo ochranný efekt
Bol vykonaný experiment na ďalšie vysvetlenie aktivity
Ll v nervovom tkanive CNS. Alikvóty vzoriek myších mesencefalónových buniek boli natreté a pestované na štyroch separátnych miskách s médiami pripravenými, ako je uvedené nižšie: prvá kontrolná miska bola natretá len poly-L-lyzínom; druhá miska bola natretá poly-L-lyzínom a Ll; tretia kontrolná miska bola natretá poly-L-lyzínom a laminínom; štvrtá miska bola natretá poly-L-lyzínom, laminínom a Ll. Všetky misky dostali alikvotné množstvo buniek a boli inkubované za rovnakých podmienok. Po 7 dňoch boli všetky misky sfarbené na prítomnosť dopamínu a výsledok bol pozorovaný. Misky, ktoré boli natreté Ll vykazovali rast o 200% až 400% väčší než kontroly. Misky natreté laminínom vykazovali väčší rast neuritov, ale nie viac než u misiek s Ll. Výsledky ukazujú, že Ll má velký nervovo ochranný efekt, pretože životnosť buniek meraná na počet buniek, ktoré rástli, bola velmi zvýšená proti kontrolám.
11211
Príklad 17
Rozpustná forma Ll (Ll-Fc) je funkčne aktívna a je silné činidlo v udržiavaní živých nervov
Rozpustná forma Ll bola vytvorená v bunkách COS ako rekombinantný spojený proteín Ll-Fc postupom opísaným v Neurón 14:57-66, 1995. Rekombinantný proteín bol purifikovaný afinitnou chromatografiou s proteínom Ä a bol použitý ako substrát natretý na plastický materiál a/alebo ako rozpustná molekula pridaná do kultivačného média v l až 10 pg/ml. Rast neuritov a prežívanie mesencefalických neurónov odo dna 17 krysích embryí bol skúšaný v kultúre po 7 dňoch udržiavania in vitro. Dopaminergické neuróny boli rozlíšené imunologickým farbením na dopamín-beta-hydrolázu (DBH) a boli spočítané pomocou morfometrického vybavenia IBAS. Kultúry s pridanou rozpustnou Ll-Fc boli udržiavané na poly-DL-otnitíne (PORN) a substrátovo potiahnutej Ll-Fc boli pridané na vrch predtým potiahnutých PORN (za podmienok opísaných v Appel et al., J. Neuroscience 13:4764-4775, 1993. NCAM-Fc bola použitá ako kontrola.
Tabuľka - Prežívanie 7 dní in vitro a rast neuritov neurónov DBH počas
počet neurónov dĺžka neuritov~
substrátovo natreté Ll 129±20 179±40
rozpustná Ll 98± 7 135+27
len PORN (kontrola) 14+ 2 37+ 9
Stredné hodnoty sú z aspoň troch nezávislých experimentov
± SEM
Počty sú z jednotky pole
Dĺžky všetkých neuritov (celková dĺžka neuritov) na 'jeden neurón boli stanovené (v pm)
- 67 11211 imunoglobulínov a bunkových molekuly sa zúčastňujú procesov (Edelman, 1970).
Rozpoznávanie medzi nervovými bunkami je dôležitá podmienka pre vývoj funkčnej nervovej sústavy. Rozpoznávacie molekuly sú exprimované na bunkovom povrchu, kde sprostredkovávajú interakcie medzi susediacimi bunkami, napr. sú to cadhedríny, alebo interakcie medzi bunkovým povrchom a extracelulárnym matrixom, napr. sú to integríny (Takeichi, 1991; Ruoslahti, 1988; Hynes, 1992). Najdôležitejšiu rodinu rozpoznávacích molekúl zastupujú imunoglobulínu (Ig) podobné domény. Ig podobné domény reflektujú spoločného predka adhéznych molekúl, obidve špecifických rozpoznávacích
V nervovej sústave obsahuje rodina Ig viac než 24 rôznych molekúl. Niektoré molekuly obsahujúce Ig podobné domény majú mnoho funkcií v extracelulárnej doméne: receptory pre cytokíny a neurotropíny majú vysoké afinitné funkcie rovnako ako rozpoznávacie vlastnosti (Tannahill et al., 1995; Fulido et al., 1992). Trojrozmerná štruktúra Ig podobných domén je podobná FN podobným opakovaniam (Main et al., 1992; Leathy et al., 1992), čo sú tiež štruktúrne motívy v niekoľkých molekulách extracelulárneho matrixu, ako je fibronektín, členovia tenascínovej rodiny a iné (Williams a Barclay, 1988; Barón et al., 1992; Erickson, 1993). Nervové rozpoznávacie molekuly rodiny Ig majú charakteristický časový, priestorový a bunkovo typový expresný profil (prehladné články, viď Edelman, 1988; Schachner, 1991; Rathjen a Josseli, 1991; Rutiehauser, 1993). Rozpoznávajúce molekuly tejto rodiny sa funkčne prekrývajú v tom, že všetky podporujú adhéziu buniek a rast neuritov. Niektoré rozpoznávajúce molekuly sú silne homofilické, t.j. navzájom sa viažúce, a naopak iné sú predovšetkým heterofilické, t.j. viažu sa na nerovnakých partnerov, ktorými sú často iní členovia rodiny Ig alebo molekuly extracelulárneho matrixu (Briimmendorf a Rathjen, 1993, 1994). Súčasná znalosť funkčných vlastností individuálnych Ig podobných domén a FN podobných opakovaní vervových rozpoznávacích molekúl ukazuje
11211 na rôzne a prekrývajúce sa funkčné vlastnosti pri rozpoznávaní, raste neuritov a odpudzovaní (Gennarini et al., 1991; Frel et al., 1992; Taylor et al., 1993; Appel et al., 1993, 1995; Pesheva et al., 1993; Feisenfeld et al., 1994; Hoim et al., 1995).
Medzi nervovými rozpoznávacími molekulami rodiny Ig, rodiny molekúl podobných nervovej rozpoznávacej molekule Ll sa ukazuje veľká podobnosť vo funkcii a štruktúre. Sú to silné promotory rastu neuritov a sú primerane exprimované počas neskoršieho vývoja, najviac v dobe prvého výskytu axogenézy. Sú prednostne exprimované v neurónoch, aj keď niektorí členovia rodiny Ll sa tiež vyskytujú v gliových bunkách, ktoré sami o sebe sú podporné pre neurity (Martini a Schachner, 1986; Bixby et al., 1988; Seilheimer a Schachner, 1988).
V experimentoch, ktoré nasledujú, je identifikovaný a charakterizovaný iný člen rodiny Ll, ktorému je blízky homológ Ll, a to je CHL1. CHL1 obsahuje šesť Ig podobných domén a FN podobných opakovaní, z ktorých štyri sú vysoko homológne k FN podobným opakovaniam iných členov rodiny Ll. Neúplné FN podobné opakovaniam je umiestnené v oblasti ležiacej blízko membrány, čo je najviac variabilná oblasť medzi molekulami podobnými s Ll. Iné vlastnosti CHL1 zdieľané s členmi rodiny Ll sú: expresia v neskorom vývojom štádiu v nervovej sústave a vysoká miera N-glykozidácie, vrátane expresie karbohydrátu HNX-1.
Príklad 18
Myši ICR a krysy Wistar boli používané na tkanivové preparácie
Protilátky
Polyklonálne protilátky vyvolané proti rekombinantne exprimovanej extracelulárnej časti CHL1 (aminokyseliny 499 až 1063 (Obr. 18 a 19)) a Ll (aminokyseliny 126 až 1981
11211 (Appel et al., 1993)) boli vyvolané v králikoch, ako bolo opísané (Rathjen a Schachner, 1984). Za účelom vyvolania protilátok proti CHL1 bolo do králika injekované 200 pg purifikovaného peptidu a potom ešte 4 ďalšie injekcie po 100 pg v intervaloch troch týždňov. Protilátky proti Ll boli skoncentrované zo séra vyzrážaním amónium sulfátom (13,5 mg/ml). Monoklonálna krysia protilátka 412 bola použitá na identifikáciu karbohydrátového epitopu HNK-1 (Kruse et al., 1984). Honoklonálne protilátky proti gliovému fibrilárnemu kyslému proteínu (GFAP) boli získané od Boehringera (Mannheim). Monoklonálne protilátky proti antigénu 01 boli opísané (Sommer a Schachner, 1981).
Purifikácia nervových adhéznych molekúl
Ll, N-CAG a MAG boli imunoafinitne purifikované z detergentových extraktov hrubých bunkových frakcií z dospelého myšieho mozgu pomocou kolón s monoklonálnymi protilátkami (Rathjen a Schachner, 1984; Falssner et al., 1985; Poltorak et al., 1987).
Knižnice cDNA a ich testovanie
Preparácia knižnice lambda gtll odvodenej z poly(A)*
RNA z mozgu z 8 dní starých myší a testovanie tejto knižnice imunoafinitne purifikovanými polyklonálnymi protilátkami proti Ll boli vykonané podľa (Tácke et al., 1987). Za účelom získania ďalších klonov cDNA bola vytvorená nová knižnica DNA: RNA bola purifikovaná z mozgov 6 až 14 dní starých myší spôsobom cez guanídium tiocyanát/kyslý fenol (Chomezynski a Sacchi, 1987). Poly(A)* RNA bola obohatená cez dve po sebe nasledujúce pasáže cez kolónu s oligo(dT) celulózou (Sambrook et al., 1989). 8 pg poly(A)* RNA bolo použité na syntézu oligo(dT) primérovanej dvojvláknovej cDNA pomocou súpravy na syntézu cDNA (Amersham). cDNA bola vybratá podľa veľkosti a bola ligovaná do plazmidu pXNDl s adaptormi DralII obsahujúcimi miesto Sali (Kluxen et al., 1992). Za účelom propagácie a amplifikácie knižnice bol použitý kmeň
11211
E. coli TOP10 (Invitrogen, Holandsko). Pri testovaní boli alikvóty priamo nanesené na nylonové membrány (BIODYNE™ Pall) s hustotou 2xl04 baktérií na filter (138 cm2). Replikované filtre boli inkubované cez noc pri 37’C. Potom boli baktérie lyzované (0,5M NaOH; 1,5M NaCl), filtre boli neutrál izované (3M NaCl; 0,5M Tris-HCl pH 8,0), premyté v 2xSSC, vysušené a zapekané 2 hod. pri 80°C. Silonové membrány boli prehybridizované, potom bybridizované s fragmentom dlhým 1 kb (HincII/KpnI) z CHL1 (odvodené z knižnice lambda gtll), boli rádioaktívne označené náhodným primérovaním (Boehringer Nannheim) podľa pokynov výrobcu, premyté za silne stringentných podmienok pri 42°C a potom exponované na film, ako bolo opísané (Sambrook et al., 1989). Šesť pozitívnych klonov bolo ďalej charakterizovaných reštrikčným mapovaním a sekvencovaním podľa štandardných protokolov (Sambrook et al., 1989). Jeden kloň (pX#2), ktorý obsahoval inzert CHL1 dlhý 4,43 kb, bol ďalej charakterizovaný.
Sekvencovanie DNA a sekvenčná analýza
Nukleotidové sekvencie boli určené reťazovou terminačnou metódou dideoxy (Sanger et al., 1977) pomocou dvojvláknovej DNA ako predlohy pre T7 DNA polymerázu (Pharmacia) a syntetických oligonukleotidov ako primérov. Sekvencia cDNA boli zostavené a analyzované programom DNASTAR (DNASTAR, Inc., Londýn). Pokiaľ nie je uvedené inak, boli aminokyselinové sekvencie porovnané pomocou Jolun Heinovej metódy (Heín, 1990) (veľkosť medzier = 11, dĺžka medzier = 5, hodnota K = 2).
Porovnanie proteínových sekvencií
Kvôli výpočtu indexu podobnosti (%) na porovnanie vzdialeností medzi konzervovanými aminokyselinovými zvyškami bolo niekoľko rozdielnych proteínov obsahujúcich šesť Ig podobných domén a aspoň 4 FN podobné domény porovnané v konzervovaných aminokyselinových zvyškoch v Ig podobných
11211 doménach (cysteíny, kde sú mostíky S-S) a v FN podobných opakovaniach (tryptofán a tyrozín/fenylalanín). Počet aminokyselinových zvyškov medzi týmito konzervovanými miestami bol určený. Tento počet je uvedený ako konzervovaná vzdialenosť. Priemerná hodnota vzdialenosti, t.j. konsezné vzdialenosti a štandardné odchýlky (SD) medzi členmi rodiny L1 bola vypočítaná. Hodnota SD bola zaokrúhlená na najbližšie vyššie celé číslo. Vzdialenosť pre každý proteín bola porovnaná s priemernou vzdialenosťou a považovaná za zhodnú, pokiaľ sa hodnota vzdialenosti rovnala priemernej hodnote ± SD (=konsenzná vzdialenosť). Počet zhôd až do 18 konsenzných vzdialeností bol vypočítaný pre každý individuálny proteín (index podobnosti = počet zhôd / 19 x 100). Napríklad: V proteíne CHL1 sa zhoduje 16 hodnôt vzdialenosti aj keď tri zo všetkých kritérií sa nezhodujú. To dáva index podobnosti 16 - 19 alebo 84% pre CHL1.
Príklad 19
Bunková kultúra a expresia CHLI a L1 v bunkách COS-1
Inzert klonu pX#2 dlhý 4,43 kb bol ligovaný do pXKDl štiepeného Sali (Kluxen et al., 1992; Kluxen a Lobbert,
1993). Subfragment EcoRI (plazmid polylinker)/PvulI pb 4048) myší cDNA L1 (Noos et al. , 1968) bol ošetrený T4 DNA polymerázou a ligovaný do pXMDl.
Bunky COS-1 udržiavané v DNEN (0,1% glukóza) a doplnené 10% (v/v) fetálnym teľacím sérom pri 37°C vo zvlhčenej atmosfére s 5% CO2. DEAE dextránom sprostredkovaná transfekcia DNA bola vykonaná, ako bolo opísané (Kluxen et al., 1992) s niektorými modifikáciami. Krátko, bunky boli stočené na hustotu 10000 buniek na cm2. 0 jeden deň neskôr, po dvoch premytiach s DMEN (0,45% glukóza), holo médium nahradené transfekčným roztokom zloženým z DMEM doplneným 10% (v/v) Nu-sérom (Becton Dickinson, Švajčiarsko),
0,4 mg/ml (w/v) DEAE-dextránom (Pharmacia), 50 μΗ
11211 chlóroquinónom a 1,25 pd/ml DNA (w/v) (4 ml na misku s priemerom 10 cm). Bunky boli inkubované 4 hod. pri 37°C a v 5% CO2. Potom bolo médium odstránené a bunky boli inkubované 2 min. vo fosfonátovom pufri (pS 7,3, obsahujúcom 10% dimetylsulfoxid (v/v)). Po dvoch premytiach s DMEM (0,45% glukóza) bol pridaný DMEM doplnený 10% (v/v) fetálnym teľacím sérom a 20 yg/ml gentamycínu a bunky boli inkubované v tomto médiu. 0 24 hodín neskôr boli bunky oddelené od steny po inkubácii s 0,01% trypsínom a 0,0004% EDTA v Eanksovom rovnovážnom soľnom roztoku (HBSS) počas doby 5 min. a pri 37°C., boli znovu rozotreté kvôli imunochémii pri hustote 20000 buniek na cm2 v 24 komôrkových miskách (falkon) obsahujúcich poly-L-lyzínom natreté sklenené otvory (11 mm v priemere) a boli inkubované ďalších 24 hodín. Pre analýzu Western blot boli bunky znovu rozotreté na misky s tkanivovou kultúrou a inkubované ďalších 48 hod.
Bunky PC12 boli udržiavané v DMEM doplneným 10% (v/v) fetálnym teľacím sérom a 5% (v/v) konským sérom na kolagénom potiahnutých miskách pre tkanivové kultúry. Pre indukciu buniek s nervovým rastovým hormónom (NGF) bolo médium odstránené z jednovrstvy pri 50% zhlukovaní a nahradené séra (5% konské sérum) doplneným Švajčiarsko). Po dvoch dfioch inkubácie boli bunky oddelené od steny po inkubácii s 0,01% trypsínom a 0,04% EDTA, boli stočené a podrobené extrakcii RNA.
médiom so zníženým obsahom 100 ng/ml 7s-NGF (Sigma,
Primárne kultúry astrocytov boli pripravené podľa McCartby a De Vellis (1980) s modifikáciami (Guénard et al., 1994) a použité na imunologické farbenie po jednom až dvoch dňoch in vitro. Primárne kultúry oligodendrocytov boli pripravené, ako bolo opísané v Laeng et al., (1994) a udržiavané in vitro počas doby 12 dní.
11211
Príklad 20
Výroba protizmyslovej RNA
Inzert klonu pX#2 dlhý 4,43 kb bol ligovaný do pBS II SK štiepeného Sali (Stratagene) a potom sa vystrihol fragment Apal (vektor)/AvrII (pb3330 (Obr. 18)) za účelom získania fragmentu cDNA CHL1 kódujúceho extracelulárnu časť proteínu (viď Obr. 18 a 19). Podobná konštrukcia pre L1 bola pripravená ligáciou fragmentu EcoNI (plazmid polylinker)/EcoRI (pb 3304) cDNA L1 (Moos et al., 1988) ošetreného T4 DNA polymerázou a ligovaného do pBS II SK-štiepeného Smal. Plazmidy boli Štiepené Xbal a použité na syntézu protizmyslovéj RNA označenej 32P pomocou T7 RNA polymerázy, ako bolo opísané (Melton et al., 1984).
Analýza Nothern blot
Poly(Ä)* mRNA bola pripravená z rôznych tkanív práve narodených a 9 dní starých myši pomocou súpravy Oligotex™ Direct mRNA (QIAGEN Inc., Diisseldorf, Nemecko) podlá pokynov výrobcu. Poly(A)* mRNA a značka RNA (rebrík RNA, GIBCO/BRL) bola podrobená elektroforéze na 0,8% formadid/agarózovom géli a potom bola prenesená na membránu Hybond-N (Amersham) pomocou kapilárneho prenosu (Southern, 1975) v 20xSSC. Po
UV (OV-Stratalinker” 1800, bolo množstvo DNA prenesené skontrolované farbením metylénovou
1989). Po prehybridizácii 2 hod.
väzbovom spojení pomocou Stratagene, La Jolla, CA), a naviazané na membránu modrou (Sambrook et al.
pri 65’C bola membrána hybridizovaná cez noc s CHL1 a L1 špecifickými 32P označenými protizmyslovými próbami RNA v hybridizačnom pufri (5xSSC, 2,5x Denhartov roztok, 50 mM NazPOz (pH 6,5), 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 2 yg/ml DNA z lososieho mlieka, 50% formamid) pri 65°C. Filter bol potom 3 krát premytý pri 65°C v 0,lx SSC, 0,1% SDS počas doby hod. a bol exponovaný na film.
- 74 11211
Príklad 21
Expresia a purifikácia rekombinantného proteínu CHL1 v E. coli cDNA-fragment CHL1 dlhý 1,7 kh (MscI; pb 1791 (ktorý pochádza z klonovacieho miesta vektoru a 5'konca klonu CHL1 odvodeného z lambda gtll) a BsmAI; ph 3494) kódujúci šiestou Ig podobnú doménu (Ig VI) a FN podobné opakovania 1, 4, 5 (viď Obr. 18 a 19b) bol subklonovaný do unikátneho reštrikčného miesta BamHI vektora pET (Studier a Moffatt, 1986). Správna sekvencia plazmidu bola potvrdená sekvencovaním. Kmeň E. coli BL21 (DE3) bol transformovaný týmto plazmidom. Expresia a purifikácia rekombinantného proteínu cez iónovo výmennú chromatografiu bola vykonaná podlá Appel et al. (1993). SDS-PAGE a farbenie Coomassie ukázalo hlavný prúžok s predpokladanou molekulovou hmotnosťou (70 kD), ktorý obsahoval aspoň 80% celkového proteínu (nie je ukázané).
Tkanivové frakcie
Detergentové lyzáty celého tkaniva boli pripravené homogenizáciou tkaniva v 40 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1% Triton X100 a boli udržiavané v 4’C počas 3 hodín za neustáleho miešania. Rozpustná frakcia bola oddelená od nerozpustného materiálu centrifugáciou pri 100 000 g.
Za účelom prípravy detergentových lyzátov membránových frakcií boli tkanivá homogenizované v l mM NaHC02 (pH 7,9, 0,2 mM MgCl2, 1 mM spermidín, 5 pg/ml aprotonín, 10 pg/ml trypsínový inhibítor zo sójových bôbov, 1 mM PMSF a 0,5 mM jódoacetamid pri 4°C. Membránové a rozpustné frakcie boli potom oddelené a membránový sediment bol rozsuspendovaný v solubilizačnom roztoku (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 0,15 M
NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X100, 5 pm/ml aprotonín, 10 ug/ml trypsínový inhibítor zo sójových bôbov, mM PMSF a 0,5 mM jódoacetamid).
11211
Tranzientne transfekované bunky COS-1 boli dvakrát premyté s HBSS a inkubované v 1 mM EDTÄ v HBSS počas doby 10 minút pri 37eC. Bunky boli potom odstránené pomocou opálenej Pasteurovej pipety a stočené centrifugáciou pri 200 g 10 min. pri 4*C. Bunky boli lyzované v 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTÄ, 1 mM EGTÄ, 1 mM jódoacetamid, 1 mM PMSF a 1% MP-40 a supernatant bol prečistený centrifugáciou (13000 g). Určenie proteínov bolo vykonané ako je opísané v Bradford (1976).
Analýza Western blot
Proteíny boli oddelené pomocou SDS-PAGE (Laemmil, 1970) na 8% alebo 10% plochých géloch za redukčných podmienok a prenesené na nitrocelulózové filtre (0,45 um, BA 85; Schleicher & Schuell, Dassel, Nemecko) kvôli imunodetekcii podľa Faissner et al., (1985) pomocou antiséra CHL1 (nariedené 1:500, 1:10000 pre ECL), polyklonálne protilátky proti Ll (nariedené 1:1000, 1:15000 pre ECL), monoklonálne protilátky 412 (nariedené 1:1000, 1:10000 pre ECL) a alkalické s fosfatázou spojené sekundárne protikrysie a protikráličie IgG. Naviazané protilátky boli detekované buď zosilnenou chemiluminiscenciou (ECL) podľa pokynov výrobcu pomocou blotovacích detekčných činidiel (Amersham) a filmov alebo pomocou BCIP a NBT ako chromogénnych substrátov.
Príklad 22
Enzýmová spojovacia imunosorbentná skúška
Enzýmová spojovacia imunosorbentná skúška (ELISA) bola vykonaná ako bolo opísané v Husmann et al., (1992) s tou výnimkou, že proteíny boli natreté v koncentráciách 100 ng/ml. Antisérum CHL1 bolo použité v niekoľkých zriedeniach medzi 1:250 a 1:2x10®.
- 76 11211
Deglykozilácia CHL1
Detergentové lyzáty homogenátu (200 μΐ, s proteínovou koncentráciou starých myší boli oddelené na a nerozpustný materiál centrifugáciou mozgového tkaniva 6 mg/ml) zo 7 dní rozpustnú frakciu (viď Tkanivové frakcie) a boli inkubované s 0,5 jednotkami N-glykozidázy F alebo 2,5 jednotkami O-glykozidázy alebo s obidvoma enzýmami v rovnakých koncentráciách podľa pokynov výrobcu (Boehringer Mannheim, Nemecko). Lyzáty boli rozdelené na 10% géloch SDS-PAGE. Proteíny boli prenesené na nitrocelulózu a boli inkubované s antisérom CHL1 (1:500 nariedené) vyvolaným proti rekombinantnému fragmentu proteínu CHL1 (viď Obr. 18).
Imunoprecipitácla
Rozpustná frakcia detergentových lyzátov homogenátu z mozgových tkanív (s proteínovou koncentráciou 300 mg/ml) z 9 dní starých myší (viď Tkanivové frakcie) bola inkubovaná s 10 μΐ antiséra CHL1 alebo s polyklonálnymi protilátkami proti Ll cez noc pri 5°C v 5 ml pufra (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) obsahujúcim 1% NP40 a 30 μΐ G-Sefarózy (Pharmacia/LKB). Po postupnom premytí v pufroch obsahujúcich 0,1% NP40, 0,05% SDS a potom 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) boli guľôčky Sefarózy povarené na 10 min. v 5x koncentrovanom nanášacom pufri (250 mM Tris-HCl (pH 6,6), 10% SDS, 50% glycerolu, 0,5% brómfenolová modrá, 25% B-merkaptoetanol) a supernatant bol rozdelený na 10% géloch SDS-PAGE. Proteíny boli prenesené na nitrocelulózu a detekované polyklonálnymi protilátkami proti Ll, antisérom CHL1 alebo monoklonálnou protilátkou 412 pomocou analýzy Western blot.
Nepriama imunofluorescencia
Za účelom sfarbenia bunkového a Schachner, 1981) boli bunky COS-1 povrchu (Schnitzer transfekované CHL1 a slepo (len vektor) nanesené do komôrok a inkubované
11211 min. pri izbovej teplote spoločne s primárnymi protilátkami (antisérum CHL1 (nariedené 1:100) alebo polyklonálnymi protilátkami proti Ll (nariedenými 1:200)) v DMEM obsahujúcom 10% fetálne teľacie sérum, 10 mM HEPES (pH 7,3) a 0,02% NaN3 a potom so sekundárnymi protilátkami. Po imunologickom farbení holi bunky fixované 4% paraformaldehydom vo fosfátovom pufri (pH 7,3) a boli ponechané v Moviolu (Hoechst) obsahujúcom 2,5% jodid draselný. Pre dvojité imunofluorescenčné farbenie astrocytov a oligodendrocytov bola vykonaná inkubácia primárnych protilátok s povrchovými bunkovými antigénmi ako bolo opísané pre transfekované bunky COS-1. Potom bola vykonaná inkubácia buniek s primárnymi protilátkami proti medzibunkovým antigénom po permeabilizácii buniek metanolom pri -20*C.
Príklad 23
Hybridizácia in situ
Za účelom vytvorenia protizmyslových prób cRNA označených digoxigenžnom s rovnakou veľkosťou z príslušných častí CHL1 a Ll boli použité rovnaké konštrukcie ako pre analýzu Northern blot. Zmyslové próby boli vytvorené z podobných konštrukcií s inzertami v opačnej orientácii. Všetky próby cRNA boli vytvorené pomocou T7 RNÄ polymerázy nasledované alkalickým pôsobením kvôli získaniu priemernej dĺžky fragmentov 250 nukleotidov. Hybridizácia in situ bola vykonaná ako bolo opísané (Bartsch et al., 1992; Dorries et al., 1994).
Výsledky a diskusia
Identifikácia cDNA CHL1
Testovanie expresnej knižnice lambda gtll na klony cDNA kódujúce bunkovú adhéznu molekulu Ll cez polyklonálne protilátky vyvolané proti imunopurifikovanej Ll z mozgu
11211 (Tácke et al., 1987) identifikovalo kloň 311. Tento kloň obsahoval neúplnú cDNA homológnu k Ll (34,1* podľa Lipman a Pearson (1985)) a otvorený čítací rámec dlhý 2112 párov báz (pb) kódujúci 704 aminokyselín vrátane cytoplazmovej časti. Kvôli izolácii klonov cDNA s úplnou dĺžkou bol použitý fragment DNA tohoto klonu na testovanie inej knižnice cDNA. Bolo izolovaných šesť nezávislých klonov. Dva klony obsahovali inzerty dlhé 4,2 a 4,4 kb, ktoré obsahovali úplnú kódujúcu oblasť blízkeho homológu Ll (CHL1). Kloň obsahujúci inzert dlhý 4,4 kb bol ďalej skúmaný.
DNA a odvodené aminokyselinové sekvencie a štruktúrne vlastnosti
Inzert, ktorý je dlhý 4,4 kb, kóduje 5*netransplantovanú oblasť dlhú 295 pb, otvorený čítací rámec dlhý 3627 pb a 3'netransplantovanú oblasť dlhú 518 pb (Obr. 18). Aj keď je na 3'konci úsek oligo(A), jasný konsezný polyadenylačný signál chýba. Sekvencia okolo štartovacieho kodónu ATG (pozícia 296, Obr. 18) nemá optimálnu konsenznú sekvenciu pre inicializáciu translácie (Kozák, 1987). Ale tento kodón ATG je vzatý ako štartovací kodón pre transláciu na základe dvoch dôkazov. Proti smeru translácie je predchádzaný terminačnými kodónmi vo všetkých troch čítacích rámcoch a po fiom nasleduje potenciálna signálna sekvencia s miestom štiepenia predpokladaným po zvyškoch 24 alebo 25 (hodnoty 8,65 a 6,40 podľa algoritmu von Heijne (1986)) (Obr. 18).
Translácia otvoreného čítacieho rámca dáva proteín s dĺžkou 1209 aminokyselín s vypočítanou molekulovou hmotnosťou 134,9 kD a profil charakteristický pre integrálny membránový glykoproteín. Pravdepodobná extracelulárna doména je zložená z 1081 aminokyselín s 18 potenciálnymi miestami pre N-glykozidáciu (Obr. 18 a 19a) a viac než 60 O-glykozilačných konsenzných miest (nie je ukázané) (Pisano et al·., 1993), po nej nasleduje ťransmembránová doména dlhá 23 aminokyselín, ako je usudzované z hydropatickej analýzy
11211 podľa Kyte a Doolittle (1982) (Obr. 19c). Táto doména je na svojom N-terminálnom konci ohraničená polárnym zvyškom a na svojom N-terminálnom konci ohraničená zásaditou aminokyselinou, čo súhlasí pre transférový signál terminázy (Obr. 18). Intracelulárna oblasť je zložená zo 105 aminokyselinových zvyškov.
Extracelulárna oblasť obsahuje dva hlavné motívy opakovaných domén, ktoré sú charakteristické pre rodinu Ll: úsek dlhý 685 aminokyselín s homológiou k doménam podobným Ig a úsek dlhý 472 aminokyselín s homológiou k opakovaniam podobným FN (Obr.l a 2a). Všetkých šesť domén podobných Ig obsahuje charakteristický pár cysteínových zvyškov, ktoré sú umiestnené vo vzdialenostiach 47 až 54 aminokyselín od seba (Obr. 19). Konzervovaný prolín (s výnimkou šiestej domény podobnej Ig) na konci štruktúry beta B v spojení s úsekom typu C2 konzervovaných aminokyselín okolo druhého cysteínového zvyšku v každej doméne (DXGXYXCXAXN) porovnáva domény podobné Ig podľa sady C2 (Wiliams a Barclay, 1988). Medzi doménami podobnými Ig a transmembránovou oblasťou sú štyri domény, ktoré sú homológne k opakovaniam podobným FN vo fibronektíne (Kornblihtt et al., 1985). Každá z týchto domén, približne 100 aminokyselín, obsahuje veľmi konzervovaný tryptofán (s výnimkou prvého opakovania podobného FN) a tyrozínové/fenylalanínové zvyšky v N- a C-terminálnych oblastiach. Je zaujímavé, že piate opakovanie podobné FN je len polovičné na rozdiel od iných členov rodiny Ll (Obr. 18). Ak toto polovičné opakovanie podobné FN predstavuje jednu z niekoľkých alternatívnych zostrihových foriem, z ktorých jedna obsahuje úplnú doménu podobnú FN, môže sa určiť spôsobmi inými ako je analýza Northern blot. V tomto kontexte je dôležité, že nebol nájdený žiadny dôkaz pre alternatívny zostrih pomocou reštrikčnej analýzy šiestich nezávisle izolovaných klonov (nie je ukázané). Alternatívny zostrih tejto domény podobnej FN bol pozorovaný u CAM/BRAVO, kde beli izolované izoformy cDNA, ktorým fhýba piate opakovanie podobné FN (Grumet et al., 1991; Kayyem
11211 et al., 1992). Neprítomnosť piatej domény podobnej FN v kuracom neurofascíne (Volkmer et al., 1992) je najpravdepodobnejšie tiež spôsobená alternatívnym zostrihom, pretože jeho krysí homológ, ankyrín väzbový glykoproteín (ABGP) (Davis et al., 1993), obsahuje piatu doménu podobnú FN. Takže CHL1 vnáša nový štruktúrny rys do rodiny Ll: len štyri a jedno polovičné opakovanie podobné FN je exprimované (Obr. 19).
Iným štruktúrnym rysom CHL1 je prítomnosť sekvencie RGD (aminokyseliny 185 až 187) v druhej doméne podobnej Ig (Obr. 18). Tento tripeptid bol pôvodne identifikovaný ako miesto bunkového prichytenia vnútri desiatej domény fibronektínu typu III (Pietschbacher a Rusolahti, 1984) a prispieva k väzbe na integrín (pre prehlad viď Rusolahti a Pietschbacher, 1987). Trojrozmerná štruktúrna analýza opakovaní podobných FN ukázala, že motív RGD je umiestnený medzi štruktúrami beta F a G (Main et al., 1992). Tento motív sa tiež nachádza u iných členov rodiny Ll. Pri treťom opakovaní podobnom FN kuracej Ng-CAH (Burgoon et al., 1991) a druhových homológoch kuracieho neurofascínu a krysej ABGP sa nachádza sekvencia RGD na rovnakom mieste, t.j. medzi štruktúrami beta F a G. Motívy RGD sa tiež nachádzajú pri Ll (dva pri myšej Ll a krysej (NÍLE) a jeden pri ľudskej Ll (Moos et al., 1988; Hlavin a Lemmon, 1991; Prince et al. , 1991). Všetky sekvencie RGD pri Ll sa nachádzajú v šiestej Ig podobnej doménam, ale v rôznom aminokyselinovom zložení ako RGD v FN podobných moduloch fibronektínu. Rovnako ako pri Ll je tripeptid u CHLI umiestnený v štruktúre beta E druhej Ig podobnej domény. Nie je v súčasnosti známe, či sú sekvencie RGD u týchto proteínov funkčne aktívne. V tomto kontexte je zaujímavé, že predĺženie neuritov indukované molekulou TAG-1 (Furley et al., 1992), členom rodiny F3/F11 (Bríimmendorf a Rathjen, 1993, 1994), ktorý obsahuje motív RGD v druhej FN podobnej doméne, závisí na B, integríne a Ll (Feisenfeld et al., 1994). Toto pozorovanie zvyšuje možnosť priamej fyzickej interakcie medzi druhým opakovaním podobným
11211
FN a integrínom betal.
CHL1 tiež obsahuje sekvenciu DGEA (aminokyseliny 555 až 558) v štruktúre beta C šiestej Ig podobnej domény (Obr. 18). Táto sekvencia sa nenachádza u ostatných členov rodiny Ll. Sekvencia DGEA sa tiež zúčastňuje pri rozpoznávaní integrínu alfa2 betal a kolagénu typu I, ktorý obsahuje tento motív (Staatz et al., 1991).
Štruktúrna podobnosť CHL1 s inými rozpoznávacími molekulami rodiny Ig
Porovnanie aminokyselinovej sekvencie CHL1 s translatovanou génovou sekvenčnou databankou EMBL ukázalo, že CHL1 je z 87,2% identická k 109 aminokyselín dlhému úseku a z 79,6% identická k 93 aminokyselín dlhému úseku predtým identifikovanému v ludskom mozgu (príjmové číslo HS2431 a HSXT02610 (Adams et al., 1992, 1993)). Takže sa ukazuje, že u človeka existuje velmi konzervovaná molekula CHL1. Sekvencie myšej, ludskej a krysej Ll/NILE, kuracej Ng-CAM, kuracej Nr-CAM, Ll.l zebričky (Tongiorgi et al., 1995), kuracieho neurofascínu/krysej ABGP, Drozofilieho neurogliánu (Bieber et al., 1989), myšej F3/kuracej Fl/Iudskej CNTN1 (Gennarini et al., 1989; Ranscht, 1988; Brummendorf et al., 1989; Berglund a Ranscht, 1994), krysej TAG-l/kuracieho axonínu-1/Iudskej TAX-1 (Furley et al., 1990; Hasler et al., 1993; Tsiotra et al., 1993) a krysej BIG-l/myšej PANG (Yoshihara et al., 1994; Connely et al., 1994) nájdené v translatovanej génovej sekvenčnej databanke ENBL boli porovnané s CHL1. Porovnanie je znázornené v Tabuľke l, ktorá je uvedená nižšie.
CHL1 je najpodobnejší na kuraciu Ng-CAM (37% aminokyselinovej identity v extracelulárnej doméne, Tabulka 1) a na myšiu Nr-CAM (64% aminokyselinovej identity v extracelulárnej doméne, Tabulka 2). Ale stupeň identity, zvlášť v extracelulárnej časti, nie je dostatočný pre úvahu, že tieto proteíny sú druhové homológy. Nedávno bol identifikovaný neúplný kloň cDNA myšej Nr-CAM (Moscoso
11211 a Sanes, 1995). Myší Nr-CAM je takmer identický (99%) s kuracím Nr-CAM (viď Tabuľka 2). Preto nie je CHL1 pravdepodobne homológom Nr-CAM u myší. CHL1 je štvrtým členom rodiny Ll u myší spoločne s Ll, Nr-CAM, neurofascínom (Moscoso a Sanes, 1995) a spoločne s veľmi konzervovanými druhovými homológmi u človeka (Adams et al., 1992, 1993).
Keď uvažujeme podobnosť intracelulárnych sekvencií kuracej a myšej Nr-CAM a kuracieho a myšieho neurofascínu (99% a 87%, Tabuľka 2), je veľmi nepravdepodobné, že sú myší Ll a kurací Ng-CAM druhové homológy, pretože vykazujú len 10% sekvenčnú identitu v intracelulárnej doméne (Tabuľka 2). Existencia Ng-CAM ako piateho člena rodiny Ll u myší s veľmi konzervovanou intracelulárnou doménou je skôr očakávaná. Je zaujímavé, že myšia Ll podporuje rast neuritov cez heterofilnú interakciu s kuracou Ng-CAM (Lemmon et al., 1989), čo implikuje, že členovia rodiny Ll môžu interagovať so sebou navzájom.
Okrem podobností v celkovej štruktúre členov rodiny Ll (Tabuľka 1 a Tabuľka 3) sú identifikované najviac konzervované oblasti v cytoplazmovej oblasti (Obr. 20). Nápadná homológia je evidentná pre členov rodiny Ll u všetkých druhov doteraz identifikovaných, ktoré obsahujú intracelulárnu doménu: Ll, CHL1, Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascín, neuroglián a Ll.1 zebričky a tiež neúplné sekvencie L1.2 zebričky (Tongiorgi et al., 1995) a myší Nr-CAM a neurofascín (Moscoso a Sanes, 1995) (Tabuľka 2). Vnútri tejto oblasti sú dva úseky takmer identické, jeden umiestnený blízko pri a čiastočne vnútri segmentu prechádzajúceho plazmatickou membránou a druhý na jeho C-terminálnom konci (I, III v Obr 20). Iný aminokyselinový úsek, ktorý je konzervovaný u Ll, Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascíne, Ll.l a L1.2, ale nie u CHL1 (Tabuľka 2), obsahuje motív RSLE (II v Obr. 3), ktorý pochádza z alternatívneho zostrihu a je exprimovaný len v neurónoch (Grumet et al., 1991; Miura et al., 1991; Volkmer et al., 1992). Pretože je intracelulárna oblasť najviac konzervovaná
11211 medzi týmito proteínmi, všetci členovia rodiny Ll môžu používať tie isté signálne transdukčné cesty na aktiváciu predĺženia neuritov. Bolo demonštrované, že cytoplazmové domény u ÄBGP, Ll a Nr-CÄM interagujú s ankyrínom prepájajúcim bunkovú rekogníciu s cytoskeletálnym lešením (Davis et al., 1993; Davis a Bennett, 1994).
Príklad 24
Identifikácia štruktúrnych požiadaviek v extracelulárnej doméne za účelom klasifikovania členov rodiny Ll
Pre ďalšie štúdium všeobecných kritérií rodiny Ll sme skúmali umiestnenie veľmi konzervovaných aminokyselín v doménach podobných Ig (cysteínov, ktoré sa zúčastňujú mostíkov S-S) a opakovaní podobných FN (tryptofán, tyrozín/fenylalanín) pre niektorých členov rodiny Ig (Tabuľka 3). Molekuly obsahujúce šesť domén podobných Ig a aspoň štyri opakovania podobné FM (rodina Ll a nižšia rodina F3/F11 s kotvou GPI (Briimmendorf a Rathjen, 1993)) odhalili velmi konštantný počet aminokyselín, ktoré oddelujú tieto konzervované aminokyseliny. Do úvahy bolo zobraných päť rôznych parametrov vzdialenosti:
1) počet aminokyselín oddeľujúcich konzervované cysteíny, ktoré tvoria cysteínové mostíky (S-S) v každej doméne podobnej Ig (Tabuľka 3, stĺpce Igl, Ig2, Ig4, Ig5 a Ig6);
2) počet aminokyselín medzi druhým cysteínom v jednej doméne podobnej Ig a prvým cysteínom nasledujúcej domény podobné Ig, ktorý odráža vzdialenosť medzi dvoma susediacimi doménami podobnými Ig (Tabuľka 3, stĺpce 1-2, 2-3, 3-4, 4-5 a 5-6);
3) počet aminokyselín medzi posledným konzervovaným cysteínom šiestej domény podobnej Ig a konzervovaným tryptofánom prvého opakovania podobného FN, ktorý odráža vzdialenosť medzi modulom domény podobnej Ig a modulom opakovania podobného FN Tabuľka 3, stĺpce IgG-FNl);
11211
4) počet aminokyselín medzi konzervovaným tryptofánom, tyrozínom/fenylalanínom každého jednotlivého opakovania podobného FN (Tabuľka 3, FN1, FN, FN3 a FN4);
5) počet aminokyselín medzi tyrozínom/fenylalanínom jedného opakovania podobného FN a tryptofánom nasledujúceho opakovania podobného FN, ktorý odráža vzdialenosť medzi dvoma susediacimi opakovaniami podobnými FN (Tabuľka 3,
FN1-FN2, FN2-FN3, FN3-FN4).
Pre získanie vysoko stringentných podmienok pre porovnanie molekúl podobných Ll sme nezahŕňali do výpočtu priemerných vzdialeností a štandardných odchýlok niekoľko málo hodnôt, ktoré sa jasne odchyľovali od priemeru, najpravdepodobnejšie v dôsledku alternatívneho zostrihu (neuroglián: Ig2, 2-3; Nr-CÄM a ABGP: Ig6-FN1; F3: Ig4, FN3; Ng-CAM: FN2, FN3 Tabuľka 3, označené *)). Aj keď počet aminokyselín medzi mostíkmi S-S pre prvú a šiestu doménu podobnú Ig (Igl; štandardná odchýlka (SD) = 3; Ig6: SD = 4) a počet aminokyselín medzi konzervovaným tryptofánom, tyrozínom/fenylalanínom opakovaní podobných FN tri a štyri (FN3: SD = 4; FN4: SD = š) sú mierne rozdielne, všetky ostatné parametre vzdialeností zostávajú pozoruhodne konštantné pre rôzne molekuly (FN1-FN2: SD = 0; FN2 a 2-3: SD = 2 (Tabuľka 3)). Na základe týchto kritérií sme vypočítali index podobnosti (viď Materiál niekoľko molekúl podobných Ig vo vzťahu hodnotám v zozname Tabuľky 3. Pre Ll, CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, ABGP, Ll.l, TAG-1 a BIG-1 bol získaný index podobnosti 74 až 95% (Tabuľka 3). Pre drozofilí neuroglián bola určená mierne nižšia hodnota (66%), zrejme preto, že je tu evolučná vzdialenosť medzi stavovcami a hmyzom. F3 a jeho druhové homológy sú menej konzervovaní, zvlášť v ich doménach podobných Ig, ale stále vykazujú index podobnosti 63%. Avšak niektoré úseky konzervovaných aminokyselín, ktoré sú základom silne konzervovanej kolinearity (napr.
FxVxAxNxxG(8x)TxxAxPxxxP na konci prvého opakovania podobného FN alebo NxxGxGPxS medzi poslednými dvoma a Metódy) pre k priemerným
11211 čo ukazuje, že je dôležitým štruktúrami beta tretieho opakovania podobného FN (nie je ukázané), podporujú myšlienku, že F3 patrí do rodiny L1. Je zaujímavé, že počet aminokyselín medzi susednými doménami (domény podobné Ig alebo opakovania podobné FN) je dokonca viac konzervovaný medzi týmito molekulami, vzdialenosť medzi jednotlivými doménami štruktúrnym rysom, t.j. rozhodujúcim pre funkciu nervových rozlišovacích molekúl (Tabuľka 3, stĺpce 1-2, 2-3, 3-4,
4-5, 5-6, FN1-FN2, FN2-FN3 a FN3-FN4). Táto vysoká konzervácia tohoto zoradenia (kolinearity) a vzdialeností je použitá na všeobecnejšie definovanie extracelulárnej domény členov rodiny L1. Na základe týchto práve definovaných kritérií obsahujú tieto extracelulárne domény modul šiestich domén podobných Ig na konci N, po ktorom nasledujú štyri FN. Tento štruktúrny rys budeme nazývať opakovania podobné kazetou rodiny L1.
Takže všetci charakteristické rysy konzervované aminokyseliny tieto molekuly odvodené molekuly, ktorá obsahovala členovia rodiny Ll zdieľajú kazety rodiny L1 a tiež veľmi Tieto výsledky navrhujú, že od spoločnej predchádzajúcej kazetu rodiny Ll, ktorá mohla rozšíriť svoj funkčný potenciál cez génovú duplikáciu pre účely najrôznejších bunkových interakcií v zložitejších nervových sústavách. Hlavná rodina Ll tak môže byť rozdelená na •klasických členov rodiny Ll (Ll, CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, neurofascín, neuroglián, Ll.l), ktorí obsahujú variabilné šieste opakovanie podobné FN, transmembránovú doménu a veľmi konzervovanú intracelulárnu doménu, a na podskupinu F3/F11 (F3/F11/CNTN1, BIG-l/PANG a TAG-l/Äxonín-l/TAX-1), ktorej spoločným rysom je spojenie s membránou skrz skupinu GPI a v ktorej nebolo zatiaľ identifikované žiadne variabilné piate opakovanie podobné FN. Extracelulárne domény obidvoch podskupín obsahujú kazetu rodiny Ll.
Ostatní členovia veľkej rodiny Ig, napr. N-CÄM (Cunningham et al., 1987; Barthels et al.,* 1987), MAG (Arquint et al., 1987; Lai et al., 1987; Salzor et al. ,
11211
1987), neuromuskulín (Kania et al., 1993) a rse (Mark et al., 1994) alebo fibronektín (Kornblihtt et al., 1985), ktorí obsahujú domény podobné Ig a alebo opakovania podobné FN, vykazujú jasne odlišné parametre vzdialeností, čo ukazujú, že sú oveľa menej príbuzné medzi sebou a k členom rodiny Ll (Tabuľka 3). Je zaujímavé, že gén kódujúci ľudský príbuzný leukocytárny spoločný antigén (HLAR) (Streull et al., 1988) a produkt génu potláčajúceho nádory (DCC), ktorý je deletovaný u rakoviny konečníka (Fearson et al., 1990), sú blízko príbuzní k rodine Ll podľa parametrov vzdialenosti (index podobnosti 42% a 50%). Rozbor konzervovaných aminokyselín odhalil, že DCC je naozaj oveľa bližší k rodine Ll než k N-CAM, ako bolo skôr navrhnuté vo Fearson et al., (1990) a Pierceall et al., (1994), aj keď sa zdá, že stratili piatu a šiestu doménu podobnú Ig. Nedávne štúdie ukazujú, že DCC je exprimovaný prednostne v mozgu a že rast neuritov krysích buniek PC12 je stimulovaný na substráte fibroblastov transfekovaných DCC, ktoré exprimujú tento proteín na svojom povrchu (Pierceall et al., 1994). Aj keď HLAR tiež vykazuje tiež relatívne vysoký index podobnosti, jeho príbuznosť k rodine Ll nie je tak zrejmá.
Príklad 25
Tkanivové rozšírenie mRNA CHL1 a proteínu
Pre určenie, či CHL1 zdieľa prednostnú expresiu v nervovej sústave spolu s inými členmi rodiny Ll, sme analyzovali expresiu CHL1 v rôznych tkanivách na úrovni mRNA a proteínu. V analýze Northern blot hybridizovala ribopróba CHL1 so silným prúžkom mRNA s veľkosťou 8 kb (Obr. 21), ktorý je o dosť väčší než veľkosť mRNA detekovanej próbou Ll (6 kb) (Tácke et al., 1987). Menší a tenší prúžok mRNA (Obr. 21a, dráha 3) je najpravdepodobnejšie spôsobený hybridizáciou k ribozomálnej RNA. RNA dlhá 8 kb bola detekovaná v mozočku, mozgu bez mozočku a v mieche, ale nie v dorzálnom koreňovom gangliu (DRG) (Obr. 21a). Naopak,
11211 analyzované a ľadviny), iónovej chromatografie. ELISA (nie je ukázané) ribopróba Ll ukázala silný signál s RNA z DRG (Obr. 21a). mRNA CHL1 bola tiež detekovaná v mozočku deväť dní starej krysy a v mieche šesť dní starej krysy, ale nie v krysích bunkách PC12 udržiavaných s a bez NFG alebo v bunkách COS-1 (Obr. 21b). Vo všetkých ostatných tkanivách, ktoré boli (detská žľaza, pľúca, pečeň, črevá, slinivka nebol detekovaný žiadny signál (Obr. 21a). Na identifikáciu proteínu CHL1 boli vytvorené protilátky proti bakteriálne exprimovanému fragmentu. 1,7 kb dlhý fragment cDNA reprezentujúci časť šiestej domény podobnej Ig a štyri opakovania podobné FN (Obr. 18 a 19b), ale nie transmembránovú alebo intracelulárnu oblasť, bol naklonovaný do expresného vektora pET. Expresia výsledného proteínového fragmentu viedla k detekcii prúžku s veľkosťou 70 kD pomocou farbenia Coomassie modrou po SDS-PAGE, ktorý bol purifikovaný pomocou výmennej
Analýza Western blot (Obr. 22a) a preukázali, že antiséra z dvoch králikov reagovali s proteínovým fragmentom CHL1, ale nie s purifikovanými Ll, N-CAM a MAG. Niektoré reakcie s bakteriálnymi proteínmi, ktoré putovali spoločne s peptidom CHL1 alebo s degradačnými produktami fragmentu CHL1, boli pozorované (Obr. 22a, dráha 4).
Pre dalšie preskúmanie špecifickosti protilátok a určenie, či tieto protilátky rozpoznávajú na bunkovom povrchu exprimovanú CHL1, boli tranzientne transfekované bunky COS-1 preskúmané týmito protilátkami. Imunocytochémia odhalila povrchovú expresiu CHL1 na bunkách transfekovaných CHL1, ale nie na bunkách transfekovaných samotným vektorom (Obr. 23). Tieto výsledky tiež ukazujú, že signálna sekvencia je funkčná a že otvorený čítací rámec je správny.
Aj keď bol prvý kloň cDNA CHL1 izolovaný z expresnej knižnice pomocou testovania s imunoafinitne purifikovanými protilátkami proti Ll z mozgu, reakcie rôznych preparátov 'protilátok proti rekombinantne exprimovaným doménam podobným Ig Ll s bunkami transfekovanými CHL1 neboli pozorované (nie
11211 použité ako kontrola, prúžky 185, 165 a je ukázané). Tiež protilátky proti CHL1 vyvolané proti extracelulárnej časti tejto molekuly (Obr. 19) nereagovali s bunkami transfekovanými Ll (nie je ukázané). Je preto pravdepodobné, že polyklonálne protilátky proti Ll použité na testovanie expresnej knižnice boli reaktívne s intracelulárnou časťou CHLI na konci C, ktorý je najviac homológny medzi CHL1 a Ll.
Antiséra CHL1 boli použité na identifikáciu imunoreaktívnych proteínov v niekoľkých tkanivách (mozog, pečeň, pľúca, ľadviny a črevá z deväť dní starých myší, Obr. 23b). Hrubé membránové frakcie, rozpustné alebo nerozpustné v 0,5% Tritone X-100, boli analyzované pomocou analýzy Western blot. Polyklonálne protilátky proti Ll boli Protilátky CHL1 rozpoznávajú tri rôzne 125 kD v nerozpustných a rozpustných frakciách membrán z mozgu. Prúžok 185 kD bol detekovaný len slabo v rozpustnej frakcii a prúžok 125 kD bol menej zastúpený v nerozpustnej frakcii (Obr. 23b, dráhy 1 a 2), čo ukazuje, že prúžok 185 kD je pravdepodobne membránovo viazaná forma CHL1, naopak prúžky 185 kD a 165 kD sú pravdepodobne proteolyticky štiepené fragmenty. Podobné rozloženie imunoreaktívnych prúžkov bolo pozorované po analýze Western blot buniek COS-1 transfekovaných CHL1 a celého mozgového tkaniva (nie je ukázané). Podobné rozloženie prúžkov bolo pozorované pre Ll (Faissner et al., 1985; Sadoul et al., 1988), Ng-CAM (Grumet et al., 1984) a Nr-CAM (Xayyem et al., 1992). Avšak dvojbázová konsezná sekvencia pre proteolytické štiepenie v tretej doméne podobné FN (Ll: SKR; Ng-CAM: SRR; Nr-CAM: SRR; Nr-CAM: “SRRSKR) sa nenachádza u CHL1. Podobne, ako iní členovia rodiny Ll, bolo u CHL1 zistené, že je exprimované len v neskorých štádiách vývoja. CHL1 nebola detekovateľná v mozgu pred embryonickým dňom 15 pomocou analýzy Western blot (nie je ukázané). Imunoreaktívny prúžok 50 kD bol detekovaný v detergentovej rozpustnej fralccii celého tkaniva pečene. Tento prúžok je najpravdepodobnejšie spôsobený
11211 nejakou reaktivitou protilátok CHL1 s proteínom podobných CHL1, pretože žiadna mRNA, ktorá by zodpovedala CHL1, nebola vidieť v pečeni pri analýze Northern blot (Obr. 22a). Žiadna imunoreaktivita na CHL1 nebola detekovaná v iných tkanivách, ktoré boli skúšané (Obr. Členovia rodiny v neurónoch CNS. Preto rezy (Obr.
23b).
Ll sú prednostne exprimovaní sme sa zaujímali, Či má tiež CHL1 tento profil expresie. Experimenty hybridizácie in situ boli vykonané za účelom identifikácie buniek syntetizujúcich Ll a CHLI v sietnici, optickom nerve a v cerebelárnom kortexe mladých práve narodených myší. V sietnici 7 dní starých myší sú exprimované mRNA Ll (Obr. 24a) a CHL1 (Obr. 24b) gangliónovými bunkami. Transkripty Ll boli ďalej detekovateľné v amakrínových a horizontálnych bunkách umiestnených na vnútornej jadrovej vrstve (Obr. 24a). mRNA CHL1 bola naopak detekovatelná len príležitostne v niekoľko málo bunkách umiestnených na vnútornej hrane vnútornej jadrovej vrstvy (Obr. 24b). Gliové bunky v optickom nerve neobsahovali detekovateľné hladiny transkriptov Ll (Obr. 24a). Naopak, mRNA CHL1 bola silne exprimovaná v gliových bunkách umiestnených v bližších oblastiach optického nervu (Obr. 24b) a nízke hladiny expresie CHL1 boli viditeľné v gliových bunkách umiestnených vo vzdialenejších oblastiach tohoto nervu (Obr. 24b).
V cerebelárnom kortexe dva dni starých myší bola mRNA Ll detekovateľná vo hviezdicových a košíčkových bunkách umiestnených v molekulárnej vrstve a v Golgiho a granulových bunkách umiestnených vo vnútornej granulárnej vrstve (Obr. 24d). Tie isté bunkové typy boli označené, keď boli hybridizované s protizmyslovou próbou cRNA CHL1 24e), s tou výnimkou, že transkripty CHL1 boli sotva detekovateľné v bunkách umiestnených vo vnútornej časti molekulárnej vrstvy (porovnajte Obr. 24d a e). Ako negatívna kontrola boli rezy hybridizované s príslušnými zmyslovými próbami cRNA a nebolo pozorované žiadne označenie buniek (pre sietnicu a optický nerv, ktorý bol hybridizovaný so
11211 z predných pripravené zmyslovou próbou cRNA CHL1, viď Obr. 24c). Kvôli odpovedi na otázku, či gliové bunky exprimujú CHL1 in vitro, boli mozgov práve narodených myší alebo krýs kultúry purifikovaných astrocytov alebo oligodendrocytov. Tie isté polyklonálne protilátky proti CHL1, ktoré špecificky detekovali CHLI na bunkovom povrchu transfekovaných buniek COS-1, boli použité. Astrocyty a oligodendrocyty boli identifikované protilátkami proti GFAP alebo s protilátkami proti antigénu 01. Kultúry astrocytov obsahovali niektoré bunky, ktoré boli označené dvojito polyklonálnymi protilátkami proti CHL1 (Obr. 25a, d) a monoklonálnymi protilátkami proti GFAP (Obr. 25b, e). Analýza kultúr oligodendrocytov však neodhalila žiadnu spoločnú lokalizáciu CHL1 a antigénu 01, čo znamená, že zrelé oligodendrocyty neexprimujú in vitro detekovateíné hladiny CHL1. Kombinované pozorovania ukazujú, že CHL1 a Ll vykazujú prekrývajúce sa, ale tiež rôzne profily expresie. Najnápadnejšie je, že CHL1, ale nie Ll, je exprimovaná v určitých gliových bunkách nervovej sústavy in vivo, čo naznačuje, že rôzni členovia rodiny Ll vykonávajú rôzne funkcie.
modifikácie.
Analýza glykozilácie a detekcie karbohydrátu HNK-1 u glykoproteínu CHL1
Pretože pozorovaná molekulová hmotnosť CHL (185 kD) je podstatne väčšia než vypočítaná molekulová hmotnosť (134,9 kD), bol analyzovaný príspevok karbohydrátov k molekulovej hmotnosti a tiež typ karbohydrátovej
Detergentové rozpustné a nerozpustné frakcie dní starých myší boli mozgových membrán sedem z hrubých podrobené enzýmovej deglykozilácii. Po pôsobení N-glykozidázy F (PNGázaF) bola molekulová hmotnosť všetkých imunoreaktívnych proteínov CHL1 (Obr. 26): prúžok 185 kD sa posunul na 150 kD, prúžok 165 kD na 135 kD a prúžok 125 kD na 110 kD. Výsledkom pôsobenia O-glykozidázy, enzýmu, ktorý štiepi na serín/treonín pripojené galaktozyl
11211 beta(l-3)N-acetylgalaktozaminyl disacharidy (Glasgow et al., 1977), bola a 165 kD sa posunuli neposunul. Tieto ľahko zvýšená pohyblivosť: prúžky 185 na 180 a 160 kD, ale prúžok 125 kD sa pozorovania ukazujú, že väčšina karbohydrátovej molekulovej hmotnosti je spôsobená N-pripojenými karbohydrátmi. Pôsobenie obidvoch enzýmov spoločne (Obr. 26) viedlo k väčšiemu posunu než bolo vidieť u jednotlivých enzýmov, čo naznačuje, že nie všetky glykozilačné miesta, najskôr 0-glykozilačné miesta, boli štiepené O-glykozidázou samotnou. Výsledky ukazujú, že CHL1 obsahujú približne 30% svojej molekulovej hmotnosti ako N-glykozidicky pripojené karbohydráty.
Niekoľko nervových bunkových adhéznych molekúl nesie karbohydrát HNK-1, ako napr. Ll (Kruse et al., 1984), TAG-1 (Dodd et al., 1988), Nr-CAM (Grumet et al., 1991), F3 (Gennarini et al., 1989), N-CAM (Kruse et al., 1984), glykoproteín asociovaný s myelínom MAG (McGarry et al., 1983; Kruse et al., 1984), a Po (Bollenson a Schachner, 1987). Preto sme analyzovali, či nesie CHL1 karbohydrát HNK-1. CHL1 bola imunoprecipitovaná z detergentových lyzátov celého mozgového tkaniva z deväť dní starých myší protilátkami proti Ll. Ako kontrola bola Ll podobne imunoprecipitovaná polyklonálnymi protilátkami z toho istého mozgového extraktu. Analýza Western blot s monoklonálnymi protilátkami 412 vyvolanými proti karbohydrátovému epitopu HNK-1 ukázala, že obidva imunoprecipitáty obsahovali prúžky, ktoré boli rozpoznané monoklonálnou protilátkou 412 v molekulových hmotnostiach očakávaných pre CHL1 (Obr. 27) alebo Ll (nie je ukázané). Pretože karbohydrát HNK-1 sa zúčastňuje bunkovej adhézie a viaže sa na laminín (Keilhauer et al. , 1985; Kiinemund et al. , 1988; Halí et al., 1993,
1995), môže CHL1, podobne ako ostatní členovia rodiny Ll, interagovať s laminínom skrz karbohydrát HNK-1.
11211
Záver
Vyššie opísané experimenty pridali CHL1 do rodiny Ll nervových rozpoznávacích molekúl, ktoré sa vyskytujú u takých rôznych druhov, ako sú človek, krysa, myš, sliepka, zehrička a Drozofila, a tak určujú filogeneticky konzervovanú rodinu molekúl, ktorej všetci členovia sú exprimovaní neskôr vo vývoji pri nástupe axogenézy v neurónoch a podmnožine neurónov. Skutočnosť, že existuje mnoho molekúl podobných Ll, ukazuje požiadavka prírody na štruktúrne podobné, ale funkčne rôzne molekuly podporujúce rast neuritov, a ukazuje na evolúciu rodiny Ll ako na skupinu molekúl, ktorá môže určovať reguláciu vedenia axónov.
Aj keď bol vynález opísaný a ilustrovaný prostredníctvom odkazov na rôzne špecifické materiály, postupy a príklady, rozumie sa, Že vynález nie je obmedzený na zvláštne kombinácie materiálu a postupov vybratých pre ten účel. Mnohé variácie takýchto detailov môžu byť zahrnuté, čo bude odborne vítané.
Nasleduje abecedný zoznam citácií uvedených v Príkladoch 18 až 25.
Tabuľka 1: Porovnanie podobností sekvencií extracelulámych častí CHL1 a iných molekúl podobných Ll
ŕ-< ' 1 o — w k CO — an •4 ^4 ^4 •*e d 1S
O d in OJ m
X *4 ΗΊ· «» w •4 d •4
•4 *í tb d d an
d e •m in •v »4 »4 *4 *4
c -
«
^4
O* •4 d w
O d d d r4. ^4 »4 •4
S O Ό c
^4
• 00 40 irt r* tO d to
•4 U U d d d d »4 d »4 •4
C
4
o
«
o 4» t* an in TT d d an
O 3 — «I O C ** d d d d ď »4 r4' »4 *4
5 o — ď t0 to m r- m d W
u u z —- d d n d m d *4 •4 «-4 •4
5 o — tft r» o to r*· to r* r4 d r*
o* u £ d d m d d d *4 •4 d v4
r* d «Ο <o «Ο 00 r* σ» d in Wl
-í E J — tn d d m d d d r4 r4 *4 «4
»4 r* o* m tO 00 d r* p* r* •4 tn to
sa d n d d d d d d d c4 •4 d •4
o XJ
c
—4 c
4—. «»«, o «0
O u (D Mu u lu
·—· <0 N «-4 «»» JZ E
«*«. MU Ρ» X E «Μ»
E x x o o E 4 ^4
2 Λ M »4 u 1 1 CC X
υ O a • 3 o o u ^4 «c 2
•4 θ’ U « 4 O d < •4 o X u u
J Z z c J C u· H ffi o x z z
sú uvedené v zátvorkách: c = kurča, d = Drozofila, h = človek, m = myš, r = krysa a zf= zebrička.
-97Tabuľka 2: Porovnanie podobností sekvencii extracelulárnych častí molekúl podobných Ll
£ M «4 o* «·» - •k •n
g 3 3 M- r* o s c*
Ϊ í 2 S = e*ť «1 **
£ J í r- e* w <* Λ •M r* - ΒΛ «n
s J) 1 BO •n w s o w •n O <*· o ΒΛ Brt
•c* K s < 8 r* O «r w K r* O o ΒΛ V»
s δ £ ·*» Φ·» w o 2 s r»· «· Ok o ·»» B©
S 2 í X •*1 «r 3 «Λ Μ» 8 O ΒΛ «· m = = r*
** ä 2 i S · 3 3 <1 w bo w o* •o s - r* <M
2« *ľ i 3 •rt 2 ts 3 2 v* 3 Zo 2 r- o r- *O
3 i r* *** 3 •x o Λ w Ο» *> r* *0 2 «k •n X» v*k - r*
• ŕ 3 5 2 < y z v 2 $ Z M 2 < U M Z «L S < 1 Λ X é 9 a V .B X i i g J y i 5 3 S r* 3 S <s .s 3 x «*· r- b. O í g o •v 5 < u z J o O.
£ U ifl-s t β·«·§
Tabuľka 3: Štruktúrna príbuznosť medzi členmi rodiny Ll a inými členmi rodiny Ig obsahujúcimi domény C2
<M ·*» •n •k *r Ok *r Ok •o 40 w •O τ- ο* 3 ·» _ *o •Λ •O 40 n =—
2 **· *r. <«· W es w· Π w r· *r O «*· •o r· w O· W ' x> d Ok W
40’ jr ·«' 4T ·> w Ok W _ •k' 40 ' «k r* w w - Ok , ·* d Ok ok 3 3
•3 3 3 3 w **» 40 4» Ok O 3 40 d. w O 4r. ao' 4»
W Jf s «k w Ok S Si e •o o' 40 τ- ο r* 4» • OC ••k Ok «V •o «· 4T 40 40 40 4Γ Ok
T •o c* *r W. wr C* w r*a w •o r· w r*· o ·*· r· o •o d <*· •r _ T4 4T TM r*· o
•o Jt w 40 o «· w o» to o *» w r- 4r w ’ **2 Ο» or 40 Ok Ο» 3 3
<íi V» *k 40 40 40 *40 Ok «e •o • 3 e* wo T4 *k 40 40 e-ζ Ok o 40 O 40 o 3 Ό '
r* •JT «Ο 40 *k •k 55 • •o 40 JT« •o •M 40 •o 40 40 r* d Ok 4» S •O Ok 40
«*· 5 3 3 3 3 •n 3 3 3 3 3 m d 3 Ok 4» Ο» w Ok .40 4 t •O 4»
5 S
CAMi Σ3 3 x u 3 δ «· x 3 $ Z a. S < □ .3 i Ú < B- Ó S C <1 J > < a va u 8 OC 5 X s 2 < z T o 2 .9 3 X 3 S š c- B -S 1 Jft
V
- - -y-td -J------»n
| «Κ 3 vt 3 vt r* * S vt S w 3 M· 3 M 3 Wt 3 « 3 wt s CM © w m m WK M Mt. •m Mt ©
š ©k ©k cm' V» ©Z CM ©k 3 r- © r* © ©k k© •M ©k •n ©k 3
I r- mc © w w T*· mc - © s © © ©» O ©» © © C* MC
•n £ *ϊ ©k • P ** ©k cm ©k ©k ©k r· ©» • ' © 3 ©i ©k k© © 3
š ο» ΜΤ © mt ©k © mt © W «X © «X © © © «* © <x «e o ©k © © ·· ©
g © «τ «X *» • t* ©k Si 3 3 CM ©k •n «1 *» •k ©k © k© © O ©k © © «V kO MC
š i s - s 3 3 3 3 s O ©k O ©k o ©» O O o ©k ©k © *r k© •O CM ©
e s ·» s? 3 O ©k S O ©k ©k ©i ©k ©» ©k MC <x © «Ο © © © ©k ck ©k MC
É j, Λ 3 W s • «n • 3 - e - - - - CM
5 < o 3 3 z u 2 < u M Z 2 < V Z K § < 3 J y □ x ó < »- ô £ c v y > < C ©> U E OL 3 s 3 < U Z o 5 .5 5 St 9 C β S w e C 5 a S J5 tZ
fV - 97

Claims (21)

1. Rekombinantná molekula DNA na podporu rastu in vivo v centrálnej nervovej sústave cicavca obsahujúca látku vybranú zo skupiny skladajúcej sa z Ll, N-CAM a glykoproteínu asociovaného s myelínom, látku odvodenú z molekúl, ktoré obsahujú štruktúrne motívy podobné homológnym opakovaniam 1 až 2 vo fibronektíne typu III a doménam podobným imunoglobínu I až II, III až IV a V až VI, ktoré sú spojené s expresnou kontrolnou sekvenciou.
2. Vektor obsahujúci rekombinantnú molekulu DNA podľa nároku 1.
3. Transformovaný hostiteľ obsahujúci vektor podľa nároku 2.
4. Protilátka vyvolaná proti látke podľa nároku 1 až 3 obsahujúca polyklonálnu alebo monoklonálnu protilátku.
5. Bunková kultúra obsahujúca gliové bunky transgénnych cicavcov podľa jedného z nárokov 1 až 4.
6. Bunkový tkanivový systém podľa nároku 5 obsahujúci tkanivo z nervovej centrálnej sústavy bunky transgénnych cicavcov.
7. Transgénne cicavce podľa nároku 6 obsahujúce gliové bunky, ktoré exprimujú exogénnu nervovú adhéznu molekulu.
8. Transgénne cicavce podľa nároku 7, kde gliovými bunkami sú astrocyty.
9. Transgénne cicavce podľa nároku 7, kde nervovou adhéznou molekulou je Ll.
10. Farmaceutický prostriedok na úpravu nervového rastu v centrálnej nervovej sústave cicavca podľa nárokov 1 až 6,
- 9«
11211 vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo látky, protilátky a farmaceutický prijateľných nosičov.
11. Spôsob testovania schopnosti látky alebo inej entity upravovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
a) pridávanie neurónov CNS do bunkového tkanivového systému podľa nároku 5;
b) pridávanie testovanej látky do bunkového tkanivového systému;
c) meranie nervového rastu neurónov CNS; a
d) korelovanie rozdielu v hladine nervového rastu buniek obsahujúcich túto látku vzhľadom na kontrolnú kultúru, do ktorej nebola žiadna taká látka pridaná.
12. Spôsob testovania schopnosti látky alebo inej entity upravovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
a) pridávanie neurónov CNS do bunkového tkanivového systému podľa nároku 6;
b) pridávanie testovanej látky do bunkového tkanivového systému;
c) meranie nervového rastu neurónov CNS; a
d) korelovanie rozdielu v hladine nervového rastu buniek obsahujúcich túto látku vzhľadom na kontrolnú kultúru, do ktorej nebola žiadna taká látka pridaná.
13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že nervovou adhéznou molekulou je Ll.
14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že nervovou adhéznou molekulou je Ll.
15. Skúškový systém na testovanie látok a iných činidiel na schopncjsť upravovať produkciu nervovej adhéznej molekuly podľa nárokov 11 až 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuj e
11211
a) pestovanie bunkového tkanivového systému podľa nároku 5 zaočkovaného látkou alebo činidlom;
b) pridávanie neurónov CNS do bunkového tkanivového systému kroku a); a
c) meranie nervového rastu za účelom určenia vplyvu látky na vyššie uvedené.
16. Skúškový sysxém na testovanie látok a iných činidiel na schopnosť upravovať produkciu nervovej adhéznej molekuly podľa nárokov 11 až 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuj e
a) pestovanie bunkového tkanivového systému podľa nároku 6 zaočkovaného látkou alebo činidlom;
b) pridávanie neurónov CNS do bunkového tkanivového systému kroku a); a
c) meranie nervového rastu za účelom určenia vplyvu látky na vyššie uvedené.
17. Skúškový systém podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že nervová adhézna molekula je vybratá zo skupiny skladajúcej sa z laminínu, fibronekxínu, N-cadhedrínu, BSP-2 (myší N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NÍLE, Nr-CAM, TAG-1 (axonín-1), Ng-CAM a F3/F11.
18. Skúškový systém podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že nervovou adhéznou molekulou je Ll.
19. Skúškový systém podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že nervová adhézna molekula je vybratá zo skupiny skladajúcej sa z laminínu, fibronektínu, N-cadhedrínu, BSP-2 (myší N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NÍLE, Nr-CAM, TAG-1 (axonín-1), Ng-CAM a F3/F11.
20. Skúškový systém podľa nároku 16,vyznačujúci sa tým, že nervovou adhéznou molekulou je Ll.
21. Použitie farmaceutického prostriedku podľa nároku 10 na
- -’ÍC 11211 prípravu liečiva na zvýšenie synaptickej výkonnosti centrálnej nervovej sústavy, na posilňovanie nervového rastu neurónov, posilňovanie pamäte, na testovanie schopnosti látky alebo inej entity upravovať aktivitu nervovej adhéznej molekuly.
i i
hTQ
7>ť ?··?
I—h
1kb
SK1424-97A 1995-04-19 1996-04-19 Recombinant dna molecule, vector, transformed host, an antibody, cell culture and cell system, transgenic mammals, pharmaceutical composition, method of testing drug, assay system suitable for such method, and use of pharmaceutical composition SK142497A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42499595A 1995-04-19 1995-04-19
US48395995A 1995-06-07 1995-06-07
PCT/US1996/005434 WO1996032959A1 (en) 1995-04-19 1996-04-19 Cns neurite outgrowth modulators, and compositions, cells and methods embodying and using same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK142497A3 true SK142497A3 (en) 1999-08-06

Family

ID=27026535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1424-97A SK142497A3 (en) 1995-04-19 1996-04-19 Recombinant dna molecule, vector, transformed host, an antibody, cell culture and cell system, transgenic mammals, pharmaceutical composition, method of testing drug, assay system suitable for such method, and use of pharmaceutical composition

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0821591A1 (sk)
JP (1) JPH11504211A (sk)
KR (1) KR19990007893A (sk)
AU (1) AU718508B2 (sk)
CA (1) CA2218599A1 (sk)
CZ (1) CZ330197A3 (sk)
EA (1) EA199700323A1 (sk)
HU (1) HUP9900060A3 (sk)
IS (1) IS4590A (sk)
MX (1) MX9708127A (sk)
NO (1) NO974811L (sk)
PL (1) PL322947A1 (sk)
SK (1) SK142497A3 (sk)
TR (2) TR199701203T1 (sk)
WO (1) WO1996032959A1 (sk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2190418A1 (en) * 1996-11-15 1998-05-15 Zhi-Cheng Xiao Neuron and neural tumor growth regulatory system, antibodies thereto and uses thereof
CA2243984A1 (en) * 1997-02-13 1998-08-20 Smithkline Beecham P.L.C. Neural cell adhesion molecule splicing variants
CA2343975A1 (en) * 1998-09-29 2000-04-06 Lars Christian Ronn Ncam binding compounds
AUPQ614200A0 (en) * 2000-03-10 2000-03-30 Department Of Human Physiology, Flinders University School Of Medicine Method for treating chronic spinal cord injury
US20020164668A1 (en) * 2000-04-03 2002-11-07 Durham L. Kathryn Nucleic acid molecules, polypeptides and uses therefor, including diagnosis and treatment of alzheimer's disease
AU2002330215A1 (en) * 2001-10-03 2003-04-14 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Nucleic acid molecules, polypeptides and uses therefor, including diagnosis and treatment of alzheimer's disease
TWI323265B (en) 2002-08-06 2010-04-11 Glaxo Group Ltd Antibodies
AU2003243151A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
GB0306309D0 (en) 2003-03-19 2003-04-23 Glaxo Group Ltd Method of treatment
EP2462444B1 (en) 2009-08-07 2018-10-03 Affinimark Technologies, Inc. Methods for the immunological identification of cerebrospinal fluid

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0396719B1 (en) * 1988-11-04 1995-07-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
WO1993000427A2 (en) * 1991-06-24 1993-01-07 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
WO1995013291A1 (en) * 1993-11-08 1995-05-18 New York University Neuron-glia cell adhesion molecule, ng-cam, in treatment of nerve damage

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9900060A2 (hu) 1999-04-28
NO974811D0 (no) 1997-10-17
EP0821591A1 (en) 1998-02-04
HUP9900060A3 (en) 2001-08-28
NO974811L (no) 1997-12-19
TR199801650T2 (en) 1999-03-22
TR199701203T1 (en) 1998-03-21
AU5557296A (en) 1996-11-07
JPH11504211A (ja) 1999-04-20
IS4590A (is) 1997-10-15
PL322947A1 (en) 1998-03-02
KR19990007893A (ko) 1999-01-25
WO1996032959A1 (en) 1996-10-24
CZ330197A3 (cs) 1998-04-15
EA199700323A1 (ru) 1998-04-30
AU718508B2 (en) 2000-04-13
MX9708127A (es) 1998-06-28
CA2218599A1 (en) 1996-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU719841B2 (en) Novel human metabotropic glutamate receptor
Meiri et al. Monoclonal antibodies show that kinase C phosphorylation of GAP-43 during axonogenesis is both spatially and temporally restricted in vivo.
Pimenta et al. The limbic system-associated membrane protein is an Ig superfamily member that mediates selective neuronal growth and axon targeting
Santuccione et al. Prion protein recruits its neuronal receptor NCAM to lipid rafts to activate p59fyn and to enhance neurite outgrowth
US5792743A (en) Method for promoting neural growth comprising administering a soluble neural cell adhesion molecule
Holz et al. Molecular and developmental characterization of novel cDNAs of the myelin-associated/oligodendrocytic basic protein
JP2010207239A (ja) Ｎｏｇｏ受容体アンタゴニスト
Mohajeri et al. Neurite outgrowth on non‐permissive substrates in vitro is enhanced by ectopic expression of the neural adhesion molecule L1 by mouse astrocytes
US6576607B1 (en) Methods using CNS neurite outgrowth modulators
SK142497A3 (en) Recombinant dna molecule, vector, transformed host, an antibody, cell culture and cell system, transgenic mammals, pharmaceutical composition, method of testing drug, assay system suitable for such method, and use of pharmaceutical composition
US6436673B1 (en) Polynucleotides encoding a novel neuronal cell growth factor
Giordano et al. Molecular characterization of E587 antigen: an axonal recognition molecule expressed in the goldfish central nervous system
KR20050042826A (ko) 쥐피알54 넉-아웃 포유류 및 이를 이용한 스크리닝 방법
US20060241284A1 (en) Transmembrane protein amigo and uses thereof
JP3787473B2 (ja) セマフォリン受容体
Lodge et al. Identification and characterization of CEPU-Se—a secreted isoform of the IgLON family protein, CEPU-1
JP2001501476A (ja) 脊椎動物Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄタンパク質
KR20060036466A (ko) 수용체
Cantor Retrograde Signaling at the Neuromuscular Junction: Mechanisms and Therapeutic Approaches to Stimulate Differentiation and Attachment of Motor Nerve Terminals to Muscle
US20080241168A1 (en) Transmembrane protein amigo and uses thereof
Coleman Characterization of the role of the cell adhesion molecule Thy-1 during development and regeneration in the mouse sensorimotor system
Rolf Functional analysis of the cell adhesion molecules L1, CHL1 and NCAM in vivo
Mingorance Jiménez et al. Nogo, myelin and axonal regeneration
Blackmore Neuron-intrinsic limitations to axon regeneration in the developing spinal cord
Soriano García et al. Nogo, myelin and axonal regeneration